Gegenstand
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Herstellung eines chemisch modifizierten Proteins bei dem
man
- – in
einem ersten Verfahrensschritt ein eine reaktive, funktionelle Gruppe
tragendes Hilfsprotein, welches aus einem Inteinfragment und einer
Exteinsequenz besteht, mit einer in das Zielprotein einzuführenden
Gruppe modifiziert und
- – in
einem zweiten Verfahrensschritt ein mit dem zu modifizierenden und
mit einem komplementären
Inteinfragment fusioniertes Zielprotein umsetzt, so dass die modifizierte
Exteinsequenz mit dem Zielprotein verbunden wird.
Im
Allgemeinen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im ersten Verfahrensschritt
ein Hilfsprotein eingesetzt, das ein Intein C enthält. Das erfindungsgemäße Verfhahren
kann jedoch auch so gestaltet werden, dass im ersten Verfahrensschritt ein
Protein eingesetzt wird, das ein Intein N enthält und das im zweiten Verfahrensschritt
eingesetzte Zielprotein mit einem Intein C fusioniert ist.
Besonders
bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die reaktive, funktionelle
Gruppe des Hilfsproteins eine SH-Gruppe ist. Da die SH-Gruppe in
einer sehr einfachen und übersichtlichen
Weise mit einem Maleinimid oder einem Halo-Acetamid reagiert, ist es sehr vorteilhaft,
die in das Zielprotein einzuführende Gruppe
gebunden an ein Maleinimid oder ein Halo-Acetamid mit einem eine
SH-Gruppe tragenden Hilfsprotein zu modifizieren. Die in das Zielprotein einzuführende Gruppe
kann, wenn sie als Label dienen soll, z.B. ein fluorophorer Rest,
ein Biotinrest, ein Oligonukleotidrest oder ein radioaktiver Rest
sein.
Wird
als Hilfsprotein ein Intein C eingesetzt, dann muss die Exteinsequenz
aus mindestens zwei Aminosäuren
bestehen. Wird hingegen ein Hilfsprotein eingesetzt, das ein Intein
N enthält,
dann muss die im Hilfsprotein enthaltene Exteinsequenz mindestens
eine Aminosäure
aufweisen.
Der
entscheidende Schritt der vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung
der herkömmlichen
chemischen Modifikation von Cystein in Proteinen, ohne die Nachteile
der Unspezifität
in Kauf nehmen zu müssen.
Die Reaktion wird durch das in 1 dargestellte
Reaktionsschema verdeutlicht:
Dabei wird zunächst ein
Protein (Hilfsprotein; „Intein C-cystag"), welches nur ein
Cystein enthält,
mit der vorstehend beschriebenen Methode modifiziert. Die dadurch
erhaltene Protein-Modifikation, das Protein „Intein C-cystag"-Modifikation" wird dann in gereinigter
Form mit dem eigentlichen Zielprotein umgesetzt, welches seinerseits
zuvor mit einem Intein teilfusioniert wurde („Zielprotein-Intein N"). Die Intein N-
und Intein C-Hälften
treten daraufhin in Interaktion, bilden das aktive Intein, welches
sich durch den Prozess des Protein-Spleißens (protein splicing) autokatalytisch
herausschneidet und dabei die fusionierten Sequenzen („Zielprotein" und „Cystag
Modifikation") mit einer
Peptidbindung miteinander verknüpft.
Dadurch entsteht das gewünschte
Reaktionsprodukt, die „Zielprotein-Cystag-Modifikation". Das Prinzip der
Erfindung ist in 1 illustriert.
Der
Vorteil dieser Reaktion ist, dass weitere Cysteine, die im „Zielprotein" enthalten sind,
von dieser Reaktion nicht betroffen sind. Die chemische Reaktion
am „Cystag" wird somit regioselektiv
an das Zielprotein geknüpft,
und zwar am C-Terminus des Zielproteins. Der „Cystag" ist eine Sequenz aus wenigen Aminosäuren. Das
hat den Vorteil, dass die für die
Durchführung
der Methode in Kauf zu nehmende weitere Veränderung des Zielproteins mit
nur wenigen Aminosäuren
minimal ist. Das modifizierte Zielprotein wird anschließend gereinigt,
was durch eine geeignete Strategie wie z.B. die Affinitätschromatographie
sehr vereinfacht werden kann. Ggfs. kann die C-Extein-Sequenz („Cystag") aber auch eine
längere Sequenz,
wie z.B. einen größeren Teil
eines Proteins, darstellen.
Die
Vereinigung der beiden Teile des Inteins, des Inteins N und des
Inteins C, sowie die Tatsache, dass das Intein C kein Cystein enthält und durch
die Fusion mit „Cystag" mit genau einem
Cystein versehen werden kann, um diesen modifizierten „Cystag" anschließend an
ein Zielprotein spleißen
zu können, stellen
somit das wesentliche Element der vorliegenden Erfindung dar.
Die
Intein-Teile N und Intein C sind bekannt und sind vom Ssp DnaB Intein
ausgehend entwickelt worden. Dafür
wurden zwei verschiedene Intein N- und Intein C-Teile des Ssp DnaB
mini-Inteins mit gentechnischen Methoden gewonnen, die einer Spaltung des
Inteins an zwei verschiedenen Stellen entsprechen. Diese beiden
Spaltstellen sind die Stellen S0 und S1, wie sie von Sun et al.
im Journal of Biological Chemistry, (2004), 279: 35281 bis 35286
beschrieben worden sind. Die Spaltstelle S0 wurde erstmals von Wu
et al., Journal of Biological Chemistry, (1998), 1387: 422 bis 432
beschrieben. Die Intein-Hälften
Intein C (S0) und Intein C (S1) wurden als gereinigte, rekombinante
Polypeptide mit dem „Cystag" als C-Exteinsequenz
hergestellt. Im Hilfsprotein Intein C(S0) wurde dabei das verbleibende
Cystein an Position 50 des Inteins gegen Serin ausgetauscht. Die komplementären Intein-Hälften Intein
N(S0) und Intein N(S1) wurden mit dem jeweiligen Zielprotein fusioniert.
Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf die vorstehend genannten Inteine
beschränkt,
sondern kann auch auf andere Inteine ausgeweitet werden. Hierfür kommen
alle Inteine in Betracht, die als katalytisches N- oder C-Nukleophil
kein Cystein, sondern ein Serin oder Threonin besitzen und die sich
in aktive Intein N- und Intein C-Hälften spalten lassen. Weitere
innerhalb des Inteins vorkommende Cysteine müssen dann ggfs. durch Mutagenese
entfernt werden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren
auch durchführbar,
wenn man eine Intein N-Hälfte
mit einem Cystag verknüpft
(siehe 1b). Dann lässt sich das Zielprotein an
seinem N-Terminus modifizieren. Ein gespaltenes Intein, dessen katalytisches
N-Nukleophil Serin ist, und das auch sonst keine Cysteinreste enthält, ist
das Psp-GBD Pol1 Intein, das beschrieben worden ist von Southworth
et al., im EMBO Journal (1998), 17: 918 bis 926. Diese Intein-Hälfte erfüllt alle Anforderungen, wenn
sie entsprechend mit einem Cystag versehen ist und erfindungsgemäß modifiziert
wird.
Die
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Produkte lassen sich von den Produkten, die durch
die chemische Ligationsmethode hergestellt worden sind, unterscheiden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist das Modifikationsreagenz (zum Beispiel Fluorescein-Maleinimid)
an die Seitenkette eines Cysteinrestes am C-Terminus bzw. N-Terminus
des Proteins gekoppelt, während
ggfs. weitere Cysteine im Protein unmodifiziert vorliegen. Das ist
in aller Regel bei den bisher bekannten Verfahren nicht der Fall.
Erfindungsgemäß können nicht
nur die bisher üblichen
biophysikalischen Sonden wie Fluorophore, Biotin, Oligonukleotide
mit Proteinen verbunden werden oder Proteine an feste Phasen wie
Chips und Mikroarrays sowie an synthetische Cofaktoren geknüpft werden,
sondern es lassen sich auch therapeutisch und diagnostisch interessante
Proteine herstellen. Diese müssen
meist die zahlreichen posttranslationalen Modifikationen, die der
menschliche Körper
an ihnen vornimmt, ebenfalls tragen, um biologisch und medizinisch
wirksam zu sein. Darüber
hinaus gibt es viele Anwendungen der synthetischen Modifikation
von Proteinen, die zur Stabilität
und damit längerer
Verweildauer im Körper
beitragen. Auch solche Modifikationen können erfindungsgemäß mit dem
vorliegenden Verfahren in Proteine eingeführt werden.
Folgende
Modifikationen können
erfindungsgemäß durchgeführt werden:
Glykosylierungen,
Phosphorylierungen, Acetylierungen, Isoprenylierungen, Farnesylierungen,
Lipoylierungen, Myristoylierungen, Palmitoylierungen, Polyethylenglykolylierungen
sowie der Einbau von Chelatbildnern für Metallionen wie Technetium
zur Sichtbarmachung oder Bestrahlung von Tumoren.
Die
vorstehend genannten Reaktionen können nach dem vorliegenden
Verfahren auch in mit einfachen technischen Mitteln ausgestatteten
Laboratorien leicht durchgeführt
werden. Damit unterscheidet sich dieses Verfahren grundsätzlich von
den chemischen Ligationsmethoden, bei denen mit großem experimentellen
Aufwand die Reaktionskomponenten hergestellt werden müssen, was
meist nur chemisch sehr versierten Laboratorien möglich ist.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird durch das nachstehende Beispiel im Einzelnen erläutert:
Herstellung
der Expressionsplasmide
Die
Inteinfusionen mit dem Cys-tag wurden ausgehend vom Ssp DnaB mini-Intein aus pMST (Wu et
al., Biochimica et Biophysica Acta 1387 (1998) 422-432) hergestellt.
pMST diente als Templat für eine
Polymerase Kettenreaktion (PCR), wobei der C-terminale Teil des
DnaB-Inteins (DnaBC) der Spaltstelle S0
entsprechend unter Verwendung der Oligonukleotide 5'-ATACCATGGGCACTAGTTCACCAGAAATAGAAAAGTTGTC-3' (Erkennungssequenzen der
Restriktionsendonukleasen NcoI und SpeI sind unterstrichen) und
5'-ATAGGTACCAGATCTAATACTGTTATGGACAAT-GATGTC-3' (KpnI, BglII) amplifiziert
wurde. Das gereinigte PCR-Fragment wurde anschließend mit
NcoI und BglII geschnitten. Das so erhaltene Fragment wurde anschließend mittels
T4 DNA Ligase in den gleichermaßen
präparierten
Vektor pQE60 (Qiagen) ligiert. Nach Transformation von kompetenten
E. coli-Zellen mit dem Ligationsansatz und Selektion auf Ampicillin-resistente
Kolonien wurde der Vektor pTK048 erhalten. Durch eine Punktmutations-PCR
mit den beiden Oligonukleotiden oTK15 (5'-CAT AAC AGT ATT AGA TCC TGC GGT CAT
CAC CAT CAC CAT C-3')
und oTK16 (5'-G ATG
GTG ATG GTG ATG ACC GCA GGA TCT AAT ACT GTT ATG-3') wurde die kodierende
Sequenz im resultierenden pTK052 so verändert, dass das Genprodukt
das zu modifizierende Cystein des Cys-tags in der Exteinsequenz
SIRSCGHHHHHH beinhaltet. Ebenso diente das Ausgangsplasmid pTK048
als DNA-Templat für
eine PCR mit den beiden Oligonukleotiden oHM116 (5'-ATA CCA TGG GCA
CTA GTT CAC CAG AAA TAG AAA AGT TGT C-3', NcoI, SpeI) und oTK14 (5'-ATA AGA TCT ACC
GCA ACC CTG TTC GAT ACT GTT ATG GAC AAT GAT G-3', BglII), die das DnaBC kodierende
Fragment mit der Exteinsequenz SIEQGCGRSHHHHHH enthält. Nach
Behandlung mit NioI und BglII wurde auch dieses Fragment wie oben
beschrieben in den Vektor pQE60 ligiert, so dass das Expressionsplasmid
pTK049 erhalten wurde. Die Plasmide pTK048 und pTK049 wurden mit
den Restriktionsenzymen SpeI und HindIII geschnitten und das Insert
in den mit XbaI und HindIII behandelten Vektor pHM45 (Mootz et al.,
J. Am. Chem. Soc. 2003, 125: 10561-10569) ligiert. Dies lieferte
die Plasmide pTK054 (kodierend für MBP-DnaBC-SIRSCGHHHHHH, MBP = maltose-binding protein)
und pTK053 (kodierend für MBP-DnaBC-SIEQGCGRSHHH-HHH). Als Negativkontrolle
wurde das Plasmid pTK048 (kodierend für ein Protein ohne Cystein)
ebenfalls SpeI, HindIII geschnitten und gleichermaßen in den
Vektor pHM45 kloniert. Auf diese Weise wurde pTK055 (kodierend für MBP-DnaBC-SIRSRSHHHHHH)
erhalten. Die Fusion des DnaBC-Fragmentes
mit MBP diente der Steigerung der Expressionsausbeute der jeweiligen
Fusionsproteine und konnte ferner zur besseren Reinigung derselben
durch eine Amylosesäule
verwendet werden.
Die
Expressionsplasmide für
die Fusionsproteine mit dem N-terminalen Inteinfragment DnaB" (Spaltstelle SO)
wurden ausgehend von Plasmid pSB13 hergestellt. Zu dessen Herstellung
wurde die Sequenz, die für
DnaB" kodiert, mit
den Oligonukleotiden 5'-ATAGAATTCTCCGCTGCATCAGTGGAGATAG-3' (EcoRI) und 5'-ATAAAGCTTTTATCTAGATAAAGAGGAGCTTTCTAG-TTTACG-3' (HindIII, XbaI)
von dem Plasmid pMST PCR-amplifiziert und über die integrierten EcoRI
und XbaI Schnittstellen in den Vektor pHM41 (Mootz et al., JACS
125 (2003) 10561-10569) kloniert. Das resultierende Plasmid pSB13
wurde mit den Restriktionsenzymen XbaI und SpeI geschnitten und
das entstehende Vektorfragment religiert, wodurch pTK056 gewonnen werden
konnte (kodierend für
MBP-DnaBN-Hiss).
pTK060
(kodierend für
TyrA-PCP-DnaBN-His6)
wurde nach Entfernung des für
MBP kodierenden Fragmentes in pTK056 durch NcoI- und EcoRI-Behandlung
und anschließender
Ligation mit einem für
TyrA-PCP kodierenden Fragment gewonnen. Letzteres wurde durch PCR
mit den Oligonukleotiden oTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC
ATG-3', NcoI) und
oTK19 (5'-ATA GAA TTC
TCC GCT CGT GGC GAC ATA CTG GGC CAA CGC-3', EcoRI) aus dem Konstrukt pCLA-PCP2b1 amplifiziert.
Das Konstrukt pCLA-PCP2b1 wurde ausgehend von chromosomaler DNA
aus Bacillus brevis mittels der Primer oTL02 (5'-TTT TCC ATG GCG TTG TCC GAG ATC ACC
ATG-3', NcoI) und oTL03
(5'-AAA AAG ATC
TCG TGG CGA CAT ACT GG-3',
BglII ) in den Vektor pQE60 kloniert. TyrA-PCP ist die Tyrosin-aktivierende
Adenylierungs-Domäne und
entsprechende Peptidyl-Carrier-Protein-Domäne (PCP) der nichtribosoma len
Tyrocidin-Synthetase TycC3 (Mootz und Marahiel, J. Bacteriol. (1997)
179: 6843-6850). Dieses Protein enthält sechs Cysteinreste, die
unter herkömmlichen
Methoden zur Sulfhydrylmarkierung von Proteinen ebenfalls zu unerwünschten
Nebenreaktionen führen
würden.
Expression
und Reinigung der Proteine
Für die Expression
der Proteine TK095 (MBP-DnaBC-SIEQGCGRSHHHHHH),
TK097 (MBP-DnaBC-SIRSCGHHHHHH), TK117 (MBP-DnaBC-SIRSRSHHHHHH),
TK115 (MBP-DnaBN-Hiss) und TK107 (TyrA-PCP-DnaBN-Hiss)
wurden E. coli BL21-Zellen mit den entsprechenden Plasmiden pTK053,
pTK054, pTK055, pTK056 und pTK060 transformiert. Die erhaltenen
Expressionsstämme
wurden in einer Vorkultur (LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/mL) und
für die
MBP-enthaltenden Proteine mit zusätzlich 0,2% Glukose) über Nacht
bei 37°C
und 250 upm angezogen. 6 mL der jeweiligen Vorkultur wurden zur
Animpfung von 600 mL des gleichen Mediums verwendet. Nachdem die
Zellkulturen bei 37°C
und 250 upm eine optische Dichte (OD600 nm) von
ca. 0,7 erreicht hatten, wurde die Temperatur auf 30°C gesenkt
und die Produktion der Proteine durch Zugabe von Isopropyl-☐-D-thiogalaktopyranosid
in einer Endkonzentration von 0,4 mM induziert. Die Zellen wurden
nach 3-4 Stunden durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand
verworfen und das Zellpellet in Wasch-Puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH
8,0) mit 5 mM Imidazol resuspendiert. Der Aufschluß der Zellen
erfolgte durch 2 Durchgänge
mit einem Emulsifier (Avestin EmuIsiFlex C-5). Die unlöslichen
Zellbestandteile wurden durch Zentrifugation bei 30.000 g (15 min)
abgetrennt und die lösliche
Fraktion anschließend
auf eine äquilibrierte
Ni2+-NTA-Gravity-Flow-Säule (Firma Qiagen, Bettvolumen
ca. 2 mL) aufgetragen. Die Waschschritte wurden durchgeführt mit
50 mL Waschpuffer mit 5 mM Imidazol, 30 mL Waschpuffer mit 20 mM
Imidazol und 10 mL Waschpuffer mit 40 mM Imidazol. Die gebundenen
Proteine wurden anschließend
mit Waschpuffer mit 250 mM Imidazol eluiert. Die Fusionsproteine,
die auch MBP enthielten, wurden anschließend gegen Amylosepuffer (20
mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) dialysiert und auf eine äquilibrierte
Amylosesäule (Firma
New England Biolabs, Bettwolumen ca. 4 mL) aufgetra gen. Nach Waschen
der Amlyosesäule
mit 50 mL Amylosepuffer wurden die Proteine schließlich mit
Amylosepuffer mit 10 mM Maltose eluiert. Die vereinigten Fraktionen
mit dem jeweiligen gereinigten Protein wurden gegen Spleißpuffer
(50 mM Tris, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, pH 7,0)
oder gegen Modifikationspuffer (20-50 mM Phosphat, 150 mM NaCl,
10% Glycerin, pH 7,2) dialysiert und dann bis zur weiteren Verwendung
bei –80°C eingefroren.
Spleißreaktionen
Die
Spleißreaktionen
wurden bei 25°C
in Spleißpuffer
durchgeführt,
wobei DTT unmittelbar vor der Reaktion frisch zugegeben wurde (Endkonzentration
2 mM). Ein Inteinkonstrukt wurde in Spleißpuffer vorgelegt und die Reaktion
durch Zugabe des entsprechenden anderen Inteinfusionsproteins gestartet.
Die Endkonzentration der Proteine wurde auf 2 μM eingestellt, wenn nicht anders
angegeben. Gestoppt wurden die Spleißreaktionen durch Zugabe von
10 μL 4 × SDS-Puffer (500 mM Tris/HCl,
pH 6.8, 8 % SDS, 40 % Glycerin, 20 % ☐-Mercaptoethanol, 5 mg/mL Bromphenolblau)
zu 30 μL-Aliquots
des Spleißansatzes.
Die Auswertung der Spleißreaktion erfolgte
nach SDS-PAGE-Auftrennung
mit Coomassie-Brilliant Blue-Färbung
oder durch Visualisierung von Fluorophor-markierten Proteinen auf
einem UV-Schirm (☐max = 312 nm).
Die Intensität
der Proteinbanden wurde densitometrisch ausgewertet.
Modifikationsreaktionen
Die
Modifikationsreaktionen wurden mit den entsprechenden Proteinen
und dem jeweiligen Modifikationsreagenz bei 25°C und vor Licht geschützt durchgeführt. Hierfür wurde
das zu modifizierende Protein in Konzentrationen von 10-40 μM eingesetzt, mit
dem 10fachen molaren Überschuß an Tris(2-carboxyethyl)phosphin
hydrochlorid (TCEP) in Modifikationspuffer versetzt und anschließend mit
einem 10-25fachen molaren Überschuß an Modifikationsreagenz
versetzt. Die Modifikationsreaktionen wurden nach 120 min durch
Zugabe von 1 mM (Endkonzentration) DTT, 1 mM (Endkonzentration) ☐- Mercaptoethanol,
oder dem 0.25fachen Volumen 4 × SDS-Probenpuffer
gestoppt. Die Modifikationsreaktion mit verschiedenen Reagenzien
sind nachfolgend im Detail beschrieben.
Modifikation mit Fluorescein-5-Maleimid
(FM)
Für die Modifikation
der Proteine TK095, bzw. TK097 mit Fluorescein-5-Maleimid (FM) wurde FM (Pierce, Bestellnummer
46130) in DMF gelöst und
anschließend
mit Modifikationspuffer auf 1 mM eingestellt (Endkonzentration von
DMF 2% (v/v) in Modifikationspuffer). Vor Beginn der Modifikationsreaktion
wurden die Proteine mit der 10fachen molaren Menge an TCEP für 5 Minuten
vorinkubiert. Anschließend
wurde FM im 25fachen molaren Überschuß zugegeben
und für
weitere 2 Stunden bei RT oder 25°C vor
Licht geschützt
inkubiert. Eingesetzt wurden die beiden Proteine TK095 und TK097.
In 2 ist die Modifikationsreaktion mit FM für Protein
TK095 schematisch dargestellt. Zur weiteren Verwendung der modifizierten
Proteine in Spleißreaktionen
wurde die Modifikationsreaktion mit 1 mM DTT abgestoppt (10 min)
und mit dem entsprechenden N-terminalen Inteinkonstrukt in Spleißpuffer
zur Spleißreaktion
eingesetzt. Zur Analyse der Modifikation mittels SDS-PAGE wurden
die Modifikationsreaktionen mit dem 0,25fachen Volumen 4 × SDS-Probenpuffer
gestoppt, direkt auf ein SDS-Gel aufgetragen und das Gel anschließend auf
einem UV-Schirm (312 nm) oder mit Hilfe einer Coomassie-Brilliant-Blue
Anfärbung
analysiert. In 3 sind die massenspektrometrische
Analyse sowie die Ergebnisse der SDS-PAGE und Detektion der Fluoreszensbanden der
Modifikationsreaktion des Proteins TK095 vor (M+ berechnet:
50354,52 Da) und nach Modifikation (M+ ber.
50781,52 Da; beobachtet: 50782,9 Da) gezeigt.
Modifikation mit Maleimid-PEO2-Biotin (BM)
Für die Modifikation
mit BM (Pierce, Bestellnummer 21901) wurde eine frische 10 mM Stocklösung von
BM in Modifikationspuffer hergestellt. Die zu modifizierende Proteine
TK095 und TK097 wurden jeweils in Konzentrationen von 10-40 μM vorgelegt
und mit der 10fachen molaren Menge an TCEP 5 Minuten bei 25°C vorinkubiert.
Anschließend
wurde die 15fache molare Menge an BM zugegeben und der Reaktionsmix
für weitere
2 Stunden bei 25°C
vor Licht geschützt
inkubiert. In 4 ist die Modifikationsreaktion
der Cys-tag Konstrukte mit BM schematisch dargestellt. Nach Quenchen
von überschüssigem Reagenz
durch Zugabe von 1 mM DTT oder 1 mM ☐-Mercaptoethanol,
wurde das Reaktionsgemisch gegen Avidin-Säulenpuffer (50 mM Tris, 150 mM
NaCl, pH 7,5) dialysiert, um überschüssiges BM abzutrennen.
Das dialysierte Protein wurde auf eine äquilibrierte Soft-Link-Soft-Elute-Avidin-Säule (Promega)
gegeben, mit dem 10fachen Säulenvolumen Avidin-Säulenpuffer
gewaschen und das biotinylierte Protein anschließend mit Avidin-Säulenpuffer
(+ 10 mM Biotin) eluiert. Das SDS-Gel der Reinigung, sowie die Massenbestimmung
des eluierten, biotinylierten Proteins TK095 sind in 5 gezeigt.
Modifikation mit 5-Iodoacetamido-Fluorescein (5-IAF)
Für die Modifikation
mit 5-IAF (Molecular Probes, Bestellnummer I30451), wie schematisch
in 6 dargestellt, wurde das Modifikationsreagenz in
DMF gelöst
und anschließend
mit Modifikationspuffer auf 10 mM eingestellt (Endkonzentration
DMF 2 % (v/v) in Modifikationspuffer). Die zu modifizierenden Proteine
wurden mit der 10fachen molaren Menge an TCEP 5 Minuten lang reduziert,
anschließend mit
der 25fachen molaren Menge an 5-IAF versetzt und für weitere
2 Stunden vor Licht geschützt
inkubiert. Die Analyse des Reaktionsverlaufs erfolgte wie für die Modifikation
mit FM beschrieben und ist in 7 gezeigt.
Das modifizierte Protein TK095 wurde anschließend zur Spleißreaktion
eingesetzt.
Spleißreaktion
mit unmodifiziertem Protein
Für die Spleißreaktion
wurde das unmodifizierte Protein TK095 in Spleißpuffer vorgelegt. Die Reaktion
wurde daraufhin durch Zugabe des Proteins TK115, bzw. TK117 gestartet.
Die Endkonzentrationen der beiden Proteine war jeweils 2 μM. Nach verschiedenen
Zeitpunkten wurde ein Aliquot aus dem Reaktionsansatz entfernt und
die Reaktion durch Zugabe von 4 × SDS-Probenpuffer ge stoppt. Die
Spleißreaktion
von TK095 und TK115 ist schematisch in 8 und die
zugehörige
Analyse mittels SDS-PAGE und folgender densitometrischer Auswertung
in 9 gezeigt.
Spleißreaktion
mit modifiziertem Protein
Zur
Spleißreaktion
wurden das C-terminale Inteinkonstrukt TK095 mit 5IAF, FM, bzw.
BM wie oben beschrieben modifiziert und gegebenenfalls gereinigt.
Anschließend
wurde das modifizierte Protein in Spleißpuffer vorgelegt und die Spleißreaktion durch
Zugabe des N-terminalen Inteinkonstrukts (TK115, bzw. TK117) gestartet.
Die Konzentration der beiden Proteine betrug jeweils 2 oder 4 μM. Zu verschiedenen
Zeitpunkten wurden Proben für
die Analyse mittels SDS-PAGE
entnommen. Die Spleißreaktion
wurde sowohl durch Kontrolle der Banden auf einem UV-Schirm (nur
für die
5IAF und FM modifizierten Proteine), durch Coomassie-Anfärbung, als
auch durch massenspektrometrische Analyse verfolgt.
Durch
das Protein-Spleißen
wurde die modifizierte C-Exteinsequenz (einschließlich des Cys-tags)
der Proteine TK095 mit dem Zielprotein, dem N-Extein des Proteins TK115, bzw. TK117
verknüpft.
In 10 ist die Reaktion von modifiziertem TK095 mit
TK115 schematisch dargestellt. 11a und 11b zeigen die Analyse der Reaktionen durch eine
UV-Bestrahlung des durch SDS-PAGE aufgetrennten Reaktionsgemisches.
Das modifizierte Zielprotein konnte durch die entsprechende Bande
im SDS-PAGE-Gel nachgewiesen werden, wie in 11 anhand
der Spleißreaktionen
von mit FM (11a) und 5IAF (11b) modifiziertem TK095 erkennbar ist. Die neu
auftretende fluoreszierenden Bande zeigt jeweils die richtige Größe des erwarteten
Spleißproduktes
(MBP-Cys(FM)-His = 45270,42 Da; bzw. MBP-Cys(5IAF)-His = 45231,78 Da). 11c zeigt eine massenspektrometrische Analyse
(ESI-MS) des Reaktionsgemisches
von TK115 mit TK095/FM. Neben den anderen Produkten der Spleißreaktion
ist eindeutig das Fluorescein-modifizierte Spleißprodukt MBP-Cys(FM)-His nachgewiesen.
12 zeigt
die Analyse der Reaktion von TK117 mit TK095/5IAF. Auch hier ist
deutlich erkennbar, dass das gewünschte
Produkt der Spleißreaktion,
TyrA-PCP-Cys(5IAF)-His, den Fluoreszenzmarker trägt.
13 zeigt
die Analyse der Spleißreaktionen
mittels Coomassiegefärbten
SDS-PAGE-Gelen von biotinylierten und gemäß 5 gereinigten
Proteinen TK095/BM und TK097/BM mit TK115 bzw. TK117.
Zusammenfassend
ist in den 2–13 folgendes
dargestellt:
2 zeigt
die schematische Darstellung Modifikationsreaktion der C-terminalen Intein-Cys-tag-Konstrukte
TK095 und TK097 mit Fluorescein-5-Maleimid (FM).
3a) zeigt SDS-PAGE und
3b) zeigt massenspektrometrische (ESI-MS)
Analyse der Modifikation des Proteins TK095 mit FM. Es ist sowohl
das Coomassie gefärbte SDS-Gel
(links) als auch dasselbe Gel vor der Coomassie-Färbung unter
UV-Licht (rechts) dargestellt. Gezeigt sind die Proteinbanden vor
(-FM) und nach Modifikation (+FM). Der Massenpeak in b) zeigt das modifizierte
Protein (TK095/FM) (berechnet: M+ = 50781,52
Da; gemessen: M+ = 50781,9 Da).
4 zeigt
die schematische Darstellung der Modifikationsreaktion der C-terminalen
Intein-Cys-tag-Konstrukte TK095 und TK097 mit Maleimid PEO2-Biotin
(BM).
5a) zeigt Coomassie gefärbtes SDS-Gel der Reinigung
und
5b) zeigt Massenbestimmung des eluierten,
biotinylierten Proteins TK095/BM. Gezeigt ist in a) das modifizierte
Protein vor dem Auftragen auf die Soft-Link-Soft-Elute-Säule (v.S.),
der Durchlauf von ungebunden Protein (DL), die Waschfraktionen (WS
1-3), sowie vier Elutionsfraktionen (E 1-4) von biotiny liertem Protein
(M = Proteinmarker). b) Massenspektrometrische Analyse (ESI-MS) des biotinylierten
Protein (berechnet: M+ = 50565,84 Da; gemessen:
M+ = 50566 Da).
6 zeigt
die schematische Darstellung der Modifikationsreaktion mit 5-Iodoacetamidofluorescein
(5IAF).
7a) zeigt SDS-PAGE und
7b) zeigt massenspektrometrische Analyse
(ESI-MS) der Modifikation des Proteins TK095 mit 5-Iodoacetamidofluorescein
(5IAF). Gezeigt sind die Proteinbanden vor (-5IAF) und nach Modifikation
(+5IAF). Es ist sowohl das Coomassie gefärbte SDS-Gel (links), als auch
dasselbe Gel vor der Coomassie-Färbung
unter UV-Licht (rechts) dargestellt (M = Proteinmarker). Der Massenpeak
in b) entspricht dem modifizierten Protein (berechnet: M+ = 50742,88 Da; gemessen: M+ =
50741,7 Da).
8 zeigt
die schematische Darstellung der Spleißreaktion von TK115 und nicht-modifizierten TK095.
Gezeigt sind neben dem Spleißprodukt MBP-Cys-His auch die
beiden entstehenden N- und C-terminalen Inteinspleißprodukte.
9a) zeigt Coomassie gefärbtes SDS-Gel der Spleißreaktion
von unmodifiziertem TK095 mit TK115 (M = Proteinmarker).
9b) zeigt Densitometrische Auswertung der Spleißbanden
wobei die Abnahme der Eduktbande von TK115 bei 56,4 kDa und die
Zunahme der Bande des Spleißproduktes
MBP-Cys-His bei 44,8 kDa verfolgt wurde.
10 zeigt
die schematische Darstellung der Spleißreaktion von TK115 mit TK095,
welches vorher mit 5IAF modifiziert wurde.
11a) zeigt SDS-PAGE der Spleißreaktion von TK115 mit TK095,
welches vorher mit Fluorescein-5-Maleimid modifiziert wurde, wobei
das modifizierte Protein TK095/FM und der Verlauf der Spleißreaktion
mit TK115 nach 0, 1 und 2h zu sehen ist.
11b) zeigt SDS-Gel der Spleißreaktion von TK115 mit TK095,
welches mit 5-Iodoacetamidofluorescein modifiziert wurde. Die SDS-Gele
wurden auf einem UV-Schirm analysiert. Das neu entstehende Spleißprodukt
MBP-Cys(FM, bzw.
5IAF)-His ist jeweils durch einen Pfeil hervorgehoben. C) ESI-MS-Analyse des Reaktionsgemisches
von TK115 mit TK095/FM. Hervorgehoben ist der Massenpeak des Spleißproduktes
MBP-Cys(FM)-His (berechnet: M+ = 45270,42
Da; gemessen: M+ = 45270,08 Da)
12 zeigt
SDS-PAGE Analyse der Spleißreaktion
von TK117 mit dem modifizierten Protein TK095/5IAF. Es ist jeweils
der Fortschritt der Spleißreaktion
nach einer Stunde gezeigt. Es ist sowohl das Gel vor der Coomassie-Färbung unter UV-Licht (links),
als auch dasselbe Coomassie gefärbte
SDS-Gel (rechts) dargestellt.
13 zeigt
SDS-PAGE-Analyse (Coomassie-Färbung)
der Spleißreaktion
der gereinigten, biotinylierten Proteine TK095 und TK097. Gezeigt sind
jeweils die Spleißreaktionen
nach 2 h. Bei den Spleißreaktionen
mit TK115 (links) erkennt man die jeweiligen neu gebildeten Banden
der Spleißprodukte
MBP-SIEQGC(BM)GRS-His
(45,3 kDa) , bzw. MBP-SIRSC(BM)G-His (44,9 kDa). Im Falle der Spleißreaktionen
mit TK117 (rechts) erkennt man ebenfalls die Spleißprodukte
der berechneten Größen (TyrA-PCP-SIEQGC(BM)GRS-His
(69,2 kDa), bzw. TyrA-PCP-SIRSC(BM)G-His (68,9 kDa)).