DE60033405T2

DE60033405T2 - Chimäre polypeptide, verfahren zur herstellung und verwendung dafür

Info

Publication number: DE60033405T2
Application number: DE60033405T
Authority: DE
Inventors: Hauke Lilie; Susanne Richter; Rainer Rudolph; Kay-Gunnar Stubenrauch
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-31
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2020-08-01
Also published as: CA2380569C; MXPA02001139A; CN1184235C; CA2380569A1; DE60033405D1; AR021448A1; KR20020026558A; EP1206495A1; ATE353921T1; US6437095B1; EP1074563A1; JP2003506028A; BR0012926A; WO2001009193A1; TR200200252T2; ZA200109746B; ES2280231T3; DK1206495T3; EP1206495B1; JP4011914B2

Description

Die Erfindung betrifft peptidische lineare Linker und Verfahren zur Herstellung eines chimären Polypeptids.
Künstliche bifunktionale oder multifunktionale biologisch aktive Verbindungen besitzen einen breiten Bereich von Anwendungsmöglichkeiten in Diagnostik und Therapie. Bifunktionale Proteine werden besonders bevorzugt in der Immundiagnostik und Immuntherapie eingesetzt. Beispielsweise wird die spezifische Bindung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments an dessen Antigen ausgenützt, um ein Protein mit einer anderen biologischen Funktion auf dieses spezifische Antigen zu richten. Beispielsweise kann ein bispezifischer Antikörper, dessen Antigene sich einerseits auf Tumorzellen und andererseits auf Makrophagen befinden, eingesetzt werden, um Killerzellen auf einen Tumor zu richten (Bohlen, H. et al., Blood 82 (1993) 1803–1812). Solche bispezifischen Antikörper können durch Fusionieren zweier Hybridomzellen, welche die jeweiligen monospezifischen Antikörper produzieren, unter Bildung von Quadromzellen hergestellt werden (Milstein, C. und Cuello, A. C., Nature 305 (1983) 537–540). Neben den beiden ursprünglichen Antikörpern produzieren diese Zellen auch bispezifische Antikörper. Dieses Verfahren um bispezifische Proteine zu erhalten ist jedoch ausschließlich auf Antikörper begrenzt. Außerdem zeigen nur 15% der exprimierten Antikörper die gewünschte Bispezifität. Diese Antikörper müssen aus dem Gemisch durch arbeitsaufwändige Reinigungsverfahren isoliert werden.
Ein deutlich effizienteres Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper und anderer bispezifischer Proteine beruht auf der chemischen Quervernetzung von zwei Proteinen, welche die gewünschten Eigenschaften besitzen (Fanger, M. W. et al., Crit. Rev. Immunol. 12 (1992) 101–24). Diese Quervernetzung wird mittels eines bifunktionalen Linkermoleküls, das mit Aminogruppen der Proteine oder mit Cysteinresten reagiert, bewerkstelligt. In dem letzteren Fall können beispielsweise Cysteinreste des einen Proteins durch 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) aktiviert werden und die Zugabe des zweiten Proteins, welches Cysteinreste in reduzierter Form enthält, bewirkt die Bildung von Disulfiden und somit eine kovalente Kopplung der beiden Proteine. Über dieses Verfahren kann die Ausbeute an heterodimeren bifunktionalen Proteinen im Vergleich zu der nicht-spezifischen Quervernetzung, die üblicherweise zu einem hohen Anteil an Homodimeren führt, beträchtlich verbessert werden. Das Verfahren der chemischen Quervernetzung führt aber zu nicht-homogenem Material. Diese Heterogenität kann sich negativ auf die Stabilität und Funktionalität des bispezifischen Konstrukts auswirken (Debinski, W. und Pastan, I., Bioconjug. Chem. 5 (1994) 40–43).
Das am häufigsten eingesetzte Verfahren zur Herstellung bifunktionaler Proteine ist die Bildung von Fusionsproteinen auf genetischer Ebene. Dabei wird das 5'-Ende der cDNA eines Proteins mit dem 3'-Ende des Gens eines anderen Proteins über gentechnische Verfahren verknüpft, wobei der Leserahmen beibehalten wird, und das Konstrukt wird rekombinant in Prokaryoten oder Eukaryoten exprimiert. Auf diese Weise wurde beispielsweise ein Antikörperfragment, das gegen einen Tumor gerichtet war, mit einem bakteriellen Toxin verbunden (Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8616–8620). Dieses Immuntoxin ist in der Lage, spezifisch Tumorzellen abzutöten. Neben dem bakteriellen Toxin wurden auch Fusionen von Antikörperfragmenten erfolgreich hergestellt mit RNAse und anderen Enzymen und ihre Funktionalität wurde in Zellkulturen untersucht (Newton, D. L et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19572–19578; Zewe, M. et al., Immunotechnol. 3 (1997) 127–136).
Die sogenannten Diabodies stellen eine weitere Form von Fusionsproteinen dar (Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444–6448). Die Diabodies bestehen aus zwei Fv-Fragmenten mit unterschiedlichen Spezifitäten. Anders als bei scFv-Fragmenten, in denen die beiden variablen Domänen eines Antikörpers miteinander über einen Linker verbunden sind, ist bei Diabodies die VL-Domäne des einen Antikörpers mit der VH-Domäne eines zweiten Antikörpers fusioniert. Die Struktur des für diesen Zweck verwendeten Linkers ist derart, dass der Linker eine intramolekulare Assoziierung der beiden Domänen verhindert und dass stattdessen eine intermolekulare Assoziierung zweier dieser Konstrukte auftritt, was zur Bildung eines bifunktionalen Diabodies führt.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche Versuche durchgeführt, um Systeme zu entwickeln, die allgemein für die Herstellung von bifunktionalen Proteinen eingesetzt werden können. Dazu wurden Proteine auf Genebene fusioniert mit Peptiden oder Proteinen als Dimerisierungsdomänen, um eine gezielte Assoziierung zu vermitteln. Als Dimerisierungseinheiten wurden die Antikörperdomänen CL und CHI, Calmodulin und das entsprechende Bindungspeptid oder Streptavidin verwendet (Müller, K. M. et al., FEBS Lett. 422 (1998) 259–264; Neri, D. et al., BioTechnology 13 (1995) 373–377; Dübel, S et al., J. Immunol. Methods 178 (1995) 201–209). Außerdem könnten auch kurze Peptidsequenzen wie Leucin-Zipper und amphiphile Helices als funktionelle Einheiten für die gezielte Heterodimerisierung verwendet werden (Kostelny, S. A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547–1553). Bis heute hat sich jedoch keines der Verfahren zur gerichteten Assoziierung als allgemein anwendbare Technik etabliert.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen peptidischen linearen Linker bereitzustellen, der stabil ist und einfach hergestellt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung umfasst einen peptidischen linearen Linker für die Verknüpfung von biologisch aktiven Verbindungen, wobei der Linker besteht aus einer ersten Polypeptid-Linkergruppe, bestehend aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 basischen Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und Ornithin, und einer zweiten Polypeptid-Linkergruppe, bestehend aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 sauren Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Glutamat und Aspartat, wobei die erste und die zweite Gruppe durch ionische Wechselwirkung über ihre Vielzahl von geladenen Aminosäuren und durch kovalente Disulfidbrücken zwischen ihren Cysteinen gebunden sind, wobei jede der Gruppen an ihrem C- und/oder N-Terminus mit einer biologisch wirksamen Verbindung verknüpft ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheiden sich die biologisch wirksamen Verbindungen durch ihre chemische Struktur voneinander. Es ist weiter bevorzugt, dass die Verbindung ein Antikörper, ein Antikörperfragment oder ein Enzym ist.
Die Erfindung umfasst ferner ein Verfahren für die Herstellung eines chimären Polypeptids, das aus zwei biologisch wirksamen Polypeptiden besteht, die über einen peptidischen Linker verbunden sind, wobei in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle simultan oder separat Nukleinsäuren exprimiert werden, die kodieren für eine erste Gruppe des chimären Polypeptids, bestehend aus einem ersten biologisch wirksamen Polypeptid und einer ersten Polypeptid-Linkergruppe, die aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 basischen Aminosäuren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und Ornithin, und einer zweiten Gruppe des chimären Polypeptids, bestehend aus einem zweiten biologisch wirksamen Polypeptid und einer zweiten Polypeptid-Linkergruppe, die aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 sauren Aminosäuren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Glutamat und Aspartat, wobei die erste und die zweite Gruppe des chimären Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem Zellüberstand gewonnen werden und zusammengebracht werden, um die Bildung einer polyionischen Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Polypeptid-Linkergruppe zu ermöglichen, wobei mit einem Oxidationsmittel behandelt wird, um Disulfidbrücken zwischen den Polypeptid-Linkergruppen zu bilden und das chimäre Polypeptid isoliert wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung chimärer Polypeptide ist es möglich, die Bildung von Homodimeren im Wesentlichen zu vermeiden, wenn Heterodimere die gewünschten Produkte sind.
Die Erfindung beruht auf der Tatsache, dass eine Polypeptid-Linkergruppe, die aus 4 bis 12 basischen Aminosäuren besteht, in einer wässrigen Lösung mit niedriger Ionenstärke spezifisch mit einer Polypeptid-Linkergruppe wechselwirkt, die aus 4 bis 12 sauren Aminosäuren besteht. Wenn beide Polypeptide zusätzlich Cysteine enthalten, können in einer darauffolgenden Reaktion zwischen den Cysteinen beider Polypeptid-Linkergruppen unter oxidierenden oder sogar leicht reduzierenden Bedingungen spezifisch Disulfidbrücken gebildet werden. Vorzugsweise beträgt der Abstand zwischen zwei Cysteinen in der Polypeptid-Linkergruppe mehr als eine Aminosäure, vorzugsweise 3 bis 6 Aminosäuren. Dies impliziert, dass die Menge und der Abstand der Cysteine beider Polypeptide vorzugsweise identisch sind und dass dann, wenn die Cysteine beider Polypeptide einander gegenüber angeordnet sind, die sauren Aminosäuren des einen Strangs und die basischen Aminosäuren des anderen Strangs jeweils ebenfalls einander gegenüber angeordnet sind. Identischer Abstand der Cysteine bedeutet, dass in beiden Strängen dieselbe Anzahl anderer Aminosäuren als Cystein zwischen den Cysteinen angeordnet ist.
Es ist erfindungsgemäß möglich, zwei oder mehr biologisch wirksame Verbindungen miteinander über die erste und die zweite Polypeptid-Linkergruppe in stabiler und kovalenter Weise und in einer räumlich definierten Position zu verknüpfen.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform bevorzugter Linkergruppen sind die erste und die zweite Polypeptid-Linkergruppe so konzipiert, dass die Positionen der Cysteine und der basischen und sauren Aminosäuren eine optimierte ionische Wechselwirkung zwischen den sauren und basischen Aminosäuren und eine Kopplung über ein oder mehrere Disulfidbrücken auf vorgewählte gerichtete Weise ermöglichen. So ist es möglich, die biologisch wirksamen Verbindungen in eine vorgewählte räumliche Position zueinander zu bringen. Wenn sich beispielsweise die erste und die zweite Polypeptid-Linkergruppe in einer Position befinden, in der sich ihre N-terminalen Enden treffen und in der sich ihre C-terminalen Enden treffen, dann können die biologisch wirksamen Verbindungen in eine sehr dichte räumliche Position zueinander gebracht werden, wenn sie beide am C-Terminus (oder beide am N-Terminus) der Polypeptid-Linkergruppen verknüpft sind. Wenn eine der biologisch wirksamen Verbindungen an den C-Terminus der Polypeptid-Linkergruppe geknüpft ist und die andere an den N-Terminus geknüpft ist, so ist ihr räumlicher Abstand voneinander viel größer. In diesem Fall fungieren die dimensierte erste und zweite Polypeptid-Linkergruppe im Wesentlichen als ein linearer Linker zwischen zwei biologisch wirksamen Verbindungen, vorzugsweise zwischen zwei Polypeptiden. Eine analoge Vorgehensweise kann angewendet werden, wenn vier biologisch wirksame Verbindungen in eine räumliche Position relativ zueinander gebracht werden sollen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Unter „chimäres Polypeptid" wird erfindungsgemäß ein Polypeptid verstanden, das aus einer ersten und einer zweiten Polypeptid-Linkergruppe besteht, wobei sich die Linkergruppen chemisch unterscheiden und sie so zusammengesetzt sind, dass sie als Ergebnis einer ionischen Wechselwirkung über eine Vielzahl von Aminosäuren, die unterschiedliche Ladungen tragen, aneinander binden und dass sie zusätzlich kovalent über Disulfidbrücken von Cysteinen aneinander gebunden sind. Bei der Herstellung der chimären Polypeptide dienen die polyionischen Wechselwirkungen zwischen den sauren und basischen Aminosäuren in den Polypeptid-Linkergruppen dazu, die Polypeptide in eine vorgewählte Position zueinander zu bringen, wobei diese Position es ermöglicht, die Disulfidbrücken leicht zu bilden. Der Zweck der chimären Polypeptide besteht darin, die biologisch wirksamen Verbindungen auf stabile und vorbestimmte Weise aneinander zu koppeln, unter Vermeidung unerwünschter Nebenprodukte (zum Beispiel Homodimere oder chimäre Produkte, in denen sich die biologisch wirksamen Verbindungen in einer ungünstigen Position relativ zueinander befinden). Üblicherweise zeigen die erste und die zweite Polypeptid-Linkergruppe selbst im Wesentlichen keine biologische Aktivität. Sie sind lediglich Hilfsmittel, welche die Kopplung der biologisch wirksamen Verbindungen unterstützen, die in ihrer dimeren oder multimeren Form in der Lage sind, einen vorgewählten pharmazeutischen Effekt zu entwickeln. Für eine starke ionische Wechselwirkung zwischen den Polypeptid-Linkergruppen ist es bevorzugt, dass die pK_s-Werte der basischen und sauren Aminosäuren, die an den Linkergruppen in einer einander gegenüber liegenden Position angeordnet werden, sich so stark wie möglich unterscheiden. Es ist daher bevorzugt, dass der pK_s-Wert der basischen Aminosäure etwa 10 oder mehr beträgt, während der pK_s-Wert der sauren Aminosäure etwa 4,5 oder weniger beträgt.
Die Polypeptid-Linkergruppen bestehen aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 zusätzlichen Aminosäuren, die, für die erste Polypeptid-Linkergruppe, vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und Ornithin. Die zweite Polypeptid-Linkergruppe besteht ebenfalls aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 sauren Aminosäuren, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Glutamat und Aspartat. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Polypeptid-Linkergruppe aus 6 bis 10 basischen oder sauren Aminosäuren. Es ist weiter bevorzugt, dass die Polypeptid-Linkergruppen jeweils einen Cysteinrest enthalten. Es können jedoch auch andere saure oder basische Aminosäuren oder Derivate davon erfindungsgemäß verwendet werden, solange ihre pK_s-Werte sich deutlich unterscheiden (bevorzugte Differenz etwa 5 oder mehr Einheiten) und eine ionische Wechselwirkung zur Bindung der beiden Polypeptid-Linkergruppen führt.
Eine beliebige biologisch wirksame Verbindung kann als die biologisch wirksame Verbindung verwendet werden.
Die Bezeichnung „biologisch wirksame Verbindung oder Material" bezeichnet, wie hierin verwendet, ein organisches Molekül, einschließlich ein Arzneimittel, ein biologisches Makromolekül wie beispielsweise ein Peptid, Protein, Kohlenhydrat (einschließlich Monosaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide), Nukleoprotein, Mukoprotein, Lipoprotein, synthetisches Polypeptid oder Protein oder ein an ein Protein geknüpftes kleines Molekül, Glycoprotein, Steroid, Nukleinsäure (beliebige Form von DNA, einschließlich cDNA oder RNA oder ein Fragment davon), Nukleotid, Nukleosid, Oligonukleotide (einschließlich antisense-Oligonukleotide, Gen, Lipid, Hormon, Vitamin, einschließlich Vitamin C und Vitamin E oder eine Kombination davon, die eine biologische Wirkung hervorruft, wenn sie in vivo einem Tier verabreicht wird, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Vögel und Säuger, einschließlich Menschen.
Die Bezeichnung „Arzneimittel" betrifft wie hierin verwendet eine beliebige Substanz, die innerlich oder äußerlich als Medizin für die Behandlung, Heilung oder Vorbeugung einer Erkrankung oder Störung verwendet wird und beinhaltet, ist aber nicht begrenzt auf, Immunsuppressoren, Antioxidanzien, Anästhetika, chemotherapeutische Mittel, Steroide (einschließlich Retinoide), Hormone, Antibiotika, antivirale Mittel, Antimykotika, antiproliferative Mittel, Antihistamine, Antikoagulanzien, Anti-Photoalterungsmittel, melanotrope Peptide, nicht-steroide und steroide antiinflammatorische Verbindungen und Strahlungsabsorber, einschließlich UV-Absorber.
Die Bezeichnung „biologisch wirksames Mittel" beinhaltet auch Mittel wie beispielsweise Insektizide, Pestizide, Fungizide, Rodentizide, und Pflanzennährstoffe und Wachstumsförderungsmittel.
Biologische Makromoleküle, die vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von zwei- oder dreitausend bis zu vielen Millionen aufweisen, sind wichtige Regulatoren physiologischer Funktionen. Größe und Tertiärstruktur eines biologisch wirksamen Makromoleküls übermitteln signifikante chemische Informationen durch hochspezifische Wechselwirkungen mit Rezeptoren, Enzymen, Nukleinsäuren oder anderen biologischen Mediatoren, mit denen es wechselwirkt. Sogar so unterschiedliche Ereignisse wie Thrombose, Entzündung und Immunantworten werden zumindest teilweise durch die dreidimensionale Topologie von Makromolekülen kontrolliert. Die Oberfläche des Makromoleküls ist aus geometrisch verteilten Gruppen zusammengesetzt, welche dem Molekül ionische, hydrophobe, sterische, elektrostatische und Wasserstoffbindungs-Eigenschaften verleihen und die molekulare Matrix für eine Rezeptorbindung darstellen.
Saure Mukopolysaccharide, die auch als Glycosaminglycane (GAG) bezeichnet werden, bestehen aus wiederkehrenden Disaccharid-Einheiten, von denen jede ein Derivat einer Aminohexose, üblicherweise D-Glucosamin oder D-Galactosamin, enthält. Zumindest eine der beiden Zucker in der wiederkehrenden Disaccharideinheit von sauren Mukopolysacchariden enthält eine saure Gruppe mit einer negativen Ladung bei pH 7, entweder eine Carbonsäure- oder eine Sulfatgruppe. Ein wichtiges saures Mukopolysaccharid ist Heparin, welches durch bestimmte Arten von Zellen erzeugt wird, die besonders reichlich in der Auskleidung arterieller Blutgefäße vorkommen. Heparin ist ein sehr wirkungsvoller Blutgerinnungshemmer und trägt dazu bei, die Bildung von Blutgerinseln im Blutkreislauf zu verhindern (Jackson, R. L., et al., Physiol. Reviews 71 (1991) 481–522).
Es ist bekannt, dass GAG ein Mediator zellulärer Prozesse (Angiogenese, Nervenzellentwicklung, Proliferation von glatten Muskelzellen), Genexpression und Homöostase ist. GAG wechselwirkt mit DNA (Davidson, J. N., in „The biochemistry of the nucleic acids", Methuem, London, 1969).
Sowohl DNA als auch GAG (beispielsweise Heparin) sind lineare Polymere, die polyanionische Ladungen tragen, welche für die biologische Wirkung essentiell sind. Die Rigidität der DNA-Helix gewährleistet, dass die spezifisch sequenzierten Nukleinsäuren präsentiert werden, um so eine gewünschte biologische Wechselwirkung zu erhalten.
Proteine sind die in Zellen am reichlichsten vorhandenen Makromoleküle und machen mehr als die Hälfte ihres Trockengewichts aus. Es ist bekannt, dass Proteine und Peptide in ihren Tertiärstrukturen chemische Informationen tragen. Zahlreiche in der Natur vorkommende Proteine sind an andere chemische Gruppen konjugiert. Beispiele sind Lipoproteine, Glycoproteine, Phosphorproteine, Hämoproteine, Flavoproteine und Metalloproteine.
Proteine besitzen unterschiedliche biologische Funktionen. Nicht einschränkende Beispiele sind Transportproteine (z.B. Hämoglobin und Serumalbumin), Nährstoff- und Speicherproteine (beispielsweise Gliadin, Ovalbumin, Casein und Ferritin); kontraktile oder motile Proteine (z.B. Actin, Myosin, Tubulin und Dynein); Strukturproteine (zum Beispiel Keratin, Fibroin, Collagen, Elastin und Proteoglycane); Verteidigungsproteine (zum Beispiel Antikörper, Immunglobuline, Fibrinogen, Thrombin, Botulinumtoxin, Diphtheriatoxin, Schlangengift und Ricin); Enzyme und regulatorische Proteine (z.B. Insulin, Wachstumshormon, Corticotropin und Repressoren).
Hormone werden klassifiziert als Peptidhormone wie beispielsweise Thyrotropin-freisetzender Faktor, Corticotropin, Vasopressin, Insulin und Glucagon; Aminhormone wie beispielsweise Adrenalin und Thyroxin; oder Steroidhormone wie beispielsweise Cortisol, Beta-Östradiol, Testosteron und Progesteron). Weitere Beispiele wichtiger Hormone beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Adrenocorticotropin-freisetzendes Hormon, Somatotropin-freisetzendes Hormon, Somatostatin, Prolactin-freisetzendes Hormon, Prolactin-inhibitorisches Hormon, FSH- und LH-freisetzendes Hormon, Vasopressin und Oxytocin.
Therapeutische biologisch wirksame Verbindungen können auch ausgewählt werden aus der allgemeinen Gruppe bestehend aus antineoplastischen Mitteln, antiinfektiven Mitteln, Antidepressiva, antiviralen Mitteln, antinozizeptiven Mitteln, Anxiolytika und Hormonen.
Repräsentative Beispiele für antineoplastische Mittel, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Methotrexat, Taxol, Tumornekrosefaktor, Chlorambucil, Interleukine, Bleomycin, Etoposid, Fluoruracil und Vinblastin.
Repräsentative Beispiele für antiinfektive Mittel, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Pentamidin, Metronidazol, Penicillin, Cephalexin, Tetracyclin und Chloramphenicol.
Repräsentative Beispiele für antivirale Mittel, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Didesoxycytidin, Zidovudin, Acyclovir, Interferone, Didesoxyinosin und Ganciclovir.
Repräsentative Beispiele für Anxiolytica und Seditiva, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Benzodiazepine, wie beispielsweise Diazepam, Barbiturate, wie beispielsweise Phenobarbital, und andere Verbindungen, wie beispielsweise Buspiron und Haloperidol.
Repräsentative Beispiele für Hormone, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Östradiol, Prednison, Insulin, Wachstumshormon, Erythropoietin und Prostaglandine.
Repräsentative Beispiele für Antidepressiva, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Fluoxetin, Trazodon, Imipramin und Doxepin.
Repräsentative Beispiele für Antinozizeptiva, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich sind, beinhalten Hydromorphin, Oxycodon, Fentanyl, Morphin und Meperidin.
Die Liste der oben beschriebenen therapeutischen biologisch wirksamen Verbindungen ist nur beispielhaft und soll den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken. Viele andere Klassen von pharmakologischen Verbindungen wären in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren nützlich, einschließlich lokaler Anästhetika, Vitamine, Vakzine, Wundheilungsstimulanzien, Immunsuppressiva, Antiemetika, Antimalaria-Mittel, Antimykotika, Antipsychotika, Antipyretika, Koagulanzien, Diuretica, Calciumkanalblocker, bronchodilatorische Mittel etc.
Die biologisch wirksamen Verbindungen können an die Polypeptid-Linkergruppen gemäß im Fachbereich bekannter Verfahren geknüpft werden, beispielsweise durch chemische Kopplung über reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino- oder Carboxylgruppen. Solche Verfahren sind beispielsweise in Mattson et al., Mol. Biol. Rep. 17 (1993) 167–183 beschrieben.
Wenn die biologisch wirksame Verbindung ein Polypeptid ist, so ist es auch möglich, die Nukleinsäure, welche die Sequenz der ersten oder zweiten Polypeptid-Linkergruppe und die Sequenz eines oder mehrerer Polypeptide, bei denen es sich um die biologisch wirksamen Verbindungen handelt, enthält, zu erzeugen, sie auf rekombinante Weise in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen zu exprimieren, die rekombinanten Polypeptide zu gewinnen und sie erfindungsgemäß miteinander zu verknüpfen.
Es ist besonders bevorzugt, chimäre Polypeptide zu erzeugen, in deren die biologisch wirksamen Verbindungen zwei verschiedene Antikörper oder Antikörperfragmente sind (Fab-, Fc, Fv-Fragmente) oder in denen eine biologisch wirksame Verbindung ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist und die andere ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität, wie Kinasen, Phosphatasen, RNasen, Toxine oder mit spezifischen Bindungswirkungen, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren, ist.
Es ist ferner bevorzugt, als eine erste biologisch wirksame Verbindung eine Substanz zu verwenden, die spezifisch an Zelloberflächen bindet, während die andere biologisch wirksame Verbindung eine pharmazeutisch wirksame Verbindung ist, die ihre therapeutische Wirkung an dieser Stelle entwickeln soll. In diesem Zusammenhang ist beispielsweise die erste biologisch wirksame Verbindung ein Ligand für ein Zelloberflächenmolekül, wie beispielsweise CD40 oder CD40L (CD154), und eine zweite biologisch wirksame Verbindung ist eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, wie beispielsweise eine antisense-Nukleinsäure oder eine zytostatische Verbindung.
Weitere Beispiele einer therapeutischen Verwendung wären ein tumorspezifischer Antikörper als erste biologisch wirksame Verbindung und eine zweite biologisch wirksame Verbindung, welche Pseudomonas Exotoxin, Diphtheriatoxin, Transkriptionsfaktoren, welche die p53-Produktion aktivieren oder andere Apoptose-induzierende Faktoren umfasst.
Eine weitere Kombination biologisch wirksamer Verbindungen könnte die Assoziation der gp120-HIV-Bindungsdomäne von CD4 und eines beliebigen antiviralen oder cytotoxischen Arzneimittels sein, welches in der Lage ist, die Virusreifung zu blockieren oder die infizierte Zelle abzutöten.
Nicht nur bifunktionale, sondern multifunktionale Oligomere könnten durch die Erfindung erzeugt werden, wobei als eine Verbindung (nicht notwendigerweise biologisch aktiv) ein multivalentes System verwendet wird, welches die covalente Assoziation verschiedener biologisch wirksamer Verbindungen über polyionische Wechselwirkungen und eine Disulfidbrücke erlaubt. Beispielsweise könnte ein Virusmantel, der verschiedene polyionische Peptidsequenzen auf der Oberfläche zeigt, als eine solche multivalente Matrix dienen.
Erfindungsgemäß werden Nukleinsäuren, welche die beiden Polypeptid-Linkergruppen, die an ein biologisch wirksames Polypeptid geknüpft sind kodieren, in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle simultan oder separat exprimiert, die Polypeptide werden aus der Wirtszelle oder dem Überstand gewonnen, mit einem Oxidationsmittel behandelt, um die Disulfidbrücken zu bilden und das chimäre Polypeptid wird isoliert. Solche „Naturierungsverfahren" sind beispielsweise in US-Patent 4,933,434, Seite 453, 363, und in US-Patent 5,593,865 beschrieben.
Gemäß der Erfindung werden in dem ersten Schritt die erste und die zweite Polypeptid-Linkergruppe über ionische Wechselwirkungen bei neutralem oder schwach basischem pH-Wert (vorzugsweise pH 7 bis 8,5) und bei geringer Ionenstärke (vorzugsweise 0 bis 200 mmol/l NaCl) gekoppelt. In dem zweiten Schritt werden die Polypeptid-Linkergruppen entweder direkt kovalent über die Disulfidbrücke verknüpft, wobei ein gemischtes Disulfid gebildet wird, und die beiden Polypeptid-Linkergruppen werden über Disulfidbrücken unter oxidierenden oder schwach reduzierenden Bedingungen miteinander verknüpft. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird GSH in Kombination mit GSSG verwendet, wobei das Verhältnis GSH:GSSG von 5:1 bis 1:5 beträgt, bei neutralem oder schwach basischem pH-Wert.
Beschreibung der Figuren
1: Bildung des Disulfit-gebundenen Heterodimers ACE8-ACK8 in Abhängigkeit von der NaCl-Konzentration in dem Puffer. Die relativen Mengen an ACK8 (
), dem gemischten Disulfid zwischen ACK8 und GSSG (ACK8-SG, (∎) und dem Disulfid-verknüpften Heterodimer ACE8-ACK8 (•) sind gezeigt.
2: Bildung des Disulfid-gebundenen Heterodimers ACE8-ACK8 in Abhängigkeit von dem Redoxpotenzial des Puffers. Die Menge an Heterodimer ACE8-ACK8 (•) und nicht-umgewandeltem Peptid ACK8 (∎) sind angegeben.
3: Die Bildung des Disulfid-gebundenen Heterodimers ACE8-ACK8 in Abhängigkeit von einem zehnfachen molaren Überschuss eines Cystein-enthaltenden Laminin-Peptids bzw. α-Glucosidase wird analysiert. Die Kompetition wird in Puffern mit zwei verschiedenen Redoxsystemen durchgeführt.
4: Coomassie-angefärbtes SDS-PAGE (18%) unter reduzierenden Bedingungen als Anzeichen einer gerichteten Assoziierung von VLPs mit ds Fvs; Bahnen: (1) ds Fv dissoziiert in VH und VL; (2) Assoziationsreaktion zwischen Wildtyp-VLPs und ds Fv in Gegenwart von 200 mM NaCl; (3) Assoziationsreaktion zwischen VLPs, aufgebaut aus VP1-Glu und ds Fv, in Gegenwart von 750 mM Ammoniumsulphat; (4) Assoziationsreaktion zwischen VLPs, aufgebaut aus VP1-Glu und ds Fv, in Gegenwart von 200 mM NaCl; (5) Molekulargewichtsmarker.
5: Elutionsprofile der Assoziationsreaktion von FabD10SCP und α-Glucosidase R10CGP bei geringer Ionenstärke (TosoHaas TSK 2000 SWXL; 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH 7,0; 300 mM NaCl; Fließrate 0,75 ml/min; Säulenvolumen: 14,335 ml). Die Ergebnisse des Bifunktionalitätsassays (modifizierter ELISA), die nur Moleküle mit sowohl th Fab als auch α-Glucosidase detektieren, sind gezeigt. 100 μl Aliquote der eluierten Fraktionen wurden mit 1 ml biotinylierter Kreatinkinase-Lösung (5% Blockierungsreagenzien) in Streptavidin-beschichteten Röhren für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert; nach zweimaligem Waschen mit stark salzhaltigem Puffer (2 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH 7,5) und einmaligem Waschen mit wenig salzhaltigem Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5) wurden die Röhren mit 800 μl 2 mM Paranitroglucopyranosid in 100 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 6,8 bei 30°C für 3 Stunden inkubiert; die Adsorption wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm gegen eine Referenz gemessen. Die hochmolekulargewichtige Fraktion, welche das chimäre Protein enthält, zeigt die stärkste bifunktionale Aktivität. Das Vorhandensein von nicht-assoziierter α-Glucosidase führt zu einem geringen Hintergrundsignal.
Beispiel 1
Spezifische Assoziation und kovalente Verknüpfung von polyionischen Peptiden
a) Assoziation und Verknüpfung
Die spezifische Assoziation und kovalente Verknüpfung von Peptiden über polyionische Wechselwirkungen und eine Disulfidbindung wurde analysiert unter Verwendung der polyionischen Peptide (SEQ ID NO: 1) AlaCysGluGluGluGluGluGluGluGlu (ACE₈) und (SEQ ID NO: 2) AlyCysLysLysLysLysLysLysLysLys (ACK₈). Alle Peptide. wurden an einem ABI Applied Biosystem-Peptidsynthesizer 431A mittels des Fmoc-Verfahrens synthetisiert. 1 mM Peptid wurde in 20 mM Natriumborat pH 8,5, 2 mM EDTA gelöst (Konzentration überprüft gemäß Ellman, G. L., Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959) 70–77).
Die Bildung von Dilsufid-gebundenen Heterodimeren wurde durch Kationenaustauschchromatographie analysiert. Proben wurden auf eine POROs 20 HS-Säule aufgebracht (Säulenvolumen 1,7 ml, äquilibriert in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0). Die Elution wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten zwischen 0 und 2 M bei einer Fließrate von 4 ml/min durchgeführt. Das Peptid ACK8 eluierte bei 1070 mM NaCl, das gemischte Disulfid von ACK8 und Glutathion (ACK8-SG) bei 800 mM NaCl und das Disulfid-gebundene Heterodimer ACK8-ACE8 bei 350 mM NaCl. ACE8 band nicht an die Säule. Die Menge der Peptide wurde durch Integration der Peakflächen der Absorption bei 205 nm quantitativ bestimmt (Pharmacia Unikorn Software).
Die Spezifität der Assoziation der Peptide ACK8 und ACE8 wurde in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern gemessen:

b) Einfluss der Ionenstärke
c) Signifikanz des Redoxpotenzials für die Bildung der Disulfidbindung zwischen den Peptiden
d) Kompetition der Assoziation unter Verwendung ungeladener Cystein-enthaltender Peptide und Proteine

b) Einfluss der Ionenstärke (NaCl-Konzentration) auf die Bildung von Disulfidbindungen zwischen ACE8 und ACK8
200 μM ACK8 wurden in die gemischte Disulfidform ACK8-SG umgewandelt, unter Verwendung von 10 mM GSSG in einem Puffer 500 mM Natriumborat pH 8,5. Das gemischte Disulfid wurde durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die spezifische Assoziation und Redoxreaktion von 20 μM ACE8 und dem gemischten Disulfid ACK8-SG wurde in 20 mM Natriumborat pH 8,5, 2 mM EDTA, 25°C in Gegenwart von NaCl bei einer Konzentration zwischen 0 und 1 M durchgeführt. Nach einer Inkubation für 30 Min wurde die weitere Redoxreaktion durch Zugabe von 20 mM Iodacetamid geblockt. Die Analysen der Heterodimerbildung wurden durch Kationenaustauschchromatographie wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Das Disulfid-gebundene Heterodimer ACK8-ACE8 wurde bei NaCl-Konzentrationen unterhalb 200 mM quantitativ gebildet. Bei höheren Salzkonzentrationen wurde die polyionische Wechselwirkung zwischen den Peptiden unterdrückt, was zu geringeren Ausbeuten an Heterodimerbildung führt.
c) Abhängigkeit der Disulfidbindung zwischen ACE8 und ACK8 von dem Redoxpotenzial
50 μM ACK8 und 75 μM ACE8 wurden in 100 mM Natriumphosphat pH 8,5, 2 mM EDTA bei 25°C in Gegenwart von 2,5 mM Redoxsubstanzen (GSH und GSSG) inkubiert. Das Redoxpotenzial des Puffers wurde variiert, indem das Verhältnis von GSH und GSSG verändert wurde. Nach 5 Stunden Inkubation wurde die Reaktion angehalten, indem 100 mM Iodacetamid zugegeben wurde und es wurde wie zuvor beschrieben analysiert.
Eine spezifische Assoziation und kovalente Verknüpfung der Peptide ACE8 und ACK8 trat selbst unter reduzierenden Bedingungen auf. Die Bildung des Heterodimers ACE8-ACK8 war quantitativ bei Redoxbedingungen von GSH²/GSSG = 1:1 (mM).
d) Kompetition der Disulfidbindungsbildung zwischen ACK8 und ACE8
Die Spezifität der Disulfidbindungsbildung zwischen ACE8 und ACK8 wurde unter Verwendung eines Kompetitionsansatzes analysiert. 25 μM ACK8 und 37,5 μM ACE8 wurden in 100 mM Natriumborat pH 8,5, 2 mM EDTA, 0,5 mM GSH, 2 mM GSSG in Gegenwart von 250 μM Lamininnonapeptid (Sequenz: CysAspProGlyTyrIleGlySerArg, SEQ ID NO: 3) inkubiert. In einem weiteren Experiment wurde das Redoxpotenzial des Puffers erzeugt durch 1,65 mM GSH und 0,85 mM GSSG. Als Kontrolle wurden die selben Experimente in Abwesenheit des Lamininpeptids durchgeführt. Nach 2 Stunden Inkubation wurde die Reaktion durch Ansäuern (pH 2) geblockt und die Produkte wurden durch RP-HPLC analysiert. Die Menge an heterodimerem ACE8-ACK8 in den Kontrollen wurde auf 100% gesetzt und die Ausbeute der Heterodimerbildung in den Kompetitionsexperimenten wurde analysiert.
Als zweiter Kompetitor wurde α-Glucosidase (68,1 kDa) verwendet. Dieses Protein enthält 5 Cysteine, die für niedermolekulargewichtige Thiolreagenzien zugänglich sind. 25 μM ACK8 und 37,5 μM ACE8 wurden in Natriumborat pH 8,5, 2 mM EDTA in Gegenwart von 60 μM α-Glucosidase inkubiert. Die beiden unterschiedlichen Redoxbedingungen waren identisch zu den zuvor beschriebenen Bedingungen. Die Analysen wurden durch RP-HPLC durchgeführt.
Die Bildung von heterodimeren und kovalent verknüpftem ACE8-ACK8 wurde durch Zugabe eines Überschusses an Lamininpeptid bzw. α-Glucosidase nicht beeinflusst. Auf Basis der polyionischen Wechselwirkungen zwischen ACE8 und ACK8 ist die Dimerisierung dieser Peptide zu ACE8-ACK8 hoch spezifisch.
Beispiel 2
Bildung eines chimären Oligomers, bestehend aus einem Fab-Fragment und α-Glucosidase aus Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung polyionischer Fusionspeptide
Die Antigenbindungsaktivität des Fab-Fragments von MAb33 wird mit der enzymatischen Aktivität von α-Glucosidase kombiniert, unter Verwendung polyionischer Fusionspeptide, was zu der Bildung eines bifunktionalen Antikörperderivats (chimären Polypeptids) führt.
Das Fab-Fragment von MAb33 wurde genetisch modifiziert, so dass es ein negativ geladenes Fusionspeptid mit einem zusätzlichen Cysteinrest an seinem C-Terminus enthält: AspAspAsp-AspAspAspAspAspAspAspSerCysPro (abgekürzt als D₁₀SCP, SEQ ID NO: 4). Die zweite Polypeptidkette ist ein Derivat von α-Glucosidase PI aus Saccharomyces cerevisiae, welche ein positiv geladenes C-terminales Fusionspeptid (ArgArgArgArgArgArgArgArgArgArgCysGlyPro (abgekürzt als R₁₀CGP, SEQ ID NO: 5) trägt.
Die Bildung des chimären Proteins beinhaltet die folgenden Schritte:

I. Herstellung eines Fab-Fragments mit einem C-terminalen polyionischen Fusionspeptid
a) Erzeugung der Expressionsvektoren
b) Expression in E. coli, Isolierung von Inclusion Bodies, Solubilisierung und Renaturierung
c) Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie
II. Herstellung von α-Glucosidase mit C-terminalem polyionischem Fusionspeptid
a) Erzeugung des Expressionsvektors
b) Expression in E. coli in löslicher Form
c) Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie
III. Bildung eines Disulfid-verknüpften Proteins, vermittelt durch polyionische Fusionspeptide

I. Herstellung eines Fab-Fragments mit einem C-terminalen polyionischen Fusionspeptid
a) Erzeugung der Expressionsvektoren
Das Fab-Fragment von mAb (monoklonaler Antikörper) 33 wurde als ein Teil des chimären Proteins verwendet. MAb 33 ist ein muriner Antikörper der Unterklasse klgG1, gerichtet gegen die dimere muskelspezifische humane Kreatinkinase (CK-MM E. C. 2.7.3.2.) (Buckel et al., Gene 51 (1987) 13). Das Fab-Fragment von mAb 33 enthält eine Disulfidbindung zwischen der leichten Kette k (25 kD) und der schweren Kette fd (25 kD).
a1) Erzeugung eines die leichte Kette kodierenden Plasmids (Kappa)
Die leichte Kette von mAb 33 wurde auf Plasmid pBT111 kodiert, welches ein Derivat des Plasmids pBR223-3 ist. Die Sequenz- und Klonierungsstrategie ist in EP 0 364 926 B1 beschrieben. Für die Expression wurde das Plasmid in E. coli-Wirtszellen, welche das Plasmid pUBS520 enthalten, transformiert (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109–114).
a2) Erzeugung von Plasmiden, welche ein Fusionsprotein der schweren Kette mit einer C-terminalen polyionischen Peptidsequenz kodieren
Die Vektorerzeugung begann mit einem Plasmid p12016, welches die schwere Kette von mAb 33 kodiert (Buckel et al., Gene 51 (1987) 13). Die Nukleotidsequenzen, welche die Ch2- und Ch3-Domänen der schweren Kette kodieren, wurden deletiert und eine Nukleotidsequenz, welche ein polyionisches Peptid mit einem Cystein am C-Terminus kodiert wurde unter Verwendung von Primermutagenese an der ch1-Domäne addiert. Die Nukleotidsequenz enthält Hilfskodons an ihrem 5'-Ende, welche die fünf N-terminalen Aminosäurereste von β-Galactosidase (ITNSR) kodieren, um Proteinexpression in E. coli zu ermöglichen. Die für das fd-Fragment kodierende cDNA wurde mit den Primern 1 und 2 mittels PCR amplifiziert. An dem 5'-Ende wurde eine NdeI-Restriktionsstelle eingefügt. An dem 3'-Terminus wurden eine HindIII-Restriktionsstelle und die Nukleotidsequenz des polyionischen Peptids mit dem zusätzlichen Cystein eingefügt.
Die PCR wurde mit den folgenden Primern durchgeführt:
Vorwärtsprimer: N-terminal NdeI Fd (SEQ ID NO: 6):
5'-GCG TTA GCC ATA TGA CCA TGA TTA CGA ATT CCC GG-3'
Rückwärtsprimer der fdD₁₀SCP-Variante (SEQ ID NO: 7):
5'-CAT AGT CCC AAG CTT TTA CGG GCA AGA ATC ATC GTC ATC ATC ATC GTC GTC ATC ATC ACC ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3'
Das modifizierte cDNA-Fragment wurde in den Vektor pET-11a (Novagen) kloniert, der zu den T7-Expressionssystemen gehört (Studier, F. W., und Moffatt, B. A., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113): Für die Expression wurde der Vektor in Wirtszellen, welche das Plasmid pUBS520 enthalten, transformiert. Das Plasmid pUBS520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109–114) kodiert eine tRNA, die für die Translation der Kodons AGA und AGG, die in E. coli selten auftreten, notwendig ist.
b) Expression in E. coli, Isolierung von Inclusion Bodies, Solubilisierung und Renaturierung
Die Kulturen wurden auf Mineralsalzmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle bei 37°C in einem Maßstab von 5-Litern in einem Fermenter durchgeführt. Vier Stunden nach Induktion mit 0,4 mM IPTG wurden die Zellen durch Zentrifugation (5000 upm; 20 Min; 4°C) geerntet. Die Biomasse wurde bei –70°C gelagert. Das überexprimierte rekombinante Protein sammelte sich in Inclusion Bodies in dem bakteriellen Cytosol. Die Inclusion Bodies wurden isoliert gemäß Rudolph et al., Folding Proteins, In: T. E. Creighton (Hrsg.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996) und bei –20°C gelagert. Die Proteinaggregate wurden in 6 M Guanidinhydrochlorid (100 mM TRIS-HCL pH 8,5; 1 mM EDTA; 100 mM DTT) bei 4°C über Nacht solubilisiert. Der pH-Wert wurde auf 4,0 verringert unter Verwendung von 0,5 M HCl und nicht-solubilisiertes Material wurde durch Zentrifugation (20.000 upm; 30 Min; 4°C) abgetrennt. Die Lösung wurde ausgiebig dialysiert gegen 4 M Guanidin-Hydrochlorid pH 4,0, um Dithiothreitol zu entfernen. Die Proteinkonzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt unter Verwendung von authentisch denaturiertem reduzierten Fab-Fragment als Standard.
Das denaturierte Protein wurde 100-fach in Renaturierungspuffer (1 M Tris/HCl pH 8,0; 2 mM EDTA; 2,4 mM GSSG/0,6 mM GSH) auf eine Proteinendkonzentration von 10 μg/ml verdünnt. Die Renaturierung wurde in einem Maßstab von 10 Litern über 150 Stunden bei 15°C durchgeführt. Die Funktionalität der renaturierten Fab-Fragmente wurde durch ELISA untersucht gemäß Buchner, J., und Rudolph, R., Bio/Technology 9 (1991) 157. Die renaturierte Proteinlösung wurde zentrifugiert (13.000 upm; 30 Min; 4°C) um höher molekulare Aggregate zu entfernen, und der Überstand wurde durch Cross-Flow-Filtration (Tangenzialflussultrafiltration; ProVario-3-System; Filterkassette: Minisette OMEGA FSQ; Cut Off: 8 kD) aufkonzentriert. Das Retentat des Fab-Fragments mit dem Polyaspartatfusionspeptid (abgekürzt als FabD₁₀SCP) wurde gegen 20 mM Tris/HCl pH 8,0 dialysiert.
c) Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie
Das Fab-Fragment FabD₁₀SCP wurde durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Resource Q-Säule (Pharmacia; Säulenvolumen: 6 ml) gereinigt. Die Elution wurde in einem linearen Natriumchlorid-Gradienten von 0 bis 1 M in 20 mM Tris-HCl pH 8,0 über 20 Säulenvolumina bei einer Fließrate von 6 ml/min durchgeführt. FabD₁₀SCP eluierte bei einer NaCl-Konzentration von 300 mM. Das Dimer wurde effektiv von höher molekularen Disulfid-verbrückten fdD₁₀SCP-Ketten abgetrennt, die bei einer Natriumchloridkonzentration von 400 mM eluierten.
II. Herstellung von α-Glucosidase mit einer C-terminalen polyionischen Peptidsequenz
Wildtyp-α-Glucosidase aus Saccharomyces cerevisiae ist ein monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 68 kDa. Es enthält fünf Cysteine, die nicht an Disulfidbindungen beteiligt sind. In den vorliegenden Untersuchungen wurde ein Fusionsprotein genetisch erzeugt, welches aus α-Glucosidase PI und einem C-terminalen deca-Arginin Fusionspeptid mit einem zusätzlichen Cystein, Glycin und Prolin besteht.
a) Erzeugung des Expressionsvektors
Der Vektor pKK177-3/GlucPI, der von Kopetzki et al., Mol. Gen. Genet. 216 (1989) 149, beschrieben wurde, kodiert die α-Glucosidase PI aus Saccharomyces cerevisiae. Der Expressionsvektor ist ein Derivat von pKK223-3 (Brosius, J., und Holy, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6929), welches einen Tac-Promotor und ein β-Lactamasegen enthält. Der Vektor wurde so modifiziert, dass er eine einzelne EcoRI-Restriktionsstelle an Position 1600 des α-Glucosidasegens enthält. Das Fusionspeptid, welches zehn Argininreste, einen Cystein-, einen Glycin- und einen Prolinrest kodiert, wurde an dem C-Terminus durch Primermutagenese unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardtechniken insertiert. Die PCR wurde unter Verwendung der folgenden Primersequenzen durchgeführt:
Vorwärtsprimer EcoRI1600: (SEQ ID NO: 8)
5'-CAT AAG AGT ACG GAG ACA AGA CGC TGT TTG C-3'
Rückwärtsprimer R10CGP: (SEQ ID NO: 9)
5'-AAA CAG AAG CTT ATT ATG GTC CAC ATC GAC GTC GAC GAC GCC GGC GAC GTC GGC GTT TGA CCA GGT AGA TTC TAC C-3'
Nach dem Verdau des Vektors und der PCR-Produkte mit EcoRI und HindIII wurden sie ligiert.
b) Expression in E. coli in löslicher Form
Für die Expression wurde der Vektor in E. coli C600 (Appleyard, R. K., Genetics 39 (1954) 440) pFDX500 (LacI^q in pACYC177 (Chang, A. C. Y. und Cohen, S. N., J. Bacteriol. 134 (1978) 1141) transformiert. Kultivierung und Induktion wurden gemäß Kopetzki et al., Mol. Gen. Genet. 216 (1989) 149 durchgeführt. Die Zellen wurden auf Luria Broth (LB)- Medium, ergänzt mit 2% Glucose, bei 37°C inkubiert. Für die Induktion wurde der pH-Wert mit Phosphorsäure (3 M) von 7,0 auf 5,0 verringert, und die Temperatur wurde auf 24°C erniedrigt. In Kombination mit der begrenzten Induktion in Gegenwart von 0,5% Lactose sammelte sich α-Glucosidase überwiegend in löslicher Form in dem Cytosol an. Sechs Stunden nach Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (5000 upm; 4°C; 10 Min) und in 10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 6,8; 10 mM EDTA gewaschen. Die Biomasse wurde bei –20°C gelagert.
10 g Biomasse wurden in 50 ml Puffer (10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 6,8; 10 mM EDTA) resuspendiert. Die Zellen wurden durch Hochdruckhomogenisierung (Gaulin MicronLab 40; 1200 bar; 2 Durchgänge) zerstört. Anschließend wurde das rohe Extrakt in Gegenwart von 15 mM MgCl₂ und 1 U/ml Benzonase (Merck, Darmstadt) bei 4°C für zwei Stunden inkubiert. Unlösliche Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (20.000 upm; 4°C; 2 h) entfernt.
c) Reinigung durch Kationenaustauschchromatographie
Der Überstand des rohen Extrakts wurde durch Kationenaustauschchromatographie an einer Resource S-Säule (Pharmacia; 6 ml) gereinigt. Die Proteinfraktion, welche α-Glucosidaseaktivität enthielt, eluierte bei einer NaCl-Konzentration von 350 mM in einem linearen Gradienten von 0 bis 500 mM NaCl (Puffer: 10 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 6,8; 10 mM EDTA) über 20 Säulenvolumina bei einer Fließrate von 6 ml/min. Die enzymatische Aktivität wurde spektrophotometrisch gemäß Kopetzki et al., Yeast 5 (1989) 11, bei 405 nm und 30°C bestimmt mit 2 mM Para-nitrophenylglucopyranosid (PNPG) (Sigma) in 100 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄ pH 6,8 als künstlichem Substrat (Kopetzki et al., Yeast 5 (1989) 11).
III. Bildung eines Disulfid-verknüpften chimären Proteins, vermittelt durch polyionische Fusionspeptide
Die Assoziation wurde in 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 2 mM EDTA in Gegenwart eines Redoxsystems durchgeführt. Oxidiertes und reduziertes Glutathion wurden in einem molaren Verhältnis von 10:1 mit einer Gesamtkonzentration von 2 mM (1,8 mM GSSG/0,2 mM GSH) durchgeführt. Die Polypeptide wurden in äquimolaren Mengen (3 μmol/l) bei 20°C für 48 Stunden inkubiert. Für die Analyse wurde die Reaktion mit Iodacetamid (Endkonzentration 20 mM in Tris-HCl pH 8,0) angehalten und die Proben wurden an einem 12%-igen SDS-PAGE unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Fab-enthaltende Bahnen wurden durch Immunblotting auf Nitrocellulose detektiert.
Alternativ wurden Reaktionsprodukte auf einer Gelfiltrationssäule (TSKgel 2000 SW_XL; TosoHaas) in einem 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄-Puffer, der 300 mM NaCl enthielt, bei einer Fließrate von 0,75 ml/min unter Verwendung einer Vision Workstation (BioCad Vision Station; Perseptive Biosystems) aufgetrennt.
200 μl der Assoziationsreaktion wurden in die Säule injiziert. Fraktionen wurden auf Antigenbindungsfunktionalität, Enzymaktivität und Bifunktionalität untersucht. Bifunktionalität wurde mit einem modifizierten ELISA-System nachgewiesen: Inkubation in Gegenwart von biotinylierter Kreatinkinase bei Raumtemperatur für eine Stunde in Streptavidin-beschichteten Röhren (Roche Diagnostics GmbH), gefolgt von zweimaligem Waschen mit Puffer mit hohem Salzgehalt (2 M NaCl; 10 mM Tris-HCl; pH 7,5) und einmaligem Waschen mit Puffer mit niedrigem Salzgehalt (10 mM Tris-HCl; pH 7,5) und Detektion bei 405 nm nach 3 Stunden Inkubation mit 2 mM pNPG in 100 mM K₂HPO₄/KH₂PO₄; pH 6,8 bei 30°C. Die Assoziationsreaktionen wurden in Abwesenheit und in Gegenwart von 500 mM NaCl durchgeführt. Die Assoziation der einzelnen Spezies wurde ebenfalls bei niedriger und hoher Ionenstärke untersucht. Als Kontrolle wurde FabD₁₀SPC mit α-Glucosidase-Wildtyp-Protein inkubiert.
Die einzelne Spezies, die allein inkubiert wurde, reagierte nicht zu einem höher molekularen Produkt, weder bei geringer noch bei hoher Ionenstärke. Außerdem reagierte FabD₁₀SPC nicht mit Wildtyp-α-Glucosidase. Die Reaktion von FabD₁₀SPC mit α-GlucosidaseR₁₀CGP in Abwesenheit von NaCl führte als einzige zu einem Produkt mit bifunktionaler Aktivität.
Beispiel 3
Spezifische Assoziation zwischen virusähnlichen Partikeln (VLPs) und einem Antikörperfragment, vermittelt durch polyionische Wechselwirkungen
Die kovalente Assoziierung von VLPs von Polyoma-Mantelprotein VP1 und Disulfid-verbrückten Fv-Fragmenten (ds Fv) von mAb B3 auf Basis von erzeugten polyionischen Peptidsequenzen ist ein weiteres Beispiel der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung beinhaltet die Herstellung von VLPs, die Herstellung von ds Fv-Fragmenten und die anschließende Assoziation.

I) Herstellung von VLPs
a) Insertion eines polyionischen Peptids in VP1 auf cDNA-Ebene und Expression in E. coli
b) Reinigung des löslichen (mutierten) Proteins VP1-Glu
c) In vitro-Verbindung von VP1-Glu zu VLPs
II) Herstellung von ds Fv
a) Expression von ds Fv mit einer polyionischen Peptidsequenz in E. coli
b) Isolierung von Inclusion Bodies (IBs) und Solubilisierung
c) Renaturierung und Reinigung von ds Fv mAb B3
III) Assoziation von VLPs mit ds Fvs vermittelt durch polyionische Wechselwirkungen und einer intramolekularen Disulfidbrücke

I) Herstellung von VLPs
a) Insertion eines polyionischen Peptids in VP1: Plasmiderzeugung und Expression in E. coli
Das Polyoma-Mantelprotein VP1 ist in der Lage, sich in vitro zu icosaedrischen VLPs anzuordnen (Salunke, D. M., et al. Cell 46 (1986) 895–904; Salunke, D. M., et al., Biophysical J. 56 (1989) 887–904). Das Plasmid pALVP1TAC (Leavitt, A. D., et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 12803–12809) kodiert das Wildtypprotein und ermöglicht die rekombinante Herstellung löslichen pentameren Proteins in E. coli. Auf Basis dieses Plasmids wurde eine polyionische Sequenz in die Lösungsmittel-ausgesetzte HI-Schleife auf der Oberfläche von VP1 insertiert (Stehle, T., et al., Structure 4 (1996) 165–182). Diese Sequenz besteht aus 8 Glutamaten und einem Cystein. Für die Klonierung des mutierten VP1 wurde die Sequenz GluGluGluGluGluGluGluGluCys (E₈C, SEQ ID NO: 10) zwischen die Aminosäuren Asn²⁹⁴und Tyr²⁹⁵ auf cDNA-Ebene insertiert mit dem ortsgerichteten QuickChange^TM-Mutagenesekit (Stratagene).
Für die Expression wurde das resultierende Plasmid, welches VP1-Glu kodiert, in Eco B transformiert. Der Expressionsstamm wurde auf Minimalsalzmedium bei 30°C in einem Maßstab von 5 Litern in einem Biostat-Fermenter (Braun) unter Verwendung der Fed-Batch-Technik kultiviert. Die rekombinante Expression von VP1-Glu wurde durch 0,4 mM IPTG induziert bei einer Zelldichte von OD₆₀₀ = 20. Sechs Stunden nach Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation (8000 g, 15 Min) geerntet und bei –70°C gelagert.
b) Reinigung des mutierten löslichen Proteins
Für die Herstellung von mutiertem VP1-Glu wurden 50 g Zellen in 500 ml Puffer A (50 mM Tris HCl; pH 7,4; 5% Glycerin; 2 mM EDTA; 200 mM NaCl; 4 mM DTT) resuspendiert. Celllyse wurde durch Hochdruckdispersion (Gaulin, 1200 Bar) in Gegenwart von 1 Einheit/ml Benzonase, 20 μg/ml RNase und 4 Tabletten Komplettprotease-Inhibitorcocktail (Roche Diagnostics GmbH, DE) durchgeführt. Das Lysat wurde für 30 Min mit 47.000 g zentrifugiert.
Der erste Reinigungs- und Aufkonzentrierungsschritt besteht aus einer fraktionierten Ammoniumsulphatpräzipitation zwischen 17,5% und 27,5% Salzsättigung. Das resuspendierte Protein wurde auf eine Anionenaustauschsäule (Poros 20 HQ) geladen. In einem linearen Gradienten von 200 mM zu 1 M NaCl in Puffer A etwa 30 Säulenvolumina eluierte VP1-Glu bei 500 mM NaCl als nahezu homogenes Protein. Anschließend wurde das Eluat bei 20°C für 20 Min mit 2,5 Einheiten/ml Benzonase und 20 mg/ml RNase in Gegenwart von 10 mM Magnesiumchlorid inkubiert. Anschließend wurde eine Größenausschlusschromatographie (Pharmacia Superdex 200 Prep Grade, in Puffer A) durchgeführt, um das pentamere VP1 von höher oligomerem und aggregiertem Material abzutrennen.
c) In vitro-Anordnung von VP1-Glu (leere virusähnliche Partikel – VLPs)
Für die Anordnung zu VLPs wurde das gereinigte pentamere VP1-Glu gegen Puffer B (20 mM Tris, pH 7,4; 0,75 M Ammoniumsulphat; 5% Glycerin; 1 mM CaCl2) für 2 Tage bei 15°C dialysiert. Unter diesen Bedingungen wird die Bildung von VLPs induziert. Um das Ammoniumsulphat zu entfernen, wurde die Lösung der VLPs gegen Puffer C (20 mM Tris, pH 7,4; 200 mM NaCl; 5% Glycerin; 1 mM CaCl2) für 1 Tag bei 15°C dialysiert und anschließend bei 4°C oder –20°C gelagert.
II) Herstellung von ds Fv
a) Expression von ds Fv mit einer polyionischen Peptidsequenz in E. coli
Auf Grundlage des Vektors pUli 39-1, welcher die cDNA der VL-Domäne gekoppelt an Pseudomonas Exotoxin kodiert, und des Vektors pYR 38-2, welcher die VH-Domäne kodiert (Reiter, Y., et al., Protein Engng. 12 (1995) 1323–1331), wurde ein Disulfid-stabilisiertes Fv-Fragment mit einem polyionischen Fusionspeptid erzeugt. Für diesen Zweck wurde ein Stopkodon zwischen die kodierende Sequenz von VL und den Toxinabschnitt eingefügt, so dass ein Expressionsvektor für die VL-Domäne von mAb B3 erzeugt wurde.
Die V_H-Domäne, welche auf dem Plasmid pYR 38-2 kodiert ist, wurde um eine polyionische Sequenz ArgArgArgArgArgArgArgArgCysPro (R₈CP, SEQ ID NO: 11) am C-Terminus verlängert. Diese Verlängerung wurde durch eine zweistufige Vorgehensweise unter Verwendung des ortsgerichteten QuickChange^TM-Mutagenesekits (Stratagene) erreicht. Zunächst wurde ein ArgArgArgArgCysPro-kodierendes Oligonukleotid in das 3'-Ende des V_H-Gens insertiert (Reiter, Y., et al., Protein Engng. 12 (1995) 1323–1331).
Um den Tag zu vervollständigen, welcher das R8CP-Peptid enthält, wurden vier weitere Argininreste durch eine zweite Mutagenese eingefügt.
b) Isolierung von IBs und Solubilisierung von IBs
Die V_H- und V_L-Domäne wurde separat in E. coli als Inclusion Bodies exprimiert. Die Herstellung von IBs wurde gemäß dem Verfahren von Rudolph et al. (Rudolph et al., Folding Proteins, In: T. E. Creighton (Hrsg.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996)) durchgeführt. Die IBs wurden bei –70°C gelagert. Die Solubilisierung von IBs wurde ebenfalls gemäß dem Verfahren von Rudolph et al. (Rudolph et al., Folding Proteins, In: T. E. Creighton (Hrsg.): Protein function: A Practical Approach, 57 (1996)) durchgeführt.
c) Renaturierung und Reinigung von ds Fv mAb B3
Der ds Fv mAb B3 wurde renaturiert durch gleichzeitige Verdünnung von solubilisierten V_H- und V_L-IBs in dem Faltungspuffer (100 mM Tris, pH 8,5; 1 mM EDTA; 0,5 M Arginin; 1 mM GSH; 1 mM GSSG). Die Renaturierung wurde bei einer Proteingesamtkonzentration von 30 μg/ml mit einem molaren Verhältnis von V_H:V_L = 5:1 durchgeführt. Das Renaturierungsgemisch wurde bei 10°C für 7 Tage inkubiert. Anschließend wurde aggregiertes Material durch Zentrifugation bei 47.000 g für 30 Min entfernt. Im Fall von korrekt gefaltetem Protein wurde eine intermolekulare Disulfidbrücke zwischen V_H und V_L gebildet. Das lösliche Renaturat wurde durch Tangenzialfluss (Vario-3-System Filtron; Minisette FSQ; Cut Off: 8 kDa) aufkonzentriert und der Puffer wurde ausgetauscht durch Puffer D (50 mM Tris; pH 7,5; 200 mM NaCl).
Die polykationische Sequenz an dem C-Terminus der V_H-Domäne erlaubte eine Reinigung von gefaltetem ds Fv durch Kationenaustauschchromatographie. Das renaturierte Protein wurde auf eine Poros20 HS-Säule geladen und mit einem linearen Gradienten von 0,2 zu 1 M NaCl in Puffer D eluiert. Das ds Fv eluiert als ein homogenes Protein bei 400 mM NaCl. Die Homogenität von ds Fv wurde mittels Gelfiltration gezeigt (Pharmacia Superdex 75), durchgeführt mit Puffer D und SDS PAGE.
III) Kovalente Assoziation von VLPs mit ds Fvs
Die gerichtete Assoziation von ds Fv und VLPs wurde in Puffer E (20 mM Tris; pH 7,4; 5% Glycerin; 1 mM CaCl₂; 37,5 μM GSSG) durchgeführt. Die verwendete VP1-Glu-Konzentration war 5 μM und die Konzentration an ds Fv war 2,5 μM. Die Reaktion wurde in Gegenwart von 0,2 M NaCl bzw. 0,75 M Ammoniumsulphat durchgeführt. Als Kontrolle wurde Wildtyp VP1 ohne polyionische Sequenz mit ds Fv in Gegenwart von 0,2 M NaCl vermischt. Die Reaktionsgemische wurden für 8 Stunden bei 20°C inkubiert und dann auf eine Gelfiltrationssäule (TosoHAAS TSK-Gel PW 6000 XL) aufgetragen, in Puffer E und 0,2 M NaCl äquilibriert. Fraktionen, welche VLPs enthalten, wurden in Natriumdesoxycholat präzipitiert und durch 18%-iges SDS PAGE (4) und Western Blot analysiert.
Nur in dem Gemisch mit 0,2 M NaCl und beiden polyionischen Proteinen VP1-Glu bzw. ds Fv B3 wurde eine Disulfidbrücke zwischen ds Fv und mutierten VLPs gebildet, unterstützt durch polyionische Wechselwirkungen zwischen den polyionischen Fusionspeptiden. In Gegenwart von 0,75 M Ammoniumsulfat wurden die polyionischen Wechselwirkungen unterdrückt und kein Disulfid gebildet. Ebenso waren in der Kontrollmischung keine intermolekularen Disulfidbrücken zwischen ds Fv und Wildtyp-VLPs nachweisbar. Diese Daten zeigen, dass polyionische Fusionspeptide eine Heterodimerisierung von Proteinen hervorrufen. In dem vorliegenden Beispiel verbleibt einer der Reaktionspartner, VP1-Glu, in einer multimeren Form, was nicht nur die Kopplung eines anderen funktionalen Proteins, sondern das Andocken verschiedener unterschiedlicher polyionischer getaggter Proteine möglich macht.
Literaturverzeichnis

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Bohlen, H. et al., Blood 82 (1993) 1803–1812
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptidischer linearer Linker für die Verknüpfung von biologisch wirksamen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker besteht aus: einer ersten Polypeptid-Linkergruppe, bestehend aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 basischen Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und Ornithin, und einer zweiten Polypeptid-Linkergruppe, bestehend aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 sauren Aminosäuren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Glutamat und Aspartat, wobei die erste und die zweite Gruppe durch ionische Wechselwirkung über ihre Vielzahl von geladenen Aminosäuren und durch kovalente Disulfid-Brücken zwischen ihren Cysteinen gebunden sind, wobei jede der Gruppen an ihrem C- oder N-Terminus mit einer biologisch wirksamen Verbindung verknüpft ist.
Peptidischer Linker nach Anspruch 1, worin die biologisch wirksamen Verbindungen, die mit der ersten und der zweiten Polypeptid-Linkergruppe verknüpft sind, sich durch ihre chemische Struktur voneinander unterscheiden.
Peptidischer Linker nach Anspruch 1 oder 2, worin die biologisch wirksame Verbindung ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment ist.
Verfahren zur Herstellung eines chimären Polypeptids, das aus zwei biologisch wirksamen Polypeptiden besteht, die über einen peptidischen Linker verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass a) in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle simultan oder separat Nukleinsäuren exprimiert werden, die codieren für aa) eine erste Gruppe des chimären Polypeptids, bestehend aus einem ersten biologisch wirksamen Polypeptid und einer ersten Polypeptid-Linkergruppe, die aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 basischen Aminosäuren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Lysin und Ornithin und ab) eine zweite Gruppe des chimären Polypeptids, bestehend aus einem zweiten biologisch wirksamen Polypeptid und einer zweiten Polypeptid-Linkergruppe, die aus 1 bis 3 Cysteinen und 4 bis 12 sauren Aminosäuren besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Glutamat und Aspartat, b) die erste und die zweite Gruppe des chimären Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem Zellüberstand gewonnen werden und zusammengebracht werden, um die Bildung einer polyionischen Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Polypeptid-Linkergruppe zu ermöglichen, c) das Produkt aus b) mit einem Oxidationsmittel behandelt wird, um Disulfid-Brücken zwischen den Polypeptid-Linkergruppen zu bilden, und d) das chimäre Polypeptid isoliert wird.