Aktive Fusionsproteine und Verfahren zu ihrer
Herstellung
Beschreibung-
Die Erfindung betrifft aktive Fusionsproteine, ein Verfahren zur Herstellung aktiver rekombinanter Proteine und die Verwendung dieser in der medizinischen Diagnostik und Therapie.
Eines der wichtigsten Ziele der Gentechnologie ist die Synthese und Reinigung von Proteinen klonierter Gene und insbesondere die Produktion therapeutisch wichtiger Proteine. Viele Proteine können bereits gentechnisch hergestellt werden, wie zum Beispiel Insulin, Interferone oder der Faktor VIII. Entscheidend für die biologische Aktivität der Proteine ist ihre korrekte Faltung.
Ursprünglich hatte man angenommen, dass die räumliche Anordnung eines Proteins dem Zustand der niedrigsten freien Energie entspricht und dass das Protein durch das Zufallsprinzip diesen Zustand der niedrigsten Energie einnimmt. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass solch ein Vorgang in den Zellen nicht abläuft .
Die Faltung eines Proteins wird primär durch seine
Aminosäuresequenz bestimmt, dennoch ist es nicht möglich bei bekannter Sequenz die Sekundär -und/oder Tertiärstruktur genau vorauszusagen.
In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche komplexe Faltungsmechanismen gefunden. So wurde entdeckt, dass bestimmte Proteine - wie Chaperone oder Foldasen - die
korrekte Faltung von Proteinen entweder unterstützen oder katalysieren.
Proteine falten sich in-vitro innerhalb weniger Sekunden. Da sich Proteine nicht nach dem Zufallsprinzip gemäß der niedrigsten freien Energie falten, muss es verschiedene Stoffwechselwege für die Faltung geben und es kann angenommen werden, dass die korrekte Faltung eines Proteins nicht zwingend die stabilste Faltung darstellt. Die Erforschung der Faltungskinetik ist nur bedingt möglich, da Zwischenstadien der Proteine bei der Faltung kaum isoliert betrachtet werden können.
Es wurden verschieden Möglichkeiten vorgeschlagen, um die biotechnologische Gewinnung korrekt gefalteter Proteine zu optimieren:
(i) Modifikation der Fermantationstechnik,
(ii) Austausch von Aminosäuren und
(iii) Änderung der intrazellulären Konzentration an Faltungsmodulatoren.
(i) Aus in-vitro Experimenten ist bekannt, dass bei der Rückfaltung denaturierter Proteine , eine niedrige Proteinkonzentration eine korrekte Faltung begünstigt . In- vivo wird dies so genutzt, dass die Überexpression nicht voll induziert wird, so dass die intrazelluläre Konzentration an rekombinanten Protein moderat ist.
Außerdem ist es möglich, durch Zusammenstellung des
Mediums, den pH-Wert, die Begasung oder die Stammwahl signifikanten Einfluss auf die Faltung zu nehmen. Auch eine Erhöhung des osmotischen Druckes, z.B. durch die Zugabe von
Polyolen, hat einen stabilisierenden Einfluss auf die Faltung des Proteins .
Weiterhin führt die Senkung der Wachstumstemperatur zu einem höheren Anteil an korrekt gefalteten Proteinen. So wurde die Produktion von 5-Lipoxygenase zunächst bei 37°C durchgeführt, durch eine Senkung auf 16°C konnte der Anteil korrekt gefalteter Proteine erhöht werden.
(ii) Die Änderung der Aminosäuresequenz führt zu - oftmals dramatischen - Änderungen der Faltung. Dies wurde beispielsweise für Interferon und Interleukin gezeigt.
(iii) Eine andere Möglichkeit besteht in der Fusion des Zielproteins mit einem Faltungsvermittler. Dazu gehören beispielsweise Thioredoxin, die Gluthation-S-Transferase, das Staphylococcus aureus-Protein A und das Maltose- Bindeprotein. Weiterhin ist der Einsatz von Hitzeschock- Proteinsystemen aus E. coli wie den Systemen DnaK-DnaJ-GrpE und GroEL-GroES bekannt. Diese Chaperone können in einem Co-Expressionssystem gleichzeitig mit dem Zielprotein exprimiert werden. Für TNF, das Wachstumshormon und die Dihydrofolatreduktase liegen als Zielprotein bereits Ergebnisse mit Co-exprimierenden Chaperonen vor.
Eine Besonderheit bei der Herstellung rekombinanter Proteine, insbesondere im Zusammenhang mit ihrer korrekten Faltung, ist die Bildung von Aggregaten (inclusion bodies, IB) . Die Bildung von IBs kann vorteilhaft sein, wenn die Zielproteine anfällig für proteolytische Vorgänge sind, da IBs von Proteasen kaum angegriffen werden oder wenn es das Ziel ist inaktive Proteine oder Proteine, die keine aktive Faltung benötigen, in großen Mengen herzustellen. Durch ihren denaturierten Zustand können IBs bei höheren Temperaturen und mit einer viel höheren Scherstressbelastung isoliert werden. Maßnahmen, mit denen
die in-vivo Faltung der Proteine verbessert werden kann, modifizieren auch die Bildung der IBs. IBs sind unlöslich und biologisch nicht aktiv. Zur Gewinnung von aktiven Proteinen müssen sie daher durch drastische Methoden denaturiert und anschließend - mit den oben genannten Methoden - in der korrekten Faltung renaturiert werden.
Diese Methoden der korrekten Faltung weisen jedoch mehrere Nachteile auf . Die Maßnahmen der Temperatursenkung reduzieren die Produktivität und garantieren die korrekte Faltung der Proteine nicht. Letztendlich muss für jedes Protein die Produktion individuell optimiert werden. Die Änderung der Aminosäuresequenz erfordert eine vorherige Bestimmung der Struktur und möglichst des Faltvorganges . Bei der Verwendung von Fusionsproteinen, kann es in Abhängigkeit vom Zielprotein, dazu kommen, dass die Fusionskonstrukte in schwer löslichen Proteinaggregaten ausfallen. Der Einsatz Co-exprimierenden Chaperonen ist sehr aufwendig und kostenintensiv; weiterhin benötigen die Proteine in diesen Systemen genügend Raum für ihre Faltung, speziell wenn Disulfid-Brücken gebildet werden müssen. Daher müssen die Proteine vor der Faltung oder Rückfaltung sehr stark verdünnt werden. Bei der Herstellung von rekombinanten Insulin bedeutet dies z.B., dass der Produktionsreaktor ein Volumen von 35 qm aufweist und der Rückfaltungskessel jedoch ein Volumen von 73 qm.
Aufgabe der Erfindung ist es daher korrekt oder aktiv gefaltete Proteinen bereitzustellen, die eine Struktur aufweisen, die eine hohe biologische Aktivität bedingt.
Die Erfindung löst dieses technische Problem durch Bereitstellung eines multimeren Fusionsproteins, umfassend ein Expressionsprotein und ein Phagenhüllproteinfragment, wobei das Phagenhüllproteinfragment eine Domäne Dl oder ein
funktionsanaloges Fragment dieser des pIII des filamentösen Bakteriophagen M13 ist.
Der filamentöse Bakteriophage M13 exprimiert an der Oberfläche Proteine, die mit römischen Ziffern fortlaufend nummeriert werden: beispielsweise pl, pH, pIII bis pIX. PIII ist ein Hüllprotein und bildet zusammen mit pVI den infektiösen Endbereich des Phagen. Die Hüllproteine bestehen aus unterschiedlichen Domänen. Das Protein pIII umfasst drei Domänen, Dl, D2 und D3. Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen das Dl enthaltenden Fusionsproteine aktiv gefaltete Strukturen, die Expressions- oder Zielproteine, bereitstellen und dass die das Dl enthalten erfindungsgemäßen Fusionsproteine Multimere bilden können, d.h. ohne das eine Interaktion mit D2 erforderlich ist. Dl im Sinne der Erfindung umfasst auch Proteine oder deren Fragmente, die eine ausreichende Homologie aufweisen, um zu einer natürlich vorkommenden Dl Domäne funktionsanalog zu sein und auch solche Proteine oder Peptide beziehungsweise Fragmente, die durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu Dl sind. Es war überraschend, dass Dl selbst miteinander interagiert und Multimere bindet. Man erhält über die Multimerisierung der Dl Domänen mehrere Fusionsproteine und insbesondere eine Erhöhung der Affinität aufgrund der Avidität, z.B. wenn die Expressionsproteine Fragmente von Antikörpern sind. Vorteile dieser Technologien im Hinblick auf multimere Fusionsproteine wird weiter unten detaillierter beschrieben. Die Erfindung zeigt den Vorteil des Dl als Fusionskomponente zum Expressionsprotein im Vergleich zu D1-D2 oder des gesamten pIII. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder -peptids sind weiterhin die geringere Größe und ihre Immunogenität .
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können Homo-Multimere oder Hetero-Multimere sein. Heterologe multimere Fusionsproteine (Hetero-Multimere) umfassen dem gemäß zwei oder mehrere verschiedene Fusionsproteine .
Das Phagenhüllproteinfragment Dl oder sein funktionsanaloges Fragment können von dem Expressionsprotein im Fusionsprotein durch einen Linker getrennt werden. Dies kann vorteilhaft für die Aktivität und Multimerisierung des Fusionsproteins sein. Ein oder mehrere Linker können auch an anderen Stellen im Fusionsprotein vorkommen, beispielsweise zwischen einzelnen Domänen des Expressionsproteins wie im Beispiel von scFv oder zwischen dem Phagenhüllproteinfragment Dl oder seinem funktionsanalogem Fragment oder dem Expressionsprotein und weiteren Seuquenzen wie beispielswiese Tags (siehe unten) . Die Polypeptidlinker haben charakteristischerweise eine Länge von 1 bis 50 Aminosäuren. Wenn kein Linker vorhanden ist spricht man erfindungsgemäß auch von einem Linker der Länge 0.
Dies ermöglicht es insbesondere, gezielt mit Hilfe von Fusionsproteinen mit Dl als Partner zum Expressionsprotein aktive multimere Fusionsproteine herzustellen. Diese haben den Vorteil, dass sie bei Interaktion mit dem Bindungspartner des . Expressionsproteins eine erhöhte Bindungsstärke durch die hohe Avidität erreichen können. Durch die Anwesenheit von Dl bilden sich vor allem Tetramere Fusionsproteine aus, die eine besonders hohe Avidität erreichen. Die hohe Avidität ist beispielsweise bei Rezeptor-Liganden Interaktionen und für Antikδrperbindungen besonders vorteilhaft oder auch bei enzy atischen Reaktionen.
Erfindungsgemäß können als Expressionsprotein oder Expressionspeptid alle Proteine eingesetzt werden, die als
Zielstruktur ausgewählt wurden. So kann vorgesehen sein, multimere Antikörper bereitzustellen, indem insbesondere scFv als Expressionsproteine mit dem Dl als Fusionsprotein aktiv exprimiert ist . Verwendet man die gleichen scFv erhält man vorteilhafterweise ein meist höher affines, weil avides, Multimer aus Antikörperfragmenten, bevorzugt Tetramere. Diese sind für unterschiedliche an sich bekannte in vitro und in vivo Applikationen vorteilhaft, bei denen eine höhere Affinität/ Avidät Vorteile bringt. Beispielsweise bei immunologischen Testsystemen und Therapien. Bei Verwendung von unterschiedlichen scFv in Hetero-Multimeren ist es dabei einfach möglich bi- bzw- multispezifische Antikörper herzustellen, die eine Anwendung in den verschiedensten an sich bekannten in vivo und in vitro Applikationen haben, beispielsweise in biochemischen, immunologischen, immunohistochemischen, zellbiologischen Testsystemen, bevorzugterweise beispielsweise Immunhistologie, Immunocytochemie, ELISA, RIA, Westernblots, FACS Analysen, In vivo Radiodiagnostika, in vivo Radiotherapeutika, Immunpräzipitationen, zur Immunisierung und andere mehr. Die technologische Anwendung und die einzelnen Methoden ist dabei dem Fachmann bekannt oder ableitbar. Für diese Zwecke kann es vorteilhaft sein, die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle mit beispielsweise Fluoreszenzmolekülen, Radioisotopen oder anderen zum Nachweisegeeigneten Molekülen, wie beispielsweise Moleküle des Streptavidin-Biotin Systems, direkt zu markieren oder mit einem Tag markieren, der durch an sich bekannte sekundäre NachweisSysteme detektiert wird (s.u.). Hierfür können Spacer oder Chleatoren notwendig oder vorteilhaft sein. Die hierzu notwendigen Technologien sind dem Fachmann im Prinzip bekannt und können von ihm für die entsprechende Anwendung angepasst und/oder optimiert werden.
Es ist aber selbstverständlich auch möglich, als Expressionsprotein ein single-chain MHC Klasse Molekül zu verwenden. Die MHC Klasse Moleküle kommen durch die
Multimerisierung mit Vorteil zu einer höheren Valenz . Die gereinigten Single chain MHC Klasse Moleküle umfassende Fusionsproteine können dabei nach an sich bekannten Methoden mit Peptiden beladen werden oder in Form von single-chain Molekülen als MHC Klasse Molekül mit entsprechendem Peptid als Fusionsprotein exprimiert werden. Dabei können geeignete Linker verwendet werden. Solche MHC Klasse Multimere mit Peptiden lassen sich beispielsweise in einer Technologie analog der bekannten Tetramertechnologie zum Nachweis von spezifischen T Zellen verwenden. Die MHC Klasse Multimere mit den Peptiden können mit an sich bekannten Methoden beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden.
Weiterhin ist es beispielsweise möglich Enzymkomplexe bereitzustellen, bei denen mehrere Enzyme oder aktive Anteile von Enzymen zusammen in einem Homo- oder Hetero- Multimer gelagert werden. Der Vorteil in einem Homo- Multimer ist die Effizienzsteigerung durch die Konzentration der Enzyme. Mit Hilfe eines Hetero-Multimers können mehrere Enzyme räumlich nahe beieinander liegen. Dies ist vor allem dann vorteilhaft, wenn die unterschiedlichen Enzyme aus einer katalytischen Reihe entsprechen, wodurch es ermöglicht wird Reaktionsgleichgewichte aufgrund der räumlichen Nähe effizient zur Seite der Produktes zu verschieben und damit eine effiziente Katalyse in einem Mehrschritt Prozess zu erzeugen. In einer weiteren bevorzugten Form werden dabei in die multimeren Komplexe auch Substrate oder Zwischenprodukte, Stabilatoren oder andere Katalysatoren mit einbezogen um eine möglichst hohe Effizienz zu erreichen.
Die multimeren Fusionsproteine über das Dl ergeben die Möglichkeit hochaffine und hochaktive Multibodies zu konstruieren. Die Erfindung liefert ebenfalls die
Möglichkeit über das beschriebene Selektionssystem (s.u.) direkt Multimere in Ihrer Funktion zu gewinnen. Die multimeren Fusionsproteine können für die verschiednen Anwendungen durch Stabilisierung für bestimmte Anwendungen verbessert werden, bei denen ein möglichst stabiles Multimer erwünscht ist, beispielsweise von Multibodies. Hierfür gibt es aus dem Stand eine Reihe von bekannten Techniken. Insbesondere können die einzelnen Fusionsproteine des multimeren Fusionsproteins durch kovalente Vernetzung stabilisiert werden. Hierfür kommen eine Reihe von an sich bekannten chemischen, biochemischen und physikochemisehen Technologien in Betracht, beispielsweise Vernetzung durch Formaldehyd oder Glutaraldehyd, Vernetzung über Schwefelbrücken, . Carboxygruppen, Amidgruppen oder photochemische Aktivierungsmethoden. Kovalente Verbindungen werden bevorzugt über sogenannte Spacer-Moleküle hergestellt, die dem Fachmann an sich bekannt sind. In einer bevorzugten Variante werden zusätzliche spezielle Tags oder Mutationen, bespielsweise Cysteine oder Lysine, im Fusionsprotein eingeführt, die eine stabile Vernetzung erlauben oder begünstigen Dabei werden die einzelnen Techniken für die einzelnen Anwendungen nach an sich bekannten Methoden optimiert und angepasst . Das unten erläuterte Verfahren der Selektion kann dabei zu Hilfe gezogen werden, indem die Phagen, die die erfindungsgemäßen Fusionsproteine tragen nach der entsprechenden Stabilisierungsmethode behandelt werden und anschließend die Selektion erfolgt. Dabei werden nur solche Fusionsproteine über ihr mit dem Phagen verknüpftes genetisches Material identifiziert, die ihre Funktion nach der Stabilisierungsbehandlung behalten.
Bevorzugt wird zwischen dem Expressionsprotein und dem Dl des erfindungsgemäßen Fusionsproteins eine Spaltstelle eingefügt, die es ermöglicht das Expressionsprotein in Form eines aktiven Proteins von dem Anteil mit dem Dl zu spalten. Hierfür wird nach an sich bekannten Methoden eine
geeignete die Spaltstelle kodierende Nukleinsäuresequenz in die das Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure eingefügt . Das exprimierte Fusionsprotein wird entsprechend den oben beschriebenen Techniken isoliert und anschließend durch eine enzymatische, ribozymatische oder chemische Spaltung mit Spaltungsmolekülen abgespalten. Als Spaltungsmoleküle dienen dabei, in Verbindung mit einer geeigneten Spaltstelle, spezifische Enzyme oder chemische Moleküle, die das zu gewinnende aktive Protein nicht deaktivieren. In Tabelle 4 ist eine bevorzugte Auswahl von Spaltungsmolekülen mit einer entsprechend geeigneten Aminosäuresequenz aufgeführt. Selbstverständlich ist es weiterhin möglich, dass das Fusionsprotein mindestens einen weiteren Tag, beispielsweise einen His-Tag, der nach der Spaltung am Dl-Anteil verbleibt, umfasst. Die Spaltung wird dabei bevorzugt mit einem Enzym durchgeführt, das ebenfalls einen entsprechenden Tag trägt, beispielsweise den His-Tag. So ist in einem Schritt die Abtrennung der Spaltungsmoleküle und des Dl-Anteils von dem aktiven Protein möglich. Dies ist beispielsweise dann von Vorteil, wenn das zu gewinnende aktive Protein ohne den Tag bevorzugt eingesetzt werden kann. Ein Beispiel hierfür ist die Gewinnung von aktiven Antikörperfragmenten, die für den Einsatz im Menschen dienen und dort möglichst keine oder eine möglichst geringe Immunantwort hervorrufen sollen. Damit ist dies ein Verfahren, das besonders geeignet ist zur Herstellung von aktiven Antikörpern für Antikδrpertherapien oder Antikörperdiagnostika am Menschen. Solche Antikörper können dann in weiteren, dem Fachmann bekannten, Schritten beispielsweise mit Radioisotopen mit oder ohne Chelatoren beladen werden oder mit Hilfe entsprechender Kopplungsschritte und -molekülen an Toxine oder andere Stoffe gekoppelt werden. Für die Diagnostik sind dabei bevorzugt Fluoreszenzmarkierung, die direkt oder über sekundäre Bindungssysteme, wie beispielsweise dem Streptavidin-Biotin System eingesetzt werden.
Im Zusammenhang mit der Erfindung sollen folgend einige Begriffe definiert werden:
Unter aktiven Proteinen versteht man erfindungsgemäß solche Proteine, die aufgrund einer Faltung beziehungsweise einer räumlichen Struktur eine Aktivität beinhalten, diese Aktivität kann beispielsweise eine Bindungsaktivität, enzymatische Aktivität, katalytische Aktivität oder eine Aktivität, die auf Wechselwirkung beruht, sein. Solche Proteine können auch posttranslational modifiziert sein.
Unter Fusionsproteinen versteht man erfindungsgemäß zwei oder mehrere Polypeptide oder Proteine, die zusammen über ein Genkonstrukt als ein zusammenhängendes Protein, dem Fusionsprotein, exprimiert werden können. Dabei können die Polypeptide oder Proteine durch weitere Sequenzen, beispielsweise Linker oder Tags voneinander getrennt und/ oder an diese an einem der beiden Seiten angehängt werden.
Unter einem Expressionsprotein versteht man erfindungsgemäß den Anteil des Fusionsproteins, der die Aktivität beinhaltet .
Unter dem Dl versteht man erfindungsgemäß ein Polypeptid oder dessen entsprechende kodierende Nukliensäuresequenz, das der Domäne Dl des Phagenhüllproteins pIII des filamentösen Bakteriophagen M13 entspricht oder deren Funktionsanaloga. Erfindungsgemäß versteht man unter dem Dl aber auch Ableitungen des Dl, die beispielsweise Mutationen des Dl sind oder Dl das mit zusätzlichen Aminosäuresequenzen verbunden ist (siehe auch oben) . Dl kann dabei ebenfalls Teile der Sequenzen der Domäne D2 des Phagenhüllproteins pIII des filamentösen Bakteriophagen M13 enthalten, solange die volle Länge des D2 nicht erreicht wird. VorrausSetzung der Ableitungen des Dl ist, dass diese weiterhin eine Expression von aktiven Proteinen im Sinnen der Erfindung und/oder eine Multimerisierung der Fusionsproteine erlauben.
Unter dem Dl-Anteil versteht man erfindungsgemäß der Teil des Fusionsproteins oder die das Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure, der das Dl enthält und nicht das Expressionsprotein ist, wobei weitere Sequenzen dabei enthalten sein können, beispielsweise Tags, Linker, und/oder SignalSequenzen.
Unter einem Linker versteht man erfindungsgemäß eine Aminosäuresequenz oder die die Sequenz kodierende Nukleinsäure, die zwei Polypeptide oder Proteine miteinander in einem Fusionsprotein verbindet . Ein Linker kann dabei ebenfalls zwischen zwei oder mehreren Polypeptiden eines Expressionsproteins vorkommen, beispielsweise zwischen den variablen Domänen der leichten und der schweren Kette von Antikörpern bei Single chain Antikörperfragmenten oder beispielsweise zwischen der alpha Einheit und der beta-Einheit eines MHC Klasse I Moleküls und dem MHC Klasse I Peptid die in Form eines Single chain MHC I/Peptid im Fusiosnprotein umfasst sind.. Die Linker können eine Länge von 0 bis 50 Aminosäuren besitzen (siehe auch oben) .
Unter einem Tag versteht man erfindungsgemäß längere oder kürzere Aminosäure Sequenzen oder die die Sequenz kodierende Nukleinsäure, die beispielsweise der Identifizierung oder Affinitätsreinigung durch einen gegen das Tad spezifisch gerichteten Antikörper oder Bindungsmolekül, der Reinigung durch Komplexbindung an Metalle (His-Tag), der Fluoreszenzmarkierung (z.B. green fluorescence protein) oder der Markierung oder Kopplung an Molekülen dienen, beispielsweise durch Radioaktiv- oder Fluoreszenz-Markierung oder Kopplung an Biotin, Enzyme oder andere Strukturen. Diese und andere Tags sind dem Fachmann bekannt, sowie ihre Einfügung in entsprechende Nukleinsäure- oder Proteinkonstrukte und Verknüpfung mit
den Molekülen, sowie weiterführenden Reinigungs- und Markierungstechniken.
Unter einer Wirtszelle versteht man erfindungsgemäß eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle, die eine Expression des Fusionsproteins im Periplasma oder in einer sezernierten Form erlaubt . In einer bevorzugten Variante ist die Zelle eine Bakterienzelle. Die Wirtszelle kann auch Teil eines Organismus sein, beispielsweise von Pflanzenzellen.
Unter Spaltungsmolekülen versteht man erfindungsgemäß Enzyme, beispielsweise Proteasen, Ribozyme oder andere chemische Moleküle, beispielsweise Bromcyan, die spezifisch die Spaltstelle im Fusionsprotein erkennen und diese spezifisch spalten, wodurch es zu einer Freisetzung des aktiven Proteins kommt
Unter einem multimeren Fusionsprotein versteht man erfindungsgemäß die nicht-kovalente Zusammenlagerung von zwei oder mehreren Fusionsproteinen, die durch die Domäne Dl oder sein Funktionsanalog des Phagenhüllproteins pIII des Bakteriophagen M13 vermittelt wird. Homologe multimere Fusionsproteine bestehen dabei aus Fusionsproteinen mit gleichen Expressionsproteinen. Heterologe Fusionsproteine bestehen dabei aus Fusionsproteinen mit unterschiedlichen Fusionsproteinen.
Unter Multibodies versteht man erfindungsgemäß multimere Antikörperfragmente, beispielsweise Dia-, Tria- oder Tetrabodies . Diese werden beispielsweise durch Verkürzung oder Weglassen des Linkers zwischen den variablen Domänen VH (Variable Domäne der schweren Kette) und VL (Variable Domäne der leichten Kette) hergestellt. Dabei haben Multibodies Bindungsstellen gleicher Spezifität, beispielsweise Dia-, Tria-, Tetrabodies, oder unterschiedlicher Spezifität, beispielsweise bispezifische Diabodies .
Unter einer Vakzine versteht man erfindungsgemäß einen Stoff zur Immunisierung von Menschen oder Tieren. Eine Vakzine enthält dabei erfindungsgemäß ein er indungsgemäßes Fusionsprotein oder ein multimeres Fusionsprotein.
Unter einem Arzneimittel versteht man erfindungsgemäß ein pharmazeutisches Produkt, das eine erfindungsgemäße Vakzine in einer geeigneten pharmazeutischen Darreichungsform umfasst und für die Anwendung am Menschen dient .
Unter einem Ab2 versteht man erfindungsgemäß einen Antikörper, der gegen die Bindungsregion eines primären Antikörpers, der das gewünschte Antigen erkennt, gegen das immunisiert werden soll, spezifisch gerichtet ist und das Antigen immunologisch imitiert, und in einer Immunisierung eine Immunantwort gegen das Antigen bewirkt .
Unter einem Bakteriophagen versteht man erfindungsgemäß ein Virus, das ein Bakterium infizieren kann.
Unter einem Mimikry-Peptid gegen Konformationsepitope versteht man erfindungsgemäß ein Peptid, das ein Konformationsepitop oder eine Nicht-Proteinstruktur, beispielsweise eine KohlenhydratStruktur, immunologisch imitiert und in einer Immunisierung eine Immunantwort gegen das Konformationsepitop bewirkt.
Unter einer Nukleinsäure versteht man erfindungsgemäß solche DNA oder RNA Moleküle, die eine Aminosäuresequenz kodieren, die die erfindungsgemäßen Fusionsproteine umfasst. Die DNA und/ oder RNA wird nach an sich bekannten Methoden synthetisch oder aus natürlichen Quellen, beispielsweise eukaryontisehen oder prokaryontischen Zellen, beispielsweise Bakterien, oder Viren, beispielsweise Bakteriophagen, gewonnen. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt. Nukleinsäuren, die als Vakzine eingesetzt werden, haben dabei zusätzliche
Sequenzen, die einen Gebrauch als Vakzine, beispielsweise als DNA Vakzine, ermöglichen oder verbessern. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt . Dabei ist es weiterhin vorteilhaft die Sequenzen mit entsprechenden CpG Formen entweder synthetisch oder aus Bakterien zu gewinnen. Entsprechende Methoden sind dem Fachmann bekannt. Nukleinsäuren, die für die Expression in Wirtszellen verwendet werden umfassen zusätzliche Sequenzen die eine Lokalisation der exprimierten aktiven Fusionsproteine in das Periplasma oder in Form sezernierter aktiver Fusionsproteine bewirken. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise sind bevorzugte Sequenzen in der Tabelle 5 und 6 aufgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Fusionspeptid einen Polypeptidlinker, eine sekretorische Lokalisationssequenz und/oder eine periplasmatisches Lokalisationssequenz. Der Polypetidlinker kann null bis 50 Aminosäuren umfassen (siehe auch oben) . Die Lokalisationssequenzen ermöglichen insbesondere, dass das Fusionspeptid oder Fusionsprotein bei seiner Gewinnung im Periplasma oder im Wirtszellüberstand vorliegt. Selbstverständlich ist es möglich, in einer bevorzugten Ausführungsform die Lokalisationssequenzen und/oder den oder die Polypeptidlinker und/oder den oder die Tags am Fusionspeptid beizubehalten. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden die Lokalisationssequenzen und/oder den oder die Polypeptidlinker und/oder den oder die Tags nach der Gewinnung des Fusionsproteins abgespalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Fusionspeptid mindestens eine Spaltstelle zwischen dem Zielprotein und der Domäne Dl auf . Mit Vorteil ist es möglich bereits in dem codierenden Vektor mehrere Spaltstellen bereitzustellen, um eine geeignete für das Expressionsprotein zu beinhalten (s.o.).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Expressionsprotein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörperfragment, einem Single chain antibody, einem Multibody, einem Fab-Fragment, einem Single chain MHC-Molekül, einem MHC-Peptid Fusionspeptid und/oder Ab2. Die Expressionspeptide können auch Expressionsproteine sein, die mit Immunreaktion im Zusammenhang stehen können, wie Liganden, Rezeptoren, Enzyme oder andere Strukturproteine .
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das multimere Fusionspeptid gleiche Expressionspeptide oder mindestens zwei verschiedene Expressionspeptide.
Die Erfindung betrifft auch ein Nukleinsäuremolekül dass das erfindungsgemäße Fusionspeptid codiert . Das Nukleinsäuremolekül umfasst insbesondere eine Nukleinsäurensequenz, die eine oder mehrere Signalsequenzen für den Transport in das Periplasma oder in das umgebende Medium kodiert . Die Herstellung der Nukleinsäuren und ihre Einbringung in Bakterien ist dem Fachmann bekannt . Mit Vorteil können weitere Expressionsvektoren mit zusätzlichen Tags und/oder Linkern versehen werden. Die hierzu benötigten Technologien sind dem Fachmann prinzipiell bekannt und erlauben mit Hilfe der offenbarten Erfindung die Herstellung solcher Expressionsvektoren. Das Nukleinsäuremolekül oder ein Vektor, die das Nukleinsäuremolekül umfaßt, kann in geeignete Liposomen oder Wirtszellen eingebracht werden, wobei in den Liposomen die Enzyme eingebracht werden können, die für die Expression des Fusionspeptid erforderlich sind. Hierdurch wird ein Expressionsvektorsystem erhalten. Das Expressionsvektorsystem umfasst demgemäß Fragmente des Bakteriophagenhüllproteins pIII, wie die Domäne Dl des pIII des filamentösen Bakteriophagen M13. Dl ist dabei mit einem Expressionsprotein in Form eines Fusionsproteins verbunden
und wird entweder im Periplasma oder löslich in den Kulturüberstand von Bakterien exprimiert. Aber es können auch Wirtszellen verwendet werden, die es ermöglichen, lösliche Proteine zu exprimieren, beispielsweise Hefezellen oder höhere eukaryontische Zellen, wie beispielsweise Insektenzellen, bevorzugt Vertebratenzellen bevorzugt Säugerzellen, hierbei bevorzugt menschliche Zellen und Zelllininen. Hierfür enthalten die Nukleinsäuren, die das Fusionsprotein kodieren, zusätzlich an sich bekannte entsprechende Signalsequenzen, die es erlauben das Protein in einer löslichen Form zu exprimieren. Solche Signalsequenzen codieren Signalpeptide, beispielsweise periplasmatische Lokalisationssignale oder Exportsignale, die für eine Lokalisation des Fusionsproteins im Periplasma oder in sezernierter Form außerhalb der Wirtszelle verantwortlich sind, wie sie beispielhaft in Tabelle 5 und 6 aufgeführt werden.
Als weitere Komponenten können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren für Linker kodieren, die das Dl und das Expressionsprotein voneinander trennen, und/oder die zwischen Teilen des Expressionsproteins eingefügt sind, wie beispielsweise bei scFv. Die Herstellung von Nukleinsäuren die Varianzen von scFv oder einzelner scFv kodieren oder der Gewinnung der Nukleinsäuresequenzen oder relevanter Teile von anderen Antikörpern oder Antikörperfragmenten aus Zellen sind dem Fachmann bekannt .
Ob Linker an den bestimmten Stellen notwendig oder vorteilhaft sind, oder ob es günstiger ist Linker an bestimmten Stellen wegzulassen, ist von dem Fusionsprotein abhängig und dem dort exprimierten Expressionsprotein und kann nach an sich bekannten Methoden ermittelt werden. So kann es beispielsweise vorteilhaft sein, den Linker zwischen den beiden Domänen der variablen Ketten von scFv zu verkürzen oder wegzulassen, wodurch es zur Multimerisierung des Antikörper kommt, die dem Fachmann an
sich bekannt ist. Diese Multimerisierisierung ist von der weiter unten beschriebenen Multimerisierung über Dl Domänen unterschiedlich.
Als weitere Komponente können die das Fusionsprotein codierende Nukleinsäuren zusätzlich auch Tags enthalten, die beispielsweise zur Reinigung, Detektion, Stabilisierung oder Markierung dienen können. Diese Tags können sowohl vor, nach oder zwischen einzelnen Komponenten des Fusionsproteins, einschließlich innerhalb des Expressionsprotein-Anteils liegen.
In den Beispielen ist im Detail erläutert, dass die Expression von Expressionsproteinen in Form von Fusionsproteinen zur Expression von aktivem Protein führt. Dabei werden bestimmte Proteine, die vorher in herkömmlichen Expressionssystemen nicht aktiv exprimiert werden konnten, aktiv exprimiert und andere haben eine erhöhte Aktivität. Die Beispiele zeigen weiterhin, dass dies auf einer Aktivierung des Fusionsproteins basiert und nicht auf einer Erhöhung der Expression alleine. Außerdem wird auch deutlich, dass der Effekt nicht durch eine Multimerisierung alleine zustande kommt, da ebenfalls Monomere, die zuvor ohne Fusion an Dl inaktiv waren, in Form des erfindungsgemäßen monomeren Fusionsproteins aktiv wurden. Monomere Fusionsproteine .können durch chromatographische Verfahren, die in den Beispielen im Detail erläutert werden, gewonnen werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das Nukleinsäuremolekül umfasst, insbesondere pKJB3.
Die Erfindung betrifft auch einen Phagen umfassend den Vektor, wobei der Teil des Vektors, der Phagenhüllprotein- Anteil, beispielsweise die Dl Domäne oder ihr Funktionsanalog, codiert nicht den Teil des Phagenhüllprotein codiert, der der Verankerung in der
Phagenhülle dient. Verankerungsproteine sind alle Proteine, die der Integrierung in die Phagenhülle dienen.
Die Erfindung betrifft auch Erkennungsmoleküle, die gegen ein Fusionsprotein, die Nukleinsäuremolekül und/oder die Wirtszelle gerichtet sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisense-Konstrukt ist, insbesondere ein RNA- Interferenzmolekül . Bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen das aktive Protein, nämlich das Expressionsprotein, des Fusionsproteins. Mit Hilfe der Phagen Display Technologie unter Verwendung des aktiven Proteins oder des aktiven Fusionsproteins als Antigen können Antikörper Phagen Display Bibliotheken gewonnen werden. Dem Fachmann sind Ver ahren zur Generierung der Erkennungssubstanzen bekannt .
Die Erfindung betrifft auch eine Vakzine umfassend das Fusionspeptid, das Nukleinsäuremolekül, die Wirtszelle und/oder das Erkennungsmolekül gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die Vakzine können insbesondere Expressionsproteine umfassen, die einem Ab2 entsprechen oder einem Mimikrypeptid, das ein Konformationsepitop imitiert. Bevorzugt umfassen die
Vakzine ein monomeres Fusionsprotein oder multimeres
Fusionsprotein umfassend die Domänen Dl oder funktionsanaloge Domänen wie bestimmte Strukturanteile von
D2 , oder Fragmente davon und ein oder mehrere Antikörperfragmente und/oder mindestens ein zusätzliches
Adjuvans oder einen anderen geeigneten Stoff zur
Wirkungsverstärkung in einer geeigneten Lösung enthält .
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines aktiven Fusionsproteins umfassend die Schritte:
Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls codierend ein Fusionspeptid umfassend eine Domäne Dl eines pIII oder dessen Funktionsanalogen und ein Expressionsprotein,
Einbringen des Nukleinsäuremolekül in eine Wirtszelle,
- Gewinnung des durch das Nukleinsäuremolekül codierten Fusionspeptides aus einem Periplasma und/oder einem Wirtszellüberstand.
In dem Verfahren können neben Dl auch Homologe/Analoge eingesetzt werden, die eine Dl Aktivität aufweisen. Beispielsweise können dies sein ein anders Phagenhüllprotein eines filamentösen Phagen, beispielsweise pVI oder pVIII, bevorzugt ein Phagenhüllprotein des filamentösen Phagen M13 , besonders bevorzugt die Domäne 2 von pIII des Bakteriophagen M13. Die bevorzugte Form ist das Dl oder sein Fumktionsanalog (s.o.) . Das bereitgestellte Verfahren ermöglicht es, effizient aktive Fusionspeptide oder Proteine zu exprimieren. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Proteine oder Peptide können monomer oder multimer vorliegen. Die Gewinnung von multimeren Strukturen kann vorteilhaft sein, wenn z.B. eine gute Avidität erzielt werden soll. Selbstverständlich ist es auch möglich, aktive Monomere zu gewinnen. Vorteilhafterweise müssen die hergestellten Proteine nicht renaturiert werden Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere solche Fusionspeptide oder Proteine gewonnen werden, die durch herkömmliche Verfahren oder die Verwendung bekannter Expressionssysteme in einer nicht aktiven Form oder in einer vermindert aktiven Form in Bakterien exprimiert wurden. Durch das Verfahren können Fusionspeptide oder Proteine in einer aktiven oder einer höher aktiven Form exprimiert werden. Das Fusionsprotein kann hierbei so ausgewählt sein, dass es umfasst: mindestens eine Polypeptidlinkerlänge von 0 bis 50 Aminosäuren, einem oder
mehrere Tags und/oder eine oder mehrere zusätzlichen - Spaltstellen zwischen dem Phagenhüllprotein und dem Expressionsprotein. Das Expressionsprotein kann insbesondere sein: ein Antikörperfragment, ein single chain antibody, ein Multibody, ein Fab Fragment oder ein MHC- Molekül/MHC-Peptid Fusionspeptid. Die Erfindung liefert also ein Verfahren, das es ermöglicht Proteine in einer aktiven Form im Periplasma von Bakterien zu exprimieren, die zuvor nicht oder weniger aktiv bei einer Expression im Periplama waren. Dabei wird das Protein, das aktiv exprimiert werden soll in Form eines Fusionsproteins mit einem Phagenhüllprotein, bevorzugt dem pIII des filamentösen Bakteriophagen M13 bzw. Homologen, die funktionsanalog sind, exprimiert und durch ein Periplasmatisches Lokalisationssignal ins Periplasma gebracht. Es gibt eine Reihe von Proteinen, die auch bei einer Expression im Periplasma nicht in eine aktive Faltungsform gebracht werden oder die Aktivität relativ gering ist. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert die Möglichkeit, durch Fusion der Proteine mit einem Phagenhüllprotein, bevorzugt dem pIII des filamentösen Bakteriophagen M13, oder Fragmenten davon, bei einer Expression im Periplasma von solchen Proteinen aktive Proteine zu erzeugen, die zuvor nicht aktiv im Periplama exprimiert werden konnten, oder die Aktivität der Proteine im Vergleich zu Expression im Periplasma ohne den Phagenhüllproteinanteil erhöhen. Die Proteine können als aktive Fusionsproteine verwendet werden oder über eingefügte proteolytische Spaltstellen durch Abspaltung mit Spaltmolekülen ohne das Phagenhüllprotein eingesetzt werden. Bevorzugt trägt der Expressionsprotein-Anteil einen Tag, mit dem das aktive Protein nach Abspaltung des Dl- Anteils mit dem Verfahren von den anderen Anteilen gereinigt werden kann. Ein dabei bevorzugtes Verfahren ist die Bindung auf einer Nickelsäule über einen His-Tag und der Abspaltung des Dl-Anteils mit Hilfe des
Spaltungsmoleküls. Nach anschließendem Waschen wird das aktive Protein mit Imidazol eluiert . Die entsprechenden einzelnen Technologien sind dem Fachmann bekannt und können für das Verfahren angepasst und optimiert werden.
Dem Fachmann ist bekannt, dass er ein Verfahren zur Gewinnung einer biologischen Struktur mit anderen Verfahren kombinieren kann. Beispielweise kann das er indungsgemäße Verfahren mit einem Reinigungsverfahren des Fusionsproteins kombiniert werden, mit einer Abspaltung des Phagenhüllproteins oder dessen Fragment vom Expressionsprotein mit Hilfe einer oder mehrerer spezifischer Spaltungsmoleküle und/oder mit einer Reinigung des so gewonnenen aktiven Proteins . Weiterhin ist es selbstverständlich möglich das erfindungsgemäße Verfahren mit einem Verfahren zur Selektion eines aktiven Fusionsproteins mit Hilfe der Phagen-Display Technologie zu kombinieren, wobei das Phagenhüllprotein in der Expression des Fusionsproteins in der Wirtszelle als Fragment vorliegen kann. Bevorzugt ist auch die Kombination mit anderen DisplaySystemen, wie dem Ribosomen-Display oder dessen separater Verwendung.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere Antikörperfragmente hergestellt werden. Darüber hinaus können Expressionsproteine auch alle anderen Proteine sein, die in einer aktiven Form exprimiert werden müssen und/oder die eine bestimmte Konformation, die über eine Faltung oder Interaktion von Aminosäuren des Expressionsproteins oder Fusionsproteins zustande kommt . Darunter fallen beispielsweise Enzyme, Antikörperfragmente, Rezeptoren, Liganden, Strukturproteine und andere, aber auch Peptide die eine bestimmte Konformation einnehmen oder solche, die eine bestimmte Konformation immunologisch imitieren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des
Fusionsproteins, des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors, des
Phagens, der Wirtszelle, des Erkennungsmoleküls, der
Vakzine und/oder des Arzneimittels in Diagnostik und Therapie.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Verwendung des Fusionsproteinsp, des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors, des Phagens, der Wirtszelle, des Erkennungsmoleküls, der Vakzine und/oder des Arzneimittels die Initiierung einer Immunreaktion in einer Zelle, einer Zellsuspension, einem Gewebe und/oder einem Organismus.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der erfindungsgemäße Phage in einem Phagen-Bakteriensystem eingesetzt . Hierbei wird eine Selektionstechnologie über die Dl Domäne in einem Phagen-Bakteriensystem mit einem Expressionsplasmid in Kombination mit einem Helferphagen- Rescue verwendet . Diese Verwendung innerhalb einer Technologie unterscheidet sich von den bekannten Phagen- Display Systemen. Sie beinhaltet kein Phagemid- oder Phagenvektor-System. Die Verwendung nutzt die überraschenden Eigenschaften der Multimerisierung des Dl . Kern der Verwendung ist ein Expressionsvektor ist, dass in das erfindungsgemäße Fusionsprotein aus ein Expressionsprotein und einem Dl umfasst und der Expressionsvektor nicht den Part des Phagenhüllproteins codiert, der für die Verankerung in der Phagenhülle verantwortlich ist, d.h. es werden keine Verankerungsproteine codiert, der das erfindungsgemäße Fusionsproteinen codiert, das ein Expressionsprotein und ein Dl bzw. sein Funktionsanalog umfasst, mit der Eigenschaft, dass solche exprimierten Fusiosnproteine nicht in der Phagenhülle integrieren können, sondern nur über Wechselwirkungen an diese adherieren. Bakterien, die das Expressionsplasmid oder den Vektor beinhalten, werden nach an sich bekannten Methoden mit dem an sich bekannten
filamentösen Helpferphagen M13 oder mit Helferphagen, die daraus abgeleitet wurden, beispielsweise VCS-M13 oder KM13, infiziert. Eine bevorzugte Variante der Helferphagen ist eine Deletionsmutante bei der- DU oder Teile von DU deletiert Teile des DU mutiert sind, um eine Interaktion zwischen Dl und D2 zu vermeiden oder zu vermindern. Solche Helferphagen behalten ihre Infektiösität, die dabei im Prinzip verringert sein kann. Es kommt nach sich bekannten Methoden zur Produktion von Phagen. Diese Phagen tragen neben dem pIII oder veränderten pIII des Helferphagen nicht kovalent gebunden das Fusionsprotein. (Dabei wird sich bevorzugt die Multimerisierung über Dl Domäne zu Nutze gemacht. In einer Sonderform können aber auch D1-D2 Domänen verwendet werden. Bevorzugterweise werden die Phagen, bevorzugt das pIII, so verändert, dass eine Multimerisierung mit den Fusionsproteinen verstärkt wird. Hierzu können geeignete InduktionsSysteme verwendet werden, wie beispielsweise das IPTG Lac-Promotor System oder konstitutive Expressionsvektoren, (um die Effizienz des Systems zu erhöhen) . Diese erfindungsgemäßen Phagen, die nach an sich bekannten Methoden produziert wurden, tragen das genetische Material des Expressionsvektors. Da die Phagen das Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure enthalten, werden dabei die genetische und damit die Sequenz Information des Expressionsproteins mit dem exprimierten aktiven Fusionsprotein auf der Oberfläche des Phagen gekoppelt. Dies dient zur Identifizierung und zur Vermehrung des Fusionsproteins. Damit kann dieses System als Selektionssystem für Bibliotheken von Expressionsproteinen verwendet werden. Die Selektion erfolgt dabei nach an sich Bekannten Methoden des Biopanning, bei dem die Phagen mit dem Fusionsprotein auf ihre Bindung an eine Zielstruktur, z.B. einem Protein selektioniert werden und/oder durch Abreicherung unerwünschte Phagen entfernt werden. Selektionierte Phagen werden nach an sich bekannten Methoden zur Infektion auf
entsprechend geeignete Bakterien gegeben und die Bakterien, denen der Expressionsvektor durch Infektion übertragen wurde, werden durch Antibiotikaresistenten oder andere Marker selektioniert und können kloniert werden. Aus den Klonen kann durch an sich bekannte Methoden beispielsweise mit Hilfe der PCR die Sequenz der selektionierten Expressionsproteine und/oder Fusionsproteine bestimmt werden. Ein großer Vorteil des Systems ist, dass keine Umklonierung in einen Expressionsvektor nötig ist um entsprechende Mengen von aktivem Protein oder Fusionsprotein zu generieren. Damit benötigt das System kein Amber-Stop Codon oder ähnliches System wie im Falle des Phagemid Systems. Damit ist die Expressionsrate der aktiven Fusionsproteine für die Gewinnung als multimeres Fusionsprotein oder in der Verbindung mit dem Phagen in den meisten Fällen deutlich besser als mit dem herkömmlichen Phagemidsystem. Ein weiterer Vorteil des Systems ist, dass aufgrund der kleineren Größe des Expressionsvektors im Vergleich zu Phagemid oder Phagenvektorsystemen eine größere Varianz oder einfacher eine große Varianzen an unterschiedlichen Nukleinsäuren, die unterschiedliche Expressionsprotein-Anteile der Fusionsproteine kodieren, in Verbindung mit der Infektion der Bakterien bei der Herstellung von Bibliotheken gewonnen werden können. Die Varianzen der Bibliothek werden dabei nach an sich bekannten Methoden in der Regel synthetisch durch an sich bekannte PCR Methoden hergestellt. Vorteilhaft ist dabei auch, dass das offenbarte System eine einfache und schnelle Expression des multimeren Fusionsproteins erlaubt und es erlaubt direkt aktive Proteine oder aktive Fusionsproteine zu gewinnen. Viele dieser Fusionsproteine sind dabei aktiv, die im Vergleich zu herkömmlichen Phagemidsystemen nicht oder vermindert aktiv sind (s.o.) .
Bevorzugt ist die Herstellung von Antikörperbibliotheken und die Selektion von Antikörpern mit Hilfe der
Technologie. Vorteilhaft ist aufgrund der Multimerisierung,
dass auch Expressionsproteine selektioniert werden können, die eine vergleichbar geringe Affintät eines einzelnen Fusionsproteins zu dem Bindungspartner aufweist. Letztere werden durch herkömmliche Selektionssysteme häufig nicht 5. identifiziert. Dieses Problem kann durch einen multiplen Display aufgrund der Bindung an mehrere pIII abgeleitete Proteine (Dl und sein Funktionsanaloga) des Phagen verstärkt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des 0 Fusionsproteins, des Nukleinsäuremoleküls, des Vektors, d es Phagen, der Wirtszelle, des Erkennungsmoleküls, der Vakzine und/oder des Arzneimittels in Forschung, Diagnostik und Therapie .
Bevorzugt ist die Verwendung bei der Erforschung, Diagnose 5 und Therapie von Tumoren, Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Infektionskrankheiten.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Modifizierung oder Verhinderung der Angiogenese .
Die Erfindung betrifft demgemäß auch die Verwendung von 0 erfindungsgemäßen multimeren Fusionspeptiden oder - proteinen zur Gewinnung von monomeren Formen sowie die monomeren Formen selbst .
In einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung werden Multimere Fusionsproteine zur Immunisierung verwendet. Wie 5 in den Beispielen ausgeführt, erreicht eine Immunisierung mit den Multimeren eine starke Immunantwort . Die Dl Komponente fungiert dabei als Adjuvans, wobei die unerwartet hohen Immunantworten wahrscheinlich dadurch zustande kommen, dass die Technologie einen Vorteil hat 0 indem es zu einem langsamen Freisetzen der einzelnen Fusionsproteine aus dem Multimer kommt, das dadurch untermauert wird, dass es ein Gleichgewicht von Multimeren
und einzelnen Fusionsproteinen geben kann. - Ein solches verlangsamtes Freisetzten kann einen Depoteffekt oder einem dem Depoteffekt fiύnktionell ähnlichen Effekt haben. Beide werd ansonsten bei anderen Adjuvantien beispielsweise durch große relativ schlecht charakterisier- und standardisierbare und damit für GMP in klinischen Anwendung nur bedingt tauglichen Riesenmoleküle wie beispielsweise das KLH (Keyhole limpet hemocyanin) oder Wasser-Öl Gemische erreicht . Diese Technologie kann in Form einer Vakzine mit entsprechenden Antigenen als Expressionsproteine zur Immunisierung gegen unterschiedliche Erkrankungen, beispielsweise Tumor- oder Infektionserkrankungen dienen oder zur Herstellung von Antikörpern durch Immunisierung von Tieren, beispielsweise Mäusen, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Ab2 scFv in Form von Homo- oder Hetero-Multimeren Fusionsproteinen als Vakzine bzw. zur Immunisierung verabreicht, um eine Immunantwort gegen das ursprüngliche Antigen zu erzielen. Dies ist beispielsweise für Tumortherapien vorteilhaft um Anergien zu brechen. Dabei werden Ab2 , die ein Tumorepitop imitieren in Form eines multimeren Fusionsproteins in geeigneten pharmakologischen Formulierungen, Dosen und Vakzinierungsabständen verabreicht, um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu erzielen, die das oder die Tumorantigene tragen. Analog dazu werden über dieses System auch Mimikry-Peptide von Antigenen, die eine aktive Konformation besitzen oder die keine Proteine sind, in aktiven multimeren Fusionsproteinen vorteilhaft zur Vakzinierung gegen Erkrankungen eingesetzt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung von multimeren Fusionsproteinen mit Liganden oder Rezeptoren-inhibierende Moleküle, beispielsweise in Form von Antikörperfragmenten oder Peptiden, als Expressionsproteinanteil. Dies dient beispielsweise als Aktivator oder Inhibitor von Rezeptor-vermittelten Prozessen. Damit können Sekundärprozesse in den Zellen
gesteuert werden oder die Interaktion zwischen Zellen moduliert werden. Beispielsweise können dadurch die Interaktionen von Tumorzellen mit Endothelzellen im Blut inhibiert werden, wodurch es zu einer Verminderung oder Verhinderung eines Entzündungsprozesses oder Metastasierung kommt . Diese angesprochenen Prozesse laufen dabei beispielsweise über Selektin-vermittelte Adhesion von Zellen an das Endothel ab, die durch Antikörper oder Mimikrymoleküle, Ab2 oder Mimikry-Peptide, verhindert werden können. Die Anwendung in der erfindungsgemäßen multimeren Form ist dabei vorteilhaft, da es aufgrund der erhöhten Avidität zu einer vergleichsweise starken Inhibition kommt. Ein weiteres Beispiel ist die Interaktion des scFv L36 mit Laminin, wodurch die Angibgenese verhindert werden kann. Die Anwendungstechnologien und Verabreichungsformen sind über die in den Beispielen beschriebenen Technologien hinaus an sich bekannt.
Die Erfindung soll im folgenden anhand eines Beispiels näher erläutert werden ohne auf dieses beschränkt zu sein:
Beispiel 1
Herstellung des pKBJ-Konstrukts
Der Vektor pUC119His6MycXbaI wurde als Ausgangsvektor für die Herstellung der pKBJ-Vektoren benutzt. Ein scFv- Antikörper wurde zwischen die Hindlll- und Notl- Schnittstelle des Vektors kloniert. Gen III (Nucleotide Accession Code:V00604) aus pHEN2 (www.mrc- cpe .cam.ac.uk/~pha e/glp. tml) wurde mittels. PCR durch Nutzung spezieller Primer für jeden Vektor amplifiziert . pKBJl wurde hergestellt durch PCR-Amplifikation mit den Primern glll N-term Notl und DII-DIII Eagl und durch anschließende Klonierung des Eagl-geschnittenen PCR- Produktes in die Notl-Schnittstelle des scFv-enthaltenden
pUC119His6MycXbaI. Für pKBJ2 wurde das Gen III mit den Primern VL-Link und DU-III Opal-EcoRI amplifiziert, mit Notl und EcoRI verdaut und in die entsprechenden Stellen des Ausgansvektors kloniert. Zur Entfernung des Amber-Stop- Codons zwischen dem scFv und Genlll in pHEN2 wurden der QuikChange-Mutägenese-Kit (Stratagene) und die Primer glll N-term QC Amber-back und glll N-term QC Amber-fw benutzt. Das pKBJ3-Konstrukt wurde analog zu pKBJl mit den Primern glll N-term Notl und DI-DII Eagl hergestellt. Die drei Konstrukte sind alle in Fig. 1 schematisch dargestellt. Drei verschiedene scFv Antikörperfragmente L36, D4 und XR5, wurden vom Phagemid pHEN2 in drei pKBJ Vektoren und den Vektor pUC119 subkloniert indem die Restriktionsenzyme Ncol und Notl verwendet wurden. Die DNA, die das Dl-Fusionsprotein des XR5 kodiert wurde von pKBJ3 in den pROOSTER Vektor, der eine kanamycin restenz kodiert subkloniert, indem die Restriktionsenzyme Hindlll und EcoRI verwendet wurden. Alle Konstrukte wurden anschließend mit den Primern M13-Rev, VL-link und M13-20 unter Benutzung des 373A-Sequenzierers (Applied Biosystems) und des ABI Prism Dye Terminator-Sequenzierungskits
(Perkin-Eimer) sequenziert. Alle Enzyme wurde von New
England Biolabs geordert, wenn nicht gesondert angegeben, und nach den Anweisungen des Herstellers eingesetzt. In Tab.l sind die verwendeten Primer aufgelistet.
Tabelle . 1 : Liste der Primer-Sequenzen
Expression der Antikörper
Die Klone wurde von TYE-Platten gepickt und über Nacht bei 37°C in 2xTY [J. Sambrook, Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (1989)] mit lOOμg/ml Ampicillin und 1% Glukose kultiviert, anschließend 1:100 verdünnt in 2xTY mit lOOμg/ml Ampicillin und 0,1% Glukose und für 4 Stunden bei 37°C geschüttelt. Die Kulturen wurden induziert durch Zugabe von ImM IPTG und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert . Die Zellen wurden mit 6000xg pelletiert, in 50mM NaxHyP04 pH8,0 resuspendiert und in einer French Press (American Instruments Co., ine. Silver Spring, MD, USA) lysiert . Vor der immobilisierten Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) wurde die Suspension bei 26000xg zentrifugiert und der Überstand mit 30mM Imidazol und 300mM NaCl versetzt. Ni-NTA wurde mit dem Überstand für 2h bei 4°C inkubiert und anschließend mit mindestens 100ml Waschpuffer (50mM NaxHyP04 pH8,0; 30mM Imidazol und 300mM NaCl) und anschließend 50ml Hochsalz- Waschpuffer (50mM NaxHyP04 pH8,0; 30mM Imidazol und 750mM NaCl) gewaschen. Das Protein wurde mit 300mM Imidazol in Wasschpuffer eluiert . Die Konzentrationen wurden nach Bradford bestimmt [M.M. Bradford Anal Biochem 72 (1976) 248-254] und sind in Tabelle 2 für die verschiedenen Antikörper und ihre pKBJ Konstrukte angegeben und die Reinheit mittels SDS-PAGE [U.K.Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685] analysiert (Fig. 2) .
Tabelle 2
Gesamtausbeute der Expression in mg pro Liter
Affinitätsbestimmung mittels ELISA
Für ELISAs mit den pKBJ-Derivaten der scFv-Antikörper L36 und D4 wurden die Platten (Maxi-sorp™, NUNC, Roskilde, Dänemark) mit Laminin-1 (Sigma) oder Fibronektin (Sigma) in einer Konzentration von 0,5jug pro Vertiefung in 50mM NaHC03 pH 9,6 über Nacht bei 4°C beschichtet. Die übrigen Bindungsstellen der Plastikoberfläche wurden anschließend mit 2% MPBS ( 2% w/v Magermilchpulver in PBS) für 2h blockiert, die Antikörperderivate in verschiedenen Konzentrationen zugegeben und lh inkubiert. Anschließend wurden die Platten 6-mal mit PBS gewaschen und der gebundene Antikörper mit dem murinen Antikörper 9E10 (ECACC) , der das c-myc Tag der Antikörper erkennt, in einer Konzentration von 0,5μg/ml detektiert. Nach 6 weiteren Waschschritten in PBS wurden die Platten mit 1:1000 verdünntem HRP-konjugierten Kaninchen-anti-Maus- Antikδrper (DAKO) in 2% MPBS inkubiert. Nach 6 Waschschritten wurde die Reaktion mit o-Phenylendiamin- Tabletten (DAKO, Dänemark) nach Herstellerangaben entwickelt (Fig. 3.a, b) .
Um die Aktivität des scFv XR5 und seiner Derivate zu testen, wurde der MUC1-Antikörper A76-A/C7 mit einer Konzentration von 0,lμg/well über Nacht in PBS beschichtet. Restliche Bindungsstellen wurden mit 2% BSA (Sigma) in PBS für 2h blockiert und die Platten anschließend für 2h mit den Antikörperderivaten inkubiert. Der XR5-Antikörper wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen c- myc (A-14; Santa Cruz Biotechnology) und anschließend einem HRP-konjugierten Schwein-anti-Kaninchen Antikörper (DAKO, Dänemark) nachgewiesen. Zwischen den Inkubationsschritten wurden die Platten jeweils 5-mal mit PBS gewaschen (Fig. 3.c) .
Stabilitätsmessungen
Um den Effekt der Fusion auf die Stabilität der Antikörperfragmente zu untersuchen wurden Aktivitätsbestimmungen nach Inkubation der Fusionsproteine bei verschiedenen Temperaturen für unterschiedliche Zeiträume durchgeführt. Alle Konstrukte des L36 und XR5 zeigten keine Aktivitätsänderung nach einer Inkubation von bis zu 4 Tagen bei Raumtemperatur, 30°C und 37°C.
Beispielhaft wurde die Stabilität unter denaturierenden Bedingungen anhand der Konstrukte von L36 weiter untersucht, indem die Konstrukte mit Hilfe von Guanidinium- Chlorid (GdmCl) induzierter Aufhebung der Faltung mit Hilfe von "Steady State Fluorescence Spectroscopy" bestimmt wurde.
Gereinigeter L36-Fusions scFv wurde auf eine Endkonzentration von lμM verdünnt in verschiedenen Konzentrationen von Guanidinchlorid (GdmCl) in lOmM Tris- HC1 pH8 und in Quartzküvetten mit 3mm Weglänge transferiert. Die Kuvette wurde in ein RTC2000-Fluorimeter mit einer 75 W-Xenonbogenlampe (Photon Technology International, Lawrenceville, NJ) gestellt und ein Emissionssprektrum der Wellenlängen von 300 bis 400nm aufgenommen (Dex 285nm, Excitationsschlitzweite 2nm, Emissionsschlitzweite 6nm) . Gefalteter scFV hatte ein Emissionsmaximum bei 330nm, während das Maximum für ungefalteten scFv bei 355nm lag. Das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz dieser beiden Wellenlängen wurde daher als zu bestimmendes Signal festgelegt [GdmCl] 50% [M.M. Santoro, Biochemistry 27 (1988) 8063-8068 Gelfiltrationsanalysen] .
[GdmCl] so%, die Konzentration die benötigt wird um scFv-L36, pKBJl-L36, pKBJ2-L36 und pKBJ3-L36 zur Hälfte zu denaturieren war 2.73 ± 0.11 M, 2.70 ± 0.07 M, 2.67 + 0.03 M und 2.41 ± 0.09 M.. Daraus folgt, dass die Beobachtete
Erhöhung der Aktivität nicht durch eine erhöhte Stbilität zustsnde kommt.
Gelfiltrationsanalysen
Gelfiltrationsanalysen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Antikörperfusionsproteine mutimerisieren. Die Gelfiltration wurde auf einer TSK-Gel G3000 SW-Säule mit einer Präsäule (ToSoHaas) mittels HPLC (Biotek instruments) durchgeführt. Für die Korrelation der Retentionszeiten mit der globularen molaren Masse wurden Rinderplasma-Fibronektin, murines IgG, BSA und GST auf die Säule aufgetragen und das Protein mit einem Dioden Array- Detektor 540+ (Biotek Instruments) nachgewiesen. Mindestens 1 mg scFv-Fusionsprotein von jedem Konstrukt wurden auf die Säule aufgebracht und die Fraktionen für eine anschließende Analyse im ELISA gesammelt (Fig. 4) In Tabelle 3 sind der prozentuellen Anteile an Monomeren, Dimeren und Multimeren für die verschiedenen Antikörper und ihre Konstrukte angezeigt .
Die Dl-Fusionsproteine zeigen die höchste Aktivität an Multimeren und die Multimerisierungsfähigkeit wurde daher weiter untersucht. Um zu testen, ob die gereinigten Monomere, Dimere und Multimere im Hinblick auf eine Multimerisation stabil sind wurden sie jeweils für 36 h bei 37°C inkubiert und anschließend auf einer TSK-Gel G3000 SW Säule untersucht (Fig. 5) . Die Ergebnisse zeigen, dass die Multimerisierung bedingt reversible ist und sich Gleichgewichte einstellen.
Analysen mit Hilfe einerGX4000 Säulentrennung, zeigen, daß die Tetramerisierung bei weitem die am meisten auftretende Multimerisierungsform dvon Dl-Fusionsproteinen ist (Fig. 6) .
Die Möglichkeit Hetero-Multimere Fusionsproteine zu generieren wurde eine doppelte Transformation des D4 Antikörperfragmentes als Dl Fusionsprotein im pKBJ3 Vektor und des XR5 Dl Fusionsproteins im pROOSTER Vektor in E.coli mit anschließender Expression und Reinigung untersucht, Ein Sandwich-ELISA des gereinigten Fusionsproteins zeigt die Bildung von Hetero-Multimeren (Fig. 7) .
Tabelle 3
Jedes scFv-Konstrukt wurde mittels HPLC-Gelfiltration analysiert. Diese Methode unterscheidet zwischen Monomeren und Dimeren als einzelnen Peaks, wohingegen Multimere im Ausschlussvolumen eluiert werden. Der Anteil an Monomer, Dimer und Multimer variiert bei den verschiedenen Konstrukten (siehe Tabelle) . Die Zahlenwerte geben die Fläche unter der Gelfiltrationskurve an. Für jeden scFv wurden drei verschiedene Konstrukte verglichen - pUC119 (nicht-fusionierter scFv) , pKBJl (scFv fusioniert mit den Domänen I-II) and pKBJ3 (scFv fusioniert mit Domäne I) .
Immunisierung von Balb/c-Mäusen
Die Mäuse wurden mit gereinigtem Protein injiziert, das in einem der beiden FuncFAb-Format oder dem scFv-Format exprimiert wurde, mit oder ohne Emulsion in inkomplettem Freund'sehen Adjuvanz (FIA) . Nach einer Boost-Imunisierung am Tag 14 wurden die Mäuse an Tag 28 getötet und Blut entnommen, um das Serum auf scFv-spezifische Antikörper vom IgM und IgG-Typ zu testen. Im Vergleich zu Tag -1 wurden in allen getesteten Mäusen scFv-spezifische Antikörper generiert, obwohl die Titer und Isotypen variierten. Die Injektion des scFv-L36 allein induzierte eine begrenzte IgG-Antwort in einer der Mäuse (Fig. 8.a), möglicherweise analog zur HAMA-Reaktion, die im Menschen nach der Gabe muriner Antikörper beobachtet wurde, wobei die Maus in diesem Fall eine Maus-Anti-Human-Antikörperantwort erzeugt. Die Zugabe von FIA erhöhte die IgG-Antwort deutlich, wobei die IgM-Antwort nicht verändert wurde (eine dritte Maus starb bei der Immunisierung) (Fig. 8.b) . Die mit dem scFv- L36 im pKBJl-Format immunisierten Mäuse zeigten eine stärkere Immunantwort als die Mäuse, die mit scFv-L36 allein injiziert wurden, jedoch war diese Reaktion nicht so stark wie bei der Immunisierung mit FIA (Fig. 8.c). Der Effekt der Proteinlll Domäne I-Fusionen des scFv-L36 unterschied sich hingegen von den anderen Immunisierungen. Zusätzlich zu einem positiven Effekt auf die IgG-Antwort im Vergleich mit den Immunisierungen mit scFv-L36 allein und dem pKBJl-L36, wurde eine IgM-Antwort erzeugt, die bei den übrigen Immunisierungen nicht auftrat (Fig. 8.d).
Die Fusionsproteine mit den Domänen I-II und Domäne I von Proteinlll erzeugten eine Immunantwort gegen den Fusionspartner (scFv-L36) und können daher als Adjuvans verwendet werden. Der beobachtete Effekt auf die IgG- Antwort ist jedoch nicht so ausgeprägt wie bei der Verwendung von FIA. Ausserdem scheint der Effekt von Domäne
I allein besser zu sein als die Kombination mit Domäne I- II, was zum Teil durch die Zusammensetzung des Proteins, das in die Maus injiziert wurde, erklärt werden kann.
So wurde berichtet, dass Proteine als Bestandteile von Komplexen bessere Immunogene sind (Claassen et al . , 1998; Morein et al . , 1984) . Die Antikörper werden im Komplex, der' durch die Domäne I-Fusion entsteht, besser präsentiert, da diese aktiver ist, als der Komplex, der durch die Fusion mit Domäne I-II gebildet wird. Ausserdem kann diskutiert werden, ob der beobachtete Adjuvanseffekt der Proteinlll- Fusionsprodukte durch Chaperone-Eigenschaften vermittelt wird, da solche Eigenschaften kürzlich mit potenten Adjuvanzien assoziiert wurden ( Brenner und Wainberg, 1999) .
Die Anti-idiotypische Antwort
L36 ist ein durch Phagendisplay gewonnener Antikörper, der gegen humanes, aufgereinigtes Laminin-1 gerichtet ist und in der Lage ist, die Tumor-Neovaskularisation zu inhibieren
(Sanz et al . 2002; Sanz et al . 2001). Vorläufige Ergebnisse weisen auf das Vorhandensein anti-idiotypischer Antikörper im Serum hin, da die Seren der Mäuse, die mit scFv-L36 in FIA, L36-pKBJl und L36-pKBJ3 immunisiert wurden, einen dosisabhängigen Effekt auf die Bindung von scFv-L36 an Laminin-1 besitzen (Fig. 9) . Ausserdem erkennen die Seren der mit scFv-L36 in FIA und L36-pKBJ3 und in geringerem Maße auch die mit L36-pKBJl immunisierten Mäuse im ELISA einen polyklonalen Kaninchen-anti-Laminin-1-Antikörper (Fig. 10) . Das weist darauf hin, dass ein bestimmtes Epitop von Laminin-1 im Serum der immunisierten Mäuse vorliegt.
Legende zu den Figuren;
Fig. 1 Schematische Struktur der Fusionsproteine
Schematische Darstellung der Domänenstruktur von des pIII- Proteins des filamentösen Bakteriophagen. Die Aminosäuresequenz ist entsprechen der schematischen Domänenstruktur farbig markiert. Die pelB-Signalsequenz ist in violet, die drei pIII-Domänen sind blau und die verbindenden Linker sind rot dargestellt . Die Transmembrandomäne hingegen ist grau gekennzeichnet . Die drei pKBJ-Konstrukte 1-3 sind in der schematischen Darstellung mit denselben Farben für die entsprechenden pIII-Domänen markiert. Die Positionen für die Tags sind in grün und für die scFv-Anteile in braun angegeben. Der pKBJ2 besitzt dieselbe Tagstruktur wie im Phagendisplay-System, während bei pKBJl und pKBJ3 die Tags C-terminal angeordnet sind. Die Tag-Sequenz beeinhaltet ein c-myc-Tag (AAEQKLISEEDLNGAA) und ein Hexa-Histidin-Tag .
Fig. 2 : SDS-Gel der verschiedenen Antikörper
SDS-PAGE von vier verschiedenen Konstrukten für jeden der drei scFvs- D4 (lanes 1-4) , L36 (Spur 5-8) und XR5 (Spur 9- 12) . Die vier Konstrukte sind pUC119 nicht fusionierter scFv (Spur 1, 5 and 9), pKBJ3 (Spur 2, 6 and 10), pKBJl (Spur 3, 7 and 11) and pKBJ2 (Spur 4, 8 and 12) .
Fig. 3.a-c : ELISA des scFv, und der scFv-Konstrukte in pKBJl, pKBJ2 und pKBJ3 auf Laminin, Fibronectin und A76- A/C7.
ELISA der drei verschiedenen scFv und der pKBJ-Konstrukte dieser scFvs, der die Bindung von D4 an Fibronektin von L36
an Laminin, und von XR5 an den monoklonalen Maus-Antikörper A/C7 zeigt. Das Domäne I-Fusionskonstrukt pKBJ3 (•) ist generell aktiver als die Domäne I-II-Fusionskonstrukte pKBJl (■) und pKBJ2 (A) , welche wiederum eine höhere Aktivität als der nicht-fusionierte scFv, pUC119 (♦) besitzen. In den Verdünnungsreihen sind Mittelwerte aus ZweifachbeStimmungen dargestellt .
Fig. 4. Aktivität in den Fraktionen der praparativen HPLC
Die Aktivität der verschiedenen Multimerisierungsstadien der pKBJl- und pKBJ3-Konstrukte wurde für die verschiedenen Konstukte der einzelnen scFv bei Benutzung gleicher Mengen an Monomer (leere Balken) , Dimer (schraffierte Balken) und Multimer (ausgefüllte Balken) verglichen. Die pKBJ3- Multimere sind generell aktiv, nicht jedoch die pKBJl- Multimere von L36 und D4. L36 scheint als Dimer am aktivsten zu sein, was auf eine Tendenz dieses scFv zur Bildung aktiver Dimere hindeutet .
Fig. 5
HPLC Gelfiltration wurde mit einer GX3000 Gelfiltrationssäule für R5 pKBJ3 Fusionsprotein durchgeführt. A) zeigt das gereinigte Monomer nach 36 h bei 37°C, b) zeigt bei gleichen Bedingungen die Daten für gereinigte Dimereundc) zeigt bei gleichen Bedingungen die Daten für gereinigte Multimere (Trimere, Tetramere,
Pentamere ) . d) zeigt eine Gelfiltrationsdiagrammshows von
10-fach konzentriertem Monomer. In allen Fällen entsprechen die Retentionszeiten von 21, 18, nd 15 Minuten den Monomeren, Dinieren bzw. den Multimeren. Gelfiltrationsanalysen mit Hilfe der GX3000 Saulentrenneung
erlaubt nur die Trennung von Monomeren, Dimeren und höheren Multimeren.
Fig. 6
HPLC Gelfiltration mit einerGX4000 Säule ermöglicht mit einem Größenausschluß von 7MDa die Separation von größeren Multimeren Die Daten zeigen, daß Tetramere die ■ am häufigsten vorkommenden Multimere sind.
Fig. 7
Analyse der Hetero-Multimerisierung von pKBJ3 Fusiosnproteinen (Dl Fusionsproteinen) mit Hilfe eines Sandwich ELISA. Der ELISA wurde durchgeführt, indem A/C7 in den Wells immobilisiert wurde (♦) und eine Bindungvon R5/D4 pKBJ3 Fusiosnprotein mit Hilfe eine Bindung von Fibronektin, Fibrinogen und anti-Rabbit-HRP Antikörper nachgewiesen wurde. In einem spiegelbildlichen ELISA wurde Fibronektin immobilisiert (■) und anschließend mit R5/D4 pKBJ3 Fusionsprotein inkubiert und die Bindung mit A/C7 und anti-mouse HRP Antikörper nachgewiesen.. Beide Tests zeigen eine Konzentrationsabhängige Bindung.
Fig. 8.a-d: Immunisierungen von Balb/c-Mäüsen mit dem Antikörper L36
3 Mäuse wurden am Tag 0 und Tag 14 mit je 50μg gereinigtem L36 entweder als a) scFv-L36 allein, b) scFv-L36 in Kombination mit inkomplettem Freund'schen Adjuvanz, c) scFv-L36 als Fusionsprotein mit den Domänen I und II von Proteinlll und d) scFv-L36 als Fusionsprotein mit Domäne I von Proteinlll immunisiert. Den Mäusen wurde am Tag vor der Immunisierung (-1) und nach Tag 28 (+28) Blut entnommen und
die Seren auf scFv-L36-spezifische IgM- und IgG-Antikörper in zwei Verdünnungen 1:50 und 1:250 untersucht. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von 2 unabhängigen Messungen.
Fig. 9: Dosisabhängiger Effekt der Seren auf die L36- Bindung an Laminin.
A) L36-Erkennung mit 1:50- bzw. 1 : 250-verdünnten Seren von Mäusen, die mit L36-scFv (AI, A2 und A3) , L36-scFv in FIA (Bl und B2) , L36 fusioniert an Domäne I-II (Cl, C2 und C3) und L36-scFv fusioniert mit Domäne I (Dl, D2 und D3) immunisiert wurden, vor der Immunisierung (Tag -1) und nach der Immunisierung (T ag 28) .
B) Kompetition der L36-Bindung an immobilisiertes Laminin-1 mit Seren (Verdünnung 1:15, 1:45 und 1:135) von Mäusen, die mit L36-scFv (A2 und A3) , L36-scFv in FIA (Bl und B2) , L36 fusioniert an Domäne I-II (C2 und C3) und L36-scFv fusioniert mit Domäne I (Dl und D2) immunisiert wurden, vor der Immunisierung (Tag -1) und nach der Immunisierung (Tag 28) .
Fig. 10: Ligandenanalyse mittels anti-idiotypischer Antikörper.
Erkennung von polyklonalen Kaninchen-anti-EHS-Laminin- Antikδrpern mit 1 :25-verdünnten Seren von Mäusen, die mit L36-scFv (A2 und A3) , L36-scFv in FIA (Bl und B2) , L36 fusioniert an Domäne I-II (C2 und C3) und L36-scFv fusioniert mit Domäne I (Dl und D2) immunisiert wurden.
Tabelle 4 : Spaltstelle für proteolytische Enzyme.
Kann die erste Aminosäure von dem „Ausschnitt des pIII" sein.
Tabelle 5 : Periplasmatische Lo alisationssignale
Tabelle 6 : Sekretorische Lokalisationssignale