TWI613212B - 作爲澱粉樣蛋白結合劑之ｇ３ｐ融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本發明係相關於用於減少澱粉樣蛋白，及/或用於增進澱粉樣蛋白之去凝集作用之試劑與醫藥組成物。該組成物亦可用於檢測澱粉樣蛋白。

Description

作為澱粉樣蛋白結合劑之G3P融合蛋白

本發明係有關包含絲狀噬菌體(filamentous bacteriophage)g3p蛋白之澱粉樣蛋白結合片段或此類澱粉樣蛋白結合片段之突變體或變體形式之融合蛋白。本發明涵蓋編碼此類融合蛋白之核酸分子與構築體、以此類核酸分子轉形之細胞，以及以重組方式製造此類融合蛋白之方法。此外，本發明係有關包含本文所揭示融合蛋白之醫藥組成物，以及此類組成物在治療上與預防上用於減少與疾病，如全身性與周邊性澱粉樣蛋白疾病、神經退化性疾病包括神經退化性τ病變(tauopathies)及傳染性海綿狀腦病變(普裡昂蛋白(prion)相關之疾病)，相關聯之澱粉樣蛋白負荷之用途。本發明亦涵蓋以此類組成物用於預防該些疾病相關聯之澱粉樣蛋白累積，以及使用此類組成物作為診斷試劑以檢測澱粉樣蛋白，從而診斷此類疾病。

在蛋白質錯誤折疊疾病之動物模式中，絲狀噬菌體M13及相關之絲狀噬菌體具有效用，因此，其可為蛋白質錯誤折疊疾病之有潛力治療類型。請見，美國專利公開號US 2011/0142803，在此併入本案以作為參考資料。特別 是，目前發現絲狀噬菌體具有媒介清除大腦中已形成之澱粉樣蛋白的能力。請見，例如，WO2006083795與WO2010060073，在此併入本案以作為參考資料。

M13噬菌體為Ff噬菌體家族成員之一，其為具有406個胺基酸的成熟型g3p。GenBank Ref Seq NP_510891.1提供了參考序列，其中包括18個殘基的胺基端訊息序列。相較於公開的序列，變體具有胺基酸差異很常見。I家族之絲狀噬菌體具有g3p且異於Ff家族成員，但是即便如此，g3p在家族之間仍為高度保留。Stassen et al.,J Mol Evol(1992)34：141-52。

G3p已經有晶體結構。Lubkowski et al.,Structure(1998)7(6)711-722。該蛋白質包含3個折疊結構域，其由彎曲之富含甘胺酸之連接子序列分開。兩個胺基端結構域N1與N2含有262個胺基酸，並相互作用以形成N1-N2複合體。羧基端(CT，亦稱為N3)結構域含有146個胺基酸，其與g8p進行疏水性交互作用，使g3p錨泊於噬菌體顆粒。Marvin,Current Opin.in Structural Biology(1998)8：150-158。由Holliger,J Mol.Biol.(1999)288(4)：649-57提出的N1-N2結構域融合蛋白2g3p所製成之公開可用的帶狀結構顯示於圖1。

不同於多數蛋白質，未折疊之N1與N2結構域之潛伏性“閉鎖”形式，為g3p產生其原始生物活性所必需。Eckert & Schmid,J.Mol.Biol.(2007)373：452-461。在感染之初期步驟中，N2經由其外緣之殘基結合於細菌F纖毛。 Deng & Perham,2002。此種N2之初期結合，可經由“打開”N1-N2複合體而“開啟”g3p，使N1隨後結合於共同受體TolA。在g3p之N1-N2片段中，初步開啟步驟之熱轉變使N2於48.1℃之熔融溫度(T_M)下發生未折疊。此流程之一部分涉及Gln212-Pro213胜肽鍵之異構化作用。Pro213在開啟狀態下為反式轉換。N1仍維持穩定折疊直到第二步驟，其發生於T_M值60.2℃。請參照Eckert & Schmid,2007。

N1-N2片段之突變已被用於研究多種突變體之穩定性與感染力。Eckert & Schmid,2007。其中一種被命名為“3A”的變體，會破壞纖毛結合及降低N2結構域之穩定性。在此突變中，T_M值降至42.6℃。3A具有下列突變體：W181A、F190A，以及F194A。另一N2突變體G153D會使N2不穩定，並使T_M值降至44.4℃。突變體Q129H會穩定N2，使T_M值升至51.4℃。IY變體為於鉸鏈區含有突變體T101I與D209Y，並增加N1-N2片段之穩定性(T_M=56.5℃)。IHY含有突變體T101I、Q129H，以及D209Y(T_M=60.1℃)。IIHY含有突變體T13I、T101I、Q129H，以及D209Y(T_M=61.8℃)。突變體Q129Y與T13I兩者皆具有穩定性，而加入這些突變會進一步增加熔融溫度(T_M)。噬菌體感染力之變化與g3p內部結構域交互作用之強度成反比。Eckert & Schmid,2007。刪除N2結構域(噬菌體fd(△N2))可增加感染力，其解除N2結構域對於N1與TolA之間結合之阻斷效應。請參照同上。

近來發現，g3p亦媒介絲狀噬菌體與澱粉樣蛋白 之結合，其作用方式類似噬菌體感染細菌之流程。WO 2013/082114揭示了噬菌體g3p可直接結合於澱粉樣蛋白纖維，而該噬菌體媒介之去凝集作用取決於此種初始結合步驟。以g3p之辨識方式用於絲狀噬菌體媒介之澱粉樣蛋白之結合，為新類型的治療試劑與診斷試劑提供一基礎。本發明提供此類治療與診斷組成物，及以其檢測、診斷、治療、預防，或延遲澱粉樣蛋白凝集相關聯之疾病與失調的發生。

本發明之額外目的與優點係部分闡述如下，並將因該說明而更臻清楚，或經由本發明之實踐而理解。本發明之目的與優點將因附加之申請專利範圍中所特別指明之要素與組合而理解與達成。應瞭解到，前述之一般說明與下列之詳細說明，如所揭示，僅具示例性與解釋性，而非用於侷限本發明。

圖1係顯示g3p之N1與N2結構域及鉸鏈區之帶狀結構。

圖2A-2C係比對不同來源之g3p。圖2A係比對噬菌體M13(SEQ ID NO：1)、fd(SEQ ID NO：2)，及f1(SEQ ID NO：3)之g3p，其中包括共同序列(SEQ ID NO：4)。圖2B係比對噬菌體I2-2(SEQ ID NO：5)與Ike(SEQ ID NO：6)之g3p，並伴隨I2-2與Ike之共同序列(SEQ ID NO：7)。圖2C係顯示噬菌體If之g3p胺基酸序列(SEQ ID NO：8)。

圖3A與3B係顯示噬菌體結合作用之表面電漿共振(SPR)研究。將10¹⁴噬菌體/mL流過生物感測器晶片，進 行結合於Aβ纖維與結合於Aβ單體之比較。圖3B係顯示圖3A之SPR數據計算出的K_a、K_d，以及K_D。

圖4A與4B係顯示結合作用之研究。圖4A係顯示隨著fAβ42莫耳量之增加，兩個噬菌體劑量(10¹¹/mL與10¹²/mL)之直接結合試驗。圖4B係結合競爭研究，其提供一替代方法以測定M13結合之K_D值。其使用構築體1。

圖5係顯示結合競爭作用之結果，其於澱粉樣蛋白纖維結合競爭試驗中比較熱變性(方形；於90℃下10分鐘)與原始構形(圓形)之M13(構築體1)。

圖6係顯示硫代黃素T(ThT)螢光試驗，其以fAβ42培養於有或無存在2個濃度之M13噬菌體中(構築體1)。

圖7A與7B係顯示於ThT去凝集試驗中改變個別試驗參數之影響。圖7A係顯示於兩個鹽類濃度(0.15 M與1.5 M)存在下之去凝集百分比。圖7B係顯示於兩個溫度下(4℃與37℃)fAβ之剩餘百分比。其使用構築體1。

圖8A與8B係使用fAβ42之M13澱粉樣蛋白結合試驗。在圖8A中，於18℃至58℃溫度下培養3小時以報導M13結合作用。圖8B係顯示37℃與50℃培養條件之結合動力學。

圖9A-9C係顯示以蛋白水解方式移除g3p對於噬菌體-澱粉樣蛋白交互作用之影響。利用蛋白酶Arg C自M13噬菌體剪去g3p(M13△g3p)。圖9A係顯示Aβ結合競爭研究之結果，其以M13△g3p噬菌體與原始(其處理方式與經Arg C處理之噬菌體相同，但不處理蛋白酶)噬菌體進行比較。圖9B係顯示相較於原始噬菌體，處理Arg C對於M13△g3p噬菌體感染力之影響。圖9C係以去凝集試驗比較Arg C處理之噬菌體與原始噬菌體。

圖10A與10B係顯示g3p之N1-N2片段之結合競爭試驗結果，其中包括重組型可溶性N1N2(rs-g3p(N1N2)；“構築體3”)、M13△g3p(經Arg C處理)，及以M13作為經標定之M13結合至fAβ42之競爭試劑。圖10B係顯示競爭試驗之重複結果。

圖11係顯示噬菌體fd、IIHY、AAA，以及M13之競爭作用數據。於50℃下，噬菌體fd、AAA，及IIHY進行預活化1.5小時，隨後進行經活化與未經活化之Fd、AAA與IIHY的比較，其中比較其於37℃之45分鐘培養期內對於經標定之M13結合至Aβ的競爭能力。

圖12A係顯示rs-g3p(N1N2)(構築體3)之概要圖。圖12B係顯示rs-g3p(N1N2)之離子交換情況。圖12C係顯示以Sephacryl S-300與rs-g3p(N1N2)進行膠體過濾試驗之結果。圖12D係顯示rs-g3p(N1N2)之西方墨點法，並以g3p與g8p作為對照組。第1與第2行係作為陽性對照組之M13噬菌體，並以多株抗-M13抗體檢測，其可檢測g8p與g3p。第3與第4行為經純化之rs-g3p，並以相同的多株抗-M13抗體檢測。

圖13係顯示rs-g3p(N1N2)(構築體3)之SPR數據。rs-g3p(N1N2)可有效結合於fAβ42，並具有K_D值約160 nM，但不與單體結合。

圖14A與14B係顯示ThT螢光試驗，用於測定指定樣本中存在之澱粉樣蛋白。在37⁰C下，以10 μM之Aβ42單體培養於有或無存在5種濃度之rs-g3p(N1N2)(構築體3)中3天。在3天結束後，將結合的ThT螢光量化，以測定產生的纖維量。IC₅₀為約20 nM，其顯示rs-g3p(N1N2)可有效抑制Aβ42纖維之形成。本圖亦指出，結合作用具有劑量依賴性。重複進行實驗顯示，IC₅₀之範圍介於20 nM與100 nM之間。

圖15A係顯示以fAβ42培養於有或無存在rs-g3p(N1N2)(構築體3)之穿透式電子顯微照片(TEM)結果。圖15B係顯示以Aβ42與2μM rs-g3p(N1N2)(構築體3)培養於37℃下7天之ThT螢光試驗結果。rs-g3p(N1N2)可抑制fAβ42的形成。

圖16證實rs-g3p(N1N2)(構築體3)可有效抑制α突觸核蛋白纖維的形成。在37℃下，於300 rpm攪拌4天以聚集25μM之α突觸核蛋白(請見，第1個條形圖)。第2個條形圖代表α突觸核蛋白單體加上1 x 10^-13之五聚體M13噬菌體，其於37℃下搖晃3天。第2個條形圖之結果顯示，五聚體M13可抑制α突觸核蛋白纖維聚集。第3個條形圖代表α突觸核蛋白單體加上83 nM rsg3p單體。第3個條形圖之結果顯示，在抑制α突觸核蛋白纖維形成方面，單體之功效較五聚體M13差。第4個條形圖為陰性對照組，其顯示時間點為零時之α突觸核蛋白單體。第5個條形圖為未加入α突觸核蛋白纖維之g3p單體，顯示其可決定g3p是否結合至pTAA並阻斷該染 劑結合至纖維。第5個條形圖之結果顯示，g3p無法與pTAA結合。

圖17係顯示rs-g3p(N1N2)(構築體3)、M13(構築體2)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(構築體4)之競爭性結合作用數據，並以IgG4-Fc作為陰性對照組。

圖18係顯示M13(構築體2；方形)、rs-g3p(N1N2)(構築體3；三角形)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(構築體4；倒三角形)，以及重組型IgG4-Fc陰性對照組(菱形)之競爭性結合作用的數據比較。

圖19係顯示濾膜捕捉試驗，其比較了五種濃度的Aβ42纖維與有或無添加兩種濃度的M13(構築體2)、800 nM rs-g3p(N1N2)(構築體3)，以及三種濃度的rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(構築體4)。

圖20係顯示rs-g3p(N1N2)(構築體3；“單體”)與經卵白素共軛結合之rs-g3p(N1N2)(“SA[g3pN1N2]_n=2-4”；“SA-g3p”；“四聚體”)之競爭性結合作用數據。以rs-g3p(N1N2)與SA-g3p進行比較，係比較其於37℃之3小時培養期間內對於經標定之M13結合至Aβ的競爭能力。

圖21係顯示濾膜捕捉試驗，其比較五種濃度之fAβ42及有或無添加兩種濃度之rs-g3p(N1N2)(構築體3；“單體”)與兩種濃度之SA-g3p(“四聚體”)。

圖22A與22B係顯示時間點為零時(圖22A)及以SA-g3p培養三天後(圖22B)fAβ42之TEMs。

圖23係顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc構築體“構築 體4”之胺基酸序列(SEQ ID NO：9)。“構築體4”之N1N2區段係源自“構築體1”之N1N2區段(SEQ ID NO：10)。

圖24係顯示另一rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc構築體“構築體5”之胺基酸序列(SEQ ID NO：11)。“構築體5”之N1N2區段係源自“構築體2”之N1N2區段(SEQ ID NO：12)。

圖25係顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc構築體“構築體6”之胺基酸序列(SEQ ID NO：13)。“構築體6”之N1N2區段係源自“構築體2”之N1N2區段。

圖26係比對fd(SEQ ID NO：14)、f1(SEQ ID NO：15)、M13(SEQ ID NO：16)、Ike(SEQ ID NO：17)、I2-2(SEQ ID NO：18)，以及If1(SEQ ID NO：19)之N2之胺基酸序列。星號“*”代表具有單一、完整保留的殘基位置。冒號“：”代表強相似性之組間保留性，其於Gonnet PAM 250矩陣中積分高於0.5。句點“.”代表弱相似性之組間保留性，其於Gonnet PAM 250矩陣中積分等於或低於0.5。

圖27A係構築體3之圖解。圖27B係顯示構築體3之g3p部分之DNA序列(SEQ ID NO：23)。圖27C係顯示構築體3之g3p部分之胺基酸序列(SEQ ID NO：24)。

圖28係檢測兩種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白於減少阿茲海默氏症基因轉殖小鼠模型澱粉樣蛋白β之能力的實驗結果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)兩者可明顯減少阿茲海默氏症小鼠海馬迴澱粉樣蛋白β的量。

圖29係檢測兩種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白於減 少阿茲海默氏症基因轉殖小鼠模型澱粉樣蛋白β之能力的實驗結果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)兩者可明顯減少阿茲海默氏症小鼠大腦皮質澱粉樣蛋白β的量。

圖30A與30B係顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)之Aβ42聚集之抑制作用。圖30A係不含SDS之“原始”瓊脂凝膠。樣本以不含SDS之TEA緩衝液進行，且不煮沸。結果顯示，構築體6能抑制fAβ42聚集。圖30B係以ThT螢光試驗測定給定樣本之澱粉樣蛋白。在37℃下，以10 μM之Aβ42單體培養於有或無存在2種濃度的rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)中1天。在1天結束後，以量化經結合之ThT螢光，測定形成之纖維量。rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)可有效抑制Aβ42纖維之形成。本圖亦指出，以構築體6抑制纖維之形成具有劑量依賴性。

圖31A、31B、31C與31D為典型的圓二色數據，其顯示rs-g3p(N1N2)(構築體3)可抑制Aβ42聚集。圓二色係測定欲分析之Aβ纖維的α-螺旋與β-摺疊含量。圖31A係T=0、T=24小時與T=48小時之Aβ42之橢圓率(ellipticity)與波長。圖31B係T=0、T=24小時與T=48小時之Aβ42加上構築體3之橢圓率與波長。圖31C係顯示典型的ThT試驗，其中以量化結合之ThT螢光測定24與48小時之間形成之纖維量。構築體3可有效抑制Aβ42纖維之形成。圖31D係顯示T=0、T=24小時與T=48小時之構築體3之橢圓率與波長。總 之，這些數據確認了構築體3抑制Aβ42聚集的能力。

圖32係顯示M13(構築體2)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)可於N2a細胞中抑制寡聚物誘發之毒性。請見，例如，Stine et al.(2003)J.Biol.Chem.278(13)：11612-11622與Stine et al.(2011)Erik D.Roberson(ed.)Alzheimer’s Dsease and Frontotemporal Dementia,Methods in Molecular Biology,vol.670：13-32。在處理之前，N2a細胞以血清飢餓48小時以產生分化。在加至N2a細胞之前，Aβ42寡聚物(2 uM)於37⁰C下以構築體2與構築體6進行預處理3小時。時間點為零(“TO”)之複合物未進行預處理。在培養24小時之後，檢測腺苷酸激酶(“AK”)之釋放。AK釋放至培養基，表示細胞死亡/溶解。以Stine et al.,2011之描述製備Aβ42寡聚物。結果顯示，M13與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc為有毒寡聚物之有效抑制劑。

圖33係顯示濾膜捕捉試驗，其包含六種濃度的Aβ42纖維與有或無1 x 10¹²/ml M13(構築體2)；80 nM與800 nM之rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc構築體(構築體5)；以及80 nM與800 nM之rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)。在37℃下，以構築體2、5與6培養Aβ42纖維3天，接著進行濾膜留滯試驗。利用mAb 6E10(1：15000)檢測濾膜，以辨識濾膜上捕捉到的Aβ42纖維。800 nM之構築體5或構築體6等於5 x 10¹⁴/ml分子莫耳濃度之構築體2。結果顯示，構築體2、5與6可有效去凝集β澱粉樣蛋白纖維。

圖34A與34B為代表性試驗，用於測定以fτ預培 養3小時後，結合至fAβ42之M13(構築體2)的量。將5 μM之結合至構築體2之Aβ42單體培養於有或無存在4種濃度之fτ中3小時。由於fAβ：M13-Alexa488可沉澱(pellet)而fτ：M13-Alexa488無法沉澱，測定經沉澱材料之螢光消失，表示fτ可競爭fAβ之結合作用。於此，在3小時後，經由量化經沉澱之結合競爭作用之Alexa488螢光，測定形成之M13-fAβ的量。結果顯示，fτ可與M13-Alexa488(構築體2)競爭fAβ42之結合。

圖35係顯示一代表性SPR試驗之結果，其檢測rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體4)結合至fτ的能力。結果顯示，構築體4可有效結合於fτ。

圖36A與36B係顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)之fτ去凝集能力。將40 uM之τ微管結合重複區段(“MTBR”)稀釋於50 mM之超氧化物歧化酶(“Sod”)以製備τ纖維。將各濃度之構築體6與經製備之fτ培養於pH7.0之醋酸鹽緩衝液，其於37⁰C下歷時72小時。紀錄5倍過量之ThT存在時之ThT螢光值。圖36A係ThT試驗之代表性結果，其顯示構築體6之fτ去凝集能力。圖36B係另一代表性實驗，其確認構築體6之fτ去凝集能力。圖36A與36B亦顯示構築體6之fτ去凝集具有劑量依賴性。

圖37A、37B、37C與37D係代表性實驗，其顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)與rs-g3p(N1N2)(構築體3)隨時間變化之Aβ凝集抑制作用。將Aβ42溶於DMSO並稀釋於含有NaN₃之PBS。在37℃下，Aβ42可於有或無各種濃度 之構築體3與構築體6時凝集。利用ThT螢光測定Aβ42之凝集作用。圖37A係顯示樣本之SDS PAGE。圖37B係顯示一代表性實驗之結果。圖37C係顯示另一代表性實驗之結果。圖37D摘錄結果。

圖38A與圖38B係顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)抑制PrP轉變為PrP-Sc之能力的實驗結果。利用構築體6及IgG細胞裂解液進行超速離心，以分離可溶性(上清液)與不溶性(丸粒)之PrP物種。以抗-PrP單株抗體(6D11)進行PrP物種之生化學觀察。在IgG存在下，PrP於可溶性與不溶性分液中有所區分。在構築體6存在下，不溶性PrP有限。數據代表n=4。

圖39A與圖39B係顯示在普裡昂蛋白病變之細胞培養模型中，rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)減少PrP^Sc累積與凝集之能力的實驗結果。圖39A係顯示以構築體6與IgG處理後，未經切割與經PK切割之N2a22L^Sc細胞裂解液之生化學解析。在以濃度漸增之構築體6處理之細胞中，清楚觀察到PrP^Sc之量明顯減少。以~0.08μg/ml之構築體6處理時，PrP^Sc之量約減少50%。以10μg/ml之構築體6處理時，PrP^Sc之量減少至5.725%，p<0.0001。以1μg/ml之鼠科IgG處理N2A22L^Sc細胞時，PrP^Sc之量未觀察到明顯變化。在圖39B中，X光片隨後經數字化，並以經IgG處理之相同培養代數N2a22L^Sc細胞之功效(其視為100%)進行初步標準化。隨後，相對於相同方式墨染的未切割裂解液，分析經PK切割之墨染圖的密度測量數據，並以PrP^Sc/PrPc變化百分比表 示。數據代表n=4。

圖40係以rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)處理後，檢測兩種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白對於阿茲海默氏症基因轉殖小鼠模型海馬迴突觸體素(synaptophysin)量之影響的實驗結果。兩種構築體明顯增加阿茲海默氏症小鼠海馬迴突觸體素的量。

圖41係以rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)處理後，檢測兩種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白對於阿茲海默氏症基因轉殖小鼠模型海馬迴Iba-1量之影響的實驗結果。兩種構築體明顯增加阿茲海默氏症小鼠海馬迴Iba-1的量。

圖42係以rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)處理後，檢測兩種rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白對於阿茲海默氏症基因轉殖小鼠模型海馬迴GFAP量之影響的實驗結果。兩種構築體皆未明顯改變阿茲海默氏症小鼠海馬迴GFAP的量。

圖43係比較rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)之結合實驗結果。兩構築體可有效結合至fAβ並具有類似之K_D值(~11)。

圖44A與44B係顯示rs-g3p(N1N2)(構築體3)抑制τ聚集之能力。在圖44A中，以1μM τ單獨培養或共同培養於1μM構築體3，並於5天後以TEM分析。構築體3抑制τ聚集。圖44B係顯示以fτ培養於有或無存在3種濃度之 rs-g3p(N1N2)(構築體3)之ThT螢光試驗結果。構築體3對於τ聚集之抑制作用具有劑量依賴性。

圖45係顯示一實驗流程，用於分析fAβ42與rs-g3p(N1N2)(構築體3)之間的交互作用。

圖46係顯示NMR研究結果，以分析fAβ42與rs-g3p(N1N2)(構築體3)之間的交互作用。H代表氫及D代表氘。Aβ纖維之氫隨時間轉變為氘，且其速率受到構築體3結合至纖維的影響。結果顯示，構築體3與fAβ42之間的分子疊代(molecular iteration)位於fAβ42殘基17至22及33至40。

圖47A、47B、47C與47D係顯示培養744小時後，構築體3去凝集預先形成之fAβ42的代表性TEMs。圖47A為僅單獨之fAβ42。圖47B係顯示fAβ42加上構築體3。圖47C係顯示相較於圖47A，單獨fAβ42之放大倍率。圖47D係顯示相較於圖47B，fAβ42加上構築體3之較大倍率。

圖48係一代表性SPR試驗之結果，其顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)可有效結合fτ。

圖49A係一代表性ThT試驗之結果，其顯示構築體6之fτ去凝集能力。圖49B係圖49A實驗之圖形呈現。圖49A與49B亦顯示構築體6之fτ去凝集作用具有劑量依賴性。

圖50A係顯示rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG4-Fc(構築體8)結合至Aβ纖維之SPR研究。結果顯示，構築體8強烈結合於Aβ纖維(K_D~36 nM)。G3p之N1N2片段(未連接至Fc結構域)顯示結合作用較弱(K_D~36 nM)。圖50B係結合競爭試 驗之結果，其顯示rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG1-Fc(構築體8)結合至fAβ1-42之能力。G3p之N1N2片段(未連接至Fc結構域)顯示結合作用較弱。

圖51係顯示If1 g3p(SEQ ID NO：29)與fd g3p(SEQ ID NO：30)之間的胺基酸比較。在If1與fd之間，g3p N1結構域之相同胺基酸以陰影表示。N1結構域以加深表示。

圖52A與52B係直接注射阿茲海默氏症小鼠體內模型之大腦後，rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)明顯減少Aβ與τ纖維沈積之能力的實驗結果。在圖52A中，相較於對照組，接受構築體6之小鼠，Aβ的量明顯減少。在圖52B中，相較於對照組，接受構築體6之小鼠，τ的量明顯減少。

圖53A與53B係以全身性而非直接注射大腦時，rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)治療AD之能力的實驗結果。圖53A與53B顯示，相較於對照組小鼠，接受構築體6之AD小鼠過動症下降。

圖54係以全身性而非直接注射大腦時，rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)治療AD之能力的實驗結果。在圖54中，相較於對照組，接受構築體6之AD小鼠繞圈行為減少。

圖55係以全身性而非直接注射大腦時，rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)治療AD之能力的實驗結果。在圖55中，相較於對照組，接受構築體6之AD小鼠角落跳躍行為減少。

圖56係以全身性而非直接注射大腦時， rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)治療AD之能力的實驗結果。在圖56中，相對於接受對照品PBS之小鼠，接受構築體6之AD小鼠在Y型迷宮中的臂進入次數(arm entries)有明顯更多的自發性交替。

序列之簡單說明

較佳實施例之詳細說明

本發明係提供融合蛋白，其包含g3p之澱粉樣蛋白結合片段或其突變體或變體。在特定之實施例中，本發明之融合蛋白進一步包含免疫球蛋白之Fc片段恆定區。在該些實施例之一觀點中，該融合蛋白為可溶性。在該些實施例之另一觀點中，該融合蛋白藉由，例如，去凝集及/或預防或抑制澱粉樣蛋白之凝集(例如，澱粉樣蛋白斑點)，以減少澱粉樣蛋白。本發明之融合蛋白結合至澱粉樣蛋白。在一些實施例中，本發明之融合蛋白移除及/或抑制形成的有毒寡聚物。

本發明係提供融合蛋白醫藥組成物，及以其結合與減少澱粉樣蛋白之用途。減少澱粉樣蛋白包括，舉例而言，去凝集澱粉樣蛋白、預防及/或抑制澱粉樣蛋白之凝集，以及移除及/或預防有毒寡聚物之形成。本發明亦包括 使用該組成物檢測澱粉樣蛋白沈積物，以及診斷具有澱粉樣蛋白特徵之疾病與病況。

定義

術語“g3p”單獨或以術語如“g3p衍生之”使用時，意指任何的野生型或重組型絲狀噬菌體g3p蛋白質(包括g3p之片段、變體及突變體)。該術語不應理解為侷限於衍生自任何特定絲狀噬菌體之g3p。舉例而言，術語“g3p”包括SEQ ID NO：1及圖2所示之相關蛋白質。

術語“結構域”意指多胜肽區段(包括蛋白質)具有某些獨特物理特性或角色，舉例而言，包括由一部分之多胜肽鏈所組成之獨立折疊結構。結構域可含有該獨特物理特性之多胜肽序列，或其可含有物理特性之片段，其中保留其結合特徵(亦即，其可結合至第二種結構域)。一結構域可與另一結構域結合。換句話說，第一種結構域可自然地結合至第二種結構域。舉例而言，g3p N2結構域結合於F纖毛且g3p N1結構域結合於TolA。

使用於此，術語“澱粉樣蛋白”、“澱粉樣蛋白原纖維”及“澱粉樣蛋白纖維”為一種三級結構之通用術語，其由任何的多種不同蛋白質凝集而成，並由垂直於纖維軸堆疊之依序排列之β摺疊組成。Sunde et al.,J.Mol.Biol.(1997)273：729-39。示範性之澱粉樣蛋白為出現於阿茲海默氏症之澱粉樣蛋白β凝集物，其由β澱粉樣蛋白胜肽“βA”組成，其為切割自人類澱粉樣蛋白前驅蛋白質(hAPP)之39至43個胺基酸之內部片段。其具有短型如Aβ40，及長型如Aβ42，其 為更具原纖維性之Aβ異構型。其他示範性之澱粉樣蛋白包括折疊錯誤之α突觸核蛋白(與帕金森氏症相關)、杭丁頓蛋白(與杭丁頓氏症相關聯)、τ(與阿茲海默氏症相關)，以及普裡昂蛋白之異常構形PrP^Sc。本文亦提供其他範例，並為本領域之技術人員所習知(請見，例如，Aguzzi(2010)，以及Eichner and Radford,Mol.Cell(2011)43：8-18)。因此，除非蛋白質或胜肽已有明訂，術語“澱粉樣蛋白”、“澱粉樣蛋白原纖維”或“澱粉樣蛋白纖維”之使用不應理解為侷限於任何特定蛋白質或疾病。

術語“g3p之澱粉樣蛋白結合片段”意指g3p之片段可維持結合至澱粉樣蛋白之能力。術語“g3p之澱粉樣蛋白結合片段”亦指可維持澱粉樣蛋白結合能力之g3p之突變體與變體，包括g3p之N、C，或N與C端之截斷形式。

術語“貝他澱粉樣蛋白胜肽”同義於“β澱粉樣蛋白胜肽”、“βAP”、“βA”與“Aβ”。所有該些術語意指源自人類澱粉樣蛋白前驅蛋白質(hAPP)之澱粉樣蛋白形成肽。

本發明之融合蛋白或組成物，其包含該些描述為“去凝集”或“媒介去凝集作用”之融合蛋白，可減少已形成之凝集物。以濾膜捕捉試驗(filter trap assay)測定去凝集作用。Wanker et al.,Methods Enzymol(1999)309：375-86。濾膜捕捉試驗係說明於本文，並可用於檢測凝集物及偵測本發明組成物媒介之去凝集作用。以濾膜上澱粉樣蛋白滯留量之減少檢測去凝集作用，例如，去凝集試劑之濃度漸增時，染色量減少。

使用於此，融合蛋白或組成物可“減少澱粉樣蛋白”或“降低澱粉樣蛋白負荷”，意指其執行以下一或多者：抑制澱粉樣蛋白形成、導致澱粉樣蛋白去凝集、促進澱粉樣蛋白清除、抑制澱粉樣蛋白凝集、抑制及/或預防有毒澱粉樣蛋白寡聚物形成，及/或促進有毒澱粉樣蛋白寡聚物清除。

本發明所描述之“保護神經元免於澱粉樣蛋白損害”之任何產物或組成物，意指可預防新的澱粉樣蛋白累積及/或預防有毒澱粉樣蛋白寡聚物之形成。本發明所描述之“保護神經元免於澱粉樣蛋白損害”之產物或組成物，可預防性使用。產物或組成物是否保護神經元免於澱粉樣蛋白之損害，可由本文所述之神經元細胞毒性試驗測定。

使用於此，“PrP蛋白”、“PrP”與“普裡昂蛋白”意指能於適當條件下誘發導致蛋白質錯誤折疊疾病之凝集物產生的多胜肽。舉例而言，正常細胞的普裡昂蛋白(PrP^c)可於該條件下轉變成相對應之羊搔癢症異構型(PrP^Sc)，其造成的疾病包括但不侷限於，牛海綿狀腦炎(BSE)，或狂牛病、貓海綿狀腦炎、庫魯病(kuru)、庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob Disease；CJD)、格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease；GSS)，以及致死性家族性失眠症(FFI)。

使用於此，與融合蛋白或融合蛋白之g3p部分之澱粉樣蛋白結合片段有關之術語“變體”，意指相較於參考物質，其相對應之胺基酸序列含有至少一個胺基酸的差異 (取代、插入或刪除)。在某些實施例中，相較於參考序列，“變體”具有高度胺基酸序列同源性及/或保留的胺基酸取代、刪除及/或插入。在一些實施例中，相較於參考序列，變體具有不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個胺基酸之差異。“保留性取代”意指以第二個胺基酸取代第一個胺基酸，其不會實質上改變蛋白質、多胜肽或胺基酸序列，如g3p蛋白或g3p之澱粉樣蛋白結合片段，之化學、物理及/或功能特性(例如，g3p蛋白或澱粉樣蛋白結合片段保留相同的電荷、結構、極性、疏水性/親水性，及/或保留功能如辨識、結合及/或減少澱粉樣蛋白之能力)。此種保留性胺基酸修飾作用係基於胺基酸側鏈取代基之相對類似性，舉例而言，其疏水性、親水性、電荷、大小，及其類似特性。示範性之保留性取代，其考量了多個前述之特性，為本領域之技術人員所習知，並包括：精胺酸與離胺酸；麩胺酸與天門冬胺酸；絲胺酸與蘇胺酸；麩醯胺酸與天門冬醯胺酸；以及纈胺酸、白胺酸與異白胺酸。術語“g3p之變體”或“g3p之澱粉樣蛋白結合片段之變體”亦包括具有至少70%、至少75%、至少78%、至少80%、至少82%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%之胺基酸序列等同於野生型g3p或其相對應片段之多胜肽。

術語“突變體”意指具有一或多個胺基酸被突變 之融合蛋白或融合蛋白之g3p之澱粉樣蛋白結合片段，以調控其治療或診斷效果。在某些實施例中，突變體為習知可作用於澱粉樣蛋白之胺基酸取代、刪除及/或插入。在其他實施例中，突變體為野生型g3p或其澱粉樣蛋白結合片段之保留性胺基酸所具有之取代、刪除及/或插入。在一些實施例中，相較於參考序列，突變體具有不超過75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個胺基酸之差異。在一些實施例中，胺基酸之取代為保留性取代。術語“變體”與“突變體”於此可互換使用，除了“變體”一般在本質上為非重組型，而“突變體”一般為重組型以外。術語“g3p突變體”或“g3p之澱粉樣蛋白結合片段突變體”亦包括具有至少70%、至少75%、至少78%、至少80%、至少82%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%之胺基酸序列等同於野生型g3p或其相對應片段之多胜肽。

“融合蛋白”為非天然存在之蛋白質，其含有至少兩種多胜肽結構域。本發明之融合蛋白包含以g3p之澱粉樣蛋白結合片段連接、融合或共軛連接至第二種蛋白質或多胜肽。在特定之實施例中，該融合蛋白包含g3p之澱粉樣蛋白結合片段與免疫球蛋白之Fc片段。

術語“活性化合物”、“活性試劑”與“活性成分”於此可互換使用，意指提供融合蛋白生物活性之融合蛋白部分。本發明融合蛋白之g3p部分為“活性化合物”、“活性 試劑”或“活性成分”。同樣地，本發明融合蛋白之g3p部分為生物活性或治療有效部分。本發明融合蛋白之g3p部分並非用於促進融合夥伴之蛋白質折疊，該融合夥伴隨後作為與g3p無關之治療試劑，如WO 2004/018685所揭示。本發明之融合蛋白亦非用於噬菌體顯現法(phage display)，如US 2009/105090所揭示。

術語“免疫原性”，使用於此，意指組成物引發哺乳類動物免疫反應之能力，其中該哺乳類動物暴露於該組成物。

使用於此，“構築體1”係源自野生型M13(請見，Genbank檔案：NC_003287.2，版本GI：56718463。在構築體1中，相較於野生型M13，Ser378(AGC)變為Gly(GGC)，且Ile87(ATT)變為Asn(AAC))。因此，在野生型M13中，“G”位於核酸編號2710，而在構築體1中，該位置為“A”。同樣地，在野生型M13中，“A”位於核酸編號4479，而在構築體1中，該位置為“T”。最後，在野生型M13中，“C”位於核酸編號4480，而在構築體1中，該位置為“T”。構築體1包含SEQ ID NO：10之核酸。

“構築體2”為野生型M13分離物(GenBank JX412914.1)。構築體2含有SEQ ID NO：12之核酸。

“構築體3”為重組型可溶性g3p片段，其包含g3p之N1與N2結構域(rs-g3p(N1N2))，內含SEQ ID NO：20之胺基酸。

“構築體4”為重組型可溶性g3p片段IgG4 Fc融合 蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸。“構築體4”之N1N2區段為源自“構築體1”之N1N2區段。“構築體4”之編碼核酸序列係闡述於SEQ ID NO：26。

SEQ ID NO：9所闡述的前21個胺基酸代表一訊息序列，在重組生產期間，胺基酸20與21之間被切割。SEQ ID NO：9之第21個胺基酸為甲硫胺酸，其為人為選殖(由多重選殖位置所編碼，用於將訊息序列融合至N1-N2序列)且有時亦於重組期間被切割。SEQ ID NO：9之第22個胺基酸為丙胺酸，其相對應於分離自M13噬菌體之g3p之N端胺基酸。SEQ ID NO：9之第22個胺基酸丙胺酸有時亦於重組期間被切割。SEQ ID NO：9之第506個胺基酸為C端離胺酸，其有時亦於真核細胞重組生產期間被切割。含有一或多種上述確定之N端與C端刪除之產物，皆為本發明之一部分。

因此，在一些實施例中，以“構築體4”說明之g3p融合蛋白為“成熟型之構築體4”，並包含SEQ ID NO：9之胺基酸21至506。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：9之胺基酸22至506(“N端Met被截斷之成熟型構築體4”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：9之胺基酸23至506(“N端Met-Ala被截斷之成熟型構築體4”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：9之胺基酸21至505(“C端Lys被截斷之成熟型構築體4”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：9之胺基酸22至505(“N端Met被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體4”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：9之胺基酸23至505 (“N端Met-Ala被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體4”)。

同樣地，還包括本文所述之構築體4之全長、N、C，及N與C端截斷形式之編碼核酸。在一實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸包含SEQ ID NO：26之核苷酸。在其他實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸為SEQ ID NO：26之一部分，其編碼g3p部分、或g3p-Ig部分，且不包括編碼訊息序列之核苷酸(亦即，不包括編碼SEQ ID NO：9之胺基酸1至20、1至22或1至23之核苷酸)。

“構築體5”為重組型可溶性g3p片段IgG4 Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸。“構築體5”之N1N2區段為源自“構築體2”之N1N2區段。“構築體5”之編碼核酸序列係闡述於SEQ ID NO：27。

SEQ ID NO：11所闡述的前21個胺基酸代表一訊息序列，在重組生產期間，胺基酸20與21之間被切割。SEQ ID NO：11之第21個胺基酸為甲硫胺酸，其為人為選殖(由多重選殖位置所編碼，用於將訊息序列融合至N1-N2序列)且有時亦於重組生產期間被切割。SEQ ID NO：11之第22個胺基酸為丙胺酸，其相對應於分離自M13噬菌體之g3p之N端胺基酸。SEQ ID NO：11之第22個胺基酸丙胺酸有時亦於重組期間被切割。SEQ ID NO：11之第506個胺基酸為C端離胺酸，其有時亦於重組生產期間被切割。含有一或多種上述確定之N端與C端刪除之產物，皆為本發明之一部分。

因此，在一實施例中，以“構築體5”說明之g3p融合蛋白為“成熟型之構築體5”，並包含SEQ ID NO：11之胺 基酸21至506。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸22至506(“N端Met被截斷之成熟型構築體5”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸23至506(“N端Met-Ala被截斷之成熟型構築體5”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸21至505(“C端Lys被截斷之成熟型構築體5”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸22至505(“N端Met被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體5”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸23至505(“N端Met-Ala被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體5”)。

同樣地，還包括本文所述之構築體5之全長、N、C，及N與C端截斷形式之編碼核酸。在一實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸包含SEQ ID NO：27之核苷酸。在其他實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸為SEQ ID NO：27之一部分，其編碼g3p部分、或g3p-Ig部分，且不包括編碼訊息序列之核苷酸(亦即，不包括編碼SEQ ID NO：11之胺基酸1至20、1至22或1至23之核苷酸)。

“構築體6”為重組型可溶性g3p片段IgG1 Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc)，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸。“構築體6”之N1N2區段為源自“構築體2”之N1N2區段。“構築體6”之編碼核酸序列係闡述於SEQ ID NO：28。

SEQ ID NO：13所闡述的前21個胺基酸代表一訊息序列，在重組生產期間，胺基酸20與21之間被切割。SEQ ID NO：13之第21個胺基酸為甲硫胺酸，其為人為選殖(由多重選殖位置所編碼，用於將訊息序列融合至N1-N2序列)且有時亦於重組期間被切割。SEQ ID NO：13之第22個胺基酸為丙胺酸，其相對應於分離自M13噬菌體之g3p之N端胺基酸。SEQ ID NO：13之第22個胺基酸丙胺酸有時亦於重組生產期間被切割。SEQ ID NO：13之第506個胺基酸為C端離胺酸，其有時亦於重組生產期間被切割。在抗體與相關融合蛋白之重組生產時，C端離胺酸之移除並不少見(J Lou et al.,Biotechnol Bioeng 2012 Sep；109(9)：2306-15)。含有一或多種上述確定之N端與C端刪除之產物，皆為本發明之一部分。

因此，在一實施例中，以“構築體6”說明之g3p融合蛋白為“成熟型之構築體6”，並包含SEQ ID NO：13之胺基酸21至509。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸22至509(“N端Met被截斷之成熟型構築體6”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸23至509(“N端Met-Ala被截斷之成熟型構築體6”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸21至508(“C端Lys被截斷之成熟型構築體6”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸22至508(“N端Met被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體6”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸23至508(“N端Met-Ala被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體6”)。

同樣地，還包括本文所述之構築體6之全長、N、 C，及N與C端截斷形式之編碼核酸。在一實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸包含SEQ ID NO：28之核苷酸。在其他實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸為SEQ ID NO：28之一部分，其編碼g3p部分、或g3p-Ig部分，且不包括編碼訊息序列之核苷酸(亦即，不包括編碼SEQ ID NO：13之胺基酸1至20、1至22或1至23之核苷酸)。

“構築體8”為重組型可溶性g3p片段IgG1 Fc融合蛋白(rs-g3p(If1 N1N2)-hIgG1-Fc)，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸。“構築體8”之g3p區段係源自If1。“構築體8”之編碼核酸序列係闡述於SEQ ID NO：32。

SEQ ID NO：31詳述如下，其顯示構築體8之胺基酸。G3p N1結構域係源自If1，除了某些If1噬菌體之半胱胺酸(C)變為色胺酸(W)以外，其以醒目顏色/方框顯示如下，而下圖中所示之前21個胺基酸係對應於IL2分泌序列，其為購自Invivogen之pFUSE Ig-融合物載體之一部分。接下來的胺基酸延伸區段以粗體與底線標示，其對應於If1之g3p N1結構域。需注意的是，C→W之胺基酸改變以醒目顏色/方框顯示。接下來的胺基酸延伸區段，其以底線標示，為g3p If1之N1與N2結構域之間的連接子序列。If1之g3p N2結構域以斜體標示。G3p N2結構域之後為第二種連接子序列，其於If1中係連接N2與N3結構域(以斜體與底線表示)。最後，以粗體、斜體與底線標示之胺基酸為源自pFUSE載體之IgG1-Fc序列。

SEQ ID NO：31所闡述的前21個胺基酸代表一訊息序列，在重組生產期間，胺基酸20與21之間被切割。SEQ ID NO：31之第21個胺基酸為甲硫胺酸，其為人為選殖(由多重選殖位置編碼，用於將訊息序列融合至N1-N2序列)且有時亦於重組期間被切割。SEQ ID NO：31之第22個胺基酸為丙胺酸，其相對應於分離自M13噬菌體之g3p之N端胺基酸。SEQ ID NO：31之第22個胺基酸丙胺酸有時亦於重組生產期間被切割。SEQ ID NO：31之第528個胺基酸為C端離胺酸，其有時亦於重組生產期間被切割。在抗體與相關融合蛋白之重組生產時，C端離胺酸之移除並不少見(J Lou et al.,Biotechnol Bioeng 2012 Sep；109(9)：2306-15)。含有一或多種上述確定之N端與C端刪除之產物，皆為本發明之一部分。

因此，在一實施例中，以“構築體8”說明之g3p融合蛋白為“成熟型之構築體8”，並包含SEQ ID NO：31之胺 基酸21至528。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：31之胺基酸22至528(“N端Met被截斷之成熟型構築體8”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：31之胺基酸23至528(“N端Met-Ala被截斷之成熟型構築體8”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：31之胺基酸21至527(“C端Lys被截斷之成熟型構築體8”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：31之胺基酸22至527(“N端Met被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體8”)。在一些實施例中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO：31之胺基酸23至527(“N端Met-Ala被截斷、C端Lys被截斷之成熟型構築體8”)。“構築體8”之編碼核酸序列係闡述於SEQ ID NO：32。

還包括本文所述之構築體8之全長、N、C，及N與C端截斷形式之編碼核酸。在一實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸包含SEQ ID NO：32之核苷酸。在其他實施例中，g3p融合蛋白之編碼核酸為SEQ ID NO：32之一部分，其編碼g3p部分、或g3p-Ig部分，且不包括編碼訊息序列之核苷酸(亦即，不包括編碼SEQ ID NO：31之胺基酸1至20、1至22或1至23之核苷酸)。

G3p融合蛋白

本發明之g3p融合蛋白包含g3p之澱粉樣蛋白結合片段，其為各融合物之活性試劑、活性成分、活性化合物、生物上活性部分、治療上有效部分，及/或醫藥上有效部分。含有突變體、變體及g3p片段之融合蛋白皆涵蓋於本發明之中。在一觀點中，g3p融合蛋白包含可結合至澱粉樣 蛋白之g3p片段。在一些實施例中，本發明之g3p融合蛋白包含g3p N1N2結構域或其突變體、變體或片段，其中該g3p之澱粉樣蛋白結合片段係連接、融合、共軛連接、耦合或結合於非g3p蛋白之至少一者。在特定之實施例中，該非g3p蛋白為免疫球蛋白之Fc片段。該融合蛋白之g3p部分不提供促進其治療性融合夥伴之蛋白質折疊，如WO 2004/018685所揭示，或噬菌體顯現法，如US 2009/105090所揭示。

在其他觀點中，融合蛋白包含可結合至澱粉樣蛋白之g3p多胜肽，並包含g3p N2結構域或其突變體、變體或片段，其中該g3p之澱粉樣蛋白結合片段係連接、融合、共軛連接、耦合或結合於非g3p蛋白之至少一者。在特定之實施例中，該非g3p蛋白為免疫球蛋白之Fc片段。在又其他觀點中，融合蛋白包含可結合至澱粉樣蛋白之g3p多胜肽，並包含g3p N1N2結構域，其中該g3p N2結構域包含g3p N2之突變體、變體或片段，其可穩定g3p N1結構域或以其他方式使g3p N1結構域成為一適合g3p結合之構形。

融合蛋白之g3p部分係連接、融合、共軛連接、耦合或結合於/至額外之蛋白質或蛋白質結構域之至少一者，其於正常情況下不會互相結合。在某些實施例中，本發明g3p融合蛋白之非g3p部分包含免疫球蛋白之Fc片段。在一實施例中，融合蛋白為g3p融合蛋白，其包含以g3p之澱粉樣蛋白結合片段連接至含有免疫球蛋白之Fc片段之第二種結構域。在另一實施例中，融合蛋白包含以g3p蛋白之澱粉樣蛋白結合片段連接至免疫球蛋白之Fc片段。如前面 所述，本發明之一些融合蛋白包含經突變或經變異之g3p之澱粉樣蛋白結合片段，如經突變或經變異之N1N2或N2結構域，其結合於澱粉樣蛋白纖維。因此，含有此類突變或變異形式之融合蛋白亦為本發明之一部分。

G3p之澱粉樣蛋白結合片段及融合夥伴多胜肽可為連續性胺基酸序列之一部分，其中該融合夥伴多胜肽係直接或經由一短型胜肽連接子連接至g3p或該澱粉樣蛋白結合片段多胜肽之N端或C端。在此情況下，該g3p之澱粉樣蛋白結合片段與該融合夥伴多胜肽可自編碼序列轉譯成單一多胜肽，其編碼該g3p之澱粉樣蛋白結合片段與該融合夥伴多胜肽。

A. G3p融合蛋白之g3p部分

G3p具有兩個胺基端結構域N1與N2，其互相作用以形成N1-N2複合體，以及一羧基端結構域N3(亦稱作“CT”)。一鉸鏈區使N1與N2之間打開與關閉。有時該鉸鏈區被視為N2之一部分，而在其他情況下，其被視為單獨片段。N1與N2亦可以彎曲之富含甘胺酸之連接子序列連接。N1有兩個雙硫鍵，其位於Cys7與Cys36之間及Cys46與Cys53之間。N2有一個雙硫鍵，其位於Cys188與Cys201之間。羧基端結構域有一個雙硫鍵，其位於Cys354與Cys371之間。Marvin,1998。G3p沒有結構域間之雙硫鍵。

G3p之澱粉樣蛋白結合片段之範例包括有鉸鏈區或無鉸鏈區之N2結構域；以及有或無間隔連接子序列，及有或無鉸鏈區之N1-N2結構域。在任何前述之範例中， N2或N1N2片段可為野生型絲狀噬菌體之N2或N1N2或重組型N2或N1N2。在任何前述之範例中，N2或N1N2片段可為野生型絲狀噬菌體序列之突變體或變體。

圖26係顯示以N2之一級結構比對fd、f1、M13、Ike、I2-2與If1。Fd之胺基酸顯示於SEQ ID NO：14；f1顯示於SEQ ID NO：15；M13顯示於SEQ ID NO：16；Ike顯示於SEQ ID NO：17；I2-2顯示於SEQ ID NO：18；以及If1顯示於SEQ ID NO：19。依據該圖示及比對，本發明之一實施例係包括含有可結合至澱粉樣蛋白之g3p多胜肽之g3p融合蛋白，並包括g3p N2結構域或該g3p N2結構域之片段。在一些觀點中，該g3p N2結構域可穩定組成物之g3p之澱粉樣蛋白結合部分。含有g3p N2結構域之任何g3p融合蛋白係包括g3p N2之突變體、變體與片段。G3p N2之片段意指任何全長之g3p N2結構域之N或C端個別或同時具有至少一截斷形式。G3p N2多胜肽係以SEQ ID NOs：14、15、16、17、18或19之胺基酸及其片段、變體與突變體列舉。

圖2A係顯示fd、f1與M13之一級結構比對，而圖2B則顯示Ike、I2-2與If1之比對。依據該比對，本發明之一實施例涵蓋一融合蛋白，其包含結合至澱粉樣蛋白之g3p多胜肽及包含g3p N1N2結構域或該g3p N1N2結構域之片段。含有g3p N1N2結構域之g3p融合蛋白係包括g3p N1N2之突變體、變體與片段。G3p N1N2之片段意指任何全長之g3p N1N2之N或C端個別或同時具有至少一截斷形式。G3p N1N2多胜肽係以SEQ ID NOs：1至9、11、13、20、24與29 至31之任何的胺基酸及其片段、變體與突變體列舉。

B. G3p融合蛋白之非g3p部分

本發明之融合蛋白包含以免疫球蛋白之Fc片段恆定區作為第二種結構域。由免疫球蛋白恆定區連接至感興趣蛋白質或其片段所構成之融合蛋白已被提出(請見，例如，美國專利號5,480,981與5,808,029；Gascoigne et al.1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936；Capon et al.1989,Nature 337：525；Traunecker et al.1989,Nature 339：68；Zettmeissl et al.1990,DNA Cell Biol.USA 9：347；Byrn et al.1990,Nature 344：667；Watson et al.1990,J.Cell.Biol.110：2221；Watson et al.1991,Nature 349：164；Aruffo et al.1990,Cell 61：1303；Linsley et al.1991,J.Exp.Med.173：721；Linsley et al.1991,J.Exp.Med.174：561；Stamenkovic et al.,1991,Cell 66：1133；Ashkenazi et al.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Lesslauer et al.1991,Eur.J.Immunol.27：2883；Peppel et al.1991,J.Exp.Med.174：1483；Bennett et al.1991,J.Biol.Chem.266：23060；Kurschner et al.1992,J.Biol.Chem.267：9354；Chalupny et al.1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10360；Ridgway and Gorman,1991,J.Cell.Biol.115，摘錄號1448；Zheng et al.1995,J.Immun.154：5590)。這些分子通常具有與連接之感興趣分子相關聯之生物活性及效應子功能，或與該免疫球蛋白恆定區相關聯之一些其他所欲特性(例如，生物穩定性、細胞分泌性)。

Fc表現基因匣為商業上可購。Fc片段由免疫球蛋白之CH2與CH3結構域及免疫球蛋白之鉸鏈區構成。Fc片段可為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc片段。在一特定實施例中，免疫球蛋白恆定區之部分為IgG1之Fc片段。在另一實施例中，免疫球蛋白恆定區之部分為IgG4之Fc片段。在又另一實施例中，免疫球蛋白恆定區之部分為IgM之Fc片段。

因此，在一實施例中，利用標準分子生物技術，將g3p之重組型可溶性澱粉樣蛋白結合片段融合至免疫球蛋白之Fc結構域。該g3p之重組型可溶性澱粉樣蛋白結合片段可經突變或經變異。舉例而言，g3p之澱粉樣蛋白結合片段，如N1N2結構域或N2結構域，可選殖至IgGFc融合物表現載體。示範性之IgGFc融合物載體包括，舉例而言，購自InvivoGen之其中一種pFUSE-Fc載體。在一些實施例中，所得之雙價(例如，g3p(N1N2)-IgGFc或g3p(N2)-IgGFc)融合蛋白，其澱粉樣蛋白結合性高於重組型可溶性g3p，因其為雙價。

在其他實施例中，融合蛋白包含至少兩種g3p之澱粉樣蛋白結合片段。在其他實施例中，融合蛋白包含三或多種g3p之澱粉樣蛋白結合片段。在其他實施例中，融合蛋白包含五種g3p之澱粉樣蛋白結合片段。此類二聚體型與多聚體型之融合蛋白可提供更高的結合能力，因其包括大於一種之g3p之澱粉樣蛋白結合片段。

在某些實施例中，融合蛋白包含白蛋白。請見，舉例而言，美國專利號6,686,179。

C.示範性之本發明g3p融合蛋白

在一些實施例中，融合蛋白包括含有g3p之澱粉樣蛋白結合片段之第一種結構域，以及含有非g3p蛋白之第二種結構域，如免疫球蛋白之Fc片段。含有g3p之澱粉樣蛋白結合片段之第一種結構域為活性成分，其提供融合蛋白治療之生物活性。在一些觀點中，融合蛋白之g3p部分所含之胺基酸序列為至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少98%等同於本文所述之SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31，或SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之任何的N、C，或N與C端之截斷形式之g3p部分。在此實施例之一觀點中，融合蛋白之g3p部分所含之胺基酸序列等同於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分。在其他實施例中，相較於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31列舉之任何的g3p部分，該g3p部分可為突變體、變體或片段，並能結合至澱粉樣蛋白。在另一觀點中，該融合蛋白係選自於SEQ ID NO：9之胺基酸21至506、SEQ ID NO：9之胺基酸22至506、SEQ ID NO：9之胺基酸23至506、SEQ ID NO：9之胺基酸21至505、SEQ ID NO：9之胺基酸22至505、SEQ ID NO：9之胺基酸23至505、SEQ ID NO：11之胺基酸21至506、SEQ ID NO：11之胺基酸22至506、SEQ ID NO：11之胺基酸23至506、SEQ ID NO：11之胺基酸21至505、SEQ ID NO：11之胺基酸22至505、SEQ ID NO：11之胺基酸23至505、SEQ ID NO：13之 胺基酸21至509、SEQ ID NO：13之胺基酸22至509、SEQ ID NO：13之胺基酸23至509、SEQ ID NO：13之胺基酸21至508、SEQ ID NO：13之胺基酸22至508、SEQ ID NO：13之胺基酸23至508、SEQ ID NO：31之胺基酸21至528、SEQ ID NO：31之胺基酸22至528、SEQ ID NO：31之胺基酸23至528、SEQ ID NO：31之胺基酸21至527、SEQ ID NO：31之胺基酸22至527，或SEQ ID NO：31之胺基酸23至527，或為任何之該些融合蛋白之突變體或變體。

在另一觀點中，相較於相對應之任何的SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分，該融合蛋白之g3p部分為g3p之突變體，並包含具有1至20個胺基酸取代之胺基酸序列，其中該融合蛋白於人體內之免疫原性低於其未經修正之對應物。在該些實施例之一些觀點中，相較於相對應之任何的SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分，該融合蛋白具有1至10個胺基酸取代。在其他觀點中，相較於相對應之任何的SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分，該融合蛋白具有1至5個胺基酸取代。在又其他觀點中，該胺基酸取代位於該融合蛋白之g3p部分(例如，SEQ ID NO：9之胺基酸21、22，或23至238、SEQ ID NO：11之胺基酸21、22，或23至238、SEQ ID NO：13之胺基酸21、22，或23至238，或SEQ ID NO：31之胺基酸21、22，或23至296)。

在其他實施例中，該較低免疫原性融合蛋白為 SEQ ID NO：9之胺基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO：11之胺基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO：13之胺基酸21、22或23至508或509，或SEQ ID NO：31之胺基酸21、22或23至527或528之一變體，其中該變體不同於所提及胺基酸序列之處，僅為具有1至20個胺基酸取代，其分別位於SEQ ID NO：9之胺基酸22或23至238、SEQ ID NO：11之胺基酸22或23至238、SEQ ID NO：13之胺基酸22或23至238，或SEQ ID NO：31胺基酸22或23至296之區段。在該些實施例之一些觀點中，該融合蛋白具有1至10個胺基酸取代。在其他觀點中，該融合蛋白具有1至5個胺基酸取代。

前述之該較低免疫原性融合蛋白可由習知之去免疫流程辨別。典型而言，該融合蛋白之g3p部分係經篩選以確定是否含有T細胞表位。此類潛在之T細胞表位常被定義為具有結合至MHC第II類分子之能力的任何胺基酸殘基序列。在其他實施例中，以該完整之融合蛋白進行T細胞表位篩選。

在本領域中，已提供方法以檢測T細胞表位，係以運算工具篩選經實驗確定之T細胞表位之可辨識序列模體，或以運算技術預測MHC第II類結合胜肽，特別是DR結合胜肽。舉例而言，WO98/52976與WO00/34317揭示了計算線程(computational threading)方法以辨別具有結合人類MHC第II類DR異型子集潛力之多胜肽序列。WO08/044032揭示了針對已知之T細胞表位數據庫篩選一級胺基酸序列以辨別該序列之T細胞表位。

或者，可合成欲進行去免疫之蛋白質之胜肽部分(例如，SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13之g3p部分)，並以電腦輔助或細胞試驗或活體內檢測，確定其是否結合至MHC分子(請見，例如，美國專利號7,208,147)。

一旦預測的T細胞表位被辨別，則明確進行本發明融合蛋白之g3p部分之一級序列胺基酸取代，以減少免疫原性。這些經預測之SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：31之g3p部分之去免疫突變體，隨後進行活性與免疫原性再篩選，以辨別出，相較於任何的SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13之g3p部分，該些保留活性卻減少或無免疫原性者。典型而言，這將需要1至20個胺基酸的取代。

在所有情況中，本發明融合蛋白之g3p之澱粉樣蛋白結合片段涵蓋其突變體與變體。

一般而言，結合至澱粉樣蛋白之融合蛋白，應具備至少如同其相對應之未經連接之g3p之澱粉樣蛋白結合片段之功效。當應用時，該融合蛋白具備至少如同其相對應之未經連接之g3p之澱粉樣蛋白結合片段之媒介澱粉樣蛋白去凝集作用、促進澱粉樣蛋白清除、抑制澱粉樣蛋白凝集，及/或移除或預防有毒寡聚物形成等功效。在一些實施例中，該融合蛋白結合於澱粉樣蛋白，並具備至少如同其相對應之含有SEQ ID NO：1之重組型可溶性g3p之媒介澱粉樣蛋白去凝集作用、促進澱粉樣蛋白清除、抑制澱粉樣蛋白凝集，及/或移除或預防有毒寡聚物形成等功效。在又 其他實施例中，該融合蛋白結合於澱粉樣蛋白，並具備至少如同噬菌體M13之媒介澱粉樣蛋白去凝集作用、促進澱粉樣蛋白清除、抑制澱粉樣蛋白凝集，及/或移除或預防有毒寡聚物形成等功效。在另其他實施例中，該融合蛋白結合於澱粉樣蛋白，並具備優於噬菌體M13之媒介澱粉樣蛋白去凝集作用、促進澱粉樣蛋白清除、抑制澱粉樣蛋白凝集，及/或移除或預防有毒寡聚物形成等功效。在一些實施例中，該融合蛋白結合於澱粉樣蛋白，並具備至少如同噬菌體M13之減少蛋白質錯誤折疊疾病之澱粉樣蛋白之功效。在又其他實施例中，該融合蛋白結合於澱粉樣蛋白，並具備優於噬菌體M13之減少蛋白質錯誤折疊疾病之澱粉樣蛋白之功效。在又其他實施例中，該融合蛋白結合於澱粉樣蛋白，並具備至少如同或優於噬菌體M13之預防澱粉樣蛋白形成之功效。

融合蛋白可由本領域之習知技術合成。舉例而言，本發明之融合蛋白可於細胞中重組合成(請見，例如，Sambrook et al.1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.，及Ausubel et al.1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.)。或者，本發明之融合蛋白可由習知之合成方法，如固相合成法，合成。合成技術為本領域所習知(請見，例如，Merrifield,1973,Chemical Polypeptides,(Katsoyannis and Panayotis eds.)pp.335-61；Merrifield 1963,J.Am.Chem.Soc. 85：2149；Davis et al.1985,Biochem.Intl.10：394；Finn et al.1976,The Proteins(3d ed.)2：105；Erikson et al.1976,The Proteins(3d ed.)2：257；美國專利號3,941,763)。或者，最終之構築體可能具有如同重組生產之融合蛋白之基本功能，而其僅以非重組技術，如連接化學，生產。以g3p表現及g3p突變時所描述之相同方法製備融合蛋白元件。

D. G3p融合蛋白之編碼核酸

在一些實施例中，本發明係提供一核酸序列，其編碼含有本發明g3p之澱粉樣蛋白結合片段之融合蛋白，其中該融合蛋白之g3p部分包括g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體或變體，其具有胺基酸序列為至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%，或至少98%等同於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分。在這些實施例之一觀點中，該核酸序列係選自於SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28與SEQ ID NO：32(分別為編碼SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13與SEQ ID NO：31之實際核酸序列)，或為簡併式(degenerative)卻能編碼相同於任一種前述之多胜肽的核酸序列。在這些實施例之另一觀點中，該核酸序列係選自於SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：32之g3p-Ig編碼部分(亦即，編碼SEQ ID NO：9之胺基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO：11之胺基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO：13之胺基酸21、22或23至508或509，或SEQ ID NO：31之胺基酸21、22或23至527或528 之任一者之核酸序列)，其融合於編碼訊息序列之核苷酸序列之5’端且與之呈正確讀框(in-frame)，或為簡併式卻能編碼相同於任一種前述之多胜肽之核酸序列。在一些實施例中，該訊息序列係源自哺乳類動物。

在這些實施例之另一觀點中，該核酸序列係選自於SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：32之g3p編碼部分(亦即，編碼SEQ ID NO：9之胺基酸21、22或23至238、SEQ ID NO：11之胺基酸21、22或23至238、SEQ ID NO：13之胺基酸21、22或23至238，或SEQ ID NO：31之胺基酸21、22或23至296之任一者之核酸序列)，其融合於編碼訊息序列之核苷酸序列之5’端且與之呈正確讀框，或為簡併式卻能編碼相同於任一種前述之多胜肽之核酸序列。在一些實施例中，該訊息序列係源自哺乳類動物。

在一些實施例中，該g3p融合蛋白之編碼核酸包含SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28與SEQ ID NO：32，其中不包括訊息序列(亦即，SEQ ID NOs：9、11、13或31之任一者之胺基酸1至20、1至21或1至22)之編碼核酸。在某些實施例中，不含訊息序列核苷酸之g3p融合蛋白編碼核酸，係選自於i)SEQ ID NOs：26或27之任一者之核苷酸61、64或67至1521；ii)SEQ ID NO：28之核苷酸61、64或67至1527；以及iii)SEQ ID NO：32之核苷酸61、64或67至1587。在一些實施例中，該核酸序列係編碼g3p N1N2結構域或其突變體、變體或片段。

在一些實施例中，本發明係提供核酸序列，相較 於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之任一者之g3p部分，本發明之核酸序列編碼包含具有1至20個胺基酸取代之胺基酸序列之融合蛋白，其中該融合蛋白於人體內之免疫原性低於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之任一者之g3p部分。在該些實施例之一些觀點中，相較於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分，該核酸序列編碼具有1至10個胺基酸取代之融合蛋白。在該些實施例之其他觀點中，相較於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之g3p部分，該核酸序列編碼具有1至5個胺基酸取代之融合蛋白。在該些實施例之又其他觀點中，該核酸序列編碼多胜肽，其中胺基酸取代皆位於融合蛋白之g3p部分(例如，SEQ ID NO：9之胺基酸21、22或23至238、SEQ ID NO：11之胺基酸21、22或23至238、SEQ ID NO：13之胺基酸21、22或23至238，或SEQ ID NO：31之胺基酸21、22或23至296，或其突變體、變體或片段)。

在一些實施例中，本發明提供之核酸序列所編碼之融合蛋白為下列變體之任一者：SEQ ID NO：9之胺基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO：11之胺基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO：13之胺基酸21、22或23至508或509，或SEQ ID NO：31之胺基酸21、22或23至527或528，且其免疫原性低於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：31，其中該變體不同於其相對應胺基 酸序列之處，僅在於g3p區段具有1至20個胺基酸取代(亦即，分別為SEQ ID NO：9之胺基酸21、22或23至238、SEQ ID NO：11之胺基酸22或23至238、SEQ ID NO：13之胺基酸22或23至238，或SEQ ID NO：31之胺基酸22或23至胺基酸296)。在該些實施例之一些觀點中，該核酸序列所編碼之融合蛋白具有1至10個此類胺基酸取代。在其他觀點中，該核酸序列所編碼之融合蛋白具有1至5個此類胺基酸取代。

E. G3p融合蛋白之突變體

在另一觀點中，本發明係關於包含g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體之融合蛋白。可製備或篩選含g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體融合蛋白，以產生本申請案所述之醫藥組成物療效。舉例而言，g3p之澱粉樣蛋白結合片段可經重組突變或以其他方式篩選，以產生一或多種下列關於M13 g3p之特性：增加澱粉樣蛋白結合親和力、降低鉸鏈區T_M、增加結合性(結合性不同於親和力，因結合性用於描述所有可得之澱粉樣蛋白結合作用之總和，其中g3p包含大於一者之澱粉樣蛋白結合位置)、增加對於澱粉樣蛋白凝集物之去凝集能力，或增加預防澱粉樣蛋白纖維凝集之能力。或者，或此外，該g3p之澱粉樣蛋白片段之突變體可合併本文所述之其他適用特性。

G3p之澱粉樣蛋白片段之突變體可由噬菌體突變法或重組技術，如以PCR為主之定點突變法或隨機突變法，製備。

G3p之澱粉樣蛋白片段，如N1N2結構域或N2結 構域，亦可利用重組技術進行突變，並併入本發明之融合蛋白。舉例而言，本文所述之攜帶g3p或其澱粉樣蛋白結合片段之載體(例如，N1N2或N2)，係以PCR為主之突變策略進行突變。隨後，進行該編碼之突變蛋白的表現，並以所述之方法評估突變體之澱粉樣蛋白結合作用與親和力。

G3p之澱粉樣蛋白片段之突變體亦可衍生自g3p之突變體。舉例而言，藉由突變g3p及/或篩選具有所欲特性之經突變之g3p，之後經由蛋白質水解及隨後的純化，從其中取得所欲之澱粉樣蛋白結合片段。

在一些實施例中，本發明g3p融合蛋白所含的g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，以高於相對應之未經突變之M13 g3p片段或相對應之未經突變之g3p融合蛋白之結合作用至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或甚至1000倍之親和力結合於澱粉樣蛋白。在其他實施例中，該含有g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體融合蛋白，其澱粉樣蛋白結合能力強度為至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同於相對應之未經突變之M13 g3p之澱粉樣蛋白結合片段或相對應之未經突變之g3p融合蛋白之結合能力。在一些實施例中，即使g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體的澱粉樣蛋白結合親和力低於相對應之未經突變型，其亦具有另外所欲之生物上(例如，較佳之澱粉樣蛋白去凝集能力；較佳之預防澱粉樣蛋白纖維凝集之能力)或醫藥上(例如，較佳之代謝穩定性、良好之藥物動力學特徵、較佳之濃解度)特性，且 相較於該相對應之未經突變型已有改進。以表面電漿共振或競爭性ELISA評估澱粉樣蛋白結合作用，如範例中所述。

在一些實施例中，利用DNA基因庫篩選，辨別g3p之澱粉樣蛋白片段之變體及/或突變體，係將M13 g3p雜合至經篩選之相關聯DNAs，其於高度或中度嚴苛度條件下雜合至M13 g3p。

在一些實施例中，含有經突變之g3p之澱粉樣蛋白片段之本發明g3p融合蛋白係以重組方式製備，且其所含之g3p之澱粉樣蛋白結合片段之胺基酸殘基之至少一者異於未經突變之g3p多胜肽，但仍可結合於澱粉樣蛋白。在一些實施例中，個別之點突變之具體說明為，於g3p多胜肽之特定殘基提供未經突變之g3p胺基酸，及置換該殘基之胺基酸。舉例而言，“F194A”意指成熟型M13序列(SEQ ID NO：1)之位置194苯丙胺酸被改成丙胺酸。在其他實施例中，經突變之g3p以一胺基酸與特定胺基酸序列間之百分比相似度具體說明，並且再次聲明，該經突變之g3p可結合於澱粉樣蛋白纖維。在這些實施例中，本發明融合蛋白之經突變之g3p部分為至少70%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%等同於其相對應之SEQ ID NO：1部分之全長。在本發明之該些實施例中，其含有經突變之g3p之澱粉樣蛋白結合片段，該經突變之澱粉樣蛋白結合片段為至少70%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少 88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%等同於其相對應之SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31片段之全長。

在實際情況下，是否任何特定之多胜肽為至少70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等同於另一序列，可使用習知之電腦程式(如Bestfit程式)進行常規性判定。當以Bestfit或其他序列比對程式判定是否一特定序列為，例如，95%等同於依據本發明之一參考序列時，參數係經設定，當然，同源於查詢序列之該參考胺基酸之序列部分，其全長之等同度百分比可計算出。

在各種觀點之一些實施例中，本發明g3p融合蛋白之g3p部分之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，其於Ff家族、I家族，或Ff與I家族兩者之g3p之相對應部分的保留性胺基酸殘基上，不具有突變。在其他實施例中，g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，其於Ff家族、I家族，或Ff與I家族兩者之g3p之相對應部分的保留性胺基酸殘基上，有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的突變。在又其他實施例中，g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，其於Ff家族、I家族，或Ff與I家族兩者之g3p之相對應部分的非保留性胺基酸殘基上，有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的突變。在又另一實施例中，g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，其於I22、Ike與If1之一 或多者之相對應部分的非保留性胺基酸殘基上，有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的突變。在另其他實施例中，g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，其於Ff家族、I家族，或Ff與I家族兩者之g3p之相對應部分的非保留性胺基酸殘基上，有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的突變。在一些實施例中，該至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變係位於N1結構域內。在一些實施例中，該至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變係位於N2結構域內。在一些實施例中，該至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個突變係位於N2結構域內，且非位於鉸鏈區內。

定點突變法係針對就g3p、N1N2，或N2結構域穩定性而言重要之殘基。舉例而言，針對D94與T95；E115；N122；L125；E126與E127；E127與E128；Q129；Q145；T154與T156；Q157；T159與D160；K163與T164；Y166；以及E196與D197的丙胺酸置換突變，先前已顯示未明顯影響噬菌體結合至F纖毛，Deng & Perham,2002。因此，這些位置具有突變耐受性，且一或多個這些位置的突變，對於本發明g3p融合蛋白之澱粉樣蛋白結合能力，具有增進或中和效應。因此，在一些實施例中，本發明包括含有g3p之澱粉樣蛋白結合片段之g3p融合蛋白，其中D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196，或D197之一或多者係經突變(相對於SEQ ID NO：1中所述之 該成熟型g3p序列)。在一些實施例中，突變點位於D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196，或D197之一或多者，且不完全突變成丙胺酸。

先前已顯示，F194；F190與H191；K184、R186與D187；R142與R144之丙胺酸置換突變會降低F纖毛之結合性，Deng & Perham,2002。因此，在一些實施例中，本發明融合蛋白之g3p部分之突變係選自於不包括一或多個下列殘基之突變：R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191，或F194(相對於SEQ ID NO：1中所述之該成熟型g3p序列之編號)。然而，以非丙胺酸殘基置換R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191，或F194可增加澱粉樣蛋白結合作用。因此，在一實施例中，該突變為R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191，或F194之一或多者之非丙胺酸突變。在一實施例中，該突變為F194之非丙胺酸突變。在另一實施例中，該突變為F190與H191之非丙胺酸突變。在另一實施例中，該突變為K184、R186與D187之非丙胺酸突變。在另一實施例中，該突變為W181之非丙胺酸突變。在另一實施例中，該突變為R142與R144之非丙胺酸突變。在某些實施例中，該突變不完全為下列一者、一些或全部：T13I、T101I、Q129H、G153D、W181A、F190A、F194A，及D209Y。

在一些實施例中，本發明融合蛋白之g3p部分之突變係位於N2結構域表面殘基之一或多者，其為g3p結合於 F纖毛之部分。在一實施例中，該突變係位於N2結構域外緣殘基之一或多者。在其他實施例中，該突變係位於N1結構域表面殘基之一或多者，其為g3p結合於TolA之部分。在一實施例中，本發明融合蛋白之g3p部分之突變係位於N1結構域外緣殘基之一或多者。在另一實施例中，該突變係位於g3p之溶劑可接觸殘基之一或多者。在又另一實施例中，該突變將Pro213之順式/反式平衡轉變為大於50、60、70、80、90或95%之反式。因此，在一些實施例中，g3p融合蛋白包含經突變之g3p，其中Pro213之順式/反式平衡為至少50、至少60、至少70、至少80、至少90，或至少95%之反式。

在一些實施例中，本發明融合蛋白g3p部分之g3p之澱粉樣蛋白結合片段不包括結構上保留性殘基之突變。結構上保留性殘基之範例包括涉及提供Ff與I家族成員結構域構造之殘基，儘管可能有序列插入之情形。

在一些實施例中，本發明融合蛋白之g3p部分所產生之任何突變，皆保留澱粉樣蛋白結合能力。在其他實施例中，該突變並未置換脯胺酸殘基。

在一些實施例中，本發明融合蛋白之g3p部分所產生之任何突變，皆保留澱粉樣蛋白結合能力，且未置換半胱胺酸殘基。在一些實施例中，該突變保留g3p內雙硫鍵之全部、至少一者、至少二者、至少三者或所有四者。因此，在一實施例中，任何的突變皆保留N1的兩個雙硫鍵，該雙硫鍵介於Cys7與Cys36之間及Cys46與Cys53之間。在另一實施例中，任何的突變皆保留N1的兩個雙硫鍵之其中一 者而非兩者，該雙硫鍵介於Cys7與Cys36之間及Cys46與Cys53之間。在一實施例中，保留介於Cys188與Cys201之間的雙硫鍵。在一些實施例中，保留Cys7與Cys36、Cys46與Cys53，及Cys188與Cys201之間之每一雙硫鍵。在一實施例中，該突變保留Cys354與Cys371之間的雙硫鍵。在一些實施例中，該突變保留Cys7與Cys36之間、Cys46與Cys53之間、Cys188與Cys201之間，及Cys354與Cys371之間的雙硫鍵。

在一些實施例中，本發明融合蛋白之g3p部分所產生之任何突變，皆保留澱粉樣蛋白結合能力，並降低N1N2之熔融溫度(T_M)。T_M係以範例中所述之任何方法測量。N1N2之T_M降低之突變體，預期有較好的Aβ結合能力、更大程度的Aβ聚集抑制能力，以及於去凝集試驗中之功效至少如同M13之g3p。因此，含該些g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體之融合蛋白，預期於一或多種蛋白質錯誤折疊疾病之治療上，其療效至少分別相同於相對應之M13序列、含有相對應之未經突變之g3p之澱粉樣蛋白結合片段之融合蛋白，以及完整之M13。

亦可將含g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體之融合蛋白設計成包括一標定序列。此類標定序列可被插入N1N2之間，或N2與N2融合蛋白之另一結構域之間的彎曲性連接子區段。標定核定位序列(NLS)可能有益於杭丁頓氏症。標定內體(endosome)可能有益於帕金森氏症。

除了標定細胞內之專一性區域以外，標定序列可 用於標定不同種類之澱粉樣蛋白。成核序列可增加親和力，並將蛋白質之突變體導引至特定之澱粉樣蛋白。本發明之g3p融合蛋白之其他g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體，可製成包括疏水性胜肽序列，因此可自行沈澱。舉例而言，可將多重AVVAI序列加至g3p及/或其澱粉樣蛋白結合片段(例如，N2與N1N2)及/或其融合蛋白，以產生具有強化的多重結合序列之嵌合蛋白質。可結合澱粉樣蛋白並可併入g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體或嵌合體之胜肽，以及含有該些g3p之澱粉樣蛋白結合片段之突變體或嵌合體之融合蛋白的一些範例，包括以描述於Sato,Biochemistry(2006)45：5503-16之GxFxGxF骨架(SEQ ID NO：21)及描述於Tjernberg et al.,J.Biol.Chem.(1996)271：8545-48之KLVFF胜肽(SEQ ID NO：22)為主之胜肽抑制劑。其他標定片段為習知，並亦可用於本發明。請見，例如，Sciarretta et al.,Methods in Enzymology(2006)413：273-312。

重組技術

一般以常規之重組DNA技術製備編碼g3p融合蛋白(及其突變體與變體)之DNA，其涉及g3p基因之選殖、直接DNA合成，或以M13序列作為探針，自基因庫分離相對應之DNA(請見，例如，Sambrook et al.1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.及Ausubel et al.1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.)。

在重組生產方面，將本發明g3p融合蛋白或其澱粉樣蛋白結合片段之編碼核酸序列插入適當之表現載體，其中包含用於該經插入編碼序列之轉錄與轉譯所需之元件，或在RNA病毒載體之情況，其中包含用於複製與轉譯所需之元件。將該編碼核酸插入載體之正確讀框內。

因此，本發明係提供載體，其包含編碼本文所揭示之g3p融合蛋白，包括其突變體與變體，之聚核苷酸。本發明亦提供包含編碼g3p或g3p融合分子之聚核苷酸之載體。該些載體包括但不侷限於，DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、反轉病毒載體等。

用於重組表現之示範性細胞類型包括：昆蟲細胞，其包括桿狀病毒系統；真菌細胞，其包括畢赤酵母屬(Pichia)、酵母菌，及麴菌(Aspergillus)細胞；細菌細胞，其包括大腸桿菌細胞；動物細胞株，其包括NSO、CHO、HEK293、COS、HeLa，或任何其他既定之動物細胞株；以及基因轉殖動物，如山羊。

在一些實施例中，選定一載體，其經優化以在CHO或CHO衍生細胞中表現多胜肽。示範性之此類載體係描述於，例如，Running Deer et al.,Biotechnol.Prog.(2004)20：880-889。

在一些實施例中，選定一載體，用於動物，包括人類，之體內表現g3p、其澱粉樣蛋白結合片段及/或g3p融合物分子。在一些該類實施例中，多胜肽之表現係由促進子控制，其以組織專一性方式執行功能。

將表現載體轉染或共轉染至適用之標的細胞，其將表現多胜肽。非侷限之示範性轉染方法係揭示於，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3^rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。依據本領域之習知方法，核酸可暫時或穩定轉染於所欲之宿主細胞。有多種宿主表現載體系統可供使用，包括原核或真核細胞，以表現本文所述之蛋白質。該些系統包括但不限於，微生物，如以含有適當編碼序列之重組型噬菌體DNA或質體DNA表現載體轉形細菌(例如，大腸桿菌)；以含有適當編碼序列之重組型酵母菌或真菌表現載體轉形酵母菌或絲狀真菌；以含有適當編碼序列之重組型病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染昆蟲細胞系統；以含有適當編碼序列之重組型病毒表現載體(例如，花椰菜鑲嵌病毒或煙草鑲嵌病毒)感染或重組型質體表現載體(例如，Ti質體)轉形植物細胞系統；或動物細胞系統，包括哺乳類動物(例如，CHO、Cos、HeLa，或HEK-293細胞)。蛋白質亦可於浮萍(duckweed)中重組生產。請見，例如，美國專利號8,022,270。

轉形用載體常含有可篩選標記物，用於辨別轉形體。在細菌系統中，其可包括抗生素抗性基因，如安比西林(ampicillin)或康黴素(kanamycin)。用於經培養之哺乳類動物細胞之可篩選標記物包括提供抗藥性之基因，如新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)，及滅殺除癌錠(methotrexate)。可篩選標記物可為擴增性可篩選標記物。 其中一種擴增性可篩選標記物為DHFR基因。另一種擴增性標記物為DHFRr cDNA(Simonsen and Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),(1983)80：2495)。Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,MA)回顧了一些可篩選標記物，且可篩選標記物之選擇，為本領域技術人員之能力範圍內可及。

表現系統之表現元件因其強度及專一性而變。依據所使用之宿主/載體系統，任何的多種適用之轉錄與轉譯元件，包括組成性及誘發性促進子，可用於表現載體。舉例而言，當以細菌系統選殖時，可使用誘發性促進子，如噬菌體λ之pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜合促進子)及其類似物；當以昆蟲細胞系統選殖時，可使用之促進子如桿狀病毒多面體促進子；當以植物細胞系統選殖時，可使用源自植物細胞基因組(例如，熱休克促進子；RUBISCO之小型次單元之促進子；葉綠素a/b結合蛋白之促進子)或源自植物病毒之促進子(例如，CaMV之35S RNA促進子；TMV之封套蛋白促進子)；當以哺乳類動物細胞選殖時，可使用源自哺乳類動物細胞基因組之促進子(例如，金屬硫蛋白促進子)或源自哺乳類動物病毒之促進子(例如，腺病毒晚期促進子；牛痘病毒7.5 K促進子)；當產生之細胞株含有多重拷貝之表現產物時，可使用含有適當可篩選標記物之以SV40、BPV與EBV為主之載體。

在使用植物表現載體之情況中，本發明之線型或非環型編碼序列之表現產物，其表現可由任何之多種促 進子驅動。舉例而言，可使用病毒促進子，如CaMV之35S RNA與19S RNA促進子(Brisson et al.,Nature(1984)310：511-514)，或TMV之封套蛋白促進子(Takamatsu et al.,EMBO J.(1987)6：307-311)；或者，可使用植物促進子，如RUBISCO之小型單元(Coruzzi et al.,EMBO J.(1984)3：1671-1680；Broglie et al.,Science(1984)224：838-843)或熱休克促進子，如黃豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley et al.,Mol.Cell.Biol.(1986)6：559-565)。該些構築體可利用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接DNA轉形、顯微注射、電穿孔等方法導入植物細胞。欲回顧該些技術，請見，例如，Weissbach & Weissbach 1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp.421-463；以及Grierson & Corey 1988,Plant Molecular Biology,2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9。

在一可用於生產本發明蛋白質之昆蟲表現系統中，以加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus；AcNPV)作為載體並表現外來基因。病毒生長於秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。將編碼序列選殖至病毒之非必需區段(例如，多面體基因)，其受AcNPV促進子(例如，多面體促進子)調控。編碼序列成功插入後，將造成多面體基因失活，並產生非閉合型之重組型病毒(亦即，缺少多面體基因編碼之蛋白質封套之病毒)。隨後，以該些重組型病毒感染秋夜盜蛾細胞，其中該插入之基因被表現(請見，例如，Smith et al.,J.Virol.(1983) 46：584；美國專利號4,215,051)。該表現系統之進一步範例可見於Ausubel et al.,eds.1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.2,Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience。

在哺乳類動物宿主細胞中，可使用多種以病毒為主之表現系統。在以腺病毒作為表現載體之情況中，編碼序列可連接至腺病毒轉錄/轉譯調控複合體，例如，晚期促進子與三重領導序列。隨後，此融合體基因以體外或體內重組方式插入腺病毒基因組。病毒基因組非必需區段(例如，區段E1或E3)之基因插入，將使重組型病毒存活，並能於經感染之宿主內部表現胜肽(請見，例如，Logan & Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1984)81：3655)。或者，可使用牛痘病毒7.5 K促進子(請見，例如，Mackett et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79：7415；Mackett et al.,J.Virol.(1984)49：857；Panicali et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79：4927)。其他病毒表現系統包括腺相關病毒與慢病毒(lentiviruses)。

含有DNA構築體之宿主細胞係生長於適當之生長培養基中。使用於此，術語"適當之生長培養基"意指含有細胞生長所需營養物之培養基。本發明之重組生產蛋白質係以本領域之常規技術自培養基中分離。

體外試驗

在一些實施例中，使用硫代黃素T螢光(ThT)試驗檢測澱粉樣蛋白之去凝集作用。

在一些實施例中，於有或無存在本發明融合蛋白或組成物之情況下，偵測界面活性劑之溶解作用，以檢測去凝集作用。舉例而言，經凝集之α突觸核蛋白能以本發明之組成物處理。相較於未經處理之纖維，可去凝集該經凝集之α突觸核蛋白之融合蛋白或組成物，將造成該α突觸核蛋白纖維更快溶於界面活性劑，如SDS。此種將澱粉樣蛋白纖維轉變為可溶性形式之情況，可於凝集作用期間併入一定比例之經標定(例如，使用Cy5)α突觸核蛋白單體以進行檢測。

在一些實施例中，預防有毒澱粉樣蛋白寡聚物之形成，係以神經元細胞毒性試驗進行檢測。在此試驗中，以Aβ42寡聚物共培養於經分化之N2a神經母細胞瘤細胞或同等物。該寡聚物結合於細胞膜，使細胞膜擾動，並使細胞質酵素滲漏至培養基。以高濃度之該寡聚物延長培養，將會殺死細胞。在培養於細胞之前，若寡聚物以噬菌體或g3p進行前處理，則該寡聚物至少毒性較低且有時無毒。此種中和效應可由測量腺苷酸激酶，一種示範性之細胞質酵素並於細胞膜擾動後由神經元細胞釋出，之釋出而進行量化。

在一些實施例中，本發明之g3p融合蛋白或組成物，可於蛋白質錯誤折疊環形擴增(PMCA)試驗中，抑制可溶性普裡昂蛋白轉變為抗蛋白酶K活性之構形異構物。Wang et al.,Science,(2010)327：1132-35。在此試驗中，於有或無存在本發明融合蛋白或組成物之情況下，以脂質 POPG與RNA混合重組型PrP。隨後，以該材料進行多重(例如，48次)循環之30秒鐘超音波震盪，接著培養29.5分鐘。隨後，將反應混合物之分液分裝於另一試管，並重複該循環。每次皆檢測抗蛋白酶K活性材料之存在，其為感染型PrP之指標。在本發明組成物之存在下，抗蛋白酶K活性材料之減少，代表融合蛋白或組成物可抑制抗PK活性之構形異構物的形成。

如前面所述，某些普裡昂蛋白的澱粉樣蛋白形式，如酵母菌普裡昂蛋白NM，亦可於濾膜捕捉試驗中測出。因此，取決於普裡昂蛋白，在一些實施例中，本發明融合蛋白或組成物之去凝集該普裡昂蛋白凝集物的能力，可於濾膜捕捉試驗中檢測。

體內功能性試驗

除了活性(例如，對於澱粉樣蛋白之結合親和力增加或T_M減少)可於體外試驗中證實之外，本發明之融合蛋白或組成物亦可於多種體內試驗之一者之中減少澱粉樣蛋白。一種確定體內澱粉樣蛋白減少的方法，為使用結合顯影劑弗貝他比(florbetapir；F18-AV-45,Eli Lilly)之正子發射斷層攝影術(PET)，並於處理之前與之後比較β澱粉樣蛋白之數目及/或分佈。當然，如同其他被找到的生物標記物，其亦可用於測定澱粉樣蛋白之減少。

另一種確定本發明之g3p融合蛋白或組成物是否減少體內澱粉樣蛋白的方法，為使用hAPP小鼠模型。Rockenstein,J Neurosci Res.(2001)66(4)：573-82。該些小鼠 於早期(3至4個月大)即發展出高濃度的β澱粉樣蛋白。本發明融合蛋白或組成物之澱粉樣蛋白減少能力，可由本發明之組成物注射至小鼠而確定，並以該些小鼠之澱粉樣蛋白濃度與未經注射之對照組相比較。本發明之融合蛋白或組成物亦可僅注射於hAPP小鼠之一腦半球，並比較相同小鼠於注射與未注射之腦半球間的澱粉樣蛋白濃度差異。

在另一範例中，以阿茲海默氏症(TgAD)基因轉殖小鼠模型檢測本發明之融合蛋白或組成物，其揭示於US2011/0142803,Hsiao et al.,Science(1996)274：99-102，或Duyckaerts et al.,Acta Neuropathol(2008)115：5-38。簡單而言，以野生型及基因轉殖小鼠進行實驗。欲評估以本發明之融合蛋白或組成物作為去凝集試劑的可能性，組成物以顱內或全身注射至基因轉殖小鼠(Taconic，APPSWE(2576)，10個月大)。舉例而言，在顱內注射方面，含本發明融合蛋白之組成物可注射至一腦半球，而其對側則注射磷酸鹽緩衝液(PBS)以作為對照組。隨後，經處理之小鼠於不同時間點犧牲，其大腦於4%多聚甲醛中固定隔夜，並以切片機進行切割。進行硫代黃素-S(ThS)染色，以評估澱粉樣蛋白負荷。利用梅爾氏蘇木精(Mayer's hematoxylin)進行切片染色，以中止核自體螢光，並於洗滌後，施加ThS溶液(1%)3分鐘。以1%醋酸進行20分鐘之鑑別反應，並於洗滌後，將玻片乾燥及以抗褪色甘油固定液進行固定。利用LEICA Qwin程式計算澱粉樣蛋白負荷。或者，以抗-澱粉樣蛋白抗體分析澱粉樣蛋白負荷。

同時，測量經放射性(例如，I¹²⁵)或螢光性標定之融合蛋白或組成物，或未經標定之融合蛋白或組成物之生物分佈，以證實本發明之融合蛋白或組成物可於體內結合於澱粉樣蛋白。舉例而言，該融合蛋白可經放射性或螢光性標定。將BALB/c小鼠分組。隨後，每週小鼠以鼻內投予融合蛋白，並歷時1小時。第一組小鼠係於4%多聚甲醛之心肌內灌流給藥後1小時犧牲。第二組係於處理後3小時犧牲，而最後一組則於處理後24小時犧牲。在灌流後，將大腦及周圍器官移除，並測量標定物。或者，可利用類似方法評估未經標定之融合蛋白或組成物之結合作用，不過必須以一種可辨識澱粉樣蛋白的染劑及一種可辨識組成物或噬菌體的染劑進行大腦切片共同染色。

同時，可使用其他蛋白質錯誤折疊疾病之基因轉殖模型，以證實本發明之融合蛋白或組成物可減少澱粉樣蛋白。該非侷限之範例包括“D品系”α突觸核蛋白小鼠(一種帕金森氏症模型，Masliah et al.,Science(2000)287：1265-1269)；Tg2576小鼠(一種阿茲海默氏症模型，Hsiao et al.,Science(1996)274：99-102 and Duyckaerts et al.,Acta Neuropathol(2008)115：5-38 at 9)；多種Jax®小鼠，用於帕金森氏症研究(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)；以及購自JSW Lifescience之帕金森氏症、阿茲海默氏症、杭丁頓氏症小鼠及大鼠模型。

醫藥組成物

在另一觀點中，本發明係提供醫藥上可接受組成 物，其包含上述之任何g3p融合蛋白，包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31之融合蛋白，或其片段、突變體或變體。特別的是，本發明之醫藥組成物包含SEQ ID NO：9之胺基酸21至506、SEQ ID NO：9之胺基酸22至506、SEQ ID NO：9之胺基酸23至506、SEQ ID NO：9之胺基酸21至505、SEQ ID NO：9之胺基酸22至505，或SEQ ID NO：9之胺基酸23至505；或上述之任何該些序列之突變體或變體。在其他實施例中，本發明之醫藥組成物包含SEQ ID NO：11之胺基酸21至506、SEQ ID NO：11之胺基酸22至506、SEQ ID NO：11之胺基酸23至506、SEQ ID NO：11之胺基酸21至505、SEQ ID NO：11之胺基酸22至505，或SEQ ID NO：11胺基酸23至505；SEQ ID NO：13之胺基酸21至508、SEQ ID NO：13之胺基酸22至508、SEQ ID NO：13之胺基酸23至508、SEQ ID NO：13之胺基酸21至507、SEQ ID NO：13之胺基酸22至507，或SEQ ID NO：13胺基酸23至507；或SEQ ID NO：31之胺基酸21至528、SEQ ID NO：31之胺基酸22至528、SEQ ID NO：31之胺基酸23至528、SEQ ID NO：31之胺基酸21至527、SEQ ID NO：31之胺基酸22至527或SEQ ID NO：31胺基酸23至527，或上述之任何該些序列之突變體或變體。

"醫藥組成物"意指一醫藥有效量之本發明g3p融合蛋白及生理上適用載劑及/或賦形劑，其中該融合蛋白之g3p部分為該融合蛋白之具療效部分。醫藥組成物不會對生物體造成顯著刺激。術語“生理上可接受載劑”與“醫藥上可 接受載劑”可互換使用，並意指不會對生物體造成顯著刺激及不會破壞該醫藥組成物之生物活性與特性之載劑或稀釋劑。

術語“賦形劑”意指以惰性物質加入醫藥組成物，以進一步協助活性成分之投藥。其範例包括但不限於，舉例而言，食鹽水、碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖與澱粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇，及界面活性劑，包括，例如，聚山梨糖醇酯20。

本發明所用之醫藥組成物可由常規方法配製，係以包括賦形劑與助劑之一或多種生理上可接受載劑配製，以協助g3p活性成分加工成具有醫藥上用途之組成物。適當之配方取決於所選用之給藥途徑及欲投藥組成物之本質。

本發明醫藥組成物之適用給藥途徑，舉例而言，包括經黏膜給藥，尤其是經鼻給藥；非經口給藥，包括肌內、皮下、髓內、鞘內、心室內、靜脈、腹腔、鼻內或眼內注射；經口給藥；或直腸給藥。

在一些實施例中，醫藥組成物之投藥為局部而非全身形式，舉例而言，直接將該醫藥組成物注射至病患大腦。在一些實施例中，注射技術為任何可迴避血腦障壁之技術，舉例而言，利用直接髓內、鞘內或腦室內注射。

在注射方面，本發明之活性成分可配製成水性溶液，較佳為生理上兼容性緩衝液，如漢克氏液(Hank’s solution)、林格氏液(Ringer’s solution)，或生理食鹽水緩衝液。在經黏膜給藥方面，配方中使用適合穿透障壁之滲透 劑。這類滲透劑一般為本領域所習知。

在一些實施例中，本發明之醫藥組成物係經由鼻內給藥。據報導，鼻內給藥可使病毒及巨分子直接進入腦脊液(CSF)或CNS。Mathison et al.,1998；Chou et al.,1997；Draghia et al.,1995。

在鼻內途徑給藥方面，組成物透過加壓包裝或噴霧器之氣溶膠噴霧形式以方便投藥，該氣溶膠噴霧形式使用適用之推進劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓型氣溶膠方面，投劑單位以一投藥計量閥決定。以分裝器配製明膠膠囊與藥匣時，需包括化合物粉末混合物及適用之粉末基底，如乳糖或澱粉。

本文所述之各種融合蛋白之醫藥組成物成分，亦可以嗅覺受體神經元作為投藥點進行大腦給藥。舉例而言，含有任何之該些蛋白質編碼基因之腺病毒載體可經由嗅覺受體神經元給藥。Draghia et al.,1995。

本文所述之組成物可配製成非經口給藥，例如，丸劑注射(bolus injection)或連續輸液。用於非經口給藥之醫藥組成物包括水溶性形式之組成物水性溶液。此外，活性成分之懸液配方可製成油性或水性注射懸液配方。適用之親脂性溶劑或載體包括脂肪油類(例如，麻油)，或合成之脂肪酸酯類(例如，油酸乙酯、三酸甘油酯或微脂體)。水性注射懸液含有可增加懸液黏滯性之物質，如羧酸甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚醣。任擇地，懸液亦可含有適用之穩定劑或試劑(例如，界面活性劑如聚山梨糖醇酯(Tween 20))，其增加活性成分之溶解度，使能製備高濃度溶液。使用以蛋白質為主之試劑，例如，白蛋白試劑，以防止M13吸附在傳輸表面上(亦即，IV袋、導管、針頭等)。

在經口給藥方面，組成物可容易地以本領域習知之醫藥上可接受載劑結合活性化合物配製。

配方以單位劑量形式製備(例如，小瓶、安瓿或多劑量容器配方)，並任擇地添加防腐劑。組成物可為溶於油性或水性載體之懸液、溶液或乳液，並可包含配製劑(例如，懸劑、穩定劑及/或分散劑)。液體或固體型可為單一劑量形式。單一劑量形式可直接投予病患而無須調整，或於投藥前稀釋或重組。在某些實施例中，單一劑量形式以丸劑形式給藥(例如，單一劑量注射、單一口服劑量)，包括一口服劑量中含有多種片劑、膠囊劑、丸劑等。在另外的實施例中，單一劑量形式可經由輸液或植入性幫浦(例如，ICV幫浦)於一段時間內給藥。在後一實施例中，單一劑量形式可為融合蛋白預填充之輸液袋或幫浦儲液。或者，該輸液袋或幫浦儲液可於病患投藥前製備，係將單一劑量之融合蛋白混入該輸液袋或幫浦儲液。

本發明之另一觀點包括製備本發明醫藥組成物之方法。藥物配方技術可見於，舉例而言，最新版的“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，在此併入本案以作為參考資料。

本發明適用之醫藥組成物包括含有欲達成預期目的之一有效量之g3p活性成分。本發明之醫藥組成物包含 g3p融合蛋白，其中該融合蛋白之g3p部分的用量對於有需求之病患，可有效減少澱粉樣蛋白、抑制澱粉樣蛋白形成、抑制澱粉樣蛋白凝集，或移除及/或預防有毒寡聚物之形成。該組成物不包含噬菌體。

治療上或診斷上有效量的決定，為本領域之技術人員能力範圍內可及，尤其是依據本文提供之詳細揭示。

給藥量及投藥間隔可個別調整以提供大腦可容許之噬菌體顯現載體量，其足以治療或診斷特定的大腦疾病、失調或病況(最小有效濃度，MEC)。MEC將因每一種製備而有不同，不過可從體外研究之數據評估。欲達到MEC之所需給藥量，將取決於個體之特徵。

投藥間隔亦可由MEC值決定。以治療方案進行製備物給藥，其將大腦可容許量維持在高於MEC之10至90%之間，較佳為介於30至90%之間，且最佳為介於50至90%之間。

依據欲治療病況之嚴重度及反應性，可單次或複數次給藥，且療程持續數天至數週，或直到治癒或疾病狀態降低。

當然，欲投藥之組成物的量將取決於欲治療或診斷個體、疾病嚴重度、處方醫師判斷等。

含有本文所述之g3p融合蛋白或其突變體或變體之本發明組成物，若有需要，以包裝或分裝形式呈現(例如，FDA批准之套組)，其中包括一或多個含有活性成分之單位劑型。該包裝，舉例而言，包括金屬或塑膠箔(例如， 泡殼包裝)。包裝或分裝可結合說明書以進行給藥。包裝或分裝亦附有政府機構對於藥劑之製造、使用或銷售的規範說明，反映了政府機構批准該組成物之形式，或其於人體或動物之投藥。此類說明，舉例而言，可為美國食品與藥物管理局之用藥批准標籤或核可產品仿單。含有以本發明製備物配製於兼容性醫藥載劑之組成物，亦可製備、放置於適當容器內，並標示用於治療之指定病況，如前面之進一步詳述。

應瞭解到，前面與以下之說明僅具示範與解釋意涵，不可視為侷限本發明，如同本發明之主張。

治療用途

本發明之另一觀點係關於以任何本發明之g3p融合蛋白或組成物治療蛋白質錯誤折疊疾病，包括但不侷限於，涉及任何之fAβ42、fαsyn、fNM或fτ之該些疾病。

本發明之另一觀點係關於，針對有需求之病患，以任何本發明之g3p融合蛋白或組成物減少澱粉樣蛋白、抑制澱粉樣蛋白形成、抑制澱粉樣蛋白凝集，及/或移除及/或預防有毒寡聚物之形成。

在治療時，術語“病患”、“個體”與“接受者”可互換使用，並包括人類及其他哺乳類動物。在一些實施例中，病患為對於蛋白質錯誤折疊疾病相關之生物標記物呈現陽性之人類。在一實施例中，病患在結合弗貝他比(florbetapir)之PET攝影中出現β澱粉樣蛋白沈積物。

術語“治療”意指減少、延緩或逆轉具有一或多種 疾病臨床症狀病患之疾病進展。“治療”亦指減少、延緩或逆轉具有一或多種疾病臨床症狀病患之疾病症狀。在一實施例中，病患在結合弗貝他比之PET攝影中出現β澱粉樣蛋白沈積物，且該β澱粉樣蛋白沈積物之數量因治療而減少。在一實施例中，經由本發明g3p組成物之檢測，病患具有β澱粉樣蛋白沈積物，且該β澱粉樣蛋白沈積物之數量因治療而減少或維持不變。在另一實施例中，病患在PET攝影中出現任何類型之澱粉樣蛋白沈積物，且治療後病患的認知功能改進。認知功能之改進可利用McKhann et al.,Alzheimer’s & Dementia(2011)May；7(3)：263-9所述之方法與檢測進行分析。

不同於治療，“預防”意指於任何臨床症狀發生之前，以組成物投予個體。預防係使用涵蓋本發明之任何融合蛋白或組成物。預防可能涉及已知有疾病風險增加，或確定發展成疾病之個體，其純粹依據一或多種基因標記物而定。針對多種蛋白質錯誤折疊疾病，有許多基因標記物被發現。舉例而言，具有一或多種瑞典型突變(Swedish mutation)、印第安納型突變(Indiana mutation)，或倫敦型突變(London mutation)之人類澱粉樣蛋白前驅蛋白質(hAPP)之個體，其發展為早發性阿茲海默氏症的風險增加，故為預防之候選對象。同樣地，杭丁頓蛋白基因上有三核苷酸CAG重複子之個體，特別是該些36個或更多之重複子者，最終將發展為杭丁頓氏症，故其為預防之候選對象。

術語“蛋白質錯誤折疊”意指疾病之特徵在於形 成澱粉樣蛋白，其由凝集性蛋白質(澱粉樣蛋白成形胜肽)造成，包括但不侷限於，β澱粉樣蛋白、血清澱粉樣蛋白A、胱蛋白C、IgG-κ輕鏈，或普裡昂蛋白。習知之錯誤折疊及/或凝集性澱粉樣蛋白相關之疾病包括阿茲海默氏症，其包含早發性阿茲海默氏症、晚發性阿茲海默氏症，及症狀前阿茲海默氏症、帕金森氏症、SAA澱粉樣變性症、胱蛋白C、遺傳性冰島症候群、衰老、多發性骨髓瘤、普裡昂蛋白病變，包括但不侷限於，庫魯病(kuru)、庫賈氏症(CJD)、格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)、羊搔癢症，及牛海綿狀腦炎(BSE)；肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、脊髓小腦性失調症(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、杭丁頓氏症、齒狀核紅核蒼白球肌肉萎縮症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy)、脊髓與延髓肌肉萎縮症、遺傳性腦澱粉樣血管病變、家族性澱粉樣變性症、額顳葉型失智症、英國/丹麥失智症，以及家族性腦病變。本發明之g3p融合蛋白與組成物可用於治療“蛋白質錯誤折疊”疾病。

許多的這類錯誤折疊及/或凝集性澱粉樣蛋白疾病發生於中樞神經系統(CNS)。一些發生於CNS的疾病範例包括帕金森氏症；阿茲海默氏症；額顳葉失智症(frontotemporal dementia；FTD)，包括具有下列臨床症狀之病患：行為亞型FTD(bvFTD)、漸進式非流暢型失語症(progressive non-fluent aphasia；PNFA)及語意性失智症(semantic dementia；SD)；額顳葉型退化症(frontotemporal lobar degenerations；FTLDs)；以及杭丁頓氏症。利用本發明g3p融合蛋白或組成物治療之疾病，其特徵為中樞神經系統(CNS)內出現錯誤折疊及/或凝集性澱粉樣蛋白。

蛋白質錯誤折疊及/或凝集亦可於CNS以外發生。澱粉樣變性症A(AA)(其前驅蛋白為血清急性期脂蛋白元，SAA)與多發性骨髓瘤(其前驅蛋白為免疫球蛋白輕鏈及/或重鏈)為發生於CNS以外的兩個廣為人知的蛋白質錯誤折疊及/或凝集性蛋白質疾病。其他範例包括涉及β₂微球蛋白、轉甲狀腺素蛋白(家族性澱粉樣多發性神經病變[FAP]、家族性澱粉樣心肌症[FAC]，及老年全身性澱粉樣變性症[SSA])、(原)血清AA、脂蛋白元AI、AII與AIV、凝溶膠蛋白(芬蘭型家族性澱粉樣多發性神經病變)、溶菌酶、纖維蛋白原、胱蛋白C(冰島型大腦澱粉樣蛋白血管病變、澱粉樣變性症之遺傳性腦出血)、降鈣素原、胰島澱粉樣蛋白多胜肽澱粉樣變性症(IAPP)、心房利尿鈉因子、催乳激素、胰島素、乳凝集素、角膜上皮素、乳鐵素、齒源性造釉細胞相關蛋白(odontogenic ameloblast-associated protein)，及精囊蛋白I形成之澱粉樣蛋白之疾病。本發明之g3p融合蛋白或組成物可用於治療涉及發生於CNS以外的蛋白質錯誤折疊及/或凝集性疾病。

神經退化性疾病亦涉及τ病變(請見，Lee et al.(2001)Annu.Rev.Neurosci.24：1121-159)。τ蛋白為表現於中樞與周邊神經系統軸突之微管相關之蛋白質。其涵蓋神經退化性τ病變(有時稱作τ病變)，並可由本發明所述之g3p融 合蛋白與組成物治療。τ病變之範例包括阿茲海默氏症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/帕金森氏症-失智症複合症、嗜銀顆粒失智症(Argyrophilic grain dementia)、皮質基底核退化症(Corticobasal degeneration)、庫賈氏症、拳擊手失智症(Dementia pugilistica)、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、唐氏症、額顳葉失智症，包括額顳葉失智症伴隨第17號染色體相關之帕金森氏症、格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症、哈雷伯登-斯巴茲病(Hallervorden-Spatz disease)、強直性肌肉失養症(Myotonic dystrophy)、尼曼匹克症C型(Niemann-Pick disease type C)、非關島型運動神經元病伴隨神經纖維纏結、畢克氏病(Pick’s disease)、腦炎後帕金森氏症(Postencephalitic parkinsonism)、普裡昂蛋白大腦澱粉樣蛋白血管病變、進行性皮層下神經膠質增生症(Progressive subcortical gliosis)、進行性核上眼神經麻痺症(Progressive supranuclear palsy)、亞急性硬化性腦炎(Subacute sclerosing panencephalitis)，以及神經纏結型失智症。一些該等疾病亦包括纖維狀澱粉樣蛋白β胜肽沈積物。舉例而言，阿茲海默氏症同時發生澱粉樣蛋白β沈積物與τ病變。同樣地，普裡昂蛋白媒介之疾病如庫賈氏症、普裡昂蛋白大腦澱粉樣蛋白血管病變，及格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症亦具有τ病變。因此，若一疾病為“τ病變”，不應被解釋為排除其他神經退化性疾病類型或組別，因其使用於此僅就便利考量。本發明之g3p融合蛋白或組成物可用於治療神經退化性疾病與涉及τ病變之疾病。

在一實施例中，本發明所述之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種減少病患澱粉樣蛋白之方法，該病患具有澱粉樣蛋白存在之相關症狀或對於蛋白質錯誤折疊疾病相關之生物標記物，如弗貝他比(AV-45,Eli Lilly)，呈現陽性。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射(intrathecal injection)、直接腦室內注射(direct intraventricular injection)、腦實質體內注射(intraparenchymal injection)，或鼻內傳輸。

在一實施例中，本發明所述之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種維持病患澱粉樣蛋白之量的方法，該病患具有澱粉樣蛋白存在之相關症狀或對於蛋白質錯誤折疊疾病相關之生物標記物，如弗貝他比(AV-45,Eli Lilly)，呈現陽性。病患係投予一有效量之本發明所述之g3p融合蛋白、醫藥組成物，或配方。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種去凝集病患澱粉樣蛋白之方法，包含投予具澱粉樣蛋白之病患一有效量之本發明所述之g3p融合蛋白、醫藥組成物，或配方。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種導致大腦β澱粉樣蛋白沈積物去凝集作用之 方法，其包含直接注射一有效量之本發明所述之醫藥組成物至有需求病患之大腦，從而減少大腦內β澱粉樣蛋白沈積物。

在一實施例中，g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種減少大腦澱粉樣蛋白形成之方法。大腦內澱粉樣蛋白的減少，可預防、治療或降低蛋白質折疊或神經退化性疾病之症狀或嚴重度。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，本發明之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種促進大腦內澱粉樣蛋白清除之方法。大腦內澱粉樣蛋白清除之促進，可預防、治療或降低蛋白質折疊或神經退化性疾病之症狀或嚴重度。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，本發明之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種抑制大腦內澱粉樣蛋白凝集作用之方法。大腦內澱粉樣蛋白凝集作用之抑制，可預防、治療或降低蛋白質折疊或神經退化性疾病之症狀或嚴重度。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，本發明之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種清除大腦內有毒澱粉樣蛋白寡聚物之方法。大腦內有毒澱粉樣蛋白寡聚物之清除，可預防、 治療或降低蛋白質折疊或神經退化性疾病之症狀或嚴重度。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，本發明之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種預防大腦內有毒澱粉樣蛋白寡聚物形成之方法。大腦內有毒寡聚物形成之預防，可預防、治療或降低蛋白質折疊或神經退化性疾病之症狀或嚴重度。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。

在一實施例中，本發明之g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係用於一種保護神經元免於澱粉樣蛋白損害之方法。神經元之澱粉樣蛋白損害之保護，可預防、治療或降低蛋白質折疊或神經退化性疾病之症狀或嚴重度。在一實施例中，給藥途徑係選自於脊髓腔內注射、直接腦室內注射、腦實質體內注射，或鼻內傳輸。在一實施例中，用於保護神經元免於澱粉樣蛋白損害之本發明g3p融合蛋白、醫藥組成物或配方係預防性給藥。

在一些實施例中，病患對於蛋白質錯誤折疊及/或凝集性疾病相關之生物標記物呈現陽性。在一實施例中，該生物標記物為弗貝他比(AV45,Eli Lilly)。

在一些實施例中，病患具有與澱粉樣蛋白之存在相關聯之神經退化性疾病症狀。在各種實施例中，該澱粉樣蛋白為fAβ42、fαsyn、fNM，或fτ之任一者。

在某些實施例中，該神經退化性疾病為帕金森氏 症、阿茲海默氏症，或杭丁頓氏症。在一實施例中，該神經退化性疾病為阿茲海默氏症。在一實施例中，該神經退化性疾病為阿茲海默氏症且病患具有β澱粉樣蛋白，其可由顯影劑弗貝他比(AV-45,Eli Lilly)測出。

在一些實施例中，該病患具有普裡昂蛋白媒介之疾病症狀。

在某些實施例中，該普裡昂蛋白媒介之疾病係選自於庫賈氏症、庫魯病、致死性家族性失眠症，或格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症。

在一些實施例中，該病患除了阿茲海默氏症之外，還具有神經退化性τ病變之症狀。在某些實施例中，欲治療之疾病係選自於嗜銀顆粒失智症、皮質基底核退化症、拳擊手失智症、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、唐氏症、額顳葉失智症，包括額顳葉失智症伴隨第17號染色體相關之帕金森氏症、哈雷伯登-斯巴茲病、強直性肌肉失養症、尼曼匹克症C型、非關島型運動神經元病伴隨神經纖維纏結、畢克氏病、腦炎後帕金森氏症、進行性皮層下神經膠質增生症、進行性核上眼神經麻痺症、亞急性硬化性腦炎，以及神經纏結型失智症。

診斷試劑

在本發明之另一觀點中，本發明所述之g3p融合蛋白與組成物係用於本文所述之各種疾病之體外及/或體內診斷。舉例而言，當以本發明之g3p融合蛋白或組成物作為體內或體外顯影劑時，其結合作用可為所述之蛋白質錯 誤折疊疾病之一者之診斷之一部分。

診斷試劑，或本文他處所稱之診斷組成物，皆涵蓋於此，並包含任何前述之本發明融合蛋白或組成物。該診斷試劑可進一步包含可檢測標定物，或可於體內測得者。

在一些實施例中，本發明之g3p融合蛋白或含有該融合蛋白之組成物係用作澱粉樣蛋白顯影劑。該顯影劑可檢測澱粉樣蛋白及診斷澱粉樣蛋白相關聯之疾病。由於本發明之融合蛋白與組成物可結合於各種纖維類型之澱粉樣蛋白，故其優點為可進行任何澱粉樣蛋白凝集物(Aβ、τ、α突觸核蛋白等)之顯影，並由單一顯影劑完成。現今，針對CNS之τ或α突觸核蛋白凝集物，尚無可接受之顯影劑/方法。雖然有β澱粉樣蛋白顯影劑，但是仍需要額外的試劑，以提供認知功能與顯影結果之間相關性之改進及/或更佳地預測會惡化與保持穩定之病患。欲參照，請見，Resnick & Sojkova,Alzheimer’s Res Ther.(2011)3(1)：3。

本發明之g3p融合蛋白與診斷組成物可作為顯影劑，並結合β澱粉樣蛋白專一性顯影劑(例如，F18-AV-45(Eli Lilly))使用。由於目前並沒有非β澱粉樣蛋白凝集物之顯影劑，以本發明之診斷組成物結合β澱粉樣蛋白專一性顯影劑使用，將可依據差異檢測(differential detection)測出非β澱粉樣蛋白凝集物。因此，在一實施例中，以本發明之g3p融合蛋白或診斷組成物作為顯影劑並結合β澱粉樣蛋白顯影劑使用，以檢測非β澱粉樣蛋白凝集物。

在另一實施例中，以本發明之診斷組成物作為顯 影劑，以檢測CNS(包括大腦)之β澱粉樣蛋白。

本發明之診斷組成物，當作為顯影劑時，通常該澱粉樣蛋白之結合性融合蛋白組件必須連接至一或多種可檢測標定物。利用標定蛋白質之標準技術，將各種標定物連接至檢測性組成物之澱粉樣蛋白結合組件。標定物之範例包括螢光性標定物及放射性標定物。有許多放射性標定物可使用，不過通常標定物皆選自包括但不限於，¹⁸F、¹¹C，及¹²³I。利用習知之化學方法，此類及其他放射性同位素可連接至蛋白質。在一實施例中，利用正子發射斷層攝影術(PET)檢測標定物。然而，亦可使用任何其他檢測放射性同位素之適用技術，以檢測放射性追蹤劑。

本發明診斷組成物係以相同於作為治療組成物時之途徑投予。在一實施例中，該診斷組成物之投予途徑為脊髓腔內投予。在另一實施例中，該診斷組成物之投予途徑為靜脈投予。

範例

以絲狀噬菌體作為結合與抗凝集試劑，雖然其證實之療效並非取決於任何特定之作用機制，但是理解其機制有助於設計更具療效之噬菌體。此外，其可作為製備其他抗凝集試劑之基礎。

如前述，M13顯示能結合及去凝集至少四種不同的澱粉樣蛋白纖維：澱粉樣蛋白β 1-42纖維(fAβ42)、α突觸核蛋白纖維(fαsyn)、酵母菌普裡昂蛋白NM纖維(fNM)，以及τ纖維(fτ)。構成這些澱粉樣蛋白纖維的四種蛋白質，具 有不相關的一級胺基酸序列，但是所有四種蛋白質可經錯誤折疊成典型的澱粉樣蛋白折疊。Eichner & Radford,2011。由M13結合與媒介該澱粉樣蛋白纖維之每一者之去凝集能力，顯示M13可辨識一結構模體(例如，跨β摺疊構形)或特色構形(例如，疏水性凹槽)，兩者皆為所有澱粉樣蛋白纖維的定義特徵。

不過，澱粉樣蛋白去之凝集作用，並非所有噬菌體之共同特性。舉例而言，構造迥異之二十面體噬菌體T7無法媒介fAβ42的去凝集作用，即使fAβ42在37℃下以T7培養於三天亦然。噬菌體T7縱使以M13可分離約70%共培養澱粉樣蛋白纖維之濃度加入，仍未顯示任何分離活性。相反地，相較於M13，噬菌體fd之g8p攜帶負電荷胺基酸(因此，鑑於g8p之拷貝數，該噬菌體每一者之負電荷值較M13多出2800)，故其結合及去凝集fAβ42之情況類似M13。這些初步研究，伴隨其他的發現，即煙草鑲嵌病毒(TMV)大腸桿菌纖毛及T4尾管亦可媒介澱粉樣蛋白去凝集作用，其全部具有螺旋圓筒形狀與重複單元(請見，US 2011/0182948)，顯示噬菌體形狀對於澱粉樣蛋白纖維之分離活性相當重要。

然而，下列範例說明絲狀噬菌體結合及抗凝集特性之另一種(雖然不會互相排斥)機制。依據這些範例及其所支持的作用機制，顯示g3p融合蛋白具有改進之澱粉樣蛋白結合作用。

範例1：M13噬菌體優先結合於Aβ纖維

以表面電漿共振(SPR)測定M13對於Aβ纖維與Aβ單體之結合作用。

M13噬菌體優先結合於Aβ纖維；其未結合於Aβ單體。以10¹⁴噬菌體/mL流入fAβ固定於其上之生物感測器晶片之表面電漿共振研究係報導於圖3。圖3顯示，M13結合作用之K_D為約4 nM，其相當於單株抗體之結合能力。此種高親和性交互作用顯示，一種專一性之結合過程發生於噬菌體與澱粉樣蛋白纖維之間。

範例2：M13與Ab纖維之結合作用具有劑量依賴性

M13與fAβ42之結合作用亦具有劑量依賴性。圖4A係比較兩種噬菌體劑量與漸增之fAβ42莫耳量之結合作用。在該M13-澱粉樣蛋白纖維結合試驗中，將M13-Alexa488與Aβ(fAβ)混合2至3小時以形成複合體，隨後於7500 rpm離心10分鐘以沈澱複合體。丸粒螢光與結合至澱粉樣蛋白之M13成正比。此試驗提供了噬菌體結合至fAβ之量化測定，並提供一系統以評估其他試劑競爭噬菌體結合作用之能力。圖4B顯示，M13結合競爭作用之K_D值類似於表面電漿共振觀察到的結合能力。

範例3：M13結合至Aβ纖維需要原始構形

當M13噬菌體以90℃加熱10分鐘時，其競爭結合之能力基本上已喪失。圖5顯示，在澱粉樣蛋白纖維競爭性結合試驗中，熱處理(方形)與原始構形(圓形)M13之結合競爭作用結果。

範例4：溫度與M13-澱粉樣蛋白交互作用具有關聯性

M13可有效去凝集澱粉樣蛋白纖維。圖6顯示fAβ之硫代黃素T(ThT)螢光試驗。在M13存在下，fAβ42去凝集。

圖7A顯示，在ThT螢光試驗中，鹽類濃度改變10倍(0.15至1.5 M)，僅造成fAβ去凝集百分比2至3倍的差異。這顯示，疏水性交互作用為多數去凝集作用之成因。

相對於鹽類濃度之較輕微影響，圖7B顯示，溫度由4℃變為37℃，造成去凝集作用8至10倍的差異。

這些結果顯示，M13之去凝集作用取決於試驗中該蛋白質在較高溫下更具活性及對於鹽類之影響相對不敏感(意指疏水性交互作用)。噬菌體g3p符合此陳述。其N1與N2結構域以彎曲之富含甘胺酸之連接子相連接，並“開啟”後續的N2與細菌F纖毛之結合。接著，N1可結合至細菌之共同受體，其為感染過程之一部分。在去凝集試驗中，溫度之增加預期可“開啟”g3p之N2與N1結構域。

雖然M13在高溫下之去活化(90℃，10分鐘，請見圖5)使其結合能力喪失，但是在M13-澱粉樣蛋白結合試驗中，增加培養溫度對於結合作用具有正面影響。圖8A顯示，溫度由18℃增至58℃時，結合能力逐漸變好且鉸鏈區之未折疊T_M值為約50℃，而該溫度點之後結合作用開始下降。此優化之結合作用溫度與g3p之N1-N2未折疊溫度(所謂的熔融溫度，或T_M)一致，其為48.1℃。培養溫度增至50℃與37℃時，亦造成M13與fAβ42更迅速地結合。如圖8B所示。

範例5：G3p為M13-β澱粉樣蛋白之交互作用所必需

欲直接檢測g3p是否為M13-β澱粉樣蛋白之交互 作用所必需，g3p以ArgC(M13△g3p)進行蛋白水解處理，使其從噬菌體移除，並比較M13△g3p噬菌體與再折疊之噬菌體之Aβ結合能力。處理芽孢桿菌(Bacillus)蛋白酶ArgC可選擇性地自噬菌體移除g3p次單元。結果顯示於圖9A。在競爭性結合試驗中，經再折疊之M13仍可與野生型M13競爭，儘管程度較低。然而，若僅相較於野生型M13，即使是15倍的M13△g3p競爭能力仍不佳。這種無法競爭野生型M13的情況，與M13△g3p噬菌體感染力喪失之結果一致。如圖9B所示。處理ArgC亦造成去凝集活性的喪失。如圖9C所示。

若g3p媒介結合作用之方式類似其於感染時之角色，則在感染時相當重要的N1與N2結構域，應也能競爭M13的結合作用。欲測試這一點，進行重組型可溶性N1N2(“rs-g3p(N1N2)”；“構築體3”)之製備，並以競爭試驗檢測。如圖10A與10B所示，M13可與經標定之M13競爭fAβ42之結合作用，但是M13△g3p則否。相反地，rs-g3p(N1N2)可競爭M13，顯示g3p之N1與N2結構域足以用於β澱粉樣蛋白之結合作用。在一重複之競爭試驗中可得到類似結果。如圖10B所示。

範例6：G3p鉸鏈區之未折疊突變可調控澱粉樣蛋白之結合作用

若突變可影響g3p之N1與N2結構域之間鉸鏈區之開啟能力，則其應亦可影響含此類突變之噬菌體競爭野生型M13結合至Aβ的能力。Eckert & Schmid，2007，描述數個噬菌體之變體，用於檢測此假設。變體“AAA”(亦稱為 “3A”)可破壞纖毛結合能力，並降低N2結構域之穩定性。AAA之g3p具有下列突變：W181A、F190A與F194A。IIHY之突變為T13I、T101I、Q129H與D209Y，其可穩定N2結構域及增加T_M。

評估噬菌體fd，其N1與N2結構域具有與M13 g3p相同的胺基酸序列(圖2)；IIHY，其鉸鏈區Tm高於M13，及AAA之結合競爭作用。噬菌體fd、AAA與IIHY皆於50℃下預先活化1.5小時，接著比較經活化與未經活化之Fd、AAA與IIHY競爭經標定之M13的能力。圖11顯示其結果。當加熱活化時，野生型fd為較佳之競爭試劑。相反地，加熱對於IIHY之影響不大，其具有較高之鉸鏈區Tm。相對於M13，AAA之N2結構域穩定性降低，其無論有或無進行加熱前處理，皆為較佳之競爭試劑。

這些數據所支持之結論為，M13與β澱粉樣蛋白之交互作用係經由類似於M13感染細菌之機制。首先，其顯示疏水性交互作用對於M13-β澱粉樣蛋白之交互作用相當重要。其次，M13結合作用及去凝集活性之溫度依賴性反映了N1-N2鉸鏈區之未折疊Tm。再者，g3p之選擇性蛋白水解可破壞M13-β澱粉樣蛋白之交互作用。

範例7：G3p片段可選擇性地及有效地結合於澱粉樣蛋白，而非單體

欲評估g3p片段是否保有結合澱粉樣蛋白之能力，製備含N1與N2之g3p片段並以表面電漿共振(SPR)評估其結合於Aβ纖維與Aβ單體之能力。結果顯示，rs-g3p(N1N2) 優先結合Aβ纖維；其並未結合Aβ單體。以4μM rs-g3p(N1N2)所進行的表面電漿共振研究報導於圖13，其亦顯示rs-g3p(N1N2)結合作用之K_D值約為160nM。此高親和性交互作用顯示，rs-g3p(N1N2)與澱粉樣蛋白纖維之間發生專一性結合過程。

以SPR評估之其他構築體。下表摘錄其結果。

範例8：G3p片段可有效抑制Aβ42纖維之聚集

欲檢測是否g3p片段可抑制澱粉樣蛋白纖維聚集，以ThT螢光試驗測定rs-g3p(N1N2)預防fAβ42纖維聚集之能力。結果顯示，rs-g3p(N1N2)可有效抑制Aβ42聚集。圖14A顯示此實驗之結果，其中rs-g3p(N1N2)以劑量依賴性方式預防Aβ42聚集成纖維。圖14B顯示其IC₅₀為約20nM。

在另一實驗中，於37℃下，以Aβ42培養於有或無2μM濃度之rs-g3p(N1N2)七天，並以穿透式電子顯微技術評估Aβ42纖維之完整性。圖15A顯示此實驗之結果，其中 rs-g3p(N1N2)抑制Aβ42聚集成澱粉樣蛋白纖維之能力。圖15B係報導相同樣本之ThT試驗結果。

範例9：Rs-g3p(N1N2)抑制α突觸核蛋白、fτ與Aβ凝集，而g3p-Ig融合蛋白抑制聚集並抑制Aβ凝集

欲確定是否g3p可抑制α突觸核蛋白纖維聚集，以及欲確定是否價數(亦即，g3p之拷貝數)扮演一角色，進行一試驗以檢測g3p之五聚體(5個g3p拷貝)與g3p之單體(1個g3p拷貝)對於α突觸核蛋白活性之抑制能力。結果顯示，g3p抑制α突觸核蛋白纖維聚集，而其中g3p之五聚體之活性比g3p之單體更具功效。請見圖16。

同時，評估rs-g3p(N1N2)(構築體3)與一代表性g3p融合蛋白rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)抑制Aβ42聚集之能力。如圖30與圖31所示，構築體3與構築體6皆以劑量依賴性方式抑制fAβ42聚集。如圖37所示，構築體3與構築體6能抑制fAβ42凝集。

亦評估rs-g3p(N1N2)(構築體3)抑制fτ聚集之能力。如圖44A與圖44B所示，構築體3能以劑量依賴性方式抑制fτ聚集。

範例10：G3p融合蛋白結合及去凝集Aβ

欲評估是否g3p之價數在g3p結合至澱粉樣蛋白之功效上扮演一角色，製備rs-g3p(N1N2)之雙價Ig融合蛋白(“rs-g3p(N1N2)-Ig融合體”)，並與五價M13比較其結合至Aβ纖維之能力。如圖17所示，rs-g3p(N1N2)-Ig融合體以類似於M13之親和力結合至Aβ，並比單獨處理rs-g3p(N1N2)更 有效，其顯示g3p之價數可能很重要。在一重複之競爭試驗中可得到類似結果。如圖18所示。在圖18中，方形代表構築體2(M13)；三角形代表構築體3(rs-g3p(N1N2))；倒三角形代表構築體4(rs-g3p(N1N2)-Ig融合體)；以及菱形代表陰性對照組r-IgG4 Fc。

欲確認本發明之g3p融合蛋白無法以非專一性方式結合至非澱粉樣蛋白質與聚合物(例如，疏水性蛋白質與蛋白聚合物)，以構築體6(50nM或200nM)檢測其非澱粉樣蛋白質/聚合物酪蛋白(疏水性)、明膠(聚合物)、彈性蛋白(膠原蛋白聚合物)，及牛血清白蛋白(疏水性血清蛋白)之結合。以Aβ42纖維作為陽性對照組。利用ELISA方法，將100ng之各檢測蛋白固定於高吸附性之微滴定孔上(測試兩種類)，接著在37℃下，以構築體6或不相關之IgG1抗體陰性對照組(200nM)培養1hr。在以山葵過氧化酶(HRP)共軛結合之抗-人類Fc抗體進行阻斷及洗滌步驟之後，檢測結合之構築體6或IgG1陰性對照組。在加入HRP顯影劑之後，以405 nm之析光進行量化。結果顯示，相較於非澱粉樣蛋白聚合物或疏水性蛋白質，構築體6優先結合於澱粉樣蛋白纖維。構築體6結合至非澱粉樣蛋白之情況類似於該不相關之hIgG1陰性對照組抗體。

欲評估是否價數於去凝集作用中亦扮演一角色，以濾膜捕捉試驗比較雙價rs-g3p(N1N2)-Ig融合體(“構築體4”)與五價M13。如圖19所示。結果顯示，雙價rs-g3p(N1N2)-Ig融合體與五價M13兩者皆可有效去凝集β澱 粉樣蛋白纖維。同時亦顯示，價數對於去凝集作用之功效可能很重要，其可見於1.7nM之五價M13所減少之凝集物量與40nM rs-g3p(N1N2)-Ig融合體類似。如圖19所示。

在類似之試驗中，以濾膜捕捉試驗檢測1 x 10¹²/ml M13(構築體2)；80 nM與800 nM rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體5)；及80 nM與800 nM rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)之Aβ42纖維去凝集能力。構築體2、5與6可有效去凝集β澱粉樣蛋白纖維。如圖33所示。

範例11：四聚體型卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]蛋白可結合及去凝集fAβ

欲進一步評估價數在g3p結合與去凝集澱粉樣蛋白的能力上所扮演的角色，在NiSO₄存在下，藉由結合rs-g3p(N1N2)與生物素-Lys-NTA，製備四聚體型卵白素共軛連接型g3p(N1N2)。以MWCO 3KDa薄膜移除過剩之配體。將卵白素加入，並以MWCO 100 KDa薄膜移除過剩之rs-g3p(N1N2)-生物素。所產生之g3p構築體卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]具有四個rs-g3p(N1N2)片段。在結合試驗中，比較卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]與rs-g3p(N1N2)(“構築體3”)。如圖20所示。四聚體型卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]與fAβ之結合比單體型rs-g3p(N1N2)更有效，其進一步顯示，價數對於結合功效相當重要。如圖20所示。然而，即使單體型rs-g3p(N1N2)是以治療上可接受之量結合至fAβ。

欲評估是否價數於去凝集作用中亦扮演一角 色，在濾膜捕捉試驗中，比較單體型rs-g3p(N1N2)與四聚體型卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]。如圖21所示。結果顯示，單體型rs-g3p(N1N2)與四聚體型卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]兩者皆可有效去凝集fAβ纖維。同時亦顯示，價數對於去凝集作用之功效可能相當重要，其可見於360 nM之四聚體型卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]破壞200 ng之fAβ凝集物之優越能力，對照2.5μM之單體型rs-g3p(N1N2)對於Aβ去凝集之能力降低。舉例而言，在圖21中，比較第2列與第4列。

同時，以TEM評估卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]之Aβ去凝集作用。在培養三天之後，卵白素-[生物素-g3p(N1N2)]可完全去凝集fAβ42。如圖22所示。

範例12：G3p-Ig融合蛋白明顯減少阿茲海默氏症鼠科模型之預先存在之Aβ斑點

以習知之小鼠模型研究阿茲海默氏症(Hsiao et al.,Science(1996)274：99-102；Duyckaerts et al.,Acta Neuropathol(2008)115：5-38)，雄性Tg2576小鼠之年齡大於500天，以兩種不同的N1N2-Ig融合體(構築體5為7.8μg/注射與構築體6為8.2μg/注射)製備物或以食鹽水作為陰性對照組進行海馬迴之雙側注射(2 μL/注射)，並於第7天犧牲。取出大腦組織、切片，並以抗-澱粉樣蛋白β單株抗體(82E1；cat.# MBS490005-IJ10323，購自MyBioSource)染色，並進行斑點負荷之量化。如圖28所示，相較於食鹽水處理小鼠，兩種N1N2-Ig融合蛋白皆能明顯減少海馬迴之斑點負荷。如 圖29所示，相較於食鹽水處理小鼠，兩種N1N2-Ig融合蛋白皆能明顯減少大腦皮質之斑點負荷。

Tg2576小鼠以構築體5與6處理後，測定海馬迴突觸體素(synaptophysin)的量，其為突觸神經元之成分。使用抗-突觸體素SY38抗體(Milliporte)。突觸體素之量已知與突觸密度相關聯，因此，其表現量增加代表可由先前之斑點損傷中復原。請見，DaRocha-Souto et al.(2011)J.Neuropathol Exp Neurol 70(5)：360-376。如圖40所示，兩種N1N2-IgG融合蛋白皆能明顯增加阿茲海默氏症小鼠海馬迴突觸體素之量。結果顯示，除了斑點量減少，以N1N2-Ig融合蛋白治療阿茲海默氏症小鼠會產生額外的生理上益處。

同樣地，在以構築體5處理Tg2576小鼠之後，以抗-Iba-1抗體測定海馬迴Iba-1的量，其為小神經膠質細胞活化作用標記物並為斑點清除時所需(請見，例如，Wilcock et al.(2004)J.Neurosci.24(27)：6144-6151)。如圖41所示，在處理7天/週之後，兩種N1N2-IgG融合蛋白皆能明顯增加阿茲海默氏症小鼠海馬迴Iba-1的量。此結果證實，以N1N2-Ig融合蛋白處理阿茲海默氏症小鼠能清除斑點。

在以構築體5與6處理Tg2576小鼠之後，以抗-GFAP抗體(Millipore # AB5804)測定海馬迴膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)之量，其為星狀細胞活化作用及大腦發炎反應之標記物。已知GFAP之量隨著大腦損傷而增加。請見，例如，DaRocha-Souto et al.(2011)J.Neuropathol Exp Neurol 70(5)：360-376，第374頁。因此，GFAP可作為任何特定處理後之標記物，以評估是否該處理可增加GFAP之量，其顯示該治療可能損害大腦。如圖42所示，兩種N1N2-IgG融合蛋白皆未明顯增加阿茲海默氏症小鼠海馬迴GFAP之量，其顯示以N1N2-Ig融合蛋白處理阿茲海默氏症小鼠不會損害海馬迴。

範例13：G3p-Ig融合蛋白抑制Aβ寡聚物誘發之細胞毒性

Aβ寡聚物會使神經元細胞釋出某些有毒酵素。可評估該酵素以確定是否化合物可抑制Aβ寡聚物誘發之細胞毒性。圖32為M13(構築體2)與rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)抑制寡聚物誘發之N2a細胞毒性之代表性數據。因此，g3p-Ig融合蛋白為Aβ寡聚物誘發細胞毒性之有效抑制劑。

範例14：G3p-Ig融合蛋白可結合與去凝集τ，以及減少年老3xTg小鼠與年老τ基因轉殖小鼠之Aβ斑點與p-τ

欲評估是否g3p-Ig融合蛋白結合至τ，製備含有N1與N2之g3p片段-Ig融合蛋白並以表面電漿共振(SPR)評估其結合fτ之能力。圖35為一代表性之SPR試驗結果，其顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(構築體4)可有效結合fτ。圖48為另一代表性之SPR試驗結果，其顯示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)可有效結合fτ。

欲檢測是否g3p-Ig融合蛋白可去凝集τ，以ThT螢光試驗檢測含N1與N2之g3p片段-Ig融合蛋白分解預先形成之fτ的能力。結果顯示，g3p-Ig融合蛋白可有效去凝集fτ。 請見，圖36A、圖36B、圖49A，及圖49B。

欲檢測是否g3p-Ig融合蛋白在活體內具有效用，使用19至20月大之雄性與雌性3xTg小鼠，其被視為阿茲海默氏症模型(請見，Sterniczuk et al.,2010 Brain Res 1348：139；Sterniczuk et al.,2010 Brain Res 1348：149)，並將rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)或對照組直接注射至大腦海馬迴區域。注射7天後收取大腦組織。以切片進行免疫染色，其中以抗-澱粉樣蛋白β單株抗體(82E1；cat.# MBS490005-IJ10323，購自MyBioSource)檢測Aβ斑點或以抗-PHF1抗體檢測p-τ(請見，Kosik et al.,1986,Proc Natl Acad Sci USA 83(11)：4044；PHF=成對螺旋狀纖維)。成對螺旋狀纖維為含τ纖維家族之一，其可沈積為稱作神經纖維纏結的大型細胞質凝集物，並被視為τ的標記物。結果顯示，相較於對照組，構築體6明顯減少經處理小鼠海馬迴Aβ斑點之量。請見，圖52A。結果亦顯示，相較於對照組，構築體6明顯減少經處理小鼠海馬迴τ之量。請見，圖52B。以單尾之杜納氏檢定(Dunnett’s test)進行分析(* p<0.05；** p<0.01)。

欲評估本發明g3p融合蛋白在不同活體模型中減少τ的能力，以年老τ(P301L)基因轉殖小鼠進行研究。T(P301L)小鼠可過度表現τ，並被視為研究阿茲海默氏症之模型。請見，Lewis J et al.(2000)Nat Genet 25：402-405。年老P301L小鼠具有與τ病變相關聯之明顯過動症表型。以植入式鞘內幫浦將構築體6(約2 mg/Kg)緩慢輸注至τ(P301L) 小鼠(N=7)脊柱內14天。在14天後，在盲目法中，觀察小鼠的運動活性(移動10分鐘之距離)。構築體6處理小鼠，而非PBS處理小鼠，顯示具有明顯較佳之動活性。構築體6對於野生型小鼠(N=10)不產生影響。

範例15：G3p-Ig融合蛋白抑制PrP ^Sc 累積、凝集，以及PrP ^Sc 於普裡昂蛋白病變細胞培養模型中(N2a22L ^Sc )之形成

普裡昂蛋白病變之特徵在於，將正常細胞之普裡昂蛋白(PrP^c)轉變為抗蛋白酶之病理形式PrP^Sc。PrP^Sc不同於PrP^c之處在於抗蛋白酶活性：蛋白酶可部分分解PrP^Sc以形成抗蛋白酶活性之C端核心片段(PrPres)，其為未醣化形式並具有分子量19至21 kDa。PrP^Sc之抑制、回復與減少，為治療多種退化性疾病之可行療法。

欲確定是否含N1與N2之g3p-Ig融合蛋白可於普裡昂蛋白病變之體外模型中干擾病理性普裡昂蛋白構形異構物(PrP^Sc)之形成，以及欲確認N2a22L^Sc細胞於有或無g3p-Ig融合蛋白存在時之去凝集作用或PrP之溶解度變化，細胞於有或無1 μg/ml之構築體6或IgG存在下培養24h，並以溶解緩衝液收取。在4℃下，100 μg之總蛋白質於Beckman Optima TL超高速離心機與TLA 100.1轉子之55,000 rpm下，進行90分鐘超高速離心。以25μl之經溶解丸粒樣本與上清液進行SDS-PAGE，並以抗-PrP抗體6D11 mAb進行接下來的分析。PrP^Sc或PrP之突變體之界面活性劑不溶性增加，發生於抗蛋白酶K(PK)活性出現之前，因此證實g3p-Ig融合蛋白改變PrP溶解度之能力。相較於經IgG處理之 N2a22L^Sc細胞，經構築體6處理之細胞具有明顯較低量之凝集型/不溶性PrP。請見，圖38A與圖38B。

在圖38A與38B中，N2a22L^Sc細胞之產生如前述(Pankiewicz et al.,Eur.J.Neurosci.(2006)23：2635-2647)。簡單而言，以小鼠適應型22L普裡昂蛋白株感染之絕症型CD-1小鼠的大腦進行均質化，係於冰冷之磷酸鹽緩衝液與5%葡萄糖之無菌條件下進行超音波震盪(10%重量/體積)。在感染方面，大腦均質物進一步以Opti-MEM稀釋成2%，並以1 mL/10-cm²孔之量加至生長中的六孔培養盤內(Corning,Acton,MA,USA)。在5小時後，將1 mL之常規MEM加入，且細胞於感染性大腦均質物之存在下繼續培養12小時。細胞經洗滌並加入標準MEM生長培養基。細胞培養至全滿，並隨即以1：2稀釋分裝至25-cm²長頸瓶(Corning)。每隔4天，生長於其中一長頸瓶之細胞以1：2分裝生產繼代，而另一長頸瓶之細胞則被收取並均質化以檢測PrP^Sc之量。依據先前之研究，源自PrP^Sc之接種體僅能於第一與第二代細胞中測得，故以第4代(P4)細胞進行接下來的研究。在4℃下，以50 mM Tris-HCl，pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1 mM Na₃V0₄、1 mM NaF、2.5 mM Na₄P₂O₇、1 mM β甘油磷酸鹽、1% NP-40、0.25%去氧膽酸鈉、0.5 mM苯甲基磺醯氟(PMSF)、1 mM亮肽素、1 mM胃抑素A，或不含PMSF(以進行PK分解)組成之均質緩衝液溶解細胞5分鐘，並於4℃下以10,000g離心10分鐘，以移除不溶性材料。在細胞分離方面，100 μg之蛋白質以55,000 rpm離心90 min，之後丸粒再回復為初始體積。以20%之丸粒與上清液進行生化學解析與確認。

欲探究是否g3p-Ig融合蛋白可藉由去凝集作用或改變其物化特性，而劑量依賴性地改變PrP^Sc增殖性，將有或無濃度漸增之構築體6或IgG培養於N2a22L^Sc細胞中24小時，並以溶解緩衝液收取。以有或無PK處理之經溶解細胞分液進行SDS-PAGE，並以抗-PrP抗體6D11與6H4 mAb進行後續分析。取自對照組IgG與經構築體6處理之細胞裂解液，於生化學上之PK分解與未分解處理後，評估PrP之免疫反應性。處理組別包括：N2a22L^Sc+10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.333μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、0.012μg/ml，及0.004μg/ml之構築體6，或N2a22L^Sc+1μg/ml mIgG。

結果顯示，於構築體6存在下，PrP^Sc明顯有劑量依賴性減少，其中相較於1μg/ml IgG，0.08μg/ml之構築體6造成PrP^Sc之產量低於50%。請見，圖39A與圖39B。重複之實驗確認此結果。

欲評估PrP之蛋白酶K(PK)抗性構形異構物，在37℃下，以1：50之稀釋倍率之PK(1μg/μg)處理溶解細胞之等分試樣30分鐘，係依據先前之方法進行(Perrier et al.,J.Neurochem(2004)84：454-463,Pankiewicz et al.,Eur J Neurosci(2006)23：2635-2647)。在培養之後，加入4 mM PMSF以終止該分解反應。

以BCA蛋白質試驗套組(Pierce)測定蛋白質濃度。以樣本緩衝液(250 mM Tris-HCl，pH 6.8、10% SDS、5 mM β巰乙醇、50%甘油、0.02%考馬思藍G250)稀釋樣本，並煮沸5分鐘。經處理之樣本於還原條件下以SDS-PAGE進行解析。

以抗-PrP單株抗體6D11(請見，Sadowski et al.(2009)Neurobiol Dis.34(2)：267-278)與6H4(請見，Cordes et al.(2008)J Immunol Methods 337：106-120)及抗-肌動蛋白抗體確認樣本。以山葵過氧化酶共軛連接之抗-小鼠IgG(GE Healthcare UK Limited,Buckinghamshire,UK)檢測抗原-抗體複合物，並依據製造商之指示以ECL系統(GE Healthcare UK Limited)進行顯影。以底片之光密度分析進行蛋白質層帶之定量(Image J,NIH)。

綜上所述，圖38A與38B，及圖39A與39B顯示之結果證實g3p-Ig融合蛋白於體外直接抑制PrP^Sc形成之能力。

範例16：NMR研究

欲評估作用於rs-g3p(N1N2)(構築體3)之fAβ42殘留物，以¹⁵N-HSQC NMR分析fAβ42之氫/氘(H/D)交換作用。請見，例如，Sanchez et al.(2011)J.Am.Chem Soc 133：6505-08。測定骨幹上醯胺鍵氫原子之氫/氘(H/D)交換，以確定纖維之Aβ分子之分離速率及澱粉樣蛋白纖維具備之結合作用片段，並偵測是否纖維結構因構築體3之結合而受干擾。

製備以¹⁵N均勻標定之Aβ單體所產生的成熟型澱粉樣蛋白纖維(fAβ42)，並於37℃之有或無存在構築體3之 下，暴露於D₂O中0至744小時(0至31天)。暴露於構築體3之後，將纖維凍乾，並將凍乾材料溶於二甲基亞碸/二氯乙酸(DMSO/DCA)溶劑中。隨後，以¹⁵N-HSQC NMR光譜測定每一胺基酸相關之H/D交換比例。由於有些其他的H/D交換反應發生在DMSO/DCA溶液中，因此，每次在纖維暴露於D₂O時，測定DMSO/DCA溶液中H/D交換比例之時間依賴關係，並將數據外推至DMSO/DCA中的溶解時間。請見，例如，Whittemore et al.(2005)Biochemistry 44：4434-41及Sanchez et al.(2011)J.Am.Chem Soc 133：6505-08之方法。

在有或無構築體3之存在下，構築體3：fAβ42(25：75 μM)以化學計量比1：3進行H/D交換實驗。使用10倍過剩量進行實驗以確保飽和之結合作用。

結果顯示，H/D交換並未遵守單相流程，其如同前面的Aβ纖維及其他澱粉樣蛋白所觀察之結果(Yamaguchi et al.(2004)J.Mol.Bio 338：559-571；Sanchez et al.,2011)。不存在構築體3時，其交換情況顯示，Aβ1-42的兩種延伸序列，殘基17至27與31至40，皆相當受保護以免於H/D交換。加入構築體3則增加殘基17至22與33至40的保護。因此，結果顯示，構築體3經由疏水性核心殘基辨識Aβ纖維。需注意的是，殘基18、32、36與41因訊號重疊而省略其分析，而殘基2、7、8、14、30與38則於DMSO/DCA溶解停滯期產生交換，因此未報導對於這些殘基的影響，而其貢獻僅能由鄰近胺基酸之數據推斷。

結果亦顯示，保護作用主要出現在較低相之交 換，其產生強烈抑制。

同時，以TEM分析構築體3與fAβ42之間的交互作用。結果顯示，以預先形成之fAβ42與構築體3培養744小時後，無定形凝集物增加，故其可去凝集預先形成之fAβ42。由pH 2.0產生之fAβ42，其TEM一致顯示密集的纖維網絡，而欲清楚確定其型態，常需要10倍稀釋。所形成之纖維為互異之個別纖維，其中觀察到的纏繞及少數橫向連結，類似於先前觀察到的Aβ42(Olofsson et al.(2006)J.Biol Chem 281：477-83)及纏繞性Aβ40(Petkova et al.(2005)Science 307：262-65)。無定形凝集物相對較少，而寡聚物型結構可於多數影像中觀察到，其可視為次要背景物種。寡聚物與無定形凝集物，伴隨小量的纖維，皆能極頻繁地在上清液的影像中觀察到，且在190 000 RCF_MAX離心後仍存在。

在H/D交換過程期間(於pH 7.4之緩衝液中)而非離心時進行樣本TEM，其顯示無定形凝集物之量較原始製備方式增加。無定形凝集物並未與fAβ42一起被離心下來。在744小時後，當構築體3存在時，未離心材料含有較少的纖維。因此，在744小時，構築體3可去凝集預先形成之fAβ42。

圖45係顯示實驗之示意圖。圖46為作用於構築體3之fAβ42殘基之代表圖。圖47為於744小時構築體3去凝集預先形成之fAβ42之代表性TEM。

範例17：If1 N1N2融合蛋白可有效結合至fAβ42

If1噬菌體與M13噬菌體之g3p之N1結構域具有大約30%等同度，但其N2結構域之間沒有等同度。製造g3p N1N2-IgG-Fc融合物構築體，其中g3p之N1N2區段係源自If1噬菌體(構築體8；SEQ ID NOs：31與32)。利用SPR分析構築體8，以確定其結合至Aβ纖維之親和力。以1：1混合100μM Aβ42纖維(重組型胜肽Aβ1-42，於10 mM HCl中聚集3天)與10 mM NaAc pH 5.0，並固定在CM3表面上。將大約2μM之構築體3(N1N2 g3p非融合蛋白)與構築體8溶於運行緩衝液[10 mM HEPES pH7.5、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% P20]，並以5μl/min流過生物晶片表面10至12 min。所有樣本皆於25℃製備。結果顯示於圖50A。構築體8強烈結合於Aβ纖維並具有K_D值~36 nM。G3p之N1N2片段(未連接至Fc結構域)具有較弱的結合能力(K_D~36 nM)。

接著，進行另一澱粉樣蛋白纖維之結合試驗，以比較If1 N1N2 g3p與M13 N1N2 g3p結合fAβ之能力。在此試驗中，以Aβ(fAβ)與M13-Alexa488混合2至3小時，使其形成複合體、將受測構築體(If1 N1N2 g3p與M13 N1N2 g3p；兩者皆不具有Fc結構域)加入，並隨即以7500xg離心10分鐘以沈降該複合體。丸粒螢光值與結合至澱粉樣蛋白之M13成正比。此試驗提供噬菌體與fAβ結合之量化測定，並提供一系統以評估其他試劑競爭噬菌體結合作用的能力。圖50B為其結果，其顯示If1 N1N2 g3p之結合能力優於M13 N1N2 g3p約四倍。

範例18：以年老Tg2576小鼠進行全身性投藥時，g3p-Ig融 合蛋白可減少澱粉樣蛋白及改進阿茲海默氏症相關之行為

欲確定是否g3p-Ig融合蛋白能於全身性投藥時有效治療阿茲海默氏症，以10 mg/kg之rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)或PBS腹腔投予年老Tg2576小鼠(21至23個月大的雄性品種)。所有小鼠皆接受抗-CD4之前處理(0.5 mg-IP)，以防止rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(構築體6)之全身性給藥產生的週邊免疫反應。

在第3週時，評估小鼠之肌陣攣性角落跳躍行為(myoclonic corner jumping)，其評估海馬迴、紋狀體，及涉及運動協調性與控制之區域(腦幹、小腦、運動皮層)之功能。請見，Lalonde & Strazielle,2012,Neurosci Res,74(2)：69。此行為類似於後期阿茲海默氏症病患發生的肌躍症(myoclonus)。請見，Lalonde et al,2012,Rev.Neurosci,23(4)：363。小鼠於新環境中觀察5分鐘，並記錄其後腳直立於獸籠角落時，出現持續跳躍及/或攀爬行為之次數。結果顯示，相較於接受對照組PBS之小鼠，接受構築體6之小鼠具有明顯較少的肌陣攣性角落跳躍事件。請見，圖55。

在第6週時，以測量總移動距離評估小鼠的過動症(請見圖53A與圖53B)，及繞圈活動(請見圖54)。該些試驗藉由測定其於新環境中之總移動距離以檢測過動症之改善情形。該些行為試驗係模擬AD病患常見的高度激動情況。請見，Mega et al.,1996 Neurology 46：130；以及King et al.,1999 Brain Res,103：145。將小鼠置於40 cm x 40 cm的方形 平臺上10分鐘，並以影像追蹤系統即時記錄其自發性之運動與行為。結果顯示，相較於接受對照組PBS之小鼠，接受構築體6之小鼠具有明顯降低的自發性活動力。請見，圖53A與53B。相較於接受對照組PBS之小鼠，接受構築體6之小鼠亦具有明顯減少的繞圈行為。請見，圖54。

在第9週時，以Y型迷宮評估小鼠之自發性交替能力，其可評估小鼠之短期空間記憶與對新奇之探索能力。請見，Hughes,2004 Neurosci & Biobehav Rev,28：497。請見，圖56。相對於短期記憶正常之小鼠，短期記憶受損之小鼠，如Tg2576小鼠模型，具有較差的自發性交替能力。此試驗係模擬AD病患之短期記憶與空間記憶受損情況。將小鼠置於Y型迷宮中10分鐘，並以自動化影像追蹤系統追蹤其臂進入次數(arm entries)。相對於接受對照組PBS之小鼠，接受構築體6之小鼠在Y型迷宮中的臂進入次數有明顯更多的自發性交替，顯示其記憶能力改善。下方為一示意圖，其顯示PBS或構築體6之注射時間點(箭頭)及行為評估之時間點(星號)。

在第10週時，犧牲構築體6處理與PBS處理之小鼠，並以抗-Aβ抗體染色及硫代黃素S染色評估Aβ斑點負荷之減少情形。結果顯示，全身性投予g3p-Ig融合蛋白可明顯減少阿茲海默氏症小鼠海馬迴之Aβ斑點負荷。

在另一實驗中，每週以腹腔注射3個劑量組別(0.2 mg/Kg，N=13；2 mg/Kg，N=12；以及20 mg/Kg，N=13)之構築體6至>19個月大之年老Tg2576阿茲海默氏症模型小鼠，並歷時10週。以PBS處理組(N=13)作為陰性對照組。構築體6處理小鼠之自發性交替檢測顯示，在空間記憶部分有劑量依賴性改進，因此，接受20 mg/Kg之組別明顯有改進。

綜合這些結果顯示，g3p-Ig融合蛋白可改善Tg2576小鼠之多種精神運動表型及認知缺陷，其類似於中期至晚期阿茲海默氏症病患所觀察到的症狀，以及可減少大腦的澱粉樣蛋白。因此，這些結果支持一概念，亦即全身性給予g3p融合蛋白可治療阿茲海默氏症。

範例19：構築體6之選殖、表現與純化

以QIAprep Spin M13套組(Qiagen,Cat#27704)萃取M13 ssDNA。以PCR伴隨正向引子(AAAAAAGGGAATTCGATGGCTGAAACTGTTGAAAGTTG；SEQ ID NO：33)與負向引子(AAAAAACCATGGCACCGGAACCAGAGCCAC；SEQ ID NO：34)放大M13 g3p(g3pN1N2)之N1-連接子-N2-連接子結構域。以限制酶EcoRI-HF(New England Biolabs，Cat#R3101)與NcoI-HF(New England Biolabs，Cat#R3193)切割g3pN1N2 PCR產物(其編碼SEQ ID NO：13之胺基酸22-277)與pFUSE-hIgG1-Fc2載體(InvivoGen，Cat# pfuse-hglfc2)。該載體編碼IL2訊息序列(SEQ ID NO：13之胺基酸1-20)、多重選殖位置，及人類IgG1-Fc2(SEQ ID NO：13之胺基酸 287-509)。以切割之載體進行去磷酸化並連接至經切割之插入子。將連接產物轉形至NEB 5α勝任大腸桿菌(New England Biolabs，Cat# C2987)。由於pFUSE-hIgG1-Fc2載體使用多重選殖位置，連接產物預期可於訊息序列與g3PN1N2之第一個胺基酸之間編碼甲硫胺酸(SEQ ID NO：13之胺基酸21)。以經挑選之單一殖株轉形體進行培養，並製備質體。質體經萃取後，以限制酶切割及瓊脂凝膠電泳檢查其插入子之大小。以DNA定序確認IgG1Fc-g3p(N1N2)之質體候選物。

以無內毒素之Maxi套組(Qiagen)製備質體，並以過濾法除菌。利用下述之Expi293^TM Expression System(Life Technologies，Cat# A14635)進行蛋白質之高產量表現。

依據製造商之指示培養Expi293F^TM細胞。在搖晃長頸瓶中，以30 ml至0.5公升之批次進行轉染。在轉染前一天，將細胞稀釋成2x10⁶細胞/ml。欲轉染30 ml之細胞懸液(2.5x10⁶細胞/ml)，將30 μg之質體DNA稀釋於1.5 ml之Opti-MEM並將80 μl之ExpiFectamine^TM 293 Reagent稀釋於1.5 ml之Opti-MEM。在以質體DNA加入ExpiFectamine^TM 293 Reagent之前，各混合物預培養5分鐘，之後額外培養20至30分鐘。將DNA-ExpiFectamine^TM 293 Reagent混合物緩慢加入細胞溶液中並輕微搖動。在加入150 μl之ExpiFectamine^TM 293 Transfection Enhancer I與1.5 ml之ExpiFectamine^TM 293 Transfection Enhancer II之前，細胞先行培養約16小時。在收取培養基之前，細胞另外培養5至6 天。以10,000xg離心30分鐘收集細胞培養基，並於4℃中保持無菌直到純化。

以HiTrap^TM rProtein A FF管柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)純化經表現之融合蛋白。管柱以pH 3之0.1M甘胺酸-HCl沖提緩衝液再生、以pH 7之20mM磷酸鈉緩衝液平衡，並依據製造商之建議將樣本加入。在以pH 7之20mM磷酸鈉緩衝液清洗之後，蛋白質以pH 3之0.1M甘胺酸-HCl緩衝液沖提至含pH 9之Tris-緩衝液試管中。以SDS-PAGE凝膠及隨後的考馬思染色確認融合蛋白之純度，接著將蛋白質透析至PBS pH 7，並分別以Amicon® Ultracel 30k旋轉濾膜(EMD Millipore Corp,Billerica,MA)與Ultrafree CL旋轉管柱(EMD Millipore Corp,Billerica,MA)進行濃縮與濾膜除菌。所有蛋白質於使用前保存於4℃。

所得之融合蛋白預期為SEQ ID NO：13之胺基酸21至509。經純化之融合蛋白之胜肽定序顯示，胺基酸序列為SEQ ID NO：13之胺基酸23至508，表示Met21、Ala22與Lys509於重組生產期間被Expi293F^TM細胞移除。在其他真核或非真核表現系統中，目前不知道是否會發生類似過程，若有，又到達何種程度。此種過程(或缺乏)預期不會影響該表現之融合蛋白結合於澱粉樣蛋白之能力及造成澱粉樣蛋白去凝集作用。

範例20：G3p-Ig融合蛋白可減少肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之澱粉樣蛋白

欲確定是否g3p融合蛋白有益於減少肌肉萎縮性 脊髓側索硬化症(ALS)之澱粉樣蛋白，檢測一代表性之g3p-Ig融合蛋白(構築體6)干擾SOD-1纖維聚集之能力，其代表ALS之病理狀況。在有或無構築體6(1.5 μM、0.75 μM、0.15 μM)之存在下，以100 rpm攪拌SOD-1單體(原酶，3.5 μM溶於PBS、5 mM EDTA、1 mM βME)24小時。以硫代黃素T(ThT)螢光試驗測定纖維之形成(亦即，單體凝集成纖維)。構築體6不存在時，SOD-1單體形成纖維。然而，構築體6抑制SOD-1纖維之形成，並具有IC50值~0.75 μM。因此，本發明之g3p-Ig融合蛋白可於ALS模型中減少澱粉樣蛋白，並可用於治療ALS。

範例21：G3p-Ig融合蛋白可減少帕金森氏症之α突觸核蛋白

欲檢測本發明g3p融合蛋白在帕金森氏症(PD)體內模型的效用，以2 μL之構築體6(5.3 mg/mL)或PBS進行尾部兩側注射至8個月大的人類α突觸核蛋白過度表現小鼠(品系61，E.Masliah，N=9/組)。同時，以PBS注射非基因轉殖小鼠(N=5)，作為另一對照組。所有小鼠於注射14天後犧牲，並取得大腦以進行神經病理學及生化學分析。在紋狀體均質物中，具蛋白酶K抗性之α突觸核蛋白之測定顯示，構築體6處理小鼠具有明顯較少的α突觸核蛋白凝集物，且酪胺酸羥化酶(多巴胺合成酵素)的量明顯增加，兩者皆代表臨床上之改進。因此，本發明之g3p融合蛋白可減少帕金森氏症模型之澱粉樣蛋白，並可用於治療帕金森氏症。

範例22：G3p融合蛋白可成功治療澱粉樣變性症

轉甲狀腺素蛋白(transthyretin；ttr)之凝集為澱粉 樣變性症的特徵之一。欲確認本發明之g3p融合蛋白能治療澱粉樣變性症，檢測一代表性之g3p融合蛋白結合至凝集態ttr之能力。Ttr以大腸桿菌表現後純化至純度>90%，並於37℃下，以有或無攪拌(350 rpm)之方式，將0.2 mg/mL之ttr培養於凝集緩衝液(100 nM醋酸鈉、100 mM KCl、1 nM EDTA，pH4.3)以產生凝集。所得之纖維以ThT螢光試驗與穿透式電子顯微鏡進行確認，並連續稀釋於硝化纖維素薄膜上以進行西方墨點法分析。將薄膜培養於本發明之代表性g3p融合蛋白構築體6(100 nM)或抗-ttr抗體，以量化其結合作用。以原始型ttr(四聚體)及Aβ42纖維作為對照組。以HRP共軛連接之山羊抗-人類IgG抗體檢測構築體6。結果顯示，無論有或無攪拌，構築體6可定量結合於ttr纖維，但無法辨識原始ttr。以抗-ttr抗體處理之薄膜作為結合作用之對照組，其顯示凝集型與原始型ttr製備物兩者皆定量留存於薄膜上，且抗-ttr抗體無法辨識Aβ42纖維對照組。因此，g3p融合蛋白，包括構築體6，可有效結合於凝集型ttr，其代表澱粉樣變性症之病理生理學，而無法結合於原始型ttr，其為正常之生理上四聚體。此數據證實，本發明之g3p融合蛋白可結合至ttr之澱粉樣蛋白構形，因此可用於治療澱粉樣變性症。

<110> 神經噬菌體製藥股份有限公司

<120> 澱粉樣蛋白結合劑

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<141>

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<151> 2013-03-15

<150> 61/730,316

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<150> 61/708,709

<151> 2012-10-02

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 1

<210> 2

<211> 424

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 2

<210> 3

<211> 424

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 3

<210> 4

<211> 422

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之一致序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (375)..(375)

<223> Tyr或Phe

<220>

<221> MOD_RES

<222> (376)..(376)

<223> Gly或Ser

<400> 4

<210> 5

<211> 434

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 5

<210> 6

<211> 434

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 6

<210> 7

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之一致序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> (35)..(35)

<223> Ile或Met

<220>

<221> MOD_RES

<222> (44)..(44)

<223> Lys或Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222> (48)..(48)

<223> Pro或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (72)..(72)

<223> Asn或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (77)..(77)

<223> Ile或Met

<220>

<221> MOD_RES

<222> (81)..(81)

<223> Leu或Phe

<220>

<221> MOD_RES

<222> (84)..(84)

<223> Thr或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (86)..(86)

<223> Asn或Pro

<220>

<221> MOD_RES

<222> (105)..(105)

<223> Gly或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (121)..(121)

<223> Ile或Met

<220>

<221> MOD_RES

<222> (153)..(153)

<223> Phe或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (185)..(185)

<223> Ser或Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (201)..(201)

<223> Pro或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (206)..(206)

<223> Leu或Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (243)..(243)

<223> Ser或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (248)..(248)

<223> Ser或Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (272)..(272)

<223> Val或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (292)..(292)

<223> Tyr或Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (327)..(327)

<223> Phe或Leu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (336)..(336)

<223> Thr或Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (356)..(356)

<223> Arg或Leu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (378)..(378)

<223> Thr或Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (384)..(384)

<223> Asn或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (388)..(388)

<223> Tyr或Phe

<220>

<221> MOD_RES

<222> (395)..(395)

<223> Ile或Leu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (396)..(396)

<223> Glu或Asp

<220>

<221> MOD_RES

<222> (403)..(403)

<223> Asn或Gly

<220>

<221> MOD_RES

<222> (425)..(425)

<223> Val或Ala

<400> 7

<210> 8

<211> 460

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 8

<210> 9

<211> 506

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 9

<210> 10

<211> 6407

<212> DNA

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 10

<210> 11

<211> 506

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 11

<210> 12

<211> 6407

<212> DNA

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 12

<210> 13

<211> 509

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 13

<210> 14

<211> 131

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 14

<210> 15

<211> 131

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 15

<210> 16

<211> 131

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 16

<210> 17

<211> 128

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 17

<210> 18

<211> 128

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 18

<210> 19

<211> 161

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 19w

<210> 20

<211> 227

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 20

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之胜肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任何胺基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 任何胺基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> 任何胺基酸

<400> 21

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之胜肽

<400> 22

<210> 23

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之聚核苷酸

<400> 23

<210> 24

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之多胜肽

<400> 24

<210> 25

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之6xHis標籤

<400> 25

<210> 26

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之聚核苷酸

<400> 26

<210> 27

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之聚核苷酸

<400> 27

<210> 28

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之聚核苷酸

<400> 28

<210> 29

<211> 264

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 29

<210> 30

<211> 219

<212> PRT

<213> 腸內菌噬菌體

<400> 30

<210> 31

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之多胜肽

<400> 31

<210> 32

<211> 1587

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之聚核苷酸

<400> 32

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之引子

<400> 33

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之描述：合成之引子

<400> 34

Claims (22)

1. 一種融合蛋白，其包含一g3p之澱粉樣蛋白結合片段與一免疫球蛋白之Fc片段，其中該蛋白包含一選自於下列之胺基酸序列：(a)SEQ ID NO：9之胺基酸21至506；(b)SEQ ID NO：9之胺基酸22至506；(c)SEQ ID NO：9之胺基酸23至506；(d)SEQ ID NO：9之胺基酸21至505；(e)SEQ ID NO：9之胺基酸22至505；(f)SEQ ID NO：9之胺基酸23至505；(g)SEQ ID NO：11之胺基酸21至506；(h)SEQ ID NO：11之胺基酸22至506；(i)SEQ ID NO：11之胺基酸23至506；(j)SEQ ID NO：11之胺基酸21至505；(k)SEQ ID NO：11之胺基酸22至505；(l)SEQ ID NO：11之胺基酸23至505；(m)SEQ ID NO：13之胺基酸21至509；(n)SEQ ID NO：13之胺基酸22至509；(o)SEQ ID NO：13之胺基酸23至509；(p)SEQ ID NO：13之胺基酸21至508；(q)SEQ ID NO：13之胺基酸22至508；(r)SEQ ID NO：13之胺基酸23至508；(s)SEQ ID NO：31之胺基酸21至528； (t)SEQ ID NO：31之胺基酸22至528；(u)SEQ ID NO：31之胺基酸23至528；(v)SEQ ID NO：31之胺基酸21至527；(w)SEQ ID NO：31之胺基酸22至527；(x)SEQ ID NO：31之胺基酸23至527；以及(y)一突變體或變體，其至少95%等同於(a)-(x)任一者之胺基酸序列，且能結合至澱粉樣蛋白。
2. 如請求項1之融合蛋白，其中在(a)-(x)任一者中的g3p之澱粉樣蛋白結合片段具有多達5個胺基酸取代。
3. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸21至509；或一突變體或變體，其與相對應的SEQ ID NO：13之g3p部份相較，包含多達5個胺基酸取代。
4. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸22至509；或一突變體或變體，其與相對應的SEQ ID NO：13之g3p部份相較，包含多達5個胺基酸取代。
5. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸23至509；或一突變體或變體，其與相對應的SEQ ID NO：13之g3p部份相較，包含多達5個胺基酸取代。
6. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸21至508；或一突變體或變體，其與相對應的SEQ ID NO：13之g3p部份相較，包含多達5個胺基酸 取代。
7. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸22至508；或一突變體或變體，其與相對應的SEQ ID NO：13之g3p部份相較，包含多達5個胺基酸取代。
8. 如請求項1之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO：13之胺基酸23至508；或一突變體或變體，其與相對應的SEQ ID NO：13之g3p部份相較，包含多達5個胺基酸取代。
9. 如請求項1至8任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白於人體內之免疫源性係低於SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：31。
10. 一種醫藥組成物，其包含一治療有效量之如請求項1至8任一項之融合蛋白，以及一醫藥上可接受之載體。
11. 一種如請求項1至8任一項之融合蛋白用於製造一藥劑之用途，該藥劑係用於使一有需要之病患減少澱粉樣蛋白、抑制澱粉樣蛋白形成、抑制澱粉樣蛋白凝集、移除有毒寡聚物及/或預防有毒寡聚物形成。
12. 一種如請求項1至8任一項之融合蛋白用於製造一藥劑之用途，該藥劑係用於治療一病患之疾病或病況，其中該疾病或病況係選自於：阿茲海默氏症，包括早發性阿茲海默氏症、晚發性阿茲海默氏症，及症狀前阿茲海默氏症；帕金森氏症；SAA澱粉樣變性症；胱蛋白C；遺傳性冰島症候群；衰老；多發性骨髓瘤；普裡昂蛋白 (prion)病變，包括庫魯症(kuru)、庫賈氏症(Creutzfeldt-Jakob disease；CJD)、格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease；GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)、羊搔癢症，及牛海綿狀腦炎(BSE)；肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)；脊髓小腦性失調症(SCA1、SCA3、SCA6，或SCA7)；杭丁頓氏症；齒狀核紅核蒼白球肌肉萎縮症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy)；脊髓與延髓肌肉萎縮症；遺傳性腦澱粉樣血管病變；家族性澱粉樣變性症；額顳葉型失智症；英國/丹麥失智症；以及家族性腦病變。
13. 如請求項11之用途，其中當生物標記物弗貝他比(florbetapir)被用作為正子發射斷層攝影術之顯影劑時，該病患對於該生物標記物弗貝他比之反應係呈陽性。
14. 如請求項12之用途，其中當生物標記物弗貝他比(florbetapir)被用作為正子發射斷層攝影術之顯影劑時，該病患對於該生物標記物弗貝他比之反應係呈陽性。
15. 如請求項12之用途，其中該疾病或病況為帕金森氏症、阿茲海默氏症，或杭丁頓氏症。
16. 如請求項15之用途，其中該疾病或病況為阿茲海默氏症。
17. 如請求項12之用途，其中該疾病或病況為普裡昂蛋白病 變。
18. 如請求項17之用途，其中該普裡昂蛋白病變係選自於庫賈氏症、庫魯症、致死性家族性失眠症，以及格斯特曼-施特勞斯納-史辛格氏症。
19. 一種核酸序列，其編碼如請求項1-8任一項之融合蛋白。
20. 一種載體，其包含如請求項19之核酸序列。
21. 一種宿主細胞，其包含如請求項20之載體。
22. 一種製造如請求項1-8任一項之融合蛋白之方法，其包含表現由請求項20之載體中的核酸所編碼之融合蛋白，以及分離該經表現之蛋白。