CN101166536A - 治疗与淀粉样蛋白沉积有关的炎症和涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症的方法 - Google Patents

Abstract

在其表面上不展示抗体或者非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体用于抑制或者治疗与淀粉样蛋白沉积有关的和/或涉及活化的小胶质细胞的脑部炎症、用于抑制淀粉样蛋白沉积的形成、以及用于解聚预形成的淀粉样蛋白沉积。

Description

治疗与淀粉样蛋白沉积有关的炎症和涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求在2005年2月1日提交的美国临时申请60/648,383的优先权，其全部内容在此通过参考并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及抑制淀粉样蛋白沉积形成和溶解预先形成的淀粉样蛋白沉积以及涉及用于治疗脑部炎症和用于治疗与淀粉样蛋白或者淀粉样蛋白样在脑和体内其它部位中沉积相关之炎症的方法和药物组合物。

背景技术

斑块形成疾病(plaque forming disease)的特征在于在脑中存在淀粉样蛋白斑块沉积以及神经元退化。淀粉样蛋白沉积是通过肽聚集成不溶性团块而形成的。所述肽自身依不同的疾病而变化，但是在大多数情况下，所述聚集物具有β-折叠片层结构并可用刚果红染料染色。除了包括早发性阿尔茨海默病、迟发性阿尔茨海默病和先兆性阿尔茨海默病在内的阿尔茨海默病(AD)之外，以淀粉样蛋白沉积为特征的其他疾病是，例如，SAA淀粉样变性、遗传性冰岛综合征(hereditary Icelandic syndrome)、多发性骨髓瘤和朊病毒病。动物中最常见的朊病毒病是绵羊和山羊的搔痒病和牛的牛海绵状脑病(BSE)(Wilesmith and Wells，1991)。在人类中已鉴定了4种朊病毒病：(i)库鲁病，(ii)克-雅氏病(CJD)，(iii)格-施-沙病(Gerstmann-Streussler-Sheinker Disease，GSS)，和(iv)致死性家族性失眠症(fatal familial insomnia，FFI)(Gajdusek，1977；and Tritschler et al.1992)。

朊病毒病涉及正常的细胞朊病毒蛋白(PrPC)转变为相应的搔痒症异形体(scrapie isoform)(PrPSc)。分光测量证明PrPC转变为搔痒症异形体(PrPSc)涉及重大的构象转换，这意味着朊病毒病，象其它的淀粉样蛋白生成疾病一样，是蛋白质构象的异常。从PrPC向PrPSc的转变伴随着α-螺旋二级结构的减少(从42％至30％)和β-片层含量的显著增加(从3％至43％)(Caughey et al，1991；and Pan et al，1993)。这种重排与异常的物理化学特性有关，所述物理化学特性包括在非变性去污剂中的不溶性和对蛋白质水解的部分抗性。先前的研究已表明与人PrP的残基106-126(PrP 106-126)同源的合成肽表现出PrPSc的某些致病和物理化学特性(Selvaggini et al，1993；Tagliavini et al，1993；and Forloni et al，1993)。所述肽显示出明显的构象多态性，其在不同环境中获得不同的二级结构(DeGioea et al，1994)。其在缓冲溶液中倾向于采用β-片层构象并聚集成淀粉样原纤维，该原纤维对蛋白酶的消化有部分抗性。最近，对抗体3F4和其肽表位(PrP 104-113)的复合物的X-射线晶体学研究提供了对该柔性区在结构上的了解，该柔性区被认为是对于发生朊病毒病关键的构象重排的组分(Kanyo et al，1999)。基于防止聚集和/或诱导解聚，对参与折叠-解折叠和/或溶解-聚集过程的多种类型序列的鉴定可以开创治疗斑块形成疾病的新方向(Silen and Agard，1989；Frenkel et al，1998；Horiuchi and Caughey，1999)。

阿尔茨海默病(AD)是导致老年性痴呆的进行性疾病。一般地说，这种病分成两类：迟发型，其在老年人(通常超过65岁)中发生；以及早发型，其在老年期之前很早(例如，在35-60岁之间)发生。在这两类疾病中，病理学是相似的，但是在较早年龄就开始的情况，异常性倾向于更加严重和广泛传播。该疾病的特征在于在脑中两种类型的病变，老年斑和神经纤维缠结。老年斑是中性粒细胞组织异常的区域，可达150mm，在其中心有细胞外淀粉样蛋白沉积，其通过脑组织切片的显微镜分析可见。神经纤维缠结是由成对相互缠绕的两条纤维组成的tau蛋白的细胞内沉积。

老年斑的主要成分是被称为β淀粉样蛋白(Aβ)或者β-淀粉样肽(βAP或者βA)的肽。β淀粉样肽是被称为淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的前体蛋白质的39-43个氨基酸的内部片段。在APP蛋白质内的几个突变已经与阿尔茨海默病的发生相互关联起来(Goate et al，(1991)，缬氨酸717突变为异亮氨酸；Chartier Harlan et al，(1991)，缬氨酸717突变为甘氨酸；Murrell et al，(1991)，缬氨酸717突变为苯丙氨酸；Mullan et al，(1992)，双突变，将赖氨酸595-甲硫氨酸596改变为天冬酰胺595-亮氨酸596)。

这样的突变被认为通过增加或者改变将APP加工为β-淀粉样蛋白的过程，尤其是将APP加工为更多量的长形β-淀粉样蛋白(即Aβ1-42和Aβ1-43)的过程而引起阿尔茨海默病。其它基因比如早老蛋白基因，PS1和PS2中的突变被认为间接地影响加工APP而产生更多量的长形β-淀粉样蛋白的过程(见Hardy，TINS 20，154，1997)。这些观测结果指出β-淀粉样蛋白，尤其是它的长形，是阿尔茨海默病的致病因素。

还已经知道具有自我聚集证据的其他外的肽或者蛋白质，比如，但不限于，amylin(Young et al，1994)；铃蟾肽、蛙皮缩胆囊素、胆囊收缩素八肽、章鱼素、胃泌素相关五肽、胃泌素四肽、促生长素抑制素(还原型)、P物质(substance P)；以及肽、黄体化激素释放激素、促生长素抑制素N-Tyr(Banks and Kastin，1992)。

有关淀粉样蛋白纤维的出版物指出圆柱状β-片层是仅有的与一些x射线和电子显微镜数据一致的结构，并且阿尔茨海默Aβ片段和变体的纤维可能是由两或三个同心圆柱状β-片层所构成的(Perutz et al.，2002)。完整的Aβ肽含有42个残基，恰好这个数目的残基使圆柱状壳成核；该发现和在缺少脯氨酸的情况下由Aβ肽构成的β-片层中许多可能的强静电相互作用可以解释在阿尔茨海默病患者中发现的Aβ肽形成细胞外淀粉样蛋白斑块的倾向性。如果该解释是正确的，那么淀粉样蛋白就是由具有中央充水腔的窄管(纳米管)所组成的。淀粉样蛋白斑块在体外生长的可逆性表明在斑块中和在溶液中的βA之间的稳态平衡(Maggio and Mantyh，1996)。βA聚合对肽-肽相互作用以形成β-折叠片层原纤维的依赖性以及其他蛋白质对该反应的刺激作用表明，淀粉样蛋白的形成可以受到调节。已有许多尝试来寻找能够干扰淀粉样蛋白形成的物质。研究最多的化合物中有抗体，由β-破坏氨基酸如脯氨酸组成的肽，向识别基序加入带电基团，和应用N-甲基化氨基酸作为构件(综述见Gazit，2002)。

由交替的D和L残基构成的环肽形成这种纳米管，这些纳米管通过它们自身插入膜并使其去极化来杀死细菌(Perutz et al.，2002)。有一些提议某些淀粉样蛋白纤维也许是引导物并通过同样的机制杀死细胞。

自身能插入螺旋转折之间间隙的芳香族化合物比如刚果红可以使圆柱状壳去稳定化并启动这个过程，但是阻止将更加有效并且可能更容易实现(Perutz et al.，2002)。

在本文中对任何文件的引用并没有意图承认此文件属于现有技术，或者作为考虑本申请任何权利要求专利性的材料。对于任何文件的内容或日期的任何陈述是基于在提交申请时申请人可获得的信息，但是并不等同于承认该陈述的正确性。

发明内容

本发明提供用于抑制或者治疗与在脑中和体内其它部位中淀粉样蛋白沉积有关的炎症以及涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症的方法。该方法包括给需要这些的患者施用有效量的野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或者非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体。

本发明还提供作为活性成分包含有效量的所述丝状噬菌体的药物组合物。

本发明还提供通过使丝状噬菌体与斑块形成肽或者预先形成的淀粉样蛋白沉积接触来抑制淀粉样蛋白沉积形成或者来解聚预先形成的淀粉样蛋白沉积的方法。

附图说明

图1是显示颅内应用噬菌体/PBS至hAPP转基因小鼠的脑的截面示意图。向5只转基因小鼠脑内注射噬菌体。向对侧半球注射PBS。在1小时、2天和3天后处死小鼠。它们的脑被切成5μm切片，并且用硫黄素-S(Thioflavine-S)染色以评估它们的斑块负荷。

图2A和2B是显示采用ThT分析通过丝状噬菌体解聚(图2A)和阻止(图2B)β-淀粉样蛋白1-40聚集的图。在图2A(解聚试验)中，β-淀粉样蛋白(58μM)被单独培育21天。在第21天时，加入不同浓度的噬菌体并培育过夜。在图2B(阻止试验)中，β-淀粉样蛋白(58μM)被单独地或者与丝状噬菌体一起培育7天，随后将样品加入ThT溶液并通过分光荧光计测量淀粉样蛋白的含量。用结合淀粉样蛋白原纤维的硫黄素-T(Thioflavine-T)测量淀粉样蛋白的含量并且在485nm波长处检测其荧光发射。

图3A-3K是在缺少或者存在丝状噬菌体的条件下培育β-淀粉样蛋白的电子显微镜照片(放大倍数×100K)。图3A：在缺少噬菌体的条件下，在PBS中的97μM β-淀粉样蛋白。对β-淀粉样蛋白先使用小鼠单克隆抗体10D5接着用山羊抗小鼠12mn金标记抗体进行染色。图3B-3C：97μM β-淀粉样蛋白与0.5nM(1×10¹⁰)噬菌体一起培育。对β-淀粉样蛋白用小鼠单克隆抗体10D5和偶联12mn金颗粒的第二抗体进行染色。对噬菌体先用多克隆兔抗噬菌体血清接着用山羊抗兔6nm金标记抗体进行标记。在不含有噬菌体或者不含有第一抗体的样品中观察不到第二抗体的信号。图3D：对丝状噬菌体(fd)(1×10¹⁰个噬菌体)用兔多克隆血清进行染色。用6nm金颗粒标记第二抗体。图3E：在β淀粉样蛋白附近的丝状噬菌体。如用抗噬菌体抗体的分散标记所显示(箭头)，所述肽有可能增强噬菌体的降解。当单独培育噬菌体时(样品D)，该标记不存在。图3F-3G：在37℃单独培育10天后的β-淀粉样蛋白(放大倍数：F-×30K，G-×100K)。图3H-3I：β淀粉样蛋白被单独培育10天，在第10天时加入丝状噬菌体并再保持16小时(H-×30K，I-H的×100K放大)。图3J-3K：淀粉样蛋白原纤维和丝状噬菌体间的界面。噬菌体沿着原纤维轴排列(×100K)。

图4A-4C是电子显微镜照片，其中将球状噬菌体加入预聚集的β-淀粉样蛋白并一起培育过夜。与球状噬菌体在一起的β-淀粉样蛋白(图4A和4B)。单独的球状噬菌体(图4C)(放大倍数×100K)。

图5A-5C是应用MTT分析显示丝状噬菌体对于β-淀粉样蛋白对LAN-1细胞毒性的抑制作用的图。对于图5A的预防性试验，以βA/噬菌体1760∶1的摩尔比将噬菌体加入25μM的β-淀粉样蛋白中。将该混合物加入所述细胞中。存活百分率针对于在缺少β-淀粉样蛋白(处理-PBS)条件下视为100％的细胞存活率而言。在图5B和5C中，应用两种预聚集肽(βA1-40和βA17-42)测量噬菌体防护βA毒性的能力。这两种肽(βA1-40和βA17-42)在37℃培育5天。在第6天，以1.2nM的浓度将丝状噬菌体加入该预聚集的肽中并进一步培育12小时，接着将其加入在前一天接种于96孔板的细胞系中。让细胞再生长3天，然后加入MTT。3小时后，加入提取缓冲液并将该板在37℃培育过夜。在接下来的一天，在570nm波长处对该板进行读值。

图6A和6B显示被注入hAPP转基因小鼠(SWE2576，Taconic)一个半球的丝状噬菌体(图6B)和单独注入另一半球的PBS(图6A)。在处理后3天处死小鼠，与经PBS处理的半球相比，另一半球的斑块负荷减少40％。

图7是显示在鼻内应用后噬菌体在BALB/c小鼠中分布的图。在给BALB/c小鼠鼻部施用后1、3和24小时在脑和嗅球中噬菌体分布之间的比较表明，甚至在施用后1小时即有噬菌体存在(标记噬菌体，uCi/mg)。在该1小时时间点之后，它们的浓度降低。

具体实施方式

β-淀粉样蛋白肽(βA)是阿尔茨海默病的两种标志之一。该肽在脑组织中形成纤维状毒性聚集物，其只能在强变性剂作用下溶解。由于这些神经毒性特性与肽聚集形式有关，在针对降低或者消除脑中淀粉样蛋白纤维状沉积的程度来开发治疗性方法的方面已投入了很大努力。

在生理条件下，合成的βA采取聚集形式并且还表现出来自神经突的改变，其促进对海马神经元的神经毒性作用。已证明βA的聚集依赖于pH、肽的浓度、温度和培育时间。

本发明已惊奇地发现丝状噬菌体本身有能力在体外防止βA聚集，以及溶解已形成的聚集物。

在本发明人的实验室中，使用丝状噬菌体M13、f1和fd，在结构和遗传水平上对它们已有充分了解(Greenwood et al.，1991)。本实验室首次证明丝状噬菌体展示出侵入中枢神经系统的特性，然而它们还保留载体的惰性以及携带外源分子的能力(Frenkel and Solomon，2002)。

丝状噬菌体是一组在结构上相关的病毒，其包含环状单链DNA基因组。它们在生产性感染期间不杀死它们的宿主。感染含有F质粒的大肠埃希氏菌的噬菌体被统称为Ff噬菌体。它们不感染哺乳动物细胞。

所述丝状噬菌体是长约1至2微米和直径为6nm的柔性杆，在其DNA核周围具有蛋白质亚基的螺旋壳。两种主要的衣壳蛋白，蛋白质pIII和主要衣壳蛋白pVIII，在所展示蛋白质的拷贝数上有差异。pIII存在4-5拷贝，但pVIII有约3000拷贝。约有50个残基的主要衣壳蛋白pVIII亚基基本上是α-螺旋并且α-螺旋的轴与病毒粒子的轴呈现出一个小的角度。可在以下三个部分中考虑蛋白质壳：外表面，由所述亚基的N-末端区域占据，富含与周围溶剂相互作用并给予病毒粒子低等电点的酸性残基；壳内部，包括19个残基长的非极性侧链，在此蛋白质亚基主要是彼此之间相互作用；和内表面，由所述亚基的C-末端区域占据，富含与DNA核心相互作用的碱性残基。几乎所有蛋白质侧链相互作用是在衣壳蛋白阵列中不同亚基之间而不是在亚基内部发生，这种事实使其对于研究在大分子装配中α-螺旋亚基间相互作用而言是一种有用的模式系统。丝状噬菌体的独特结构使得它能够侵入脑，尽管它的质量约为16.3MD以及可有助于其干扰βA纤维化的能力，因为噬菌体结构类似于淀粉样蛋白原纤维自身。

综上所述，本发明人已研究了丝状噬菌体干扰β-淀粉样蛋白肽聚集过程的能力并且发现在体外以不同的时间间隔，以不同的比率将野生型丝状噬菌体与β-淀粉样蛋白肽一起培育导致β-淀粉样蛋白的阻止和/或解聚。此外，所述丝状噬菌体显示出对细胞存活性的保护作用。

在将所述丝状噬菌体-β-淀粉样蛋白原纤维与在载玻片上生长的小胶质细胞一起培育后获得了最令人激动的数据。如果β-淀粉样蛋白确实活化了小胶质细胞，所述噬菌体将其溶解并且不活化小胶质细胞。噬菌体技术提供对于β-淀粉样蛋白的抗聚集剂来说一个新的和实际上无限的资源，其防止通过Fc受体而可能过度活化小胶质细胞的抗体的有害影响。

噬菌体作为基因和/或递送载体具有超出动物病毒的明显优点。它们是简单的系统，其大规模生产和纯化是非常高效的并且比动物病毒载体更加便宜。此外，大片段DNA能够有效地包装于噬菌粒载体。由于是针对原核生物的感染、装配和复制进化而来，噬菌体既不能在哺乳动物细胞中复制也不对哺乳动物细胞显示天然向性。这使非特异性基因递送的可能性最小化。因为噬菌体载体更低可能在动物细胞中产生有复制能力的实体，所以噬菌体载体潜在地比病毒更加安全(Monaci et al.，2001)。

本发明提供用于抑制或者治疗与淀粉样蛋白沉积有关的或者涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症的方法。此外，本发明方法还抑制或者治疗与除脑之外的体内其他部位中淀粉样蛋白沉积有关的炎症，比如在多发性骨髓瘤和肾淀粉样变性的情况。

本发明方法涉及向有此需求的患者引入/施用有效量的野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体。所述丝状噬菌体可以是任何丝状噬菌体比如M13、f1或者fd。尽管在以下的实施例中采用M13噬菌体，由于它们具有相似的结构以及由于其基因组有超过95％的基因组一致性，因此预期任何其他丝状噬菌体以相似方式运作和发挥功能。

当所述方法被用来抑制或者治疗脑部炎症时，优选鼻内施用所述丝状噬菌体从而通过受者的嗅觉系统向受者体内引入所述活性成分。

本发明方法不但在斑块形成疾病中抑制蛋白质聚集成淀粉样蛋白斑块或者沉积物，而且在解聚预先形成的淀粉样蛋白沉积比如βA原纤维中也是有效的。

所述丝状噬菌体对于βA原纤维形成或者解聚的抗聚集或者解聚特性可以通过众所周知的硫黄素T(ThT)结合分析进行测量。ThT荧光性的显著降低指示βA原纤维结构形成中断和预先形成的βA原纤维解聚。

对于本说明书和所附权利要求来说，术语“患者”、“对象”和“受者”可互相交换使用。它们包括作为预防性、试验性或者治疗性处理对象的人和其他哺乳动物。

对于本说明书和所附权利要求来说，术语“β淀粉样蛋白肽”与“β-淀粉样肽”、“βAP”、“βA”和“Aβ”意思相同。所有这些术语表示源于淀粉样蛋白前体蛋白的斑块形成肽。

本文中所用的“PrP蛋白”、“PrP”、“朊病毒(prion)”表示在适宜条件下能够诱导导致斑块形成疾病的聚集体形成的多肽。例如，正常的细胞朊病毒蛋白质(PrPC)在这样的条件下转化成相应的搔痒症异形体(PrPSc)，其导致斑块形成疾病比如，但不限于，牛海绵状脑病(BSE)、或者疯牛病、猫的海绵状脑病、库鲁病、克-雅氏病(CJD)、格-施-沙病(GSS)和致死性家族性失眠症(FFI)。

本文中所用的术语“解聚”表示通常靠非共价键结合在一起的聚集蛋白质的溶解。

术语“治疗”的意思表示实质性抑制、减缓或者逆转疾病的发展、实质性改善疾病的临床症状或者实质性预防疾病临床症状的出现。

也在本文中应用的术语“斑块形成疾病”涉及特征在于在疾病比如但不限于早发性阿尔茨海默病、迟发性阿尔茨海默病、先兆性阿尔茨海默病、SAA淀粉样变性、遗传性冰岛综合征、衰老、多发性骨髓瘤中中由于聚集蛋白质(斑块形成肽)比如但不限于β-淀粉样蛋白、血清淀粉样蛋白A、胱抑蛋白C(cystatin C)、IgGκ轻链或朊病毒蛋白质形成斑块的疾病，以及已知侵染人的朊病毒病比如例如，库鲁病、克-雅氏病(CJD)、格-施-沙病(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)，和侵染动物的朊病毒病，比如，例如，搔痒病和牛海绵状脑病(BSE)

因为与本文上述疾病有关的大部分淀粉样蛋白斑块(也被称为淀粉样蛋白沉积)位于脑内，任何建议的治疗形式必须证明有跨越血脑屏障(BBB)的能力以及溶解淀粉样蛋白斑块的能力。正常地，能穿透BBB的分子大小为2kDa左右。

越来越多的证据表明在AD临床过程早期就影响嗅觉缺陷和中枢嗅觉通路的退行性变化。此外，AD相关的解剖学模式表明嗅觉通路可能是AD发展中的初始阶段。

嗅觉受体神经元是双极性细胞，其居于鼻腔的上皮衬层。它们的轴突横越筛状板并且投射到脑嗅球中嗅觉通路的第一突触。此构造使得它们成为一个干道，病毒或者其它转运物质通过此干道可以跨BBB进入CNS。

如先前所表明的，鼻内施用(Mathison et al，1998；Chou et al，1997；Draghia et al，1995)能够使得病毒和大分子直接进入脑脊液(CSF)或者CNS。

在文献中已报道过利用嗅觉受体神经元作为递送点用于将腺病毒载体递送至脑。该方法据报道引起报告基因在脑中表达12天，并且没有明显的毒性(Draghia et al，1995)。

因此，根据本发明的一个优选实施方案，通过此途径将能够解聚或者防止与斑块形成疾病有关的多肽聚集体形成或者能够抑制小胶质细胞活化的丝状噬菌体递送至脑。

因为在外周组织中由细胞持续产生Aβ，其跨过血脑屏障(BBB)在特定神经元类群中导致局限性毒性作用，所以该载体的鼻内施用还可以通过最小化可用于形成斑块的外周Aβ的量来防止所述疾病的发展。

根据本发明的药物制剂包括野生型丝状噬菌体或者在其表面不展示抗体或者非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体作为活性成分。该药物制剂也可以是不同丝状噬菌体的混合物。

根据本发明的制剂可以以自身或者在混合有合适载体或者赋形剂的药物组合物中施用于有机体。

本文所用的“药物组合物”表示一种或多种本文所述的活性成分与其他化学成分比如生理适合的载体和赋形剂的一种制剂。药物组合物的目的在于辅助化合物向有机体的施用。

本文中的术语“活性成分”表示可发挥生物学作用的制剂。

在下文中，可互换使用的短语“生理可接受的载体”和“药物可接受的载体”表示载体或者稀释剂，其不引起对有机体的明显刺激以及不消除所施用化合物的生物学活性和特性。这些短语的意思包括辅剂。

本文中的术语“赋形剂”表示加到药物组合物中的惰性物质，以进一步促进活性成分的施用。赋形剂的非限定性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

配制和施用药物的技术可见“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA的最新版本，其通过参考并入本文中。

合适的施用途径可以，例如，包括口服、直肠、透粘膜尤其是透鼻、经肠或者胃肠外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或者眼内注射。

作为替代，可以以局部而非全身性方式施用制剂，例如，通过将制剂直接注射入患者的脑。

本发明的药物组合物可以用本领域众所周知的方法进行配制，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、糖衣化、研磨、乳化、胶囊化、包埋(entrapping)或者冻干方法。

因此，根据本发明应用的药物组合物可以以常规方式应用一种或多种生理可接受的载体进行配制，所述生理可接受的载体包括赋形剂和辅助剂，其促进将所述活性成分加工成可药用制剂。适当的制剂取决于所选的施用途径。

对于注射，本发明的活性成分可配制于水溶液中，优选在生理相容的缓冲液比如Hank’s溶液、Ringer’s溶液、或者生理盐水缓冲液中。对于透粘膜施用，在所述制剂中使用对于待透过屏障合适的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中是公知的。

对于口服施用，可以很容易地通过将活性化合物与本领域众所周知的药物可接受载体组合来配制所述化合物。这样的载体能够使本发明化合物配制为片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆、膏剂(slurry)、混悬剂等，用于患者的口服摄入。用于口服应用的药物制剂可以用固体赋形剂进行配制，任选地研磨所得混合物，并且如果期望的话可以在加入合适的辅助剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或者糖衣剂核心。具体来说，合适的赋形剂是填充剂比如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或者山梨醇；纤维素制备物比如，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理可接受的聚合物比如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望的话，可以添加崩解剂，比如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或者海藻酸或其盐比如海藻酸钠。

向糖衣剂核心提供合适的包衣。为此目的，可应用浓缩的糖溶液，其可任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯基吡咯烷酮、卡泊普凝胶(carbopolgel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或者糖衣剂包衣添加染料或者颜料，以识别或者表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服施用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊以及由明胶和增塑剂比如甘油或山梨醇制成的软、密封胶囊。推入配合式胶囊可包含与填充剂比如乳糖、粘合剂比如淀粉、润滑剂比如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳定剂相混合的活性成分。在软胶囊中，所述活性成分可以溶解于或者悬浮于合适的液体中，比如脂肪油、液体石蜡、或者液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂应当是对于所选施用途径合适的剂量。

对于含服施用，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或者锭剂形式。

对于鼻吸入施用，根据本发明应用的活性成分以气雾剂喷雾形式从加压包装或者利用合适抛射剂例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或者二氧化碳的喷雾器中方便地递送。对于加压气雾剂的情形，可以通过所提供的递送计算量的阀来确定剂量单位。可以配制用于分配器的例如明胶的胶囊和药筒，其包含所述化合物与合适的粉末基础成分比如乳糖或者淀粉的粉末混合物。

可以配制本文所述的制剂用于胃肠外施用，例如，通过快速推注或者持续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如，在安瓿中或者在多剂量容器中，并任选地含有外加防腐剂。所述组合物可以是溶于油性或水性载体中的混悬剂、溶液或者乳剂，并且可以包含剂型配制剂(formulatory agent)比如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

用于胃肠外施用的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水溶液。另外，所述活性成分的混悬剂可以制备成适当的油或者水基注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或者载体包括脂肪油比如芝麻油、或者合成脂肪酸酯比如油酸乙酯、甘油三酯或者脂质体。水性注射混悬剂可以包含增加混悬剂粘度的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或者葡聚糖。任选地，所述混悬剂还可以包含合适的稳定剂或者增加所述活性成分溶解性的试剂，以允许制备高浓缩溶液。

作为替代，所述活性成分可以在粉末形式中，用于在使用之前与合适的载体例如无菌无热源水基溶液进行配制。

本发明的制剂还可以利用例如常规栓剂基础成分比如可可脂或者其它甘油酯配制成直肠用组合物比如栓剂或者保留灌肠剂。

适于在本发明背景下使用的药物组合物包括这些组合物，其中含有可实现预期目的的有效量的所述活性成分。更具体地，治疗有效量表示可有效预防、缓解或者改善疾病症状或者延长治疗对象存活的活性成分的量。

确定治疗有效量在本领域技术人员的能力之内，尤其是依照本文所提供的详细公开内容。

对于在本发明方法中应用的任何制剂而言，治疗有效量或剂量可以从体外和细胞培养分析中进行初步估计。例如，可以在动物模型中确定剂量以实现期望的循环抗体浓度或者效价。这样的信息可被用来更准确地确定用于人的剂量。

本文中所述活性成分的毒性和疗效可以通过标准药学方法在体外、在细胞培养或者实验动物中来确定。从这些体外和细胞培养分析和动物研究中获得的数据可被用来确定人用的剂量范围。所述剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径而变化。可以由医师个人考虑患者的状况来选择确切的制剂、施用途径和剂量。(见，例如，Fingl et al，in“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.1(1975))。

可以个别地调整剂量和间隔从而提供足以防止聚集或者使已有聚集体解聚的所述丝状噬菌体的血浆或脑水平(最小有效浓度，MEC)。MEC将对于每种制剂而变化，但是可从体外数据进行估计。实现MEC所必须的剂量将依赖于个体特性和施用途径。可采用结合分析确定血浆浓度。

还可以使用MEC值确定给药间隔。应该使用一定的给药方案来施用制剂，以在10-90％、优选在30-90％和最优选50-90％的时间中维持血浆水平高于所述MEC。

取决于待治疗病况的严重程度和反应性，给药可以是单次或者多次施用，治疗时程持续几天至几周或者直至实现治愈或者达到疾病状态减轻。

当然，待施用组合物的量将取决于治疗对象、疾病严重程度、施用方式、主治医师的判断等。

如果希望的话，本发明的组合物可以在包装或者分配装置中提供，比如FDA批准的试剂盒，其可以包含一种或多种含所述活性成分的单位剂量形式。所述包装可以包括，例如，金属或者塑料薄片，比如泡罩包装。所述包装或者分配装置可附带施用说明书。所述包装或者分配器还可随所述容器提供由监管药物制造、使用或销售的政府部门规定形式的公告，该公告反映了所述组合物用于人用或者兽用的形式得到政府部门的批准。该公告，例如，可以是美国食品和药品监督管理局对有关处方药物的批准标签或者是所批准的产品插页。还可以制备包含有在药物相容载体中配制的本发明制剂的组合物，其置于适当的容器中，以及标记其治疗适应症，正如以上所详细描述的。

现已一般性描述了本发明，通过参考以下的实施例将更加易于理解本发明，这些实施例是例证性的，并无限制本发明的意图。

实施例

材料和方法

噬菌体的生长和纯化

从在含50μg/ml卡那霉素的2YT液体培养基中的转化TG1培养物中制备丝状噬菌体(M13)。通过离心沉淀细菌细胞，并移出澄清的上清液。通过加入20％初始体积的溶于2.5M NaCl的20％聚乙二醇(分子量8000Da)并且在4℃下保持3小时来从该上清液中沉淀噬菌体。通过离心(9000rpm，1小时)沉淀噬菌体，然后重悬在3％上清液体积的PBS中。通过7000rpm进一步离心去除细菌残余物，并且通过另外的聚乙二醇沉淀再次浓缩噬菌体。沉淀物最后重悬于在0.001倍生长培养基初始体积中的PBS中。(Hart et al，1994)。

噬菌体干扰β-淀粉样蛋白聚集：

通过以下三种方法分析噬菌体阻止βA聚集和解聚已形成聚合物的能力：

1.硫黄素-T荧光分析：

采用硫黄素-T(ThT)染料测量βA聚集，硫黄素-T(ThT)染料一旦与淀粉样蛋白原纤维结合就改变其发射光谱(LeVine，1993)。为评估噬菌体阻止聚集体形成的能力，8μl的βA1-40 577μM(Bachem)或者单独(用PBS稀释至80μl，终浓度为58μM)或者与丝状噬菌体(72μl的3×10¹²个噬菌体/ml)一起在37℃培育14天。在加入溶于pH9 50mM甘氨酸缓冲液的980μl ThT(2μM)(Sigma)之后，测量每个反应混合物(20μl)的荧光。应用Perkin-Elmer model LS-50分光荧光计在激发波长435nm处和发射波长485nm处测量荧光。

如下所述检测噬菌体的解聚活性：在37℃下培育βA(58μM)21天以促进聚集。添加噬菌体(等体积的浓度为10¹⁴个噬菌体/ml溶液的噬菌体)并与聚集的βA一起再培育17小时。如上所述利用ThT荧光估计聚集程度。

2.电子显微镜(EM)：

β-淀粉样蛋白和丝状噬菌体的相互作用.使用EM观察βA的聚集水平。为了防止βA形成，10μl所述肽(289μM)或者单独(添加20μl的PBS)或者与不同浓度的噬菌体(来自以下浓度的20μl噬菌体：1×10¹⁴个噬菌体/ml、1×10¹²个噬菌体/ml、和1×10¹⁰个噬菌体/ml)一起在37℃下培育9天。

通过向预聚集的βA添加不同浓度的噬菌体来证明所述噬菌体的解聚活性。溶解于PBS的20μl的β-淀粉样蛋白1-40(193μM)在37℃下培育10天。在第10天时，10μl的PBS或者不同浓度的噬菌体(1×10¹⁴个噬菌体/ml、1×10¹²个噬菌体/ml)被加到样品中并且再培育16小时。

在阻止和解聚分析中，噬菌体和βA被附着于碳蒸发的包被formvar的200#网上(carbon evaporated coated formvar 200#grids)。用不同大小的金标记抗体(Lin et al.，1999)对所述淀粉样蛋白和噬菌体进行免疫标记以容易地区分β-淀粉样蛋白原纤维和可类似于淀粉样蛋白纤维的噬菌体。β-淀粉样蛋白原纤维用单克隆抗体(mAb)10D5、和偶联至12nm金颗粒的山羊抗小鼠第二抗体(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)进行染色。为标记所述噬菌体，采用抗噬菌体的兔多克隆血清，并将第二抗体偶联至6nm金颗粒(Electron Microscopy Sciences)。用水性(2％重量/体积)乙酸双氧铀(Sigma)对样品进行负染色。使用JEOL 1200 EX电子显微镜在30K和100K放大倍数下观察所述网。

β-淀粉样蛋白和氯仿处理后噬菌体的相互作用.向200μl氯仿添加200μl噬菌体(10¹⁴个噬菌体/ml)。在室温下3分钟内对该溶液涡旋振荡6次(每次10秒钟)(Griffith et al，1981)。管子在13,200rpm被离心1分钟；将水相转移到另一管子，并置于通风橱中以蒸发氯仿残余物。通过电子显微镜分析β-淀粉样蛋白和球形噬菌体之间的相互作用。

β-淀粉样蛋白(97μM)在37℃下培育13天。在第13天时，PBS或者不同浓度的S-噬菌体(氯仿处理过的)(5×10¹³个噬菌体/ml，5×10¹¹个噬菌体/ml)被添加到样品中并进一步培育16小时。如前所述通过JEOL1200 EX电子显微镜观察β-淀粉样蛋白的聚集程度。

3.MTT分析

实施MTT分析来评估噬菌体保护人神经元细胞系存活力免于βA毒性的作用。该分析是基于在活细胞中将3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)还原为MTT-甲

(formazan)。通过分光光度计在570nm处测量MTT-甲的浓度，并且其直接与细胞存活力相关。

在添加10％胎牛血清和100单位/ml青霉素/链霉素的RPMI中培养LAN-1人神经元细胞系，并且在5％CO₂和37℃条件下进行培育。对于神经毒性分析，将培养LAN-1细胞以10⁴个细胞/100μl/孔的密度接种于96孔板。采用或者单独或者与不同浓度噬菌体一起的β-淀粉样蛋白(289μM)的样品来测量剂量依赖性神经毒性。

2μl所述肽与8μl不同浓度噬菌体(5×10¹³/ml，5×10¹²/ml，5×10¹¹/ml噬菌体)在37℃下培育4天，以检验噬菌体抗βA神经毒性的预防性作用。在将细胞接种于并附着于所述板之后24小时添加样品。该板在37℃下培育2天，其后如前所述通过用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)测量细胞的氧化还原活性来评估细胞存活力(Solomon et al，1997)。以1mg/ml的终浓度将MTT(Sigma)加到孔中并与细胞一起在37℃下进一步培育3小时。添加细胞裂解缓冲液(20％(重量/体积)SDS溶于50％二甲基甲酰胺溶液，pH7.4)，并且将该板在37℃下培育过夜。通过采用自动微板分光光度计测量在570nm处OD的变化来比色确定MTT还原。

在对已形成的βA原纤维的解聚分析中，应用两种肽(β-淀粉样蛋白17-42和β-淀粉样蛋白1-40)作为神经毒性因子。依照以下所述检测噬菌体保护细胞存活力免于聚集肽影响的能力。在第一试验中，细胞与预聚集的βA1-40一起培育5天，而在第二试验中，使用β-淀粉样蛋白17-42作为神经毒性肽。如前所述，在加入样品之前，将细胞以10⁴个细胞/100μl/孔的密度接种于96孔板并让其附着24小时。向2μl聚集肽(288μM-储备溶液)添加8μl噬菌体(10¹⁴个噬菌体/ml，10¹³个噬菌体/ml，10¹²个噬菌体/ml)并培育过夜。将样品添加到细胞中，并进一步培育2天。添加终浓度为1mg/ml的MTT，3小时后加入裂解缓冲液，以测量MTT-甲

含量。通过定量在570nm处的O.D.变化来评估细胞存活率。

丝状噬菌体的体内应用

用丝状噬菌体攻击野生型以及转基因小鼠的AD模型：

抗聚集特性的评价.为了评估作为抗聚集剂的噬菌体活性的最大潜能，依下述将噬菌体颅内注射给转基因小鼠(Taconic，APPSWE(2576)，10个月大)：

在10分钟内向一侧半球注射(前囟-2.8mm，侧向2.5mm，腹侧2.5mm)2.5μl所述丝状噬菌体溶液(10¹⁴个噬菌体/ml)，而对于对侧，施用磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为对照(图1)。因为对于噬菌体解聚淀粉样蛋白沉积的时间段是未知的，所以在不同的时间点处死处理后小鼠。第一组，在注射后1小时心内输注4％低聚甲醛，第二组，两天后施用，最后一组，3天后。它们的脑在4％低聚甲醛中后固定过夜，并用切片机对其进行切片。用硫黄素-S染色来评估斑块负荷。为此目的，用Mayer’s苏木精对切片进行染色以淬灭核自发荧光，并且在清洗后，施加ThS溶液(1％)3分钟。用1％乙酸实施分化20分钟，并且在清洗后，干燥载玻片并用抗褪色封固剂包埋。采用LEICA Qwin程序计算斑块负荷。

成射性标记丝状噬菌体的生物学分布.用I¹²⁵对丝状噬菌体进行放射性标记。从未结合碘的噬菌体中应用G25 sephadex柱纯化所述噬菌体并且如前所述使用聚乙二醇(PEG)进一步沉淀洗脱液。将9只BALB/c小鼠分成3组。在一小时内，每只小鼠鼻内接受100μl的噬菌体(1.25×10¹²个噬菌体)，其标记有9微居里的I¹²⁵。在心脏内灌注施用4％低聚甲醛后1小时处死第一组的小鼠。在处理后3小时处死第二组小鼠，在24小时后处死最后一组小鼠。灌注后，取脑以及外周器官并测量它们的γ辐射。

鼻内施用丝状噬菌体。为全面评估丝状噬菌体的作用，对SWE/APP2576转基因小鼠(Taconic，10个月大)鼻内施用噬菌体。每2周施用20μl噬菌体溶液(5×10¹²/ml)，持续4个月并对其认知功能进行评估。在第九次免疫之后，实施目标识别测验以研究噬菌体对记忆改善的影响。在第一天，将小鼠暴露于两个新目标20分钟。此后一天，一个目标被替换，并测试小鼠探究该新目标的好奇心。将小鼠花费在新目标附近的时间除以小鼠花费在两个物体附近的总时间，计算每只小鼠的识别指数。因此，超过0.5的值指示其认知旧目标并且花费更多时间在新物体周围来探究。

结果

从减少和预防淀粉样蛋白形成的方面评估丝状噬菌体的体外抗聚集特性。在硫黄素-T分析中，噬菌体在解聚βA原纤维方面比预防它们形成方面更加有效。当肽与丝状噬菌体以1∶10,000摩尔比(噬菌体比βA)一起培育时，观测到βA聚集下降26％(图2B)。向预聚集的βA添加噬菌体(28nM)导致淀粉样蛋白原纤维减少45％(图2A)。

应用免疫金染色的β-淀粉样蛋白及其与噬菌体的复合物来实施电子显微镜对噬菌体与β-淀粉样蛋白肽之间物理相互作用的观察。当噬菌体与β-淀粉样蛋白肽相互作用时，与不存在噬菌体时相比，聚集物更小并且更加分散。令人感兴趣地是，噬菌体与β-淀粉样蛋白肽一起培育导致噬菌体降解，这可以从大量的抗噬菌体主要衣壳蛋白的标记抗体不在噬菌体颗粒上而得知(图3C)。当噬菌体与β-淀粉样蛋白肽一起培育过夜(在解聚分析中)时或者当噬菌体单独培育同样时间时(图3D)，没有观测到此现象。图3(F-K)显示噬菌体对已形成淀粉样蛋白聚集物的作用。图3F表明淀粉样蛋白原纤维在由12nm金颗粒标记的聚簇中。更高放大倍数(图3G)显示不同大小的聚集原纤维针。图3H-K呈现组织成束的噬菌体(箭头)，其在附着于淀粉样蛋白针(箭)时被分散。淀粉样蛋白簇是小的并且包含窄小的淀粉样蛋白原纤维。尤其感兴趣的是噬菌体相对于淀粉样蛋白原纤维(空心箭)的平行组织结构。

已表明pVIII分子存在有三种构象。在完整的噬菌体中，该蛋白质至少90％是α-螺旋，但是当暴露于氯仿/水界面时其在形状上就发生很大变化。这是一种温度依赖性的过程。在2℃形成棒形(I-形)，而在25℃形成球形结构(S-形)。向S-形的转变伴随有衣壳蛋白螺旋含量的实质减少，但是在色氨酸26环境中有明显变化(Roberts and Dunker，1993)。

用氯仿处理噬菌体3分钟表明尽管球形噬菌体存在于βA聚集物的部位，但是它们通常定位于原纤维的末端并且无助于溶解(图4A-B)。MTT：

采用MTT分析证明了丝状噬菌体保护LAN-1细胞免于βA神经毒性的作用。当噬菌体与βA一起培育时，与在单独存在βA条件下生长的细胞相比，神经元存活力增加。加到细胞培养物中的最大量噬菌体引起最显著的效果(细胞存活率增加17％)(图5A)。

噬菌体避免β-淀粉样蛋白17-42毒性的保护作用要高于其预防β-淀粉样蛋白1-40毒性的作用。当把噬菌体加入预聚集的βA17-42时，与单独和βA一起生长的细胞相比，细胞存活率增加30％(图5B)。向βA1-40加入同样浓度的噬菌体导致细胞存活率只有17％的增加(图5C)。与βA处理过的细胞相比，加入更高浓度的噬菌体使细胞存活率成功增加到25％。

对造成此差异的可能原因可归因于可以干扰噬菌体活性的β-淀粉样蛋白的N-末端，或者是由于β-淀粉样蛋白17-42比β-淀粉样蛋白1-40聚集更快的事实(Pike et al.，1995)。噬菌体对β-淀粉样蛋白1-40的亲和性随着肽聚集而增加。ELISA检测噬菌体结合可溶性β-淀粉样蛋白、1小时聚集的β-淀粉样蛋白或者3周聚集的肽，其表明在噬菌体结合βA1-40方面有明显不同。因此，噬菌体对高度聚集肽的较高亲和性可解释其与β-淀粉样蛋白17-42的较强相互作用。

在通过脑内注射丝状噬菌体解聚β-淀粉样蛋白斑块的体内研究中，在注射后1小时处死的小鼠中没有检测到斑块负荷的减少。在处理后2天处死的小鼠中，与注射PBS的半球相比，在用丝状噬菌体处理过的半球中注意到斑块负荷有25％降低。处理后3天处死的小鼠显示在注射噬菌体的半球中斑块负荷有40％降低(图6A和6B)。

放射性标记的丝状噬菌体在脑中的分布：

鼻内施用之后，在施用后早在1小时就在嗅球中和在脑中检测到丝状噬菌体(图7)。尽管所述的组太小(n＝3)而不能总结噬菌体清除速率，但看上去噬菌体浓度在1小时后达到峰值，接着在24小时内几乎完全被消除。在小鼠之间的高度变化性可能是吞咽和吸入不同量噬菌体的结果。渗透入脑实质的剂量在给定剂量的0.0009％至0.018％范围内变化。值得提及的是0.1％的抗体血清浓度成功地到达脑并且降低了斑块负荷。这些初步的数据表明在正常的BALB/C小鼠中噬菌体可以在短时间内渗透入脑并在一小时后开始清除。因此，鼻内施用丝状噬菌体可以检验其在治疗携带淀粉样蛋白沉积的转基因小鼠中的功效。

向转基因小鼠重复鼻内施用丝状噬菌体：

与未用噬菌体处理过的组相比，在噬菌体处理过的小鼠中注意到在认知功能方面有明显改善(数据未显示)。在研究结束时，将实施组织化学分析以评估小鼠的斑块负荷、小胶质细胞活化、突触密度和可能的副作用以便获得对治疗功效的全面评估。

过论

本发明人的实验室在早前已报道针对βA N-末端区的位点定向单克隆抗体(mAb)结合预先形成的βA原纤维，并且导致淀粉样蛋白解聚成无定形状态以及抑制它们的神经毒性作用(Solomon et al.，1996，1997)。在AD转基因小鼠中也体内证明了该活性(Bard et al.，2000)。应用展示抗βA之scFv的噬菌体来鼻内递送抗聚集抗体片段至脑斑块(Frenkel et al.，2002)。所述噬菌体被用作载体，其可实现scFv渗透入脑以及其与转基因小鼠中淀粉样蛋白沉积的结合。

在施用次数与在海马和嗅球中所检测到的噬菌体量之间显示出直接相关性。所述噬菌体的线性结构显示出赋予经由各种膜的渗透特性。值得提及的是，在噬菌体施用后，在那些小鼠的脑中没有观察到病理征兆(Frenkel et al.，2002)。

通过ThT和荧光标记抗噬菌体抗体可以显示βA原纤维并且在组织学研究中表明丝状噬菌体从脑中消失且不引起毒性作用。在先前报道的试验中，丝状噬菌体经静脉注射入小鼠并且随后从不同器官中被找到，这表明它们在体内循环中其完整性没有受到影响。

认为淀粉样蛋白的纤维化是由疏水性而不是静电相互作用所驱动的。βA包含两个疏水性片段，其中心部分是由残基17-21和包含残基30-40的C-末端区所组成的。基于来自固态NMR的实验性约束条件根据所述模型，该肽的构象包含两个β-链，其由残基25-29形成的180°弯曲所分开。所述β-链形成两个互相对准平行的β-片层，其通过侧链-侧链接触相互作用。疏水性侧链被暴露于外表面并且形成疏水面，而另外的带电和极性侧链分布于相对面、所述弯曲的凸起侧和N-末端片段中，在此它们可以随着原纤维生长而被溶剂化(Petkova et al，2002)。

另一方面，主要噬菌体衣壳蛋白由三部分组成：外表面，被所述亚基的N-末端区域所占据，富含与周围溶剂相互作用并赋予毒粒低等电点的酸性残基；壳内部，包含19残基长的非极性侧链，在此蛋白质亚基主要是彼此之间发生相互作用；和内表面，由所述亚基的C-末端区域所占据，富含与DNA核心相互作用的碱性残基。实际上几乎所有蛋白质侧链的相互作用是发生在衣壳蛋白阵列内的不同亚基之间而不是在亚基内的事实使得这对于研究在大分子装配中α-螺旋亚基之间的相互作用来说是一种可用的模式系统。

在本研究中，证明了噬菌体除了具有报道过的作为用于递送抗βA抗体至脑的载体的功能之外，还拥有抗聚集特性。从在实施例中所呈现的数据来看，丝状噬菌体与β-淀粉样蛋白相互作用并且能够干扰其聚集过程，甚至诱导其溶解。解聚特性具有重要的价值，因为目前是在β-淀粉样蛋白斑块已形成的疾病晚期才进行诊断。这个过程是时间依赖性的，因为将噬菌体颅内注射给携带有淀粉样蛋白斑块的Tg(转基因)小鼠之后，仅在3天之后即观察到最大作用。该作用可能是噬菌体的细长纤维的独特结构的结果，该结构使得它沿着淀粉样蛋白原纤维来组织，正如可在电子显微镜的纤维照片中所见的。这个推测可以通过以下事实来证明：丧失其线性结构的球状噬菌体不能抑制淀粉样蛋白形成的事实来证明。可能是主要促成噬菌体活性的另一因素是其高含量的α-螺旋(蛋白质8)，这可以干扰β片层结构。pVIII亚基装进螺旋阵列从而形成围绕ssDNA基因组的管状结构。pVIII的C-末端暴露于该管状结构的内部并且含有带正电荷的残基，这些正电荷残基与带负电荷的ssDNA基因组相互作用。中间部分富含疏水性氨基酸，其负责亚基之间的相互作用。最后，柔性、带负电荷的N-末端部分暴露于颗粒外部(Marvin，1998)。

丝状噬菌体具有超过其它载体的明显优点。在结构和遗传水平上，对丝状噬菌体M13、f1和fd都有充分了解(Wilson and Finley 1998；Rodiand Makowski，1999)。它们经过遗传改造来展示抗原和/活抗体并且被用于不同的生物学系统来在它们的表面呈现外源蛋白质(Scott et al.1990；McCafferty et al 1990)。由于已针对原核生物的感染、装配和复制进化而来，噬菌体既不能在哺乳动物细胞中复制，也不表现出对于哺乳动物细胞的天然向性。这使得发生非特异性基因递送的可能性最小化。噬菌体载体潜在地比其他病毒更加安全，因为它们更少可能在动物细胞中产生具有复制能力的实体。

应用噬菌体作为解聚剂的另一优点是它的易生产性，因为通过细菌培养物的生长可以很容易地获得较多的材料。根据放射性标记分析，噬菌体在不到一小时后就侵入脑实质。稍后它们可能就开始消除。侵入的噬菌体占所施用剂量的百分率从0.0009％至0.018％变化。应当进行更多的研究以尽可能降低小鼠之间的可变性。尽可能降低剂量、并在每次点滴之间等待更长时间会有帮助。相比较而言，抗体血清浓度的0.1％达到脑。尽管噬菌体的分子量高于抗体两个数量级，但是鼻内施用可以导致噬菌体的侵入。

通过对本发明已进行的全面描述，本领域的技术人员应当理解，在很宽范围的等效参数、浓度和条件内可以实施本发明，而不脱离本发明的精神和范围并且不需要过度的实验。

尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但是应当理解它能够作进一步的改进。本申请的范围涵盖本发明的任何变型、应用或者适应性修改，通常它们遵从本发明的原理，并且包括偏离本发明的公开内容，但是这些偏离来自本发明所属领域内的公知内容或者常规实践，以及这些偏离可应用于以下列出的所附权利要求范围中的前述必要技术特征。

所有在本文中引用的参考文献，包括杂志文章或者摘要、公布的或者相应的美国或者外国专利申请、已颁布的美国或者外国专利、或者任何其他参考文献，通过参考全部并入本文中，包括存在于所引用参考文献中的所有数据、表、图和文本。此外，在本文所引用参考文献中所引用的参考文献的全部内容也通过参考全部并入本文。

对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或者常规方法的参考无论如何不是承认本发明的任何方面、说明或者实施方案被公开于、教导于或者建议于相关领域中。

具体实施方案的前述说明充分地披露了本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用本领域内的知识(包括本文所引用参考文献的内容)很容易地改进和/或改变具体实施方案的各种应用，而不需要过度的实验、并且没有脱离本发明的一般性概念。因此，基于本文所提供的教导和指导，这些改变和改进意在涵盖于本文所公开实施方案的等同的意思和范围内。应当理解，本文的措辞或者术语是用于说明的目的，并无限制的意思，因此本领域技术人员应当根据本文中所提供的教导或者指导并结合本领域普通技术人员的知识来解释本说明书中的术语或者措辞。

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Claims (23)

1.用于抑制或者治疗与淀粉样蛋白沉积有关的炎症以及与淀粉样蛋白沉积有关的或者涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体，以抑制或者治疗与淀粉样蛋白沉积有关的炎症以及与淀粉样蛋白沉积有关的或者涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症。

2.权利要求1的方法，其中所述丝状噬菌体选自M13、f1和fd噬菌体、及其混合物。

3.权利要求1的方法，其中所述丝状噬菌体是M13。

4.权利要求1的方法，其中通过鼻内施用有效量的所述丝状噬菌体来抑制或者治疗脑部炎症。

5.权利要求1的方法，其中所述的与淀粉样蛋白沉积有关的或者涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症是斑块形成疾病。

6.权利要求5的方法，其中所述斑块形成疾病是阿尔茨海默病。

7.权利要求5的方法，其中所述斑块形成疾病是朊病毒病。

8.权利要求1的方法，其中所述的与淀粉样蛋白沉积有关的炎症是多发性骨髓瘤。

9.权利要求1的方法，其中所述的与淀粉样蛋白沉积有关的炎症是肾淀粉样变性。

10.一种药物组合物，其包含药物可接受的载体或者赋形剂、以及或者野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体作为活性成分。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述丝状噬菌体选自M13、f1、fd、及其混合物。

12.用于抑制淀粉样蛋白沉积形成的方法，其包括使丝状噬菌体与斑块形成肽接触以抑制淀粉样蛋白沉积的形成，其中所述丝状噬菌体是野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或者非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体。

13.权利要求12的方法，其中所述的丝状噬菌体选自M13、f1和fd噬菌体、及其混合物。

14.用于解聚预先形成的淀粉样蛋白沉积的方法，其包括使丝状噬菌体与预先形成的淀粉样蛋白沉积相接触以解聚预先形成的淀粉样蛋白沉积，其中所述丝状噬菌体是野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或者非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体。

15.权利要求14的方法，其中所述的丝状噬菌体选自M13、f1和fd噬菌体、及其混合物。

16.野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体在制备用于抑制或者治疗与淀粉样蛋白沉积有关的炎症以及与淀粉样蛋白沉积有关的或者涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症的药物中的用途。

17.根据权利要求16的用途，其中与淀粉样蛋白沉积有关的或者涉及已活化小胶质细胞的脑部炎症是选自阿尔茨海默病和朊病毒病的斑块形成疾病。

18.根据权利要求16的用途，其中所述的与淀粉样蛋白沉积有关的炎症选自多发性骨髓瘤和肾淀粉样变性。

19.根据权利要求16的用途，其中所述的丝状噬菌体选自M13、f1和fd噬菌体、及其任意混合物。

20.野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体在制备用于抑制淀粉样蛋白沉积之形成的药物中的用途。

21.根据权利要求20的用途，其中所述的丝状噬菌体选自M13、f1和fd噬菌体、及其任意混合物。

22.野生型丝状噬菌体或者在其表面上不展示抗体或非丝状噬菌体抗原的丝状噬菌体在制备用于解聚预先形成的淀粉样蛋白沉积的药物中的用途。

23.根据权利要求22的用途，其中所述的丝状噬菌体选自M13、f1和fd噬菌体、及其任意混合物。

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