CN104870008A - 噬菌体的p3融合蛋白作为淀粉样蛋白结合剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于减少淀粉样蛋白形成和/或用于促进淀粉样蛋白的去凝集的试剂和药物组合物。所述组合物还可用于检测淀粉样蛋白。

Description

噬菌体的P3融合蛋白作为淀粉样蛋白结合剂的用途

本发明涉及包含丝状噬菌体g3p蛋白的淀粉样蛋白结合片段或此类淀粉样蛋白结合片段的突变体或变体形式的融合蛋白。本发明包括编码此类融合蛋白的核酸分子与构建体、以此类核酸分子转化的细胞以及以重组方式制备此类融合蛋白的方法。此外，本发明涉及包含本文所公开的融合蛋白的药物组合物，以及此类组合物治疗性地和预防性地用于减少与疾病相关联的淀粉样蛋白负荷的用途，所述疾病例如全身性与周边性淀粉样蛋白疾病、神经退化性疾病包括神经退化性τ病变(tauopathy)和传染性海绵状脑炎变(朊病毒相关的疾病)。本发明还包括使用此类组合物来预防这些疾病相关联的淀粉样蛋白累积，以及使用此类组合物作为诊断剂来检测淀粉样蛋白，从而诊断此类疾病。

丝状噬菌体M13和相关丝状噬菌体已在蛋白质错误折叠疾病的动物模型中显示效用，且因此可代表蛋白质错误折叠疾病的潜在治疗剂类型。参见美国专利公开US 2011/0142803，其以引用方式整体并入本文。具体来说，已发现丝状噬菌体具有介导清除大脑中已形成的淀粉样蛋白的能力。参见例如WO2006083795与WO2010060073，所述申请以引用方式整体并入本文。

M13噬菌体为Ff噬菌体家族成员之一，其具有406个氨基酸的成熟型g3p。GenBank Ref Seq NP_510891.1提供了参考序列，其包含18个残基的氨基端信号序列。相较于公开的序列具有氨基酸差异的变体很常见。I家族的丝状噬菌体的g3p异于Ff家族成员，但即便如此，g3p在各家族之间仍为高度保守。Stassen等,J Mol Evol(1992)34:141-52。

已获得g3p的晶体结构。Lubkowski等,Structure(1998)7(6)711-722。所述蛋白质包含3个折叠结构域，被柔性富含甘氨酸的接头序列分隔开。存在两个氨基端结构域N1与N2，其含有262个氨基酸并相互作用以形成N1-N2复合物。羧基端(CT，也称为N3)结构域含有146个氨基酸且其通过与g8p进行疏水性相互作用使g3p锚泊于噬菌体颗粒中的g3p。Marvin,Current Opin.in Structural Biology(1998)8:150-158。使用Holliger,J Mol.Biol.(1999)288(4):649-57中N1-N2结构域融合蛋白2g3p制得的公开可用的带状结构显示于图1中。

不同于多数蛋白质，未折叠的N1与N2结构域的潜伏性“闭锁”形式为g3p产生其天然生物活性所必需。Eckert和Schmid,J.Mol.Biol.(2007)373:452-461。在感染的初期步骤中，N2经由其外缘的残基结合于细菌F纤毛。Deng和Perham,2002。此种N2的初期结合经由“打开”N1-N2复合物而“开启”g3p，使N1随后结合于共同受体TolA。在g3p的N1-N2片段中，初步开启步骤的热转变使N2于48.1℃的熔融温度(T_M)下发生未折叠。此过程的一部分涉及Gln212-Pro213肽键的异构化作用。Pro213在开启状态下转化为反式。N1仍维持稳定折叠直到第二个步骤，其发生于T_M值60.2℃。综述于Eckert和Schmid,2007中。

N1-N2片段的突变已被用于研究多种突变体的稳定性与感染力。Eckert和Schmid,2007。一种被命名为“3A”的变体会破坏纤毛结合并降低N2结构域的稳定性。在此突变中，T_M值降至42.6℃。3A携带下列突变：W181A、F190A以及F194A。N2中另一突变体G153D会使N2不稳定，使T_M值降至44.4℃。突变体Q129H会稳定N2，使T_M值升至51.4℃。IY变体于铰链区含有突变T101I与D209Y并增加N1-N2片段的稳定性(T_M＝56.5℃)。IHY含有突变T101I、Q129H和D209Y(T_M＝60.1℃)。IIHY含有突变T13I、T101I、Q129H和D209Y(T_M＝61.8℃)。突变Q129Y与T13I两者皆具有稳定性，而加入这些突变会进一步增加熔融温度(T_M)。噬菌体感染力的变化与g3p内结构域相互作用的强度成反比。Eckert和Schmid,2007。删除N2结构域(噬菌体fd(ΔN2))因解除N2结构域对N1与TolA之间结合的阻断效应而增加感染力。请参照同上。

近来，g3p还介导丝状噬菌体与淀粉样蛋白的结合，其作用方式类似于噬菌体感染细菌的过程。WO 2013/082114公开了噬菌体g3p可直接结合于淀粉样蛋白纤维，而所述噬菌体介导的去凝集取决于此初始结合步骤。认识到g3p负责丝状噬菌体介导的淀粉样蛋白的结合，这为新类型的治疗剂与诊断剂提供了基础。本发明提供此类治疗与诊断组合物，以及使用其检测、诊断、治疗、预防或延迟淀粉样蛋白凝集相关联的疾病与病症的发生。

本发明的其它目的和优点是部分于下面的说明中列出，且自说明显而易见，或可通过本发明的实践而习得。本发明的目的和优点将借助在所附权利要求书中特别指出的要素和组合来实现和达到。应理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。

附图简述

图1显示g3p的N1与N2结构域和铰链区的带状结构。

图2A-2C显示不同来源的g3p的比对。图2A为噬菌体M13(SEQ ID NO:1)、fd(SEQ ID NO:2)和f1(SEQ ID NO:3)的g3p的比对，包括共同序列(SEQID NO:4)在内。图2B显示噬菌体I2-2(SEQ ID NO:5)和Ike(SEQ ID NO:6)的g3p的比对，以及I2-2与Ike之间的共同序列(SEQ ID NO:7)。图2C显示噬菌体If的g3p氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。

图3A和3B显示噬菌体结合作用的表面等离子共振(SPR)研究。利用10¹⁴个噬菌体/mL流经生物传感器芯片来进行结合于Aβ原纤维与结合于Aβ单体的比较。图3B显示从图3A中所示的SPR数据计算出的K_a、K_d和K_D。

图4A和4B显示结合作用的研究。图4A显示随着fAβ42摩尔量的增加，两个噬菌体剂量(10¹¹个/mL和10¹²个/mL)的直接结合测定。图4B是结合竞争研究，并提供了测定M13结合的K_D值的备选方式。其使用构建体1。

图5显示在淀粉样蛋白纤维结合竞争测定中使用热变性(方形；于90℃下10分钟)与天然构象(圆形)的M13(构建体1)的结合竞争作用的结果。

图6显示使用在存在或不存在2个浓度的M13噬菌体(构建体1)时孵育的fAβ42的硫代黄素T(ThT)荧光测定。

图7A和7B显示于ThT去凝集测定中改变个别测定参数的影响。图7A显示于两个盐浓度(0.15M与1.5M)存在下的去凝集百分比。图7B显示于两个温度(4℃与37℃)下fAβ的剩余百分比。其使用构建体1。

图8A和8B显示使用fAβ42的M13淀粉样蛋白结合测定。在图8A中，使用18℃至58℃的孵育温度达3小时以报告M13结合作用。图8B显示在37℃与50℃下孵育的结合动力学。

图9A-9C显示以蛋白水解方式移除g3p对噬菌体-淀粉样蛋白相互作用的影响。利用蛋白酶Arg C自M13噬菌体剪去g3p(M13Δg3p)。图9A显示使用M13Δg3p噬菌体相较于天然(其处理方式与经Arg C处理的噬菌体相同，但未进行蛋白酶处理)噬菌体的Aβ结合竞争研究的结果。图9B显示相较于天然噬菌体，Arg C处理对于M13Δg3p噬菌体感染力的影响。图9C在去凝集测定中比较Arg C处理的噬菌体与天然噬菌体。

图10A和10B显示使用g3p的N1-N2片段(此处称为重组可溶性N1N2(rs-g3p(N1N2)；“构建体3”))、M13Δg3p(经Arg C处理)和M13作为经标记的M13的竞争剂结合至fAβ42的结合竞争测定结果。图10B显示竞争测定的重复结果。

图11显示噬菌体fd、IIHY、AAA和M13的竞争作用数据。噬菌体fd、AAA和IIHY在50℃下经预活化1.5小时，随后在37℃下孵育45分钟期间比较了经活化与未经活化的Fd、AAA与IIHY竞争经标记的M13结合Aβ的能力。

图12A显示rs-g3p(N1N2)(构建体3)的示意图。图12B显示rs-g3p(N1N2)的离子交换谱图。图12C显示使用Sephacryl S-300和rs-g3p(N1N2)的凝胶过滤测定的结果。图12D显示rs-g3p(N1N2)以及g3p和g8p对照的蛋白质印迹。使M13噬菌体在泳道1和2中运行作为阳性对照，并以多克隆抗-M13抗体检测，其可检测g8p和g3p。经纯化的rs-g3p在泳道3和4中运行，并以相同的多克隆抗-M13抗体检测。

图13显示使用rs-g3p(N1N2)(构建体3)的SPR数据。rs-g3p(N1N2)可有效结合fAβ42，K_D为约160nM，但不与单体结合。

图14显示用于测量指定样本中存在的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。在存在或不存在5种浓度的rs-g3p(N1N2)(构建体3)时，将10μM Aβ42单体在37℃下孵育3天。，通过将结合后的ThT荧光量化来测量在3天结束时所形成的纤维量。IC₅₀为约20nM，这表明rs-g3p(N1N2)可有效抑制Aβ42纤维的形成。本图还表明，结合作用具有剂量依赖性。重复的实验显示，IC₅₀介于20nM与100nM之间。

图15A显示在存在或不存在rs-g3p(N1N2)(构建体3)时孵育fAβ42的透射电子显微照相(TEM)结果。图15B显示使用于37℃下孵育7天的Aβ42和2μM rs-g3p(N1N2)(构建体3)的ThT荧光测定结果。rs-g3p(N1N2)阻断fAβ42的形成。

图16证实rs-g3p(N1N2)(构建体3)可有效抑制α-突触核蛋白纤维的形成。通过在37℃下以300rpm搅拌4天以使25μM的α-突触核蛋白聚集(参见，条柱1)。图上的条柱2代表于37℃下振荡3天的α-突触核蛋白单体加上1x 10^-13的五聚M13噬菌体。条柱2中所示的结果表明，五聚M13可阻断α-突触核蛋白纤维聚集。图上的条柱3代表α-突触核蛋白单体+83nMrsg3p单体。条柱3中所示的结果表明，在抑制α-突触核蛋白纤维形成方面，单体的功效较五聚M13差。条柱4为阴性对照，其显示时间点为零时的α-突触核蛋白单体。在条柱5中，为显示不含α-突触核蛋白纤维的g3p单体以确定g3p是否结合pTAA并阻断染料结合至纤维。条柱5中所示的结果表明g3p不与pTAA结合。

图17显示rs-g3p(N1N2)(构建体3)、M13(构建体2)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(构建体4)和IgG4-Fc阴性对照的竞争结合作用数据。

图18显示M13(构建体2；方形)、rs-g3p(N1N2)(构建体3；三角形)、rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(构建体4；倒三角形)和重组IgG4-Fc阴性对照(菱形)的竞争结合作用的数据比较。

图19显示可比较五种浓度的Aβ42纤维的滤膜截留测定，所述Aβ42纤维是加上或不加上两种浓度的M13(构建体2)、800nM rs-g3p(N1N2)(构建体3)以及三种浓度的rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc融合蛋白(构建体4)。

图20显示rs-g3p(N1N2)(构建体3；“单体”)和经链霉亲和素缀合的rs-g3p(N1N2)(“SA[g3pN1N2]_n＝2-4”；“SA-g3p”；“四聚体”)的竞争结合作用数据。比较了rs-g3p(N1N2)与SA-g3p在37℃下孵育3小时期间竞争经标记的M13结合至Aβ的能力。

图21显示可比较五种浓度的fAβ42的滤膜截留测定，所述fAβ42是加上或不加上两种浓度的rs-g3p(N1N2)(构建体3；“单体”)和两种浓度的SA-g3p(“四聚体”)。

图22A和22B显示fAβ42在时间点为零时(图22A)和与SA-g3p一起孵育三天后(图22B)的TEM。

图23显示rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc构建体“构建体4”的氨基酸序列(SEQID NO:9)。“构建体4”的N1N2区域是源自“构建体1”的N1N2区域(SEQ IDNO:10)。

图24显示另一rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc构建体“构建体5”的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。“构建体5”的N1N2区域是源自“构建体2”的N1N2区域(SEQ ID NO:12)。

图25显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc构建体“构建体6”的氨基酸序列(SEQID NO:13)。“构建体6”的N1N2区域是源自“构建体2”的N1N2区域。

图26显示下列中N2的氨基酸序列比对：fd(SEQ ID NO:14)、f1(SEQ IDNO:15)、M13(SEQ ID NO:16)、Ike(SEQ ID NO:17)、I2-2(SEQ ID NO:18)和If1(SEQ ID NO:19)。星号“*”指示具有单一、完全保守性残基的位置。冒号“:”指示强相似性的组间保守性，其于Gonnet PAM 250矩阵中评分高于0.5。句点“.”指示弱相似性质的组间保守性，其于Gonnet PAM 250矩阵中评分等于或低于0.5。

图27A显示构建体3的示意图。图27B显示构建体3的g3p部分的DNA序列(SEQ ID NO:23)。图27C显示构建体3的g3p部分的氨基酸序列(SEQ IDNO:24)。

图28显示在阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型中测试两种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白减少β-淀粉样蛋白的能力的实验结果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)均能显著减少阿尔茨海默氏病小鼠海马回中β-淀粉样蛋白的量。

图29显示在阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型中测试两种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白减少β-淀粉样蛋白的能力的实验结果。rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)两者均能显著减少阿尔茨海默氏病小鼠大脑皮质中β-淀粉样蛋白的量。

图30A和30B显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)对Aβ42聚集的抑制作用。图30A显示在没有SDS的情况下制备的“天然”琼脂凝胶。使样本在不含SDS的TEA缓冲液运行且不煮沸。结果表明构建体6能抑制fAβ42聚集。图30B显示用于测量给定样本中存在的淀粉样蛋白的ThT荧光测定。在存在或不存在2种浓度的rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)时将10μM的Aβ42单体在37℃下孵育1天。通过将结合后的ThT荧光量化来测量在1天结束时所形成的纤维量。rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)可有效抑制Aβ42纤维的形成。本图还表明，构建体6对纤维形成的抑制作用具有剂量依赖性。

图31A、31B、31C和31D显示代表性圆二色性数据，其显示rs-g3p(N1N2)(构建体3)抑制Aβ42聚集。圆二色性能衡量待评估Aβ纤维的α-螺旋与β-折叠含量。图31A显示T＝0、T＝24小时与T＝48小时的Aβ42相对于波长的椭圆率。图31B显示T＝0、T＝24小时与T＝48小时的Aβ42加上构建体3相对于波长的椭圆率。图31C显示代表性ThT测定，其中通过将结合后的ThT荧光量化来测量在24与48小时之间形成的纤维量。构建体3可有效抑制Aβ42纤维的形成。图31D显示T＝0、T＝24小时与T＝48小时的构建体3相对于波长的椭圆率。总之，这些数据验证了构建体3抑制Aβ42聚集的能力。

图32显示了代表性数据，所述数据显示M13(构建体2)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)可于N2a细胞中阻断寡聚物诱发的毒性。参见例如Stine等,(2003)J.Biol.Chem.278(13):11612-11622和Stine等,(2011)Erik D.Roberson(编)Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia,Methods in Molecular Biology,第670卷:13-32。在处理之前，N2a细胞以血清饥饿48小时以产生分化。在加至N2a细胞之前，Aβ42寡聚物(2uM)于37℃下用构建体2与构建体6进行预孵育3小时。时间点为零(“TO”)的复合物未进行预孵育。在孵育24小时之后，监测腺苷酸激酶(“AK”)的释放。AK释放至培养基表明细胞死亡/裂解。Aβ42寡聚物如Stine等,2011中所述制备。结果表明，M13和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc为有毒寡聚物的有效抑制剂。

图33显示可比较六种浓度的Aβ42纤维的滤膜截留测定，所述Aβ42纤维是加上或不加上1x 10¹²个/ml M13(构建体2)；80nM和800nM的rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc构建体(构建体5)；以及80nM和800nM的rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)。将Aβ42纤维与构建体2、5与6一起在37℃下孵育3天，接着进行滤膜留滞测定。利用mAb 6E10(1:15000)探测滤膜，以识别滤膜上截留的Aβ42纤维。800nM的构建体5或构建体6就分子摩尔浓度来说计等于5x 10¹⁴个/ml的构建体2。结果表明，构建体2、5和6可有效去凝集β-淀粉样蛋白纤维。

图34A和34B显示用于测定与fτ一起预孵育3小时后结合至fAβ42的M13(构建体2)的量的代表性测定。将5μM的结合至构建体2的Aβ42单体在存在或不存在4种浓度的fτ时孵育3小时。由于fAβ:M13-Alexa488可沉淀而fτ:M13-Alexa488无法沉淀，测量经沉淀物质的荧光损失，其表明fτ可竞争fAβ的结合作用。于此处，通过将沉淀后结合竞争反应的Alexa488荧光量化来测定在3小时结束时所形成M13-fAβ的量。结果表明，fτ能够与M13-Alexa488(构建体2)竞争fAβ42的结合。

图35显示了测试rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体4)结合至fτ的能力的代表性SPR测定的结果。结果表明，构建体4可有效结合fτ。

图36A和36B显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)的fτ去凝集能力。将40uM的τ微管结合重复区域(“MTBR”)稀释于50mM超氧化物歧化酶(“Sod”)中以制备τ纤维。于37℃下将各浓度的构建体6与制得的fτ在pH7.0的乙酸盐缓冲液中孵育72小时。记录5倍过量的ThT存在时的ThT荧光值。图36A显示ThT测定的代表性结果，其显示构建体6的fτ去凝集能力。图36B显示另一代表性实验，其验证了构建体6的fτ去凝集能力。图36A和36B还显示构建体6的fτ去凝集作用具有剂量依赖性。

图37A、37B、37C和37D显示代表性实验，其显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)和rs-g3p(N1N2)(构建体3)随时间变化的Aβ凝集抑制作用。将Aβ42溶于DMSO并稀释于含有NaN3的PBS中。在37℃下，使Aβ42在加上或不加上各种浓度的构建体3和构建体6时凝集。利用ThT荧光测量Aβ42的凝集作用。图37A显示样本的SDS PAGE。图37B显示一个代表性实验的结果。图37C显示另一代表性实验的结果。图37D汇总了结果。

图38A和图38B显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)阻断PrP向PrP-Sc转化的能力的实验结果。对构建体6和IgG细胞裂解液进行超速离心以分离可溶性(上清液)与不溶性(沉淀)的PrP物种。以抗-PrP单克隆抗体(6D11)进行PrP物种的生化观察。在IgG存在下，在可溶性和不溶性等分试样中均分配有PrP。在构建体6存在下，不溶性PrP有限。数据代表n＝4。

图39A和图39B显示在朊病毒病的细胞孵育模型中，rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)减少PrP^Sc累积与凝集的能力的实验结果。图39A显示经构建体6与IgG处理后，以生化方法解析的未经消化与经PK消化的N2a22L^{S c}细胞裂解液。在经浓度渐增的构建体6处理的细胞中，清楚观察到PrP^Sc的量显著减少。以～0.08μg/ml的构建体6处理时可实现PrP^Sc的量约50％减少。以10μg/ml的构建体6处理时，PrP^Sc的量减至5.725％，p<0.0001。以1μg/ml的鼠科动物IgG处理N2A22L^Sc细胞时，未观察到PrP^Sc的量有明显变化。对于图39B，X射线底片随后经数字化，并以经IgG处理的相同代N2a22L^{S c}细胞的功效(其被视为100％)进行初步标准化。随后，相对于相同方式进行印迹分析的未消化裂解液，分析经PK消化的印迹图的密度测量数据，并以PrP^Sc/PrPc变化百分比表示。数据代表n＝4。

图40显示在阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型中以rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)与rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)处理后，测试两种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白对海马回中突触素量的影响的实验的结果。两种构建体均显著增加阿尔茨海默氏病小鼠海马回中突触素的量。

图41是在阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型中以rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)与rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)处理后，测试两种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白对海马回中Iba-1量的影响的实验的结果。两种构建体均显著增加阿尔茨海默氏病小鼠海马回中Iba-1的量。

图42是在阿尔茨海默氏病转基因小鼠模型中以rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)与rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)处理后，测试两种rs-g3p(N1N2)-IgG融合蛋白对海马回中GFAP量的影响的实验的结果。两种构建体均未明显改变阿尔茨海默氏病小鼠海马回中GFAP的量。

图43显示rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)与rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)的结合实验结果的比较。所述构建体可有效结合至fAβ并具有类似的K_D(～11)。

图44A和44B显示rs-g3p(N1N2)(构建体3)阻断τ聚集的能力。在图44A中，将1μMτ单独孵育或与1μM构建体3共同孵育，并于5天后利用TEM进行分析。构建体3阻断τ聚集。图44B显示使用于存在或不存在3种浓度的rs-g3p(N1N2)(构建体3)时孵育的fτ的ThT荧光测定结果。构建体3对τ聚集的抑制作用具有剂量依赖性。

图45显示用以分析fAβ42与rs-g3p(N1N2)(构建体3)之间的相互作用的实验的示意图。

图46显示用以分析fAβ42与rs-g3p(N1N2)(构建体3)之间的相互作用的NMR研究的结果。H代表氢且D代表氘。Aβ纤维的氢随时间被交换为氘且速率受构建体3与纤维的结合作用影响。结果表明，构建体3与fAβ42之间的分子迭代(molecular iteration)位于fAβ42残基17至22与33至40。

图47A、47B、47C和47D显示孵育744小时后，构建体3去凝集预先形成的fAβ42的代表性TEM。图47显示单独的fAβ42。图47B显示fAβ42加上构建体3。图47C显示相较于图47A放大倍数增大的单独的fAβ42。图47D显示相较于图47B放大倍数增大的fAβ42加上构建体3。

图48显示代表性SPR测定的结果，其显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)可有效结合fτ。

图49A显示代表性ThT测定的结果，其显示构建体6的fτ去凝集能力。图49B显示图49A的实验的图示。图49A和49B还显示构建体6的fτ去凝集具有剂量依赖性。

图50A显示rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG4-Fc(构建体8)结合至Aβ原纤维的SPR研究。结果显示，构建体8牢固地结合Aβ原纤维(K_D～36nM)。G3p的N1N2片段(未连接至Fc结构域)显示较弱的结合作用(K_D～36nM)。图50B显示结合竞争测定的结果，其显示rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG1-Fc(构建体8)结合至fAβ1-42的能力。G3p的N1N2片段(未连接至Fc结构域)显示较弱的结合作用。

图51显示If1g3p(SEQ ID NO:29)与fd g3p(SEQ ID NO:30)之间的氨基酸比较。在If1与fd之间，g3p N1结构域的相同氨基酸以阴影表示。N1结构域以加框表示。

图52A和52B显示在阿尔茨海默氏病小鼠体内模型中的实验结果，其显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)在直接注入大脑后显著减少Aβ沉积和τ纤维的能力。在图52A中，相较于对照，接受构建体6的小鼠Aβ的量显著减少。在图52B中，相较于对照，接受构建体6的小鼠τ的量显著减少。

图53A和53B显示以全身给予而非直接注入大脑时，显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)治疗AD的能力的实验结果。图53A和53B显示，相较于对照小鼠，接受构建体6的AD小鼠过动症减轻。

图54显示以全身给予而非直接注入大脑时，显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)治疗AD的能力的实验结果。在图54中，相较于对照，接受构建体6的AD小鼠绕圈行为减少。

图55显示以全身给予而非直接注入大脑时，显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)治疗AD的能力的实验结果。在图55中，相较于对照，接受构建体6的AD小鼠角落跳跃行为减少。

图56显示以全身给予而非直接注入大脑时，显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)治疗AD的能力的实验结果。在图56中，相对于接受对照PBS的小鼠，接受构建体6的AD小鼠在Y型迷宫中的臂进入次数(arm entry)有明显更多的自发性交替。

序列的简单说明

实施方案描述

本发明提供融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段或其突变体或变体。在特定实施方案中，本发明的融合蛋白进一步包含免疫球蛋白的Fc片段恒定区。在这些实施方案的一个方面，所述融合蛋白为可溶性。在这些实施方案的另一个方面，所述融合蛋白通过(例如)去凝集和/或预防或抑制淀粉样蛋白的凝集(例如，淀粉样蛋白斑块)来减少淀粉样蛋白。本发明的融合蛋白结合至淀粉样蛋白。在一些实施方案中，本发明的融合蛋白移除和/或抑制有毒寡聚物的形成。

本发明提供本发明融合蛋白的药物组合物以及其结合与减少淀粉样蛋白的用途。减少淀粉样蛋白包括(例如)去凝集淀粉样蛋白、预防和/或抑制淀粉样蛋白的凝集，以及移除和/或预防有毒寡聚物的形成。本发明还包括使用所述组合物检测淀粉样蛋白沉积物以及诊断具有淀粉样蛋白特征的疾病与病状。

定义

术语“g3p”单独或以术语如“g3p衍生的”使用时，是指任何的野生型或重组型丝状噬菌体g3p蛋白质(包括g3p的片段、变体和突变体)。所述术语不应理解为局限于衍生自任何特定丝状噬菌体的g3p。举例来说，术语“g3p”包括SEQ ID NO:1和图2所示的相关蛋白质。

术语“结构域”是指多肽(包括蛋白质)中具有某种独特物理特征或作用的区域，举例来说，包括由一段多肽链组成的独立折叠结构。结构域可含有具所述独特物理特性的多肽序列，或其可含有能保持其结合特性(即，其可结合至第二结构域)的具所述物理特征的片段。一结构域可与另一结构域缔合。换句话说，第一结构域可自然地结合至第二结构域。举例来说，g3p N2结构域结合F纤毛且g3p N1结构域结合TolA。

如本文所使用，术语“淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白原纤维”和“淀粉样蛋白纤维”为一种三级结构的通用术语，所述三级结构由任何数种不同蛋白质凝集而成，并由垂直于纤维轴堆栈的依序排列的β片层组成。Sunde等,J.Mol.Biol.(1997)273:729-39。一种例示性淀粉样蛋白为于阿尔茨海默氏病中形成的淀粉样蛋白-β凝集物，其由β-淀粉样蛋白肽“βA”组成，所述βA为切割自人类淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的39至43个氨基酸的内部片段。其具有短型例如Aβ40，和长型例如Aβ42，其为更具原纤维性的Aβ同种型。其它例示性淀粉样蛋白包括折叠错误的α-突触核蛋白(与帕金森氏病相关)、亨廷顿蛋白(与亨廷顿氏病相关联)、τ(与阿尔茨海默氏病相关)，以及朊病毒蛋白的异常构象PrP^Sc。其它实例是贯穿本说明书提供且为本领域技术人员已知(参见例如Aguzzi(2010)以及Eichner和Radford,Mol.Cell(2011)43:8-18)。因此，除非已指明蛋白质或肽，否则术语“淀粉样蛋白”、“淀粉样蛋白原纤维”或“淀粉样蛋白纤维”的使用不应理解为局限于任何特定蛋白质或疾病。

术语“g3p的淀粉样蛋白结合片段”是指可维持结合至淀粉样蛋白的能力的g3p的片段。术语“g3p的淀粉样蛋白结合片段”还指可维持淀粉样蛋白结合能力的g3p的突变体和变体，包括g3p的N端、C端、或N与C端的截断形式。

术语“贝他淀粉样蛋白肽”与“β-淀粉样蛋白肽”、“βAP”、“βA”与“Aβ”同义。这些术语全部是指源自人类淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)的淀粉样蛋白形成肽。

被描述为“去凝集”或“介导去凝集”的本发明的融合蛋白或包含这些融合蛋白的组合物可减少已形成的凝集物。通过滤膜截留测定(filter trap assay)测定去凝集。Wanker等,Methods Enzymol(1999)309:375-86。滤膜截留测定在本文中有所描述，并可用于检测凝集物和监测本发明组合物介导的去凝集。依照滤膜上淀粉样蛋白滞留量的减少检测去凝集，其显示为在存在浓度渐增的去凝集试剂时染色减少。

如本文所使用，“减少淀粉样蛋白”或“降低淀粉样蛋白负荷”的融合蛋白或组合物执行下列一者或多者：抑制淀粉样蛋白形成、导致淀粉样蛋白去凝集、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白凝集、抑制和/或预防有毒淀粉样蛋白寡聚物的形成，和/或促进有毒淀粉样蛋白寡聚物的清除。

被描述为“保护神经元免于淀粉样蛋白损害”的本发明任何产物或组合物皆可预防新淀粉样蛋白的累积和/或预防有毒淀粉样蛋白寡聚物的形成。被描述为“保护神经元免于淀粉样蛋白损害”的本发明产物或组合物可预防性使用。产物或组合物是否保护神经元免于淀粉样蛋白的损害可由本文所述的神经元细胞毒性测定来测量。

如本文所使用，“PrP蛋白”、“PrP”与“朊病毒”是指能于适当条件下诱发导致蛋白质错误折叠疾病的凝集物形成的多肽。举例来说，正常细胞的朊病毒(PrP^c)可于此类条件下转变成相对应的羊搔痒症同种型(PrP^Sc)，其造成的疾病例如但不限于牛海绵状脑炎(BSE)，或疯牛病、猫海绵状脑炎、库鲁病(kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease；CJD)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease；GSS)以及致死性家族性失眠症(FFI)。

在本文中与融合蛋白或融合蛋白的g3p部分的淀粉样蛋白结合片段结合使用的术语“变体”是指相较于参考物质，其相对应的氨基酸序列含有至少一个氨基酸的差异(取代、插入或删除)。在某些实施方案中，相较于参考序列，“变体”具有高度氨基酸序列同源性和/或保守性氨基酸取代、删除和/或插入。在一些实施方案中，相较于参考序列，变体具有不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸的差异。“保守性取代”是指以第二个氨基酸取代第一个氨基酸而不会实质上改变蛋白质、多肽或氨基酸序列(例如g3p蛋白或g3p的淀粉样蛋白结合片段)的化学、物理和/或功能特性(例如，g3p蛋白或淀粉样蛋白结合片段保持相同的电荷、结构、极性、疏水性/亲水性，和/或保持诸如识别、结合和/或减少淀粉样蛋白的能力等功能)。此种保守性氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代基的相对类似性，举例来说，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑多个前述特征的例示性保守性取代为本领域技术人员熟知且包括：精氨酸与赖氨酸；谷氨酸与天冬氨酸；丝氨酸与苏氨酸；谷氨酰胺与天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸。术语“g3p的变体”或“g3p的淀粉样蛋白结合片段的变体”还包括具有与野生型g3p或其相对应片段至少70％、至少75％、至少78％、至少80％、至少82％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的多肽。

术语“突变体”是指使一个或多个氨基酸发生突变以调节其治疗或诊断效果的融合蛋白或融合蛋白的g3p的淀粉样蛋白结合片段。在某些实施方案中，突变体含有已知与淀粉样蛋白相互作用的氨基酸取代、删除和/或插入。在其它实施方案中，突变体含有针对野生型g3p或其淀粉样蛋白结合片段中存在的保守性氨基酸的氨基的取代、删除和/或插入。在一些实施方案中，相较于参考序列，突变体具有不超过75、50、40、30、25、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸的差异。在一些实施方案中，氨基酸取代为保守性取代。术语“变体”与“突变体”在本文中可互换使用，不同之处在于“变体”通常在本质上为非重组的，而“突变体”通常为重组的。术语“g3p突变体”或“g3p的淀粉样蛋白结合片段突变体”还包括具有与野生型g3p或其相对应片段至少70％、至少75％、至少78％、至少80％、至少82％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的多肽。

“融合蛋白”为含有至少两种多肽结构域的非天然存在的蛋白质。本发明的融合蛋白包含与第二种蛋白质或多肽连接、融合或缀合的g3p的淀粉样蛋白结合片段。在特定实施方案中，所述融合蛋白包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段。

术语“活性化合物”、“活性试剂”与“活性成分”在本文中可互换使用，其是指提供融合蛋白生物活性的融合蛋白部分。本发明融合蛋白的g3p部分为“活性化合物”、“活性试剂”或“活性成分”。同样地，本发明融合蛋白的g3p部分为生物活性或治疗有效部分。本发明融合蛋白的g3p部分并非用于促进融合伙伴的蛋白质折叠，所述融合伙伴随后作为与g3p无关的治疗剂，如WO 2004/018685所描述。本发明的融合蛋白也不用于噬菌体展示，如US2009/105090所描述。

本文所用的术语“免疫原性”是指组合物引发已暴露于所述组合物的哺乳动物的免疫反应的能力。

如本文所使用，“构建体1”是源自野生型M13(参见，Genbank档案：NC_003287.2，版本GI:56718463。在构建体1中，相较于野生型M13，Ser378(AGC)变为Gly(GGC)，且Ile87(ATT)变为Asn(AAC))。因此，在野生型M13中，“G”位于核酸编号2710，而在构建体1中，所述位置为“A”。同样地，在野生型M13中，“A”位于核酸编号4479，而在构建体1中，所述位置为“T”。最后，在野生型M13中，“C”位于核酸编号4480，而在构建体1中，所述位置为“T”。构建体1包含SEQ ID NO:10的核酸。

“构建体2”为野生型M13分离物(GenBank JX412914.1)。构建体2含有SEQ ID NO:12的核酸。

“构建体3”为重组型可溶性g3p片段，其包含g3p的N1与N2结构域(rs-g3p(N1N2))，内含SEQ ID NO:20的氨基酸。

“构建体4”为重组型可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸。“构建体4”的N1N2区域为源自“构建体1”的N1N2区域。“构建体4”的编码核酸序列是陈述于SEQ ID NO:26中。

SEQ ID NO:9所述的前21个氨基酸代表信号序列，其在重组生产期间在氨基酸20与21之间被切割。SEQ ID NO:9的第21个氨基酸为甲硫氨酸，其为人为克隆(由用来将信号序列融合至N1-N2序列的多克隆位点所编码)且有时还于重组期间被切割。SEQ ID NO:9的第22个氨基酸为丙氨酸，其相对应于自M13噬菌体分离的g3p的N端氨基酸。SEQ ID NO:9的第22个氨基酸为丙氨酸，其有时还于重组期间被切割。SEQ ID NO:9的第506个氨基酸为C端赖氨酸，其有时还于真核细胞重组生产期间被切割。含有一种或多种上文鉴定的N端与C端删除的产物皆为本发明的一部分。

因此，在一些实施方案中，被描述为“构建体4”的g3p融合蛋白为“成熟形式的构建体4”，并包含SEQ ID NO:9的氨基酸21至506。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸22至506(“N端Met被截断的成熟形式的构建体4”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ IDNO:9的氨基酸23至506(“N端Met-Ala被截断的成熟形式的构建体4”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸21至505(“C端Lys被截断的成熟形式的构建体4”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸22至505(“N端Met被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体4”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸23至505(“N端Met-Ala被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体4”)。

同样地，还包括本文所述的构建体4的全长、N端、C端和N端与C端截断形式的编码核酸。在一个实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸包含SEQ ID NO:26的核苷酸。在其它实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸为SEQ ID NO:26的一部分，其编码g3p部分、或g3p-Ig部分，不包括编码信号序列的核苷酸(即，不包括编码SEQ ID NO:9的氨基酸1至20、1至22或1至23的核苷酸)。

“构建体5”为重组型可溶性g3p片段IgG4Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸。“构建体5”的N1N2区域为源自“构建体2”的N1N2区域。“构建体5”的编码核酸序列陈述于SEQ ID NO:27中。

SEQ ID NO:11所述之前21个氨基酸代表信号序列，其在重组生产期间在氨基酸20与21之间被切割。SEQ ID NO:11的第21个氨基酸为甲硫氨酸，其为人为克隆(由用于将信号序列融合至N1-N2序列的多克隆位点所编码)且有时还于重组生产期间被切割。SEQ ID NO:11的第22个氨基酸为丙氨酸，其相对应于自M13噬菌体分离的g3p的N端氨基酸。SEQ ID NO:11的第22个氨基酸丙氨酸有时还于重组期间被切割。SEQ ID NO:11的第506个氨基酸为C端赖氨酸，其有时还于重组生产期间被切割。含有一种或多种上文鉴定的N端与C端删除的产物，皆为本发明的一部分。

因此，在一个实施方案中，被描述为“构建体5”的g3p融合蛋白为“成熟形式的构建体5”，并包含SEQ ID NO:11的氨基酸21至506。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸22至506(“N端Met被截断的成熟形式的构建体5”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ IDNO:11的氨基酸23至506(“N端Met-Ala被截断的成熟形式的构建体5”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸21至505(“C端Lys被截断的成熟形式的构建体5”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸22至505(“N端Met被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体5”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:11的氨基酸23至505(“N端Met-Ala被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体5”)。

同样地，还包括本文所述的构建体5的全长、N端、C端和N端与C端截断形式的编码核酸。在一个实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸包含SEQ ID NO:27的核苷酸。在其它实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸为SEQ ID NO:27的一部分，其编码g3p部分、或g3p-Ig部分，且不包括编码信号序列的核苷酸(即，不包括编码SEQ ID NO:11的氨基酸1至20、1至22或1至23的核苷酸)。

“构建体6”为重组型可溶性g3p片段IgG1Fc融合蛋白(rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸。“构建体6”的N1N2区域为源自“构建体2”的N1N2区域。“构建体6”的编码核酸序列陈述于SEQ ID NO:28中。

SEQ ID NO:13所述之前21个氨基酸代表一信号序列，其在重组生产期间在氨基酸20与21之间被切割。SEQ ID NO:13的第21个氨基酸为甲硫氨酸，其为人为克隆(由多克隆位点所编码，用于将信号序列融合至N1-N2序列)且有时还于重组期间被切割。SEQ ID NO:13的第22个氨基酸为丙氨酸，其相对应于自M13噬菌体分离的g3p的N端氨基酸。SEQ ID NO:13的第22个氨基酸丙氨酸有时还于重组生产期间被切割。SEQ ID NO:13的第509个氨基酸为C端赖氨酸，其有时还于重组生产期间被切割。在抗体与相关融合蛋白的重组生产时，C端赖氨酸的移除并不少见(J Lou等,Biotechnol Bioeng2012年9月；109(9):2306-15)。含有一种或多种上文鉴定的N端与C端删除的产物，皆为本发明的一部分。

因此，在一个实施方案中，被描述为“构建体6”的g3p融合蛋白为“成熟形式的构建体6”，并包含SEQ ID NO:13的氨基酸21至509。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸22至509(“N端Met被截断的成熟形式的构建体6”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ IDNO:13的氨基酸23至509(“N端Met-Ala被截断的成熟形式的构建体6”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸21至508(“C端Lys被截断的成熟形式的构建体6”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸22至508(“N端Met被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体6”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸23至508(“N端Met-Ala被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体6”)。

同样地，还包括本文所述的构建体6的全长、N端、C端和N端与C端截断形式的编码核酸。在一个实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸包含SEQ ID NO:28的核苷酸。在其它实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸为SEQ ID NO:28的一部分，其编码g3p部分、或g3p-Ig部分，且不包括编码信号序列的核苷酸(即，不包括编码SEQ ID NO:13的氨基酸1至20、1至22或1至23的核苷酸)。

“构建体8”为重组型可溶性g3p片段IgG1Fc融合蛋白(rs-g3p(If1N1N2)-hIgG1-Fc)，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸。“构建体8”的g3p区域是源自If1。“构建体8”的编码核酸序列陈述于SEQ ID NO:32中。

SEQ ID NO:31将在下文予以叙述且显示构建体8的氨基酸。G3p N1结构域是源自If1，只是某些If1噬菌体的半胱氨酸(C)变为色氨酸(W)，通过下方加醒目颜色/方框指示，而下下文显示，前21个氨基酸对应于IL2分泌序列，其为购自Invivogen的pFUSE Ig-融合体载体的一部分。接下来的氨基酸延伸区域以粗体与下划线标示，其对应于If1的g3p N1结构域。注意，C→W的氨基酸改变被加了醒目颜色/方框。接下来的氨基酸延伸区域，其以下划线标示，为g3p If1的N1与N2结构域之间的接头序列。If1的g3p N2结构域以斜体标示。G3p N2结构域之后为第二个接头序列，其于If1中是连接N2与N3结构域(以斜体与下划线表示)。最后，以粗体、斜体与下划线标示的氨基酸为源自pFUSE载体的IgG1-Fc序列。

SEQ ID NO:31所述之前21个氨基酸代表信号序列，其在重组生产期间在氨基酸20与21之间被切割。SEQ ID NO:31的第21个氨基酸为甲硫氨酸，其为人为克隆(由多克隆位点编码，用于将信号序列融合至N1-N2序列)且有时还于重组期间被切割。SEQ ID NO:31的第22个氨基酸为丙氨酸，其相对应于自M13噬菌体分离的g3p的N端氨基酸。SEQ ID NO:31的第22个氨基酸丙氨酸有时还于重组生产期间被切割。SEQ ID NO:31的第528个氨基酸为C端赖氨酸，其有时还于重组生产期间被切割。在抗体与相关融合蛋白的重组生产时，C端赖氨酸的移除并不少见(J Lou等,Biotechnol Bioeng 2012年9月；109(9):2306-15)。含有一种或多种上文鉴定的N端与C端删除的产物，皆为本发明的一部分。

因此，在一个实施方案中，被描述为“构建体8”的g3p融合蛋白为“成熟形式的构建体8”，并包含SEQ ID NO:31的氨基酸21至528。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:31的氨基酸22至528(“N端Met被截断的成熟形式的构建体8”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ IDNO:31的氨基酸23至528(“N端Met-Ala被截断的成熟形式的构建体8”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:31的氨基酸21至527(“C端Lys被截断的成熟形式的构建体8”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:31的氨基酸22至527(“N端Met被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体8”)。在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至527(“N端Met-Ala被截断、C端Lys被截断的成熟形式的构建体8”)。“构建体8”的编码核酸序列陈述于SEQ ID NO:32中。

还包括本文所述的构建体8的全长、N端、C端和N端与C端截断形式的编码核酸。在一个实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸包含SEQ IDNO:32的核苷酸。在其它实施方案中，g3p融合蛋白的编码核酸为SEQ IDNO:32的一部分，其编码g3p部分或g3p-Ig部分，且不包括编码信号序列的核苷酸(即，不包括编码SEQ ID NO:31的氨基酸1至20、1至22或1至23的核苷酸)。

构建体4、5、6和8以及其突变体和变体均为本发明的例示性g3p融合蛋白。

G3p融合蛋白

本发明的g3p融合蛋白包含g3p的淀粉样蛋白结合片段，其为各融合体的活性试剂、活性成分、活性化合物、生物上活性部分、治疗上有效部分和/或药学上有效部分。含有突变体、变体和g3p片段的融合蛋白皆包括于本发明的中。在一个方面，g3p融合蛋白包含可结合至淀粉样蛋白的g3p片段。在一些实施方案中，本发明的g3p融合蛋白包含g3p N1N2结构域或其突变体、变体或片段，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段是连接、融合、缀合、偶联或缔合于至少一个非g3p蛋白。在特定实施方案中，所述非g3p蛋白为免疫球蛋白的Fc片段。提供所述融合蛋白的g3p部分并非促进其治疗性融合伙伴的蛋白质折叠，如WO 2004/018685所描述；或噬菌体展示，如US2009/105090所描述。

在其它方面，融合蛋白包含可结合至淀粉样蛋白的g3p多肽，并包含g3pN2结构域或其突变体、变体或片段，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段是连接、融合、缀合、偶联或缔合于至少一个非g3p蛋白。在特定实施方案中，所述非g3p蛋白为免疫球蛋白的Fc片段。在另外其它方面，融合蛋白包含可结合至淀粉样蛋白的g3p多肽，并包含g3p N1N2结构域，其中所述g3p N2结构域包含g3p N2的突变体、变体或片段，其可稳定g3p N1结构域或以其它方式使g3p N1结构域成为适合g3p结合的构象。

融合蛋白的g3p部分是连接、融合、缀合、偶联或缔合于/至其正常不会缔合的至少一个额外蛋白质或蛋白质结构域。在某些实施方案中，本发明g3p融合蛋白的非g3p部分包含免疫球蛋白的Fc片段。在一个实施方案中，融合蛋白为g3p融合蛋白，其包含以g3p的淀粉样蛋白结合片段连接至含有免疫球蛋白的Fc片段的第二结构域。在另一实施方案中，融合蛋白包含以g3p蛋白的淀粉样蛋白结合片段连接至免疫球蛋白的Fc片段。如前面所述，本发明的一些融合蛋白包含突变或变异的g3p的淀粉样蛋白结合片段，例如可结合淀粉样蛋白纤维的突变或变异的N1N2或N2结构域。因此，包含此类突变或变异形式的融合蛋白也是本发明的一部分。

G3p的淀粉样蛋白结合片段和融合伙伴多肽可为连续氨基酸序列的一部分，其中所述融合伙伴多肽是直接或经由短肽接头连接至g3p或所述淀粉样蛋白结合片段多肽的N端或C端。在此情况下，所述g3p的淀粉样蛋白结合片段与所述融合伙伴多肽可自编码所述g3p的淀粉样蛋白结合片段与所述融合伙伴多肽的编码序列转译成单一多肽。

A.G3p融合蛋白的g3p部分

G3p具有两个氨基端结构域N1与N2，其互相作用以形成N1-N2复合物，以及一个羧基端结构域N3(还称作“CT”)。铰链区使N1与N2之间打开与关闭。有时所述铰链区被视为N2的一部分，而在其它情况下，其被视为单独元件。N1与N2还可由柔性富甘氨酸接头序列连接。N1有两个双硫键，其位于Cys7与Cys36之间和Cys46与Cys53之间。N2有一个双硫键，其位于Cys188与Cys201之间。羧基端结构域有一个双硫键，其位于Cys354与Cys371之间。Marvin,1998。G3p没有结构域间的双硫键。

G3p的淀粉样蛋白结合片段的实例包括有铰链区或无铰链区的N2结构域；以及有或没有间隔接头序列和有或没有铰链区的N1-N2结构域。在任何前述实施例中，N2或N1N2片段可为野生型丝状噬菌体中存在的N2或N1N2或重组型N2或N1N2。在任何前述的实施例中，N2或N1N2片段可为野生型丝状噬菌体序列的突变体或变体。

N2与fd、f1、M13、Ike、I2-2和If1的一级结构比对如图26所示。Fd的氨基酸显示于SEQ ID NO:14中；f1的氨基酸显示于SEQ ID NO:15中；M13的氨基酸显示于SEQ ID NO:16中；Ike的氨基酸显示于SEQ ID NO:17中；I2-2的氨基酸显示于SEQ ID NO:18中；且If1的氨基酸显示于SEQ IDNO:19中。使用该图和比对作为指导，本发明的一个实施方案包括含有可结合至淀粉样蛋白并包含g3p N2结构域或g3p N2结构域片段的g3p多肽的g3p融合蛋白。在一些方面，所述g3p N2结构域可稳定组合物的g3p的淀粉样蛋白结合部分。包含g3p N2结构域的任何g3p融合蛋白包括g3p N2的突变体、变体和片段。G3p N2的片段为N或C端中任一者或两者经至少一次截断的任何全长g3p N2结构域。G3p N2多肽由SEQ ID NO:14、15、16、17、18或19的氨基酸及其片段、变体和突变体例示。

Fd、f1与M13的一级结构比对如图2A所示，而Ike、I2-2与If1的一级结构比对如图2B所示。使用该比对作为指导，本发明的一个实施方案包括包含结合至淀粉样蛋白的g3p多肽并包含g3p N1N2结构域或所述g3pN1N2结构域片段的融合蛋白。包含g3p N1N2结构域的g3p融合蛋白包括g3p N1N2的突变体、变体和片段。G3p N1N2的片段为N或C端中任一者或两者经至少一次截断的任何全长g3p N1N2。G3p N1N2多肽由SEQ IDNO:1至9、11、13、20、24和29至31的任何的氨基酸及其片段、变体和突变体例示。

B.G3p融合蛋白的非g3p部分

本发明的融合蛋白可包含免疫球蛋白的Fc片段恒定区作为第二结构域。对包含免疫球蛋白恒定区连接至目标蛋白质或其片段的融合蛋白已有描述(参见例如美国专利号5,480,981和5,808,029；Gascoigne等,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2936；Capon等,1989,Nature 337:525；Traunecker等,1989,Nature 339:68；Zettmeissl等,1990,DNA Cell Biol.USA 9:347；Byrn等,1990,Nature 344:667；Watson等,1990,J.Cell.Biol.110:2221；Watson等,1991,Nature 349:164；Aruffo等,1990,Cell 61:1303；Linsley等,1991,J.Exp.Med.173:721；Linsley等,1991,J.Exp.Med.174:561；Stamenkovic等,1991,Cell66:1133；Ashkenazi等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10535；Lesslauer等,1991,Eur.J.Immunol.27:2883；Peppel等,1991,J.Exp.Med.174:1483；Bennett等,1991,J.Biol.Chem.266:23060；Kurschner等,1992,J.Biol.Chem.267:9354；Chalupny等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10360；Ridgway和Gorman,1991,J.Cell.Biol.115，文摘号1448；Zheng等,1995,J.Immun.154:5590)。这些分子通常具有与目标连接分子相关联的生物活性以及效应子功能，或与所述免疫球蛋白恒定区相关联的一些其它合意特性(例如，生物稳定性、细胞分泌作用)。

Fc表达盒可自市面购得。Fc片段由免疫球蛋白的CH2与CH3结构域和免疫球蛋白的铰链区构成。Fc片段可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白恒定区的部分为IgG1的Fc片段。在另一实施方案中，免疫球蛋白恒定区的部分为IgG4的Fc片段。在又一实施方案中，免疫球蛋白恒定区的部分为IgM的Fc片段。

因此，在一个实施方案中，利用标准分子生物技术，将g3p的重组型可溶性淀粉样蛋白结合片段融合至免疫球蛋白的Fc结构域。所述g3p的重组型可溶性淀粉样蛋白结合片段可经突变的或变异。举例来说，可将g3p的淀粉样蛋白结合片段(例如N1N2结构域或N2结构域)克隆至IgGFc融合体表达载体中。例示性IgGFc融合体载体包括(例如)购自InvivoGen的其中一种pFUSE-Fc载体。在一些实施方案中，所产生的双价(例如，g3p(N1N2)-IgGFc或g3p(N2)-IgGFc)融合蛋白因为现为双价而将具有比重组型可溶性g3p高的淀粉样蛋白结合亲合力。

在其它实施方案中，融合蛋白包含至少两种g3p的淀粉样蛋白结合片段。在其它实施方案中，融合蛋白包含三种或三种以上g3p的淀粉样蛋白结合片段。在其它实施方案中，融合蛋白包含五种g3p的淀粉样蛋白结合片段。此类二聚体型与多聚体型的融合蛋白提供更高的亲合力相互作用，因为其包含一种以上g3p的淀粉样蛋白结合片段。

在某些实施方案中，融合蛋白包含白蛋白。参见例如，美国专利号6,686,179。

C.例示性本发明g3p融合蛋白

在一些实施方案中，融合蛋白包含含有g3p的淀粉样蛋白结合片段的第一结构域和含有非g3p蛋白的第二结构域(例如免疫球蛋白的Fc片段)。包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的第一结构域为活性成分并赋予融合蛋白治疗生物活性。在一些方面，融合蛋白的g3p部分包含与本文所述的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的任何的N端、C端或N端与C端截断形式的g3p部分至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在该实施方案的一个方面，融合蛋白的g3p部分包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:31的g3p部分相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，相较于SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31列举的任何的g3p部分，所述g3p部分可为突变体、变体或片段，并能结合至淀粉样蛋白。在另一个方面，所述融合蛋白选自SEQ ID NO:9的氨基酸21至506、SEQ IDNO:9的氨基酸22至506、SEQ ID NO:9的氨基酸23至506、SEQ ID NO:9的氨基酸21至505、SEQ ID NO:9的氨基酸22至505、SEQ ID NO:9的氨基酸23至505、SEQ ID NO:11的氨基酸21至506、SEQ ID NO:11的氨基酸22至506、SEQ ID NO:11的氨基酸23至506、SEQ ID NO:11的氨基酸21至505、SEQ ID NO:11的氨基酸22至505、SEQ ID NO:11的氨基酸23至505、SEQ ID NO:13的氨基酸21至509、SEQ ID NO:13的氨基酸22至509、SEQ ID NO:13的氨基酸23至509、SEQ ID NO:13的氨基酸21至508、SEQID NO:13的氨基酸22至508、SEQ ID NO:13的氨基酸23至508、SEQ IDNO:31的氨基酸21至528、SEQ ID NO:31的氨基酸22至528、SEQ ID NO:31的氨基酸23至528、SEQ ID NO:31的氨基酸21至527、SEQ ID NO:31的氨基酸22至527或SEQ ID NO:31的氨基酸23至527，或为这些融合蛋白中任一者的突变体或变体。

在另一个方面，相较于相对应的任何的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的g3p部分，所述融合蛋白的g3p部分为g3p的突变体，其包含具有1至20个氨基酸取代的氨基酸序列，其中所述融合蛋白于人体内的免疫原性低于其未经修饰的对应物。在这些实施方案的一些方面，相较于相对应的任何的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的g3p部分，所述融合蛋白具有1至10个氨基酸取代。在其它方面，相较于相对应的任何的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:31的g3p部分，所述融合蛋白具有1至5个氨基酸取代。在另外其它方面，所述氨基酸取代位于所述融合蛋白的g3p部分(例如，SEQ ID NO:9的氨基酸21、22、或23至238、SEQ ID NO:11的氨基酸21、22、或23至238、SEQ ID NO:13的氨基酸21、22、或23至238或SEQ IDNO:31的氨基酸21、22、或23至296)。

在其它实施方案中，所述较低免疫原性融合蛋白为SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO:11的氨基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO:13的氨基酸21、22或23至508或509，或SEQ ID NO:31的氨基酸21、22或23至527或528的变体，其中所述变体不同于所提及氨基酸序列之处仅为分别在SEQ ID NO:9的氨基酸22或23至238、SEQ IDNO:11的氨基酸22或23至238、SEQ ID NO:13的氨基酸22或23至238或SEQ ID NO:31氨基酸22或23至296的区域中具有1至20个氨基酸取代。在这些实施方案的一些方面，所述融合蛋白具有1至10个氨基酸取代。在其它方面，所述融合蛋白具有1至5个氨基酸取代。

上文所提及的较低免疫原性融合蛋白可使用熟知去免疫方法来鉴定。通常，对所述融合蛋白的g3p部分进行筛选以确定其是否含有T细胞表位。此类潜在T细胞表位常被定义为具有结合至MHC第II类分子的能力的任何氨基酸残基序列。在其它实施方案中，对整个融合蛋白进行T细胞表位筛选。

在本领域中，已提供了实现T细胞表位检测的方法，其通过使用计算机手段扫描经实验确定的T细胞表位的可识别序列基序，或者使用计算机技术预测MHC第II类结合肽，且特别是DR结合肽。举例来说，WO98/52976和WO00/34317教示了计算机穿线(computational threading)方法以识别具有结合人类MHC第II类DR异型子集潜力的多肽序列。WO08/044032教示了针对已知的T细胞表位数据库筛选一级氨基酸序列以鉴定所述序列的T细胞表位。

或者，可合成待去免疫的蛋白质的肽部分(例如，SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:13的g3p部分)，并在silico中或在细胞测定中或活体内进行合成并测试以确定其是否结合至MHC分子(参见例如美国专利号7,208,147)。

一旦预测的T细胞表位被鉴定出来，则利用对本发明融合蛋白的g3p部分进行明确的一级序列氨基酸取代来减少免疫原性。这些经预测的SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:31的g3p部分的去免疫突变体随后进行活性与免疫原性再筛选，以鉴定出相较于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13中任一者的g3p部分保持活性却减少或没有免疫原性的那些。通常，这将需要1至20个氨基酸的取代。

在所有情况下，本发明融合蛋白的g3p的淀粉样蛋白结合片段包括其突变体和变体。

一般来说，所述融合蛋白至少同相对应的未经连接的g3p的淀粉样蛋白结合片段一样有效地结合至淀粉样蛋白。适用时，所述融合蛋白至少在以下方面同相对应的未经连接的g3p的淀粉样蛋白结合片段一样有效：介导淀粉样蛋白去凝集、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白凝集、和/或移除或预防有毒寡聚物的形成。在一些实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白并至少在以下方面同包含SEQ ID NO:1的重组型可溶性g3p一样有效：介导淀粉样蛋白去凝集、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白凝集、和/或移除或预防有毒寡聚物的形成。在另外的其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白并至少在以下方面同噬菌体M13一样有效：介导淀粉样蛋白去凝集、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白凝集、和/或移除或预防有毒寡聚物的形成。在另外的其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白并在以下方面较噬菌体M13更有效：介导淀粉样蛋白去凝集、促进淀粉样蛋白清除、抑制淀粉样蛋白凝集、和/或移除或预防有毒寡聚物的形成。在一些实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白并至少在减少蛋白质错误折叠疾病的淀粉样蛋白方面同噬菌体M13一样有效。在另外的其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白并在减少蛋白质错误折叠疾病的淀粉样蛋白方面较噬菌体M13更有效。在另外的其它实施方案中，所述融合蛋白结合淀粉样蛋白并至少在预防淀粉样蛋白形成方面同噬菌体M13一样有效或比其更有效。

融合蛋白可使用本领域熟知的技术合成。举例来说，本发明的融合蛋白可于细胞中重组合成(参见例如Sambrook等,1989,Molecular Cloning ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.和Ausubel等,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.)。或者，本发明的融合蛋白可使用熟知合成方法(例如固相合成法)合成。合成技术为本领域所熟知(参见例如Merrifield,1973,ChemicalPolypeptides,(Katsoyannis和Panayotis编),第335-61页；Merrifield 1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis等,1985,Biochem.Intl.10:394；Finn等,1976,The Proteins(第3版)2:105；Erikson等,1976,The Proteins(第3版)2:257；美国专利号3,941,763)。或者，最终的构建体可具有与重组生产的融合蛋白基本上相同的功能，而其仅使用非重组技术(例如连接化学(例ligationchemistry))生产。可使用针对g3p表达和g3p突变所描述的相同方法来制备融合蛋白组件。

D.g3p融合蛋白的编码核酸

在一些实施方案中，本发明提供核酸序列，其编码本发明包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白，其中所述融合蛋白的g3p部分包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体或变体，其具有与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:31的g3p部分至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在这些实施方案的一个方面，所述核酸序列选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32(分别为编码SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:31的实际核酸序列)，或为简并式(degenerative)却能编码与前述任一者相同的多肽的核酸序列。在这些实施方案的另一个方面，所述核酸序列选自SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32的g3p-Ig编码部分(即，编码下列中任一者的核酸序列：SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至505或506，SEQ ID NO:11的氨基酸21、22或23至505或506，SEQ ID NO:13的氨基酸21、22或23至508或509，或SEQ ID NO:31的氨基酸21、22或23至527或528)，其于5’端且在读框内融合至编码信号序列的核苷酸序列，或为简并式却能编码与前述任一者相同的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，所述信号序列是源自哺乳动物。

在这些实施方案的另一个方面，所述核酸序列选自SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32的g3p编码部分(即，编码下列中任一者的核酸序列：SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至238，SEQ ID NO:11的氨基酸21、22或23至238，SEQ ID NO:13的氨基酸21、22或23至238，或SEQ IDNO:31的氨基酸21、22或23至296)，其于5’端且在读框内融合至编码信号序列的核苷酸序列，或为简并式却能编码与前述任一者相同的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，所述信号序列是源自哺乳动物。

在一些实施方案中，编码所述g3p融合蛋白的核酸包含SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32，其中不包括编码信号序列(即，SEQ ID NO:9、11、13或31中任一者的氨基酸1至20、1至21或1至22)的核酸。在某些实施方案中，编码g3p融合蛋白但不包括编码信号序列的核苷酸的核酸选自i)SEQ ID NO:26或27中任一者的核苷酸61、64或67至1521；ii)SEQ IDNO:28的核苷酸61、64或67至1527；以及iii)SEQ ID NO:32的核苷酸61、64或67至1587。在一些实施方案中，所述核酸序列编码g3p N1N2结构域或其突变体、变体或片段。

在一些实施方案中，本发明提供核酸序列，其编码包含如下氨基酸序列的融合蛋白，相较于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:31中任一者的g3p部分，所述氨基酸序列具有1至20个氨基酸取代，其中所述融合蛋白于人体内的免疫原性低于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13或SEQ ID NO:31中任一者的g3p部分。在这些实施方案的一些方面，相较于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的g3p部分，所述核酸序列编码具有1至10个氨基酸取代的融合蛋白。在这些实施方案的其它方面，相较于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQID NO:31的g3p部分，所述核酸序列编码具有1至5个氨基酸取代的融合蛋白。在这些实施方案的另一些方面，所述核酸序列编码多肽，其中氨基酸取代皆位于融合蛋白的g3p部分(例如，SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至238、SEQID NO:11的氨基酸21、22或23至238、SEQ ID NO:13的氨基酸21、22或23至238或SEQ ID NO:31的氨基酸21、22或23至296，或其突变体、变体或片段)。

在一些实施方案中，本发明提供的核酸序列所编码的融合蛋白为下列变体中任一者：SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO:11的氨基酸21、22或23至505或506、SEQ ID NO:13的氨基酸21、22或23至508或509，或SEQ ID NO:31的氨基酸21、22或23至527或528，且其免疫原性低于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:31，其中所述变体不同于其相对应氨基酸序列之处，仅在于g3p区域(即，分别为SEQ IDNO:9的氨基酸21、22或23至238、SEQ ID NO:11的氨基酸22或23至238、SEQID NO:13的氨基酸22或23至238或SEQ ID NO:31的氨基酸22或23至氨基酸296)具有1至20个氨基酸取代。在这些实施方案的一些方面，所述核酸序列所编码的融合蛋白具有1至10个此类氨基酸取代。在其它方面，所述核酸序列所编码的融合蛋白具有1至5个此类氨基酸取代。

E.G3p融合蛋白的突变体

在另一个方面，本发明涉及包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体的融合蛋白。可制备包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体的融合蛋白或加以筛选，以使其具备可促成本申请案所述的药物组合物疗效的特性。举例来说，g3p的淀粉样蛋白结合片段可经重组突变或以其它方式筛选，以相对于M13的g3p具备下列特性中的一种或多种：增加淀粉样蛋白结合亲和力、降低铰链区T_M、增加亲合力(亲合力与亲和力的不同之处在于亲合力被用来描述在g3p包含一个以上淀粉样蛋白结合位点的情况下所有可得的淀粉样蛋白结合作用的总和)、增加对于淀粉样蛋白凝集物的去凝集能力，或增加预防淀粉样蛋白原纤维凝集的能力。或者或此外，所述g3p的淀粉样蛋白片段的突变体可合并本说明书其它地方所述的其它适用特性。

G3p的淀粉样蛋白片段的突变体可通过噬菌体诱变或通过重组技术(例如基于PCR的定点诱变或随机诱变)制备。

G3p的淀粉样蛋白结合片段(例如N1N2结构域或N2结构域)还可利用重组技术进行诱变处理，且并入本发明的融合蛋白。举例来说，如本文所述的携带g3p或其淀粉样蛋白结合片段(例如，N1N2或N2)的载体可使用基于PCR的突变策略进行突变。随后，进行所述编码的突变蛋白的表达并如所述评估突变体的淀粉样蛋白结合作用与亲和力。

G3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体还可衍生自g3p的突变体。举例来说，通过使g3p突变和/或筛选具有合意特性的经突变的g3p，且随后(例如)经由蛋白质水解和后续纯化从其中获得所希望的淀粉样蛋白结合片段。

在一些实施方案中，本发明g3p融合蛋白所含的g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体，以高于相对应的未经突变的M13g3p片段或相对应的未经突变的g3p融合蛋白的结合作用至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或甚至1000倍的亲和力结合于淀粉样蛋白。在其它实施方案中，所述包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体的融合蛋白所保留的淀粉样蛋白结合能力的强度为相对应未经突变的M13g3p的淀粉样蛋白结合片段或相对应未经突变的g3p融合蛋白的结合能力的至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。在一些实施方案中，g3p的淀粉样蛋白结合片段所展示的淀粉样蛋白结合亲和力低于相对应的未经突变形式时，其还具有相较于所述相对应的未经突变型有所改进的另一种合意的生物学特性(例如，更大的淀粉样蛋白去凝集能力；更大的预防淀粉样蛋白原纤维凝集的能力)或药学特性(例如，更大的代谢稳定性、有利的药代动力学特征、更大的浓解度)。可如实施例中所述通过表面等离子共振或竞争性ELISA评估淀粉样蛋白结合作用。

在一些实施方案中，可利用在高度或中等严苛度条件下使M13g3p与所选可杂合M13g3p的相关DNA进行杂合，通过DNA文库筛选来鉴定g3p的淀粉样蛋白片段的变体和/或突变体。

在一些实施方案中，包含经突变的g3p的淀粉样蛋白片段的本发明g3p融合蛋白是以重组方式产生，且其所含的g3p的淀粉样蛋白结合片段的氨基酸残基的至少一者异于未经突变的g3p多肽，但仍可结合于淀粉样蛋白。在一些实施方案中，个别的点突变的具体说明为，于g3p多肽的特定残基处提供未经突变的g3p氨基酸以及置换所述残基的氨基酸。举例来说，“F194A”是指成熟型M13序列(SEQ ID NO:1)的位置194处的苯丙氨酸被改成丙氨酸。在其它实施方案中，经突变的g3p以具体说明与特定氨基酸序列的氨基酸百分比相似度的方式描述，并且再次声明，所述经突变的g3p可结合于淀粉样蛋白原纤维。在这些实施方案中，本发明融合蛋白的经突变的g3p部分为至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同于SEQ ID NO:1中相对应部分的全长。在本发明包含经突变的g3p的淀粉样蛋白结合片段的那些实施方案中，所述经突变的淀粉样蛋白结合片段为至少70％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％等同于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31中相对应片段的全长。

在实际情况下，可使用已知计算机程序(例如Bestfit程序)以常规方式判定是否任何特定的多肽为至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等同于另一序列。当使用Bestfit或其它序列比对程序判定是否一个特定序列为(例如)95％等同于根据本发明的参考序列时，当然，将参数设定为在所述参考氨基酸序列中与查询序列同源的部分的全长范围内计算同一性百分比。

在各方面的一些实施方案中，本发明g3p融合蛋白的g3p部分的淀粉样蛋白结合片段的突变体于Ff家族、I家族、或Ff与I家族两者的g3p的相对应部分的保守性氨基酸残基上不具有突变。在其它实施方案中，g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体于Ff家族、I家族、或Ff与I家族两者的g3p的相对应部分的保守性氨基酸残基上有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的突变。在另外的其它实施方案中，g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体于Ff家族、I家族、或Ff与I家族两者的g3p的相对应部分的非保守性氨基酸残基上有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的突变。在又一实施方案中，g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体于I22、Ike与If1的一者或多者的相对应部分的非保守性氨基酸残基上有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的突变。在另外的其它实施方案中，g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体于Ff家族、I家族、或Ff与I家族两者的g3p的相对应部分的非保守性氨基酸残基上有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的突变。在一些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变是位于N1结构域内。在一些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变是位于N2结构域内。在一些实施方案中，所述至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个突变是位于N2结构域内，且非位于铰链区内。

定点诱变可靶向对g3p、N1N2或N2结构域的稳定性重要的残基。举例来说，先前已证明D94与T95；E115；N122；L125；E126与E127；E127与E128；Q129；Q145；T154与T156；Q157；T159与D160；K163与T164；Y166；以及E196与D197的丙氨酸置换突变不会显著像响噬菌体与F纤毛的结合作用，Deng和Perham,2002。因此，这些位置具有突变耐受性，且这些位置中一个或多个发生突变均可增强本发明g3p融合蛋白的淀粉样蛋白结合能力或对其具有中和效应。因此，在一些实施方案中，本发明包括包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的g3p融合蛋白，其中D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197中一者或多者发生突变(相对于SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，突变位于D94、T95、E115、N122、L125、E126、E127、E128、Q129、Q145、T154、T156、Q157、T159、D160、K163、T164、Y166、E196或D197中一者或多者处，且不完全为丙氨酸的突变。

先前已证实，F194；F190与H191；K184、R186与D187；R142与R144的丙氨酸置换突变会降低对F纤毛的结合作用，Deng和Perham,2002。因此，在一些实施方案中，本发明融合蛋白的g3p部分的突变选自不包括一个或多个下列残基的突变：R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194(相对于SEQ ID NO:1的编号)。然而，以非丙氨酸残基置换R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194可增加淀粉样蛋白结合作用。因此，在一个实施方案中，所述突变为R142、R144、W181、K184、R186、D187、F190、H191或F194中一者或多者的非丙氨酸突变。在一个实施方案中，所述突变为F194的非丙氨酸突变。在另一实施方案中，所述突变为F190与H191的非丙氨酸突变。在另一实施方案中，所述突变为K184、R186与D187的非丙氨酸突变。在另一实施方案中，所述突变为W181的非丙氨酸突变。在另一实施方案中，所述突变为R142与R144的非丙氨酸突变。在某些实施方案中，所述突变不完全为下列一者、一些或全部：T13I、T101I、Q129H、G153D、W181A、F190A、F194A和D209Y。

在一些实施方案中，本发明融合蛋白的g3p部分的突变是位于N2结构域(其为g3p结合于F纤毛的部分)的表面的一个或多个残基。在一个实施方案中，所述突变是位于N2结构域外缘的一个或多个残基。在其它实施方案中，所述突变是位于N1结构域(其为g3p结合于TolA的部分)的表面的一个或多个残基。在一个实施方案中，本发明融合蛋白的g3p部分的突变是位于N1结构域外缘的一个或多个残基。在另一实施方案中，所述突变是位于g3p上的一个或多个溶剂可及的残基。在又一实施方案中，所述突变将Pro213的顺式/反式平衡转变为大于50、60、70、80、90或95％的反式。因此，在一些实施方案中，g3p融合蛋白包含经突变的g3p，而使Pro213的顺式/反式平衡为至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少95％的反式。

在一些实施方案中，本发明融合蛋白g3p部分的g3p的淀粉样蛋白结合片段不包括结构上保守的残基的突变。结构上保守的残基的实例包括尽管可能有序列插入时仍在Ff与I家族成员中参与提供结构域结构的残基。

在一些实施方案中，本发明融合蛋白的g3p部分所产生的任何突变皆保留淀粉样蛋白结合能力。在其它实施方案中，所述突变并未置换脯氨酸残基。

在一些实施方案中，本发明融合蛋白的g3p部分所产生的任何突变皆保留淀粉样蛋白结合能力，且未置换半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述突变保留g3p内的全部、至少一个、至少二个、至少三个或全部四个双硫键。因此，在一个实施方案中，任何的突变皆保留N1的两个双硫键，所述双硫键位于Cys7与Cys36之间和Cys46与Cys53之间。在另一实施方案中，任何的突变皆保留N1的两个双硫键的其中一者而非两者，所述双硫键位于Cys7与Cys36之间和Cys46与Cys53之间。在一个实施方案中，保留Cys188与Cys201之间的双硫键。在一些实施方案中，保留Cys7与Cys36、Cys46与Cys53，和Cys188与Cys201之间的每一双硫键。在一个实施方案中，所述突变保留Cys354与Cys371之间的双硫键。在一些实施方案中，所述突变保留Cys7与Cys36之间、Cys46与Cys53之间、Cys188与Cys201之间以及Cys354与Cys371之间的双硫键。

在一些实施方案中，本发明融合蛋白的g3p部分所产生的任何突变皆保留淀粉样蛋白结合能力，并降低N1N2的熔融温度(T_M)。T_M是可使用实施例中所述的任何方法测量。使N1N2的T_M降低的突变体预期有较好的Aβ结合能力、更大程度的Aβ聚集抑制能力、以及于去凝集测定中的功效至少如同M13的g3p。因此，包含这些g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体的融合蛋白预期于一种或多种蛋白质错误折叠疾病的治疗上，其疗效至少分别如同相对应的M13序列、含有相对应未经突变的g3p的淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白、以及完整的M13。

还可将含g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体的融合蛋白设计成包括导向序列。此类导向序列可被插入N1N2之间，或N2与N2融合蛋白的另一结构域之间的柔性接头区域。导向核定位序列(NLS)可能有益于亨廷顿氏病。导向核内体可能有益于帕金森氏病。

除了导向细胞内特定区域以外，导向序列还可用于导向不同种类的淀粉样蛋白。成核序列可增加亲和力，并将蛋白质的突变体导引至特定淀粉样蛋白。本发明的g3p融合蛋白的其它g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体可制成包括疏水性肽序列，因此可自行沉淀。举例来说，可将多重AVVAI序列加至g3p和/或其淀粉样蛋白结合片段(例如，N2与N1N2)和/或其融合蛋白，以产生具有强化的多重结合序列的嵌合蛋白质。可结合淀粉样蛋白并可并入g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体或嵌合体以及含有这些g3p的淀粉样蛋白结合片段的突变体或嵌合体的融合蛋白的肽的一些实例为基于Sato,Biochemistry(2006)45:5503-16中所描述的GxFxGxF骨架(SEQ ID NO:21)与Tjernberg等,J.Biol.Chem.(1996)271:8545-48中所描述的KLVFF肽(SEQ IDNO:22)的肽抑制剂。其它导向部分是为已知且也可用于本发明。参见例如Sciarretta等,Methods in Enzymology(2006)413:273-312。术语“变体”与“突变体”在本文中可互换使用，不同之处在于“变体”通常在本质上为非重组的，而“突变体”通常为重组的。

重组技术

一般来说，使用常规重组DNA技术来制备编码g3p融合蛋白(以及其突变体和变体)的DNA且可涉及g3p基因的克隆、直接DNA合成或使用(例如)M13序列作为探针从文库中分离相对应的DNA(参见例如Sambrook等,1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.和Ausubel等,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.)。

对于重组生产，将本发明g3p融合蛋白或其淀粉样蛋白结合片段的编码核酸序列插入适当的表达载体中，所述表达载体含有使所插入编码序列的转录与转译所需的组件，或在RNA病毒载体的情形下，含有复制与转译所需的组件。将所述编码核酸插入载体的合适读框内。

因此，本发明提供了包含编码本文所公开的g3p融合蛋白(包括其突变体和变体)的多核苷酸的载体。还提供了包含编码g3p或g3p融合分子的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。

用于重组表达的例示性细胞类型包括：昆虫细胞，包括杆状病毒系统；真菌细胞，其包括毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)和曲菌属(Aspergillus)细胞；细菌细胞，包括大肠杆菌(E.coli)细胞；动物细胞系，包括NSO、CHO、HEK293、COS、HeLa、或任何其它经确定的动物细胞系；以及转基因动物，例如山羊。

在一些实施方案中，选择载体，所述载体经优化以在CHO或CHO衍生细胞中表达多肽。例示性此类载体描述于(例如)Running Deer等,Biotechnol.Prog.(2004)20:880-889中。

在一些实施方案中，选择载体用于使g3p、其淀粉样蛋白结合片段和/或g3p融合体分子在动物(包括人)中进行体内表达。在一些所述类实施方案中，多肽的表达是由启动子控制，所述启动子以组织专一性方式执行功能。

将表达载体转染或共转染至将表达多肽的适合靶标细胞中。非限制性例示性转染方法描述于(例如)Sambrook等,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)中。可根据本领域已知方法将核酸暂时或稳定转染于合意的宿主细胞中。可利用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的蛋白质，包括原核或真核细胞。这些系统包括但不限于微生物，例如以含有适当编码序列的重组型噬菌体DNA或质粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌)；以含有适当编码序列的重组型酵母或真菌表达载体转化的酵母或丝状真菌；以含有适当编码序列的重组型病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以含有适当编码序列的重组型病毒表达载体(例如，花椰菜镶嵌病毒或烟草镶嵌病毒)感染或重组型质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包括哺乳动物细胞(例如，CHO、Cos、HeLa或HEK-293细胞)。蛋白质还可于浮萍中重组生产。参见例如美国专利号8,022,270。

转化用载体常含有可筛选标记物用来鉴定转化体。在细菌系统中，其可包括抗生素抗性基因，例如氨比西林(ampicillin)或卡那霉素(kanamycin)抗性基因。用于经培养的哺乳动物细胞的可筛选标记物包括赋予对诸如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和甲氨蝶呤(methotrexate)等药物的抗性的基因。可筛选标记物可为扩增性可筛选标记物。一种扩增性可筛选标记物为DHFR基因。另一种扩增性标记物为DHFRr cDNA(Simonsen和Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),(1983)80:2495)。Thilly(Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,MA)对可筛选标记物进行了综述，且可筛选标记物的选择在本领域技术人员的能力范围内可及。

表达系统的表达元件的强度和专一性有所不同。取决于所使用的宿主/载体系统，多种适合转录与转译元件(包括组成型和诱发型启动子)中任一者皆可用于表达载体中。举例来说，当在细菌系统中克隆时，可使用诱发型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可使用诸如杆状病毒多面体启动子等启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可使用源自植物细胞基因组的启动子(例如，热休克启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或源自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞中克隆时，可使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)；当产生的细胞系含有多重拷贝的表达产物时，可使用含有适当可筛选标记物的基于SV40、BPV与EBV的载体。

在使用植物表达载体的情形下，本发明的直线或未环化形式的表达产物的编码序列的表达可由多种启动子中的任一种驱动。举例来说，可使用病毒启动子，例如CaMV的35S RNA与19S RNA启动子(Brisson等,Nature(1984)310:511-514)，或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等,EMBO J.(1987)6:307-311)；或者，可使用植物启动子，例如RUBISCO小亚基(Coruzzi等,EMBO J.(1984)3:1671-1680；Broglie等,Science(1984)224:838-843)或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等,Mol.Cell.Biol.(1986)6:559-565)。这些构建体可利用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等引入植物细胞中。关于此类技术的综述参见例如Weissbach和Weissbach 1988,Methods for Plant Molecular Biology,AcademicPress,NY,Section VIII,第421-463页；以及Grierson和Corey 1988,PlantMolecular Biology,第2版,Blackie,London,第7-9章。

在一个可用于生产本发明蛋白质的昆虫表达系统中，使用加州苜蓿夜蛾核多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus；AcNPV)作为载体来表达外来基因。病毒生长于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中。可将编码序列克隆至病毒的非必需区域(例如，多面体基因)中并使其受AcNPV启动子(例如，多面体启动子)控制。编码序列成功插入后，将造成多面体基因失活，并产生非闭合型的重组型病毒(即，缺少多面体基因编码的蛋白质外套的病毒)。随后使用这些重组型病毒感染草地贪夜蛾细胞，所插入的基因于其中被表达(参见例如Smith等,J.Virol.(1983)46:584；美国专利号4,215,051)。此种表达系统的其它实例可见于Ausubel等编,1989,CurrentProtocols in Molecular Biology,第2卷,Greene Publish.Assoc.&WileyInterscience。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用多种基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情形下，编码序列可连接至腺病毒转录/转译控制复合物，例如，晚期启动子和三联导向序列。随后可将该融合体基因以体外或体内重组方式插入腺病毒基因组。插入病毒基因组非必需区域(例如，区域E1或E3)内将使重组型病毒存活并能于受感染宿主内表达肽(参见例如Logan和Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1984)81:3655)。或者，可使用牛痘病毒7.5K启动子(参见例如Mackett等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:7415；Mackett等,J.Virol.(1984)49:857；Panicali等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1982)79:4927)。其它病毒表达系统包括腺相关病毒和慢病毒。

含有DNA构建体的宿主细胞是生长于适当的生长培养基中。如本文所使用，术语"适当的生长培养基"是指含有细胞生长所需营养物的培养基。本发明的重组生产蛋白质可使用本领域的常规技术从培养基中分离。

体外测定

在一些实施方案中，使用硫代黄素T荧光(ThT)测定来监测淀粉样蛋白的去凝集。

在一些实施方案中，于存在或不存在本发明的融合蛋白或组合物时侦测洗涤剂的溶解来测试去凝集。举例来说，可用本发明的组合物处理凝集的α-突触核蛋白。相较于未经处理的纤维，可去凝集所述凝集的α-突触核蛋白的融合蛋白或组合物将使所述α-突触核蛋白纤维更快溶于洗涤剂(例如SDS)。淀粉样蛋白纤维向可溶性形式的此种转化可通过在凝集期间掺入一定比例的经标记(例如，经Cy5标记的)α-突触核蛋白单体进行监测。

在一些实施方案中，对有毒淀粉样蛋白寡聚物的形成的预防作用是通过神经元细胞毒性测定来测试。在此测定中，将经分化的N2a神经母细胞瘤细胞或同等物与Aβ42寡聚物进行共孵育。所述寡聚物结合于细胞膜，引起细胞膜扰动，并使胞质酶渗漏至培养基。长时间与高浓度的寡聚物一起孵育将会杀死细胞。当所述寡聚物在与细胞一起孵育之前经噬菌体或g3p预处理时，所述寡聚物至少毒性较低且有时无毒。此种中和效应可通过测量腺苷酸激酶(一种例示性胞质酶，其于细胞膜扰动后由神经元细胞释出)的释出来进行量化。

在一些实施方案中，本发明的g3p融合蛋白或组合物在蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)测定中可抑制可溶性朊病毒转化为抗蛋白酶K的构象异构体。Wang等,Science,(2010)327:1132-35。在此测定中，在存在或不存在本发明的融合蛋白或组合物时将重组型PrP与脂质POPG和RNA混合。随后对所述物质进行多次(例如，48次)30秒钟超声波处理并之后孵育29.5分钟的循环。随后取反应混合物的一部分用于接种另一底物管并重复所述循环。每轮皆测试抗蛋白酶K物质的存在，该物质指示PrP的感染形式。在本发明组合物的存在下，抗蛋白酶K物质减少，这表明融合蛋白或组合物可抑制抗PK的构象异构体的形成。

如前面所述，某些朊病毒的淀粉样蛋白形式(例如酵母菌朊病毒蛋白NM)还可于滤膜截留测定中检测。因此，根据先前的蛋白质，在一些实施方案中可于滤膜截留测定中测试本发明的融合蛋白或组合物的去凝集所述朊病毒凝集物的能力。

体内功能测定

除了活性(例如，对淀粉样蛋白的结合亲和力增加或T_M减少)可于体外测定中证实之外，本发明的融合蛋白或组合物还可于数种体内测定中的一者中减少淀粉样蛋白。一种确定体内淀粉样蛋白减少的方法是于处理之前和之后利用正电子发射断层摄影术(PET)与显像剂氟罗贝它(florbetapir)(F18-AV-45,Eli Lilly)来比较β-淀粉样蛋白的数目和/或分布。当然，因附加生物标记物能被鉴定，其还可用于测量淀粉样蛋白的减少。

另一种确定本发明的g3p融合蛋白或组合物是否可减少体内淀粉样蛋白的方法是使用hAPP小鼠模型。Rockenstein,J Neurosci Res.(2001)66(4):573-82。这些小鼠于早期(3至4个月大)即产生高含量的β-淀粉样蛋白。本发明的融合蛋白或组合物减少淀粉样蛋白的能力可通过以下方式确定：对小鼠注射本发明的组合物，然后相比于未经注射的对照，比较这些小鼠的淀粉样蛋白含量。本发明的融合蛋白或组合物还可仅注射于hAPP小鼠的一个脑半球，以比较相同小鼠经注射与未经注射的脑半球之间的淀粉样蛋白含量。

在另一实施例中，在阿尔茨海默氏病(TgAD)转基因小鼠模型中测试本发明的融合蛋白或组合物，所述模型描述于US2011/0142803、Hsiao等,Science(1996)274:99-102或Duyckaerts等,Acta Neuropathol(2008)115:5-38中。简单来说，对野生型小鼠以及转基因小鼠进行激发。为了评估本发明的融合蛋白或组合物充当去凝集试剂的可能性，对转基因小鼠(Taconic，APPSWE(2576)，10个月大)颅内或全身注射组合物。举例来说，对于颅内注射，包含本发明融合蛋白的组合物可注射至一个脑半球，而其对侧则施加磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照。随后将经处理的小鼠于不同时间点处死并将大脑于4％多聚甲醛中固定后隔夜，并使用切片机进行切割。进行硫代黄素-S(ThS)染色以评估淀粉样蛋白负荷。利用梅尔氏苏木素(Mayer's hematoxylin)进行切片染色以猝灭核自发荧光，并于洗涤后，施加ThS溶液(1％)3分钟。使用1％乙酸进行20分钟的分化反应，并于洗涤后，将玻片干燥并用抗褪色封片介质进行封片。使用LEICA Qwin程序计算淀粉样蛋白负荷。或者，以抗-淀粉样蛋白抗体分析淀粉样蛋白负荷。

还可测量经放射性(例如，I¹²⁵)或荧光性标记的融合蛋白或组合物或者未经标记的融合蛋白或组合物的生物分布，以证实本发明的融合蛋白或组合物可于体内结合于淀粉样蛋白。举例来说，所述融合蛋白可经放射性或荧光性标记。将BALB/c小鼠分组。随后在1小时内对各小鼠鼻内给予融合蛋白。第一组小鼠是在使用4％多聚甲醛进行心内灌注施用后1小时处死。第二组是于处理后3小时处死，而最后一组则于24小时后处死。在灌注后，摘除大脑以及周边器官并测量标记。或者，可利用类似方法评估未经标记的融合蛋白或组合物的结合作用，不过必须以一种可识别淀粉样蛋白的染剂和一种可识别组合物或噬菌体的染剂进行大脑切片共同染色。

还可使用蛋白质错误折叠疾病的其它转基因模型来证实本发明的融合蛋白或组合物可减少淀粉样蛋白。非限制性实例包括“D品系”α-突触核蛋白小鼠(一种帕金森氏病模型，Masliah等,Science(2000)287:1265-1269)；Tg2576小鼠(一种阿尔茨海默氏病模型，Hsiao等,Science(1996)274:99-102和Duyckaerts等,Acta Neuropathol(2008)115:5-38，9月)；用于帕金森氏病研究的多种小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)；以及购自JSWLifescience的小鼠和大鼠模型，包括用于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病的那些。

药物组合物

在另一个方面，本发明提供药学上可接受组合物，其包含上述的任何g3p融合蛋白，包括SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ IDNO:31的融合蛋白，或其片段、突变体或变体。具体来说，本发明的药物组合物可包含SEQ ID NO:9的氨基酸21至506、SEQ ID NO:9的氨基酸22至506、SEQ ID NO:9的氨基酸23至506、SEQ ID NO:9的氨基酸21至505、SEQ ID NO:9的氨基酸22至505或SEQ ID NO:9的氨基酸23至505；或如上所述的任何这些序列的突变体或变体。在其它实施方案中，本发明的药物组合物可包含SEQ ID NO:11的氨基酸21至506、SEQ ID NO:11的氨基酸22至506、SEQ ID NO:11的氨基酸23至506、SEQ ID NO:11的氨基酸21至505、SEQ ID NO:11的氨基酸22至505或SEQ ID NO:11氨基酸23至505；SEQ ID NO:13的氨基酸21至508、SEQ ID NO:13的氨基酸22至508、SEQID NO:13的氨基酸23至508、SEQ ID NO:13的氨基酸21至507、SEQ IDNO:13的氨基酸22至507或SEQ ID NO:13氨基酸23至507；或SEQ IDNO:31的氨基酸21至528、SEQ ID NO:31的氨基酸22至528、SEQ ID NO:31的氨基酸23至528、SEQ ID NO:31的氨基酸21至527、SEQ ID NO:31的氨基酸22至527或SEQ ID NO:31氨基酸23至527，或如上所述的任何这些序列的突变体或变体。

"药物组合物"是指治疗有效量的如本文所述的g3p融合蛋白与生理上适合的载体和/或赋形剂，其中所述融合蛋白的g3p部分负责所述融合蛋白的疗效。药物组合物不会对生物体造成显著刺激。短语“生理上可接受的载体”与“药学上可接受的载体”可互换使用，其是指不会对生物体造成显著刺激且不会破坏所施用组合物的生物活性与特性的载体或稀释剂。

术语“赋形剂”是指被加到药物组合物中以进一步协助活性成分的施用的惰性物质。其实例包括但不限于(例如)盐水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类型淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇，和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。

根据本发明的供使用的药物组合物可以以常规方式配制，使用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理上可接受的载体以协助g3p活性成分加工成具有药学上用途的组合物。适当的制剂取决于所选施用途径和所递送组合物的性质。

举例来说，本发明药物组合物的适合施用途径可包括经黏膜、尤其经鼻递送；肠胃外递送，包括肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射；经口；或直肠递送。

在一些实施方案中，药物组合物以局部而非全身方式施用，举例来说，经由直接将药物组合物注射至患者脑内。在一些实施方案中，注射技术为任何可避免血脑屏障的技术，举例来说，利用直接髓内、鞘内或心室内注射。

对于注射而言，本发明的活性成分可配制成水溶液，优选于生理上相容缓冲液中，例如汉克溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液。对于经黏膜施用而言，在制剂中使用适合穿透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物经由鼻内施用进行施用。据报导，鼻内递送可使病毒和大分子直接进入脑脊液(CSF)或CNS。Mathison等,1998；Chou等,1997；Draghia等,1995。

对于鼻内途径施用，组合物以气溶胶喷雾形式利用适合的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)从加压包装或喷雾器中方便地施用。在加压气溶胶的情形下，可通过提供递送计量数量的阀来确定剂量单位。例如，可配制在分配器中使用的(例如)明胶的胶囊和药筒，其含有化合物与适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。

在本文中被描述为药物组合物成分的各种融合蛋白还可使用嗅觉受体神经元作为递送点递送至大脑。举例来说，包含任何这些蛋白质编码基因的腺病毒载体皆可经由嗅觉受体神经元递送。Draghia等,1995。

本文所述的组合物可配制成胃肠外施用，例如，通过一次性注射或连续输注。用于胃肠外施用的药物组合物包括水溶性形式的组合物的水溶液。此外，活性成分的悬液可制成油性或基于水的注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油类(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯类(例如，油酸乙酯、三酸甘油酯或脂质体)。水性注射悬液可含有可增加悬液黏度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬液还可含有适合的稳定剂或试剂(例如，表面活性剂，例如聚山梨醇酯(Tween 20))，其增加活性成分的溶解度而允许制备高浓度溶液。可使用基于蛋白质的试剂(例如，白蛋白)以防止M13吸附在递送表面上(即，IV袋、导管、针等)。

对于经口施用，组合物可容易地通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来配制。

制剂可以以单位剂型呈现(例如，以小瓶、安瓿或以多剂量容器)，并任选地添加防腐剂。组合物可为溶于油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液，并可含有配制剂，例如，悬剂、稳定剂和/或分散剂。单一剂型可呈液体或固体形式。单一剂型可不经改变直接施用患者，或经稀释或重组后施用。在某些实施方案中，单一剂型以一次性形式(例如，单次注射、单次口服剂量，包括包含多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量)施用。在备选实施方案中，单一剂型可例如通过输注或经由植入式泵(例如，ICV泵)于一段时间内施用。在后一个实施方案中，单一剂型可为预先填充有所述融合蛋白的输液袋或泵式储液器。或者，所述输液袋或泵式储液器可于患者施用前制备，其通过将单一剂量的所述融合蛋白与所述输液袋或泵式储液器中的溶液混合。

本发明的另一个方面包括制备本发明药物组合物的方法。药物配制技术可见于例如最新版的“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Mack PublishingCo.,Easton,Pa.，其以引用方式整体并入本文。

适合在本发明的背景下使用的药物组合物包括其中包含可有效达成预期用途的量的g3p活性成分的组合物。本发明的药物组合物包含g3p融合蛋白，其中所述融合蛋白的g3p部分的用量应在有需要的患者中有效减少淀粉样蛋白、抑制淀粉样蛋白形成、抑制淀粉样蛋白凝集、或移除和/或预防有毒寡聚物的形成。所述组合物不包含噬菌体。

治疗上或诊断上有效量的确定为本领域技术人员的能力范围内可及，尤其是根据本文提供的详细公开。

剂量数量和间隔可经个别地调整以提供大脑足以治疗或诊断特定脑部疾病、病症或病状的噬菌体展示载体的量(最小有效浓度，MEC)。每种制剂的MEC将有所不同，但可从体外数据估算。达到MEC所需的剂量将取决于个体的特征。

还可利用MEC值来确定剂量间隔。应使用治疗方案进行制剂施用，所述治疗方案维持大脑中含量高于MEC的10至90％之间，优选介于30至90％之间，且最优选介于50至90％之间。

根据所治疗病状的严重程度和反应性，可进行单次或复数次施用给药，且疗程持续数天至数周，或直到实现治愈或达到疾病状态减少。

当然，所施用的组合物的量将取决于待治疗或诊断的个体、痛苦的严重程度、处方医师判断等。

含有本文所述的g3p融合蛋白或其突变体或变体的本发明组合物视需要可提供于包装或分配器装置(例如FDA批准的试剂盒)中，所述包装或分配器装置可含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。举例来说，所述包装包括金属或塑料箔(例如，泡罩包装)。所述包装或分配器装置可附有施用说明书。包装或分配器装置还可提供有关于容器呈管理药品的制造、使用或销售的政府机构所规定的形式的公告，该公告反映该机构批准该形式的组合物用于人类或兽医施用。举例来说，此类公告可为经美国食品和药物管理局(U.S.Foodand Drug Administration)批准的处方药物标签或具有获批产品插页。还可制备包含配制于相容药物载体中的本发明制剂的组合物，放置于适当容器内并标示用于治疗的指定病状，如同上文进一步详述。

应理解，前面与下面的说明仅为例示性和解释性而并非限制要求保护的本发明。

治疗用途

本发明的另一个方面涉及使用任何本发明的g3p融合蛋白或组合物治疗和/或预防蛋白质错误折叠疾病，包括但不限于涉及fAβ42、fαsyn、fNM或fτ中任一者的那些疾病。

本发明的另一个方面涉及使用任何本发明的g3p融合蛋白或组合物在有需要的患者中减少淀粉样蛋白、抑制淀粉样蛋白形成、抑制淀粉样蛋白凝集、和/或移除和/或预防有毒寡聚物的形成。

在治疗和/或预防的背景下，术语“患者”、“个体”与“接受者”可互换使用并包括人类以及其它哺乳动物。在一些实施方案中，患者为对与蛋白质错误折叠疾病相关的生物标记物呈现阳性的人。在一个实施方案中，患者展现β-淀粉样蛋白沉积物，如通过以氟罗贝它进行PET成像所检测。

术语“治疗”欲指减少、延缓或逆转展现一种或多种疾病临床症状的患者的疾病进展。“治疗”还欲指减少、延缓或逆转展现一种或多种疾病临床症状的患者的疾病症状。在一个实施方案中，患者展现β-淀粉样蛋白沉积物，如通过以氟罗贝它进行PET成像所检测，且β-淀粉样蛋白沉积物的数量在治疗后减少。在一个实施方案中，患者展现β-淀粉样蛋白沉积物，如通过本发明的g3p组合物所检测，且所述β-淀粉样蛋白沉积物的数量在治疗后减少或维持不变。在另一实施方案中，患者展现任何类型的淀粉样蛋白沉积物，如通过PET成像所检测，且患者的认知功能在治疗后得到改善。认知功能的改善可通过McKhann等,Alzheimer’s&Dementia(2011)5月；7(3):263-9所述的方法和测试进行测定。

“预防”不同于治疗，其是指在任何临床症状发生之前将组合物施用至个体。如本文中所使用，“预防性地”使用本发明的g3p融合蛋白或组合物与“预防上”使用本发明的g3p融合蛋白或组合物同义。包括使用包括任何本发明的融合蛋白或组合物进行预防。预防可能涉及已知有疾病风险增加或确信会发生疾病的个体，仅根据一种或多种基因标记物便能确定。已针对多种蛋白质错误折叠疾病鉴定出许多基因标记物。举例而言，人类淀粉样蛋白前体蛋白(hAPP)具有瑞典型突变(Swedish mutation)、印第安纳型突变(Indianamutation)或伦敦型突变(London mutation)中一者或多者的个体发生早发性阿尔茨海默氏病的风险增加，故为预防的候选对象。同样地，亨廷顿蛋白基因上有三核苷酸CAG重复序列的个体，特别是具有36个或更多个重复序列的个体，最终将发生亨廷顿氏病，故为预防的候选对象。

术语“蛋白质错误折叠”是指以凝集蛋白质(淀粉样蛋白成形肽)形成淀粉样蛋白为特征的疾病，所述凝集蛋白质包括但不限于β-淀粉样蛋白、血清淀粉样蛋白A、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、IgG-κ轻链或朊病毒蛋白。已知与错误折叠和/或凝集淀粉样蛋白相关的疾病包括阿尔茨海默氏病(其包括早发性阿尔茨海默氏病、迟发性阿尔茨海默氏病和症状前阿尔茨海默氏病)、帕金森氏病、SAA淀粉样变性、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、遗传性冰岛综合征、衰老、多发性骨髓瘤、朊病毒病，包括但不限于库鲁病、克雅氏病(CJD)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)、羊搔痒症和牛海绵状脑炎(BSE)；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓小脑性共济失调(SCA1)、(SCA3)、(SCA6)、(SCA7)、亨廷顿氏病、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩症(entatorubral-pallidoluysian atrophy)、脊髓延髓肌肉萎缩症、遗传性脑淀粉样血管病变、家族性淀粉样变性、额颞叶性痴呆、英国/丹麦痴呆以及家族性脑病变。本发明的g3p融合蛋白与组合物可用于治疗“蛋白质错误折叠”疾病。

许多的这类错误折叠和/或凝集淀粉样蛋白疾病发生于中枢神经系统(CNS)。一些发生于CNS的疾病实例包括帕金森氏病；阿尔茨海默氏病；额颞叶性痴呆(FTD)，包括具有下列临床症状的患者：行为异常型FTD(bvFTD)、进行性非流利性失语(progressive non-fluent aphasia；PNFA)和语意性痴呆(SD)；额颞叶性退化症(FTLD)；以及亨廷顿氏病。本发明g3p融合蛋白或组合物可用来治疗以中枢神经系统(CNS)内出现错误折叠和/或凝集淀粉样蛋白为特征的疾病。

蛋白质错误折叠和/或凝集还可于CNS以外发生。淀粉样变性A(AA)(其前体蛋白为血清急性期载脂蛋白，SAA)与多发性骨髓瘤(其前体蛋白为免疫球蛋白轻链和/或重链)为发生于CNS以外的两个广为人知的蛋白质错误折叠和/或凝集蛋白质疾病。其它实例包括涉及由下列所形成的淀粉样蛋白疾病：β₂微球蛋白、转甲状腺素蛋白(家族性淀粉样多发性神经病变[FAP]、家族性淀粉样心肌病[FAC]和老年全身性淀粉样变性[SSA])、(载脂蛋白)血清AA、载脂蛋白AI、AII与AIV、凝溶胶蛋白(芬兰型家族性淀粉样多发性神经病变)、溶菌酶、纤维蛋白原、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(冰岛型大脑淀粉样蛋白血管病变、遗传性脑出血伴淀粉样变性)、降钙素原、胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP淀粉样变性)、心房利钠因子、催乳素、胰岛素、乳凝集素、角膜上皮素、乳铁蛋白、齿源性造釉细胞相关蛋白和精液凝固蛋白I。本发明的g3p融合蛋白或组合物可用于治疗涉及发生于CNS以外的蛋白质错误折叠和/或凝集疾病。

神经退化性疾病还可涉及τ病变(综述于Lee等,(2001)Annu.Rev.Neurosci.24:1121-159中)。τ蛋白为表达于中枢与周边神经系统轴突的微管相关的蛋白质。其包括神经退化性τ病变(有时称作τ病变)，并可由本发明所述的g3p融合蛋白与组合物治疗。τ病变的实例包括阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症/帕金森氏病-痴呆复合症、嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、克雅氏病、拳击手痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴随钙化、唐氏综合征、额颞叶痴呆，包括额颞叶痴呆伴随第17号染色体相关的帕金森氏病、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、肌强直性营养不良、C型尼曼皮克病(Niemann-Pick disease type C)、非关岛型运动神经元病伴随神经原纤维缠结、皮克氏病(Pick’s disease-affected areassease)、脑炎后帕金森氏病、朊病毒大脑淀粉样蛋白血管病变、进行性皮质下胶质增生、进行性核上麻痹、亚急性硬化性脑炎，以及神经缠结型痴呆。一些所述疾病还包括纤维状β-淀粉样蛋白肽沉积物。举例来说，阿尔茨海默氏病同时发生β-淀粉样蛋白沉积物与τ病变。同样地，朊病毒介导的疾病如克雅氏病、朊病毒大脑淀粉样蛋白血管病变和杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征还具有τ病变。因此，如果疾病为“τ病变”，不应被解释为排除其它神经退化性疾病类型或组别，因其如本文所使用仅就便利考虑。本发明的g3p融合蛋白或组合物可用于治疗神经退化性疾病与涉及τ病变的疾病。

在一个实施方案中，本发明所述的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种减少患者淀粉样蛋白的方法，所述患者具有淀粉样蛋白存在的相关症状或对于蛋白质错误折叠疾病相关的生物标记物，如氟罗贝它(AV-45,EliLilly)，呈现阳性。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内(intraparenchymal)注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，本发明所述的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种维持患者淀粉样蛋白的量的方法，所述患者具有淀粉样蛋白存在的相关症状或对于蛋白质错误折叠疾病相关的生物标记物，如氟罗贝它(AV-45,Eli Lilly)，呈现阳性。患者是施用有效量的本发明所述的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种去凝集患者淀粉样蛋白的方法，包含施用具淀粉样蛋白的患者有效量的本发明所述的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种使大脑β-淀粉样蛋白沉积物去凝集的方法，其包括直接注射有效量的本发明所述的药物组合物至有需要患者的大脑，从而减少大脑内β-淀粉样蛋白沉积物。

在一个实施方案中，g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种减少大脑淀粉样蛋白形成的方法。大脑内淀粉样蛋白的减少可预防、治疗或减轻蛋白质折叠或神经退化性疾病的症状或严重程度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，本发明的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种促进大脑内淀粉样蛋白清除的方法。大脑内淀粉样蛋白清除的促进可预防、治疗或减轻蛋白质折叠或神经退化性疾病的症状或严重程度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，本发明的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种抑制大脑内淀粉样蛋白凝集作用的方法。对大脑内淀粉样蛋白凝集作用的抑制可预防、治疗或减轻蛋白质折叠或神经退化性疾病的症状或严重程度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，本发明的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种清除大脑内有毒淀粉样蛋白寡聚物的方法。大脑内有毒淀粉样蛋白寡聚物的清除可预防、治疗或减轻蛋白质折叠或神经退化性疾病的症状或严重程度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，本发明的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种预防大脑内有毒淀粉样蛋白寡聚物形成的方法。对大脑内有毒寡聚物形成的预防可预防、治疗或减轻蛋白质折叠或神经退化性疾病的症状或严重程度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。

在一个实施方案中，本发明的g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是用于一种保护神经元免于淀粉样蛋白损害的方法。对神经元的淀粉样蛋白损害的保护可预防、治疗或减轻蛋白质折叠或神经退化性疾病的症状或严重程度。在一个实施方案中，施用途径选自鞘内注射、直接心室内注射、脑实质体内注射或鼻内递送。在一个实施方案中，用于保护神经元免于淀粉样蛋白损害的本发明g3p融合蛋白、药物组合物或制剂是预防性施用。

在一些实施方案中，患者对蛋白质错误折叠和/或凝集疾病相关的生物标记物呈现阳性。在一个实施方案中，所述生物标记物为氟罗贝它(AV45,EliLilly)。

在一些实施方案中，患者具有与淀粉样蛋白的存在相关联的神经退化性疾病症状。在各种实施方案中，所述淀粉样蛋白为fAβ42、fαsyn、fNM或fτ中任一者。

在某些实施方案中，所述神经退化性疾病为帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿氏病。在一个实施方案中，所述神经退化性疾病为阿尔茨海默氏病。在一个实施方案中，所述神经退化性疾病为阿尔茨海默氏病且患者具有β-淀粉样蛋白，其可由显像剂氟罗贝它(AV-45,Eli Lilly)测出。

在一些实施方案中，所述患者具有朊病毒介导的疾病症状。

在某些实施方案中，所述朊病毒介导的疾病选自克雅氏病、库鲁病、致死性家族性失眠症或杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征。

在一些实施方案中，所述患者除了阿尔茨海默氏病之外，还具有神经退化性τ病变的症状。在某些实施方案中，欲治疗的疾病选自嗜银颗粒性痴呆、皮质基底核退化症、拳击手痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴随钙化、唐氏综合征、额颞叶痴呆，包括额颞叶痴呆伴随第17号染色体相关的帕金森氏病、哈勒沃登-施帕茨病、肌强直性营养不良、尼曼皮克病C型、非关岛型运动神经元病伴随神经原纤维缠结、皮克氏病、脑炎后帕金森氏病、进行性皮质下胶质增生、进行性核上麻痹、亚急性硬化性脑炎以及神经缠结型痴呆。

诊断剂

在本发明的另一个方面，本文所述的g3p融合蛋白与组合物是用于与本文所述的各种疾病相关的体外和/或体内诊断应用。举例来说，当以本发明的g3p融合蛋白或组合物作为体内或体外显像剂时，其结合作用可为所述蛋白质错误折叠疾病中一者的诊断的一部分。

诊断剂，或本文他处所称的诊断组合物，皆包括于此，且可包含任何前述本发明的融合蛋白或组合物。所述诊断剂可进一步包含可检测标记，或可于体内测得者。

在一些实施方案中，本发明的g3p融合蛋白或包含所述融合蛋白的组合物是用作淀粉样蛋白显像剂。所述显像剂可检测淀粉样蛋白和诊断淀粉样蛋白相关联的疾病。由于本发明的融合蛋白与组合物可结合于各种纤维类型的淀粉样蛋白，故其优点为可进行任何淀粉样蛋白凝集物(Aβ、τ、α-突触核蛋白等)的显像且皆以单一显像剂完成。现今，对于CNS的τ或α-突触核蛋白凝集物尚无可接受的显像剂/方法。虽然有β-淀粉样蛋白显像剂，但仍需要额外的试剂，以提供认知功能与显像结果之间相关性的改善和/或更佳地预测会恶化与保持稳定的患者。关于综述参见Resnick和Sojkova,Alzheimer’s ResTher.(2011)3(1):3。

本发明的诊断型g3p融合蛋白与组合物可作为显像剂，并结合β-淀粉样蛋白专一性显像剂(例如，F18-AV-45,Eli Lilly)使用。由于目前并没有非β-淀粉样蛋白凝集物的显像剂，以本发明的诊断组合物结合β-淀粉样蛋白专一性显像剂使用，将可根据差异检测(differential detection)测出非β-淀粉样蛋白凝集物。因此，在一个实施方案中，以本发明的g3p融合蛋白或诊断组合物作为显像剂并结合β-淀粉样蛋白显像剂使用，以检测非β-淀粉样蛋白凝集物。

在另一实施方案中，使用本发明的诊断组合物作为显像剂来检测CNS(包括大脑)内的β-淀粉样蛋白。

本发明的诊断组合物当作为显像剂时，通常所述淀粉样蛋白的结合性融合蛋白组件必须连接至一种或多种可检测标记。利用标记蛋白质的标准技术，将各种标记连接至诊断组合物的淀粉样蛋白结合组件。标记的实例包括荧光标记和放射性标记。有许多放射性标记可使用，但一般来说，标记通常选自放射性标记，包括但不限于¹⁸F、¹¹C和¹²³I。可利用熟知化学方法将这些和其它放射性同位素连接至蛋白质。在一个实施方案中，利用正电子发射断层摄影术(PET)检测标记。然而，还可使用任何其它适于检测放射性同位素的技术来检测放射性示踪剂。

本发明的诊断组合物可使用与针对治疗组合物所述相同的途径施用。在一个实施方案中，所述诊断组合物的施用途径为鞘内施用。在另一实施方案中，所述诊断组合物的施用途径为静脉施用。

实施例

虽然丝状噬菌体作为结合与抗凝集试剂的经证实疗效并非取决于任何特定的作用机制，但理解其机制容许设计更具疗效的噬菌体。此外，其可充当制备其它抗凝集试剂的基础。

如前面所述，M13显示能结合和去凝集至少四种不同的淀粉样蛋白纤维：β-淀粉样蛋白1-42纤维(fAβ42)、α-突触核蛋白纤维(fαsyn)、酵母菌朊病毒NM纤维(fNM)和τ纤维(fτ)。构成这些淀粉样蛋白纤维的四种蛋白质具有不相关的一级氨基酸序列，但所有四种蛋白质可经错误折叠成典型的淀粉样蛋白折叠。Eichner和Radford,2011。M13结合这些淀粉样蛋白纤维中每一者并介导其去凝集的能力指示M13可识别结构基序(例如交叉β片层构象)或构象特征(例如疏水性凹槽)，其二者皆为所有淀粉样蛋白纤维的定义特征。

但淀粉样蛋白去的凝集作用并非所有噬菌体的一般特性。举例来说，构造迥异的二十面体噬菌体T7无法介导fAβ42的去凝集，即便T7在37℃下与fAβ42一起孵育三天的情况下。噬菌体T7纵使为M13可解离超过70％的共孵育淀粉样蛋白纤维的浓度，仍未显示任何解离活性。相反，相较于M13，噬菌体fd的g8p携带负电荷氨基酸(且因此鉴于g8p的拷贝数，其显示负电荷值较M13多出2800)，故其结合和去凝集fAβ42的情况类似于M13。这些初步研究连同如下发现，即烟草镶嵌病毒(TMV)大肠杆菌纤毛和T4尾管(其全部具有螺旋圆筒形状与重复单元)也可介导淀粉样蛋白去凝集(参见，US2011/0182948)，一起表明噬菌体形状对于淀粉样蛋白纤维的解离活性相当重要。

然而，下列实施例描述了丝状噬菌体结合和抗凝集特性的另一种(但并非互相排斥)机制。根据这些实施例和其所支持的作用机制，显示g3p融合蛋白具有改进的淀粉样蛋白结合作用。

实施例1：M13噬菌体优先结合Aβ原纤维

通过表面等离子共振(SPR)来测定M13对于Aβ原纤维与Aβ单体的结合作用。

M13噬菌体优先结合Aβ原纤维；其未结合于Aβ单体。使用10¹⁴个噬菌体/mL流经固定有fAβ的生物传感器芯片的表面等离子共振研究报告于图3中。图3显示M13结合作用的K_D为约4nM，其相当于单克隆抗体的结合能力。此种高亲和力相互作用表明，噬菌体与淀粉样蛋白纤维之间发生了专一性结合过程。

实施例2：M13与Ab原纤维的结合作用具有剂量依赖性

M13与fAβ42的结合作用还具有剂量依赖性。在图4A中，比较了两种噬菌体剂量与渐增摩尔量的fAβ42的结合作用。在该M13-淀粉样蛋白纤维结合测定中，将M13-Alexa488与Aβ(fAβ)混合2至3小时以形成复合物，随后以7500rpm离心10分钟以使复合物沉降。沉淀的荧光值与结合至淀粉样蛋白的M13成正比。此测定提供了噬菌体与fAβ的结合作用的定量量度，并提供了供评估其它试剂与噬菌体竞争结合的能力的系统。图4B显示M13结合竞争作用的K_D类似于使用表面等离子共振观察到的结合能力。

实施例3：M13结合至Aβ原纤维需要天然构象

将M13噬菌体于90℃下加热10分钟时，其竞争结合的能力基本上已丧失。图5显示在淀粉样蛋白纤维竞争结合测定中经热处理(方形)与天然构象(圆形)M13的结合竞争作用结果。

实施例4：温度与M13-淀粉样蛋白相互作用具有关联性

M13可有效去凝集淀粉样蛋白纤维。图6显示使用fAβ的硫代黄素T(ThT)荧光测定。在M13存在下，fAβ42去凝集。

图7A显示在ThT荧光测定中，盐浓度改变10倍(从0.15至1.5M)，仅造成fAβ去凝集百分比2至3倍的差异。这表明疏水性相互作用是所观察到的大多数去凝集的原因。

与盐浓度的相对较小影响形成对比，图7B显示温度由4℃变为37℃造成去凝集8至10倍的差异。

这些结果显示，M13的去凝集取决于如下蛋白质，其在较高温度下更具活性并且在测定中对盐的影响(是指疏水性相互作用)相对不敏感。噬菌体g3p符合此描述。其N1与N2结构域由柔性富含甘氨酸的接头连接，所述接头“开启”后续的N2与细菌F纤毛的结合。N1随后可用于结合细菌的共同受体，其为感染过程的一部分。在去凝集测定中，预计升高温度可“开启”g3p的N2与N1结构域。

虽然M13在高温下失活(90℃，10分钟，参见图5)使其结合能力丧失，但在M13-淀粉样蛋白结合测定中，升高孵育温度对于结合作用具有正面影响。图8A显示温度由18℃升至58℃时，结合能力逐渐变好，直至铰链区的未折叠T_M值为约50℃，届时结合作用开始减小。此最优选结合作用温度与g3p的N1-N2未折叠温度(所谓的熔融温度或T_M)一致，其为48.1℃。孵育温度升至50℃相比于37℃还使得M13与fAβ42更迅速地结合(图8B)。

实施例5：g3p为M13-β-淀粉样蛋白的相互作用所必需

为了直接测试g3p是否为M13-β-淀粉样蛋白的相互作用所必需，通过用ArgC进行蛋白水解处理来使g3p从噬菌体移除(M13Δg3p)，并比较M13Δg3p噬菌体与经再折叠的噬菌体的Aβ结合能力。用芽孢杆菌(Bacillus)蛋白酶ArgC处理可自噬菌体选择性地移除g3p亚基。结果于图9A中给出。在竞争结合测定中，经再折叠的M13仍可与野生型M13竞争，但程度较低。然而，如果仅相较于野生型M13，即使是15倍的M13Δg3p竞争能力仍不佳。这种与野生型M13无法竞争的情况，与M13Δg3p噬菌体感染力丧失的结果一致(图9B)。ArgC处理还造成去凝集活性的丧失(图9C)。

如果g3p介导结合作用的方式类似其于感染时的作用，那么对于感染相当重要的N1与N2结构域应也能与M13竞争结合。为了测试这一点，制备重组可溶性N1N2(“rs-g3p(N1N2)”；“构建体3”)并在竞争测定中进行测试。如图10A和10B所示，M13与经标记的M13竞争结合fAβ42，但M13Δg3p并不如此。相比之下，rs-g3p(N1N2)能够与M13竞争，表明g3p的N1与N2结构域足以用于β-淀粉样蛋白的结合作用。在重复的竞争测定中可获得类似结果(图10B)。

实施例6：g3p铰链区的未折叠突变调节淀粉样蛋白的结合作用

影响g3p的N1与N2结构域之间铰链区的开启能力的突变应也能影响具有那些突变的噬菌体与野生型M13竞争结合Aβ的能力。Eckert和Schmid，2007，描述了用于检验此假设的若干噬菌体的变体。变体“AAA”(也称为“3A”)可破坏纤毛结合能力，并降低N2结构域的稳定性。AAA使g3p中携带下列突变：W181A、F190A和F194A。IIHY含有突变T13I、T101I、Q129H和D209Y，所述突变使N2结构域稳定并使T_M升高。

评估噬菌体fd(其N1与N2结构域具有与M13g3p相同的氨基酸序列(图2))、IIHY(其铰链区Tm高于M13)和AAA的结合竞争作用。噬菌体fd、AAA和IIHY皆于50℃下预先活化1.5小时，接着比较经活化与未经活化的Fd、AAA和IIHY竞争经标记的M13的能力。图11显示了结果。当加热活化时，野生型fd为优选的竞争剂。相比之下，加热对于具有较高铰链区Tm的IIHY的影响不大。AAA(相对于M13，其N2结构域稳定性降低)无论有或没有进行加热预处理，皆为优选的竞争剂。

这些数据支持M13与β-淀粉样蛋白的相互作用是经由类似于M13感染细菌的机制的推论。首先，它们指示疏水性相互作用对于M13-β-淀粉样蛋白的相互作用相当重要。其次，M13结合作用和去凝集活性的温度依赖性反映了N1-N2铰链区的未折叠Tm。再者，g3p的选择性蛋白水解可破坏M13-β-淀粉样蛋白的相互作用。

实施例7：g3p片段选择性地且有效地结合淀粉样蛋白，而非单体

为了评估g3p片段是否保留有结合淀粉样蛋白的能力，制备含N1与N2的g3p片段并通过表面等离子共振(SPR)评估其结合Aβ原纤维与Aβ单体的能力。结果表明rs-g3p(N1N2)优先结合Aβ原纤维；其并未结合Aβ单体。使用4μM rs-g3p(N1N2)的表面等离子共振研究报告于图13中，其还显示rs-g3p(N1N2)结合作用的K_D值为约160nM。此高亲和力相互作用表明rs-g3p(N1N2)与淀粉样蛋白纤维之间发生了专一性结合过程。

通过SPR评估其它构建体。下表汇总了结果。

实施例8：g3p片段有效阻断Aβ42纤维聚集的能力

为了测试g3p片段是否能阻断淀粉样蛋白纤维聚集，在ThT荧光测定中测试了rs-g3p(N1N2)阻止fAβ42原纤维聚集的能力。结果表明rs-g3p(N1N2)可有效阻断Aβ42聚集。图14A显示此实验的结果，即rs-g3p(N1N2)以剂量依赖性方式阻止Aβ42聚集成纤维。图14B显示其IC₅₀为约20nM。

在单独的实验中，将Aβ42于37℃下以2μM浓度在有或没有rs-g3p(N1N2)的情况下孵育七天，并通过透射电子显微照相评估Aβ42纤维的完整性。图15A显示此实验的结果，即rs-g3p(N1N2)可阻断Aβ42聚集成淀粉样蛋白纤维的能力。图15B报告了这些相同样本的ThT测定结果。

实施例9：rs-g3p(N1N2)阻断α-突触核蛋白、fτ和Aβ凝集，而g3p-Ig融合蛋白阻断Aβ聚集并抑制其凝集

为了确定g3p是否能抑制α-突触核蛋白纤维聚集，以及为了确定价数(即，g3p的拷贝数)是否发挥作用，进行测定以测试五聚g3p(5个g3p拷贝)与单体g3p(1个g3p拷贝)对α-突触核蛋白活性的阻断能力。结果表明g3p可阻断α-突触核蛋白纤维聚集，并且在该活性方面五聚g3p比单体g3p更有效。参见图16。

还评估了rs-g3p(N1N2)(构建体3)与代表性g3p融合蛋白rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)抑制Aβ42聚集的能力。如图30和图31所示，构建体3和构建体6能够以剂量依赖性方式抑制fAβ42聚集。如图37所示，构建体3和构建体6能抑制fAβ42凝集。

还评估了rs-g3p(N1N2)(构建体3)抑制fτ聚集的能力。如图44A和图44B所示，构建体3能以剂量依赖性方式抑制fτ聚集。

实施例10：g3p融合蛋白结合和去凝集Aβ

为了评估g3p的价数是否在g3p结合至淀粉样蛋白的功效方面发挥作用，制备rs-g3p(N1N2)的双价Ig融合蛋白(“rs-g3p(N1N2)-Ig融合体”)，并与五价M13比较其结合至Aβ纤维的能力。如图17所示，rs-g3p(N1N2)-Ig融合体以类似于M13的亲和力结合至Aβ，并比单独rs-g3p(N1N2)更有效，表明g3p的价数可能相当重要。在重复的竞争测定中获得类似结果(图18)。在图18中，方形代表构建体2(M13)；三角形代表构建体3(rs-g3p(N1N2))；倒三角形代表构建体4(rs-g3p(N1N2)-Ig融合体)；且菱形代表阴性对照r-IgG4Fc。

为了确认本发明的g3p融合蛋白并非以非专一性方式结合至非淀粉样蛋白质和聚合物(例如，疏水性蛋白质和蛋白质聚合物)，对构建体6(50nM或200nM)测试了对非淀粉样蛋白质/聚合物酪蛋白(疏水性)、明胶(聚合物)、弹性蛋白(胶原蛋白聚合物)和牛血清白蛋白(疏水性血清蛋白)的结合作用。使用Aβ42纤维作为阳性对照。利用ELISA形式，将100ng的各测试蛋白固定于高吸附性微量滴定孔上(测试两种类型)，接着在37℃下，以构建体6或不相关的IgG1抗体阴性对照(200nM)孵育1小时。在使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人Fc抗体的阻断和洗涤步骤之后，检测结合的构建体6或IgG1阴性对照。在加入HRP显像剂之后，通过在405nm下吸收进行量化。结果显示，相较于非淀粉样蛋白聚合物或疏水性蛋白质，构建体6优先结合淀粉样蛋白纤维。构建体6结合至非淀粉样蛋白的情况堪比不相关的hIgG1阴性对照抗体。

为了评估价数是否还在去凝集中发挥作用，在滤膜截留测定中比较双价rs-g3p(N1N2)-Ig融合体(“构建体4”)与五价M13(图19)。结果表明双价rs-g3p(N1N2)-Ig融合体与五价M13两者皆可有效去凝集β-淀粉样蛋白纤维。还表明价数对于去凝集的功效可能相当重要，如由1.7nM的五价M13所减少的凝集物量的能力与40nM rs-g3p(N1N2)-Ig融合体类似所指示(图19)。

在类似的测定中，在滤膜截留测定中测定1x 10¹²个/ml M13(构建体2)；80nM与800nM rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体5)；和80nM与800nMrs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)使Aβ42纤维去凝集的能力。构建体2、5与6可有效去凝集β-淀粉样蛋白纤维(图33)。因此，g3p融合蛋白可治疗性地或预防性地用于治疗其中存在淀粉样蛋白的任何疾病或病状。

实施例11：四聚体型链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]蛋白结合和去凝集fAβ

为了进一步评估价数对g3p结合与去凝集淀粉样蛋白的能力所扮演的角色，在NiSO₄存在下，通过将rs-g3p(N1N2)与生物素-Lys-NTA组合来制备经四聚体型链霉亲和素缀合的g3p(N1N2)。使用MWCO 3KDa膜移除过量的配体。加入链霉亲和素并使用MWCO 100KDa薄膜移除过量的rs-g3p(N1N2)-生物素。所产生的g3p构建体链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]具有四个rs-g3p(N1N2)部分。在结合测定中比较了链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]与rs-g3p(N1N2)(“构建体3”)(图20)。四聚体型链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]与fAβ的结合比单体rs-g3p(N1N2)更有效，这进一步表明价数对结合功效相当重要(图20)。然而，即使单体型rs-g3p(N1N2)是以治疗上可接受的量结合至fAβ。

为了评估价数是否还在去凝集中发挥作用，在滤膜截留测定中比较了单体型rs-g3p(N1N2)与四聚体型链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)](图21)。结果表明单体型rs-g3p(N1N2)与四聚体型链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]两者皆可有效去凝集fAβ纤维。还表明价数对去凝集的功效可能相当重要，如由以下所指示，360nM的四聚体型链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]破坏200ng的fAβ凝集物的能力出众，相比之下，对照2.5μM的单体型rs-g3p(N1N2)使Aβ去凝集的能力降低。举例来说，在图21中，第2行相比于第4行。

还通过TEM评估了链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]的Aβ去凝集。在孵育三天之后，链霉亲和素-[生物素-g3p(N1N2)]可完全去凝集fAβ42(图22)。

实施例12：g3p-Ig融合蛋白显著减少阿尔茨海默氏病鼠科动物模型的先前存在的Aβ斑块

使用熟知的用于研究阿尔茨海默氏病的小鼠模型(Hsiao等,Science(1996)274:99-102；Duyckaerts等,Acta Neuropathol(2008)115:5-38)，雄性Tg2576小鼠的年龄大于500天，对海马回双侧注入(2μL/注射)两种不同的N1N2-Ig融合体(构建体5为7.8μg/注射且构建体6为8.2μg/注射)制备物或作为阴性对照的盐水，并于第7天处死。收取脑组织、切片并使用抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体(82E1；目录号MBS490005-IJ10323，购自MyBioSource)染色以用于斑块负荷的量化。如图28所示，相较于盐水处理小鼠，两种N1N2-Ig融合蛋白皆能显著减少在海马回中测量的斑块负荷。如图29所示，相较于盐水处理小鼠，两种N1N2-Ig融合蛋白皆能显著减少在大脑皮质中测量的斑块负荷。

Tg2576小鼠用构建体5和6处理后，测量海马回中突触素(突触神经元的一种成分)的量。使用抗-突触素SY38抗体(Milliporte)。已知突触素的量与突触密度相关联，且因此，其表达增加指示可从先前的斑块损伤复原。参见DaRocha-Souto等,(2011)J.Neuropathol Exp Neurol 70(5):360-376。如图40所示，两种N1N2-IgG融合蛋白皆能显著增加阿尔茨海默氏病小鼠海马回中突触素的量。结果表明除了斑块量减少以外，用N1N2-Ig融合蛋白处理阿尔茨海默氏病小鼠会产生额外的生理益处。

类似地，用构建体5和6处理Tg2576小鼠之后，使用抗-Iba-1抗体测量其海马回中Iba-1的量(据信为斑块清除时所需的小胶质细胞活化标记物(参见例如Wilcock等,(2004)J.Neurosci.24(27):6144-6151))。如图41所示，在处理7天/周之后测试时，两种N1N2-IgG融合蛋白皆能显著增加阿尔茨海默氏病小鼠海马回中Iba-1的量。此结果证实，用N1N2-Ig融合蛋白处理阿尔茨海默氏病小鼠能清除斑块。

用构建体5和6处理Tg2576小鼠之后，使用抗-GFAP抗体(Millipore编号AB5804)测量其海马回中胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(星形胶质细胞活化和大脑发炎的标记物)的量。已知GFAP的量随着大脑损伤而增加。参见例如DaRocha-Souto等,(2011)J.Neuropathol Exp Neurol 70(5):360-376，第374页。因此，GFAP可作为任何特定处理后的标记物，用来评估所述处理是否可增加GFAP的量，其量增加表明该处理可能损害大脑。如图42所示，两种N1N2-IgG融合蛋白皆未显著增加阿尔茨海默氏病小鼠海马回中GFAP的量，表明用N1N2-Ig融合蛋白处理阿尔茨海默氏病小鼠不会损害海马回。因此，g3p融合蛋白可治疗性地或预防性地用于治疗阿尔茨海默氏病。

实施例13：g3p-Ig融合蛋白阻断Aβ寡聚物诱发的细胞毒性

Aβ寡聚物会使神经元细胞释出某些有毒的酶。可测定所述酶以确定化合物是否能抑制Aβ寡聚物诱发的细胞毒性。图32显示了证实M13(构建体2)和rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)阻断寡聚物诱发的N2a细胞毒性的代表性数据。因此，g3p-Ig融合蛋白为Aβ寡聚物诱发细胞毒性的有效抑制剂。

实施例14：g3p-Ig融合蛋白结合与去凝集τ，以及减少年老3xTg小鼠与年老τ转基因小鼠的Aβ斑块与p-τ

为了评估g3p-Ig融合蛋白是否能与τ结合，制备含有N1与N2的g3p片段-Ig融合蛋白并通过表面等离子共振(SPR)评估其结合fτ的能力。图35显示一个代表性SPR测定的结果，其显示rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc(构建体4)可有效结合fτ。图48显示另一代表性SPR测定的结果，其显示rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)可有效结合fτ。

为了测试g3p-Ig融合蛋白是否能去凝集τ，在ThT荧光测定中测试含N1与N2的g3p片段-Ig融合蛋白降解预先形成的fτ的能力。结果表明g3p-Ig融合蛋白可有效去凝集fτ。参见，图36A、图36B、图49A和图49B。

为了测试g3p-Ig融合蛋白是否在体内有效，向19至20月大的雄性和雌性3xTg小鼠的大脑海马回区域中直接注射rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)或对照，所述小鼠被视为阿尔茨海默氏病模型(参见Sterniczuk等,2010Brain Res 1348:139；Sterniczuk等,2010Brain Res 1348:149)。注射7天后收取大脑组织。对切片进行免疫染色，对Aβ斑块使用抗-β-淀粉样蛋白单克隆抗体(82E1；目录号MBS490005-IJ10323，购自MyBioSource)，或对于p-τ使用抗-PHF1抗体(参见，Kosik等,1986,Proc Natl Acad Sci USA 83(11):4044；PHF＝成对螺旋状细丝)。成对螺旋状细丝为含τ纤维家族之一，其可累积于称作神经原纤维缠结的大型细胞质凝集物中并被视为τ的标记物。结果显示，相较于对照，构建体6显著减少经处理小鼠海马回中Aβ斑块的量。参见，图52A。结果还显示，相较于对照，构建体6显著减少经处理小鼠海马回中τ的量。参见，图52B。使用单尾邓奈特检验(Dunnett’s test)(*p<0.05；**p<0.01)。

为了评估本发明g3p融合蛋白在不同体内模型中减少τ的能力，对年老τ(P301L)转基因小鼠进行了研究。Τ(P301L)小鼠可过度表达τ，并被视为研究阿尔茨海默氏病的模型。参见，Lewis J等,(2000)Nat Genet 25:402-405。年老P301L小鼠因与τ病变相关联的表型而展现明显的活动减退。经由植入式鞘内泵将构建体6(约2mg/Kg)缓慢输注至τ(P301L)小鼠(N＝7)脊柱内，保持14天。14天后，以不知情的方式观察小鼠的运动活动(在10分钟内移动的距离)。经构建体6处理的小鼠显示明显更大的运动活动，而经PBS处理的小鼠并未如此。构建体6对野生型小鼠(N＝10)不产生影响。因此，本发明的g3p融合蛋白可治疗性地和/或预防性地用于其中存在τ的任何疾病或病状。

实施例15：g3p-Ig融合蛋白抑制PrP^Sc累积、凝集、以及PrP^Sc于朊病毒病细胞孵育模型中(N2a22L^Sc)的形成

朊病毒病的特征在于，将正常细胞的朊病毒(PrP^c)转变为抗蛋白酶的病理形式PrP^Sc。PrP^Sc与PrP^c根据蛋白酶抗性进行区分：蛋白酶使PrP^Sc部分降解以形成抗蛋白酶的C端核心片段(PrPres)，其具有非糖基化形式，分子量为19至21kDa。对PrP^Sc的抑制、逆转和减少构成治疗若干退化性疾病的可行治疗途径。

为了确定含N1与N2的g3p-Ig融合蛋白是否在朊病毒病的体外模型中干扰病理性朊病毒构象异构体(PrP^Sc)的形成，以及为了确认N2a22L^Sc细胞在存在或不存在g3p-Ig融合蛋白时的去凝集或PrP的溶解度变化，细胞在存在或不存在1μg/ml的构建体6或IgG时孵育24h，并以裂解缓冲液收取。在4℃下，使100μg的总蛋白质在具有TLA 100.1转子的Beckman Optima TL超高速离心机中以55,000rpm下超高速离心90分钟。对25μl的经溶解沉淀样本和上清液进行SDS-PAGE，并用抗-PrP抗体6D11mAb进行接下来的分析。洗涤剂不溶性增加先于PrP^Sc或PrP的突变体获得蛋白酶K(PK)抗性，因此对g3p-Ig融合蛋白改变PrP溶解度的能力进行了评估。相较于经IgG处理的N2a22L^Sc细胞，经构建体6处理的细胞展现明显较低量的凝集型/不溶性PrP。参见图38A和图38B。

在图38A和38B中，N2a22L^Sc细胞是如先前所述产生(Pankiewicz等,Eur.J.Neurosci.(2006)23:2635-2647)。简单来说，通过在冷磷酸盐缓冲液与5％葡萄糖的无菌条件下进行超声波处理(10％重量/体积)对感染小鼠适应型22L朊病毒株的绝症CD-1小鼠的大脑进行均质化。为了进行感染，将大脑均质物进一步于Opti-MEM中稀释至2％并以1mL/10-cm²孔加至亚汇合六孔板内(Corning,Acton,MA,USA)。在5h后，加入1mL的常规MEM，且将细胞于感染性大脑均质物的存在下再孵育12h。将细胞洗涤并加入标准MEM生长培养基。使细胞生长直至汇合，并随后分装成1:2稀释液并转移至25-cm²烧瓶(Corning)中。每隔4天，将生长于一个烧瓶中的细胞以1:2分装以生产继代，而生长于另一烧瓶中的细胞则被收取并均质化以监测PrP^Sc的量。根据先前的研究，仅能于第一代和第二代细胞中检测到源自PrP^Sc的接种体的存在，故利用第4代(P4)细胞进行后续研究。在4℃下，在由50mM Tris-HCl，pH 7.4、150mM NaCl、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、1mM Na₃V0₄、1mMNaF、2.5mM Na₄P₂O₇、1mMβ-甘油磷酸盐、1％NP-40、0.25％脱氧胆酸钠、0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、1mM亮肽素、1mM胃酶抑素A、1mM或不含PMSF(对于PK消化)组成的均质缓冲液裂解细胞5分钟，并于4℃下以10,000g离心10分钟，以移除不溶性物质。对于细胞分级分离，将100μg的蛋白质以55,000rpm旋转90分钟，此后将沉淀再复原为初始体积。对沉淀与上清液二者中的20％进行生化解析与表征。

为了解决g3p-Ig融合蛋白是否可通过去凝集或改变其物化特性而剂量依赖性地改变PrP^Sc繁殖，在存在或不存在浓度渐增的构建体6或IgG时将N2a22L^Sc细胞培养24小时，并以裂解缓冲液收取。对经与未经PK处理时裂解的细胞的等分试样进行SDS-PAGE，并用抗-PrP抗体6D11和6H4mAb进行接下来的分析。对经生化解析PK消化与未消化处理的取自对照IgG与经构建体6处理的细胞裂解液评估PrP免疫反应性。处理组别包括：N2a22L^Sc+10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.333μg/ml、0.111μg/ml、0.037μg/ml、0.012μg/ml、以及0.004μg/ml的构建体6、或N2a22L^Sc+1μg/ml mIgG。

结果表明，在构建体6存在下，PrP^Sc明显有剂量依赖性减少，其中相较于1μg/ml IgG，在0.08μg/ml的构建体6存在下产生低于50％的PrP^Sc。参见图39A和图39B。重复的实验验证了这些结果。

为了评估PrP的抗蛋白酶K(PK)的构象异构体，根据先前方法在37℃下用1:50稀释的PK(1μg/μg)处理溶解细胞的等分试样30分钟(Perrier等,J.Neurochem(2004)84:454-463,Pankiewicz等,Eur J Neurosci(2006)23:2635-2647)。在孵育之后，加入4mM PMSF以终止消化。

使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)来测定蛋白质浓度。将样本稀释于样本缓冲液(250mM Tris-HCl，pH 6.8、10％SDS、5mMβ巯乙醇、50％甘油、0.02％考马斯蓝G250)中并煮沸5分钟。经处理的样本于还原条件下以SDS-PAGE进行解析。

使用抗-PrP单克隆抗体6D11(参见，Sadowski等,(2009)Neurobiol Dis.34(2):267-278)和6H4(参见，Cordes等,(2008)J Immunol Methods337:106-120)以及抗-肌动蛋白抗体来表征样本。使用辣根过氧化物酶缀合的抗-小鼠IgG(GE Healthcare UK Limited,Buckinghamshire,UK)检测抗原-抗体复合物，并按照制造商说明书使用ECL系统(GE Healthcare UK Limited)进行显像。通过对底片进行光密度分析将蛋白质层带量化(Image J,NIH)。

综上所述，图38A与38B以及图39A与39B显示的结果证实g3p-Ig融合蛋白于体外直接抑制PrP^Sc形成的能力。因此，本发明的g3p融合蛋白可治疗性地和/或预防性地用于其中存在朊病毒的任何疾病或病状。

实施例16：NMR研究

为了评估fAβ42上与rs-g3p(N1N2)(构建体3)相互作用的残基，使用¹⁵N-HSQC NMR分析fAβ42的氢/氘(H/D)交换行为。参见例如Sanchez等,(2011)J.Am.Chem Soc 133:6505-08。测量主链酰胺氢的氢/氘(H/D)交换，以确定Aβ分子从纤维解离的速率，从而确定对淀粉样蛋白纤维展示结合的部分，并监测纤维结构是否受构建体3的结合干扰。

自¹⁵N均匀标记的Aβ单体产生成熟型淀粉样蛋白纤维(fAβ42)，并于37℃下在存在或不存在构建体3时暴露于D₂O，保持0至744小时(0至31天)。暴露于构建体3之后，将纤维冻干，并将冻干物质溶于二甲亚砜/二氯乙酸(DMSO/DCA)溶剂中。随后使用¹⁵N-HSQC NMR光谱测量各氨基酸相关的H与D的比率。由于在DMSO/DCA溶液中会进一步发生一定程度的H/D交换，因此，每次在纤维暴露于D₂O时，测量DMSO/DCA溶液中H与D的比率的时间依赖性，并将数据外推至在DMSO/DCA中的溶解时间。关于方法参见例如Whittemore等,(2005)Biochemistry 44:4434-41和Sanchez等,(2011)J.Am.Chem Soc 133:6505-08。

在存在或不存在构建体3时，以构建体3:fAβ42为1:3的化学计量比(25:75μM)进行H/D交换实验。使用10倍过量以确保饱和的结合作用。

结果表明，如先前对Aβ纤维和其它淀粉样蛋白所观察到，H/D交换并未遵循单相过程(Yamaguchi等,(2004)J.Mol.Bio 338:559-571；Sanchez等,2011)。不存在构建体3时，交换谱图显示Aβ1-42的两个延伸序列即残基17至27与31至40相对受保护而免于H/D交换。加入构建体3会加大对残基17至22与33至40的保护。因此，结果表明构建体3经由疏水性核心残基识别Aβ纤维。注意，残基18、32、36和41因信号重叠而省略其分析，而残基2、7、8、14、30和38则于DMSO/DCA溶解停滞期产生交换，因此未报告对于这些残基的影响，而其贡献仅能由邻近氨基酸的数据推断。

结果还表明，保护作用主要出现在交换受到强烈抑制而减慢的阶段。

还通过TEM分析了构建体3与fAβ42之间的相互作用。结果显示，将构建体3与预先形成的fAβ42一起孵育744小时后，无定形凝集物增多，且因此其可去凝集预先形成的fAβ42。在pH 2.0下产生的fAβ42的TEM一致显示密集的纤维网络，而为了清楚确定其形态，常需要10倍稀释。所形成的纤维为互异的个别纤维，其中观察到的缠绕和少数横向连结，类似于先前观察到的Aβ42(Olofsson等,(2006)J.Biol Chem 281:477-83)和缠绕Aβ40(Petkova等,(2005)Science 307:262-65)。无定形凝集物相对较少，而寡聚结构可于多数图像中作为次要背景种类被观察到。寡聚物与无定形凝集物以及少量的纤维皆能极频繁地在上清液的图像中观察到，且以190000RCF_MAX离心后仍存在。

在H/D交换过程期间(于pH 7.4的缓冲液中)而非离心时进行样本TEM，其显示无定形凝集物的量相对于初始制备物有所增加。无定形凝集物并未与fAβ42一起被离心下来。在744小时后，当构建体3存在时，未离心物质含有较少的纤维。因此，在744小时，构建体3可去凝集预先形成的fAβ42。

图45显示实验的示意图。图46显示与构建体3相互作用的fAβ42残基的图示。图47显示在744小时构建体3去凝集预先形成的fAβ42的代表性TEM。

实施例17：If1N1N2融合蛋白可有效结合至fAβ42

If1噬菌体与M13噬菌体的g3p的N1结构域具有大约30％同一性，但其N2结构域之间没有同一性。制备g3p N1N2-IgG-Fc融合体构建体，其中g3p的N1N2区域是源自If1噬菌体(构建体8；SEQ ID NO:31和32)。利用SPR分析构建体8，以确定其对Aβ纤维的结合亲和力。将100μM Aβ42纤维(于10mM HCl中聚集3天的重组肽Aβ1-42)与10mM NaAc pH 5.0以1:1混合，并固定在CM3表面上。将大约2μM的构建体3(N1N2g3p非融合蛋白)与构建体8溶于运行缓冲液[10mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、3mMEDTA、0.005％P20]，并以5μl/分钟流经生物芯片表面10至12分钟。所有样本皆于25℃制备。结果显示于图50A中。构建体8牢固地结合Aβ原纤维，K_D为～36nM。G3p的N1N2片段(未连接至Fc结构域)显示较弱的结合作用(K_D～36nM)。

接着，进行另一淀粉样蛋白纤维的结合测定，以比较If1N1N2g3p与M13N1N2g3p结合fAβ的能力。在此测定中，将Aβ(fAβ)与M13-Alexa488混合2至3小时以使其形成复合物，加入待测构建体(If1N1N2g3p和M13N1N2g3p；两者皆不具有Fc结构域)，随后以7500xg离心10分钟以使所述复合物沉降。沉淀荧光值与结合至淀粉样蛋白的M13成正比。此测定提供噬菌体与fAβ的结合作用的量化测定，并提供用于评估其它试剂与噬菌体竞争结合的能力的系统。图50B显示所述结果，其显示If1N1N2g3p的结合能力优于M13N1N2g3p约四倍。

实施例18：在年老Tg2576小鼠中进行全身施用时，g3p-Ig融合蛋白可减少淀粉样蛋白并改善阿尔茨海默氏病相关的行为

为了确定g3p-Ig融合蛋白是否能于全身施用时有效治疗阿尔茨海默氏病，对年老Tg2576小鼠(21至23个月大的雄性品种)腹腔内施用10mg/kg的rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)或PBS。所有小鼠皆接受抗-CD4之预处理(0.5mg，腹腔内)，以抑制rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc(构建体6)的全身施用产生的可能周围免疫反应。

在第3周时，评估小鼠的肌阵挛性角落跳跃行为(myoclonic cornerjumping)，其评估海马回、纹状体以及涉及运动协调性与控制的区域(脑干、小脑、运动皮质)的功能。参见，Lalonde和Strazielle,2012,Neurosci Res,74(2):69。此行为类似于在晚期阿尔茨海默氏病患者中看到的肌阵挛。参见，Lalonde等,2012,Rev.Neurosci,23(4):363。小鼠于新环境中观察5分钟时间段，并记录其后脚直立于兽笼角落时，出现连续跳跃和/或攀爬行为的次数。结果表明，相较于接受对照PBS的小鼠，接受构建体6的小鼠展现明显较少的肌阵挛性角落跳跃事件。参见图55。

在第6周时，通过评估总移动距离评估小鼠的过动症(参见图53A和图53B)和绕圈活动(参见图54)。这些测定通过测定其于新环境中的总移动距离来测试过动症的改善。这些行为测定模拟AD患者常见的高度激动情况。参见，Mega等,1996Neurology 46:130；以及King等,1999Brain Res,103:145。将小鼠置于40cm x 40cm的方形平台上10分钟，并用图像追踪系统实时记录其自发性的运动和行为。结果表明，相较于接受对照PBS的小鼠，接受构建体6的小鼠具有明显降低的自发性活动力。参见，图53A和53B。相较于接受对照PBS的小鼠，接受构建体6的小鼠还具有显著减少的绕圈行为。参见图54。

在第9周时，以Y型迷宫评估小鼠的自发性交替能力，其可评估啮齿动物的短期空间记忆与对新奇的探索能力。参见，Hughes,2004Neurosci和Biobehav Rev,28:497。参见图56。相对于短期记忆正常的小鼠，短期记忆受损的小鼠(例如Tg2576小鼠模型)展现较差的自发性交替能力。该任务模拟AD患者的短期记忆与空间记忆受损情况。将小鼠置于Y型迷宫中10分钟，并使用自动化基于视频的追踪追踪系统来追踪其臂进入次数。相对于接受对照PBS的小鼠，接受构建体6的小鼠在Y型迷宫中的臂进入次数展现明显更多的自发性交替，表明其记忆力改善。下方为显示PBS或构建体6的注射时间点(箭头)和行为评估的时间点(星号)的示意图。

在第10周时，处死经构建体6处理的小鼠和经PBS处理的小鼠，并以抗-Aβ抗体染色和硫代黄素S染色评估Aβ斑块负荷的减少。结果表明，全身施用g3p-Ig融合蛋白可显著减少阿尔茨海默氏病小鼠海马回中的Aβ斑块负荷。

在单独的实验中，每周对年龄>19个月的Tg2576阿尔茨海默氏病模型小鼠经腹腔内(i.p.)递送3个剂量组别(0.2mg/Kg，N＝13；2mg/Kg，N＝12；和20mg/Kg，N＝13)的构建体6，持续10周。以PBS处理组(N＝13)作为阴性对照。经构建体6处理的小鼠的自发性交替测试显示，空间记忆有剂量依赖性改善，因此，接受20mg/Kg的组别有明显改善。

综合这些结果显示，g3p-Ig融合蛋白可改善Tg2576小鼠的许多精神运动表型和认知缺陷，其类似于在中期至晚期阿尔茨海默氏病患者中所观察到的症状，以及可减少大脑中的淀粉样蛋白。因此，全身施用g3p融合蛋白可治疗性地或预防性地用于治疗阿尔茨海默氏病。

实施例19：构建体6的克隆、表达与纯化

以QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen,目录号27704)萃取M13ssDNA。以正向引物(AAAAAAGGGAATTCGATGGCTGAAACTGTTGAAAGTTG；SEQID NO:33)和反向引物(AAAAAACCATGGCACCGGAACCAGAGCCAC；SEQ ID NO:34)进行PCR来扩增M13g3p(g3pN1N2)的N1-接头-N2-接头结构域。以限制酶EcoRI-HF(New England Biolabs，目录号R3101)和NcoI-HF(New England Biolabs，目录号R3193)消化g3pN1N2PCR产物(其编码SEQ ID NO:13的氨基酸22-277)与pFUSE-hIgG1-Fc2载体(InvivoGen，目录号pfuse-hglfc2)。该载体编码IL2信号序列(SEQ ID NO:13的氨基酸1-20)、多克隆位点和人IgG1-Fc2(SEQ ID NO:13的氨基酸287-509)。使经消化的载体去磷酸化并与经消化的插入片段连接。将连接产物转化至NEB 5α感受态大肠杆菌(New England Biolabs，目录号C2987)中。由于在pFUSE-hIgG1-Fc2载体中使用多克隆位点，连接产物预期可编码位于信号序列与g3PN1N2的第一个氨基酸之间甲硫氨酸(SEQ ID NO:13的氨基酸21)。选出单菌落转化体并进行培育以供质粒制备。萃取质粒并通过限制酶消化和琼脂凝胶电泳测试插入片段的大小。以DNA定序确认IgG1Fc-g3p(N1N2)的质粒候选物。

以无内毒素的Maxi试剂盒(Qiagen)制备质粒并以过滤法除菌。如下文所述使用Expi293^TM表达系统(Life Technologies，目录号A14635)进行高产率蛋白质表达。

按照制造商的指导培养Expi293F^TM细胞。在振荡烧瓶中以30ml至0.5升的批量进行转染。在转染前一天，将细胞稀释成2x10⁶个细胞/ml。欲转染30ml的细胞悬液(2.5x10⁶个细胞/ml)，将30μg质粒DNA稀释于1.5mlOpti-MEM中并将80μl ExpiFectamine^TM 293试剂稀释于1.5ml Opti-MEM中。将质粒DNA加入ExpiFectamine^TM 293试剂中之前将各混合物孵育5分钟，之后再孵育20至30分钟。将DNA-ExpiFectamine^TM 293试剂混合物缓慢加入细胞溶液中，同时轻微摇动。在加入150μl ExpiFectamine^TM 293转染增强剂I和1.5ml ExpiFectamine^TM 293转染增强剂II之前，将细胞孵育约16小时。将细胞再孵育5至6天后收取培养基。以10,000xg离心30分钟收集细胞培养基并于4℃下保持无菌直到纯化。

使用HiTrap^TM rProtein A FF柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)纯化经表达的融合蛋白。柱以pH 3的0.1M甘氨酸-HCl洗脱缓冲液再生，以pH 7的20mM磷酸钠缓冲液平衡，并根据制造商的建议将样本加入。在以pH 7的20mM磷酸钠缓冲液洗涤之后，蛋白质以pH 3的0.1M甘氨酸-HCl缓冲液洗脱至含pH 9的Tris-缓冲液的试管中。以SDS-PAGE凝胶和随后的考马斯染色检查融合蛋白的纯度，接着将蛋白质透析至pH 7的PBS中，分别使用 Ultracel 30k旋转滤膜(EMD Millipore Corp,Billerica,MA)和Ultrafree CL旋转柱(EMD Millipore Corp,Billerica,MA)进行浓缩和滤膜除菌。所有蛋白质于使用前均保存于4℃下。

预测所产生的融合蛋白对应于SEQ ID NO:13的氨基酸21至509。经纯化的融合蛋白的肽定序显示，氨基酸序列对应于SEQ ID NO:13的氨基酸23至508，表明Met21、Ala22和Lys509于重组生产期间被Expi293F^TM细胞移除。尚不知道在其它真核生物或非真核生物表达系统中进行重组生产后是否会发生类似过程，如果发生，又达到何种程度。此加工(或缺少此加工)预期不会影响所述表达的融合蛋白结合于淀粉样蛋白的能力和使淀粉样蛋白去凝集。

实施例20：g3p-Ig融合蛋白可减少肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的淀粉样蛋白

为了确定g3p融合蛋白是否有益于减少肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的淀粉样蛋白，测试代表性g3p-Ig融合蛋白(构建体6)干扰SOD-1纤维聚集(其与ALS的病理学有关联)的能力。在存在或不存在构建体6(1.5μM、0.75μM、0.15μM)时，以100rpm搅动SOD-1单体(脱辅基酶，3.5μM溶于PBS、5mMEDTA、1mMβME)24小时。以硫代黄素T(ThT)荧光测量测定纤维形成(即，单体凝集成纤维)。不存在构建体6时，SOD-1单体形成纤维。然而，构建体6抑制SOD-1纤维的形成，IC50为～0.75μM。因此，本发明的g3p-Ig融合蛋白可于ALS模型中减少淀粉样蛋白，且因此可治疗性地和/或预防性地用于治疗ALS。

实施例21：g3p-Ig融合蛋白可减少帕金森氏病的α-突触核蛋白

为了测试本发明的g3p融合蛋白在帕金森氏病(PD)体内模型中的效用，对8个月大的人α-突触核蛋白过度表达小鼠(品系61，E.Masliah，N＝9只/组)尾部两侧注射2μL构建体6(5.3mg/mL)或PBS。还用PBS注射非转基因小鼠(N＝5)作为另一对照。所有小鼠于注射14天后处死，并收取大脑以进行神经病理学和生化分析。针对纹状体均质物中抗蛋白酶K的α-突触核蛋白的测量显示，经构建体6处理的小鼠具有明显较少的α-突触核蛋白凝集物，且酪氨酸羟化酶(多巴胺合成酶)的量显著增加，两者皆为临床改善的量度。因此，本发明的g3p融合蛋白可于帕金森氏病模型中减少淀粉样蛋白，且因此可治疗性地或预防性地用于治疗帕金森氏病。

实施例22：g3p融合蛋白可成功治疗淀粉样变性

转甲状腺素蛋白(ttr)的凝集为淀粉样变性的标志之一。为了确认本发明的g3p融合蛋白能治疗淀粉样变性，测试代表性g3p融合蛋白结合至凝集ttr的能力。Ttr以大肠杆菌表达后纯化至纯度>90％，并于37℃下在有或没有搅动(350rpm)时以0.2mg/mL孵育于凝集缓冲液(100nM乙酸钠、100mM KCl、1nM EDTA，pH4.3)中以产生凝集。所产生的纤维通过ThT荧光测定与透射电子显微镜进行验证，并连续稀释于硝化纤维素薄膜上以供蛋白质印迹分析。将薄膜与本发明的代表性g3p融合蛋白构建体6(100nM)或抗-ttr抗体一起孵育以量化结合作用。天然ttr(四聚体)和Aβ42纤维用作对照。以HRP缀合的山羊抗-人IgG抗体检测构建体6。结果显示，无论有或没有搅动，构建体6均可定量结合于ttr纤维，但无法识别天然ttr。经抗-ttr抗体处理的薄膜充当结合作用的对照，其显示凝集型与天然ttr制备物两者皆定量留存于薄膜上，且抗-ttr抗体无法识别Aβ42纤维对照。因此，g3p融合蛋白(包括构建体6)可有效结合于凝集型ttr(其与淀粉样变性的病理生理学有关联)，而无法结合于天然ttr(其为正常的生理上四聚体)。此数据证实，本发明的g3p融合蛋白可结合至ttr的淀粉样蛋白构象，且因此可治疗性地和预防性地用于治疗淀粉样变性。

Claims (53)

1.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:9的氨基酸21至238、SEQ ID NO:9的氨基酸22至238或SEQ ID NO:9的氨基酸23至238；

(b)SEQ ID NO:11的氨基酸21至238、SEQ ID NO:11的氨基酸22至238或SEQ ID NO:11的氨基酸23至238；

(c)SEQ ID NO:13的氨基酸21至238、SEQ ID NO:13的氨基酸22至238或SEQ ID NO:13的氨基酸23至238；

(d)SEQ ID NO:31的氨基酸21至296、SEQ ID NO:31的氨基酸22至296或SEQ ID NO:31的氨基酸23至296；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列的突变体或变体。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31中任一者的相对应g3p氨基酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

3.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，所述融合蛋白选自：

(a)SEQ ID NO:9的氨基酸21至506、SEQ ID NO:9的氨基酸22至506、SEQ ID NO:9的氨基酸23至506、SEQ ID NO:9的氨基酸21至505、SEQ IDNO:9的氨基酸22至505或SEQ ID NO:9的氨基酸23至505；

(b)SEQ ID NO:11的氨基酸21至506、SEQ ID NO:11的氨基酸22至506、SEQ ID NO:11的氨基酸23至506、SEQ ID NO:11的氨基酸21至505、SEQID NO:11的氨基酸22至505或SEQ ID NO:11的氨基酸23至505；

(c)SEQ ID NO:13的氨基酸21至509、SEQ ID NO:13的氨基酸22至509、SEQ ID NO:13的氨基酸23至509、SEQ ID NO:13的氨基酸21至508、SEQID NO:13的氨基酸22至508或SEQ ID NO:13的氨基酸23至508；

(d)SEQ ID NO:31的氨基酸21至528、SEQ ID NO:31的氨基酸22至528、SEQ ID NO:31的氨基酸23至528、SEQ ID NO:31的氨基酸21至527、SEQID NO:31的氨基酸22至527或SEQ ID NO:31的氨基酸23至527；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列的突变体或变体。

4.如权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中相较于SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的N端、C端、或N端与C端截断形式中任一者的相对应氨基酸，所述g3p的淀粉样蛋白结合片段具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。

5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至238；SEQ ID NO:11的氨基酸21、22或23至238；SEQ ID NO:13的氨基酸21、22或23至238；或SEQID NO:31的氨基酸21、22或23至296。

6.如权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白于人体内的免疫源性低于SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13，或SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的N端、C端、或N端与C端截断形式。

7.如权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段为所述融合蛋白的治疗成分。

8.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:13的氨基酸21至238。

9.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:13的氨基酸22至238。

10.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:13的氨基酸23至238。

11.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸21至509。

12.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸22至509。

13.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸23至509。

14.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸21至508。

15.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸22至508。

16.一种融合蛋白，其包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸23至508。

17.一种融合蛋白，其由SEQ ID NO:13的氨基酸23至508组成。

18.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其用于在有需要的患者中减少淀粉样蛋白、抑制淀粉样蛋白形成、抑制淀粉样蛋白凝集、或移除和/或预防有毒寡聚物的形成。

20.如权利要求18或19所述的药物组合物，其用于治疗选自以下的疾病或病状：阿尔茨海默氏病，包括早发性阿尔茨海默氏病、迟发性阿尔茨海默氏病和症状前阿尔茨海默氏病；帕金森氏病；SAA淀粉样变性；抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C；遗传性冰岛综合征；衰老；多发性骨髓瘤；朊病毒病，包括库鲁病、克雅氏病(CJD)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征(GSS)、致死性家族性失眠症(FFI)、羊搔痒症和牛海绵状脑炎(BSE)；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)；脊髓小脑性共济失调(SCA1、SCA3、SCA6或SCA7)；亨廷顿氏病；齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩症；脊髓延髓肌肉萎缩症；遗传性脑淀粉样血管病变；家族性淀粉样变性；额颞叶性痴呆；英国/丹麦痴呆；以及家族性脑病变。

21.如权利要求18至20中任一项所述的药物组合物，其中使用生物标记物氟罗贝它作为正电子发射断层摄影术的显像剂时，所述患者对于所述生物标记物呈阳性。

22.如权利要求18至21中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病或病状为帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿氏病。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述疾病或病状为阿尔茨海默氏病。

24.如权利要求19所述的药物组合物，其中所述疾病或病状为朊病毒病。

25.如权利要求24所述的药物组合物，其中所述朊病毒病选自克雅氏病、库鲁病、致死性家族性失眠症和杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征。

26.一种减少有需要的患者的淀粉样蛋白的方法，其包括向所述患者施用有效量的如权利要求18所述的药物组合物或如权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述患者呈现与淀粉样蛋白的存在有关的神经退化性疾病的症状。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中当使用生物标记物氟罗贝它作为正电子发射断层摄影术的显像剂时，所述患者对于所述生物标记物呈阳性。

29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述神经退化性疾病为帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或亨廷顿氏病。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述神经退化性疾病为阿尔茨海默氏病。

31.如权利要求26所述的方法，其中所述患者呈现朊病毒介导的疾病的症状。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述朊病毒介导的疾病选自克雅氏病、库鲁病、致死性家族性失眠症或杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征。

33.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:31中任一者的相对应氨基酸至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

34.如权利要求33所述的核酸序列，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:9的氨基酸21-238、SEQ ID NO:9的氨基酸22-238或SEQID NO:9的氨基酸23-238；

(b)SEQ ID NO:11的氨基酸21-238、SEQ ID NO:11的氨基酸22-238或SEQ ID NO:11的氨基酸23-238；

(c)SEQ ID NO:13的氨基酸21-238、SEQ ID NO:13的氨基酸22-238或SEQ ID NO:13的氨基酸23-238；

(d)SEQ ID NO:31的氨基酸21-296、SEQ ID NO:31的氨基酸22-296或SEQ ID NO:31的氨基酸23-296；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的氨基酸序列的突变体或变体。

35.如权利要求33或34所述的核酸序列，其包含：

(a)编码下列任一者的核酸序列：SEQ ID NO:9的氨基酸21、22或23至505或506；SEQ ID NO:11的氨基酸21、22或23至505或506；SEQ IDNO:13的氨基酸21、22或23至508或509；或SEQ ID NO:31的氨基酸21、22或23至527或528；其于5’端且在读框内融合至编码信号序列的核苷酸序列；或者

(b)(a)的核酸序列的突变体或变体，其包含与所述(a)的核酸序列至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的核酸序列；

(c)(a)的核酸的突变体或变体，其中相较于SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的N端、C端、或N端与C端截断形式中任一者的相对应氨基酸，由所述核酸编码的g3p的淀粉样蛋白结合片段具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。

36.如权利要求33至35中任一项所述的核酸序列，其选自：

(a)SEQ ID NO:26、27、28和32的核酸；

(b)简并式核酸序列，但能编码与SEQ ID NO:26、27、28和32相同的多肽；

(c)SEQ ID NO:26、SEQ I D NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:32的核苷酸，其中不包括编码所述信号序列的核酸；

(d)SEQ ID NO:26或27中任一者的核苷酸61、64或67至1521，SEQ IDNO:28的核苷酸61、64或67至1527，或SEQ ID NO:32的核苷酸61、64或67至1587；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的突变体或变体核酸序列，其包含与SEQ ID NO:26、27、28和32至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的核酸序列。

37.如权利要求35或36所述的核酸序列，其中所述经编码的融合蛋白为SEQ ID NO:9的氨基酸21至506、SEQ ID NO:11的氨基酸21至506、SEQID NO:13的氨基酸21至509或SEQ ID NO:31的氨基酸21至528，或SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:31的N端、C端、或N端与C端截断形式中任一者的变体，且其中所述变体与其相对应的氨基酸序列的不同之处仅在于所述融合蛋白的g3p部分具有1至20个氨基酸取代。

38.一种载体，其包含如权利要求33至37中任一项所述的核酸序列。

39.一种宿主细胞，其包含如权利要求38所述的载体。

40.如权利要求39所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞、动物细胞系和转基因动物细胞。

41.一种制备结合淀粉样蛋白的融合蛋白的方法，其包括表达由如权利要求38所述的载体中的核酸所编码的融合蛋白以及分离所述经表达的蛋白。

42.一种结合淀粉样蛋白的融合蛋白，其是通过表达由如权利要求38所述的载体中的核酸所编码的融合蛋白以及分离所述经表达的蛋白来制造。

43.如权利要求42所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白是通过培养如权利要求39或40所述的宿主细胞而表达。

44.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:13的氨基酸21-238。

45.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:13的氨基酸22-238。

46.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述g3p的淀粉样蛋白结合片段包含SEQ ID NO:13的氨基酸23-238。

47.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸21-509。

48.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸22-509。

49.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸23-509。

50.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸21-508。

51.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸22-508。

52.一种编码包含g3p的淀粉样蛋白结合片段和免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:13的氨基酸23-508。

53.一种编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:13的氨基酸23-508组成。