KR102101258B1 - 아밀로이드 결합 물질로서 박테리오파지 융합 단백질의 p3의 용도 - Google Patents

아밀로이드 결합 물질로서 박테리오파지 융합 단백질의 p3의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아밀로이드의 형성을 감소시키고 및/또는 아밀로이드 단백질의 분해를 촉진시키는 물질 및 약학 조성물에 관계한다. 상기 조성물을 이용하여 아밀로이드를 또한 탐지할 수 있다.

Description

아밀로이드 결합 물질로서 박테리오파지 융합 단백질의 P3의 용도{USE OF P3 OF BACTERIOPHAGE FUSION PROTEINS AS AMYLOID BINDING AGENTS}
본 발명은 실모양의(filamentous) 박테리오파지 g3p 단백질의 아밀로이드 결합 단편 또는 이러한 아밀로이드 결합 단편의 돌연변이체 또는 변이체 형태들이 포함된 융합 단백질에 관계한다. 이러한 융합 단백질을 인코드하는 핵산 분자들 및 구조체들, 이러한 핵산 분자들에 의해 형질변형된 세포들, 그리고 이러한 융합 단백질을 재조합에 의해 만드는 방법들이 포괄된다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 공개된 융합 단백질이 포함된 약학 조성물, 그리고 질환, 이를 테면 전신 및 말초 아밀로이드 질환, 신경퇴행성 타우병증(tauopathies)이 포함된 신경퇴행성 질환, 그리고 전염성 해면상 뇌병증(프리온-연합된 질환)과 같은 질환과 연합된 아밀로이드 부하(load)를 치료요법적으로 그리고 예방적으로 감소시키기 위한 이러한 조성물의 이용에 관계한다. 이들 질환과 연합된 아밀로이드 부하의 응집을 예방하기 위한 이들 조성물의 용도, 그리고 아밀로이드를 탐지하고, 이러한 질환을 진단하기 위한 진단물질로서 이러한 조성물의 이용 또한 포함된다.
실모양의 박테리오파지 M13, 그리고 관련된 실모양의 파지(phage)는 단백질 미스폴딩(misfolding) 질환의 동물 모델에서 유용성을 보여주었으며, 따라서 단백질 미스폴딩 질환의 잠재적 치료 부류가 된다. 미국 특허 공개 US 2011/0142803(이의 전문이 참고자료에 편입됨) 참고. 구체적으로, 실모양의 박테리오파지는 뇌에서 이미 형성된 아밀로이드의 제거를 중재하는 능력을 보유한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면 WO2006083795 및 WO2010060073 참고(이들의 전문이 참고자료에 편입됨).
파지의 Ff 패밀리 구성원인 M13 파지는 406개 아미노산의 성숙한 g3p를 보유한다. GenBank Ref Seq NP_510891.1은 18개의 잔기 아미노-말단 신호 서열이 포함된 기준 서열을 제공한다. 공개된 서열들과 비교하였을 때 아미노산 차이가 있는 변이체들은 흔하다. I-패밀리의 실모양의 파지는 Ff 패밀리 구성원들과는 상이하지만, 패밀리 g3p간에 여전히 상당히 보존된 g3p를 가진다. Stassen et al., J Mol Evol (1992) 34:141-52.
g3p에 대한 결정 구조는 이용가능하다. Lubkowski et al., Structure (1998) 7(6) 711-722. 상기 단백질은 유연성 글리신-풍부한 링커 서열들에 의해 분리된 3개의 폴드된(folded) 도메인을 포함한다. 262개 아미노산이 포함된 2개의 아미노-말단 도메인, N1과 N2가 있는데, 이들이 서로 상호작용하여 N1-N2 복합체가 형성된다. 카르복시-말단 (CT, N3이라고도 함) 도메인은 146개의 아미노산이며, 이는 g8p와 소수성 상호작용에 의해 파지 입자내에서 g3p를 고정시키는 역할을 한다. Marvin, Current Opin. in Structural Biology (1998) 8:150-158. N1-N2 도메인 융합 단백질 2g3p(Holliger, J Mol. Biol.(1999) 288(4):649-57)를 이용하여 만들어진 공개적으로 이용가능한 리본 구조가 도 1에 제시된다.
대부분 단백질과는 달리, g3p의 경우 고유한 생물학적 활성을 얻기 위하여 잠복기(latent) "잠긴(locked)" 형태로부터 N1과 N2 도메인의 언폴딩(unfolding)이 요구된다. Eckert & Schmid, J. Mol. Biol.(2007) 373:452-461. 감염의 초기 단계에서, N2는 N2의 외측 가장자리에 있는 잔기들을 통하여 F-섬모에 결합한다. Deng & Perham, 2002. N2에 의한 이와 같은 초기 결합은 N1-N2 복합체를 개방("opening")시켜, g3p를 잠금해제시키고("unlocks"), 그 다음 N1이 공동-수용체 TolA에 결합되는 것이 허용된다. g3p의 N1-N2 단편에서 N2가 언폴드되는 초기 잠금해제 단계의 열 전이는 48.1℃의 융점 (TM)에서 발생된다. 이 과정의 일부는 Gln212-Pro213 펩티드 결합에서 이성화(isomerization)와 관련된다. Pro213 전환(converting)은 잠금해제 상태에서 trans다. N1은 60.2℃의 TM에서 발생되는 제 2 단계까지 안정적으로 폴드된 상태로 유지된다. Eckert & Schmid, 2007 검토.
N1-N2 단편에서의 돌연변이는 다양한 돌연변이체의 안정성 및 감염성을 연구하는데 이용되어 왔었다. Eckert & Schmid, 2007. "3A"으로 지정된 한 가지 변이체는 섬모 결합이 손상되었으며, N2 도메인의 안정성을 감소시켰다. 이 돌연변이의 경우, TM은 42.6℃로 감소되었다. 3A는 다음의 돌연변이들 가진다: W181A, F190A, 그리고 F194A. N2에서의 또다른 돌연변이체인 G153D는 N2를 불안정화시켰고, TM을 44.4℃로 감소시켰다. Q129H 돌연변이체는 N2를 안정화시켰으며, TM은 51.4℃로 증가되었다. IY 변이체는 힌지(hinge)에 돌연변이 T101I 와 D209Y를 가지며, N1-N2 단편 (TM = 56.5℃)의 안정성을 증가시켰다. IHY는 돌연변이 T101I, Q129H, 및 D209Y (TM = 60.1℃)를 포함한다. IIHY는 돌연변이 T13I, T101I, Q129H, 및 D209Y (TM = 61.8℃)를 포함한다. Q129Y 및 T13I 돌연변이는 모두 안정화되고, 이들 돌연변이의 추가는 융점, TM을 더 증가시킨다. 파지 감염성은 g3p안에 도메인 상호작용의 강도에 역으로 변화되었다. Eckert & Schmid, 2007. N2 도메인의 결손 (파지 fd(ΔN2))은 TolA의 N1-결합에서 N2 도메인의 차단 효과를 제거함으로써 감염성을 증가시켰다. Id.
최근, g3p는 파지가 세균을 감염시키는 것과 유사한 방식으로 아밀로이드에 실모양의 파지 결합 또한 중재한다는 것이 밝혀졌다. WO 2013/082114에서 파지 g3p는 아밀로이드 섬유에 직접적으로 결합하고, 파지-중개된 분해(disaggregation)는 이 최초 결합 단계에 의존적임을 밝히고 있다. g3p가 실모양의 파지-중개된 아밀로이드 결합을 담당한다는 인식은 새로운 부류의 치료제 및 진단제에 대한 기준을 제공한다. 본 발명은 이러한 치료 및 진단 조성물들을 제공하고 뿐만 아니라 이들 조성물을 이용하여 아밀로이드 응집(aggregation)과 관련된 질환 및 장애를 탐지, 진단, 치료, 예방 또는 개시의 지연 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 목적 및 장점들은 다음의 설명에서 부분적으로 제시되며, 이들은 설명으로부터 명백할 것이며, 또는 본 발명의 실시에 의해 배우게 될 수도 있다. 본 발명의 목적 및 장점들은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된 요소들 및 조합들에 의해 실현되거나 획득될 것이다. 전술한 전반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 예시적이며 설명을 위함이고, 청구되는 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아님을 인지할 것이다.
도 1은 g3p의 N1 및 N2 도메인, 그리고 힌지의 리본 구조를 나타낸다.
도 2a-2c는 상이한 원천의 g3p 배열을 제시한다. 도 2a는 콘센서스(consensus) 서열 (서열번호: 4)이 포함된, 파지 M13 (서열번호: 1), fd (서열번호:2), 및 f1 (서열번호: 3)의 g3p의 배열이다. 도 2b는 I2-2와 Ike 사이에 콘센서스 서열(서열번호: 7)과 함께, 파지 I2-2 (서열번호: 5) 및 Ike (서열번호: 6)의 배열을 보여준다. 도 2c는 파지 If의 g3p의 아미노산 서열 (서열번호: 8)을 제시한다.
도 3a 및 3b는 파지 결합의 표면 플라스몬 공명 (SPR) 연구를 나타낸다. Aβ 소섬유(fibrils)에 대한 결합은 바이오센서 칩을 통하여 유동된 1014 파지/mL를 이용하여 Aβ 단량체들에 대한 결합과 비교되었다. 도 3b는 도 3a에서 보여준 SPR 데이터로부터 산출된 Ka, Kd, 및 KD 를 보여준다.
도 4a 및 4b는 결합 연구를 제시한다. 도 4a는 fAβ42의 몰량을 증가시키면서 2개의 파지 용량(doses)(1011/mL 및 1012/mL)에 대한 직접 결합 분석을 보여준다. 도 4b는 결합 경쟁 연구이며, 그리고 M13 결합에 대한 KD 를 결정하기 위한 대안을 제시한다. 구조체 1이 이용되었다.
도 5는 아밀로이드 섬유 결합 경쟁 분석에서 고유의 입체형태(conformation)(원) M13 (구조체 1)과 비교하여 열 변성된 입체 형태(네모 - 90℃에서 10 분)를 이용한 결합 경쟁 결과를 보여준다.
도 6은 2개 농도의 M13 파지 존재 또는 부재 상태에서 항온처리된 fAβ42를 이용한 티오플라빈 T (ThT) 형광 분석을 보여준다(구조체 1).
도 7a 및 7b는 ThT 분해 분석에서 개별 분석 가변 매개변수들의 효과를 보여준다. 도 7a는 2가지 염 농도 (0.15 M 및 1.5 M) 존재하에 분배 백분율을 제시한다. 도 7b는 2가지 온도 (4℃ 및 37℃)에 남아있는 fAβ의 백분율을 제시한다. 구조체 1이 이용되었다.
도 8a 및 8b는 fAβ42를 이용한 M13-아밀로이드 결합 분석을 제시한다. 도 8a에서, 3시간 동안 18℃ 내지 58℃의 항온처리 온도를 이용하여 M13 결합이 보고된다. 도 8b는 37℃ 대 50℃의 온도에서 항온처리에 대한 결합 역동학을 보여준다.
도 9a-9c는 파지-아밀로이드 상호작용에 있어서 g3p의 단백질분해성 제거 효과를 나타낸다. M13 파지로부터 g3p를 제거하기 위하여 (M13Δg3p), 프로테아제 Arg C가 이용되었다. 도 9a는 고유한 파지( ArgC-처리된 파지와 동일하게 처리되었지만, 프로테아제 처리는 없음)와 비교하여 M13Δg3p 파지를 이용한 Aβ 결합 경쟁 연구 결과를 나타낸다. 도 9b는 고유 파지와 비교하였을 때, M13Δg3p 파지의 감염성에 있어서 ArgC 처리 효과를 보여준다. 도 9c는 분해 분석에서 고유 파지에 대하여 ArgC 처리된 파지를 비교한다.
도 10a 및 10b는 본 명세서에서 재조합 가용성 N1N2 (rs-g3p(N1N2); "구조체 3")로 지칭되는 g3p의 N1-N2 단편, M13Δg3p (Arg C 처리됨), 그리고 fAβ42에 라벨된 M13 결합의 경쟁자로서 M13을 이용한 결합 경쟁 분석 결과를 제시한다. 도 10b는 경쟁 분석의 반복을 보여준다.
도 11은 파지 fd, IIHY, AAA, 및 M13의 경쟁 데이터를 제시한다. 파지 fd, AAA, 및 IIHY는 50℃에서 1.5 시간 동안 사전-활성화되었고, 그 다음 활성화된 그리고 비-활성화된 Fd, AAA, & IIHY는 37℃에서 45분의 항온처리 동안 Aβ에 결합에 있어서 라벨된 M13과 경쟁하는 이들의 능력이 비교되었다.
도 12a는 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)의 조직도(schematic)이다. 도 12b는 rs-g3p(N1N2)의 이온 교환 프로파일이다. 도 12c는 Sephacryl S-300 및 rs-g3p(N1N2)를 이용한 겔 여과 분석 결과를 보여준다. 도 12d는 g3p 및 g8p 대조와 함께 rs-g3p(N1N2)의 웨스턴 블랏(Western Blot)을 나타낸다. M13 파지는 라인 1과 2에서 양성 대조로 이용되며, g8p 및 g3p를 모두 탐지하는 다중클론 항-M13 항체로 탐지된다. 정제된 rs-g3p는 라인 3 및 4에서 이동되며, 그리고 동일한 다중클론 항-M13 항체로 탐지된다.
도 13은 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)를 이용한 SPR 데이터를 나타낸다. rs-g3p(N1N2)는 약 160 nM의 KD로 fAβ42에 강력하게 결합되지만, 단량체들에는 결합되지 않는다.
도 14는 주어진 시료 안에 존재하는 아밀로이드를 측정하는데 이용된 ThT 형광 분석을 나타낸다. 10 μM의 Aβ42 단량체들은 37℃에서 3일 동안 5가지 농도의 rs-g3p(N1N2) (구조체 3) 존재 또는 부재하에 항온처리되었다. 3일 종료시 형성된 섬유의 양은 결합된 ThT 형광을 정량화함으로써 측정되었다. IC50은 대략적으로 20 nM이며, 이는 rs-g3p(N1N2)가 Aβ42 섬유의 형성을 강력하게 저해한다는 것을 나타낸다. 이 도면은 결합이 용량-의존적임을 또한 나타낸다. 반복된 실험에서 IC50는 20nM 내지 100 nM 사이에 있다.
도 15a는 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)의 존재 또는 부재하에 fAβ42의 항온처리 전자 전달 현미경사진 (TEM) 결과를 보여준다. 도 15b는 37℃에서 7 일간 항온처리된 Aβ42 및 2μM rs-g3p(N1N2) (구조체 3)를 이용한 ThT 형광 분석 결과를 보여준다. rs-g3p(N1N2)는 fAβ42의 형성을 차단시킨다.
도 16은 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)가 α-시누클레인 섬유 형성을 강력하게 저해한다는 것을 설명한다. 25μM의 α-시누클레인은 37℃에서 4일 동안 300rpm에서 교반(agitating)됨으로써 어셈블리되었다 (막대 1 참고). 그래프의 두번째 막대는 37℃에서 3 일 동안 교반된 알파-시누클레인 단량체들과 1 x 10-13 오량체(pentameric) M13 파지를 나타낸다. 막대 2에 나타난 결과는 오량체 M13이 α-시누클레인 섬유의 어셈블리(assembly)를 차단한다는 것을 나타낸다. 그래프 상의 세번째 막대는 알파-시누클레인 단량체들 + 83 nM rsg3p 단량체들을 나타낸다. 막대 3에서 보여진 결과는 단량체들이 α-시누클레인 섬유 형성을 저해하는데 있어서 오량체 M13보다는 효과가 적다는 것을 나타낸다. 막대 4는 0시점에서 알파 시누클레인 단량체들을 보여주는 음성 대조다. 막대 5에서, α-시누클레인 섬유가 없는 g3p 단량체들은 g3p가 pTAA에 결합하는 지를 결정하고, 염료가 이 섬유에 결합하는 것을 격리시키는지를 결정하는 것으로 보인다. 막대 5에서 보여진 결과는 g3p가 pTAA에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
도 17 은 rs-g3p(N1N2) (구조체 3), M13 (구조체 2), rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc 융합 단백질 (구조체 4), 및 IgG4-Fc 음성 대조에 대한 경쟁 결합 데이터를 나타낸다.
도 18은 M13 (구조체 2; 사각형), rs-g3p(N1N2) (구조체 3; 삼각형), rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc 융합 단백질 (구조체 4; 역 삼각형), 그리고 재조합 IgG4-Fc 음성 대조 (다이아몬드)를 비교하는 경쟁 결합 데이터를 나타낸다.
도 19는 5개 농도의 Aβ42 섬유 + 또는 - 2개 농도의 M13 (구조체 2), 800 nM rs-g3p(N1N2) (구조체 3), 그리고 3개 농도의 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc 융합 단백질 (구조체 4)을 비교한 필터 트랩(filter trap) 분석을 보여준다.
도 20은 rs-g3p(N1N2) (구조체 3; "단량체") 그리고 스트랩타아비딘 결합된 rs-g3p(N1N2) ("SA[g3pN1N2]n=2-4"; "SA-g3p"; "사량체")의 경쟁 결합 데이터를 나타낸다. 37℃에서 3시간 항온처리 동안 rs-g3p(N1N2) 및 SA-g3p는 라벨된 M13와 경쟁하거나 또는 Aβ에 결합하는 이들의 능력에 대해 비교되었다.
도 21은 5개 농도의 fAβ42 + 또는 - 2개 농도의 rs-g3p(N1N2) (구조체 3; "단량체") 그리고 2개 농도의 SA-g3p ("사량체")를 비교하는 필터 트랩 분석을 보여준다.
도 22a 및 22b는 0시점에서 (도 22a) 그리고 SA-g3p과 함께 항온처리 후 3일 시점에서(도 22b) fAβ42의 TEMs를 나타낸다.
도 23은 한 가지 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc 구조체 "구조체 4" (서열번호:9)의 아미노산 서열을 보여준다. "구조체 4"의 N1N2 영역은 "구조체 1"의 N1N2 영역 (서열번호:10)으로부터 유도된다.
도 24는 또다른 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc 구조체 "구조체 5" 의 아미노산 서열을 보여준다(서열번호:11). "구조체 5"의 N1N2 영역은 "구조체 2"의 N1N2 영역 (서열번호:12)으로부터 유도된다.
도 25는 한 가지 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc 구조체 "구조체 6"의 아미노산 서열을 보여준다 (서열번호:13). "구조체 6"의 N1N2 영역은 "구조체 2"의 N1N2 영역으로부터 유도된다.
도 26은 fd (서열번호:14), f1 (서열번호:15), M13 (서열번호:16), Ike (서열번호:17), I2-2 (서열번호:18), 그리고 If1 (서열번호:19)의 N2의 아미노산 정렬을 보여준다. 별표 "*"은 단일, 완전하게 보존된 잔기를 보유한 위치를 나타낸다. 콜론 ":"은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 점수가 0.5 이상이 되는 매우 유사한 성질 집단간에 보존을 나타낸다. 점 "."은 Gonnet PAM 250 매트릭스에서 점수가 0.5이거나 또는 이보다 적은 유사성질이 빈약한 집단간에 보존을 나타낸다.
도 27a는 구조체 3의 조직도다. 도 27b는 구조체 3의 g3p 부분의 DNA 서열 (서열번호:23)을 보여준다. 도 27c는 구조체 3의 g3p 부분의 DNA 서열 (서열번호:24)을 보여준다.
도 28은 알츠하이머 질환의 유전자삽입(transgenic) 마우스 모델에서 아밀로이드 β을 감소시키는 능력에 대하여 2가지 rs-g3p(N1N2)-IgG 융합 단백질을 테스트하는 실험 결과를 보여준다. rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 모두다 알츠하이머 질환 마우스의 해마에서 아밀로이드 β 수준을 상당히 감소시켰다.
도 29는 알츠하이머 질환의 유전자삽입 마우스 모델에서 아밀로이드 β을 감소시키는 능력에 대하여 2가지 rs-g3p(N1N2)-IgG 융합 단백질을 테스트하는 실험 결과를 보여준다. rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 모두다 알츠하이머 질환 마우스의 대뇌피질에서 아밀로이드 β 수준을 상당히 감소시킬 수 있었다.
도 30a 및 30b는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)에 의한 Aβ42의 어셈블리 저해를 보여준다. 도 30a는 SDS 없이 만들어진 "고유" 아가로스 겔을 보여준다. 이 시료들은 SDS 없이 그리고 가열하지 않은 TEA 완충액에서 실시되었다. 구조체 6은 fAβ42의 어셈블리를 저해할 수 있음이 결과에서 나타난다. 도 30b는 주어진 시료 안에 존재하는 아밀로이드를 측정하는데 이용되는 ThT 형광 분석을 제시한다. 10 μM의 Aβ42 단량체들 37℃에서 1 일 동안 2가지 농도의 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 존재 또는 부재하에 항온처리되었다. 1 일 종료시 형성된 섬유의 양은 결합된 ThT 형광을 정량화함으로써 측정되었다. rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)는 Aβ42 섬유의 형성을 강력하게 저해한다. 이 도면은 구조체 6에 의한 섬유 형성 저해는 용량-의존적임을 또한 나타낸다.
도 31a, 31b, 31c, 및 31d는 대표적인 원평광 이색성(circular dichroism) 데이터를 나타내는데, 여기에서 Aβ42 어셈블리가 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)에 의해 방해된다는 것을 보여준다. 원평광 이색성은 평가되는 Aβ 섬유의 α-나선 및 β-쉬트 함량을 측정한다. 도 31a은 T= 0, T=24 시간, 및 T=48 시간 시점에서 Aβ42의 파장에 대한 타원률(ellipticity)을 나타낸다. 도 31b는 T= 0, T=24 시간, 그리고 T=48 시간 시점에서 Aβ42+구조체 3의 파장에 대한 타원률을 나타낸다. 도 31c는 대표적인 ThT 분석을 보여주는데 이때 24 내지 48 시간 사이에 형성된 섬유의 양은 결합된 ThT 형광을 정량화함으로써 측정된다. 구조체 3은 Aβ42 섬유의 형성을 강력하게 저해한다. 도 31d는 T= 0, T=24 시간, 그리고 T=48 시간 시점에서 구조체 3의 파장에 대한 타원률을 나타낸다. 이 모두를 고려할 때, 이들 데이터에서 Aβ42 어셈블리를 저해하는 구조체 3의 능력이 확인된다.
도 32는 M13 (구조체 2) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)가 N2a 세포의 올리고머-유도된 독성을 차단시킨다는 것을 보여주는 데표적인 데이터를 제시한다. 가령, Stine et al. (2003) J. Biol. Chem.278(13): 11612-11622 그리고 Stine et al. (2011) Erik D. Roberson (ed.) Alzheimer's Disease and Frontotemporal Dementia, Methods in Molecular Biology, vol. 670: 13-32 참고. N2a 세포는 처리 전 48시간 동안 혈청 절식(starvation)에 의해 분화되었다. Aβ42 올리고머 (2uM)는 N2a 세포에 추가되기 전 37℃에서 3 시간 동안 구조체 2와 구조체 6과 함께 사전-항온처리되었다. 0 시점 ("TO") 복합체들은 사전-항온처리되지 않았다. 24 시간의 항온처리 후, 아데닐레이트 키나제 ("AK") 방출이 감시되었다. 배지로의 AK 방출은 세포 사멸/용해를 나타낸다. Aβ42 올리고머들은 Stine et al., 2011에서 설명된 것과 같이 만들어졌다. 이 결과들은 M13 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc가 독성 올리고머들의 강력한 저해물질임을 나타낸다.
도 33은 6가지 농도의 Aβ42 섬유 + 또는 - 1 x 1012/ml M13 (구조체 2); 80 nm 및 800 nM rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc 구조체 (구조체 5); 그리고 80 nm 및 800 nM의 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 비교한 필터 트랩 분석을 보여준다. Aβ42 섬유는 구조체 2, 5, 및 6과 함께 37℃에서 3 일 동안 항온처리 후, 필터 지체(filter retardation)되었다. 상기 필터는 mAb 6E10 (1:15000)에 의해 탐지(probe)되었는데, 이것은 필터상에 걸린 Aβ42 섬유를 인지한다. 800nM의 구조체 5 또는 구조체 6는 분자 몰농도로 5 x 1014/ml 구조체 2에 대등하다. 구조체 2, 5, 및 6은 β-아밀로이드 섬유를 강력하게 분해시킨다는 것을 이 결과에서 나타난다.
도 34a 및 34b는 ftau와 함께 3시간의 사전-항온처리 후 fAβ42에 결합된 M13 (구조체 2)의 양을 측정하는데 이용된 대표적인 분석을 나타낸다. 구조체 2에 결합된 5 μM의 Aβ42 단량체들은 37℃에서 3 시간 동안 4가지 농도의 ftau 존재 또는 부재하에 항온처리되었다. fAbeta:M13-Alexa488 펠렛화되지만, 그러나 ftau:M13-Alexa488는 펠렛화되지 않기 때문에, 펠렛화된 물질로부터 형광 상실의 측정은 ftau가 fAbeta 결합과 경쟁하였다는 것을 나타낸다. 여기에서, 3 시간 종료시 형성된 M13-fAβ의 양은 펠렛화된 결합 경쟁 반응에서 Alexa488 형광을 정량화함으로써 측정되었다 ftau는 fAβ42 결합에 대하여 M13-Alexa488 (구조체 2)과 경쟁할 수 있음을 이 결과에서 나타난다.
도 35는 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 4)가 ftau에 결합하는 능력을 테스트하는 한 가지 대표적인 SPR 분석의 결과를 나타낸다. 구조체 4는 ftau에 강하게 결합한다는 것이 결과에서 나타난다.
도 36a 및 36b는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)가 ftau를 분해하는 능력을 보여준다. Tau 섬유는 tau의 미세관(microtubule) 결합 반복 영역 ("MTBR") 40 uM를 50 mM 수퍼옥시드 디스무타제 ("Sod")를 희석시킴으로써 준비되었다. 다양한 농도의 구조체 6과 준비된 ftau는 pH7.0, 37℃에서 72 시간 동안 아세테이트 완충액에서 항온처리되었다. ThT 형광은 5 배 과량의 ThT 존재하에서 기록되었다. 도 36a은 ftau를 분해하는 구조체 6의 능력을 보여주는 대표적인 ThT 분석 결과를 나타낸다. 도 36b는 ftau를 분해하는 구조체 6의 능력을 확인시켜주는 또다른 대표적인 실험을 나타낸다. 도 36a 및 36b는 구조체 6에 의한 ftau 분해는 용량 의존적임을 또한 보여준다.
도 37a, 37b, 37c, 및 37d는 시간의 경과에 따라 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 및 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)에 의한 Aβ 응집 저해를 보여주는 대표적인 실험을 나타낸다. Aβ42는 DMSO에 용해되었으며, NaN3가 포함된 PBS에서 희석되었다. Aβ42는 37℃ + 또는 - 다양한 농도의 구조체 3과 구조체 6에서 응집되었다. Aβ42의 응집은 ThT 형광에 의해 측정되었다. 도 37a는 시료들의 SDS PAGE를 나타낸다. 도 37b는 하나의 대표 실험 결과를 보여준다. 도 37c는 또다른 대표적인 실험 결과를 보여준다. 도 37d는 결과를 요약한 것이다.
도 38a 및 도 38b는 PrP에서 PrP-Sc로의 전환을 차단시키는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)의 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 구조체 6 및 IgG 세포 용해물은 가용성 (상청액) 종과 불용성 (펠렛) PrP 종을 구별하기 위하여 한외-원심분리되었다. PrP 종은 항-PrP 단클론성 항체 (6D11)와 함께 생화학적으로 가시화되었다. IgG 존재하에, 가용성 및 불용성 분획에서 PrP가 구분된다. 구조체 6 존재하에서, 제한된 불용성 PrP이 있다. 데이터는 n=4를 나타낸다.
도 39a 및 도 39b는 프리온 질환의 세포 배양 모델에서 PrPSc의 응집 및 축적을 감소시키는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)의 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 39a는 구조체 6와 IgG로 처리한 후 생화학적으로 해리된(resolved) 절단안된 그리고 PK-절단된 N2a22LSc 세포 용해물을 보여준다. 구조체 6의 농도를 증가시키면서 처리된 세포에서 PrPSc 수준의 상당한 감소가 명백하게 관찰된다. ~0.08μg/ml 구조체 6으로 처리하면 PrPSc 수준이 대략적으로 50% 감소된다. 10μg/ml 구조체 6으로 처리하면 PrPSc 수준은 5.725%, p<0.0001으로 감소된다. 1μg/ml 뮤린 IgG로 처리된 N2a22LSc 세포에서 PrPSc 수준의 두드러진 변화가 관찰되지는 않았다. 도 39b의 경우, X-선 필름이 후속적으로 디지털화되었으며, 100%로 간주되는 동일한 계대의 IgG 처리된 N2a22LSc 세포에서 효과로 우선 표전화되었다. PK-절단된 블랏의 밀도 측정 데이터는 대등하게 블랏된 절단안된 용해물과 비교하여 분석되었으며, 그리고 PrPSc/PrPc 변화율로 나타내었다. 데이터는 n=4를 나타낸다.
도 40은 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)로 처리 후 알츠하이머 질환의 유전자삽입 마우스 모델 해마 안에 시냅토피신(synaptophysin) 수준에 있어서, 이들 효과에 대하여 2가지 rs-g3p(N1N2)-IgG 융합 단백질을 테스트하는 실험 결과를 나타낸다. 두 구조체들은 모두 알츠하이머 질환 마우스의 해마내 시냅토피신의 수준을 상당히 증가시켰다.
도 41은 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)로 처리 후 알츠하이머 질환의 유전자삽입 마우스 모델 해마 안에 Iba-1 수준에 있어서, 이들 효과에 대하여 2가지 rs-g3p(N1N2)-IgG 융합 단백질을 테스트하는 실험 결과를 나타낸다. 두 구조체들은 모두 알츠하이머 질환 마우스의 해마내 Iba-1의 수준을 상당히 증가시켰다.
도 42는 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)로 처리 후 알츠하이머 질환의 유전자삽입 마우스 모델 해마 안에 GFAP 수준에 있어서, 이들 효과에 대하여 2가지 rs-g3p(N1N2)-IgG 융합 단백질을 테스트하는 실험 결과를 나타낸다. 알츠하이머 질환 마우스의 해마내 GFAP의 수준을 상당히 변화시킨 구조는 없었다.
도 43은 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5)와 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 비교하기 위하여 기획된 결합 실험 결과를 나타낸다. 이들 구조체는 유사한 KD 값 (~11)으로 fAβ에 강력하게 결합한다.
도 44a 및 44b는 tau의 어셈블리를 차단시키는 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)의 능력을 보여준다. 도 44a에서, 1μM tau는 단독으로 또는 1 μM의 구조체 3과 함께 공동-항온처리되었으며, 그리고 5일 후 TEM를 이용하여 분석되었다. 구조체 3은 tau의 어셈블리를 차단시킨다. 도 44b는 3가지 농도의 rs-g3p(N1N2) (구조체 3) 존재하에 또는 부재하여 항온처리된 ftau를 이용한 ThT 형광 분석 결과를 나타낸다. 구조체 3은 용량-의존적으로 tau의 어셈블리를 차단시킨다.
도 45는 fAβ42와 rs-g3p(N1N2) (구조체 3) 사이의 상호작용을 분석하기 위한 실험 조직도를 나타낸다.
도 46은 fAβ42와 rs-g3p(N1N2) (구조체 3) 사이의 상호작용을 분석하기 위한 NMR 연구 결과를 나타낸다. H는 수소를, 그리고 D는 중수소를 나타낸다. Aβ 섬유의 수소는 시간이 경과함에 따라 중수소로 교환되며, 구조체 3이 이 섬유에 결합됨으로써 상기 비율이 영향을 받게된다. 결과는 fAβ42의 잔기 17-22 및 33-40에서 구조체 3과 fAβ42 사이에 분자 반복을 나타낸다.
도 47a, 47b, 47c, 및 47d는 744 시간 동한 항온처리 후 형성된 fAβ42를 분리시키는 구조체 3의 대표적인 TEMs를 보여준다. 도 47a는 오직 fAβ42 만을 나타낸다. 도 47b는 fAβ42 + 구조체 3을 보여준다. 도 47c는 도 47a와 비교하였을 때 확대 배수가 증가된 상태에서 오직 fAβ42 만을 보여준다. 도 47d는 도 47b와 비교하였을 때 더 높은 확대 배수가 증가된 상태에서 fAβ42 + 구조체 3을 보여준다.
도 48은 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)는 ftau에 강력하게 결합된다는 것을 보여주는 대표적인 SPR 분석 결과를 보여준다.
도 49a는 ftau를 분해하는 구조체 6의 능력을 보여주는 대표적인 ThT 분석 결과를 나타낸다. 도 49b는 도 49a의 실험을 그래프로 나타낸 것이다. 도 49a 및 49 b는 구조체 6에 의한 ftau 분해는 용량 의존적임을 또한 보여준다.
도 50a는 Aβ 소섬유에 결합하는 rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 8)의 SPR 연구를 나타낸다. 구조체 8은 Aβ 소섬유 (KD ~ 36 nM)에 강력하게 결합한다는 것을 결과에서 보여준다. g3p의 N1N2 단편 (Fc 도메인에 연계되지 않음)은 더 약한 결합 (KD ~ 36 nM)을 보여주었다. 도 50b는 fAβ1-42에 결합하는 rs-g3p(If1-N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 8)의 능력을 보여주는 결합 경쟁 분석 결과를 나타낸다. g3p의 N1N2 단편 (Fc 도메인에 연계되지 않음)은 더 약한 결합을 보여주었다.
도 51은 If1 g3p (서열번호:29)와 fd g3p (서열번호:30) 사이의 아미노산 비교를 나타낸다. g3p의 N1 도메인에서 If1과 fd 사이에서 동일한 아미노산들은 음영표시된다. N1 도메인은 박스로 표시된다.
도 52a 및 52b는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 알츠하이머 질환의 생체내 모델의 뇌에 직접 주사 후 Aβ 침착 및 tau 섬유를 상당히 감소시키는 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 52a에서, 대조와 비교하였을 때, 구조체 6을 제공받았던 마우스에서 Aβ의 수준은 상당히 감소된다. 도 52b에서, 대조와 비교하였을 때, 구조체 6을 제공받았던 마우스에서 tau의 수준은 상당히 감소된다.
도 53a 및 53b는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 뇌로 직접 주사한 것보다 전신으로 제공되었을 때 AD를 치료하는 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 53a 및 53b는 대조가 제공된 마우스와 비교하였을 때 구조체 6을 제공받았던 AD 마우스는 과다활성이 감소되었음을 보여준다.
도 54는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 뇌로 직접 주사한 것보다 전신으로 제공되었을 때 AD를 치료하는 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 54에서 대조와 비교하였을 때, 구조체 6을 제공받았던 AD 마우스의 빙빙도는 능력이 감소된다.
도 55는 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 뇌로 직접 주사한 것보다 전신으로 제공되었을 때 AD를 치료하는 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 55에서 대조와 비교하였을 때, 구조체 6을 제공받았던 AD 마우스의 모퉁이를 점핑하는 능력은 상당히 감소된다.
도 56은 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)를 뇌로 직접 주사한 것보다 전신으로 제공되었을 때 AD를 치료하는 능력을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 56에서 구조체 6을 제공받은 AD 마우스는 대조 PBS를 제공받은 마우스와 비교하여 Y-형 미로에서 암 엔트리(arm entries)의 좀더 자발적인 변경을 상당히 보여주었다.
서열의 간단한 설명
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본 발명은 g3p 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체의 아밀로이드 결합 단편이 포함된 융합 단백질을 제공한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은 면역글로블린 불변 영역의 Fc 단편을 더 포함한다. 이들 구체예들의 한 측면에 있어서, 상기 융합 단백질은 가용성이다. 이들 구체예의 또다른 측면에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드의 응집 (가령, 아밀로이드 플락)을 분해하거나 및/또는 방지 또는 저해함으로써, 아밀로이드를 감소시킨다. 본 발명의 융합 단백질은 아밀로이드에 결합된다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질은 독성 올리고머들의 형성을 제거 및/또는 저해시킨다.
본 발명은 본 발명의 융합 단백질의 약학 조성물, 뿐만 아니라 아밀로이드에 결합하여 이를 감소시키는데 사용되는 용도를 제시한다. 아밀로이드의 감소는 예를 들면, 아밀로이드의 분해, 아밀로이드의 응집을 방지 및/또는 저해시키고, 그리고 독성 올리고머들의 형성을 제거 및/또는 방지하는 것을 포괄한다. 아밀로이드 침착을 탐지하고, 아밀로이드에 의해 특징화된 질환 및 장애를 진단하는데 상기 조성물의 용도가 포함된다.
정의
단독으로 사용될 때 이를 테면 "g3p-유도된"의 용어에서 용어 "g3p"은 임의의 야생형 또는 재조합 실모양의 파지 g3p 단백질 (g3p의 단편, 변이체, 및 돌연변이체 포함)을 지칭한다. 상기 용어는 임의의 특정 실모양의 박테리오파지로부터 유도된 g3p에 한정시키는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 든다면, 용어 "g3p"은 서열번호: 1 및 도 2에 나타낸 관련된 단백질을 포함한다.
용어 "도메인"은 폴리펩티드 쇄의 한 섹션을 포함하는 독립적으로 폴드된 구조가 포함된 일부 독특한 특징 또는 역할을 가진 폴리펩티드(단백질 포함)의 영역을 말한다. 도메인은 폴리펩티드의 독특한 물리적 특징의 서열을 포함하거나 또는 이의 결합 특징을 보유하는 물리적 특징의 단편 (가령, 제 2 도메인에 결합할 수 있는)을 포함할 수 있다. 한 도메인은 또다른 도메인과 연합될 수 있다. 바꿔말하면, 제 1 도메인은 자연적으로 제 2 도메인에 결합될 수 있다. 예를 들면, g3p N2 도메인은 F-섬모(pili)에 결합하고, g3p N1 도메인은 TolA에 결합한다.
본원 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "아밀로이드", "아밀로이드 소섬유", 그리고 "아밀로이드 섬유"는 임의의 몇몇 상이한 단백질의 응집에 의해 형성되고, 그리고 섬유 축에 대해 수직으로 쌓인 β 쉬트의 정도된 배열로 구성된 3차 구조의 일반명이다. Sunde et al., J. Mol. Bio.(1997) 273:729-39. 한 가지 예시적인 아밀로이드는 알츠하이머 질환에서 형성된 아밀로이드-β의 응집체(aggregate)이며, 이는 베타-아밀로이드 펩티드 "βA"을 포함하며, 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)로부터 절단된 39-43개의 아미노산 내부 단편이다. 짧은 형태, 이를 테면 Aβ40, 그리고 긴 형태, 이를 테면 좀더 섬유형성적인 Aβ 아이소폼(isoform), Aβ42이 있다. 다른 예시적인 아밀로이드 단백질은 미스폴드된 α-시누클레인 (파킨슨 질환과 연합된), 헌팅틴 (헌팅턴 질환과 연합된), tau (알츠하이머 질환과 연합된), 그리고 프리온 단백질의 비정상적인 입체 형태, PrPSc를 포함한다. 추가적인 예들이 설명을 통하여 제시되며, 이것들은 당분야 당업자들에게 공지된 것들이다 (가령, Aguzzi (2010), 그리고 Eichner and Radford, Mol. Cell (2011) 43:8-18 참고). 따라서, 단백질 또는 펩티드가 명시되지 않는 한, 용어 "아밀로이드", "아밀로이드 소섬유", 또는 "아밀로이드 섬유"의 용도는 임의의 특정 단백질 또는 질환에 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다.
용어 "g3p의 아밀로이드 결합 단편"은 아밀로이드에 결합할 수 있는 능력이 유지된 g3p의 단편을 말한다. 용어 "g3p의 아밀로이드 결합 단편"은 아밀로이드에 결합할 수 있는 능력이 유지되면서, g3p의 N-, C-, 또는 N- 및 C-말단 절두(truncations)가 포함된 g3p의 돌연변이체 및 변이체를 또한 지칭한다.
용어 "베타 아밀로이드 펩티드"은 "β-아밀로이드 펩티드", " βAP", " βA", 및 "Aβ."과 동의어다. 이들 모든 용어는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)로부터 유도된 아밀로이드 형성 펩티드를 말한다.
"분해시키는" 또는 "분해를 중재하는"으로 설명된 본 발명의 융합 단백질 또는 이들 융합 단백질이 포함된 조성물들은 이미 형성된 응집체들을 감소시킨다. 필터 트랩 분석에 의해 분해가 측정될 수 있다. Wanker et al., Methods Enzymol (1999) 309:375-86. 필터 트랩 분석이 본 명세서에서 설명되며, 응집체들을 탐지하고, 그리고 본 발명의 조성물에 의해 중개된 분해를 관찰하는데 모두 이용될 수 있다. 분해(Disaggregation)는 분해 물질의 농도를 증가시키면서 착색(staining)이 감소되는 것으로 확인되는, 필터 상의 아밀로이드 보유 감소로 탐지된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "아밀로이드를 감소시키는" 또는 "아밀로이드 부하를 감소시키는" 융합 단백질 또는 조성물은 다음중 하나 또는 그 이상의 기능을 한다: 아밀로이드 형성을 저해하고, 아밀로이드 분해를 야기시키고, 아밀로이드 청소를 촉진시키고, 아밀로이드 응집을 저해하고, 독성 아밀로이드 올리고머들의 형성을 차단 및/또는 방지시키고, 및/또는 독성 아밀로이드 올리고머들의 청소를 촉진시킨다.
"아밀로이드 손상으로부터 뉴런을 보호하는"으로 설명된 본 발명의 임의의 산물 또는 조성물은 새로운 아밀로이드의 축적을 방지하고 및/또는 독성 아밀로이드 올리고머들의 형성을 방지한다. "아밀로이드 손상으로부터 뉴런을 보호하는"으로 설명된 본 발명의 산물 또는 조성물은 예방적으로 취할 수 있다. 산물 또는 조성물이 아밀로이드 손상으로부터 뉴런을 보호할 수 있는 지는 하는 산물 또는 조성물은 본 명세서에서 설명된 것과 같이 신경 세포 배양물 세포독성 분석에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "PrP 단백질", "PrP", 및 "프리온"은 적절한 조건하에서 단백질 미스폴딩 질환의 원인이 되는 응집체 형성을 유도하는 것을 포함하는 능력을 가진 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 정상적인 세포의 프리온 단백질 (PrPc)은 이러한 조건하에서 질환 이를 테면, 소 해면모양뇌병증 (BSE), 또는 광우병, 고양잇과 고양이의 해면모양뇌병증, 쿠루병, 크로이츠펠트-야코프 질환 (CJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 질환 (GSS), 그리고 치명적 가족성 불면증 (FFI)을 포함하나 이에 국한되지 않는 질환의 원인이 되는 진전병 아이소폼 (PrPSc)으로 전환된다.
융합 단백질 또는 상기 융합 단백질의 g3p 부분의 아밀로이드 결합 단편과 연결되어 본원 명세서에서 이용된 용어 "변이체"는 기준 물질과 비교하였을 때 최소한 한개의 아미노산 차이(치환, 삽입 또는 결손)를 포함하는 대응하는 아미노산 서열을 말한다. 특정 구체예들에 있어서 "변이체"는 기준 서열과 비교하였을 때 높은 아미노산 서열 상동성(homology) 및/또는 보존적 아미노산 치환, 결손 및/또는 삽입을 가진다. 일부 구체예들에 있어서, 변이체는 기준 서열과 비교하였을 때 75개, 50개, 40개, 30개, 25개, 20개, 15개, 12개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개의 아미노산 차이를 가진다. "보존적 치환"은 상기 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산 서열, 이를 테면, 가령, g3p 단백질 또는 g3p의 아밀로이드 결합 단편의 화학적, 물리적 및/또는 기능적 성질을 실질적으로 변경시키지 않는 제2아미노산에 의해 제1 아미노산이 대체되는 것을 말한다 (가령, g3p 단백질 또는 아밀로이드 결합 단편은 동일한 전하, 구조, 극성, 소수성/친수성을 유지하거나, 및/또는 기능 이를 테면 아밀로이드를 인지하고, 이에 결합하거나 및/또는 이를 감소시키는 능력과 같은 기능을 보존한다). 이러한 보존적 아미노산 변형은 아미노산 측쇄 치환체들, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기, 그리고 이와 유사한 것들의 상대적 유사성에 기초된다. 고려되는 전술한 다양한 특징을 가지는 예시적인 보존적 치환은 당업계의 당업자들에게 공지되어 있으며, 그리고 다음이 포함된다: 아르기닌과 리신; 글루탐산염과 아스파르탐산염; 세린 및 트레오닌; 글루타민과 아스파라긴; 그리고 발린, 류신, 및 이소류신. 용어 "g3p 변이체" 또는 "g3p의 아밀로이드 결합 단편의 변이체"는 야생형 g3p 또는 이의 대응 단편에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 78%, 최소한 80%, 최소한 82%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99% 아미노산 서열 동일성(identity)을 가진 폴리펩티드를 또한 포함한다.
용어 "돌연변이체"는 이의 치료 또는 진단 효과를 조절하기 위하여 하나 또는 그 이상의 아미노산에서 돌연변이된 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질의 g3p의 아밀로이드 결합 단편을 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 돌연변이체는 아밀로이드와 상호작용하는 것으로 알려진 아미노에서 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 돌연변이체는 야생형 g3p 또는 이의 아밀로이드 결합 단편에 존재하는 보존된 아미노산인 아미노에서 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 돌연변이체는 기준 서열과 비교하였을 때 75개, 50개, 40개, 30개, 25개, 20개, 15개, 12개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개의 아미노산 차이를 가진다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 아미노산 치환은 보존적 치환이다. 용어 "변이체" 및 "돌연변이체"는 서로 호환되며, 단 "변이체"는 전형적으로 자연적으로 비-재조합적이지만, 한편 "돌연변이체"는 전형적으로 재조합적이다. 용어 "돌연변이체 g3p" 또는 "돌연g3p의 아밀로이드 결합 단편의 변이체"는 야생형 g3p 또는 이의 대응 단편에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 78%, 최소한 80%, 최소한 82%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99% 아미노산 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 또한 포함한다.
"융합 단백질"은 최소한 2개의 폴리펩티드 도메인이 포함된 비-자연적으로 생성되는 단백질이다. 본 발명의 융합 단백질은 제 2 단백질 또는 폴리펩티드에 연계된, 융합된 또는 결합된 g3p의 아밀로이드 결합 단편을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 g3p의 아밀로이드 결합 단편과 면역글로블린의 Fc 단편을 포함한다.
용어 "활성 화합물들", "활성 물질", 그리고 "활성 성분"은 본 명세서에서 호환되며, 상기 융합 단백질의 생물학적 활성을 제공하는 융합 단백질의 일부분을 지칭한다. 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분은 "활성 화합물", "활성 물질", 또는 "활성 성분"이다. 유사하게, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분은 생물학적으로 활성 또는 치료적으로 효과적인 부분이다. 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분은 융합 짝의 단백질 폴딩을 실행하는데 이용되지 않으며, g3p에 무관한 치료제로 작용하고, 이는 WO 2004/018685에 기술되어 있다. US 2009/105090에서 설명된 것과 같이 본 발명의 융합 단백질은 파지 디스플레이에 이용되지 않는다.
용어 "면역원성(immunogenic)"이란 한 조성물에 이미 노출된 포유류에서 면역 반응을 유도하는 이 조성물의 능력을 지칭하는데 이용된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "구조체 1"은 야생형 M13으로부터 유도된다(Genbank 파일: NC_003287.2, 버젼 GI:56718463 참고. 구조체 1에서 야생형 M13과 비교하여, Ser378(AGC)는 Gly(GGC)으로 변화되었으며, 그리고 Ile87 (ATT)는 Asn(AAC))으로 변화된다. 따라서, 야생형 M13에서 핵산 번호 2710의 "G"는 구조체 1의 이 위치는 "A"가 된다.　유사하게, 야생형 M13에서 핵산 번호 4479의 "A"는 구조체 1의 이 위치는 "T"가 된다. 끝으로, 야생형 M13에서 핵산 번호 4480의 "C"는 구조체 1의 이 위치는 "T"가 된다. 구조체 1은 서열번호:10의 핵산들을 포함한다.
"구조체 2"는 야생형 M13 분리주(isolate)(GenBank JX412914.1)다. 구조체 2는 서열번호:12의 핵산들을 포함한다.
"구조체 3"은 서열번호:20의 아미노산 서열이 포함된 g3p의 N1 및 N2 도메인이 포함된 재조합 가용성 g3p 단편 (rs-g3p(N1N2))이다.
"구조체 4"는 서열번호:9의 아미노산 서열이 포함된 재조합 가용성 g3p 단편 IgG4 Fc 융합 단백질(rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)이다. "구조체 4"의 N1N2 영역은 "구조체 1"의 N1N2 영역으로부터 유도된다. "구조체 4"를 인코드하는 핵산 서열은 서열번호:26에서 제시된다.
서열번호:9에서 제시된 처음 21개 아미노산은 재조합 생산 동안 아미노산 20과 21 사이에서 절단되는 신호 서열을 나타낸다. 서열번호:9의 아미노산 21의 메티오닌은 인위적 클로닝 (신호 서열을 N1-N2 서열에 융합시키기 위하여 이용된 다중 클로닝에 의해 인코드된)이며, 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:9의 아미노산 22의 알라닌은 M13 파지로부터 단리된 g3p의 N-말단 아미노산에 상응한다. 서열번호:9의 아미노산 22의 알라닌은 재조합 동안 때때로 절단된다.　 서열번호:9의 아미노산 506의 C-말단 리신은 진핵 세포에서 재조합 생산 동안 때때로 절단된다. 하나 또는 그 이상의 상기-명시된 N- 및 C-말단 결손이 포함된 산물들이 본 발명의 일부가 된다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, "구조체 4"로 설명된 g3p 융합 단백질은 구조체 4의 성숙형(Mature form)"이며, 서열번호:9의 아미노산 21-506을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 22-506을 포함한다 ("구조체 4의 N-말단 Met-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 23-506을 포함한다 ("구조체 4의 N-말단 Met-Ala-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 21-505을 포함한다 ("구조체 4의 C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 22-505을 포함한다 ("구조체 4의 N-말단 Met-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 23-505를 포함한다 ("구조체 4의 N-말단 Met-Ala-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형").
유사하게, 본원에서 설명된 바와 같이 구조체 4의 전장, N-, C-, 그리고 N- 및 C- 말단 절두된 형태를 인코드하는 핵산들 또한 포함된다. 한 구체예에 있어서, 상기 g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:26의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 신호 서열을 인코드하는 뉴클레오티드를 제외하고 (가령, 서열번호:9의 아미노산 1-20, 1-22, 또는 1-23을 인코드하는 뉴클레오티드 제외), g3p 부분, 또는 g3p-Ig 부분을 인코드하는 서열번호:26의 일부분이다.
"구조체 5" 는 서열번호:11의 아미노산이 포함된 재조합 가용성 g3p 단편 IgG4 Fc 융합 단백질 (rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc)이다. "구조체 5"의 N1N2 영역은 "구조체 2"의 N1N2 영역으로부터 유도된다. "구조체 5"를 인코드하는 핵산 서열은 서열번호:27에서 제시된다.
서열번호:11에서 제시된 처음 21개 아미노산은 재조합 생산 동안 아미노산 20과 21 사이에서 절단되는 신호 서열을 나타낸다. 서열번호:11의 아미노산 21의 메티오닌은 인위적 클로닝 (신호 서열을 N1-N2 서열에 융합시키기 위하여 이용된 다중 클로닝에 의해 인코드된)이며, 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:11의 아미노산 22의 알라닌은 M13 파지로부터 단리된 g3p의 N-말단 아미노산에 상응한다. 서열번호:11의 아미노산 22의 알라닌은 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:11의 아미노산 506의 C-말단 리신은 재조합 생산 동안 때때로 절단된다. 하나 또는 그 이상의 상기-명시된 N- 및 C-말단 결손이 포함된 산물들이 본 발명의 일부가 된다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, "구조체 5"로 설명된 g3p 융합 단백질은 구조체 5의 성숙형"이며, 서열번호:11의 아미노산 21-506을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:11의 아미노산 22-506을 포함한다 ("구조체 5의 N-말단 Met-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:11의 아미노산 23-506을 포함한다 ("구조체 5의 N-말단 Met-Ala-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:11의 아미노산 21-505를 포함한다 ("구조체 5의 C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:11의 아미노산 22-505을 포함한다 ("구조체 5의 N-말단 Met-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:11의 아미노산 23-505를 포함한다 ("구조체 5의 C-말단 Lys-절두된 성숙형").
유사하게, 본원에서 설명된 바와 같이 구조체 5의 전장, N-, C-, 그리고 N- 및 C- 말단 절두된 형태를 인코드하는 핵산들 또한 포함된다. 한 구체예에 있어서, 상기 g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:27의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 신호 서열을 인코드하는 뉴클레오티드를 제외하고 (가령, 서열번호:11의 아미노산 1-20, 1-22, 또는 1-23을 인코드하는 뉴클레오티드 제외), g3p 부분, 또는 g3p-Ig 부분을 인코드하는 서열번호:27의 일부분이다.
"구조체 6" 은 서열번호:13의 아미노산이 포함된 재조합 가용성 g3p 단편 IgG1 Fc 융합 단백질 (rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc)이다. "구조체 6"의 N1N2 영역은 "구조체 2"의 N1N2 영역으로부터 유도된다. "구조체 6"을 인코드하는 핵산 서열은 서열번호:28에서 제시된다.
서열번호:13에서 제시된 처음 21개 아미노산은 재조합 생산 동안 아미노산 20과 21 사이에서 절단되는 신호 서열을 나타낸다. 서열번호:13의 아미노산 21의 메티오닌은 인위적 클로닝 (신호 서열을 N1-N2 서열에 융합시키기 위하여 이용된 다중 클로닝에 의해 인코드된)이며, 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:13의 아미노산 22의 알라닌은 M13 파지로부터 단리된 g3p의 N-말단 아미노산에 상응한다. 서열번호:13의 아미노산 22의 알라닌은 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:13의 아미노산 509의 C-말단 리신은 재조합 생산 동안 때때로 절단된다. C-말단 리신의 제거는 항체 및 연합된 융합 단백질의 재조합 생산에서 흔하다 (J Lou et al., Biotechnol Bioeng 2012 Sep;109(9):2306-15). 하나 또는 그 이상의 상기-명시된 N- 및 C-말단 결손이 포함된 산물들이 본 발명의 일부가 된다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, "구조체 6"으로 설명된 g3p 융합 단백질은 구조체 6의 성숙형"이며, 서열번호:13의 아미노산 21-509를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:13의 아미노산 22-509를 포함한다 ("구조체 6의 N-말단 Met-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:13의 아미노산 23-509를 포함한다 ("구조체 6의 N-말단 Met-Ala-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:13의 아미노산 21-508을 포함한다 ("구조체 6의 C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:13의 아미노산 22-508을 포함한다 ("구조체 6의 N-말단 Met-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:13의 아미노산 23-508을 포함한다 ("구조체 6의 N-말단 Met-Ala-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형").
유사하게, 본원에서 설명된 바와 같이 구조체 6의 전장, N-, C-, 그리고 N- 및 C- 말단 절두된 형태를 인코드하는 핵산들 또한 포함된다. 한 구체예에 있어서, 상기 g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:28의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 신호 서열을 인코드하는 뉴클레오티드를 제외하고 (가령, 서열번호:13의 아미노산 1-20, 1-22, 또는 1-23을 인코드하는 뉴클레오티드 제외), g3p 부분, 또는 g3p-Ig 부분을 인코드하는 서열번호:28의 일부분이다.
"구조체 8" 은 서열번호:31의 아미노산이 포함된 재조합 가용성 g3p 단편 IgG1 Fc 융합 단백질 (rs-g3p(If1 N1N2)-hIgG1-Fc)이다. "구조체 8"의 g3p 영역들은 If1로부터 유도된다. "구조체 8"을 인코드하는 핵산 서열은 서열번호:32에서 제시된다.
서열번호:31은 하기에서 언급되며, 구조체 8의 아미노산을 보여준다. g3p N1 도메인은 If1로부터 유래되지만, 단 특정 If1 파지는 아래 강조되고/상자로 표시된 바와 같이 시스테인 (C) 대신 트립토판 (W)을 가지는 점이 예외이며, 한편 하기에서 나타낸 것과 같이 처음 21개의 아미노산은 Invivogen의 pFUSE Ig-융합 벡터의 일부분인 IL2 분비 서열에 상응한다. 그 다음 펼쳐진 아미노산은 굵은 글씨에 밑줄 표시되어 있으며, If1의 g3p N1 도메인에 상응한다. C→W 아미노산 변화는 강조 및 상자로 표시되어 있다. 그 다음 밑줄친 아미노산들은 g3p If1의 N1 및 N2 도메인 사이에서 발견된 링커 서열이다. If1의 g3p N2 도메인은 이태리체로 표시되어 있다. g3p N2 도메인에 이어서 제 2 링커 서열이 있는데, If1에서 N2와 N3 도메인을 연계시킨다 (이탤리체로 되어 있고, 밑줄친 부분으로 나타냄). 끝으로, 굵은 이태리체로 밑줄친 아미노산은 pFUSE 벡터의 IgG1-Fc 서열들이다.
Figure 112015042302843-pct00002
서열번호:31에서 제시된 처음 21개 아미노산은 재조합 생산 동안 아미노산 20과 21 사이에서 절단되는 신호 서열을 나타낸다. 서열번호:31의 아미노산 21의 메티오닌은 인위적 클로닝 (신호 서열을 N1-N2 서열에 융합시키기 위하여 이용된 다중 클로닝에 의해 인코드된)이며, 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:31의 아미노산 22의 알라닌은 M13 파지로부터 단리된 g3p의 N-말단 아미노산에 상응한다. 서열번호:31의 아미노산 22의 알라닌은 재조합 동안 때때로 절단된다. 서열번호:31의 아미노산 528의 C-말단 리신은 재조합 생산 동안 때때로 절단된다. C-말단 리신의 제거는 항체 및 연합된 융합 단백질의 재조합 생산에서 흔하다 (J Lou et al., Biotechnol Bioeng 2012 Sep;109(9):2306-15). 하나 또는 그 이상의 상기-명시된 N- 및 C-말단 결손이 포함된 산물들이 본 발명의 일부가 된다.
따라서, 일부 구체예들에 있어서, "구조체 8"로 설명된 g3p 융합 단백질은 구조체 8의 성숙형"이며, 서열번호:31의 아미노산 21-528을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:31의 아미노산 22-528을 포함한다 ("구조체 8의 N-말단 Met-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:31의 아미노산 23-528을 포함한다 ("구조체 8의 N-말단 Met-Ala-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:31의 아미노산 21-527을 포함한다 ("구조체 8의 C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:31의 아미노산 22-527을 포함한다 ("구조체 8의 N-말단 Met-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형"). 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 서열번호:31의 아미노산 23-527을 포함한다 ("구조체 8의 N-말단 Met-Ala-절두된, C-말단 Lys-절두된 성숙형"). "구조체 8"을 인코드하는 핵산 서열은 서열번호:32에서 제시된다
본원에서 설명된 바와 같이 구조체 8의 전장, N-, C-, 그리고 N- 및 C- 말단 절두된 형태를 인코드하는 핵산들 또한 포함된다. 한 구체예에 있어서, 상기 g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:32의 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 신호 서열을 인코드하는 뉴클레오티드를 제외하고 (가령, 서열번호:31의 아미노산 1-20, 1-22, 또는 1-23을 인코드하는 뉴클레오티드 제외), g3p 부분, 또는 g3p-Ig 부분을 인코드하는 서열번호:32의 일부분이다.
구조체 4, 5, 6, 및 8, 뿐만 아니라 이의 돌연변이체 및 변이체는 예시적인 본 발명의 g3p 융합 단백질.
G3p 융합 단백질들
본 발명의 g3p 융합 단백질은 각 융합의 활성 물질, 활성 성분, 활성 화합물, 생물학적으로 활성 부분, 치료적으로 효과적인 부분, 및/또는 약학적으로 효과적인 부분인 g3p의 아밀로이드 결합 단편을 포함한다. g3p의 돌연변이체, 변이체, 및 단편이 포함된 융합 단백질은 본 발명에 포괄된다. 한 측면에서 g3p 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하는 g3p의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질은 g3p N1N2 도메인 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 또는 단편을 포함하고, 이때 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 최소한 하나의 비-g3p 단백질에 연계된, 융합된, 결합된, 연결된(coupled), 또는 연합된다. 특정 구체예들에 있어서, 비-g3p 단백질은 면역글로블린의 Fc 단편이다. 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 WO 2004/018685에서 설명된 것과 같이 치료 융합 짝의 단백질 폴딩을 실행하기 위하여 제공되지 않으며, 또는 US 2009/105090에서 설명된 것과 같이 파지 디스플레이를 위하여 제공되지 않는다.
다른 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하는 g3p 폴리펩티드를 포함하고, 그리고 g3p N2 도메인 또는 이의 돌연변이체, 변이체를 포함하며, 여기에서 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 최소한 하나의 비-g3p 단백질에 연계된, 융합된, 결합된, 연결된, 또는 연합된다. 특정 구체예들에 있어서, 비-g3p 단백질은 면역글로블린의 Fc 단편이다. 여전히 다른 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하는 g3p 폴리펩티드를 포함하며 그리고 g3p N1N2 도메인을 포함하고, 여기에서 g3p N2 도메인은 g3p N1 도메인을 안정화시키거나, 또는 그렇지 않으면 g3p 결합할 수 있는 입체 형태로 g3p N1를 배치하는 돌연변이체, 변이체, 또는 단편 g3p N2를 포함한다.
상기 융합 단백질의 g3p 부분은 정상적으로 연합되지 않은 최소한 하나의 추가 단백질 또는 단백질 도메인에 연계된, 융합된, 결합된, 연결된, 또는 연합된다. 특정 구체예들에 있어서 본 발명의 g3p 융합 단백질의 비-g3p 부분은 면역글로블린의 Fc 단편을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로블린의 Fc 단편이 포함된 제 2 도메인에 연계된 g3p의 아밀로이드 결합 단편을 포함하는 g3p 융합 단백질이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 융합 단백질은 면역글로블린의 Fc 단편에 연계된 g3p 단백질의 아밀로이드-결합 단편으로 구성된다. 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 융합 단백질은 g3p의 돌연변이된 또는 변이된 아밀로이드-결합 단편, 이를 테면 아밀로이드 섬유에 결합하는 돌연변이된 또는 변이된 N1N2 또는 N2 도메인을 포함한다. 따라서, 돌연변이된 또는 변이된 형태가 포함된 융합 단백질 또한 본 발명의 일부분이다.
g3p의 아밀로이드 결합 단편 및 융합 짝 폴리펩티드는 g3p 또는 아밀로이드 결합 단편 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 짧은 펩티드 링커를 통하여 또는 직접 연계된 융합 짝 폴리펩티드를 가진 연속 아미노산 서열의 일부일 수도 있다. 이런 경우들에 있어서, g3p의 아밀로이드 결합 단편과 융합 짝 폴리펩티드는 g3p의 아밀로이드 결합 단편과 융합 짝 폴리펩티드를 모두 인코드하는 코딩 서열로부터 단일 폴리펩티드로 해독될 수 있다.
A. g3p 융합 단백질의 G3p 부분
G3p는 상호작용하여 N1-N2 복합체를 형성하는 2개의 아미노-말단 도메인, N1 및 N2, 그리고 한 개의 카르복시-말단 도메인, N3 ("CT"이라고도 불림)를 보유한다. 힌지에 의해 N1과 N2 사이가 개방되고, 닫힌다. 때로, 상기 힌지는 N2의 일부분으로 간주되며, 다른 경우에서는 별도의 요소로 취급된다. N1과 N2는 유연성 글리신-풍부한 링커 서열에 의해 또한 연계된다. N1 안에 Cys7와 Cys36 사이, 그리고 Cys46과 Cys53 사이에 2개의 이황화 결합 다리가 있다. Cys188과 Cys201 사이 N2에 단일 이황화결합 다리가 있다. 카르복시 말단 도메인 안에 Cys354와 Cys371 사이에 이황화결합 다리가 있다. Marvin, 1998. g3p에서 도메인간 이황화 다리는 없다.
g3p의 아밀로이드 결합 단편의 예로는 힌지를 가진 또는 힌지가 없는 N2 도메인; 그리고 중개 링커 서열을 가진 또는 중개 링커 서열이 없는 그리고 힌지를 가진 또는 힌지가 없는 N1-N2 도메인을 포함한다. 전술한 실시예들중 임의의 것에 있어서, N2 또는 N1N2 단편은 야생형 실모양의 박테리오파지에서 볼 수 있는 N2 또는 N1N2이거나 또는 재조합 N2 또는 N1N2일 수 있다. 전술한 실시예들중 임의의 것에 있어서, 상기 N2 또는 N1N2 단편은 야생형 실모양의 박테리오파지 서열의 돌연변이체 또는 변이체일 수 있다.
fd, f1, M13, Ike, I2-2, 및 If1의 N2의 1차 구조 정렬은 도 26에 나타낸다. fd의 아미노산은 서열번호:14; f1의 아미노산은 서열번호:15에; M13의 아미노산은 서열번호:16에; Ike의 아미노산은 서열번호:17에; I2-2의 아미노산은 서열번호:18에; 그리고 If1의 아미노산은 서열번호:19에 나타낸다. 지침으로 도면과 정렬을 이용하여, 본 발명의 한 구체예는 아밀로이드에 결합하는 g3p 폴리펩티드가 포함된 g3p 융합 단백질을 포함하는데, 그리고 g3p N2 도메인 또는 g3p N2 도메인의 단편을 포함한다. 일부 측면에 있어서, g3p N2 도메인은 조성물 안에 g3p의 아밀로이드 결합 부분들을 안정화시킨다. g3p N2 도메인이 포함된 임의의 g3p 융합 단백질은 g3p N2의 돌연변이체, 변이체, 그리고 단편을 포함한다. g3p N2의 단편은 N- 또는 C-말단의 하나 또는 둘 모두에 최소한 하나의 절두를 가진 임의의 전장 g3p N2 도메인이다. G3p N2 폴리펩티드들은 서열번호:14, 15, 16, 17, 18, 또는 19의 아미노산과 이의 단편, 변이체, 그리고 돌연변이체로 구체화된다.
fd, f1, 및 M13의 1차 구조 정렬은 도 2a에 나타내며, 그리고 Ike, I2-2, 및 If1의 구조 정렬은 도 2b에 나타낸다. 지침으로 도면과 정렬을 이용하여, 본 발명의 한 구체예는 아밀로이드에 결합하는 g3p 폴리펩티드가 포함된 g3p 융합 단백질을 포함하는데, 그리고 g3p N1N2 도메인 또는g3p N1N2 도메인의 단편을 포함한다. g3p N1N2 도메인이 포함된 g3p 융합 단백질은 g3p N1N2의 돌연변이체, 변이체, 그리고 단편을 포함한다. g3p N1N2의 단편은 N- 또는 C-말단의 하나 또는 둘 모두에 최소한 하나의 절두를 가진 임의의 전장 g3p N1N2 도메인이다. G3p N1N2 폴리펩티드는 서열번호:1-9, 11, 13, 20, 24, 및 29-31, 이의 단편, 변이체, 그리고 돌연변이체로 구체화된다.
B. g3p 융합 단백질의 비- g3p 부분
본 발명의 융합 단백질은 제 2 도메인으로서 면역글로블린의 Fc 단편 불변 영역을 포함할 수 있다. 관심 단백질, 또는 이의 단편에 연계된 면역글로블린 불변 영역들이 포함된 융합 단백질이 설명되었다(가령, U.S. 특허 번호 5,480,981 및 5,808,029; Gascoigne et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936; Capon et al. 1989, Nature 337:525; Traunecker et al. 1989, Nature 339:68; Zettmeissl et al. 1990, DNA Cell Bio. USA 9:347; Byrn et al. 1990, Nature 344:667; Watson et al. 1990, J. Cell. Bio . 110:2221; Watson et al. 1991, Nature 349:164; Aruffo et al. 1990, Cell 61:1303; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 173:721; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 174:561; Stamenkovic et al., 1991, Cell 66:1133; Ashkenazi et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Lesslauer et al. 1991, Eur. J. Immunol.27:2883; Peppel et al. 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Bennett et al. 1991, J. Biol. Chem.266:23060; Kurschner et al. 1992, J. Biol. Chem.267:9354; Chalupny et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10360; Ridgway and Gorman, 1991, J. Cell. Bio . 115, Abstract No.1448; Zheng et al. 1995, J. Immun.154:5590). 이들 분자는 연계된 관심 분자와 연합된 생물학적 활성 뿐만 아니라 효과물질(effector) 기능을 보통 보유하고, 또는 면역글로블린 불변 영역과 연합된 일부 다른 원하는 특징 (가령, 생물학적 안정성, 세포의 배출)을 보유한다.
시판되는 Fc 발현 카세트를 구입할 수 있다. 상기 Fc 단편은 면역글로블린의 CH2와 CH3 도메인 그리고 면역글로블린의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 상기 Fc 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 단편일 수 있다. 한 가지 특이적 구체예에 있어서, 면역글로블린 불변 영역의 부분은 IgG1의 Fc 단편이다. 또다른 구체예에 있어서, 면역글로블린 불변 영역의 부분은 IgG4의 Fc 단편이다. 여전히 또다른 구체예에 있어서, 면역글로블린 불변 영역의 부분은 IgM의 Fc 단편이다.
따라서, 한 구체예에 있어서, g3p의 재조합 가용성 아밀로이드-결합 단편은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 면역글로블린 Fc 도메인에 융합된다. g3p의 재조합 가용성 아밀로이드-결합 단편은 돌연변이되거나 또는 변이될 수 있다. 예를 들면, g3p의 아밀로이드-결합 단편, 이를 테면 N1N2 도메인 또는 N2 도메인은 IgGFc 융합 발현 벡터 안에 클론될 수 있다. 예시적인 IgGFc 융합 벡터들은 예를 들면, InvivoGen에서 이용가능한 pFUSE-Fc 벡터중 하나를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 생성된 이가(bivalent) (가령, g3p(N1N2)-IgGFc 또는 g3p(N2)-IgGFc) 융합 단백질은 아밀로이드 결합에 있어서 재조합 가용성 g3p보다 더 높은 항원항체결합력(avidity)을 가질 것인데, 그 이유는 이가이기 때문이다.
다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 g3p의 최소한 2개 아밀로이드-결합 단편을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 3개 또는 그 이상의 g3p의 아밀로이드-결합 단편을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 5개 g3p의 아밀로이드-결합 단편. 이러한 이량체 및 다량체 융합 단백질은 더 높은 항원항체결합력 상호작용을 제공하는데, 그 이유는 이들 단백질은 하나 이상의 g3p의 아밀로이드-결합 단편을 포함하기 때문이다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 알부민을 포함한다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,686,179 참고.
C. 본 발명의 예시적인 g3p 융합 단백질
일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 g3p의 아밀로이드 결합 단편이 포함된 제 1 도메인, 그리고 비-g3p 단백질 이를 테면, 가령, 면역글로블린의 Fc 단편이 포함된 제 2 도메인을 포함한다. g3p의 아밀로이드 결합 단편이 포함된 제 1 도메인은 활성 성분이며, 치료 생물학적 활성을 상기 융합 단백질에 부여한다. 일부 측면에 있어서, 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 본 명세서에서 설명된 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31 또는 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31의 N, C, 또는 N과 C 말단 절두중 임의의 하나의 g3p 부분에 최소한 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 98% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에 있어서, 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13 또는 서열번호:31의 g3p 부분과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, g3p 부분은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31에서 언급된 임의의 g3p 부분과 비교하였을 때 돌연변이체, 변이체, 또는 단편일 수 있으며, 아밀로이드에 결합할 수 있다. 또다른 측면에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 21-506, 서열번호:9의 아미노산 22-506, 서열번호:9의 아미노산 23-506, 서열번호:9의 아미노산 21-505, 서열번호:9의 아미노산 22-505, 서열번호:9의 아미노산 23-505, 서열번호:11의 아미노산 21-506, 서열번호:11의 아미노산 22-506, 서열번호:11의 아미노산 23-506, 서열번호:11의 아미노산 21-505, 서열번호:11의 아미노산 22-505, 서열번호:11의 아미노산 23-505, 서열번호: 13의 아미노산 21-509, 서열번호: 13의 아미노산 22-509, 서열번호: 13의 아미노산 23-509, 서열번호: 13의 아미노산 21-508, 서열번호: 13의 아미노산 22-508, 서열번호: 13의 아미노산 23-508, 서열번호: 31의 아미노산 21-528, 서열번호: 31의 아미노산 22-528, 서열번호: 31의 아미노산 23-528, 서열번호: 31의 아미노산 21-527, 서열번호: 31의 아미노산 22-527, 또는 서열번호: 31의 아미노산 23-527로부터 선택되며, 또는 이들 융합단백질중 임의의 돌연변이체 또는 변이체다.
또다른 측면에 있어서, 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31중 임의의 상응하는 g3p 부분과 비교하였을 때 1 내지 20개 아미노산 치환을 보유한 아미노산 서열이 포함된 돌연변이체 g3p이며, 여기에서 상기 융합 단백질은 변형안된 대응부보다 인간에서 면역원성이 덜하다. 이들 구체예의 일부 측면에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31중 임의의 상응하는 g3p 부분과 비교하였을 때 1 내지 10개 아미노산 치환을 보유한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31중 임의의 상응하는 g3p 부분과 비교하였을 때 1 내지 5개 아미노산 치환을 보유한다. 여전히 다른 측면들에 있어서, 상기 아미노산 치환은 상기 융합 단백질의 g3p 부분 (가령, 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:11의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:13의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 또는 서열번호:31의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 296)에 존재한다.
다른 구체예들에 있어서, 면역원성이 약한 융합 단백질은 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 505 또는 506, 서열번호:11의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 505 또는 506, 서열번호:13의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 508 또는 509, 또는 서열번호:31의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 527 또는 528의 변이체이며, 여기에서 상기 변이체는 서열번호:9의 아미노산 22 또는 23 내지 238, 서열번호:11의 아미노산 22 또는 23 내지 238, 서열번호:13의 아미노산 22 또는 23 내지 238, 또는 서열번호:31의 아미노산 22 또는 23 내지 296의 각 영역안에 1 내지 20개의 아미노산 치환을 가짐으로써 언급된 아미노산 서열과 상이하게 된다. 이들 구체예의 일부 측면에 있어서, 상기 융합 단백질은 1 내지 10개 아미노산 치환을 보유한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질은 1 내지 5개 아미노산 치환을 보유한다.
상기에서 언급된 면역원성이 약한 융합 단백질은 공지의 탈면역화 과정(deimmunizing processes)을 이용하여 식별될 수 있다. 전형적으로, 상기 융합 단백질의 g3p 부분들이 T-세포 에피토프를 포함하는지를 결정하기 위하여 스크리닝된다. 이러한 잠재적인 T-세포 에피토프는 MHC 클라스 II 분자들에 결합할 수 있는 능력을 가진 임의의 아미노산으로 흔히 정의된다. 다른 구체예들에 있어서, T-세포 에피토프에 대하여 전체 융합 단백질이 스크리닝된다.
당업계에서, 실험적으로 결정된 T-세포 에피토프내 인지된 서열 모티프에 대한 컴퓨터화된 수단 스캐닝에 의해 또는 대안으로 MHC 클라스 II-결합 펩티드 그리고 특히 DR-결합 펩티드를 예측하는 자동화된 기술을 이용하여 T-세포 에피토프를 탐지할 수 있는 방법들이 제시되어 왔었다. 예를 들면, WO98/52976 및 WO00/34317는 인간 MHC 클라스 II DR 동종이형(allotypes)의 하위집단에 결합하는 능력을 가진 폴리펩티드 서열을 확인하는 자동화된 트레딩(threading) 방법을 교시한다. WO08/044032는 이 서열내 T-세포 에피토프를 확인하기 위하여 공지의 T-세포 에피토프의 데이터 베이스에 대해 1차 아미노산 서열의 스크리닝을 교시한다.
대안으로, 탈면역화되는 단백질의 펩티드 부분(가령, 서열번호:9, 서열번호:11 또는 서열번호:13의 g3p 부분들)이 합성되고, 이들이 MHC 분자들에 결합할 수 있는지를 판단하기 위하여 가상환경(in silico) 또는 세포 분석 또는 생체내에서 테스트될 수 있다(가령 US 특허 7,208,147 참고).
예측된 T-세포 에피토프가 일단 확인되면, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분의 1차 서열 안에 적절한 아미노산 치환이 면역원성을 감소시키는 시도에 이용된다. 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13 그리고 서열번호:31의 g3p 부분의 이와 같은 예측된 탈면역화된 돌연변이체는 그 다음 서열번호:9, 서열번호:11 또는 서열번호:13중 임의의 g3p 부분과 비교하였을 때 면역원성이 없거나 감소된 것들을 확인하기 위하여 활성과 면역원성 둘 모두에 대하여 재-스크리닝된다. 전형적으로, 이것은 1 내지 약 20개의 아미노산 치환을 요구할 것이다.
모든 경우에서, 본 발명의 융합 단백질내 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 이의 돌연변이체 및 변이체를 포함한다.
일반적으로, 상기 융합 단백질은 대응하는 연계안된 g3p의 아밀로이드 결합 단편과 같이 최소한 효과적으로 아밀로이드에 결합한다. 적용가능할 경우, 상기 융합 단백질은 아밀로이드의 분해 중재, 아밀로이드 청소를 촉진, 아밀로이드 응집을 저해, 및/또는 독성 올리고머들의 형성을 제거 또는 방지하는데 있어서 대응하는 연계안된 g3p의 아밀로이드 결합 단편 만큼 효과적이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하고, 아밀로이드의 분해 중재, 아밀로이드 청소를 촉진, 아밀로이드 응집을 저해, 및/또는 독성 올리고머들의 형성을 제거 또는 방지하는데 있어서 서열번호:1이 포함된 재조합 가용성 g3p 만큼 효과적이다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하고, 아밀로이드의 분해 중재, 아밀로이드 청소를 촉진, 아밀로이드 응집을 저해, 및/또는 독성 올리고머들의 형성을 제거 또는 방지하는데 있어서 파지 M13 만큼 효과적이다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하고, 아밀로이드의 분해 중재, 아밀로이드 청소를 촉진, 아밀로이드 응집을 저해, 및/또는 독성 올리고머들의 형성을 제거 또는 방지하는데 있어서 파지 M13 보다 더 효과적이다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하고, 그리고 단백질 미스폴딩 질환에서 아밀로이드의 감소에 있어서 파지 M13 만큼 효과적이다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하고, 그리고 단백질 미스폴딩 질환에서 아밀로이드의 감소에 있어서 파지 M13 보더 더 효과적이다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 융합 단백질은 아밀로이드에 결합하고, 그리고 단백질 미스폴딩 질환에서 아밀로이드의 감소에 있어서 파지 M13 만큼 효과적이거나 또는 더 효과적이다.
융합 단백질은 당업계 공지된 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 융합 단백질은 세포 안에서 재조합에 의해 합성될 수 있다 (가령, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.그리고 Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 참고). 대안으로, 본 발명의 융합 단백질은 공지의 합성 방법들, 이를 테면 고형 상 합성을 이용하여 합성될 수 있다. 합성 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (가령, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis and Panayotis eds.) pp.335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc.85:2149; Davis et al. 1985, BioChem. Intl. 10:394; Finn et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:257; U.S. 특허 번호 3,941,763 참고. 대안으로, 최종 구조체는 재조합에 의해 생산된 융합 단백질과 기본적으로 동일한 기능을 공유할 수 있지만, 그러나 비-재조합 기술, 이를 테면 결찰 화학을 이용하여 단순히 생산될 수 있다. 상기 융합 단백질의 성분들은 g3p 발현 및 g3p 돌연변이에서 설명된 동일한 전반적인 방법을 이용하여 만들어질 수 있다.
D. g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 g3p의 아밀로이드 결합 단편이 포함된 본 발명의 융합 단백질을 인코드하는 핵산 서열을 제공하며, 여기에서 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13 또는 서열번호:31의 g3p 부분에 대해 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 최소한 98% 동일한 아미노산 서열을 보유한 돌연변이체 또는 변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편을 포함한다. 이들 구체예들의 한 측면에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호:26, 서열번호:27, 서열번호:28 및 서열번호:32 (차례로 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 및 서열번호:31를 인코드하는 실제 핵산 서열), 또는 전술한 것중 하나와 동일한 폴리펩티드를 인코드하지만 축중(degenerative)인 핵산 서열에서 선택된다. 이들 구체예의 또다른 측면에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열의 5' 말단에서 그리고 신호서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 틀내에 융합된 서열번호:26, 서열번호:27, 서열번호:28 또는 서열번호:32 (가령, 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 505, 또는 506, 서열번호:11의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 505 또는 506, 서열번호:13의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 508 또는 509 또는 서열번호:31의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 527 또는 528 중 임의의 하느를 인코드하는 핵산 서열) 또는 전술한 것중 하나와 동일한 폴리펩티드를 인코드하지만 축중인 핵산 서열의 부분을 인코드하는 g3p-Ig로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서 상기 신호 서열은 포유류다.
이들 구체예의 또다른 측면에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열의 5' 말단에서 그리고 신호서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 틀내에 융합된 서열번호:26, 서열번호:27, 서열번호:28 또는 서열번호:32 (가령, 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:11의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:13의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238 또는 서열번호:31의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 296 중 임의의 하느를 인코드하는 핵산 서열) 또는 전술한 것중 하나와 동일한 폴리펩티드를 인코드하지만 축중인 핵산 서열의 부분을 인코드하는 g3p로부터 선택된다. 일부 구체예들에 있어서 상기 신호 서열은 포유류다.
일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:26, 서열번호:27, 서열번호:28 및 서열번호:32를 포함하며, 여기에서 상기 신호 서열 (가령, 서열번호: 9, 11, 13, 또는 31중 임의의 것중 아미노산 1-20, 1-21, 또는 1-22)를 인코드하는 상기 핵산은 제외된다. 특정 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질을 인코드하나, 신호 서열을 인코드하는 뉴클레오티드는 제외한 상기 핵산은 i) 서열번호:26 또는 27중 임의의 뉴클레오티드 61, 64, 또는 67 내지 1521; ii) 서열번호:28의 뉴클레오티드 61, 64, 또는 67 내지 1527; 그리고 iii) 서열번호:32의 뉴클레오티드 61, 64, 또는 67 내지 1587에서 선택된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 핵산 서열은 g3p N1N2 도메인 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 단편을 인코드한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 서열번호:9, 서열번호:11 서열번호:13, 또는 서열번호:31중 임의의 것의 g3p 부분과 비교하였을 때 1 내지 20개 아미노산 치환을 보유한 아미노산 서열이 포함된 융합 단백질을 인코드하는 핵산 서열을 제공하며, 여기에서 상기 융합 단백질은 인간에서 서열번호:9, 서열번호:11 서열번호:13, 또는 서열번호:31중 임의의 것의 g3p 부분보다 면역원성이 덜하다. 이들 구체예의 일부 측면에 있어서, 상기 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31의 g3p 부분과 비교하였을 때 1 내지 10개 아미노산 치환을 보유한다. 이들 구체예의 다른 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질을 인코드하는 핵산은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31의 g3p 부분과 비교하였을 때 1 내지 5개 아미노산 치환을 보유한다. 이들 구체예의 여전히 다른 측면들에 있어서, 상기 핵산 서열은 폴리펩티드를 인코드하며 여기에서 상기 아미노산 치환은 상기 융합 단백질의 g3p 부분 (가령, 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:11의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:13의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 또는 서열번호:31의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 296, 또는 이의 돌연변이체, 변이체 또는 단편)에 모두 존재한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 505 또는 506, 서열번호:11의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 505 또는 506, 서열번호:13의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 508 또는 509, 또는 서열번호:31의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 527 또는 528 임의의 하나의 변이체이며, 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 서열번호:31보다 면역원성이 덜한 융합 단백질이 인코드된 핵산 서열을 제공하며 , 여기에서 상기 변이체는 단지 g3p 영역 (가령, 차례로 서열번호:9의 아미노산 21, 22, 또는 23 내지 238, 서열번호:11의 아미노산 22 또는 23 내지 238, 서열번호:13의 아미노산 22 또는 23 내지 238, 또는 서열번호:31의 아미노산 22 또는 23 내지 296)에서 1 내지 20개 아미노산 치환을 보유함으로써 이의 대응하는 아미노산 서열과 상이하다. 이들 구체예의 일부 측면에 있어서, 상기 융합 단백질이 인코드된 핵산 서열은 1 내지 10개의 이러한 아미노산 치환을 보유한다. 다른 측면들에 있어서, 상기 융합 단백질이 인코드된 핵산 서열은 1 내지 5개의 이러한 아미노산 치환을 보유한다.
E. 돌연변이체 g3p 융합 단백질
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 돌연변이체 g3p의 아밀로이드-결합 단편이 포함된 융합 단백질에 관계한다. 돌연변이체 g3p의 아밀로이드-결합 단편이 포함된 융합 단백질이 생산될 수 있고, 또는 본 출원에서 설명된 약학 조성물의 치료 효과에 기여하는 성질에 대해 선택될 수 있다. 예를 들면, g3p의 아밀로이드-결합 단편은 재조합에 의해 돌연변이되거나 또는 그렇지 않으면 M13의 g3p와 비교하여 다음 성질중 하나 또는 그 이상을 보유하는 것으로 선택될 수 있다: 아밀로이드 결합에 있어서 친화력 증가, 힌지 TM 감소, 항원항체결합력 증가(항원항체결합력은 이용가능한 모든 아밀로이드 결합의 합을 설명하는데 이용되어, 항원항체결합력과 친화력이 구별되며 이때 g3p는 하나 이상의 아밀로이드 결합 부위를 포함한다), 아밀로이드 응집체를 분해하는 능력의 증가, 또는 아밀로이드의 소섬유의 응집을 방지하는 능력의 증가. 대안으로, 또는 추가로, g3p의 돌연변이체 아밀로이드 단편은 본 명세서의 도체에서 설명된 기타 유용한 성질들을 포함할 수 있다.
g3p의 돌연변이체 아밀로이드 단편은 파지의 돌연변이유발, 또는 재조합 기술, 이를 테면 PCR-기반 부위 지향된 돌연변이유발 또는 무작위 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다.
g3p의 아밀로이드 결합 단편, 가령, N1N2 도메인 또는 N2 도메인은 재조합 기술을 이용하여 또한 돌연변이될 수 있으며, 본 발명의 융합 단백질 안에 혼입될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 것과 같이 g3p 또는 이의 아밀로이드 결합 단편 (가령, N1N2 또는 N2)을 가지는 벡터는 PCR-기반의 돌연변이유발 전략을 이용하여 돌연변이될 수 있다. 인코드된, 돌연변이된 단백질이 발현되며, 이 돌연변이체의 아밀로이드 결합 및 친화력은 설명된 것과 같이 평가된다.
돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 또한 돌연변이체 g3p로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, g3p를 돌연변이시키고, 및/또는 바람직한 성질을 가진 돌연변이된 g3p를 선택하고, 그 다음 이로부터 원하는 아밀로이드 결합 단편은 가령 단백질용해와 이어서 정제를 통하여 얻는다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질은 M13의 대응하는 돌연변이안된 g3p 단편, 또는 대응하는 돌연변이안된 g3p 융합 단백질의 결합보다 최소한 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 또는 심지어 1000배 더 높은 친화력으로 아밀로이드에 결합하는 돌연변이체 g3p의 아밀로이드-결합 단편을 포함한다. 다른 구체예들에 있어서, 돌연변이체 g3p 아밀로이드-결합 단편이 포함된 상기 융합 단백질은 M13의 대응하는 돌연변이안된 g3p 단편, 또는 대응하는 돌연변이안된 g3p 융합 단백질의 결합의 최소한 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 만큼 강력하게 아밀로이드-결합을 유지한다. 일부 구체예들에 있어서 대응하는 돌연변이안된 형태보다 더 낮은 아밀로이드-결합 친화력을 나타내는 돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 또한 대응하는 돌연변이안된 형태와 비교하였을 때 개선된 또다른 생물학적 성질(가령, 아밀로이드를 분해하는 능력이 더 크고; 아밀로이드 소섬유의 응집을 방해하는 능력이 더 크고) 또는 약학 성질 (가령, 더 큰 대사 안정성, 우호적인 약동학 프로파일, 더 큰 용해도) 을 보유한다. 아밀로이드 결합은 실시예에서 설명된 것과 같이 표면 플라스몬 공명 또는 경쟁적 ELISA에서 평가될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, g3p의 아밀로이드 단편의 변이체 및/또는 돌연변이체는 높은 엄격성(stringency) 또는 중간 엄격성 조건하에 M13 g3p에 혼성화되는 관련 DNAs를 선택하기 위하여 M13 g3p에 혼성화를 이용하여 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, g3p의 돌연변이된 아밀로이드 단편이 포함된 본 발명의 g3p 융합 단백질은 재조합에 의해 생산되며, 그리고 돌연변이안된 g3p 폴리펩티드와 비교하여 최소한 하나의 아미노산 잔기가 상이하지만, 그러나 여전히 아밀로이드에 결합하는 g3p의 아밀로이드 결합 단편을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 개별 점 돌연변이는 g3p 폴리펩티드의 특정 잔기에서 돌연변이안된 g3p의 아미노산과 이 잔기에서 대체 아미노산의 제시에 의해 명시된다. 예를 들면, "F194A"은 성숙 M13 서열 (서열번호:1)의 위치 194에 있는 페닐알라닌이 알라닌으로 변화되었음을 의미한다. 다른 구체예들에 있어서, 돌연변이된 g3p는 돌연변이된 g3p가 아밀로이드 소섬유에 결합한다는 내용과 함께, 특정 아미노산 서열에 대한 아미노산 유사성을 명시함으로써 기술된다. 이들 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 돌연변이된 융합 단백질의 g3p 부분은 서열번호:1의 대응 부분의 전장에 대하여 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일성을 공유한다. 돌연변이된 g3p의 아밀로이드 결합 단편이 포함된 본 발명의 이들 구체예에 있어서, 상기 돌연변이된 아밀로이드-결합 단편은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호: 31의 전장에 걸쳐 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일성을 공유한다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 또다른 서열에 최소한 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한지는 공지의 컴퓨터 프로그램, Bestfit 프로그램을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 특정 서열이 본원 발명에 따른 기준 서열에 예를 들면 95% 동일한 지를 판단하기 위하여 Bestfit 또는 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 때, 문제의 서열에 대하여 상동성인 기준 아미노산 서열 부분 전장에 대해 동일성 비율이 산출되도록 매개변수가 설명된다.
다양한 측면의 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질의 g3p 부분의 돌연변이체 아밀로이드 결합 단편은 Ff 패밀리, I-패밀리, 또는 Ff 와 I-패밀리 모두의 g3p 대응 부분중 보존된 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함하지 않는다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 Ff 패밀리, I-패밀리, 또는 Ff 와 I-패밀리 모두의 g3p 대응 부분중 보존된 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 Ff 패밀리, I-패밀리, 또는 Ff 와 I-패밀리 모두의 g3p 대응 부분중 보존안된 많아야 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다. 여전히 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 I22, Ike, 및 If1중 하나 또는 그 이상의 대응 부분 간에 보존되지 않은 많아야 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다. 여전히 다른 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 Ff 패밀리, I-패밀리, 또는 Ff 와 I-패밀리 모두의 g3p 대응 부분중 보존안된 기껏해야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 돌연변이는 N1 도메인 안에 위치한다. 일부 구체예들에 있어서, 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 돌연변이는 N2 도메인 안에 위치한다. 일부 구체예들에 있어서, 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 돌연변이는 N2 도메인 안에 위치하지만, 힌지 영역 안에는 없다.
부위 지향된 돌연변이유발은 g3p, N1N2, 또는 N2 도메인의 안정성에 중요한 것으로 알려진 잔기들을 표적으로 할 수 있다. 예를 들면, D94 및 T95; E115; N122; L125; E126 및 E127; E127 및 E128; Q129; Q145; T154 및 T156; Q157; T159 및 D160; K163 및 T164; Y166; 그리고 E196 및 D197에서 알라닌 대체 돌연변이는 F-섬모(pili)에 파지의 결합에 심각하게 영향을 주지 않는 것으로 이미 알려졌다, Deng & Perham, 2002. 따라서, 이들 위치는 돌연변이에 잘 견디며(tolerant), 이들 위치중 하나 또는 그 이상에서 돌연변이는 본 발명의 g3p 융합 단백질의 아밀로이드-결합 능력을 강화시키거나 또는 중립적인 효과를 가질 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 D94, T95, E115, N122, L125, E126, E127, E128, Q129, Q145, T154, T156, Q157, T159, D160, K163, T164, Y166, E196, 또는 D197 ( 서열번호:1에 대하여)에서 돌연변이된 g3p 아밀로이드-결합 단편이 포함된 g3p 융합 단백질을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 D94, T95, E115, N122, L125, E126, E127, E128, Q129, Q145, T154, T156, Q157, T159, D160, K163, T164, Y166, E196, 또는 D197에서 상기 돌연변이는 독점적으로 알라닌으로의 돌연변이는 아니다.
F194; F190 및 H191; K184, R186, 및 D187; R142 그리고 R144에서 알라닌 대체 돌연변이는 F-섬모에 결합을 감소시키는 것으로 이미 설명되었다, Deng & Perham, 2002. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에서 돌연변이는 다음 잔기들중 하나 또는 그 이상이 포함되지 않은 돌연변이로부터 선택된다: R142, R144, W181, K184, R186, D187, F190, H191, 또는 F194 (서열번호:1에 대하여 번호매김). 그러나, R142, R144, W181, K184, R186, D187, F190, H191, 또는 F194가 비-알라닌 잔기로 대체되면 아밀로이드 결합이 증가될 수 있다. 따라서, 한 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 R142, R144, W181, K184, R186, D187, F190, H191, 또는 F194에서 비-알라닌 돌연변이다. 한 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 F194에서 비-알라닌 돌연변이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 F190 및 H191에서 비-알라닌 돌연변이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 K184, R186, 및 D187에서 비-알라닌 돌연변이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 W181에서 비-알라닌 돌연변이다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 R142 및 R144에서 비-알라닌 돌연변이다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이는 배타적으로 T13I, T101I, Q129H, G153D, W181A, F190A, F194A, 및 D209Y중 하나, 일부 또는 전부는 아니다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에서 상기 돌연변이는 N2 도메인의 표면에 위치한 하나 또는 그 이상의 잔기에 있으며, 이는 F-섬모에 결합하는 g3p의 부분이다. 한 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 N2 도메인의 외측 테에 있는 하나 또는 그 이상의 잔기에 있다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이는 N1 도메인의 표면에 위치한 하나 또는 그 이상의 잔기에 있으며, 이는 TolA에 결합하는 g3p 부분이다. 한 구체예에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에 있는 돌연변이는 N1 도메인의 외측 테에 위치한 하나 또는 그 이상의 잔기에 있다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 g3p의 하나 또는 그 이상의 용매 접근가능한 잔기들에 있다. 여전히 또다른 구체예에 있어서, 상기 돌연변이(들)은 Pro213에서 cis/trans 평형을 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% trans로 이동시킨다. 따라서, 일부 구체예들에 있어서, g3p 융합 단백질은 Pro213에서 최소한 50, 최소한 60, 최소한 70, 최소한 80, 최소한 90, 또는 최소한 95% trans인 cis/trans 평형을 가진 돌연변이된 g3p를 포함한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에서 g3p의 아밀로이드 결합 단편은 구조적으로 보존된 잔기에서의 돌연변이를 포함하지 않는다. 구조적으로 보존된 잔기들의 예로는 잠재적 서열 삽입에도 불구하고, Ff 및 I-패밀리 구성원 모두에서 도메인 구조를 제공하는 것과 관련된 잔기들이 포함된다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에서 만들어진 임의의 돌연변이는 아밀로이드 결합을 보존한다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이는 프롤린 잔기를 대체하지 않는다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에서 만들어진 임의의 돌연변이는 아밀로이드 결합을 보존하고, 그리고 시스테인 잔기를 대체하지 않는다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이는 g3p 안에서 발견되는 이황화 다리중 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개 또는 4개 모두를 보존시킨다. 따라서, 한 구체예에 있어서, 임의의 돌연변이는 N1에서 Cys7과 Cys36 사이, 그리고 Cys46과 Cys53 사이의 2개 이황화 결합을 보존시킨다. 또다른 구체예에 있어서, 임의의 돌연변이는 N1에서 Cys7와 Cys36 사이, 그리고 Cys46과 Cys53 사이의 이황화 다리 둘 모두를 보존시키지 않고, 이중 하나를 보존시킨다. 한 구체예에 있어서, Cys188과 Cys201 사이의 이황화 다리가 보존된다. 일부 구체예들에 있어서, Cys7과 Cys36, Cys46과 Cys53, 그리고 Cys188과 Cys201 사이의 각 이황화 다리가 보존된다. 한 구체예에 있어서, 상기 돌연변이들은 Cys354와 Cys371 사이의 이황화 다리를 보존시킨다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 돌연변이들은 Cys7과 Cys36, Cys46과 Cys53, Cys188과 Cys201, 그리고 Cys354와 Cys371 사이의 이황화 다리를 보존시킨다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질의 g3p 부분에서 만들어진 임의의 돌연변이는 아밀로이드 결합을 보존시키고, N1N2의 융점 (TM)을 감소시킨다. 실시예들에서 설명된 임의의 방법을 이용하여 TM이 측정될 수 있다. N1N2의 TM을 감소시키는 돌연변이체는 Aβ에 대해 더 나은 결합을 나타내고, Aβ 어셈블리를 더 많이 저해하는 것으로 예측되며, 그리고 분해 분석에서 M13의 g3p로서 최소한 효과적인 것으로 기대된다. 따라서, g3p의 돌연변이체 아밀로이드 결합 단편이 포함된 이러한 융합 단백질은 하나 또는 그 이상의 단백질 미스폴딩 질환을 치료하는데 있어서, M13의 대응하는 서열, g3p의 대응하는 돌연변이안된 아밀로이드 결합 단편이 포함된 융합 단백질, 그리고 고유 M13과 치료요법적으로 최소한 대등한 효과를 가지는 것으로 기대된다.
돌연변이체 g3p의 아밀로이드 결합 단편이 포함된 융합 단백질은 표적화 서열이 포함되도록 또한 기획될 수 있다. 이러한 표적화 서열들은 N1N2 사이, 또는 N2와 N2 융합 단백질에서 또다른 도메인 사이의 유연성 링커 영역 안으로 삽입될 수 있다. 핵 국소화 서열들 (NLS)을 표적으로 하는 것이 헌팅턴 질환에서 유익할 수 있다. 엔도솜(endosome)을 표적화하는 것이 파킨슨 질환에서 유익할 수 있다.
세포에서 특정 영역을 표적화하는 것에 추가하여, 상이한 종류의 아밀로이드를 표적화하기 위하여 표적화 서열들이 이용될 수 있다. 핵을 이루는(Nucleating) 서열들은 특정 아밀로이드에 대한 친화력을 증가시키고, 상기 돌연변이체 단백질을 특정 아밀로이드로 지향시킬 수 있다. 본 발명의 g3p 융합 단백질에서 펩티드 서열이 소수성이어서 이들 자체가 침전되는 펩티드 서열들이 포함되도록 g3p의 다른 돌연변이체 아밀로이드 결합 단편이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 강화된 다중 결합 서열들을 보유하는 키메라 단백질을 만들기 위하여 다수의 AVVAI 서열들이 g3p에 첨가될 수 있거나 또는 이의 아밀로이드 결합 단편 (가령, N2 및 N1N2) 및/또는 이들의 융합 단백질에 첨가될 수 있다. 아밀로이드에 결합하고, 그리고 g3p의 상기 돌연변이체 또는 키메라 아밀로이드 결합 단편 안에 혼힙될 수 있는 펩티드의 일부 실시예와, 그리고 이들 g3p의 돌연변이체 또는 키메라 아밀로이드 결합 단편이 포함된 융합 단백질은 Sato, Biochemistry (2006) 45:5503-16에서 설명된 GxFxGxF (서열번호:21) 틀(framework)과 Tjernberg et al., J. Biol. Chem.(1996) 271:8545-48에서 설명된 KLVFF (서열번호:22) 펩티드에 기반된 펩티드 저해제들이다. 기타 표적화 모이어티들이 공지되어 있으며, 본 발명에 또한 이용될 수 있다. 가령, Sciarretta et al., Methods in Enzymology (2006) 413:273-312 참고. 용어 "변이체"와 "돌연변이체"는 본 명세서에서 서로 호환되며, 단 "변이체"는 전형적으로 자연적으로 비-재조합적이지만, 한편 "돌연변이체"는 전형적으로 재조합적이다.
재조합 기술
일반적으로, g3p 융합 단백질 (뿐만 아니라 돌연변이체와 이의 변이체)을 인코드하는 DNA는 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 준비되며, g3p 유전자의 클로닝, 직접 DNA 합성이 관련될 수 있으며, 또는 프로브로서 예를 들면, M13 서열을 이용하여 라이브러리로부터 대응하는 DNA의 단리에 의해 준비될 수 있다. (가령, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 및 Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. 참고).
재조합 생산을 위하여, 본 발명의 g3p 융합 단백질, 또는 이의 아밀로이드 결합 단편이 인코딩된 핵산 서열은 삽입된 코딩 서열의 전사 및 해독을 위한 필수 요소들이 포함된 적절한 발현 벡터 안에 삽입되거나, 또는 RNA 바이러스성 벡터의 경우 복제 및 해독을 위한 필수 요소들이 포함된 적절한 발현 벡터 안에 삽입된다. 상기 코딩 핵산은 적절한 판독 틀에서 벡터 안으로 삽입된다.
따라서, 본 발명은 g3p 융합 단백질의 돌연변이체 및 변이체가 포함된 본 명세서에서 공개된 g3p 융합 단백질이 인코드된 폴리뉴클레오티드를 포함한 벡터를 제공한다. g3p 또는 g3p-융합 분자가 인코드된 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터들이 또한 제공된다. 이러한 벡터들로는 DNA 벡터들, 파지 벡터들, 바이러스성 벡터들, 레트로바이러스성 벡터들, 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
재조합 발현을 위한 예시적인 세포 유형은 다음이 포함된다: 베큘로바이러스(Baculovirus) 계통이 포함된 곤충 세포; 피치아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 그리고 아스퍼길러스(Aspergillus) 세포가 포함된 곰팡이 세포; 대장균(E. coli ) 세포가 포함된 세균성 세포; NSO, CHO, HEK293, COS, HeLa가 포함된 동물 세포 계통, 또는 임의의 기타 확립된 동물 세포 계통; 그리고 유전자삽입 동물들, 가령, 염소.
일부 구체예들에 있어서, CHO 또는 CHO-유도된 세포에서 폴리펩티드의 발현에 최적화되는 벡터가 선택된다. 예시적인 이러한 벡터들은 가령, Running Deer et al., Biotechnol. P rog.(2004) 20:880-889에서 설명된다.
일부 구체예들에 있어서, 인간이 포함된 동물에서 g3p, 이의 아밀로이드 결합 단편 및/또는 g3p 융합 분자들의 생체내 발현을 위한 벡터가 선택된다. 일부 이러한 구체예들에 있어서, 폴리펩티드는 조직-특이적 방식으로 기능을 하는 프로모터의 조절하에서 발현된다.
발현 벡터들는 상기 폴리펩티드를 발현시키는 적절한 표적 세포 안에 트랜스펙션되거나 또는 공동-트랜스펙션된다. 예시적인 트랜스펙션의 비제한적 방법은 가령, Sambrook et al.,　Molecular Cloning , A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에서 설명된다. 당업계 공지된 방법에 따라 핵산은 바람직한 숙주 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 단백질을 발현시키기 위하여 진핵 세포 또는 원핵 세포가 포함된 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이런 것들에는 미생물, 이를 테면, 적절한 코딩 서열이 포함된 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현 벡터들에 의해 형질변환된 세균 (가령, 대장균(E. coli)); 적절한 코딩 서열이 포함된 재조합 효모 또는 곰팡이 발현 벡터들에 의해 형질변환된 효모 또는 실모양의 곰팡이; 적절한 코딩 서열이 포함된 재조합 바이러스 발현 벡터들 (가령, 베큘로바이러스) 곤충 세포 시스템; 적절한 코딩 서열이 포함된 재조합 바이러스 발현 벡터들 (가령, 꽃양배추 모자이크 바이러스 또는 담배 모자이크 바이러스) 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터들 (가령, Ti 플라스미드)로 감염된 식물 세포계; 또는 포유류 세포 (가령, CHO, Cos, HeLa, 또는 HEK-293 세포)가 포함된 동물 세포계가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 상기 단백질은 개구리밥(duckweed)에서 제조합에 의해 또한 생산될 수 있다. 가령, U.S. 특허 8,022,270 참고.
형질변환에 이용된 벡터들은 형질변환체를 식별하는데 이용되는 선택성 표지를 통상적으로 포함한다. 세균성 시스템에서 이 표지는 항생제 저항 유전자 이를 테면 암피실린 또는 카나마이신을 포함할 수 있다. 배양된 포유류 세포에 이용되는 선택성 표지는 약물 이를 테면, 네오마이신, 하이드로마이신, 그리고 메토트렉세이트에 대해 저항성을 부여하는 유전자들이 포함된다. 상기 선택성 표지는 증폭가능한 선택성 표지가 될 수 있다. 한 가지 증폭가능한 선택성 표지는 DHFR 유전자다. 또다른 증폭가능한 표지는 DHFRr cDNA (Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. ( USA ), (1983) 80:2495)이다. 선택성 표지들은 Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA)에 의해 재검토되며, 선택성 표지들의 선택은 당업자의 통상적인 기술 범위 안에 있다.
발현 시스템의 발현 요소들은 이들의 강도 및 특이성에서 다양하다. 이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성 및 유도성 프로모터들이 포함된 임의의 다수의 적절한 전사 및 해독 요소들이 상기 발현 벡터에 이용될 수 있다. 예를 들면, 세균성 시스템에서 클로닝될 때, 유도성 프로모터 이를 테면 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 그리고 이와 유사한 것들이 이용될 수 있으며; 곤충 세포 시스템에서 클로닝될 때, 프로모터 이를 테면 베큘로바이러스 폴리헤드론 프로모터가 이용될 수 있으며; 식물 세포 시스템에서 클로닝될 때, 식물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 (가령, 열 쇼크 프로모터; RUBISCO의 작은 하위단위용 프로모터; 클로로필 a/b 결합 단백질용 프로모터) 또는 식물 바이러스로부터 유도된 프로모터 (가령, CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 피복 단백질 프로모터)가 이용될 수 있으며; 포유류 세포 시스템에서 클로닝될 때, 포유류 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 (가령, 메탈로티오나인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유도된 프로모터(가령, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두증 바이러스 7.5 K 프로모터)가 이용될 수 있으며; 다수의 발현 산물 복사체가 포함된 세포 계통이 생성될 때, 적절한 선택성 표지와 함께 SV40-, BPV- 및 EBV-기반된 벡터들이 이용될 수 있다.
식물 발현 벡터들이 이용되는 경우, 임의의 다수의 프모모터에 의해 본 발명의 선형 또는 비-고리화된 형태의 발현 산물을 인코드하는 서열의 발현이 유도될 수 있다. 예를 들면, 바이러스성 프로모터 이를 테면 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터 (Brisson et al., Nature (1984) 310:511-514), 또는 TMV의 피복 단백질 프로모터 (Takamatsu et al., EMBO J.(1987) 6:307-311)가 이용될 수 있거나; 대안으로, 식물 프로모터 이를 테면 RUBISCO의 작은 하위단위 (Coruzzi et al., EMBO J.(1984) 3:1671-1680; Broglie et al., Science (1984) 224:838-843) 또는 열 쇼크 프로모터, 가령, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B (Gurley et al., Mol. Cell. Bio. (1986) 6:559-565)가 이용될 수 있다. 이들 구조체들은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터들, 직접 DNA 형질변환, 현미주사(microinjection), 전기천공(electroporation) 등을 이용하여 식물 세포 안으로 도입될 수 있다. 이러한 기술에 대한 검토는 가령, Weissbach & Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology , Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; 그리고 Grierson & Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch.7-9를 참고한다.
본 발명의 단백질을 만들기 위하여 이용될 수 있는 한 가지 곤충 발현 시스템에서 오토그라파 칼리포티카(Autographa californica ) 핵 다한증 바이러스 (AcNPV)는 외부 유전자들을 발현시키는 벡터로 이용된다. 상기 바이러스는 스포도프테라 플루기페르다(Spodoptera frugiperda ) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들면, 폴리헤드론 유전자) 안으로 클로닝되며, AcNPV 프로모터 (예를 들면, 폴리헤드론 프로모터)의 조절하에 위치된다. 코딩 서열의 성공적인 삽입으로 폴리헤드론 유전자의 비활성화 및 비-차단된 재조합 바이러스의 생산 (가령 폴리헤드론 유전자에 의해 코드된 단백질성 피복이 부족한 바이러스)이 결과된다. 그 다음 이들 재조합 바이러스는 스포도프테라 플루기페르다(Spodoptera frugiperda)를 감염시키는데 이용되며, 여기에서 삽입된 유전자가 발현된다 (가령, Smith et al., J. Virol.(1983) 46:584; U.S. 특허 번호 4,215,051 참고). 이 발현 시스템의 추가 예들은 Ausubel et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience에서 찾아볼 수 있다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스성 기반의 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 이용되는 경우, 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/해독 대조 복합체, 가령, 후기 프로모터와 세 부분으로 된 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이 융합 유전자는 시험관 또는 생체내 재조합에 의해 그 다음 아데노바이러스 게놈 안으로 삽입될 수 있다. 바이러스성 게놈의 비-필수 영역 (가령, 영역 E1 또는 E3)안에 삽입에 의해 감염된 숙주에서 살아있고, 펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스가 결과된다 (가령, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:3655 참고). 대안으로, 우두증 7.5 K 프로모터가 이용될 수 있다(가령, Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ( USA ) (1982) 79:7415; Mackett et al., J. Virol.(1984) 49:857; Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ( USA ) (1982) 79:4927 참고). 기타 바이러스성 발현 시스템은 아데노-연합된 바이러스와 렌티바이러스를 포함한다.
DNA 구조체들이 포함된 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "적절한 성장 배지"이란 세포의 성장에 필요한 영양소들이 포함된 배지를 말한다. 본 발명의 재조합에 의해 생산된 단백질은 당업계 통상적인 기술을 이용하여 상기 배양물 배지로부터 단리될 수 있다.
시험관 분석
일부 구체예들에 있어서, 티오플라빈 T 형광 (ThT) 분석을 이용하여 아밀로이드 분해가 감시될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물 존부하에 세제의 용해화를 감시함으로써 분해가 테스트된다. 예를 들면, 응집된 α-시누클레인이 본 발명의 조성물로 처리될 수 있다. 상기 응집된 α-시누클레인을 분해하는 융합 단백질 또는 조성물은 처리안된 섬유와 비교하였을 때 세제, 이를 테면 SDS에서 α-시누클레인 섬유는 더 신속하게 용해되게 할 것이다. 아밀로이드 섬유가 가용성 형태로 전환은 응집동안 라벨된(가령, Cy5) α-시누클레인 단량체들 일부의 혼입에 의해 감시될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 신경 세포 배양물 세포독성 분석에 의해 독성 아밀로이드 올리고머들의 형성 방해가 테스트된다. 이 분석에서, 분화된 N2a 신경모세포종 세포 또는 등가물은 Aβ42 올리고머들과 함께 공동항온처리된다. 상기 올리고머들은 막에 결합하고, 막을 교란시켜, 세포액(cytosolic) 효소들은 배지로 누출되게 된다. 고농도의 올리고머들과 연장된 항온처리에 의해 세포가 사멸될 것이다. 올리고머들이 파지 또는 g3p로 사전-처리되고, 세포와 항온처리되면, 상기 올리고머들은 최소한 독성이 적어지거나, 때로 비독성이 된다. 이러한 중화 효과는 막 교란 후 신경 세포에 의해 방출되는 한 가지 예시적인 세포액 효소, 아데닐레이트 키나제의 방출을 측정함으로써 정량화될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 단백질 미스폴딩 순환 증폭 (PMCA) 분석에서 본 발명의 g3p 융합 단백질 또는 조성물은 가용성 프리온 단백질이 단백질분해효소 K 저항성 이형태체(conformer)로의 전환을 방해한다. Wang et al., Science, (2010) 327:1132-35. 이 분석에서, 재조합 PrP는 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물의 존부하에 지질 POPG 및 RNA와 혼합된다. 그 다음 상기 물질은 30초 초음파쇄를 다수 (가령, 48회)받고, 이어서 29.5 분 항온처리된다. 그 다음 상기 반응 혼합물의 한 분획을 이용하여 또다른 기질 튜브에 접종시키고, 이 과정은 반복된다. PrP의 감염 형태의 지표가 되는 단백질분해효소 K 저항성 물질 존재하에 각 라운드가 테스트된다. 본 발명의 조성물 존재하에 단백질분해효소 K 저항성 물질의 감소는 상기 융합 단백질 또는 조성물이 PK 저항성 이형태체 형성을 저해한다는 것을 나타낸다.
상기에서 명시된 바와 같이, 특정 프리온 단백질, 이를 테면 효모 프리온 단백질 NM의 아밀로이드 형태 또한 필터 트랩 분석에서 탐지될 수 있다. 따라서, 사전 단백질에 따라, 일부 구체예들에 있어서 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물의 프리온 단백질 응집체를 분해하는 능력이 필터 트랩 분석에서 테스트될 수 있다.
생체내 기능 분석
시험관 분석에서 설명될 수 있는 활성, 이를 테면 아밀로이드에 대한 결합 친화력 증가 또는 TM의 감소에 추가하여, 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물은 몇 가지 생체내 분석중 하나에서 또한 아밀로이드를 감소시킬 수 있다. 생체내에서 아밀로이드 감소를 결정하는 한 가지 방법은 영상화 물질 플루베타피르 (F18-AV-45, Eli Lilly)를 이용한 양전자방출단층촬용(PET)을 이용하여 처리 전과 처리 후β-아밀로이드의 수 및/또는 분포를 비교한다. 물론, 추가 생물표지가 확인되면, 이들 또한 아밀로이드의 감소를 측정하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 g3p 융합 단백질 또는 조성물이 생체내 아밀로이드를 감소시키는 지를 결정하는 또다른 방법은 hAPP 마우스 모델을 이용한다. Rockenstein, J Neurosci ReS. (2001) 66(4):573-82. 이들 마우스는 어린 나이(3-4월령)에 높은 수준의 β-아밀로이드를 발달시킨다. 아밀로이드를 감소시키는 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물의 능력은 본 발명의 조성물을 마우스에게 주사하고, 그 다음 주사안된 대조 마우스와 비교하여 이들 마우스에 있는 아밀로이드 수준을 비교함으로써, 결정될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물을 hAPP 마우스의 오직 하나의 반구에 주입함으로써, 동일한 마우스에서 주사된 반구와 주사안된 반구 사이에 아밀로이드 수준을 비교하는 것 또한 가능하다.
또다른 실시예에서, 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물은 US2011/0142803, Hsiao et al., Science (1996) 274:99-102, 또는 Duyckaerts et al., Acta Neuropathol (2008) 115:5-38에서 설명된 알츠하이머 질환에 대한 유전자삽입 마우스 모델 (TgAD)에서 테스트된다. 간략하게 설명하자면, 야생형, 뿐만 아니라 유전자삽입 마우스가 도전을 받는다. 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물이 물질을 분해하는 능력을 평가하기 위하여, 조성물은 유전자삽입 마우스의 두개내 또는 전신으로 주사된다(Taconic, APPSWE(2576), 10 월령). 예를 들면, 두개내 주사를 위하여, 본 발명의 융합 단백질이 포함된 조성물은 한 반구로 주사되며, 한편 반대 측면에는 인산염-완충된 염수(PBS)가 제공되어 대조군이 된다. 처리된 마우스는 상이한 시점에 희생시키고, 뇌는 4% 파라포름알데히드에 하룻밤 동안 고정시키고, 마이크로톰을 이용하여 절단한다. 티오플라빈-S (ThS) 착색을 실시하여 아밀로이드 부하가 평가된다. 핵 자가형광을 소거하기 위하여 Mayer의 헤마토실린으로 단편들이 착색되며, 그리고 세척 후 ThS 용액 (1%)은 3 분간 제공된다. 20분간 1% 아세트산을 이용하여 분화가 실행되고, 세척 후 슬라이드를 건조시키고, 항-변색(fade) 탐재 배지와 탑재된다. 아밀로이드 부하는 LEICA Qwin 프로그램을 이용하여 산출된다. 대안으로, 아밀로이드 부하는 항-아밀로이드 항체로 측정될 수 있다.
방사능활성 (가령, I125) 또는 형광 라벨된 융합 단백질 또는 조성물, 또는 라벨안된 융합 단백질 또는 조성물의 생체 분포 또한 측정될 수 있고, 이는 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물이 생체내 아밀로이드에 결합한다는 것을 보여준다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 방사능활성 또는 형광 라벨될 수 있다. BALB/c 마우스는 집단으로 분할된다. 그 다음 각 마우스들은 한 시간에 걸쳐 비강으로 융합 단백질을 제공받는다. 제 1 집단의 마우스는 심장내 주입 후 한 시간 시점에 4% 파라포름알데히드를 이용하여 희생시켰다. 제 2 집단은 처리후 3 시간에서, 그리고 마지막 집단은 24 시간 후에 희생시켰다. 주입 후, 뇌 뿐만 아니라 말초 장기들이 제거되고, 라벨이 측정된다. 대안으로, 라벨안된 융합 단백질 또는 조성물은 유사한 방법을 이용하여 결합에 대하여 평가되지만, 그러나 아밀로이드를 인지하는 착색과 상기 조성물 또는 파지를 인지하는 착색으로 뇌 단편들이 공동-착색된다.
본 발명의 융합 단백질 또는 조성물이 아밀로이드를 감소시킨다는 것을 설명하기 위하여 단백질 미스폴딩 질환의 다른 유전자삽입 모델이 또한 이용될 수 있다. 비-제한적 예로는 "D 라인" α-시누클레인 마우스 (파킨슨 질환 모델, Masliah et al., Science (2000) 287:1265-1269); Tg2576 마우스 (알츠하이머 질환 모델, Hsiao et al., Science (1996) 274:99-102 및 Duyckaerts et al., Acta Neuropathol (2008) 115:5-38 at 9); 파킨슨 질환 연구를 위한 다양한 Jax® 마우스 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME); 그리고 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 헌팅턴 질환이 포함된 JSW Lifescience에서 이용가능한 마우스 및 렛 모델을 포함한다.
약학 조성물
또다른 측면에 있어서, 본 발명은 서열번호:9, 서열번호:11, 서열번호:13, 또는 서열번호:31의 상기 융합 단백질, 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 변이체가 포함된 상기에서 설명된 g3p 융합 단백질이 포함된 약학적으로 수용가능한 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 서열번호:9의 아미노산 21-506, 서열번호:9의 아미노산 22-506, 서열번호:9의 아미노산 23-506, 서열번호:9의 아미노산 21-505, 서열번호:9의 아미노산 22-505, 또는 서열번호:9의 아미노산 23-505; 또는 상기에서 설명된 것과 같은 임의의 서열의 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 서열번호:11의 아미노산 21-506, 서열번호:11의 아미노산 22-506, 서열번호:11의 아미노산 23-506, 서열번호:11의 아미노산 21-505, 서열번호:11의 아미노산 22-505, 또는 서열번호:11의 아미노산 23-505; 서열번호: 13의 아미노산 21-508, 서열번호: 13의 아미노산 22-508, 서열번호: 13의 아미노산 23-508, 서열번호:13의 아미노산 21-507 , 서열번호:13의 아미노산 22-507, 또는 서열번호:13의 아미노산 23-507 ; 또는 서열번호: 31의 아미노산 21-528, 서열번호: 31의 아미노산 22-528, 서열번호: 31의 아미노산 23-528, 서열번호: 31의 아미노산 21-527, 서열번호: 31의 아미노산 22-527, 또는 서열번호: 31의 아미노산 23-527 또는 상기에서 설명된 것과 같은 임의의 서열의 돌연변이체 또는 변이체를 포함할 수 있다.
"약학 조성물"은 생리학적으로 적절한 운반체 및/또는 부형제와 함께 본 명세서에서 설명된 치료적으로 유효량의 g3p 융합 단백질을 말하는데, 여기에서 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 상기 융합 단백질의 치료 효과를 담당한다. 약학 조성물은 유기체에게 유의적인 자극을 야기하지 않는다. 구절 "생리학적으로 수용가능한 운반체" 및 "약학적으로 수용가능한 운반체"는 호환되어 이용될 수 있는데, 유기체에게 유의적인 자극을 야기하지 않고, 생물학적 활성을 없애거나, 투여된 조성물의 성질을 없애지 않는 운반체 또는 희석제를 말한다.
용어 "부형제"는 활성 성분의 투여를 더 용이하게 하기 위하여 약학 조성물에 추가되는 비활성 물질을 말한다. 예를 들면, 염수, 탄산칼슘염, 인산칼슘염, 다양한 슈가 및 전분 유형, 셀룰로오스 유도체들, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 예를 들면, 폴리소르베이트 20이 포함된 계면활성제가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라 이용되는 약학 조성물은 g3p 활성 성분들이 약학적으로 유용하게 될 수 있는 조성물로 처리를 촉진시키는 부형제 및 보조제가 포함된 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 수용가능한 운반체를 이용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 운반되는 조성물의 성질 및 투여 경로에 따라 달라진다.
본 발명의 약학 조성물의 투여에 적합한 경로는 예를 들면, 경점막, 구체적으로 비강을 통한 전달; 근육내, 피하, 척수내, 척추강내, 심실내, 정맥내, 복막내, 비강내, 또는 안구내 주사가 포함된 비경구 전달; 경구; 또는 직장 전달이 포함될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 약학 조성물은 전신 방식보다는 국소로 투여되는데, 예를 들면, 환자의 뇌로 직접 약학 조성물이 주사된다. 일부 구체예들에 있어서, 주사 기술은 척추강내, 척수내, 또는 심실내 직접 주사에 의해 뇌-혈관 장벽을 회피하는 임의의 기술이다.
주사용으로, 본 발명의 활성 성분은 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 양립가능한 완충액 이를 테면 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리학적 염 완충액에서 제형화될 수 있다. 경점막 투여를 위하여, 침투되어야 하는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 이용된다. 이러한 침투제들은 일반적으로 당업계에 잘 공지되어 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 비강내 투여를 통하여 투여된다. 비강내 전달로 인하여 바이러스 및 거대분자들이 뇌척수 유체 (CSF) 또는 CNS 안으로 직접 진입가능하게 한다는 것이 보고된 바 있다. Mathison et al., 1998; Chou et al., 1997; Draghia et al., 1995.
비강내 경로를 통한 투여의 경우, 조성물은 적절한 추진체, 가령, 디클로로디플루오르메탄, 트리클로로플루오르메탄, 디클로로-테트라플루오르에탄 또는 이산화탄소의 사용과 함께, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 형태로 흔히 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 정해진 양이 전달되도록 하는 벨브가 제공됨으로써 투약 단위가 결정된다. 분배기에 사용되는 가령, 젤라틴의 캡슐 및 카트릿지는 화합물과 적절한 파우더 베이스, 이를 테면 락토오스 또는 전분의 파우더 믹스가 포함되도록 제형화된다.
본 명세서에서 설명된 약학 조성물의 성분들로서 다양한 융합 단백질은 운반 점으로 후각수용기 뉴런을 이용하여 뇌로 또한 전달될 수 있다. 예를 들면, 이들 임의의 단백질이 인코딩된 유전자가 포함된 아데노바이러스 벡터는 후각수용기 뉴런을 통하여 전달될 수 있다. Draghia et al., 1995.
본 명세서에서 설명된 조성물은 비경구 투여, 가령, 볼루스 주사 또는 연속 주입용으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 약학 조성물은 물-가용성 형태에 조성물의 수성 용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 성분들의 현탁액들은 유성 또는 수성 기반 주사 현탁액으로 만들어질 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 운반체는 지방 오일 이를 테면 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 이를 테면 에틸 올레이트, 트리글리세리드 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질, 이를 테면 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 솔비톨 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 임의선택적으로, 현탁액은 적절한 안정화제 또는 활성 성분의 용해도를 증가시켜 매우 높은 농도의 용액이 만들어질 수 있도록 하는 물질 (가령, 계면활성제 이를 테면 폴리소르베이트 (Tween 20))을 또한 포함할 수 있다. 단백질 기반 물질 이를 테면, 예를 들면, 알부민을 이용하여 전달 표면(가령, IV 백, 카테테르, 바늘 등)에 M13가 흡착되는 것을 방지할 수 있다.
경구 투여를 위하여, 상기 조성물은 당업계에 잘 알려진 약학적으로 수용가능한 운반체들과 활성 화합물들을 복합시킴으로써 용이하게 제형화될 수 있다.
제형은 단위 투약형 가령, 바이알, 앰플 안에 또는 임의선택적으로 추가된 보존제와 함께 다중투여분량 용기 안에 존재할 수 있다. 상기 조성물은 현탁액, 용액 또는 유성 또는 수성 운반체내 에멀션일 수 있고, 그리고 제형화 물질 이를 테면 현탁, 안정화 및/또는 분산 물질들을 포함할 수 있다. 단일 투약 형태는 액체 또는 고체형일 수 있다. 단일 투약 형태는 변형없이 환자에게 직접 투여될 수 있거나, 또는 투여 전 희석되거나 또는 재구성될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 단일 투약형은 볼루스 형, 가령, 단일 주사, 다중 테블릿, 캡슐, 알약 등이 포함된 경구 투여 분량이 포함된 단일 경구 투여분량(dose)으로 투여될 수 있다. 대체 구체예들에 있어서 단일 투약형은 기간을 두고 투여될 수 있는데, 이를 테면 주입, 이식된 펌프, 이를 테면 ICV 펌프를 통하여 투여될 수 있다. 후자 구체예에 있어서, 상기 단일 투약형은 융합 단백질이 사전에 채워진 주입 백 또는 펌프 저장기일 수 있다. 대안으로, 상기 주입 백 또는 펌프 저장기는 환자에게 투여하기 직전에 단일 투여분량의 상기 융합 단백질을 주입 백 또는 펌프 저장기 용액과 혼합하여 준비될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 약학 조성물을 준비하는 방법들을 포함한다. 약물의 제형화 기술은 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신 판에서 찾아볼 수 있으며, 이것은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
본원 발명의 내용에서 이용되는데 적절한 약학 조성물은 의도된 목적을 이루는데 유효한 양의 g3p 활성 성분이 포함된 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 g3p 융합 단백질을 포함하는데, 여기에서 상기 융합 단백질의 g3p 부분은 환자에게서 아밀로이드를 감소시키고, 아밀로이드 형성을 저해하고, 아밀로이드 응집을 저해하고, 또는 독성 올리고머들 형성을 제거 및/또는 방지하는데 유효한 양으로 존재한다. 상기 조성물은 박테리오파지를 포함하지 않는다.
치료적으로 또는 진단학적으로 효과적인 양의 결정은 본 명세서에서 제공된 상세한 설명을 바탕으로, 당업자의 능력 범위 안에 있다.
투여량과 간격은 특정 뇌 질환, 장애, 또는 상태를 치료 또는 진단하는데 충분한 파지 디스플레이 운반체의 뇌 수준을 제공하기 위하여 (최저 효과 농도, MEC) 개별적으로 조정될 수 있다. 상기 MEC는 각 조제에 따라 변화될 수 있지만, 시험관 데이터로부터 예측가능하다. MEC를 획득하는데 필수적인 투여량은 개별 특징에 따라 달라질 것이다.
MEC 값을 이용하여 투여량 간격 또한 결정될 수 있다. 조제물은 시간의 10-90%, 바람직하게는 30-90% 그리고 가장 바람직하게는 50-90% 동안 MEC 이상으로 뇌 수준을 유지시키는 섭생을 이용하여 투여되어야 한다.
치료될 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여분량은 단일 또는 다중 투여가 될 수 있는데, 수일 내지 수주동안 지속되는 치료 과정 또는 치료가 효과를 가지거나 또는 질환의 약화가 이루어질 때까지 지속된다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료되는 대상, 고통의 심각성, 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에서 설명된 g3p 융합 단백질 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체가 포함된 본 발명의 조성물은 바람직한 경우, 팩 또는 분배 장치, 이를 테면 FDA 승인된 키트에 존재할 수 있는데, 이는 활성 성분이 포함된 하나 또는 그 이상의 단위 투약 형을 포함할 수 있다. 상기 팩은 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 포일, 이를 테면 블리스터(blister) 팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여 지침을 수반할 수 있다. 상기 팩 또는 분배기는 약물의 제조, 사용 또는 판매를 관리하는 정부기관에 규정한 형태의 용기에 연합된 고지문이 또한 제공될 수 있는데, 이 고지는 조성물의 형태 또는 인간 또는 수의학적 투여의 정부 승인을 나타낸다. 이러한 고지는 예를 들면, 약물의 처방 또는 승인된 제품 삽입에 대하여 U.S. Food and Drug Administration에 의해 승인된 라벨이 될 수 있다. 양립가능한 약학 운반체 안에서 제형화된 본 발명의 조제물이 포함된 조성물이 만들어지고, 적절한 용기 안에 놓고, 상기에서 추가 상세하게 설명된 것과 같이 표시된 상태의 치료용이라는 라벨이 제공될 수 있다.
전술한 그리고 다음의 설명은 예시적이며 설명을 위함이고, 청구되는 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아님을 인지할 것이다.
치료학적 용도
본 발명의 또다른 측면은 fAβ42, fαsyn, fNM, 또는 ftau가 관련된 질환이 포함되나 이에 한정되지 않은, 단백질 미스폴딩 질환의 치료 및/또는 방지에 본 발명의 g3p 융합 단백질 또는 조성물의 용도에 관계한다.
본 발명의 또다른 측면은 환자에게서 아밀로이드를 감소시키고, 아밀로이드 형성을 저해하고, 아밀로이드 응집을 저해하고, 및/또는 독성 올리고머들 형성을 제거 및/또는 방지하기 위하여 하는데 본 발명의 임의의 g3p 융합 단백질 또는 조성물의 용도에 관계한다.
치료 및/또는 방지 내용에 있어서, 용어 "환자", "대상" 및 "수용자"는 호환되며, 인간 뿐만 아니라 다른 포유류가 포함된다. 일부 구체예들에 있어서, 환자는 단백질 미스폴딩 질환과 연합된 생물표지에 대하여 양성인 인간이다. 한 구체예에 있어서, 상기 환자는 플루베타피르에 의해 PET 영상에서 탐지되는 바와 같이 β-아밀로이드 침착을 나타낸다.
용어 "치료하는"이란 질환의 하나 또는 그 이상의 임상적 증상들을 나타내는 환자에게서 질환의 진행을 감소, 지연 또는 역전시킨다는 의미다. "치료하는"은 또한 질환의 하나 또는 그 이상의 임상적 증상들을 나타내는 환자에게서 질환의 증상을 감소, 지연 또는 역전시킨다는 의미다. 한 구체예에 있어서, 상기 환자는 플루베타피르에 의해 PET 영상에서 탐지되는 바와 같이 β-아밀로이드 침착을 나타내고, 다수의 β-아밀로이드 침착은 상기 치료에 의해 감소된다. 한 구체예에 있어서, 상기 환자는 본 발명의 g3p 조성물에 의해 탐지되는 바와 같이 β-아밀로이드 침착을 나타내고, 다수의 β-아밀로이드 침착은 상기 치료에 의해 감소되거나 또는 유지된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 환자는 PET 영상화에 의해 탐지되는 바와 같이 임의의 유형의 아밀로이드 침착을 나타내고, 환자의 인지 기능은 상기 치료에 의해 개선된다. 인지기능의 개선은 McKhann et al., Alzheimer' s & Dementia (2011) May;7(3):263-9의 방법 및 테스트에 의해 분석될 수 있다.
"예방(Prophylaxis)"은 치료와 구별되며, 임의의 임상적 증상의 개시 전 개체에게 조성물을 투여하는 것을 말한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이 본 발명의 g3p 융합 단백질 또는 조성물의 "예방적(prophylactically)" 이용은 본 발명의 g3p 융합 단백질 또는 조성물의 "방지적(preventively)" 사용과 동일한 의미다. 본 발명의 임의의 상기 융합 단백질 또는 조성물을 이용한 예방이 포함된다. 질환의 위험이 증가된 것으로 알려진, 또는 하나 또는 그 이상의 유전적 표지에 전적으로 근거하여 질환이 발병할 것으로 확신되는 개체에서 예방을 보여줄 수 있다. 다양한 단백질 미스폴딩 질환에 대하여 많은 유전적 표지들이 확인되었다. 예를 들면, 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)에서 스웨덴형(Swedish) 돌연변이, 인디아나(Indiana) 돌연변이, 또는 런던형(London) 돌연변이중 하나 또는 그 이상을 가진 개체들은 알츠하이머 질환의 조기-개시될 가능성의 위험이 증가되며, 따라서 예방을 위한 후보자가 된다. 유사하게, 헌팅틴 유전자에서 트리뉴클레오티드 CAG 반복을 가진 개체, 특히 36개 또는 그 이상의 반복을 가진 개체들은 결국 헌팅턴 질환이 발병할 것이며, 따라서 따라서 예방을 위한 후보자가 된다.
용어 "단백질 미스폴딩"은 응집하는 단백질 (아밀로이드 형성 펩티드), 이를 테면, β-아밀로이드, 혈청 아밀로이드 A, 시스타틴 C, IgG 카파 경쇄, 또는 프리온 단백질이 포함되나 이에 국한되지 않는 단백질에 의해 아밀로이드 단백질이 형성되는 것을 특징으로 하는 질환을 말한다. 미스폴드된 및/또는 응집된 아밀로이드 단백질이 연합된 것으로 알려진 질환은 조기 개시 알츠하이머 질환, 후기 개시 알츠하이머질환 그리고 증상발현 전(presymptomatic) 알츠하이머 질환을 포함하는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, SAA 아밀로이드증, 시스타틴 C, 유전적 아이슬랜드식 증후군(Icelandic syndrome), 노망, 다발골수종, 쿠루병이 포함되나 이에 국한되지 않는 프리온 질환, 크로이츠펠트-야코프 질환 (CJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 질환 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 진전병, 그리고 소 해면상뇌증 (BSE); 근위축성 측색 경화증 (ALS), 척수소뇌성 실조증 (SCA1), (SCA3), (SCA6), (SCA7), 헌팅턴 질환, 치상핵적핵담시상하핵 위축증, 척수 및 연수근 위축증, 유전적 뇌 아밀로이드 맥관병, 가족성 아밀로이드중, 전두측두엽 치매, 영국식/덴마크식(British/Danish) 치매, 그리고 가족성 뇌병증을 포함한다. 본 발명의 g3p 융합 단백질 및 조성물을 이용하여 "단백질 미스폴딩" 질환을 치료할 수 있다.
많은 미스폴드된 및/또는 응집된 아밀로이드 단백질 질환이 중추 신경계 (CNS)에서 발생된다. CNS에서 발생되는 질환의 일부 예는 파킨슨 질환; 알츠하이머 질환; 다음의 임상적 증상을 가지는 환자들이 포함된 전두측두 치매 (FTD): 거동 변이성 FTD (bvFTD), 진행성 비-유창 실어증 (PNFA) 그리고 의미(semantic) 치매 (SD); 전두측두엽 퇴행 (FTLDs); 그리고 헌팅턴 질환이다. 본 발명의 g3p 융합 단백질 및 조성물을 이용하여 중추 신경계 (CNS)에서 발생되는 미스폴드된 및/또는 응집된 아밀로이드 단백질을 특징으로 하는 질환이 치료될 수 있다.
단백질의 미스폴딩 및/또는 응집은 또한 CNS 외부에서 일어날 수도 있다. 아밀로이드증 A (AA) (전구체 단백질은 혈청 급성 상 아포리포단백질, SAA이다) 및 다발골수종 (전구체 단백질 면역글로블린 경쇄 및/또는 중쇄)은 CNS 외부에서 발생되는 것으로 알려진 단백질 미스폴딩 및/또는 응집된 단백질 질환이다. 다른 예로는 β2-마크로글로블린, 트란스티레틴 (가족성 아밀로이드성 다발신경병증 [FAP], 가족성 아밀로이드성 심장근육병증 [FAC], 그리고 노인성 전신 아밀로이드증 [SSA]), (아포)혈청 AA, 아포리포단백질 AI, AII, 및 AIV, 겔소린 (가족성 아밀로이드성 다발신경병증의 핀란드식 형태), 리소자임, 피브리노겐, 시스타틴 C (뇌 아밀로이드 맥관병, 아밀로이드증과 함께 유전적 뇌 출혈, 아일랜드식 유형), (프로)칼시토닌, 섬 아밀로이드 폴리펩티드 (IAPP 아밀로이드증), 심방 나트륨배설 인자(atrial natriuretic factor), 프로락틴, 인슐린, 락타헤드린, 케라토-에피테린, 락토페린, 치원성 사기질모세포-연합된 단백질, 그리고 세메노겔린 I에 의해 형성된 아밀로이드가 관련된 질환을 포함한다. 본 발명의 g3p 융합 단백질 및 조성물을 이용하여 CNS 외부에서 발생되는 단백질의 미스폴딩 및/또는 응집과 관련된 질환을 치료할 수 있다.
신경퇴행성 질환 또한 tau 병소와 관련될 수 있다. (Reviewed in Lee et al. (2001) Annu. Rev. Neurosci. 24:1121-159). Tau 단백질은 중추 및 말초 신경계 뉴런 모두의 엑손에서 발현되는 미세관-연합된 단백질이다. 신경퇴행성 타우병증 (때로 타우병증이라고도 불림)이 포함되며, 본 명세서에서 설명된 g3p 융합 단백질 및 조성물에 의해 치료될 수 있다. 타우병증의 예로는 알츠하이머 질환, 근위축성 측색 경화증/파킨슨증-치매 복합체, 은친화성 입자 치매, 피질괴저 퇴행, 크로이츠펠트-야코프 질환, 권투선수 치매, 석회화와 함께 미만성 신경섬유 다발, 다운 증후군, 염색체 17과 연계된 파킨슨증과 함께 전두측두엽 치매가 포함된 전두측두 치매, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 질환, 할러포르덴-슈파츠 질환, 근긴장성 이영양증, 니만-피크 질환 유형 C, 신경섬유 다발을 가진 비-괌사람형 운동 신경 질환, 피크 질환, 뇌염후 파킨슨증, 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 맥관병, 진행성 피질하 신경교종, 진행성 핵상안근 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 그리고 전적 다발(Tangle only)치매를 포함한다. 이들 질환의 일부는 소섬유성 아밀로이드 β 펩티드들의 침착을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 알츠하이머 질환은 아밀로이드 β 침착 및 tau 병소를 모두 나타낸다. 유사하게, 프리온-중개된 질환 이를 테면 크로이츠펠트-야코프 질환, 프리온 단백질 뇌 아밀로이드 맥관병, 그리고 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 중후 또한 tau 병소를 보유할 수 있다. 따라서 질환이 "타우병증(tauopathy)"이라는 것은 기타 신경퇴행성 질환 부류 및 집단으로부터 상기 질환을 배제하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이것은 편의의 목적으로 단순히 제시된 것이다. 본 발명의 g3p 융합 단백질 및 조성물을 이용하여 신경퇴행성 질환 뿐만 아니라 타우 병소 관련된 질환을 치료할 수 있다.
한 구체예에 있어서, 본 명세서에서 설명된 것과 같이 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 아밀로이드의 존재와 관련된 증상을 나타내는 또는 단백질 미스폴딩 질환과 연합된 생물 표지, 이를 테면 플루베타피르 (AV-45, Eli Lilly)에 양성인 환자에게서 아밀로이드를 감소시키는 방법에 사용된다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, 본 명세서에서 설명된 것과 같이, g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 아밀로이드의 존재와 관련된 증상을 나타내는 또는 단백질 미스폴딩 질환과 연합된 생물 표지, 이를 테면 플루베타피르 (AV-45, Eli Lilly)에 양성인 환자에게서 아밀로이드의 수준을 유지시키는 방법에 사용된다. 이 환자에게 본원 명세서에서 설명된 유효량의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물, 또는 제제가 투여된다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 아밀로이드를 가진 환자에게 본 명세서에서 설명된 것과 같은 유효량의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제를 투여하는 것이 포함된, 환자의 아밀로이드를 분해하는 방법에 이용된다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 뇌에 있는 β-아밀로이드 침착을 분해시키는 방법에 이용되는데, 이 방법은 이를 필요로 하는 환자의 뇌로 본 명세서에서 설명된 유효량의 약학 조성물을 직접 주사하고, 이로 인하여 뇌에 있는 β-아밀로이드 침착이 감소되도록 하는 것을 포함한다.
한 구체예에 있어서, g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 뇌에서 아밀로이드 형성을 감소시키는 방법에 이용된다. 뇌에서 아밀로이드 형성의 감소는 단백질-미스폴딩 또는 신경퇴행성 질환의 증상 또는 심각성을 방지, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 뇌에서 아밀로이드 청소를 촉진시키는 방법에 용도를 가진다. 아밀로이드 청소의 촉진은 단백질-미스폴딩 또는 신경퇴행성 질환의 증상 또는 심각성을 방지, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 뇌에서아밀로이드 응집을 저해시키는 방법에 용도를 가진다. 뇌에서 아밀로이드 응집의 저해는 단백질-미스폴딩 또는 신경퇴행성 질환의 증상 또는 심각성을 방지, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 뇌에서 독성 아밀로이드 올리고머들을 청소하기 위한 방법에 용도를 가진다. 독성 아밀로이드 올리고머들의 청소로 단백질-미스폴딩 또는 신경퇴행성 질환의 증상 또는 심각성을 방지, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 뇌에서 독성 아밀로이드 올리고머들의 형성을 방지하기 위한 방법에 용도를 가진다. 독성 올리고머들의 형성의 방지로 단백질-미스폴딩 또는 신경퇴행성 질환의 증상 또는 심각성을 방지, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 아밀로이드 손상으로부터 뉴런을 보호하기 위한 방법에 용도를 가진다. 아밀로이드 손상으로부터 뉴런의 보호에 의해 단백질-미스폴딩 또는 신경퇴행성 질환의 증상 또는 심각성을 방지, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 투여 경로는 척추강 주사, 직접 심실내 주사, 뇌실질내 주사, 또는 비강내 전달에서 선택된다. 한 구체예에 있어서, 아밀로이드 손상으로부터 뉴런의 보호용도의 본 발명의 g3p 융합 단백질, 약학 조성물 또는 제제는 예방차원에서 제공된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 환자는 단백질 미스폴딩 질환과 연합된 생물표지에 대하여 양성이다. 한 구체예에 있어서, 상기 생물표지는 플루베타피르 (AV45, Eli Lilly)이다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 환자는 아밀로이드의 존재와 연합된 신경퇴행성 질환의 증상을 나타낸다. 다양한 구체예들에 있어서, 상기 아밀로이드는 fAβ42, fαsyn, fNM, 또는 ftau중 임의의 것이다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 또는 헌팅턴 질환이다. 한 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환이다. 한 구체예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 질환이며, 상기 환자는 영상화 물질 플루베타피르 (AV-45, Eli Lilly)에 의해 탐지되는 것과 같이 β-아밀로이드를 나타낸다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 환자는 프리온-중개된 질환의 증상을 나타낸다.
특정 구체예들에 있어서, 상기 프리온-중개된 질환은 크로이츠펠트-야코프 질환, 쿠루병, 치명적 가족성 불면증, 또는 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군에서 선택된다.
일부 구체예들에 있어서, 상기 환자는 알츠하이머 질환 이외의 신경퇴행성 타우병증의 증후를 나타낸다. 특정 구체예들에 있어서, 치료되는 질환은 은친화성 입자 치매, 피질괴저 퇴행, 권투선수 치매, 석회화와 함께 미만성 신경섬유 다발, 다운 증후군, 염색체 17과 연계된 파킨슨증과 함께 전두측두엽 치매가 포함된 전두측두 치매, 할러포르덴-슈파츠 질환, 근긴장성 이영양증, 니만-피크 질환 유형 C, 신경섬유 다발을 가진 비-괌사람형 운동 신경 질환, 피크 질환, 뇌염후 파킨슨증, 진행성 피질하 신경교종, 진행성 핵상안근 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 그리고 전적 다발(Tangle only)치매에서 선택된다.
진단학( Diagnostics )
또다른 측면에 있어서, 본 명세서 설명된 본 발명, g3p 융합 단백질 및 조성물은 본 명세서에서 설명된 다양한 질환과 연합된 시험관 및/또는 생체 진단에 이용된다. 예를 들면, 생체내 또는 시험관내 영상화 물질로 이용될 때 본 발명의 g3p 융합 단백질 및 조성물의 결합이 설명된 단백질 미스폴딩 질환중 하나의 진단 일부가 될 수 있다.
진단 조성물이라고도 불리는 진단 물질이 포함되며, 상기-설명된 본 발명의 융합 단백질 또는 조성물중 임의의 것을 포함할 수 있다. 상기 진단 물질은 탐지가능한 라벨을 더 포함하며, 또는 생체내에서 탐지될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 g3p 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질이 포함된 조성물이 아밀로이드 영상화 물질로 이용된다. 상기 영상화 물질은 아밀로이드를 탐지하고, 아밀로이드 연합된 질환을 진단한다. 본 발명의 상기 융합 단백질 및 조성물은 섬유 유형과 무관하기 때문에, 이들은 단일 영상화 물질과 함께 임의의 아밀로이드 응집체 (Aβ, tau, α-시누클레인, 등.) 모두를 형상화시킬 수 있는 장점이 있다. 현재, CNS에서 tau 또는 알파 시누클레인 응집체를 위한 수용가능한 영상화 물질/방법은 없다. 그리고 β-아밀로이드에 대한 영상화 물질은 존재하지만, 인지 기능과 영상화 결과 사이에 개선된 상관관계를 제공하거나, 환자가 악화되는지 또는 안정적으로 유지되는 지를 더 잘 예측하게 하는 추가 물질이 여전히 필요하다. 검토를 위하여, Resnick & Sojkova, Alzheimer's Res Ther. (2011) 3(1):3 참고
본 발명의 진단학적 g3p 융합 단백질 및 조성물은 β-아밀로이드에 특이적인 영상화 물질 이를 테면, 예를 들면, F18-AV-45, Eli Lilly과 함께 영상화 물질로 이용될 수 있다. 비-β-아밀로이드 응집체용 공지된 영상화 물질이 현재 없기 때문에, β-아밀로이드-특이적 영상화 물질과 함께 본 발명의 진단 조성물의 사용으로 차등적 탐지에 기반을 둔 비-β-아밀로이드 응집체를 탐지하게 될 것이다. 따라서, 한 구체예에 있어서, 본 발명의 진단학적 g3p 융합 단백질 및 조성물은 비-β-아밀로이드 응집체를 탐지하는 β-아밀로이드 영상화 물질과 함께 영상화 물질로 이용된다.
또다른 구체예에 있어서, 본 발명의 진단 조성물은 뇌를 포함하는 CNS에서 β-아밀로이드를 탐지하는 영상화물질로 이용된다.
본 발명의 진단 조성물은 영상화 물질로 이용될 때 하나 또는 그 이상의 탐지가능한 라벨에 부착되는 아밀로이드-결합 융합 단백질 성분을 일반적으로 요구한다. 다양한 라벨은 단백질을 라벨시키기 위한 표준 기술을 이용하여 진단 조성물의 아밀로이드 결합 성분에 부착될 수 있다. 라벨의 예로는 형광 라벨 및 방사능라벨이 포함된다. 이용될 수 있는 광범위한 방사능라벨이 있지만, 일반적으로 라벨은 18F, 11C, 및 123I을 포함하나 이에 국한되지 않는 방사능라벨로부터 대개 선택된다. 공지의 화학을 이용하여 이들 방사능 동위원소 및 기타 동위원소들이 상기 단백질에 부착될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 양전자방출단층촬영 (PET)을 이용하여 상기 라벨이 탐지된다. 그러나, 방사능동위원소의 탐지를 위한 임의의 기타 적절한 기술이 이용되어 방사능추적자가 탐지될 수도 있다.
본 발명의 진단적 조성물은 치료 조성물에서 설명된 동일한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 상기 진단 조성물을 투여하기 위한 경로로 척추강 투여가 이용된다. 또다른 구체예에 있어서, 상기 진단 조성물을 투여하기 위한 경로로 정맥내 투여가 이용된다.
실시예들
결합 및 항-응집 물질로서 실모양의 파지의 설명된 치료 효과는 특정 작용 기전에 있어서 중요하지만, 상기 기전의 이해로 더 큰 치료 효과를 가지는 파지를 기획할 수 있다. 또한, 추가 항-응집 물질들을 준비하는 기초로 삼을 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, M13은 최소한 4가지 상이한 아밀로이드 섬유: 아밀로이드-β 1-42 섬유 (fAβ42), α-시누클레인 섬유 (fαsyn), 효모 프리온 NM 섬유 (fNM), 그리고 tau 섬유 (ftau)에 결합하고, 그리고 이를 분해한다는 것을 보여주었다. 이들 아밀로이드 섬유를 구성하는 4가지 단백질은 무관한 1차 아미노산 서열을 보유하지만, 4가지 모두 미스폴드되어 원형(canonical) 아밀로이드 폴드가 된다. Eichner & Radford, 2011. M13가 이들 각각에 결합하고, 이를 분해시키는 능력은 M13가 구조적 모티프, 이를 테면 아밀로이드 섬유의 명백한 특징이 되는 교차-베타 쉬트 입체형태 또는 입체형태적 특징 이를 테면 소수성 홈(hydrophobic groves)을 인지한다는 것을 나타낸다.
그러나 아밀로이드 분해는 모든 파지의 일반적인 성질은 아니다. 예를 들면, 구조적으로 별개의 20면체 파지 T7은 T7이 37℃에서 3일간 fAβ42와 항온처리되더라도 fAβ42의 분해를 중재하지 않는다. 박테리오파지 T7은 공동-항온처리된 아밀로이드 섬유의 70% 이상을 해리시키는 농도에서 조차도 임의의 해리 활성을 보이지 않았다. 대조적으로, M13와 비교하였을 때 g8p에 음전하를 띈 아미노산을 운반하는 박테리오파지 fd (그리고 따라서 g8p의 복사 수가 제공되면 M13보다 파지당 2800배 더 많은 음성 전하를 나타낸다)는 M13과 유사하게 fAβ42에 결합하고, 그리고 분해한다. 모두 나선형 실린더 모양과 반복 단위를 보유한(US 2011/0182948 참고) 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 대장균(E.coli) 섬모, 그리고 T4의 꼬리 튜브에 의해 아밀로이드 분해가 중개될 수 있다는 발견과 함께 이러한 초기 연구에서 이들의 아밀로이드 섬유-분해 활성에서 중요한 것은 파지의 모양일 것이라는 것이 암시된다.
그러나, 다음의 실시예들은 실모양의 파지의 보고된 결합 및 항-응집 성질에 대한 대체 기전(비록 상호 배타적이지는 않지만)을 설명한다. 이들 실시예와 이를 뒷받침하는 기전에 근거하여, 아밀로이드에 대한 결합이 개선된 g3p 융합 단백질이 제시된다.
실시예 1: M13 파지는 선호적으로 Aβ 소섬유에 결합한다.
Aβ 소섬유 대 Aβ 단량체들에 대한 M13의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정된다.
M13 파지는 Aβ 소섬유에 선호적으로 결합하지만; Aβ 단량체들에게 결합하지 않는다. 고정된 fAβ을 이용하여 바이오센서 칩위로 유동되는 1014 파지/mL을 이용한 표면 플라스몬 공명 연구가 도 3에 보고된다. 도 3에서 M13의 결합에 대한 KD는 약 4 nM으로서, 단클론 항체에 의한 결합에 필적된다는 것을 볼 수 있다. 이러한 높은 친화력 상호작용은 특이적 결합 과정이 파지와 아밀로이드 섬유 사이에서 일어난다는 것을 나타낸다.
실시예 2: Ab 소섬유에 대한 M13 의 결합은 투여분량 의존적이다.
fAβ42에 대한 M13 결합 또한 투여분량 의존적이다. 도 4a에서, fAβ42의 몰량을 증가시키면서 2가지 파지 용량의 결합이 비교되었다. M13-아밀로이드 섬유 결합 분석에서, 복합체들이 형성되도록 2-3시간 동안 M13-Alexa488은 Aβ (fAβ)와 혼합되었고, 그 다음 10분간 7500 rpm에서 원심분리에 의해 상기 복합체는 침전된다. 펠렛에서 형광은 아밀로이드에 결합된 M13에 비례되었다. 이 분석은 fAβ에 대한 파지의 결합을 정량적 척도로 제공하며, 그리고 결합에 있어서 파지와 경쟁하는 다른 물질의 능력을 평가하기 위한 시스템을 제공한다. 도 4b는 M13 결합 경쟁에 대한 KD가 표면 플라스몬 공명을 이용하여 결합에 대하여 관철된 것과 유사하다는 것을 보여준다.
실시예 3: Aβ 소섬유에 M13 가 결합하기 위하여 고유 입체형태를 필요로 한다.
M13 파지가 10분간 90℃에서 가열될 때, 결합을 위하여 경쟁하는 능력은 기본적으로 제거된다. 도 5는 아밀로이드 섬유 경쟁 결합 분석에 있어서 M13의 열 처리된 형태 (상자) 대(versus) 고유 입체형태 (원)를 이용한 결합 경쟁 결과를 나타낸다.
실시예 4: 온도는 M13 -아밀로이드 상호작용과 관련된다
M13은 강력하게 아밀로이드 섬유를 분해한다. 도 6은 fAβ을 이용한 티오플라빈 T (ThT) 형광 분석을 보여준다. M13 존재하에, fAβ42는 분해된다.
도 7a는 ThT 형광에서 염 농도가 10 배 변화(0.15에서 1.5 M로)되어도 분해되는 fAβ의 비율은 고작 2-3배 차이가 난다는 것을 보여준다. 이것은 소수성 상호작용이 관찰된 분해의 대부분의 원인이 된다는 것을 나타낸다.
염 농도의 상대적으로 미미한 영향과는 대조적으로, 온도가 4℃에서 37℃로 변화되면 분해는 8-10 배 차이를 초래한다는 것을 도 7b에서 보여준다.
M13 분해는 더 높은 온도에서 활성이 더 큰 단백질에 의존적이며, 분석에서 염의 영향에는 상대적으로 둔감하여, 소수성 상호작용임을 이들 결과에서 암시된다. 파지 g3p는 이러한 설명에 일치된다. 이의 N1 및 N2 도메인은 유연성 글리신-풍부한 링커에 의해 연계되는데, N2가 세균성 F-섬모에 결합시 링커는 "개방"된다. 그 다음 감염 과정의 일부분으로서 세균성 공동-수용체에 결합에 N1이 이용된다. 분해 분석에서 온도를 증가시키면 g3p의 N2 및 N1 도메인이 "개방"되는 것으로 예상된다.
고온(90℃, 10 분, 도 5 참고)에서 M13의 비활성화로 결합이 없어지지만, M13-아밀로이드 결합 분석에서 항온처리 온도를 증가시키면 결합에 대하여 양성 효과를 가진다. 온도가 18℃에서 58℃로 높아지면 결합이 감소되기 시작되는 온도인 약 50℃의 힌지 언폴딩 TM까지 점진적으로 결합이 더 좋아진다는 것을 도 8a에서 볼 수 있다. 이러한 최적의 결합 온도는 g3p에서 N1-N2 언폴딩 (소위 융점, 또는 TM) 온도, 즉 48.1℃과 일치된다. 항온처리 온도 37℃ 대비 50℃ 로 높이면 또한 fAβ42에 M13의 결합이 더 신속해진다. 도 8b.
실시예 5: M13 -β-아밀로이드 상호작용에 있어서 g3p 가 요구된다.
g3p가 M13-β-아밀로이드 상호작용에 요구되는 지를 직접 테스트하기 위하여, ArgC로 단백질분해성 처리함으로써 파지로부터 g3p가 제거되었고 (M13Δg3p), 그리고 M13Δg3p 파지는 Aβ 결합에 대하여 리폴드된 파지와 비교되었다. ArgC, 바실러스(Bacillus ) 프로테아제를 이용한 처리에 의해 파지로부터 선택적으로 g3p 하위단위들이 제거된다. 결과는 도 9a에서 제시된다. 리폴드된 M13은 경쟁 결합 분석에서 비록 감소된 수준이지만 야생형 M13과 여전히 경쟁한다. 그러나, M13Δg3p의 심지어 15배도 야생형 M13과는 경쟁이 저조하였다. 야생형 M13과의 경쟁 불능은 M13Δg3p 파지에서 감염성 상실과 일치된다. 도 9b. ArgC 처리에 의해 분해 활성의 상실이 초래되었다. 도 9c.
g3p가 감염에서 이의 역할과 유사하게 결합을 중재한다면, 그 다음 감염에 중요한 N1 및 N2 도메인 결합에 있어서 M13과 또한 경쟁해야만 한다. 이를 테스트하기 위하여, 재조합 가용성 N1N2 ("rs-g3p(N1N2)"; "구조체 3")가 준비되었고, 경쟁 분석에서 테스트되었다. 도 10a 및 10b에서 나타낸 것과 같이, M13은 fAβ42에 대한 결합에 있어서 라벨된 M13과 경쟁하지만, 그러나 M13Δg3p는 경쟁하지 않는다. 대조적으로, rs-g3p(N1N2)는 M13과 경쟁이 가능하였으며, g3p의 N1 및 N2 도메인은 β-아밀로이드 결합을 위하여 충분하다는 것을 나타낸다. 경쟁 분석의 반복에서도 유사한 결과가 획득되었다. 도　10b.
실시예 6: g3p 힌지 언폴딩 돌연변이는 아밀로이드 결합을 조절한다
힌지가 g3p의 N1 및 N2 도메인 사이를 개방하는 능력에 영향을 주는 돌연변이는 Aβ에 결합에 있어서 야생형 M13과 경쟁하는 이들 돌연변이를 보유한 파지의 능력에 또한 영향을 주어야 한다. Eckert & Schmid, 2007은 이러한 가설을 테스트하기 위하여 이용된 몇 가지 변이체 파지를 설명하였다. 변이체 "AAA" ("3A"으로도 알려짐)는 섬모 결합을 손상시키고, N2 도메인의 안정성을 감소시킨다. AAA는 g3p에 다음의 돌연변이들을 가지고 있다: W181A, F190A, 그리고 F194A. IIHY는 상기 돌연변이 T13I, T101I, Q129H, 및 D209Y를 포함하는데, 이들은 N2 도메인을 안정화시키고, 그리고 TM을 증가시킨다.
N1 및 N2 도메인 (도 2)에서 M13 g3p와 동일한 아미노산 서열을 보유한 파지 fd; M13보다 힌지 Tm이 더 높은 IIHY, 그리고 AAA에 대하여 결합 경쟁이 평가되었다. 파지 fd, AAA, 그리고 IIHY는 50℃에서 1.5 시간 동안 사전-활성화되었고, 그 다음 활성화된 그리고 비-활성화된 Fd, AAA, & IIHY는 라벨된 M13과 경쟁하는 능력에 있어서 비교되었다. 결과는 도 11에서 제시된다. 야생형 fd는 가열에 의해 활성화될 때 더 우수한 경쟁자였다. 대조적으로, 더 높은 힌지 Tm을 가진 IIHY에서 가열은 거의 효과가 없었다. M13과 비교하여 N2 도메인 안정성이 감소된 AAA는 사전 열처리없이, 또는 사전 열처리에 의해 더 우수한 경쟁자였다.
이들 데이터는 β-아밀로이드와 M13의 상호작용은 M13이 세균을 감염시키는 것과 유사한 기전을 통하여 이루어진다는 결론을 뒷받침한다. 우선, 소수성 상호작용이 M13-β-아밀로이드 상호작용에 중요함을 나타낸다. 둘째, M13 결합 및 분해 활성에 온도 의존성은 N1-N2 힌지 언폴딩 Tm을 반영한다. 셋째, g3p의 선택적 단백질분해는 M13-β-아밀로이드 상호작용을 없앤다.
실시예 7: g3p 단편은 아밀로이드에 선택적으로 그리고 강력하게 결합하지만, 단량체들에는 결합하지 않는다.
g3p 단편이 아밀로이드에 결합하는 능력을 유지하는 지를 판단하기 위하여, N1 및 N2가 포함된 g3p 단편이 준비되었고, 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 Aβ 단량체들과 비교하여 Aβ 소섬유에 대한 이들의 결합 능력이 평가되었다. rs-g3p(N1N2)는 Aβ 소섬유에 선호적으로 결합하지만, Aβ 단량체들에는 결합하지 않는다는 것을 결과에서 알 수 있다. 4μM rs-g3p(N1N2)를 이용한 표면 플라스몬 공명 연구는 도 13에 나타내며, 이 도면에서 rs-g3p(N1N2) 결합의 KD는 약 160 nM임을 또한 알 수 있다. 이러한 높은 친화력 상호작용은 특이적 결합 과정이 rs-g3p(N1N2)와 아밀로이드 섬유 사이에서 일어난다는 것을 나타낸다.
SPR을 이용하여 추가 구조체들이 평가되었다. 하기 표에 이 결과들이 요약되어 있다.
Figure 112015042302843-pct00003
실시예 8: g3p 단편은 Aβ 42 섬유가 어셈블리되는 능력을 강력하게 차단시킨다 .
g3p 단편이 아밀로이드 섬유의 어셈블리를 차단시킬 수 있는 지를 테스트하기 위하여, fAβ42 소섬유의 어셈블리릴 차단시키는 rs-g3p(N1N2) 능력은 ThT 형광 분석에서 테스트되었다. rs-g3p(N1N2)은 Aβ42의 어셈블리를 강력하게 차단시킨다는 것이 결과로 나타났다. 도 14a는 실험 결과를 보여주는데, rs-g3p(N1N2)는 투여분량 의존적 방식으로 Aβ42가 섬유로 어셈블리되는 것을 막는다. 도 14b는 IC50가 대략적으로 20 nM임을 보여준다.
별도 실험에서, Aβ42는 2 μM의 rs-g3p(N1N2)와 함께, 또는 없이 37℃에서 7일간 항온처리되었고, 그리고 Aβ42 섬유의 일체성은 전자 전달 현미경사진에 의해 평가되었다. 도 15a는 실험 결과를 보여주는데, rs-g3p(N1N2)는 Aβ42가 아밀로이드 섬유로 어셈블리되는 능력을 차단한다. 도 15b는 이들 동일한 시료에서 ThT 분석를 보여준다.
실시예 9: rs - g3p ( N1N2 )는 α- 시누클레인 , ftau , 그리고 Aβ 어셈블리를 차단시키고, 그리고 g3p - Ig 융합 단백질은 Aβ의 어셈블리를 차단시키고 , 응집을 저해시킨다.
g3p가 α-시누클레인 섬유 어셈블리를 차단시킬 수 있는 지를 판단하고, 그리고 결합가(valency) (가령, g3p의 복사체의 수)가 역할을 하는지를 또한 판단하기 위하여, 오량체 g3p (g3p의 5개 복사체) 및 단량체 g3p (g3p의 한 개 복사체)가 α-시누클레인 활성을 차단시키는 능력을 테스트하는 분석이 실행되었다. g3p는 α-시누클레인 섬유 어셈블리를 차단시키고, 그리고 이 활성에서 오량체 g3p가 단량체 g3p 보다 더 효과적이라는 것을 결과에서 보여준다. 도 16 참고.
Aβ42의 어셈블리를 저해하는 rs-g3p(N1N2) (구조체 3) 및 대표적인 g3p 융합 단백질, rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)의 능력 또한 평가되었다. 도 30 및 도 31에서 나타낸 것과 같이, 구조체 3 및 구조체 6은 용량-의존적 방식으로 fAβ42의 어셈블리를 저해할 수 있다. 도 37에서 나타낸 것과 같이, 구조체 3 및 구조체 6은 fAβ42 응집을 저해할 수 있다.
ftau의 어셈블리를 저해하는 rs-g3p(N1N2) (구조체 3)의 능력 또한 평가되었다. 도 44a 및 도 44b에서 나타낸 것과 같이, 구조체 3은 용량-의존적 방식으로 ftau의 어셈블리를 저해할 수 있다.
실시예 10: g3p 융합 단백질은 Aβ 에 결합하여 이를 분해시킨다.
g3p 결합가가 아밀로이드에 g3p의 결합 능력에 역할을 하는 지를 평가하기 위하여, rs-g3p(N1N2) ("rs-g3p(N1N2)-Ig 융합")에 대하여 이가인(bivalent) Ig 융합 단백질이 만들어졌고, Aβ 섬유에 결합하는 능력에 있어서 오결합가(pentavalent)의 M13과 비교되었다. 도 17에서 나타낸 것과 같이, rs-g3p(N1N2)-Ig 융합은 M13과 유사한 친화력으로 Aβ에 결합하고, rs-g3p(N1N2) 단독보다는 더 강력하였으며, 이는 g3p의 결합가가 중요할 수 있음을 암시한다. 경쟁 분석의 반복에서도 유사한 결과가 획득되었다. 도 18. 도 18에서, 사각형은 구조체 2 (M13)을 나타내고; 삼각형은 구조체 3 (rs-g3p(N1N2))을 나타내고; 역 삼각형은 구조체 4 (rs-g3p(N1N2)-Ig 융합)를 나타내고; 그리고 다이아몬드는 r-IgG4 Fc 음성 대조를 나타낸다.
본 발명의 g3p 융합 단백질은 비-아밀로이드 단백질 및 중합체, 이를 테면, 예를 들면, 소수성 단백질 및 단백질 중합체에 비-특이적으로 결합하지 않는다는 것을 확인하기 위하여, 비-아밀로이드 단백질/중합체 카제인 (소수성), 젤라틴 (중합체), 엘라스틴 (콜라겐 중합체), 그리고 소 혈청 알부민 (소수성 혈청 단백질)에 대한 구조체 6 (50 nM 또는 200 nM)의 결합을 테스트하였다. Aβ42 섬유는 양성 대조로 이용되었다. ELISA 포멧이 이용되었는데, 이때 각 테스트 단백질 100 ng은 높은 흡착성 미량적정 웰 (테스트된 2가지 유형)에 고정되며, 이어서 구조체 6 또는 무관한 IgG1 항체 음성 대조 (200 nM)와 함께 1 hr동안 37℃에서 항온처리되었다. 서양고추냉이 과산화효소(HRP)에 결합된 항-인간-Fc 항체를 이용하여 차단 및 세척 단계 이후 결합된 구조체 6 또는 IgG1 음성 대조의 탐지가 실행되었다. HRP 현상액(developer)을 추가한 후 405nm에서 흡수도를 측정함으로써 정량화되었다. 구조체 6은 비-아밀로이드 단백질 중합체 또는 소수성 단백질과 비교하였을 때 선호적으로 아밀로이드 섬유에 결합되었다는 것을 결과에서 보여준다. 비-아밀로이드 단백질에 구조체 6의 결합은 무관한 hIgG1- 음성 대조 항체에 필적되었다.
결합가 역시 분해에 있어서 역할을 하는지를 판단하기 위하여, 필터 트랩 분석에서 이가 rs-g3p(N1N2)-Ig 융합 ("구조체 4")이 오결합가 M13과 비교되었다. 도 19. 이가 rs-g3p(N1N2)-Ig 융합 및 오결합가 M13은 모두 β-아밀로이드 섬유를 강력하게 분해시킨다는 것을 이 결과에서 나타난다. 1.7nM 오결합가 M13이 40 nM rs-g3p(N1N2)-Ig 융합과 유사한 수준에서 응집체를 감소시킨다는 것으로 나타난 것과 같이, 결합가는 분해 능력에 중요할 수 있음을 또한 나타낸다. 도 19.
유사한 분석에서, 1 x 1012/ml M13 (구조체 2); 80 nm 및 800 nM rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 5); 그리고 80 nm 및 800 nM의 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)는 필터 트랩 분석에서 Aβ42 섬유를 분해하는 이들 능력에 대하여 분석되었다. 구조체 2, 5, 및 6은 β-아밀로이드 섬유를 강력하게 분해시킨다. 도 33. 따라서, g3p 융합 단백질은 아밀로이드가 존재하는 임의의 질환 또는 장애를 치료요법적으로 또는 예방차원으로 치료하는데 이용될 수 있다.
실시예 11: 사량체 스트랩타아비딘 -[ 바이오틴 -g3p( N1N2 )] 단백질은 fAβ에 결합하여 이를 분해시킨다 .
아밀로이드에 결합하고, 이를 분해시키는 g3p의 능력에 있어서 결합가의 역할을 더 평가하기 위하여, 사량체 스트랩타아비딘 결합된 g3p(N1N2)는 NiSO4 존재하에서 rs-g3p(N1N2)에 바이오틴-Lys-NTA를 복합시켜 준비되었다. MWCO 3KDa 막을 이용하여 과량의 리간드들은 제거되었다. 스트렙타비딘이 추가되었으며, 과량의 rs-g3p(N1N2)-바이오틴은 MWCO 100 KDa 막을 이용하여 제거되었다. 생성된 g3p 구조체, 스트랩타아비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]는 4개의 rs-g3p(N1N2) 모이어티를 보유한다. 결합 분석에서 스트렙타비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]은 rs-g3p(N1N2) ("구조체 3")과 비교되었다. 도 20. 사량체 스트랩타아비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]은 단량체 rs-g3p(N1N2)보다는 fAβ에 더 강력하게 결합되었으며, 이로써 결합의 능력에 결합가가 중요하다는 것을 추가로 나타낸다. 도 20. 그러나, 단량체 rs-g3p(N1N2)는 치료적으로 수용가능한 수준으로 fAβ에 결합하였다.
결합가 역시 분해에 있어서 역할을 하는지를 판단하기 위하여, 필터 트랩 분석에서 단량체 rs-g3p(N1N2)는 사량체 스트랩타아비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]과 비교되었다. 도 21. 단량체 rs-g3p(N1N2)와 사량체 스트랩타아비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]은 모두 fAβ 섬유를 강력하게 분해한다는 것을 결과에서 나타낸다. 2.5μM 단량체 rs-g3p(N1N2)에 의한 Aβ의 감소된 분해와 비교하였을 때, 360 nM 사량체 스트랩타아비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]이 최대 200 ng fAβ 응집체를 제거하는 우위의 능력으로 나타난 것과 같이, 결합가는 분해 능력에 중요할 수 있음을 또한 나타낸다. 도 21에서, 예를 들면, 줄 2는 줄 4에 비교되었다.
스트랩타아비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)]에 의한 Aβ의 분해는 TEM에 의해 또한 평가되었다. 3일의 항온처리 후 스트렙타비딘-[바이오틴-g3p(N1N2)] 는 fAβ42를 완전하게 분해하였다. 도 22.
실시예 12: g3p - Ig 융합 단백질은 알츠하이머 질환의 뮤린 모델에서 기존의 Aβ 플락을 상당히 감소시켰다.
알츠하이머 질환의 연구용으로 잘 알려진 마우스 모델을 이용하여 (Hsiao et al., Science (1996) 274:99-102; Duyckaerts et al., Acta Neuropathol (2008) 115:5-38), 일령이 500일 이상인 Tg2576 수컷 마우스에게 상이한 2가지 준비물 N1N2-Ig 융합 (구조체 5, 7.8 μg/주사 그리고 구조체 6, 8.2 μg/주사) 또는 음성 대조로 염수를 해마의 양측으로 주사(2 μL/주사) 되었으며, 그리고 7일차에 희생시켰다.　뇌 조직이 수거되었고, 절단되었고, 항-아밀로이드 베타 단클론성 항체를 이용한 플락 부하 정량화를 위하여 착색되었다 (82E1; cat.# MBS490005-IJ10323, MyBioSource). 도 28에 나타낸 것과 같이, 염수-처리된 마우스와 비교하였을 때, 두 가지 N1N2-Ig 융합 단백질은 해마에서 측정된 플랏 부하를 상당히 감소시켰다. 도　29에서 나타낸 것과 같이, 염수-처리된 마우스와 비교하였을 때, 두 가지 N1N2-Ig 융합 단백질은 대뇌피질에서 측정된 플랏 부하를 상당히 감소시켰다.　
시냅스에 있는 뉴런의 성분인 시냅토피신의 수준은 구조체 5 및 6으로 처리된 후 Tg2576 마우스의 해마에서 측정되었다. 항-시냅토피신 SY38 항체 (Milliporte)가 이용되었다. 시냅토피신 수준은 시냅스 밀도와 관련있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 증가된 발현은 기존의 플락 손상으로부터 회복을 의미한다. DaRocha-Souto et al. (2011) J. Neuropathol Exp Neurol 70(5):360-376 참고. 도 40에서 나타낸 것과 같이, N1N2-IgG 융합 단백질은 모두 알츠하이머 질환 마우스의 해마내 시냅토피신의 수준을 상당히 증가시켰다. 플락의 수준을 감소시키는 것에 추가하여, N1N2-Ig 융합 단백질로 알츠하이머 질환 마우스를 처리하면 추가 생리학적 이점이 초래된다는 것을 결과에서 나타낸다.
유사하게, 플락 청소에 필수적인 것으로 간주되는 (가령, Wilcock et al. (2004) J. Neurosci, 24(27):6144-6151 참고) 소교세포 활성화의 표지가 되는 Iba-1의 수준은 Tg2576 마우스를 구조체 5 및 6으로 처리한 후 항-Iba-1 항체를 이용하여 이 마우스의 해마에서 측정되었다. 도 41에서 나타낸 것과 같이, N1N2-IgG 융합 단백질은 모두 처리 후 7일/주일에 테스트하였을 때, 알츠하이머 질환 마우스의 해마내 Iba-1의 수준을 상당히 증가시켰다. 이들 결과는 알츠하이머 질환 마우스를 N1N2-Ig 융합 단백질로 처리하면 플락이 청소된다는 것을 확인시킨다.
별아교세포 활성화 및 뇌 염증의 표지가 되는 아교세포 소섬유성 산성 단백질 (GFAP)의 수준은 구조체 5 및 6으로 처리된 후 Tg2576 마우스의 해마에서 항-GFAP 항체 (Millipore # AB5804)를 이용하여 측정되었다. GFAP 수준은 뇌에 손상 증가로 알려져 있다. 가령, DaRocha-Souto et al.,(2011) J. Neuropathol Exp Neurol 70(5):360-376, 페이지 374 참고. 따라서, 상기 처리가 GFAP 수준을 증가시키는 지를 평가하기 위하여 임의의 특정 처리 후 GFAP가 표지로 이용될 수 있으며, 이는 상기 처리가 뇌를 손상시킬 수 있음을 나타낸다. 도 42에서 나타낸 것과 같이, N1N2-IgG 융합 단백질은 알츠하이머 질환 마우스의 해마에서 GFAP의 수준을 상당히 증가시키지 않았으며, 이로써 알츠하이머 질환 마우스를 N1N2-Ig 융합 단백질로 처리하여도 해마가 손상되지 않음을 암시한다. 따라서, g3p 융합 단백질은 알츠하이머 질환을 치료요법적으로 또는 예방차원으로 치료하는데 이용될 수 있다.
실시예 13: g3p - Ig 융합 단백질은 Aβ 올리고머 유도된 세포독성을 차단시킨다 .
Aβ 올리고머들은 신경 세포에서 특정 독성 효소의 방출의 원인이 된다. 화합물이 Aβ 올리고머 유도된 세포독성을 저해시킬 수 있는지를 판단하기 위하여 상기 효소가 분석될 수 있다. 도 32는 대표적인 데이터를 제시하는데, M13 (구조체 2) 및 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)는 N2a 세포에 올리고머-유도된 독성을 차단시키는 것을 보여준다. 따라서 g3p-Ig 융합 단백질은 Aβ 올리고머 유도된 세포독성의 잠재적 저해제들이다.
실시예 14: g3p - Ig 융합 단백질은 tau 에 결합하고, 이를 분해하며, 나이든 3 xTg 마우스와 나이든 tau 유전자삽입 마우스에서 Aβ 플락 & p- tau 을 감소시킨다.
g3p-Ig 융합 단백질이 tau에 결합하는 지를 평가하기 위하여, N1 및 N2가 포함된 g3p 단편-Ig 융합 단백질이 준비되었고, 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 A 단량체들과 비교하여 ftau에 대한 이의 결합 능력이 평가되었다. 도 35는 rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (구조체 4)는 ftau에 강력하게 결합된다는 것을 보여주는 한 가지 대표적인 SPR 분석 결과를 보여준다. 도 48은 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 는 ftau에 강력하게 결합된다는 것을 보여주는 또다른 대표적인 SPR 분석 결과를 보여준다.
g3p-Ig 융합 단백질이 tau를 분해할 수 있는 지를 테스트하기 위하여, ThT 형광 분석에서 N1 및 N2가 포함된 g3p 단편-Ig 융합 단백질은 사전 형성된 ftau를 분해하는 이의 능력에 대하여 테스트되었다. g3p-Ig 융합 단백질은 ftau를 강력하게 분해시킨다는 것이 결과에서 나타난다. 도 36a, 도 36b, 도 49a, 그리고 도 49b 참고.
g3p-Ig 융합 단백질이 생체내에서 효과적인 지를 테스트하기 위하여, 알츠하이머 질환의 모델로 인식되는 19-20 월령의 암수 3xTg 마우스 (Sterniczuk et al., 2010 Brain Res 1348:139; Sterniczuk et al., 2010 Brain Res 1348:149)에게 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 또는 대조를 뇌의 해마 영역으로 직접 주사하였다. 뇌 조직은 주사 후 7일 시점에서 수거되었다. 절단물은 Aβ 플락에 대하여 항-아밀로이드 베타 단클론성 항체 (82E1; cat# MBS490005-IJ10323, MyBioSource)로 면역 착색되거나, 또는 p-Tau에 대하여 항-PHF1 항체로 면역 착색되었다 (Kosik et al., 1986, Proc Natl Acad Sci USA 83(11): 4044; PHF = 쌍을 이룬 나선형 섬유(들)). 쌍을 이룬 나선형 섬유는 tau-포함된 섬유의 한 가지 패밀리로, 신경원섬유 매듭으로 공지된 큰 세포질 응집체에 축적되며, 그리고 tau에 대한 표지로 인식된다. 구조체 6은 대조와 비교하였을 때, 처리된 마우스의 해마내 Aβ 플락 수준을 상당히 감소시킨 것을 결과에서 보여준다. 도 52a 참고. 구조체 6은 대조와 비교하였을 때, 처리된 마우스의 해마내 tau 수준을 상당히 감소시킨 것을 결과에서 보여준다. 도 52b 참고. 원-테일 Dunnett의 테스트 (* p < 0.05; ** p < 0.01)가 이용되었다.
상이한 생체내 모델에서 본 발명의 g3p 융합 단백질이 tau를 감소시키는 능력을 평가하기 위하여, 나이든 tau(P301L) 유전자삽입 마우스들이 연구되었다. Tau(P301L) 마우스는 tau를 과다발현시키고, 알츠하이머 질환을 연구하기 위한 모델로 인식된다. Lewis J et al. (2000) Nat Genet 25:402-405 참고. 나이든 P301L 마우스는 tau 병리학과 연합된 표현형으로서 눈에 띄는 과소 활동을 나타낸다. 구조체 6 (약 2 mg/Kg)는 tau(P301L) 마우스 (N=7)에 이식된 척추강 펌프를 통하여 14 일 동안 장기적으로 척추에 주입되었다. 14 일 후, 운동 활성(10분에 걸쳐 이동된 거리)에 대해 블라인드 방식으로 마우스들을 관찰하였다. 구조체 6 처리된 마우스는 상당히 많은 운동 활성을 보여주었지만, PBS 처리된 마우스는 그러지 못하였다. 구조체 6은 야생형 마우스 (N=10)에서는 효과가 없었다. 따라서, 본 발명의 g3p 융합 단백질은 tau가 존재하는 임의의 질환 또는 장애를 치료요법적으로 또는 예방차원으로 치료하는데 이용될 수 있다.
실시예 15: g3p - Ig 융합 단백질은 프리온 질환의 세포 배양물 모델 ( N2a22L Sc )에서 PrP Sc 축적, 응집, 그리고 PrP Sc 형성을 저해한다.
프리온 질환은 정상적인 세포의 프리온 단백질 (PrPc)이 프로테아제-저항성 병리학적 형태 PrPSc로 전환되는 것을 특징으로 한다. PrPSc는 프로테아제 저항에 근거하여 PrPc와 구별되는데: 프로테아제는 부분적으로 PrPSc를 분해시켜 프로테아제-저항성 C-말단 코어 단편 (PrPres)을 만들고, 이는 19-21 kDa의 분자량을 가진 글리코실화안된 형태를 가진다. PrPSc의 저해, 역전 및 감소는 몇 가지 퇴행성 질환의 치료에 대한 실행가능한 치료로 구성된다.
N1 및 N2가 g3p-Ig 융합 단백질이 프리온 질환의 시험관 모델에서 병리학적 프리온 이형태체(PrPSc)의 형성을 간섭하는지를 판단하고, 그리고 g3p-Ig 융합 단백질의 존재 또는 부재하에 N2a22LSc 세포에서 PrP의 용해도의 변화 또는 분해를 증명하기 위하여, 세포는 1 μg/ml 구조체 6 또는 IgG 존재 또는 부재하에 24시간 동안 배양되었고, 그리고 용해 완충액에서 수거되었다. 100 μg의 총 단백질은 Beckman Optima TL 초원심분리기의 TLA 100.1 로터에서 55,000rpm으로 4℃에서 초원심분리되었다. 가용화된 펠렛 및 상청액의 25μl 시료는 SDS-PAGE되고, 그리고 항-PrP 항체 6D11 mAb를 이용한 분석을 거치게된다. 증가된 세제 불용성은 PrPSc 또는 PrP 돌연변이체에 의한 단백질분해효소 K (PK) 저항을 능가하고, 따라서 PrP 용해도를 변경시키는 g3p-Ig 융합 단백질의 능력이 평가되었다. 구조체 6-처리된 세포는 IgG 처리된 N2a22LSc 세포와 비교하였을 때, 응집된/불용성 PrP의 양이 상당히 감소된 것으로 나타났다. 도 38a 및 도 38b 참고.
도 38a 및 38b의 경우, N2a22LSc 세포는 이전에 설명된 것과 같이 생성되었다(Pankiewicz et al., Eur. J. Neurosci(2006) 23:2635-2647). 간략하게 설명하자면, 마우스-적응된 22L 프리온 균주에 감염된 말기 질환 CD-1 마우스의 뇌는 멸균 상태에서 냉각 인산염-완충된 염수와 5% 덱스트로즈에서 초음파파쇄됨으로써(10% 중량/용적) 균질화되었다. 감염을 위하여, 뇌 균질화물은 Opti-MEM에서 2%로 추가 희석되었으며, 10-cm2 웰당 1mL로 준합류 6-웰 플레이트(Corning, Acton, MA, USA)에 추가되었다. 5 h 후, 1 mL의 정규 MEM이 추가되었고, 세포는 추가 12시간 동안 감염성 뇌 균질화물 존재하에 항온처리되었다. 상기 세포는 세척되었으며, 표준 MEM 성장 배지가 추가되었다. 세포들은 합류될 때까지 성장되었으며, 그 다음 1:2 희석으로 분리되어, 25-cm2 플라스크 (Corning)로 옮겨졌다. 플라스크들중 하나의 플라스크에서 성장된 세포는 매4일마다 1:2로 분할되어, 후속 계대를 만들었고, 한편 다른 플라스크에서 성장된 세포는 수거되어, 균질화되어 PrPSc의 수준이 측정되었다. 앞선 연구를 바탕으로, 접종 유도된 PrPSc의 존재는 제 1 및 제 2 계대에서만 탐지되며, 따라서 계대 4 (P4) 세포는 모든 후속 연구에 이용되었다. 균질화 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 1 mM Na3V04, 1 mM NaF, 2.5 mM Na4P2O7, 1 mM β-글리세로포스페이트, 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜레이트 나트륨, 0.5 mM 페닐메틸술포닐플로라이드 (PMSF), 1 mM 류펩틴, 1 mM 펩스타틴 A, 1 mM) 또는 PK 절단을 위하여 PMSF 없이)에서 5 분간 4℃에서 세포들이 용해되었으며, 4℃에서 10분간 10,000g에서 원심분리시켜 불용성 물질들이 제거되었다. 세포의 분획화를 위하여, 100 μg의 단백질은 55,000 rpm에서 90 분간 회전되었고, 그 다음 펠렛은 출발 용적에서 재구성되었다. 펠렛 및 상청액의 20%가 해리되었고, 생화학적으로 특징화되었다.
g3p-Ig 융합 단백질이 이의 물리화학적 성질의 분해 또는 변경에 의해 용량-의존적으로 PrPSc증식을 변경시키는 지를 파악하기 위하여, N2a22LSc 세포는 구조체 6 또는 IgG의 농도를 증가시키면서 또는 이들 없이 24시간 동안 배양되었고, 그리고 용해 완충액에서 수거되었다. PK 처리와 함께, 그리고 처리없이 용해된 세포 분획은 SDS-PAGE를 거치고, 항-PrP 항체 6D11 및 6H4 mAb을 이용한 분석을 거치게 된다. 대조 IgG 및 구조체 6-처리된 세포로부터 생화학적으로 해리된 PK 절단된 그리고 절단안된 용해물에서 PrP 면역반응성이 평가되었다. 처리는 다음을 포함한다: N2a22LSc + 10μg/ml, 3μg/ml, 1μg/ml, 0.333μg/ml, 0.111μg/ml, 0.037μg/ml, 0.012μg/ml, 그리고 0.004μg/ml 구조체 6, 또는 N2a22LSc + 1μg/ml mIgG.
결과는 구조체 6 존재하에 PrPSc의 상당한 용량-의존적 감소를 나타내며, 1μg/ml IgG와 비교하였을 때, 0.08μg/ml 구조체 6 존재하에 50% 적은 PrPSc가 생성되었다. 도 39a 및 도 39b 참고. 반복된 실험으로 이들 결과를 확인하였다.
PrP의 단백질분해효소 K (PK)-저항성 이형태체를 평가하기 위하여, 용해된 세포의 분획물은 기존 방법에 따라 37℃에서 30 분간 PK (1μg/μg) 1:50 희석물로 처리되었다(Perrier et al., J. Neurochem (2004) 84:454-463, Pankiewicz et al., Eur J Neurosci (2006) 23:2635-2647). 항온처리 후, PMSF를 4 mM이 되도록 첨가함으로써 절단(digestion)은 중단되었다.
BCA 단백질 분석 키트 (Pierce)를 이용하여 단백질 농도가 측정되었다. 시료는 시료 완충액 (250 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% SDS, 5 mM β-멀캅토에탄올, 50% 글리세롤, 0.02% 코마시 블루 G250)에서 희석되었고, 5분간 가열되었다. 처리된 시료들은 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 해리되었다.
항-PrP 단클론성 항체 6D11 (Sadowski et al.(2009) Neurobiol Dis 34(2): 267-278 참고) 및 6H4 (Cordes et al.(2008) J Immunol Methods 337:106-120 참고) 뿐만 아니라 항-액틴을 이용하여 시료를 특징화시켰다. 항원-항체 복합체들은 양고추냉이 과산화효소-결합된 항-마우스 IgG (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 탐지되었으며, 제조업자의 지시에 따라 ECL 시스템 (GE Healthcare UK Limited)을 이용하여 시각화되었다. 단백질 밴드의 정량화는 필름의 농도 분석에 의해 실행되었다 (Image J, NIH).
이와 함께, 도 38a 및 38b 그리고 도 39a 및 39b의 결과에서 g3p-Ig 융합 단백질은 시험관에서 PrPSc 형성을 직접적으로 저해한다는 것이 설명된다. 따라서, 본 발명의 g3p 융합 단백질은 프리온이 존재하는 임의의 질환 또는 장애를 치료요법적으로 또는 예방차원으로 치료하는데 이용될 수 있다.
실시예 16: NMR 연구
rs-g3p(N1N2) (구조체 3)와 상호작용하는 fAβ42에 있는 잔기를 평가하기 위하여, 15N-HSQC NMR을 이용하여 fAβ42의 수소/중수소(H/D) 교환 거동이 분석되었다. 가령, Sanchez et al. (2011) J.Am.Chem Soc 133:6505-08 참고. 섬유로부터 Aβ 분자들의 해리 속도를 확인하고, 아밀로이드 섬유상에 나타나는 결합 모이어티를 결정하고, 그리고 섬유 구조가 구조체 3의 결합에 의해 동요되는지를 감시하기 위하여 기본골격 아미드 수소들의 수소/중수소(H/D) 교환이 측정되었다.
균일하게 15N-라벨된 Aβ 단량체들로부터 성숙된 아밀로이드 섬유 (fAβ42)가 생성되었고, 구조체 3의 존재 또는 부재하에 0 내지 744 시간 (0-31 일)동안 37℃에서 D2O에 노출되었다. 구조체 3에 노출된 후, 상기 섬유는 동결건조되었으며, 동결건조된 물질은 디메틸술폭시드/디클로로아세트산 (DMSO/DCA) 용매에 용해되었다. 각 아미노산에 연합된 H와 D의 비율은 15N-HSQC NMR 스펙트럼을 이용하여 측정되었다. 일부 추가 H/D 교환이 DMSO/DCA 용액에서 발생되기 때문에, D2O에 섬유의 각 노출 시간에 있어서, DMSO/DCA 용액내 H에 대한 D의 시간 의존성이 측정되었으며, 이 데이터는 DMSO/DCA에서 해리 시간으로 외삽되었다. 이 방법에 대하여 가령, Whittemore et al. (2005) Biochemistry 44:4434-41 및 Sanchez et al. (2011) J. Am. Chem Soc 133:6505-08 참고.
1:3의 구조체 3: fAβ42 (25:75 μM) 화학량론적 비율에서 구조체 3 존재 및 부재하에 H/D 교환 실험이 실행되었다. 포화된 결합을 담보하기 위하여 10-배 과량이 이용되었다.
결과에서 H/D 교환은 Aβ 섬유, 및 다른 아밀로이드에 대하여 기존에 관찰된 것과 같이(Yamaguchi et al. (2004) J. Mol. Bio 338:559-571; Sanchez et al., 2011), 단일 상 과정에 따르지 않는다는 것을 나타낸다. 구조체 3 없이, Aβ1-42 서열의 2개 스트래취, 잔기 17-27 및 31-40은 H/D 교환으로부터 상대적으로 보호되었음을 상기 교환 프로파일에서 알 수 있다. 구조체 3의 추가로 증가된 잔기 17-22 및 33-40에 대한 보호가 증가되었다. 따라서, 구조체 3은 소수성 코어 잔기를 통하여 Aβ 섬유를 인지한다는 것이 결과에서 나타난다. 잔기 18, 32, 36 및 41은 신호 중첩으로 인하여 생략되었으며, 잔기 2, 7, 8, 14, 30 및 38은 DMSO/DCA 해리 불감시간(dead time)에 교환되었고, 따라서 이들 잔기에서 효과는 보고되지 않았으며, 이들의 기여는 인접 아미노산의 데이터로부터만 추론될 수 있다.
이들 결과는 보호가 교환의 더 느린 상에서 주로 현시되어, 교환이 강력하게 억제된다는 것을 나타낸다.
구조체 3과 fAβ42 사이의 상호작용은 또한 TEM에 의해 분석되었다. 구조체 3와 사전형성된 fAβ42를 744 시간 동안 항온처리하면, 무정형 응집체가 증가되고, 따라서 사전형성된 fAβ42가 분해된다는 것을 결과에서 보여준다. pH 2.0에서 생성된 fAβ42의 TEM은 섬유의 조밀한 망을 보여주었고, 그리고 10-배 희석은 흔히 형태를 명백하게 결정하는데 필수적이었다. 형성된 섬유는 Aβ42에서 관찰된 것과(Olofsson et al. (2006) J. Biol Chem 281:477-83) 그리고 꼬인(twisted) Aβ40 (Petkova et al. (2005) Science 307:262-65)에서 관찰된 것과 유사하게, 꼬임이 관찰되며, 그리고 측면 연합이 거의 없는 명백한 개별 섬유였다. 무정형 응집체는 상대적으로 드물고, 올리고머 구조는 소량의 배경 종과 같이 대부분의 영상에서 관찰되었다. 소량의 섬유와 함께, 올리고머와 무정형 응집체들은 190 000 RCFMAX에서 원심분리 후 남아있는 상청액의 영상에서 더 많은 빈도로 관찰되었다.
H/D 교환 시기 (pH 7.4 완충액) 동안 취한 그러나 원심분리되지 않은 시료의 TEM은 원 준비물과 비교하여 무정형 응집체의 양이 증가되었음을 나타내었다. 무정형 응집체들은 fAβ42와 함께 원심분리되지 않았다. 744 시간 후, 원심분리안된 물질은 구조체 3이 존재할 때 섬유를 덜 포함하였다. 따라서, 744 시간에서 구조체 3은 사전형성된 fAβ42를 분해한다.
실험 과정은 도 45에 나타낸다. 도 46은 구조체 3과 상호작용하는 fAβ42의 잔기를 그래프로 나타낸 것을 보여준다 도 47은 744 시간에서 사전형성된 fAβ42를 분해하는 구조체 3의 대표 TEM을 보여준다.
실시예 17: If1 N1N2 융합 단백질은 fAβ42에 강력하게 결합한다.
If1 파지 및 M13 파지는 g3p의 N1 도메인에서 약 30% 동일성을 공유하지만, N2 도메인에서는 실질적인 동일성은 없다. g3p N1N2-IgG-Fc 융합 구조체가 만들어졌고, 이때 g3p의 N1N2 영역은 If1 파지로부터 유래된 것이다(구조체 8; 서열번호:31 및 32). Aβ 섬유에 대한 구조체 8의 결합 친화력을 결정하기 위하여 SPR에 의해 구조체 8이 분석되었다. 100μM Aβ42 섬유 ( 10mM HCl에서 3 일 동안 어셈블리된 rPeptide Aβ1-42)는 10mM NaAc pH 5.0와 1:1로 혼합되었으며, CM3 표면에 고정되었다. 이동(running) 완충액 [10mM HEPES pH7.5, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20] 안에 대략 2μM 구조체 3 (N1N2 g3p 비-융합 단백질)과 구조체 8은 10-12 분동안 5μl/분으로 바이오칩의 표면을 통과하였다. 모든 시료는 25℃에서 준비되었다. 도 50a에 결과를 나타낸다. 구조체 8은 ~ 36 nM의 KD로 Aβ 소섬유에 강력하게 결합한다. g3p의 N1N2 단편 (Fc 도메인에 연계되지 않음)은 더 약한 결합 (KD ~ 36 nM)을 보여주었다.
그 다음, If1 N1N2 g3p 및 M13 N1N2 g3p가 fAβ에 결합하는 능력을 비교하기 위하여 또다른 아밀로이드 섬유 결합 분석이 실행되었다. 이 분석에서, 복합체들이 형성되도록 2-3시간 동안 M13-Alexa488은 Aβ (fAβ)와 혼합되었고, 테스트 구조체들 (If1 N1N2 g3p 및 M13 N1N2 g3p; 둘 다 Fc 도메인 없음)이 추가되었으며, 그 다음 상기 복합체들은 7500xg에서 10 분 동안 원심분리에 의해 침전된다. 펠렛에서 형광은 아밀로이드에 결합된 M13에 비례되었다. 이 분석은 fAβ에 대한 파지의 결합을 정량적 척도로 제공하며, 그리고 결합에 있어서 파지와 경쟁하는 다른 물질의 능력을 평가하기 위한 시스템을 제공한다. 도 50b은 이 결과를 나타내는데, If1 N1N2 g3p는 M13 N1N2 g3p보다 약 4배 더 잘 결합한다는 결과를 보여준다.
실시예 18: g3p - Ig 융합 단백질은 아밀로이드를 감소시키고, 나이든 Tg2576 마우스의 전신으로 투여되었을 때 마우스에서 아밀로이드를 감소시키고, 알츠하이머 질환과 연합된 거동을 개선시킨다.
g3p-Ig 융합 단백질이 전신 투여될 때 알츠하이머 질환 치료에 효과적인 지를 판단하기 위하여, 10mg/kg의 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6) 또는 PBS는 나이든 Tg2576 마우스 (21 내지 23 월령의 퇴물 수컷 번식 동물)의 복막 안으로 투여되었다. 전신으로 투여된 rs-g3p(N1N2)-hIgG1-Fc (구조체 6)에 대한 잠재적 말초 면역 반응을 억제시키기 위하여 모든 마우스는 항-CD4 전-처리 (0.5 mg-IP)를 받았다.
3주차에, 근간대성 코너 점핑(myoclonic corner jumping)에 대하여 마우스를 평가하는데, 이로 인하여 해마, 선조체, 그리고 운동 협응 및 조절(뇌간, 소뇌, 운동 피질)에 관련된 영역들의 기능이 평가된다. Lalonde & Strazielle, 2012, Neurosci Res, 74(2):69 참고. 이 거동은 후기 알츠하이머 질환을 가진 환자에서 볼 수 있는 근간대경련과 유사하다. Lalonde et al, 2012, Rev. Neurosci, 23(4):363 참고. 마우스들은 5분 동안 지속적인 점핑 및/또는 기어오르려는 거동의 발작 횟수 및 새로운 환경에서 관찰되며, 한편 우리의 모퉁이를 들이받는 것이 주목된다. 구조체 6을 제공받은 마우스는 대조 PBS를 제공받은 마우스와 비교하였을 때 근단대성 코너 점핑 사건이 상당히 줄었음을 결과에서 알 수 있다. 도 55 참고.
6주 차에, 총 거리 달리기(도 53a 및 도 53b) 및 빙글빙글 도는 활동(도 54)를 평가함으로써 과다 활성에 대하여 마우스가 평가되었다. 이들 분석은 새로운 환경에서 이동된 총 거리를 측정함으로써 과다활성의 개선을 테스트한다. 이들 거동 분석은 AD 환자에서 통상적으로 관찰되는 고조된 동요를 모델로 한다. Mega et al., 1996 Neurology 46:130; 그리고 King et al., 1999 Brain Res, 103:145 참고. 40 cm x 40 cm 사각지역에 10분간 마우스를 두고, 비디오 추적 시스템을 이용하여 실시간으로 자발적 이동 및 거동이 등급화되었다. 구조체 6을 제공받은 마우스는 대조 PBS를 제공받은 마우스와 비교하였을 때 자발적 운동 활성이 상당히 줄었음을 결과에서 알 수 있다. 도 53a 및 53b 참고. 구조체 6을 제공받은 마우스는 대조 PBS를 제공받은 마우스와 비교하였을 때, 감소된 빙글빙글 도는 거동을 나타내었다. 도 54 참고.
9주차, Y-형 미로에서 자발적 교체 행동(spontaneous alternation)에 대하여 마우스가 평가되는데, 이 평가는 설치류에서 단기간 공간적 기억 및 새로운 탐사를 평가한다. Hughes, 2004 Neurosci & Biobehav Rev, 28:497 참고. 도 56 참고. 단기 기억에 손상된 마우스, 이를 테면 Tg2576 마우스 모델은 단기 기억이 정상인 마우스와 비교하여 자발적 교체 행동을 덜 나타낸다. 이 테스트는 AD 환자에서 볼 수 있는 단기 기억 및 공간 기억 손상을 흉내낸다. 마우스를 10분간 Y-자형 미로에 두고, 자동화된 비디오-기반 추적 시스템을 이용하여 암 엔트리를 추적하였다. 구조체 6을 제공받은 AD 마우스는 대조 PBS를 제공받은 마우스와 비교하여 Y-자형 미로에서 암 엔트리의 좀더 자발적인 교채를 상당히 보여주었다. 다음은 PBS 또는 구조체 6의 주사 시점 (화살표) 뿐만 아니라 거동 평가 시점(별표)를 보여주는 도식이다.
Figure 112015042302843-pct00004
10 주차에 마우스 처리된 구조체 6, 및 PBS-처리된 마우스으로 처리된 마우스를 희생시키고, 항-Aβ 항체 착색 및 티오플라빈 S 착색에 의해 Aβ 플락 부하 감소에 대하여 평가하였다. 전신으로 투여된 g3p-Ig 융합 단백질은 알츠하이머 질환을 가진 마우스의 해마내 Aβ 플락 부하를 상당히 감소시켰다는 것을 결과에서 나타낸다.
별도 실험에서, 구조체 6은 3가지 투여량 집단(0.2 mg/Kg, N=13; 2 mg/Kg, N=12; 그리고 20 mg/Kg, N=13)으로 10주간 >19 월령의 나이든 Tg2576 알츠하이머 질환 모델에게 주당 복막으로(i.p.) 전달되었다. PBS-처리된 집단 (N=13)은 음성 대조로 작용된다. 구조체 6-처리된 마우스를 테스트하는 자발적 교체 테스트는 공간 기억이 투여분량 의존적 개선을 보여주는데, 20 mg/Kg를 제공받은 집단은 상당히 개선되었다.
복합된 이들 테스트는 Tg2576 마우스에서 g3p-Ig 융합 단백질은 중기 내지 말기 알츠하이머 질환 환자에서 관찰된 증상과 유사한 많은 정신운동 표현형 및 인지 결함을 개선시키고, 뿐만 아니라 뇌에 있는 아밀로이드를 감소시킨다는 것을 결과에서 보여준다. 따라서, 전신으로 투여된 g3p 융합 단백질은 알츠하이머 질환을 치료요법적으로 또는 예방차원으로 치료하는데 이용될 수 있다.
실시예 19: 구조체 6의 클로닝 , 발현 및 정제
M13 ssDNA는 QIAprep Spin M13 키트 (Qiagen, Cat#27704)에 의해 추출되었다. M13 g3p (g3pN1N2)의 N1-링커-N2-링커 도메인은 포워드 프라이머 (AAAAAAGGGAATTCGATGGCTGAAACTGTTGAAAGTTG; 서열번호:33) 및 역 프라이머 (AAAAAACCATGGCACCGGAACCAGAGCCAC; 서열번호:34)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. g3pN1N2 PCR 산물 (서열번호:13의 아미노산 22-277를 인코드하는) 그리고 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터 (InvivoGen, Cat# pfuse-hglfc2)는 제한 효소 EcoRI-HF (New England Biolabs, Cat#R3101) 및 NcoI-HF (New England Biolabs, Cat#R3193)에 의해 절단되었다. 이 벡터는 IL2 신호 서열 (서열번호:13의 아미노산 1-20), 다중 클로닝 부위, 그리고 인간 IgG1-Fc2 (서열번호:13의 아미노산 287-509)를 인코드한다. 상기 절단된 벡터는 탈포스포릴화되고, 절단된 삽입체에 결찰되었다. 상기 결찰 산물은 NEB 5-알파 컴피턴트(Competent) 대장균(E.coli)(New England Biolabs, Cat# C2987)에 형질도입되었다. pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터의 다중 클로닝 부위의 이용으로 인하여 상기 결찰 산물은 상기 신호 서열과 g3PN1N2의 제 1 아미노산 사이에 메티오닌 (서열번호:13의 아미노산 21)을 인코드하는 것으로 예측된다. 단일 콜로니 형질변환체를 선택하여, 플라스미드 조작을 위하여 성장시켰다. 상기 플라스미드는 추출되었고, 제한 절단 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 삽입체 크기에 대하여 테스트되었다. IgG1Fc-g3p(N1N2)의 플라스미드 후보물질은 DNA 서열화에 의해 확인되었다.
내독소(Endotoxin)-없는 Maxi 키트 (Qiagen)와 살균된 필터에 의해 플라스미드가 준비되었다. 하기에서 설명된 것과 같이, Expi293TM Expression System (Life Technologies, Cat# A14635)를 이용하여 고-생산량 단백질 발현이 실행되었다.
제조업자의 지시에 따라 Expi293FTM 세포들이 배양되었다. 쉐이커 플라스크 안에서 30ml 내지 0.5 리터에서 트랜스펙션이 실행되었다. 트랜스펙션 하루 전, 세포는 2x106 세포 /ml로 희석되었다. 30ml 세포 현탁액 (2.5x106 세포/ml)의 트랜스펙션을 위하여, 30μg 플라스미드 DNA는 1.5ml의 Opti-MEM에서 희석되었으며, 그리고 80μl의 ExpiFectamineTM 293 시약은 1.5ml Opti-MEM에서 희석되었다. 각 혼합물은 5분간 항온처리된 후, 상기 플라스미드 DNA가 ExpiFectamineTM 293 시약에 추가되었으며, 이어서 추가 20-30 분 항온처리되었다. 상기 DNA-ExpiFectamineTM 293 시약 혼합물은 부드러운 소용돌이 속에서 세포에 천천히 추가되었다. 대략적으로 16 시간 동안 세포를 항온처리한 후, 150μl의 ExpiFectamineTM 293 트랜스펙션 인헨서 I 및 1.5ml의 ExpiFectamineTM 293 트랜스펙션 인헨서 II가 추가되었다. 배지를 회수하기 전 또다른 5-6 일 동안 세포는 항온처리되었다. 10,000xg에서 30 분간 원심분리에 의해 세포 배지가 수집되었고, 정제될 때까지 4℃에서 멸균으로 유지되었다.
HiTrapTM rProtein A FF 컬럼(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 발현된 융합 단백질이 정제되었다. 용리 완충액 0.1M 글리신-HCl 완충액 pH 3으로 컬럼은 재건되었으며, 20mM 인산나트륨 완충액 pH 7로 평형을 이루었고, 제조업자의 추천에 따라 시료가 추가되었다. 20mM 인산 나트륨 완충액 pH7로 세척한 후, 0.1M 글리신-HCl 완충액 pH 3을 이용하여 Tris-완충액 pH 9가 포함된 튜브로 상기 단백질은 용리되었다. 상기 융합 단백질의 순도는 SDS-PAGE 겔에서 점검되고, 코마시 착색 후 상기 단백질은 PBS pH 7에서 투석되고, Amicon® Ultracel 30k 스핀 필터 (EMD Millipore Corp, Billerica, MA) 및 Ultrafree CL 스핀 컬럼 (EMD Millipore Corp, Billerica, MA)을 각각 이용하여 농축 및 여과 살균되었다. 사용 전까지 모든 단백질은 4℃에서 보관되었다.
생성된 융합 단백질은 서열번호: 13의 아미노산 21-509에 대응하는 것으로 예상되었다. 정제된 융합 단백질의 펩티드 서열화에서 서열번호: 13의 아미노산 23-508에 대응하는 아미노산으로 나타났으며, 이는 Met21, Ala22 및 Lys509는 Expi293FTM 세포에 의해 재조합 생산 동안 제거됨을 나타낸다. 유사한 공정이 발생하는지는 모르지만, 그렇다면, 다른 진핵 또는 비-진핵 발현계에서 재조합 생산시에도 어떤 수준으로 발생되는지에 대해서는 알 수 없다. 이러한 공정(또는 이의 부재)가 발현된 융합 단백질이 아밀로이드에 결합하고, 이의 분해를 야기하는 능력에 영향을 주는 것으로 예상되지는 않는다.
실시예 20: g3p - Ig 융합 단백질은 근위축성 측색 경화증 ( ALS )에서 아밀로이드를 감소시킨다.
g3p 융합 단백질이 근위축성 측색 경화증 (ALS)에서 아밀로이드 감소에 유익한 지를 판단하기 위하여, 대표적인 g3p-Ig 융합 단백질 (구조체 6)이 ALS의 병리에 연루된 SOD-1 섬유 어셈블리를 간섭하는 능력에 대하여 테스트되었다. SOD-1 단량체들 (아포-엔자임, PBS에서 3.5 μM, 5 mM EDTA, 1 mM βME)은 구조체 6 (1.5 μM, 0.75 μM, 0.15 μM) 존부하에 24시간 동안 100 rpm에서 교반되었다. 섬유 형성 (가령, 단량체들가 섬유로 응집)은 티오플라빈 T (ThT) 형광에 의해 측정되었다. SOD-1 단량체들은 구조체 6이 없이 섬유를 형성하였다. 그러나, 구조체 6은 ~0.75 μM의 IC50으로 SOD-1 섬유 형성을 저해시켰다. 따라서, 본 발명의 g3p-Ig 융합 단백질은 ALS 모델에서 아밀로이드를 감소시키며, 따라서 ALS를 치료하기 위한 치료요법으로 및/또는 예방용으로 이용될 수 있다.
실시예 21: g3p - Ig 융합 단백질은 파킨슨 질환에서 알파- 시누클레인을 감소시킨다.
본 발명의 g3p 융합 단백질의 효과를 파킨슨 질환 (PD)의 생체 모델에서 테스트하기 위하여, 인간 알파-시누클레인 과다발현시키는 8-월령의 마우스 (Line 61, E. Masliah, N=9/집단)의 미상핵의 양측으로 2 μL의 구조체 6 (5.3 mg/mL) 또는 PBS가 주사되었다. 추가 대조군으로 비-유전자삽입 마우스 (N=5)에게 PBS가 또한 주사되었다. 주사 후 14일 시점에 모든 마우스를 희생시키고, 신경병리 및 생화학 분석을 위하여 뇌가 수거되었다. 선조체 균질물내 단백질분해효소-K 저항성 알파-시누클레인의 측정에서 구조체 6-처리된 마우스는 알파-시누클레인 응집체를 상당히 낮추었으며, 티로신 히드록시라제(도파민 합성 효소)의 수준은 상당히 증가되었음을 알 수 있는데, 이 둘은 모두 임상적 개선의 척도가 된다. 따라서, 본 발명의 g3p 융합 단백질은 파킨슨 질환 모델에서 아밀로이드를 감소시키며, 따라서 파킨슨 질환를 치료하기 위한 치료요법으로 및/또는 예방용으로 이용될 수 있다.
실시예 22: g3p 융합 단백질은 아밀로이드증의 치료에 성공적이다.
응집된 트란스티레틴 (ttr)은 아밀로이드증의 특징이다. 본 발명의 g3p 융합 단백질이 아밀로이드증을 치료할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 응집된 ttr에 결합하는 능력에 대하여 대표적인 g3p 융합 단백질이 테스트되었다. 대장균(E. coli)에서 발현되고, >90% 순도로 정제된 Ttr은 교반(350 rpm)과 함께, 또는 교반 없이 37℃에서 응집 완충액 (100 nM 아세테이트 나트륨, 100 mM KCl, 1 nM EDTA, pH4.3) 안에서 항온처리에 의해 응집된다. ThT 형광 및 전자 전달 현미경에 의해 확인된 생성된 섬유는 웨스턴 블랏 분석을 위하여 연속 희석되어 니트로셀룰로오스 막에 얹는다. 상기 막들은 대표적인 본 발명의 g3p 융합 단백질인 구조체 6(100 nM) 또는 항-ttr 항체와 함께 항온처리되어 결합을 정량화시켰다. 고유의 ttr (사량체) 및 Aβ42 섬유는 대조로 이용되었다. HRP-결합된 염소 항-인간 IgG 항체를 이용하여 구조체 6이 탐지되었다. 구조체 6은 교반과 함께, 또는 교반 없이 만들어진 ttr 섬유에 정량적으로 결합하지만, 고유 ttr은 인지하지 못한다는 것이 결과에서 나타난다. 항-ttr 항체로 처리된 막은 결합 대조로 이용되었는데, 응집된 ttr 준비물 및 고유 ttr 준비물은 막 위에 정량적으로 모두 유지되었고, 항-ttr 항체는 Aβ42 섬유 대조를 인지하지 못함을 보여주었다. 따라서, 구조체 6이 포함된 g3p 융합 단백질은 아밀로이드증의 병리에 연루된 응집된 ttr에 강력하게 결합하지만, 정상적인 생리학적 사량체인 고유 ttr에는 결합하지 않는다. 본 발명의 g3p 융합 단백질은 trr의 아밀로이드 입체형태에 결합하고, 따라서 아밀로이드증을 치료하기 위한 치료요법적 그리고 예방적으로 유용함을 이 데이터에서 확인된다.
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annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (201)..(201) <223> /replace="Pro" <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (206)..(206) <223> /replace="Leu" <220> <221> misc_feature <222> (206)..(206) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (243)..(243) <223> /replace="Ser" <220> <221> misc_feature <222> (243)..(243) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (248)..(248) <223> /replace="Ser" <220> <221> misc_feature <222> (248)..(248) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (272)..(272) <223> /replace="Val" <220> <221> misc_feature <222> (272)..(272) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (292)..(292) <223> /replace="Tyr" <220> <221> misc_feature <222> (292)..(292) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (327)..(327) <223> /replace="Phe" <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (336)..(336) <223> /replace="Thr" <220> <221> misc_feature <222> (336)..(336) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (356)..(356) <223> /replace="Arg" <220> <221> misc_feature <222> (356)..(356) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (378)..(378) <223> /replace="Thr" <220> <221> misc_feature <222> (378)..(378) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (384)..(384) <223> /replace="Asn" <220> <221> misc_feature <222> (384)..(384) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (388)..(388) <223> /replace="Tyr" <220> <221> misc_feature <222> (388)..(388) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (395)..(395) <223> /replace="Ile" <220> <221> VARIANT <222> (396)..(396) <223> /replace="Glu" <220> <221> misc_feature <222> (395)..(396) <223> note="Residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for said positions" <220> <221> VARIANT <222> (403)..(403) <223> /replace="Asn" <220> <221> misc_feature <222> (403)..(403) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <220> <221> VARIANT <222> (425)..(425) <223> /replace="Val" <220> <221> misc_feature <222> (425)..(425) <223> note="Residue given in the sequence has no preference with respect to that in the annotations for said position" <400> 7 Met Lys Arg Lys Ile Ile Ala Ile Ser Leu Phe Leu Tyr Ile Pro Leu 1 5 10 15 Ser Asn Ala Asp Asn Trp Glu Ser Ile Thr Lys Ser Tyr Tyr Thr Gly 20 25 30 Phe Ala Met Ser Lys Thr Val Glu Ser Lys Asp Gln Asp Gly Lys Thr 35 40 45 Val Arg Lys Glu Val Ile Thr Gln Ala Asp Leu Thr Thr Ala Cys Asn 50 55 60 Asp Ala Lys Ala Ser Ala Gln Asp Val Phe Asn Gln Met Lys Leu Thr 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ile Trp Pro Asp Ser Gln Phe Arg Leu Val Thr Gly Asp 85 90 95 Thr Cys Val Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Glu Lys Thr Glu Ser Trp Ser 100 105 110 Ile Arg Ala Gln Val Glu Gly 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Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Ser Gly Ala Met Val Arg Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys 275 280 285 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 290 295 300 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 305 310 315 320 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 325 330 335 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 340 345 350 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 355 360 365 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 370 375 380 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 385 390 395 400 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 405 410 415 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 420 425 430 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 435 440 445 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 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1440 tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500 attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560 tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc 1620 tattctcact ccgctgaaac tgttgaaagt tgtttagcaa aaccccatac agaaaattca 1680 tttactaacg tctggaaaga cgacaaaact ttagatcgtt acgctaacta tgagggctgt 1740 ctgtggaatg ctacaggcgt tgtagtttgt actggtgacg aaactcagtg ttacggtaca 1800 tgggttccta ttgggcttgc tatccctgaa aatgagggtg gtggctctga gggtggcggt 1860 tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt actaaacctc ctgagtacgg tgatacacct 1920 attccgggct atacttatat caaccctctc gacggcactt atccgcctgg tactgagcaa 1980 aaccccgcta atcctaatcc ttctcttgag gagtctcagc ctcttaatac tttcatgttt 2040 cagaataata ggttccgaaa taggcagggg gcattaactg tttatacggg cacttttact 2100 caaggcactg accccgttaa aacttattac cagtacactc ctgtatcatc aaaagccatg 2160 tatgacgctt actggaacgg taaattcaga gactgcgctt tccattctgg ctttaatgag 2220 gatccattcg tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc tcctgtcaat 2280 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tgtcttgcga ttggatttgc atcagcattt acatatagtt atataaccca acctaagccg 4020 gaggttaaaa aggtagtctc tcagacctat gattttgata aattcactat tgactcttct 4080 cagcgtctta atctaagcta tcgctatgtt ttcaaggatt ctaagggaaa attaattaat 4140 agcgacgatt tacagaagca aggttattca ctcacatata ttgatttatg tactgtttcc 4200 attaaaaaag gtaattcaaa tgaaattgtt aaatgtaatt aattttgttt tcttgatgtt 4260 tgtttcatca tcttcttttg ctcaggtaat tgaaatgaat aattcgcctc tgcgcgattt 4320 tgtaacttgg tattcaaagc aatcaggcga atccgttatt gtttctcccg atgtaaaagg 4380 tactgttact gtatattcat ctgacgttaa acctgaaaat ctacgcaatt tctttatttc 4440 tgttttacgt gcaaataatt ttgatatggt aggttctatt ccttccatta ttcagaagta 4500 taatccaaac aatcaggatt atattgatga attgccatca tctgataatc aggaatatga 4560 tgataattcc gctccttctg gtggtttctt tgttccgcaa aatgataatg ttactcaaac 4620 ttttaaaatt aataacgttc gggcaaagga tttaatacga gttgtcgaat tgtttgtaaa 4680 gtctaatact tctaaatcct caaatgtatt atctattgac ggctctaatc tattagttgt 4740 tagtgctcct aaagatattt tagataacct tcctcaattc ctttcaactg ttgatttgcc 4800 aactgaccag atattgattg agggtttgat atttgaggtt cagcaaggtg atgctttaga 4860 tttttcattt gctgctggct ctcagcgtgg cactgttgca ggcggtgtta atactgaccg 4920 cctcacctct gttttatctt ctgctggtgg ttcgttcggt atttttaatg gcgatgtttt 4980 agggctatca gttcgcgcat taaagactaa tagccattca aaaatattgt ctgtgccacg 5040 tattcttacg ctttcaggtc agaagggttc tatctctgtt ggccagaatg tcccttttat 5100 tactggtcgt gtgactggtg aatctgccaa tgtaaataat ccatttcaga cgattgagcg 5160 tcaaaatgta ggtatttcca tgagcgtttt tcctgttgca atggctggcg gtaatattgt 5220 tctggatatt accagcaagg ccgatagttt gagttcttct actcaggcaa gtgatgttat 5280 tactaatcaa agaagtattg ctacaacggt taatttgcgt gatggacaga ctcttttact 5340 cggtggcctc actgattata aaaacacttc tcaggattct ggcgtaccgt tcctgtctaa 5400 aatcccttta atcggcctcc tgtttagctc ccgctctgat tctaacgagg aaagcacgtt 5460 atacgtgctc gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 5520 gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 5580 tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 5640 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gtctggaaag aaggagactc acgttatgca aattttgaaa actgcattta cgaactttcg 180 ggtattggta tcggttatga taatgatact tcgtggaatg ggcactggac gcctgttcgt 240 gctgctgatg gctctggcaa tggtggtgat gataattcat ctggcggggg tagtaatgga 300 gactcaggaa acaattctac gccagataca gtaacacccg ggcagactgt gaatttaccg 360 tctgacttat ctactctgag cattcctgct aatgtggtta aatctgactc aataggttct 420 cagttttcgc tttatacaaa tgccagttgc acaatgtgtt cagggtatta tctgtctaac 480 aatgctgatt caattgccat tgctaacatt acggaaacgg taaaggctga ttataaccag 540 cctgatatgt ggtttgagca aaccgacagt gacggcaatc atgttaaaat actacagaac 600 agttataagg ctgtttctta taatgtggaa tcaaaacaat ctgacgtgaa taacccgaca 660 tacattaact attcttattc cgttaatgta aaacaagttt cctatgacac atcaaatgtc 720 tgcataatga actgggaaac ttttcagaat aagtgtgatg cctcacgtgc tgttttgata 780 actgatacgg ttacgccatc ttattccaga aatataacga tacagtcgaa tattaattat 840 cagggtagca acgggtcagg cgggtcaggc gggtcaggcg ggtcaggcgc catggttaga 900 tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 960 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1020 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1080 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1140 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1200 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1260 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1320 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1380 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1440 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1500 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1560 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1587 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 33 aaaaaaggga attcgatggc tgaaactgtt gaaagttg 38 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 34 aaaaaaccat ggcaccggaa ccagagccac 30

Claims (53)

  1. 다음에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 3 단백질(gene 3 protein; g3p)의 아밀로이드 결합 단편과 면역글로블린의 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질:
    (a) 서열번호:9의 아미노산 21-506;
    (b) 서열번호:9의 아미노산 22-506;
    (c) 서열번호:9의 아미노산 23-506;
    (d) 서열번호:9의 아미노산 21-505;
    (e) 서열번호:9의 아미노산 22-505;
    (f) 서열번호:9의 아미노산 23-505;
    (g) 서열번호:11의 아미노산 21-506;
    (h) 서열번호:11의 아미노산 22-506;
    (i) 서열번호:11의 아미노산 23-506;
    (j) 서열번호:11의 아미노산 21-505;
    (k) 서열번호:11의 아미노산 22-505;
    (l) 서열번호:11의 아미노산 23-505;
    (m) 서열번호: 13의 아미노산 21-509;
    (n) 서열번호: 13의 아미노산 22-509;
    (o) 서열번호: 13의 아미노산 23-509;
    (p) 서열번호: 13의 아미노산 21-508;
    (q) 서열번호: 13의 아미노산 22-508;
    (r) 서열번호: 13의 아미노산 23-508;
    (s) 서열번호: 31의 아미노산 21-528;
    (t) 서열번호: 31의 아미노산 22-528;
    (u) 서열번호: 31의 아미노산 23-528;
    (v) 서열번호: 31의 아미노산 21-527;
    (w) 서열번호: 31의 아미노산 22-527; 및
    (x) 서열번호: 31의 아미노산 23-527.
  2. 아밀로이드를 감소시키거나, 아밀로이드 형성을 저해하거나, 아밀로이드 응집을 저해하거나, 또는 독성 올리고머들의 형성을 제거 및/또는 방지하는 것이 필요한 환자에서 아밀로이드를 감소시키거나, 아밀로이드 형성을 저해하거나, 아밀로이드 응집을 저해하거나, 또는 독성 올리고머들의 형성을 제거 및/또는 방지하는 데 사용하기 위한, 치료적으로 유효량의 제1항의 융합 단백질 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물.
  3. 환자에서, 알츠하이머 질환, 조기 개시 알츠하이머 질환, 후기 개시 알츠하이머질환, 증상발현 전(presymptomatic) 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, SAA 아밀로이드증, 시스타틴 C의 응집에 의해 아밀로이드 단백질이 형성되는 것을 특징으로 하는 질환, IgG 경쇄의 응집에 의해 아밀로이드 단백질이 형성되는 것을 특징으로 하는 질환, 가족성 아밀로이드성 다발신경병증 (FAP), FAP의 핀란드식 형태, 가족성 아밀로이드성 심장근육병증 (FAC), 노인성 전신 아밀로이드증 (SSA), 섬 아밀로이드 폴리펩티드 아밀로이드증 (IAPP), 유전적 아이슬랜드식 증후군(Icelandic syndrome), 노망, 다발골수종, 프리온 질환, 쿠루병, 크로이츠펠트-야코프 질환 (CJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 질환 (GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 진전병, 소 해면상뇌증 (BSE), 근위축성 측색 경화증 (ALS), 척수소뇌성 실조증 (SCA1, SCA3, SCA6 또는 SCA7), 헌팅턴 질환, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(dentatorubral-pallidoluysian atrophy), 척수 및 연수근 위축증, 유전적 뇌 아밀로이드 맥관병, 가족성 아밀로이드중, 전두측두엽 치매, 영국식/덴마크식(British/Danish) 치매, 및 가족성 뇌병증에서 선택되는 질환 또는 상태를 치료하는 것이 필요한 환자에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 데 사용하기 위한, 치료적으로 유효량의 제1항의 융합 단백질 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 플로베타피르가 양전자방출단층촬영에서 영상화 물질로 이용시 상기 환자가 플로베타피르에 대해 양성인 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 질환 또는 상태가 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환 또는 헌팅턴 질환인 약학 조성물.
  6. 제1항의 융합 단백질을 인코드하는 핵산 서열.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28 또는 서열번호: 32인 핵산 서열.
  8. 제6항 또는 제7항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제6항 또는 제7항의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 발현시키는 단계 및 발현된 융합 단백질을 단리시키는 단계를 포함하는, 제6항 또는 제7항의 핵산 서열에 의해 인코드된 융합 단백질의 제조 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022010043A1 (ko) 2020-07-06 2022-01-13 서울대학교산학협력단 삼중환 다이락톤 화합물, 이의 생산 방법, 및 용도

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140100543A (ko) 2011-11-29 2014-08-14 뉴로페이지 파마슈티컬즈, 인크. 박테리오파아지 유전자 3 단백질 조성물 및 아밀로이드 결합제로서의 용도
ES2641373T3 (es) 2012-10-02 2017-11-08 Proclara Biosciences, Inc. Uso de P3 de proteínas de fusión de bacteriófagos como agentes de unión amiloides
EP3003349B1 (en) * 2013-05-28 2018-12-12 Proclara Biosciences, Inc. Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence with reduced immunogenicity
AU2015358504A1 (en) 2014-12-03 2017-06-29 Proclara Biosciences, Inc. Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence lacking a glycosylation signal
TWI804917B (zh) * 2015-03-27 2023-06-11 美商再生元醫藥公司 偵測生物污染物之組成物及方法
EP3532497A4 (en) * 2016-10-26 2020-05-13 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University MODIFIED IMMUNOGLOBULIN BAND REGIONS TO REDUCE HEMAGGLUTINATION
MX2020013525A (es) 2018-06-15 2021-02-26 Proclara Biosciences Inc Motivo de interaccion amiloide general.
WO2023230282A1 (en) * 2022-05-25 2023-11-30 The General Hospital Corporation Modulation of bace1 as a therapy for spinocerebellar ataxia

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083795A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method for treating inflammation associated with amyloid deposits and brain inflammation involving activated microglia

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
DE10399023I2 (de) 1989-09-12 2006-11-23 Ahp Mfg B V TFN-bindende Proteine
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
EP0575545B1 (en) 1991-03-15 2003-05-21 Amgen Inc. Pegylation of polypeptides
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ATE311895T1 (de) 1992-05-26 2005-12-15 Immunex Corp Neue zytokine die cd30 binden
EP0983303B1 (en) 1997-05-21 2006-03-08 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
ATE352559T1 (de) 1998-12-08 2007-02-15 Biovation Ltd Verfahren zur verminderung der immunogenität von proteinen
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US6376117B1 (en) 2000-07-18 2002-04-23 Sofco L.P. Internal fuel staging for improved fuel cell performance
US8022270B2 (en) 2000-07-31 2011-09-20 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
MXPA03007323A (es) 2001-02-19 2003-12-12 Merck Patent Gmbh Proteinas artificiales con inmunogenicidad reducida.
MXPA03008032A (es) 2001-03-08 2003-12-04 Merck Patent Gmbh Factor de estimulacion de colonias de granulocitos- macrofagos modificado con inmunogenicidad reducida.
AU2002328742A1 (en) * 2001-10-05 2003-04-22 Cangene Corporation Phagemid display system
DE10238846A1 (de) * 2002-08-20 2004-03-04 Nemod Immuntherapie Ag Aktive Fusionsproteine und Verfahren zu ihrer Herstellung
US20090304726A1 (en) 2006-02-15 2009-12-10 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Viral display vehicles for treating multiple sclerosis
JP2009529320A (ja) 2006-02-15 2009-08-20 ラモット・アット・テルアビブ・ユニバーシティ 脳への送達のための抗体および免疫複合体のバインダーとしてのプロテインａをディスプレイする繊維状バクテリオファージ
WO2007109733A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic markers and treatment strategies for multiple sclerosis
US20090105090A1 (en) 2006-04-06 2009-04-23 Fumiaki Uchiyama Phage Display By Novel Filamentous Bacteriophage
US20090324554A1 (en) 2006-07-21 2009-12-31 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method for inhibiting or treating a disease associated with intracellular formation of protein fibrillar or aggregates
JP5456477B2 (ja) 2006-10-11 2014-03-26 アンチトープ リミテッド Ｔ細胞エピトープデータベース
WO2009143470A1 (en) 2008-05-22 2009-11-26 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Method for treating disease characterized by plaque
KR20110091778A (ko) 2008-11-24 2011-08-12 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드 사상 박테리오파지를 이용하는 파킨슨병의 치료방법
EP2233500A1 (en) * 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
WO2011084714A2 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF
KR20140051840A (ko) * 2011-03-11 2014-05-02 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드 신경변성 타우오패씨를 치료하는 방법
KR20140100543A (ko) 2011-11-29 2014-08-14 뉴로페이지 파마슈티컬즈, 인크. 박테리오파아지 유전자 3 단백질 조성물 및 아밀로이드 결합제로서의 용도
ES2641373T3 (es) 2012-10-02 2017-11-08 Proclara Biosciences, Inc. Uso de P3 de proteínas de fusión de bacteriófagos como agentes de unión amiloides
EP3003349B1 (en) 2013-05-28 2018-12-12 Proclara Biosciences, Inc. Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence with reduced immunogenicity
AU2015358504A1 (en) 2014-12-03 2017-06-29 Proclara Biosciences, Inc. Polypeptides comprising a modified bacteriophage g3p amino acid sequence lacking a glycosylation signal

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006083795A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method for treating inflammation associated with amyloid deposits and brain inflammation involving activated microglia

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022010043A1 (ko) 2020-07-06 2022-01-13 서울대학교산학협력단 삼중환 다이락톤 화합물, 이의 생산 방법, 및 용도

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Publication number Publication date
TW201418279A (zh) 2014-05-16
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