JP5456477B2 - T細胞エピトープデータベース - Google Patents
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Description
(a)生物から抗原提示細胞(APCs)及びT細胞を単離する工程
(b)前記単離した細胞から制御性T細胞を枯渇するか又は抑制する工程
(c)前記制御性T細胞が枯渇化した細胞を前記テスト対象の物質とインキュベートする工程
(d)前記テスト対象の物質に対するT細胞応答を測定する工程
従って,本発明は,制御性T細胞が培養液から取り除かれ,結果としてテスト抗原に対するT細胞応答が上昇する,T細胞エピトープを最適に検出するための新規T細胞アッセイ方法をも含む。特に,制御性T細胞は,表面にCD25抗原を高レベルに発現しているT細胞(CD25hi T細胞)を取り除くことによって取り除かれ,好ましくは,CD25hi T細胞が5〜75%の間,特にCD25hi T細胞が10〜25%の間で,取り除く,阻害する,又は破壊する方法が採用される。
(1) PBMCsがヒト血液サンプルから単離される
(2) CD8+T細胞が取り除かれる
(3) CD25hiT細胞が枯渇される
(4) 培養液は,1つまたは2つ以上の濃度でテスト抗原とインキュベートされ,1つまたは2つ以上の点でT細胞増殖及び/又はサイトカイン放出のテストをされる
(a)新しいタンパク質に所望の特性を与えるために必要とされるアミノ酸(“所望の残基”)を決定するために,1つ又は2つ以上の既存のタンパク質を分析する工程;
(b)改質タンパク質中に包含するために前記所望の残基を,既存のタンパク質中の所望の残基に対応する位置に含む1つまたは2つ以上のペプチドを,ペプチド配列データベース群から選択する工程であって,選択されたペプチドがT細胞エピトープではない,工程;
(c)前記選択されたペプチドを1つ又は2つ以上包含することによって改質タンパク質を合成する工程。
(a)新しいタンパク質に所望の特性を与えるために必要とされるアミノ酸(“所望の残基”)を決定するために,1つ又は2つ以上の既存のタンパク質を分析する工程;
(b)改質タンパク質中に包含するために前記所望の残基を,既存のタンパク質中の所望の残基に対応する位置に含む1つまたは2つ以上のペプチドを,ペプチド配列データベース群から選択する方法であって,選択されたペプチドがT細胞エピトープではないか,上記ペプチドのいくつか又は全てがT細胞エピトープを含む工程;
(c)前記選択されたペプチドを1つ又は2つ以上の包含することによって改質タンパク質を合成する工程。
末梢血単核球は,アデンブルク病院地域研究倫理委員会によって付与された承認に従って,国立輸血サービス(アデンブルク病院,ケンブリッジ,英国)から得られる(24時間以内に取り出される血液から)健康な人たちからなるドナーの軟膜から単離された。PBMCはフィコール(GEヘルスケア,チャルフォント セント ジャイルズ,英国)密度遠心法によって軟膜から単離され,CD8+T細胞は,CD8+RossetteSepTM(StemCell Technologies,バンクーバー,カナダ)を用いて枯渇させた。ドナーは,AllsetTM SSP−PCRベース組織タイピングキット(Dynal,ウィラル,英国)を用いてHLA−DRハロタイプを同定することと同様に,コントロール抗原キーホールリンペットヘモシアニン(KLH),破傷風トキソイド(Aventis Pasteur,リオン,フランス)及びインフルエンザHAからのコントロールペプチドエピトープ(C32,aa307−319)へのT細胞応答を決定することによって,特徴づけられた。
2−F→G(GDKGVSWYQQGSGQS)
9−L→G(QSISNWGNWYQQKPG)
25M→G(PKYRNGQPLNSLKIAT)
26F→G(TVGYNIPPMPL)
相対的な1,4,6,7,及び9の位置を固定した次のペプチドは,(i)実施例1の方法を用いて作成されたT細胞エピトープのデータベース,(ii)ペプチド−MHC結合予測のためのTEPITOPEアルゴリズム(Sturnioloら,同書),及び(iii)実施例1のT細胞アッセイ方法を用いて分析された。
1−NWLRNYDQKQGAT
2−NWLEGYHQKIGAT
3−NWLLKYMQKFGAT
4−NWLPSYTQKWGAT
5−NWLYVYAQKRGAT
6−NWLNDYQQKEGAT
7−NWLGHYIQKLGAT
8−NWLKMYFQKPGAT
9−NWLSTYWQKYGAT
10−NWLAAYAQKAGAT
11−NWGRNYDQKQGAT
12−NWGEGYHQKIGAT
13−NWGLKYMQKFGAT
14−NWGPSYTQKWGAT
15−NWGYVYAQKRGAT
16−NWGNDYQQKEGAT
17−NWGGHYIQKLGAT
18−NWGKMYFQKPGAT
19−NWGSTYWQKYGAT
20−NWGAAYAQKAGAT
MHC結合ペプチドにおいて,MHC接触残基(対応する相対的位置1,4,6,7及び9)のいずれの組合せのバックグランドにおいても,T細胞応答を誘導するための固定T細胞受容体接触残基(相対的位置2,3,5及び8)の能力は,コア9merのLQHWSYPLTを有する確定されたデータベースT細胞エピトープからT細胞受容体接触残基を用いてテストされる。T細胞受容体接触残基_QH_S__Lは,次に示す他の4つのT細胞エピトープデータベースのバックグラウンドに置換された;FLLTRILTI,ILWEWASVR,LSCAAGGRA,及びFKGEQGPKGは,テストペプチドFQHTSILLI,IQHESASLR,LQHASGGLA,及びFQHESGPLGとなる。コントロールペプチドは,また,次のように改変されたP1残基(F−>G)で作製される;改変されたP1残基(F−>G)は,GQHWSYPLT,,GQHTSILLI,GQHESASLR,GQHASGGLA,及びGQHESGPLGである。
T細胞エピトープのデータベースを,抗CD20抗体Leu16において公知のT細胞エピトープを同定するために用いた(Gillies et al.,Blood 105(2006)p3972−3978)。次のように,Leu16軽鎖可変領域(LH)配列5’−DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK−3’のN末端から始まる重複している15merとともに,Leu16重鎖可変領域(VH)配列5’−EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS−3’のN末端から始まる重複している15merは,VH中の3つの実際のT細胞エピトープ(同一のコア9mer)が同一,及びVL中の潜在的な2つのT細胞エピトープ(疎水性P1アンカーを有する対応する相対的位置2,3,5及び8で同一の残基)が同一になると分析した。
データベースエピトープ9mer
Leu16VH LVKPGASVK LVKPGASVK
FKGKATLTA FKGKATLTA
LTSEDSADY LTSEDSADY
Leu16VL ILSASPGEK LLSGSPAEK
MDWYQKKPG LDWYQKKPG
推定T細胞エピトープ データベース非エピトープ9mer
Leu16VH LVKPGASVK ⇒ VVKPGASVK
FKGKATLTA ⇒ FKGRVTLTA
LTSEDSADY ⇒ LRSEDSAVY
Leu16VL ILSASPGEK ⇒ TLSASPGEK
MDWYQKKPG ⇒ MAWYQQKPG
2つのヒト化抗体の可変領域配列である,ヒト化A33抗体(US6307026,Celltech Ltd.)とハーセプチン(登録商標)(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol89(1992)p4285,US5821337)として知られているヒト化抗HER2抗体を,T細胞エピトープデータベースを検索することによって比較した。実施例1に従って生成されたT細胞エピトープのデータベースを用いて,同一の9mer配列が検索され,対応する相対的位置2,3,5及び8を有する9merも検索された。結果は図3に示す。ヒト化A33の場合,T細胞エピトープ活性に陽性なペプチドから得られた3つの同一の9merは,ヒト化A33からのコア9merで,同書に掲載されたSturnioloらの文献でMHCクラスIIへの結合が予想されていた,対応する相対的位置2,3,5,及び8を有するエピトープとでは2カ所が共に一致していることがデータベースで同定された。一致の範囲は,T細胞エピトープ活性を有さないデータベースペプチドで見つけられた(データは示さず)。ヒト化抗HER2抗体の場合,T細胞エピトープ活性にポジティブなペプチドから同一の9merがデータベースで同定されず,コア9merがMHCクラスIIを結合すると予測される対応する相対的位置2,3,5及び8を有するエピトープとでは1カ所の一致が同定された。
Claims (11)
- テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの9個のアミノ酸残基を分析することにより、前記テスト対象タンパク質のペプチド配列からヘルパーT細胞エピトープを決定する方法であって、
(a)既知のヘルパーT細胞エピトープを解析し、1又は複数のヘルパーT細胞エピトープと前記テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの連続する9個のアミノ酸残基の対応する相対位置2,3,5および8番目の位置で,アミノ酸残基が一致するか否かの同一性マッチングを行う工程と、
(b)前記同一性マッチングを行う工程で同一性がマッチしたテスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合するか否か解析及び決定する工程と、
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記ヘルパーT細胞エピトープとの同一性マッチングは、ヘルパーT細胞エピトープのデータベースを検索することにより決定される、
方法。。 - 請求項1又は2に記載の方法であって、
前記既知のヘルパーT細胞エピトープ及び前記MHCクラスII分子はヒト由来である、
方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の方法であって、
前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合するか否か解析及び決定する工程は、
インシリコ分析により前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合するか否かにより決定される、
方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の方法であって、
前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合するか否か解析及び決定する工程は、
インビボ分析により前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合するか否か決定される、
方法。 - 請求項1〜3のいずれかに記載の方法であって、
前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合するか否か解析及び決定する工程は、
前記既知のヘルパーT細胞エピトープのうちの連続する9個のアミノ酸残基と前記テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの連続する9個のアミノ酸残基との対応する相対位置1,4,6,7および9番目の位置で、同一のアミノ酸残基を有するか否かにより決定される、
方法。 - ヘルパーT細胞エピトープを解析することで、
前記テスト対象タンパク質の免疫原性を解析するための、
請求項1〜6のいずれかの方法の使用。 - 前記テスト対象タンパク質の配列からヘルパーT細胞エピトープを同定するための請求項1〜6のいずれかの方法の使用であって、
前記ヘルパーT細胞エピトープは、ヘルパーT細胞エピトープを取り除くためにその配列が変更される、
方法。 - 請求項8に記載の方法であって
ヘルパーT細胞エピトープを取り除くことは、前記ヘルパーT細胞エピトープの残基1を疎水性の残基から非疎水性の残基に変換することにより達成される、
方法。 - テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの9個のアミノ酸残基を分析することにより、前記テスト対象タンパク質のペプチド配列から非ヘルパーT細胞エピトープを決定する方法であって、
(a)既知の非ヘルパーT細胞エピトープを解析し、1又は複数の非ヘルパーT細胞エピトープと前記テスト対象タンパク質のペプチド配列のうちの連続する9個のアミノ酸残基の対応する相対位置2,3,5および8番目の位置で,アミノ酸残基が一致するか否かの同一性マッチングを行う工程、又は
(b)前記テスト対象タンパク質のペプチドの前記連続する9個のアミノ酸残基がMHCクラスII分子と結合しないか否か解析及び決定する工程と、
を含む方法。 - 請求項10に記載の方法であって、
前記非ヘルパーT細胞エピトープとの同一性マッチングは、非ヘルパーT細胞エピトープのデータベースを検索することにより決定される、
方法。
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