KR20090069326A

KR20090069326A - Ｔ 세포 에피토프 데이터베이스들

Info

Publication number: KR20090069326A
Application number: KR1020097009517A
Authority: KR
Inventors: 프랭크 카; 메튜 파울 바커
Original assignee: 안티토페 리미티드
Priority date: 2006-10-11
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2009-06-30
Also published as: JP2010505929A; SG175596A1; KR101485202B1; US20100017370A1; RU2009113455A; SG10201502661SA; CA2666320A1; EP2080138A2; WO2008044032A2; US20120289417A1; WO2008044032A3; AU2007306102B2; JP5456477B2; AU2007306102A1

Abstract

본 발명은 T 세포 에피토프들의 유무에 대해 단백질 서열들의 신속한 조사를 위한 T 세포 에피토프들, 특히 헬퍼 T 세포 에피토프들의 데이터베이스들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시험 펩티드(test peptide)들을 이용한 생체 외 T 세포 분석(T cell assay)에 의하여 확인된 에피토프들을 포함하는 T 세포 에피토프들의 전체 또는 부분적 데이터베이스들 및 데이터 구조들을 포함하며 시험 펩티드들로부터 데이터의 외삽에 의하여 확인된 T 세포 에피토프들을 포함한다. 또한, 본 발명은 T 세포 에피토프 활성의 검출 감도를 최대화하기 위하여 T 세포들, 특히 조절 T 세포들의 서브세트(subset)들을 제거하거나 억제하는 방법들을 포함한, 이후 데이터베이스 및 데이터 구조에의 포함을 위해 펩티드들의 T 세포 에피토프 활성을 결정하는 고속처리 방법들을 포함한다.

T 세포 에피토프, MHC 클래스 II, 제약 단백질, 인간 말초혈 단핵구

Description

Ｔ 세포 에피토프 데이터베이스들{T CELL EPITOPE DATABASES}

인간에게 투여되는 제약 단백질들에 대하여, 상기 제약 단백질에 대한 항체의 개발로 인해 명백히 드러나는 면역원성은 때때로 인간에게 투여되는 제약 단백질의 효능 및 안정성에 대한 한계이다. 대부분의 경우, 면역원성은 MHC 클래스(class) II상에 상기 제약 단백질로부터 유래된 펩티드들의 제시(presentation) 및 T 세포 상의 T 세포 수용체에 의한 펩티드-MHC 클래스 II 복합체들의 인식에 의 한 헬퍼 T 세포들의 순차적 활성화로부터 발생한 헬퍼 T 세포 에피토프들을 포함할 것이다. 헬퍼 T 세포 에피토프들의 면역원성에의 포함에 대한 증거는 면역글로불린 G 동종형(IgG isotype)의 항체들이 검출되어 헬퍼 T 세포-유도 면역글로불린 클래스를 암시하는 면역원성의 임상 사례들을 포함한다. 그 자체만으로, T 세포 에피토프는 제약 단백질에 대한 중요한 동력원인 것으로 간주된다, 따라서 제약 단백질 내의 상기 T 세포 에피토프들의 측정은 상기 에피토프들의 유무가 면역원성의 중요한 예측 인자가 되어 임상 시험으로 진행 또는 상기 시험의 설계에 있어서의 하나의 인자일 수 있으므로 인간에게 시험을 실시하기 이전에 상당히 바람직하다.

현재 사용되는 T 세포 에피토프들의 측정법은 가상실험법(in silico method), 시험관내 실험법(in vitro method), 생체외 실험법(ex vivo method) 및 생체내 실험법(in vivo method)를 포함한다. 통상적으로, 가상실험법은 MHC 분자들에 펩티드들의 결합에 관한 것으로, MHC 분자들에 펩티드들의 시험관 내 결합을 모방하려 하는 것이다. 가상실험법은 MHC를 결합하는 펩티드 서열들의 모티프에 기반한 방법들로부터 MHC 분자들에 결합하는 펩티드의 컴퓨터 모델링을 포함하는 방법들에 이르기까지 다양하다. MHC 클래스 II에 대해, 가상실험법은 DR 분자의 동형 이량체가 펩티드 결합에 관여하는 HLA-DR로 크게 한정된다. 펩티드가 HLA-DQ 및 HLA-DP와 결합하는 가상실험법은 DQ 및 DP 결합의 이형이량체적 특성 및 시험관내 MHC 결합 데이터의 극히 제한된 이용가능성으로 인하여 일반적으로 훨씬 부정확하거나 이용가능성이 적다. 시험관내 실험법은 통상적으로 용해성 또는 용해된 MHC 분자들 및 라벨링되거나 표시된(tagged) 펩티드들을 이용하여 펩티드들의 MHC 분자 들에의 물리적 결합을 통상적으로 측정한다. 생체외 측정은 통상적으로 증식에 의하거나 시토카인 방출에 의하여 펩티드들에 대한 헬퍼 T 세포 반응들을 측정하는 혈액 표본을 사용한다. 생체내 측정은 통상적으로 마우스를 사용하는데, 여기서는 펩티드들에 대한 헬퍼 T 세포 반응들이 펩티드들의 주입 이후에 측정되거나 상기 펩티드에 대한 후속 항체 반응들이 헬퍼 T 세포 반응들의 간접 지표로서 측정된다. 인간 T 세포 에피토프와 같은 쥐 유래가 아닌(non-murine) T 세포 에피토프들의 생체내 측정은 인간 혈구 세포의 SCID 마우스로의 주입으로 발생한 재구성된 면역 시스템을 갖는 마우스 또는 인간 MHC 클래스 II로 형질전환되고 인간 MHC 클래스 II 상에 제시(presentatin)를 통하여 T 세포 반응을 도출하는 마우스를 통상적으로 사용한다.

가상실험법은 펩티드들의 MHC 클래스 II에의 결합을 잠재적으로 신속히 예측하는 반면에, 이들은 비허용(non-tolerant) T 세포들의 유무, 펩티드-MHC 복합체들의 T 세포 수용체 인식, 특이적 시토카인들의 유무 및 공동자극분자들(co-stimulatory molecules)의 상호작용을 포함한 펩티드-MHC 결합 이외의 다른 단계들을 필요로 하는 헬퍼 T 세포 에피타프들을 정확히 측정하지 않는다. 그러므로, 가상실험법들은 T 세포 에피토프의 유무를 일정하게 과다예측(overpredict)하며, 또한 HLA-DQ/DP 한정된 헬퍼 T 세포 에피토프들을 정확하게 예측하지 않는다. 또한, MHC 클래스 II 결합만 예측함으로써, 가상실험법은 특정 MHC 결합 펩티드들, 특히 "자기(self)" 펩티드들에 대한 T 세포들의 허용 또는 비반응성을 고려하지 않는다. 마찬가지로, MHC 클래스 II에 대한 펩티드들의 물리적 결합 또는 펩티드-MHC 복합 체들에 대한 T 세포 수용체들의 결합을 포함하는 시험관 내 방법들은 펩티드-MHC 복합체들에 대한 T 세포 허용 또는 T 세포 반응성의 결핍을 고려하지 않는다. 또한, 상기 방법들은 느리며, T 세포 에피토프들의 실시간 측정을 제공하지 않는다. 생체외 및 생체내 방법들은 T 세포 에피토프들의 가장 엄격한 측정 방법들을 제공하는 반면에, 이러한 방법들은 T 세포 에피토프들의 실시간 측정을 제공하지 않으며 전문적인 기술 방법들 또는 특이적인 동물 균주들을 필요로 한다. 따라서, T 세포 에피토프들의 실시간이며 사용하기 간편한 새로운 측정법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 생체외 또는 생체내 측정으로 유래된 T 세포 에피토프들의 새로운 데이터베이스들 및 데이터 구조들을 포함하는, T 세포 에피토프들의 신규한 측정 방법들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체외 측정으로부터 실제 T 세포 에피토프들의 데이터베이스들 및 데이터 구조들에 관한 것으로서, 이에 의하여 하나 이상의, 바람직하게는 시험 제약 단백질에서 발생할 수 있는 가능한 모든 펩티드들이 T 세포 에피토프 활성에 대하여 사전에 시험되며, 이에 의하여 각각의 펩티드에 대한 상기 측정이 T 세포 에피토프들의 유무 대한 제약 단백질 서열들의 신속한 조사를 위한 데이터베이스 또는 데이터 구조로서 제시되는 것에 관한 것이다. 그 자체만으로, 임의의 제약 단백질에 있어서 T 세포 에피토프들은 시험 제약 단백질 서열로부터, 펩티드들 상에 시간 소모적이며 기술적으로 전문가적인 생체외 측정을 할 필요없이 실시간으로 측정될 수 있다. 또한, 본 발명은 세포 서브세트들의 제거 또는 억제에 의하여 T 세포 에피토프들의 향상된 검출 방법들을 포함한다.

제1 태양에서, 본 발명은 T 세포 에피토프 활성에 대하여 사전에 분석된 펩티드 서열들의 데이터베이스를 검색하여 시험 펩티드 서열이 T 세포 에피토프를 포함하는지 여부를 결정하는 결정 방법을 제공한다.

상기 데이터베이스는 본 발명을 수행하는데 적당한 당업자에게 공지된 임의의 데이터베이스일 수 있다. 예를 들면, 상기 데이터베이스는 유사한 서열들을 확인하는 BLAST 프로그램을 사용하여 검색될 수 있는 텍스트 파일일 수 있다. 상기 데이터베이스는 데이터 구조의 일부일 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적당한 데이터 구조가 사용될 수 있다.

바람직하게는 상기 데이터베이스는 상기 시험 펩티드 서열과 동일하거나 서열 유사성을 공유하는 펩티드 서열들에 대하여 검색된다.

두 개의 아미노산 서열들 사이의 동일성(identity) 수준은 최적 비교 목적을 위하여 서열들을 일치시키고 해당 위치들에서 아미노산 잔기들을 비교하여 결정될 수 있다. 퍼센트 동일성은 비교되는 서열들에서의 동일한 아미노산 잔기들의 숫자에 의하여 결정된다(즉, 퍼센트 동일성 = 동일한 위치의 숫자/전체 위치의 숫자 x 100).

두 서열들 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 당업자에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 두 서열들을 비교하는 수학적 알고리즘의 일례는 Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5877에 수정되어 있는 Karlin and Altschul (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-2268의 알고리즘이다. Altschul, et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410의 BLAST 프로그램은 그러한 알고리즘을 포함하였다. BLAST 및 PSI-Blast 프로그램들을 사용하는 경우에, 각각의 프로그램의 기본 매개변수(default parameter)들이 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 서열들의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 예는 Myers and Miller, CABIOS의 알고리즘(1989)이다. CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부분인 ALIGN 프로그램(2.0 버전)은 그러한 알고리즘을 포함하였다. 업계에 공지된 서열 분석을 위한 다른 알고리즘들은 Torellis and Robotti (1994) Comput . Appl . Biosci ., 10 :3-5에 기술된 ADVANCE 및 ADAM, 그리고 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :2444-8에 기술된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup는 검색의 감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다.

헬퍼 T 세포 에피토프들의 데이터베이스들 및 데이터 구조들을 구축하는 바람직한 방법에 있어서, 핵심 MHC 결합 9 아미노산 서열('핵심 9량체(core 9mer)') 내에서 복수개의 아미노산 조합들을 제시하는 복수개의 펩티드들은 특히, T 세포 증식 또는 시토카인 방출 분석 판독(cytokine release assay read-outs)을 이용하여 헬퍼 T 세포 반응들의 유도를 여부를 위해 T 세포 분석(주로 인간 T 세포 분석)에서 시험된다. 통상적으로, 상기 핵심 9량체의 한쪽 말단을 플랭킹(flanking)하는 아미노산들을 포함할 길이가 10 내지 15개의 아미노산인 펩티드들이 시험될 것이다. 또한, 상기 핵심 9량체의 말단 각각을 플랭킹하는 동일한 두 개의 아미노산들을 갖는 15량체들이 예를 들면, 각각의 말단에서 2개의 알라닌(Alanine) 잔기들을 갖는 15량체들이 시험될 것이다. 상기 핵심 9량체 내의 모든 아미노산 서열의 조합들을 전부 분석하기 위하여는, 하나의 9량체에 5.12 x 10¹¹개의 다른 아미노산 조합들(즉, 20⁹개)이 필요할 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시예는 헬퍼 T 세포 활성에 대하여 사전에 시험되지 않은 모든 핵심 9량체 서열들을 분석하고, 추가적으로 헬퍼 T 세포 활성에 대하여 다른 핵심 9량체들의 사전 분석으로부터 얻은 데이터와 함께 이러한 모든 분석들로부터 얻은 헬퍼 T 세포 에피토프 데이터베이스 또는 데이터 구조를 편집하는 것이다. 이후, 이러한 데이터베이스 또는 데이터 구조는 사용자들로 하여금 임의의 특정 핵심 9량체 서열의 헬퍼 T 세포 에피토프 활성에 대하여 이를 신속히 분석하도록 할 것이다.

데이터베이스들 및 데이터 구조들을 구축하는 바람직한 방법의 파생물(derivative)에 있어서, 핵심 9량체 T 세포 에피토프 활성에 대한 일련의 제한된 데이터 세트를 분석하여 헬퍼 T 세포 에피토프 활성과 연관된 아미노산들의 부분 서열들을 확인할 것이다. 일단 이러한 부분 서열들이 확인되면, 다른 잠재적인 헬퍼 T 세포 에피토프들의 서열들은 외삽되어 상기 부분 서열들을 확인하는데 사용되는 실제 T 세포 에피토프들에 대한 서열들과 함께 상기 데이터베이스 및 데이터 구조로 입력될 수 있다. 예를 들면, 헬퍼 T 세포 에피토프의 상기 핵심 9량체 내에서, 위치 1, 4, 6, 7 및 9에 있는 아미노산들은 주로 MHC 클래스 II에의 결합에 포함되어 아미노산 2, 3, 5 및 8을 상기 T 세포 수용체와 인터페이스(interface) 하는 주요 아미노산으로 남는다는 것을 알게 된다. 따라서, 위치 1, 4, 6, 7 및 9에 고정된 잔기들 및 위치 2, 3, 5 및 8에 한정된 아미노산들의 변이들을 갖는 MHC 결합 펩티드들은 FXXFXFFXF의 핵심 9량체 서열을 갖는 160,000 개의 펩티드들만을 필요로 하여 MHC 결합 펩티드들에 대한 데이터 세트들을 얻을 수 있다(여기서, F = 고정된 아미노산 잔기 및 X = 가능한 모든 조합의 20개 천연 아미노산 중 임의의 것을 포함하는 변이 잔기). 헬퍼 T 세포 활성을 나타내지 않는다고 알려져 있는 특정 펩티드 서열들 (각각의 X = 프롤린인 경우와 같이) 및 헬퍼 T 세포 활성을 유도하지 않는다 라고 이미 알려져 있는 X들의 서열들을 배제하면 시험에 필요한 펩티드들의 숫자를 줄여줄 것이다. 또한, 소수성(소수성 = 알라닌(Ala), 이소류신(Ileu), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 발린(Val))이 아닌 위치 1을 갖는 9량체 서열들을 배제하면 시험에 필요한 펩티드들의 숫자를 줄여줄 것이다.

본 발명의 바람직한 방법에 있어서, 하나 이상의 시험 펩티드 서열들은 헬퍼 T 세포 활성에 대하여 사전에 분석된 동일하거나 유사한 펩티드들에 대한 데이터베이스 또는 데이터 구조를 검색하여 분석될 것이다. 통상적으로 길이 9 내지 15 개 아미노산들, 바람직하게는 9 개 아미노산들의 펩티드들은 동일하거나 유사한 펩티드들에 대하여 데이터베이스를 검색하여 분석될 것이다. 이는 동일한 9량체 서열들을 갖는 펩티드들을 확인하는 단계 또는 시험 펩티드에 동일성을 갖는 펩티드들(통상적으로 시험 및 데이터베이 펩티드 서열들 내의 해당 상대 위치들에서 5 개 이상의 아미노산들을 갖는)를 확인하는 단계를 포함할 것이다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 시험 펩티드 서열 및 상기 데이터베이스 또는 데이터 구조의 펩티드 서열 내의 해당 상대(corresponding relative) 1, 4, 6, 7 및 9 위치들에서 동일하거나 유사한 아미노산들을 갖는 펩티드들이 확인될 것이다. 또한, 상기 시험 펩티드 서열 및 상기 데이터베이스 또는 데이터 구조의 펩티드 서열들 내의 동일하거나 유사한 해당 상대 2, 3, 5 및 8 위치들을 갖는 펩티드들이 검출될 것이다. 예를 들면, 서열 ADEFGHIKL을 갖는 시험용 9 아미노산 펩티드는 데이터베이스의 T 세포 에피토프 서열이 AAAFAHIAL(즉, 해당 상대 1, 4, 6, 7 및 9 위치들) 또는 ADEAGAAKA(즉, 해당 상대 2, 3, 5 및 8 위치들)로 구성된다면(또는 이를 포함한다면) 가능성 있는(possible) T 세포 에피토프로 간주될 수 있다. 통상적으로, 펩티드들 특히, 해당 상대 2, 3, 5 및 8 위치들을 갖는 펩티드들의 이와 같은 분석은 가상실험법 또는 시험관내 실험법을 주로 사용하여, MHC에 대한 상당한 결합이 있지 않으면 상기 확인된 가능성 있는 T 세포 에피토프는 배제되도록 하는 추정(putative) 핵심 9량체 MHC 결합의 개별 분석(separate analysis)도 포함할 것이다. 예를 들면, 서열 GDEFGHIKL을 갖는 시험용 9 아미노산 펩티드는 데이터 펩티드 ADEAGAAKA와 해당 상대 2, 3, 5 및 8 위치들에서 일치하는 반면에, 본 펩티드는 위치 1에서 소수성 아미노산의 부재 또는 펩티드-MHC 결합의 가상실험 또는 시험관내 측정을 따른 이후에 MHC 결합의 부족으로 인하여 T 세포 에피토프로서는 배제될 것이다.

본 발명은 데이터베이스 또는 데이터 구조에 포함될 데이터를 획득하는 방법을 포함할 것이며 통상적으로 헬퍼 T 세포들로부터 시토카인 방출이 측정되는 Elispot 포맷과 같은 표준 생체외 헬퍼 T 세포 분석 포맷들을 이용하여 헬퍼 T 세포 에피토프 활성에 대하여 개별적으로 펩티드를 분석하는 단계를 포함할 것이다. 통상적으로, 이러한 분석 포맷들은 1회 실험에서 실제적으로 시험될 수 있는 펩티드들의 숫자를 500 개 펩티드들로 제한하며 또한 펩티드들에서 T 세포 에피토프의 검출 감도를 제한한다. 잠재적으로 이러한 분석 포맷들은 예를 들면, 헬퍼 T 세포들의 유도 여부에 대하여 펩티드들의 풀들(pools of peptides)을 시험하고 이후 헬퍼 T 세포들을 유도하는 개별 펩티드들에 대하여 이러한 풀들을 탈복제(de-replicating)하거나, 고밀도의 펩티드들 또는 세포들이 예를 들면, 핀(pin) 상에서 사전에 합성된 펩티드들의 정렬(array)들에서 동시에 시험되고, T 세포 증식 및 시토카인 방출을 위해 감도가 고도로 높은 분석이 이러한 고밀도 분석을 위해 개조된(adapted) 마이크로포맷들(microformats)을 사용하여 펩티드 처리율(peptide throughput)을 상당히 향상시키도록 재구성되거나 소형화될 수 있다. 또한, 다른 펩티드들을 시험하기 위하여 고밀도 펩티드 정렬들 또는 세포 정렬들을 사용하기보다는, 생체외 T 세포 분석들이 유동 미세액적들(fluid microdroplets)에서 수행될 수 있어서, 이에 의하여 펩티드들이 미세액적 내부의 세포들과 반응하여 이러한 미세액적들이 예를 들면, 시토카인 방출의 형광 측정(fluorometric measurement) 또는 플루오레세인-라벨링된(fluorescein-labeled) BUDR(5'-브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine))과 같은 형광 추적자(fluorescinated tracer)를 증식하는 T 세포들로의 혼합(incorporation)을 이용한 FACS(형광 활성화 세포 분류)에 의하여 개별적으로 분석될 수 있다. 다른 분석 포맷들은 개별적으로 활성화된 헬퍼 T 세포들이 검출될 수 있으며 활성화 펩티드 서열이 결정될 수 있는 분석들을 포함할 것이다. 이러한 분석 포맷들은 개별 펩티드들 또는 펩티드들의 그룹들이 4량체들을 갖는 MHC 클래스 II에 결합될 수 있으며, 이후 T 세포들의 활성 여부에 대해 시험되어 반-무작위로(semi-randomly) 합성된 펩티드들의 그룹을 포함하여 활성화 펩티드들이 상기 활성화 펩티드와 연관된 꼬리표들(tags)에 의하거나 질량 분석법에 의한 상기 활성화 펩티드의 직접적인 확인에 의하여 순차적으로 확인될 수 있도록 MHC 클래스 II 4량체들의 유용성에 의하여 용이해질 수 있다.

상기 언급된 모든 분석 포맷들에 대하여, 본 발명은 세포 서브세트들, 특히 T 세포들의 서브세트들을 제거하며, 시험용 항원들에 대한 헬퍼 T 세포 반응들에서 실질적으로 증가하는 T 세포 분석 혼합물들로부터 조절 T 세포들을 제거함으로써, T 세포 에피토프들의 검출 감도의 개선을 포함한다. 따라서, 제2 태양에서 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 시험 물질에 대한 헬퍼 T 세포 반응들의 데이터베이스 생성 방법을 제공한다;

(a) 유기체로부터 항원-제시 세포들(APCs) 및 T 세포들을 분리하는 단계

(b) 상기 분리된 세포들로부터 조절 T 세포들을 고갈시키거나 억제하는 단계

(c) 상기 시험 물질과 함께 상기 조절 T 세포-고갈된 세포들을 배양하는 단계, 및

(d) 상기 시험 물질에 대한 T 세포 반응들을 측정하는 단계.

따라서, 본 발명은 조절 T 세포들이 배양으로부터 제거되어 시험 항원들에 대한 T 세포 반응 증가로 이어지는 T 세포 에피토프의 최적 검출을 위한 신규한 T 세포 분석 방법들도 포함한다. 특히, 조절 T 세포들은 표면 CD25 항원(CD25hi T 세포들)을 높은 수준으로 발현시키는 T 세포들의 제거에 의하여 제거되며, 바람직하게는 CD25hi T 세포들의 5 내지 75% 그리고, 특히 CD25hi T 세포들의 10 내지 25%를 제거, 억제 또는 파괴하는 방법들이 채용된다.

상기 APCs 및 T 세포들은 주로 혈액 표본으로부터 획득된다. 그러나, 편도선, 파이어스 패치(Peyer's Patch), 종양 및 세포계에서 유래된 원천을 포함하여 다른 소스들의 T 세포들 및/또는 APCs이 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 상기 방법은 인간 말초혈 단핵구들(PBMCs)을 사용하여 수행된다.

본 명세서에 사용된 "고갈시키는(depleting)"이라는 용어는 조절 T 세포들 일부의 제거를 의미한다. 이는 상기 세포들을 물리적으로 제거하거나 상기 T 세포들의 작용을 억제하거나 조절하여 이루어질 수 있다. 따라서, 표적된 T 세포들의 활성은 감소된다.

본 발명의 일부로서, 조절 T 세포들을 고갈 또는 표적하는 일련의 방법들이 CD25hi에 의한 조절 T 세포들의 고갈에 대한 대안들로서 사용될 수 있음을 당업자는 알 것이다. 또한, 본 발명은 T 세포 분석에서 조절 T 세포들의 효과를 조절하는 방법들도 포함한다는 것을 알 것이다. 고갈시키거나 또는 표적하기 위하여, 조절 T 세포들의 표면상에 발현된 분자들은 이러한 세포들을 고갈시키기 위한 CD25와 연계하거나 CD25에 대한 대안들로서 사용될 수 있다. 이러한 분자들은 GITR, CTLA-4, CD103, CC 케모카인(chemokine) 수용체 4, CD62L 및 CD45RA를 포함하지만, 여기에 한정되지 않으며, 또한 표면-연관(surface-associated) 시토카인들 또는 IL-10 및 TGFβ와 같은 시토카인들의 표면 형태들을 포함할 수 있다. 조절 T 세포들을 고체상으로 흡착시키거나, 이러한 조절 T 세포들의 파괴 또는 억제를 야기하거나 T 세포 분석을 위해 다른 T 세포들로부터 조절 T 세포들을 분리하기 위하여 특이적인 항체들에 결합하는 단계를 포함하는 일부 방법들을 이용하여 고갈을 달성할 수 있다. 조절을 위하여, 조절 T 세포들에 의해 분비된 분자들은 이러한 분비가 일어나지 않도록 방지될 수 있거나, 분비 이후에 차단/억제/파괴될 수 있다. 이러한 분자들은 IL-10, IL-4, IL-5 및 TGFβ와 같은 시토카인들을 포함할 수 있으며, 예를 들면 항체들 또는 가용성 수용체들과 같은 분자들과 결합하는 유기 또는 무기 분자들을 사용하거나, 조절 T 세포들로 전달되거나 이러한 세포들 내에서 유도되는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드들 또는 다른 핵산들과 같은 억제성 핵산들(inhibitory nucleic acids)에 의하여 이러한 분자들을 차단할 수 있다. 또한, 조절 T 세포들 상에 GITR, CTLA-4, CD103, CC 케모카인 수용체 4, CD62L 및 CD45RA를 포함하지만 여기에 한정되지 않는 수용체들 또는 다른 표면 분자들을 표적하여 이러한 세포들의 억제 기능을 깨지 않도록 하면서 조절 T 세포 활성의 조절을 이룰수 있다. 예를 들면, 효현제(agonist) 기능을 갖거나 리간드-표적 상호작용을 차단하여 조절 T 세포들이 제거되지 않지만 비기능성이 되도록하는 특이적인 항체들에 의하여 이러한 기능 억제를 이룰 수 있다. 또한, 조절 T 세포들에 의하여 분비된 분자들의 표적 수용체들을 차단함으로써, 또는 이러한 분비된 분자들에 의하여 활성화되거나 하향조절된(down-regulated) 경로들을 차단함으로써 조절 T 세포 활성의 조절을 이룰 수 있다. 또한, 조절을 위하여 예를 들면, foxp3와 같은 전사 인자들을 차단하거나 조절 T 세포들과 관련된 다른 기능들 또는 경로들을 차단함으로써 조절 T 세포들이 직접 억제될 수 있다. 유기 또는 무기 분자들에 의하거나, 조절 T 세포들로 전달되거나 이러한 세포들 내에서 유도되는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드들 또는 다른 핵산들과 같은 억제성 핵산들에 의하여 이러한 억제 또는 차단을 이룰 수 있다. 유기, 무기 또는 핵산 분자들을 이용하여 조절 T 세포들의 작용을 억제하거나 조절 T 세포들을 조절하는 과정에서 상기 분자들이 T 세포 분석에 간섭하는 모든 경우에, 바람직하게는 상기 분자들은 분석으로부터 제거되거나 분석에 간섭하지 않는 형태로 변형될 것이다. 예를 들면, 조절 T 세포들에 의하여 분비된 분자들을 제거하는데 사용된 특이적인 항체들 또는 단백질들은 T 세포 분석 이전에 선택적으로 제거되거나 T 세포 분석을 간섭하지 않는 특이적인 형태로 사용될 것이다. 예를 들면, 인간 T 세포 분석을 위하여, 항체 또는 단백질의 인간 형태가 사용되어 상기 항체 또는 단백질 자체에 대한 T 세포 반응들을 회피할 것이다.

바람직하게는, 다음과 같이 핵심 단계들을 갖는 상기 분석법은 인간 말초혈 단핵구들(PBMCs)을 사용하여 이용된다;

(1) PBMCs는 인간 혈액 표본들로부터 제거된다

(2) CD8⁺ T 세포들이 제거된다

(3) CD25^hi T 세포들이 고갈된다, 그리고

(4) 배양세포들(cultures)은 하나 이상의 농도에서 시험 항원들과 함께 배양되고 T 세포 증식 및/또는 시토카인 방출 여부를 위해 하나 이상의 시점에서 시험된다.

본 발명에서 T 세포 에피토프 활성의 측정은 단일 MHC 동형이인자형들(allotypes) 또는 다수(multiple) MHC 클래스 II 동형이인자형들과 관련하여 T 세포 에피토프 활성에 관한 것일 수 있다. 따라서, 개별 펩티드들은 단일 또는 복수 MHC 동형이인자형들을 사용하여 시험될 수 있으므로, 데이터베이스들은 단일 또는 복수 MHC 동형이인자형들 중 어느 하나에 관한 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 예를 들면 인간 헬퍼 T 세포 에피토프들에 대하여 복수 MHC 동형이인자형들을 사용하여 펩티드들이 시험되며, 통상적으로 펩티드들은 적어도 20 개의 상이한 MHC-타이핑된(typed) 인간 혈액 표본들(그리고 통상적으로 40 내지 60 개 혈액 표본들) 및 상기 표본들의 MHC-타이핑으로부터 결정된 활성 펩티드들의 MHC 연관(association)을 사용하여 시험된다.

본 발명의 바람직한 방법에서, T 세포 에피토프 데이터베이스들 및 데이터 구조들은 MHC 동형이인자형들과의 연관에 관한 데이터로 주석이 달리게(annotate)될 것이다. 또한, T 세포 에피토프 데이터베이스는 공여체의 디테일(detail)로 주석이 달리수 있으며, T 세포 에피토프를 함유하는 펩티드들에 대하여는 1차 또는 2차 반응들, 증식 및 시토카인 측정, 반응하는 공여체의 백분율, 반응의 크기(magnitude of responses) 및 반응하는 공여체의 전체 MHC 타이프들에 관한 데이터와 같은 T 세포 반응들의 디테일로 주석이 달릴 수 있다.

다수의 펩티드들의 T 세포 에피토프 활성을 결정하는데 사용된 방법들과는 관계없이, 당해 발명은 T 세포 에피토프의 유무에 대해 제약 단백질 서열들의 신속한 조사를 위하여 T 세포 에피토프들(주로 헬퍼 T 세포 에피토프들)의 데이터베이스들 및 데이터 구조들을 개시한다. 이러한 T 세포 에피토프 데이터베이스들 및 데이터 구조들은 T 세포 에피토프 활성에 대한 복수의 개별 펩티드들의 시험으로부터 또는 공지된 모든 T 세포 에피토프들을 포함하는 다른 데이터의 입력으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 데이터베이스들 및 데이터 구조들은 완전한 펩티드들의 세트들로부터 또는 불완전한 펩티드들의 세트들로 인하여 데이터가 상기 데이터베이스의 조사에 의하여 시험된 일부 펩티드들에 대하여 유용하지 않을 불완전한 펩티드들의 세트들로부터 획득한 데이터를 포함할 수 있다. 또한, 당해 발명은 데이터베이스들 및 데이터 구조들의 개념 이외에, 상기 데이터베이스들 및 데이터 구조들에 포함 여부를 위해 복수개의 펩티드를 시험하는 신규한 방법들, 특히 복수개의 펩티드들의 헬퍼 T 세포 에피토프 활성 결정 방법들을 포함한다.

본 발명의 특정한 사용은 T 세포 에피토프들, 특히 헬퍼 T 세포 에피토프들의 유무에 대해 단백성 의약품들을 분석하는 것이다. 특히, 이는 T 세포 에피토프들 및 T 세포 반응들의 빈도 및 크기와 같은 다른 인자들의 유무 및 상기 반응들의 공여체 MHC 연관에 의하여 측정된 상기 의약품들의 면역원성 또는 백신 가능성(potential)을 결정하는데 유용할 것이다. 특히, 본 발명은 상이한 단백질 변이체들의 면역원성이 본 발명의 방법들로 그 단백질 서열들의 분석으로 결정될 수 있는 약학 연구에 유용할 것이다. 약학적 용도로는, T 세포 에피토프들의 최저 빈도를 갖는 단백질 변이체들이 면역원성에 대한 최저 가능성을 갖는 선두주자로 선택될 것이다.

본 발명의 다른 용도는 치료용 또는 백신용의 신규한 단백성 의약품들의 생성에 있다. 치료용으로, 본 발명의 방법들은 출발 단백질로부터 유래된 신규한 단백질 변이체들을 생성하는데 사용되며, T 세포 에피토프들의 숫자가 감소되거나 상기 T 세포 에피토프들이 상기 변이체들에서 제거된다. 통상적으로, 치료 단백질 변이체들은 출발 단백질의 서열들을 데이터베이스로부터 T 세포 에피토프 활성이 없는 새로운 서열들로 교체하여, 이러한 교체로 인해 상기 출발 단백질 및 데이터베이스 펩티드로부터 서열들의 조합을 통해 새로운 T 세포 에피토프들을 생성하지 않는 교체에 의하거나, 데이터베이스 펩티드들로부터 서열들을 조합하여 발생될 것이다. 백신용으로, 본 발명의 방법들은 출발 단백질로부터 유래된 신규한 단백질 변이체들을 생성하는데 사용되며, T 세포 에피토프들의 숫자는 상기 변이체들에서 증가한다. 본 발명의 특히 유용한 방법은 출발 단백질들의 바람직한 특성들을 유지하지만, T 세포 에피토프들의 감소 또는 제거를 통하여 잠재적으로 감소된 면역원성과 같은 개선된 특성들을 포함하는 신규한 개선된 단백질 변이체들을 생성하는 것이다.

통상적으로 상기 방법은 다음과 같은 핵심 단계들을 포함한다;

(a) 하나 이상의 기존 단백질들을 분석하여 새로운 단백질에 원하는 특성들을 제공하는데 필요한 아미노산들("바람직한 잔기들")을 제공하는 단계;

(b) 상기 기존 단백질 내의 위치들에 해당하는 위치들에서 상기 개선된 단백질에의 포함을 위하여 상기 바람직한 잔기들을 포함하는 하나 이상의 펩티드들의 펩티드 서열 데이터베이스로부터 선택하여 그러한 펩티드들이 T 세포 에피토프들이 아닌 단계; 및

(c) 하나 이상의 상기 선택된 펩티드들의 포함에 의해 상기 개선된 단백질을 합성하는 단계.

백신용으로, 본 발명의 특히 유용한 방법은 출발 단백질들의 바람직한 특성들을 유지하지만, 다른 T 세포 에피토프들도 포함하는 신규한 개선된 단백질 변이체들을 생성하는 것이다. 통상적으로 상기 방법은 다음과 같은 핵심 단계들을 포함한다;

(b) 상기 기존 단백질 내의 위치들에 해당하는 위치들에서 상기 개선된 단백질에의 포함을 위하여 상기 바람직한 잔기들을 포함하는 하나 이상의 펩티드들의 펩티드 서열 데이터베이스로부터 선택하여 그러한 펩티드들의 일부 또는 모두가 T 세포 에피토프들을 포함하는 단계; 및

(c) 하나 이상의 상기 선택된 펩티드들의 포함에 의해 상기 개선된 단백질을 합성하는 단계

본 명세서에 사용된 "개선된 단백질 변이체"는 단백질의 바람직한 특성들을 유지하면서 그 의도된 용도에 따라서 단백질의 잠재적 면역원성을 증가시키거나 감소시키도록 개조된 단백질이다. 예를 들면, 치료용으로 적합한 단백질은 유해반응을 유발할 수 있는 임의의 T 세포 에피토프들을 제거함으로써 개선될 수 있다. 또한, 백신용으로 적합한 단백질은 잠재적인 면역 반응을 증가시키기 위해 첨가된 T 세포 에피토프들을 구비하여 제공된 보호 효과를 증가시킬 수 있다.

본 명세서에 사용된 "바람직한 특성들"은 단백질이 필요한 기능을 유지하기 위하여 요구되는 단백질의 특성들을 뜻한다. 예를 들면, 치료 단백질에 대하여 이것은 효소와 같은 표적 단백질의 활성을 억제하는 능력일 수 있다. 또한, 상기 바람직한 특성들은 혈액에서 상기 단백질의 반감기를 늘리는 상기 단백질의 부분에 기인한 것이라 할 수 있다. 또한, 백신으로 사용되는 단백질들에 대하여, 면역원성 반응을 유도하는 에피토프들은 유지되어야 한다.

본 발명은 T 세포 에피토프 활성의 측정 원천에 관계없이 임의의 T 세포 에피토프들의 데이터베이스 또는 데이터 구조를 포함한다는 것을 당업자는 알 것이다. 본 발명의 데이터베이스 및 데이터 구조는 생체외 T 세포 분석 또는 생체내 연구 예를 들면, 펩티드들이 유기체에 주입되는 연구 및 살아있는 T 세포들에 행해지는 활성 측정과 같은 생체내 연구들로부터 얻은 T 세포 분석들과 같은 살아있는 T 세포들을 채용하는 분석에서 확인된 T 세포 에피토프들에 관한 것이라는 것을 알 것이다. 본 발명의 데이터베이스들 및 데이터 구조들은 T 세포들의 효과를 갖지 않는 펩티드들에 관한 것뿐만 아니라 활성 T 세포 에피토프들에 관한 데이터를 포함한다는 것을 알 것이다. 이러한 데이터베이스들 또는 데이터 구조들은 펩티드들의 특정 서열들에 관한 데이터가 포함되지 않은 일부 데이터베이스들일 수 있음을 알 것이다. 또한, 상기 데이터베이스들 또는 데이터 구조들은 통상적으로 펩티드의 N 및/또는 C 말단에서 아미노산들을 플랭킹하는 헬퍼 T 세포 에피토프들을 위한 9량체들과 같은 특정한 길이를 갖는 펩티드들의 가능한 모든 서열들을 포함하는 완전한 데이터베이스들 또는 데이터 구조들일 수 있다. 본 발명의 데이터베이스들 및 데이터 구조들은 바람직하게는 MHC 클래스 II와 연관된 헬퍼 T 세포 타이프의 T 세포 에피토프들에 관한 것이지만, 또한 MHC 클래스 I 한정된 에피토프들, 특히 세포독성 T 세포 에피토프들에 관한 것이라는 것을 알 것이다. 또한, 본 발명의 데이터베이스들 및 데이터 구조들은 T 세포들을 직접 하향 조절하거나 억제시키는 조절 T 세포들 및 펩티드들을 자극시키는 펩티드들과 같은 T 세포들 상에서 다른 활성들을 갖는 펩티드들을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다.

본 발명은 다음과 같은 예들에 의하여 도시되지만 그에 의하여 한정되지 않는다. 다음 예들은 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주 되어서는 안 된다. 도면들 및 표들은 다음 예들에 관한 것이며 다음과 같다;

표 1은 다른 T 세포 에피토프들로부터 다양한 MHC 접촉 잔기들의 백그라운드 상에서 T 세포 에피토프로부터 유래한 고정된 T 세포 수용체 접촉 잔기들을 갖는 펩티드들의 T 세포 증식 분석의 결과들을 도시한다(예 3 참조).

도 1은 다양한 펩티드들 또는 KLH를 첨가한 이후에 헬퍼 T 세포 반응들에 미치는 CD25hi T 세포들의 고갈 효과(자극 지수 = 펩티드가 있는 T 세포 증식: 펩티드가 없는 T 세포 증식의 비율)를 도시한다(예 1 참조).

도 2는 T 세포 분석에 의하여 확인된 T 세포 에피토프들이 데이터베이스 펩티드 서열들을 선택하여 비-T 세포 에피토프들로 대체되는 키메라(chimeric) 항-CD 20 항체 및 에피토프-변형된 항체의 연속 희석들의 결합을 FACS 분석한 결과들을 도시한다(예 4 참조).

도 3은 해당 상대 2, 3, 5 및 8 잔기들(relative corresponding 2, 3, 5 and 8 residues)을 갖는 동일한 T 세포 에피토프 핵심 9량체들 및 MHC 결합 9량체들에 대한 T 세포 에피토프 데이터베이스를 검색하여 인간화 A33 및 항-HER2 항체들의 가변 영역 서열들의 상대 분석을 도시한다(예 5 참조).

도 4는 전체 인간화 A33 및 항-HER2 항체들을 분석한 T 세포 분석을 도시한다(예 5 참조).

예 1: T 세포 에피토프들의 결정 방법 및 T 세포 에피토프 데이터베이스의 생성

아덴브루크 병원 지역 연구 윤리 위원회의 승인에 따라 국립 수혈 서비스(아덴브루크 병원, Cambridge, 영국)로부터 획득한 건강한 지역 공동체 공여체(ommunity donor) 백혈구 연층으로부터(24 시간 이내에 채취한 혈액으로부터) 말초혈 단핵구들을 분리하였다. Ficoll (GE 헬스케어(Healthcare), Chalfont St Giles, 영국) 밀도 원심분리(density centrifugation)에 의하여 백혈구 연층으로부터 말초혈 단핵구를 분리하였으며 CD8+ RossetteSep^TM (StemCell Technologies, Vancouver, 캐나다)을 사용하여 CD8+ T 세포들을 고갈시켰다. 대조 항원 Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) (Pierce, Cramlington, 영국), 파상풍 톡소이드(Aventis Pasteur, Lyon, 프랑스) 및 인플루엔자 HA(C32, aa 307-319)로부터 얻은 대조 펩티드 에피토프에 대한 T 세포 반응들을 결정할 뿐만아니라 Allset^TM SSP-PCR 기반 조직-타이핑 키트(Dynal, Wirral, 영국)를 사용한 HLA-DR 단상형들을 확인함으로써 공여체들을 특성화하였다.

공급자의 표준 프로토콜 및 자석을 사용하는 Miltenyl Biotech (Guildford, 영국)의 항-CD25 마이크로비드들을 사용하여 CD25^hi T 세포 고갈을 수행하였다. 각 공여체를 담은 10 개의 바이알들을 해동시켰으며 세포들을 30 ㎖ 2% 비활성화 인간 혈청/PBS(Autogen Bioclear, Calne, Wiltshire, 영국)에 재현탁시켰다. 5x10⁷ 개의 세포들을 3개의 15 ㎖의 튜브들에 옮겨넣었으며, 나머지 세포들은 전혈(whole) 말초혈단핵구들로 보관하였다. 비드 300 ㎕ + 분리 완충제(0.5% 인간 혈청/2 mM EDTA/PBS) 4200 ㎕를 사용하여 항-CD25 마이크로비드 희석 혼합물을 제조하였다. 상기 15 ㎖ 튜브들을 원심분리하여 마이크로비드 희석 혼합물 500 ㎕에 재현탁시켰다. 이후 튜브들을 칼럼상에서 분리하기 이전에 4℃에서 5, 10 또는 20 분 동안 두었다. 스탠드 상에 지지된 자석에 칼럼을 설치해 두고, 칼럼에 분리 완충제 2 ㎖를 첨가하고 이를 적하(drip through)하도록 하여 칼럼들을 설치하였다. 비드들과 함께 배양시킨 이후에, 분리 완충제 10 ㎖를 첨가하였으며 튜브들을 1500 rpm으로 7 분 동안 원심분리하였다. 이후 세포들을 분리 완충제 500 ㎕에 재현탁시키고 상기 칼럼에 첨가한 다음 분리 완충제 1 ㎖로 2회 세척하였다. 상기 칼럼을 통과한 플로우(flow)를 15 ㎖ 튜브들에 채집하였으며 상기 흐름은 CD25^hi T 세포 고갈된 부분(fraction)을 함유하였다. 이러한 세포들을 1500 rpm으로 7 분 동안 회전시켰으며 계수하기 전에 3 ㎖ AIMV 배지(Invitrogen, Paisley, 영국)에 재현탁시켰다.

CD4 및 CD25에 대하여 세포들을 염색하였으며 세포 숫자들을 FACS로 검출하 였다. 각각의 세포 군집의 5x10⁵ 내지 10x10⁵ 개 세포들을 96-웰 U자 바닥 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, 독일)의 하나의 웰에 넣었다. 상기 플레이트를 1200 rpm으로 4 분 동안 회전시켰다. 상청액을 걷어내고 세포들을 항체 희석제(antibody dilution) 50 ㎕에 재현탁시켰다. 항체 희석제는 FACS 완충제(1% 인간 혈청/0.01% 아지드화 나트륨/PBS)에 FITC-라벨링된 항-CD4 항체(R&D Systems, Mineapolis, 미국) 1/50 희석액 + PE-라벨링된 항-CD25 항체(R&D Systems, Mineapolis, 미국) 1/25 희석액으로 구성되었다. 또한, 대조 세포들을 비염색, 동기준 표본 대조(isotype controls)으로 염색 또는 라벨링된 항체로 단독 염색하였다.

플레이트들을 암실의 얼음 상에서 30 분 동안 배양하였다. 이후 플레이트들을 1200 rpm으로 4 분 동안 회전시켰다. 상청액을 걷어내고 세포들을 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 이를 2회 반복하였으며 이후 세포들을 FACS 튜브들에 옮겨 넣었다. FACS 캘리버(Calibur)(Becton Dickinson, Oxford, 영국)에 세포들을 통과시켰으며 데이터를 수집하여 크기, 입도 및 형광 태그들을 기준으로 분석하였다.

다음과 같이 증식 분석을 수행하였다. 전체(whole) CD8⁺ T 세포 고갈된 PBMC 및 CD8⁺ CD25^hi 고갈된 PBMC를 AIMV 100 ㎕의 웰당 2 x 10⁵ 개로 첨가하였다. 평평한 바닥 96 웰 플레이트들을 사용하여, 각각의 시험 조건에 대해 3벌 배양물(triplicate cultures)을 구축하였다. 각각의 펩티드에 대하여, 100 ㎕를 상기 세포 배양물들에 첨가하여 최종 농도가 5 μM가 되도록 하였다. 각각의 웰을 1 mCi/㎖ 3 HTdR(GE Healthcare, Chalfont St Giles, 영국)로 18 시간 동안 펄스를 가하기 이전에 세포들을 펩티드들 및 단백질 항원들과 함께 7 일 동안 배양하였다.

증식 분석을 위하여, 2 이상의 자극 지수(SI≥2) 역치를 사용하여, 상기 역치 이상의 증식 반응들을 유도하는 펩티드들은 양성인 것으로 간주하였다(점선). 일방향의 짝을 짓지 않은(unpaired) 학생용 T 시험을 이용한 분산 계수(CV), 표준 편차(SD) 및 유의도(p<0.05)를 결정하기 위하여 모든 데이터를 분석하였다. SI≥2로 도시된 모든 반응들은 미처리 배지 대조군들과는 상당히 상이하였다(p<0.05).

시험된 인간 공여체들 중 하나로부터 일련의 경계선(borderline) 또는 약한 T 세포 에피토프들(2번 펩티드(GDKFVSWYQQGSGQS), 6번 펩티드(IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY), 9번 펩티드(QSISNWLNWYQQKPG)) 및 한 쌍의 강한 T 세포 에피토프들(25번 펩티드(PKYRNMQPLNSLKIAT) 및 26번 펩티드(TVFYNIPPMPL)) 및 KLH 항원에 이르는 말초혈 단핵구들에서의 T 세포 증식 반응들을 제시하는 결과들이 도 1에 도시되어 있다. 상기 결과들은 CD25^hi T 세포들을 고갈시킨 이후에 모든 펩티드들에 대한 T 세포 반응들에서의 증가를 도시한다. CD25^hi T 세포들을 10 또는 20 분 동안 고갈시킨 다음 모든 펩티드들에 대한 최대 반응들을 결정하였다. 이러한 결과들은 펩티드들 2 및 9와 같은 펩티드들의 예에서 T 세포 반응들에 대해 사전에 경계선 또는 음성으로 계산된 펩티드들에서의 T 세포 에피토프들의 검출을 가능하게 했던 CD25^hi T 세포 고갈 이후에 T 세포 반응들에서의 강한 증가를 입증하였다.

상기 2번, 9번, 25번 및 26번 펩티드들에서의 돌연변이는 다음과 같이 작성하였다;

2-F→G (GDKGVSWYQQGSGQS)

9-L→G (QSISNWGNWYQQKPG)

25 M→G (PKYRNGQPLNSLKIAT)

26 F→G (TVGYNIPPMPL)

상기와 같이 10 및 20 분 동안 CD25^hi T 세포 고갈을 포함하고 공여체 475를 포함하여 증식 분석에서 이러한 펩티드들을 재시험하였다. 공여체 475를 포함하는 어떠한 공여체들도 이러한 돌연변이된 펩티드들 중 임의의 것에 대하여 상당한 T 세포 반응을 보이지 않았다. 따라서, 2번, 6번, 9번, 25번 및 26번 펩티드들은 데이터베이스에 헬퍼 T 세포 에피토프들로 입력된 반면에, 펩티드들 2-F→G, 9-L→G, 25 M→G 및 26 F→G는 헬퍼 T 세포 에피토프 반응들에 대하여 음성인 것으로 입력되었다. Sturniolo et al. (National Biotechnology, vol 17 (1999) p555-561)의 TEPITOPE 방법에 의한 비돌연변이 펩티드 서열들을 평행 분석하면 이러한 펩티드들에 의한 MHC 클래스 II 결합을 위한 가능성 있는 P1 위치들은 이후에 G(글리신) 잔기들로 돌연변이된 아미노산들이 있는 위치였으며, 따라서 이러한 펩티드들은 MHC 클래스 결합을 위한 상대 1, 4, 6, 7 및 9 위치들에 있는 아미노산들 및 T 세포 수용체 인식을 위한 2, 3, 5 및 8 위치들에 있는 아미노산들을 포함하는 핵심 MHC 결합 9량체에서의 추정 잔기들로 상기 데이터베이스에서 주석이 달렸음을 시사하였 다.

예 2: 고정된 MHC 접촉 잔기들을 사용한 펩티드들의 분석

(i) 예 1의 방법을 이용하여 발생된 T 세포 에피토프들의 데이터베이스, (ii) 펩티드-MHC 결합 예측을 위한 TEPITOPE 알고리즘, 및 (iii) 예 1의 T 세포 분석법을 이용하여 고정된 상대 1, 4, 6, 7 및 9 위치들을 갖는 다음의 펩티드들을 분석하였다:

1 - NWLRNYDQKQGAT

2 - NWLEGYHQKIGAT

3 - NWLLKYMQKFGAT

4 - NWLPSYTQKWGAT

6- NWLNDYQQKEGAT

7 - NWLGHYIQKLGAT

8 - NWLKMYFQKPGAT

9 - NWLSTYWQKYGAT

10- NWLAAYAQKAGAT

11- NWGRNYDQKQGAT

12- NWGEGYHQKIGAT

13- NWGLKYMQKFGAT

14- NWGPSYTQKWGAT

15- NWGYVYAQKRGAT

16- NWGNDYQQKEGAT

17- NWGGHYIQKLGAT

18- NWGKMYFQKPGAT

19- NWGSTYWQKYGAT

20- NWGAAYAQKAGAT

1번 내지 10번 펩티드들은 모두 NWL이라는 3 개의 아미노산 N-말단 서열을 포함하는 반면에, 11번 내지 20번 펩티드들은 상기 제3 N-말단 아미노산이 L 대신에 G라는 점을 제외하고는 1번 내지 10번 펩티드들의 유사체들이다. 상기 1번 내지 10번 펩티드들에 대하여 상기 T 세포 에피토프 데이터베이스를 조사하면 예 1의 9번 펩티드에 해당하는 펩티드 QSISNWLNWYQQKPG에서 동일한 해당 상대 위치들 1, 4, 6, 7 및 9를 갖는 이전 헬퍼 T 세포 에피토프를 확인하였으며, 이에 의하여 이전의 TEPITOPE 분석은 LNWYQQKPG의 MHC 결합 핵심 9량체임을 시사하였다. 11번 내지 20번 펩티드들은 핵심 9량체에서 중요한 소수성 P1 앵커(anchor)가 부족하였으며, 따라서 비-에피토프들(non-epitopes)인 것으로 잠정적으로 판정되었다. 이러한 분석은 11번 내지 20번 펩티드들이 아닌 1번 내지 10번 펩티드들이 일련의 MHC 클래스 II 동종이인자형들과 결합하였다는 것을 예측하였던 1번 내지 20번 펩티드들에 대한 TEPITOPE 분석으로 지지되었다.

예 1의 T 세포 분석법을 사용하고 공여체 475(도 1 참조)를 사용하여 1번 내지 20번 펩티드들을 분석하면 1번 내지 6번 펩티드들과 8번 내지 10번 펩티드들은 상당한 헬퍼 T 세포 반응들을 나타낸 반면에, 7번 및 11번 내지 20번 펩티드들은 상당한 반응들을 나타내지 않은 것으로 드러났다. 이는 예 1로부터 9번 펩티드와의 데이터베이스 일치는 사전에 분석하지 않은 1번 내지 6번 및 8번 내지 10번 펩티드들(공통된 상대 1, 4, 6, 7 및 9 위치를 갖음)을 T 세포 에피토프들로 정확히 확인하였음을 시사하였다. 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8에서 일치 여부에 대해 데이터베이스를 더 조사하면 T 세포 분석에 의해 비-T 세포 에피토프로 사전에 판정되었으며 7번 펩티드(NWLGHYIQKLGAT)(그리고 또한 17번 펩티드(NWGGHYIQKLGAT)와 동일한 2, 3, 5 및 8 위치들을 가졌던 펩티드 서열 GFGHEIGPLGEP를 확인하였다. 이는 MHC 클래스 II와 결합한 펩티드 내에서 이러한 T 세포 수용체 접촉 잔기들은 T 세포 반응을 야기하지 않았음을 시사하였다. 해당 상대 위치 2, 3, 5 및 8에서 동일한 잔기들을 갖는 비-T 세포 에피토프 펩티드와 7번 및 17번 펩티드들의 데이터베이스 일치는 사전에 분석되지 않은 7번 및 17번 펩티드들이 비-T 세포 에피토프들이라고 정확히 확인하였음을 시사하였다. 전체적으로, 본 예는 비록 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8을 갖는 펩티드들로부터 얻은 정보로 상기 시험 펩티드가 T 세포 에피토프를 포함하는지의 여부를 결정할 수 있다고 하지만, 공지된 T 세포 에피토프에 일치하는 공통된 상대 1, 4, 6, 7 및 9 위치들을 갖는 시험 펩티드들의 잠재적인 T 세포 에피토프 활성을 입증하였다.

예 3: 고정된 T 세포 수용체 접촉 잔기들을 사용한 펩티드들의 분석

불변(constant) T 수용체 접촉 잔기들이 MHC 결합 펩티드에서 MHC 접촉 잔기들(해당 상대 위치들 1, 4, 6, 7 및 9)의 임의의 조합의 백그라운드(background) 상에 T 세포 반응들을 유도하는 능력은 핵심 9량체 LQHWSYPLT를 갖는, 확인된 데이 터베이스 T 세포 에피토프로부터 T 세포 수용체 접촉 잔기들을 사용하여 시험되었다. 상기 T 세포 수용체 접촉 잔기들 _QH_S__L은 4 가지 다른 데이터베이스 T 세포 에피토프들의 백그라운드 상으로 다음과 같이 치환되었다;

FLLTRILTI, ILWEWAWASVR, LSCAAGGRA 및 FKGEQGPKG는 시험 펩티드들 FQHTSILLI, IQHESASLR, LQHASGGLA 및 FQHESGPLG로 되었다. 또한, 대조 펩티드들은 변형된 P1 잔기들(F->G)로 다음과 같이 작성되었다; GQHWSYPLT, GQHTSILLI, GQHESASLR, GQHASGGLA 및 GQHESGPLG.

이러한 펩티드들을 일련의 MHC 클래스 단상형들을 갖는 50 개의 공여체들을 사용하여 예 1의 T 세포 분석법으로 시험하였다. 반응하는 공여체들의 숫자(50개 이상) 및 반응하는 공여체들에 대한 평균 자극 지수(SI)를 측정하여 상기 시험 펩티드들에 대하여 비교하였다. 그 결과들은 표 1에 도시되어 있는데, 이는 고정된 T 세포 수용체 접촉 잔기들 _QH_S__L은 4 가지 다른 T 세포 에피토프들과는 상이한 백그라운드 MHC 접촉 잔기들 각각에 헬퍼 T 세포 반응들을 유발할 수 있으며, 그러한 T 세포 반응들은 MHC 결합이 상기 소수성 P1 잔기의 제거에 의하여 제거되었음을 입증하였다. 또한, 본 예는 MHC 결합 잔기들의 고정된 백그라운드 상에 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8에서 가능한 T 세포 수용체 접촉 잔기들의 모든 조합들을 시험하여 공지된 T 세포 에피토프 활성을 갖는 펩티드들의 대규모(large) 데이터베이스를 생성하는 잠재력을 입증하였으며, 따라서 T 세포 분석에서 단지 20⁴ (160,000) 개 펩티드들의 분석을 필요로 한다.

예 4: T 세포 에피토프 제거에 의한 변형 항- CD20 항체의 발생

T 세포 에피토프들의 데이터베이스는 상기 항-CD20 항체 Leu 16에서 공지된 T 세포 에피토프들을 확인하는데 사용되었다(Gillies et al., Blood 105 (2006) p3972-3978). 상기 Leu16 경쇄(light chain) 가변 영역(VL) 서열 5'-DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK-3'로부터 시작하는 중복(overlapping) 15량체들과 함께 상기 Leu16 중쇄(heavy chain) 가변 영역(VH) 서열 5'-EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS-3'의 N-말단으로부터 시작하는 중복 15량체들을 분석하여 다음과 같이 상기 VH에서 3 가지 실제 T 세포 에피토프들(동일한 핵심 9량체들) 및 2 가지 잠재성 T 세포 에피토프들(소수성 P1 앵커를 갖는 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8에서의 동일한 잔기들)을 확인하였다;

데이터베이스 에피토프 9량체

Leu16VH LVKPGASVK LVKPGASVK

FKGKATLTA FKGKATLTA

LTSEDSADY LTSEDSADY

Leu16VL ILSASPGEK LLSGSPAEK

MDWYQKKPG LDWYQKKPG

업계에 공지된 방법들 및 적절하게는 이러한 방법들에 사용되는 효소들의 사용을 위한 재조사 지시사항들을 사용하여 재조합 DNA 기술을 수행하였다. 일반적인 방법들의 출처들은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, vols 1-3, eds. Sambrook and Russel (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press 및 Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, John Wiley and Sons를 포함하였다. 상기 Leu16 가변 영역 유전자들은 새로운 펩티드 서열들을 도입하는 Gillies et al., ibid 의 방법들을 이용하여 클로닝되고 변형되어 상기 T 세포 에피토프-관련 핵심 9량체들을 대체하였다. 호환성 비-에피토프 9량체 펩티드들은 다음과 같이 데이터베이스로부터 선택되었다.

추정 T 세포 에피토프 데이터베이스 비-에피토프 9량체

Leu16VH LVKPGASVK ⇒ VVKPGASVK

FKGKATLTA ⇒ FKGRVTLTA

LTSEDSADY ⇒ LRSEDSAVY

Leu16VL ILSASPGEK ⇒ TLSASPGEK

MDWYQKKPG ⇒ MAWYQQKPG

이러한 변형된 9량체들은 PCR에 의하여 상기 Leu VH 및 VL 서열들로 도입되며 그로 인한 유전자들은 개별 벡터들에 클론되어 키메라 중쇄 및 경쇄들을 각각 엔코딩하는 인간 IgG1 및 인간 κ 불변 영역들을 제공하였다. 변형되지 않은(키메라) 및 에피토프 변형된 Leu16 중쇄 및 경쇄들을 포함하는 플라스미드들은 NS0 세포들로 전달감염되었으며, 안정된 형질전환체들이 단백질 A를 사용한 항체 수확(harvesting) 및 정제를 위해 선택되었다.

상기 항체들의 시험은 Gillies et al., ibid에 따라 수행되었으며 CD20+ 인 간 다우디 버킷(Daudi Burkitt) 림프종 세포주(ATCC, Rockville, 메릴랜드)를 표적으로 사용하였다. 삽입된 데이터베이스 비-에피토프들을 갖는 변형된 항체와 비교하여 키메라 항-CD20의 결합을 시험하기 위해 결합 분석은 FACS 포맷에서 수행되었다. 그 결과들(도 2)은 Leu16으로부터 유래한 에피토프 변형된 항-CD20 항체는 키메라 항-CD20과 비교하여 유사한 효율로 다우디 세포들과 결합한다는 것을 보여준다. 상기 에피토프 변형된 항-CD20은 상기 키메라 항-CD20 항체에 대하여 잠재적으로 더 낮은 면역원성 대안을 제공한다.

예 5: T 세포 에피토프들의 유무에 대한 A33 및 항- HER2 항체 가변 영역들의 비교

T 세포 에피토프 데이터베이스를 검색하여, 인간화된 A33 항체(US6307026, Celltech Ltd.) 및 Herceptin

으로 알려진 인간화된 항-HER2 항체(Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol 89 (1992) p4285, US5821337)의 가변 영역들의 서열들을 비교하였다. 예 1에 따라 생성된 T 세포 에피토프들의 데이터베이스는 동일한 9량체 서열들에 대하여 검색되었으며, 또한 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8을 갖는 9량체들에 대하여도 검색되었다. 그 결과들은 도 3에 도시되어 있다. 인간화된 A33에 대하여, T 세포 에피토프 활성에 대해 양성인 펩티드들로부터 3 가지 동일한 9량체들은 Sturniolo et al ., ibid 에 따라 인간화된 A33으로부터 핵심 9량체가 MHC 클래스 II를 결합하는 것으로 예측되었던 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8을 갖는 에피토프들과 2번 일치하는 것으로 데이터베이스에서 확인되었다. 일련의 일치사항들은 T 세포 활성(미도시)이 없는 데이터베이스 펩티드들을 이용하여 발견되 었다. 인간화된 항-HER2 항체에 대하여, T 세포 에피토프 활성에 대해 양성인 펩티드들로부터 동일한 9량체가 데이터베이스에는 확인되지 않았으며, 핵심 9량체가 MHC 클래스 II를 결합하는 것으로 예측된 해당 상대 위치들 2, 3, 5 및 8을 갖는 에피토프와 단독 일치하는 것으로 확인되었다.

상기 인간화된 A33 및 항-HER2 항체들은 예 4의 방법들에 따라 구축되었다. 이들은 증식 분석에서 53개의 공여체들을 사용하는 예 1에서와 같이 T 세포 분석에서 분석되었으며 항체 1 ㎖를 첨가하여 최종 농도가 10 ㎍/㎖가 되었다. 도 4의 데이터는 항체 첨가 후 5일 내지 8일 사이의 최대 자극 지수를 도시하며 인간화된 A33에 대하여 53개 공여체들 중 13개에 대하여 상당한 T 세포 반응이 관찰되었으며 인간화된 항-HER2 항체에 대하여 53개 공여체들 중 단지 2개에 대해서만 상당한 T 세포 반응이 관찰되었음을 시사한다.

이러한 데이터는 상기 인간화된 A33 항체의 가변 영역이 상당한 T 세포 에피토프들(실제 3, 예측 3)을 포함하는 반면에, 상기 인간화된 항-HER2 항체는 확인된 T 세포 에피토프들을 포함하지 않으며 다른 에피토프로부터 위치들 2, 3, 5 및 8에서 소정의 모티프를 갖는 예측된 하나의 에피토프만을 포함한다는 것을 시사한다. 또한, 이러한 데이터는 상기 인간화된 A33에 비하여 상기 인간화된 항-HER2 항체(Herceptin

)의 임상 면역원성이 더 낮다는 것과 일치하는 결과이다.

	반응하는 공여체들의 숫자	평균 SI
LQHWSYPLT	5	6.3+-1.3
FLLTRILTI	6	3.9+-1.6
ILWEWASVR	3	2.6+-0.6
LSCAAGGRA	3	2.3+-0.5
FKGEQGPKG	4	3.5+-0.7

FQHTSILLI	5	3.8+-0.7
IQHESASLR	3	2.6+-0.1
LQHASGGLA	2	2.2+-0.2
FQHESGPLG	3	2.8+-0.7
GQHWSYPLT	0	-
GQHTSILLI	0	-
GQHESASLR	0	-
GQHASGGLA	0	-
GQHESGPLG	0	-

SEQUENCE LISTING <110> ANTITOPE LIMITED CARR, Frank BAKER, Matthew Paul <120> T CELL EPITOPE DATABASES <130> P43904WO/PWC <140> PCT/GB2007/003868 <141> 2007-10-11 <150> GB0620129.1 <151> 2006-10-11 <150> GB0620123.0 <151> 2006-10-11 <160> 67 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 9 amino acid test peptide which may be considered a possible T cell epitope <400> 1 Ala Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope <400> 2 Ala Ala Ala Phe Ala His Ile Ala Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope <400> 3 Ala Asp Glu Ala Gly Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope <400> 4 Gly Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Weak T cell epitope <400> 5 Gly Asp Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Gly Ser Gly Gln Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Weak T-cell epitope <400> 6 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Cys Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Weak T-cell epitope <400> 7 Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Strong T cell epitope <400> 8 Pro Lys Tyr Arg Asn Met Gln Pro Leu Asn Ser Leu Lys Ile Ala Thr 1 5 10 15 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Strong T cell epitope <400> 9 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated T cell epitope <400> 10 Gly Asp Lys Gly Val Ser Trp Tyr Gln Gln Gly Ser Gly Gln Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated T-cell epitope <400> 11 Gln Ser Ile Ser Asn Trp Gly Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated T cell epitope <400> 12 Pro Lys Tyr Arg Asn Gly Gln Pro Leu Asn Ser Leu Lys Ile Ala Thr 1 5 10 15 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated T cell epitope <400> 13 Thr Val Gly Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 14 Asn Trp Leu Arg Asn Tyr Asp Gln Lys Gln Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 15 Asn Trp Leu Glu Gly Tyr His Gln Lys Ile Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 16 Asn Trp Leu Leu Lys Tyr Met Gln Lys Phe Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 17 Asn Trp Leu Pro Ser Tyr Thr Gln Lys Trp Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 18 Asn Trp Leu Tyr Val Tyr Ala Gln Lys Arg Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 19 Asn Trp Leu Asn Asp Tyr Gln Gln Lys Glu Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 20 Asn Trp Leu Gly His Tyr Ile Gln Lys Leu Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 21 Asn Trp Leu Lys Met Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 22 Asn Trp Leu Ser Thr Tyr Trp Gln Lys Tyr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 23 Asn Trp Leu Ala Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 24 Asn Trp Gly Arg Asn Tyr Asp Gln Lys Gln Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 25 Asn Trp Gly Glu Gly Tyr His Gln Lys Ile Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 26 Asn Trp Gly Leu Lys Tyr Met Gln Lys Phe Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 27 Asn Trp Gly Pro Ser Tyr Thr Gln Lys Trp Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 28 Asn Trp Gly Tyr Val Tyr Ala Gln Lys Arg Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 29 Asn Trp Gly Asn Asp Tyr Gln Gln Lys Glu Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 30 Asn Trp Gly Gly His Tyr Ile Gln Lys Leu Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 31 Asn Trp Gly Lys Met Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 32 Asn Trp Gly Ser Thr Tyr Trp Gln Lys Tyr Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide with fixed MHC contact residues <400> 33 Asn Trp Gly Ala Ala Tyr Ala Gln Lys Ala Gly Ala Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 9mer MHC binding core <400> 34 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 1 5 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope <400> 35 Gly Phe Gly His Glu Ile Gly Pro Leu Gly Glu Pro 1 5 10 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 9mer T cell epitope core <400> 36 Leu Gln His Trp Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database T cell epitope <400> 37 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database T cell epitope <400> 38 Ile Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database T cell epitope <400> 39 Leu Ser Cys Ala Ala Gly Gly Arg Ala 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database T cell epitope <400> 40 Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Test peptide resulting from substituting contact residues onto a database T cell epitope <400> 41 Phe Gln His Thr Ser Ile Leu Leu Ile 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Test peptide resulting from substituting contact residues onto a database T cell epitope <400> 42 Ile Gln His Glu Ser Ala Ser Leu Arg 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Test peptide resulting from substituting contact residues onto a database T cell epitope <400> 43 Leu Gln His Ala Ser Gly Gly Leu Ala 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Test peptide resulting from substituting contact residues onto a database T cell epitope <400> 44 Phe Gln His Glu Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Control peptide with altered P1 residue <400> 45 Gly Gln His Trp Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Control peptide with altered P1 residue <400> 46 Gly Gln His Thr Ser Ile Leu Leu Ile 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Control peptide with altered P1 residue <400> 47 Gly Gln His Glu Ser Ala Ser Leu Arg 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Control peptide with altered P1 residue <400> 48 Gly Gln His Ala Ser Gly Gly Leu Ala 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Control peptide with altered P1 residue <400> 49 Gly Gln His Glu Ser Gly Pro Leu Gly 1 5 <210> 50 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminus of CD20 antibody Leu16 heavy chain variable region (VH) sequence <400> 50 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminus of CD20 antibody Leu16 light chain variable region (VL) sequence <400> 51 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope in VH sequence of CD20 antibody Leu16 <400> 52 Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope in VH sequence of CD20 antibody Leu16 <400> 53 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> T cell epitope in VH sequence of CD20 antibody Leu16 <400> 54 Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Potential T cell epitope in VL sequence of CD20 antibody Leu16 <400> 55 Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Potential T cell epitope in VL sequence of CD20 antibody Leu16 <400> 56 Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database T cell epitope <400> 57 Leu Leu Ser Gly Ser Pro Ala Glu Lys 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database T cell epitope <400> 58 Leu Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database non-epitope 9mer <400> 59 Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database non-epitope 9mer <400> 60 Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database non-epitope 9mer <400> 61 Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database non-epitope 9mer <400> 62 Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Database non-epitope 9mer <400> 63 Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 1 5 <210> 64 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable region of humanized A33 antibody <220> <221> SITE <222> (18)..(26) <223> T cell epitope core 9mer or MHC binding 9mer <220> <221> SITE <222> (104)..(112) <223> T cell epitope core 9mer or MHC binding 9mer <400> 64 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Thr Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 65 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region of humanized A33 antibody <220> <221> SITE <222> (11)..(19) <223> T cell epitope core 9mer or MHC binding 9mer <220> <221> SITE <222> (89)..(97) <223> T cell epitope core 9mer or MHC binding 9mer <400> 65 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Val 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys 100 105 <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Heavy chain variable region of humanized anti-HER2 antibody <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Light chain variable region of humanized anti-HER2 antibody <220> <221> SITE <222> (54)..(62) <223> T cell epitope core 9mer or MHC binding 9mer <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims

T 세포 에피토프 활성에 대하여 사전에 분석된 펩티드 서열들의 데이터베이스를 검색하여 시험 펩티드 서열이 T 세포 에피토프를 포함하는지 여부를 결정하는 것을 특징으로 하는 결정 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 데이터베이스는 상기 시험 펩티드 서열과 동일한 펩티드 서열들에 대하여 검색되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 2에 있어서,

상기 시험 펩티드 서열은 길이가 9개 아미노산인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1에 있어서,

상기 데이터베이스는 상기 시험 펩티드 서열과 유사한 펩티드 서열들에 대하여 검색되며, 길이가 9 내지 15개 아미노산인 시험 펩티드 서열들에 대하여 아미노산 4개 정도가 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 데이터베이스는 해당 상대 위치들 1, 4, 6, 7 및 9에서 동일한 아미노 산들에 대하여 검색되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 4에 있어서,

상기 데이터베이스는 해당 상대 위치들 2, 3, 5, 및 8에서 동일한 아미노산들에 대하여 검색되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,

상기 펩티드 및 상기 데이터베이스로부터 일치된 임의의 펩티드들은 MHC 결합을 결정하기 위하여 가상(in silico) 또는 생체내 실험법들을 사용하여 MHC 결합에 대하여 분석되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 방법으로 단백질 서열로부터 펩티드들을 분석하여 T 세포 에피토프들의 유무에 대한 단백질 서열을 시험하는 것을 특징으로 하는 단백질 서열 시험 방법.
청구항 8의 방법으로 T 세포 에피토프들의 유무를 결정하여 하나 이상의 제약 단백질들의 면역원성 가능성(immunogenicity potential)을 시험하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 8의 방법으로 T 세포 에피토프들의 유무를 결정하여 하나 이상의 제 약 단백질들의 백신 가능성(vaccine potential)을 시험하는 것을 특징으로 하는 방법.
바람직한 특성들 및 감소된 면역원성 가능성을 갖는 개선된 단백질의 생성 방법에 있어서,

(a) 하나 이상의 기존 단백질들을 분석하여 새로운 단백질에 원하는 특성들을 제공하는데 필요한 아미노산들("바람직한 잔기들")을 제공하는 단계;

(b) 상기 기존 단백질 내의 위치들에 해당하는 위치들에서 상기 개선된 단백질에의 포함을 위하여 바람직한 잔기들을 포함하는 하나 이상의 펩티드들의 데이터베이스들로부터 선택하여 그러한 펩티드들이 T 세포 에피토프들이 아니거나 상기 개선된 단백질 내에 T 세포 에피토프들을 생성하지 않는 단계; 및

(c) 하나 이상의 상기 선택된 펩티드들의 포함에 의해 상기 개선된 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생성 방법.
바람직한 특성들 및 증가된 면역원성 가능성을 갖는 개선된 단백질의 생성 방법에 있어서,

(a) 하나 이상의 기존 단백질들을 분석하여 새로운 단백질에 원하는 특성들을 제공하는데 필요한 아미노산들("바람직한 잔기들")을 제공하는 단계;

(b) 상기 기존 단백질 내의 위치들에 해당하는 위치들에서 상기 개선된 단백질에의 포함을 위하여 바람직한 잔기들을 포함하는 하나 이상의 펩티드들의 데이터 베이스들로부터 선택하여 그러한 펩티드들이 T 세포 에피토프들인 단계; 및

(c) 하나 이상의 상기 선택된 펩티드들의 포함에 의해 상기 개선된 단백질을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생성 방법.
시험 물질에 대한 헬퍼 T 세포 반응들의 데이터베이스의 생성 방법에 있어서,

(e) 유기체로부터 항원-제시 세포들(APCs) 및 T 세포들을 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 세포들로부터 조절 T 세포들을 고갈시키거나 억제하는 단계;

(c) 상기 시험 물질과 함께 상기 조절 T 세포-고갈된 세포들을 배양하는 단계; 및

(d) 상기 시험 물질에 대한 T 세포 반응들을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생성 방법.
청구항 13에 있어서,

상기 조절 T 세포들은 CD25hi⁺ T 세포들의 고갈에 의하여 고갈되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 14에 있어서,

T 세포들은 CD8+ T 세포들이 고갈되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 반응들은 T 세포 증식의 측정 및/또는 시토카인 방출의 측정에 의하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 에피토프들은 헬퍼 T 세포 에피토프들인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 에피토프들은 세포독성 T 세포 에피토프들인 것을 특징으로 하는 방법.
T 세포 에피토프 활성에 대하여 생체외 실험법들로 분석된 하나 이상의 펩티드 서열들에 관한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터베이스.
청구항 19에 있어서,

청구항 13 내지 청구항 19 중 어느 한 항의 방법에 의하여 분석된 펩티드 서열들에 관한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터베이스.
T 세포 에피토프 활성에 대하여 생체내 실험법들로 분석된 하나 이상의 펩티드 서열들에 관한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터베이스.
MHC 4량체들을 사용하여 분석된 하나 이상의 펩티드 서열들에 관한 데이터를 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터베이스.
청구항 19 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 에피토프들은 헬퍼 T 세포 에피토프들인 것을 특징으로 하는 데이터베이스.
청구항 19 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 에피토프들은 세포독성 T 세포 에피토프들인 것을 특징으로 하는 데이터베이스.
시험 펩티드 서열이 T 세포 에피토프를 포함하는지 여부를 결정하는데 사용하기 위해 T 세포 활성에 대하여 사전에 분석된 펩티드 서열들을 특징으로 하는 데이터 구조.
청구항 25에 있어서,

청구항 13 내지 청구항 19 중 어느 한 항의 방법에 의하여 분석된 펩티드 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터 구조.
청구항 25 또는 청구항 26에 있어서,

T 세포 에피토프 활성에 대하여 생체외 방법들로 분석된 하나 이상의 펩티드 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터 구조.
청구항 25 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서,

세포 에피토프 활성에 대하여 생체내 방법들로 T 분석된 하나 이상의 펩티드 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터 구조.
청구항 25 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,

MHC 4량체들을 사용하여 분석된 하나 이상의 펩티드 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 데이터 구조.
청구항 25 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 에피토프들은 헬퍼 T 세포 에피토프들인 것을 특징으로 하는 데이터 구조.
청구항 25 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,

상기 T 세포 에피토프들은 세포독성 T 세포 에피토프들인 것을 특징으로 하는 데이터 구조.