KR20030082962A - 감소된 면역원성을 갖는 개질된과립구대식세포집락자극인자(ｇｍ-ｃｓｆ) - Google Patents
감소된 면역원성을 갖는 개질된과립구대식세포집락자극인자(ｇｍ-ｃｓｆ) Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 주로 인간에게, 특히 치료적 용도로 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드가 인간 대상에게서 면역반응을 유도하는 경향을 감소케하는 개질된 폴리펩티드이다. 본 발명은 특히 생체내에서 사용될 때, 임의의 개질되지 않은 대조물에 비해 실질적으로 비면역원성 또는 감소된 면역원성을 갖는 GM-CSF 단백질을 야기하게 하는 인간의 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF)의 개질에 관한 것이다.
Description
치료단백질의 효능이 치료단백질에대한 원치않는 면역반응에 의해 제한되는 많은 예들이 있다. 몇가지 생쥐 단일클론 항체가 많은 인간 질병 조절에서 치료 가능성을 보여주었으나, 몇몇 경우 상당한 정도의 인간의 항 생쥐 항체(HAMA) 반응의 유도로 인해 실패하고 있다[Schroff, R. W. 등(1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. 등(1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. 단일클론 항체에대해, HAMA 반응을 감소시키기 위한 시도로 많은 기술이 개발되어 왔다[WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. 일반적으로 이 재조합 DNA 방법은 최종 항체 구조에서 생쥐의 유전정보를 감소시키는 반면, 인간의 유전정보를 최종 구조에 증가시키고 있다. 그럼에도 불구하고, 결과물인 '인간화 된' 항체는 몇몇 경우에 여전히 환자들에게서 면역반응을 유도했다[Issac J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P.R. 등 (1999) Transplantation 68: 1417-1420].
항체가 면역 반응이 유도될 수 있는, 치료제로서 투여되는 폴리펩티드 분자의 유일한 종류는 아니다. 동일한 아미노산 서열을 갖고, 인체내에 존재하는 인간 유래의 단백질 조차도 인체내에서 면역반응을 유도할 수 있다. 주목할만한 예들은 그중 과립구대식세포집락자극인자[Wadhwa, M. 등(1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] 및 인터페론 알파 2[Russo, D. 등(1996) Bri. J. Haem. 94: 300 - 305; Stein, R. 등(1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1419]의 치료적 사용을 포함한다.
면역 반응의 유도의 중요한 인자는 소위 'T- 세포 에피토프'라 불리는 MHC 클래스 II 단백질 상에 제시를 통해 T-세포의 활성을 자극할 수 있는 펩티드 단백질 내에 존재한다. 상기 잠재적 T-세포 에피토프는 일반적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 능력을 갖는 임의의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. T- 세포 에피토프는 MHC 결합을 성립하는 것으로 판단될 수 있다. 함축적으로, 'T-세포 에피토프'는 MHC 분자에 결합할 때, T-세포 수용체(TCR)에 의해 인지될 수 있고, 적어도 특히 TCR에 관여하여 T-세포의 활성을 유도하여 T-세포 반응을 촉진하는 에피토프를 의미한다. 한편, 일반적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 것으로 알려진 특정 펩티드가 최종 단백질이 투여되는 유기체 내에서 '자가'로 인식되어 단백질 서열내에 유지될 수 있음이 이해되고 있다.
특정 T-세포 에피토프 펩티드가 세포내에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 분해 도중에 방출될 수 있고, 이어서 주조직적합복합체(MHC)의 분자에 제공되어 T-세포의 활성을 발동시킬 수 있음이 알려져 있다. 펩티드가 제시된 MHC 클래스 II 에의해 T- 세포의 상기 활성은 예를 들어 B-세포의 직접적인 자극에 의한 항체 반응을 유도하여 상기 항체를 생산하게 한다.
MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T-세포 선택 및 활성에 핵심적 역할을 하는 고도의 다형성 단백질 군이다. 인간 백혈구 항원 군 DR(HLA-DR)은 이 단백질 군의 중요한 동위체(isotype)이며, 본 발명의 주된 핵심이다. 한편, 동위체 HLA-DQ 및 HLA-DP는 유사한 기능을 수행하며, 따라서 본 발명은 이들에 동일하게 적용된다. MHC 클래스 II DR 분자는 세포막을 C-말단을 통해 삽입되는 알파 및 베타 사슬로 이루어진다. 각 헤테로-다이머는 비록 결합 그루브(groove)가 최대 11 아미노산을 수용할 수 있으나, 9 내지 20 아미노산 길이의 다양한 펩티드에 결합하는 리간드 결합 도메인을 지닌다. 이 리간드 결합 도메인은 알파 사슬의 1 내지 85 아미노산 및 베타 사슬의 1 내지 94 아미노산으로 이루어져 있다. DQ 분자들은 최근 상동 구조를 갖음이 밝혀 졌으며, DP 족 단백질들이 또한 매우 유사하리라고 예상된다. 인간에서, DR 동위체의 70 개의 다른 알로타입(allotype)이 알려져 있으며, DQ 에 대해서는 30 개의 다른 알로타입, DP 에 대해서는 47 개의 알로타입이 알려져 있다. 각 개인은 2 에서 4개 의 DR 대립유전자, 2 개의 DQ 및 2 개의 DP 대립유전자를 갖는다. 많은 DR 분자의 구조가 해독되었으며, 상기 구조는 펩티드의 소수성 잔기(포켓 잔기)와 작용하는, 많은 소수성 포켓을 갖는 열려진 말단 펩티드 결합 그루브를 교시하고 있다[Brown 등, Nature (1993) 364: 33; Stern 등(1994) Nature 368:215].
클래스 II 분자의 다른 알로타입을 식별하는 다형성은 펩티드 결합 그루브내 펩티드에 대한 다른 결합면들의 많은 다양성의 원인이 되며, 집단 수준에서 외부 단백질을 인식하고 병원성 유기체에 면역반응을 일으키기는 능력에 대해 최대의 유연성을 보장한다.
다른 지역의 인구 및 인종군 내에 분명한 '군'을 갖는 리간드 결합 도메인내에 상당한 정도의 다형성이 존재한다. 이러한 다형성은 펩티드 결합 도메인의 결합특성에 영향을 미치며, 따라서 DR 분자들의 다른 '군'은 비록 약간의 중복이 있을 수 있으나, 다른 서열 특성을 갖는 펩티드에 특이성을 갖게될 것이다. 이러한 특이성은 Th-세포 에피토프(클래스 II T-세포 반응)의 인식을 결정하는데, Th-세포 에피토프의 인식은 궁극적으로 동일한 단백질에 존재하는 β-세포 에피토프에 항원 반응의 작동을 초래한다. 따라서, 개체내 단백질에 대한 면역 반응은 주로 개채의 HLA-DR 알로타입의 펩티드 결합 특이성의 기능인 T- 세포 에피토프 인식에 의해 영향을 받는다. 그러므로, 포괄적인 집단에서 단백질 또는 펩티드 내에 T-세포 에피토프를 확인하기 위하여, 가능한한 전집단의 높은 퍼센트를 커버하는 가능한한 다양한 HLA-DR 알로타입 세트의 결합특성을 고려하는 것이 바람직하다.
본 발명의 목적이 되는 단백질 같은 치료용 단백질에 대한 면역 반응은 MHC 클래스 II 펩티드 제시 경로를 따라 진행된다. 여기서 외인성 단백질은 DR, DQ 또는 DP 형의 MHC 클래스 II 분자들과 관련된 제시를 위해 감싸지고, 가공된다. MHC 클래스 II 분자는 그중 대식세포 및 가지세포와 같은 전문 항원 제시 세포(APCs)에 의해 발현된다. CD4 분자와 같은 특정 다른 공 수용체의 교차 결합을 갖으며 T-세포 표면에 동족 T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 펩티드 복합체의 연대는 T-세포내의 활성화된 상태를 유도할 수 있다.
활성화는 시토킨의 분비를 유도하여 B-세포와 같은 다른 림프구를 추가 활성화하여 항체를 생산하거나 전 세포 면역 반응으로서 T 킬러 세포을 활성한다.
APC 의 표면에서 제시를 위해 주어진 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드의 능력은 많은 수의 인자, 가장 현저게는 주 서열 인자의 수에 달려있다. 이는 단백질 분해 절단 경향 및 MHC 클래스 II 분자의 펩티드 결합 틈중 결합 친화도 둘다에 영향을 미친다. APC 표면에서의 MHC 클래스 II/ 펩티드 복합체는 특히 펩티드 잔기 및 MHC 클래스 II 분자의 외부의 드러난 잔기에 의해 제공되는 결정인자를 인식할 수 있는 T-세포 수용체(TCR)에 결합면을 제공한다.
본 기술분야에 MHC 클래스 II 분자와 결합할 수 있는 합성 펩티드를 동정할 수 있는 방법들이 있다(예를 들어, WO98/52976 및 WO00/34317). 그러한 펩티드는 가공 경로 또는 다른 현상으로 인해 모든 상황에서, 특히 생체내에서 기능하지않을 수 있다. T-세포 에피토프 동정은 에피토프 제거의 첫번째 단계이다. 단백질에서 잠재적 T-세포 에피토프의 동정 및 제거는 종래에 개시되어 있다. 본 기술분야에 일반적으로 실험적으로 결정된 T-세포 에피토프중 인식된 서열 모티프를 스캔하는 계산 수단 또는 택일적으로 MHC 클래스 II 결합 펩티드 및 특히는 DR 결합 펩티드를 예측하는 계산 기술을 사용하여 T-세포 에피토프의 검출을 할 수 있는 방법이 제안되었다. WO98/52976 및 WO00/34317은 인간 MHC 클래스 II DR 알로타입의 서브 셋에 결합하는 잠재력을 지닌 폴리펩티드 서열을 동정함에 계산 트레딩(threading) 접근을 교시하고 있다. 이들 교시에서, 예측된 T-세포 에피토프는 비-인간 및 인간 유래의 치료용 항체 또는 비-항체 단백질 내에서 적절한 아미노산 치환을 이용하여 제거된다.
합성 펩티드와 조합에서 재조합 MHC 분자의 가용성 복합체를 이용하고, 인간 또는 실험 동물 대상에서 말초 혈액 샘플에서 T-세포 클론에 결합할 수 있는 다른 기술들이 본 기술분야에 공지되어 있으며[Kern, F. 등(1998) Nature Medicine 4: 975 - 978; Kwok, W.W. 등(2001) TRENDS in immunology 22: 583-588], 에피토프 동정 전략에 또한 이용되고 있다.
위에서 서술된 것 및 그 결과로 부터 알 수 있는 바와 같이, 주로 치료적으로 가치있으나 천연 면역원 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 주어진 T-세포 에피토프를 동정하고 제거 또는 적어도 감소시키는 것이 요망되고 있다.
이들 치료적으로 가치 있는 단백질중 하나가 인간 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF)이다. GM-CSF 는 골수 전구 물질로부터 과립백혈구 및 단핵구의생산을 자극하는 것으로 정의되는 산성 당단백질이다. 상기 단백질은 127 아미노산 잔기를 포함하며, 다른 포유류원 유래의 GM-CSF 단백질과 상당한 서열 유사성을 공유한다. 재조합 GM-CSF의 이용성은 또한 이 중요한 조혈 증식 인자(haemopoietic growth factor)가 또한 적혈구 및 거대핵세포 전구체의 형성을 자극하고, 추가로 성숙한 호중구, 단핵구, 호산구 및 비만세포를 자극하여 기능적으로 활성화할 수 있음을 보여주었다[Kaushanski, K. 등 (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 3101; Emerson, S.G. 등(1985) Eur. J. Biochem. 165:7; Weisbart, R.H. 등(1985) Nature 314: 361; Grabastein, K.H. 등(1985) Science 232: 506].
인간 GM-CSF 유전자의 일차 번역 산물은 144 아미노산 잔기의 단백질로서, 성숙(가공)후 127 개의 잔기를 갖는다. 비록 생쥐와 같은 다른 종의 GM-CSF가 인간 세포를 자극하지는 못해도, 다른 포유류 종의 GM-CSF 단백질과 높은 상동성을 갖으며, 이황(di-sulphide) 구조의 완전한 상보성을 갖는다.
다른 GM-CSF 분자들 및 그 유사체가 제시되어 있으나[US 5391485; US 5032676; US 5942253; US 6120807], 이들 교시의 어느 것도 T-세포 에피토프의 단백질의 면역원성 특성에의 중요성을 인식하고 있지 못하거나, 본 발명의 구성에 따른 특이적이고 조절된 방식으로 상기 특성들에 직접 영향을 주는 것을 착상하고 있지 못하였다.
인간 GM-CSF의 일차 127 아미노산 서열은 다음과 같다:
그러나, 개선된 특성을 갖는 GM-CSF 유사체에 대한 지속적인 요구가 있어왔다. 요구되는 개선은 발현 및 치료의 정제를 위한 다른 구성 및 양식들 뿐만아니라 특히 단백질의 생물학적 특성에서의 향상을 포함한다. 특히 인간에게 투여할 때 생채내 특성의 개선에 대한 요구가 있다. 이에 대하여, 인간에게서 면역반응을 유도하는 잠재력이 감소되거나 존재하지 않는 GM-CSF을 제공하는 것이 크게 요망되고 있다.
본 발명은 주로 인간에게, 특히 치료적 용도로 투여되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드가 인간 대상에게 면역반응을 유도하는 경향을 감소케하도록 개질된 폴리펩티드이다. 본 발명은 특히 생체내에서 사용될 때, 임의의 개질되지 않은 대조물에 비해 실질적으로 비면역원성 또는 감소된 면역원성을 갖는 GM-CSF 단백질 변형체를 야기하게하는 인간의 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF)의 개질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 비 개질된 단백질로부터 유래되며, 감소된 면역원성을 갖도록 개질된 GM-CSF 변형체를 야기할 수 있는, T-세포 에피토프 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 잠재적 T-세포 에피토프의 감소 또는 제거된 수로 인해 면역특성이 개질된 과립구대식세포집락자극인자의 개질된 형태를 제공한다.
본 발명은 MHC 클래스 II 결합의 잠재력에 의한 잠재적 T-세포 에피토프인, GM-CSF 일차 서열내에서 확인되는 서열들을 개시한다. 이 개시는 특히 127 아미노산 잔기인 인간 GM-CSF 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따라 생물 활성에 크게 영향을 미침 없이 분자의 일차 서열내에서 특정 아미노산의 치환, 추가 또는 결실로 변형할 수 있는 특이적 위치를 개시한다. 면역원성의 상실이 생물 활성의 동시 상실로 인해서만 성취될 수 있는 경우에, 단백질의 아미노산서열내에 추가 변형으로 상기 활성을 회복시키는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 상기 개질된 분자를 생산하는 방법, 및 면역원성 위치를 감소 또는 제거시키기 위해, 변형을 요구하는 T-세포 에피토프를 동정하는 모든 방법을 개시한다.
본 발명에 따른 단백질은 인간 대상 내에서 순환 시간의 증가를 나타낼 것으로 예상되며, GM-CSF에 대한 많은 징후의 경우와 같이, 만성 또는 재발 질병 조절에 특히 유익할 것이다. 본 발명은 생체내에서 개선된 특성의 발현이 기대되는 GM-CSF 단백질의 개질된 형태를 제공한다. 개질된 GM-CSF 분자는 약학적 조성물에서 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명은 하기의 사항에 관한 것이다:
ㆍ인간 GM-CSF의 생물 활성을 갖고, 생체내에서 사용될 때 동일한 생물 활성을 갖는 임의의 다른 비 개질 분자들에 비해 실질적으로 비-면역원성이거나 면역원성이 감소된 개질된 분자;
ㆍ그에 따라, 상기 면역원성의 상실이 본래의 비 개질된 분자 유래의 하나 이상의 T-세포 에피토프의 제거로 달성되는 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 상기 면역원성의 상실이 상기 분자 유래의 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수의 감소에 의해 달성되는 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 하나의 T-세포 에피토프가 제거된 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 상기 본래 존재하는 T-세포 에피토프가 클래스 II 상에 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 결합하는 능력을 보여주는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 상기 펩티드 서열이 표 1에 기재된 군에서 선택되는 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 중 1 내지 9 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 아미노산 잔기가 변형된 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 아미노산 잔기의 변형이 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환, 추가 또는 결실인 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 의 기재에 따라 수행된 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 상기 분자에서 유래된 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수의 감소를 위해 표 3 의 기재에 따라 (추가적으로) 수행된 특이적 분자;
ㆍ그에 따라, 필요하다면, 대개 특이 아미노산의 치환, 추가 또는 결실에 의해 추가적인 변형이 부가적으로 상기 분자의 생물 활성을 회복시키기 위해 수행되는 특이적 분자;
ㆍ상기 및 하기에서 정의된 임의의 상기 특이적 개질된 분자를 암호화하는 DNA 서열 또는 분자;
ㆍ상기 및/또는 청구범위에서 정의되는 GM-CSF의 생물활성을 갖는 개질된 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물;
ㆍ하기 단계들을 포함하는 상기 인용된 청구범위들중 어느 한 항에서 정의된GM-CSF의 생물 활성을 갖는 개질된 분자의 제조 방법:
(i) 폴리펩티드 또는 그 일부의 아미노산 서열의 측정;
(ii) 시험관(in vitro) 또는 인 실리코(in silico) 기술 또는 생물 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에의 결합의 분석을 포함하는 임의의 방법에 의해, 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적 T-세포 에피토프를 동정;
(iii) 시험관 또는 인 실리코(in silico) 기술 또는 생물 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에의 결합에 의해 측정되는 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위해 동정된 잠재적 T-세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산으로 개질된 신규한 서열 변이체를 고안;
(iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구성 및 목적 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위한 변이체의 시험; 및
(V) 선택적으로 단계 (ii) 내지 (iv)를 반복.
ㆍ그에 따라, 단계 (iii)이 본래 존재하는 임의의 T-세포 에피토프 중 1 내지 9 아미노산 잔기의 치환, 추가 또는 결실로 수행되는 방법;
ㆍ그에 따라, 변형이 상동 단백질 및/또는 인 실리코 모델링 기술을 참고하여 이루어진 특이적 방법;
ㆍ그에 따라, 상기의 단계(ii)가 하기 단계들에 의해 수행되는 특이적 방법:
(a) 알려진 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 지역을 선택;
(b) 선택된 지역으로 부터 3 이상의 아미노산 잔기에의해 구성되며, 미리 정해진 균일한 크기의 아미노산 잔기 단편과 중복되게 하는 연속적인 샘플링;
(c) 각 샘플된 아미노산 잔기 단편 중에 존재하는 각 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 할당된 점수를 합함으로써, 각 샘플된 단편의 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 계산; 및
(d) 그 단편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수에 기초하여, 펩티드의 치료적 유용성의 실질적인 감소 없이 펩티드의 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 변경하기 위해, 개질에 적합한 하나 이상의 단편을 동정;
단계 (c)는 바람직하게는 12 - 6 반데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목(term) 및 리간드 형태 에너지 항목을 포함하도록 개선된 봄 점수 계산 함수(Bohm scoring fucntion)을 사용하여 하기에 의해 수행함;
(1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫번째 데이타 베이스를 제공함;
(2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델 용 허락된 펩티드 골격(back bone)의 두번째 데이터 베이스를 제공함;
(3) 첫번째 데이터 베이스에서 한 모델을 선택함;
(4) 두번째 데이터 베이스에서 한 허락된 펩티드 골격을 선택함;
(5) 각 샘플된 단편중 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정함;
(6) 각 샘플된 단편중 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도 값을 측정함;
및 각 상기 모델 및 각 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5)를 반복함;
ㆍ잠재적 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖으며, 면역원적으로 비-개질된 GM-CSF로부터 제조되고, 표 1 에 개시된 군에서 선택되는 13 mer T-세포 에피토프 펩티드, 및 생체 내에서 사용될 때, 동일한 생물 활성을 갖는 임의의 비-개질 분자보다 실질적으로 전무 또는 적은 면역원성을 갖는 GM-CSF 제조를 위한 용도;
ㆍ상술한 바와 같은 13 mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 이상의 연속적인 아미노산 잔기들로 구성되는 펩티드 서열 및 생체 내에서 사용될때, 동일한 생물 활성을 갖는 임의의 비-개질 분자보다 실질적으로 전무 또는 적은 면역원성을 갖는 GM-CSF 제조를 위한 용도;
ㆍ상기 및 하기에서 기재된 임의의 방법에 의해 수득가능한 인간 GM-CSF의 생물 활성을 갖는 면역원적으로 개질된 분자.
용어 "T-세포 에피토프"는 본 발명의 이해에 따라, MHC 클래스 II와 결합할 수 있고, T-세포를 자극할 수 있고/거나 또한 MHC 클래스 II와의 복합체에서 (반드시 중요 활성화함 없이) T-세포와 결합할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 여기 상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 용어 "펩티드"는 2 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 아미노산은 펩티드 결합으로 같이 연결된다(이하에서 이렇게 정의함). 펩티드의 생물학적 생산에 관련된 천연적으로 존재하는 20 개의 다른 아미노산이 있으며, 그들중 임의의 숫자가 임의의 순서에 따라 연결되어 펩티드 사슬 또는 고리를 형성한다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연적으로 존재하는 아미노산은 모두 L-배열을 갖는다. 합성 펩티드는 L-아미노산, D-아미노산 또는 두개의 다른 배열의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 전통적인 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 펩티드는 단지 몇몇의 아미노산 단위를 포함한다. 10 이하의 아미노산 단위를 갖는 것과 같은 짧은 펩티드는 종종 "올리고펩티드"로 일컬어진다. 다른 펩티드는 많은 수의 아미노산 잔기,예를 들어 100 이상 까지를 포함하고, 종종 "폴리펩티드"로 일컬어진다. 편의에 따라, "폴리펩티드"는 3 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드로서 생각될 수 있고, 반면, "올리고펩티드"는 대개 "짧은" 펩티드의 특수 형으로 생각된다. 따라서 여기에서 사용될때, "폴리펩티드"에 대한 임의의 언급은 또한 올리고 펩티드를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, "펩티드"에 대한 임의의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질을 포함한다. 각 다른 아미노산의 배열은 다른 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 폴리펩티드의 수, 그리고 형성될 수 있는 다른 단백질의 수는 실질적으로 제한되지 않는다.
"알파 탄소(Cα)"은 펩티드 사슬내에 있는 탄소-수소(CH) 구성요소의 탄소원자이다. "측쇄"는 단순 또는 복합 군 또는 일부분을 포함할 수 있으며 펩티드의 크기에 비교할때 현저하게 다양할 수 있는 물리적 크기를 갖는 Cα에 매달린 기이다.
본 발명은 본 명세세서에 개시된 것과 실질적으로 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 임의의 GM-CSF 종의 분자에 적용될 수 있으며, 따라서 유전공학적 수단 또는 기타 가공에 의해 유래된 GM-CSF 분자를 포함하며, 약 127 아미노산 잔기를 함유할 수 있다.
다른 포유류원에서 동정된 것과 같이 GM-CSF 단백질은 본 발명의 개시의 펩티드 서열과 많은 공통 부분을 갖으며, 개시된 리스트와 실질적으로 동일한 서열을 갖는 펩티드 서열과 많은 공통부분을 갖는다. 그러한 단백질 서열은 그러므로 본 발명의 범위에 동일하게 속한다.
본 발명은 자가 조직에 도입된 가용성 단백질이 가용성 단백질에 결합하는 호스트 항체의 발현을 야기하는 면역반응을 개시할 수 있다는 실용성상의 사실을 극복하리라고 본다. 다른 예들중 한 예는 단백질이 내생적으로 생산되는 사실에도 불구하고 인간 환자의 일정 비율이 항체를 생산하는 인터페론 알파 2이다[Russo, D. 등 (1996) ibid; Stein, R. 등(1988) ibid]. 동일한 상황이 GM-CSF의 치료적 용도에 해당할 수 있으나, 본 발명은 인간 호스트에의 투여에 면역 반응을 도출하는 변형된 경향을 갖는 GM-CSF 단백질을 제공함으로써 이를 해결 하고자한다.
개질된 GM-CSF 에 이르는 본 발명의 일반적인 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a)폴리펩티드 또는 그 일부의 아미노산 서열의 측정;
(b) 시험관 또는 인 실리코(in silico) 기술 또는 생물 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에의 결합의 분석을 포함하는 임의의 방법에 의해, 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적 T-세포 에피토프를 동정;
(c) 시험관 또는 인 실리코(in silico) 기술 또는 생물 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에 결합에의해 측정되는 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위해 동정된 잠재적 T-세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산으로 개질된 신규한 서열 변이체를 고안, 이러한 서열 변이는 그러한 신규한 잠재적 T-세포 에피토프가 차례로 실질적으로 T-세포 에피토프의 활성을 감소하거나 제거하는 방식으로 개질되지 않는 한, 서열 변이에 의해 신규한 잠재적 T-세포 에피토프의 생성을 방해하는 방식으로 생성된다;
(d) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구성 및 잘 알려진 재조합 기술에 의해 목적 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위한 변이체의 시험.
단계 (b)에 따른 잠재적 T-세포의 식벽은 선행기술에서 개시된 방법들에 따라 수행될 수 있다. 적합한 방법들은 WO 98/59244; WO 98/52976; WO 00/34317 에 개시되어 있으며, 바람직하게는 MHC 클래스 II 분자에 GM-CSF 유도 펩티드의 결합 경향을 확인하는데 사용될 수 있다.
계산에 의한 T-세포 에피토프를 동정하기 위한 또다른 매우 효과적인 방법은 본 발명에 따른 바람직한 구현예인 실시예에 개시되어 있다.
실제로 많은 수의 변이 GM-CSF 단백질이 제조되고, 목적 면역 및 기능 특성을 위해 시험될 것이다. 변이 단백질은 비록 GM-CSF 단편의 화학 합성을 포함하는 기타 방법들이 고려될 수 있으나, 가장 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 것이다.
상기 구성의 단계 (b)에 따른, 인간 GM-CSF 단백질 서열 127 아미노산 잔기에 관한 분석의 결과는 표 1 에 나타나있다.
펩티드는 13 mer이고, 아미노산은 단일 문자 코드를 사용하여 확인되었다.
상기 방법의 단계 (c) 및 (d)에 따른, 본 발명의 개질된 분자에 관한 고안 및 구성의 결과는 표 2 및 표 3 에 나타나있다.
본 발명은 단백질로 부터 하나 이상의 잠재적 T-세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거를 야기하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이이루어진 GM-CSF 유사체에 관한 것이다. 표 1 에서 확인되는 임의의 잠재적 MHC 클래스 II 리간드내의 특정 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 인간 호스트에 치료적으로 사용될 때 잠재적 면역원성을 갖는 GM-CSF 분자를 야기할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 치환은 T-세포 에피토프의 활성의 실질적인 감소 또는 제거의 달성을 예상케 하는, 펩티드 서열 중 적절한 위치에서 이루어진다. 실제로는 적절한 위치는 MHC 클래스 II 결합 그루브내에 제공 되는 포켓의 하나내에 결합하는 아미노산 잔기에 바람직하게 대응한다.
펩티드의 소위 P1 또는 P2 고정 위치(anchor position)의 갈라진 틈(cleft)의 첫번째 포켓내에서 결합을 변경하는 것이 가장 바람직하다. 펩티드의 P1 고정 잔기와 MHC 클래스 II 결합 그루브의 첫번째 포켓 사이의 결합 상호작용의 질은 전체 펩티드에 대한 전체 결합 친화도의 주요 결정자가 되는 것으로 생각된다. 펩티드의 이 위치의 적절한 치환(예를 들어 보다 친수성 잔기에의 치환)은 잔기에 대하여 포켓 내에서 덜 용이하게 수용되게 할 것 이다. MHC 결합 틈내에 다른 포켓 지역내 결합에 동등한 위치내 펩티드 중 아미노산 잔기가 또한 고려되며, 본 발명의 범위에 속한다.
주어진 잠재적 T-세포 에피토프내 단일 아미노산 치환이 에피토프가 제거될 수 있는 가장 바람직한 루트라고 이해된다. 단일 에피토프내에 치환의 조합이 예상될 수 있으며, 예를 들어 각 정의된 에피토프가 서로 서로 중복되는 것이 특히 적합하다. 게다가, 주어진 에피토프 내 단독 또는 단일 에피토프내 조합 아미노산 치환은 MHC 클래스 II 결합 그루브에 대해 "포켓 잔기"에 동등한 위치가 아니라, 펩티드 서열 내 임의의 위치에서 이루어질 수 있다. 본 발명에 의하면, 치환은 상동 구조 또는 본 발명이 속하는 산업분야에서 알려진 인 실리코 기술을 이용하여 착안된 구조적 방법을 참고로 하여 이루어질 수 있고, 분자의 알려진 구조적 특성에 기초할 수 있다. 상기와 같은 모든 치환은 본 발명의 범위에 속한다.
상기에서 동정된 펩티드 내 이외의 아미노산 치환은 특히 리스트된 펩티드내 이루어진 치환(들)과 조합될 때 예상될 수 있다. 예를 들어, 변이가 변이 분자의 구조 또는 생물 활성을 회복하기 위해 예상될 수 있다. 이러한 보상적 변이 및 목적 활성을 갖는 변이체를 야기하는, GM-CSF 폴리펩티드로부터 특정 아미노산의 결실 또는 추가를 포함하는 변이 및 임의의 개시된 펩티드의 변이의 조합은 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명이 개질된 GM-CSF에 관한 한, 상기 개질된 GM-CSF 단백질 또는 개질된 GM-CSF 단백질의 단편을 포함하는 조성물 및 관련 조성물은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 생각된다. 다른 면으로, 본 발명은 개질된 GM-CSF 본체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 또 다른 면으로, 본 발명은 개질된 GM-CSF 단백질을 사용하는 인간 치료 방법에 관한 것이다.
단백질 또는 폴리펩티드의 전체 구조를 결정하는데 중요한 역할을 하는 많은 인자들이 있다. 먼저, 펩티드 결합(즉 사슬내에서 아미노산을 함께 포함하는 결합)은 공유결합이다. 이 결합은 구조상 평면, 본질적으로 치환된 아미드이다."아미드"는 -CONH- 기를 함유하는 임의의 유기 화합물 기이다.
인접한 아미노산의 Cα을 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기와 같이 나타내어 질 수 있다:
O=C 및 C-N 원자들은 상대적으로 단단한 평면에 있기 때문에, 이 축에 대해 자유 회전은 일어나지 않는다. 따라서, 점선으로 표시된 구조적 평면은 펩티드 골격의 산소(O), 탄소(C), 질소(N) 및 수소(H) 원자가 있으며, 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면"으로 불린다. 아미드 평면의 대각 코너들에 Cα원자들이 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 실질적인 어떠한 회전도 없기 때문에, 펩티드 사슬은 Cα를 연결하는 일련의 평면 펩티드 연쇄를 포함한다.
정의되는 전체 구조 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 형태에서 중요한 역할을 하는 두번째 인자는 공통의 Cα연쇄에 대한 각 아미드 평면의 회전각이다. 용어 "회전각" 및 "비틀림 각"은 이하에서 동일한 용어로 간주한다. O, C, N 및 H 원자가 아미드 평면에 있음을 가정하면(일부의 형태에서 이들 원자의 평면성에 다소 경미한 변이가 있을 수 있다고 하더라도, 대개 유용한 가정), 이들 회전 각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 형태, 즉, 인접한 잔기들 사이에 존재하는 구조를 특징 짓는다. 이들 두 각은 φ및 ψ으로 알려져 있다. 각 φi및 ψi의 세트는, 여기서 첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄, 따라서 폴리펩티드 이차 구조를 효율적으로 특징 짓는다. φ및 ψ각을 정의 하는데 사용되는 협약, 즉 주어진 폴리펩티드에 대해 아미드 평면이 영도각을 이루는 기준점, 및 각이 φ인 정의 및 각이 ψ인 정의가 문헌에 정의되었다. 그 해당 페이지가 본 발명에 참고로 혼입되는 문헌, 예를 들어 Ramachandran 등, Adv. Prot. Chem. 23: 283-437(1968), 285 ~ 94 면을 참조한다.
본 발명의 방법은 임의의 단백질에 사용될 수 있으며, 인체내에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치가 특정 아미노산 측쇄에 대해잘 고안된 특이성을 갖음에 대한 발견에 일부 기초하고 있다. 이 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 위치에서 아미노산의 정체성에 의해 결정된다. 이 위치는 포켓 1의 바닥에 위치하며 이 포켓에 수용될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다[Marshall, K. W., J. Immunol. 152; 4946 ~ 4956(1994)]. 잔기가 글리신이면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산(소수성 지방족: 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌 및 방향족: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판)이 포켓에 수용될 수 있으며, 방향족 측쇄가 바람직하다. 포켓 잔기가 발린이면, 아미노산의 측쇄는 포켓 속으로 튀어나오므로, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한하여, 단지 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있다. 그러므로, 아미노산 잔기 서열내에 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄가 발견되는 곳이면 MHC 클래스 II 제한 T-세포 에피토프가 제시될 수 있는 잠재성이 있다. 측쇄가 소수성 지방족이면, 그러나 방향족 측쇄 보다 약 두배로 T-세포 에피토프와 결합된다(전체 집단을 통해 포켓 1 형의 대략적인 균일한 분포를 가정).
하기와 같은 본 발명을 구현하는 계산 방법은 T-세포 에피토프를 함유할 펩티드 지역의 가능성을 보여준다:
(1) 미리 결정된 길이의 펩티드 단편의 일차 서열을 스캔하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 동정한다.
(2) 소수성 지방족 측쇄에 지방족 측쇄보다 높은 값을 할당한다; 바람직하게는 방향족 측쇄에 할당된 값의 약 두배, 즉 소수성 측쇄에는 값 2 그리고 방향족 측쇄에는 값 1.
(3) 펩티드 내에 미리 결정된 균일한 길이의 각각 겹쳐지는 아미노산 잔기 단편(window)에 대해 제시하기 위해 결정된 값들을 합하고, 특정 단편(window)의 전체값을 단편(window)의 중간 위치의 단일 아미노산 잔기, 바람직하게는 샘플된 단편(window)의 약 중간점의 잔기에 할당한다. 본 과정을 중복되도록 샘플된 아미노산 잔기 단편(window)들에 각각 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에 특정 단편(window)에 존재하는 T-세포 에피토프의 가능성에 관한 값이 할당된다.
(4) 단계 (3)에서 개시된 것처럼, 계산되고 할당된 값들을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 좌표에 대해 도면을 작성할 수 있다.
(5) 미리 결정된 값, 예를 들어 값 1의 점수를 갖는 서열의 모든 부분이 T-세포 에피토프를 함유하는 것으로 생각되며, 목적에 따라 개질될 수 있다.
본 발명의 특정 면은 T-세포 에피토프를 함유할 것 같은 펩티드의 지역을 표시할 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 이러한 지역에서의 펩티드에의 개질은 MHC 클래스 II 결합 특성을 변형할 잠재력을 가진다.
본 발명의 또 다른 면에 따라, T-세포 에피토프는 MHC 클래스 II 대립유전자 모델과 펩티드의 상호작용을 고려하는 보다 정교한 계산방법의 사용으로 인해 보다 높은 정확도로 예측될 수 있다.
본 특정 면에 따른 펩티드 내에 존재하는 T-세포 에피토프의 계산적 예측은 모든 알려진 MHC 클래스 II 분자의 구조 및 T-세포 에피토프의 계산적 동정중 이 모델의 사용 방법에 기초한 적어도 42 MHC 클래스 II 대립유전자 모델들의 구축, 관련 펩티드 골격 알파 탄소(Cα)위치에 공지된 다양성을 허락하게 하는 각 모델에 펩티드 골격의 라이브러리 구축, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자사이의 상호작용을 위한 중요한 위치에서 20 개의 각 아미노산 택일에 대한 각 모델을 갖는 각 골격 독(dock)에 대한 아미노산 측쇄 형태의 라이브러리 구축, 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 연결된 특정 펩티드에 대한 최적의 골격 및 측쇄 형태를 선택하기 위해, 점수 계산 함수와 함께 골격 및 측쇄 형태에 대한 이들 라이브러리의 사용, 및 이들 상호작용으로부터 결합 점수의 전개를 예측할 수 있다.
MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven Protein Data Bank("PDB")내에 발견된 많은 유사 구조로부터 상동 모델링을 통해 유래될 수 있다. 이는 에너지 최소를 위해 CHARMm 포스 필드와 함께 촉진된 어닐링 기능을 포함하는 반 자동 상동 모델링 소트프웨어(Modeller, SaliA. 및 Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815)를 사용하여 이루어질 수 있다. 택일적 모델링 방법이 또한 사용될수 있다.
본 방법은 MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브에서 각 위치에 각 택일적인 아미노산의 실험적으로 유래된 결합 데이터의 라이브러리를 이용하는 다른 계산 방법(Marshall, K. W. 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162)(1995) 또는 그루브 내에 결합 포켓의 특정 타입의 결합특성을 정의하기 위해 유사한 실험적 결합 데이터를 사용, 그리고 다시 MHC 클래스 II 분자의 상대적으로 작은 서브세트를 사용하고, 그 후 이들 포켓 라이브러리에서 인공적으로 보다 '실제적'인 MHC 클래스 II 분자를 창조하는 '혼합 및 매칭'의 다른 계산 방법[Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561(1999)]과 현저히 다르다. 두 선행 방법은 분석의 복잡성 및 많은 수의 펩티드 변이를 합성해야할 필요 때문에, 단지 작은 수의 MHC 클래스 II 분자가 실험적으로 스캔될 수 있다는 큰 단점이 있다. 그러므로, 첫번째 선행 방법은 작은 수의 MHC 클래스 II 분자에 대해 예측할 수 있을 뿐이다. 두번째 선행 방법은 또한 다른 클래스 II 대립유전자에 관해서 한 분자내 유사한 아미노산으로 나열된 포켓이 동일한 결합 특성을 갖음을 가정하고, 단지 그 MHC 클래스 II 분자만이 '실제적'으로 포켓 라이브러리내에 함유되는 포켓을 함유하도록 창조될 수 있는 추가 단점을 갖는다. 본 발명에서 개시된 모델링 접근법을 사용하면, 임의의 수 및 타입의 MHC 클래스 II 분자의 구조가 예측될 수 있으며, 따라서 대립유전자가 전 집단을 대표하여 특이적으로 선택될 수 있다. 또한, 스캔된 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이터를 산출하는 것보다 추가 모델을 만듦으로서 증가될 수 있다.
골격 라이브러리의 사용은 특정 MHC 클래스 II 분자와 연결될 때, 스캔되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변이를 허락한다. 이는 특정 포켓에서 아미노산 결합을 스캐닝하기 위한 단순화된 펩티드 골격의 사용에 의존하는 선행 계산 방법과 또다른 차이이다. 이들 단순화된 골격은 '실제' 펩티드내에서 발견된 골격 형태를 나타내지 않는 것으로, 펩티드 결합의 예측에서 부정확성을 초래한다. 본 골격 라이브러리는 단백질 데이터 뱅크내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 모든 펩티드의 골격을 중복 시키고, 결합 그루브에 위치한 11 개의 아미노산 각각의 Cα 원자사이에서 유래된 제곱평균(RMS)에 유의하여 제조될 수 있다. 본 라이브러리는 작은 수의 적당히 이용가능한 생쥐 및 인간 구조(현재 13)으로부터 유래될 수 있으며, 균등한 보다 큰 다양성의 가능성의 허가를 위해, 각 C"-α위치의 RMS 값은 50 % 증가한다. 각 아미노산의 평균 Cα위치는 그후 측정되며, 반경이 그 위치에서 RMS 편차와 동일한 이 위치 주위에 그려진 영역은 50 % 증가한다. 이 영역은 모든 허가된 Cα위치를 나타낸다.
최소 RMS 편차를 갖는 Cα(상기한 바와 같이, 포켓 1 의 아미노산의 Cα이며, 결합 그루브 중 11 잔기의 위치 2와 동일한)로부터, 상기 구는 3 차원적으로 격자화되고, 격자내 각 꼭지점은 그 후 그 아미노산의 Cα에대한 가능한 위치로 사용된다. 다음 아미노산에의 펩티드 결합에 대응하는 다음 아미드 평면은 이들 Cα의 각각 위에 합체되며, Φ및 Ψ각은 세트 간격에서 단계적으로 회전하여, 다음 Cα를 위치시킨다. 다음 Cα가 이 Cα에 대한 '구의 허가된 위치'내에 포함된다면, 디펩티드의 방위는 허가될 것이나, 반면에 구 밖을 벗어난다면, 디펩티드는거절될 것이다. 이 공정은 다음 Cα위치 각각에 반복되어, 펩티드는 포켓 1 Cα'씨앗'으로부터 모든 9 개의 다음 Cα이 선행하는 모든 가능한 순열로부터 위치될때까지 자란다. 이 공정은 그 후 결합 그루브 내에 위치한 골격 Cα 위치의 라이브러리를 생성 하기 위해 단일 Cα선행 포켓에 대해 한번 이상 반복된다.
생성된 골격의 수는 여러 인자에 의존한다: '구의 허가된 위치'의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구'의 격자의 미세도; 다음 Cα를 위치시키기 위해 사용된 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 미세도. 본 공정을 사용하여, 골격의 거대한 라이브러리가 생성될 수 있다. 보다 거대한 골격 라이브러리는 최적의 적합이 MHC 클래스 II분자의 결합 그루브내에 특정 펩티드에서 발견될 것이다. 결합 도메인의 아미노산의 불일치 때문에, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자와 연결에 적합한 것은 아니므로, 각 대립유전자에 대해 그 대립유전자에 의해 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트가 생성된다. MHC 클래스 II 분자와 함께 골격 라이브러리의 사용은 각 허가된 골격과 연결된 각 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각 아미노산의 허가된 측쇄의 입체 형태들로 이루어진 철저한 데이터베이스를 생성한다. 이 데이터 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 연결되고, 아미노산 측쇄가 목적 위치에서 골격에 결합되는 간단한 입체 중복 함수를 사용하여 생성된다. 측쇄의 화전가능한 결합 각각은 세트 간격으로 단계적으로 회전되고, 원자의 결과 위치는 언급한 결합에 의존한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄의 원자들의 상호작용을 주목하고, 위치들은 하기의 척도에 따라 허가되거나 거절된다: 이제까지 위치된 모든 원자의 중복의전체 합이 미리 결정된 값을 초과하지 않아야 한다. 따라서 입체 형태 조사의 엄격함은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 전체 중복에 대한 미리 결정된 한계의 함수이다. 후자 값은 특정 포켓이 정확함이 알려진 경우 작아질수 있으나, 엄격함은 포켓 측쇄의 위치가 상대적으로 유연한 것으로 알려진 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓내에 유연하게 변이를 모방하는 것이 허가될 수 있다. 이 입체 형태 서치는 그후 측쇄 입체 형태의 철저한 데이터베이스의 생성을 위해 각 MHC 클래스 II 분자와 연결될 때, 각 골격의 모든 위치에서 모든 아미노산에 대해 반복된다.
상술된 골격/측쇄 입체 형태의 거대한 데이터 베이스를 스캔함으로써 유래된 경험적으로 유래된 적당한 수학식이 펩티드 리간드 입체 형태와 함께 MHC 클래스 II 분자들의 모델들 사이의 결합 에너지를 측정하는데 사용된다. 따라서, 9 내지 20 아미노산(비록 그 길이는 각 스캔에 대해 일정하게 유지되지만)의 다양한 길이의 펩티드를 하기의 계산에 적용시킴으로서, 잠재적 T-세포 에피토프를 위해 단백질을 스캔한다: 하나의 MHC 클래스 II 분자를 그 분자에 허가된 펩티드 골격과 함께 선택하고, 목적 펩티드 서열에 상응하는 측쇄를 그위에 결합한다. 골격상 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 동정 및 원자간 거리 데이터가 그 아미노산의 허가된 각 배열(상술한 데이터베이스에서 얻어진)에 대해 수집된다. 이는 골격 및 점수 계산 함수를 이용하여 유래된 펩티드 점수에 따라 각 측쇄에 대해 반복된다. 그 골격에 대한 최적 점수는 유지되며 그 공정은 선택된 모델에 대해 각 허가된 골격에 대해 반복된다. 모든 허가된 골격의 점수를 비교하고, 최고 점수를 MHC 클래스 II 모델에서 목적 펩티드에 대한 펩티드 점수로 간주한다. 본 공정을 그후 스캔되는 단백질에서 유래된 모든 가능한 펩티드를 가지고 각 모델에 대해 반복하며, 모델에 대한 펩티드의 점수를 나타낸다.
본 발명의 명세서에서, 결합 친화도 계산을 위해 제시된 각 리간드는 상술된 봐 같이 펩티드 또는 단백질로부터 선택되는 아미노산 단편이다. 따라서, 리간드는 알려진 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유래되는 선택된 길이인 약 9 내지 20 아미노산 길이의 아미노산이다.
용어 "아미노산" 및 "잔기"들은 이하에서는 동일한 용어로 간주된다. 리간드(골격 라이브러리에서 골격상에 결합되고 시험되는 펩티드의 연속적인 아미노산 형태)를 펩티드 골격의 C"α원자의 좌표를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리에서 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈에 위치시키고, 각 측쇄의 허가된 배열은 허가된 배열의 데이터 베이스로부터 선택한다. 관련 원자 동정 및 원자간 거리를 또한 데이터 베이스로부터 구하고, 펩티드 결합 점수를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓의 높은 결합 친화도를 갖는 리간드를 특정 부위 유도 돌연변이에 대한 후보로 한다. 아미노산 치환을 상기 리간드(따라서 목적 단백질 중)에 하고, 리간드는 그 후 미리 결정된 시초 값 미만으로 결합 친화도를 감소시키는 변화를 결정하기 위해 점수 계산 함수를 사용하여 다시 시험된다. 이 변화는 목적 단백질 내부에 혼입되어 T-세포 에피토프를 제거한다.
펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브사이의 결합은 하기에 개시된 비-공유 결합 상호 작용을 포함을 포함하나 그에 제한되지 않는다: 수소결합, 정전기 상호작용, 소수성(친유성) 상호작용 및 반데르발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 개시되는 펩티드 점수 계산 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 하전된 기들 사이에서 형성될 수 있는 비-공유 결합으로서, 수소 원자가 두 다른 원자들에 의해 공유되어 이루어지는 것으로 이해된다. 수소 공여자의 수소는 양극을 갖고, 수소 수용자는 부분적으로 음극을 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용의 목적을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 결합된 질소 또는 산소 또는 질소에 결합된 수소가 될 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 결합되지 않은 산소, 결합된 수소가 없거나 하나 또는 두개의 결합을 갖는 질소, 또는 하나의 결합만을 갖는 황일 수 있다. 수소에 결합된 산소 또는 이민 질소(예를 들어 C=NH)와 같은 특정 원자는 수소 수용자 또는 공여자 둘다일 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/mol이며, 반데르발스 결합보다 강하며, 공유결합보다 약하다. 수소결합은 또한 매우 방향적이며, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 직선일 때 가장 강하다. 정전기 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에 형성되며, 상호작용의 세기는 쿨롱의 법칙에 따라 원자들간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍간의 최적의 거리는 약 2.8 Å이다. 단백질/펩티드 상호작용중, 정전기 결합이 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 및 아스파테이트 또는 글루타메이트사이에서 이루어질 수 있다. 결합의 세기는 수소결합과 결합의 세기에서 유사하나 이온기의 pKa 및 매질의 유도상수에 의존한다.
친유성 상호작용은 선호되는 단백질 및 펩티드 리간드사이에 일어나는 소수성-소수성 접촉이다. 대개, 이들은 용매에 노출되지 않도록 결합 그루브의 포켓 내부에 묻혀진 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄들 사이에서 발생한다.
주위 용매 분자가 서로 수소 결합되어 새장과 같이 격자 구조를 형성하기 때문에 용매에 소수성 잔기를 노출시키는 것은 매우 바람직하지 않다. 엔트로피의 결과적인 감소가 매우 바람직하지 않다. 친유성 원자는 극성도 아니고 수소 수용자도 아닌 황 및 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.
반데르 발스 결합은 3-4Å 거리의 원자간에서 발생하는 비특이적인 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 더 약하고 더 특이적이지 않다. 원자 주변의 전기 전하 분포는 시간에 따라 변하고, 어떤 경우에도, 전하 분포는 대칭적이지 않다. 이러한 전기 전하에서의 순간적인 비대칭성은 이웃하는 원자에서의 유사한 비대칭성을 유발한다. 원자간의 결과적인 인력은 반데르 발스 접촉 거리(Van der Waal's contact distance)에서 최고에 이르나 약 1Å 내지 약 2Å에서 매우 빨리 감소한다. 역으로, 원자가 접근 거리보다 좁게 됨에 따라, 원자의 외곽 전자구름이 중첩됨에 따라 강력한 척력이 더욱 증가하게 된다. 비록 인력이 상대적으로 정전기적 결합 및 수소결합과 비교하여 약하더라도(약 0.6Kcal/mol), 척력은 특히 펩티드 리간드가 성공적으로 단백질에 결합될 수 있는가 여부를 결정함에 있어서 매우 중요할 수 있다.
한 구현예에서, 봄 점수 계산 함수 (SCORE1 접근법) 가 결합 상수를 추측하기 위해 사용된다 [Bohm, H.J.,J.Comput Aided Mol.Des.,8(3): 243-256 (1994)]. 점수 계산 함수 (SCORE2 approach)는 T-세포 에피토프를 함유하는 리간드의 지표로서 결합 친화도를 측정하기 위해 사용된다 [Bohm, H.J.,J.Comput Aided Mol.Des.,12(4): 309-323 (1998); 본 발명의 명세서에 전체로 동봉됨]. 그러나, 상술된 참조문헌에 기술된 바와 같은 봄 점수 계산 함수는, 리간드가 성공적으로 단백질에 결합되고 단백질/리간드 복합체의 구조가 밝혀지고 밝혀진 구조가 단백질 데이타 은행 ("PDB": Protein Data Bank)에 있는 것이 이미 공지된 단백질에 대한 리간드의 결합 친화도를 측정하기 위해 사용된다. 그러므로, 점수 계산 함수는 공지된 포지티브 결합 데이타의 이점을 가지고 개발되었다. 포지티브와 네거티브 결합제간의 구별을 위해, 반발 항이 수학식에 삽입되어야만 한다. 또한, 더욱 만족스러운 결합 에너지의 측정값은 상기 봄 함수의 에너지 항에 기초한 면적을 사용하는 것 보다 오히려 페어와이즈(pairwise) 방식으로 친유성 상호작용을 계산함으로써 얻어진다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 결합 에너지는 개선된 Bohm 계산 방식을 사용하여 계산된다. 개선된 봄 점수 계산 함수단백질과 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔGbind)를 후술하는 매개변수를 고려하여 계산한다: 리간드의 전이 및 회전 엔트로피의 총 손실에 기인한 결합 에너지의 감소 (ΔG0); 하나이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소결합(ΔGhb)으로부터의 기여도 ; 교란되지 않은 이온성 상호작용으로부터의 기여도 (ΔGionic); 친유성 리간드 원자와 친유성 수용자 원자간(ΔGlipo)의 친유성 상호작용; 리간드의 내부 자유도의 동결에 기인한 결합 에너지의 손실, 즉 각 C-C 결합에서 회전의 자유도(ΔGrot) 감소; 단백질과 리간드 사이의 상호작용의 에너지 (EVdW). 이들 항을수학식 1에 적용한다:
(ΔGbind)=(ΔG0)+(ΔGhbxNhb)+(ΔGionicxNionic)+(ΔGlipoxNlipo)+(ΔGrotxNrot)+(EVdW)
여기서, N은 특정한 항에 대한 상호작용을 한정하는 수이고, 한 실시양태에서 ΔG0, ΔGhb, Gionic. Glipo및 ΔGrot)는 각각 5.4, -4.7, -4.7, -0.17 및 1.4 값으로 주어지는 상수이다.
항 Nhb는 수학식 2에 따라 계산된다:
Nhb=∑h-bondsf(ΔR, Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR, Δα)는 이상조건으로부터 수소결합의 큰 편차를 계산하는 패널티 함수이고 수학식 3에 따라 계산된다:
f(ΔR, Δα)=f1(ΔR)×f2(Δα)
여기서, ΔR <= TOL인 경우: f1(ΔR)= 1
또는ΔR <= 0.4 + TOL인 경우: = 1-(ΔR-TOL)/0.4
또는ΔR > 0.4 + TOL인 경우: = 0
및 Δα < 30°인 경우: f2(Δα) = 1
또는 Δα <= 80°인 경우: = 1-(Δα-30)/50
또는 Δα > 80°인 경우: = 0
TOL은 수소결합길이=0.25Å에서 허용 편차(tolerated deviation)이다.
ΔR은 이상값 (ideal value)=1.9Å으로부터 H-O/N 수소결합 길이의 편차이다.
Δα는 180°의 이상적인 값으로부터 수소결합 각도 ∠N/O-H..O/N의 편차이다.
f(Nneighb)는 단백질 표면의 요면과 철면 부분간을 분류하고, 그럼으로써 단백질 표면에서 발견되는 극성 상호작용보다 포켓(pockets)에서 발견되는 극성 상호작용에 대해 더큰 웨이트를 대입한다. 이 함수는 하기 수학식 4에 따라 계산한다:
f(Nneighb)=f(Nneighb/Nneighb,0)α
여기서 α=0.5
Nneighb는 임의의 주어진 단백질 원자에 대하여 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.
Nneighb,0는 상수 + 25 이다.
fpcs는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적에 대한 함수이고. 그러므로 강한 수소결합과 약한 수소결합을 구별하고, 그의 값은 하기 기준에 따라 계산된다.
Apolar/NHB< 10Å2일 경우 fpcs는 β이거나
Apolar/NHB> 10Å2일 경우 fpcs는 1이고,
Apolar는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이고,
NHB는 수소결합 수이고,
β는 상수 전체 값=1.2이다.
개선된 봄 점수 계산 함수의 실행을 위해서, 동일한 기하학적 의존성이 추정되기 때문에, 이온성 상호작용 ΔGionic으로부터의 분포는 상술한 수소결합으로부터의 분포와 동일한 양상으로 계산된다.
항목 Nlipo는 하기 수학식 5에 따라 계산한다:
Nlipo= ∑lLf(rlL)
하기 기준에 따라, 모든 친유성 리간드 원자, l 및 모든 친유성 단백질 원자, L, 에 대해 f(r1L)을 계산한다:
rlL<= R1 인 경우, f(rlL) = 1
R2 < rlL> R1일때, f(rlL) = (rlL- R1)/(R2-R1),
rlL>= R2인 경우 f(rlL) = 0
여기서, R1 = rl vdw+ rL vdw+ 0.5이고,
R2 = R1 + 3.0이고,
rl vdw는 원자 l의 반데르 발스 직경이고,
rL vdw는 원자 L의 반데르 발스 직경이다.
항목 Nrot는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이고, 비환식 sp3-sp3및sp3-sp2결합의 수이다. 말단 -CH3또는 -NH3의 회전은 고려하지 않는다.
최종 항목, EvdW는 하기 수학식 6에 따라 계산된다:
EvdW= ε1ε2((r1 vdw+ r2 vdw)12/r12- (r1 vdw+ r2 vdw)6/r6)
여기서, ε1및 ε2는 원자의 정체에 의존하는 상수이고
r1 vdw+ r2 vdw는 반데르 발스 원자 반경이고,
r은 원자쌍간의 거리이다.
수학식 6과 관련하여, 한 구현예에서, 상수 ε1및 ε2는 각각 원자값 C:0.245, N:0.283, O:0.316, S:0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황에 대해)으로 주어진다. 수학식 5 및 6과 관련하여, 반데르 발스 반경은 주어진 원자값 C:1.85, N:1.75, O:1.60, S:2.00Å이다.
상기 수학식에서 모든 미리 결정된 값과 상수를 여기서 채택된 계산 (computation)의 타입에 관해 단백질 리간드 상호작용의 최근의 이해내에서 결정되는 것으로 이해되어야 한다. 그러므로, 본 점수 계산 함수가 추가로 개량되어짐에 따라, 이러한 값이나 상수는 변할 수 있고, 그러므로 리간드에 대한 단백질의 결합 에너지를 평가하는 항목에서 바람직한 결과를 얻을 수 있는 임의의 적합한 수치가 변화될 수 있고, 따라서 이는 본원발명의 기술적 범위에 속한다. 상술한 바와 같이, 점수 계산 함수는 측쇄 입체 형태 (confirmation), 원자 정체성, 및 원자간 거리의 데이타베이스로부터 추출되는 데이타에 적용된다. 본 설명의 목적을 위해, 이 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4개의 밝혀진 구조이다. 본 설명으로부터, 본원발명의 계산 방법의 구축의 모듈적 성질은 새로운 모델이 측쇄 입체 형태 서치 함수 (side-chain confirmational search function) 및 펩티드 골격 라이브러리로 스캔될 수 있고 단순히 첨가되어 상술한 바와 같은 펩티드 점수 계산 함수에 의해 진행될 수 있는 추가의 데이타 세트를 생성할 수 있음을 의미하는 것이 명백하다. 이는 스캔된 MHC 클래스 II 분자의 레퍼토리를 쉽게 증가시키고, 구조 (structure) 및 만일 얻을 수 있어 대립 유전자 형질이 존재하는 더욱 정확한 모델을 만들 수 있다면, 관련된 데이타를 대체할 수 있도록 한다.
본원 예측방법은 다양한 MHC Class II 분자에 대한 친화도가 이전에 실험적으로 결정된 다수의 단백질을 포함하는 데이타 세트에 대응할 수 있다. 계산된 데이타와 실험적인 데이타를 비교함으로써, 값의 절편이 상기에서 결정되고, 모든 실험적으로 결정된 T-에피토프가 정확히 예측되는 것이 알려진다. 비록 상기 점수 계산 함수가 적용가능한 어떤 매우 정교한 방법론과 비교하여 상대적으로 단순할지라도, 극히 빨리 계산을 수행할 수 있음을 이해하여야 한다. 발명의 목적이 선별된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 (binding groove)에 연결된 각 단백질에 대한 진정한 결합 에너지 그 자체를 계산하는 것이 아니라는 것을 또한 이해하여야 한다. 근원적인 목적은 선별된 단백질의 일차 구조 (즉, 아미노산 서열)에 기초하여 T-세포 에피토프의 위치를 예측하는 것을 도우기 위한 것으로서 상대적인 결합에너지 데이타를 얻는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 선별된 한계 값을 초과하는 결합에너지는 리간드내 T-세포 에피토프의 존재를 암시할 것이다. 이후 리간드는 최소한 1번 이상의 아미노산 치환 및 결합 에너지를 다시 계산한다.
계산의 빠름으로 인해, 펩티드 서열의 이러한 교묘한 처리는 저렴하게 사용가능한 컴퓨터 하드웨어상에 프로그램 사용자의 인터페이스내에 쌍방향으로 수행될 수 있다. 컴퓨터 하드웨어에서 큰 투자는 필요하지 않는다. 당업자에게는 다른 사용가능한 소프트웨어가 동일한 목적을 위해 사용될 수 있음이 분명할 것이다. 특히, 단백질 결합 위치내로 결합 리간드 (docking ligand)일 수 있는 더욱 정밀한 소프트웨어는 에너지 최소화와 연결하여 사용될 수 있다. 도킹 소프트웨어의 예는 DOCK (Kunt 등,J. Mol.Biol., 161:269-288 (1982)), LUDI (Bohm, H.J.,J.Comput Aided Mol.Des., 8:623-632(1994)) 및 FLEXX (Rarey M. 등,ISMB,3:300-308(1995))이다. 분자의 모델링 및 조작 소프트웨어의 예는 AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.)를 포함한다. 이러한 계산 방법의 사용은 필요한 계산을 위한 프로세싱 시간의 길이로 인해 본원발명의 방법을 통해 매우 제한될 것이다. 그러나, 이러한 방법은 '2차 스크린'으로서 사용되어 본원발명의 방법을 통해 '포지티브 결합제'로 밝혀진 펩티드에 대한 결합 에너지의 더욱 정확한 계산값을 얻을 수 있을 것이다. 정밀한 분자기계적 또는 분자 다이너믹 계산을 위한 프로세싱 시간의 한계는 이러한 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안이나 최근의 컴퓨터 하드웨어 기술의 한계에 의해 정의될 수 있는 것이다. 미래에는 보다 효율적인 코드 기록과 컴퓨터 프로세서의 속도에서의 계속적인 증가로 더욱 효율적인 시간-프래임으로 이와 같은 계산이 가능할 것으로 예상된다. 폴딩된 단백질 구조내에 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 마크로분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가의 정보는 참조문헌 [Brooks,B.R., 등,J. Comput. Chem.,4:187-217(1983)]에서 찾을 수 있고 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가의 정보는 참조문헌[Dauber-Osguthorpe 등,Proteins 4(1):31-47(1998)]에서 찾을 수 있다. 유용한 기본 정보는 예를 들어 참조문헌[Fasman, G.D., Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Confirmation, Plenum Press, New York, ISBN:0-306 4313-9]에서 찾을 수 있다.
Claims (29)
- 생체내에서 사용될 때, 동일한 생물 활성을 갖는 임의의 비 개질된 분자에 비해 실질적으로 비 면역원성이거나 또는 면역원성이 감소된, 인간의 과립구대식세포집락자극인자(GM-CSF)의 생물 활성을 갖는 개질된 분자.
- 제 1 항에 있어서, 면역원성의 상실이 본래의 비 개질된 분자 유래의 하나 이상의 T-세포 에피토프의 제거로 달성되는 분자.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역원성의 상실이 상기 분자 유래의 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수의 감소에 의해 달성되는 분자.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 하나의 T-세포 에피토프가 제거된 분자.
- 제 2 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 본래 존재하는 T-세포 에피토프가 클래스 II 상에 제시를 통해 T-세포를 자극하거나 결합하는 능력을 보여주는 MHC 클래스 II 리간드 또는 펩티드 서열인 분자.
- 제 5 항에 있어서, 펩티드 서열이 표 1 에 개시된 군에서 선택되는 분자.
- 제 2 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 중 1 내지 9 아미노산이 변형된 분자.
- 제 7 항에 있어서, 하나의 아미노산 잔기가 변형된 분자.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변형이 특정 위치(들)에서 다른 아미노산 잔기(들)에 의한 본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 치환인 분자.
- 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 표 2 의 기재에 따라 수행된 분자.
- 제 10 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기 치환이 상기 분자 유래의 펩티드와 결합할 수 있는 MHC 알로타입의 수의 감소를 위해 표 3 의 기재에 따라 추가적으로 수행되는 분자.
- 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환이 표 3 에 기재에 따라 수행된 분자.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변형이 특정 위치(들)에서본래 존재하는 아미노산(들) 잔기(들)의 결실인 분자.
- 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 아미노산 잔기의 변형이 본래 존재하는 아미노산 잔기에 특정 위치(들)에서 아미노산(들)의 추가인 분자.
- 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 또 다른 변형이 상기 분자의 생물활성을 회복시키기 위해 수행되는 분자.
- 제 15 항에 있어서, 추가적인 또 다른 변형이 특정 아미노산(들)의 치환, 추가 또는 결실인 분자.
- 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형이 상동 단백질 서열을 참고하여 이루어진 개질된 분자.
- 제 7 항 내지 제 16 항 중 어느 한항에 있어서, 아미노산 변형이 인 실리코(in silico) 모델링 기술을 참고하여 이루어진 개질된 분자.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한항의 개질된 GM-CSF을 암호화하는 DNA 서열.
- 제 1 항 내지 제 19 항중 어느 한항의 GM-CSF의 생물 활성을 갖는 개질된 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제를 선택적으로 포함하는 약학적 조성물.
- 하기 단계들을 포함하는 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 GM-CSF 활성을 갖는 개질된 분자의 제조 방법:(i) 폴리펩티드 또는 그 일부의 아미노산 서열의 측정;(ii) 시험관(in vitro) 또는 인 실리코(in silico) 기술 또는 생물 분석을 사용하여, 펩티드의 MHC 분자에의 결합의 분석을 포함하는 임의의 방법에 의해, 단백질의 아미노산 서열내에서 하나 이상의 잠재적 T-세포 에피토프를 동정;(iii) 시험관 또는 인 실리코(in silico) 기술 또는 생물 분석 또는 펩티드-MHC 복합체의 T-세포에의 결합에 의해, 펩티드의 MHC 분자에 결합에 의해 측정되는 T-세포 에피토프의 활성을 실질적으로 감소시키거나 제거하기 위해 동정된 잠재적 T-세포 에피토프 내에 하나 이상의 아미노산으로 개질된 신규한 서열 변이체를 고안;(iv) 재조합 DNA 기술에 의한 상기 서열 변이체의 구성 및 목적 특성을 갖는 하나 이상의 변이체를 동정하기 위한 변이체의 시험; 및(V) 선택적으로 단계 (ii) 내지 (iv)를 반복.
- 제 21 항에 있어서, 단계 (iii)이 임의의 본래 존재하는 T-세포 에피토프 중1 내지 9 아미노산 잔기의 치환, 추가 또는 제거로 수행되는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 변형이 상동 단백질 서열 및/또는 인 실리코 모델링 기술을 참고하여 수행되는 방법.
- 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(ii)가 하기 단계들에 의해 수행되는 방법:(a) 알려진 아미노산 잔기 서열을 갖는 펩티드 지역을 선택;(b) 선택된 지역으로 부터 3 이상의 아미노산 잔기에의해 구성되며, 미리 정해진 균일한 크기의 아미노산 잔기 단편과 중복되는 연속적인 샘플링;(c) 각 샘플된 아미노산 잔기 단편 중에 존재하는 각 소수성 아미노산 잔기 측쇄에 할당된 점수를 합함으로써, 각 샘플된 단편의 MHC 클래스 II 분자 결합 점수를 계산; 및(d) 그 단편에 대해 계산된 MHC 클래스 II 분자 결합 점수에 기초하여, 펩티드의 치료적 유용성의 실질적인 감소 없이 펩티드의 전체 MHC 클래스 II 결합 점수를 변경하기 위해 개질에 적합한 하나 이상의 단편을 동정.
- 제 24 항에 있어서, 단계 (c)를 12 - 6 반데르 발스 리간드-단백질 에너지 반발 항목(term) 및 리간드 입체 형태 에너지 항목을 포함하도록 하기와 같이 개선된 봄 점수 함수를 사용하여 수행하는 방법:(1) MHC 클래스 II 분자 모델의 첫번째 데이타 베이스를 제공함;(2) 상기 MHC 클래스 II 분자 모델 용 허락된 펩티드 골격의 두번째 데이터 베이스를 제공함;(3) 첫번째 데이터 베이스에서 한 모델을 선택함;(4) 두번째 데이터 베이스에서 하나의 허락된 펩티드 골격을 선택함;(5) 각 샘플된 단편 중 존재하는 아미노산 잔기 측쇄를 동정함;(6) 각 샘플된 단편 중 존재하는 모든 측쇄에 대한 결합 친화도 값을 측정함; 및각 상기 모델 및 각 상기 골격에 대해 단계 (1) 내지 (5)를 반복함.
- 표 1 에 개시된 군에서 선택되는, 잠재적 MHC 클래스 II 결합 활성을 갖고, 비-개질 GM-CSF로부터 생성되는 13 mer T-세포 에피토프 펩티드.
- 제 26 항의 13 mer T-세포 에피토프 펩티드의 9 이상의 연속적인 아미노산 잔기들로 구성되는 펩티드 서열.
- 생체내에서 사용될때, 동일한 생물 활성을 갖는 임의의 비 개질 분자에 비해 실질적으로 면역원성이 없거나 감소된 GM-CSF 의 제조를 위한 제 26 항의 13 mer T-세포 에피토프 펩티드의 용도.
- 생체내에서 사용될때, 동일한 생물 활성을 갖는 임의의 비 개질 분자에 비해 실질적으로 면역원성이 없거나 감소된 GM-CSF 의 제조를 위한 제 27 항의 펩티드 서열의 용도.
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