RU2003129058A - Модифицированный колониестимулирующий гранулоцитарно-макрофагальный фактор (gm-csf) с уменьшенной иммуногенностью - Google Patents

Claims (29)

1. Модифицированная молекула, обладающая биологической активностью колониестимулирующего гранулоцитарно-макрофагального фактора (GM-CSF) человека и являющаяся существенно неиммуногенной или менее иммуногенной, чем любая немодифицированная молекула, которая имеет такую же биологическую активность при использовании in vivo.

2. Молекула по п.1, в которой указанная потеря иммуногенности достигается путем удаления одного или более эпитопов Т-клеток, имеющих происхождение от исходно немодифицированной молекулы.

3. Молекула по п.1 или 2, в которой указанная потеря иммуногенности достигается путем уменьшения числа аллотипов МНС, способных связывать пептиды, имеющие происхождение от указанной молекулы.

4. Молекула по п.2 или 3, в которой удален один эпитоп Т-клеток.

5. Молекула по любому из пп.2-4, в которой указанные изначально присутствующие эпитопы Т-клеток являются лигандами МНС класса II или пептидными последовательностями, которые демонстрируют способность стимулировать или связывать Т-клетки через презентацию на классе II.

6. Молекула по п.5, в которой указанные пептидные последовательности выбраны из группы, как представлено в таблице 1.

7. Молекула по любому из пп.2-6, в которой 1-9 аминокислотных остатков в любом из исходно присутствующих эпитопов Т-клеток изменены.

8. Молекула по п.7, в которой один аминокислотный остаток изменен.

9. Молекула по п.7 или 8, в которой изменение аминокислотных остатков представляет собой замену исходно присутствующего(их) аминокислотного(ных) остатка(ов) другим(ими) аминокислотным(ыми) остатком(ами) в специфическом(их) положении(ях).

10. Молекула по п.9, в которой одна или более замен аминокислотных остатков выполнены так, как представлено в таблице 2.

11. Молекула по п.10, в которой дополнительно одна или более замен аминокислотных остатков выполнены так, как представлено в таблице 3, для уменьшения числа аллотипов МНС, способных связывать пептиды, имеющие происхождение от указанной молекулы.

12. Молекула по п.9, в которой одна или более аминокислотных замен выполнены так, как представлено в Таблице 3.

13. Молекула по п.7 или 8, в которой изменение аминокислотных остатков представляет собой делецию исходно присутствующего(их) аминокислотного(ных) остатка(ов) в специфическом(их) положении(ях).

14. Молекула по п.7 или 8, в которой изменение аминокислотных остатков представляет собой добавление аминокислоты(от) в специфическом(их) положении(ях) к тем, что изначально присутствуют.

15. Молекула по любому из пп.7-14, в которой также дополнительно создают изменение для того, чтобы восстановить биологическую активность указанной молекулы.

16. Молекула по п.15, в которой дополнительное изменение представляет собой замену, добавление или делецию специфической(их) аминокислоты(от).

17. Модифицированная молекула по любому из пп.7-16, в которой изменение аминокислоты сделано в соответствии с гомологичной белковой последовательностью.

18. Модифицированная молекула по любому из пп.7-16, в которой изменение аминокислоты сделано в соответствии со способами моделирования in silico.

19. Последовательность ДНК, кодирующая модифицированный GM-CSF, по любому из пп.1-18.

20. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированную молекулу, обладающую биологической активностью GM-CSF, как определено в любом из приведенных выше пунктов, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

21. Способ производства модифицированной молекулы, обладающей биологической активностью GM-CSF, как определено в любом из приведенных выше пунктов, который включает следующие стадии:

(i) определение аминокислотной последовательности полипептида или его части;

(ii) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности белка с помощью любого способа, предполагающего определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов;

(iii) разработку новых вариантов последовательностей с одной или более аминокислотами в пределах идентифицированных потенциальных эпитопов Т-клеток, модифицированных таким образом для существенного уменьшения или устранения активности Т-клеточного эпитопа, как определено путем связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов, или путем связывания комплексов пептид-МНС с Т-клетками;

(iv) конструирование таких вариантов последовательностей с помощью способов рекомбинантной ДНК и тестирование таких вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желаемыми свойствами; и

(v) необязательное повторение стадий (ii)-(iv).

22. Способ по п.21, в котором стадию (iii) выполняют путем замены, прибавления или делеции 1-9 аминокислотных остатков в любом из первоначально присутствующих эпитопов Т-клеток.

23. Способ по п.22, в котором изменение выполняют в соответствии с гомологичной белковой последовательностью и/или способами моделирования in silico.

24. Способ по любому из пп.21-23, в котором стадию (ii) выполняют с помощью следующих этапов: (а) отбор участка пептида, имеющего известную последовательность аминокислотных остатков; (b) последовательный отбор перекрывающихся сегментов аминокислотных остатков с предварительно определенным одинаковым размером и состоящих, по крайней мере, из трех аминокислотных остатков выбранного участка; (с) подсчет значения связывания молекулы МНС класса II для каждого указанного выборочного сегмента путем суммирования определенных значений для каждой гидрофобной аминокислотной боковой цепи, которая присутствует в указанном дискретном сегменте аминокислотного остатка; и (d) идентификация, по крайней мере, одного из указанных сегментов, подходящих для модификации, основываясь на подсчитанном значении связывания молекулы МНС класса II для этого сегмента для изменения общего значения связывания МНС класса II для пептида, без существенного уменьшения терапевтической полезности пептида.

25. Способ по п.24, в котором этап (с) выполняют при использовании счетной функции Bцhm, модифицированной для включения 12-6 составляющей лиганд-протеиновой энергии отталкивания Ван-дер-Ваальса и составляющей конформационной энергии лиганда путем (1) обеспечения первой базы данных моделей молекулы МНС класса II; (2) обеспечения второй базы данных возможного пептидного скелета для указанных моделей молекул МНС класса II; (3) отбора модели из указанной первой базы данных;

(4) отбора возможного пептидного скелета из указанной второй базы данных;

(5) идентификации боковых цепей аминокислотных остатков, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; (6) определения значения связывающего сродства для всех боковых цепей, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; и повторения этапов от (1) до (5) для каждой указанной модели и каждого указанного скелета.

26. Тринадцатимерный пептид эпитопа Т-клеток, имеющий потенциальную связывающую активность МНС класса II и созданный из немодифицированного GM-CSF, выбранный из группы, как представлено в таблице 1.

27. Пептидная последовательность, состоящая, по крайней мере, из 9 последовательных аминокислотных остатков тринадцатимерного пептида эпитопа Т-клеток по п.26.

28. Применение тринадцатимерного пептидного эпитопа Т-клеток по п.26 для производства GM-CSF, который существенно не имеет иммуногенности или имеет меньшую иммуногенность, чем любая немодифицированная молекула с той же биологической активностью, при использовании in vivo.

29. Применение пептидной последовательности по п.27 для производства GM-CSF, который существенно не имеет иммуногенности или имеет меньшую иммуногенность, чем любая немодифицированная молекула с той же биологической активностью, при использовании in vivo.