RU2003127409A

RU2003127409A - Модифицированный тромбопоэтин с уменьшенной иммуногенностью

Info

Publication number: RU2003127409A
Application number: RU2003127409/13A
Authority: RU
Inventors: Фрэнсис Дж. КАРР (GB); Фрэнсис Дж. Карр; Грэм КАРТЕР (GB); Грэм КАРТЕР
Original assignee: Мерк Патент ГмбХ (DE); Мерк Патент Гмбх
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2005-04-10
Also published as: WO2002068469A2; BR0207542A; US20040071688A1; JP2004533812A; ZA200307468B; HUP0401121A3; HUP0401121A2; KR20030077632A; WO2002068469A3; CA2439168A1; PL363520A1; MXPA03007625A; CN1494590A; EP1364011A2

Claims

1. Модифицированная молекула, обладающая биологической активностью тромбопоэтина (ТРО) человека и являющаяся существенно неиммуногенной или менее иммуногенной, чем любая немодифицированная молекула, которая имеет такую же биологическую активность при использовании in vivo.

2. Молекула по п.1, в которой указанная потеря иммуногенности достигается путем удаления одного или более эпитопов Т-клеток, имеющих происхождение от исходной немодифицированной молекулы.

3. Молекула по п.1 или 2, в которой указанная потеря иммуногенности достигается путем уменьшения числа аллотипов МНС (основного комплекса гистосовместимости), способных связывать пептиды, имеющие происхождение от указанной молекулы.

4. Молекула по п.2 или 3, в которой удален один эпитоп Т-клеток.

5. Молекула по одному из пп.2-4, в которой указанные изначально присутствующие эпитопы Т-клеток являются лигандами класса II МНС или пептидных последовательностей, которые демонстрируют способность стимулировать или связывать Т-клетки через презентацию на классе II.

6. Молекула по п.5, в которой указанные пептидные последовательности выбраны из группы, как представлено в таблице 1.

7. Молекула по любому из пп.2-6, в которой 1-9 аминокислотных остатков в любом из исходно присутствующих эпитопов Т-клеток изменены.

8. Молекула по п.7, в которой один аминокислотный остаток изменен.

9. Молекула по п.7 или 8, в которой изменение аминокислотных остатков представляет собой замену исходно присутствующей(их) аминокислоты(от) другим(ими) аминокислотным(ыми) остатком(ами) в специфическом положении(ях).

10. Молекула по п.9, в которой одна или более аминокислотных замен выполнены так, как показано в таблице 2.

11. Молекула по п.10, в которой дополнительно одна или более аминокислотных замен выполнены так, как показано в таблице 3, для уменьшения числа аллотипов МНС, способных связывать пептиды, имеющие происхождение от указанной молекулы.

12. Молекула по п.9, в которой одна или более аминокислотных замен выполнены так, как показано в таблице 3.

13. Молекула по п.7 или 8, в которой изменение аминокислотных остатков представляет собой делецию исходно присутствующего(их) амикислотного(ых) остатка(ов) в специфическом положении(ях).

14. Молекула по п.7 или 8, в которой изменение аминокислотных остатков представляет собой добавление аминокислоты(от) в специфическом положении(ях) к тем, что изначально присутствуют.

15. Молекула по любому из пп.7-14, в которой также дополнительно создают изменение для того, чтобы восстановить биологическую активность указанной молекулы.

16. Молекула по п.15, в которой дополнительные изменения представляют собой замену, добавление или делецию специфической аминокислоты(от).

17. Модифицированная молекула по любому из пп.7-16, в которой изменение аминокислоты делают в соответствии с гомологичной белковой последовательностью.

18. Модифицированная молекула по любому из пп.7-16, в которой изменение аминокислоты делают в соответствии со способами моделирования in silico.

19. Последовательность ДНК, кодирующая модифицированный ТРО по любому из пп.1-18.

20. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированную молекулу, обладающую биологической активностью ТРО, как определено в любом из приведенных выше пунктов, необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или наполнителем.

21. Способ производства модифицированной молекулы, обладающей биологической активностью ТРО, как определено в любом из приведенных выше пунктов, который включает следующие стадии:

(i) определение аминокислотной последовательности полипептида или его части;

(ii) идентификацию одного или более потенциальных эпитопов Т-клеток в пределах аминокислотной последовательности белка с помощью любого метода, предполагающего определение связывания пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологических анализов;

(iii) конструирование вариантов с новыми последовательностями с одной или более аминокислотами в пределах идентифицированных потенциальных эпитопов Т-клеток, модифицированных таким образом для существенного уменьшения или устранения активности Т-клеточного эпитопа, как определено связыванием пептидов с молекулами МНС при использовании способов in vitro или in silico или биологическими анализами, или путем связывания комплексов пептид-МНС с Т-клетками;

(iv) конструирование таких вариантов последовательности с помощью способов рекомбинантной ДНК и тестирование таких вариантов для того, чтобы идентифицировать один или более вариантов с желаемыми свойствами; и

(v) необязательное повторение стадий (ii)-(iv).

22. Способ по п.21, в котором стадию (iii) выполняют путем замены, прибавления или делеции 1-9 аминокислотных остатков в любом из первоначально присутствующих эпитопов Т-клеток.

23. Способ по п.22, в котором изменение сделано касательно гомологичной белковой последовательности и/или моделирующего способа in silico.

24. Способ по любому из пп.21-23, в котором стадию (ii) выполняют с помощью следующих этапов: (а) отбора участка пептида, имеющего известную последовательность аминокислотных остатков; (b) последовательного отбора аминокислотных сегментов перекрывающихся участков с предварительно определенным одинаковым размером и состоящих, по крайней мере, из трех аминокислотных остатков выбранного участка; (с) подсчет значения связывания молекулы класса II МНС для каждого выборочного сегмента путем суммирования определенных значений для каждой гидрофобной аминокислотной боковой цепи, которая присутствует в каждом дискретном сегменте аминокислотных остатков; и (d) идентификацию, по крайней мере, одного из указанных сегментов, основываясь на подсчитанной величине связывания молекулы класса II МНС для этого сегмента для изменения общего значения связывания МНС класса II для пептида, без существенного уменьшения терапевтической полезности пептида.

25. Способ по п.24, в котором этап (с) выполняют при использовании счетной функции Bohm, модифицированной для включения 12-6 лиганд-протеиновой энергии отталкивания Ван-дер-Ваальса и лиганд-конформационной энергии путем (1) обеспечения первой базы данных моделей молекулы класса II МНС; (2) обеспечения второй базы данных возможного пептидного скелета для моделей молекул указанного класса II МНС; (3) отбора модели из указанной первой базы данных; (4) отбора возможного пептидного скелета из второй базы данных; (5) идентификации боковых цепей аминокислотных остатков, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; (6) определения значения связывающего сродства для всех боковых цепей, которые присутствуют в каждом выборочном сегменте; и повторение этапов от (1) до (5) для каждой указанной модели и каждого указанного скелета.

26. Тринадцатимерный пептид эпитопа Т-клеток, имеющий потенциальную связывающую активность класса II МНС и созданный из немодифицированного ТРО, выбранный из группы, как показано в таблице 1.

27. Пептидная последовательность, состоящая, по крайней мере, из 9 соприкасающихся аминокислотных остатков тринадцатимерного пептида эпитопа Т-клеток по п.26.

28. Применение тринадцатимерного пептидного эпитопа Т-клеток в соответствии с п.26 для производства ТРО, который существенно не имеет иммуногенности или имеет меньшую иммуногенность, чем немодифицированная молекула с той же биологической активностью, при использовании in vivo.

29. Применение пептидной последовательности по п.27 для производства ТРО, который существенно не имеет иммуногенности или имеет меньшую иммуногенность, чем немодифицированная молекула с той же биологической активностью, при использовании in vivo.