KR20170085132A - 글리코실화 신호가 결핍된 변형된 박테리오파지 ｇ3ｐ 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해시키는 데 충분한 사상성 박테리오파지 유전자 3 단백질 (g3p)의 부분, 즉 g3p의 N1-N2 부분 및 그의 돌연변이체 및 단편을 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 상기 g3p 아미노산 서열은 추정 글리코실화 신호를 제거하기 위해 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 통하여 변형된 것인 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 생체내에서 사용되었을 때 상응하는 야생형 g3p 아미노산 서열보다 실질적으로 더 작은 면역원성을 띠도록 추가의 아미노산 치환을 통해서 또한 변형된 상기 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해시킬 수 있는 그의 능력을 유지한다. 본 발명은 추가로 아밀로이드의 미스폴딩 또는 응집과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에서의 상기 g3p-변형된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

Description

글리코실화 신호가 결핍된 변형된 박테리오파지 Ｇ3Ｐ 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 {POLYPEPTIDES COMPRISING A MODIFIED BACTERIOPHAGE G3P AMINO ACID SEQUENCE LACKING A GLYCOSYLATION SIGNAL}

본 출원은 2014년 12월 3일 출원된 미국 가출원 번호 62/087,052의 이점을 주장하고, 이 출원은 본 개시내용의 연속성을 제공하기 위해 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명은 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해시키는 데 충분한 사상성 박테리오파지 유전자 3 단백질 (g3p)의 부분, 즉, g3p의 N1-N2 부분 및 그의 돌연변이체 및 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 상기 g3p 아미노산 서열은 추정 글리코실화 신호를 제거하기 위해 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 통하여 변형된 것인 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 생체내에서 사용되었을 때 상응하는 야생형 g3p 아미노산 서열보다 실질적으로 더 작은 면역원성을 띠도록 추가의 아미노산 치환을 통해서 또한 변형된 상기 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해시킬 수 있는 그의 능력을 유지한다. 본 발명은 추가로 아밀로이드의 미스폴딩 또는 응집과 연관된 질환의 치료 및/또는 예방에서의 상기 g3p-변형된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

사상성 박테리오파지 g3p 단백질, 및 특히, g3p의 N1-N2 영역을 포함하는 그의 폴리펩티드 부분은 다양한 아밀로이드, 예컨대, β-아밀로이드, 타우 단백질, 및 프리온 단백질에 결합하고, 그를 분해시키는 것으로 입증되어 왔다. 공계류 중인 PCT 출원 PCT/US2012/066793, 및 US 가출원 US 61/801,349, 및 US 61/801,849 (상기 출원의 개시내용은 각각 본원에서 참조로 포함된다)를 참조할 수 있다. 또한, 문헌 [R. Krishnan et al., J. Mol . Biol . (2014)]도 참조할 수 있다. 상기와 같은 효능에도 불구하고, 재조합 포유동물 세포 시스템에서의 상기 폴리펩티드의 생산은 g3p 서열 중 추정 아스파라긴-연결된 글리코실화 신호에서의 글리코실화에 의해 유해한 영향을 받을 수 있다고 예상된다. 추가로, 인간에게 g3p 또는 그의 N1-N2 영역을 포함하는 폴리펩티드를 전신 투여하는 것도 유해한 면역 반응을 유발할 수 있다. 상기 선행 기술의 교시들 중 어느 것도 추정 글리코실화에 관한 임의의 잠재적인 문제점들을 확인하지 못했다.

다수의 재조합 또는 다른 비-천연 치료학적 단백질 또는 폴리펩티드의 효능은 치료학적 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 환자의 원치않는 면역 반응에 의해 제한될 수 있다. 단백질에 의한 면역 반응의 유도에서 주요 인자는 단백질 내의 T 세포 에피토프의 존재, 즉, 주요 조직적합 복합체 (MHC) 클래스 II 분자 상에의 제시를 통해 T 세포의 활성을 자극시킬 수 있는 아미노산 서열의 존재이다. T 세포 에피토프는 통상 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 능력이 있는 임의의 아미노산 서열로서 정의된다. MHC 분자에 결합하였을 때, T 세포 에피토프는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 인식될 수 있고, T 세포 수용체에 결합함으로써 T 세포를 활성화시켜 T 세포 반응을 촉진시킬 수 있다. 그러나, 일반적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 특정 T 세포 에피토프는 이들 펩티드가 단백질이 투여되는 유기체 내에서 "자기"인 것으로서 인식되기 때문에 T 세포 반응을 자극하지 못하는 것으로 이해된다.

일부 T 세포 에피토프는 세포 내에서 치료학적 단백질 또는 폴리펩티드가 분해되는 동안 펩티드로서 방출된 후, MHC 분자에 의해 제시되어 T 세포의 활성화를 일으킬 수 있다. MHC 클래스 II 분자에 의해 제시된 펩티드의 경우, 이어서, T 세포의 상기 활성화는 예를 들어, 상기 항체를 생성하기 위하여 B 세포의 직접적인 자극에 의해 항체 반응을 일으킬 수 있다.

MHC 클래스 II 분자는 헬퍼 T 세포 선택 및 활성화에서 중요한 역할을 하는 고도의 다형성 단백질 군이다. 인간 백혈구 항원 군 DR (HLA-DR)은 상기 단백질 군의 지배적인 이소타입이다. 그러나, 이소타입 HLA-DQ 및 HLA-DP는 유사한 기능을 수행한다. 인간에서, DR 이소타입에 대해 대략 70종의 상이한 알로타입이 알려져 있으며, DQ의 경우, 30종의 상이한 알로타입이 존재하고, DP의 경우, 47종의 상이한 알로타입이 알려져 있다. 각 개체는 2 내지 4개의 DR 대립유전자, 2개의 DQ 및 2개의 DP 대립유전자를 가진다.

개체에서 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 면역 반응은, 그 개체의 HLA-DR 알로타입의 펩티드 결합 특이성의 함수인 T 세포 에피토프 인식에 의해 크게 영향을 받는다. 전 세계 인구의 맥락에서 단백질 또는 폴리펩티드 내에서 T 세포 에피토프를 확인하기 위해, 가능한 한 다양한 HLA-DR 알로타입 세트의 결합 특성을 고려하고, 이로써 가능한 높은 백분율의 세계 인구를 커버하도록 하는 것이 바람직하다.

T 세포 에피토프 확인이 에피토프 제거를 위한 제1 단계이다. T 세포 에피토프를 검출할 수 있는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, WO 98/52976, WO 00/34317, US2007/0269435; US 7,208,147, [Kern et al., Nature Medicine 4:975-978 (1998)]; 및 [Kwok et al., Trends in Immunology 22:583-588 (2001)]에 개시되어 있다. 상기 접근법에서, 예상되거나 확인된 T 세포 에피토프는 치료학적 단백질 또는 폴리펩티드의 1차 서열 내에서 적절한 아미노산 치환을 사용함으로써 제거된다. 비록 상기 참조 문헌을 통하여 T 세포 에피토프를 추정 방식으로 확인할 수는 있지만, 생물학적 활성에 미치는 부정적 영향을 피하는 아미노산 치환을 선택하는 것은 적절하게 예측되지 못한다. 이는 단지 상기 활성에 대해 각각의 변형된 폴리펩티드를 시험함으로써만 결정될 수 있다.

따라서, 그의 아밀로이드-결합/분해 특성을 파괴하지 않으면서 단독으로, 또는 g3p의 N1-N2 부분의 면역원성을 감소시키는 것과 함께 글리코실화를 검사하고, 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 이를 통해서는 글리코실화와 연관된 제조의 어려움 없이 g3p의 N1-N2 부분을 포함하는 폴리펩티드를 포유동물 세포에서 제조할 수 있다. 추가로, 감소된 면역원성을 통하여 N1-N2 부분을 포함하는 폴리펩티드를 치료학적 및/또는 진단학적 목적으로 만성적으로 전신 투여할 수 있다. 본 발명은 PCT/US13/62862 (WO 2014/055515)에 기술된 바와 같은 g3p 폴리펩티드의 활성, 또는 PCT/US2014/039760에 기술된 바와 같은 면역원성을 감소 또는 제거하도록 변형된 g3p 폴리펩티드의 활성 (상기 두 문헌 모두 본원에서 참조로 포함된다)은 보존하면서, g3p의 N1-N2 부분 중 추정 글리코실화 신호를 확인하고, 글리코실화를 막는 그의 변형을 제공함으로써 이러한 요구에 부합하고 있다. 따라서, 본 발명의 특정 g3p 폴리펩티드는 글리코실화를 막기 위해 변형될 뿐만 아니라, 아밀로이드에 결합하고/거나, 아밀로이드 응집을 막고/거나, 아밀로이드 플라크를 분해할 수 있는 변이체 N1-N2의 능력을 파괴하지 않으면서, 상기 T 세포 에피토프의 면역원성을 감소 또는 제거하는 변이체 N1-N2 서열을 생성하기 위하여 이들 잠재적인 T 세포 에피토프 내에서 특정 아미노산 치환을 포함한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 글리코실화 신호를 제거하도록 변형된 g3p 또는 그의 아밀로이드 결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 또한 확인된 T 세포 에피토프 중 하나 이상의 것 내에서의 하나 이상의 아미노산 치환에 기인하여 면역원성이 감소되고, 글리코실화 신호가 결핍된, N1-N2 아미노산 서열의 변이체, 또는 그의 돌연변이체 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 인간 면역글로불린 Fc 영역에 융합된 변이체 N1-N2 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물, 및 미스폴딩된 및/또는 응집된 아밀로이드 단백질과 연관된 질환을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 상기 제약 조성물을 투여함으로써 상기 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 뿐만 아니라, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 보유하는 세포를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 보유하는 세포를 사용한다.

도 1은 N1-N2-hIgG1-Fc 융합 단백질 (서열식별번호: 1)의 아미노산 서열을 보여주는 것이고, 여기서, 5개의 T 세포 에피토프는 굵은 밑줄체로 식별 표시되어 있고, 추정 글리코실화 신호는 굵은 이탤릭체의 밑줄체로 식별 표시되어 있다. 아미노산 1-217이 야생형 g3p 서열의 N1-N2 부분을 구성한다. 아미노산 218-256은 M13 박테리오파지에 존재하는 야생형 g3p 글리신이 풍부한 N2-C-말단 링커로 이루어진 링커 영역을 나타낸다. 이 영역은 음영 표시로 식별 표시되어 있다. 아미노산 257-261은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 구축하기 위해 사용된 다중 클로닝 부위에 의해 코딩되는 아미노산을 나타낸다. 단백질의 IgG-Fc 부분은 아미노산 262에서 시작된다.
도 2는 또 다른 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질 (서열식별번호: 2)의 아미노산 서열을 보여주는 것이고, 여기서, 3개의 T 세포 에피토프는 굵은 밑줄체로 식별 표시되어 있고, 추정 글리코실화 신호는 굵은 이탤릭체의 밑줄체로 식별 표시되어 있다. 4번째 T 세포 에피토프는 서열식별번호: 1과 비교하여 V215A 및 G220E의 치환에 의해 제거되었고, 5번째 T 세포 에피토프는 서열식별번호: 1의 아미노산 258 및 259에 상응하는 아미노산의 결실에 의해 제거되었다.
도 3은 N-말단 포유동물 신호 서열을 포함하는, 서열식별번호: 1의 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (서열식별번호: 3)을 보여주는 것이다.
도 4는 N-말단 포유동물 신호 서열을 포함하는, 서열식별번호: 2의 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열 (서열식별번호: 4)을 보여주는 것이다.
도 5는 실시예 1에 기술된 연구에서 발현된 공여자 알로타입의 빈도 비교를 제공하는 것이다.
도 6은 서열식별번호: 2와 비교하여 추정 글리코실화 신호 (T41G), 에피토프 1 (T56H), 및 에피토프 3 (K174R)에 아미노산 변이가 있는 g3p-hIgG1-Fc 융합 단백질인 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 (서열식별번호: 5)을 보여주는 것이다. 치환된 아미노산은 굵은 이탤릭체의 밑줄체 및 회색 강조 표시로 식별 표시되어 있다.
도 7은 N-말단 포유동물 신호 서열을 포함하는 폴리펩티드 86을 코딩하는 플라스미드의 DNA 서열 (서열식별번호: 6)을 보여주는 것이다. 신호 서열을 포함하는 코딩 서열은 굵게 표시되어 있다. 서열식별번호: 1을 코딩하는 DNA와 비교하여 코돈 변이는 밑줄로 표시되어 있다.
도 8은 N-말단 포유동물 신호 서열을 포함하는 폴리펩티드 86 T41G를 코딩하는 플라스미드의 DNA 서열 (서열식별번호: 7)을 보여주는 것이다. 신호 서열을 포함하는 코딩 서열은 굵게 표시되어 있다. 서열식별번호: 1을 코딩하는 DNA와 비교하여 코돈 변이는 밑줄로 표시되어 있다.
도 9는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드를 폴리펩티드 86 및 폴리펩티드 86 T41G와 비교하는 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다.
도 10은 서열식별번호: 1의 폴리펩티드를 폴리펩티드 86 및 폴리펩티드 86 T41G와 비교하는 필터 지연 검정 결과를 도시한 것이다.
도 11은 ELISA에 의해 측정된 3가지 상이한 유형의 섬유에 대한 결합을 비교한, 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 폴리펩티드 86 T41G의 비교 결합을 도시한 것이다.

본 출원에서, 참조 (비변형된) 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여 "변이체" (및 그의 동족 언어)라는 용어는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 또는 코돈의 상응하는 치환, 결실 또는 삽입을 함유하는 서열을 지칭한다. 참조 서열은 또한 "출발 아미노산 서열" 또는 "출발 서열"로서 지칭된다. 변이체는 반드시 참조 서열의 물리적 조작을 필요로 하지는 않는다. 서열이 참조 서열과 비교하여 상이한 아미노산을 함유하는 한, 이는 그가 합성된 방법과는 상관없이 "변이체"로 간주될 것이다.

본원에서 사용되는 바, "돌연변이체" (및 그의 동족 언어)라는 용어는 본 출원에서 기술된 특정 서열 (예컨대, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 등)과 비교하여 변형이 이루어진 출발 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "변형된" (및 그의 동족 언어)이라는 용어는 참조 아미노산 서열 또는 핵산 서열 중 변이가 존재하는 것을 지칭한다. 출발 서열이 변형되었을 때, 생성된 서열은 변이체이다. 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 또는 코돈의 상응하는 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "상응하는 치환"이라는 용어는 돌연변이체 또는 단편이 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217과 정렬되었을 때, 하기 표 1, 표 2, 표 6 또는 표 7의 등가의 아미노산 치환에 상응하는 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 돌연변이체 또는 단편의 치환을 의미한다.

아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해하는 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 단편의 예로는 서열식별번호: 1의 아미노산 1-67을 포함하는 임의의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해하는 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 돌연변이체의 예로는 (1) 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217; (2) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217 또는 아미노산 43-45의 VVV가 AAA로 치환된 치환을 보유하는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217; (3) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217, 또는 치환 C53W를 가지는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217; (4) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217, 또는 아미노산 96-103의 결실을 가지는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217; (5) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217, 또는 아미노산 212-214의 QPP가 AGA로 치환된 치환을 보유하는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217; (6) 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217, 또는 치환 W181A, F190A 및 F194A를 가지는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217; (7) PCT/US2012/066793에 개시된 다른 활성 돌연변이체 및 단편; (8) 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217; (9) 서열식별번호: 1의 아미노산 2-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 2-217, 또는 서열식별번호: 5의 아미노산 2-217; (10) 서열식별번호: 1의 아미노산 3-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 3-217, 또는 서열식별번호: 5의 아미노산 3-217; (11) 추가의 N-말단 메티오닌 잔기를 함유하는 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217, 또는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-217 중 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

사상성 박테리오파지 g3p 단백질의 N1-N2 부분은 앞서 아밀로이드 결합 및 분해 특성을 가지는 것으로 밝혀져 있다 (PCT/US2012/066793 참조). 천연 M13 파지의 N1-N2 부분은 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217로 표시된다. 동일한 N1-N2 아미노산 서열은 또한 fd 및 f1 사상성 박테리오파지에 존재한다. 서열식별번호: 1의 아미노산 218-256은 또한 천연 g3p 서열의 부분이고, 전형적으로 N3 도메인으로도 공지되어 있는, g3p의 C-말단 도메인 (CT)에 g3p의 N2 영역을 결합시키는 글리신이 풍부한 링커로서 지칭됨을 이해하여야 한다. 서열식별번호: 1의 아미노산 257-261은 서열식별번호: 1의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 구축하는 데 사용되는 다중 클로닝 부위에 의해 코딩되는 아미노산을 나타낸다.

폴리펩티드

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 출발 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217 및 상기 아미노산 중 하기 변형: 아미노산 43-45의 VVV의 AAA로의 치환; 치환 C53W; 아미노산 96-103의 결실; 아미노산 212-214의 QPP의 AGA로의 치환; 치환 W181A, F190A 및 F194A; 아미노산 1의 결실; 아미노산 1 및 2의 결실; 및 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 중 하나 이상을 가지는 임의의 것의 돌연변이체로부터 선택되고, 여기서

(a) 출발 아미노산 서열은 추정 글리코실화 신호를 제거하기 위해 아미노산 39-41에서 변형되고;

(b) 폴리펩티드는 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해하는 것인, 출발 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

본 실시양태의 한 측면에서, 출발 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217로부터 선택된다.

추정 글리코실화 신호의 제거는, 치환, 결실 또는 삽입이 글리코실화 신호를 재생시키지 않는 한, N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 아미노산 치환; N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 결실; N39와 A40 사이의 하나 이상의 아미노산의 삽입; 및 A40과 T41 사이의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 달성된다. 추정 글리코실화 서열은 Asn-X-Thr/Ser이고, 여기서, X는 Pro 또는 Cys 이외의 다른 임의의 아미노산이다. 따라서, A40에 대한 특정 치환만이 오직 글리코실화 서열을 제거하게 될 것이다. 본 실시양태의 한 측면에서, 추정 글리코실화 신호의 제거는 N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 달성된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 추정 글리코실화 신호의 제거는 T41의 아미노산 치환에 의해 달성된다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 추정 글리코실화 신호의 제거는 하기 치환: T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 또는 T41A 중 임의의 것에 의해 달성된다. 본 실시양태의 가장 구체적인 측면에서, 추정 글리코실화 신호의 제거는 T41G 치환에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 추정 글리코실화 신호를 제거하기 위해 아미노산 39-41에서 변형된 것인 폴리펩티드는 출발 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 감소된 면역원성을 추가로 가지며; 변이체는 출발 아미노산 서열과 비교하여 (글리코실화 신호를 제거하는 임의의 치환 이외의) 1 내지 9개의 치환을 가지고, 여기서, 각 아미노산 치환은 표 1 및 표 2에 기술된 아미노산 치환 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용되는 바, "출발 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 폴리펩티드"라는 용어는 글리코실화 신호의 변형 및 추가의 치환(들)을 제외하면, 출발 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미한다.

<표 1>

서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 1-217에 대한 탈면역화 아미노산 치환

<표 2>

서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 아미노산 1-217에 대한 대안적 또는 추가의 탈면역화 아미노산 치환.

* 표 1 및 2에서, 명시된 아미노산은 각각 서열식별번호: 1 및 3에서 동일한 것이다.

표 1 및 2에 기술된 아미노산 치환은 N1-N2 아미노산 서열 내에 완전히 존재하는 T 세포 에피토프를 확인함으로써 도출된 것이다. 이는 잠재적인 T 세포 에피토프를 확인하기 위하여 HLA-DR 알로타입의 세계 인구를 가장 잘 나타내는 혈액 공여자 공동체 코호트로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대해 N1-N2 서열의 상이한 중복 펩티드 부분을 인큐베이션시킴으로써 수행되었다. 이어서, 상기 잠재적인 에피토프 내의 최적의 아미노산 치환을 확인하기 위하여 상기의 정보에 대해 공지된 T 세포 에피토프의 데이터베이스에 대한 소프트웨어 분석을 수행하였다. 이들 절차는 실시예에 상세하게 기술되어 있다.

본 실시양태의 한 측면에서, (글리코실화 신호를 제거하는 임의의 치환 이외의) 1-9개의 추가의 아미노산 치환은 표 1에 기술된 것으로부터 선택된다. 상기 기술된 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 오직 구체적인 단일 아미노산 치환만을 가지고, 여기서, 치환은 하기 표 3에 기술된 치환들 중 하나로부터 선택되는 것인, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체를 포함한다:

<표 3>

서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217 중의 구체적인 탈면역화 단일 아미노산 치환

본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 구체적인 단일 아미노산 치환은 에피토프 2 (서열식별번호: 1의 아미노산 135-143)에는 존재하지 않는다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 (글리코실화 신호를 제거하는 임의의 치환 이외의) 2-9개의 추가의 아미노산 치환을 가지고, 여기서, 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개에 존재하고, 여기서, 치환은 표 1 및 2에 기술된 것으로부터 선택되는 것인, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체를 포함한다. 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체에서 적어도 2개의 치환은 표 1에 기술된 것으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 측면에서 폴리펩티드는 오직 2개의 아미노산 치환만을 가지고, 여기서, 치환은 하기 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 임의의 것으로 선택되는 것인, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 변이체를 포함한다:

<표 4>

서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217 중의 구체적인 2개의 탈면역화 아미노산 치환:

본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 두 아미노산 치환 중 어느 것도 에피토프 2 (서열식별번호: 1의 아미노산 135-143)에는 존재하지 않는다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 두 아미노산 치환은 T56H 및 K174R이다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 (글리코실화 신호를 제거하는 임의의 치환 이외의) 3-9개의 추가의 아미노산 치환을 가지고, 여기서, 적어도 하나의 치환은 에피토프 1, 2 및 3 각각에 존재하고, 여기서, 치환은 표 1 및 2에 기술된 치환으로부터 선택되는 것인, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체를 포함한다. 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체 중 적어도 3개의 아미노산 치환은 표 2에 기술된 치환으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 오직 3개의 아미노산 치환만을 가지고, 여기서, 치환은 하기 표 5에 기술된 구체적인 3개의 아미노산 치환 중 임의의 것으로부터 선택된다.

<표 5>

서열식별번호: 1의 아미노산 1-215, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217 중의 구체적인 3개의 탈면역화 아미노산 치환

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 1 내지 9개의 치환 중 하나가 V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 또는 V215R로부터 선택되는 에피토프 4 중의 치환인 것인, g3p 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 1 내지 9개의 치환 중 하나가 V215A, V215S, V215G, V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 또는 V215R로부터 선택되는 에피토프 4 중의 치환인 것인, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. N1-N2 서열의 중복되는 잠재적인 T 세포 에피토프 펩티드 부분의 시험을 통해, 본 출원인은 서열식별번호: 1의 V215가 서열식별번호의 아미노산 215-223에 걸친 (글리신이 풍부한 링커의 부분을 통해 N2의 단부) 잠재적인 T 세포 에피토프 (도 1의 에피토프 4)의 일부라는 것을 확인하게 되었다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 에피토프 4는 (서열식별번호: 2에서와 같이) V215A 및 G220E 치환을 가진다. 추가로, 에피토프 4 중의 단일 V215G 치환은 서열식별번호: 1과 비교하였을 때, 아밀로이드에 결합 또는 그를 분해할 수 있는 폴리펩티드의 능력에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 상기 기술된 V215에 대한 다른 치환들은 각각 소프트웨어 및 데이터베이스 분석에 의하면, 아밀로이드 결합에는 영향을 거의 미치지 않거나, 또는 전혀 미치지 않으면서, T 세포 에피토프를 제거하는 것으로 예상된다.

더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형: 상기 기술된 V215 치환 중 어느 하나; 뿐만 아니라, 표 1 또는 표 2에 기술된 아미노산 치환 중 1-8개의 치환을 가진다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 1-8개의 아미노산 치환은 표 1에 기술된 것으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환; V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R로부터 선택되는 V215 치환; 및 표 3에 기술된 것으로부터 선택되는 하나의 추가의 단일 아미노산 치환을 가지며; 여기서, 단일 아미노산 치환은 에피토프 2에 존재하지 않는다. 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형: 상기 기술된 V215 치환 중 어느 하나; 및 2-8개의 추가의 아미노산 치환을 가지고, 여기서, 추가의 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개에 존재하고, 여기서, 치환은 표 1 또는 표 2에 기술된 것으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개에서 적어도 하나의 치환은 표 1에 기술된 치환으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환; V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R로부터 선택되는 V215 치환; 및 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 하나를 가지며, 상기 아미노산 치환 중 어느 것도 에피토프 2에는 존재하지 않는다.

더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217의 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형; 상기 기술된 V215 치환 중 어느 하나; 및 표 1 또는 표 2에 기술된 것으로부터 선택되는 3-8개의 추가의 아미노산 치환을 가지며, 에피토프 1, 2 및 3은 각각 추가의 치환 중 하나를 포함한다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 각 에피토프 1, 2 및 3 중의 치환은 표 1에 기술된 것으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환; V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R로부터 선택되는 V215 치환; 임의적 G220E 치환; 및 표 5에 기술된 구체적인 3개의 아미노산 치환 중 하나를 가진다.

더욱더 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환; 및 표 4에 기술된 것으로부터 선택되는 치환 쌍을 가지고, 여기서, 상기 치환 중 하나는 에피토프 1에 존재하고, 나머지 하나는 에피토프 3에 존재하는 것인, 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217의 변이체를 포함한다. 본 실시양태의 한 측면에서, T41 치환은 T41G이다. 상기 실시양태의 대안적 측면에서, 상기 치환 중 하나는 에피토프 1에 존재하고, 나머지 하나는 에피토프 3에 존재하는 치환 쌍은 T56H 및 K174R이다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 5의 아미노산 1-215를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본질적으로, 변이체 g3p 아미노산 서열의 C-말단에 직접 또는 펩티드 링커를 통해 융합된 인간 또는 인간화 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 서열로 이루어진 융합 단백질이다. 본원에서 사용되는 바, "펩티드 링커"라는 용어는 폴리펩티드의 기능을 방해하지 않을 연속된 아미노산 시리즈를 지칭한다. 상기 기술된 바와 같이, 서열식별번호: 1 내지 3에서, 아미노산 218-256은 보통 M13 g3p 단백질에 존재하는 글리신이 풍부한 링커를 나타낸다. 상기 링커가 사용될 수 있거나, 또는 다른 링커가 본 발명의 폴리펩티드에서 그 대신으로 치환될 수 있다. 대안적으로, Fc 폴리펩티드 서열은 N2를 코딩하는 마지막 아미노산 (예컨대, 서열식별번호: 1 내지 3의 아미노산 217)에 직접 연결될 수 있다. 링커 서열 및/또는 그의 부재에 관한 선택은 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 발현에 이용가능한 벡터를 고려하여 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있고, 상기 링커의 임의의 2차 또는 3차 구조가 폴리펩티드에 부여될 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, Fc 폴리펩티드는 인간 IgG의 Fc 부분이다. 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형을 가지는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 3의 변이체이다. 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형; 및 표 1, 표 2, 또는 하기 표 6, 또는 표 7에 기술된 아미노산 치환 군으로부터 선택되는, 그 중의 1 내지 9개의 추가의 아미노산 잔기 치환을 가지는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 변이체이다:

<표 6>

서열식별번호: 1의 아미노산 215-223에 대한 탈면역화 아미노산 치환.

<표 7>

서열식별번호: 1의 아미노산 215-223에 대한 대안적 및 추가의 탈면역화 아미노산 치환.

* V215A 및 G220E는, 서열식별번호: 2의 변이체가 상기 아미노산 잔기에 추가의 치환을 함유하지 않도록 하기 위해 서열식별번호: 2에서 이미 치환된 상태이다.

한 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형; 및 2-9개의 추가의 아미노산 치환을 가지고, 여기서, 추가의 치환 중 하나는 표 6 및 표 7에 기술된 치환이고; 치환 중 적어도 하나의 다른 치환은 표 1 및 표 2에 기술된 치환인 것인, 서열식별번호: 1의 변이체이다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 추가의 치환 중 하나는 표 6에 기술된 치환이고; 치환 중 적어도 하나의 다른 치환은 표 1에 기술된 치환이다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 에피토프 2에 치환을 가지지 않는다. 본 실시양태의 또 다른 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형을 가지고; 3-9개의 추가의 아미노산 치환을 가지고, 여기서, 추가의 치환 중 적어도 하나는 표 6 및 표 7에 기술된 치환으로부터 선택되고; 여기서, 에피토프 1, 2, 및 3 중 적어도 2개는 표 1 및 표 2에 기술된 치환으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 함유하는 것인, 서열식별번호: 1의 변이체이다. 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 표 6에 기술된 치환 중 적어도 하나 및 표 1에 기술된 치환으로부터 선택되는 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개 중의 적어도 하나의 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 에피토프 2에 치환을 가지지 않는다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 또 다른 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 추가의 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다. 본 실시양태의 대안적 측면에서, 폴리펩티드는 단지 2개의 추가의 치환을 가지고, 여기서, 하나는 에피토프 1에 존재하고, 나머지 다른 하나는 에피토프 3에 존재한다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 단 2개의 추가의 치환을 가지고, 여기서, 하나는 T56H이고, 나머지 다른 하나는 K174R이다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형을 가지고; 4-9개의 추가의 아미노산 치환; 표 6 및 표 7에 기술된 치환 중 적어도 하나; 및 표 1 및 표 2에 기술된 치환으로부터 선택되는 각 에피토프 1, 2 및 3 중의 적어도 하나의 치환을 가지는, 서열식별번호: 1의 변이체이다. 본 실시양태의 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 표 6에 기술된 치환 중 적어도 하나 및 표 1에 기술된 것으로부터 선택되는 각 에피토프 1, 2 및 3 중의 적어도 하나의 치환을 가진다. 또 다른 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 표 6에 기술된 치환 중 적어도 하나; 및 각각 표 3, 표 4 또는 표 5에 기술된 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환인 구체적인 치환 중 적어도 하나를 가진다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 1의 변이체이고, 표 6에 기술된 아미노산 치환 중 단 하나, 및 각각 표 3, 표 4 또는 표 5에 기술된 구체적인 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환 중 하나로부터 선택되는 단 1, 2, 또는 3개의 추가의 아미노산 치환을 가진다. 본 실시양태의 또 다른 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다.

대안적 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형; 및 표 1 및 표 2에 기술된 아미노산 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 9개의 추가의 아미노산 잔기 치환을 가지는, 서열식별번호: 2의 변이체이다. 더욱 구체적인 측면에서, 적어도 하나의 추가의 치환은 표 1에 기술되어 있다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드는 에피토프 2에 치환을 가지지 않는다. 본 실시양태의 또 다른 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 아미노산 39-41에 추정 글리코실화 부위를 제거하는 변형; 및 2-9개의 추가의 아미노산 치환 및 표 1 및 표 2에 기술된 치환 중 임의의 것으로부터 선택되는 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개 중의 적어도 하나의 치환을 가지는, 서열식별번호: 2의 변이체이다. 더욱 구체적인 측면에서, 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개 중의 적어도 하나의 치환은 표 1에 기술된 것으로부터 선택된다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 에피토프 2에 치환을 가지지 않는다. 본 실시양태의 또 다른 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다. 본 실시양태의 대안적 측면에서, 폴리펩티드는 에피토프 1 중 적어도 하나의 아미노산 치환 및 에피토프 3 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T56H 및 K174R 치환을 포함한다.

또 다른 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 5의 변이체이고, 3-9개의 아미노산 치환을 가지고, 여기서, 적어도 하나의 치환은 에피토프 1, 2 및 3 각각에 존재하고, 이는 표 1 및 표 2에 기술된 치환 중 임의의 것으로부터 선택된다. 더욱 구체적인 측면에서, 각 에피토프 1, 2 및 3 중의 적어도 하나의 치환은 표 1에 기술된 것으로부터 선택된다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 5의 변이체이고, 각각 표 3, 표 4 또는 표 5에 기술된 구체적인 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환 중 하나로부터 선택되는 단 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 가진다. 본 실시양태의 또 다른 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환; 및 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 임의의 것으로부터 선택되는 단 2개의 추가의 아미노산 치환을 가지는 서열식별번호: 2의 변이체이다. 본 실시양태의 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다. 본 실시양태의의 더욱 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다. 본 실시양태의 또 다른 더욱 구체적인 측면에서, 하나의 추가의 아미노산 치환은 에피토프 1에 존재하고, 나머지 다른 추가의 아미노산 치환은 에피토프 3에 존재한다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 하나의 추가의 아미노산 치환은 T56H이고, 나머지 다른 추가의 아미노산 치환은 K174R이다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 5에 기술된 아미노산 서열을 가진다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 T41 치환; 및 표 5에 기술된 구체적인 3개의 아미노산 치환 중 임의의 것으로부터 선택되는 단 3개의 추가의 아미노산 치환을 가지는 서열식별번호: 2의 변이체이다. 본 실시양태의 구체적인 측면에서, 폴리펩티드는 T41G 치환을 가진다.

핵산 분자, 서열, 벡터 및 숙주 세포

다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 기술된 g3p 변이체를 포함하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 실시양태의 한 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (서열식별번호: 1 또는 3의 아미노산 39-41의 아미노산 NAT에 상응하는) 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 코돈 치환, 프레임내 코돈 삽입 또는 프레임내 코돈 결실에 의해 변형된, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-714 또는 서열식별번호: 5의 뉴클레오티드 64-708의 변이체를 포함한다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 64-714의 변이체는 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 코돈 치환에 의해 변형된 것이다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 64-714의 변이체는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 아미노산 치환을 코딩하는 (서열식별번호: 1 및 2의 T41을 코딩하는) 뉴클레오티드 187-189의 코돈 치환에 변형된 것이다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 치환된 코돈 치환은 gga, tgg, cat, gtt, att, ctt, agg, aaa, tat, ttc, gac, gag, cag, aat, 및 gct로부터 선택된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 64-714의 변이체는 아미노산 치환 T41G를 코딩하는 뉴클레오티드 187-189의 코돈 치환에 변형된 것이다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 치환된 코돈 치환은 gga이다.

또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 변형 이외에도, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 64-714의 변이체는 추가로 1-9개의 코돈 치환으로 이루어지고, 여기서, 각 코돈 치환은 표 1, 및 표 2에 기술된 치환, 및 하기 V215 아미노산 치환: V215A, V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 변이체 핵산 서열은 상기 기술된 V215 아미노산 치환 중 어느 하나를 코딩하도록 선택되고; 1-8개의 추가 코돈 치환으로부터 선택되는 한 코돈 치환에 의해 변형되고, 여기서, 각 추가의 코돈 치환은 표 1에 기술된 아미노산 치환을 코딩하도록 선택된다. 본 실시양태의 더욱더 구첵적인 측면에서, 변이체 핵산 서열은 상기 기술된 V215 아미노산 치환 중 어느 하나를 코딩하도록 선택되고; 2-8개의 추가 코돈 치환으로부터 선택되는 한 코돈 치환에 의해 변형되고, 여기서, 각 추가의 코돈 치환은 표 1에 기술된 아미노산 치환을 코딩하고, 코돈 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개의 에피토프 각각에 존재한다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 변이체 핵산 서열은 상기 기술된 V215 아미노산 치환 중 어느 하나를 코딩하도록 선택되고; 3-8개의 추가 코돈 치환으로부터 선택되는 한 코돈 치환에 의해 변형되고, 여기서, 각 추가의 코돈 치환은 표 1에 기술된 아미노산 치환을 코딩하고, 코돈 치환은 각 에피토프 1, 2 및 3에 존재한다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 변이체 핵산 서열은 V215A 아미노산 치환을 코딩하도록 선택되는 한 코돈 치환; 및 표 3에 기술된 단일 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 한 추가의 코돈 치환에 의해 변형된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 표 3에 기술된 단일 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 한 추가의 코돈 치환은 에피토프 2 중의 아미노산 치환을 코딩하지 않는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 변이체 핵산 서열은 상기 기술된 V215A 아미노산 치환을 코딩하도록 선택되는 한 코돈 치환; 및 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 2개의 추가 코돈 치환에 의해 변형된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 2개의 추가 코돈 치환은 에피토프 2 중의 아미노산 치환을 코딩하지 않는다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 변이체 핵산 서열은 상기 기술된 V215 아미노산 치환을 코딩하도록 선택되는 한 코돈 치환; 및 표 5에 기술된 구체적인 3개의 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 3개의 추가 코돈 치환에 의해 변형된다.

추가의 다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열이 (서열식별번호: 1 또는 3의 아미노산 39-41의 아미노산 NAT에 상응하는) 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 코돈 치환, 프레임내 코돈 삽입 또는 프레임내 코돈 결실에 의해 변형된 것인, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체를 포함한다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 코돈 치환에 의해 변형된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 아미노산 치환을 코딩하는 뉴클레오티드 187-189(aca, 이는 서열식별번호: 1 및 2의 T41을 코딩)에서의 코돈 치환에 의해 변형된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 치환된 코돈 치환은 gga, tgg, cat, gtt, att, ctt, agg, aaa, tat, ttc, gac, gag, cag, aat, 및 gct로부터 선택된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 64-714의 변이체는 아미노산 치환 T41G를 코딩하는 뉴클레오티드 187-189에서의 코돈 치환에 의해 변형된다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 치환된 코돈 치환은 gga이다.

또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 변형 이외에도, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 추가로 1-9개의 코돈 치환으로 이루어지고, 여기서, 각 코돈 치환은 표 1, 및 표 2에 기술된 치환, 및 하기 V215 아미노산 치환: V215S, V215G 또는 V215T, V215C, V215D, V215E, V215F, V215H, V215K, V215N, V215P, V215Q, 및 V215R 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 각 코돈 치환은 표 1에 기술된 치환, 및 상기 기술된 V215 치환 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 더욱더 구체적인 실시양태에서, 변이체 핵산 서열은 상기 기술된 V215 아미노산 치환 중 어느 하나를 코딩하도록 선택되고; 1-8개의 추가 코돈 치환으로부터 선택되는 한 코돈 치환에 의해 변형되고, 여기서, 각 추가의 코돈 치환은 표 1에 기술된 치환으로부터 선택되는 아미노산 치환에 상응한다. 더욱 구체적인 측면에서, 변이체는 표 3에 기술된 구체적인 1개의 아미노산 치환 중 하나에 상응하는 한 추가의 코돈 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 표 3에 기술된 단일 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 한 추가의 코돈 치환은 에피토프 2 중의 아미노산 치환을 코딩하지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 변형 이외에도, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-1530 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 64-1524의 변이체는 상기 기술된 V215 아미노산 치환 중 어느 하나를 코딩하도록 선택되고; 2-8개의 추가 코돈 치환으로부터 선택되는 한 코돈 치환으로 이루어진 변형을 가지고, 여기서, 각 추가의 코돈 치환은 표 1에 기술된 아미노산 치환에 상응하고, 코돈 치환은 에피토프 1, 2 및 3 중 적어도 2개의 에피토프 각각에 존재한다. 더욱 구체적인 측면에서, 변이체는 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 하나에 상응하는 2개의 추가 코돈 치환을 가진다. 본 실시양태의 더욱 구체적인 측면에서, 표 4에 기술된 구체적인 2개의 아미노산 치환 중 하나를 코딩하도록 선택된 2개의 추가 코돈 치환은 에피토프 2 중의 아미노산 치환을 코딩하지 않는다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 표 4로부터의 구체적인 2개의 아미노산 치환은 T56H 및 K174R이다. 본 실시양태의 더욱더 구체적인 측면에서, 변이체 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 8이다.

또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 3 또는 4의 뉴클레오티드 181-189에 의해 코딩되는 추정 글리코실화 부위를 파괴시키는 변형 이외에도, 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 64-1530, 또는 서열식별번호: 6의 뉴클레오티드 64-1524 중 어느 하나의 변이체는 상기 기술된 V215 아미노산 치환 중 어느 하나를 코딩하도록 선택되고; 3-8개의 추가 코돈 치환으로부터 선택되는 한 코돈 치환으로 이루어진 변형을 가지고, 여기서, 각 추가의 코돈 치환은 표 1에 기술된 아미노산 치환에 상응하고, 코돈 치환은 각 에피토프 1, 2 및 3에 존재한다. 더욱 구체적인 측면에서, 변이체는 표 5에 기술된 구체적인 3개의 아미노산 치환 중 하나에 상응하는 3개의 추가 코돈 치환을 가진다.

본 발명의 핵산 분자의 추가의 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 변이체 g3p를 코딩하는 핵산 서열의 5' 단부에 직접적으로 및 같은 위상에서 융합된 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 본 실시양태의 한 측면에서, 신호 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 1-63이다.

본 발명의 핵산 분자는 축퇴성이지만, 상기 기술된 핵산 핵산 분자 중 임의의 것에 의해 코딩되는 것과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

재조합체 제조를 위해, 본 발명의 핵산 분자 중 임의의 것을 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필수적인 요소를 함유하거나, RNA 바이러스 벡터인 경우, 복제 및 번역을 위한 필수 요소를 함유하는 적절한 발현 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 코딩 핵산은 적절한 리딩 프레임으로 벡터 내로 삽입된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 및 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터로는 DNA 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 핵산 분자 및 서열이 클로닝되는 적절한 벡터의 선택은 발현이 수행되는 선택된 숙주 세포와 벡터의 화합성에 관한 널리 공지된 지식을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다. 이는 포유동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 효모 세포 등 중 임의의 것에서 수행될 수 있다. 이들 각 세포 유형에 대해 적절한 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 이는 일반적으로 상업적으로 이용가능하다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 보유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 숙주 세포로 형질감염 또는 형질전환 또는 달리 수득하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 벡터를 보유하는 세포는 적절한 조건하에 배양된 경우에는 본 발명의 폴리펩티드를 생성할 것이다. 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 제조에 사용된 벡터 및 세포에 관한 구체적인 예는 하기 실시예 섹션에 기술된다.

제약 조성물

일부 실시양태에서, 본 발명은 임의적으로 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 변이체 g3p를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. "제약 조성물"이란, 생리학상 적합한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 치료학상 유효량의 조성물을 지칭한다. 제약 조성물은 유기체에 유의적인 자극을 유발하지 않는다. 상호교환적으로 사용될 수 있는 "생리학상 적합한 담체" 및 "제약상 허용되는 담체"라는 어구는 유기체에 대해 유의적인 자극을 유발하지 않고, 투여된 조성물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. "부형제"라는 용어는 제약 조성물에 가해져서 활성 성분의 투여를 추가로 용이하게 하는 불활성 물질을 지칭한다. 예로는 제한 없이, 예를 들어, 염수, 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당들 및 전분 유형, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 및 예를 들어, 폴리소르베이트 20을 비롯한, 계면활성제를 포함한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 활성 성분을 제약상 사용될 수 있는 조성물로 프로세싱하는 것을 용이하게 하는, 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제제화할 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로 및 전달되는 조성물의 성질 (예컨대, 폴리펩티드의 크기 및 용해도)에 의존한다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제약 조성물은 환자의 혈류 내로의 주사 또는 주입용으로 제제화된다. 본 실시양태의 또 다른 측면에서, 제약 조성물은, 예를 들어, 직접적인 골수내, 척추강내 또는 심실내 주사에 의해 환자의 뇌 또는 중추신경계로 직접 투여하기 위한 것으로 제제화된다.

본원에 기술된 조성물은 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화할 수 있다. 비경구 투여용 제약 조성물은 수용성 형태의 조성물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 성분의 현탁액은 오일계 또는 수계 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예컨대, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁제는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁제는 또한 활성 성분들의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하는 적합한 안정화제 또는 작용제 (예컨대, 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 (트윈 20))를 함유할 수 있다. 예를 들어, 알부민과 같은 단백질계 작용제를 사용하여 전달 표면 (즉, IV 백, 카테터, 니들 등)에 본 발명의 폴리펩티드가 흡수되는 것을 방지할 수 있다.

경구 투여를 위해, 조성물은 활성 화합물을 관련 기술분야에 널리 공지된 제약상 허용되는 담체와 함께 조합함으로써 쉽게 제제화될 수 있다.

제형은 단위 투여 형태로, 예컨대, 바이알, 앰플로 또는 다중투약 용기 속에 임의적으로, 첨가된 보존제와 함께 제공할 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제 또는 에멀젼일 수 있고, 예컨대, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다. 단일 투여 형태는 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 단일 투여 형태는 변형 없이 환자에게 직접 투여될 수 있거나, 투여 이전에 희석되거나 재구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 투여 형태는 볼루스 형태로, 예컨대, 단일 주사, 다수의 정제, 캡슐제, 환제 등을 포함하는 경구 투약을 비롯한, 단일 경구 투약으로 투여될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 단일 투여 형태는 예컨대, 주입에 의해 또는 이식 펌프, 예컨대, ICV 펌프를 통해 일정 기간 동안에 걸쳐 투여될 수 있다. 후자의 실시양태에서, 단일 투여 형태는 적절한 양의, 변이체 g3p를 포함하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질로 미리 충전된 주입 백 또는 펌프 저장소일 수 있다. 대안적으로, 주입 백 또는 펌프 저장소는 환자에게로의 투여 직전에 적절한 용량의 변이체 g3p를 주입 백 또는 펌프 저장소 용액과 혼합함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 제약 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 약물 제제화 기술은 예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition] (상기 문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.

본 발명과 관련하에 사용하는 데 적합한 제약 조성물로는 활성 성분을 의도 목적을 달성하는 데 효과적인 양으로 함유하는 조성물을 포함한다.

치료학상 또는 진단학상 유효량을 결정하는 것은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 잘 포함되어 있다.

투여량 및 투여 간격은 특정 뇌 질환, 장애, 또는 병태를 치료 또는 진단하는 데 충분한 뇌 수준(최소 유효 농도, MEC)으로 파지 디스플레이 비히클을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. MEC는 각 제제에 따라 변하겠지만, 이는 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는 데 필요한 투여량은 개개의 특징들에 따라 달라질 것이다.

투여 간격 또한 MEC 값을 사용하여 결정될 수 있다. 제제는, 시간의 10-90%, 바람직하게는 30-90% 및 가장 바람직하게는 50-90% 동안 뇌 수준을 MEC 초과로 유지시키는 요법을 사용하여 투여되어야 한다.

치료하고자 하는 병태의 중증도 및 반응에 따라, 투약은 단일 투여 또는 복수 회에 걸친 투여일 수 있고, 여기서, 치료 과정은 수일 내지 수주, 또는 치유될 때까지 또는 질환 상태가 축소될 때까지 지속된다.

투여하고자 하는 조성물의 양도 물론 치료 또는 진단하고자 하는 대상체, 질병의 중증도, 주치의의 판단 등에 의존하게 될 것이다. 특정 실시양태에서, 투여하고자 하는 폴리펩티드의 양은 0.1-100 mg/kg (대상체 체중); 0.5-50 mg/kg; 1-30 mg/kg; 1-10 mg/kg; 3-30 mg/kg; 1-3 mg/kg; 3-10 mg/kg; 및 10-30 mg/kg으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 대상체에게 주 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 매 4주마다 1회, 또는 월 1회로 투여된다.

본 발명의 조성물은 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치, 예컨대, FDA 승인을 받은 키트로 제공될 수 있다. 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서를 수반할 수 있다. 팩 또는 디스펜서에는 또한 통지가 조성물의 형태 또는 인간 또는 수의학적 투여에 관한 정부 기관의 승인을 반영하는 것인, 제약의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 상기 기관이 처방한 형태로 용기와 결합된 통지가 장착되어 있을 수 있다. 상기 통지는 예를 들어, 처방 약물에 대한 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration)이 승인한 표지 또는 승인받은 제품의 인서트일 수 있다. 화합성인 제약 담체 중의 것으로 제제화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물은 또한 상기에서 추가로 상세히 설명된 바와 같이, 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 명시된 병태 치료용인 것으로 라벨링될 수 있다.

상기 및 하기의 설명은 단지 예시하고 설명하기 위한 것이며, 청구하는 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

치료학적 용도

본 발명의 또 다른 측면은 fAβ42, fαsyn 또는 ftau 중 임의의 것을 포함하는 단백질 미스폴딩 질환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 상기 단백질 미스폴딩 질환 치료에서의 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 조성물 중 임의의 것의 용도에 관한 것이다.

치료와 관련하여, "환자," "대상체" 및 "수혜자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 이는 인간 뿐만 아니라, 다른 포유동물도 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자는 단백질 미스폴딩 질환과 연관된 바이오마커에 대하여 양성 반응을 보이는 인간이다. 한 실시양태에서, 환자는 플로르베타피르를 사용한 PET 영상화에 의해 검출되는 바, β-아밀로이드 침착물을 나타낸다.

"치료하는"이라는 용어 및 그의 동족 언어는 질환의 하나 이상의 임상적 증상을 보이는 환자에서 질환 진행을 감소, 저속화 또는 역전시키는 것을 의미하는 것으로 의도된다. "치료하는"이란, 질환의 하나 이상의 임상적 증상을 보이는 환자에서 질환의 증상을 감소, 저속화 또는 역전시키는 것을 의미하는 것으로도 또한 의도된다. 한 실시양태에서, 환자는 플로르베타피르를 사용한 PET 영상화에 의해 검출되는 바, β-아밀로이드 침착물을 나타내고, β-아밀로이드 침착물의 개수는 치료에 의해 감소된다. 한 실시양태에서, 환자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조성물에 의해 검출되는 바, β-아밀로이드 침착물을 나타내고, β-아밀로이드 침착물의 개수는 치료에 의해 감소되거나, 또는 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 PET 영상화에 의해 검출되는 바, 임의 유형의 아밀로이드 침착물을 나타내고, 환자의 인지 기능은 치료에 의해 개선된다. 인지 기능 개선은 문헌 [McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 7(3):263-9(2011)]의 방법 및 시험에 의해 검정될 수 있다.

"예방"은 치료와는 다르며, 이는 임의의 임상적 증상이 발병되기 이전에 개체에게 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 조성물 중 임의의 것을 사용하는 예방을 포함한다. 예방은 질환 위험이 증가되어 있는 것으로 공지되어 있거나, 또는 단지 하나 이상의 유전자 마커에 기초하여 질환이 발병될 것으로 확신되는 개체에서 연루되어 있을 수 있다. 각종의 단백질 미스폴딩 질환에 대하여 다수의 유전자 마커가 확인되었다. 예를 들어, 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (hAPP)에서 스웨덴 돌연변이(Swedish mutation), 인디언 돌연변이(Indiana mutation), 또는 런던 돌연변이(London mutation) 중 하나 이상의 것을 가진 개체는 조기 발병 알츠하이머병이 발생할 위험이 증가되어 있으며, 이로써, 예방을 위한 후보 대상이 된다. 유사하게, 헌팅틴 유전자 중 트리뉴클레오티드 CAG 반복부를 가지는 개체, 특히, 36개 이상의 반복부를 가지는 개체에서는 결국 헌팅톤병이 발생하게 될 것이며, 이로써, 이는 예방을 위한 후보 대상이 된다.

"단백질 미스폴딩"이라는 용어는 응집 단백질 (아밀로이드 형성 펩티드), 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, β-아밀로이드, 혈청 아밀로이드 A, 시스타틴 C, IgG 카파 경쇄, 또는 프리온 단백질에 의한 아밀로이드 단백질의 형성을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 미스폴딩되고/거나, 응집된 아밀로이드 단백질과 연관된 것으로 알려진 질환으로는 알츠하이머병 (조기 발병 알츠하이머병, 후기 발병 알츠하이머병, 및 전조성 알츠하이머병 포함), 파킨슨병, SAA 아밀로이드증, 시스타틴 C, 유전성 아이슬란드 증후군, 노망, 다발성 골수종, 프리온 질환 (쿠루병, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 게르스트만 슈트라우슬러 샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease: GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 스크래피, 및 소 해면상 뇌염 (BSE)을 포함하나, 이에 제한되지 않음); 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수소뇌성 실조증 (SCA1), (SCA3), (SCA6), (SCA7), 헌팅톤병, 치상핵적핵-담창구시상하핵 위축, 척추 및 연수 근육 위축, 유전성 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 아밀로이드증, 전두측두엽 치매, 영국/덴마크 치매(British/Danish dementia), 진행성 핵상마비 (PSP) 및 가족성 뇌병증을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물이 "단백질 미스폴딩" 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

상기 미스폴딩된 및/또는 응집된 아밀로이드 단백질 질환 중 다수는 중추 신경계 (CNS)에서 발생한다. CNS에서 발생하는 질환의 일부 예로는 파킨슨병; 알츠하이머병; 하기의 임상적 증상: 행동 변이 FTD (bvFTD), 진행성의 유창하지 않은 실어증 (PNFA) 및 의미 치매 (SD)를 보이는 환자를 포함하는 전측두엽 치매 (FTD); 전측두엽 변성 (FTLD); 및 헌팅톤병이다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 중추 신경계 (CNS)에서 발생하는, 미스폴딩되고/거나, 응집된 아밀로이드 단백질을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

단백질의 미스폴딩 및/또는 응집은 CNS의 외부에서도 또한 일어날 수 있다. 아밀로이드증 A (AA) (상기 경우, 전구체 단백질은 혈청 급성기 아포리포단백질, SAA이다) 및 다발성 골수종 (전구체 단백질 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄)이 CNS의 외부에서 발생하는, 2종의 널리 공지된 단백질 미스폴딩 및/또는 응집된 단백질 질환이다. 다른 예로는 α2-마이크로글로불린에 의해 형성된 아밀로이드, 트랜스티레틴 (가족성 아밀로이드증 다발성신경병증 [FAP], 가족성 아밀로이드증 심근증 [FAC], 및 노인 전신성 아밀로이드증 [SSA]), (아포)혈청 AA, 아포리포단백질 AI, AII, 및 AIV, 겔솔린 (가족성 아밀로이드증 다발성신경병증의 핀란드(Finnish) 형태), 라이소자임, 피브리노겐, 시스타틴 C (대뇌 아밀로이드 혈관병증, 아밀로이드증을 동반한 유전성 뇌일혈, 아이슬란드 타입(Icelandic Type)), (프로)칼시토닌, 섬세포 아밀로이드 폴리펩티드 (IAPP 아밀로이드증), 심방 나트륨 이뇨인자, 프로락틴, 인슐린, 락타헤드린, 케라토-에피텔린, 락토페린, 치원성 에나멜모세포-연관 단백질, 및 세메노겔린 I을 포함하는 질환을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 CNS의 외부에서 발생하는 단백질의 미스폴딩 및/또는 응집을 포함하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

신경변성 질환은 또한 tau 병변을 포함할 수 있다 (문헌 [Lee et al., Annu . Rev. Neurosci . 24:1121-159 (2001)]에서 리뷰). Tau 단백질은 중추 및 말초 신경계 뉴런, 둘 모두의 액손에서 발현된 미세소관-관련된 단백질이다. 신경변성 타우병증 (때때로 타우병증으로 지칭된다)이 포함된다. 타우병증의 예로는 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 은 친화성 그레인 치매, 피질기저 변성, 크로이츠펠트-야콥병, 권투 선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원 섬유 엉킴, 다운 증후군, 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전측두엽 치매를 비롯한, 전측두엽 치매, 게르스트만-슈트로이슬러 샤인커병, 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 근긴장성 이영양증, 니이만-픽병(Niemann-Pick disease) C형, 신경원 섬유 엉킴을 동반한 비-괌(Non-Guamanian) 운동 뉴런 질환, 픽병, 뇌염 후 파킨슨증, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하부 신경아교증, 진행성 핵상마비, 아급성 경화성 범뇌염, 및 엉킴 단독 치매(Tangle only dementia)를 포함한다. 이들 질환병 중 일부는 또한 원섬유 아밀로이드 β 펩티드의 침착물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병은 아밀로이드 β 침착물 및 tau 병변, 둘 모두를 나타낸다. 유사하게, 프리온-매개 질환, 예컨대, 크로이츠펠트-야콥병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 및 게르스트만 슈트로이슬러 샤인커 증후군 또한 tau 병변을 가질 수 있다. 따라서, 질환이 "타우병증"이라고 명시한 것은 단지 편의를 위해 제공된 것이며, 다른 신경변성 질환 분류 또는 군으로부터 상기 질환을 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 신경변성 질환 뿐만 아니라, tau 병변들을 포함하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 제제는 아밀로이드의 존재와 관련된 증상을 보이거나, 또는 단백질 미스폴딩 질환과 연관된 바이오마커, 예컨대, 플로르베타피르 (AV-45, 일라이 릴리(Eli Lilly))에 대하여 양성 반응을 보이는 환자에게 유효량의, 본원에 기술된 제약 조성물 또는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 아밀로이드를 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 제제는 아밀로이드의 존재와 관련된 증상을 보이거나, 또는 단백질 미스폴딩 질환과 연관된 바이오마커, 예컨대, 플로르베타피르 (AV-45, 일라이 릴리)에 대하여 양성 반응을 보이는 환자에게 유효량의, 본원에 기술된 제약 조성물 또는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 아밀로이드 수준을 유지시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 제제는 아밀로이드를 가지는 환자에게 유효량의, 본원에 기술된 제약 조성물 또는 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 아밀로이드를 분해시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 β-아밀로이드 침착물의 분해 유발을 필요로 환자의 뇌에 직접 유효량의, 본원에 기술된 제약 조성물을 투여하여 뇌 중의 β-아밀로이드 침착물의 감소를 유발하는 단계를 포함하는, 뇌에서 β-아밀로이드 침착물의 분해를 유발하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 β-아밀로이드 침착물의 분해 유발을 필요로 환자 내로 유효량의, 본원에 기술된 제약 조성물을 정맥내 전달로 주사하여 뇌 중의 β-아밀로이드 침착물의 감소를 유발하는 단계를 포함하는, 뇌에서 β-아밀로이드 침착물의 분해를 유발하는 방법에서 사용하기 위한 것이다.

한 실시양태에서, 제약 조성물 또는 제제는 뇌에서의 아밀로이드 형성을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌에서의 아밀로이드 형성을 감소시키는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질환의 증상 또는 중증도를 예방, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 뇌에서의 아밀로이드 제거를 촉진시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 아밀로이드 제거를 촉진시키는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질환의 증상 또는 중증도를 예방, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 뇌에서의 아밀로이드 응집을 억제시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌에서의 아밀로이드 응집을 억제시키는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질환의 증상 또는 중증도를 예방, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 뇌에서의 독성 아밀로이드 올리고머를 제거하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌에서의 독성 아밀로이드 올리고머를 제거하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질환의 증상 또는 중증도를 예방, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 뇌에서의 독성 아밀로이드 올리고머의 형성을 막는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뇌에서의 독성 올리고머의 형성을 막는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질환의 증상 또는 중증도를 예방, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 뉴런을 아밀로이드 손상으로부터 보호하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 뉴런을 아밀로이드 손상으로부터 보호하는 것은 단백질-미스폴딩 또는 신경변성 질환의 증상 또는 중증도를 예방, 치료 또는 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 뉴런을 아밀로이드 손상으로부터 보호하는 데 사용하기 위한 본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 예방적으로 제공된다.

일부 실시양태에서, 환자는 단백질 미스폴딩 및/또는 응집 질환과 연관된 바이오마커에 대하여 양성 반응을 보이는 것이다. 한 실시양태에서, 바이오마커는 플로르베타피르 (AV45, 일라이 릴리)이다.

일부 실시양태에서, 환자는 아밀로이드의 존재와 연관된 신경변성 질환의 증상을 보이는 것이다. 다양한 실시양태에서, 아밀로이드는 fAβ42, fαsyn 또는 ftau 중 임의의 것이다.

특정 실시양태에서, 신경변성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 또는 헌팅톤병이다. 한 실시양태에서, 신경변성 질환은 알츠하이머병이다. 한 실시양태에서, 신경변성 질환은 알츠하이머병이고, 환자는 영상화제, 플로르베타피르 (AV-45, 일라이 릴리)에 의해 검출되는 바, β-아밀로이드를 보이는 것이다.

일부 실시양태에서, 환자는 프리온 매개 질환의 증상을 보이는 것이다.

특정 실시양태에서, 프리온 매개 질환은 크로이츠펠트-야콥병, 쿠루병, 치명적 가족성 불면증, 또는 게르스트만 슈트로이슬러 샤인커 증후군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 환자는 알츠하이머병 이외의 신경변성 타우병증의 증상을 보이는 것이다. 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 질환은 은 친화성 그레인 치매, 피질기저 변성, 권투 선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원 섬유 엉킴, 다운 증후군, 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전측두엽 치매를 비롯한, 전측두엽 치매, 할러포르덴-스파츠병, 근긴장성 이영양증, 니이만-픽병 C형, 신경원 섬유 엉킴을 동반한 비-괌 운동 뉴런 질환, 픽병, 뇌염 후 파킨슨증, 진행성 피질하부 신경아교증, 진행성 핵상마비, 아급성 경화성 범뇌염, 및 엉킴 단독 치매로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 질환 상태 중 임의의 것은, 환자에게 본 발명의 핵산 분자 (즉, 감소된 면역원성을 보이고, 아밀로이드에 결합할 수 있고/거나, 아밀로이드 플라크를 분해할 수 있고/거나, 아밀로이드의 응집을 방지할 수 있는 능력이 있는 변이체 g3p를 코딩하는 것)를 단독으로, 또는 적합한 담체, 예컨대, 예로서, 지질 나노입자, 중합성 담체, 또는 벡터, 예컨대, 바이러스성 벡터와 함께 임의의 적합한 경로, 예컨대, 예로서, 흡입 및 정맥내 주입에 의해 투여함으로써 치료할 수 있다. 상기 치료에 적합한 본 발명의 변이체 g3p를 코딩하는 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

진단제

본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 폴리펩티드 및 조성물은 본원에 기술된 각종 질환과 연관된 진단 적용에서 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 생체내 또는 시험관내에서 영상화제로서 사용되는 경우, 이 조성물의 결합은 기술된 단백질 미스폴딩 질환 중 하나의 진단의 일부분이 될 수 있다. 진단제로서 사용되는 경우, 본 발명의 폴리펩티드는 검출가능한 표지를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 생체내에서 다르게 검출될 수 있다. 단백질을 표지하는 표준 기술을 사용하여 진단 조성물의 아밀로이드 결합 성분에 다양한 표지를 부착시킬 수 있다. 표지의 예로는 형광성 표지 및 방사성 표지를 포함한다. 사용될 수 있는 방사성 표지는 매우 다양하게 존재하지만, 일반적으로 표지는 종종 ¹⁸F, ¹¹C, 및 ¹²³I를 포함하나, 이에 제한되지 않는 방사성 표지로부터 선택된다. 상기 및 다른 방사성 동위원소를 널리 공지된 화학법을 이용하여 단백질에 부착시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 표지는 양전자 방출 단층촬영법 (PET)을 사용하여 검출된다. 그러나, 방사성 트레이서를 검출하는 데에는 방사성 동위원소를 검출하기 위한 임의의 다른 적합한 기술 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 β-아밀로이드에 특이적인 영상화제, 예컨대, 예를 들어, F18-AV-45 (일라이 릴리)와 함께 조합하여 진단용 영상화제로서 사용될 수 있다. 비-β-아밀로이드 응집물에 대해 공지된 영상화제는 현재 없기 때문에, β-아밀로이드-특이적인 영상화제와 함께 본 발명의 진단 조성물을 사용하면, 차등적 검출에 기초하여 비-β-아밀로이드 응집물을 검출할 수 있게 된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 진단 조성물은 비-β-아밀로이드 응집물을 검출하기 위한 것으로서, β-아밀로이드 영상화제와 함께 조합하여 영상화제로서 사용된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 조성물은 뇌를 비롯한 CNS에서 β-아밀로이드를 검출하기 위한 진단용 영상화제로서 사용된다.

본 발명의 진단 조성물은 치료학적 조성물에 대해 기술된 것과 동일한 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 투여 경로는 척추강내 주사 또는 주입, 직접적인 심실내 주사 또는 주입, 실질내 주사 또는 주입, 또는 정맥내 주사 또는 주입으로부터 선택된다.

실시예

실시예 1: g3p에서 CD4+ T 세포 에피토프의 맵핑

서열식별번호: 1의 아미노산 1-240의 서열에 걸치는 87개 중복 펩티드 (12개 아미노산이 중복된 15개 아미노산 길이)를 합성하고, T 세포 에피토프 맵핑 검정으로 인간 CD4+ T 세포로부터의 반응에 대해 시험하였다. 개별 펩티드는 여섯 개 한 벌의(sextuplicate) PBMC 배양물에서 시험하였고, 에피토프 위치 뿐만 아니라, 그의 상대적인 효능을 확인하기 위해 T 세포 반응을 사정하였다.

에덴브룩 병원 지역 연구 윤리 위원회(Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee)에서 인정받은 승인에 따라 영국 국립 수혈 서비스(UK National Blood Transfusion Service) (에덴브룩 병원(Addenbrooke's Hospital: 영국 캠브리지))로부터 수득한 건강한 공동체 공여자 버피 코트 (24시간 이내에 채혈된 혈액으로부터의 것)로부터 림포프렙(Lymphoprep) (액시스-쉴드(Axis-shield: 영국 던디)) 밀도 원심분리법에 의해 PBMC (말초 혈액 단핵 세포)를 단리시켰다. CD8⁺ 로제트셉(RosetteSep)™ (스템셀 테크놀러지즈 인크.(StemCell Technologies Inc, 영국 런던))을 사용하여 CD8⁺ T 세포를 고갈시켰다. HLA SSP-PCR 기반 조직-타이핑 키트 (바이오테스트(Biotest: 영국 솔리헐))를 사용하여 HLA-DR 반수체형을 확인함으로써 공여자의 특징을 규명하였다. 대조군 신생항원 단백질 (IFV 및 EBV로부터 유래된 KLH 단백질 (피어스(Pierce) (페르바이오(Perbio)): 영국 크램링톤) 및 펩티드)에 대한 T 세포 반응을 또한 측정하였다. 이어서, PBMC를 냉동시키고, 필요할 때까지 액체 질소에서 보관하였다.

세계 인구에서 발현되는 HLA-DR 알로타입의 개수 및 빈도를 가장 잘 나타내기 위하여 상기 검정을 위해 55명의 공여자로 이루어진 코호트를 선택하였다. 세계 인구에서 발현되는 것 대비로 코호트에서 발현되는 알로타입에 관해 분석함으로써 >80%의 커버리지가 달성되었고, 모든 주요 HLA-DR 대립유전자 (세계 인구에서 >5% 빈도로 발현되는 개별 알로타입)가 잘 나타났다고 밝혀졌다. 개별 공여자 반수체형에 관한 상세한 설명 및 세계 인구 및 샘플 집단에서 발현되는 MHC 클래스 II 반수체형의 빈도 비교는 각각 하기 표 8 및 도 3에 제시되어 있다.

<표 8>

공여자에 관한 상세한 설명 및 반수체형

각 공여자로부터의 PBMC를 해동시키고, 계수하고, 생존가능성에 대해 사정하였다. 세포 밀도를 2-3x10⁶ PBMC/ml (증식 세포 스톡)로 조정하기 이전에 세포를 실온 AIM-V® 배양 배지 (인비트로겐(Invitrogen: 영국 페이즐리)) 중에서 소생시켰다. 유리 N-말단 아민 및 C-말단 카르복실산을 이용하여 1-3 mg 스케일로 15개의 아미노산 길이의 펩티드를 합성하였다. 펩티드를 DMSO 중에 10 mM 농도로 용해시키고, 웰 중 AIM-V® 배양 배지에서 5 μM의 최종 농도로 희석시켜 펩티드 배양 스톡을 제조하였다. 각 펩티드 및 각 공여자의 경우, 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에서 여섯 개 한 벌의 배양물을 확립하였다. 양성 및 음성 대조군 배양물, 둘 모두 여섯 개 한 벌로 시험하였다. 각 공여자의 경우, 3개의 대조군 (IFV 및 EBV로부터 유래된 KLH 단백질 및 펩티드) 또한 포함하였다. 양성 대조군의 경우, PHA (시그마(Sigma: 영국 도시))를 최종 농도 2.5 ㎍/ml로 사용하였다.

0.75 μCi ³[H]-티미딘 (퍼킨 엘머®(Perkin Elmer®: 영국 비콘스필드))을 각 웰에 첨가하기 이전에 총 6일 동안 배양물을 인큐베이션시켰다. 톰테크 마치(TomTec Mach) III 세포 수확기를 사용하여 필터 매트 상에서 수확하기 이전에 추가로 18시간 동안 배양물을 인큐베이션시켰다. 파라룩스(paralux), 저 배경 계수 모드로 마이크로플레이트 베타 카운터(Microplate Beta Counter) (퍼킨 엘머®: 영국 비콘스필드) 상에서의 멜티렉스(Meltilex)™ (퍼킨 엘머®: 영국 비콘스필드) 섬광 계수에 의해 각 웰의 Cpm를 측정하였다.

데이터 분석을 위해, (경계선 SI ≥1.90-1.99 반응을 고려하여) SI ≥2.00이거나, 이보다 큰 자극 지수 (SI)의 임계치를 사용하였다. 양성 반응은 하기의 통계학적 및 실험적 임계치에 의해 정의하였다:

1. 쌍을 이루지 않은 두 샘플 스튜던트 t-검정을 사용하여 배지 대조군 웰과의 대비로 이루어지는 시험 웰의 cpm의 비교에 의한 반응의 유의도 (p <0.05);

2. 2.00보다 큰 자극 지수 (SI ≥ 2.00), 여기서, SI = 시험 웰의 평균 cpm/배지 대조군 웰의 평균 cpm. 상기 방식으로 제공된 데이터는 SI ≥2.00, p <0.05로 제시된다.

추가로, 복제 배양물로부터 원 데이터의 CV 및 SD를 계산함으로써 검정내 변동을 사정하였다. 여섯 개 한 벌의 배양물에서 증식 검정을 셋업하였다 ("비-조절된 데이터"). 검정내 변동성이 낮음을 보장하기 위하여, 최대 및 최소 cpm 값을 제거한 후 데이터를 또한 분석하였고 ("조절된 데이터"), 두 데이터 세트를 사용하여 공여자 반응의 SI를 비교하였다. 본 연구의 모든 펩티드에 대한 (상기 정의된) 양성 반응의 평균 빈도 + SD를 계산하여 배경 반응 속도를 제공함으로써 T 세포 에피토프를 확인하였다. 조절된 데이터 및 비-조절된 데이터, 둘 모두에서 배경 반응 속도를 초과하는 증식 반응을 유도한 임의의 펩티드는 T 세포 에피토프를 함유하는 것으로 간주되었다. 2개의 중복 펩티드가 증식 반응 속도를 유도한 경우에, T 세포 에피토프는 중복 영역 중에 존재하는 것으로 간주되었다. 상기 내용에 기초하여, 시험된 폴리펩티드 중 하기의 T 세포 에피토프가 확인되었다:

에피토프 1: C T G D E T Q C Y G T W (서열식별번호: 1의 아미노산 46-57)

에피토프 2: T F M F Q N N R F R N R (서열식별번호: 1의 아미노산 133-144)

에피토프 3: S S K A M Y D A Y W N G (서열식별번호: 1의 아미노산 172-183)

에피토프 4: P V N A G G G S G G G S (서열식별번호: 1의 아미노산 214-225)

에피토프 5: S G S G A M V R S D K T H T C (서열식별번호: 1의 아미노산 253-267).

실시예 2: 인실리코 분석에 의한 T 세포 에피토프 4 및 5에서의 치환 디자인

T 세포 검정에서 양성이었던 펩티드의 서열을 i토프(iTope)™ 및 TCED™ 인실리코 기술을 사용하여 에피토프 영역으로부터 중복된 9-mer를 사용하여 분석하였다 [Perry et al., Drugs R D 9(6):385-96 (2008)]. 각각의 9-mer을 MHC 클래스 II 대립유전자 (총 34개)의 데이터베이스에 대해 시험하고, MHC 클래스 II 분자와의 피트(fit) 및 상호작용에 기초하여 점수화하였다. 추가로, 이전 T 세포 검정에서 T 세포 반응을 자극시킨 비관련 단백질로부터의 펩티드의 데이터베이스와 9-mer의 것 사이의 임의의 높은 서열 상동성 확인을 위해 각각의 9-mer을 공지된 CD4+ T 세포 에피토프의 데이터베이스에 대해 BLAST 검색하였다. 인실리코 분석으로부터의 정보에 기초하여, 확인된 에피토프로부터의 CD4+ T 세포 에피토프 활성의 잠재적 제거를 위한 치환인지 확인되었다.

에피토프 5는 서열식별번호: 1의 N1-N2-인간 Ig Fc 융합 단백질을 제조하는 데 사용되는 pFUSE 벡터의 다중 클로닝 부위 ("MCS")에 의해 코딩된 아미노산인, 천연 N2-CT Gly이 풍부한 링커의 C-말단, 및 인간 Ig Fc 영역의 N-말단에 걸쳐져 있다. 인실리코 분석 결과, 서열식별번호: 1의 M258 및 V259는 T 세포 활성을 담당하는 P1 앵커로서 연루되어 있는 것으로 나타났다. N1-N2 코딩 영역 바깥쪽인 그의 위치에 기초하여, 상기 두 아미노산의 제거는 기능 손실을 일으킬 것으로 예상되지 않았다. 상기 두 아미노산은 MCS에 의해 코딩되었다. 그러므로, 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발에 의해, MCS를 변형시키고 서열식별번호: 1의 M258 및 V259를 코딩하는 뉴클레오티드를 제거한 이중-가닥 DNA 분자를 제조하였다. 이어서, MCS 중 EcoRI 및 BglII 제한 부위를 사용하여 생성된 돌연변이된 DNA 서열을 다시 pFUSE 벡터로 재클로닝시켰다. (신호 서열이 결핍된) 생성된 성숙 융합 단백질에는 M258 및 V259가 누락되어 있었다. 상기 융합 단백질은 서열식별번호: 1 융합 단백질과 동일한, 하기 기술되는 검정에서 A베타(Abeta)에 결합할 수 있는 능력을 유지하였다.

에피토프 4는 N2 도메인 및 천연 Gly이 풍부한 링커가 중복된다. g3p 단백질의 결정 구조 (제시되지 않음)는 에피토프 4가 아밀로이드 결합 영역으로부터 원거리에 위치하는 바, 이에, 활성에는 영향을 주지 않으면서, 아미노산 치환을 용인할 것으로 제안하았다. P1 앵커로서 확인된 V215 (서열식별번호: 1)는 측쇄가 단백질 코어 쪽으로 약간 향해 있는 상태로 표면 노출되어 있다. 구조 분석으로부터, 표 6 및 7에 기술된 V215에 대한 치환 중 임의의 것은 에피토프를 제거하여야 한다. 추가로, 표 6 및 7에 기술된 상기 에피토프 내의 다른 아미노산의 치환 중 임의의 것 또한 수용하여야 한다. V215A 치환 (서열식별번호: 4)을 포함하고, M258 및 V259가 누락되어 있는 N1-N2-Ig Fc를 코딩는 핵산 서열을 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 부위-지정 돌연변이유발에 의해 상기 기술된 뉴클레오티드 서열로부터 유도하였다. 생성된 성숙 융합 단백질 (서열식별번호: 2)은 상기 기술된 바와 같이, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질 또는 M258 및 V239가 결실된 성숙 융합 단백질과 비교하였을 때, 결합 검정에서 A베타에의 결합이 증가된 것으로 입증되었다. 서열식별번호: 4의 핵산 서열은 에피토프 1, 2 및 3에 모든 변형을 포함하는 유전자를 생성하기 위한 모체 서열로서 사용되었다.

실시예 3: 인실리코 분석에 의한 T 세포 에피토프 1, 2 및 3에서의 치환 디자인

에피토프 1은 N1-N2의 추정되는 A베타 결합부에 대해 C-말단 바로 옆에 있다. 에피토프 1의 인실리코 분석은 T 세포 에피토프의 아미노산 치환 및 제거를 위한 영역으로 서열식별번호: 1의 아미노산 48-56을 강조하였다. 상기 9-mer 내의 아미노산은 g3p의 X선 결정 구조로부터 해석된 바와 같이, 존재하는 아미노산의 성질, 표면 노출, 및 g3p의 아밀로이드 결합 영역과의 상호작용에 기초하여 치환에 대해 표적화되었다. 특히, G48, T51, Y54 및 T56은 표 1에 명시된 변이에 의한 치환에 대해 표적화되었다. 상기 영역 중의 다른 잠재적인 아미노산 치환은 표 2에 기술되어 있다.

에피토프 2의 i토프™ 분석은 상기 에피토프를 감소시키거나, 제거하기 위한 표적으로서 서열식별번호: 1의 아미노산 135-143을 지목했다. X선 결정 구조에 기초하여, 서열식별번호: 1의 아미노산 136-139는 N1-N2의 힌지 영역과 결합을 형성하는 루프 영역을 형성하는 바, 따라서, 이는 아밀로이드 결합 활성을 위해 중요할 수 있다. 상기 아미노산에 대한 변이는 덜 바람직하며, 이는 단지 표 2에만 제시되어 있다. 더욱 바람직한 변이는 M135, R140, F141 및 N143에 대한 것이며, 이는 표 1에 기술되어 있다. 상기 9개 아미노산 영역에 대한 다른 잠재적인 변이는 표 2에 기술되어 있다.

서열식별번호: 1의 아미노산 173-182는 인실리코 분석에 의해 에피토프 3 내에서 치환을 위한 표적으로서 확인되었다. 에피토프 3은 N2 도메인의 알파 나선 부분에 위치하는 바, 따라서, 상기 전략법은 소수성 잔기 및 작은 극성의 비하전된 잔기의 도입을 피하고자 하는 것이었다. 추가로, 본 발명자들은 상기 에피토프의 C-말단 쪽으로 극성 잔기 산성 잔기를 도입하는 것을 피하고자 하였다. X선 결정학적 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 표 1에 명시된 변이에 의한 치환에 대해 S173, D174, M176, D178 및 W182를 표적화하였다. 상기 영역에서의 다른 잠재적인 아미노산 치환은 표 2에 기술되어 있다.

실시예 4: T 세포 에피토프가 감소된 N1-N2-인간 IgG Fc 폴리펩티드의 생성

각각이 표 3에 기술된 상이한 단일 아미노산 치환을 함유하는 N1-N2-인간 IgG Fc 융합 단백질을 코딩하는, 58개의 상이한 핵산 분자를 제조하였다. 이는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 서열식별번호: 4의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 수행함으로써 원하는 치환을 도입한 후, 이 PCR-증폭 돌연변이된 서열을 E-hIgG1-Fc2 벡터 (인비보겐®(InVivogen®: 프랑스 툴루즈), 카탈로그 번호 pfuse-hg1fc2)로 재클로닝함으로써 달성하였다.

상기 "탈면역화된" Fc 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 프리스타일(FreeStyle) 293-F 세포 (인비트로겐: 스코틀랜드 페이즐리, 카탈로그 # R790-07) 중 개별 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터에서 일시적으로 발현시켰다. 형질감염 당일, 세포를 생존가능성을 >90%로 보장하면서, 프리스타일 293 배지(FreeStyle 293 Media) (인비트로겐, 카탈로그 # 12338) 중에서 1 x 10⁶/mL로 희석시켰다. 플라스미드 DNA 및 폴리에틸렌이민 (PEI)을 따로따로 옵티멤(Optimem) (인비트로겐, 카탈로그 # 31985) 중에서 희석시키고, 5분 동안 인큐베이션시킨 후, PEI를 DNA에 천천히 첨가하고, DNA/PEI 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 플라스크를 와동시키면서, DNA/PEI 혼합물을 293-F 세포에 적가하였다. 형질감염된 배양물을 6-7일 동안 135 rpm으로 회전하는 오비탈 쉐이커 플랫폼 상에서 37℃, 8% CO₂에서 인큐베이션시킨 후, 상기 배양물을 수확하였다.

원심분리에 의해 폴리펩티드를 함유하는 배양 배지를 수확하고, 10x PBS를 사용하여 pH를 조정하였다. 4℃에서 밤새도록 회전시켜 단백질을 단백질 A 세파로스 비드 (시그마: 영국 도시)에 결합시켰다. 비드를 1x PBS로 2회에 걸쳐 세척하고, 시그마프렙(SigmaPrep) 스핀 칼럼 (시그마)으로 옮겨 놓았다. 0.1 M 글리신 pH 3.0을 사용하여 원심분리하여 샘플을 용출시키고, 1/10 부피의 1M 트리스-HCl (pH 8.0)을 사용하여 수집 튜브에서 중화시켰다. 용출물을 2 ml 제바스핀(ZebaSpin) 칼럼 (피어스: 영국 크램링톤, UK, 카탈로그 #89890)을 사용하여 1x PBS로 완충제를 교환하였다. 샘플은 필터 멸균시키고, 각 샘플에 대해 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

실시예 5: 탈면역화된 폴리펩티드의 A베타 결합 분석

A. A베타 ( Aβ ) 섬유 제조. Aβ42 (1 mg, r펩티드 A-1002-2)를 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP, 1 mL)에 용해시키고, 철저히 와동시키고, 투명한 용액이 보일 때까지 2-18시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 분취물 (100 ㎕, 100 ㎍)을 1.5 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에 넣고, 2-3 hr 동안 진공 (스피드 백(speed Vac), 에펜도르프, 농축기 5301)) 건조시켰다. 생성된 단량체를 20 ㎕ DMSO 중에서 재현탁시키고, 피펫팅하고, 완전히 용해될 때까지 철저히 와동시켰다. 용액을 260 ㎕의 10 mM HCl 용액으로 희석시키고 (최종 Aβ42 농도는 80 μM이다), 20초 동안 와동시켰다. 투명한 용액을 37℃에서 3일 동안 (진탕 없이) 인큐베이션시켜 응집이 이루어질 수 있도록 한다.

본 검정에서 사용하기 위해, 생성된 스톡 용액으로부터의 Aβ42 섬유를 PBS 중 1.6 μM 최종 농도로 50배 희석시켰다.

B. ELISA 플레이트 제조. 96-웰 플레이트 (F96 맥시소르프 눈크-이뮤노 플레이트(F96 MAXISORP NUNC-IMMUNO PLATE); 카탈로그 번호: 442404, 로트 125436 및 128158; 덴마크)의 각 웰에 200 ㎕의 1% BSA 용액을 첨가하였다. 플레이트를 실링하고, 7℃에서 3 hr 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 PBS (250 ㎕/웰) x3으로 세척하였다. 본 발명자들은 50 ㎕의 희석된 Aβ42 섬유 용액 (1.6 μM)을 각 웰에 첨가하고, 덮지 않은 상태로 37℃에서 밤새도록 완전히 건조될 때까지 인큐베이션시켰다. PBS (50 ㎕/웰)을 (Aβ42 섬유를 함유하지 않는) 대조군 웰에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 물로 2X 및 PBS로 1X로 세척하였다 (각 세척을 위해 250 ㎕/웰).

C. ELISA 검정. 50 ㎕ 중 다양한 농도의 각 폴리펩티드 (뿐만 아니라, 서열식별번호: 2의 폴리펩티드)를 각 웰에 뿐만 아니라, 비-Aβ42 섬유 코팅된 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 PBS-T (PBS 중 0.05% 트윈 20)로 3X 및 PBS로 3X으로 세척하였다 (각 세척을 위해 250 ㎕/웰). 이어서, 본 발명자들은 각 웰에 PBS-T + 1% 밀크 (디프코™ 스킴 밀크(Difco™ Skim Milk), 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company: 미국), 카탈로그 번호: 232100, 로트 번호: 7320448) 중에 1:2,500으로 희석된 (0.32 ㎍/mL 최종) HRP-접합된 염소 항-인간 항 Fcγ (잭슨 랩스(Jackson Labs), 카탈로그 번호. 109-035-008, 로트 번호: 106617) 50 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 40 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 PBS-T로 6X 및 PBS로 2X로 세척하였다 (각 세척을 위해 250 ㎕/웰). 이어서, 본 발명자들은 50 ㎕/웰 OPD 용액 (15 mg/7.5 ml 0.05 M 시트레이트 완충제 pH-5.5/3 ㎕ H₂O₂)을 첨가하고, 3-6 min 동안 발색시켰다. 이어서, 본 발명자들은 25 ㎕/웰의 4 N HCl 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 492 nm 및 405 nm에서 흡광도를 판독하였다. 405 nm 흡광도를 492 nm 흡광도로부터 감산하였고, 그 결과를 폴리펩티드 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 이어서, 각각의 탈면역화된 폴리펩티드에 대한 결합 IC₅₀을 계산하고, 서열식별번호: 2의 폴리펩티드에 대해 계산된 IC₅₀과 비교하였다. 결과는 하기 표 9에 제시되어 있다.

<표 9>

서열식별번호: 2의 폴리펩티드와 비교하여 에피토프 1, 2 또는 3에 단일 추가의 아미노산 치환을 가지는 폴리펩티드에 대한 A베타 결합 IC₅₀에 있어서의 상대적 변화

* 수치는 IC₅₀ (치환된 폴리펩티드)/IC₅₀ (서열식별번호: 2의 폴리펩티드)을 반영한다. 다중의 값은 결합 검정에서 검사가 이중으로 수행된 것을 반영한다.

실시예 6: 전체 단백질 CD4+ T 세포 반응의 분석

서열식별번호: 1과 비교하여 본 발명의 폴리펩티드 중 임의의 것으로부터의 CD4+ T 세포 반응을 분석하기 위하여, 전체 단백질 T 세포 검정을 수행하였다. 실시예 1에서와 같이 제조된 20명의 건강한 인간 공여자 버피 코트로부터 PBMC를 단리시켰다. AIM-V® 배양 배지에서 냉동된 것으로부터 PBMC를 소생시키고, 밀테니이 CD14 마이크로비즈(Miltenyi CD14 Microbeads) 및 LS 칼럼 (밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech: 영국 옥스포드))을 사용하여 CD14⁺ 세포를 단리시켰다. 단핵구를 1,000 U/ml IL-4 및 1,000 U/ml GM-CSF로 보충된 AIM-V® ("DC 배양 배지") 중에 4-6x10⁶ PBMC/ml로 재현탁시킨 후, 24 웰 플레이트에 분배하였다 (2 ml 최종 배양물 부피). 2일째 DC 배양 배지 부피의 절반을 대체함으로써 세포를 공급하였다. 3일째까지, 단핵구는 반-성숙 수지상 세포 (DC)로 분화되었고, 이를 40 ug/ml의 시험 폴리펩티드 또는 40 ug/ml의 서열식별번호: 1의 폴리펩티드를 포함하는 항원, 또는 100 ㎍/ml KLH와 함께 또는 오직 배지하고만 미리 인큐베이션시켰다. 반-성숙 DC를 24시간 동안 항원과 함께 인큐베이션시킨 후, 과량의 항원은 세포를 2회 세척하고, 50 ng/ml TNF-α (페프로테크(Peprotech: 영국 런던))로 보충한 DC 배양 배지에 재현탁시켜 제거하였다. 7일째 50 ng/ml TNF-α로 보충된 절반 부피의 DC 배양 배지를 대체함으로써 DC를 공급하고, 8일째 성숙 DC를 수확하였다. 수확된 성숙 DC를 계수하고, 트립판 블루 염료 배제를 사용하여 생존가능성을 사정하였다. 이어서, DC에 γ-조사하고 (4,000 rads), 하기와 같은 T 세포 증식 및 ELI스폿(ELISpot) 검정에서의 분석에서 사용하기 이전에 AIM-V 배지 중에 2x10⁵개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 추가로, 8일째 CD4+ T 세포를 또한 제조하였다. CD4+ T 세포를 정제하기 위하여, AIM-V® 배양 배지에서 PBMC를 소생시키고, 밀테니이 CD4 마이크로비이드 및 LS 칼럼 (밀테니이 바이오테크: 영국 옥스포드)을 사용하여 CD4⁺ 세포를 단리시키고, AIM-V® 배지 중 2x10⁶개의 세포/ml로 재현탁시켰다.

8일째, T 세포 증식 검정을 확립함으로써, 이를 통해 1x10⁵개의 자가유래 CD4⁺ T 세포를 96 웰 U-바닥 플레이트 중에서 1x10⁴개의 항원-로딩된 DC (비 10:1)에 첨가하고, AIM-V® 배지를 최종 부피 200 ul/웰까지 첨가하였다. 14일째, 톰테크 마치 III 세포 수확기 (미국 코네티컷주 햄덴)를 사용하여 필터 매트 (퍼킨 엘머) 상에서 수확하기 이전에 6시간 동안 검정용 플레이트를 25 ul AIM-V®에서 웰당 1 uCi [³H] (퍼킨 엘머: 영국 비콘스필드)로 펄싱시켰다. 모든 폴리펩티드는 여섯 개 한 벌의 배양물에서 시험하였다. 파라룩스, 저 배경 계수로 1450 마이크로베타 왈락 트리룩스 액체 섬광 계수기(1450 Microbeta Wallac Trilux Liquid Scintillation Counter) (퍼킨 엘머) 상에서 계수하는 멜티렉스™ (퍼킨 엘머) 섬광 계수에 의해 각 웰의 분당 계수 (cpm)를 측정하였다. 각각의 항원에 대한 분당 계수는 AIM-V® 배지로만 이루어진 대조군에 대해 정규화하였다.

ELI스폿 검정을 위해, ELI스폿 플레이트 (밀리포어(Millipore: 영국 왓퍼드))를 PBS 중에서 100 ul/웰 IL-2 포획 항체 (R&D 시스템즈(R&D Systems: 영국 애빙던))로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS 중에서 2회 세척하고, 차단 완충제 (PBS 중 1% BSA (시그마)) 중에서 밤새도록 인큐베이션시키고, AIM-V® 배지 중에서 세척하였다. 8일째, 1x10⁵개의 자가유래 CD4⁺ T 세포를 96 웰 ELI스폿 플레이트 중에서 1x10⁴개의 항원-로딩된 DC (비 10:1)에 첨가하였다. 모든 폴리펩티드 시료를 여섯 개 한 벌의 배양물에서 시험하였다. 각 공여자 PBMC에 대하여, 음성 대조군 (AIM-V® 배지 단독), 세포 무함유 대조군 및 PHA (10 ug/ml) 양성 대조군 또한 포함하였다.

추가로 7일간의 인큐베이션 기간 후, PBS/1% BSA 중 100 ul 여과된 비오티닐화된 검출 항체 (R&D 시스템즈: 영국 애빙던) 첨가 이전에 dH₂O 및 PBS 중에서 3회에 걸쳐 순차적으로 세척함으로써 ELI스폿 플레이트를 전개시켰다. 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 PBS 중에서 3회에 걸쳐 추가로 세척하고, PBS/1% BSA 중 100 ul 여과된 스트렙트아비딘-AP (R&D 시스템즈)를 1시간 동안 첨가하다(실온에서 인큐베이션). 스트렙트아비딘-AP를 폐기하고, 플레이트는 PBS 중에서 4회에 걸쳐 세척하였다. BCIP/NBT (R&D 시스템즈)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. dH₂O를 사용하여 웰, 및 웰 후면을 3회에 걸쳐 세척함으로써 스폿 전개를 정지시켰다. 이뮤노스캔(Immunoscan)™ 분석기 상에서 건조된 플레이트를 스캐닝하고, 이뮤노스캔™ 버전 4 소프트웨어를 사용하여 웰당 스폿(spw)을 측정하였다.

증식 검정 및 IL-2 ELI스폿 검정, 둘 모두를 위해, 결과를 양성 T 세포 반응에 대한 자극 지수 (SI)가 2 이상 (SI≥2.0)인 임계치를 사용하여 배지-단독 대조군에 대비의 시험 폴리펩티드에 대한 cpm (증식 검정) 또는 스폿 (ELI스폿 검정)의 비로서 정의된 SI로 나타내었다.

실시예 7: T 세포 에피토프 1, 2 및 3 중 2개 이상의 것에서의 이중 및 삼중 치환 디자인

결합 검정의 결과에 기초하여, 서열식별번호: 2와 비교하여 2개의 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩티드에 존재하도록 하기 치환을 에피토프 1, 2 및 3에서 선택하였으며, 각 치환은 상이한 에피토프에 존재하였다.

<표 10>

2개의 에피토프 및 3개의 에피토프 변형을 포함하는 변이체를 위한 아미노산 치환

적절한 출발 DNA (전형적으로, 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 2개의 치환 중 하나를 코딩하는 DNA)의 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 각각이 상이한 에피토프에 존재하는 것인, 표 10에 기술된 아미노산 치환 중 2개를 가지는 N1-N2-인간 IG Fc 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 제조하였다. 상기 융합 단백질을 코딩하는 생성된 DNA를 사용하여 세포를 형질전환시키고, 실시예 4에 기술된 바와 같이 발현시키고, 정제시키고, 실시예 5에 기술된 바와 같이 결합에 대해 시험하였다. 이어서, 2개의 아미노산 치환된 폴리펩티드에 대한 결합 검정의 결과에 기초하여 에피토프 1, 2 및 3, 각각에 1개의 치환을 가지는 폴리펩티드를 디자인하였다. 에피토프 1, 2 및 3, 각각에 1개의 치환을 가지는 폴리펩티드를 A베타 결합 뿐만 아니라, 실시예 6에 기술된 T 세포 반응, 둘 모두에 대해서 검정한다. 특히, 하기 표 11에 명시된 바와 같이 서열식별번호: 2에서 특정 아미노산을 치환함으로써 하기의 이중 및 삼중 에피토프 변이체를 제조하였다.

<표 11>

본 발명의 이중 및 삼중 에피토프 변이체 폴리펩티드.

실시예 5에 기술된 ELISA 검정을 사용하여 베타-아밀로이드에의 결합에 대하여 상기-명시된 폴리펩티드를 검정하였다. 결과는 하기 표 12 및 13에 기술되어 있다. 상대 결합 값은 IC₅₀ (서열식별번호: 2의 폴리펩티드)/IC₅₀ (시험된 폴리펩티드)을 반영한다 (예컨대, 서열식별번호: 2의 폴리펩티드와 비교하여, 그 값이 낮을수록, 폴리펩티드의 결합은 더 크다). 다중의 값은 결합 검정에서 검사가 이중으로 수행된 것을 반영한다.

<표 12>

서열식별번호: 2의 폴리펩티드 대 본 발명의 예시적 폴리펩티드의 상대 결합 값.

실시예 8: 셀룰로스 아세테이트 필터 지연 검정

본 검정을 사용하여 아밀로이드 섬유의 비-아밀로이드 형성 또는 가용성 응집물로의 탈안정화 (분해) 또는 리모델링을 모니터하였다. 검정은 주로 문헌 [Chang, E. and Kuret, J., Anal Biochem 373, 330-6, (2008)] 및 [Wanker, E. E. et al., Methods Enzymol 309, 375-86, (1999)]로부터 개작하였다. 구체적으로, 2.5 μM의 fAβ 아밀로이드 섬유 시료를 상이한 농도의 본 발명의 변이체 융합 폴리펩티드 (1 nM 내지 2 μM)와 함께 37℃에서 3일 동안 미리 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 섬유를 융합 폴리펩티드와 함께, 및 융합 폴리펩티드 부재하에서 희석시키고, 진공 블롯 상에서 셀룰로스 아세테이트 막 상에 스폿팅하였다. 막을 PBS로 광범위하게 세척하고, 1 hr 동안 Aβ의 N-말단에 대해 특이적인 항체로 프로빙하였다. HRP-접합된 2차 Ab를 사용하여 막 위에 유지된 원섬유 응집물을 정량화하였다. 스폿 색상을 분석하고, 농도계 스캐너를 사용하여 디지털화하였다. 각 스폿의 신호 강도 대 각 스폿에 첨가된 융합 폴리펩티드의 농도에 기초하여 EC₅₀ (1/2 최대 유효 농도)을 계산하였다.

상기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 모두 ELISA 검정으로 측정된 바와 같이, Aβ에 대해 결합을 보였다. 시험된 변이체 폴리펩티드 대부분은 또한 도트 블롯 검정으로 측정된 바와 같이, Aβ의 분해를 보였다.

실시예 9: 변형된 글리코실화 신호를 가지는 폴리펩티드의 구축 및 분석

본 발명자들은 부위-지정 돌연변이유발을 위한 출발 물질로서 폴리펩티드 번호 86을 코딩하는 서열식별번호: 3 또는 변형된 버전의 뉴클레오티드 서열 서열식별번호: 4의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41의 글리코실화 신호가 결핍된 폴리펩티드를 구축하였다.

제조사의 지시에 따라 퀵체인지 부위-지정 돌연변이유발 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit) (애질런트(Agilent)) 및 하기 프라이머를 사용하여 pFUSE-hIgG1-Fc2 벡터 (인비보겐)로부터 유도되고, 포유동물 신호 서열에 융합된 폴리펩티드 86을 코딩하는 플라스미드 벡터를 돌연변이화시켜 T41G 치환을 생성하였다:

정방향 프라이머: GCTGTCTGTGGAATGCTGGAGGCGTTGTAGTTTG (서열식별번호: 8)

역방향 프라이머: CAAACTACAACGCCTCCAGCATTCCACAGACAGC (서열식별번호: 9).

표준 기술을 사용하여 원하는 플라스미드를 단리시키고, 서열분석하기 위해 생성된 벡터 (서열식별번호: 7)를 사용하여 NEB 5-알파 적격 E. 콜라이(E. coli) 세포를 형질전환시켰다.

이어서, 정제된 벡터를 사용하여 상업적으로 이용가능한 Expi293™ 발현 시스템(Expi293™ Expression System) (라이프 테크놀러지즈(Life Tehcnologies))을 이용함으로써 Expi293 세포를 형질전환시켰다. 형질감염 하루 전날, Expi293 세포를 2 x 10⁶개의 생존가능한 세포/ml의 밀도로 시딩하였다. 형질감염 당일, 500 ㎍의 필터 멸균된 플라스미드를 옵티-MEM I(Opti-MEM I)에 희석시켜 총 부피가 25 ml가 되도록 만들었다. 별도의 튜브에서, 1.333 ml 엑시펙트아민™ 293 시약(ExpiFectamine™ 293 Reagent)을 25 ml 옵티-MEM I 중에 희석시키고, 도립시켜 혼합하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 희석된 DNA를 희석된 엑시펙트아민^™ 293 시약에 첨가하고, 추가로 20-30분 동안 인큐베이션시켰다. 플라스크를 완만하게 와동시키면서, DNA-엑시펙트아민^™ 293 시약 복합체를 500 ml 세포(>3 x 10⁶개의 세포/ml)에 천천히 첨가하였다. 대략 18시간 후에 형질감염된 세포에 엑시펙트아민™ 293 형질감염 증진제(ExpiFectamine™ 293 Transfection Enhancer) I 및 II를 각각 2.5 ml 및 25 ml씩 첨가하였고, 세포를 또 다른 5일 동안 오비탈 쉐이커 상에서 37℃, 8% CO₂에서, 135 rpm으로 인큐베이션시켰다. 발현된 융합 단백질 ("폴리펩티드 86-T41G"로 명명)-함유 배지를, 4℃에서 20분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하여 수확하였다. 상청액을 5 ml 하이트랩 r단백질 A FF 칼럼(HiTrap rProtein A FF column) (GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에서 정제하였고, 모든 단계는 4℃에서 수행되었다. 5 ml/min 유속을 사용하여 세포 배지를 적용시키기 전에, 칼럼을 5 부피의 용출 완충제 (0.1 M 글리신, pH 3)를 이용하여 재생시키고, 5-10 부피의 20 mM 인산나트륨 완충제 중에서 세척하였다. 0.1 M 글리신 (pH 3)을 이용하여 결합된 폴리펩티드 86-T41G를 용출시켜 분리시키기 이전에 5-10 부피의 20 mM 인산나트륨 완충제를 이용하여 칼럼을 세척하였다. 1 내지 3 ml의 분획을 튜브에 수집하고, 1 M 트리스-HCl (pH 9)을 사용하여 pH를 조정하였다. 나노드롭 2000C(Nanodrop 2000C) 상에서 280 nm에서의 흡광도에 의해 수율을 측정하였다. 5 ㎕의 각 단백질 함유 분획을 SDS-PAGE TGX 겔 (바이오래드(BioRad)) 상에서 분리시키고, 2시간 동안 쿠마시(Coomassie) 염색을 수행하였다. 폴리펩티드 86-T41G를 함유하는 분획을 풀링하고, 4℃에서 밤새도록 D-PBS 중에서 투석시켰다. 최종 폴리펩티드 86-T41G 샘플을 울트라프리(Ultrafree) 스핀 필터 상에서 멸균시키고, 나노드롭 2000C 상에서 농도를 측정하였다.

정제된 폴리펩티드 86-T41G (서열식별번호: 6)를 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 이는 폴리펩티드 86보다 약간 낮은 저분자량 (겉보기 ~500 달톤 이하)의 단일 밴드로서 이동하였다 (도 9). 본 발명자들은 상기의 더 낮은 저분자량은 아미노산 41에서의 T에서 G로의 변이 뿐만 아니라, N39에서의 글리코실화 손실, 이 둘 모두에 기인한다고 믿었다.

정제된 폴리펩티드 86-T41G를 또한 슈퍼덱스200 증가 10/300 칼럼(Superdex200 increase 10/300 column) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 100 ml의 포스페이트 완충처리된 염수 ("PBS")로 칼럼을 세척하고, 평형화시켰다. 100 마이크로그램 (100 ㎍)의 폴리펩티드 86-T41G를 PBS 중에서 희석시켜 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 만들고, 칼럼 상에 로딩하였다. 이어서, 0.75 mL/분 속도로 1.5 칼럼 부피의 PBS를 이용하여 칼럼을 용출시켰다. 분광광도법을 이용하여 214 nm 및 280 nm에서 분획 중 단백질을 모니터링하였고, 이는 균질성이라는 것을 나타내는 뾰족한 피크를 보였다 (데이터는 나타내지 않음).

정제된 폴리펩티드 86-T41G를 실시예 5에 기술된 ELISA를 사용하여 A베타 결합에 대해 분석하였다. 본 검정에서 A베타 결합에 대한 EC₅₀은, 서열식별번호: 1의 폴리펩티드의 경우, 20.6-27.01 nM, 및 폴리펩티드 86의 경우, 34.5 nM인 것과 비교하여, 13.15 nM인 것으로 계산되었다.

정제된 폴리펩티드 86-T41G를 또한 실시예 8에 기술된 셀룰로스 아세테이트 필터 지연 검정을 사용하여 A베타 결합에 대해 서열식별번호: 1의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 86과 비교하였다. 본 검정의 결과는 도 10에 제시되어 있다.

이어서, 정제된 폴리펩티드 86-T41G를, 인간 HLA 반수체형의 95%를 나타내는 50개의 상이한 PBMC 공여자를 사용하는 전체 단백질 CD4+ T 세포 반응 검정에서; 및 실시예 6에 기술된 ELI스폿 시토카인 (IL-2) 검정에서 폴리펩티드 86 및 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 (뿐만 아니라, 인간화 A33 항체 및 양성 대조군으로서 키홀 림펫 헤모시아닌과) 비교하였다. 결과는 하기 표 13 및 14에 제시되어 있다.

<표 13>

PBMC T 세포 증식 반응 검정 결과

<표 14>

ELI스폿 IL-2 검정 결과.

상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 서열식별번호: 1의 폴리펩티드 (아미노산 39-41의 추정 글리코실화 부위 또는 임의의 추정 T 세포 에피토프에 어떤 아미노산 변이도 없는 것)는 공여자의 12% (6/50)에 대해 배경의 >2배인 증식 반응 ("SI")을 유도하였다. 폴리펩티드 86 및 폴리펩티드 86 T41G는 유의적으로 더 적은 공여자 PBMC (4%; 2/50)로부터 증식 반응을 유도하였고, 여기서, 반응자는 또한 배경의 2배보다 약간 더 높은 증식 반응을 보였다. 이는 인간 대상체에 대하여 예상되는 폴리펩티드 86 T41G의 더 낮은 면역원성을 나타낸다. IL-2 검정을 통해 T 세포 반응 검정 결과를 확인할 수 있다.

폴리펩티드 86 T41G를 또한 A베타42 섬유, NAC 섬유 및 tau-mtbr 섬유에의 결합에 대하여 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하였다.

섬유 및 ELISA 플레이트 제조. Aβ42 펩티드 (r펩티드 A-1002-2)를 와동시켜 헥사플루오로이소프로판올에 용해시키고, 18시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 분취물을 진공 건조시키고, -20℃에서 보관하였다. 100 ug의 Aβ42 단량체를 20 ㎕의 DMSO에 용해시키고, 와동시켜 용해시키고, 10 mM HCl 용액 중에 80 μM로 희석시켰다. Aβ42 펩티드 용액을 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시키고, ThT 형광 검정으로 섬유 형성을 확인하였다.

노인성 플라크의 비-아밀로이드 베타 성분 (NAC)은 파킨슨병의 홀마크인 응집물인 알파-시누클레인의 응집된 단편이다. NAC 펩티드 (바켐(Bachem) H2598)를 600 uM으로 20 mM NaHCO₃에 용해시키고, 1시간 동안 4℃에서 100,000xg로 원심분리하였다. 상청액을 2 N HCl로 중화시키고, 10 mM HCl과 1:1로 혼합하였다. 펩티드를 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시키고, ThT 형광 검정으로 섬유 형성을 확인하였다.

문헌 [Frost et al. J Biol Chem. 2009 May 8;284(19):12845-52]에 따라 Tau의 미세소관 결합부를 포함하는 섬유 (Tau-mtbr 섬유)를 제조하였다. 간략하면, 40 uM의 tau-mtbr 단백질을 40 uM 저분자량 헤파린 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), BP2524) 및 2 mM DTT와 함께 37℃에서 3일 동안 인큐베이션시켰다. ThT 형광 검정으로 원섬유 형성을 확인하였다.

섬유를 PBSA-0.02% 중에서 1 μM로 희석시키고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 맥시소르프 눈크 이뮤노플레이트 ELISA 플레이트 (써모피셔(ThermoFisher) 카탈로브 번호 442404) 상에 건식으로 코팅시켰다. 웰을 실온에서 1시간 동안 슈퍼블록(Superblock) (써모피셔 카탈로브 번호 37515) 중에서 200 ㎕/웰로 차단하고, PBST-0.05% 중에서 세척하였다.

결합 검정 및 결과. 서열식별번호: 1의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 86 T41G를 50 및 200 nM로 따로따로 섬유 ELISA에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. TBST-0.05%; 1% 밀크 블록 (랩사이언티픽(LabScientific) 카탈로그 번호 732-291-1940) 중 1:2500로 염소 항-인간 IgG Fc 단편 특이-HRP (잭슨 랩스 카탈로그 번호 109-035-008)와 함께 실온에서 45분 동안 인큐베이션시키기 전에 웰을 PBST-0.05% 6x200 ㎕ 중에서 세척하였다. 웰당 50 ul TMB 용액 (시그마 T0440)을 첨가하기 이전에 4x200 ul TBST-0.05%, 2x200 ul PBS 중에서 플레이트를 세척하였다. 8분 동안 방치하여 반응이 전개되도록 하고, 웰당 50 ㎕ 2 N HCl을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 테칸(Tecan) 플레이트 판독기 (인피니트 M1000프로(Infinite M1000Pro))에서 450 nm에서의 흡광도를 기록하였다.

그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)으로 계산된 삼중 웰의 평균 + 표준 편차로부터 데이터 점을 취하였다. 각 기질에 대한 폴리펩티드 없이 인큐베이션된 웰 중에서의 평균 흡광도를 감산함으로써 배경에 대하여 값을 보정하였다.

도 11에 제시된 바와 같이, 폴리펩티드 86 T41G는 서열식별번호: 1의 폴리펩티드와 비교하였을 때, 동일하거나, 그보다 더 높은 친화도로 Aβ42m NAC 및 tau-mtbr 섬유에 결합한다.

본 발명자들은 또한 단지 추정 글리코실화 부위를 제거하기 위해 변형된 하기 서열식별번호: 1의 변이체를 유사한 프로토콜에 의해 구축하였다 (치환은 괄호 안에 명시):

폴리펩티드 200 (N39A) 폴리펩티드 202 (T41M) 폴리펩티드 204 (T41H)

폴리펩티드 201 (N39Q) 폴리펩티드 203 (T41W) 폴리펩티드 205 (T41V)

폴리펩티드 206 (T41I) 폴리펩티드 211 (T41F) 폴리펩티드 216 (T41A)

폴리펩티드 207 (T41L) 폴리펩티드 212 (T41D) 폴리펩티드 217 (T41G).

폴리펩티드 208 (T41R) 폴리펩티드 213 (T41E)

폴리펩티드 209 (T41K) 폴리펩티드 214 (T41Q)

폴리펩티드 210 (T41Y) 폴리펩티드 215 (T41N)

실시예 10: 폴리펩티드 217 및 서열식별번호: 1의 약동학적 성질 (PK) 연구

동물 처리 및 샘플 수집. C57Bl6 마우스 (8 - 12 wks; 힐톱 랩 애니멀즈(Hilltop Lab Animals))에 사용된 서열식별번호: 1의 폴리펩티드 (n=22) 또는 폴리펩티드 217 (n=22)을 20 mg/kg의 단일 용량으로 복강내로 투여하였다. 서열식별번호: 1의 폴리펩티드를 22마리의 마우스에 1회 (20 mg/kg, i.p.) 투여하였다. 폴리펩티드 217을 22마리의 마우스로 이루어진 별개의 세트에 1회 (20 mg/kg, i.p.) 투여하였다. 상이한 시점 (투약 후 0 h, 6 h, 9 h, 12 h, 1 d, 3 d, 7 d 및 14 d)에 각 동물로부터 1회에 걸쳐 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플로부터 혈장을 단리시키고, 100 ㎕ 분취량으로 보관하고, 모든 후속 분석에 사용하였다. 혈액 수집 후, 마우스를 안락사시키고, PBS를 이용하여 경심관류로 관류시키고, 그의 뇌를 수확하였다. 뇌를 2등분하고, 각각의 반구를 입쪽, 꼬리쪽, 해마 및 소뇌 부분으로 추가로 절개하였다. 혈장을 약동학적 성질 분석을 위해 인터테크(Intertek: 미국 캘리포니아주 샌디에고)로 수송하여 보냈고, 좌측 전두 피질은 PK 분석을 위해 케임브리지 바이오메디컬(Cambridge Biomedical: 미국 매사추세츠주 보스톤)로 수송하여 보냈다.

혈장 ELISA 분석. 분석된 모든 표준 및 샘플을 실온 ("RT")에서 30 min 동안 217 mM 아세트산에 노출시킨 후, (1:1.5 v/v 1M 트리스 pH 9.5:샘플)에서 중화시켰다. 산성 해리 단계가 불용성 분획 중에 존재하는 폴리펩티드를 가용화시켰다.

샌드위치 ELISA 검정을 사용하여 혈장 중 폴리펩티드의 수준을 측정하였다. 맥시소르프™ 플레이트를 4℃에서 밤새도록 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 중에서 스톡 (3.7 ㎍/mL, 0.37 ㎍/웰)으로부터 1:1,000의 희석률로 토끼 항-M13 (에이비캠(Abcam): ab6188)으로 코팅시켰다. 플레이트를 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS ("PBST")로 3회에 걸쳐 세척하고, 37℃에서 2 h 동안, 이어서, RT에서 1 h 동안 PBS 중 1% 밀크로 차단하였다. 플레이트를 다시 PBST로 3회에 걸쳐 세척한 후, 샘플 또는 표준을 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 PBST로 3X 세척하고, RT에서 30 min 동안 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG (중쇄 & 경쇄, 베델(Bethel): A80-219P; 1:10,000)와 함께 인큐베이션시켰다. 웰을 PBST로 3X 세척한 후, 플레이트를 RT에서 TMB 기질로 발색시켰다. 표준의 최고 A₄₅₀이 0.6 - 0.8이 된 후, 반응을 정지시켰다. 450 nm에서 판독된 흡광도에서 650 nm에서의 참조 흡광도를 감산하여 폴리펩티드 수준을 정량화하였다. 1:20, 1:300 및 1:3,000의 희석률로 혈장을 분석하였고; 상기 희석률에서는 어떤 매트릭스 개입도 관찰되지 않았다. 결과는 하기 표 15에 제시되어 있다.

<표 15>

혈장 약동학적 성질 파라미터.

뇌 ELISA 분석. 뇌 조직 (좌측 전두 피질)을 트립 퓨어 M-바이오 등급(trip Pure M-Bio Grade) 비디드 튜브 및 프리셀리스024 용해 균질기(Precellys024 Lysis Homogenizer)를 사용하여 냉 PBS 중에서 균질화시켰다 (20 sec 동안 5,000 RPM으로 2회, 균질화 사이클 사이에는 5 sec 간격을 두고 수행). 균질액을 4℃에서 5 min 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 새 튜브로 보내고, 모든 후속 분석을 위해 사용하였다. 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정용 키트를 사용하여 뇌 용해물의 내용물을 측정하였다. 용해물은 1:2 희석률로 사용하였다.

샌드위치 ELISA 검정을 사용하여 뇌 중 폴리펩티드의 수준을 측정하였다. 맥시소르프™ 플레이트를 4℃에서 밤새도록 카르보네이트 완충제 중에서 1:1,000 (3.7 ㎍/mL, 0.37 ㎍/웰)로 토끼 항-M13 (에이비캠: ab6188)으로 코팅시켰다. 플레이트를 PBST로 3X 세척하고, 37℃에서 2 h 동안, 이어서, RT에서 1 h 동안 PBS 중 1% 밀크로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 3x 세척하고, 샘플 또는 표준을 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 PBST로 3x 세척한 후, 웰을 RT에서 30 min 동안 HRP-표지된 당나귀 항-인간 IgG (중쇄 & 경쇄, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch): 709-035-149; 1:10,000))와 함께 인큐베이션시켰다. PBST로 3x 세척한 후, 플레이트를 RT에서 15 min 동안 TMB 기질로 발색시켰다. 반응을 정지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 뇌 중의 폴리펩티드 수준을 용해물의 단백질 함량에 대한 상대적인 값으로 나타내었다. 결과는 하기 표 16에 제시되어 있다.

<표 16>

뇌 약동학적 성질파라미터

SEQUENCE LISTING <110> NEUROPHAGE PHARMACEUTICALS, INC. <120> POLYPEPTIDES COMPRISING A MODIFIED BACTERIOPHAGE G3P AMINO ACID SEQUENCE LACKING A GLYCOSYLATION SIGNAL <130> 12236.0007-00304 <140> <141> <150> 62/087,052 <151> 2014-12-03 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn 20 25 30 Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile 50 55 60 Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro 85 90 95 Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro 100 105 110 Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg 130 135 140 Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Gln Gly Thr Asp 145 150 155 160 Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met 165 170 175 Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser 180 185 190 Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser 195 200 205 Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Ala Met Val Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 260 265 270 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 275 280 285 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 290 295 300 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 305 310 315 320 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 325 330 335 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 340 345 350 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 355 360 365 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 370 375 380 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 385 390 395 400 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 405 410 415 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 420 425 430 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 435 440 445 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 450 455 460 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 465 470 475 480 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 2 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn 20 25 30 Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly 35 40 45 Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile 50 55 60 Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro 85 90 95 Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro 100 105 110 Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg 130 135 140 Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Phe Thr Gln Gly Thr Asp 145 150 155 160 Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met 165 170 175 Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser 180 185 190 Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser 195 200 205 Asp Leu Pro Gln Pro Pro Ala Asn Ala Gly Gly Glu Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 245 250 255 Ala Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 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tactttcatg tttcagaata ataggttccg aaataggcag ggggcattaa 1080 ctgtttatac gggcactttt actcaaggca ctgaccccgt taaaacttat taccagtaca 1140 ctcctgtatc atcaagagcc atgtatgacg cttactggaa cggtaaattc agagactgcg 1200 ctttccattc tggctttaat gaggatccat tcgtttgtga atatcaaggc caatcgtctg 1260 acctgcctca acctcctgcc aatgctggcg gcgagtctgg tggtggttct ggtggcggct 1320 ctgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt ctgagggtgg cggctctgag ggaggcggtt 1380 ccggtggtgg ctctggttcc ggtgccagat ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 1440 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 1500 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 1560 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 1620 agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1680 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1740 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1800 ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1860 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1920 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc 1980 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcacg 2040 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatgagtgc 2100 tagctggcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 2160 gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 2220 aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 2280 ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggaattaat 2340 tctaaaatac agcatagcaa aactttaacc tccaaatcaa gcctctactt gaatcctttt 2400 ctgagggatg aataaggcat aggcatcagg ggctgttgcc aatgtgcatt agctgtttgc 2460 agcctcacct tctttcatgg agtttaagat atagtgtatt ttcccaaggt ttgaactagc 2520 tcttcatttc tttatgtttt aaatgcactg acctcccaca ttcccttttt agtaaaatat 2580 tcagaaataa tttaaataca tcattgcaat gaaaataaat gttttttatt aggcagaatc 2640 cagatgctca aggcccttca taatatcccc cagtttagta gttggactta gggaacaaag 2700 gaacctttaa 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gtcacgcgcc tgtagcgcca gcgtgttgtg aaatgggggc ttgggggggt 3600 tggggccctg actagtcaaa acaaactccc attgacgtca atggggtgga gacttggaaa 3660 tccccgtgag tcaaaccgct atccacgccc attgatgtac tgccaaaacc gcatcatcat 3720 ggtaatagcg atgactaata cgtagatgta ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat 3780 gtactgggca taatgccagg cgggccattt accgtcattg acgtcaatag ggggcgtact 3840 tggcatatga tacacttgat gtactgccaa gtgggcagtt taccgtaaat actccaccca 3900 ttgacgtcaa tggaaagtcc ctattggcgt tactatggga acatacgtca ttattgacgt 3960 caatgggcgg gggtcgttgg gcggtcagcc aggcgggcca tttaccgtaa gttatgtaac 4020 gcctgcaggt taattaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4080 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4140 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4200 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4260 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4320 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4380 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4440 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4500 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 4560 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4620 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 4680 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 4740 tcacgttaag ggattttggt catggctagt taattaacat ttaaatcagc ggccgcaata 4800 aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg taactaacat 4860 acgctctcca tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg 4920 caagtgcagg tgccagaaca tttctctatc gaa 4953 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 8 gctgtctgtg gaatgctgga ggcgttgtag tttg 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 9 caaactacaa cgcctccagc attccacaga cagc 34

Claims (37)

1. 출발 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 폴리펩티드이며, 여기서 출발 아미노산 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 1-217 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217 및 상기 아미노산 중 하기 변형: 아미노산 43-45의 VVV의 AAA로의 치환; 치환 C53W; 아미노산 96-103의 결실; 아미노산 212-214의 QPP의 AGA로의 치환; 치환 W181A, F190A 및 F194A; 아미노산 1의 결실; 아미노산 1 및 2의 결실; 및 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 중 하나 이상을 가지는 어느 것의 돌연변이체로부터 선택되고, 여기서
   (a) 출발 아미노산 서열은 추정 글리코실화 신호를 제거하기 위해 아미노산 39-41에서 변형되고;
   (b) 폴리펩티드는 아밀로이드에 결합하고/거나, 그를 분해하는 것인, 출발 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 아미노산 39-41에서의 변형이 N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 치환; N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 결실; N39와 A40 사이의 하나 이상의 아미노산의 삽입; 및 A40과 T41 사이의 하나 이상의 아미노산의 삽입으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 출발 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 변형이 N39 및/또는 T41 중 하나 이상의 아미노산 치환으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
5. 제4항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 추정 글리코실화 신호를 제거하는 변형이 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 아미노산 치환인 폴리펩티드.
6. 제5항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 추정 글리코실화 신호를 제거하는 변형이 T41G 치환인 폴리펩티드.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   (c) 폴리펩티드가 출발 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 폴리펩티드와 비교하여 감소된 면역원성을 가지고;
   (d) 변이체가 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2 또는 그의 돌연변이체의 아미노산 39-41에서의 임의의 아미노산 치환 이외의 1 내지 9개의 아미노산 치환을 가지고, 여기서 각 아미노산 치환은 하기 기술된 아미노산 치환 군으로부터 선택되고:
   

   

   
   (e) 출발 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217일 때, 1 내지 9개의 아미노산 치환 중 임의의 것은 임의적으로 하기 기술된 아미노산 치환 군으로부터 추가로 선택되는 것인 폴리펩티드:
   

   
8. 제7항에 있어서, 1 내지 9개의 아미노산 치환이 각각 하기 기술된 아미노산 치환 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드:
   

   
9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 1-217, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1-217로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 아미노산 서열이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2 또는 그의 돌연변이체의 아미노산 39-41에서의 임의의 아미노산 치환 이외의 2 내지 9개의 아미노산 치환을 가지고, 여기서 적어도 하나의 치환은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 48-56을 포함하는 에피토프 1에 존재하고; 여기서 적어도 하나의 치환은 서열식별번호: 1, 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 173-181을 포함하는 에피토프 3에 존재하는 것인 폴리펩티드.
11. 제10항에 있어서, 변이체 아미노산 서열이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2 또는 그의 돌연변이체의 아미노산 39-41에서의 임의의 아미노산 치환 이외에 단 2개의 아미노산 치환을 가지고; 여기서 치환은 하기 기술된 2개의 아미노산 치환 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드:
    

    
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변이체 아미노산 서열의 C-말단에 직접 또는 펩티드 링커를 통해 융합된 인간 또는 인간화 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 서열로 본질적으로 이루어진 것인 폴리펩티드.
13. 제12항에 있어서, 면역글로불린 Fc 폴리펩티드 서열이 인간 IgG의 Fc 부분인 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 펩티드 링커 및 인간 IgG의 Fc 부분의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 218-488, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 218-486으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
15. 출발 아미노산 서열이 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2로부터 선택되고, 출발 아미노산 서열이 추정 글리코실화 신호를 제거하기 위해 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서 변형되고, 여기서 변형은 N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 아미노산 치환; N39, A40 및/또는 T41 중 하나 이상의 결실; N39와 A40 사이의 하나 이상의 아미노산의 삽입; 및 A40과 T41 사이의 하나 이상의 아미노산의 삽입으로부터 선택되는 것인, 출발 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 폴리펩티드.
16. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 추정 글리코실화 신호를 제거하는 변형이 N39 및/또는 T41 중 하나 이상의 아미노산 치환으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
17. 제16항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 추정 글리코실화 신호를 제거하는 변형이 T41G, T41W, T41H, T41V, T41I, T41L, T41R, T41K, T41Y, T41F, T41D, T41E, T41Q, T41N, 및 T41A로부터 선택되는 아미노산 치환인 폴리펩티드.
18. 제17항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 추정 글리코실화 신호를 제거하는 변형이 T41G 치환인 폴리펩티드.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 아미노산 서열이 서열식별번호: 2이고, 폴리펩티드가 서열식별번호: 2의 아미노산 39-41에서의 임의의 아미노산 치환 이외에 하기 중 임의의 것으로부터 선택되는 2개의 아미노산 치환을 가지는 것인 폴리펩티드:
    

    
20. 제19항에 있어서, 폴리펩티드가 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가지는 것인 폴리펩티드.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
22. 제21항에 있어서, 환자의 혈류 내로의 주사 또는 주입용으로 제제화되는 제약 조성물.
23. 제21항에 있어서, 뇌 또는 CNS로의 직접 투여용으로 제제화되는 제약 조성물.
24. 아밀로이드 또는 tau 단백질 응집물 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 또는 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 아밀로이드 또는 tau 단백질 응집물을 감소시키는 방법.
25. 제24항에 있어서, 환자가 아밀로이드 또는 tau 단백질 응집물의 존재와 연관된 신경변성 질환의 증상을 보이는 것인 방법.
26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 환자가, 플로르베타피르 바이오마커가 양전자 방출 단층촬영법에서 영상화제로서 사용되는 경우, 상기 바이오마커에 대하여 양성 반응을 보이는 것인 방법.
27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 조기 발병 알츠하이머병, 후기 발병 알츠하이머병, 및 전조성 알츠하이머병을 비롯한, 알츠하이머병, 파킨슨병, SAA 아밀로이드증, 시스타틴 C, 유전성 아이슬란드 증후군, 노망, 다발성 골수종, 쿠루병, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 게르스트만 슈트라우슬러 샤인커병(Gerstmann-Straeussler-Scheinker disease: GSS), 치명적 가족성 불면증 (FFI), 스크래피, 및 소 해면상 뇌염 (BSE)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 프리온 질환; 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수소뇌성 실조증 (SCA1, SCA3, SCA6, 또는 SCA7), 헌팅톤병, 치상핵적핵-담창구시상하핵 위축, 척추 및 연수 근육 위축, 유전성 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 아밀로이드증, 영국/덴마크 치매(British/Danish dementia), 가족성 뇌병증, 근위축성 측삭 경화증/파킨슨증-치매 복합증, 은 친화성 그레인 치매, 피질기저 변성, 권투 선수 치매, 석회화를 동반한 미만성 신경원 섬유 엉킴, 다운 증후군, 게르스트만-슈트로이슬러 샤인커병, 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 근긴장성 이영양증, 니이만-픽병(Niemann-Pick disease) C형, 신경원 섬유 엉킴을 동반한 비-괌(Non-Guamanian) 운동 뉴런 질환, 픽병, 뇌염 후 파킨슨증, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 진행성 피질하부 신경아교증, 진행성 핵상마비, 아급성 경화성 범뇌염, 엉킴 단독 치매, 전측두엽 변성 (FTLD), 및 하기의 임상적 증상: 행동 변이 FTD (bvFTD), 진행성의 유창하지 않은 실어증 (PNFA), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반한 전측두엽 치매, 진행성 핵상마비 (PSP), 및 의미 치매 (SD) 중 하나 이상의 것을 보이는 환자를 포함하는 전측두엽 치매 (FTD)로부터 선택된 신경변성 질환을 앓는 것인 방법.
28. 제27항에 있어서, 신경변성 질환이 파킨슨병, 알츠하이머병, 또는 헌팅톤병인 방법.
29. 제28항에 있어서, 신경변성 질환이 알츠하이머병인 방법.
30. 제27항에 있어서, 환자가 크로이츠펠트-야콥병, 쿠루병, 치명적 가족성 불면증, 또는 게르스트만 슈트로이슬러 샤인커 증후군으로부터 선택되는 프리온 매개 질환을 앓는 것인 방법.
31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열.
32. 제31항에 있어서, 폴리펩티드 코딩 서열과 프레임내에서 융합된 포유동물 신호 서열을 추가로 코딩하는 핵산 서열.
33. 제32항에 있어서, 핵산 서열이 서열식별번호: 6인 핵산 서열.
34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 핵산 서열은 벡터에서 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되어 있는 것인 벡터.
35. 제34항의 벡터를 함유하는 숙주 세포.
36. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질을 발현시키는 단계; 및 발현된 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법.
37. 폴리펩티드가 발현될 수 있도록 허용하는 데 충분한 조건하에서 제35항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 발현된 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법.

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