KR20080109739A - 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들 - Google Patents

증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들 Download PDF

Info

Publication number
KR20080109739A
KR20080109739A KR1020087021042A KR20087021042A KR20080109739A KR 20080109739 A KR20080109739 A KR 20080109739A KR 1020087021042 A KR1020087021042 A KR 1020087021042A KR 20087021042 A KR20087021042 A KR 20087021042A KR 20080109739 A KR20080109739 A KR 20080109739A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fusion protein
protein
rhuepo
erythropoietin
epo
Prior art date
Application number
KR1020087021042A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101235124B1 (ko
Inventor
하이타오 왕
용 두
루이 장
징 수
롱빈 리우
Original Assignee
노바젠 홀딩 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노바젠 홀딩 코포레이션 filed Critical 노바젠 홀딩 코포레이션
Publication of KR20080109739A publication Critical patent/KR20080109739A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101235124B1 publication Critical patent/KR101235124B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

면역글로블린 펩티드 부분에 연결된 인간 에리스로포이에틴 펩티드 부분을 포함하여 구성되는 재조합 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질은, 자연적으로 발생하거나 재조합형인 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 연장된 체내 반감기를 가진다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 이 단백질은 천연 인간 에리스로포이에틴보다 적어도 3 배 더 긴 체내 반감기를 가진다. 이 융합 단백질은 또한, 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 증강된 에리스로포이에틴 생활성을 나타낸다. 하나의 구체예에서, 이 융합 단백질은, 인간 에리스로포이에틴(EPO) 분자의 전체 펩티드 서열과 인간 면역글로블린 IgG1의 Fc 프레그먼트의 펩티드 서열을 포함하여 구성된다. 이 융합 단백질 내의 Fc 프레그먼트는 인간 면역글로블린 IgG1의 힌지 구역, CH2 및 CH3 도메인들을 포함한다. 체내로 투여되었을 때 외계 펩티드 연결자들을 피하고 면역성 반응의 위험을 줄이기 위해, EPO 분자가 Fc 프레그먼트에 직접 연결될 수 있다. 하나의 구체예에서, 힌지 구역은 아미노산 (6)에 비-시스테인 잔기를 가지는 인간 Fc 프레그먼트 변체이다. 본 발명은 또한, 이 융합 단백질 및 감염된 세포주들을 인코딩하는 핵산 및 아미노산 서열들, 그리고 이 융합 단백질을 생성하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 나아가, 이 융합 단백질을 포함하여 구성되는 의약 조성물, 그리고 예를 들어, 치료가 필요한 환자에 있어서의 적혈구 생성을 자극하기 위해, 이 융합 단백질 및/또는 의약 조성물들을 사용하는 방법을 포함한다.

Description

증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ＥＰＯ-ＦＣ 융합 단백질들{RECOMBINANT HUMAN EPO-FC FUSION PROTEINS WITH PROLONGED HALF-LIFE AND ENHANCED ERYTHROPOIETIC ACTIVITY IN VIVO}
관련 출원
본 출원은, 그 내용이 본 명세서의 참고 문헌을 이루는, 2006년 1월 27일에 출원된 미국 특허 출원 제 11/340,661 호에 관한 것이며 이에 대해 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 출원은, 인간 에리스로포이에틴(erythropoietin) 융합 단백질들(fusion proteins)에 관한 것이다.
조혈 성장 인자 족의 한 구성원인 인간 에리스로포이에틴(EPO)은, 감소된 혈중 산소 가용성(availability)에 기인하는 조직 저산소증(hypoxia)에 따라, 성인의 신장과 태생기 간(fetal liver)에서 주로 합성된다[1]. EPO의 주 기능은, 헤모글로빈 및 성숙한 RBC들의 합성을 자극하기 위해, 골수 내의 특정한 적혈구(RBC) 원종 들(progenitors)과 전구체들(precursors)에 직접 작용하는 것이다. 그것은 또한, RBC들의 분열, 분화 및 성숙을 조절한다. 자연적으로 발생하는 EPO의 아미노-산 서열을 갖는 재조합 EPO가 생산되어 신장 기능 고장, 암 및 기타 병리학적 상태들과 관련된 빈혈을 치료하는데 승인되어 왔다[2]. 에리스로포이에틴 성질들에 더하여, 최근의 연구 보고서들 [3]은, EPO가 또한, 뉴론들과 같은 비-골수 세포들에도 작용한다는 것을 나타내고 있으며, 이는 중추 신경계(CNS)와 다른 기관들/계들에서의 EPO의 다른 생리학적/병리학적 기능들이 가능할 수 있음을 나타내는 것이다. EPO 수용체들이 다른 많은 기관들에서 발견되기 때문에, EPO는 항-사멸제(anti-apoptotic agent)로 작용하는 것과 같은 여러 가지 생물학적 효과를 가질 수 있다.
인간 EPO는 분자량이 30.4 킬로-달톤인 당단백질이다. 탄수화물이 그것의 전체 질량의 대략 39%를 차지한다. EPO 유전자는 염색체 7ql 1-22 상에 위치하며, 5 개의 엑손들과 4 개의 인트론들을 갖는 5.4kb 구역에 걸쳐 있다(span)[4]. EPO의 전구체는 193 개의 아미노산들로 구성된다. 번역후 변형(post-translational modification)에 의한 선도 서열(leader sequence)과 최후 아미노산 Arg의 분리가 165 개 아미노산들을 갖는 성숙한 EPO를 제공한다. Asn 24, Asn38, Asn83에서의 3 개의 N-링크 사이트들과 Serl26에서의 1 개의 O-링크 사이트를 갖는 당화(glycosylation)가 EPO의 생합성, 3차 구조 및 체내 생활성(bioactivity)에 결정적인 역할을 한다[5]. EPO는 에리스로포이에틴 수용체에 결합하여(binding) 72-78 킬로달톤의 분자량을 갖는, 당화되고 인산화된(phosphorylated) 막횡단 폴리펩티드(transmembrane polypeptide)로서 기능한다. 이러한 결합이, JAK2/STAT5 시스템, G-단백질, 칼슘 채널, 및 키나아제들과 같은 몇몇 신호 전달 경로들의 활성화를 이끄는 수용체들의 동형이중결합(homodimerization)을 일으킨다. EPO 단백질의 두 분자들은, 최적의 수용체 활성화를 달성하기 위해, 하나의 수용체 분자에 동시에 결합하는 것이 필요하다[6].
인간 치료용으로 승인된 최초의 조혈 성장 인자로서의 재조합 인간 EPO(rHuEPO)는, 만성 신부전(chronic renal failure), 암(일차적으로는, 화학치료-관련 빈혈), 자가면역 질환들, AIDS, 수술, 골수 이식 및 골수형성이상증후군들(myelodysplastic syndromes) 등으로부터 초래되는 빈혈의 치료에 사용되어 왔다. 흥미롭게도, 최근의 연구들은 또한, rHuEPO가 비-혈액계 기능들을 가지고 있으며, 뇌허혈현상(cerebral ischemia), 뇌 외상(brain trauma), 염증성 질환들 및 퇴행성 신경 장애(neural degenerative disorders)에 대한 신경보호약(neuroprotective drug)으로 사용될 잠재성을 보인다는 것을 발견하였다[7].
현재로서는, 세 종류의 rHuEPO 또는 rHuEPO 유사물, 즉, rHuEPO 알파, rHuEPO 베타, 및 다르베포에틴 알파(darbepoetin alpha)가 상업적으로 구입가능하다[8]. 이 세가지 재조합 단백질들은 동일한 에리스로포이에틴 수용체에 결합하지만, 구조, 당화도(degree of glycosylation), 수용체-결합 친화성(receptor-binding affinity) 및 체내 대사에서 상이하다. 1980년대에 rHuEPO-알파가 처음으로 소개된 이래로, 임상의들은 이 약의 빈번한 투여/주사 필요성을 중대한 단점으로 바로 인식하였다. 정맥이나 피하에 투여된 rHuEPO 알파와 rHuEPO 베타의 평균 체내 반감기는 각각 겨우 8.5와 17 시간이다[9, 10]. 그러므로, 환자들은 매일, 주 2회 또는 주 3회의 주사 스케쥴을 필요로 하며, 이것은 환자와 의료 제공자 모두에게 부담을 주는 것이다. 이에 따라, 더 긴 체내 반감기와 증강된 에리스로포에틴 활성을 가지는 재조합 EPO 유사물들에 대한 개발 필요성이 오랫동안 제기되어 왔다.
그것의 체내 대사를 지연하거나 치료적 성질들을 개선시키기 위해, 천연 EPO 단백질의 구조를 유전학적으로 변화시키거나 화학적으로 변성시키려는 시도들이 종래 기술상 행해져 왔다. 예를 들어, EPO 분자 상의 시알산(sialic acid)-함유 탄수화물들의 양과 그것의 대사 및 기능적 활성 사이에는 직접적인 상관관계가 있는 것으로 보인다. 이에 따라, EPO 분자의 이 탄수화물 함량을 증가시키면 반감기가 더 길어지고 체내 활성이 개선된다[11, 12]. Amgen은 rHuEPO 유사물인 다르베포에틴 알파가, rHuEPO보다 두 개 더 많은, 5 개의 N-링크된 탄수화물 사슬들을 포함하도록 설계하였다.
다르베포에틴 알파는 또한 NESP(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein)으로 알려져 있으며, 상표 Aranesp™으로 판매되고 있다. 다르베포에틴 알파는 천연 인간 EPO와는 5 개의 위치에서 상이한데(Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro90Thr), 이것이 아스파라진 잔기(asparagines residue) 위치들(30 및 88)에서의 두 개의 추가적인 N-링킹된 올리고사카라이드들의 부착을 가능케 한다. JAK-2 키나제 및 그와 동일한 세포내 분자들 Ras/MAP-k, P13-k 및 STAT-5에 의한 티로신 인산화반응을 수반하는 세포내 신호전달(intracellular signaling)을 일으키기 위해, 다르베포에틴 알파는 천연 EPO와 동일한 방식으로 EPO 수용체에 결합한 다. 증가된 탄수화물 함량 때문에, 동물과 인간 모두에서 다르베포에틴 알파의 반감기는 rHuEPO-알파보다 거의 세배 길다(25.3 시간 대 8.5 시간) [9]. 다르베포에틴 알파(Aranesp™)는 또한 천연으로 발생하거나 재조합형의 인간 EPO와 비교할 때 체내에서 증강된 생활성(bioactivity)을 나타내는 것으로 보이고[13], FDA에 의해 2세대 rHuEPO 약으로 승인되었으며, 이 약은 rHuEPO를 주 2-3회 주사한 것과 동일한 치료 효과를 달성하는데 주 1회 투여될 필요가 있을 뿐이다[10, 14, 15].
EPO의 반감기를 연장시키기 위한 다른 시도들은 폴리에틸렌 글리콜 등과의 화학적인 접합(conjugation) (PEGylation: PEG화)을 통해 EPO 단백질의 분자량을 증가시키는데 초점을 맞춰 왔다. PEG화된 EPO는 훨씬 더 큰 분자량을 가지며 순환시에 제거되지 않게 보호되고 그러므로 더 긴 플라즈마 반감기를 가진다[16]. 그러나, PEG화가 단백질 구조를 바꾸어 EPO 족의 기능과 특이성의 예상치못한 변화를 초래할 수 있다. EPO 분자를 캐리어 단백질(인간 알부민)에 연결시키거나, 연결 펩티드들(3- 내지 17-아미노산들)을 사용하거나 화학적인 가교제들에 의해 두 개의 전체(complete) EPO 분자들의 동형이중결합을 형성시키는 것과 같은 다른 방법으로 EPO의 분자량을 증가시키는 것도 또한 보고된 바 있다[17, 18, 19. 20]. 이러한 모든 방법들이 반감기를 연장시키고 EPO의 활성을 증가시키는데 어느 정도 성공을 거둔 반면에, 본 출원에 설명된, 융합 단백질 내에 인간 EPO 분자를 인간 면역글로블린(IgG)의 Fc 프레그먼트(Fc fragment)와 결합시키는 것은 독특한 장점들을 달성케 한다.
인간 면역글로블린(IgG)은 이황화 결합들에 의해 공유적으로 연결된 4 개의 폴리펩티드들로 구성된다(가벼운 사슬 및 무거운 사슬의 두 개의 동일한 복제물임). 파파인(papain)에 의한 IgG 분자의 단백질분해(proteolysis)로 인해 두 개의 Fab 프레그먼트들과 하나의 Fc 프레그먼트가 생성된다. Fc 프레그먼트는 이황화 결합들에 의해 함께 연결된 두 개의 폴리펩티드들로 구성된다. 각 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 하나의 힌지 구역(hinge region), 하나의 CH2 도메인(CH2 domain) 및 하나의 CH3 도메인(CH3 domain)으로 구성된다. Fc 프레그먼트 구조는 인간 면역글로블린의 모든 서브타입(subtype)들 간에 거의 동일하다. IgG는 인간 혈액 내에서 가장 많은 단백질들 중 하나이며, 인간 혈청(serum) 내의 전체 면역글로블린들 중 70% 내지 75 %를 차지한다. 순환 중인 IgG의 반감기는 다섯 가지 유형의 모든 면역글로블린들 중에서 가장 길며 21일에 이를 수 있다.
현대의 바이오-공학 기술은, 사이토카인들 및 가용성 수용체들같은 치료용 단백질 프레그먼트들과 인간 IgG의 Fc 프레그먼트로 구성되는 융합 단백질들의 생성에 성공적으로 적용되어 왔다[21, 22, 23, 24]. 이 융합 단백질들은, 그들의 생물학적 및 치료적 성질들을 보유하면서도, 상당히 더 긴 체내 반감기를 가진다. 이제까지, Fc 프레그먼트를 포함하여 구성되는 두 가지 융합 단백질들이 생물의약들(biomediines)로서 성공적으로 개발되어, 류머티즘성 관절염 및 만성 반상 건선의 치료용으로 FDA에 의해 승인되었다 [25, 26].
화학적인 가교나 폴리펩티드에 의해 연결된 두 개의 EPO 분자의 다이머들(dimers: 이량체)이 증강된 체내 활성과 연장된 반감기를 나타낸다는 것이 종래 기술상 알려져 있다[17, 19]. 증강된 활성은 하나의 수용체에 대한 EPO 다이머의 더 효율적인 결합 때문일 수 있고, 연장된 체내 반감기는 다이머 단백질의 더 큰 크기 때문일 수 있다. 그러나, 화학적인 가교 과정은 효율적이 않으며 조절이 어렵다. 게다가, EPO의 다이머 내의 연결 펩티드는 EPO 분자의 3차원 구조를 바꿀 수 있으며, 펩티드 자체가 체내 면역 반응을 자극할 수 있다. 특히 신장병 환자들에 대한 EPO 대체 치료(EPO replacement therapy)는 평생 동안 이뤄지므로, 이러한 단점들은 EPO 다이머들의 치료적 잠재성을 훼손한다.
그러므로, 상당히 더 긴 체내 반감기와 증강된 활성을 갖지만, 면역 성질들이 전혀 증가되지 않는 EPO 유사물에 대한 필요가 제기되어 왔다.
발명의 요약
본 발명에 따라, 면역글로블린 펩티드 부분에 연결된 인간 에리스로포이에틴 펩티드 부분을 포함하여 구성되는 재조합 융합 단백질이 기술된다. 이 융합 단백질은, 자연적으로 발생하거나 재조합형의 천연 인간 에리스로포이에틴과 비교하여 연장된 체내 반감기를 가진다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 이 단백질은 천연 인간 에리스로포이에틴보다 세배 더 긴 체내 반감기를 가진다. 이 융합 단백질은 또한, 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 증강된 에리스로포이에틴 생활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 면역글로블린 펩티드 부분은 IgGl 프레그먼트와 같은 Fc 프레그먼트이다. 이 Fc 프레그먼트는 CH2 및 CH3 도메인들과 하나의 힌지 구역을 포함한다. EPO 펩티드 부분은 힌지 구역에 직접 연결될 수 있다. 바람직하게는, 힌지 구역은 길이가 적어도 9 개인 아미노산들이다. 하나의 구체예에서, EPO 펩티드 부분은 그것의 C 말단 근처에 하나의 시스테인 잔기(residue)를 가지며, 힌지 구역은 EPO 펩티드 부분에 가장 가까이 위치하는 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 이들 두 시스테인 잔기들은 적어도 12 개의 아미노산만큼의 간격을 두고 있다. 하나의 구체예에서, EPO 펩티드 부분은 면역글로블린 부분에 직접 연결된 전체 EPO 분자를 포함하여 구성될 수 있다(즉, EPO와 면역글로블린 부분들 사이에는 외부 펩티드 연결자들(linkers)이 개입되어 있지 않다).
본 발명은 또한, 다수의 유닛들의 본 발명의 융합 단백질을 포함하여 구성되는 다량체 단백질 구조체들(multimeric protein constructs)에 관한 것이다. 예를 들어, 두 개의 융합 단백질들이, 그 단백질들의 힌지 구역들이 이황화 결합들에 의해 연결된(joined), 하나의 다이머로 어셈블될 수 있다. 이 다이머는 IgG 분자의 전체적인 형태를 가지며, 자유 EPO 분자들보다 더 안정하다.
본 발명은 또한, 융합 단백질 및 감염된 세포주들(cell lines)을 인코딩하는 핵산 및 아미노산 서열들 그리고 이 융합 단백질을 생산하는 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이 융합 단백질을 포함하여 구성되는 의약 조성물들 그리고 예를 들어, 치료가 필요한 환자의 적혈구 생성(erythropoiesis)을 자극하기 위해 이 융합 단백질 및/또는 이 의약 조성물들을 사용하는 방법들에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 구체예들을 설명하되, 한정하는 방식으로 해석되지 않도록 의도된 도면들 중에서,
도 1A는, 본 발명의 재조합 인간 EPO-Fc 융합 단백질(rHuEPO-Fc)의 전체 구조를 나타내는 개략도이고,
도 1B는, rHuEPO-Fc 단백질의 추론된(deduced) 아미노-산 (aa) 서열 및 뉴클레오티드 서열을 보여주는 서열 목록이다. DNA의 전체 길이는 1281 bp이다. 추론된 단백질 서열 내의 426 개의 아미노산들은 신호 펩티드에 대한 27 개의 aa와 전체 rHuEPO-Fc 단백질에 대한 399 개의 aa를 포함한다. 전체 rHuEPO-Fc 단백질은, 인간 EPO 도메인(166aa), 힌지 구역(16aa, 밑줄친 부분임), 그리고 인간 IgGl의 Fc 프레그먼트의 CH2 및 CH3 도메인들(217aa)로 구성된다. 성숙한 rHuEPO-Fc 융합 단백질의 폴리펩티드의 계산된 분자량은 44.6kDa이며, 18.5kDa(41.4%)의 EPO 프레그먼트와 26.1kDa(58.6%)의 IgGl Fc 프레그먼트로 구성된다. 호모다이머는, 힌지 구역 내의 두 개의 시스테인 잔기들(박스 표시됨)을 통한 두 개의 이황화 결합들에 의해 형성된다. 성숙한 융합 단백질의 잔기 (172)(즉, 힌지 구역의 6번째 아미노산)에서, 천연 시스테인 잔기가 글리신(굵은 글씨)으로 대체되었다.
도 2는, rHuEPO-Fc 융합 단백질의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 배열을 삽입하고, rHuEPO-Fc 융합 단백질을 발현하는 CHO 세포들을 감염시키기 위해 사용되는 포유류 발현 플라스미드 pCDl의 구조 및 특징들을 보여주는 개략도이다.
도 3은, SDS-PAGE 분석법에 의한 비-환원 조건에서의(in non-reduced condition) 다이머 형태의 순수한 rHuEPO-Fc 단백질과, 환원 조건에서의 모노머 형 태의 순수한 rHuEPO-Fc 단백질의 사이즈들을 보여주는 SDS-PAGE 이미지이다. rHuEPO-FC를 발현하는 배양된 CHO 세포주의 상층액들(supernatants)로부터의 정제된 rHuEPO-Fc 단백질은 주로 다이머 형태로 존재하며, 비-환원 조건에서 8% Bis-Tris 겔 상에 약 180 kDa의 분자량을 가진다. 이황화 결합들을 해리시키기(break) 위한 환원 조건(10OmM 다이티오트레이톨, DTT)에서, 다이머는 75 kDa의 분자량을 갖는 동일한 두 개의 모노머 유닛들로 분리된다.
도 4A 및 4B는, rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO를 주 3회 피하 주사(s.c.: subcutaneous injection)하여 처리한 정상 생쥐(normal mice)에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 투여량-의존성(dose-dependent) 증가를 보여 주는 그래프들이다. 각 지점은 그 그룹(6 마리의 생쥐)의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 0 일의 레벨들(day 0 levels)은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다. A: rHuEPO-Fc로 처리한 생쥐. B: 천연 rHuEPO로 처리한 생쥐
도 5A 및 5B은, rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO를 주 1회 피하 주사(s.c.: subcutaneous injection)하여 처리한 정상 생쥐에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 투여량-의존성 증가를 보여 주는 그래프들이다. 각 지점은 그 그룹(6 마리의 생쥐)의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 0 일의 레벨들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다. A: rHuEPO-Fc로 처리한 생쥐. B: 천연 rHuEPO로 처리한 생쥐
도 6A 및 6B는, 12.5μg/kg의 rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO를 정맥 주사(i.v.: intravenously injection)하여 처리한 정상 생쥐에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 증가를 보여 주는 그래프들이다. 각 지점은 그 그룹(6 마리의 생쥐)의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 0 일의 레벨들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다. A: 주 1회 처리한 생쥐. B: 주 3회 처리한 생쥐
도 7은, rHuEPO-Fc, rHuEPO 또는 다르베포에틴-알파(다르베.로 약칭)를 주 1회 피하 주사하여 처리한 5/6 신장절제된 쥐들(nephrectomized rats)에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 투여량-의존성 증가를 보여 주는 그래프이다. 각 지점은 그 그룹의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 정상 대조구들은 캐리어 용액을 주사한 정상 쥐들이다. 모델 대조구들은 캐리어 용액(carrier solution)을 주사한 5/6 신장절제된 쥐들이다. 0 주의 레벨들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다. *: 처리 후 주(들).
도 8은, rHuEPO-Fc, rHuEPO 또는 다르베포에틴-알파(다르베.로 약칭)를 격주 1회 피하 주사하여 처리한 5/6 신장절제된 쥐들에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 투여량-의존성 증가를 보여 주는 그래프이다. 각 지점은 그 그룹의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 정상 대조구들은 캐리어 용액을 주사한 정상 쥐들이다. 모델 대조구들은 캐리어 용액을 주사한 5/6 신장절제된 쥐들이다. 0 주의 레벨들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다. *: 처리 후 주(들).
도 9는, 62.5μg/kg의 rHuEPO-Fc, rHuEPO 또는 다르베포에틴-알파(다르베.로 약칭)를 격주 1회 정맥 주사하여 처리한 5/6 신장절제된 쥐들에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 투여량-의존성 증가를 보여 주는 그래프이다. 각 지점은 그 그룹의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 정상 대조구들은 캐리어 용액을 주사한 정상 쥐들이다. 모델 대조구들은 캐리어 용액을 주사한 5/6 신장절제된 쥐들이다. 0 주의 레벨 들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다. *: 처리 후 주(들).
도 1OA - 1OC는, 상이한 투여량과 스케쥴로 처리한 5/6 신장절제된 쥐들에 있어서의, CFU-E 및 BFU-E의 콜로니(colony) 생성을 자극하기 위한 rHuEPO-Fc, rHuEPO 및 다르베포에틴-알파의 효능(potency)을 비교하여 보여준다. rHuEPO-Fc 및 다르베포에틴-알파(다르베.로 약칭) 처리는, CFU-E 및 BFU-E 콜로니 생성을 자극하기 위한 효능에서 유사한 투여량-의존성을 보여주었지만, rHuEPO는 효능이 덜하였다. A, 주 1회 피하 주사. B, 격주 1회 피하 주사. C, 격주 1회 정맥 주사.
도 11은, 5μg/kg의 rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO를 레서스 원숭이들(Rhesus Monkeys)에게 정맥 주사한 후에 rHuEPO-Fc 및 rHuEPO의 혈청 레벨(serum level)(원숭이 5 마리의 평균 레벨들)들을 보여주는 그래프이다.
도 12는, 와일드 타입 rHuEPO-Fc 단백질의 추론된 아미노-산(aa) 서열과 뉴클레오티드 서열을 보여주는 서열 목록이다. 서열의 상세 내용은, 하나의 천연, 와일드 타입 시스테인 잔기가 성숙한 융합 단백질의 잔기 (172)(즉, 힌지 구역의 6번째 아미노산)에 존재한다는 점을 제외하고는, 도 1에 도시한 것과 동일하다.
도 13은, rHuEPO-Fc(본 발명의 변종 융합 단백질), rHuEPO- FcC(와일드 타입 융합 단백질) 및 rHuEPO를 주 3회 피하 주사하여 처리한 정상 생쥐에 있어서의 헤모글로빈(Hb) 레벨들의 투여량-의존성 증가를 보여주는 그래프이다. 각 지점은 그 그룹(8)의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 정상 대조구는 캐리어 용액을 주사한 정상 생쥐들이다. 0 일의 레벨들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다.
도 14는, rHuEPO-Fc, rHuEPO-FcC 및 rHuEPO를 주 1회 피하 주사하여 처리한 정상 생쥐에 있어서의 헤모글로빈 (Hb) 레벨들의 투여량-의존성 증가를 보여주는 그래프이다. 각 지점은 그 그룹(8)의 평균 Hb 레벨을 의미한다. 정상 대조구는 캐리어 용액을 주사한 정상 생쥐들이다. 0 일 레벨들은 처리 전의 Hb 레벨들을 의미한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명에 대한 더 철저한 이해를 제공하기 위해, 다음의 설명을 통해 구체적인 세부 내용들이 제시된다. 그러나, 본 발명은 이러한 세부 사항들 없이도 실시될 수 있다. 다른 경우들에서, 본 발명을 불필요하게 모호하게 하는 것을 피하기 위해, 잘 알려진 구성요소들은 나타내지 않거나 자세히 기술하지 않았다. 따라서, 명세서 및 도면들은 한정적이라기보다는 설명적인 의미로 고려되어야 할 것이다.
본 출원은, 에리스로포이에틴 성질들을 갖는 신규한 융합 단백질에 관한 것이다. 본 명세서에서 rHuEPO-Fc로 부르는 이 융합 단백질은, 면역글로블린 Fc 프레그먼트에 재조합되어 연결된 인간 에리스로포이에틴(EPO) 분자를 포함하여 구성된다. 아래에서 더 논의되는 바와 같이, 이 융합 단백질은 두 개의 동일한 폴리펩티드 서브유닛들로 구성되는 다이머의 형태로 될 수 있다. 도 1A에 개략적으로 보여지는 구체예에서, 각 폴리펩티드 서브유닛은, N-말단에서 C-말단으로, 인간 EPO 분자의 폴리펩티드 서열과, 인간 면역글로블린 IgGl의 Fc 프레그먼트의 힌지 구역, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 폴리펩티드 서열로 구성된다. 두 폴리펩티드 서브유닛 들은 다이머 구조를 형성하기 위해 각자의 힌지 구역들 간의 이황화 결합들에 의해 함께 연결된다. 이에 따라 이 다이머는 IgG 분자와 같은 동일한 전체 형태(general shape)를 가지며, 아래의 실시예들에서 논의되는 EPO 분자들보다 더 양호한 안정성을 나타낸다.
이 분야의 기술자에게 명확할 것이지만, 원형(intact) 면역글로블린의 힌지 구역은 효과적인 항원-항체 결합을 위한 충분한 유연성을 단백질에 제공한다. 유사하게, 본 발명에서는, 특히 융합 단백질이 다이머 형태로 된 때에 그것의 유연성을 유지하기 위해, 힌지 구역이 rHuEPO-Fc 융합 단백질의 설계에 포함된다. 아래에서 설명되는 바와 같이, 이로 인해 생물학적 기능들을 활성화시키기 위한, rHuEPO-Fc 융합 단백질의 EPO 부분의 EPO 수용체들에게로의 정상적인 결합이 가능해진다. 다이머 형태의 rHuEPO-FC 융합 단백질은, 두 EPO 분자들을 제공함으로써 (예를 들어, 수용체 가교를 용이하게 함으로써) EPO 수용체들의 최적의 활성화를 유도할 수 있는 것으로 믿어진다.
아래에 설명된 실시예들에 제시된 바와 같이, rHuEPO-Fc 융합 단백질은 재조합 DNA 기술들을 사용하여 성공적으로 합성되어 왔다. 융합 단백질이 자연적으로 발생하거나 재조합형의 천연 인간 EPO에 비해 연장된 체내 반감기와 증강된 에리스로포이에틴 성질들을 나타내는 것으로 생쥐(mice), 쥐(rat) 및 영장류에 대한 연구에서 밝혀졌다. 본 특허 출원에서 사용되는 용어들인 "천연 인간 에리스로포이에틴" 및 "천연 인간 EPO"는 개질되지 않은 와일드 타입 구조를 가진 EPO를 의미한다. 이 분야의 기술자가 아는 바와 같이, 천연 인간 EPO는 자연적으로 발생하거나 재조합되어(예컨대, rHuEPO 알파) 생성될 수 있다. 용어 "천연 인간 EPO"는, 예컨대, 하이퍼글리코실레이션에 의해 EPO 구조가 상당히 개질된 다르베포에틴 알파와 같은 rHuEPO 유사물들을 포함하지는 않는다.
본 발명의 rHuEPO-Fc 융합 단백질의 핵산 서열은 SEQ. ID. 번호 1에 나타나 있다. 상응하는 추론된 아미노산 서열은 SEQ. ID. 번호 2에 나타나 있다. 전체 rHuEPO-Fc 융합 단백질은 길이가 399 개인 아미노산들이다. 도 1B에 보이는 바와 같이, 전체 rHuEPO-Fc 융합 단백질은 EPO 도메인(166 개 아미노산들), 힌지 구역(16 개 아미노산들, 밑줄침) 그리고 CH2 및 CH3 도메인들(217 개 아미노산들)로 구성된다. 27 개의 아미노산들로 구성되는 신호 또는 선도 펩티드 서열이 또한 도 1B에 나타나 있다. 신호 펩티드는 rHuEPO-Fc의 합성중에 분리된다(cleared). 신호 또는 선도 펩티드를 포함하여 rHuEPO-Fc의 핵산과 아미노산 서열들은 각각 SEQ. ID. 번호 3 및 SEQ. ID. 번호 4에 나타나 있다.
도 1B과 SEQ. ID. 번호 2에 가장 잘 나타나 있는 바와 같이, EPO 도메인은 그것의 C-말단 근처인 아미노산 번호 (161)에 시스테인 잔기를 가진다. 힌지 구역은 도 1B에 박스로 표시된 아미노산 번호 (178 및 179)에 2 개의 시스테인 잔기들을 포함한다. 힌지 구역 시스테인 잔기들은, 위에서 논의된 바와 같은, 호모다이머의 폴리펩티드 서브유닛들 사이에 이황화 결합들을 형성한다. 인간 IgGl 프레그먼트의 자연적으로 발생하는 힌지 구역도 또한 힌지 구역 부분의 잔기 번호 6(N-말단으로부터 측정됨)에 하나의 시스테인을 가진다. 본 발명에서, 힌지 부분의 시스테인 잔기 (6)는 비-시스테인 잔기로 대체되어 있다. 특히, 도 1B 및 SEQ. ID. 번호 2의 구체예에서, 아미노산 시스테인은 (힌지 구역의 잔기 (6)에 상응하는 rHuEPO-Fc의 아미노산 잔기 (172)에서) 글리신으로 대체되어 있다. 이 분야의 기술자가 아는 바와 같이, 이황화 결합의 형성을 막기 위해 이 위치에서 시스테인이 다른 비-시스테인 잔기들로 또한 대체될 수 있다.
잔기 172에서의 아미노산 치환의 결과로서, 힌지 구역 (잔기 (178에서의) 최초 시스테인 잔기는, EPO 도메인의 (잔기 (161)에서의) 위에서 설명한 시스테인 잔기로부터 17개 아미노산만큼 간격을 두고 있다. rHuEPO-Fc의 호모다이머의 성공적인 조립 및 EPO 수용체 결합을 가능케 하기 위한, EPO 도메인의 시스테인 잔기 (161)와 힌지 구역의 최초 시스테인 잔기 사이의 최소 간격은 적어도 12 개의 아미노산들이어야 한다고 발명자들은 믿는다. 즉, 잔기 (172)가 시스테인 잔기이면, 예컨대, 시스테인 잔기들 (161 및 172) 사이에, 바람직하지 못한 이황화 결합이 잠재적으로 형성될 수 있다. 이것이 EPO 분자의 3차원 구조를 바꿀 수 있으며, 생물학적 비활성 또는 감소된 생물학적 활성을 초래할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, EPO 도메인이 융합 단백질의 Fc 프레그먼트 부분에 직접 연결된다. 외부 연결자 펩티드(external linker peptide)를 제공하는 것을 피함으로써, rHuEPO-Fc 융합 펩티드의 바람직한 3차원 구조가 유지되며 바람직하지 못한 면역 반응을 촉발할 위험이 최소화된다. Fc 프레그먼트의 힌지 구역은 바람직하게는 길이가 적어도 9 개인 아미노산들이며, 바람직하게는 길이가 약 10 - 20 개인 아미노산들의 범위 내에 있다.
실시예들
본 발명이 그 구체적인 실시예들로 한정되지 않는 것으로 이해되어야할 것이지만, 다음의 실시예들은 본 발명을 더 자세히 설명해줄 것이다.
1. HuEPO - Fc 의 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 플라스미드 pCdEpo - Fc 의 구축( construction )
다음의 올리고 프라이머들(QIAGEN Inc., 미국)을 사용하여 rHuEPO-Fc의 폴리펩티드의 아미노-산을 인코딩하는 전체 길이 DNA 분자(full length DNA molecule)를 오버랩핑 PCR(overlapping PCR)에 의해 발생시켰다(generated):
EF5: 5'-ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3';
EF3: 5'-ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3';
EFL5: 5'-aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatctggtgaca-3';
EFL3: 5'-tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3'.
위에 적은 프라이머들의 서열들은 각각 SEQ. ID. 번호들 5-8에 열거되어 있다.
EcoR I 및 Not I 사이트들을 각각 EF5 및 EF3에 도입했다. 포유류 세포들에서의 HuEPO-Fc 단백질의 최적의 발현을 위해, Kozak 서열(GCCACCATGG)을 또한 EF5 에 도입했다. EFL5 및 EFL3은, Epo의 3'-말단 DNA 서열(23bp)과 IgGl 힌지의 5'-말단 DNA 서열(22bp)로 구성된 상보적인 서열들이다.
먼저, 전체 길이의 인간 EPO cDNA를 포함하는 플라스미드 p9E로부터의 프라이머들 EF5 및 EFL3을 가지고 0.6 kb의 EPO DNA 프레그먼트를, 전체 길이의 인간 IgGl cDNA 서열을 포함하는 플라스미드 pD로부터의 프라이머들 EF3 및 EFL5을 가지고 0.7 kb의 Fc 프레그먼트를 PCR(Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)에 의해 각각 증폭하였다(p9E 및 pD는 발명자들의 자체 연구실로부터 나온 것임). 그 다음에, 두 프레그먼트들을 정제하고 동등한 양으로 혼합하였다. 이 믹스를 템플릿으로 사용하여, 1.3 kb의 전체 길이의 HuEPO-Fc DNA를 프라이머들 EF5 및 EF3에 의해 증폭하였다. 정제된 1.3 kb 프레그먼트를 EocR I 및 Not I(New England Biolab Inc. 미국)에 의해 소화시킨(digest) 다음에, EcoR I/Not I-소화된 포유류 발현 벡터 pCDl(도 2)으로 클로닝하였다. 그 결과로 생성된 재조합 벡터를 pCdEpo-Fc로 명명하고, HuEPO-Fc 단백질의 아미노-산 서열을 인코딩하는 삽입된 핵산서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
2. rHuEPO - Fc 발현 세포주의 확립( establishment )
생물학적 물질 생산에 대해 FDA에 의해 승인된, 다이하이드로폴레이트 리덕타아제(dhfr) 결핍인 중국 햄스터의 난소 세포(CHO/dhfr_, ATCC No.CRL-9096)를 rHuEPO-Fc 발현용 숙주세포로 사용하였다.
CHO-dhfr_ 세포들을 리포펙타민(Lipofectamine)(Gibco, Cat.No: 18292-037, 미국)을 사용하여 재조합 벡터 pCdEpo-Fc로 감염시켰다. 선택된 클론들의 배지로부터의 상층액들(supernatants)을 가지고 EPO 활성에 대해 ELISA(Roche, Cat.No: 1-693417, 캐나다)로 분석하였다(assay). 메토트렉세이트(MTX) 압력을 증가시키면서, 양성 클론들을 더 스크리닝하였다. 최고의 rHuEPO-Fc 단백질 발현 세포주 하나를 rHuEPO-Fc-발현 CHO 세포주로 선정하고, 점진적으로 무혈청 배지(CD CHO Medium, Gibco, Cat.No: 10743-029, 미국)에 적응시켰다. 이 rHuEPO-Fc-발현 CHO 세포주를 rHuEPO- Fc 단백질의 생산을 위해 사용하였다.
3. rHuEPO - Fc 단백질의 정제
rHuEPO-Fc-발현 CHO 세포들을 배양하는 무혈청 배지로부터 수거한 상층액들에 포함된 rHuEPO-Fc 단백질 분자들을, 단백질 A 친화성 크로마토그라피(Protein A affinity chromatography)(Amersham, Cat.No: 17-0402-01, 캐나다)에 의해 먼저 분리하였다. 분리된 단백질들을 HiLoad 16/60 Superdex 200pg 칼럼(Amersham, Cat.No: 17-1069-01, 캐나다)에서 겔 여과에 의해 더 정제하였다. rHuEPO-Fc 단백질의 순도는 전기영동(electrophoresis)에 의해 측정했을 때 98%보다 높았다.
4.순수 rHuEPO - Fc 단백질의 크기 측정
먼저, 순수 rHuEPO-Fc 단백질의 크기를 측정하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 도 3에 보이는 바와 같이, 비-환원 조건에서 8% Bis-Tris 겔 상에 약 180 kDa의 분자량을 가진 단일 밴드가 보였는데, 이것은 이황화 결합들을 가지는 단백질의 전체 크기를 측정한 것이다. 이는, 대부분의 rHuEPO-Fc 단백질 분자들이, 융합 단백질의 설계로부터 예상되었듯이, 다이머 형태로 생성된다는 것을 의미하였다. SDS-PAGE 분석이 이황화 결합들을 깨트리기 위한 환원 조건(10OmM 다이티오트레이톨, DTT)에서 수행될 때, HuEPO-힌지 구역-CH2-CH3의 단일 폴리펩티드 사슬의 예상 분자량과 일치하는, 75Kda의 분자량을 갖는 밴드만이 확인되었다(idenfified).
질량 스펙트럼법(MALDI-TOF-MS)에 의해 측정된, 당화된 순수 rHuEPO-Fc 융합 단백질의 정확한 분자량은 111099 달톤(111.1 Kda)이었다. 이 분석에서, 정제된 rHuEPO-Fc 단백질이 거의 100% 순수하다는 것을 의미하는 단백질의 단일 피크만이 관찰되었다. 순수 rHuEPO-Fc 단백질의 N-말단의 15 개 아미노산들을 단백질 서열 분석법에 의해 다음과 같이 결정하였다: APPRLICDSRVLERY. 이는 천연 인간 EPO 폴리펩티드의 최초 15 개 아미노산들의 서열과 일치하였으며, 정제된 rHuEPO-Fc 단백질이, rHuEPO-Fc 융합 단백질의 아미노-산 서열들을 인코딩하는 DNA에 의해 예상된 바와 같은 올바른 전체 EPO 분자 서열을 가진다는 것을 확인시켜 주는 것이다.
5. 정상 생쥐에 있어서의 rHuEPO - Fc 의 증강된 에리스로포이에틴 활성
HuEPO-Fc 단백질의 에리스로포이에틴 활성의 유지를 확인하고 rHuEPO 및 다르베포에틴-알파와 비교한 그 효능을 측정하기 위해, 생쥐에 대한 체내 실험들을 수행하였다. 비교의 목적으로, 본 발명의 설명되는 동물 실험들에 사용된 세 가지 EPO들[우리의 rHuEPO-Fc, rHuEPO(즉, 천연 인간 EPO) 및 다르베포에틴-알파]의 투여량은 모두 몰 기준으로 EPO 분자 부분 만의 양이다. rHuEPO-Fc 단백질에 관하여, EPO 부분은, 전체 rHuEPO-Fc 분자의 전체 아미노산들의 중량 내의 EPO의 아미노산들의 중량의 비율(399개 aa 중 166개 aa)에 의해, 전체 rHuEPO-Fc 분자량의 41.4%를 차지하는 것으로 계산된다. 그리하여, rHuEPO-Fc에 있어서의 EPO 양은 rHuEPO-Fc 단백질의 전체 양의 41.4%로 결정된다.
rHuEPO-Fc[스톡(stock) 농도: 0.5mg/ml, 98.6%의 순도] 및 천연 인간 rHuEPO(즉, 천연 인간 EPO 구조를 가짐)[6000IU/0.5ml, Kirin Brewery Co.(일본)이 제조함]을 캐리어 용액[2.5mg/ml의 인간 혈청 알부민, 5.8mg/ml의 시트르산나트륨, 0.06mg/ml의 시트르산 및 5.8mg/ml의 염화나트륨, pH5.5-5.6]에 희석하였다. rHuEPO의 투여량을 그것의 활성/양 비율(ration)에 따라 계산하였다. BALB/c 생쥐[생후 6주 내지 8주, 체중 18-22g, 암수 동수, Experiment Animal Center, AMMS(중국)으로부터 구매]를 무작위로 각 그룹당 6 마리씩 무리지었다. 하나의 투여량(0.1, 0.5, 2.5, 12.5, 62.5μg/kg), 하나의 주사 경로(꼬리 정맥을 통한 정맥 주사 또는 피하 주사) 및 하나의 주사 스케쥴(주 3회 또는 주 1회)를 조합하여 각 그룹의 생쥐를 처리하였다. 대조구 그룹의 생쥐에 동일한 부피의 캐리어 용액을 주사하였다. 이 처리를 3 주 동안 지속하였고 전체 관찰 시간은 5 주였다. 측정용 말초 혈액 샘플들(꼬리 정맥)을 처리 전에, 그리고 5 주 동안 매주 4번째 날과 7번째 날에 채취하였다. 인덱스로서 Hb를 흡수계측법(absorptiometry)에 의해 측정하였다. 각 그룹의 데이터로부터 평균±SD를 계산하였고 상이한 그룹들에 대해 t 테스트를 수행하였다.
EPO들이 보통의 에리스로포이에틴 활성을 가진다면, 생쥐에 주 3회 EPO를 투여하면 적혈구 생성에 대해 포화된 자극을 유도할 수 있을 것이다. 도 4에 보이는 바와 같이, 주 3회 피하 주사 처리를 한 그룹들 모두에서, 2.5μg/kg의 투여량에서 조차도 Hb 레벨들이 상당히 상승되었다. 이 실험은, rHuEPO-Fc가 rHuEPO만큼 효과적인 체내 에리스로포이에틴 활성을 나타내었다는 것을 보여준다. 처리한 그룹에서의 Hb 레벨들의 상승은 투여량 의존적이었다. 그러나, 12.5μg/kg의 rHuEPO-Fc 투여량에서 생쥐에 Hb 레벨들의 포화된 상승이 유도된 반면에, 유사한 정도의 Hb 레벨들의 포화된 상승은 62.5μg/kg의 rHuEPO 투여량에서 겨우 달성되었다. 2.5μg/kg의 rHuEPO-Fc에 의해 유도된 Hb 레벨들의 상승은 또한, 2.5μg/kg의 rHuEPO에 의한 것보다 더 컸다. 이러한 결과들은 rHuEPO보다는 rHuEPO-Fc에 의한 에리스로포이에틴 자극이 더 효과적임(potent)을 제시하는 것이다.
주사 횟수를 주 1회로 줄여 피하 주사하여 rHuEPO-Fc의 에리스로포이에틴 효능을 더 탐구하였다. 도 5에 보이는 바와 같이, rHuEPO-Fc로 처리한 그룹들은 12.5 또는 62.5μg/kg의 투여량에서 Hb 레벨들의 투여량-의존성 상승을 보였다. 12.5 및 62.5μg/kg의 rHuEPO 투여량 모두는 또한 유사한 정도의 Hb 레벨들의 상승을 일으켰는데, 이것은 62.5μg/kg의 rHuEPO-Fc에 의한 것보다 훨씬 낮았다. 이는 rHuEPO-Fc가 체내에서 증강된 에리스로포이에틴 활성을 가진다는 것을 강하게 의미하는 것이다. 그것은 rHuEPO-Fc의 연장된 체내 반감기 또는 rHuEPO-Fc 단백질 내의 다이머 EPO 분자들에 의한 개선된 EPO 수용체 결합/활성 때문이거나, 또는 이들 모두의 결합된 효과에 의한 것이라고 추측된다.
동일한 투여량(12.5μg/kg)의 rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO가 정맥으로 주 3회 또는 주 1회 투여되었을 때, 처리한 모든 그룹들에 대해 Hb 레벨들의 상승이 관찰되었다(도 6). 그러나, rHuEPO-Fc를 주 1회 정맥으로 투여한 경우 더 크고 더 지속적인 Hb 레벨들의 상승을 일으켰고, 처리가 종료된 후에도 더 오래 지속되었다. 이 데이타는, 자연적으로 발생하는 EPO 단백질의 구조를 가진 rHuEPO과 비교하여 rHuEPO-Fc 단백질의 에리스로포이에틴 성질들이 증강됨에 대한 또 다른 증거를 제공한다.
6. 5/6 신장절제된 쥐들에 있어서의 rHuEPO - Fc 의 증강된 에리스로포이에틴 활성
정상 생쥐에 대한 실험들은 rHuEPO-Fc의 체내에서의 증강된 에리스로포이에틴 활성을 증명하였다. 적혈구 생성을 자극하는데 있어서의 rHuEPO-Fc의 효능을 더 관찰하기 위해, 5/6 신장절제하여 만들어진, 실험용의 신장성 빈혈(renal anemia)이 있는 쥐들에 대해 약력학적(pharmacodynamic) 연구들이 행해졌다. rHuEPO-Fc의 효능을 rHuEPO 및 다르베포에틴-알파[60μg/ml, 제품 번호. N079, Kirin Brewery Co.(일본)이 제조]와 비교하였다.
본 발명에서는, 2-단계 신장절제에 의한 신장 기능 고장에 기인하는 빈혈 모델을 만들기 위해 Wistar 쥐들[암수 동수, 체중 160-18Og, Vitalriver Experiment Animal Inc.(북경, 중국)로 부터 구입. 허가 번호. SCXKl1-00-0008]을 사용하였다[27]. 멸균 상태하에서 두 차례의 개별적인 수술에 의해 일반 마취된 쥐들에 대해 5/6 신장절제를 행하였다. 좌측 신장의 2/3를 절제한 후에, 쥐들이 회복하도록 20일 동안 놔두었다. 그 다음에, 우측 신장을 조심스럽게 절제하였다. 매번 수술 후에 감염을 막기 위해 항생제를 투여하였다. 합쳐서, 신장 조직의 5/6을 최종적으로 절제하였다. 신장절제된 쥐들은 점차 신장 기능 결핍과 빈혈을 일으켰다. 이 쥐들은 신장절제 후 50일 뒤에 지속적인 빈혈 상태에 빠졌으며, 그에 따라 EPO들의 투여를 시작하기 위해 이들을 무작위로 무리지었다(그룹당 9마리). 각 그룹의 쥐들을, 하나의 투여량(2.5, 12.5, 62.5μg/kg), 하나의 주사 경로(꼬리 정맥을 통한 정맥 주사 또는 피하 주사) 그리고 하나의 주사 스케쥴(주 1회 또는 격주 1회)을 하나로 조합하여 처리하였다. 대조구 그룹 및 모델 그룹의 쥐들에 동일한 부피의 캐리어 용액을 주사하였다. 이 처리를 4 주 동안 지속하였고 전체 관찰 시간은 6 주였다.
주 1회 피하 주사된 모든 투여량(2.5, 12.5, 62.5 μg/kg)의 rHuEPO-Fc가, EPO 처리를 받지 못한 모델 대조구 그룹에 비해, 투여량 의존적인 Hb 레벨들의 상승을 일으켰다. 주 1회 피하 주사된 12.5 및 62,5μg/kg의 rHuEPO 또는 다르베포에 틴 모두 Hb 레벨들의 상승을 또한 일으켰다. 12.5 또는 62.5 μg/kg의 rHuEPO-Fc으로 처리된 양 그룹에 있어서의 Hb의 증가된 레벨들은 각각, 12.5 또는 62.5 μg/kg의 rHuEPO으로 처리한 그룹보다 현저하게 높았다. 62.5μg/kg의 rHuEPO-Fc로 처리한 그룹들에서의 Hb 레벨들 또한, 62.5μg/kg의 다르베포에틴으로 처리된 그룹보다 약간 더 높았다. 처리를 중단한 후에, 62.5μg/kg의 rHuEPO-Fc로 처리한 그룹에서의 Hb 레벨들의 감소는, 관찰이 종료될 때(처리 후 2 주)까지 정상 대조구 및 모델 대조구 그룹들 모두보다 훨씬 느리고 더 높게 유지되었으며, 이는 더 강력하고 더 연장된 에리스로포이에틴 자극을 의미한다(도 7에 요약됨).
격주 1회의 피하 주사 처리를 위해, 단지 12.5 또는 62.5μg/kg의 세 가지 EPO를 투여하였다(도 8). 12.5μg/kg의 rHuEPO는 모델 대조구 그룹에 비해 가까스로 Hb 레벨들을 증가시켰고, 62.5μg/kg의 rHuEPO로 처리한 그룹에서의 약한 에리스로포이에틴 반응은 정상 대조구 그룹과 비교하여 Hb 레벨들을 정상으로 되돌리지 못했다.
12.5 또는 62.5μg/kg의 투여량으로 rHuEPO-Fc 또는 다르베포에틴을 처리하면, 정상 대조구 그룹보다 더 높은 Hb 레벨들의 상당한 상승을 일으켰는데, 이는 rHuEPO-Fc 및 다르베포에틴 모두에 의해 빈혈 상태가 효과적으로 교정됨을 의미한다. 동일한 투여량의 rHuEPO-Fc와 다르베포에틴 사이에는 효능의 관점에서 별다른 차이가 관찰되지 않았다. 62.5 μg/kg의 높은 투여량은, 관찰이 종료될 때(처리 후 2 주)까지 적혈구 생성의 지속적인 증가를 가져왔다. 이는, rHuEPO-Fc 및 다르베포에틴이 체내에서 오래 지속되는 적혈구 생성 자극 성질을 나타내며, 이것이 다시 의료적으로는 환자들에 대한 투여 빈도의 감소로 이어질 수 있음을 또한 제시한다.
환자의 편익을 증진시키고 의료 제공자들의 업무 부담을 줄여 주기 위해 덜 자주 주사하도록 다르베포에틴이 의료용으로 승인되었는 데, 이러한 실험 데이터는, 본 발명에서 개시되는 rHuEPO-Fc가 적어도 그와 유사한 잠재적 장점들을 가진다는 것을 강하게 의미하고 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 추가적인 설탕 화합물들을 포함하는(더 당화된) 인간 EPO 분자의 변종 유사물로서의 다르베포에틴은, 변경된 3차원 구조들 때문에 체내 면역발생(immunogenesis)을 일으킬 위험을 증가시킬 수 있다. 다르베포에틴으로 치료를 하고 있는 환자들에 대한 장기 관찰만이 다르베포에틴의 면역상 위험에 대한 결정적인 해답을 제공할 것이다. 이에 반해, EPO 분자 부분의 변형(modification)이 없는 rHuEPO-Fc는 천연 인간 EPO와 동일하거나 거의 유사한 탄수화물 함량을 가진다. 발명자들의 순수 rHuEPO-Fc 단백질 내의 시알산들(cialic acids)의 양들은 HuEPO의 보고된 파라미터들과 일치하는 약 10.0 mmol/mmol EPO이었다. 외부 아미노산(들)/연결 펩티드가 없는 rHuEPO-Fc의 Fc 부분은 인간 IgGl의 일반 구조를 나타내며, 이론적으로는 면역 반응을 일으키지 않을 것이다. 만일 의료적으로 승인된다면, rHuEPO-Fc는 환자들에게, 특히 장기간 투여를 요하는 환자들에게 현재 가용한 rHuEPO 및 EPO 유사물들보다 더 나은 대안을 제공할 수 있을 것이다.
격주 1회 정맥으로 주사하면, rHuEPO-Fc 및 다르베포에틴(62.5μg/kg) 모두, 신장성 빈혈을 가진 쥐들에 있어서, 정상 대조구 쥐들에서의 정상 Hb 레벨들보다 훨씬 높은, Hb 레벨들의 동일한 증가를 일으킬 수 있었다(도 9). 다르베포에틴의 효능이 의료적으로 증명된 바와 같이, 이는 rHuEPO-Fc에 의한 적혈구 생성에 대한 지속적인 자극을 더 확인시켜 주는 것이다.
처리(주 1회 또는 격주 1회 피하 주사 또는 정맥 주사) 후의 5/6 신장절제된 쥐들로부터 수집된 골수 세포들에 대한 세포 배양 실험들로부터 나온 데이터는, rHuEPO-Fc, rHuEPO 및 다르베포에틴 모두가 CFU-E 및 BFU-E의 생성을 자극하였음을 보여준다. rHuEPO-Fc 및 다르베포에틴의 효능들(potencies)은 유사하였고 rHuEPO보다 더 강력하였다(도 10).
BUN(Blood urinonitrogen)과 크레아(Crea) 레벨들은 처리한 그룹들과 모델 대조구 그룹에서 유사하였다. 모든 처리한 그룹들 내의 혈청 Fe의 레벨들은 모델 대조구 그룹의 그것보다 더 높았다. 병리학적 검사들에서, 모든 EPO-처리한 쥐들의 골수 및 비장 내에서 적혈구(RBC)-관련 세포들의 분포의 증가가 관찰되었다.
7. 레서스 원숭이들에 있어서의 rHuEPO - Fc 에 대한 약물동력학적 (Pharmacokinetic) 연구
위에서 논의된 바와 같이, 발명자들은, 이 융합 단백질의 EPO 부분이 적혈구 생성을 자극하는 것과 같은 천연 EPO의 기능적 성질들을 보유하며, 인간 IgGl의 Fc 프레그먼트가 순환 중에 이 융합 단백질의 존재를 안정하게 해주어 그에 따라 그것의 체내 반감기를 연장시키도록 하는 방식으로 rHuEPO-Fc를 설계하였다. 위에서의 동물 연구들은 rHuEPO-Fc의 에리스로포이에틴 활성들이 rHuEPO와 비교하여 증강되 는 것을 보여주었다. 발명자들은 또한 rHuEPO와 비교하여 rHuEPO-Fc의 체내 반감기를 측정하기 위한 약물동력학적 연구들을 수행하였다. 데이터를 생성하기 위해 영장류들을 사용하였는데, 그들이 생물학적으로 인간과 매우 유사하기 때문ㅇ이다.
문헌 보고서들에 기초하여 연구 설계를 하였고, 약물동력학의 일반적인 가이드라인에 따라 실험들을 수행하였다. 각 그룹에 5 마리씩, 두 그룹들의 레서스 원숭이들[(3-5kg, Experiment Animal Center, AMMS(중국)으로부터 구매]에게 5 μg/kg의 rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO를 각각 정맥으로 주사하였다. 혈액 샘플들을 주사 전에, 그리고 주사 후 0.017, 0.167, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, 240 시간 후에 채취하였다. 원심분리하여 혈청들을 수집하였고, 인간 에리스로포이에틴 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트들[R&D Systems(Minneapolis, MN)로부터 구매]을 사용하여 혈청 rHuEPO-Fc 또는 rHuEPO 레벨들을 측정하였다. 정맥으로 주사된 rHuEPO-Fc 및 rHuEPO의 평균 반감기(tl/2)는 각각 35.24+/-5.15, 8.72+/-1.69 시간이었다(도 11의 요약 참조).
rHuEPO-Fc의 생물학적 이용 가능성을 관찰하기 위해, 5ug/kg의 rHuEPO-Fc를 5 마리의 레서스 원숭이들에게 피하 주사하였다. 혈액 샘플들을, 주사 전에 그리고 주사 후 1, 2, 5, 8, 10, 12, 15, 24, 48, 72, 96, 168, 240 시간 후에 채취하였고, rHuEPO-Fc의 혈청 레벨들을 R&D 키트들로 측정하였다. 이 피하 주사에 의한 생물학적 가용성 인덱스는 35.71+/-5.37%로 계산되었다. 이는, 만성 신장 부전을 가진 환자들에 있어서의 다르베포에틴-알파(Aranesp™)의 보고된 생물학적 이용 가능성 수치들과 동일한 것이다[9, 15].
이 데이터는, rHuEPO-Fc가 영장류에 있어서 현저하게 연장된 반감기를 가지며, rHuEPO-Fc의 체내 반감기는 일본의 Kirin Beer Brewing Co.에 의해 제조된 rHuEPO보다 적어도 4 배 더 길다는 것을 보여준다. 연장된 체내 반감기가 rHuEPO-Fc의 증강된 에리스로포이에틴 활성에 기여하는 것 같다.
8. Macaca fascicularis (긴 꼬리 달린 원숭이)에 있어서의 rHuEPO - Fc 의 면역원성( immunogenicity )
위에서 언급된 대로, rHuEPO-Fc 융합 단백질의 면역 성질들의 변화를 의도적으로 피하거나 최소화하기 위한 rHuEPO-Fc 융합 단백질의 설계에 관심이 주어진다. 발명자들은 이 융합 단백질 내에 외부 아미노산(들) 또는 연결 펩티드 서열들을 포함하거나 첨가하는 것을 피하였다. 도 1B의 구체예의 본 발명의 HuEPO-Fc 융합 단백질은, 천연 EPO 단백질과 인간 IgGl의 Fc 프레그먼트(힌지 구역, CH2, CH3)의 폴리펩티드 서열들을 포함할 뿐이어서, 이론적으로는 면역성 반응과 rHuEPO-Fc 단백질에 대한 항체들의 생성을 일으키지 않을 것이다. 이 분야의 기술자들이 이해하는 것처럼, 다른 천연 구조들을 갖는 여타의 구체예들 또한 본 발명에 포함된다.
rHuEPO-Fc 단백질의 면역원성을 관찰하기 위해 다음의 영장류 연구들을 수행하였다. 게를 먹는 열 마리의 마카크원숭이(macaque)(Macaca fascicularis)[수컷/암컷=5/5, 5 살 이내, 평균 체중은 수컷이 4.0±0.3kg, 암컷이 2.9±0.4kg, Laboratory Animal Center, AMMS(중국)으로부터 구매]들에게 5μg/kg의 정제된 rHuEPO-Fc를 4 주 동안 주 3회씩 피하 주사하고, 두 마리에게는, 대조구 동물로서, 동일한 부피의 캐리어 용액을 주사하였다. 5 주(처리 후 l 주) 동안 주 1회 혈청들을 채취하고, 코팅 항원으로서 정제된 rHuEPO-Fc(5μg/ml)을 사용하여 ELISA에 의해 rHuEPO-Fc에 대한 특이적 항체에 대해 테스트하였다. 추가적으로, 실험기간 내내 말초 혈액 내의 RBC 수(count)와 Hb 레벨들을 또한 측정하였다. 그 결과 데이터는, rHuEPO-Fc로 처리한 마카크원숭이들에 있어서 자극된 적혈구 생성 증강이 관찰되었던 반면에(평균 RBC 수들은 4.74xlO9/ml로부터 6.67xlO9/ml로 증가하였고 평균 Hb 레벨들은 12.2g/dl로부터 13.7g/dl로 증가했음), rHuEPO-Fc가 이 융합 단백질에 대한 특이적 항체들을 감지할 정도로 생성하지는 않았음을 보여 주었다. 이러한 결과들은 rHuEPO-Fc 융합 단백질이 영장류에 있어서 면역원성을 유발하지 않는다는 것을 의미한다.
9. 정상 생쥐에 있어서의 rHuEPO - Fc 의 급성 독성 연구들
rHuEPO-Fc 융합 단백질의 안전성을 평가하기 위해, 급성 독성 연구들을 동물에 대해 수행하였다.
두 그룹의 BALB/c 생쥐[n=20, 암수 동수, 생후 5-6 주, 평균 체중은 암컷이 15.8±0.4g, 수컷이 15.9±0.6g, Chinese Academy of Medicine(중국)으로부터 구매]에 이들의 꼬리 정맥들을 통해 과량의 정제된 rHuEPO-Fc(수컷=13.3mg/kg, 암컷 =13.2mg/kg) 또는 동등한 부피의 캐리어 용액을 한차례씩 각각 정맥 주사하였다. 주사 후의 즉각적인 반응을 관찰하는 것에 더하여, 14일 동안 매일 일반적인 행동 및 상태, 활동들, 식사 및 배변 패턴들 및 변화들을 주시하고 기록하였다. 또한 7일째와 14일째에 모든 생쥐의 체중을 재었다. 주사후 15일째에, 생쥐의 주요 장기들에 대한 해부 검사를 수행하였다. 만일 장기들에 대해 어떤 특이한 변화나 의심스런 변화가 관찰되었다면, 병리학적 검사를 수행하였을 것이다.
두 그룹들의 모든 생쥐는 주사 후에 눈에 띄는 즉각적인 반응을 보이지 않았다. 14일의 기간 내내, 행동, 활동들, 식사 및 배변 패턴들에 있어서 눈에 띄는 변화들이 관찰되지 않았다. 또한, 양 그룹들의 생쥐의 체중은 모두 테스트 기간 동안 꾸준히 증가하였고, 주사후 7일 또는 14일째에 2 그룹들 간에 눈에 띄는 차이들이 발견되지 않았다. 뇌, 폐, 심장, 간 및 신장의 조직에서 아무런 비정상적이거나 병리적인 변화들도 감지되지 않았다. 이러한 결과들은, 정상적인 적혈구 생성 기능을 나타내기 위해 필요한 것보다 훨씬 더 많은, 과량의 rHuEPO-Fc가 투여되어도 안전하며 눈에 띄는 독성 효과도 없는 것을 의미한다.
10. 와일드 타입과 돌연변이된 EPO 융합 단백질들의 비교
와일드 타입과 돌연변이된 버젼의 EPO 단백질들을 비교하기 위한 조사를 또한 수행하였다. 위에서 설명된 바와 같이, 하나의 구체예에서 본 발명은, 아미노산 잔기 (172)(C172G)에서 단일 아미노산 변이를 포함한다. 비교 목적으로, 잔기 (172)에 시스테인 아미노산을 갖는 와일드 타입 융합 단백질을 또한 마련하였다(도 12). 위의 실시예들 1 - 3에서와 동일한 방식으로 이 와일드 타입 융합 단백질을 마련하였다. 재조합 플라스미드의 구축과 관련하여, 다음의 올리고 프라이머들(QIAGEN Inc., 미국)을 사용하였다(EFL5w 및 EFL3w의 바뀐 아미노산들을 실시예 1의 프라이머들에 비해 굵게 표시함):
EF5: 5'-ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3';
EF3: 5'-ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3';
EFL5w: 5'-aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatcttgtgaca-3';
EFL3w: 5'-tgtcacaagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3'.
프라이머들 EFL5w 및 EFL3w의 서열들을 각각 SEQ. ID. 번호. 9-10에 나열하였다.
와일드 타입 융합 단백질(본 명세서에서 rHuEPO-FcC로 부름)의 에리스로포이에틴 활성을 변이된 융합 단백질(즉, 위에서 설명한 본 발명의 rHuEPO-Fc 단백질) 및 재조합 인간 EPO(rHuEPO)과 비교하기 위해, 생쥐에 대한 체내 실험들을 수행하였다. 비교 목적으로, 이 실시예에서 사용된 세 가지 단백질들, 즉 rHuEPO-Fc, rHuEPO-FcC 및 rHuEPO의 모든 투여량들은, 몰 기준으로 EPO 분자 부분만의 양들이다. rHuEPO-Fc 및 rHuEPO-FcC 단백질들에 있어서, 전체 rHuEPO-Fc 및 rHuEPO-FcC 분자들의 전체 아미노산들의 중량에 대한 EPO의 아미노산들의 중량의 비율로 계산하였을 때(즉, 399 aa 중 166 aa) EPO 부분이 전체 분자량의 41.4%를 차지한다.
rHuEPO-Fc(스톡 농도: 300μg/ml), rHuEPO-FcC(스톡 농도: 90μg/ml) 및 천연 인간 EPO 구조를 가진 rHuEPO[6000IU/0.5ml, Kirin Brewery Co.(일본)이 제조함]을 캐리어 용액[2.5mg/ml의 인간 혈청 알부민, 5.8mg/ml의 시트르산나트륨, 0.06mg/ml의 시트르산 및 5.8mg/ml의 염화나트륨, pH5.5-5.6]에 희석시켰다. rHuEPO의 투여량을 그것의 활성/양 비율에 따라 계산하였다. BALB/c 생쥐[생후 9주 내지 10주, 체중 18-22g, 암수 동수, Experiment Animal Center, AMMS(중국)]를 무작위로 각 그룹당 8 마리씩 무리지었다. 하나의 투여량(2.5, 12.5, 62.5μg/kg), 하나의 주사 경로(피하 주사) 및 하나의 주사 스케쥴(주 3회 또는 주 1회)을 조합하여 각 그룹의 생쥐를 처리하였다. 대조구 그룹의 생쥐에 동일한 부피의 캐리어 용액을 주사하였다. 이 처리를 26 일 동안 지속하였다. 측정용 말초 혈액 샘플들(꼬리 정맥)을 처리 전에, 그리고 처리 2일째, 6일째, 9일째, 13일째, 16일째, 19일째, 22일째 및 26일째 날에 채취하였다. 인덱스로서 Hb를 흡수계측법에 의해 측정하였다. 각 그룹의 데이터로부터 평균±SD를 계산하였고 상이한 그룹들에 대해 t 테스트를 수행하였다.
도 13에 보이는 바와 같이, 주 3회의 간격으로 투여된 세 가지 EPO 단백질들 모두 적혈구 생성을 자극하였다. 2.5 μg/kg 또는 12.5 μg/kg의 투여량에서, rHuEPO-Fc는 rHuEPO보다 Hb 레벨들의 더 높은 상승을 일으켰다. Hb 레벨들의 가장 높은 상승은 12.5 μg/kg 투여량의 rHuEPO-Fc에 의해 달성되었다. 2.5 μg/kg 및 12.5 μg/kg 투여량의 rHuEPO-FcC 모두, rHuEPO-FcC로 처리된 그룹들에서의 Hb 레벨들의 현저히 낮은 상승에 의해 나타나는 바와 같이, 동등한 투여량의 rHuEPO 및 rHuEPO-Fc보다 훨씬 더 약한 적혈구 생성을 일으켰다. 실제로, 12.5 μg/kg의 rHuEPO-FcC는 2.5 μg/kg의 rHuEPO보다 더 낮은 Hb 레벨들의 더 낮은 상승을 일으켰다. 이러한 결과들은, rHuEPO-FcC가 천연 EPO 분자 서열을 갖는 rHuEPO에 비해 체내에서 에리스로포이에틴 활성을 훼손하였다는 것을 암시한다. 대조적으로, 본 발명의 rHuEPO-Fc 융합 단백질은 더 강력한(potent) 에리스로포이에틴 기능들을 나타냈다. 세 가지 EPO 단백질들을 주 3회 간격으로 투여함으로써 대체적으로 단백질들의 반감기 차이에 의한 영향을 받지 않도록 하였다.
피하 주사를 주 1회로 감소시킴으로써 rHuEPO-Fc 및 rHuEPO-FcC의 에리스로포이에틴 효능을 더 평가하였다. 도 14에 보이는 바와 같이, 12.5 μg/kg 또는 62.5 μg/kg의 투여량에서 rHuEPO-Fc로 처리된 그룹들이 rHuEPO로 처리된 그룹들보다 더 높은 Hb 레벨들의 상승을 보였다. 대조적으로, rHuEPO-FcC는 rHuEPO보다 Hb 레벨들의 더 약한 상승을 일으켰다. 예를 들어, 12.5 μg/kg의 rHuEPO는 대부분의 시점에서 62.5 μg/kg의 rHuEPO-FcC 보다 Hb 레벨들의 더 높은 상승을 일으켰다. 이는, 반감기의 영향을 포함하도록 투여 회수를 감소시킴에 따라, rHuEPO-FcC가 천연 EPO 분자 서열을 갖는 rHuEPO 및 본 발명의 rHuEPO-Fc 융합 단백질에 비해 체내에서 보다 약한 에리스로포이에틴 기능들을 나타낸다는 것을 추가로 표시한다.
요컨대, 이러한 결과들은, 인간 EPO 및 인간 Fc 프레그먼트(힌지, CH2 및 CH3) 모두의 천연 분자 서열들을 융합하여 생성된 rHuEPO-FcC가 천연 EPO 분자 서 열을 갖는 rHuEPO에 비해 체내에서 더 약한 에리스로포이에틴 기능들을 나타낸다는 것을 보여준다. 특히, rHuEPO-FcC 융합 단백질의 에리스로포이에틴 활성들은, 천연 EPO 분자의 활성들의 1/5보다 더 작다. 이는, EPO 분자와 인간 Fc 프레그먼트의 천연 서열 간의 융합이 EPO 분자의 기능적 성질들을 훼손한다는 것을 의미한다. Fc 프레그먼트의 힌지 구역 내의 최초 시스테인 잔기에서의 단일 아미노산 대체에 의해, 천연 EPO 분자 서열과 변종 Fc 프레그먼트를 포함하여 구성되는 본 발명의 rHuEPO-Fc 융합 단백질은 천연 EPO 분자에 비해 체내에서 더 강력한(potent) 에리스로포이에틴 기능들을 나타낸다. 이 데이터는, 와일드 타입 Fc 프레그먼트의 힌지 구역 내의 최초 시스테인 잔기가 어떤 식으로든, 아마도 EPO 분자에 구조적인 변화를 초래함으로써, EPO 분자를 방해하고, 이것이 적혈구 생성을 자극하는데 있어서의 EPO 분자의 기능적 성질들을 훼손시킨다는 것을 암시한다.
본 발명을 실시함에 있어서 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고도, 앞서의 개시에 의해 이 분야의 기술자들에게 명백하게 될 많은 변경과 수정이 가능할 것이다.
참고 문헌
1. Cohen J 등, 에리스로포이에틴 및 그 수용체: 신호전달 및 임상 증상들. IMAJ 4, 1072-1076쪽 (2002)
2. Blackwell K 등, rHuEPO 및 개선된 치료 결과들: 잠재적인 행동 방식들. The Oncologist 9(증보 5), 41-47쪽 (2004).
3. Lappin TR 등, EPO'의 분신(alter ego): 에리스로포이에틴은 다중 작용을 한다. Stem Cells 20, 485-492쪽 (2002).
4. Maiese K 등. 에리스로포이에틴을 탐구하는 새로운 길들. JAMA 293(1), 90-95쪽 (2005).
5. Fisher JW. 에리스로포이에틴: 생리학 및 약리학적 측면들. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 216, 358-369쪽 (1997).
6. Jelkmann W. 에리스로포이에틴의 분자 생물학. Internal Med. 43(8), 649- 659쪽 (2004).
7. Ng T 등, 의료 분야에서의 재조합 에리스로포이에틴. Postgrad. Med. J. 79, 367-376쪽 (2005).
8. Weiss G 등, 만성 질환으로서의 빈혈. N. Engl. J. Med. 352(10), lOl1- 1023쪽 (2005).
9. Macdougall IC. 새로운 적혈구 생성 자극 단백질(NESP)의 효능 및 안전성에 대한 고찰. Nephrol. D1Al. Transplant. 16(증보 3), 14-21쪽 (2001).
10. Joy MS. 다르베포에틴-알파: 새로운 적혈구 생성-자극 단백질. Ann. Pharmacother. 36, l183-1192쪽 (2002).
11. Ellirt S 등, 당공학에 의한 치료용 단백질의 체내 활성 개선. Nature Biotechnology 21, 414-421쪽 (2003).
12. Elliott S 등, rHuEPO 생물학적 활성의 조절: 탄수화물의 역할. Experimental Hematology 32, l146-1155쪽 (2004).
13. Egrie JC 등, 다르베포에틴-알파는 재조합 인간 에리스로포이에틴보다 더 긴 순환 반감기와 더 큰 체내 효능을 가진다. Exp. Hematol. 31, 290- 299 쪽 (2003).
14. Egrie JC 등, 신규한 적혈구 생성 자극 단백질(NESP)의 개발 및 특성화. British J. Caner. 84(증보 1), 3-10쪽 (2001).
15. Macdougall IC 등, 투석 환자들에 있어서의 에포에틴 알파와 비교된 신규한 적혈구 생성 자극 단백질의 약물동력학. J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2392-2395 쪽 (1999).
16. Jolling K 등, 쥐들에 있어서의 PEG화된 인간 에리스로포이에틴의 집단 약물동력학적 분석. J. Pharm. Sci. 93(12), 3027-3038쪽 (2004)
17. Dalle B 등, 체외 및 체내에서 증강된 에리스로포이에틴 활성을 가진 다이머 에리스로포이에틴 융합 단백질. Blood 97(12), 3776-3782쪽 (2001).
18. Kochendoerfer GG 등, 균일한 폴리머-개질된 적혈구 생성 단백질의 설계 및 화학적 합성. Science 299 884-887쪽 (2003).
19. Sytkowski AJ 등, 현저히 증강된 체내 활성을 가진 인간 에리스로포이에틴 디머들. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, l184-1188쪽 (1998).
20. Sytkowski AJ 등, 동일한 반복 도메인들을 포함하여 구성되는 에리스로포이에틴 융합 단백질이 증강된 생물학적 성질들을 나타낸다. J. Biol. Chem. 274(35), 24773-24778쪽 (1999).
21. Jones TD 등, C형 바이러스 간염의 치료용 신규 잠재 치료제로서의 인간 IgGl의 Fc 부분에 연결된 개질된 인간 IFN-α2b의 개발. J. Interferon. Cytokine. Res. 24, 560-572쪽 (2004).
22. Lo KM 등, 포유류 세포들에 있어서의 Fc-X 융합 단백질들의 높은 레벨의 발현 및 은닉. Protein engineering 11(6), 495-500쪽 (1998).
23. Mohler BCM 등, 가용성 종양 괴사 인자(TNF) 수용체들은 치명적인 내독소 혈증에 대한 효과적인 치료제이며, 동시에 TNF 캐리어 및 TNF 앤타보니스트 모두로서 기능한다. J. Immunol. 151(3), l548-1561쪽 (1993).
24. Way JC 등, 이황화 결합의 개조에 의한 Fc-에리스로포이에틴 구조 및 약물동력학의 개선. Protein Engineering, Design & Selection 18(3), l11 -118 쪽 (2005).
25. Goldenberg MM. Etanercept, 중증 급성 류머티즘성 관절염 환자 치료용 신규 의약. Clin. Ther. 21(1), 75-87쪽 (1999)
26. Wong VK 등, 건선 치료에 있어서의 알레파셉트의 사용. Skin Therapy Lett. 8(6), 1-2쪽 (2003)
27. Chanutin A 등, 부분 신장절제에 의해 초래된 실험적 신장 부전. Arch. Intern. Med. 49, 767-787쪽 (1932).
<110> Novagenetics, Inc. <120> RECOMBINANT HUMAN EPO-FC FUSION PROTEINS WITH PROLONGED HALF-LIFE AND ENHANCED ERYTHROPOIETIC ACTIVITY IN VIVO <130> N240 0002 <150> US 11/340,661 <151> 2006-01-27 <160> 10 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding rHuEPO-Fc fusion protein <400> 1 gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag 60 gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 120 gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 180 gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 240 ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 300 ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgcgag cccagaagga agccatctcc 360 cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 420 ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 480 tgcaggacag gggacagagt tgagcccaaa tctggtgaca aaactagtac atgcccaccg 540 tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 600 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 660 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 720 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 840 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 900 tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gccccttctt cctctacagc 1080 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1140 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa 1200 <210> 2 <211> 399 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of rHuEPO-Fc fusion protein <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg Val Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr Ser 165 170 175 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 180 185 190 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 195 200 205 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 210 215 220 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 225 230 235 240 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 245 250 255 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 260 265 270 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 275 280 285 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 290 295 300 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 305 310 315 320 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 325 330 335 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 340 345 350 Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 355 360 365 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 370 375 380 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395 <210> 3 <211> 1281 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA encoding rHuEPO-Fc fusion protein with 27 amino acid signal peptide <400> 3 atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60 ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120 aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180 agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240 atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300 gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360 catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420 gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagag ttgagcccaa atctggtgac 600 aaaactagta catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 660 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 720 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 780 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 840 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 900 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 960 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1020 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1080 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1140 ggccccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1200 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1260 tccctgtctc cgggtaaata a 1281 <210> 4 <211> 426 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of rHuEPO-Fc fusion protein with 27 amino acid signal peptide <400> 4 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190 Arg Val Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr Ser Thr Cys Pro Pro Cys 195 200 205 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 210 215 220 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 225 230 235 240 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 245 250 255 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 260 265 270 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 275 280 285 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 290 295 300 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 305 310 315 320 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 325 330 335 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 340 345 350 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 355 360 365 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe 370 375 380 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 385 390 395 400 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 405 410 415 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 5 ccggaattcg ccaccatggg ggtgcacgaa tgtcctgcct 40 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 6 ttttcctttt gcggccgctt atttacccgg agacagggag ag 42 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 7 aggcctgcag gacaggggac agagttgagc ccaaatctgg tgaca 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 8 tgtcaccaga tttgggctca actctgtccc ctgtcctgca ggcct 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 9 aggcctgcag gacaggggac agagttgagc ccaaatcttg tgaca 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide primer <400> 10 tgtcacaaga tttgggctca actctgtccc ctgtcctgca ggcct 45

Claims (48)

  1. 인간 IgG Fc 프레그먼트에 직접 연결된 인간 에리스로포이에틴 분자를 포함하여 구성되고, 자연적으로 발생하거나 재조합형의 천연 인간 에리스포이에틴에 비해 연장된 체내 반감기를 갖는, 재조합 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 반감기가, 상기 천연 인간 에리스로포이에틴보다 적어도 3 배 더 긴, 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단백질의 반감기가, 상기 천연 인간 에리스로포이에틴보다 적어도 4 배 긴, 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 상기 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 증강된 에리스로포이에틴 생활성을 갖는, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 Fc 프레그먼트가 IgGl 프레그먼트인, 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Fc 프레그먼트가 하나의 힌지 구역과 CH2 및 CH3 도메인들을 포함하여 구성되는, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 힌지 구역이 길이가 적어도 9 개인 아미노산들인, 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 SEQ. I.D. 번호 2에 존재하는 아미노산 서열 또는 실질적으로 이와 상동(homologous) 서열을 가지는, 융합 단백질.
  9. 복수의 제1항의 융합 단백질들을 포함하여 구성되는 다량체 단백질 구조체(construct).
  10. 제9항에 있어서, 상기 구조체가 다이머인, 다량체 단백질 구조체.
  11. SEQ. ID. 번호 2에 존재하는 아미노산 서열 또는 실질적으로 이와 상동인(homologous) 서열을 각기 가지는 복수의 폴리펩티드들을 포함하여 구성되는, 다량체 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질이 다이머인, 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 다이머가 상기 폴리펩티드들의 힌지 도메인들 사이에 이황화 결합들을 포함하여 구성되는, 단백질.
  14. 제11항에 있어서, 각각의 상기 폴리펩티드들이 약 75 kDa의 분자량을 가지는, 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 상기 다이머가 약 180 kDa의 분자량을 가지는, 단백질.
  16. 의약으로 사용가능한(pharmaceutically acceptable) 캐리어, 보조제(adjuvant) 또는 희석제와 함께, 하나의 제1항의 단백질을 포함하여 구성되는 의약 조성물.
  17. SEQ. ID. 번호 2와 적어도 90%의 아미노산 서열이 동일한 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 있어서, 상기 폴리펩티드가 천연 인간 에리스로포이에틴에 비해 연장된 체내 반감기를 가지는 핵산 서열.
  18. SEQ. ID. 번호 1에 존재하는 핵산 서열 또는 실질적으로 이와 상동인 서열을 포함하여 구성되는 재조합 DNA 분자.
  19. 제18항의 재조합 DNA 분자로 감염된 세포주.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포주가 CHO 세포주인, 세포주.
  21. 제18항의 DNA 분자로 감염된 세포주를 배양하는 단계와, 이에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하여 구성되는 제1항의 단백질 생산 방법.
  22. 제1항의 단백질을 포유류에 투여하는 단계를 포함하여 구성되는, 포유류의 적혈구 생성 자극 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 포유류가 영장류인, 방법
  24. 제23항에 있어서, 상기 영장류가 인간인, 방법.
  25. 제16항의 의약 조성물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하여 구성되는, 포유류의 적혈구 생성 자극 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 포유류가 영장류인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 영장류가 인간인, 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 포유류 내의 상기 단백질의 반감기가, 정맥으로 또는 피하로 투여될 때, 천연 인간 EPO보다 적어도 3 배 더 긴, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 포유류에 내의 상기 단백질의 반감기가, 정맥으로 또는 피하로 투여될 때, 천연 인간 EPO보다 적어도 4 배 더 긴, 방법.
  30. (a) 그것의 C 말단 근처에 하나의 시스테인 잔기를 갖는 하나의 에리스로포이에틴 펩티드 부분; 그리고,
    (b) 하나의 힌지 구역을 포함하여 구성되는 하나의 면역글로블린 펩티드 부분[상기 에리스로포이에틴 펩티드 부분과 가장 가까이 위치하는 하나의 힌지 구역의 시스테인 잔기가, 상기 에리스로포이에틴 펩티드 부분의 상기 시스테인 잔기로부터 적어도 12 개 아미노산들만큼 간격을 두고 있음];을 포함하여 구성되는 재조합 융합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 에리스로포이에틴 펩티드 부분이 전체 인간 에리스로포이에틴 분자인, 융합 단백질.
  32. 제30항에 있어서, 상기 면역글로블린 펩티드 부분이, 상기 힌지 구역과 CH2 및 CH3 도메인들을 포함하여 구성되는 인간 IgG Fc 프레그먼트인, 융합 단백질.
  33. 제32항에 있어서, 상기 IgG Fc 프레그먼트가 IgGl 프레그먼트인, 융합 단백질.
  34. 제32항에 있어서, 상기 힌지 구역이 상기 에리스로포이에틴 펩티드 부분에 직접 결합되는(coupled), 융합 단백질.
  35. 제32항에 있어서, 상기 힌지 구역과 상기 에리스로포이에틴 펩티드 부분 사이에 펩티드 연결자(linker)를 포함하여 구성되는, 융합 단백질.
  36. 제30항에 있어서, 상기 힌지 구역이 길이가 적어도 9 개의 아미노산들인, 융합 단백질.
  37. 제36항에 있어서, 상기 힌지 구역이 그것의 N-말단으로부터 측정되었을 때 아미노산 (6)에 비-시스테인 잔기를 가지는, 융합 단백질.
  38. 제37항에 있어서, 상기 비-시스테인 잔기가 중성(neutral) 아미노산인, 융합 단백질.
  39. 제38항에 있어서, 상기 비-시스테인 잔기가 글리신인, 융합 단백질.
  40. 제36항에 있어서, 상기 힌지 구역이, 그것의 N-말단으로부터 측정되었을 때 아미노산 (6)에 비-시스테인 잔기를 가지는 인간 Fc 프레그먼트 변종인, 융합 단백질.
  41. 제34항에 있어서, 상기 힌지 구역이, SEQ. ID. 번호 5에 존재하는 아미노산 서열, 또는 그것과 적어도 90% 동일하며, 상기 힌지 구역의 N-말단으로부터 측정되었을 때 아미노산 (6)에 비-시스테인 잔기를 가지는 서열을 가지는, 융합 단백질.
  42. 제30항에 있어서, 포유류에 투여될 때 상기 단백질의 반감기가, 동일한 수단에 의해 상기 포유류에 투여된 천연 인간 에리스로포이에틴보다 적어도 3 배 더 긴, 융합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 포유류에 투여될 때 상기 단백질의 반감기가, 동일한 수단에 의해 상기 포유류에 투여된 천연 인간 에리스로포이에틴보다 적어도 4 배 더 긴, 융합 단백질.
  44. 제42항에 있어서, 상기 포유류가 인간인, 융합 단백질.
  45. 각기 제30항의 단백질들인 제1 및 제2 융합 단백질들을 포함하여 구성되고, 상기 제1 융합 단백질의 상기 힌지 구역이 이황화 결합들에 의해 상기 제2 융합 단백질의 상기 힌지 구역에 결합되는, 다이머.
  46. 각각 제30항의 단백질들인 복수의 연결된 융합 단백질들을 포함하여 구성하 는 다량체 단백질 구성체.
  47. SEQ. ID. 번호 1에 존재하는 핵산 서열을 포함하여 구성되는 재조합 DNA 분자.
  48. 각각 SEQ. I.D. 번호 2에 존재하는 아미노산 서열을 갖는 한 쌍의 폴리펩티드들을 포함하여 구성되는 다이머.
KR1020087021042A 2006-01-27 2007-01-25 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들 KR101235124B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/340,661 2006-01-27
US11/340,661 US7625564B2 (en) 2006-01-27 2006-01-27 Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
PCT/CA2007/000107 WO2007085084A1 (en) 2006-01-27 2007-01-25 Recombinant human epo-fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117031687A Division KR20120014936A (ko) 2006-01-27 2007-01-25 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080109739A true KR20080109739A (ko) 2008-12-17
KR101235124B1 KR101235124B1 (ko) 2013-03-07

Family

ID=38308802

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087021042A KR101235124B1 (ko) 2006-01-27 2007-01-25 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들
KR1020117031687A KR20120014936A (ko) 2006-01-27 2007-01-25 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117031687A KR20120014936A (ko) 2006-01-27 2007-01-25 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들

Country Status (21)

Country Link
US (8) US7625564B2 (ko)
EP (2) EP1994157B1 (ko)
JP (3) JP5222153B2 (ko)
KR (2) KR101235124B1 (ko)
CN (3) CN102816242B (ko)
AU (1) AU2007209722B2 (ko)
BR (1) BRPI0706742C1 (ko)
CA (1) CA2650072C (ko)
DK (2) DK2450373T3 (ko)
ES (2) ES2539759T3 (ko)
HK (2) HK1125673A1 (ko)
IL (1) IL192801A (ko)
MX (1) MX2008009322A (ko)
NZ (1) NZ569702A (ko)
PL (2) PL2450373T3 (ko)
PT (2) PT1994157E (ko)
RU (1) RU2433181C2 (ko)
SG (2) SG10201404308RA (ko)
TW (1) TWI454482B (ko)
WO (1) WO2007085084A1 (ko)
ZA (1) ZA200805920B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022080912A1 (ko) * 2020-10-16 2022-04-21 주식회사 아이엠바이오로직스 IgM 영역을 이용한 융합단백질 플랫폼

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005235635B2 (en) 2004-04-21 2010-11-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bone delivery conjugates and method of using same to target proteins to bone
US20070081984A1 (en) 2005-10-11 2007-04-12 Shunji Tomatsu Compositions and methods for treating hypophosphatasia
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
JP4356902B2 (ja) * 2006-12-28 2009-11-04 信広 益子 歯ブラシ
BRPI0814465B1 (pt) * 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica
WO2010087994A2 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
EP2401302A4 (en) 2009-02-24 2013-10-09 Alexion Pharma Inc ANTIBODIES CONTAINING TPO / EPO MIMETIC THERAPEUTIC PEPTIDES
US20110016548A1 (en) * 2009-07-16 2011-01-20 University Of Southern California Control of endogenous dnmt1 gene expression by exogenous binary regulatory systems
EP2563406A4 (en) 2010-04-30 2013-11-13 Alexion Pharma Internat Sarl METHOD, COMPOSITIONS AND KITS FOR TREATING MATRIX MINERALIZATION DISORDERS
CN102260343A (zh) 2010-05-25 2011-11-30 健能隆医药技术（上海）有限公司 重组人g-csf二聚体在治疗神经损伤疾病中的用途
AU2011350066A1 (en) 2010-12-27 2013-07-11 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
PL2726092T3 (pl) 2011-06-28 2019-11-29 Inhibrx Lp Polipeptydy fuzyjne serpiny i sposoby ich stosowania
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2737905B1 (en) 2011-07-25 2019-09-11 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Use of g-csf dimer in preparation of medicament for treatment of neurodegenerative diseases
EP2561888A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases
WO2013027191A1 (en) * 2011-08-25 2013-02-28 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides
KR101183615B1 (ko) * 2011-12-28 2012-09-17 재단법인 경기과학기술진흥원 Ｗｎｔ에 결합하는 신규한 재조합 단백질
US9488664B2 (en) 2012-01-25 2016-11-08 Sbi Pharmaceuticals Co., Ltd. Diagnostic agent for tumor
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
CA2880929A1 (en) * 2012-09-07 2014-03-13 Sanofi Fusion proteins for treating a metabolic syndrome
WO2014093387A1 (en) * 2012-12-10 2014-06-19 Kindred Biosciences, Inc. Vegf receptor fusion proteins for veterinary use
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
RU2563175C1 (ru) * 2014-06-03 2015-09-20 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тюменская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздрава России) Способ стимуляции эритропоэза в предоперационном периоде
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
WO2016044676A2 (en) * 2014-09-18 2016-03-24 AskGene Pharma, Inc. Novel feline erythropoietin receptor agonists
JP6787894B2 (ja) 2014-12-05 2020-11-18 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 組換えアルカリホスファターゼを用いた発作の処置
RU2673548C1 (ru) * 2015-01-09 2018-11-28 Генексин, Инк. Способ лечения анемии с применением композиции ЕРО длительного действия
JP6868561B2 (ja) 2015-01-28 2021-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼ欠損を有する被験者を治療する方法
EP3291670A1 (en) 2015-05-04 2018-03-14 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Transgenic production of fc fusion proteins
WO2016178087A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Biosourcing Sa Transgenic production of chorionic gonadotropin
US11352612B2 (en) 2015-08-17 2022-06-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
EP3355904A4 (en) 2015-09-28 2019-06-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA
CN105111315B (zh) * 2015-09-29 2018-05-22 海南医学院 MIP3α-Fc融合蛋白及其用途
KR101847169B1 (ko) * 2015-10-07 2018-04-09 주식회사 녹십자 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물
US11400140B2 (en) 2015-10-30 2022-08-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
CN114835795A (zh) * 2015-11-16 2022-08-02 Ubi蛋白公司 用于延长蛋白质半衰期的方法
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
JP2019513711A (ja) 2016-04-01 2019-05-30 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼによって筋力低下を治療すること
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
WO2018105988A1 (ko) * 2016-12-05 2018-06-14 한미약품 주식회사 면역반응이 약화된 결합체
AU2018243320A1 (en) 2017-03-31 2019-10-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
WO2018203582A1 (ko) * 2017-05-05 2018-11-08 주식회사 유비프로틴 단백질 반감기를 증가시키는 방법
CN110078817B (zh) * 2018-01-26 2021-02-19 重庆精准生物技术有限公司 一种改良的铰链区及其在构建car骨架中的应用
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
WO2020053661A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Methods of purifying antibodies from the milk of transgenic non-human mammals comprising the use of chitosan
RU2696864C1 (ru) * 2018-09-24 2019-08-07 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ профилактики нарушений микроциркуляции в почках асиалированным эритропоэтином в эксперименте
RU2678768C1 (ru) * 2018-09-25 2019-02-01 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") Способ профилактики ишемически-реперфузионных повреждений почек карбамилированным дарбэпоэтином в эксперименте
CN113493519B (zh) * 2020-03-19 2022-12-27 浙江道尔生物科技有限公司 一种半衰期显著延长的治疗眼部血管新生疾病的融合蛋白
US20230357341A1 (en) * 2020-06-10 2023-11-09 Bica Therapeutics Inc. Fusion protein containing erythropoietin polypeptide
WO2022006601A1 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 Northwestern University Human recombinant ace2-fc mutants that decouple anti-sars-cov-2 activity from cardiovascular effects
CN111704676A (zh) * 2020-07-17 2020-09-25 上海延立药业有限公司 一种长效重组促红细胞生成素及其制备方法和应用

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ210501A (en) 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
EP0464533B1 (de) 1990-06-28 1998-07-29 Hoechst Aktiengesellschaft Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
ITFI940106A1 (it) 1994-05-27 1995-11-27 Menarini Ricerche Sud Spa Molecola ibrida di formula gm-csf-l-epo o epo-l-gm-csf per la stimolaz ione eritropoietica
JPH11501506A (ja) 1994-12-12 1999-02-09 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター キメラ型サイトカインおよびその利用
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US7696338B2 (en) 1995-10-30 2010-04-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof
US6936439B2 (en) 1995-11-22 2005-08-30 Amgen Inc. OB fusion protein compositions and methods
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
AU8182298A (en) 1997-07-10 1999-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Recombinant erythropoietin / immunoglobulin fusion proteins
AU751823B2 (en) 1998-05-14 2002-08-29 Merck Patent Gmbh Fused protein
US20050181482A1 (en) 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
EP1088084B1 (en) 1998-06-15 2006-09-13 GTC Biotherapeutics, Inc. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
JP4944324B2 (ja) * 1999-07-13 2012-05-30 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 免疫グロブリン融合タンパク質
AU1226901A (en) 1999-10-22 2001-05-08 Amgen, Inc. Biodegradable microparticles with novel erythropoietin stimulating protein
CA2391080A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Erythropoietin forms with improved properties
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
PT1274728E (pt) * 2000-04-21 2008-06-20 Amgen Inc Métodos e composições para a prevenção e tratamento de anemia
DE60117919T2 (de) 2000-12-11 2006-12-14 Cheil Jedang Corp. Fusionsprotein mit verbesserter in vivo erythropoietinwirkung
CN101684158A (zh) 2001-01-17 2010-03-31 特鲁比昂药品公司 结合域-免疫球蛋白融合蛋白
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
PL206701B1 (pl) 2001-03-07 2010-09-30 Merck Patent Gmbh Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego
US6992174B2 (en) * 2001-03-30 2006-01-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
US6900292B2 (en) * 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
US6797493B2 (en) 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
KR100467750B1 (ko) 2001-11-29 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
KR100467751B1 (ko) 2001-12-03 2005-01-24 씨제이 주식회사 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질
CN100343393C (zh) * 2002-03-15 2007-10-17 布赖汉姆妇女医院 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药
US20040063912A1 (en) 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
DE10227606B3 (de) 2002-06-20 2004-01-22 Bionethos Holding Gmbh Verwendung von Thrombopoietin zur Kultivierung von Hepatozyten
AU2003232081B2 (en) 2002-07-03 2009-02-05 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
WO2004042017A2 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2315664T3 (es) * 2003-06-30 2009-04-01 Domantis Limited Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados.
JP2007504245A (ja) 2003-09-05 2007-03-01 ジェネンテック・インコーポレーテッド 変更したエフェクター機能を有する抗体
US20060134105A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Xencor, Inc. IgG immunoglobulin variants with optimized effector function
BRPI0417916A (pt) * 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
EP1586585A1 (de) * 2004-04-14 2005-10-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Expressionssystem zur Herstellung von IL-15/Fc-Fusionsproteinen und ihre Verwendung
US20090142294A1 (en) 2005-01-25 2009-06-04 Apollo Life Sciences Limited Parameter selected gm-csf, il-3, il-4, il-5 and chimeras thereof for therapeutic and diagnostic purposes
AU2006316450A1 (en) 2005-11-24 2007-05-31 Merck Serono Sa Erythropoietin polypeptides and uses thereof
US7625564B2 (en) 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
BRPI0814465B1 (pt) 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022080912A1 (ko) * 2020-10-16 2022-04-21 주식회사 아이엠바이오로직스 IgM 영역을 이용한 융합단백질 플랫폼

Also Published As

Publication number Publication date
MX2008009322A (es) 2008-10-17
NZ569702A (en) 2012-03-30
CA2650072A1 (en) 2007-08-02
US20100099145A1 (en) 2010-04-22
ZA200805920B (en) 2009-08-26
JP2016006116A (ja) 2016-01-14
AU2007209722B2 (en) 2012-07-26
CA2650072C (en) 2015-11-24
SG169351A1 (en) 2011-03-30
JP2013066477A (ja) 2013-04-18
PT1994157E (pt) 2015-07-22
US20230265143A1 (en) 2023-08-24
EP1994157B1 (en) 2015-03-18
US20070178112A1 (en) 2007-08-02
JP6103579B2 (ja) 2017-03-29
PL1994157T3 (pl) 2015-08-31
WO2007085084A1 (en) 2007-08-02
PT2450373E (pt) 2015-07-27
US20190070307A1 (en) 2019-03-07
US20170114110A1 (en) 2017-04-27
KR20120014936A (ko) 2012-02-20
BRPI0706742B1 (pt) 2019-12-03
HK1125673A1 (en) 2009-08-14
CN102816242A (zh) 2012-12-12
CN102516399B (zh) 2017-03-22
US20090297522A1 (en) 2009-12-03
US10233223B2 (en) 2019-03-19
KR101235124B1 (ko) 2013-03-07
EP1994157A1 (en) 2008-11-26
US20130224198A1 (en) 2013-08-29
US8431132B2 (en) 2013-04-30
HK1170507A1 (en) 2013-03-01
ES2539778T3 (es) 2015-07-06
RU2008134389A (ru) 2010-03-10
BRPI0706742A2 (pt) 2011-04-05
US20100098716A1 (en) 2010-04-22
AU2007209722A1 (en) 2007-08-02
US7625564B2 (en) 2009-12-01
EP2450373A2 (en) 2012-05-09
US11279742B2 (en) 2022-03-22
BRPI0706742C1 (pt) 2021-05-25
DK1994157T3 (da) 2015-06-22
CN102816242B (zh) 2017-10-20
US9375487B2 (en) 2016-06-28
DK2450373T3 (da) 2015-06-22
SG10201404308RA (en) 2014-10-30
RU2433181C2 (ru) 2011-11-10
ES2539759T3 (es) 2015-07-03
IL192801A0 (en) 2009-02-11
CN102516399A (zh) 2012-06-27
US7964375B2 (en) 2011-06-21
JP2009524415A (ja) 2009-07-02
US10117949B2 (en) 2018-11-06
EP1994157A4 (en) 2009-11-11
EP2450373B1 (en) 2015-03-18
TWI454482B (zh) 2014-10-01
IL192801A (en) 2016-05-31
TW200904829A (en) 2009-02-01
BRPI0706742B8 (pt) 2019-12-24
CN101321870B (zh) 2012-07-04
EP2450373A3 (en) 2012-09-26
PL2450373T3 (pl) 2015-08-31
JP5222153B2 (ja) 2013-06-26
CN101321870A (zh) 2008-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101235124B1 (ko) 증강된 에리스로포이에틴 활성과 연장된 체내 반감기를 갖는 재조합 인간 ｅｐｏ-ｆｃ 융합 단백질들
KR20150006060A (ko) 섬유모세포 성장 인자 21 단백질
US8252744B2 (en) Implantable pump for protein delivery for obesity control by drug infusion into the brain
TWI554520B (zh) 在活體中具有延長之半生期以及提高之紅血球生成活性的重組人類紅血球生成素（ｅｐｏ）-ｆｃ融合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160126

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180131

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200131

Year of fee payment: 8