BRPI0706742A2 - proteìna de fusão, construção de proteìna dimérica, proteìna dimérica, composição farmacêutica, sequência de ácido nucleico, molécula de dna recombinante, linhagem de células, métodos para produzir uma proteìna e para estimular a eritropoiese em um mamìfero, e, dìmero - Google Patents

Abstract

PROTEINA DE FUSãO, CONSTRUçãO DE PROTEINA DIMERICA, PROTEiNA DIMERICA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, SEQUENCIA DE áCIDO NUCLEICO, MOLéCULA DE DNA RECOMBINANTE, LINHAGEM DE CéLULAS, METODOS PARA PRODUZIR UMA PROTEiNA E PARA ESTIMULAR A ERITROPOJESE EM UM MAMìFERO, E, DìMERO Uma proteína de fusão recombinante compreendendo uma porção de peptídeo de eritropoietina humana ligada a uma porção de peptídeo de imunoglobulina é descrita. A proteína de fusão tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação com a eritropoietina humana de ocorrência natural ou nativarecombinante. Em uma forma de realização da invenção, a proteína tem uma meia-vida in vivo pelo menos três vezes maior do que a da eritropoietina humana nativa. A proteína de fusão também demonstra uma melhorada bioatividade eritropoiética em comparação com a eritropoietina humana nativa. Em uma forma de realização, a proteína de fusão compreende a seqúência de peptídeo completade uma molécula de eritropoietina humana (EPO) e a seqúência de peptídeo de um fragmento Fc de imunoglobulina humana IgG 1. O fragmento Fc na proteína de fusão inclui a região de articulação, domínios CH2 e C113 de imunoglobulina humana IgGl. A molécula de EPO pode estar ligada diretamente ao fragmento Fe para evitar ligadores de peptídeo estranhos e diminuir o risco de uma resposta imunogênica quando administrada in vivo. Em uma forma de realização, a regiãode articulação é uma variante do fragmento Fc humano tendo um resíduo não cisteína em aminoácido 6. A invenção também refere-se às seqúências de ácido nucleico e aminoácido codificando a proteína de fusão e linhagens de células transfectadas e métodos para produzir a proteína de fusão. A invenção ainda inclui composições farmacêuticas compreendendo a proteína de fusão e métodos de usar a proteína de fusão e/ou as composições farmacêuticas, por exemplo para estimular a eritropoiese em indivíduos em necessidade de terapia.

Description

"PROTEÍNA DE FUSÃO, CONSTRUÇÃO DE PROTEÍNA DIMÉRICA,PROTEÍNA DIMÉRICA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, MOLÉCULA DE DNARECOMBINANTE, LINHAGEM DE CÉLULAS, MÉTODOS PARAPRODUZIR UMA PROTEÍNA E PARA ESTIMULAR A ERITROPOIESEEM UM MAMÍFERO, E, DÍMERO"

Pedido relacionado

Este pedido refere-se a e reivindica o benefício de pedido depatente US 11/340 661, depositado em 27 de janeiro de 2006, que é aquiincorporado por referência em sua totalidade.

Campo Técnico

Este pedido refere-se a proteínas de fusão de eritropoietinahumana.

Fundamentos

A eritropoietina humana (EPO), um membro da família defator de crescimento hematopoiético, é sintetizada principalmente no rimadulto e no fígado fetal em resposta a hipoxia de tecido devido àdisponibilidade de oxigênio no sangue diminuído [1]. A função principal deEPO consiste em atuar diretamente sobre alguns progenitores de células dosangue vermelhas (RBC) e precursores na medula óssea para estimular asíntese de hemoglobina e RBCs maduros. Também controla a proliferação,diferenciação e maturação de RBCs. EPO recombinante tendo a seqüência deaminoácido de EPO de ocorrência natural foi produzido e aprovado para trataranemia associada com a falha funcional do rim, câncer e outras condiçõespatológicas [2]. Além de suas propriedades eritropoiéticas, relatórios depesquisa recente [3] indicam que EPO também atua em células não da medulaóssea como neurônios, sugerindo outras funções fisiológicas / patológicaspossíveis de EPO no sistema nervoso central (SNC) e outros órgãos/ sistemas.Porque os receptores de EPO foram encontrados em muitos órgãos diferentes,EPO pode ter efeitos biológicos múltiplos, como atuando como um agenteanti-apoptótico.

EPO humano é uma glicoproteína com um peso molecular de30,4 quilodaltons. Os carboidratos perfazem aproximadamente 39% de suamassa total. 0 gene de EPO está localizado no cromossomo 7q 12-22 e seestende em uma região de 5,4kb com cinco exons e quatro introns [4], Oprecursor de EPO consiste de 193 aminoácidos. A clivagem da seqüêncialíder e o último aminoácido Arg por modificação pós-translacional dá o EPOmaduro tendo 165 aminoácidos. A glicosilação com três sítios N-Iigados aAsn24, Asn38, Asn83 e um sítio O-Iigado a Serl26, desempenha um papelcrucial na biossíntese, estrutura terciária e na bioatividade in vivo de EPO [5].EPO funciona por ligação a um receptor de eritropoietina, um polipeptídeo detransmembrana glicosilado e fosforilado com o peso molecular de 72-78quilodaltons. Esta ligação desencadeia a homodimerização dos receptores queleva à ativação de várias vias de transdução de sinal: sistema JAK2/STAT5,proteína G, canal de cálcio, e quinases. Duas moléculas de proteína EPO sãonecessárias para ligar simultaneamente a uma molécula de receptor para obteruma ativação do receptor ótima [6].

Como o primeiro fator de crescimento hematopoiéticoaprovado para terapia humana, EPO humana recombinante (rHuEPO) temsido usada para o tratamento de anemia resultante de falha renal crônica,cânceres (primariamente anemia associada com quimioterapia), doençasautoimunes, AIDS, cirurgia, transplante de medula óssea e síndromesmielodisplásicas, etc. Como interessante, estudos recentes tambémobservaram que rHuEPOs tem funções no sistema não sangue e mostraram opotencial de serem usados como um fármaco neuro-protetor para isquemiacerebral, trauma no cérebro, doença inflamatória e distúrbios degenerativosneurais [7].

Atualmente, três tipos de rHuEPO ou análogos de rHuEPO sãocomercialmente disponíveis, ou seja rHuEPO alfa, rHuEPO beta edarbepoetina alfa [8]. Estas três proteínas recombinantes ligam no mesmoreceptor de eritropoietina, mas diferem em estrutura, grau de glicosilação,afinidade de ligação ao receptor e metabolismo in vivo. Desde a introduçãoinicial de rHuEPO-alfa nos anos 80, os clínicos rapidamente reconhecerem aexigência de dose/ injeção freqüente do fármaco como um inconvenientesignificante. As meias-vidas in vivo médias de rHuEPO-alfa e rHuEPO betaadministradas intravenosamente ou subcutaneamente são de apenas 8,5 e 17h, respectivamente [9, 10]. Os pacientes assim precisam de um esquema deinjeção diário, duas vezes por semana ou três vezes por semana, o que impõeuma carga tanto para os pacientes como para o pessoal de saúde. Assim, setem uma necessidade existente há muito tempo de desenvolver análogos deEPO recombinantes tendo uma meia-vida in vivo mais longa e/ou umaatividade eritropoiética melhorada.

Tentativas foram feitas na técnica anterior para mudargeneticamente ou modificar quimicamente a estrutura da proteína EPO nativapara ou retardar seu metabolismo in vivo como para melhorar as propriedadesterapêuticas. Por exemplo, parece existir uma correlação direta entre asquantidades de carboidratos contendo ácido siálico na molécula de EPO e seumetabolismo in vivo e a atividade funcional. O aumento no teor decarboidrato da molécula de EPO assim resulta em uma meia-vida mais longae atividades melhoradas in vivo [11,12]. Amgen projetou o análogo derHuEPO darbepoetina alfa para incluir 5 cadeias de carboidratos N-ligadas,duas a mais que rHuEPO. A darbepoetina alfa é também conhecida comoproteína estimulante de eritropoiese nova (NESP) e é vendida sob a marcaregistrada Aranesp ™. A darbepoetina alfa difere da EPO humana nativa emcinco posições (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro90Thr) quepermite a fixação de dois oligossacarídeos N-Iigados adicionais nas posiçõesde resíduo de asparagina 30 e 88. A darbepoetina alfa liga ao receptor de EPOem um modo idêntico como EPO nativo para induzir a sinalização intracelularenvolvendo a fosforilação de tirosina por JAK-2 quinase e as mesmasmoléculas intracelulares Ras/MAP-k, P13-k e STAT-5. Devido ao teor decarboidratos aumentado, a meia-vida de darbepoetina alfa em tanto animaiscomo humanos é quase três vezes mais longa do que a de rHuEPO-alfa (25,3h versus 8,5 h) [9]. A darbepoetina alfa (Aranesp ™) também parecedemonstrar uma melhorada bioatividade em comparação com EPO humanarecombinante ou de ocorrência natural in vivo [13] e foi aprovada pelo FDAcomo uma segunda geração de fármaco de rHuEPO; este fármaco somenteprecisa ser administrado uma vez por semana para obter os efeitosterapêuticos idênticos de injeções de 2-3 vezes por semana de rHuEPO [10,14, 15].

Outras tentativas para prolongar a meia-vida de EPO foramfocalizadas no aumento do peso molecular da proteína EPO através deconjugação química com polietileno glicol (PEGuilação) e outros. EPOPEGuilado tem um peso molecular bem maior e é protegido de ser depuradoda circulação e assim tem uma meia-vida no plasma mais longa [16]. Noentanto, a PEGuilação pode alterar a estrutura de proteína resultando emmudanças não antecipadas de função e especificidade da porção de EPO.Existem também relatos de aumento do peso molecular de EPO por outrosmétodos, como para ligar a molécula de EPO a uma proteína veículo(albumina humana), ou para formar a homodimerização de duas moléculas deEPO completas por uso de peptídeos de ligação (3 a 17 aminoácidos) ou porreagentes de reticulação química [17, 18, 19, 20]. Apesar destes métodosterem obtido algum sucesso para prolongar a meia-vida e melhorar asatividades de EPO, a combinação da molécula de EPO com o fragmento Fc deimunoglobulina humana (IgG) em uma proteína de fusão, como descrito nopresente pedido, alcança vantagens singulares.

A imunoglobulina humana IgG é composta de quatropolipeptídeos ligados covalentemente por ligações dissulfeto (duas cópiasidênticas de cadeia leve e cadeia pesada). A proteólise de molécula de IgG porpapaína gera dois fragmentos de Fab e um fragmento de Fe. O fragmento deFc consiste de dois polipeptídeos ligados juntos por ligações dissulfeto. Cadapolipeptídeo, de N- a C-terminal, é composto de uma região de articulação,um domínio CH2 e um domínio CH3. A estrutura de fragmento de Fc é quaseigual entre todos os sub-tipos de imunoglobulina humana. IgG está dentreuma das proteínas mais abundantes no corpo humano e perfaz até 70 a 75%das imunoglobulinas totais no soro humano. A meia -vida de IgG nacirculação é a mais longa dentre todos os cinco tipos de imunoglobulina epode alcançar 21 dias.

A tecnologia de bioengenharia moderna tem sido aplicada comsucesso à criação de proteínas de fusão consistindo de fragmentos de proteínaterapêutica, como citocinas e receptores solúveis, e o fragmento Fc de IgGhumana [21, 22, 23, 24]. Estas proteínas de fusão tem uma meia vida in vivosignificantemente mais longa enquanto retendo suas propriedades biológicas eterapêuticas. Até agora, duas proteínas de fusão compreendendo umfragmento de Fc foram desenvolvidas com sucesso como bio-remédios eaprovadas pelo FDA para o tratamento de artrite reumatóide e psoríase deplaca crônica (25, 26].

Foi demonstrado na técnica anterior que os dímeros de duasmoléculas de EPO ligados ou por reticulação química ou por polipeptídeodemonstram atividades in vivo melhoradas e uma meia-vida prolongada [17,19]. A atividade melhorada pode ser devido à ligação mais eficiente dodímero de EPPO a um receptor, e a meia-vida in vivo prolongada devido aotamanho maior da proteína de dímero. No entanto, o processo de reticulaçãoquímica não é eficiente e é difícil de controlar. Além disso, o peptídeo deligação no dímero de EPO pode alterar a estrutura tri-dimensional demolécula de EPO e o próprio peptídeo pode estimular as respostasimunogênicas in vivo. Estes inconvenientes afetam o potencial terapêutico dedímeros de EPO, particularmente porque a terapia de substituição com EPOem pacientes renais é para a vida toda.

A necessidade assim fez surgir análogos de EPO que tem umameia-vida significantemente mais longa e atividades eritropoiéticasmelhoradas in vivo mas não tem propriedades imunogênicas aumentadas.

Sumário da Invenção

De acordo com a invenção, uma proteína de fusãorecombinante compreendendo uma porção de peptídeo eritropoietina humanaligada a uma porção de peptídeo imunoglobulina é descrita. A proteína defusão tem uma meia-vida in vivo prolongada em comparação com aeritropoietina humana nativa recombinante ou de ocorrência natural. Em umaforma de realização da invenção, a proteína tem uma meia-vida in vivo depelo menos três vezes maior do que a eritropoietina humana nativa. Aproteína de fusão também pode demonstrar bioatividade eritropoiéticamelhorada em comparação com a eritropoietina humana nativa.

Em uma forma de realização, a porção de peptídeo deimunoglobulina é um fragmento Fc, como um fragmento IgGl. O fragmentoFc inclui domínios CH2 e CH3 e uma região de articulação. A porção depeptídeo EPO pode ser diretamente ligada à região de articulação.Preferivelmente, a região de articulação tem pelo menos 9 aminoácidos emcomprimento. Em uma forma de realização, a porção de peptídeo EPO temum resíduo de cisteína próximo do C-terminal da mesma, e a região dearticulação inclui um resíduo de cisteína localizado o mais próximo da porçãode peptídeo EPO. Preferivelmente, estes dois resíduos de cisteína sãoespaçados em pelo menos 12 aminoácidos de distância. Em uma forma derealização, a porção de peptídeo EPO pode compreender uma molécula deEPO completa diretamente ligada à porção de imunoglobulina (isto é, não sãointerpostos ligadores de peptídeo externos entre as porções de EPO eimunoglobulina.

A invenção também refere-se a construções de proteínamultimérica compreendendo unidades múltiplas da proteína de fusão dainvenção, por exemplo, duas proteínas de fusão podem ser montadas comoum dímero, em que as regiões de articulação das proteínas são ligadas porligações dissulfeto. O dímero tem a forma geral de uma molécula de IgG e émais estável do que as moléculas de EPO livres.

A invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico eaminoácido codificando a proteína de fusão e linhagens de célulastransfectadas e métodos para produzir a proteína de fusão. A invençãotambém inclui composições farmacêuticas compreendendo a proteína defusão e métodos de usar a proteína de fusão e/ou as composiçõesfarmacêuticas, por exemplo para estimular a eritropoiese em indivíduos emnecessidade de terapia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Nos desenhos que ilustram várias formas de realização dainvenção mas que não são destinadas a serem construídas em um modolimitativo:

Figura IA é um diagrama esquemático mostrando a estruturageral da de proteína de fusão EPO-Fc humana recombinante (rHuEPO-Fc) dainvenção.

Figura IB é uma listagem de seqüência mostrando a seqüênciade nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida (aa) da proteínarHuEPO-Fc. O comprimento total de DNA é 1281 bp. Os 426 aminoácidos naseqüência de proteína deduzida incluem 27 aa para o peptídeo de sinal e 399aa para a proteína rHuEPO-Fc completa. A proteína rHuEPO-Fc completaconsiste de domínio EPO humano (166aa), região de articulação (16aa,sublinhado), e domínio CH2 e CH3 (217 aa) do fragmento Fc de IgGlhumano. O peso molecular calculado do polipeptídeo da proteína de fusãorHuEPO-Fc madura é 44.6kDa, composto de 18,5kDa (41,4%) de fragmentoEPO e 26,lkDa(58,6%) de fragmento IgGl Fe. Um homodímero é formadopor duas ligações dissulfeto via os dois resíduos de cisteína (em caixa) dentroda região de articulação. No resíduo 172 da proteína de fusão madura (isto é,o 6o aminoácido de região de articulação) o resíduo de cisteína nativo foisubstituído por glicina (negrito).

Figura 2 é um diagrama esquemático mostrando a estrutura easpectos do plasmídeo de expressão de mamífero pCDl usado para inserir aseqüência de DNA codificando o polipeptídeo da proteína de fusão rHuEPO-Fc, e para transfectar as células CHO que expressam a proteína de fusãorHuEPO-Fc.

Figura. 3 é uma imagem de SDS-PAGE mostrando ostamanhos da forma dimérica de proteína rHuEPO-Fc pura em uma condiçãonão reduzida e a forma monomérica de proteína rHuEPO-Fc pura emcondição reduzida por análise SDS-PAGE. A proteína rHuEPO-Fc purificadados sobrenadantes da linhagens de células CHO cultivadas expressandorHuEPO-FC existe principalmente como a forma dimérica e tem um pesomolecular de cerca de 180 kDa em gel Bis-Trisa 8% em condição nãoreduzida. Em condição reduzida (100 mM ditiotreitol, DTT) para romper asligações dissulfeto, o dímero é separado em duas unidades monoméricasidênticas com um peso molecular de 75 kDa.

Figura 4A e 4B são gráficos mostrando um aumentodependente da dose níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos normaistratados com injeção subcutânea três vezes por semana (s.c.) de rHuEPO-Fcou rHuEPO. Cada ponto representa o nível médio de Hb do grupo (6camundongos). Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antes tratamento.

A: Camundongos tratados com rHuEPO-Fc. B: Camundongos tratados comrHuEPO nativo

Figura 5A e 5B são gráficos mostrando o aumento dependenteda dose de níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos normais tratadoscom uma vez por semana s.c. com rHuEPO- Fc ou rHuEPO. Cada pontorepresenta o nível de Hb médio do grupo (6 camundongos). Níveis do dia 0representam os níveis de Hb antes tratamento. A: Camundongos tratados comrHuEPO-Fc. B: Camundongos tratados com rHuEPO nativo

Figura 6A e 6B são gráficos mostrando o aumento dos níveisde hemoglobina (Hb) em camundongos normais tratados com injeçãointravenosamente (i.v.) de 12^g/kg de rHuEPO-Fc ou rHuEPO. Cada pontorepresenta o nível de Hb médio do grupo (6 camundongos). Níveis do dia 0representam os níveis de Hb antes tratamento. A: Camundongos comtratamento uma vez a semana. B: Camundongos com tratamento 3 vezes porsemana.

Figura 7 é um gráfico mostrando o aumento dependente dadose dos níveis de hemoglobina (Hb) em 5/6 ratos nefrectomizados tratadoscom uma vez por semana s.c. com rHuEPO-Fc, rHuEPO ou darbepoetina-alfa(abreviado Darbe.). Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo. Oscontroles normais eram ratos normais com injeção de solução veículo.Controles de modelo eram os 5/6 ratos nefrectomizados com injeção desolução veículo. Os níveis de semana 0 representam os níveis de Hb antestratamento. *: semana (s) após o tratamento.

Figura 8 é um gráfico mostrando o aumento dependente dadose dos níveis de hemoglobina (Hb) em 5/6 ratos nefrectomizados tratadosuma vez a cada duas semanas s.c. com rHuEPO-Fc, rHuEPO ou darbepoetina-alfa (abreviada Darbe.). Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo.Os controles normais eram ratos normais com injeção de solução veículo.Controles de modelo eram os 5/6 ratos nefrectomizados com injeção desolução veículo. Os níveis de semana 0 representam os níveis de Hb antestratamento. *: semana(s) após o tratamento.

Figura 9 é um gráfico mostrando o aumento dependente dadose dos níveis de hemoglobina (Hb) em 5/6 ratos nefrectomizados tratadosuma vez a cada duas semana s i.v. com 62,5 μΒ/kg de rHuEPO-Fc, oudarbepoetina-alfa (abreviada Darbe.). Cada ponto representa o nível de Hbmédio do grupo. Os controles normais eram normais ratos com injeção desolução veículo. Controles de modelo eram os 5/6 ratos nefrectomizados cominjeção de solução veículo. Semana 0 níveis representam os níveis de Hbantes tratamento. *: semana (s) após tratamento.

Figura IOA- IOC mostram as comparações de potência derHuEPO-Fc, rHuEPO e darbepoetina-alfa para estimular a formação decolônias de CFU-E e BFU-E em 5/6 ratos nefrectomizados tratados comdoses e esquemas diferentes.O tratamento com rHuEPO-Fc e darbepoetina-alfa (abreviado Darbe.) mostrou potências dependentes da dose similares paraestimular a formação de colônias CFU-E e BFU-E5 enquanto rHuEPO foimenos potente. A, s.c. uma vez a cada semana. B, s.c. uma vez a cada 2semana s. C, i.v. uma vez a cada duas semanas.

Figura 11 é um gráfico mostrando os níveis séricos derHuEPO-Fc e rHuEPO após a injeção intravenosa de 5μg/kg de rHuEPO-Fcou rHuEPO para macacos Rhesus (níveis médios de 5 macacos).

Figura 12 é uma listagem de seqüências mostrando a seqüênciade nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos deduzida (aa) de uma proteínarHuEPO-FcC de tipo selvagem. Os particulares da seqüência são iguais comomostrado em Figura 1 exceto que um resíduo de cisteína de tipo selvagem,nativo, está presente no resíduo 172 da proteína de fusão madura (isto é, o 6oaminoácido de região de articulação).

Figura 13 é um gráfico mostrando aumento dependente dadose de níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos normais tratados comtrês vezes por semana injeção subcutânea (s. c.) de rHuEPO-Fc (a proteína defusão mutante da presente invenção), rHuEPO- FcC (a proteína ue fusão detipo selvagem) e rHuEPO. Cada ponto representa o nível de Hb médio dogrupo(8). Os controles normais eram camundongos normais com injeção desolução veículo. Níveis do dia 0 representam os níveis de Hb antestratamento.

Figura 14 é um gráfico mostrando o aumento dependente dadose dos níveis de hemoglobina (Hb) em camundongos normais tratados comuma vez por semana com injeção subcutânea (s. c.) de rHuEPO-Fc, rHuEPO-FcC e rHuEPO. Cada ponto representa o nível de Hb médio do grupo(8). Oscontroles normais eram camundongos normais com injeção de soluçãoveículo. Níveis do dia O representam os níveis de Hb antes do tratamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em toda a seguinte descrição os detalhes específicos sãoespecificados a fim de prover uma compreensão mais completa da invenção.No entanto, a invenção pode ser praticada sem estes aspectos particulares. Emoutros casos, elementos bem conhecidos não foram mostrados ou descritosem detalhes para evitar confundir desnecessariamente a presente invenção.Conseqüentemente, o relatório e desenhos devem ser considerados em umsentido ilustrativo, em vez de restritivo.

Este pedido refere-se a uma nova proteína de fusão tendopropriedades eritropoiéticas. A proteína de fusão, referida aqui comorHuEPO-Fc, compreende uma molécula de eritropoietina humana (EPO)ligada de modo recombinante a um fragmento Fc de imunoglobulina. Comodiscutido ainda abaixo, a proteína de fusão pode estar na forma de um dímeroconsistindo de duas subunidades de polipeptídeo idênticas. Na forma derealização mostrada em esquema na figura IA, cada subunidade depolipeptídeo, do N-terminal ao C-terminal, consiste da seqüência depolipeptídeo da molécula de EPO humana e a seqüência de polipeptídeo daregião de articulação. O domínio CH2 e o domínio CH3 do fragmento Fc daimunoglobulina humana IgGl. As duas subunidades de polipeptídeo sãoconectadas juntas por ligações dissulfeto entre as regiões de articulaçãorespectivas para formar a estrutura de dímero. O dímero assim tem a mesmaforma geral como uma molécula de IgG e demonstra uma melhor estabilidadedo que as moléculas de EPO livres, como discutido nos exemplos abaixo.

Como será evidente para um versado na técnica, a região dearticulação de uma imunoglobulina intacta provê à proteína flexibilidadesuficiente para uma ligação efetiva antígeno -anticorpo. Similarmente, napresente invenção, a região de articulação está incluída no desenho daproteína de fusão rHuEPO-Fc de modo a manter sua flexibilidade,especialmente quando a proteína de fusão está na forma dímero. Comodescrito abaixo, isto permite a ligação normal da porção de EPO da proteínade fusão rHuEPO-Fc para os receptores de EPO para ativar as funçõesbiológicas de EPO. Acredita-se que a forma dímero da proteína de fusãorHuEPO-FC, ao prover duas moléculas de EPO, é capaz de induzir a ativaçãoótima de receptores de EPO (por exemplo, ao facilitar a reticulação doreceptor).

Como demonstrado nos exemplos especificados abaixo, aproteína de fusão rHuEPO-Fc foi sintetizada com sucesso usando técnicas deDNA recombinantes. A proteína de fusão foi mostrada em estudos comcamundongos, ratos e primatas para exibir uma meia-vida in vivo prolongadae melhoradas propriedades eritropoiéticas em comparação com EPO humanonativo recombinante ou de ocorrência natural. Como usado neste pedido depatente os termos "eritropoietina humana nativa" e "EPO humana nativa"significam EPO tendo uma estrutura de tipo selvagem não modificada. Comoserá evidente para o versado na técnica, EPO humana nativa pode serproduzida de modo recombinante ou de ocorrência natural (por exemplorHuEPO alfa). O termo "EPO humana nativa" não inclui os análogos derHuEPO, como darbepoetina alfa onde a estrutura de EPO foi modificada demodo significante, como por hipergli COSlxuyu-O .

A seqüência de ácido nucleico da proteína de fusão rHuEPO -Fc da presente invenção é mostrada na SEQ ID NO: 1. A seqüência deaminoácido deduzida correspondente é mostrada em SEQ ID NO: 2. Aproteína de fusão rHuEPO-Fc completa tem 399 aminoácidos decomprimento. Como mostrado na figura 1B, a proteína de fusão rHuEPO-Fccompleta consiste de domínio de EPO (166 aminoácidos), a região dearticulação (16 aminoácidos, sublinhados) e os domínios CH2 e CH3 (217aminoácidos). Uma seqüência de peptídeo de sinal ou líder consistindo de 27aminoácidos é também mostrada na figura 1B. O peptídeo de sinal é clivadodurante a síntese de rHuEPO-Fc. As seqüências de ácido nucleico eaminoácido de rHuEPO-Fc incluindo o peptídeo de sinalo ou líder sãomostradas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Como melhor visto nas figura IB e SEQ ID NO: 2, o domíniode EPO tem um resíduo de cisteína próximo do C-terminal do mesmo emaminoácido número 161. A região de articulação inclui 2 resíduos de cisteína,em aminoácidos números 178 e 181, que estão em caixa na figura 1B. Osresíduos de cisteína da região de articulação formam as ligações dissulfetoentre as subunidades de polipeptídeo do homodímero, como discutido acima.A região de articulação de ocorrência natural de um fragmento de IgGlhumano também tem uma cisteína no resíduo número 6 da porção de regiãode articulação (medida do N-terminal). Na presente invenção, o resíduo decisteína 6 da porção de gancho foi substituído por um resíduo não cisteína.Em particular, na forma de realização da figura IB e SEQ ID NO: 2, oaminoácido cisteína foi substituído por glicina (em resíduo de aminoácido 172de rHuEPO-Fc, que corresponde ao resíduo 6 da região de articulação). Comoserá evidente para um versado na técnica, outros resíduos não cisteínatambém podem ser substituídos por cisteína neste local para evitar a formaçãode uma ligação dissulfeto.

Como um resultado da substituição de aminoácido em resíduo172, o primeiro resíduo de cisteína da região de articulação (em resíduo 178)é espaçado 17 aminoácidos do resíduo de cisteína acima descrito do domínioEPO (em resíduo 161). Os inventores acreditam que o espaçamento mínimoentre o resíduo cisteína 161 do domínio de EPO e o primeiro resíduo decisteína da região de articulação deve ser de pelo menos 12 aminoácidos parapermitir a montagem e/ou a ligação do receptor de EPO com sucesso de umhomodímero de rHuEPO-Fc. Isto é, se o resíduo 172 for um resíduo decisteína, uma ligação dissulfeto indesejável pode ser formada potencialmente,como entre os resíduos de cisteína 161 e 172. Isto pode alterar a estrutura tri-dimensional da molécula de EPO, resultando em inatividade biológica ouatividade biológica reduzida.

Em uma forma de realização da invenção, o domínio de EPO éligado diretamente à porção de fragmento de Fc da proteína de fusão. Aoevitar prover um peptídeo de ligador externo, a estrutura tri-dimensionalpreferida do peptídeo de fusão rHuEPO-Fc é mantida e o risco de desencadearuma resposta imunogênica indesejável é minimizado. A região de articulaçãodo fragmento de Fc é preferivelmente pelo menos 9 aminoácidos decomprimento e está preferivelmente na faixa de cerca de 10-20 aminoácidosem comprimento.

Os seguintes exemplos ainda irão ilustrar a invenção emmaiores detalhes, apesar de ser notado que a invenção não é limitada aosexemplos específicos.

1. Construção do pCdEpo-Fc plasmídeo recombinante codificando a proteínade fusão de rHuEPO-Fc

A molécula de DNA de comprimento completo, que codifica aseqüência de aminoácido do polipeptídeo de rHuEPO-Fc, foi gerada por PCRde sobreposição usando os seguintes iniciadores oligo (QIAGEN Inc., US):EF5: 5 ' -ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3EF3: 5 '-ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-S';EFL5: 5 ' -aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatctggtgaca-3EFL3: 5 ' -tgtcaccagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3

As seqüências dos iniciadores acima notados são listadas emSEQ. LD. Nos. 5-8 respectivamente.

Os sítios EcoR I e Not I foram introduzidos em EF5 e EF3,respectivamente. Para a expressão ótima da proteína HuEPO-Fc em célulasde mamíferos, a seqüência de Kozak (GCCACCATGG) foi tambémintroduzida em EF5. EFL5 e EFL3 são seqüências complementaresconsistindo de seqüência de DNA 3'-terminal de EPO (23bp) e seqüência deDNA 5 '-terminal de gancho de IgGl (22bp).

Primeiro, um fragmento de DNA de EPO de 0,6 kb foiamplificado por PCR (Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity) cominiciadores EF5 e EFL3 de plasmídeo p9E contendo o comprimento completode cDNA de EPO humana, fragmento Fc de 0,7 kb com iniciadores EF3 eEFL5 do plasmídeo pD contendo o comprimento completo de seqüência decDNA de IgGl humana, respectivamente (p9E e pD são do próprio laboratóriodos inventores). Os dois fragmentos foram então purificados e misturados emquantidade igual. Usando a mistura como gabarito, o DNA de rHuEPO-Fc decomprimento completo de 1,3 kb foi amplificado por iniciadores EF5 e EF3.

O fragmento de 1,3 kb purificado foi digerido por EocR I e Not I (NewEngland Biolab Inc. US) e então clonado em vetor de expressão pCD' demamífero digerido com EcoR I/Not I (Figura 2). O vetor recombinanteresultante foi chamado pCdEpo-Fc e a seqüência de ácido nucleico inseridacodificando a seqüência de aminoácidos da proteína HuEPO-Fc proteína foiconfirmada por seqüenciamento de DNA.

2. Estabelecimento da linhagem de células de expressão de rHuEPO-Fc

A célula de ovário de hamster chinês com deficiência emdiidrofolato reductase(dhfr) (CHO/dhfr, ATCC No.CRL-9096), que foiaprovada pelo FDA para produção de substâncias biológicas, foi usada comoa célula hospedeira para a expressão de rHuEPO-Fc.As células CHO-dhfr foram transfectadas com o vetorrecombinante pCdEpo-Fc usando Lipofectamine (Gibco, Cat.No: 18292-037,USA). Os sobrenadantes da cultura de clones selecionados foram testados porELISA (Roche, Cat.No: 1 -693 417, Canadá) para atividade de EPO. Osclones positivos foram ainda triados sob pressões de Metotrexato crescentes(MTX). Uma linhagem de células com a maior expressão de proteínarHuEPO-Fc foi selecionada com a linhagem de células CHO expressandorHuEPO-Fc, e gradualmente adaptada para meio isento de soro (meio CDCHO, Gibco, Cat.No: 10743-029, USA). Esta linhagem de células CHOexpressando rHuEPO-Fc foi usada para a produção de proteína rHuEPO-Fc.

3. Purificação de proteína rHuEPO-Fc

As moléculas de proteína rHuEPO-Fc contidas nossobrenadantes coletados do meio isento de soro cultivando as células CHOexpressando rHuEPO-Fc foram isoladas primeiro por cromatografia deafinidade de Proteína A (Amersham, Cat.No: 17-0402- 01, Canada). Asproteínas isoladas foram ainda purificadas por filtragem em gel em colunaHiLoad 16/60 Superdex 200pg (Amersham, Cat.No: 17- 1069-01, Canada). Apureza da proteína rHuEPO-Fc foi maior que 98% como determinado poreletroforese.

4. Determinação dos tamanhos da proteína rHuEPO-Fc pura

Primeiro, SDS-PAGE foi realizado para determinar ostamanhos da proteína rHuEPO-Fc pura. Como mostrado em Figura 3, umabanda única com peso molecular de cerca de 180 kDa foi vista em gel a 8%Bis-Tris na condição não reduzida, que mediu o tamanho global d proteínacom a existência das ligações dissulfeto. Isto indicou que a maior parte dasmoléculas de proteína rHuEPO-Fc eram produzidas como a forma dimérica,como esperado do projeto da proteína de fusão. Quando a análise SDS-PAGEfoi conduzida na condição de redução (100 niM ditiotreitol, DTT) pararomper as ligações dissulfeto, somente a banda com peso molecular de 75Kdafoi identificada, consistente com o peso molecular estimado de cadeia depolipeptídeo única de HuEPO-gancho região-CH2-CH3.

O peso molecular preciso da proteína de fusão pura rHuEPO-Fc com glicosilação, determinado por espectro de massa (MALDI-TOF-MS),foi 111,099 daltons (111,1 Kda). Neste teste, somente um pico único deproteína foi observado, indicando que a proteína rHuEPO-Fc purificada eraquase que 100% pura. Os 15 aminoácidos do N-terminal da proteína rHuEPO-Fc pura foram determinados por análise da seqüência de proteína como:APPRLICDSRVLERY. Isto foi consistente com a seqüência dos primeiros 15aminoácidos do polipeptídeo de EPO humana nativa, e confirma que aproteína rHuEPO-Fc purificada de fato tem a seqüência de molécula de EPOdireita e completa, como previsto pela seqüência de DNA codificando asseqüências de aminoácidos da proteína de fusão de rHuEPO-Fc.

5. Atividades eritropoiéticas melhoradas de rHuEPO-Fc em camundongosnormais

As experiências in vivo camundongos foram conduzidas paraconfirmar a retenção da atividade eritropoiética da proteína rHuEPO-Fc edeterminar sua eficácia comparada a rHuEPO e darbepoetina-alfa. Para finsde comparação, todas as doses de três EPOs usadas nas experiências comanimal descritas da invenção: rHuEPO-Fc dos requerentes, rHuEPO (isto é,EPO humana nativa) e darbepoetina-alfa, eram as quantidades de porção demolécula de EPO sozinha com base na base molar. Com relação à proteínarHuEPO-Fc, a porção de EPO contribui a 41,4% do peso molecular derHuEPO-Fc total, como calculado pela relação do peso de aminoácidos deEPO no peso de aminoácidos totais da molécula de rHuEPO-Fc completa(166 aa dentre 399 aa). A quantidade de EPO para rHuEPO-Fc foi entãodecidida como 41,4% da quantidade total da proteína rHuEPO-Fc.

rHuEPO-Fc (concentração de carga: 0,5 mg/ml, pureza de98,6%) e rHuEPO humano nativo (isto é estrutura de EPO humana natural)(6000 IU/0,5 ml, fabricado por Kirin Brewery Co., Japão) foram diluídos emsolução veículo (2,5mg/ml de albumina de soro humano, 5,8mg/ml de citratode sódio, 0,06mg/ml de ácido cítrico e 5,8mg/ml de cloreto de sódio, pH5,5-5,6). A dose de rHuEPO em quantidade foi calculada de acordo com suarelação de atividade / quantidade. Os camundongos BALB/c (6- a 8-semanasde idade, pesando 18-22g, números iguais de machos e fêmeas, adquiridos doExperiment Animal Center, AMMS, China) foram agrupados aleatoriamentecom 6 em cada grupo. Cada grupo de camundongos foi tratado com umacombinação de uma dose (0,1, 0,5, 2,5,12,5, 62µg/kg), uma via de injeção (i.v. pela veia da cauda ou s. c.) e um esquema de injeção (três vezes porsemana ou uma vez por semana ). O grupo de controle e camundongos foiinjetado com um volume igual de solução veículo. O tratamento durou 3semanas e os tempos de observação totais foram de 5 semanas. As amostrasde sangue periférico (veia da cauda) para medida foram tomadas antes dotratamento, no 4o dia e 7o dia de cada semana durante 5 semanas. Hb foimedido como o índice por absortiometria. Média+ desvio padrão foicalculado a partir dos dados de cada grupo e o teste t foi conduzido dentregrupos diferentes.

A administração de EPO três vezes por semana aoscamundongos, desde que as EPOs tenham atividade eritropoiética normal, iráinduzir uma estimulação saturada de eritropoiese. Como mostrado na figura 4,ambos os grupos tratados com 3 vezes por semana s.c. tinham uma elevaçãosignificante dos níveis de Hb mesmo na dose de 2,5 μg/kg. Esta experiênciademonstrou que rHuEPO-Fc demonstrou uma atividade eritropoiética in vivotão efetiva como rHuEPO. A elevação dos níveis de Hb no grupo tratado foidependente da dose. No entanto, a elevação saturada dos níveis de Hb foiinduzida em camundongos na dose de 12µg/kg de rHuEPO-Fc, enquantouma elevação saturada similar dos níveis de Hb foi somente obtida na dose de62µg/kg de rHuEPO. A elevação de níveis Hb induzida por 2µg/kg derHuEPO-Fc foi também maior do que por 2,5 μg/kg de rHuEPO. Estesresultados sugeriram uma estimulação eritropoiética mais potente porrHuEPO- Fc do que rHuEPO.

A potência eritropoiética de rHuEPO-Fc foi ainda exploradapor redução dos tempos de injeção a uma vez por semana subcutaneamente.Como mostrado em Figura 5, os grupos tratados com rHuEPO-Fc mostraramuma elevação dependente da dose de níveis de Hb nas doses de 12,5, ou62^g/kg. Ambas as doses de 12,5 e 62^g/kg de rHuEPO tambéminduziram a elevação de níveis de Hb na extensão similar, que é bem menordo que por 62^g/kg de rHuEPO-Fc. Isto indica fortemente que rHuEPO-Fctem uma atividade eritropoiética melhorada in vivo. Isto é provavelmentedevido ou à meia-vida prolongada de rHuEPO-Fc in vivo ou ligação dereceptor/ ativação de EPO melhoradas pelas moléculas de EPO do dímero naproteína rHuEPO-Fc, ou pelos efeitos combinados de ambos.

Quando as mesmas doses (12^g/kg) de rHuEPO-Fc ourHuEPO foram administradas intravenosamente ou em três vezes por semanaou uma vez por semana, elevação dos níveis de Hb foi observada para todosos grupos tratados (Figura. 6). No entanto, a administração i.v. uma vez porsemana de rHuEPO-Fc induziu uma elevação maior, mais persistente dosníveis de Hb, que continuou depois após ter terminado o tratamento. Estesdados ainda apoiam as propriedades eritropoiéticas melhoradas da proteínarHuEPO-Fc em comparação com rHuEPO tendo a estrutura de proteína EPOde ocorrência natural.

6. Atividades eritropoiéticas melhoradas de rHuEPO-Fc em 5/6 ratosnefrectomizados

Experimentos em camundongos normais provaram asatividades eritropoiética melhoradas de rHuEPO-Fc in vivo. Para aindaobservar a eficácia de rHuEPO-Fc em estimulação de eritropoiese, estudosfarmacodinâmicos foram conduzidos em ratos com anemia renal experimentalque foi feita por 5/6 nefrectomia. A eficácia de rHuEPO-Fc foi comparadacom as de rHuEPO e darbepoetina-alfa (όΟμ^πιΙ, lote No.N079, fabricadopor Kirin Brewery Co., Japão).

Os ratos Wistar (macho e fêmea em número igual, pesando160-180 g, adquiridos de Vitalriver Experiment Animal Inc., Beijing, China.Licença No. SCXKl 1-00-0008) foram usado nesta invenção para criar omodelo de anemia devido à uma falha da função renal por nefrectomia deduas etapas. [27]. 5/6 nefrectomia foi feita em ratos com anestesia geral porduas operações separadas sob condição estéril. Após 2/3 do rim esquerdoserem resseccionados, os ratos foram deixados se recuperar durante vinte dias.O rim direito foi então resseccionado com cuidado. Antibióticos foramadministrados para evitar infecção após cada operação. No total 5/6 do tecidodo rim foi finalmente resseccionado. Os ratos nefrectomizados gradualmentedesenvolveram dissuficiência da função renal e anemia. Os ratos entraram emum estado estável de anemia 50 dias após a nefrectomia, e foram agrupadosaleatoriamente (9/grupo) para iniciar a administração de EPOs. Cada grupo deratos foi tratado com uma combinação de um esquema de dose (2,5,12,5,62^g/kg), uma via de injeção ( i.v. através da veia do rabo ou s. c.) e umainjeção (uma vez por semana ou uma vez a cada 2 semanas). O grupo decontrole e grupo de modelo de ratos foram injetados com volume igual desolução de veículo. O tratamento durou por 4 semanas e os tempos deobservação total foram de 6 semanas.

Todas as doses (2,5, 12,5, 62^g/kg) de rHuEPO-Fc,administradas subcutaneamente uma vez por semana, induziram umaelevação dependente da dose dos níveis de Hb comparando ao grupo decontrole de modelo que não receberam o tratamento com EPO. Tanto 12,5como 62^g/kg de rHuEPO ou darbepoetina, administrados subcutaneamenteuma vez por semana também induziu a elevação de níveis de Hb. Os níveisaumentados de Hb em ambos os grupos tratados com 12,5 ou 62,5 μg/kg derHuEPO-Fc foram significantemente maiores do que os nos grupos tratadoscom 12,5 ou 62,5 μg/kg de rHuEPO respectivamente. Os níveis de Hb em62,5 ug/kg de grupos tratados com rHuEPO-Fc foram também levementemaiores do que em 62,5 ug/kg de grupos tratados com darbepoetina. Apósparar o tratamento, a diminuição de níveis de Hb em 62,5 ug/kg de grupostratados com rHuEPO-Fc foi bem mais lenta e os níveis de Hb permanecerammaiores do que os de tanto os grupos de controle normais como de controle demodelo até o final da observação (duas semanas após tratamento ), indicandouma estimulação eritropoiética mais forte 6 prolongada (resumida em Figura 7).

Para o tratamento de injeção subcutânea uma vez a cada duassemanas, somente 12,5 ou 62,5 ug/kg de três EPOs foram administrados(Figura 8). 62,5 ug/kg de rHuEPO raramente aumentou os níveis de Hbcomparado ao grupo de controle de modelo, e a resposta eritropoiética fracados grupos tratados com 62,5 ug/kg de rHuEPO falharam em levar os níveisde Hb a normais em comparação com o grupo de controle normal.Tratamentos de ou rHuEPO-Fc ou darbepoetina nas doses de 12,5 ou62,5 ug/kg induziram uma significante elevação de níveis de Hb que foi maiordo que no grupo de controle normal, indicando a correção efetiva do estado deanemia por tanto rHuEPO-Fc como darbepoetina. Não foram observadassignificante diferenças entre algumas doses de rHuEPO-Fc e darbepoetina emtermos de eficácia. A dose elevada de 62,5 ug/kg resultou em um persistenteaumento de eritropoiese até o término da observação (duas semanas apóstratamento). Isto ainda sugeriu que rHuEPO-Fc e darbepoetina demonstram apropriedade de uma estimulação de longa duração de eritropoiese in vivo, quepor sua vez pode ser transferida para a redução das freqüências deadministração para os pacientes clinicamente.

Apesar de darbepoetina ter sido aprovada para aplicaçãoclínica com injeções menos freqüentes para aumentar a adesão do paciente ereduzir a carga de trabalho do pessoal de saúde, estes dados experimentaisindicam fortemente que rHuEPO-Fc descrito na presente invenção tem pelomenos efeitos em potencial similares. Como discutido acima, darbepoetina,como um análogo mutante da molécula de EPO humana contendo compostosde açúcar adicionais (aumentada glicosilação) pode ter um risco aumentadode induzir imunogênese in vivo devido às estruturas tri-dimensionaisalteradas. Somente uma observação a longo prazo de pacientes sofrendotratamento com darbepoetina irá dar uma resposta decisiva para os riscosimunogênicos de darbepoetina. Em contraste, rHuEPO-Fc, sem a medição daporção da molécula de EPO, tem um teor de carboidrato idêntico ou quasesimilar ao de EPO humana nativa. As quantidades de ácidos siálicos daproteína rHuEPO-Fc pura da invenção foram em torno de 10,0 mmol/mmolEPO, consistente com os parâmetros registrados de rHuEPO. A parte Fc derHuEPO-Fc, sem aminoácido(s)/ peptídeo de ligação externos, representa aestrutura geral de IgGl humana, e teoricamente não deve levar a uma respostaimunogênica. Se aprovada clinicamente, rHuEPO-Fc pode dar uma melhorescolha para os pacientes do que os análogos de rHuEPO e EPO atualmentedisponíveis, especialmente os que precisam de uma administração a longoprazo.

Uma vez injetada intravenosamente uma vez a cada duassemanas, tanto rHuEPO-Fc como darbepoetina ((62,5μg/kg) foram capazes deinduzir aumentos idênticos dos níveis de Hb em ratos com anemia renal bemacima dos níveis de Hb normais nos ratos de controle normais (figura 9). Istoainda demonstra a estimulação persistente de eritropoiese por rHuEPO-Fc,como a eficácia de darbepoetina foi provada clinicamente.

Os dados derivados de experiências de cultura de células decélulas de medula óssea coletados de 5/6 ratos nefrectomizados apóstratamentos (uma vez por semana ou por duas semanas, s.c. ou i.v.)mostraram que rHuEPO-Fc, rHuEPO e darbepoetina estimularam, todos, aformação de CFU-E e BFU-E. As potências de rHuEPO-Fc e darbepoetinaforam similares e mais fortes do que a de rHuEPO (figura 10).

Os níveis de urino nitrogênio (BUN) e Crea no sangue foramsimilares nos grupos tratados e grupo de controle de modelo. Os níveis de Fcséricos em todos os grupos tratados foram maiores do que os do grupo decontrole de modelo. Os exames patológicos observaram o aumento dedistribuição de células relacionadas com as células vermelhas do sangue(RBC) na medula óssea e baço de todos os ratos tratados com EPO.

7. Estudos farmacocinéticos de rHuEPO-Fc em macacos Rhesus

Como acima discutido, os inventores projetaram rHuEPO-Fcem tal modo que a porção de EPO da proteína de fusão retém as propriedadesfuncionais de EPO natural, como estimulando a eritropoiese, e o fragmento Fcde IgGl humana permite a existência estável da proteína de fusão emcirculação, assim prolongando sua meia-vida in vivo. Os estudos acima comanimais demonstraram que as atividades de eritropoiese de rHuEPO-Fc sãomelhoradas em comparação com rHuEPO. Os inventores também conduziramestudos farmacocinéticos para determinar meia-vida in vivo de rHuEPO-Fcem comparação com a de rHuEPO. Os primatas foram usados para gerardadas porque eles são biologicamente muito similares aos seres humanos.

O projeto do estudo foi baseado em relatos da literatura e asexperiências foram conduzidas de acordo com as diretrizes gerais defarmacocinética. Dois grupos de macacos Rhesus com 5 macacos em cadagrupo (3-5kg, adquirido do Experiment Animal Center, AMMS, China) foraminjetados intravenosamente com 5 μg/kg de rHuEPO-Fc ou rHuEPO,respectivamente. As amostras de sangue foram tomadas antes e a 0,017,0,167, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96, 168, 240 h após injeção. Os soros foramcoletados por centrifugação e os níveis séricos de rHuEPO-Fc ou rHuEPOforam determinados usando o teste irnunossorvente ligado a enzima deeritropoietina humana (ELISA) kits (adquirido de R&D Systems,Minneapolis, MN). A meia vida média e (tl/2) de rHuEPO-Fc e rHuEPOinjetados intravenosamente foi 35,24+/-5,15 h e 8,72+/-l,69 hrespectivamente (resumido em Figura 11).

Para observar a biodisponibilidade de rHuEPO-Fc, 5ug/kg derHuEPO-Fc foram injetados subcutaneamente a 5 macacos Rhesus. Asamostras de sangue foram tomadas antes e 1, 2, 5, 8, 10, 12, 15, 24, 48, 72,96, 168, 240 h após a injeção e os níveis séricos de rHuEPO-Fc foramdeterminados pelos kits de R&D. O índice de biodisponibilidade foi calculadocomo 35,71+/- 5,37% com a injeção subcutânea. Estas são cifras idênticas àbiodisponibilidade registrada de darbepoetina-alfa (Aranesp™) em pacientescom falha renal crônica [9, 15].

Estes dados demonstram que rHuEPO-Fc tem uma meia-vidasignificantemente prolongada em primatas, e a meia vida in vivo de rHuEPO-Fc é pelo menos quatro vezes mais longa do que a de rHuEPO fabricado porKirin Beer Brewing Co. de Japan. A meia-vida prolongada in vivoprovavelmente contribui para a atividade eritropoiética melhorada derHuEPO-Fc.

8. Imunogenicidade de rHuEPO-Fc em Macaca fascicularis

Como indicado acima, atenção é dada ao projeto de umaproteína de fusão rHuEPO-Fc para intencionalmente evitar ou minimizar asmudanças nas propriedades imunogênicas de proteína de fusão rHuEPO-Fc.

Os inventores evitaram incluir/ adicionar quaisquer seqüências deaminoácido(s) ou peptídeo de ligação externas na proteína de fusão. Aproteína de fusão rHuEPO-Fc inventada da forma de realização da figura IBsomente contém as seqüências de polipeptídeos da proteína EPO natural e ofragmento Fc (região de articulação, CH2, CH3) de IgGl humana, e deveteoricamente não induzir uma resposta imunogênica e a produção deanticorpos contra proteína rHuEPO-Fc. Como será notado por um versado natécnica, outras formas de realização tendo estruturas alternativas são tambémenglobadas pela presente invenção.

Os seguintes estudos com primatas foram conduzidos paraobservar a imunogenicidade de proteína rHuEPO-Fc. Dez macacoscomedores de caranguejos {Macaca fascicularis) (machos/ fêmeas = 5/5,aproximadamente 5 anos de idade, peso médio de machos 4.0±0,3kg, fêmeas2,9±0,4kg, adquiridos do Laboratory Animal Center, AMMS, China) foraminjetados subcutaneamente com 5μg/kg de rHuEPO-Fc purificado 3 vezes porsemana durante 4 semana s, e dois injetados com volume igual de soluçãoveículo como os animais de controle. Soros foram coletados uma vez asemana durante 5 semanas (1 semana após-tratamento ) e testados para osanticorpos específicos contra rHuEPO-Fc por ELISA usando o rHuEPO-Fcpurificado (5μg/ml) como o antígeno de capa. Além disso, as contagens deRBC e níveis de Hb no sangue periféricos também foram determinados dentrodo período experimental. Os dados resultantes mostram que, apesar damelhora da eritropoiese estimulada em macacos tratados com rHuEPO-Fc serobservada (os números RBC médios aumentaram de 4.74xl09/ml a6,67x109/ml e os níveis médios de Hb de 12,2g/dl a 13,7g/dl), rHuEPO-Fcfalou em induzir anticorpos específicos detectáveis contra a proteína de fusão.Estes resultados indicam que a proteína de fusão rHuEPO-Fc não causaimunogenicidade em primatas.

9. Estudos de toxicidade aguda de rHuEPO-Fc em camundongos normais.

Para avaliar a segurança de proteína de fusão rHuEPO-Fc,estudos tóxicos agudos foram conduzidos em animais.

Dois grupos de camundongos BALB/c (n=20, números iguaisde machos e fêmeas, 5-6 semanas de idade, o peso médio da fêmea é15,8±0,4g, macho é 15,9±0,6g, adquiridos de Chinese Academy of Medicine,China) foram injetados intravenosamente uma vez com uma quantidadeexcessiva de rHuEPO-Fc purificado (macho= 13,3mg/kg, fêmea =13,2mg/kg)ou volume igual da solução veículo via suas veias da cauda respectivamente.Além de observar a presente reação após a injeção, o comportamento geral eestado, atividades, padrões de alimentação e defecação e mudanças forammonitorados e registrados diariamente durante 14 dias. Todos oscamundongos também foram pesados no dia 7 e dia 14. No dia 15 após ainjeção, o exame anatômico dos órgãos principais dos camundongos foramconduzidos. O exame patológico poderia ser conduzido se fossem observadasmudanças incomuns ou mudanças suspeitas dos órgãos.

Todos os camundongos dos 2 grupos não tinham uma reaçãoinstantânea óbvia após a injeção. No período de 14 dias, não foramobservadas mudanças óbvias de comportamento, atividades, padrões dealimentação e defecação. Além disso, o peso dos camundongos em ambos osgrupos aumentou estavelmente durante o período de teste, sem diferençasaparentes entre os 2 grupos no dia 7 ou dia 14 após a injeção. Não foramdetectadas mudanças anormais ou patológicas nos tecidos do cérebro, pulmão,coração fígado e rim. Estes resultados indicam que a administração dequantidade excessiva de rHuEPO-Fc, bem mais do que requerida parademonstrar uma função de eritropoiese normal, é segura e não tem efeitostóxicos aparentes.

10 - Comparação de proteínas de fusão de tipo selvagem e EPO mudado

As investigações também foram conduzidas para comparar asversões de tipo selvagem e mudada de proteínas EPO. Como descrito acima,em uma forma de realização, a invenção inclui uma mutação de aminoácidoúnica no resíduo de aminoácido 172 (C172G). Para fins de comparação, umaproteína de fusão de tipo selvagem foi também preparada tendo umaminoácido de cisteína no resíduo 172 (figura 12). A proteína de fusão de tiposelvagem foi preparada do mesmo modo que nos exemplos 1-3 acima. Comrelação à construção do plasmídeo recombinante, os seguintes oligo-iniciadores (QIAGEN Inc., US) foram usados (os aminoácidos alterados emEFL5w e EFL3w em comparação com os iniciadores de Exemplo 1 estão emnegrito).

EF5: 5 ' -ccggaattcgccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcct-3EF3: 5 ' -ttttccttttgcggccgcttatttacccggagacagggagag-3EFL5 w: 5 ' -aggcctgcaggacaggggacagagttgagcccaaatcttgtgaca-3EFL3w: 5 '-tgtcacaagatttgggctcaactctgtcccctgtcctgcaggcct-3

As seqüências de iniciadores EFL5w e EFL3w são listadas emSEQ. LD. Nos. 9-10 respectivamente.

As experiências in vivo em camundongos foram conduzidaspara comparar a atividade eritropoiética da proteína de fusão de tipo selvagem(aqui referida como rHuEPO-FdC) com a proteína de fusão mudada (isto éproteína rHuEPO-Fc da presente invenção descrita acima) e com EPO humanarecombinante (rHuEPO). Para fim de comparação, todas as doses das trêsproteínas usadas neste exemplo, ou seja rHuEPO-Fc, rHuEPO-FcC e rHuEPO,foram as quantidades da porção da molécula de EPO apenas em uma base molar.

Com relação às proteínas rHuEPO-Fc e rHuEPO-FcC, a porção de EPO contribuipara 41,4% do peso molecular total como calculado pela relação do peso deaminoácidos de EPO para o peso de aminoácidos totais das moléculas completasde rHuEPO-Fc e rHuEPO-FcC (isto é, 166 aa dentre 399 aa).

rHuEPO-Fc (concentração de carga: 30(^g/ml, ), rHuEPO-FcC(concentração de carga: 9C^g/ml) e rHuEPO com a estrutura de EPOnatural humana ( 6000IU/0,5ml, fabricado por Kirin Brewery Co., Japan)foram diluídos em solução veículo (2,5mg/ml de albumina de soro humana,5,8mg/ml de citrato de sódio, 0,06mg/ml de ácido cítrico e 5,8mg/ml decloreto de sódio, pH5,5-5,6). A dose de rHuEPO em quantidade foi calculadade acordo com sua relação de atividade / quantidade. Os camundongosBALB/c (9- a 10-semanas de idade, pesando 18-22g, números iguais demachos e fêmeas, adquiridos de Experiment Animal Center, AMMS, China)foram agrupados aleatoriamente com 8 em cada grupo. Cada grupo decamundongos foi tratado com uma combinação de uma dose ( 2,5,12,5,62^g/kg), uma via de injeção (s. c.) e um esquema de injeção (três vezes porsemana ou uma vez por semana). O grupo de controle de camundongos foiinjetado com um volume igual de solução veículo. O tratamento durou por 26dias. As amostras de sangue periférico (via da cauda) para medida foramtomadas antes do tratamento, nos 2°, 6°, 9°, 13°, 16°, 19°, 22° e 26° dias detratamento. Hb foi medido como um índice por absortiometria. Média+ desvio padrão foi calculado a partir dos dados de cada grupo e o teste t foiconduzido dentre grupos diferentes.

Como mostrado em Figura 13, administração de todas as trêsproteínas EPO em intervalos de três vezes por semana estimulou eritropoiese.

Em ambas as doses de 2,5 μg/kg ou 12,5 μg/kg, rHuEPO-Fc induziu umamaior elevação de níveis de Hb do que HuEPO. A maior elevação de níveisde Hb foi obtida pela dose de 12,5 μg/kg de rHuEPO- Fc. Ambas as doses de2,5 μg/kg e 12,5 μg/kg de rHuEPO-FcC induziram uma eritropoiese bem maisfraca do que as doses equivalentes de rHuEPO e rHuEPO-Fc como indicadopela menor elevação significante de níveis de Hb em grupos tratados comrHuEPO-FcC. De fato, 12,5 μg/kg de rHuEPO-FcC induziram uma menorelevação de níveis de Hb do que 2,5 μg/kg de rHuEPO. Estes resultadossugerem que rHuEPO-FcC tem uma atividade eritropoiética afetada in vivoem comparação com rHuEPO tendo a seqüência molecular de EPO natural.

Em contraste, a proteína de fusão rHuEPO-Fc da presente invençãodemonstrou funções eritropoiéticas mais potentes. A administração das trêsproteínas EPO em intervalos de três vezes por semana excluiu em grandeparte o impacto de diferenças na meia-vida das proteínas.

A potência eritropoiética de rHuEPO-Fc e rHuEPO-FcC foiainda avaliada por redução dos tempos de injeção a uma vez por semanasubcutaneamente. Como mostrado em Figura 14, os grupos tratados comrHuEPO-Fcs maiores maior elevação de níveis de Hb do que os tratados comrHuEPO nas doses de 12,5 μg/kg ou 62,5 μg/kg. Em contraste, rHuEPO-FcCinduziu uma elevação bem mais fraca dos níveis de Hb do que induzido porrHuEPO. Por exemplo, 12,5 μg kg de rHuEPO induziram uma maior elevaçãode níveis de Hb do que induzido por 62,5 μΒ/^ de rHuEPO-FcC na maiorparte dos pontos de tempo. Isto ainda indica que por redução dos tempos deadministração para incluir os efeitos de meia-vida, rHuEPO-FcC demonstroufunções eritropoiéticas bem mais fracas in vivo em comparação com rHuEPOtendo a seqüência molecular de EPO natural e em comparação com a proteínade fusão rHuEPO-Fc da presente invenção.

Em resumo, estes resultados demonstram que rHuEPO-FcC,formado pela fusão de seqüências naturais moleculares de tanto EPO humanacomo fragmento de Fc humana (gancho, CH2 e CH3), demonstra funçõeseritropoiéticas bem mais fracas in vivo em comparação com o rHuEPO tendoa seqüência molecular de EPO natural. Em particular, as atividadeseritropoiéticas de proteína de fusão rHuEPO-FcC são menores do que 1/5 dasda molécula de EPO natural. Isto indica que a fusão entre a molécula de EPOe a seqüência natural de fragmento de Fc humano afeta as propriedadesfuncionais da molécula de EPO. Pela substituição do aminoácido único noprimeiro resíduo de cisteína em região de articulação de fragmento Fc, aproteína de fusão rHuEPO-Fc da presente invenção compreendendo aseqüência da molécula de EPO natural e o fragmento de Fc mutante mostrafunções eritropoiéticas mais potentes in vivo comparado com a molécula deEPO natural. Estes dados sugerem que o primeiro resíduo de cisteína naregião de articulação de fragmento de Fc tipo selvagem interfere de algumaforma com a molécula de EPO, provavelmente ao causar mudançasestruturais na molécula de EPO, e isto por sua vez prejudica as propriedadesfuncionais da molécula de EPO para estimular a eritropoiese.

Como será evidente para os versados na técnica à luz dadescrição acima, muitas alterações e modificações são possíveis na práticadesta invenção sem sair do espírito ou escopo da mesma.REFERÊNCIAS

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27. Chanutin A, et al. Experimental renal insufficiencyproduced by partial nephrectomy. Arch. Intern. Med. 49,pp767-787 (1932).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Novagenetics, Inc.

<120> PROTEÍNAS DE FUSÃO EPO-FC HUMANAS RECOMBINANTES COM MEIA VIDAPROLONGADA E ATIVIDADE ERITROPOIÉTICA IN VIVO MELHORADA

<130> N240 0002

<150> US 11/340,661

<151> 2006-01-27

<160> 10

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Proteína de fusão rHuEPO-Fc codificando.DNA

<400> 1

gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag 60gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga gaatatcact 120gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg gcagcaggcc 180gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg ccaggccctg 240ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa agccgtcagt 300ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgcgag cccagaagga agccatctcc 360cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa 420ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc 480tgcaggacag gggacagagt tgagcccaaa tctggtgaca aaactagtac atgcccaccg 540tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 600gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 660gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 120acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 840ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 900tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 020aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gccccttctt cctctacagc 080aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 140catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa 200

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de aminoácidos da proteína de fusão rHuEPO-Fc

<400> 2

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu15 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110 Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg Val Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr Ser

165 170 175 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

180 185 190 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

195 200 205 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

210 215 220 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

225 230 235 240

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

245 250 255 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

260 265 270 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

275 280 285 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

290 295 300 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

305 310 315 320

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

325 330 335 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 340 345 350 Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

355 360 365 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

370 375 380 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395

3

1281DNA

Artificial

Proteína de fusão rHuEPO-Fc codificando DNA com peptideo de

<210><211><212><213><220><223>sinal

de 27 aminoácidos<400> 3

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 4 80actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagag ttgagcccaa atctggtgac 600aaaactagta catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 660ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 720gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 780gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 840gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 900aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 960cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1020caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1080gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1140ggccccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1200gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1260tccctgtctc cgggtaaata a 1281

<210> 4<211> 426<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Seqüência de aminoácidos da proteína de fusão rHuEPO-Fc com

peptídeo de sinal de 27 aminoácidos<400> 4

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu

85 90 95

Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser

100 105 110

Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly

115 120 125

Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu

130 135 140

Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160

Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu

165 170 175

Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp

180 185 190

Arg Val Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr Ser Thr Cys Pro Pro Cys

195 200 205

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

210 215 220

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys225 230 235 240

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

245 250 255

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

260 265 270

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

275 280 285

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn290 295 300<table>table see original document page 37</column></row><table><211> 45

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador de oligonucleotídeo

<400> 10

tgtcacaaga tttgggctca actctgtccc ctgtcctgca ggcct 45

Claims (48)

1. Proteína de fusão recombinante, caracterizada pelo fato decompreender uma molécula de eritropoietina humana diretamente ligada a umfragmento Fc de IgG humana, em que referida proteína de fusão tem umameia-vida in vivo prolongada em comparação com a eritropoietina humana deocorrência natural ou nativa recombinante.

2. Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a meia-vida da referida proteína é pelo menos três vezes maior doque a da referida eritropoietina humana nativa.

3. Proteína de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelofato de que a referida meia-vida da referida proteína é pelo menos quatrovezes maior do que a da referida eritropoietina humana nativa.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a referida proteína de fusão tem umabioatividade eritropoiética melhorada em comparação com a referidaeritropoietina humana nativa.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que referido fragmento Fc é um fragmento de IgGl.

6. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que referido fragmento Fc compreende uma regiãode articulação e domínios CH2 e CH3.

7. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem pelo menos 9aminoácidos de comprimento.

8. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que referida proteína tem a seqüência deaminoácido presente em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência substancialmentehomóloga à mesma.

9. Construção de proteína multimérica, caracterizada pelo fatode compreender uma pluralidade de proteínas de fusão como definida nareivindicação 1.

10. Construção de proteína multimérica de acordo com areivindicação 9, caracterizada pelo fato de que referida construção é umdímero.

11. Proteína multimérica, caracterizada pelo fato decompreender uma pluralidade de polipeptídeos tendo, cada, a seqüência deaminoácido presente em SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência substancialmentehomóloga à mesma.

12. Proteína de acordo com a reivindicação 11, caracterizadapelo fato de que referida proteína é um dímero.

13. Proteína de acordo com a reivindicação 12, caracterizadapelo fato de que referido dímero compreende ligações dissulfeto entredomínios de articulação de referidos polipeptídeos.

14. Proteína de acordo com a reivindicação 11, caracterizadapelo fato de que cada um dos referidos polipeptídeos tem uma massamolecular de cerca de 75 kDa.

15. Proteína de acordo com a reivindicação 12, caracterizadapelo fato de que referido dímero tem uma massa molecular de cerca de 180kDa.

16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato decompreender uma proteína como definida na reivindicação 1, junto com umveículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante ou diluente.

17. Seqüência de ácido nucleico caracterizada pelo fato de quecodifica um polipeptídeo com pelo menos 90% de identidade de seqüência deaminoácido para SEQ ID NO: 2, em que referido polipeptídeo tem uma meia-vida prolongada in vivo em comparação com a eritropoietina humana nativa.

18. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fatode compreender a seqüência de ácido nucleico presente em SEQ ID NO: 1 ouuma seqüência substancialmente homóloga à mesma.

19. Linhagem de células caracterizada pelo fato de sertransfectada com uma molécula de DNA recombinante como definida nareivindicação 18.

20. Linhagem de células de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de que referida linhagem de células é uma linhagem decélulas CHO.

21. Método para produzir uma proteína como definida nareivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender cultivar umalinhagem de células transfectada com a molécula de DNA, como definida nareivindicação 18 e purificar o polipeptídeo assim codificado.

22. Método para estimular a eritropoiese em um mamífero,caracterizado pelo fato de compreender administrar ao referido mamífero umaproteína como definida na reivindicação 1.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que referido mamífero é um primata.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que referido primata é um humano.

25. Método para estimular a eritropoiese em um mamífero,caracterizado pelo fato de compreender administrar ao referido mamífero umacomposição farmacêutica como definida na reivindicação 16.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que referido mamífero é um primata.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que referido primata é um humano.

28. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a meia-vida da referida proteína no referido mamífero é pelomenos três vezes maior do que a EPO humana nativa quando administradaintravenosamente ou subcutaneamente.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a meia-vida da referida proteína no referido mamífero é pelomenos quatro vezes maior do que EPO humana nativa quando administradaintravenosamente ou subcutaneamente.

30. Proteína de fusão recombinante, caracterizada pelo fato decompreender:(a) uma porção de peptídeo eritropoietina tendo um resíduocisteína próximo do C terminal da mesma, e(b) uma porção de peptídeo imunoglobulina compreendendouma região de articulação, em que um resíduo de cisteína da referida regiãode articulação localizado mais próximo da referida porção de peptídeoeritropoietina é espaçado pelo menos 12 aminoácidos afastado do referidoresíduo de cisteína de referida porção de peptídeo eritropoietina.

31. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que a porção de peptídeo eritropoietina é umamolécula de eritropoietina humana completa.

32. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que referida porção de peptídeo imunoglobulina éum fragmento Fc de IgG humana compreendendo referida região dearticulação e domínios CH2 e CH3.

33. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que referido fragmento Fc de IgG é um fragmentode IgGl.

34. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que referida região de articulação é copuladadiretamente na referida porção de peptídeo eritropoietina.

35. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de compreender um ligador de peptídeo entre referidaregião de articulação e referida porção de peptídeo eritropoietina.

36. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem pelo menos 9aminoácidos de comprimento.

37. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem um resíduonão cisteína no aminoácido 6 medido do N-terminal da referida região dearticulação.

38. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 37,caracterizada pelo fato de que referido resíduo não cisteína é um aminoácidoneutro.

39. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 38,caracterizada pelo fato de que referido resíduo não cisteína é glicina.

40. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que referida região de articulação é uma variante defragmento Fc humano tendo um resíduo não cisteína no aminoácido 6 medidodo N-terminal da referida região de articulação.

41. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 34,caracterizada pelo fato de que referida região de articulação tem a seqüênciade aminoácido presente em SEQ ID NO: 5 ou uma seqüência tendo pelomenos 90% de identidade de seqüência para a mesma, e tendo um resíduo nãocisteína em aminoácido 6 medido do N-terminal da referida região dearticulação.

42. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que a meia-vida da referida proteína quandoadministrada a um mamífero é pelo menos três vezes maior do que aeritropoietina humana nativa administrada ao referido mamífero pelosmesmos meios.

43. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que a meia-vida da referida proteína, quandoadministrada a um mamífero, é pelo menos quatro vezes maior do que aeritropoietina humana nativa administrada ao referido mamífero pelosmesmos meios.

44. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que referido mamífero é um humano.

45. Dímero, caracterizado pelo fato de compreender primeira esegunda proteínas de fusão, cada uma como definida na reivindicação 30, emque referida região de articulação de referida primeira proteína de fusão éligada à referida região de articulação de referida segunda proteína de fusãopor ligações dissulfeto.

46. Construção de proteína multimérica, caracterizada pelofato de compreender uma pluralidade de proteínas de fusão ligadas, cada umacomo definida na reivindicação 30.

47. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fatode compreender a seqüência de aminoácidos presente na SEQ ID NO: 1.

48. Dímero, caracterizado pelo fato de compreender umparâmetro de polipeptídeos, cada tendo a seqüência de aminoácido presenteem SEQ ID NO: 2.