KR20140015152A

KR20140015152A - Ｆｃ 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 조성물들 및 방법들

Info

Publication number: KR20140015152A
Application number: KR1020127017129A
Authority: KR
Inventors: 자스비르 세라; 존 크노프; 라빈드라 쿠마르
Original assignee: 악셀레론 파마 인코포레이티드
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2014-02-06
Also published as: EP2507267B1; BR112012013330A2; CN102770458A; IN2012DN05169A; AU2010325943A1; RU2012127383A; JP2013512674A; US8722615B2; US20150010555A1; EP2507267A4; US20110171218A1; CA2782320A1; EP2507267A1; WO2011068993A1

Abstract

증가된 혈청 반감기를 보유하는 당변이체 Fc 융합 단백질들을 제공한다. 또한, 하나 이상의 비-내생성 글리코실화 부위들을 도입시킴으로써 Fc-융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 방법도 제공한다.

Description

Ｆｃ 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 조성물들 및 방법들{COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING SERUM HALF-LIFE OF FC FUSION PROTEINS}

본 출원은 2009년 12월 2일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/266,095 및 2010년 4월 23일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/327,582를 우선권으로 주장한다. 상기 언급된 출원들의 모든 교시는 참고문헌에 첨부된다.

고유 상태의 치료 단백질들 또는 펩티드들, 또는 재조합적으로 생산된 치료 단백질들 또는 펩티드들은 짧은 안정기 또는 짧은 혈청 반감기를 나타내는 전형적인 불안정한 분자들이다. 더구나, 이들 분자들은 조제되었을 때 대개 극도로 불안정하고, 특히 진단용 및 치료 목적으로 수용액내에서 조제될 때 극도로 불안정하다. 생체내 또는 시험관내 단백질성 치료 분자들의 안정성을 늘리거나 또는 촉진시키는 실질적인 해결책들은 거의 없다. 많은 치료제들, 특히 펩티드 약물들은 생체내에서 부적절한 혈청 반감기때문에 불리하다. 이러한 치료제들을 높은 빈도 및/또는 더 높은 약량으로 투여를 해야하고, 또는 치료 효과에 필수적인 혈청 수준을 유지시키기 위하여 지속적으로 방출되는 제형을 이용해야할 필요가 있다. 약물들의 빈번한 전신 투여는 상당한 부작용과 연관된다. 예를 들면, 빈번한, 가령 매일, 전신 주사는 환자에게 상당한 불편함을 주며, 투여 관련된 감염의 고위험을 부여하고, 그리고 입원 또는 빈번한 내원을 요구할 수 있다. 특히 치료제가 정맥으로 투여될 때이다. 더욱이, 장기 치료에서 매일 정맥 주사는 혈관의 반복적인 찌르기에 의해 야기되는 심각한 조직 반흔 및 맥관 병리로 또한 이어질 수 있다. 치료제, 예를 들면, 당뇨병에 대해 인슐린 투여 또는 다발성 경화증을 앓고 있는 환자들에게 인터페론 약물들의 투여에서 빈번한 모든 전신 투여에 대한 유사한 문제점들이 알려져 있다. 이들 인자 모두는 환자의 적응성을 감소시키고, 보건 체계에 비용 증가로 이어진다.

약제의 혈청 반감기를 변경시키는 한 가지 가능한 해결책은 반감기를 증가시킬 수 있는 약제 분자들에 공유적으로 부착시키는 것이다. 이미, 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG와 같은 폴리머를 폴리펩티드들에 부착시키면 이들 펩티드들의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 그러나, 폴리머들의 부착은 약물 활성의 감소로 이어질 가능성이 있다. 불완전한 또는 비-균일한 부착은 상이한 성질들을 보유한 화합물들의 혼합 집단으로 이어질 수 있다. 추가적으로, 이러한 변형으로 인한 반감기의 변화는 예측불가능하다. 예를 들면, 상이한 폴리에틸렌 글리콜을 IL-8, G-CSF 및 IL-1ra에 콘쥬게이션시키면 다양한 활성 및 반감기를 보유한 분자들을 만들었다(Gaertner and Offord , (1996), Bioconjugate Chem . 7:38-44). IL-8에 PEG20를 콘쥬게이션시키면 IL-8의 반감기는 변화없었고, PEG20를 IL-1ra에 콘쥬게이션시키면 반감기는 거의 7배 증가하였다. 추가적으로, IL-8/PEG20 콘쥬게이트는 고유 단백질보다 10 내지 12배 효과가 적었다.

따라서, 생물학적으로 활성이 있는 분자의 혈청 반감기를 분자의 생물학적 기능의 심각한 감소없이 증가시킬 수 있는 방법들이 매우 바람직할 것이다.

요약

부분적으로, 본 내용은 면역글로블린 Fc 도메인과 최소한 하나의 이종(heterologous) 폴리펩티드 도메인을 포함하는 융합 단백질의 혈청 반감기를 연장하는 방법들을 제공한다. 특정 구체예들에서, 이 방법들은 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들을 인코드하도록 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분을 인코드하는 핵산을 변형시킴으로써, 최초 Fc 융합 단백질과 비교하여 연장된 혈청 반감기를 보유하는 변경된 Fc 융합 단백질을 인코드하는 변경된 핵산의 준비를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 변경된 핵산은 적합한 세포 배양물내에서 발현될 때, 최초 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기보다 최소한 10% 더 연장된 혈청 반감기를 보유하는 변경된 Fc 융합 단백질을 인코드할 것이다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 변경된 Fc 융합 단백질은 변경안된 Fc 융합 단백질과 비교하여 생체내 생물학적 활성이 실질적으로 동일하거나 또는 더 크다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 추가 (즉, 도입된) 글리코실화 부위들에서 글리코실화는 변경된 Fc 융합 단백질의 반감기 (가령, 시험관내, 생체내, 혈청 반감기)를 추가 글리코실화 부위가 부족한 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기와 비교하여 최소한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 또는 250% 또는 그 이상으로 증가시킨다. 특정 구체예들에서, 변경된 Fc 융합 단백질과 추가 글리코실화 부위가 부족한 융합 폴리드의 혈청 반감기는 비교를 위하여 동일한 동물 모델 또는 종에서 측정된다. 예시적인 구체예들에서, 혈청 반감기는 여기에서 설명된 것과 같이 약물동력학 쥐 분석 또는 약물동력학 원숭이 분석에서 측정한다.

일부 구체예들에서, 명세서는 a) 포유류 또는 포유류-유사 글리코실화를 제공하는 세포 배양물내 최소한 하나의 추가 N-링크된 글리코실화 부위를 도입시키기 위하여 변경된 핵산을 발현시키고, 그리고 b) 세포 배양물로부터 변경된 Fc 융합 단백질을 회수함으로써, 최초 Fc 융합 단백질에 비교하여 연장된 반감기를 보유한 변경된 Fc 융합 단백질을 준비하는 방법을 제공한다. Fc 융합 단백질들은 세포 배양물들로부터 단백질을 수득하는데 적합한 임의의 기술을 이용하여 미정제된, 부분적으로 정제된, 또는 고도로 정제된 분획물들 형태로 회수할 수 있다. 특정 측면들에서, 변경된 핵산은 시알산을 포함하는 N-링크된 슈가 모이어티들을 만드는 세포계에서 발현된다. 특정 측면들에서, 변경된 핵산은 CHO 세포계, NSO 세포계, COS 세포계, 또는 HEK236 세포계를 포함하나 이에 국한되지 않은 포유류 세포에 의해 발현된다. 다른 측면들에서, 변경된 핵산은 포유류 또는 포유류-유사 글리코실화를 제공하도록 유전공학적으로 조작된 곰팡이 세포들, 곤충 세포들, 또는 식물 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않는 비-포유류 세포에 의해 발현된다. 특정 측면들에서, 정제는 단백질 A에 변경된 Fc 융합 단백질을 노출시키는 단계 및 단백질 A에 결합된 변경된 Fc 융합 단백질을 회수하는 단계들을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예들, 명세서의 방법들에 의해 만들어진 Fc 융합 단백질들은 환자에게 투여용으로 조제된다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 여기에서 설명된 임의의 방법들에 따라 준비된 변경된 핵산을 포함하는 세포계를 제공한다. 본 발명의 세포계는 포유류 세포계 (가령, CHO 세포계, NSO 세포계, COS 세포계, 또는 HEK236 세포계) 또는 비-포유류 세포계 (가령, 곰팡이 세포들, 곤충 세포들, 또는 식물 세포들)를 포함할 수 있으며, 이들은 포유류 또는 포유류-유사 글리코실화를 제공하기 위하여 유전공학적으로 변경된 것들이다.

특정 구체예들에서, 본 명세서는 증가된 안정성 및/또는 혈청 반감기를 특징으로 하는 Fc 융합 단백질들과 증가된 반감기를 가지는 융합 단백질들을 만드는 방법들을 제공한다. 본 발명의 Fc-융합 단백질들은 면역글로블린 Fc 도메인과 최소한 하나의 이종 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. Fc-융합 단백질들은 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 면역글로블린 Fc 도메인의 외부가 변경되며, 이는 도입된 글리코실화 부위가 부족한 융합 단백질의 반감기 (가령, 시험관내, 생체내, 또는 혈청 반감기)와 비교하여 변경된 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시킨다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 융합 단백질은 도입된 글리코실화 부위가 부족한 융합 단백질의 혈청 반감기와 비교하여 최소한 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 또는 250%로 융합의 혈청 반감기를 증가시키는 비-내생성, 또는 도입된, N-링크된 글리코실화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에서, 변경된 Fc 융합 단백질과 추가 글리코실화 부위가 부족한 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 비교를 위하여 동일한 동물 모델 또는 종들에서 측정된다. 예시적인 구체예들, 혈청 반감기는 여기에서 설명된 것과 같이, 약물동력학 쥐 분석 또는 약물동력학 원숭이 분석에서 측정된다.

본 발명의 Fc 융합 단백질들은 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 하나 이상의 아미노산 잔기들의 추가, 결손, 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 특정 구체예들에서, 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 매 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개, 120개, 130개, 140개, 또는 150개의 아미노산 마다 최소한 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에서, 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 매 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 또는 125개 아미노산 마다 한 개 미만의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함한다. 특정 구체예들에서, N-링크된 글리코실화에 부착된 변경된 Fc 융합 단백질의 이종 부분의 각 아미노산은 N-링크된 글리코실화에 의해 변경된 임의의 기타 아미노산과는 최소한 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개 아미노산에 의해 떨어져 있다. 특정 구체예들에서, 추가 N-링크된 글리코실화 부위는 변경된 Fc 융합 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단 모두의 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 아미노산 이내에서 일어나지 않는다.

바람직한 구체예들에서, 본 발명의 Fc 융합 단백질들은 표면 노출된(즉, 가용성 루프 도메인) 그리고 α-헬릭스 또는 β-쉬트로 통합되지 않는 아미노산 서열에 의해 연결된 최소한 2개의 구조적으로 상이한 도메인들을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 추가 N-링크된 글리코실화 부위들은 표면 노출된 아미노산 서열내에 위치한다. 바람직한 구체예들에서, 추가 N-링크된 글리코실화 부위들은 가령, α-헬릭스 또는 β-쉬트와 같은 2차 구조 요소를 보유하는 단백질의 영역에 통합되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 이종 부분들은 단백질의 기능 도메인(가령, 효소적 또는 촉매 도메인 또는 리간드 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 Fc 융합 단백질은 링커 도메인을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 도입된 글리코실화 부위들중 최소한 하나는 링커 도메인 내에 위치한다. 본 발명의 융합 폴리펩티드의 이종 도메인은 분자량이 더 큰 것이 바람직한데, 가령, 최소한 25kDa, 30kDa, 35kDa, 40kDa, 45kDa, 50kDa, 55kDa, 60kDa, 65kDa, 70kDa, 75kDa, 80kDa, 85kDa, 90kDa, 95kDa, 100kDa, 105kDa, 또는 110 kDa이 바람직하다.

특정 구체예들에서, 이종 부분은 세포 수용체 (가령, 막통과 수용체)의 세포외(즉, 가용성) 도메인과 이의 임의의 변이체(돌연변이체들, 단편들, 그리고 펩티드모방 형태들을 포함)을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 이종 부분은 통과 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서의 방법들을 이용하여 부착된 임의의 추가 슈가 모이어티들이 리간드 결합 도메인을 실질적으로 간섭하지 않도록, 가령, 도입된 글리코실화 부위가 부족한 Fc-융합 단백질에 대한 리간드 결합과 비교하여 결합 활성이 2-, 3-, 5-, 10-, 또는 15배 낮도록 이종의 위치들에 하나 이상의 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입시킬 수 있다. 따라서, 일부 측면들에서, 도입된 N-링크된 글리코실화 부위들중 하나 이상은 리간드 결합 도메인의 아미노산 서열이 변경되지 않는 위치들 그리고/또는 리간드 인터페이스를 실질적으로 간섭하지 않는 것으로 예상되는 위치들에 도입된다. 특정 구체예들에서, Fc 융합 단백질은 최초 Fc 융합 단백질의 IC₅₀ 값보다 2배, 3배, 5배 또는 10배 낮은 IC₅₀ (즉, 최대 억제 농도의 절반값)을 가진다.

특정 구체예들에서, Fc-융합 단백질은 신경 성장 인자/종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 구성원으로부터 선택된 이종 부분을 포함한다. 특정 구체예들에서, 세포외 수용체 도메인은 종양 괴사 인자 유형 2 수용체 (즉, TNFR2)의 부분을 포함한다. 바람직한 구체예들에서, 본 명세서는 1 micromolar 미만의 또는 100, 10 또는 1 nanomolar 미만의 K_D 값을 가진 TNF-α에 결합하는 TNFR2 융합 단백질들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 TNFR2 융합 단백질들은 인간 TNFR2 전구 단백질 (즉, 서열 번호: 1)의 위치 D47, Q48, A50, E155, 또는 G253에 위치한 하나 이상의 변경된 아미노산들을 보유하는 TNFR2 세포외 도메인을 포함한다. 이들 잔기들은 TNFR2의 프로세스된 세포외 도메인 (즉, 서열 번호: 2)의 D25, Q26, A28, E133, 및 G231에 차례로 대응한다. 바람직한 변경은 TNFR2 폴리펩티드에서 하나 이상의 N-링크된 글리코실화 부위들의 도입을 초래하는 아미노산의 추가, 치환, 및/또는 결손을 포함하는데, 예를 들면, 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 아미노산 치환 Q26N, A28S, D25N, E133N, D25N, G231N을 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 변경 (가령, 추가, 결손, 및/또는 치환들)을 TNFR2 융합 단백질에 만들어 하나 이상의 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입하는데, 예를 들면, 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 대해 Q26N/A28S; D25N/E133N; D25N/G231N; Q26N/A28S/E133N; Q26N/A28S/G231N; 또는 E133N/G231N 치환들을 포함하는 TNFR2 변이체이다. 본 발명의 TNFR2-Fc 융합 단백질은 여기에서 설명된 것들중 임의의 것일 수 있고, 이러한 융합 단백질은 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 7, 또는 8로부터 선택된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드를 포함하거나 또는 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 7 또는 8로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. TNFR2-Fc 융합 단백질들은 TNFR2-Fc 융합 단백질과 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제 조제물로 조제될 수 있는데, 이때 조제물은 포유류에 투여용으로 적합하도록 발열성 원료들이 실질적으로 없다. 조성물들은 크기 압출 크로마토그래피로 측정하였을 때 다른 폴리펩티드 성분들에 대해 최소한 95% 순도를 가질 수 있고, 그리고 선택적으로, 조성물들은 최소한 98% 순도를 가질 수 있다.

특허 또는 출원은 최소한 하나의 컬러로 만들어진 도면을 포함한다. 컬러 도면을 포함하는 이 특허 또는 특허 출원 공개 사본은 요청시 필요 경비의 지불과 함께 특허청에 제공될 수 있다.
도 1은 TNFR2-h(1)Fc 폴리펩티드 (서열 번호: 5)의 아미노산 서열을 나타낸다. 가용성 TNFR2 융합 단백질은 h(1)Fc 변이체로 지정된 면역글로블린 Fc 도메인에 링커없이 융합된 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 보유하는 것으로 표현된다. 면역글로블린 Fc 영역은 한 줄의 밑줄로 표시되며, 자연적으로 발생된 N-링크된 글리코실화 부위들은 두 줄의 밑줄로 표시된다.
도 2는 Q48N/A50S 변이체 TNFR2-h(1)Fc 폴리펩티드 (서열 번호: 6)의 아미노산 서열을 나타낸다. 가용성 TNFR2 융합 단백질은 h(1)Fc 면역글로블린 Fc 도메인에 링커없이 융합된 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 보유하는 것으로 표현된다. 자연적으로 발생된 TNFR2-Fc 세포외 도메인은 위치 48과 50에서 변경되어 N-링크된 글리코실화 부위가 도입되었다. 면역글로블린 Fc 영역은 한 줄의 밑줄로 표시되며, 치환된 아미노산들은 두 줄의 밑줄로 표시된다.
도 3은 변이체 (D47N/E155N) TNFR2-h(1)Fc 폴리펩티드 (서열 번호: 7)의 아미노산 서열을 나타낸다. 가용성 TNFR2 융합 단백질은 h(1)Fc 면역글로블린 Fc 도메인에 링커없이 융합된 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 보유하는 것으로 표현된다. 자연적으로 발생된 TNFR2-Fc 세포외 도메인은 위치 47과 155에서 변경되어 N-링크된 글리코실화 부위가 도입되었다. 면역글로블린 Fc 영역은 한 줄의 밑줄로 표시되며, 치환된 아미노산들은 두 줄의 밑줄로 표시된다.
도 4는 변이체 (D47N/G253N) TNFR2-h(1)Fc 폴리펩티드 (서열 번호: 8)의 아미노산 서열을 나타낸다. 가용성 TNFR2 융합 단백질은 h(1)Fc 면역글로블린 Fc 도메인에 링커없이 융합된 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 보유하는 것으로 표현된다. 자연적으로 발생된 TNFR2-Fc 세포외 도메인은 위치 47과 253에서 변경되어 N-링크된 글리코실화 부위가 도입되었다. 면역글로블린 Fc 영역은 한 줄의 밑줄로 표시되며, 치환된 아미노산들은 두 줄의 밑줄로 표시된다.
도 5는 천연 리더 서열 (서열 번호: 9)과 TNFR2-h(1)Fc 폴리펩티드 (즉, 서열 번호:5)를 인코드하는 핵산 서열을 나타낸다.
도 6은 TNF와 TNFR2 수용체의 세포외 도메인 사이에 결합 인터페이스를 나타내는 리본 다이아그램이다. TNF는 좌측의 녹색 리본 구조이며, TNFR2 수용체는 우측의 파란색 리본 구조이다. N-링크된 글리코실화 부위들을 도입시키기 위하여 조작된 부위들은 원으로 나타낸다. 단일 돌연변이들은 파란색 원으로 나타내고, 이중 돌연변이들은 녹색 원으로 나타낸다. 리간드 결합 활성을 상당히 감소시키는 돌연변이는 TNF 결합 부위에 근접하게 위치하며, 이들은 붉은색 원으로 나타낸다.
도 7은 강조된 비-내생성 글리코실화 부위들을 도입시키기 위하여 예시적인 아미노산 변경을 가진 TNFR2의 세포외 도메인의 서열을 나타낸다. 각 강조된 영역에 대한 비-내생성 글리코실화 부위를 도입시킬 수 있는 변경의 특정 예들을 나타낸다. 신호 펩티드는 단일 밑줄로 나타내고, 내생성 글리코실화 부위들은 이중 밑줄로 나타낸다.
도 8은 TNFR2 구조내에서 베타 가닥들의 예상 위치(화살표)를 나타낸다. 고유 TNFR2 전구 서열 (서열 번호: 1)에 근거하여 번호를 메긴다. 서열 비교 및 TNFR1 (PDB ID: 1EXT), 사이토킨 반응 변경자 E (CrmE; PDB ID: 2UWI), 및 CD134 (OX40; PDB ID: 2HEY)와의 구조적 상동성으로 2차 구조를 추정하였다.
도 9는 고유 리더 서열과 함께 변이체 TNFR2-h(2)Fc 폴리펩티드 (서열 번호: 16)의 아미노산 서열을 나타낸다. 가용성 TNFR2 융합 단백질은 예시적인 인간 Fc 도메인 (서열 번호: 14)에 4개 아미노산 링커를 통하여 융합된 고유 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 보유하는 것으로 나타낸다. Fc 도메인은 단일 밑줄로 나타내고, 리더 및 링커 서열들은 이중 밑줄로 나타낸다.
도 10은 TNFR2-h(2)Fc 폴리펩티드 (즉, 서열 번호: 16)를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 17)을 나타낸다. Fc 도메인을 인코드하는 서열은 단일 밑줄로 나타내고, 리더 및 링커 서열들은 이중 밑줄로 나타낸다.
도 11은 콜라겐-유도화된-관절염 쥐 모델에서 염증 표식으로 발의 체적상에 당변이체 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc의 효과를 나타낸다. 콜라겐은 0일과 7일째 투여되었고, 시험 관절의 치료는 6일째에 시작되었다. 나타낸 데이터는 평균 SEM이다. TNFR2-h(1)Fc와 유사하게, Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc로 치료하면 연구의 두 번째 기간 동안 비이클로 치료된 쥐들에서 관찰되는 발의 부기를 예방하였다.
도 12는 콜라겐-유도화된-관절염 쥐 모델에서 골의 질에 대한 당변이체 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc의 효과를 나타낸다. 족근골 영상은 21일째 연구 종료후 마이크로-컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)에 의해 생체외에서 수득하였다. TNFR2-h(1)Fc와 유사하게, Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc로 치료하면 비이클-치료를 받은 쥐들에서 관찰된 골 부식이 예방되었다.

1. 총람

특정 측면들에서, 본 내용은 Fc-융합 단백질의 혈청 반감기가 적절한 표적 단백질내 적절한 위치에 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위의 도입에 의해 연장될 수 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서는 Fc-융합 단백질들, 특정 치료 폴리펩티드들의 폴리펩티드 상에 N-링크된 글리코실화 부위들의 수를 증가시킴으로써, 이들의 혈청 반감기를 증가시키는 방법들을 제공한다. 여기에서 설명된 것과 같이, 본 명세서의 방법들을 이용하여 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체의 세포외 도메인의 부분을 포함하는 Fc-융합 단백질들의 혈청 반감기를 증가시켰다. 특정 실시예들에서, 본 명세서는 변경안된 융합 단백질들 형태와 비교하여 증가된 반감기를 특징으로 하는 변경된 TNFR2-Fc 융합 단백질들을 제공한다. 본 명세서는 임의의 특정 기전의 효과에 한정시키지 않으며, Fc 융합 단백질의 비-Fc 부분 (이종 부분)은 환자의 체내 잔류 시간 동안 다양한 세포내 환경과 세포외 환경에 노출되도록 제안한다. 이러한 상이한 조건들은 이종 부분의 부분들이 단백질 변경 또는 분해 공정을 시작하는 프로테아제 또는 다른 효소들 또는 분자들의 기질로 노출될 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 본 명세서는 Fc 융합 단백질들의 혈청 반감기가 이종 부분을 분해하도록 작용하는 약제들에 의해 상당히 영향을 받으며, 그리고 이러한 약제들로부터 이종 부분을 보호하는 변경들이 더 큰 혈청 반감기를 유도할 것이라는 새로운 제안을 제시한다. 여기에서 설명된 것과 같이, 하나 이상의 N-링크된 글리코실화 부위들의 추가는 이종 도메인들 불필요한 분해 또는 변화(alteration)로부터 이종 도메인들의 노출되는 부분들을 차단시키는 그리고 일부 경우들에서, 이러한 분자들의 바람직한 구조적 형태들을 안정화시키는 단일-단계, 생체적합성 시스템을 제공한다.

최초 Fc 융합 단백질의 이중 도메인내에 어떤 위치가 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위에 가장 적합한 지를 연역적으로 추론하는 것은 어려울 것이며, 그리고 임의의 제약 또는 지침없이 임의의 하나의 이종 도메인은 이론적으로 하나 이상의 추가 N-링크된 부위들의 거의 무제한적인 조합으로 변경될 수 있을 것이다. 상이한 최초 Fc 융합 단백질들과의 작업을 통하여, 출원인은 변경된 Fc 융합 단백질이 최초 Fc 융합 단백질과 비교하여 연장된 혈청 반감기를 나타내지만 변경된 분자의 생물학적 활성 (특히 생체내 생물학적 활성)은 보존하는 변경된 Fc 융합 단백질에 이르도록 최초 Fc 융합 단백질의 상당한 수의 부위들에서 변경을 허용하는 다수의 지침을 발견하였다. 전반적인 발표의 범위에 제한을 원하지 않지만, 출원인은 다음중 하나 이상의 원리를 이용하면 활성이 있고, 연장된 반감기를 가진 Fc 융합 단백질을 만들 수 있는 실행가능한 방법을 제공한다는 것을 발견하였다: (1) N-링크된 글리코실화 부위들은 단백질 구조 분석 또는 경험상의 방법에 의해 측정하였을 때 Fc 융합 단백질의 이종 부분의 표면 노출된 위치에서, 그리고 특히 알파-헬릭스 또는 베타-쉬트와 같은 특정된 단백질 구조 요소들내에 포함되지 않는 위치에 있을 때 유익할 것이며; (2) N-링크된 글리코실화 부위들은 변경 또는 분해될 경우 단백질 구조 또는 기능의 실질적인 혼란을 야기할 수 있는 Fc 융합 단백질의 이종 부분내 위치에 있을 때 유익할 것이며 (예를 들면, 많은 단백질들은 절단되는 경우 전반적인 단백질 및 이의 활성에 거의 또는 전혀 혼란을 야기할 수 있는 조직화되지 않는 영역을 N-말단에 보유하고, 따라서, 이러한 위치에 있는 N-링크된 글리코실화 부위는 혈청 반감기에 적당한 영향을 가지고, 대조적으로 구조 요소들 사이에 위치한 표면 노출된 영역은 바람직하지 못한 분해를 당할 경우 단백질에 고도의 노출과 상당한 결과의 조합을 나타내고, 따라서 구조 요소들 사이에 표면 노출된 아미노산들은 N-링크된 글리코실화 부위의 도입을 위한 바람직한 위치를 나타낸다); (3) N-링크된 글리코실화 부위들은 최초 Fc 융합 단백질의 주요 기능 부위 (가령, 리간드 결합 표면 또는 촉매 부위)와 간섭하지 않는 위치에 있을 수 있으며, 이는 기능 부위 자체의 외부 위치를 선택함으로써 그리고/또는 임의의 새로운 N-링크된 슈가 모이어티가 기능 부위로 들어오지 않는 위치를 선택함으로써 이루어질 수 있고; (4) N-링크된 글리코실화 부위의 추가에 의해 얻어질 수 있는 효과 정도는 최초 Fc 융합 단백질내에 이미 존재하는 N-링크된 슈가의 밀도에 역비례하고, 따라서, 이 방법은 상대적으로 낮은 글리코실화 수준 (가령, 이종 부분의 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 125개 또는 그 이상 아미노산 마다 1개 미만의 N-링크된 부위)을 가진 이종 부분을 보유하는 최초 Fc 융합 단백질이 가장 효과적일 수 있고; (5) 상당히 글리코실화된 그리고 가볍게 글리코실화된 이종 부분 모두에서, 효과의 정도는 N-링크된 글리코실화 부위들 사이의 공간에 비례할 수 있고, 이 의미는 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 기존의 N-링크된 글리코실화 또는 다른 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들로부터 상대적으로 규칙적이고 먼 거리(가령, N-링크된 글리코실화 부위들의 N 잔기들 사이가 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개 또는 40개 아미노산들)에 위치할 때 유익하며, - 상당히 글리코실화된 단백질에서 조차도, 슈가들이 밀접하게 무리를 지어 있다면, 충분한 공간을 가진 N-링크된 부위들을 추가하여 혈청 반감기의 상당한 증가를 촉진시킬 수 있다. 상기 원리들중 하나 이상을 이용하면 최초 Fc 융합 단백질과 비교하여 연장된 혈청 반감기를 나타내는 단일 변경된 Fc 융합 단백질을 기획할 수 있고, 단일 최초 Fc 융합 단백질에 근거하여 다수의 변경된 Fc 융합 단백질들을 만드는 것이 대개 유익할 것이며, 이러한 변경된 형태들을 테스트하고, 그 다음 증가된 반감기와 보유된 생물학적 활성의 최상의 조합을 나타내는 이들 변경된 형태들의 조합을 테스트한다.

특정 측면들에서, 본 내용은 Fc-융합 단백질들, 특히 치료 폴리펩티드들의 혈청 반감기를 증가시키는 방법들에 관한 것으로, 이 폴리펩티드 상에 N-링크된 당화 부위의 수를 증가시켜 혈청 반감기를 증가시키는 방법들에 관한 것이다. 여기에서 설명된 것과 같이, 본 명세서의 방법들을 이용하여 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체의 세포외 도메인의 부분을 포함하는 Fc-융합 단백질들의 혈청 반감기를 증가시켰다. 특정 실시예들에서, 본 명세서는 각 융합 단백질들의 변경안된 형태들과 비교하여 증가된 반감기를 특징으로 하는 변경된 TNFR2-Fc 융합 단백질들을 제공한다. 기전에 무관하게, 여기에서 제공되는 데이터로부터 추가적인 글리코실화 부위의 도입은 고분자량 바이오약품들, 특히 Fc-융합 단백질들의 반감기를 연장시키는 효과적인 방법임이 명백하다는 것을 알 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 명세서는 증가된 혈청 반감기를 특징으로 하는 변경된 TNFR2-Fc 당변이체 융합 단백질들을 제공한다. 종양 괴사 인자 (TNF)는 정상적인 염증과 면역 반응들에 관계하는 자연적으로 발생된 사이토킨이다. 종양 괴사 인자-α(TNFα) 및 종양 괴사 인자-β(TNFβ)는 상동성 다기능 사이토킨들이다. 이들 폴리펩티드들의 구조적 그리고 기능적 특징에서 최대 유사성은 종양 괴사 인자 또는 "TNF"로 집합적으로 설명되었다. TNF에 부여되는 일반적인 활성들은 다음을 포함한다: IL-1, IL-6, GM-CSF, 및 IL-10을 포함하는 다른 사이토킨들의 방출, 케모킨의 유도, 흡착 분자들의 증가, 혈관들의 성장, 조직 파괴성 효소들의 방출과 T 세포들의 활성화. 예를 들면, Feldmann et al ., 1997, Adv . Immunol ., 64:283-350, Nawroth et al ., 1986, J. Exp . Med ., 163:1363-1375; Moser et al ., 1989, J. Clin . Invest , 83:444-455; Shingu et al ., 1993, Clin . Exp . Immunol . 94:145-149; MacNaul et al ., 1992, Matrix Suppl., 1:198-199; and Ahmadzadeh et al ., 1990, Clin . Exp . Rheumatol . 8:387-391을 참고. 이들 모든 활성들은 염증 반응을 증가시키도록 작용할 수 있다.

TNF는 사전-염증 작용들을 일으켜 혈관 내피 세포들 상에 응혈촉진성 활성의 유도(Pober , et al ., J. Immunol . 136:1680 (1986)), 호중구들과 림프세포들의 흡착 증가(Pober , et al ., J. Immunol . 138:3319 (1987)), 그리고 대식세포들, 호중구들 그리고 맥관 내피 세포들로부터 혈소판 활성화 인자의 방출 촉진(Camussi , et al ., J. Exp . Med . 166:1390 (1987))과 같은 조직 손상을 초래한다. TNF는 또한 감염 (Cerami, et al ., Immunol . Today 9:28 (1988)), 면역 장애들, 신형성 병리(Oliff , et al ., Cell 50:555 (1987)), 자가면역 병리 및 이식편대 숙주 병리(Piguet , et al ., J. Exp . Med . 166:1280 (1987))에 관련된다. 이러한 TNF-연관된 장애들중에 울혈성 심부전, 염증성 장 질환 (Crohn 질환을 포함), 관절염, 그리고 천식이 있다.

특히, TNF는 발열, 불쾌, 식욕부진, 및 악액질을 포함하는 그람-음성 폐혈증 및 내독소 쇼크에 중심적 역할을 한다(Michie , et al ., Br . J. Surg . 76:670-671 (1989); Debets , et al ., Second Vienna Shock Forum , p. 463-466 (1989); Simpson , et al ., Crit . Care Clin . 5:27-47 (1989); Waage , et al ., Lancet 1:355-357 (1987); Hammerle , et al ., Second Vienna Shock Forum p. 715-718 (1989); Debets , et al., Crit . Care Med . 17:489-497 (1989); Calandra , et al ., J. Infect . Dis . 161:982-987 (1990); Revhaug, et al ., Arch . Surg . 123:162-170 (1988)).

TNF는 TNF-반응성 세포들상에서 특정 세포 표면 수용체들과 상호작용을 통하여 이의 생물학적 효과를 시작한다. 세포 표면 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 두 가지 상이한 형태, p75 (또는 유형 2) 및 p55 (또는 유형 1)로 지칭된 형태가 있다 (Smith et al ., 1990, Science 248:1019-1023; Loetscher et al., 1990, Cell 61:351-359). TNFR 유형 1 및 TNFR 유형 2는 각각 TNFα와 TNFβ에 모두 결합한다. TNF의 생물학적 활성은 세포 표면 TNFR에 결합에 따라 달라진다. 유형 1 수용체 (TNF-R55, TNF-RI, 또는 TNFR-β로 불리기도 함)는 TNF-α의 세포독성, 항-바이러스 및 증식성 활성을 초래하는 신호를 변환시키는 것으로 알려진 55 kd 당단백질이다. p75 수용체 (TNF-R75, TNFR2, 또는 TNFR-α로 불리기도 함)는 세포독성 및 증식성 신호 뿐만 아니라 GM-CSF의 방출을 야기하는 신호를 변환시키는 것으로 나타난 75 kDa 당단백질이다.

가용성 TNFRs 및 항-TNF 항체들과 같은 TNF 길항제들은 TNF 활성을 차단하여, TNF에 반응하여 IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, 흡착 분자들 및 조직 파괴의 감소를 야기하는 것으로 설명되었다(Feldmann et al., 1997). 콜라겐 유형 II 관절염 모델의 DBA/1 마우스에서 햄스터 항-마우스 TNF 항체를 이용한 TNF 길항 효과를 테스트하였다(Williams et al ., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89:9784-9788). 질병이 개시된 후 시작된 치료는 발바닥 붓기, 임상 수치, 그리고 관절 파괴의 조직병리학의 개선을 결과하였다. 항체들 (Thorbecke et al ., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89:7375-7379) 또는 TNFR 구조체(Husby et al., 1988, J. Autoimmun . 1:363-71; Tetta et al ., 1990, Ann . Rheum . Dis . 49:665-667; Wooley et al ., 1993, J. Immunol . 151:6602-6607; Piguet et al ., 1992, Immunology 77:510-514)를 이용한 다른 연구들에서 유사한 결과들을 얻었다.

3가지 특정 TNF 길항제들이 현재 FDA-승인되었다: etanercept (Enbrel?), infliximab (Remicade?) 및 adalimumab (Humira?). 이들 약물들중 하나 이상은 류마티스성 관절염, 청소년 류마티스성 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척수염, 및 염증성 장 질환(Crohn 질환 또는 궤양성 대장염)의 치료에 승인되었다.

인간 IgG1의 Fc 부분에 링크된 가용성 인간 TNFR (p75)의 재조합 형태(sTNFR(p75):Fc, Enbrel?, Immunex)의 임상 시험에서 이를 투여하면 RA 질환 활성이 상당히 그리고 신속하게 감소되었다는 것을 볼 수 있었다(Moreland et al ., 1997, N. Eng . J. Med ., 337:141-147). 더구나, Enbrel?에 대한 소아과 임상 시험의 안정성 데이터에서 이 약물은 청소년 류마티스성 관절염 (JRA) 환자에게 일반적으로 잘 용인되었다(Garrison et al , 1998, Am . College of Rheumatology meeting , Nov . 9, 1998, abstract 584).

상기에서 나타낸 것과 같이, Enbrel?은 인간 IgG1의 Fc 부분에 링크된 인간의 75 킬로달톤(p75) TNFR의 세포외 리간드-결합 부분으로 구성된 이량체 융합 단백질이다. Enbrel?의 Fc 성분은 CH2 도메인, CH3 도메인 그리고 힌지 영역을 포함하지만, IgG1의 CH1 도메인을 포함하지 않는다. Enbrel?은 Chinese 헴스터 난소(CHO) 포유류 세포 발현 시스템에서 만든다. 이것은 934개 아미노산들로 구성되며, 약 150 kilodaltons의 겉보기 분자량을 가진다(Smith et al ., 1990, Science 248:1019-1023; Mohler et al., 1993, J. Immunol . 151:1548-1561; 미국 특허 제 5,395,760호(Immunex Corporation, Seattle, Wash.); 미국 특허 제5,605,690호 (Immunex Corporation, Seattle, Wash.).

Enbrel?은 현재 하나 이상의 질병-개질성 항류마티스성 약물들 (DMARDs)에 부적합한 반응을 나타낸 환자에게서 중간 내지 심각한 활성 류마티스성 관절염의 징후 및 증상의 감소에 필요하다. Enbrel?은 메토트렉세이트 단독에 적절하게 반응하지 않은 환자들에게서 메토트렉세이트와 복합하여 이용된다. Enbrel?은 또한 하나 이상의 DMARDs에 부적합한 반응을 가진 환자들에서 중간 내지 심각한 활성 다관절-진행 청소년 류마티스성 관절염의 징후 및 증상의 감소에 필요하다 (May 28, 1999). Enbrel?는 피하 주사로 매주 2회 25 mg의 양으로 RA 환자에게 제공되었다.

ENBREL 조제물을 이용한 치료는 현재 피하로 일주일에 2회 투여되는데, 비용이 많이 들고, 환자에게 불쾌하고 불편하다. 따라서, 본 명세서는 도입된 글리코실화 부위가 부족한 가용성 TNF 수용체의 혈청 반감기와 비교하여 변경된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 도입시키도록 변경된 TNF 결합 수용체의 가용성 (가령, 세포외) 부분을 포함하는 TNF 길항제들 (가령, Enbrel?)을 제공한다.

본 명세서에서 이용된 용어들은 본 발명의 문맥내에서 그리고 각 용어들이 이용된 특정 문맥내에서 당업계의 통상적인 의미를 일반적으로 가진다. 특정 용어들은 본 발명의 조성물들 및 방법들을 설명하는데 그리고 이를 어떻게 만들고 이용하는 지의 추가 지침을 실무자들에게 제공하기 위하여 하기에서 또는 명세서 곳곳에서 논의된다. 용어의 임의 용도의 범위 또는 의미는 용어가 이용된 특정 문맥으로부터 분명하게 알 수 있을 것이다.

"약" 및 "대략"은 측정의 본질 또는 정확도가 제공된다면 측정된 양에 대해 수용가능한 오차 범위를 일반적으로 의미한다. 전형적으로, 예시적인 오차 범위는 주어진 값 또는 범위의 20%, 바람직하게는 10%, 그리고 더욱 바람직하게는 5% 범위내에 있다.

대안으로, 그리고 특히 생물학적 시스템에서, 용어들 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 10배수 범위내, 바람직하게는 5-배 이내 그리고 더욱 바람직하게는 2배 범위내에 있다.

본 발명의 방법들은 하나 이상의 돌연변이체들 (서열 변이체)에 대해 야생형 서열을 포함하는 각 서열의 비교 단계들을 포함할 수 있다. 이러한 비교들은 전형적으로 가령, 당업계에 공지된 서열 배열 프로그램 및/또는 알고리즘 (예를 들면, BLAST, FASTA 및 MEGALIGN, 및 기타 몇 가지)을 이용하여 폴리머 서열의 배열을 포함한다. 당업자는 이러한 배열들에서 돌연변이가 잔기 삽입 또는 결손을 포함하면, 이 서열 배열에 삽입된 또는 결실된 잔기를 포함하지 않는 폴리머 서열내 갭(전형적으로 - 또는 A"로 나타냄)을 도입시킬 수 있다는 것을 바로 인지할 수 있다.

모든 문법적 형태 및 단어의 변이형태 내에서 "상동성(homologous)"은 유기체의 동일한 종들내 슈퍼 패밀리의 단백질 뿐만 아니라 상이한 유기체 종들의 상동성 단백질들을 포함하는 공통적인 진화 기원을 보유하는 두 개 단백질들 사이에 상관관계를 말한다. 이러한 단백질 (그리고 이를 인코드하는 핵산들)은 동일성 비율 또는 특정 잔기들 또는 모티프의 존재 또는 보존된 위치들에 의해 이들의 서열 유사성을 반영한 서열 상동성을 보유한다.

모든 문법적 형태의 용어 서열 유사성은 공통적인 진화 기원을 공유하는 또는 공유하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열간에 동일성 또는 대응 정도를 지칭한다.

그러나, 보통의 용도 및 본 출원에서, 매우(highly)와 같은 부사가 붙은 용어 "상동성"은 서열 유사성을 지칭하며, 공통의 진화 기원과 관련되거나 또는 관련되지 않을 수 있다.

용어 "약물동력학 성질"은 생체활성이 있는 약제 (가령, 소 분자, 폴리펩티드 약물, 등)의 흡수, 분포, 대사 및 배출을 지칭한다.

2. 당변이체 Fc 융합 단백질들

여기에서 이종 폴리펩티드에 링크된 면역글로블린 분자로부터 Fc 도메인을 보유하는 당변이체 융합 단백질들을 제공한다. 당변이체 융합 단백질들은 융합 단백질의 Fc 도메인의 외부에 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 포함한다. Fc 도메인은 이종 폴리펩티드에 직접적으로, 또는 폴리펩티드 링커를 통하여 간접적으로 링크될 수 있다. 비-내생성 글리코실화 부위는 이종 폴리펩티드, 링커내로 도입되거나, 또는 이둘 모두에 도입될 수 있다.

"비-내생성", "도입된", 또는 "신규한" 글리코실화 부위는 폴리펩티드의 변경안된 형태에 존재하지 않는 글리코실화 부위를 지칭한다. 따라서, 여기에서 설명하는 당변이체 융합 단백질들은 융합 단백질의 변경안된 형태에 존재하는 글리코실화 부위의 수와 비교하였을 때, 최소한 하나의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위를 가진다. 예를 들면, 융합 단백질의 변형안된 형태가 Fc 도메인의 외부에 2개의 글리코실화 부위를 가지고, 그리고 하나의 N-링크된 글리코실화 부위가 이종 폴리펩티드로 도입된다면, 그 다음 당변이체 융합 단백질은 두 개의 고유 글리코실화 부위와 하나의 도입된 글리코실화 부위를 포함하는 세 개의 N-링크된 글리코실화 부위를 가질 것이다. 글리코실화 부위들의 수를 증가시키기 위한 융합 단백질의 변형은 특정 "야생형" 아미노산 서열에 국한시키지 않는데, 그 이유는 글리코실화 부위들의 수를 증가시키기 위하여, 본 발명의 방법들에 따라 자연적으로 발생된 또는 인위적으로 만들어진 변이체들도 또한 변경될 수 있기 때문이라는 것을 인지해야 한다.

일부 단백질들은 다수의 슈가 측쇄를 지원할 수 있다는 것은 잘 알려진 사실이다. O-링크된 글리코실화 부위들 사이의 거리는 모든 다른 아미노산과 같이 거의 없을 수 있다(가령, Kolset & Tveit (2008) Cell. MoI . Life Sci 65: 1073-1085 and Kiani et al . (2002) Cell Research 12(1): 19-32). N-링크된 글리코실화 부위들의 경우, 부위들간의 거리는 3개, 4개, 5개 또는 6개 아미노산들과 같이 짧을 수 있다(가령, Lundin et al . (2007) FEBS Letters 581:5601-5604 (2007); Apweiler et al . (1991) Biochimica et Biophysica Acta 1473:4-8, 각 내용은 전문이 여기 참고자료에 통합된다). 따라서, 특정 구체예들에서 최소한 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 또는 100개 또는 그 이상 N-링크된 글리코실화 부위들이 여기에서 설명된 융합 단백질에 추가될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 당변이체 융합 단백질은 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 125개, 150개, 또는 200개 아미노산들 마다 최소한 하나의 글리코실화된 아미노산을 포함한다. 특정 구체예들에서, 각 N-링크된 글리코실화된 아미노산은 임의의 기타 N-링크된, O-링크된, 또는 N-링크되고 O-링크된 글리코실화된 아미노산으로부터 최소한 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 또는 100개 또는 그 이상 아미노산들 만큼 떨어져 있다.

여기에서 이용된 것과 같이, "글리코실화 부위"는 슈가 부착 콘센선스 서열 (즉, 아미노산 서열에 모노-, 올리고-, 또는 폴리사카라이드의 슈가를 부착하기 위한 콘센선스 서열로 작용할 수 있는 일련의 아미노산들)을 의미하거나 또는 슈가 모이어티가 공유적으로 링크된 실제 아미노산 잔기를 의미할 수 있다. 슈가 모이어티는 모노사카라이드 (단순 슈가 분자), 올리고사카라이드, 또는 폴리사카라이드일 수 있다.

슈가 모이어티를 추가하기 위하여, N-링크된 글리코실화 부위들은 단백질의 아미노산 서열의 변형 또는 융합 단백질내 아미노산 잔기를 화학적으로 변형시킴으로써, 융합 단백질내로 도입될 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 여기에서 설명하는 융합 단백질들은 콘센선스 서열 NXT/S (아스파라진-X-세린/트레오닌)을 보유한 최소한 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 도입시키기 위하여 (가령, 명시된 아미노산들의 삽입, 결손, 또는 치환에 의해) 변경되고, 여기에서 X는 프롤린이외의 임의의 아미노산이 된다. 단백질 상에서 탄수화물 모이어티들의 수를 증가시키는 또다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 결합에 의한 것이다. 예를 들면, 이용된 결합 방법에 따라, 슈가 모이어티는 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 자유 카르복실 기들; (c) 가령, 시스테인의 것과 같은 자유 설프히드릴 기들; (d) 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 자유 하이드록실 기들; (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기들; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 가령, WO 87/05330 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit . Rev . Biochem ., pp . 259-306 참고, 여기 참고문헌에 통합됨. 예시적인 구체예들에서, 슈가 모이어티는 N-링크된 글리칸을 만들기 위하여 아르기닌 잔기에 결합된다.

예시적인 구체예들에서, 슈가 모이어티들은 세포 기전을 이용하여 숙주 세포내에서 융합 단백질을 발현시킴으로써 도입된 글리코실화 부위에 추가된다. 일반적으로, 융합 단백질들은 HEK293 또는 CHO 세포계와 같은 적합한 글리코실화를 제공하는 포유류 세포계, 또는 기타 포유류 발현 세포계들에서 발현될 것이다.

특정 구체예들에서, 슈가 모이어티들은 포유류-유사 글리코실화를 만들도록 조작되었던 효모, 박테리아 또는 곤충 세포들과 같은 비-포유류 숙주 세포를 이용하여 도입된 글리코실화 부위에 추가될 수 있다. 유전공학적으로 변경된 글리코실화 경로들을 보유하는 세포계들은 인간에서 당단백질의 프로세싱을 모방하는 효소 반응의 차례를 실행하도록 발달되었다. 이들 조작된 세포들내에서 발현된 재조합 단백질들은 이들의 인간 대응부에 실질적으로 동일하지는 않지만 유사한 당단백질들을 만든다(가령, 포유류-유사 글리코실화).

발현된 펩티드들의 글리코실화 프로파일을 변경시키기 위하여 숙주 세포들을 유전공학적으로 변경시키는 기술들은 공지되어 있다. 가령, Altmann et al . (1999, Glycoconjugate J. 16: 109-123), Ailor et al . (2000, Glycobiology 10(8): 837-847), Jarvis et al ., ( In vitrogen Conference , March , 1999, abstract), Hollister and Jarvis , (2001, Glycobiology 11(1): 1-9), 그리고 Palacpac et al ., (1999, PNAS USA 96: 4697), Jarvis et al ., (1998. Curr . Opin . Biotechnol . 9:528-533), Gemgross (U.S. Patent Publication No . 20020137134)을 참고, 이들 모두는 곤충 또는 식물 세포들에게 글리코실트란스퍼라제 유전자를 형질감염시킴으로써 곤충 또는 식물 세포 발현계를 인화(humanize)시키는 기술들을 공개한다.

원핵 시스템내에서 발현된 펩티드들의 글리코실화 프로파일을 유전공학적으로 변경시키는 기술들 또한 존재한다. 대장균(E. coli)은 박테리아 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis) 및 아조리조비움(Azorhizobium)의 다양한 글리코실트란스퍼라제로 조작되어 생체내에서 올리고사카라이드를 생산한다(Bettler et al ., 1999, Glycoconj . J. 16:205-212). 나이세리아 메닝지티디스 1,3 N 아세틸 글루코아미닐트란스퍼라제 lgta 유전자를 과다발현시키도록 유전공학적으로 조작된 대장균은 외인성 락토즈를 효과적으로 글리코실화시킬 것이다 (Priem et al ., 2002, Glycobiology 12:235-240).

외인성 글리코실트란스퍼라제를 만들기 위하여 곰팡이 세포들 또한 유전공학적으로 변경되었다 (Yoshida et al ., 1999, Glycobiology , 9(1):53-58; Kalsner et al ., 1995, Glycoconj . J. 12:360-370; Schwientek and Ernst , 1994, Gene 145(2):299-303; Chiba et al , 1995, Biochem J. 308:405-409).

특정 구체예들에서, 본 명세서의 Fc 융합 단백질을 발현시키는 숙주 세포들은 하나 이상의 외인성 글리코실트란스퍼라제 효소들 및/또는 하나 이상의 외인성 글리코시다제 효소들을 발현시키는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있고, 여기서 숙주 세포내에서 재조합 글리코펩티드의 발현으로 인간 글리칸 구조를 보유하는 재조합 글리코펩티드의 생산을 초래한다.

일부 구체예들에서, 세포내에서 유용한 이종 글리코실트란스퍼라제 효소는 예를 들면, Taniguchi et al . (2002, Handbook of glycosyltransferase and Related Genes , Springer , N.Y.)에서 이용가능한 글리코실트란스퍼라제 패밀리의 목록에 포함된 임의의 공지된 글리코실트란스퍼라제 효소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 구체예들에서, 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수 있고, 여기서 하나 이상의 내생성 글리코실트란스퍼라제 효소들 및/또는 하나 이상의 내생성 글리코시다제 효소들들은 비활성화되어, 숙주 세포내에서 인간 글리칸 구조를 보유하는 재조합 글리코펩티드를 생산한다.

일부 구체예들에서, 숙주 세포는 이종 글리코실트란스퍼라제 효소들 및/또는 글리코시다제 효소들을 발현할 수 있고, 동시에 하나 이상의 내생성 글리코실트란스퍼라제 효소들 및/또는 글리코시다제 효소들은 비활성화된다. 내생성 글리코실트란스퍼라제 효소들 및/또는 글리코시다제 효소들은 안티센스 기술들 및 숙주 세포의 게놈 안으로 핵산의 삽입과 관련된 기술들을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계 당업자에 공지된 임의의 기술을 이용하여 비활성화시킬 수 있다.

예시적인 구체예들에서, 여기에서 설명된 당변이체 융합 단백질들은 융합 단백질의 변경안된 형태와 비교하여 증가된 안정성 및/또는 증가된 혈청 반감기를 보유한다. 예시적인 구체예들에서, 당변이체 융합 단백질의 혈청 반감기는 변경안된 형태의 융합 단백질과 비교하여 최소한 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250% 또는 300% 또는 그 이상 증가한다. 특정 구체예들에서, 변경된 Fc 융합 단백질 및 추가적인 글리코실화 부위가 부족한 융합 폴리펩티드의 혈청 반감기는 비교를 위하여 동일한 동물 모델 또는 종들에서 측정한다. 예시적인 구체예들에서, 혈청 반감기는 여기에서 설명된 것과 같이 약물동력학 쥐 분석 또는 약물동력학에서 측정된다(가령, 실시예 4 및 5).

예시적인 구체예들에서, 하나 이상의 비-내생성 글리코실화 부위들의 도입은 융합 단백질의 이종 폴리펩티드 부분의 하나 이상의 생물학적 활성들에게 심각한 영향을 주지 않는다. 예를 들면, 융합 단백질의 이종 폴리펩티드 부분의 하나 이상의 생물학적은 10-배, 5-배, 3-배, 2.5-배, 2-배, 1.5-배, 1-배, 0.5-배 또는 이 이만으로 영향을 받을 수 있다. 이종 폴리펩티드 부분의 생물학적 활성들의 예는 여기에서 추가 설명되며, 그리고 예를 들면, 단백질-단백질 상호작용, 리간드 결합, 생리적 활성, 등을 포함한다.

예시적인 구체예들에서, 하나 이상의 비-내생성 글리코실화 부위들은 Fc 융합 단백질의 이종 부분으로 도입된다. Fc 융합 단백질의 이종 부분은 촉매 도메인 또는 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 리간드 결합 도메인은 단백질 상에서 또다른 분자, 가령, 리간드와 상호작용하는 영역을 말한다. 예를 들면, 리간드 결합 도메인은 단백질 상에서 항체에 의해 결합되는 영역, 항체 상에서 항원에 결합하는 영역, 수용체 상에서 리간드에 결합하는 영역, 리간드 상에서 수용체에 결합하는 영역, 제 1 폴리펩티드 상에서 제 2 폴리펩티드에 결합하는 영역, 폴리펩티드 상에서 소(small) 분자에 결합하는 영역, 등을 지칭한다. 예시적인 구체예들에서, 리간드 결합 도메인은 막통과 수용체 단백질의 세포외 도메인내 리간드에 결합하는 영역이다. 여기에서 이용된 것과 같이, 촉매 도메인은 기능 활성을 보유하는 영역을 말한다. 촉매 도메인들의 예로는 예를 들면, 키나제 도메인들, 포스파타제 도메인들, 프로테아제 도메인들, 등을 포함한다.

예시적인 구체예들에서, 하나 이상의 비-내생성 글리코실화 부위들은 α-헬릭스 및/또는 β-쉬트에 연결된 유연한 또는 구조를 이루지 않는 가령, 루프 영역인 표면 노출된 영역으로 도입된다. 일반적으로, 단백질은 2차 및 3차 구조를 보유하는 폴리펩티드 쇄다. 폴리펩티드의 2차 구조는 폴리펩티드 쇄가 소위 α-헬릭스 및 β-쉬트로 불리는 2개의 통상 구조적 도메인들로 접히는 것을 포함한다. 단백질의 3차 구조는 2차 구조, α-헬릭스 및 β-쉬트가 다양한 길이와 불규칙적인 모양의 루프 영역들에 의해 연결된 복합구조를 구성한다. 일반적으로, 2차 구조 효소들의 조합은 안정적인 소수성 코어를 형성하고, 루프 영역들은 단백질의 표면에 존재한다. 루프 영역들은 용매에 노출되기 때문에, 다양한 반응성 분자들 및 단백질 효소들 (가령, 프로테아제들)에 의한 친핵성 공격/펩티드 결합 절단에 대해 내부의, 구조적으로 안정적인 2차 구조적 도메인들 (가령, α-헬릭스 및 β-쉬트 도메인들)보다 일반적으로 더 민감하다.

특정 구체예들에서, 융합 단백질의 이종 폴리펩티드 부분에서 하나 이상의 자연적으로 발생된 글리코실화 부위들 (가령, 변경안된 단백질 형태에서 글리코실화 부위들)을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, N-링크된 글리코실화 부위들의 공간을 변화시키기 위하여, 자연적으로 발생된 글리코실화 부위를 제거하고, 그 다음 원하는 위치들에서 두 개의 비-내생성 글리코실화 부위들을 도입시키는 것이 바람직할 것이다. 더구나, 융합 단백질 내에서 발생된 자연적으로 발생된 하나 이상의 O-링크된 글리코실화 부위들을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.

N-링크된 그리고 O-링크된 글리코실화 부위들은 아미노산 잔기로부터 콘센선스 아미노산 서열의 제거 또는 슈가 모이어티의 화학적 또는 효소적 절단에 의해 제거될 수 있다. 예를 들면, N-링크된 글리코실화 부위들은 N-링크된 글리코실화 인지 부위 (즉 NXT/S)의 제 1 또는 제 3 아미노산 위치 하나 또는 모두에서 아미노산 치환 또는 결손에 의해, 및/또는 삼가펩티드 서열의 제 2 위치에서 아미노산 결손에 의해 제거될 수 있다. O-링크된 글리코실화 부위들은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기들의 하기에서 제시하는 추가, 결손, 또는 치환에 의해 제거되거나 및/또는 하기에서 제시하는 O-링크된 콘센선스 서열의 파괴에 의해 제거될 수 있다. 대안으로, 폴리펩티드 상에 존재하는 하나 이상의 자연적으로 발생된 탄수화물 모이어티들의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 이루어질 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 예를 들면, 글리코실화된 폴리펩티드를 화합물 트리플루오르메탄술폰산, 또는 등가 화합물에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이와 같은 처리로 연결 슈가 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 슈가가 절단되며, 아미노산 서열은 그대로 남겨진다. 화학적 탈글리코실화는 Hakimuddin et al . (1987) Arch . Biochem . Biophys . 259:52 및 Edge et al . (1981) Anal . Biochem . 118:131에서 더 설명된다. 글리코실화된 폴리펩티드들 상에 탄수화물 모이어티들은 Thotakura et al . (1987) Meth . Enzymol . 138:350에서 설명된 것과 같이 다양한 엔도-글리코시다제 및 엑소-글리코시다제를 이용하여 효소적으로 절단할 수 있다.

특정 구체예들에서, 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들에 하나 이상의 O-링크된 글리코실화 부위들을 도입시키는 것이 바람직할 수 있다. O-링크된 글리코실화 부위들은 O-링크된 글리코실화 콘센선스 서열을 폴리펩티드로 도입시켜 단백질에 추가될 수 있다. 예시적인 O-링크된 콘센선스 서열들은 예를 들면, CXXGGT/S-C, NSTE/DA, NITQS, QSlQS, 0/E-FI1RZK-V, C-E/D-SN, 및 GGSC-K/R을 포함한다. 대안으로, O-링크된 슈가 모이어티들은 폴리펩티드 내에 아미노산을 화학적으로 변경시킴으로써 도입될 수 있다. 가령, 여기에 참고자료로 통합된 WO 87/05330 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit . Rev . Biochem., pp . 259-306.

특정 구체예들에서, 여기에서 설명된 당변이체 폴리펩티드들은 리더 서열들, 링커들, 및/또는 정제/인식 테그들과 같은 추가적인 도메인들을 포함할 수 있다.

일부 구체예들에서, 융합 단백질들은 신호 서열, 예를 들면, 꿀벌 밀리틴 리더 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호: 10); 조직 플라스미노겐 활성화물질 (TPA) 리더: MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호: 11); 또는 (iii) 고유 리더 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서의 융합 단백질들은 링커 도메인을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 융합 단백질들은 Fc 도메인과 이종 폴리펩티드 도메인 사이에 위치한 상대적으로 조직화되지 않은 형성한 링커를 포함한다. 이러한 조직화되지 않은 링커는 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 아미노산 또는 상대적으로 2차 구조가 없는 5개 내지 10개, 15개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상 아미노산의 길이를 가진 인공적인 서열일 수 있다. 링커는 글리신 및 프롤린 잔기들이 풍부하며, 그리고 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열 또는 트레오닌/세린 및 글리신들의 반복 서열(가령, TG₃ (서열 번호: 12) 또는 SG₃ (서열 번호: 13) 싱글렛 또는 반복체)을 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 도입된 글리코실화 부위들중 하나 이상은 링커 도메인 안에 위치할 수 있다.

본 명세서의 융합 단백질들은 융합 단백질의 분리 및/또는 탐지를 용이하게 하는 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 도메인들의 잘 알려진 예들은 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 트란스퍼라제 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 말토즈 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 원하는 성질을 부여하기 위하여 융합 도메인이 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 융합 도메인들은 친화력 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화력 정제의 목적을 위하여, 친화력 크로마토그래피용 관련 매트릭스, 가령, 글루타티온-, 아밀라아제-, 그리고 니켈- 또는 코발트-콘쥬게이트된 수지등을 이용한다. 이러한 매트릭스의 많은 것들은 Pharmacia GST 정제 시스템과 (HIS₆) 융합 파트너와 함께 유용한 QIAexpress™ 시스템 (Qiagen)과 같은 키트형태로 이용가능하다. 또다른 예로서, 폴리펩티드들의 탐지를 용이하게 하기 위하여 융합 도메인이 선택될 수 있다. 이러한 탐지 도메인들의 예는 다양한 형광 단백질들 (가령, GFP) 뿐만 아니라 "에피토프 테그"를 포함하는데, 이들은 보통 특이적 항체가 이용가능한 짧은 펩티드 서열들이다. 쉽게 이용가능한 특이적인 단클론성 항체들을 위한 잘 공지된 에피토프 테그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 그리고 c-myc 테그를 포함한다. 일부 경우들에서, 융합 도메인들은 프로테아제 절단 부위, 가령 인자 Xa 또는 트롬빈을 보유하고, 이들은 관련 프로테아제가 융합 단백질들을 부분적으로 절단할 수 있도록 하여, 절단에 의해 이로부터 재조합 단백질들을 유리시킨다. 유리된(liberated) 단백질들은 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다.

융합 단백질들의 상이한 요소들은 원하는 기능과 일관되도록 임의의 방식으로 배열될 수 있다는 것으로 이해된다. 예를 들면, Fc 도메인은 이종 폴리펩티드 도메인에 대해 C-말단에 위치하거나, 또는, 대안으로, 이종 폴리펩티드 도메인은 Fc 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있다. Fc 도메인 및 이종 도메인은 융합 단백질 내에서 인접해있을 필요가 없으며, 추가적인 도메인들 또는 아미노산 서열들은 이들중 하나의 도메인에 대해 C- 또는 N-말단에 포함되거나 또는 도메인들 사이에 포함될 수 있다.

특정 구체예들에서, 변이체 융합 단백질들은 페길화된(PEGylated) 아미노산, 파르네실화된(farnesylated) 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도체화 약제에 콘쥬게이트된 아미노산으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 변경된 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 해독후(post-translational) 변경의 결과로, 여기에서 설명된 융합 단백질들은 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 그리고 인산염과 같은 비-아미노산 요소들을 포함할 수 있다. 상이한 세포들 (가령 CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293)은 이러한 해독후 활성과 같은 특이적인 세포 기전 및 특징적인 기전을 보유하며, 본 발명의 폴리펩티드들의 정확한 변경 및 프로세싱이 가능하도록 선택될 수 있다.

본 명세서의 융합 단백질들은 크기가 일반적으로 더 큰 분자량을 가지는데, 최소한 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 또는 110 kDa, 또는 그 이상이다.

예시적인 구체예들에서, 본 명세서는 Fc 도메인의 외부에 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들을 보유하는 TNFR2-Fc 당변이체 융합 단백질들을 제공한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 당변이체 융합 단백질은 서열 번호: 18, 21, 22, 23, 또는 24로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 경우들에서, 당변이체 융합 단백질은 서열 번호: 18, 21, 22, 23, 또는 24로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 보유한다.

특정 구체예들에서, 여기에서 설명된 당변이체 Fc 융합 단백질들은 ActRIIb 수용체의 세포외 도메인 및/또는 항체의 가변 영역을 포함하지 않는다.

Fc 도메인들

여기에서 설명된 당변이체 융합 단백질들은 이종 폴리펩티드에 융합된 면역글로블린 중쇄 Fc 도메인을 포함한다. 면역글로블린의 Fc 부분과 융합하면 광범위한 단백질들에게 바람직한 약물동력학 성질들이 부여되는 것으로 알려져 있다. 용어 Fc 영역 또는 Fc 도메인은 여기에서 이용된 것과 같이 고유 서열 Fc 영역과 변이체 Fc 영역들을 포함하여 면역글로블린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 면역글로블린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 면역글로블린의 카르복실-말단까지 이어진 것으로 정의된다. 예를 들면, 항체의 중쇄를 인코드하는 핵산을 재조합적으로 제작할 때 Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 방식에 따라 잔기 447)이 제거될 수 있다. 다른 언급이 없는 한, 면역글로블린 중쇄에서 잔기들의 넘버링 방식은 참고문헌에 통합된 Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed . Public Health Service , National Institutes of Health , Bethesda , MD (1991)에서 설명된 것과 같이 EU 인덱스다. "EU index as in Kabat"는 인간 IgGl EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

"고유 서열 Fc 영역"은 자연계에서 볼 수 있는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 고유 서열 인간 Fc 영역들은 고유 서열 인간 IgGl Fc 영역 (비-A 및 A 알로타입); 고유 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 고유 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 그리고 고유 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 이의 자연적으로 발생된 변이체들을 포함한다.

"변이체 Fc 영역"은 최소한 하나의 아미노산 변경, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 고유 서열 Fc 영역의 것과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 고유 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하였을 때, 최소한 하나의 아미노산 치환을 보유하는데, 가령 고유 서열 Fc 영역 또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에서 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환들, 그리고 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 보유한다. 여기에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 고유 서열 Fc 영역과 최소한 약 80%의 상동성 및/또는 부모 폴리펩티드의 Fc 영역과 최소한 약 80%의 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 약 90%의 상동성, 더욱 바람직하게는 최소한 약 95% 상동성을 보유할 것이다.

바람직한 구체예들에서, 여기에서 설명된 것과 같이 Fc 융합 단백질은 면역글로블린 Fc 도메인의 C-말단 부분의 N-말단에 융합된 이종 부분을 보유한다. 바람직하게는, 파파인 절단 부위의 바로 상류 힌지 영역에서 시작하는 서열, 가령 중쇄 불변 영역의 제 1 잔기를 다른 면역글로블린의 114 또는 유사 부위들을 취하여 융합에 이용한다. 한 구체예에서, 이종 도메인은 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 중쇄의 힌지 영역과 CH2 그리고 CH3 또는 CH1, 힌지, CH2 그리고 CH3 도메인들에 융합된다. 일부 구체예들에서, 융합이 일어나는 정확한 부위가 중요한 것은 아니며, 그리고 최적 부위는 일련의 실험에 의해 결정될 수 있다.

인간 Fc 도메인들의 경우, 인간 IgG1 및 IgG3 면역글로블린 서열을 이용하는 것이 바람직하다. IgG1을 이용하는 주요 장점은 IgG1 융합 단백질이 고정된 단백질 A상에서 효과적으로 정제될 수 있다는 것이다. 대조적으로, IgG3 융합 단백질들의 정제는 현저하게 불안정한 매체인 단백질 G를 요구한다. 그러나, 특정 구성을 위한 Ig 융합 파트너를 선택할 때 면역글로블린의 다른 구조적 그리고 기능적 성질은 고려되어야만 한다. 예를 들면, IgG3 힌지는 더 길고 더 유용하여 IgG1에 융합될 때 적절하게 기능을 하지 않거나 접히지 않는 더 큰 이종 부분을 수용할 수 있다. 또다른 고려사항은 결합가(valency)일 수 있는데; IgG 이뮤노어드헤신(immunoadhesins)은 이가 동종이량체이지만, IgA 및 IgM과 유사한 Ig 서브타입은 기본 Ig 동종이량체 단위의 각각 이량체 또는 오량체 구조를 초래할 수 있다.

생체내 적용을 위하여 기획된 Fc 융합 단백질들의 경우, Fc 영역에 의해 지정된 약물동력학 성질들 및 효과물질 기능 또한 중요하다. IgG1, IgG2 및 IgG4는 모두 21일의 생체내 반감기를 가지며, 보체 시스템을 활성화시키는 이들의 상대적인 효과는 상이하다. IgG4는 보체를 활성화시키지 못하고, 그리고 IgG2는 IgG1 보다는 보체 활성화에서 상당히 더 약하다. 더욱이, IgG1와는 달리, IgG2는 단핵 세포들 또는 호중구들 상에서 Fc 수용체에 결합하지 않는다. IgG3가 보체 활성화에 최적이지만, 이의 생체내 반감기는 다른 IgG 이소타입의 대략 1/3이다.

인간 치료제로 이용되도록 기획된 Fc 융합 단백질들에 대한 또다른 주요 고려사항은 특정 이소타입의 이인자형(allotypic) 변이체의 수다. 일반적으로, 훨씬 적은 혈청학적으로-한정된 알로타입을 가진 IgG 이소타입이 바람직하다. 예를 들면, IgG1는 단지 4가지 혈청학적으로 한정된 알로타입 부위들을 보유하는데, 이중 2개(GIm 및 2)가 Fc 영역내에 위치하고; 그리고 이들 부위들중 하나 Glm1가 비-면역원성이다. 대조적으로, IgG3에는 12개의 혈청학적으로 한정된 알로타입이 있고, 이들 모두 Fc 영역내에 있으며; 이들 부위들중 단지 3개(G3m5, 11 및 21)가 비-면역원성인 하나의 알로타입을 보유한다. 따라서, IgG3 융합 단백질의 잠재적 면역원성은 IgG1 융합 단백질의 것보다 더 크다.

특정 구체예들에서, Fc 융합 단백질들에 이용된 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하였을 때 하나 이상의 변화를 포함할 수 있다. 이들 Fc 도메인들은 그럼에도 불구하고 이들의 야생형 대응부와 비교하였을 때, 치료 유용성을 위하여 요구되는 실질적으로 동일한 성질들을 보유할 수 있다. 예를 들면, 가령, WO99/51642에서 설명된 것과 같이, Fc 영역내에 특정 변화를 만들어 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) CIq 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 야기할 수 있다고 생각한다. Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 그리고 Fc 영역 변이체의 기타 예들에 관련된 WO94/29351 참고. WO00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)는 FcRs에 대해 개선된 또는 감소된 결합을 가지는 항체 변이체들을 설명한다. 이들 특허 공개의 내용은 여기 참고자료에 특별히 첨부된다. Shields et al . J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001) 또한 참고. 증가된 반감기와 태아에게 모체 IgGs의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 개선된 결합을 가지는 항체들(Guyer et al ., J. Immunol . 117:587 (1976) and Kim et al ., J. Immunol . 24:249 (1994))은 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체들은 하나 이상의 치환들을 가지는 Fc reg를 포함하는데, 이는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 개선시킨다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열과 증가된 또는 감소된 CIq 결합 능력을 가지는 폴리펩티드 변이체들은 미국 특허 제6,194,551호와 국제 공개 특허 WO99/51642에서 설명된다. 또한 Idusogie et al . J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000) 참고. 이들의 내용은 여기에 참고자료에 통합된다.

예시적인 Fc 도메인은 다음과 같다.

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDGVE

VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPR

EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYS

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK* (가령, 서열 번호: 14)

복합된 유익한 링커 (TG₃) 및 Fc 도메인의 예는 다음과 같다:

TGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호: 18)

선택적으로, Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322, 및 Asn-434와 같은 잔기들에서 하나 이상의 돌연변이들을 보유한다. 특정 경우들에서, 이들 돌연변이들중 하나 이상(가령, Asp-265 돌연변이)을 보유한 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 결합하는 능력이 감소된다. 다른 경우들에서, 이들 돌연변이들중 하나 이상(가령, Asn-434 돌연변이)을 보유한 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 MHC class I-관련된 Fc-수용체 (FcRN)에 증가된 결합 능력을 가진다.

이종 폴리펩티드들

여기에서 설명된 당변이체 융합 단백질들은 또한 Fc 도메인에 직접 또는 간접적으로 융합된 이종 폴리펩티드 부분을 또한 포함한다. 이종 폴리펩티드 부분은 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 이종 폴리펩티드 부분은 최소한 10kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa, 35kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa 또는 100 kDa 또는 그 이상의 분자량을 보유한다.

이종 폴리펩티드 부분들은 성장 인자들, 효소들, 혈청 효소들, GLP1와 같은 엔도크린 인자들, 골 형성 단백질들 그리고 가용성 수용체 단편들과 같은 치료 단백질 또는 이의 단편들일 수 있다. 예시적인 이종 폴리펩티드들은 간세포 성장 인자(HGF), 신경 성장 인자 (NGF), 상피 성장 인자들 (EGF), 섬유아세포 성장 인자들 (FGF), 형질변환 성장 인자들 (가령, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타2, TGF-베타3), 맥관 내피 성장 인자들 (VEGF; 가령, VEGF-2), 인터페론들 (가령, INF-알파, INF-베타) 그리고 인슐린과 같은 성장 인자들을 포함한다. 다른 예시적인 이종 폴리펩티드들은 알파-갈락토시다제 (가령, Fabrazyme™)와 같은 효소들을 포함한다. 다른 예시적인 이종 폴리펩티드들은 골 형성 단백질들 (BMP), 에리트로포에틴(EPO), 미오스타틴, 그리고 종양 괴사 인자들 (가령, TNF-α)을 포함한다. 다른 예시적인 이종 폴리펩티드들은 세포 수용체의 임의의 자연적으로 발생된 세포외 도메인 뿐만 아니라 이의 임의의 변이체들(돌연변이체들, 단편들 그리고 펩티드모방 형태를 포함)을 포함하는 막통과 수용체의 세포외 도메인들을 포함한다.

예시적인 구체예들에서, 이종 폴리펩티드 부분은 수용체의 TNF/NGF 패밀리로부터 수용체의 세포외 도메인이다. 가용성 수용체 폴리펩티드들의 예는 본 명세서의 예를 들면, 서열 번호: 2, 5, 6, 7, 또는 8이다. 바람직한 구체예들에서, 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 보유하는 당변이체 융합 단백질들에 포함된 세포외 수용체 도메인은 자연적으로 발생된 수용체의 리간드에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구체예들에서, 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위는 세포외 수용체 도메인의 리간드 결합 포켓의 외부에 도입된다. 바람직하게는, 도입된 글리코실화 부위의 글리코실화는 가용성 리간드에 수용체 단백질의 결합에 심각하게 영향을 주지 않는다. 예시적인 구체예들에서, 도입된 글리코실화 부위의 글리코실화는 이의 리간드에 세포외 수용체 도메인의 결합을 10-배, 5-배, 3-배, 2.5-배, 2-배, 1.5-배, 1-배, 0.5-배, 또는 그 미만 이상으로 감소시키지 않는다. 바람직하게는, 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는 가용성 수용체 도메인은 1 M 미만의 또는 100nM, 10nM, 또는 1 nM 미만의 해리 상수를 가진 지정된 리간드에 결합할 것이다.

한 구체예에서, 여기에서 설명된 당변이체 융합 단백질들은 신경 성장 인자 (NGF)/종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 패밀리로부터 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 이종 폴리펩티드 부분을 포함한다. 가령, M. Lotz , et al ., J. Leukocyte Biology , 60: 1-7 (1990) 참고. NGF/TNF 수용체 패밀리는 예를 들면, 신경 성장 인자 수용체 (NGFR), TNFR1 (또는 TNFR55), TNFR2 (또는 TNFR75), TNF 수용체-관련된 단백질 (TNFRrp), CD40, Hodgkin 항원 CD30, T 세포 항원 CD27, Fas/APO-1, OX-40, 그리고 4-1BB/ILA를 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 여기에서 설명된 융합 단백질들은 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 보유하는 TNFR2의 세포외 도메인을 포함한다.

여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "TNFR2"는 TNFR2 단백질들로부터 돌연변이 생성 또는 기타 변경에 의해 유도된 임의의 종들 및 변이체들의 종양 괴사 인자 수용체 유형 2 (TNFR2) 단백질들 패밀리를 지칭한다. TNFR2 패밀리의 구성요소들은 시스테인-풍부한 영역을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막통과 도메인, 그리고 예상된 세포내 신호생성 활성을 가지는 세포질 도메인으로 구성된 일반적으로 막통과 단백질들이다.

용어 "TNFR2 폴리펩티드"는 TNFR2 패밀리 구성요소들의 임의의 자연적으로 발생된 폴리펩티드 뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 임의의 이들 변이체들(돌연변이체들, 단편들, 융합, 그리고 펩티드모방 형태들을 포함)을 포함하는 폴리펩티드들을 포함한다. 예를 들면, TNFR2 폴리펩티드들은 TNFR2 폴리펩티드의 서열에 최소한 약 80% 동일한, 그리고 바람직하게는 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가지는 임의의 공지된 TNFR2 서열로부터 유도된 폴리펩티드들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 TNFR2 폴리펩티드는 TNFα 또는 TNFβ에 결합하고, 그리고 TNFR2 단백질 및/또는 TNFα 또는 TNFβ의 기능을 억제할 수 있다. TNFR2 폴리펩티드들의 예는 인간 TNFR2 전구 폴리펩티드 (서열 번호:1) 와 가용성 인간 TNFR2 폴리펩티드들 (가령, 서열 번호: 2, 5, 6, 7, 또는 8)을 포함한다.

인간 TNFR2 전구 단백질 서열은 다음과 같다:

신호 펩티드는 단일 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 도메인은 굵게 표시하였고, 그리고 잠재적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 이중 밑줄로 나타낸다.

인간 TNFR2 가용성 (세포외), 프로세스된 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:

자연적으로 발생된 N-링크된 글리코실화 부위들을 밑줄로 나타낸다. 여기에서 설명된 것과 같이, 아미노 말단 류신은 제거될 수 있고, 아미노-말단에 프롤린 잔기는 남겨둔다.

인간 TRFR2 전구 단백질을 인코드하는 핵산 서열은 다음과 같다(Genbank entry NM_001066.2):

인간 TNFR2 가용성 (세포외) 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열은 다음과 같다:

본 명세서에서 하나 이상의 N-링크된 글리코실화 부위들 (NXS/T)의 추가로 변경안된 TNFR2-Fc 단백질과 비교하여 TNFR2-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 증가된다는 것을 설명한다. N-링크된 글리코실화 부위들은 이미-존재하는 S 또는 T에 대해 정확한 위치에 N을 도입함으로써, 또는 이미-존재하는 N에 대해 정확한 위치에서 S 또는 T를 도입함으로써, 최소한 노력으로 도입될 수 있다. TNFR2 안에 비-내생성 NXS/T 서열들을 도입하는데 특히 적합한 부위들은 예를 들면, 서열 번호: 2에 관련하여 아미노산 25-27 (DQT), 26-28 (QIA), 133-135 (ETS), 및 231-233 (GST)를 포함한다. 예를 들면, N-링크된 글리코실화 부위를 도입할 수 있는 바람직한 변화들은 다음과 같다: D25N, Q26N, A28S, E133N, 그리고 G231N. 일부 경우들에서, 비-내생성 NXS/T 서열을 도입시키기 위하여 몇몇 아미노산이 변경될 수 있다. 예를 들면, Q26N/A28S의 이중 치환은 서열 번호: 2의 잔기 26-28에서 새로운 N-링크된 글리코실화 부위를 도입하는데 필수적인 N 및 S 잔기들을 제공한다. 더구나, 다중 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입하기 위하여 TNFR2-Fc 폴리펩티드 상의 하나 이상의 영역은 변경될 수 있다. 예를 들면, D25N/E133N의 이중 치환은 서열 번호: 2의 잔기 25-27 그리고 133-135에서 2가지 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입하고 그리고 D25N/G231N의 이중 치환은 서열 번호: 2의 잔기들 25-27 및 231-233에서 2가지 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입한다. 기타 예시적인 TNFR2 변이체들은 예를 들면, E133N/G231N, Q26N/A28S/E133N 그리고Q26N/A28S/G231N를 포함한다. 글리코실화되는 것으로 예상되는 임의의 S는 글리코실화에 의해 부여되는 보호로 인하여 면역성 부위를 만들지 않고 T로 변경될 수 있다. 유사하게, 글리코실화되는 것으로 예상되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다.

3. 당변이체 융합 단백질들을 인코딩하는 핵산들

특정 측면들에서, 본 발명은 여기에서 설명하는 단편들 그리고 기능 변이체들을 포함하는 본 발명의 임의의 당변이체 융합 단백질들을 인코드하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 해당 핵산들은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 이러한 핵산들은 DNA 또는 RNA 분자들일 수 있다. 이들 핵산은 예를 들면, 본 발명의 당변이체 융합 단백질들의 제조를 위한 방법들에 이용하거나 또는 직접적인 치료 약제(가령, 유전자 치료 방법)에 이용할 수 있다.

예시적인 구체예들에서, 본 발명의 핵산은 TNFR2-Fc 당변이체 융합 단백질을 인코드한다. 예를 들면, 서열 번호: 3은 자연적으로 발생된 인간 TNFR2 전구 폴리펩티드들을 인코드하고, 서열 번호: 4는 TNFR2의 프로세스된 세포외 도메인을 인코드한다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 당변이체 융합 단백질들을 인코드하는 핵산은 서열 번호: 3, 4, 9, 또는 17의 변이체인 핵산을 포함할 수 있다는 것으로 본다. 변이체 뉴클레오티드 서열들은 대립형질 변이체들과 같이 하나 이상의 뉴클레오티드 치환들, 추가들 또는 결손에 의해 달라진 서열들을 포함한다. 예시적인 구체예들에서, 변이체 핵산들은 핵산 서열 변경을 포함하는데, 이는 인코드된 단백질 내에 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들의 도입을 초래한다.

특정 구체예들에서, 본 발명은 서열 번호: 3, 4, 9, 또는 17에 대해 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공하고, 그리고 인코드된 단백질 내에 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들의 도입을 초래하는 하나 이상의 서열 변경을 포함한다. 당업계 숙련자는 서열 번호: 3, 4, 9, 또는 17에 상보적인 핵산 서열, 그리고 인코드된 단백질 내에 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 도입하는 서열 번호: 3, 4, 9, 또는 17의 변이체 또한 본 발명의 범위내에 있다는 것을 인지할 것이다. 추가 구체예들에서, 본 발명의 핵산 서열들은 단리된, 재조합, 및/또는 이종 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, 또는 DNA 라이브러리내에 있을 수 있다.

다른 구체예들에서, 본 발명의 핵산들은 매우 엄격한 조건(highly stringent conditions)하에서 서열 번호: 3, 4, 9, 또는 17로 지정된 뉴클레오티드 서열에, 서열 번호: 3, 4, 9, 또는 17의 상보 서열에, 또는 이의 단편들에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 서열들은 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들을 보유하는 당변이체 단백질 융합을 인코드한다. 당업계 숙련자들은 DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건들은 가변적이라는 것을 바로 인지할 수 있을 것이다. 당업게 숙련자는 DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건들은 가변적이라는 것을 바로 인지할 수 있을 것이다. 예를 들면, 약 45℃에서 6.0 X 염화나트륨/구연산 나트륨(SSC)에서 혼성화후, 50℃에서 2.0 x SSC로 세척하여 실행할 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 약 2.0 x SSC, 50℃의 낮은 엄격성에서 약 0.2 x SSC, 50℃ 높은 엄격성까지 선택될 수 있다. 더구나, 세척 단계에서 온도는 실온, 약 22℃의 낮은 엄격성으로부터 약 65℃의 높은 엄격성까지 증가될 수 있다. 온도 및 염은 변화될 수 있고, 또는 온도 또는 염 농도는 불변으로 유지하고, 다른 변수를 변화시킬 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격성하에서 혼성화되고, 실온에서 2 x SSC로 세척되는 핵산을 제공한다.

유전자 코드의 축퇴로 인하여 그리고 인코드된 단백질내에 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 도입시켜 서열 번호: 3, 4, 또는 9에서 제시된 핵산과는 상이한 단리된 핵산 변이체들 또한 본 발명의 범위내에 있다. 예를 들면, 다수의 아미노산들은 하나 이상의 3개-한 벌 코드(triplet)가 할당된다. 동일한 아미노산을 명시한 코돈, 또는 동일한 아미노산을 지정하는 코돈(synonyms) (예를 들면, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대해 동일한 코돈이다)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 침묵 돌연변이를 초래할 수 있다. 그러나, 대상 단백질들의 아미노산 서열의 변화로 이어지는 DNA 서열 다형성(polymorphisms)이 포유류 세포에 존재할 수 있다는 것으로 예상된다. 당업계 숙련자는 특정 단백질을 인코드하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 최대 약 3-5%)에서 이들 변이는 천연 대립형질 변이로 인하여 주어진 개별 종들 사이에 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 임의의 그리고 모든 이러한 뉴클레오티드 변이와 결과적인 아미노산 다형성은 본 발명의 범위내에 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 재조합 핵산들은 발현 구조체내에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열들은 발현에 이용되는 숙주 세포에 일반적으로 적절할 것이다. 당업계에는 다양한 숙주 세포에 대하여 다양한 유형의 적절한 발현 벡터들 및 적합한 조절 서열들이 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열들은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위들, 전사 시작 및 종료 서열, 해독 시작 및 종료 서열, 그리고 인헨서 또는 활성화 서열을 포함하나 이에 한정되지 않을 수 있다. 당업계 공지된 것과 같이 구성 또는 유도성 프로모터도 본 발명에서 고려된다. 프로모터는 자연적으로 발생된 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소들이 복합된 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포안에 플라스미드와 같은 에피좀에 존재할 수 있거나, 또는 발현 구조체는 염색체내에 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 형질변환된 숙주 세포의 선택을 허용하는 선택가능한 표식 유전자를 포함한다. 선택가능한 표식 유전자들은 당업계에 잘 알려져 있고, 이용되는 숙주 세포에 따라 가변적일 것이다.

특정 구체예들에서, 발명의 핵산은 최소한 하나의 조절 서열에 작용가능하도록 링크된 본 발명의 당변이체 융합 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 제공된다. 조절 서열은 당업계에서 인지되며, 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인헨서, 그리고 기타 발현 조절 요소들을 포함한다. 예시적인 조절 서열들은 Goeddel ; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology , Academic Press , San Diego , Calif . (1990)에서 설명된다. 예를 들면, 당변이체 융합 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 발현 조절 서열에 작용가능하도록 링크된 경우 DNA 서열의 발현을 조절하는 다양한 범주의 발현 조절 서열들이 이들 벡터에 이용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열들은 예를 들면, SV40 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 즉각 초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 RNA 폴리머라제에 의해 발현이 지시되는 T7 프로모터, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 피복 단백질에 대한 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜화 효소들에 대한 프로모터, 산 포스파타제, 가령, Pho5의 프로모터, 효모 알파-메이팅 인자들의 프로모터, 베큘로바이러스 시스템의 폴리헤드론 프로모터와 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 서열들, 그리고 이의 다양한 조합들을 포함한다. 발현 벡터의 기획은 형질변환될 숙주 세포 및/또는 발현되기를 바라는 단백질 유형의 선택과 같은 인자들에 따라 달라진다는 것을 인지해야만 한다. 더욱이, 벡터의 복사체 수, 복사체 수와 벡터에 의해 인코드된 임의의 기타 단백질 가령, 항생제 표식과 같은 단백질의 발현을 조절하는 능력 또한 고려되어야만 한다.

본 발명의 재조합 핵산은 클론된 유전자 또는 이의 일부분을 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류) 또는 이둘 모두안에서 발현에 적합한 벡터에 결찰시킴으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 재조합 당변이체 융합 단백질의 생산을 위한 발현 비이클은 플라스미드와 기타 벡터들을 포함한다. 예를 들면, 적합한 벡터들은 다음 유형의 플라스미드들을 포함한다: 대장균과 같은 원핵 세포에서 발현용 pBR322-유도화된 플라스미드, pEMBL-유도화된 플라스미드, pEX-유도화된 플라스미드, pBTac-유도화된 플라스미드 그리고 pUC-유도화된 플라스미드.

일부 포유류 발현 벡터들은 박테리아 내에서 벡터의 증식을 용이하게 하기 위한 원핵 서열과 진핵 세포내에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위들을 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도화된 벡터들은 진핵 세포들의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터들의 예들이다. 진핵 및 원핵 세포 모두에서 복제 및 약물 저항성 선별을 용이하게 하기 위하여 이들 벡터들중 일부는 박테리아성 플라스미드, 가령 pBR322의 서열로 변경시킨다. 대안으로, 소의 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 Epstein-Barr 바이러스 (pHEBo, pREP-유도화된 그리고 p205)와 같은 바이러스 유도체들은 진핵 세포들에서 단백질의 일과적인 발현을 위하여 이용될 수 있다. 기타 바이러스성 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템은 하기 유전자 치료 전달 시스템의 설명에서 찾아볼 수 있을 것이다. 플라스미드의 조제물 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용된 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템 뿐만 아니라 전반적인 재조합 과정들은 Molecular Cloning A Laboratory Manual , 3 rd Ed ., ed . by Sambrook , Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press , 2001)을 참고한다. 일부 경우들에서, 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 재조합 당변이체 융합 단백질들을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 베큘로바이러스 발현 시스템의 예로는 pVL-유도화된 벡터 (pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도화된 벡터 (pAcUW1), 그리고 pBlueBac-유도화된 벡터 (-gal 함유 pBlueBac III)를 포함한다.

바람직한 구체예에서, CHO 세포내에서 본 발명의 대상 당변이체 융합 단백질들의 생산을 위하여 벡터를 고안할 수 있는데, 가령, Pcmv-Script 벡터 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 그리고 pCI-neo 벡터 (Promega, Madison, Wis.)가 있다. 명백한 것으로, 정제용으로 융합 단백질들 또는 변이체 단백질들을 포함하는 단백질을 생산하기 위하여, 대상 유전자 구조체들을 이용하여 배양물에서 증식될 세포내에서 해당 당변이체 융합 단백질들의 발현을 야기할 수 있다.

본 내용은 또한 본 발명의 하나 이상의 당변이체 단백질 융합용 코딩 서열을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관계한다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 당변이체 융합 단백질은 대장균과 같은 박테리아 세포, 곤충 세포들 (가령, 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용), 효모, 또는 포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 기타 적합한 숙주 세포들은 당업계 숙련자들이 알고 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CHO 또는 BHK 세포계와 같은 발현된 단백질 상에 포유류 글리코실화 패턴을 만들 수 있는 포유류 숙주 세포일 것이다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 당변이체 융합 단백질들을 만드는 방법에 더 관계한다. 예를 들면, Fc-융합 단백질을 인코드하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 Fc-융합 단백질의 발현이 일어나는 것을 허용하는 적절한 조건하에 배양될 것이다. Fc-융합 단백질은 배출될 수 있고, 그리고 Fc-융합 단백질을 함유하는 배지와 세포들의 혼합물로부터 분리될 수 있다. 대안으로, Fc-융합 단백질은 세포질내에 남아있거나 막 분획물내에 남아 있을 수 있고, 세포를 수거하고, 용해시키고, 단백질을 단리시킬 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포들, 배지 및 기타 부산물들을 포함한다. 세포 배양물용으로 적합한 배지는 당업계에 잘 공지되어 있다. 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, Fc-융합 단백질들의 특정 에피토프에 특이적인 항체로 면역친화력 정제와 Fc-융합 단백질에 융합된 도메인에 결합하는 약제로 친화력 정제(가령, 단백질 A 컬럼을 이용하여 Fc-융합 단백질들을 정제할 수 있다)를 포함하는 단백질들을 정제하기 위한 당업계에 공지된 기술들을 이용하여 세포 배양물 배지, 숙주 세포, 또는 이둘 모두로부터 Fc-융합 단백질들을 분리시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, Fc-융합 단백질은 이의 정제를 용이하게 하는 추가 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 정제는 임의의 순서로 다음중 3개 또는 그 이상을 포함하는 컬럼 크로마토그래피 단계들에 의해 실행된다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스성 여과 및 완충액 교환으로 완성될 것이다. 본 발명의 당변이체 융합 단백질들은 크기 압출 크로마토그래피로 측정하였을 때 >98% 순도로 정제될 수 있으며 그리고 SDS PAGE로 측정하였을 때 >95% 순도로 정제될 수 있다.

또다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 당변이체 Fc-융합 단백질의 바람직한 부분의 N-말단에서 poly-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열과 같은 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni² ⁺ 금속 수지를 이용한 친화력 크로마토그래피에 의해 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 그 다음 정제 리더 서열은 본 발명의 정제된 당변이체 융합 단백질을 제공하기 위하여 엔테로키나제로 처리하여 후속적으로 제거될 수 있다(가령, Hochuli et al ., (1987) J. Chromatography 411:177; and Janknecht et al ., PNAS USA 88:8972 참고). 융합 유전자들을 만드는 기술들은 잘 알려져 있다. 기본적으로, 상이한 폴리펩티드 서열들을 코딩하는 다양한 DNA 단편들의 접합(joining)은 결찰을 위하여 블런트-끝나는 또는 스태글(stagger)-끝나는 말단을 이용하고, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 절단(digestion), 코헤시드 엔드의 적절한 말단 채움(filing in), 불필요한 접합을 회피하기 위하여 적절한 알칼리 포스파타제 처리, 그리고 효소적 결찰을 이용하는, 통상적인 기술에 따라 실행된다. 또다른 구체예, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술에 의해 합성될 수 있을 것이다. 대안으로, 유전자 단편들의 PCR 증폭은 키메라 유전자 서열을 만들기 위하여 후속적으로 어닐링될 수 있는 2개의 연속 유전자 단편들 사이에 상호적 오버행을 초래하는 앙커 프라이머를 이용하여 실행할 수 있다 (예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology , eds . Ausubel et al ., John Wiley & Sons : 1992).

4. 혈청 반감기를 증가시키는 방법들

특정 구체예들에서, 본 발명은 Fc 도메인의 외부 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입시키기 위하여 융합 단백질을 변형시킴으로써 Fc 융합 단백질의 안정성 및/또는 반감기(가령 시험관내, 생체내, 또는 혈청 반감기)를 증가시키는 방법들에 관계한다. 예를 들면, 이러한 방법은 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 도입시키기 위하여 Fc 융합 단백질 서열을 변경시키고, 그리고 Chinese 헴스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 세포와 같은 적합한 세포내에서 상기 변경된 폴리펩티드를 인코드하는 핵산을 발현시켜 당변이체 Fc 융합 단백질을 생산하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 다음을 포함할 수 있다: a) 변경된 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건들 하에서 세포를 배양하고, 여기서 상기 세포는 변경된 폴리펩티드 발현 구조체로 형질변환되며; 그리고 b) 발현된 변경 단백질을 회수한다. 정제는 다음중 하나, 둘 또는 셋 또는 그 이상을, 임의의 순서로 포함하는 일련의 정제 단계에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(가령, Q 세파로즈), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (가령, 페닐세파로즈), 크기 압출 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 본 명세서의 이러한 폴리펩티드는 액체 또는 고체(가령, 동결건조된 형)내에 추가 조제될 수 있다. 여기에서 설명된 임의의 당변이체 융합 단백질들은 상기 방법을 이용하여 만들 수 있다.

바람직한 구체예들에서, 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위들에서 글리코실화는 도입된 글리코실화 부위가 부족한 융합 단백질의 혈청 반감기와 비교하여 최소한 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 또는 250% 또는 그 이상으로 변경된 융합 단백질의 반감기 (가령, 시험관내, 생체내, 혈청 반감기)를 증가시킨다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법들은 본 명세서의 융합 단백질의 각 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 또는 200개의 아미노산들 마다 최소한 하나의 글리코실화된 아미노산을 도입시키는데 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법들은 N-링크된 글리코실화, O-링크된 글리코실화, 또는 이 둘에 의해 변경된 각 아미노산 사이에 최소한 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 또는 100개 또는 그 이상 아미노산들 만큼의 거리를 유지하도록 글리코실화 부위들을 도입시키는데 이용될 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 명세서는 최소한 하나의 이종 폴리펩티드 도메인과 면역글로블린 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 반감기를 연장시키는 방법들을 제공한다. 예를 들면, 이러한 방법들은 a) 하나 이상의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입시키기 위하여 면역글로블린 Fc 도메인의 외부 Fc-융합 단백질을 변형시키고 그리고 b) 도입된 글리코실화 부위들중 하나가 글리코실화된 Fc-융합 단백질을 발현시키는 것을 포함할 수 있다. 여기에서 설명된 방법들은 예를 들면, 리간드-결합 도메인를 포함하는 수용체의 세포외 도메인(가령, 가용성 부분)의 부분을 포함하는 Fc-융합 단백질의 반감기를 연장시키는데 이용될 수 있다. 특정 구체예들에서, 이 방법들은 Fc-융합 단백질의 리간드-결합 도메인의 외부에 글리코실화 부위들을 도입시키는데 이용된다. 바람직한 구체예들에서, 글리코실화 부위들을 도입시키는 방법들은 가용성 리간드에 융합 단백질의 수용체 부분이 결합하는 것에 큰 영향을 주지 않으며, 가령, 리간드 결합은 도입된 글리코실화 부위가 부족한 Fc-융합 단백질에 대한 리간드 결합과 비교하여 2-, 3-, 5-, 10-, 또는 15-배 적게 영향을 받는다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 방법들은 링커 도메인을 포함하는 융합 단백질 상에 하나 이상의 글리코실화 부위들을 도입시키는데 이용된다. 특정 구체예들에서, 본 명세서의 방법들은 링커 도메인 안에 최소한 하나의 글리코실화 부위를 도입시키는데 이용된다. 일반적으로, 여기에서 설명된 방법들을 이용하여 이종 도메인들을 보유하는 더 큰 분자량의 융합 단백질들, 가령, 최소한 25kDa, 30kDa, 35kDa, 40kDa, 45kDa, 50kDa, 55kDa, 60kDa, 65kDa, 70kDa, 75kDa, 80kDa, 85kDa, 90kDa, 95kDa, 100kDa, 105kDa, 또는 110 kDa인 더 큰 분자량의 단백질들의 반감기를 증가시킨다.

5. 스크리닝 분석

특정 측면들에서, 본 발명은 최소한 하나의 생물학적 활성을 유지시키고, 그리고 증가된 안정성 및/또는 증가된 혈청 반감기를 보유하는 당변이체 Fc 융합 단백질들을 확인하기 위한 스크리닝 분석을 제공한다. 생물학적 활성들을 조절하는 능력을 평가하고, 이들의 안정성을 평가하고 및/또는 혈청 반감기 생체내 또는 시험관내에서 이들의 혈청 반감기를 평가하기 위하여 당변이체 융합 단백질들을 테스트할 수 있다. 당변이체 융합 단백질들은 예를 들면, 동물 모델에서 테스트될 수 있다.

본 발명의 당변이체 융합 단백질의 생물학적 활성을 스크리닝하는 많은 방법들이 있는데, 예를 들면, 당변이체 수용체-Fc 융합 단백질을 분석할 때, 리간드에 결합하는 변경된 수용체의 능력을 측정할 수 있거나, 또는 리간드-수용체 신호생성을 파괴하는 당변이체 융합 단백질의 능력이 분석될 수도 있다. 특정 구체예들에서, 당변이체 융합 단백질들의 고처리량 스크리닝(high-throughput screening)은 변경안된 단백질의 최소한 하나의 생물학적 활성을 보유하는 당변이체, 예를 들면, 선택된 세포계 상에서 리간드 또는 수용체-중개된 효과를 교란시키는 당변이체를 확인하기 위하여 실행될 수 있다.

다양한 분석 포맷은 충분할 것이며, 그럼에도 불구하고 본 내용에 근거하여 볼 때 여기에서 명확하게 설명되지 않은 것들도 당업계 숙련자들이 이해할 수 있을 것이다. 여기에서 설명된 것과 같이, 본 발명의 당변이체 융합 단백질들은 상기 융합 단백질들을 인코드하는 핵산의 대응 단편으로부터 재조합적으로 만들어진 폴리펩티드들을 스크리닝하여 수득할 수 있다. 더구나, 단편들은 통상적인 Merrifield 고형상 f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당업계에 공지된 기술들을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 기능적으로 활성이 있는 당변이체 융합 단백질들은 상기 융합 단백질들을 인코드하는 대응하는 돌연변이된 핵산으로부터 재조합적으로 생산된 변경된 융합 단백질들의 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 당변이체들을 만들 수 있고, 변경안된 융합 단백질들의 최소한 생물학적 활성, 예를 들면, 다양한 세포 수용체 단백질들 (가령, TNFR2 수용체 단백질들)의 길항제(억제제)로 작용하는 당변이체 수용체 융합의 능력 및/또는 리간드-수용체 결합에 의해 중개되는 세포내 신호생성과 같은 활성을 보유하는 지를 테스트할 수 있다.

안정성 및/또는 혈청 반감기를 증가시키기 위하여 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 기능을 하는 당변이체들은 생성될 수 있다. 생물학적 활성, 예를 들면, 리간드 결합과 같은 생물학적 활성을 보유하는 것으로 선택될 경우 이러한 변경된 당변이체 단백질들은 변경안된 융합 단백질들의 기능적 등가물로 간주된다. 하나 이상의 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입시키기 위한 아미노산 치환, 결손 또는 추가에 의해 및/또는 보존적 치환들과 같이 기타 서열 변경에 의해 변경된 당변이체 융합 단백질들을 또한 만들 수 있다. 예를 들면, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르트산염을 글루탐산염으로, 트레오닌을 세린으로 단리된 치환, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 대체 (가령, 보존성 돌연변이들)는 생성 분자의 생물학적 활성에 큰 영향을 가지지 않을 것으로 기대한다. 보존적 대체는 이들의 측쇄에서 관련된 아미노산의 패밀리내에서 일어난다. 본 발명의 융합 단백질의 아미노산 서열내 변화가 기능적으로 등가체(homolog)를 만드는 지는 변이체 융합 단백질이 변경안된 융합 단백질과 유사한 방식으로 생물학적 활성을 나타내는 능력이 있는 지를 평가함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 수용체 폴리펩티드에 리간드의 결합을 방해하기 위하여 또는 수용체에 리간드의 결합에 의해 야기되는 신호생성을 간섭하기 위하여, 특이적인 리간드 (가령, TNFα 또는 TNFβ)에 결합하는 능력에 대하여 변이체 수용체 Fc 융합 단백질들, 가령, TNFR2-Fc 융합 단백질의 능력을 스크리닝할 수 있다.

당변이체 융합 단백질들의 복합 라이브러리는 융합 단백질들의 라이브러리 를 인코드하는 유전자의 라이브러리를 축퇴(degenerate)함으로써 만들 수 있는데, 각 유전자는 잠재적 폴리펩티드 서열의 최소한 일부분을 포함한다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드들의 혼합물은 유전자 서열에 효소적으로 결찰되어 잠재적 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드들로 발현가능하도록 하거나, 또는 대안으로, 더 큰 융합 단백질(가령, 파아지 디스플레이용) 세트로 발현되도록 할 수 있다.

축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 당변이체의 라이브러리를 만들 수 있는 많은 방법들이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기내에서 실행할 수 있고, 그리고 합성 유전자는 발현을 위하여 적절한 벡터 안으로 결찰시킬 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 잘 공지되어 있다( 예를 들면, Narang , SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al ., (1981) Recombinant DNA, Proc . 3 rd Cleveland Sympos . Macromolecules , ed . AG Walton , Amsterdam : Elsevier pp 273-289; Itakura et al ., (1984) Annu . Rev . Biochem . 53:323; Itakura et al ., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res . 11:477). 이러한 기술들은 기타 단백질들의 유향적 진화(directed evolution)에 이용되었다(예를 들면, Scott et al ., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al ., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al ., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al ., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 뿐만 아니라 미국 특허 제5,223,409호, 제5,198,346호, 및 제5,096,815호 참고).

점 돌연변이들 및 절두(truncations)에 의해 만들어진 복합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝, 그리고 특정 성질을 보유하는 유전자 산물들에 대한 cDNA 라이브러리 스크리닝에 관한 광범위한 기술들이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술들은 본 발명의 당변이체 융합 단백질들의 복합 돌연변이생성에 의해 발생된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 일반적으로 적합할 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 가장 많이 이용되는 기술은 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터 안으로 클로닝하고, 적절한 세포를 생성된 벡터 라이브러리로 형질변환시키고, 그리고 원하는 활성의 탐지는 유전자의 산물이 탐지되는 유전자를 인코드하는 벡터의 용이한 분리를 실행할 수 있는 조건들 하에서 복합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다.

바람직한 분석은 수용체-리간드 결합 분석 및 리간드-중개된 세포 신호생성 분석을 포함한다. 본 발명의 당변이체 수용체-Fc 융합 단백질들과 리간드 사이에 복합체 형성은 다양한 기술들을 이용하여 탐지할 수 있다. 예를 들면, 복합체 형성의 조절은 예를 들면, 방사능 동위원소 라벨된(가령, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H), 형광 라벨된(가령, FITC), 또는 효소적으로 라벨된 수용체 폴리펩티드 또는 리간드와 같은 탐지가능하도록 라벨된 단백질들, 면역분석, 또는 크로마토그래피 탐지를 이용하여 정량화할 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명은 당변이체 수용체-Fc 융합 단백질과 이의 결합 리간드 사이에 상호작용 정도를 직접 또는 간접적으로 측정함에 있어서 형광 편광 분석 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석을 이용하는 것을 고려한다. 더구나, 다른 방식의 탐지, 가령, 광도파로(optical waveguides) (PCT 공개 WO 96/26432 및 미국 특허 제5,677,196호), 표면 플라스몬 공명(SPR), 표면 전하 센서, 그리고 표면력 센스에 기초한 것들도 본 발명의 많은 구체예들과 양립할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 당변이체 Fc 융합 단백질과 이의 결합 파트너 사이에 상호작용을 파괴하거나 또는 강화시키는 약제를 확인하기 위하여이중 하이드리브 분석으로도 알려진 상호작용 트랩 분석의 이용을 고려한다. 예를 들면, 미국 특허 제5,283,317호; Zervos et al . (1993) Cell 72:223-232; Madura et al . (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al . (1993) Biotechniques 14:920-924; and Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696 참고). 대안으로, 이러한 단백질-단백질 상호작용은 광-교차연결, 방사능 동위원소 라벨된 리간드 결합, 그리고 친화력 크로마토그래피를 포함하는 시험관내 생화학적 방법들을 이용하여 단백질 수준에서 확인할 수 있다(Jakoby WB et al ., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). 특정 경우들에서, 당변이체 융합 단백질들은 리간드 또는 수용체 폴리펩티드에 결합하는 당변이체 융합 단백질들을 탐지하는 분석과 같은 분석에 근거한 기전에서 스크리닝할 수 있다. 고형상 또는 유동상 결합 이벤트가 포함될 수 있다. 대안으로, 리간드 또는 수용체 폴리펩티드를 인코드하는 유전자는 리포터 시스템 (가령, -갈락토시다제, 루시퍼라제, 또는 녹색 형광 단백질)과 함께 세포로 형질감염시키고, 고처리량 스크리닝에 의해 선택적으로 당변이체 라이브러리에 대해 스크리닝되거나 또는 당변이체 라이브러리의 개별 구성요소들과 함께 스크리닝할 수 있다. 결합 분석에 근거한 다른 기전들 예를 들면, 자유 에너지의 변화를 탐지하는 결합 분석을 이용할 수 있다. 결합 분석은 웰, 비드 또는 칩에 고정된 또는 고정된 항체에 의해 포집된 또는 모세관 전기영동에 의해 해리된 표적으로 실행할 수 있다. 결합된 단백질들은 발색 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 보통 탐지할 수 있다.

6. 예시적인 치료 용도

다양한 구체예들에서, 본 발명의 당변이체 융합 단백질로 치료될 환자들, 또는 본 발명의 당변이체 융합 단백질로 치료할 수 있는 후보 환자들은 포유류 가령, 설치류 및 영장류, 그리고 특히 인간 환자일 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 명세서는 증가된 반감기를 특징으로 하는 변경된 가용성 수용체-Fc 융합을 제공한다. 수용체-Fc 융합은 다양한 장애들 및 이상을 치료하는데 이용한다는 것은 이미 설명되었으며, 여기에서 요약한다.

여기에서 이용된 것과 같이, 장애 또는 이상을 예방하는 치료는 통계학적 시료에서 치료를 받지 않은 기준 시료내에서 장애 또는 이상의 발생을 감소시키거나, 또는 치료안한 기준 시료와 비교하여 장애 또는 이상의 하나 이상의 증상의 개시 또는 중증도를 감소시키는 치료를 말한다. 용어 치료하는(treating)은 여기에서 이용된 것과 같이, 지명된 이상의 예방 또는 이미 확립된 이상의 완화 또는 제거를 포함한다. 어느 경우든, 예방 또는 치료는 의사 또는 다른 건강 관리자 그리고 치료 약제의 투여의 의도된 결과에 의해 제시된 진단과 구별될 수 있다.

일부 구체예들에서, 본 명세서는 증가된 혈청 반감기를 보유하는 TNFR2 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 당변이체 융합 단백질를 제공한다. 이러한 TNFR2-Fc 당변이체 융합을 이용하여 TNF-α중개된 장애들 또는 이상, 예를 들면 급성 및 만성 면역 및 자가면역 병리(가령, 전신 홍반성 낭창(SLE), 류마티스성 관절염, 청소년 만성 관절염, 갑상선염, 이식편대 숙주 질환, 경피증, 진성 당뇨병, Graves 질환), 추골관절증, 감염과 관련된 장애들(가령, 폐혈증 증후군, 악액질, 급성 또는 만성 세균성 감염으로 인한 순환성 허탈(circulatory collapse) 및 쇼크, 급성 및 만성 기생충 및/또는 감염성 질환, 박테리아성, 바이러스성 또는 곰팡이성), 만성 염증 병리 (가령, 경피증, 유육종증, 만성 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 그리고 Crohn 질병), 맥관 염증 병리(가령, 산재성 맥관내 응고, 아테롬성동맥경화증, 그리고 Kawasaki 병리 ), 그리고 신경퇴행성 질환 (가령, 다발성 경색, 급성 횡단성 척수염, 척추세포외(extrapyramidal), Huntington 무도병 그리고 노인성 무도병; Parkinson 질환, 진행성 핵상 마비, 척추 운동실조, Friedreich의 운동실조, Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, MachadoJoseph, Refsum 질환, 무베타지질단백질혈증, 모세관확장증, 미토콘드리아성 다중-시스템 장애, 근위축성 측색 경화증, 영아성 척추 근육 위축증, 청소년 척추 근육 위축증, Alzheimer 질환, Down 증후군, 미만성 루이스 소체 질환, Wernicke-Korsakoff 증후군, Creutzfeldt-Jakob 질환, 아급성 경화성 범뇌염, Hallerrorden-Spatz 질환, 그리고 권투선수 치매)를 포함하는 다양한 TNF-중개된 장애들 또는 이상을 예방 또는 치료할 수 있다.

7. 약학 조성물들

특정 구체예들에서, 여기에서 설명된 당변이체 융합 단백질들은 약제학적으로 수용가능한 운반체와 함께 조제된다. 예를 들면, 본 명세서의 융합 단백질은 단독으로 또는 약학 조제물(치료 조성물들)의 성분으로 투여될 수 있다. 해당 화합물들은 인간 또는 수의학적 약물에서 임의의 통상적인 방식으로 투여할 수 있도록 조제될 수 있다. 적절한 투약 섭생은 담당 의사가 결정할 수 있고, 치료 단백질의 변경안된 형태에 대한 표준 투약 섭생으로 알 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 치료 방법은 전신으로 조성물을 투여하거나 또는 임플란트 또는 장치로 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여하였을 때, 본 발명에서 사용되는 치료 조성물들은 물론 발열물질 없는 생리학적으로 수용가능한 형태이다. 여기에서 설명된 융합 단백질들 이외에 조성물에 선택적으로 포함될 수 있는 치료에 유용한 약제들은 본 발명의 방법에서 해당 융합 단백질과 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

전형적으로, 여기에서 설명된 융합 단백질들은 장관외로 투여할 수 있다. 장관외 투여에 적합한 약학 조성물들은 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 멸균 등장성 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유상액, 또는 사용전 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 복합된 본 명세서의 하나 이상의 융합 단백질들을 포함할 수 있고, 조성물은 항산화제, 완충액, 정균제 그리고 의도된 수용자의 혈액과 조제물이 등장성을 이루도록 만드는 용질 또는 현탁 또는 농후제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 운반체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 이와 유사한 것), 그리고 이의 적합한 혼합물, 올리브유와 같은 식물성 오일, 그리고 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 예를 들면, 레시틴과 같은 피복 원료들을 이용하여, 분산의 경우 요구되는 입자 크기를 유지하고, 그리고 계면활성제를 이용하여 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다.

더 한층, 조성물들은 표적 조직 부위(가령, 뼈, 근육, 순환계, 등)로 운반하기 위한 형태로 포집되거나 또는 주사될 수 있다 . 특정 구체예들에서, 본 발명의 조성물들은 표적 조직 부위 (가령, 뼈, 근육, 순환계)로 하나 이상의 치료 화합물들 (가령, 당변이체 융합 단백질들)을 운반할 수 있고, 발단하는 조직을 위한 구조를 제공하고 그리고 신체로 선택적으로 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들면, 매트릭스는 본 명세서의 융합 단백질의 지연 방출을 제공할 수 있다. 이러한 매트릭스는 이식된 다른 의료 수단을 위해 현재 이용되는 원료들로 형성될 수 있다.

매트릭스 원료의 선택은 생체적합성, 생체분해성, 기계적 성질들, 미용적 외관 그리고 인터페이스 성질들에 근거한다. 해당 조성물들의 특정 용도는 적절한 조제물의 범위를 한정할 것이다. 조성물용 잠재적 매트릭스는 생분해가능할 수 있고, 황산칼슘, 트리칼슘포스페이트, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드리드로 화학적으로 정의될 수 있다. 기타 잠재적 원료들은 생분해가능하며, 뼈 또는 피부 콜라겐과 같은 생물학적으로 잘 정의된다. 추가 매트릭스는 순수 단백질들 또는 세포외 매트릭스 성분들을 포함한다. 기타 잠재적 매트릭스는 생분해불가능하며, 그리고 소결 하이드록시아파타이트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같이 화학적으로 정의된다. 매트릭스는 상기 언급된 유형의 임의의 원료의 조합가령, 폴리락트산과 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 트리칼슘포스페이트의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물들내에서 변경될 수 있고, 포어 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생체분해성을 변경시키기 위하여 프로세싱될 수 있다.

특정 구체예들에서, 융합 단백질들은 경구 투여용으로 조제될 수 있는데, 가령, 캡슐, 카세(cachets), 알약, 테블릿, 로젠지(풍미 베이스 보통 슈크로즈 및 아카시아 또는 트라가탄을 이용), 분말, 과립의 형태로, 또는 용액 또는 수성 또는 비-수성 액체내 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 유상액, 또는 엘륵시르 또는 시럽, 또는 향정(젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스와 아카시아와 같은 비활성 베이스를 이용) 및/또는 구강 세척액 및 이와 유사한 형태가 될 수 있고, 이들 각각은 활성 성분으로 예정된 양의 약제를 함유한다. 약제는 또한 환약(bolus), 지약(electuary) 또는 페스트로 투여될 수 있다.

경구 투여용 고형 투약형 (가령, 캡슐, 태블릿, 알약, 당과, 그리고 분말 과립), 본 발명의 하나 이상의 융합 단백질들은 구연산 나트륨 또는 인산이칼슘과 같은 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 운반체, 및/또는 다음중 하나와 혼합될 수 있다: (1) 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨, 및/또는 규산과 같은 충진제 또는 확장제; (2) 결합제 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오즈, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돌, 슈크로즈, 및/또는 아카시아; (3) 습윤제, 가령, 글리세롤; (4) 분해제 약제, 가령, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴간, 특정 규산염 그리고 탄산나트륨; (5) 파라핀과 같은 용액 지연제; (6) 흡수 가속화제, 가령 4차 암모늄 화합물들; (7) 가습 약제, 예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 가령 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 가령, 활석, 스테아레이트 칼슘, 스테아레이트 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 설페이트 나트륨, 그리고 이의 혼합물; 그리고 (10) 발색제. 캡슐, 태블릿 그리고 알약의 경우, 약학 조성물들은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사 유형의 고형 조성물들은 락토즈 또는 밀크 슈가와 같은 부형제, 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐내 충전제로 또한 이용될 수 있다.

경구 투여용 액체 투약형은 약제학적으로 수용가능한 유제, 마이크로유제, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘륵시르를 포함한다. 활성 성분에 추가하여, 액체 투약형은 물, 기타 용매, 가용화제와 같은 당업계에 흔히 이용되는 비활성 희석제, 그리고 유화제 가령, 에틸 알코올, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 씨, 올리브, 피마자유 그리고 참깨오일), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 그리고 소르비탄 지방산 에스테르 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 조성물들은 가습제, 유화제, 현탁제, 감미제, 풍미제, 발색제, 향료 및 보존제와 같은 부형제를 또한 포함할 수 있다.

융합 단백질들에 추가하여 현탁액은 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 소르비탄 에스테르, 미소결정 셀룰로오즈, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가탄 그리고 이의 혼합물과 같은 현탁제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물들은 보존제, 가습제, 유화제 및 분산제와 같은 부형제를 또한 포함할 수 있다. 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라젠, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 및 이와 유사한 것을 포함시키면 미생물 작용을 억제시킬 수 있다. 슈가, 염화나트륨 및 이와 유사한 것과 같은 등장성 물질을 조성물에 포함시키는 것 또한 바람직할 수 있다. 더구나, 주사가능한 약형의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약제의 주입에 의해 야기될 수 있다.

구체예

현재 본 발명은 전반적으로 설명되었지만, 다음의 실시예들을 참고하여 더 용이하게 본 발명을 이해할 수 있을 것이며, 실시예들은 본 발명의 특정 구체예들 및 구체예를 단순히 설명하기 위한 목적으로 포함되었으며, 그리고 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 아니다.

실시예 1: 당변이체 TNFR2 - Fc 융합 단백질들의 발현.

출원인들은 다양한 TNFR2-Fc 융합 단백질들의 발현을 위한 벡터를 작제하였는데, 이들 각각은 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위를 포함한다. 기준 TNFR2-Fc 융합 단백질 (즉, TNFR2-Fc의 기본적인 또는 최초의 변경안된 형태)은 중간 링커없이 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된 인간 TNFR2의 세포외 도메인을 보유한다. 최초 TNFR2-Fc 융합 단백질의 서열은 도 1 (서열 번호:5)에 나타내고, 그리고 인코딩 핵산 (리더 서열을 포함)은 도 5 (서열 번호:8)에 나타낸다. 도 1에 나타낸 융합 단백질은 더욱 충분히 TNFR2-h(1)Fc로 지정된다. TNFR2-h(2)Fc로 지정된 변이체는 도 9 (서열 번호:16)에 나타낸 대체 링커/경계 서열을 보유하며 그리고 도 10 (서열 번호: 17)에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된다. 단백질 구조체들은 포유류 세포 (Pearsall et al . PNAS 105(2008): 7082-7087)내에서 발현을 위하여 pAID4 벡터내로 클론시켰다.

최초 실험을 위하여, TNFR2-Fc의 당변이체들은 HEK293 세포내에서 일시적으로 발현되었다. 간단하게, 500ml 스피너내에서, 250 용적으로 Freestyle (Invitrogen) 배지내에서 6X10⁵ 세포/㎖로 HEK293T 세포를 준비하였고, 하룻밤동안 성장시켰다. 다음날, 이들 세포들을 0.5㎍/㎖ 최종 DNA 농도에서 DNA:PEI (1:1) 복합체로 처리하였다. 4시간 후, 250㎖ 배지를 추가하였고, 세포들을 7일간 성장시켰다. 세포를 스핀다운시켜 조건화 배지를 수거하였고, 농축시켰다.

변이체들은 예를 들면, 단백질 A 컬럼(Mab SelectTM, GE Healthcare LifeSciences, USA)을 포함하는 다양한 기술들을 이용하여 정제하였고, 낮은 pH (3.0) 글리신 완충액으로 용리시켰고, 크기 압출 크로마토그래피를 실시하였다. 단백질들은 인산염 완충 염 또는 트리스 완충된 염을 통하여 투석시켰다.

도 5에서 제공하는 단백질 서열들은 LPA의 N-말단 서열을 나타내며, 각 단백질의 상당 부분은 N-말단 류신이 제거되어 PAQ의 N-말단 서열이 생성된다는 것을 보여주었다. 따라서 여기에서 설명된 TNFR2-Fc 분자들은 N-말단으로부터 제거된 하나 이상의 아미노산들을 보유할 수 있다.

3가지 상이한 리더 서열의 사용을 고려하였다:

(i) 꿀벌 멜리틴(HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호: 10),

(ii) 조직 플라스미노겐 활성물질(TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호: 11), 그리고

(iii) 고유 TNFR: MAPVAVWAALAVGLELWAAAHA (서열 번호: 15).

추가 정제는 예를 들면, 다음중 3개 또는 그 이상을 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피를 임의의 순서로 실행하여 얻을 수 있다: Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 것이다.

실시예 2: 당변이체 TNFR2 - Fc 융합 단백질들의 기획

추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들을 도입시키는 위치는 TNFR2의 세포외 도메인과 이의 리간드 TNF의 공동-결정 구조(공개적으로 이용할 수 있는 결정 좌표)의 정밀검사, 및 여기에서 설명된 원리들의 적용에 의해 선택되었다. 연장된 반감기를 부여하면서 이 단백질의 TNF 길항 활성을 보존하기 위하여 예측된 위치에서 변화가 선택되었고, 그리고 도 7에 나타낸다. 아미노산들의 넘버링은 도 7에 나타낸 것과 같이 고유의 프로세스안된 TNFR2 아미노산 서열에 기초한다. 변경된 TNFR2-Fc 융합 단백질들은 다음 위치 47, 48, 62, 114, 155, 202, 203, 222 및 253중 하나의 위치에서 추가적인 N-링크된 슈가 모이어티를 보유하도록 기획되었다. 고유 TNFR2-Fc는 위치 171 그리고 193에서 N-링크된 슈가 모이어티들을 보유하며, 이는 최초 TNFR2-Fc 융합 단백질의 이종(heterolgous) 도메인은 1:117.5 비율의 N-링크된 슈가 모이어티들과 아미노산들을 보유한다는 것을 의미한다. 추가적인 슈가 모이어티들의 예상된 위치는 TNFR2-TNF 공동-결정 구조 상에 나타내고 그리고 이들은 도 6에서 볼 수 있다. 도 8은 서열 비교와 관련된 단백질들과의 구조적 유사성으로 추론하였을 때 TNFR2 세포외 도메인내 베타 가닥 2차 구조의 예상 위치를 나타낸다. 새로운 각 N-링크된 부위들은 구조적 요소들의 내부에 위치하였다. 예를 들면, 위치 47과 48에 도입된 부위들은 제 1 베타-쉬트 구조적 요소에 대해 내부에 있다. 하나의 추가 N-링크된 글리코실화 부위들을 가진 단백질을 만들고 그리고 테스트한 후, 복합 돌연변이체들을 만들고 테스트하였다.

실시예 3: TNFR2 - Fc 당변이체 단백질들의 테스트

변경된 분자들의 기능과 분자들의 약물 동력학 성질상에 이러한 변경의 효과를 평가하기 위하여 일련의 분석으로 TNFR2-h(1)Fc의 당변이체들을 테스트하였다.

세포-없는 생화학적 분석에서 리간드 결합을 평가하기 위하여, Biacore? 3000 바이오센스 기구를 이용하였다. 간략하게 설명하면, TNFR2-h(1)Fc 변이체들을 유동 쎌(flow cell)내에 적하시키고, 그 다음 TNF에 노출시켰다. 역학 변수들(k_a 및 k_d)을 평가함으로써, 해리 상수(K_D)들을 계산하였다.

리간드 억제를 평가하기 위하여, 기본적으로 Khabar et al . Immunol . Lett . 46 (1995): 107-110에서 설명한 것과 같이 TNF 신호생성을 위한 세포계 분석을 이용하였다. 요약하면, WEHI 세포들(ATCC)은 TNF-알파 (R&D Systems, Minneapolis, Minn.)와 악티노마이신 D 존재하에 배양하였다. TNF-알파는 이들 세포내에서 아팝토시스를 여기하고, A_490nm에서 용해율을 탐지하였다. TNF-알파 길항제의 존재는 IC₅₀의 탐지를 허용하는 신호의 감소를 야기시킨다.

표준 기술을 이용하여 분자 연구의 약물동력학 성질 평가를 Sprague-Dawley 쥐에서 실행하였다. 요약하면, 순화(acclimation) 기간 후, 동물들에게 TNFR2-h(1)Fc 분자를 투여하고, 최초 투여후 6시간, 10시간, 24시간 32시간, 48시간, 72시간, 96시간, 144시간, 216시간 그리고 312시간 시점에 꼬리-칼자국을 통하여 뼈를 뽑았다. 인간 Fc 부분용 ELISA로 TNFR2-Fc 분자들의 존재를 탐지하였다.

실험간의 가변성을 최소화시키기 위하여 고유 TNFR2-h(1)Fc 분자로부터 수득한 데이터에 대하여 이들 데이터를 표준화시켰다. 표준화된 값은 하기에 나타낸다. 바람직한 성질을 나타내는 단백질들은 음영과 밑줄로 표시한다.

*D47N 단백질은 생체내 테스트를 허용할 정도의 충분한 양으로 발현되지 않았다.

**위치 62 또는 114에 N-링크된 슈가를 둔 돌연변이들은 리간드 결합의 완전한 파괴를 야기시켰고, 그리고 기타 성질들은 평가되지 않았다.

상기에서 제공된 데이터는 단일 추가적인 N-링크된 부위를 함유하는 변이체중 거의 절반 (9개중 4개)이 야생형 분자의 것과 유사하게 리간드 결합 및 길항성은 유지하면서 실질적으로 혈청 반감기가 개선되었는 것을 나타낸다. 혈청 반감기에서 생물 상대생장의 스케일링(allometric scaling) 효과 때문에, 쥐의 20-30%에서 혈청 반감기의 변화가 인간 환자를 위한 투약 섭생에 의미있는 개선을 제공할 수 있다. 흥미로운 것은, 복합 돌연변이들은 일반적으로 혈청 반감기 또는 단백질 활성을 감소시키는 것으로 보고, 이 분자내에서 글리코실화 밀도의 추가 증가가 더 이상 도움이 되지 않았다는 것을 말한다.

이들 데이터들은 여기에서 설명된 기술들을 이용하여 당업자가 연장된 혈청 반감기를 가진 Fc-융합 단백질들을 효과적으로 만들 수 있다는 것을 설명한다.

실시예 4: 약물동력학적 쥐 분석( Pharmacokinetic rat assay )

당변이체 분자들의 약물동력학 성질들은 표준 기술들을 이용하여 Sprague-Dawley 쥐에서 결정할 수 있을 것이다. 요약하면, 순화 기간 후, 8마리 동물들의 피하(SC)로 당변이체 분자를 투여하고, 최초 투여후 6시간, 10시간, 24시간, 32시간, 48시간, 72시간, 96시간, 144시간, 216시간 및 312시간 시점에 꼬리-자국을 내어 피를 뽑는다. 표적 단백질에 적합한 임의의 방법을 이용하여 당변이체 분자들의 존재를 탐지할 수 있다. 예를 들면, 당변이체 Fc 융합 단백질은 인간 Fc 부분에 대한 ELISA를 이용하여 탐지할 수 있다. 각 개별 동물에서 혈청 제거 반감기 (T₁ _/2)를 계산한다. 당변이체 분자에 대한 평균 T₁ _/2및 표준 편차를 계산한다. 미리 측정하지 않았다면, 동일한 투여량으로 투여된 도입된 N-링크된 글리코실화 부위를 함유하지 않은 Fc-융합 단백질들과 같은 적절한 기준 분자에 대한 평균 T₁ _/2및 표준 편차를 계산하기 위하여 유사한 연구를 실행할 수 있다. Students t-test와 같은 적절한 통계 테스트를 이용하여 평균 T₁ _/2를 분석한다. 당변이체 분자의 평균 T₁ _/2를 적절한 기준 분자의 평균 T₁ _/2및 표준 편차와 비교할 수 있다.

쥐에서 TNFR2-h(1)Fc, Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc, 및Q48N/A50S TNFR2-h(2)Fc의 약물동력학 성질을 비교하기 위하여 전술한 방법들에 따라 연구를 실행하였다. 이 연구는 5 mg/kg의 단일 투여량을 피하 투여후 최대 28일 까지 단백질 농도를 측정하였다(n= 구조체당 3 마리 쥐).

TNFR2-h(1)Fc와 비교하였을 때, 당변이체 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc 및 Q48N/A50S TNFR2-h(2)Fc의 혈청 반감기는 각각 50% 및 80% 더 길어졌다는 것을 알았다. 눈에 띄는 것은, Q48N/A50S TNFR2-h(2)Fc의 최대 혈청 농도(Cmax)는 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc의 것보다 거의 5배 더 높았다(20.8 g/ml versus 4.4 g/ml, p < 0.05). 이들 결과는 TNFR2-Fc 당변이체의 링커/경계 영역 (서열 번호: 16와 서열 번호: 5의 비교)의 변경은 변이체(이 실시예에서는 Q48N/A50S TNFR2-h(2)Fc)에 개선된 약물동력학 성질들을 부여한다는 것이 설명된다. 따라서, 서열 번호:18로 제공된 링커-hFc 서열은 여기에서 설명된 임의의 당변이체와 복합하여 특히 유용할 것이다.

실시예 5: 약물동력학 원숭이 분석

게잡이(cynomolgus) 원숭이 모델에서 표준 기술들을 이용하여 당변이체 분자들의 약물동력학 성질들 실행하였다. 요약하면, 각 4마리 수컷과 암컷 게잡이 원숭이들이 선택된다. 이 동물들은 과정 시작 시에 실험적으로 순수하였으며, 대략 2 내지 6살이며, 체중은 최소한 2.5 kg이다. 동물에게는 표준 식이가 제공되며, 치료를 통하여 표준 일정에 따라 수용된다. 동물에게는 피하(SC) 또는 정맥 (IV) 투여를 통하여 당변이체 분자가 투여된다. 투여후 다음의 시간대에서 22일에 걸쳐 대퇴 정맥 천자를 통하여 채혈 시료를 수거한다: 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 34 시간, 48 시간, 58 시간, 72 시간, 120 시간, 168 시간, 240 시간, 336 시간, 408 시간, 그리고 504 시간. 투여전 채혈 시료도 수거한다. 채혈 후, 시료는 얼음에 보관하고, 원심분리에 의해 혈청을 분리한다. 혈청 시료내 당변이체 분자들의 존재는 표적 단백질에 적합한 임의의 방법을 이용하여 탐지할 수 있다. 예를 들면, 당변이체 Fc 융합 단백질은 인간 Fc 부분에 대한 ELISA를 이용하여 탐지할 수 있다. 각 개별 동물에서 혈청 제거 반감기 (T₁ _/2)를 계산한다. 당변이체 분자에 대한 평균 T₁ _/2및 표준 편차를 계산한다. 미리 측정하지 않았다면, 동일한 투여량으로 투여된 도입된 N-링크된 글리코실화 부위를 함유하지 않은 Fc-융합 단백질들과 같은 적절한 기준 분자에 대한 평균 T₁ _/2및 표준 편차를 계산하기 위하여 유사한 연구를 실행할 수 있다. Students t-test와 같은 적절한 통계 테스트를 이용하여 평균 T₁ _/2를 분석한다. 당변이체 분자의 평균 T₁ _/2를 적절한 기준 분자의 평균 T₁ _/2및 표준 편차와 비교할 수 있다.

실시예 6: 콜라겐- 유도화된 -관절염 쥐 모델에서 Q48N /A50S TNFR2 -h(1)Fc의 효과

콜라겐-유도화된 관절염 쥐 모델에서 당변이체 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc의 효과를 평가하였다. 소의 콜라겐 유형 II (Elastin Products, catalog no. CN276)는0.01 M 아세트산과 Freund 불완전 어쥬번트(Difco, catalog no. 263910)에 용해시켜 1 mg/ml의 농도로 만들고, 연구 0일 및 7일 시점에 암컷 Lewis 쥐(150-200 g)의 꼬리 기부에서 피내 주사(2 mg/kg)를 통하여 투여하였다. 6일 시점에 시작하여, Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc, 3 mg/kg, TNFR2-h(1)Fc, 3 mg/kg, 또는 비이클로 주당 3회 쥐의 피하로 반복 투여하였다. 연구를 통하여 기준 및 다양한 시간대에서 체적변동유량측정법(plethysmometry)으로 발의 체적을 측정하였고, 골의 질은 연구 종료시 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (micro-CT)(생체외)으로 평가하였다.

발 붓기는 콜라겐-유도화된 염증에 대한 표식으로 이용되었다. 예상한 것과 같이, 비이클-치료를 받은 발의 체적은 연구를 통하여 중간쯤 증가되고, 연구 종료까지 상승된 상태로 유지되었다. 양성 기준 TNFR2-h(1)Fc 으로 치료된 것에서와 같이 당변이체 Q48N/A50S TNFR2-h(1)F로 치료를 받음 쥐에서 발 붓기가 효과적으로 억제되었다(도 11). 더욱이, micro-CT로 평가하였을 때 뼈의 질은 비이클-처리된 기준과 비교하여 이들 두 가지 처리 군들에서 유사하게 개선되었고(도 12), 항-염증 효과의 추가 증거를 제공한다. 당변이체 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc가 치환안된 대응부, TNFR2-h(1)Fc에 대하여 등가의 생체내 항-염증 효과를 보유한다는 것을 이들 데이터는 설명한다.

이들과 함께, 전술한 결과에서 TNFR2-h(1)Fc의 특정 당변이체, 예를 들면 Q48N/A50S TNFR2-h(1)Fc는 TNFR2-h(1)Fc 자체와 비교하였을 때 증가된 혈청 반감기를 보유하고, 감소안된 항-염증 효과를 보유한다는 것을 나타낸다.

참고자료에 통합

여기에서 설명된 모든 공보 및 특허들은 각각 배결 공보 또는 특허가 특이적으로 그리고 개별적으로 참고자료에 통합된 것과 같이 이들의 전문이 참고자료에 통합된다.

주제의 특정 구체예들이 논의되었지만 상이 설명은 설명을 위한 것이며 이에 제한하는 것이 아니다. 명세서 및 하기 청구 범위의 검토에 의해 당업자는 많은 변수가 있음을 명백하게 인지할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 청구범위와 이의 등가의 범주, 그리고 명세서 및 이의 변이에 의해 결정되어야만 한다.

SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. SEEHRA, JASBIR KNOPF, JOHN KUMAR, RAVINDRA <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING SERUM HALF-LIFE <130> PHPH-026-WO1 <140> PCT/US2010/058765 <141> 2010-12-02 <150> 61/327,582 <151> 2010-04-23 <150> 61/266,095 <151> 2009-12-02 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 489 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro 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ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660 tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720 ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cgagcccaaa 780 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 840 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 900 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 960 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1020 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1080 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1140 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1200 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1260 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1320 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1380 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1440 aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga 1470 <210> 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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 17 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60 cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc 120 cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc 180 caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240 agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300 agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360 aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420 cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480 tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540 ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc 600 acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660 tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720 ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga caccggtggt 780 ggaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 840 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 900 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 960 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1020 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1080 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1140 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1200 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1260 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1320 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1380 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1440 tccctgtctc cgggtaaatg a 1461 <210> 18 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 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Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Glu or Asp <400> 20 Asn Ser Thr Xaa Ala 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Asn Ile Thr Gln Ser 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 22 Gln Ser Xaa Gln Ser 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid <400> 23 Glu Phe Ile Xaa Arg Xaa Lys Val 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys or Arg <400> 24 Gly Gly Ser Cys Xaa 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6x His tag <400> 25 His His His His His His 1 5 <210> 26 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 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Synthetic peptide <400> 31 Gly Gln Asn Ala Thr Val Phe 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Arg Glu Asn Asn Ser Ile Cys 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Cys Thr Asn Thr Ser Pro Thr Arg 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Cys Thr Ser Asn Ser Ser Thr Arg 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT 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Claims

최초 Fc 융합 단백질과 비교하여 연장된 혈청 반감기를 가지는 변경된 Fc-융합 단백질을 인코드하는 변경된 핵산을 준비하는 방법에 있어서, 여기서 변경된 그리고 최초 Fc 융합 단백질들은 각각 Fc 부분 및 이종 부분을 포함하며,
이 방법은 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들을 코드하는 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분을 인코드하는 핵산을 변경하는 것을 포함하고,
여기서 (a) 변경된 핵산은 변경된 Fc 융합 단백질을 인코드하여, 적합한 세포 배양물에서 발현되었을 때, 약물동력학 원숭이 분석에서 측정하였을 때, 최초 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기보다 최소한 10% 더 연장된 혈청 반감기를 보유하고; 그리고 (b) 변경된 Fc 융합 단백질은 변경안된 Fc 융합 단백질과 비교하였을 때 실질적으로 동일하거나 또는 더 큰 생체내 생물학적 활성을 보유하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 여기서 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 표면 노출된 이종 부분의 하나 이상의 아미노산 서열로 도입된, 방법.
청구항 2에 있어서, 여기서 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 표면 노출된 이종 부분의 하나 이상의 아미노산 서열로 도입되지만 β-쉬트 또는 α-헬릭스 안에 통합되지는 않는, 방법.
청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 이종 부분은 리간드 결합 도메인을 포함하는, 방법.
청구항 4에 있어서, 여기서 리간드 결합 도메인은 막통과 수용체의 세포외 도메인으로부터 유도화된, 방법.
청구항 4 또는 5에 있어서, 여기서 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 임의의 추가적인 슈가 모이어티들이 리간드 결합 도메인을 실질적으로 간섭하지 않는 이종 부분내 위치로 도입된, 방법.
청구항 4-6중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 리간드 결합 도메인의 아미노산 서열이 변경되지 않는 위치에 도입된, 방법.
청구항 4-7중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 하나 이상의 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들은 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위들에 부착된 임의의 슈가 모이어티들이 리간드 결합 인터페이스를 실질적으로 간섭하지 않는 것으로 예상된 위치에 도입된, 방법.
청구항 4-8중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 Fc 융합 단백질은 최초 Fc 융합 단백질 보다 적은 단지 2배의 최대 저해 절반 농도(IC₅₀)로 가진 리간드에 결합하는, 방법.
청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질은 최소한 하나의 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 최소한 하나의 아미노산 잔기의 추가 또는 결손에 의해 변경된, 방법.
청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질은 최소한 하나의 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 최소한 하나의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변경된, 방법.
청구항 1-11중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 표면 노출된 조직화되지 않은 폴리펩티드 영역에 의해 연결된 최소한 2가지 구조적으로 상이한 α-헬릭스 및/또는 β-쉬트 도메인들을 포함하는, 방법.
청구항 12에 있어서, 여기서 추가적인 N-링크된 글리코실화 부위는 조직화되지 않은 펩티드 영역 내에 위치하는, 방법.
청구항 1-13중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 90개 아미노산 마다 1개 미만의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 방법.
청구항 1-14중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 125개 아미노산 마다 1개 미만의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 방법.
청구항 1-15중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 90개 아미노산 마다 최소한 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 방법.
청구항 1-16중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 65개 아미노산 마다 최소한 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 방법.
청구항 1-17중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 N-링크된 글리코실화가 부착된 변경된 Fc 융합 단백질의 이종 부분 각 아미노산은 N-링크된 글리코실화에 의해 변경된 임의의 다른 아미노산으로부터 최소한 20개 아미노산에 의해 분리된, 방법.
청구항 1-18중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질은 Fc 부분과 N-링크된 글리코실화 부분을 포함하지 않는 이종 부분 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하는, 방법.
청구항 1-18중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 Fc 융합 단백질은 링커 내에 위치한 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 방법.
청구항 1-20중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 이종 부분은 리간드 결합 도메인을 포함하는 TNFR2 수용체의 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2와 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
최초 Fc 융합 단백질과 비교하여 연장된 혈청 반감기를 보유하는 변경된 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 이 방법은:
(a) 포유류 또는 포유류-유사 글리코실화를 제공하는 세포 배양물 내에서 청구항 1 내지 22중 임의의 한 항에 따른 방법에 따라 준비된 변경된 핵산을 발현시키고; 그리고
(b) 세포 배양물로부터 변경된 Fc 융합 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 23에 있어서, 변경된 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 24에 있어서, 여기서 변경된 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 변경된 Fc 융합 단백질을 단백질 A에 노출시키고, 그리고 단백질 A에 결합된 변경된 Fc 융합 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 23-25중 임의의 한 항에 있어서, 환자에게 투여하기 위하여 변경된 Fc 융합 단백질을 조제하는 것을 더 포함하는 방법.
청구항 23에 있어서, 여기서 변경된 핵산은 포유류 세포계에 의해 발현되는, 방법.
청구항 27에 있어서, 여기서 포유류 세포계는 CHO 세포계, NSO 세포계, COS 세포계 및 HEK236 세포계로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
청구항 23, 27 또는 28중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 핵산은 시알산을 포함하는 N-링크된 슈가 모이어티들을 만드는 세포계에서 발현되는, 방법.
청구항 23 또는 29에 있어서, 여기서 변경된 핵산은 포유류 또는 포유류-유사 글리코실화를 제공하도록 조작된 비-포유류 세포에 의해 발현되는, 방법.
청구항 30에 있어서, 여기서 세포계는 곰팡이 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포로부터 유도되는, 방법.
청구항 1-22중 임의의 한 항에 따른 방법에 따라 준비된 변경된 핵산을 포함하는 세포계.
청구항 23-32중 임의의 한 항에 따른 방법에 따라 준비된 변경된 Fc 융합 단백질.
면역글로블린 Fc 도메인과 최소한 하나의 이종 폴리펩티드 도메인을 포함하는 융합 단백질에 있어서, 여기서 융합 단백질은 최소한 하나의 비-내생성 N-링크된 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 면역글로블린 Fc 도메인의 외부에서 변경되고, 그리고 여기서 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위들에서 글리코실화는 약물동력학 원숭이 분석으로 측정하였을 때, 도입된 글리코실화 부위가 부족한 융합 단백질의 혈청 반감기과 비교하여 변경된 융합 단백질의 혈청 반감기를 최소한 10% 증가시키는, 융합 단백질.
청구항 34에 있어서, 여기서 이종 폴리펩티드 도메인은 리간드 결합 도메인을 포함하는 수용체의 세포외 도메인의 최소 일부를 포함하는, 융합 단백질.
청구항 35에 있어서, 여기서 글리코실화 부위는 리간드 결합 포켓 외부의 세포외 도메인에 도입된, 융합 단백질.
청구항 35 또는 36에 있어서, 여기서 하나 이상의 도입된 글리코실화 부위들에서 글리코실화는 수용체의 리간드 결합 활성을 3배 이상 영향을 주지 않는, 융합 단백질.
청구항 34-37중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 융합 단백질은 최소한 하나의 글리코실화 부위를 도입하기 위하여 최소한 하나의 아미노산 잔기의 추가 또는 결손에 의해 변경된, 융합 단백질.
청구항 34-38중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 융합 단백질은 최소한 하나의 글리코실화 부위를 도입시키기 위하여 최소한 하나의 아미노산 잔기의 치환에 의해 변경된, 융합 단백질.
청구항 34-39중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 이종 폴리펩티드 도메인의 분자량은 최소한 25 kDa인, 융합 단백질.
청구항 34-40중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 도입된 글리코실화 부위들중 하나 이상에서 글리코실화는 도입된 글리코실화 부위가 부족한 융합 단백질의 혈청 반감기와 비교하여 융합 단백질의 혈청 반감기를 최소 20% 증가시키는, 융합 단백질.
청구항 34-41중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경안된 이종 폴리펩티드 도메인은 90개 아미노산들 마다 1개 미만의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 융합 단백질.
청구항 34-41중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경안된 이종 폴리펩티드 도메인은 125개 아미노산들 마다 1개 미만의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 융합 단백질.
청구항 34-41중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 이종 폴리펩티드는 90개 아미노산들 마다 최소한 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 융합 단백질.
청구항 34-41중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 변경된 이종 폴리펩티드는 65개 아미노산들 마다 최소한 하나의 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는, 융합 단백질.
청구항 34-45중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 N-링크된 글리코실화에 의해 변경된 각 아미노산은 N-링크된 글리코실화에 의해 변경된 임의의 기타 아미노산으로부터 최소한 20개 아미노산에 의해 분리된, 융합 단백질.
청구항 34-46중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 융합 단백질은 Fc 도메인과 이종 폴리펩티드 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함하는, 융합 단백질.
청구항 47에 있어서, 여기서 최소한 하나의 도입된 글리코실화 부위들은 링커내에 위치하는, 융합 단백질.
청구항 34-48중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 최초 Fc 융합 단백질의 이종 부분은 표면 노출된 조직화되지 않은 폴리펩티드 영역에 의해 연결된 최소한 2가지 구조적으로 상이한 α-헬릭스 및/또는 β-쉬트 도메인들을 포함하는, 융합 단백질.
청구항 49에 있어서, 여기서 도입된 글리코실화 부위는 조직화되지 않은 펩티드 영역내에 위치한, 융합 단백질.
청구항 35-50중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 수용체는 신경 성장 인자/종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 구성요소인, 융합 단백질.
청구항 51에 있어서, 여기서 수용체는 TNFR2 수용체인, 융합 단백질.
청구항 52에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 Q26, D25, A28, E133, 또는 G231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 아미노산 치환을 포함하는, 융합 단백질.
청구항 53에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 26에서 Q가 N으로 치환, 그리고 서열 번호: 2의 아미노산 28에서 A가 S로의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
청구항 53에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 25에서 D가 N으로 치환, 그리고 서열 번호: 2의 아미노산 133에서 E가 N으로의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
청구항 53에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 25에서 D가 N으로 치환, 그리고 서열 번호: 2의 아미노산 231에서 G가 N으로의 치환을 포함하는, 융합 단백질.
청구항 53-56중 임의의 한 항에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 최소한 90% 동일한, 융합 단백질.
청구항 57에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 최소한 95% 동일한, 융합 단백질.
청구항 58에 있어서, 여기서 TNFR2 수용체의 세포외 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 최소한 99% 동일한, 융합 단백질.
청구항 53에 있어서, 여기서 융합 단백질은 다음으로부터 선택된 이종 도메인을 포함하는, 융합 단백질:
a) 서열 번호: 5의 아미노산들 13-257을 포함하는 폴리펩티드;
b) 서열 번호: 6의 아미노산들 13-257을 포함하는 폴리펩티드;
c) 서열 번호: 7의 아미노산들 13-257을 포함하는 폴리펩티드; 그리고
d) 서열 번호: 8의 아미노산들 13-257을 포함하는 폴리펩티드.
청구항 60에 있어서, 여기서 링커와 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 보유하는 Fc 부분을 포함하는, 융합 단백질.
청구항 34-61중 임의의 한 항에 따른 융합 단백질과 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 조제물에 있어서, 여기서 조제물은 포유류에 투여하기에 적합하도록 하기 위하여 실질적으로 발열성 원료들이 없는, 약학 조제물.