KR102489452B1 - Ngf 길항제 도메인 및 tnfa 길항제 도메인으로 구성된 키메라 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 통증을 제어하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 NGF 길항제와 TNFα 길항제를 공동-투여하는 것을 포함하는, 통증의 제어 방법을 제공한다. 이러한 NGF 길항제 및 TNFα 길항제는 별도의 분자일 수 있거나, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자의 일부일 수 있다. 본 개시내용은 또한, NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자를 제공한다. 상기 방법은 개선된 통증 제어를 제공한다. 본원에 제공된 바와 같은 NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 투여하면, 단독으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 유효하게 대상체에게서 통증을 제어할 수 있다.

Description

NGF 길항제 도메인 및 TNFA 길항제 도메인으로 구성된 키메라 단백질 {CHIMERIC PROTEIN COMPOSED OF NGF ANTAGONIST DOMAIN AND A TNFA ANTAGONIST DOMAIN}
관련 출원
본 출원은 2014년 2월 2일에 출원된 미국 가출원 번호 61/934,828을 우선권 주장한다. 상기 언급된 출원의 교시 모두가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2015년 1월 29일에 작성된, 상기 ASCII 카피는 110421-0054-WO1_SL.txt로 명명되고 그 크기가 134,721 바이트이다.
통증은 의료 지원을 요청하는 가장 흔한 증상 중 하나이고, 의사를 방문하는 모든 환자 중 절반의 주요 불만이다. 수많은 진통제가 존재하고 광범위하게 사용되고 있음에도 불구하고, 통증, 특히 만성 통증을 제거하는 것은 성공적이지 못하였다. 따라서, 사회에 대한 부담은 여전히 높다. 각종 연구 결과, 통증으로 인해, 매년 5천만 작업 일이 손실되고 612억 달러의 생산 비용이 손실된다. 만성 통증 환자의 경우에는, 처방된 이용 가능한 치료 옵션을 이용해서는 대략 절반만이 통증을 관리할 수 있다. 그리고, 총 처방 진통제 시장은 매년 대략 250억 달러이다. 이들 데이터에 의해 암시되는 바와 같이, 안전하고도 유효한 신규 진통제에 대한 필요성은 여전히 크다.
조직 수준을 감소시키거나 또는 분비된 신경 성장 인자 (NGF 또는 베타-NGF)의 효과를 억제시키는 치료제가 이러한 새로운 진통제가 될 가능성이 있다. NGF는 신경계의 발생에 있어서 널리 공지된 중추적 역할을 하지만, NGF는 또한, 통증에 대한 널리 검증된 표적인데, 이는 NGF가 동물과 인간에게서 통증을 유발시키기 때문이다. 성인에게서 NGF는 특히, 중추 및 말초 신경세포의 서브세트의 건강과 생존을 증진시킨다 (Huang & Reichardt, Ann. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001)). NGF는 또한, 이들 신경세포의 기능적 특징의 조정에 기여하고, 통각수용기(nociceptor)로 불리우는 감각 통증 수용체의 감수성 또는 흥분성 전반에 걸쳐 강직성 제어를 발휘한다 (Priestley et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 80:495-505 (2002); Bennett, Neuroscientist 7:13-17 (2001)). 통각수용기는 통증의 지각 (통각)을 유발시킬 있는 각종 유해 자극을 감지하고, 이를 중추 신경계에 전달한다. NGF 수용체는 통각수용기 상에 위치한다. NGF의 발현은 손상되고 염증이 생긴 조직에서 증가되고, 인간 통증 상태에서 상향 조절된다. 따라서, 통각에 있어서의 NGF의 역할 때문에, NGF의 수준을 감소시키는 NGF-결합성 작용제가 진통 치료제로서의 유용성을 지니고 있다.
NGF 그 자체를 피하 주사하는 것이 인간과 동물에게서 통증을 야기시킨다. 주사된 NGF는 신속한 열 통각과민증을 유발시킨 다음, 지연형 열 통각과민증과 기계적 이질통증을 유발시킨다 (Petty et al., Ann. Neurol. 36:244-46 (1994); McArthur et al., Neurology 54:1080-88 (2000)). 내생적으로 분비된 NGF는 유사하게 통각 유발성이다. NGF의 조직-손상-유도된 방출 및 그의 말초에서의 후속 작용은 "말초 감작"의 과정을 통하여 열 통각과민증을 유도하는 데 있어서 중요한 역할을 한다 (Mendell & Arvanian, Brain Res. Rev. 40:230-39 (2002)). 조직 손상은 통각 유발성 및 염증 유발성 시토카인의 방출을 증진시켜, 결국에는 각질세포 및 섬유모세포로부터의 NGF의 방출을 유도시킨다. 이와 같이 방출된 NGF는 통각수용기 상에 직접적으로 작용하여, 유해한 발작이 일어난 지 수분 이내에 고통스럽거나 통각수용성 상태를 유도한다. 따라서, NGF는 또한, 피드-포워드(feed-forward) 방출에서 통각수용성/통증 상태를 유도시키고 이를 유지하기 위해 간접적으로 작용한다. 이는 비만 세포 탈과립화를 촉발시켜, 통각 유발성 작용제, 예컨대 히스타민 및 세로토닌, 및 중요하게 더 많은 NGF를 방출시키고, 또한 교감 신경 말단을 자극하여 통각 유발성 신경전달 물질, 예컨대 노르아드레날린을 방출시킬 수 있다 (Ma & Woolf, Neuroreport. 8:807-10 (1997)).
NGF의 조직 수준은 완전 프로인트 아주반트 (CFA)-주사된 동물과 카라기난-주사된 동물에서 상승된다 (Ma & Woolf, Neuroreport. 8:807-10 (1997); Amann & Schuligoi, Neurosci. Lett. 278:173-78 (2000)). NGF는 래트에게서 DRG (배근 신경절) 캅사이신 반응을 증강시킨다. 증가된 수준의 NGF가, 류마티스성 관절염 (문헌 [Aloe & Tuveri, Clin. Exp. Rheumatol. 15:433-38 (1997)]) 또는 방광염 (문헌 [Lowe et al., Br. J. Urol. 79:572-77 (1997)])으로 인해 고통받고 있는 환자에게서 확인되었다. 설치류에서는, 말초 신경 손상이 대식세포, 섬유모세포 및 슈반(Schwann) 세포에서의 NGF mRNA의 발현을 증가시킨다 (Heumann et al., J. Cell Biol. 104:1623-31 (1987)). NGF가 트랜스제닉 마우스에서 과발현되면, 야생형 마우스와 비교해서 신경 손상 후의 신경병성 통증 거동이 증강된다 (Ramer et al., Pain, Supp. 6:S111-20 (1998)). 수시간 및 15일에 걸쳐, 상승된 NGF 수준은 척수의 통각수용 경로에 있어서 시냅스에서의 신경전달의 증강인 "중추 감작"을 증진시키는 데 특정 역할을 한다. 중추 감작으로 인해, 지속적이면서 만성적인 통각과민증 및 이질통증이 초래된다. 이러한 과정은 NGF와 그의 고 친화성 수용체인 티로신 수용체 키나제 A (trkA)의 복합체의 내재화를 포함하는 것으로 생각된다. 이들 복합체를 DRG 내의 통각수용기 세포체로 역행 수송하는 것이 통각수용성 뉴로펩티드, 예를 들어 물질 P 또는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP)의 분비, 단백질 키나제 C (PKC) 활성화, 및 척수의 배면각(dorsal horn)에서의 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 활성화를 증강시킨다 (Sah et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2:460-72 (2003)) (모든 과정은 통각수용성 경로의 감작을 증진시킨다). NGF는 또한, 전압-의존성 및 리간드-작동 이온 채널 (나트륨 채널 아형 포함) 및 캅사이신 수용체인 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널 서브패밀리 V 구성원 1 (TRPV1)의 상향 조절 및 재분포에 있어 일정 역할을 한다 (Mamet et al., J. Biol. Chem. 278:48907-13 (1999); Fjell et al., J. Neurosci. Res. 57:39-47 (1999); Priestley et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 80:495-505 (2002)). 전달물질, 수용체 및 이온 채널의 변경된 활성 및/또는 발현은 신경병성 통증 상태와 연관된 통각수용기의 증가된 감수성과 흥분성의 기초를 이룬다.
NGF-유도된 통각/통증은 고 친화성 NGF 수용체인 trkA (티로신 수용체 키나제 A)에 의해 매개된다 (Sah, et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2:460-72 (2003)). DRG 내의 통각수용기 세포체의 약 40 내지 45%가 trkA를 발현한다. 이들은 직경이 작은 섬유, 또는 C-섬유의 세포체인데, 이는 또한, 분비된 통각 유발성 펩티드, 물질 P 및 CGRP를 발현한다. 이들 섬유는 배면각의 층 I 및 II에서 종결되는데, 이들은 말초 통각수용기에 의해 감지된 유해 자극을 중추 신경계로 전달한다. trkA 유전자 내에서의 돌연변이 또는 결실로 인해, 인간 (문헌 [Indo, Clin. Auton. Res. 12 (Supp 1):I20-I32 (2002)])과 trkA 녹아웃(knock-out) 마우스 (문헌 [de Castro et al., Eur. J. Neurosci. 10:146-52 (1998)]) 둘 다에서 통증 감각 기능 상실을 특징으로 하는 표현형이 생성된다. 중요하게도, trkA의 발현은 관절염 통증 (문헌 [Pozza et al., J. Rheumatol. 27:1121-27 (2000)]) 또는 방낭염 통증 (문헌 [Qiao & Vizzard, J. Comp. Neurol. 454:200-11 (2002)]), 또는 CFA 또는 카라기난을 발에 주사함으로써 유도된 염증성 통증 (문헌 [Cho et al., Brain Res. 716:197-201 (1996)])의 모델에 따라서 동물에게서 상향 조절된다.
NGF는 또한, p75 뉴로트로핀 수용체 (p75NTR)와 결합한다. p75NTR의 역할은 그의 세포성 환경과, 보조 또는 공동-수용체 기능을 하는 것으로 여겨지는 다른 수용체의 존재에 의존적이다. trkA와 p75NTR 간의 상호 작용으로 인해, NGF에 대한 고 친화성 결합 부위가 형성된다. NGF-매개된 통증 시그널링에 있어서 이러한 수용체 상호 작용의 중요성은 명확하지 않지만, 최근의 연구 결과는 p75NTR이 관련될 수 있는 세포성 과정에 연루되었다는 것을 나타낸다 (Zhang & Nicol, Neurosci. Lett. 366:187-92 (2004)). 그러나, p75NTR 녹아웃 마우스가 유해 자극에 대한 상승된 한계치를 표시하기 하지만, 이들은 여전히 NGF의 통각과민 효과에 대해 반응성인데, 이는 trkA 수용체 단독으로도 이들 효과를 매개하는 데 충분하다는 사실을 제안한다 (Bergmann et al., Neurosci. Lett. 255:87-90 (1998)).
NGF 봉쇄는 만성 통각수용성 통증, 예를 들어, 골관절염 (OA) 및 만성 하부 요통에서 NSAID에 비해 큰 변화 효능을 가져다 준다. NGF를 표적으로 하는 수많은 치료 항체 후보가 각종의 전임상 및 임상 개발 단계에 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, IgG2 포맷의 인간화 항체인 타네주맙(Tanezumab) [PF-4383119; 화이자(Pfizer)]; IgG4 포맷의 인간 항체인 SAR164877/REGN475 [사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)/레제네론 파마슈티칼즈(Regeneron Pharmaceuticals)]; IgG2 포맷의 인간 항체인 AMG 403 [암젠(Amgen)/존슨 앤 존슨(Johnson & Johnson)]; IgG4 포맷의 인간화 항체인 PG110 [팬제네틱스(PanGenetics)/애보트(Abbott)]을 포함한다. 또 다른 치료 항체 후보가 WO 2006/077441에 개시되어 있는데, 이 출원은 NGF 항체; 및 개시된 항체를 이용하여, NGF가 일정 역할을 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. MEDI-578은 IgG4 포맷의 인간 항체이다. 이들 후보의 개발에도 불구하고, 강력한 효능과 개선된 안전성 프로파일을 갖는 NGF-결합성 작용제를 통하여 보다 광범위한 통증 병태에 대한 진통성 완화를 제공할 필요가 있다.
카켁틴(cachectin)으로 불리우기도 하는 종양 괴사 인자-알파 (TNFα)는 세포독성, 면역 세포 증식, 염증, 종양형성 및 바이러스 복제를 포함한 광범위한 생물학적 활성을 지닌 다면발현성(pleiotropic) 시토카인이다 (Kim et al., J. Mol. Biol. 374, 1374 (2007)). TNFα는 막투과 단백질 (tm TNFα)로서 처음 생성되는데, 이어서 이는 메탈로프로테이나제에 의해 절단되어 가용성 형태 (sTNFα)로 된다 (Wallis, Lancet Infect. Dis. 8(10): 601 (2008)). TNFα (약 17 kDa)는 단단한 동종삼량체성 분자로서 존재하는데, 이는 세포-표면 TNF 수용체 1 또는 TNF 수용체 2와 결합하여, 수용체 올리고머화 및 신호 전달을 유도시킨다.
염증성 시토카인, 및 특히 TNFα가 통각과민증의 발생에 일정 역할을 하는 것으로 공지되어 있다 (Leung, L., and Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7:27 (2010)). 일부 예비 데이터는 TNFα 억제제가 신경병성 통증을 제어하는 데 유용할 수 있다고 제시하였다 (예를 들어, 문헌 [Sommer C, et al., J. Peripher . Nerv. Syst. 6:67-72 (2001)], [Cohen et al., A&A Feb 2013, 116, 2, 455-462], [Genevay et al., Ann Rheum Dis 2004, 63, 1120-1123] 참조). 신경병성 통증을 치료하는 데 있어서 단일 요법으로서의 TNFα 억제제를 시험하는 임상 연구로부터의 결과는 여전히 결정적이지 않다 (문헌 [Leung and Cahill (2010)] 참조).
통증을 치료하기 위한 NGF-표적화 후보 및 TNFα-표적화 후보의 개발에도 불구하고, 현재의 표준 치료보다 우수한 효능을 갖는 작용제를 통하여 각종 통증 병태에 대한 진통성 완화를 제공할 필요성은 여전히 있다. 본 개시내용은 통증 환자에 대한 투여량과 투여 횟수 둘 다를 감소시킬 수 있는 잠재력을 가지며 효능을 증가시킬 수 있는, NGF와 TNFα 둘 다를 표적으로 하는 조합 치료를 제공한다.
본 개시내용은 통증의 제어를 필요로 하는 대상체에게 신경 성장 인자 (NGF) 길항제 및 종양 괴사 인자-알파 (TNFα) 길항제, 또는 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 것인 결합성 분자의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에게서 통증을 제어하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 단독으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 효과적으로 상기 대상체에게서 통증을 제어한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 TNFα 길항제와 NGF 길항제를 공동-투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFα 길항제와 NGF 길항제는 순차적으로 또는 동시에 투여된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게서 통증을 예방, 저하, 완화 또는 제거하는 데 충분하다. 일부 실시양태에서, 통증은 급성 통증, 단기간의 통증, 지속적 또는 만성 통각수용성 통증, 또는 지속적 또는 만성 신경병성 통증이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게서 통증을 제어하는 데 있어서 단독으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 더 유효하다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자의 TNFα 길항제 부분은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합한다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자의 NGF 길항제 부분은 항-NGF 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 TrkA, p75NTR, 또는 TrkA와 p75NTR 둘 다에 대한 NGF 결합을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 항-NGF 항체는 p75NTR에 대한 NGF 결합에 비해 TrkA에 대한 NGF 결합을 우선적으로 차단한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 약 0.25 내지 0.44 nM의 친화도로 인간 NGF와 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 MEDI-578과 동일한 에피토프와 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 인간 NGF에 대한 MEDI-578의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 VH 도메인; 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하며, 여기서 상기 HCDR1은 서열식별번호: 4, 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열식별번호: 5, 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, HCDR3은 서열식별번호: 6, 2개 이하의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 6, SSRIYDFNSALISYYDMDV (서열식별번호: 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV (서열식별번호: 12)의 아미노산 서열을 갖고, LCDR1은 서열식별번호: 8, 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 가지며, LCDR2는 서열식별번호: 9, 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열식별번호: 10, 또는 2개 이하의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 완전한 H2L2 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편 또는 단일 쇄 Fv (scFv) 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 인간화, 키메라, 영장류화, 또는 완전한 인간이다. 일부 실시양태에서, NGF 길항제는 항-NGF scFv 단편이다. 일부 실시양태에서, 상기 scFv는 SS-안정화된다. 일부 실시양태에서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단에서부터 C-말단까지, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3 (서열식별번호: 15), 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단에서부터 C-말단까지, 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)4 (서열식별번호: 19), 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 측면에서, 상기 방법은 TNF 수용체 (TNFR)에 대한 TNFα의 결합을 억제함으로써, TNFα 활성을 차단시키는 TNFα 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 TNFα 길항제는 항-TNFα 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 VH 도메인; 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하며, 여기서 상기 CDR들은 인플릭시맙(infliximab)의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 또는 아달리무맙(adalimumab)의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3과 동일하다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 완전한 항-TNFα 항체; 및 이러한 항-TNFα 항체의 중쇄의 C-말단과 융합된 항-NGF scFv를 포함한다. 그러한 결합성 분자는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 TNFα 길항제는 TNFR의 가용성, TNFα-결합성 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFR은 TNFR-2 또는 그의 가용성 단편이다. 다른 실시양태에서, TNFR은 TNFR-1 또는 그의 가용성 단편이다. 일부 실시양태에서, TNFR-1의 가용성 단편은 55 kD 단편이다. 다른 실시양태에서, TNFR-2의 가용성 단편은 75 kD 단편이다. 일부 실시양태에서, TNFR 단편은 면역글로불린 Fc 도메인과 융합된다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역글로불린 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, TNFα 길항제는 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 단편을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 링커를 통하여 TNFα 길항제와 융합된 NGF 길항제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합성 분자는 상기 융합 단백질의 동종이량체이다.
일부 실시양태에서, NGF 길항제는 항-NGF scFv 도메인이고, TNFα 길항제는 그의 카르복시-말단에서 면역글로불린 Fc 도메인과 융합된 TNFR-2의 가용성, TNFα-결합성 단편이다. 일부 실시양태에서, 상기 scFv는 링커를 통하여 면역글로불린 Fc 도메인의 카르복시-말단과 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 N-말단에서부터 C-말단까지, TNFR-2의 TNFα-결합성 75 kD 단편, 인간 IgG1 Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)2, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3 (서열식별번호: 15), 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 N-말단에서부터 C-말단까지, TNFR-2의 TNFα-결합성 75 kD 단편, 인간 IgG1 Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)2, 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)4 (서열식별번호: 19), 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 N-말단에서부터 C-말단까지, TNFR-2의 TNFα-결합성 75 kD 단편, 인간 IgG1 Fc 도메인, 링커 서열, 및 항-NGF scFv 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
본 개시내용은 또한, 특정 세포에서 p38 인산화를 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 특정 세포를 본원에 기재된 폴리펩티드 중 임의의 것 (예를 들어, 본원에 기재된 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 것인 결합성 분자 중 임의의 것)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 특정 세포에서 ERK 인산화를 억제하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 특정 세포를 본원에 기재된 폴리펩티드 중 임의의 것 (예를 들어, 본원에 기재된 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 것인 결합성 분자 중 임의의 것)과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 신경 세포이다. 다른 실시양태에서, 상기 세포는 말초 신경 세포이다. 또한 다른 실시양태에서, 상기 세포는 중추 신경 세포이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 포유류 내에 있다. 일부 실시양태에서, 포유류는 인간이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 세포의 배양물 내에 있다.
본 개시내용은 또한, 본원에 개시된 결합성 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 및 이들 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 결합성 분자의 생성 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 결합성 분자를 포함하는 조성물, 제약 조성물 및 키트를 제공한다.
도 1: TNFR2-Fc 융합 단백질 (패널 A); 및 항-NGF scFv 도메인과 융합된 TNFR2-Fc 도메인을 포함하는, 예시되는 다중특이적 결합성 분자인 TNFR2-Fc_VH#4 (패널 B)를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2A는 정제된 TNFR2-Fc_VH#4의 배치 내의 집합체, 단량체 및 단백질 단편화의 수준을 SEC-HPLC 분석한 결과를 도시한 것이다.
도 2B는 환원 및 비-환원 조건하에 정제된 TNFR2-Fc_VH#4 및 정제된 TNFR2-Fc 단백질을 SDS-PAGE 분석한 것을 도시한 것이다. 겔 부하 순서: 1. TNFR2-Fc_VH#4, 2. TNFR2-Fc_VL-VH (역 가변 도메인 유전자 배향으로 항-NGF scFv와 융합된 TNFR2-Fc), 3. TNFR2-Fc 무관한 scFv 1, 4. TNFR2-Fc, 5. TNFR2-Fc 무관한 scFv 2.
도 3A는 단백질 A 칼럼 정제 후 TNFR2-Fc_VH#4의 순도를 도시한 것이다. 도 3B는 SP 세파로스 칼럼 상에서의 제2 정제 단계 후 TNFR2-Fc_VH#4의 순도를 도시한 것이다.
도 4는 시차 주사 열량측정법을 이용한 TNFR2-Fc_VH#4의 안정성 분석을 도시한 것이다.
도 5는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은, TNFα 및 NGF 단독에 대한, 및 TNFα와 NGF 둘 다에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 결합성을 도시한 것이다. 도 5A는 NGF에 대한 결합성을 도시한 것이고, 도 5B는 TNFα에 대한 결합성을 도시한 것이며, 도 5C는 TNFα와 NGF에 대한 동시 결합성을 도시한 것이다.
도 6은 TNFR2-Fc_VH#4에 대한 표면 플라스몬 공명 결합 검정의 센서그램을 도시한 것이다. TNFR2-Fc_VH#4 다중특이적 항체의 공동 항원 결합은 비아코어(BIAcore) 2000을 이용하여 수행하였다. 동시 항원 결합성은 센서 표면과 결합된 TNFR2-Fc_VH#4 전반에 걸쳐 TNFα 및 NGF를 일련으로 결합시킴으로써 평가하였다. 센서그램의 첫 번째 부분은 상기 다중특이적 항체에 대한 포화량의 TNFα의 결합을 도시한 것이고, 센서그램의 두 번째 부분은 두 번째 항원을 적용한 경우의 결합성을 도시하는데, TNFα 단독을 다시 적용하거나 (표면이 포화되었다는 것을 나타내었다), 또는 TNFα와 NGF의 등몰 혼합물을 적용하였다. 공명 단위 상의 증가는 다중특이적 분자에 대한 NGF의 결합, 및 이에 따른 동시 항원 개입에 해당되었다. 상기 검정은 또한, 항원을 역 순서로 부가하면서 수행하여 이들 데이터를 확증하였다.
도 7은 TF-1 세포의 NGF-매개된 증식의 억제를 도시한 것이다. a. 부가된 NGF 길항제의 부재 하에서의 NGF-매개된 증식. b. TNFR2-Fc_VH#4에 의한 인간 NGF 반응의 억제. c. TNFR2-Fc_VH#4의 뮤린 NGF 반응의 억제. NGF의 활성은 정상적으로는, RLU (상대적 발광 단위)로서 표시되고, NGF 매개된 증식의 %는 다음 식을 이용하여 NGF 리간드 단독에 대한 반응 %로서 계산된다: 100 * (웰 RLU - 배경 RLU)/(총 RLU - 배경 RLU) (여기서, 배경 RLU는 배지 대조군의 평균이고, 총 RLU는 대조군을 제외한 리간드의 평균이다. d. TNFR2-Fc_VarB 및 엔디맙(ndimab) VarB에 의한 인간 NGF 반응의 억제. e. TNFR2-Fc_VarB 및 엔디맙 VarB에 의한 뮤린 NGF 반응의 억제.
도 8은 U937 세포에서 TNFα 유도된 카스파제(Caspase) 3 활성의 억제를 도시한 것이다. a. 부가된 TNFα 길항제의 부재하에 U937 세포에서의 TNFα 유도된 카스파제 3 활성. b. 부가된 길항제의 부재하에 반응의 %로서 제시된, U937 세포에서의 TNFα 유도된 카스파제 3 활성의 억제. TNF의 활성은 정상적으로는, RFU (상대적 형광 단위)로서 나타내고, TNF 매개된 카스파제 3 방출의 %는 상기 도 7c에 기재된 바와 같은 식을 이용하여 TNF 리간드 단독에 대한 반응 %로서 계산되었다. c. 관련 분자 TNFR2-Fc_varB 및 엔디맙 VarB에 대하여 유사한 결과가 제시되었다.
도 9는 부분 좌골 신경 라이게이션(ligation)-유도된 기계적 통각과민증에 대한, 에타네르셉트(etanercept)와 MEDI-578을 이용한 조합 치료의 효과를 도시한 것이다. 그 결과는 동측/반대측 비율로서 제시된다. 군당 N=9 내지 10. 의존성 인자로서 시간 및 처치에 따라서 2원 ANOVA 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. 본페로니 사후 검정을 이용하여 후속 통계적 유의성을 수득하였다. *** Op + CAT-251 대조군에 대한 p<0.001.
도 10a는 부분 좌골 신경 라이게이션-유도된 기계적 통각과민증에 대하 TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 도시한 것이다. 그 결과는 동측/반대측 비율로서 제시된다. 군당 N=10. 의존성 인자로서 시간 및 처치에 따라서 2원 ANOVA 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. 본페로니 사후 검정을 이용하여 후속 통계적 유의성을 수득하였다. *** 이중특이적 이소형 대조군과 비교한 p<0.001. 도 10b는 관련 분자 TNFR2-Fc_varB를 이용한 유사한 결과를 도시한 것이다.
도 11은 기계적 과민증의 관절 통증 모델에서 통증 감소에 대한, MEDI-578과 에타네르셉트의 공동-투여의 효과를 도시한 것이다. 군당 N=9 내지 10. 2원 ANOVA 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. 본페로니 사후 검정을 이용하여 후속 통계적 유의성을 수득하였다. * P>0.05; *** CAT-251과 비교한 P<0.001.
도 12는 기계적 과민증의 관절 통증 모델에서 통증 감소에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 도시한 것이다. 군당 N=9 내지 10. 2원 ANOVA 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. 본페로니 사후 검정을 이용하여 후속 통계적 유의성을 수득하였다. *** 이중특이적 이소형 대조군과 비교한 P<0.001.
도 13은 래트 모델에서 CFA-유도된 통각과민증에 대한 TNFR2-Fc_varB의 5가지 상이한 용량의 효과를 도시한 것이다.
도 14: 포스포-p38 반응으로부터의 HTRF 비를 도시한 열 지도.
도 15: p38 인산화에 대한 TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물의 효과를 도시한 용량 반응 곡선.
도 16: 포스포-ERK 반응으로부터의 HTRF 비를 도시한 열 지도.
도 17: ERK 인산화에 대한 TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물의 효과를 도시한 용량 반응 곡선.
정의
"단수" 형태의 실체는 이러한 실체 하나 이상을 지칭한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, "특정", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
더욱이, 본원에 사용된 경우의 "및/또는"은 다른 것을 수반하거나 수반하지 않는, 2개의 명시된 특색 또는 성분들 각각의 특이적 개시물로서 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 표현에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하고자 한다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 표현에 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음 측면들 중 각각을 포괄하고자 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
용어 "포함하는"을 이용하여 특정 측면이 본원에 기재되는 모든 경우에, "이루어지는" 및/또는 "본질적으로 이루어지는"이란 면에서 기재된 달리 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련되는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 다음 사전 (the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press)은 본 개시내용에 사용된 많은 용어의 일반적 사전을 통상의 기술자에게 제공한다.
단위, 접두사, 및 부호는 시스템 인터내셔날 드 유나이티즈 (Systeme International de Unites; SI)에 의해 용인된 형태로 나타낸다. 수치 범위는 그 범위를 규정하는 수를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 좌측에서 우측으로 표기된다. 본원에 제공된 표제는 본 개시내용의 각종 측면을 제한하지 않고, 이는 전체로서 본 명세서를 참조하여 만들어질 수 있다. 따라서, 바로 다음에 규정된 용어들은 그의 전부가 본 명세서를 참조로 하여 보다 상세히 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결합성 분자"는 가장 광범위한 의미에서, 항원 결정기, 예를 들어, 항원과 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 결합성 분자의 비-제한적 예는 항체 또는 그의 단편, 가용성 수용체 융합 단백질 또는 그의 단편, 비-면역글로불린 스캐폴드 또는 그의 단편을 포함하는데, 각각은 항원 특이적 결합성을 보유하고 있다. 예시되는 비-면역글로불린 스캐폴드는 Tn3 (문헌 [Koide et al., J Mol Biol 2012 Jan 13;415(2):393-405]), DARPin (문헌 [Boersma & Pluckthun, Curr Opin Biotechnol. 2011 22(6):849-57]), 안티칼린(anticalin) (문헌 [Gebauer & Skerra, Methods Enzymol. 2012; 503:157-88])을 포함한다. 예시되는 가용성 수용체 융합 단백질 및 항체가 다음에 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 결합성 분자는 상기 항체 또는 그의 단편, 가용성 수용체 융합 단백질 또는 그의 단편, 및 비-면역글로불린-기반 스캐폴드 또는 그의 단편의 조합물을 포함하도록 조작될 수 있었다.
상기 결합성 분자, 또는 항원을 인식하는 결합성 분자의 임의의 부분이 본원에서 "결합성 도메인"으로서 지칭된다. 구체적으로 실물 크기의 결합성 분자, 예컨대 자연 발생적 항체를 지칭하지 않는 한, 용어 "결합성 분자"는 실물 크기의 항체 또는 다른 비-항체 결합성 분자뿐만 아니라 상기 결합성 분자, 예를 들어, 자연 발생적 항체 또는 면역글로불린 분자의 항원-결합성 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체, 또는 실물 크기의 결합성 분자와 유사한 방식으로 항원과 결합하는 것으로 조작된 결합성 분자 또는 단편을 제한없이 포괄한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 특정의 다중특이적 결합성 분자, 예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등의 결합성 분자, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체, 또는 유도체를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은, 다중특이적 결합성 분자는 하나 이상의 항체 결합성 도메인, 하나 이상의 비-항체 결합성 도메인, 또는 그의 조합물을 포함할 수 있다.
문헌에서 베타-신경 성장 인자로서 지칭되기도 하는, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신경 성장 인자" ("NGF")는 각종 신경 세포의 성장과 생존에 있어서 기능하는 분비된 단백질을 지칭한다. 인간 NGF는 유전자은행 수탁 번호 NP_002497.2로서 존재하고, 본원에 서열식별번호: 1로서 제시된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 NGF는 인간 NGF에 제한되지 않고, 인간 NGF의 모든 종 오르소로그(ortholog)를 포함한다. 용어 "NGF"는 NGF의 프로-형태, 프로-NGF, 완전한 길이의 NGF뿐만 아니라 세포 내에서의 프로세싱으로부터 발생되는 NGF의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, NGF의 자연 발생적 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체, 및 이소형을 포괄한다. NGF는 다음 2개의 수용체와 결합할 수 있다: p75 뉴로트로핀 수용체 (p75(NTR)) 및 막투과 티로신 키나제인 TrkA. NGF는 통각수용기의 감작을 매개하는 것으로 공지되어 있는 통증에 대한 널리 검증된 표적이다.
각종 작용제가 NGF 활성의 길항제로서 시험받고 있다. 이러한 항-NGF 작용제 중 하나가 trkA-Fc인데, 이는 미끼 또는 스캐빈저(scavenger)로서 작용하여 내인성 NGF와 결합함으로써, 이를 불활성화시킨다. TrkA-Fc는 IgG 항체의 불변 도메인 단편 (Fc)과 연결된 trkA의 NGF 결합성 영역으로 이루어진 융합 단백질이다. TrkA-Fc는 나이브(naive) 동물에게 통각감퇴를 야기시키고, 통각수용기 반응을 저하시키며, 무수 통증-감지 신경 세포의 발아를 감소시킨다 (Bennett, D. L. et al. (1998) Eur J Neurosci, 10:1282-91).
NGF-매개된 통증이, 본원에 제시된 바와 같은 결합성 분자를 이용하여 안전하고도 유효하게 치료하는 데 특히 적절한데, 이는 NGF 수준이 유해 자극에 반응하여 말초에서 증가되고 항체가 낮은 혈액-뇌 장벽 투과성을 갖고 있기 때문이다. 본원에 기재된 요법 및 조성물에 사용될 수 있는 수많은 항-NGF 항체 및 그의 항원-결합성 단편은 다음 문헌에서 찾을 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO02/096458 및 WO04/032870 참조).
용어 "MEDI-578"은 국제 출원 번호 PCT/GB2006/000238 및 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0107658 A1 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)의 대상인, NGF와 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. MEDI-578 중쇄 및 경쇄 서열이 서열식별번호: 3 및 7에 각각 제시되어 있다.
용어 NGF-NG는 NGF와 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. NGF-NG 중쇄 및 경쇄 서열이 서열식별번호: 24 및 26에 각각 제시되어 있다.
문헌에서 카켁틴, APC1 단백질; 종양 괴사 인자; TNF; 또는 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리(superfamily) 구성원 2로서 지칭되기도 하는, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양 괴사 인자 알파" ("TNFα")는 특이적 TNFα 단백질을 지칭하고, TNF 리간드의 슈퍼패밀리를 지칭하지 않는다. 인간 TNFα는 유전자은행 수탁 번호 NP_000585.2로서 존재하고, 서열식별번호: 2로서 제시된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 TNFα는 인간 TNFα에 제한되지 않고, 인간 TNFα의 모든 종 오르소로그를 포함한다. 용어 "TNFα"는 TNFα의 프로-형태, 프로-TNFα, 완전한 길이의 TNFα뿐만 아니라 세포 내에서의 프로세싱으로부터 발생되는 TNFα의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, TNFα의 자연 발생적 및 비-자연 발생적 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체, 대립유전자 변이체, 및 이소형을 포괄한다. TNFα는 다음 2개의 수용체와 결합할 수 있다: TNFR1 (TNF 수용체 유형 1; CD120a; p55/60) 및 TNFR2 (TNF 수용체 유형 2; CD120b; p75/80). TNFα는 염증 유발성 시토카인으로서 기능하는데, 예를 들어, 신경 염증에 있어서 기능성이다. 예를 들어, TNFα는 신경병성 통증의 발생에 기능적으로 관여하는 것으로 생각된다 (Leung, L., and Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7:27 (2010)).
다수의 TNFα 길항제가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이들 중 많은 것이 치료제로서 시판되고 있다. 본원에 제공된 요법 및 조성물에 사용될 수 있는 시판용 TNF-알파 길항제의 예는 에타네르셉트 (ENBREL®, 암젠/화이자), 인플릭시맙 [예를 들어, REMICADE®, 센토코르(Centocor)], 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol) (예를 들어, CIMZIA®, UCB), 골리무맙(golimumab) (예를 들어, SIMPONI™, 센토코르), 및 아달리무맙 (예를 들어, HUMIRA®/TRUDEXA®, 애보트)을 포함한다.
"단리된" 결합성 분자, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물은 비-자연 발생적 형태의 결합성 분자, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물을 지칭한다. 단리된 결합성 분자, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 이들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태로 존재하지 않은 정도로 변화, 적응, 조합, 재배열, 조작, 또는 달리 조작시켰던 것을 포함한다. 일부 측면에서 단리되는 결합성 분자, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 조성물은 "재조합"이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "다관능성 폴리펩티드" 및 "이관능성 폴리펩티드"는 2개 이상의 항원을 표적으로 하도록 설계된 비-자연 발생적 결합성 분자를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드는 전형적으로, 2가지 상이한 목적하는 생물학적 관능기를 합하여 단일 결합성 분자가 되도록 설계한, 유전적으로 조작된 융합 단백질이다. 예를 들어, 다관능성 폴리펩티드는 다관능성 결합성 분자일 수 있다. 본원에 기재된 예시되는 다관능성 폴리펩티드는 NGF 길항제 도메인, 예를 들어, 하나 이상의 자연 NGF 관능기를 차단, 저하 또는 억제하는 펩티드 도메인, 및 TNFα 길항제 도메인, 예를 들어, 하나 이상의 자연 TNFα 관능기를 차단, 저하 또는 억제시키는 펩티드 도메인을 포함하는 다관능성 결합성 분자이다.
본원에 제공된 다관능성 폴리펩티드의 1개 군은 다중특이적 결합성 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항체 결합성 도메인, 예를 들어, "다중특이적 항체", 하나 이상의 비-항체 결합성 도메인, 예를 들어, 미끼 수용체, 또는 그의 조합물을 포함하는 것인 결합성 분자이다. 예를 들어, 하나 이상의 항체 결합성 도메인, 하나 이상의 비-항체 결합성 도메인, 또는 그의 조합물을 포함한 다중특이적 결합성 분자는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하고 이와 결합할 수 있는 결합성 도메인을 수반한 분자이다. 이러한 상이한 에피토프는 동일한 분자 (예를 들어, 동일한 NGF) 내에 있을 수 있거나 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있으므로, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 NGF 뿐만 아니라 또 다른 에피토프-함유 분자, 예를 들어, TNFα를 특이적으로 인식하고 이와 결합할 수 있어, 상기 다중특이적 결합성 분자는 NGF와 TNFα를 특이적으로 인식하게 된다.
예를 들어, 하나 이상의 항체 결합성 도메인, 하나 이상의 비-항체 결합성 도메인, 또는 그의 조합물을 포함한 다중특이적 결합성 분자를 제조하기 위한 기술은 관련 기술분야에서 이용 가능하다 (Dimasi, N., et al., 2009, J Mol Biol . 393:672-92; Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol . 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp . Med . 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol . 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol . 152:5368; 및 미국 특허 번호 5,731,168). 3가 이상의 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
용어 "항체"는 특정 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통하여, 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합물을 인식하고 이와 특이적으로 결합하는 상기 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 무손상 폴리클로날 항체; 무손상 모노클로날 항체; 항체 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편); 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체; 적어도 2개의 무손상 항체로부터 생성된 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다 (단, 상기 항체는 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다). 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤 각각으로 지칭된 그들의 중쇄 불변 도메인의 실체를 근거로 하여, 5가지 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 그의 하위부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 면역글로불린 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이하고 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원적 입체 배치를 갖는다.
일부 실시양태에서, "차단성" 결합성 분자, 예를 들어, 차단성 항체 또는 "길항제" 결합성 분자, 예컨대 예를 들어, 길항제 항체 또는 융합 단백질은 이것과 결합하는 항원, 예컨대 NGF 또는 TNFα의 생물학적 활성을 억제 또는 저하시키는 것이다. 특정 측면에서 차단성 항체 또는 길항제 결합성 분자는 상기 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 예를 들어, 이러한 생물학적 활성은 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100% 저하될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "길항제" 및 "길항제 도메인"은 그의 표적 (예를 들어, TNFα 또는 NGF)과 결합함으로써, 이러한 표적이 특정 수용체와 상호 작용하는 것을 차단 또는 억제시키는 폴리펩티드 또는 기타 분자를 포함한다. 따라서, NGF 및/또는 TNFα 길항제는 NGF가 trkA 또는 p75 뉴로트로핀와 상호 작용하는 것, 또는 TNFα가 TNFR-1 또는 TNFR-2와 상호 작용하는 것을 차단 또는 억제하는 분자를 포함한다. NGF 및/또는 TNFα 길항제는 또한, p38 인산화 및/또는 ERK 인산화를 저하시키는 분자를 포함한다. 예시되는 길항제는 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 및 표적-특이적, 가용성, 비-시그널링 수용체 펩티드 ("미끼 수용체" 또는 그의 리간드-결합성 단편)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 특정 부분을 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원의 다른 곳에 기재된, 비-항체 결합성 분자의 항원-결합성 단편이 또한, 본 개시내용에 의해 제공된다.
"모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동질적 항체 집단을 지칭한다. 이는 상이한 항원 결정기에 대항하여 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 항체와 완전한 길이의 모노클로날 항체 둘 다 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 더욱이, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현, 및 트랜스제닉 동물에 의한 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 수많은 방식으로 제조된 상기 항체를 지칭한다.
용어 "인간화 항체"는 최소한의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하는 특이적 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린, 또는 그의 단편인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로써 대체시킨 인간 면역글로불린이다 (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR 또는 FW) 잔기를, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 대체시킨다. 인간화 항체는 Fv 골격 영역 내의 부가 잔기 및/또는 상기 대체된 비-인간 잔기 내의 부가 잔기를 치환시킴으로써 추가로 변형시켜 항체 특이성, 친화성 및/또는 능력을 정련 및 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역을 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 1개 이상, 및 전형적으로는 2개 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인 반면, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 특정 부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성시키기 위해 사용된 방법의 예가 미국 특허 번호 5,225,539 또는 5,639,641에 기재되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합되는, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역으로서 공지되기도 한 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 골격 영역 (FR 또는 FW)으로 이루어진다. 각 쇄 내의 CDR은 FR에 의해 아주 근접하여 결합되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지 기술이 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 근거한 접근 방식 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 근거한 접근 방식 (문헌 [Al-lazikani et al. (1997) J. Molec . Biol . 273:927-948)]). 또한, 이들 2가지 접근 방식의 조합이 종종, CDR을 결정하기 위해 관련 기술분야에 사용된다.
카바트(Kabat) 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내의 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]).
카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 문헌 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)])에서의 항체 편집에서 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 몇 개 적거나 부가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따르는 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따르는 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 결정할 수 있다. 코티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 카바트 넘버링 협약을 이용하여 넘버링할 경우 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 이러한 루프의 길이에 따라서 H32와 H34 간에 다양하다 (이는 카바트 넘버링 도식이 H35A 및 H35B에 삽입물을 놓아두기 때문이고; 35A도 존재하지 않고 35B도 존재하지 않는다면, 루프는 32에서 종결되며; 35A만이 존재한다면, 루프는 33에서 종결되고; 35A와 35B 둘 다가 존재한다면, 루프는 34에서 종결된다). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 간의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 몰레쿨라(Oxford Molecular's) AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. 특정 비교가 다음 표 1에 제공된다.
<표 1>
항체 넘버링 시스템의 비교
Figure 112016084236903-pct00001
용어 "인간 항체"는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술을 이용하여 제조된, 천연 인간 항체, 또는 천연 인간 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 무손상 또는 완전한 길이의 항체, 그의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예컨대 예를 들어, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2가지 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄와 중쇄 둘 다의 가변 영역은 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 지닌 포유류의 한 가지 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하지만, 불변 영역은 상기 종에서의 면역 반응이 유도되는 것을 피하기 위해 또 다른 종 (통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체 내의 서열과 상동이다. 예를 들어, 하나 이상의 항체 결합성 도메인, 하나 이상의 비-항체 결합성 도메인, 또는 그의 조합물을 포함한 다중특이적 결합성 분자, 예를 들어, 본원에 제공된 TNFα 길항제 및/또는 NGF 길항제는 천연 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체와 비교한 경우에, 목적하는 생화학적 특징, 예컨대 증가된 종양 국재화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하도록, 불변 영역 도메인 중 하나 이상의 적어도 특정 분획을 결실시켰거나 또는 달리 변경시킨 항체 불변 영역 (예를 들어, Fc 영역)을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 변형된 불변 영역은 3개의 중쇄 불변 도메인 중 하나 이상 (CH1, CH2 또는 CH3) 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 불변 도메인은 부분적으로 또는 전적으로 결실될 수 있다. 일부 측면에서, 전체 CH2 도메인이 결실될 수 있다 (ΔCH2 구축물) (예를 들어, 문헌 [Oganesyan V, et al., 2008 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr . 64:700-4]; [Oganesyan V, et al., Mol Immunol . 46:1750-5]; [Dall'Acqua, W.F., et al., 2006. J. Biol . Chem . 281:23514-23524]; 및 [Dall'Acqua, et al., 2002. J. Immunol . 169:5171-5180] 참조).
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 이는 특별한 항체에 의해 인식될 수 있으며 이와 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 그 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬된 비연속되는 아미노산과 연속되는 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 연속되는 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로, 단백질 변성시 보유되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로, 단백질 변성시 상실된다. 에피토프는 전형적으로, 독특한 공간 입체 구조에 있어서 적어도 3개, 및 보다 통상적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개 아미노산을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 에피토프는 이러한 에피토프를 형성하는 특이적 아미노산으로 하향 정의될 필요가 없다. 일부 측면에서 에피토프는 폴리펩티드 항원의 펩티드 서브유닛에 대한 결합을 조사함으로써, 또는 항원-특이적 항체의 특정 군에 의한 항원에 대한 결합 경쟁을 조사함으로써 확인할 수 있다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 그에 대한 진단, 예후 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 동물원 동물을 포함하는데, 이는 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 곰 등을 포함한다.
용어 "조성물" 및 "제약 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용해주는 형태로 존재하고, 조성물이 투여될 대상체에 대하여 허용 가능하지 않는 수준으로 독성인 부가 성분을 전혀 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량" 및 "치료상 유효량"은 특정 대상체에게서 통증을 제어하는 데 유효한 하나 이상의 치료 조성물의 양을 지칭한다. 용어 "통증 제어" 및 문법적 등가물은 통증 제어를 필요로 하는 대상체에게서 임의의 유익하거나 또는 바람직한 효과를 기재하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 치료 조성물의 유효량은 특정 대상체에게서, 예를 들어 통증을 예방하거나, 통증의 관용되는 수준을 유지하거나, 통증을 완화시키거나, 통증을 감소시키거나, 통증을 최소화하거나, 또는 통증을 없앨 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는"은 특정 대상체에게 본원에 기재된 하나 이상의 치료 조성물, 예를 들어, NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 이관능성 폴리펩티드, NGF 길항제와 TNFα 길항제의 조합물을 포함하는 치료 조성물, 또는 별도의 치료 조성물 (하나는 NGF 길항제를 포함하고 다른 하나는 TNFα 길항제를 포함한다)을 투여하는 것을 지칭한다. 용어 "공동-투여하는"은 특정 대상체에게 2가지 이상의 치료 조성물, 예를 들어, NGF 길항제를 포함하는 하나의 조성물과 TNFα 길항제를 포함하는 하나의 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 공동-투여하는 것은 2가지 이상의 치료 조성물을 상기 대상체에게 동시에 투여하는 것을 포함하지만, 반드시 요구되는 것은 아니다. 2가지 이상의 치료 조성물은 대상체에게 순차적으로, 예를 들어 30분 간격으로, 1시간 간격으로, 2시간 간격으로, 3시간 간격으로, 4시간 간격으로, 또는 5시간 또는 그 초과의 시간 간격으로 투여할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 공동-투여의 순서와 시기는 고정될 수 있거나, 또는 전문 의료진의 판단에 근거하여 다양할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 공유적으로 연결된 뉴클레오티드 잔기로 구성된 중합체성 화합물을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA, RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 벡터, 플라스미드, 파지, 또는 바이러스일 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주 세포 내의 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달 및 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 외피없는(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 피막화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지될 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 이를 방해할 수 있다. 상기 용어는 또한, 자연적으로 또는 간섭에 의해, 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형시킨 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는, 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함함)를 함유하는 폴리펩티드뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형물이 포함된다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열이 관련 기술분야에 정의되었는데, 이는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것이 보존적 치환이다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 폴리펩티드 및 항체의 서열 내에서의 보존적 치환은 그러한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드의 결합 또는 다른 기능적 활성을 없애지 않는다. 기능에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell et al., Biochem . 32: 1180-1187 (1993)]; [Kobayashi et al. Protein Eng . 12:879-884 (1999)]; 및 [Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)] 참조).
NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 것인 결합성 분자
본 개시내용은 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 이관능성 폴리펩티드를 제공한다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 이관능성 폴리펩티드의 유효량을 투여하는 것이 통증 제어를 필요로 하는 대상체에게서, 단독으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 유효하게 통증을 제어할 수 있다. 본원에 제공된 이관능성 폴리펩티드는 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 어떠한 순서, 구조 또는 입체 구조로도 포함할 수 있다. 임의의 적합한 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제가 본원에 제공된 이관능성 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 예시되는 NGF 길항제 및 TNFα 길항제는 본 개시내용 내의 다른 곳에 기재되어 있다.
특정 측면에서, NGF 길항제는 NGF 활성을 억제할 수 있는 비-항체 분자, 또는 그의 결합성 도메인, 예를 들어, TrkA의 가용성, NGF-결합성 단편이다. 특정 측면에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편이다. 적합한 항-NGF 길항제, 예를 들어, 길항제 항체는 TrkA, p75NRT, 또는 TrkA와 p75NRT 둘 다에 대한 NGF 결합을 억제할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 이관능성 분자, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자에 사용하기 위한 항-NGF 길항제, 예를 들어, 길항제 항체 또는 그의 단편은 p75NRT에 대한 NGF 결합에 비해 TrkA에 대한 NGF 결합을 우선적으로 차단할 수 있다.
본원에 개시된 이관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자에 사용하기 위한 예시 항체 또는 그의 단편은 미국 출원 공개 번호 2008/0107658 (그의 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 이용 가능하다. 특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 항-NGF 항체 MEDI-578보다 더 큰 친화도로 NGF와 결합할 수 있거나, NGF와 동일한 에피토프와 결합하거나, 또는 NGF를 경쟁적으로 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 1, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.2 nM 이하의 친화도로 인간 NGF 및/또는 래트 NGF와 결합한다. 예를 들어, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 약 0.2 내지 0.8, 0.2 내지 0.7, 0.2 내지 0.6, 0.2 내지 0.5, 및/또는 0.25 내지 0.44 nM의 친화도로 인간 NGF와 결합할 수 있고, 약 0.2 내지 0.9, 0.2 내지 0.8, 및/또는 0.25 내지 0.70 nM의 친화도로 래트 NGF와 결합할 수 있다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 MEDI-578이다. MEDI-578은 미국 출원 공개 번호 2008/0107658에 클론 1252A5로서 개시되어 있다. 다른 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 인간화 항-NGF mAb인 타네주맙 (RN-624) (화이자; 문헌 [Kivitz et al., (2013) PAIN, 154, 9, 1603-161]에 기재됨); 완전한 인간 항-NGF mAb인 풀라누맙(fulranumab) (암젠; 문헌 [Sanga et al., PAIN, Volume 154, Issue 10, October 2013, Pages 1910-1919]에 기재됨); 완전한 인간 항-NGF mAb인 REGN475/SAR164877 (레제네론/사노피-아벤티스); 인간화 항-NGF mAb인 ABT-110 (PG110) [애보트 라보라토리즈(Abbott Laboratories)]이다. 본원에 제공된 이관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자 내에 포함된 항-NGF 항체 또는 그의 단편은, 예를 들어, 인간화, 키메라, 영장류화, 또는 완전한 인간일 수 있다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 MEDI-578의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 MEDI-578 중쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 4의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 5의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 6의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 이러한 HCDR3은 아미노산 서열 SSRIYDFNSALISYYDMDV (서열식별번호: 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV (서열식별번호: 12)을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 MEDI-578의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 MEDI-578 경쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 8의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 9의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 10의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 3의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 7의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 94의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 95의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 및 96 중 어느 하나의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 그의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 및 97 중 어느 하나의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 그의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 및 96 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 및 96 중 어느 하나의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 및 97 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 및 97 중 어느 하나의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 NGF-NG의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 NGF-NG 중쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 88의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 88의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 89의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 90의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 NGF-NG의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 NGF-NG 경쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 91의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 92의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 93의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 수반한 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 24의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-NGF 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 26의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 완전한 항-NGF 항체, 즉 2개의 완전한 중쇄와 2개의 완전한 경쇄를 H2L2 포맷으로 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 항-NGF 항체가 완전한 항체인 경우, 하나 이상의 TNFα 길항제 도메인은 항-NGF 항체의 하나 이상의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단과 융합되거나 또는 항-NGF 항체의 하나 이상의 경쇄의 N-말단 또는 C-말단과 융합될 수 있다. 또 다른 한편으론, 본 개시내용에 의해 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 항-NGF 항체의 항원-결합성 단편을 포함할 수 있다. 특정 측면에서 항-NGF 항체 단편은 항체의 불변 도메인의 임의의 부분을 포함할 수 있거나, 또는 가변 도메인만을 포함할 수 있다. 이관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자에 봉입시키기 위한 예시 항-NGF 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편 또는 단일 쇄 Fv (scFv) 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 제공된 특정의 예시 조성물에서, 항-NGF 항체는 scFv 단편, 예를 들어 MEDI-578의 scFv 단편, 또는 그의 NGF-결합성 변이체이다. 본원에 제공된 특정의 예시 조성물에서, 항-NGF 항체는 scFv 단편, 예를 들어 NGF-NG의 scFv 단편, 또는 그의 NGF-결합성 변이체이다. 항-NGF scFv 폴리펩티드는 VH 도메인과 VL 도메인을 임의의 순서, 즉 N-VH-VL-C 또는 N-VL-VH-C로 포함할 수 있다. ScFv 분자는 전형적으로, VH 도메인과 VL 도메인이 가요성 링커를 통하여 연결되도록 조작된다. 각종 링커를 포함한, 예시되는 scFv 구조는 문헌 ([Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393:672-92 (2009)]), 및 PCT 공개 번호 WO 2013/070565 (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 찾을 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, scFv 항체 단편은 표준 Fab 입체 구조에 존재하는 가변 도메인과 비교해서 저하된 안정성을 가질 수 있다. 일부 측면에서 상기 scFv는 안정화 돌연변이를 도입하거나 또는 쇄간 디술피드 결합(들)을 도입함으로써 (예를 들어, SS-안정화됨) 구조적으로 안정화시킬 수 있다. 그러나, 안정화 돌연변이 및/또는 도입된 쇄간 디술피드 결합이 필요하지 않고, 특정 측면에서는 존재하지 않는다. 관련 기술분야에서 승인된 수많은 방법이 scFv 폴리펩티드를 안정화시키기 위해 이용될 수 있다.
링커를 사용하여 본원에 제공된 이관능성 폴리펩티드의 도메인/영역을 연결시킬 수 있다. 링커를 사용하여 이관능성 분자의 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 연결시킬 수 있고, 링커를 또한 사용하여 scFv의 가변 중쇄와 경쇄를 상호 연결시킬 수 있다. 링커의 예시되는 비-제한적 예는 적어도 4개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드 쇄이다. 이러한 링커의 부분이 가요성, 친수성일 수 있고, 그들 자신 (링커 부분 또는 가요성 링커 부분)의 2차 구조를 거의 또는 전혀 갖고 있지 않다. 적어도 4개의 아미노산의 링커를 사용하여, 이관능성 폴리펩티드 분자를 어셈블리한 후 서로에게 가까운 곳에 위치한 도메인 및/또는 영역을 연결할 수 있다. 보다 긴 링커를 사용할 수도 있다. 따라서, 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 잔기일 수 있다. 링커는 또한, 예를 들어, 약 100개 내지 175개 잔기일 수 있다. 다중 링커를 사용하여 이관능성 폴리펩티드 분자의 부분들을 상호 연결시키는 경우에는, 이러한 링커가 동일하거나 상이할 수 있다 (예를 들어, 동일하거나 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열).
이관능성 폴리펩티드 분자 내의 링커(들)는 목적하는 구조의 형성을 촉진시켜 준다. 링커는 (Gly-Ser)n 잔기 (여기서, n은 적어도, 1, 2, 및 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 또는 그 초과의 정수이다)를 포함할 수 있는데, 용해도를 증가시키기 위해 일부 Glu 또는 Lys 잔기가 전반에 걸쳐 분산되어 있다. 또 다른 한편으론, 특정 링커는 임의의 세린 잔기를 포함하지 않는데, 예를 들어, 이러한 링커에 O-연결된 글리코실화가 적용된다. 일부 측면에서, 예를 들어, 링커의 이량체화를 이용하여 이관능성 폴리펩티드의 도메인을 그들의 적당하게 폴딩된 입체 배치로 만드는 경우에는, 링커가 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 이관능성 폴리펩티드는 이러한 폴리펩티드의 도메인들을 연결시켜 주는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 폴리펩티드 링커를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 폴리펩티드 링커는 1 내지 50개 잔기, 1 내지 25개 잔기, 25 내지 50개 잔기, 또는 30 내지 50개 잔기를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 폴리펩티드 링커는 Fc 모이어티(moiety)의 특정 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 상기 폴리펩티드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4 항체의 면역글로불린 힌지(hinge) 도메인의 특정 부분 또는 그의 변이체를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 폴리펩티드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 잔기와 세린 잔기로 이루어지는 펩티드를 지칭한다. 예시되는 gly-ser 링커는 식 (Gly4Ser)n (여기서, n은 적어도, 1, 2, 및 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 또는 그 초과의 정수이다)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드 링커는 힌지 영역의 적어도 특정 부분 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자로부터 유래됨) 및 일련의 gly-ser 아미노산 잔기 [예를 들어, gly-ser 링커, 예컨대 (Gly4Ser)n]를 포함할 수 있다.
다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자가 scFv를 포함하는 경우, 가요성 링커는 이러한 scFv의 중쇄와 경쇄를 연결할 수 있다. 이러한 가요성 링커는 일반적으로, 힌지 부분을 포함하지 않고, 이는 오히려 gly-ser 링커 또는 다른 가요성 링커이다. scFv의 도메인들을 상호 연결하는 가요성 링커의 길이 및 아미노산 서열은 용이하게 선택하고 최적화할 수 있다.
특정 측면에서, 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 N-말단에서부터 C-말단까지, VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3, 및 VL을 포함하는 항-NGF scFv 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, scFv의 VH와 VL을 연결하는 링커는 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)4이다. 특정 측면에서 VH는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서 VL은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 서열식별번호: 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 및 96 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 서열식별번호: 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 및 97 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, VH 도메인은 서열식별번호: 3, 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 및 96 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, VL 도메인은 서열식별번호: 7, 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 및 97 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 폴리펩티드의 안정성은 VH 및 VL 도메인 내의 특정 잔기를 시스테인 잔기로 변형시킴으로써 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 쇄간 디술피드 결합을 부가함으로써 개선시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Michaelson, J. S., et al. (2009) MAbs 1, 128-41]; [Brinkmann, U., et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7538-42]; [Young, N. M., et al., (1995) FEBS Lett 377, 135-9] 참조). 예를 들어, VL의 위치 100, 101 또는 102에 있는 글리신 잔기를 시스테인 잔기로 변형시킬 수 있고, VH의 위치 44에 있는 글리신 잔기를 시스테인 잔기로 변형시킬 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 TNFα 길항제 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, TNFα 길항제 도메인은 세포의 표면 상에서 TNF 수용체 (TNFR)에 대한 TNFα의 결합을 억제함으로써, TNF 활성을 차단시킬 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드의 TNFα 길항제 도메인은 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합성 단편이다. 특정 측면에서, 항-TNFα 항체는 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 또는 이들 항체 중 임의의 것의 항원-결합성 단편이다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은, 항-TNFα 항체인 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙, 또는 이들 항체 중 임의의 것의 항원-결합성 단편 중 임의의 것보다 더 큰 친화도로 TNFα와 결합할 수 있거나, TNFα와 동일한 에피토프와 결합하거나, 또는 TNFα를 경쟁적으로 억제할 수 있다. 특정 측면에서 항-TNFα 항체는 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙, 또는 이들 항체 중 임의의 것의 항원-결합성 단편이다. 이들 항-TNFα 항체의 구조 및 서열은 통상의 기술자에게 용이하게 입수 가능하고, 이는 과도한 실험없이도 본원에 기재된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자 내에 포함될 수 있다. 다관능성 폴리펩티드 내에 포함된 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은, 예를 들어, 인간화, 키메라, 영장류화, 또는 완전한 인간일 수 있다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인; 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙 중쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인; 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙 경쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙의 VH 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙의 VL 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 측면에서 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 28의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 측면에서, 항-TNFα 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 29의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.
본 개시내용에 의해 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 완전한 항-TNFα 항체, 즉 2개의 완전한 중쇄와 2개의 완전한 경쇄를 H2L2 포맷으로 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 항-TNFα 항체가 완전한 항체인 경우, 하나 이상의 NGF 길항제 도메인은 항-TNFα 항체의 하나 이상의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단과 융합되거나 또는 항-TNFα 항체의 하나 이상의 경쇄의 N-말단 또는 C-말단과 융합될 수 있다. 또 다른 한편으론, 본 개시내용에 의해 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 항-TNFα 항체의 항원-결합성 단편을 포함할 수 있다. 특정 측면에서 항-TNFα 항체 단편은 항체의 불변 도메인의 임의의 부분을 포함할 수 있거나, 또는 가변 도메인만을 포함할 수 있다. 다관능성 폴리펩티드에 봉입시키기 위한 예시 항-TNFα 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)2 단편 또는 단일 쇄 Fv (scFv) 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 상기 다관능성 분자는 완전한 항-TNFα 항체, 즉 2개의 완전한 중쇄와 2개의 완전한 경쇄를 H2L2 포맷으로 포함하는 항체를 포함하는 분자 (MEDI-578 scFv가 항-TNFα 항체의 중쇄의 C-말단과 융합된다)인 엔디맙 varB이다. 엔디맙 varB는 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 측면에서, 이관능성 분자는 서열식별번호: 20과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열식별번호: 22와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특정 측면에서, 항-TNFα 항체는 scFv 단편, 예를 들어 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 또는 골리무맙으로부터 유래된 scFv 단편, 또는 그의 TNFα-결합성 변이체이다. 항-TNFα scFv 폴리펩티드는 VH 도메인과 VL 도메인을 임의의 순서, 즉 N-VH-VL-C, 또는 N-VL-VH-C로 포함할 수 있다. ScFv 분자는 전형적으로, VH 도메인과 VL 도메인이 가요성 링커를 통하여 연결되도록 조작되고, 상기 언급된 바와 같은 수많은 상이한 구조를 추정할 수 있다. 항-TNFα scFv 폴리펩티드는 또한 상기 언급된 바와 같이 안정화시킬 수 있다.
특정 측면에서, TNFα 길항제는 TNF 수용체, 예를 들어, TNFR-1 또는 TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편, 또는 그의 변이체 또는 그의 가용성 단편이다. 특정 측면에서, TNFR-1의 가용성 단편은 55 kD 단편이다. 특정 실시양태에서, TNFR-2의 가용성 단편은 75 kD 단편이다. 특정 측면에서 상기 TNF 수용체 단편은 이종 폴리펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 Fc 단편, 예를 들어, IgG1 Fc 도메인과 융합된다. 특정 측면에서, TNFα 길항제는 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산, 또는 그의 TNFα-결합성 단편을 포함한다. TNFR-2 부분은 서열식별번호: 13의 아미노산 1 내지 235를 포함한다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편의 변이체는 서열식별번호: 13의 아미노산 1 내지 235와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편의 변이체는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, 또는 50개 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 제외하고는, 서열식별번호: 13의 아미노산 1 내지 235를 포함한다. IgG1 Fc 부분은 서열식별번호: 13의 아미노산 236 내지 467을 포함한다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편은 임의의 인간 또는 비-인간 항체의 Fc 부분과 융합되거나 또는 안정성을 제공할 것인 임의의 다른 단백질 또는 비-단백질 물질, 예를 들어, 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜과 융합될 수 있다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편의 변이체는 서열식별번호: 13의 아미노산 236 내지 467과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편의 변이체는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, 또는 50개 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 제외하고는, 서열식별번호: 13의 아미노산 236 내지 467을 포함한다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편의 변이체는 서열식별번호: 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편의 변이체는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, 또는 50개 아미노산 삽입, 치환 또는 결실을 제외하고는, 서열식별번호: 13을 포함한다.
특정 측면에서, TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편은 단일 쇄 융합 단백질이다. 특정 측면에서 TNFR-2의 TNFα-결합성 가용성 단편은, 예를 들어, 2개의 Fc 도메인 간의 디술피드 결합을 통하여 회합된, 2개의 융합 단백질의 이량체이다.
본원에 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 각종 상이한 구조 및 입체 구조를 가질 수 있다. 한 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 상기 언급된 바와 같은 NGF 길항제 도메인이 가요성 링커를 통하여, 상기 언급된 바와 같은 TNFα 길항제 도메인과 융합된다. 링커의 예는 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 특정 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드는 융합 단백질의 동종이량체를 포함한다.
예시 측면에서, NGF 길항제가, 예를 들어 MEDI-578로부터 유래된 항-NGF scFv 도메인이고 TNFα 길항제가 그의 카르복시-말단에서 면역글로불린 Fc 도메인과 융합된 TNFR-2의 가용성, TNFα-결합성 단편인 다관능성 폴리펩티드가 제공된다. 항-NGF scFv는 일부 측면에서, 링커를 통하여 면역글로불린 Fc 도메인의 카르복시-말단과 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드의 단량체는 N-말단에서부터 C-말단까지, TNFR-2의 TNFα-결합성 75 kD 단편, 인간 IgG1 Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)2 (서열식별번호: 98), 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3 (서열식별번호: 15), 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VL을 포함하는 각 서브유닛과 동종이량체를 형성한다. 한 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 TNFR2-Fc_VH#4이다. 일부 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드는 서열식별번호: 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
또 다른 예시 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드는 N-말단에서부터 C-말단까지, TNFR-2의 TNFα-결합성 75 kD 단편, 인간 IgG1 Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)2 (서열식별번호: 98), 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)4 (서열식별번호: 19), 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VL을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 TNFR2-Fc_varB이다. 일부 측면에서, 상기 다관능성 폴리펩티드는 서열식별번호: 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.
폴리펩티드
본원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드, 예를 들어, NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드는 자연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능에 유의적 효과를 나타내지 않으면서 다양할 수 있는 것으로 관련 기술분야에서 인식될 것이다. 따라서, 본 개시내용은 추가로, 실질적 활성을 갖거나 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는, 본원에 제공된 폴리펩티드의 변이를 제공한다. 이러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복, 및 유형 치환을 포함한다.
상기 폴리펩티드 및 유사체는 정상적으로는 단백질의 일부가 아닌 부가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 이와 같이 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수성을 개선시킬 수 있다. 상기 모이어티는 또한, 단백질의 임의의 바람직하지 못한 부작용 등을 감소시키거나 또는 없앨 수 있다. 이들 모이어티에 대한 고찰은 문헌 ([REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)])에서 찾을 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 다관능성 폴리펩티드는 항체가 아닌 NGF 또는 TNFα 결합성 도메인을 포함할 수 있다. 특정 단백질 표적과 고 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드를 확인 및 생성하기 위한 각종 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Skerra, Curr . Opin . Biotechnol ., 18:295-304 (2007)], [Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006)], [Gill et al., Curr. Opin . Biotechnol ., 17:653-658 (2006)], [Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008)], 및 [Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008)] 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 특정 측면에서, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 적합한 다관능성 폴리펩티드를 확인/생성할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자는 단백질 A, 리포칼린(lipocalin), 피브로넥틴 도메인, 안키린(ankyrin) 컨센서스 반복 도메인, 및 티오레독신(thioredoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포
본 개시내용은 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 추가로, NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 특정 측면에서 상기 폴리뉴클레오티드는 NGF 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하고 또한 TNFα 또는 그의 단편과 결합하는 펩티드 도메인을 코딩한다. 예를 들어, 본 개시내용은 항-NGF 항체 또는 그의 항원-결합성 단편을 포함하는 폴리펩티드 도메인; 및 TNFα 길항제, 예컨대 항-TNFα 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 또는 TNF 수용체, 예를 들어, TNFR2의 가용성 TNFα-결합성 부분을 포함하는 폴리펩티드 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고; 이는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥인 경우, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 다관능성 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 16, 18 또는 99의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 단편, 또는 서열식별번호: 16, 18 또는 99와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열, 또는 그의 단편을 포함한다.
본원에 기재된 단리된 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터, 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고, 이들 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현하는 방법까지 다양하다. 일부 측면에서, DNA 서열은 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성함으로써 재조합 기술을 이용하여 구축한다. 따라서, 본 개시내용은 상기 상세히 기재된 바와 같은 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 이관능성 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 추가로, NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
일부 측면에서 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 관심 다중특이적 결합성 분자, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 화학적 합성함으로써 구축할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 목적하는 다관능성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 근거하고, 관심 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선별하여 설계할 수 있다. 표준 방법을 적용하여, 관심 다관능성 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여, 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 추가로, 특별한 다관능성 폴리펩티드 또는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 부분을 코딩하는 몇 가지 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 이를 라이게이션할 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 상보적 어셈블리를 위한 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 함유한다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 정제를 허용해 주는 마커 서열과 동일한 판독 프레임 내에서 융합된 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커와 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유류 숙주 (예를 들어, COS-7 세포)가 사용되는 경우에 인플루엔자 적혈구응집소 단백질로부터 유래된 적혈구응집소 (HA) 태그일 수 있다.
본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 코딩 영역, 비-코딩 영역, 또는 둘 다에서의 변경을 추가로 함유할 수 있다. 일부 측면에서 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 야기시키는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경시키지는 않는다. 일부 측면에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전 코드의 축중(degeneracy)으로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 각종 이유, 예를 들어 특별한 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위하여 [인간 mRNA 내의 코돈을, 박테리아 숙주, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)에 의해 선호되는 것으로 변화시키기 위하여] 생성될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다. (합성, 부위-유도 돌연변이 유발 또는 또 다른 방법에 의해) 일단 어셈블리되면, 특별히 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 이를 목적하는 숙주에서 단백질의 발현에 적당한 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 본 개시내용은 이러한 벡터를 제공한다. 뉴클레오티드 서열 분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서의 생물학상 활성 폴리펩티드의 발현이 적당한 어셈블리를 확증시킬 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지되는 바와 같이, 숙주에서 고 발현 수준의 형질감염된 유전자를 수득하기 위해서는, 이러한 유전자가 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열과 작동가능하게 연결되어야만 한다.
특정 측면에서, 재조합 발현 벡터를 사용하여, NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절성 요소와 작동가능하게 연결된, 다관능성 폴리펩티드, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제 가능한 DNA 구축물이다. 전사 단위는 일반적으로, (1) 유전자 발현에 있어서 조절 역할을 하는 유전적 요소(들), 예를 들어, 전사 프로모터 또는 증강인자, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 다음에 상세히 기재되는 바와 같은, 적당한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함한다. 이러한 조절성 요소는 전사를 제어하기 위한 작동유전자 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제 기점, 및 형질전환체의 인식을 촉진시키기 위한 선택 유전자에 의해 부여된, 숙주에서 복제할 수 있는 능력이 부가적으로 혼입될 수 있다. DNA 영역들이 기능상 서로 관계가 있는 경우에는, 이들 DNA 영역이 작동가능하게 연결되어 있다. 예를 들어, 시그널 펩티드 (분비성 리더)에 대한 DNA가 특정 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우에는, 이러한 DNA가 상기 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동가능하게 연결되거나; 프로모터가 특정 코딩 서열의 전사를 제어하는 경우에는, 프로모터가 이러한 코딩 서열과 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 허용하도록 위치 설정되는 경우에는, 이러한 리보솜 결합 부위가 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 효모 발현 시스템에 사용하도록 의도된 구조적 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 해주는 리더 서열을 포함한다. 또 다른 한편으론, 리더 또는 수송 서열을 이용하지 않고서도 재조합 단백질이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 임의로, 최종 생성물을 제공하기 위하여 상기 발현된 재조합 단백질로부터 후속 절단될 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 좌우될 것이다. 광범위한 발현 숙주/벡터 조합을 이용할 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 이. 콜라이로부터의 플라스미드 (pCR1, pBR322, pMB9 및 그들의 유도체 포함), 보다 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대 M13 및 섬유상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
본 개시내용은 추가로, 본원에 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원에 제공된 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 적당한 프로모터의 제어하의 원핵생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스(bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 다음에 기재되는 바와 같은 포유류 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 세포-무함유 번역 시스템을 또한 이용할 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유류 세포성 숙주와 함께 사용하기에 적당한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 ([Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)]; 그의 관련 개시내용이 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있다. 항체 생성을 포함한 단백질 생성 방법에 관한 부가의 정보는, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2008/0187954, 미국 특허 번호 6,413,746 및 6,660,501, 및 국제 특허 공개 번호 WO 04009823 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에서 찾을 수 있다.
각종 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템이, 재조합 단백질을 발현하기 위해 유리하게 이용될 수도 있다. 포유류 세포에서 재조합 단백질의 발현을 수행할 수 있는데, 이는 이러한 단백질이 일반적으로, 정확하게 폴딩되고, 적당하게 변형되며 완전히 기능적이기 때문이다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 HEK-293 및 HEK-293T; 문헌 ([Gluzman (Cell 23:175, 1981)])에 기재된 원숭이 신장 세포의 COS-7 계통; 및 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함한 기타 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현될 유전자와 연결된 적합한 프로모터 및 증강인자, 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생성하기 위한 바쿨로바이러스 시스템은 문헌 ([Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)])에서 고찰된다.
본 개시내용은 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드를 생성하거나, 또는 NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 각각 포함하는 개개의 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 언급된 바와 같은 숙주 세포를, 상기 다관능성 폴리펩티드 또는 개개의 폴리펩티드의 발현을 증진시키는 조건하에 배양하는 단계, 및 이러한 다관능성 폴리펩티드 또는 개개의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 수반한다.
재조합 단백질을 장기간 고 수율로 생성하기 위해서는, 안정적인 발현이 적당하다. 예를 들어, 다관능성 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는 오히려, 적당한 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 증강인자, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별성 마커에 의해 제어된 DNA를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 강화된 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 다음, 선택 배지로 전환시킬 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선별성 마커는 선별에 대한 저항성을 부여해 주고, 세포가 상기 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정적으로 통합될 수 있도록 해주며, 결국에는 세포주 내로 클로닝 및 확장될 수 있는 병소를 형성하도록 성장시켜 준다. 상기 방법을 이용하여, 상기 다관능성 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 조작할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제시된 다관능성 폴리펩티드는 이러한 다관능성 폴리펩티드의 일시적 발현을 나타내는 세포주에서 발현된다. 일시적 형질감염은 특정 세포 내로 도입된 핵산이 이러한 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 통합되지는 않지만, 그 세포에서 염색체외 요소, 예를 들어 에피솜으로서 유지되는 과정이다. 에피솜의 핵산의 전사 과정은 영향을 미치지 않으며, 이러한 에피솜의 핵산에 의해 코딩된 단백질이 생성된다.
안정적이거나 일시적으로 형질감염된 세포주는 폴리펩티드의 발현 및 생성을 초래하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 세포 배양 배지 및 조건하에 유지시킨다. 특정 실시양태에서, 포유류 세포 배양 배지는, 예를 들어 DMEM 또는 햄스(Ham's) F12를 포함한 시판용 배지 배합물에 근거한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 배양 배지는 세포 성장과 생물학적 단백질 발현 둘 다의 증가를 지지하기 위해 변형된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 배양 배지", "배양 배지" 및 "배지 배합물"은 다세포 유기체 또는 조직의 외부에 있는 인공적 시험관내 환경에서의 세포의 유지, 성장, 증식 또는 확장을 위한 영양 용액을 지칭한다. 세포 배양 배지는, 예를 들어 세포성 성장을 증진시키도록 배합되는 세포 배양 성장 배지, 또는 재조합 단백질 생성을 증진시키도록 배합되는 세포 배양 생산 배지를 포함한, 특이적 세포 배양 용도를 위해 최적화시킬 수 있다. 용어 영양분, 재료, 및 성분은 세포 배양 배지를 구성하는 구성분을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
각종 실시양태에서, 세포주는 공급 배치식 방법을 이용하여 유지시킨다. 본원에 사용된 바와 같은, "공급 배치식 방법"은 공급 배치식 세포 배양물을 먼저, 기저 배지와 인큐베이션한 후에 이에 부가의 영양분을 공급하는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 공급 배치식 방법은 소정의 기간 내에 결정된 공급 스케줄에 따라서 보충 배지를 부가하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, "공급 배치식 세포 배양"은 세포, 전형적으로 포유류 세포, 및 배양 배지를 초기에 배양 용기에 공급하고, 부가의 배양 영양분을 연속적으로 또는 별개로 증가시키면서, 배양을 종결하기 전에 주기 세포 및/또는 생성물 수거를 동반하거나 동반하지 않으면서 배양 동안 배양물에 공급하는 세포 배양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기저 배지, 및 적어도 하나의 가수분해물, 예를 들어, 대두-기반 가수분해물, 효모-기반 가수분해물, 또는 변형된 기저 배지를 초래하는 2가지 유형의 가수분해물의 조합물을 포함한다. 부가의 영양분은 종종, 기저 배지, 예를 들어 농축된 기저 배지 만을 포함할 수 있거나, 또는 가수분해물, 또는 농축된 가수분해물 만을 포함할 수 있다. 적합한 기저 배지는 둘벡코(Dulbecco's) 변형 이글 배지 (DMEM), DME/F12, 최소 필수 배지 (MEM), 기저 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, .알파.-최소 필수 배지 (.알파.-MEM), 글래스고(Glasgow's) 최소 필수 배지 (G-MEM), PF CHO [예를 들어, CHO 단백질 무함유 배지 (시그마(Sigma)) 또는 CHO 세포 단백질-무함유에 대한 EX-CELL.TM. 325 PF CHO 혈청-무함유 배지 (SAFC 바이오사이언스(Bioscience))], 및 이스코브(Iscove's) 변형 둘벡코 배지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원의 기술에 사용될 수 있는 기저 배지의 다른 예는 BME 기저 배지 [깁코-인비트로젠 (Gibco-Invitrogen)]; 둘벡코 변형 이글 배지 (DMEM, 분말) (깁코-인비트로젠 (#31600))를 포함한다.
특정 실시양태에서, 기저 배지는 혈청 무함유 배지 [이는 배지가 혈청 (예를 들어, 태아 소 혈청 (FBS), 말 혈청, 염소 혈청, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 동물-유래 혈청)을 함유하지 않는다는 것을 의미한다], 또는 동물 단백질 무함유 배지 또는 화학적으로 규정된 배지일 수 있다.
기저 배지는 표준 기저 배지에서 발견되는 특정의 비-영양 성분, 예컨대 각종 무기 및 유기 완충제, 계면활성제(들), 및 염화나트륨을 제거하기 위해 변형시킬 수 있다. 기저 세포 배지로부터 상기 성분들을 제거하면, 남아있는 영양 성분의 농도를 증가시킬 수 있고, 전반적인 세포 성장과 단백질 발현을 개선시킬 수 있다. 또한, 세포 배양 조건의 요구 사항에 따라서 변형된 기저 세포 배지를 함유하는 세포 배양 배지 내로 생략된 성분을 다시 부가할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지는 변형된 기저 세포 배지, 및 다음 영양분들 중 적어도 하나를 함유한다: 철 공급원, 재조합 성장 인자; 완충제; 계면활성제; 삼투압 조절제; 에너지 공급원; 및 비-동물 가수분해물. 또한, 변형된 기저 세포 배지는 아미노산, 비타민, 또는 아미노산과 비타민 둘 다의 조합물을 임의로 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 기저 배지는 글루타민, 예를 들어, L-글루타민, 및/또는 메토트렉세이트를 추가로 함유한다.
일부 실시양태에서, 단백질 생산은 관련 기술분야에 공지된 공급-배치식, 배치식, 관류 또는 연속 공급 바이오반응기 방법을 이용하여 바이오반응기 공정에 의해 대량으로 수행된다. 대규모 바이오반응기는 적어도 50리터의 용량을 갖고 있고, 종종 약 500리터 초과 또는 1,000 내지 100,000리터의 용량을 갖고 있다. 이들 바이오반응기는 산소 및 영양분을 분배하기 위한 진탕 임펠러를 사용할 수 있다. 소규모 바이오반응기는 일반적으로, 대략 100리터 이하의 용적 용량의 세포 배양을 지칭하고, 약 1리터 내지 약 100리터의 범위일 수 있다. 또 다른 한편으론, 대규모 또는 소규모 배양을 위해 1회용 바이오반응기 (SUB)를 사용할 수 있다.
온도, pH, 진탕, 통기 및 접종물 밀도는 사용된 숙주 세포 및 발현될 재조합 단백질에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 세포 배양은 30 내지 45℃의 온도에서 유지시킬 수 있다. 배양 배지의 pH는 6.0 내지 8.0의 pH 범위 내에서, 특정의 숙주 세포에 대하여 최적의 수준에 머무르도록 배양 과정 동안 이러한 pH를 모니터링할 수 있다. 진탕을 위한 상기 배양 방법을 위해 임펠러 구동된 혼합을 사용할 수 있다. 임펠러의 회전 속도는 대략 50 내지 200 cm/sec 팁 속도일 수 있지만, 배양되는 숙주 세포의 유형에 따라서, 관련 기술분야에 공지된 다른 에어리프트 또는 다른 혼합/통기 시스템을 사용할 수 있다. 또한 배양되는 선택된 숙주 세포에 따라서, 배양물 중의 대략 20% 내지 80% 공기 포화도의 용존 산소 농도를 유지하기에 충분한 통기를 제공한다. 또 다른 한편으론, 바이오반응기는 공기 또는 산소를 상기 배양 배지 내로 직접 살포할 수 있다. 중공 섬유 막 통풍기를 이용하는 버블-없는 통기 시스템을 포함한, 산소 공급의 다른 방법이 존재한다.
단백질 정제
상기 언급된 바와 같은 형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라서 정제할 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술을 포함한다. 친화 태그, 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합성 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타치온-S-트랜스페라제를 단백질에 부착시켜, 적당한 친화 칼럼 상으로 통과시킴으로써 용이한 정제를 허용할 수 있다. 단리된 단백질은 또한, 단백질 분해, 핵 자기 공명 및 x선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 명확히 규명할 수 있다.
예를 들어, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상등액은 먼저, 시판용 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 농축시킬 수 있다. 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 음이온 교환 수지, 예를 들어 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기질을 이용할 수 있다. 상기 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 단백질 정제에 흔히 이용되는 다른 유형일 수 있다. 또 다른 한편으론, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환제는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 각종 불용성 매트릭스를 포함한다. 최종적으로, 소수성 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 매질, 예를 들어, 펜던트 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 RP-HPLC 단계를 이용하여 NGF-결합성 작용제를 추가로 정제할 수 있다. 전술된 정제 단계 중 일부 또는 전부를 각종 조합으로 또한 이용하여, 동질적 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
박테리아 배양에서 생성된 재조합 단백질은, 예를 들어, 세포 펠릿으로부터의 초기 추출에 이어, 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리할 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 최종 정제 단계에 이용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 이용된 미생물 세포는 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 붕괴, 또는 세포 용해제의 사용을 포함한, 임의의 편리한 방법에 의해 붕괴시킬 수 있다.
재조합 폴리펩티드를 정제하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 방법은 또한, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048, 및 2009/0187005 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 것을 포함한다.
사용 방법 및 제약 조성물
본 개시내용은 본원에 제공된 바와 같은, TNFα 및 NGF 길항제 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하거나, 또는 TNFα 길항제와 NGF 길항제를 공동-투여하는 것을 포함하는, 특정 대상체에게서 통증을 제어 또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 대상체는 인간이다.
본 개시내용은 추가로, 본원에 제공된 바와 같은, TNFα 및 NGF 길항제 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자를 포함하거나, 또는 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 길항제와 NGF 길항제의 조합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 이들 제약 조성물은 통증, 예를 들어, 신경병성 및 염증성 (예를 들어, 골관절염 또는 류미티스성 관절염) 통증을 치료하는 데 유용하다.
본원에 제공된 NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 포함하는 다관능성 폴리펩티드 및 조성물은 통증, 예를 들어, 신경병성 통증의 제어 또는 치료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 적용에 유용할 수 있다. 이러한 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다.
특정 측면에서, NGF-결합성 작용제 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩티드)를 이용하여 치료되는 질환, 장애, 또는 병태는 통증과 연관이 있다. 특정 측면에서, 이러한 통증은 만성 통각수용성 통증, 만성 하부 요통, 신경병성 통증, 암 통증, 포진 후 신경통 (PHN), 또는 내장통 병태와 연관이 있다.
본 개시내용은 통증 제어를 필요로 하는 대상체에게 신경 성장 인자 (NGF) 길항제 및 종양 괴사 인자 (TNFα) 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 (여기서, 이러한 투여는 단독으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 유효하게 상기 대상체에게서 통증을 제어할 수 있다), 상기 대상체에게서 통증을 제어하는 방법을 제공한다.
특정 측면에서, 상기 투여는 조합 요법으로서 NGF 길항제와 TNFα 길항제를 공동-투여하는 것이다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 개개의 성분들을 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 개개의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제는 본원에 제공된 임의의 NGF 또는 TNFα 길항제, 예를 들어, 가용성 NGF-결합성 TrkA 수용체 단편, 항-NGF 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, TNF 수용체, 예를 들어, TNFR-2의 가용성 TNFα-결합성 단편, 또는 항-TNFα 항체 또는 그의 단편, 예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 또는 이들 항체 중 임의의 것의 항원-결합성 단편일 수 있다.
상기 공동-투여는 통증을 제어하는 데 필요한 만큼의 상기 길항제 각각의 각종 용량을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 공동-투여는 개개의 요법으로서 정상적으로 투여되는 것보다 더 적은 용량 또는 덜 빈번한 용량의 각 성분을 포함함으로써, 부가의 안전성, 편의성 및 경제성을 제공할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 통증의 제어 방법은 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자를 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법에 사용하기 위한 예시 다관능성 폴리펩티드는 본원에 상세히 기재되어 있다. 본 개시내용에 근거하여, 상기 방법에 유용한 부가의 다관능성 폴리펩티드가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
단독으로 투여된 성분들 보다 "더 유효하게" 통증을 제어하는 것이란 조합 치료가 개별적으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 통증을 제어하는 데 있어서 더 유효하다는 것을 의미한다. 특정 측면에서, 및 다음에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 본원에 제공된 통증 제어 방법은 상승적 효능을 제공할 수 있는데, 예를 들어 NGF 길항제와 TNFα 길항제 둘 다의 투여 효과는 부가적 효과보다 더 클 수 있거나, 또는 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제 중 어느 것도 개별적으로 유효하지 않은 경우에도 유효할 수 있다. 특정 측면에서 상기 조합으로 인해 용량을 절약할 수 있는데, 예를 들어 공동-투여되는 경우에 개개의 성분의 유효 투여량은 개별적으로 투여된 어느 한 성분의 유효 용량보다 더 적을 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 통증 제어 방법은 단독으로 투여된 등가량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 상기 대상체에게서 통증을 제어하는 데 있어서 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 더 유효하다. 특정 측면에서, 대상체에게 공동-투여된 개개의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제의 투여량, 또는 본원에 제공된 이관능성 폴리펩티드의 투여시 제공된 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제의 상대적 용량은 단독으로 투여된 성분에 대해 필요한 투여량보다, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 적을 수 있다.
통증 제어의 효능은 환자에게 경험한 통증의 질과 세기를 상이한 등급 수에 따라서 평가해주기를 요청함으로써 측정할 수 있다. 구두로 전달받은 통증 등급은 통증이 전혀 없음, 순한 통증, 중간 수준의 통증, 및 심한 통증을 각각 0 내지 3의 스코어로 할당하여 글로 표기하였다. 또 다른 한편으론, 환자에게 자신의 통증을 0 (통증이 전혀 없음) 내지 10 (가능한 최악의 통증)의 수치적 통증 등급에 따라서 평가해주기를 요청할 수 있다. 시각 아날로그 척도 (VAS) 상의 수직선 또는 수평선에, 통증을 통증 없음 내지 가능한 최악의 통증으로 표기하였고, 그 환자에게 자신의 현재 통증 수준을 나타내는 지점을 선으로 표시하도록 요청하였다. 맥길(McGill) 통증 지수는 환자가 일련의 짧은 목록으로부터 자신의 통증을 가장 잘 설명하는 단어, 예를 들어 파운딩(pounding), 버닝(burning), 핀칭(pinching)을 선택함으로써 통증의 질과 세기 둘 다를 설명할 수 있게 해준다. VAS 또는 수치 등급을 이용하는 데 어려움을 경험한 성인에 대해서는 다른 통증 등급, 예를 들어 FACES를 사용할 수 있거나, 또는 구두로 표현하지 못하는 환자의 경우에는, 예를 들어 행위 평가 등급을 사용할 수 있다. 기능적 활동 스코어는 환자에게 통증있는 부위와 관련한 특정 임무를 수행하기를 요청함으로써 환자가 자신의 통증에 의해 어떻게 방해를 받는지에 관한 것이다. 이들 유형의 등급을 이용한 통증 스코어 상의 개선은 잠재적으로, 진통제의 효능 상의 개선을 표시할 것이다.
본원에 제공된 통증의 제어 방법에 따라서, 상기와 같이 투여하는 것이 통증 제어를 필요로 하는 대상체에게서 통증을 제어하는 데 충분한데, 예를 들어 NGF 길항제와 TNFα 길항제를 공동-투여하거나, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자를 투여하는 것이 상기 대상체에게서 통증을 예방, 저하, 완화, 또는 없앨 수 있다. 특정 측면에서, 통증은 급성 통증, 단기간의 통증, 지속적 또는 만성 통각수용성 통증, 또는 지속적 또는 만성 신경병성 통증일 수 있다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 및 NGF 길항제 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자, 또는 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 길항제와 NGF 길항제의 조합물을 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체, 부형제)과 조합함으로써, 저장 및 사용을 위한 제형을 제조한다 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적합한 제약상 허용되는 비히클은 무독성 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 항산화제 (아스코르브산 및 메티오닌 포함); 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용의 다관능성 폴리펩티드는 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라서 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제형화할 수 있다. 제형은 부형제, 또는 부형제의 조합물, 예를 들어 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액상 제형은 광범위한 폴리펩티드 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고형 제형은 동결건조, 분무 건조, 또는 예를 들어, 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제형 중 임의의 것이 동결건조된 제형이다.
구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 다관능성 폴리펩티드는 20 mM 인산나트륨, 50 mM L-아르기닌-HCL, 150 mM 슈크로스, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.5에서 제형화된다.
본원에 제공된 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위한 임의의 수의 방식으로 투여할 수 있다. 투여는 국소 투여 (예컨대, 질 및 직장 전달을 포함한 점막에 대함) (예컨대, 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 비말제, 좌제, 스프레이, 액상제 및 산제에 의함); 폐 투여 (예를 들어, 분무기에 의한 것을 포함한, 산제 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입; 기관내, 비내, 표피 및 경피에 의함); 경구 투여; 또는 비경구 투여 (정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입 포함); 또는 두개내 투여 (예를 들어, 척추강내 또는 심실내)일 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 TNFα 및 NGF 길항제 다관능성 폴리펩티드, 또는 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 길항제와 NGF 길항제의 조합물은 제약 조합 제형 내에서 또는 조합 요법으로서의 투여 요법에서, 항-통각수용성 특성을 갖는 제2의 (또는 제3의) 화합물과 추가로 조합될 수 있다.
통증을 치료하는 경우, 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 및 NGF 길항제 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자, 또는 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 길항제와 NGF 길항제의 조합물의 적당한 투여량은 치료 의사의 판단 하에 치료하고자 하는 통증의 유형, 통증의 중증도 및 과정, 통증의 반응성, 상기 다관능성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조합물이 치료 목적으로 투여되는지 아니면 예방 목적으로 투여되는 지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 등에 좌우된다. 상기 다관능성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조합물은 1회 투여되거나 또는 수일 내지 수개월 동안 지속되는 일련의 치료 기간에 걸쳐 투여되어 유효한 통증 제어를 유지할 수 있다. 최적의 투여 스케줄은 환자의 체내에서의 약물 축적을 측정함으로써 계산할 수 있고, 이는 개개의 항체 또는 폴리펩티드의 상대적 효력에 따라서 다양할 것이다. 투여 의사는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자, 또는 폴리펩티드 조합물 요법의 투여는 "상승 효과"를 제공할 수 있고, "상승적"인 것으로 입증될 수 있는데, 즉 활성 성분들을 함께 사용한 경우에 달성된 효과가 화합물들을 별도로 사용한 경우에 비롯되는 효과의 합보다 더 크다. 상승적 효과는 활성 성분들이 (1) 단일의 다관능성 융합 폴리펩티드로서 투여되는 경우; (2) 조합된 단위 투여 제형 내에 공동-제형화되고 투여되거나 또는 동시에 전달되는 경우; (3) 별도의 제형으로서 병행해서 또는 교대로 전달되는 경우; 또는 (4) 일부 다른 요법에 의해 투여되는 경우에 획득될 수 있다. 교대 요법으로 전달되는 경우에는, 화합물들을, 예를 들어 별도의 주사기에서 상이하게 주사함으로써, 순차적으로 투여 또는 전달하는 경우에 상승적 효과가 획득될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는, 각 활성 성분의 유효 투여량이 순차적으로 투여되는 반면, 조합 요법에서는 2가지 이상의 활성 성분의 유효 투여량이 함께 투여된다.
통증
가장 광범위한 활용에서, "통증"은 이를 경험하는 개체에 대해 고도로 주관적이고, 환경 및 문화적 배경을 포함한 개체의 정신적 상태에 의해 영향을 받는 경험적 현상을 지칭한다. "신체적" 통증은 통상적으로, 실제적 또는 잠재적 조직 손상의 원인인 제3자에게 지각될 수 있는 자극과 연계될 수 있다. 이러한 의미에서, 통증은 국제 통증 연구 협회 (IASP)에 따라서, "실제적 또는 잠재적 조직 손상과 연관되거나, 또는 이러한 손상 면에서 언급된 감각 및 정서적 경험"으로서 간주될 수 있다. 그러나, 통증의 일부 경우는 지각 가능한 원인이 없다. 예를 들어, 심인성 요인 또는 종종 지속적인 일련의 증상에 의한 기존의 신체적 통증의 악화를 포함한 심인성 통증이, 통증의 지각 가능한 원인의 어떠한 증거도 없는 심리적 장애가 있는 사람에게서 통증을 지각하게 하였다.
통증의 유형
통증은 통각수용성 통증, 신경병성/신경성 통증, 돌발 통증, 이질통증, 통각과민증, 감각과민, 감각장애, 감각이상, 통각과민, 환상 사지 통증, 심인성 통증, 무감각부위 통증, 신경통, 신경염을 포함한다. 기타 범주화는 악성 통증, 협심증성 통증, 및/또는 특발성 통증, 복합 부위 통증 증후군 I, 복합 부위 통증 증후군 II를 포함한다. 통증의 유형과 증상이 상호 배타적일 필요는 없다. 이들 용어는 IASP에 의해 정의된 바와 같이 의도된다.
통각수용성 통증은 유해 자극에 반응하여 말초 신경 내의 특수 감각 통각수용기에 의해 개시되어, 유해 자극을 활동 전위로 코딩한다. 일반적으로, Aδ 섬유 및 (다모드) C 섬유 상의 통각수용기는 피부 바로 아래, 힘줄, 관절 및 신체 기관에서 종결되는 자유 신경 말단이다. 배근 신경절 (DRG) 신경세포는 말초부와 척수 간의 소통 부위를 제공한다. 시그널이 척수를 통하여 뇌간 및 시상 부위로 프로세싱되고, 최종적으로는 대뇌 피질로 프로세싱되는데, 여기서 이는 통상적으로 (항상은 아니다) 통증의 감각 기능을 유도해낸다. 통각수용성 통증은, 일반적으로 통각수용기에서 통각수용성 활동을 유발시키는 데 필요한 세기의 특정 최소 한계치 이상인, 신체 조직을 자극하거나 또는 손상을 입힐 잠재력을 지닌 광범위한 화학적, 열적, 생물학적 (예를 들어, 염증성) 또는 기계적 사건으로부터 비롯될 수 있다.
신경병성 통증은 일반적으로, 말초 또는 중추 신경병성 통증을 각각 유발시키는, 말초 또는 중추 신경계 내의 비정상적인 기능에 따른 결과이다. 신경병성 통증은 IASP에 의해, 신경계 내에서의 원발성 병변 또는 기능이상에 의해 개시되거나 또는 유발되는 것으로서 정의된다. 신경병성 통증은 종종, 특히 만성 증례에서 신경계에 대한 실제적 손상과 관련이 있다. 염증성 통각수용성 통증은 일반적으로, 조직 손상의 결과이고, 이로써 비롯되는 염증성 과정이다. 신경병성 통증은 조직에 대해 관찰 가능한 임의의 손상을 명백히 치유한 후에도 (예를 들어, 수개월 또는 수년) 상당히 지속될 수 있다.
신경병성 통증의 증례에서는, 병에 걸린 부위로부터의 감각 프로세싱이 비정상적으로 될 수 있고, 정상적으로는 통증을 유발시키지 못하는 무해 자극 (예를 들어, 열, 접촉/압박)이 통증을 유발시킬 수 있거나 (즉, 이질통증) 또는 유해 자극이 정상적으로는 고통스러운 자극에 반응하여 악화된 통증 지각 (즉, 통각과민증)을 유발시킬 수 있다. 또한, 전기적 따끔거림 또는 쇼크 또는 "핀과 바늘"과 유사한 감각 기능 (즉, 감각이상) 및/또는 불쾌한 특성을 갖는 감각 기능 (즉, 감각장애)이 정상적인 자극에 의해서도 유발될 수 있다. 돌발 통증은 기존의 만성 통증의 악화이다. 통각과민은 특정 자극에 대한 비정상적으로 고통스러운 반응으로부터 비롯되는 고통스러운 증후군이다. 대부분의 증례에 있어서의 자극은, 환자가 통증으로서 인식할 수 있는 최소한의 통증 경험으로서 간주될 수 있는 통증 한계치를 증가시키면서 반복적이다.
신경병성 통증의 예는 촉각 이질통증 (예를 들어, 신경 손상 후 유도됨), 신경통 [예를 들어, 포진 후 (또는 대상포진 후) 신경통, 삼차 신경통], 반사 교감신경 이상증/작열통 (신경 외상), 암 통증의 구성 요소 (예를 들어, 암 그 자체 또는 관련 병태, 예컨대 염증으로 인한 통증, 또는 화학요법, 수술 또는 방사선 요법과 같은 치료로 인한 통증), 환상 사지 통증, 포착성 신경병증 (예를 들어, 손목굴 증후군), 및 신경병증, 예컨대 말초 신경병증 [예를 들어, 당뇨병, HIV, 만성 음주, 기타 독소에 대한 노출 (많은 화학요법 포함), 비타민 결핍, 및 다양한 기타 의학적 병태에 기인함]을 포함한다. 신경병성 통증은 각종 원인, 예를 들어 외과적 수술, 상처, 대상포진, 당뇨병성 신경병증, 다리 또는 팔의 절단, 암 등에 기인한 신경 손상 후 신경계의 병리학적 수술의 표출에 의해 유도된 통증을 포함한다. 신경병성 통증과 연관된 의학적 병태는 외상성 신경 손상, 뇌졸증, 다발성 경화증, 척수구멍증, 척수 손상 및 암을 포함한다.
통증-유발성 자극은 종종, 염증 반응을 유발시키는데, 이는 그 자체가 통증 경험의 원인일 수 있다. 일부 병태에서는, 통증이 통각수용성 인자와 신경병성 인자의 복합적 혼합에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 만성 통증은 종종, 염증성 통각수용성 통증 또는 신경병성 통증, 또는 둘 다의 혼합을 포함한다. 초기 신경계 기능이상 또는 손상은 염증성 매개인자의 신경 방출 및 후속 신경병성 염증을 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, 편두통은 신경병성 통증과 통각수용성 통증의 혼합을 나타낼 수 있다. 또한, 근막 통증은 근육으로부터의 통각수용성 유입에 대한 이차적인 것으로 추정되지만, 비정상적인 근육 활동은 신경병성 병태의 결과일 수 있다.
TNFα 및 NGF 길항제를 포함하는 키트
본 개시내용은 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는, 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 및 NGF 길항제 다관능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합성 분자, 또는 본원에 제공된 바와 같은 TNFα 길항제와 NGF 길항제의 조합물을 포함하는 키트를 제공한다. 특정 측면에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에, TNFα 길항제 및 NGF 길항제를 포함하는 적어도 다관능성 융합 폴리펩티드, 예를 들어 서열식별번호: 14 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 NGF 길항제, 예를 들어, MEDI-578, 및 TNFα 길항제, 예를 들어, 항-TNFα 항체, 예컨대 인플릭시맙 또는 아달리무맙, 또는 TNF 수용체의 TNFα-결합성 가용성 단편, 예를 들어, TNFR2-Fc의 조합물을 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 상기 개시된 TNFα 길항제 및 NGF 길항제가, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 상기 확립된 키트 포맷 중 하나 내로 용이하게 혼입될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
실시예
본 개시내용이 다음에 일반적으로 기재되긴 하지만, 이는 다음 실시예를 참조로 하여 보다 용이하게 이해될 것인데, 다음 실시예는 본 개시내용의 특정 측면 및 실시양태를 예시할 목적으로만 포함되고, 본 개시내용을 제한하지 않는다.
실시예 1 - 항 NGF scFv/TNFR2-Fc 다중특이적 결합성 분자의 구축 및 성상 확인
다관능성 분자, 구체적으로, 항 NGF 항체 도메인 및 TNFR2-Fc 도메인을 포함하는 다중특이적 결합성 분자를 다음과 같이 생성하였다. 항-NGF 항체 scFv 단편을 문헌 ([Dimasi, N., et al., J Mol Biol . 393:672-92 (2009)], 및 PCT 공개 번호 WO 2013/070565)에 기재된 Bs3Ab 포맷에 따라서, 중쇄 CH3 도메인을 통하여 TNFR2-Fc 융합 단백질 (서열식별번호: 13)의 C-말단과 융합시켰다. 그 구조의 다이어그램이 도 1에 도시되어 있다. TNFR2-Fc 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 구축물 및 상기 다중특이적 결합성 분자를 코딩하는 DNA 구축물을 진아트 (GeneArt; 인비트로젠)에 의해 합성하였다. 다중특이적 결합성 분자의 경우에는, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3 (서열식별번호: 15)을 통하여 함께 연결된 MEDI-578의 VH (서열식별번호: 3) 및 VL (서열식별번호: 7) 도메인을 포함하는 항-NGF scFv를 구축하였다. 이러한 scFv의 N-말단을, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)2을 통하여 서열식별번호: 13의 C-말단과 융합시켰다. 이러한 다중특이적 결합성 분자가 본원에서 TNFR2-Fc_VH#4로서 지칭된다. 상기 다중특이적 결합성 분자를 코딩하는 DNA 구축물을, Bs3Ab 발현 벡터 내로 클로닝하기 위하여 3' 말단에 EcoRI 제한 부위 및 중지 코돈을 함유하도록 조작하였다. TNFR2-Fc_VH#4를 코딩하는 DNA 서열이 서열식별번호: 16으로서 제시되고, 그의 아미노산 서열은 서열식별번호: 14로서 제시된다.
TNF-NGF 다중특이적 결합성 분자의 열안정성은, 이러한 다중특이적 결합성 분자의 MEDI-578 scFv 부분의 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 쇄간 디술피드 결합을 부가함으로써 개선시켰다. 이는 VH 도메인의 아미노산 44에 G->C 돌연변이를 도입하고 (서열식별번호: 94), VL 도메인의 아미노산 102에 G->C 돌연변이를 도입함으로써 (서열식별번호: 95) 수행되었다. 이 클론은 TNFR2-Fc_varB로 지명되었다. TNFR2-Fc_varB의 아미노산 서열이 서열식별번호: 17로서 제시된다. TNFR2-Fc_varB를 코딩하는 DNA 서열이 서열식별번호: 18로서 제시된다. TNFR2-Fc_varB를 코딩하는 코돈 최적화 DNA 서열이 서열식별번호: 99로서 제시된다. TNFR2-Fc_varB는 추가로, 상기 scFv 부분의 VH와 VL을 연결하는 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3을 20개 아미노산 링커 (GGGGS)4 (서열식별번호: 19)로 대체한다는 점에서 TNFR2-Fc_VH#4와 상이하다. 시차 주사 열량측정법 (DSF)을 이용하여 TNFR2-Fc_VH#4 및 TNFR2-Fc_varB의 Tm을 측정하였다. 이 방법은 상승 온도에 대한 노출시 단백질 도메인 중첩풀림 동안 드러난 소수성 표면과 결합하는 형광성 염료인 시프로 오렌지 (Sypro Orange; 인비트로젠)의 혼입량을 측정한다. DSF 검정에서, TNFR2-Fc_VH#4의 Tm은 62℃인 반면, TNFR2-Fc_varB의 Tm은 66℃였다. 따라서, 상기 다중특이적 분자의 MEDI-578 scFv 부분에 쇄간 디술피드 결합을 부가하는 것이 상기 분자의 열안정성을 4℃ 개선시켰다.
TNFR2-Fc 단백질 및 TNFR2-Fc_VH#4를, 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민 (PEI) [폴리사이언스(Polysciences)]을 이용하여 현탁 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 상기 세포를 CD-CHO 배지 [라이프 테크놀로지(Life Technologies)]에서 유지시켰다. 소규모 형질감염으로부터의 배양 수거물을, 제조업자의 프로토콜 [GE 헬스케어(Healthcare)]에 따라서 1 ml 하이트랩 맵셀렉트 슈레(HiTrap MabSelect SuRe™) 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하고, 연속해서 1% 슈크로스, 100 mM NaCl, 25 mM L-아르기닌 히드로클로라이드, 및 25 mM 인산나트륨 (pH 6.3)에서 완충제 교환하였다. 재조합 단백질은 순도는 환원성 조건하에 SDS-PAGE를 이용하고 분석적 크기-배제 크로마토그래피 (하기 방법 참조)를 이용하여 분석하였고, 이론적으로 결정된 흡광 계수를 이용하여 280 nm 하에서의 흡광도를 판독함으로써 농도를 결정하였다.
TNFR2-Fc 융합 단백질 및 TNF-NGF 다중특이적 구축물인 TNFR2-Fc_VH#4를 소규모로 일시적 발현시키고 단백질 A 칼럼 정제하면, 각각 36.6 및 79.9 mg L-1의 산출량이 생성되었다.
보다 큰 배치의 TNFR2-Fc_VH#4가 다음과 같이 생성되었다. 대규모 형질감염 (6 L 이하)으로부터의 조악한 배양 수거물을, 심층 여과를 이용하여 여과하였고, 이를 완충제 A (인산염 완충 식염수 pH 7.2)로 미리-평형시킨 1.6 x 20 cm 단백질 A 아가로스 칼럼 (GE 헬스케어) 상으로 부하하였다. 이어서, 상기 칼럼을 완충제 A로 세척하고, 생성물을 완충제 B (50 mM 소듐 아세테이트 pH <4.0)의 단계 구배로 용출시켰다. 생성물을, 완충제 C (50 mM 소듐 아세테이트 완충제 pH<5.5)에서 미리 평형시킨 1.6 x 20 cm 포로스(Poros) HS 50 칼럼 [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)] 상으로 부하함으로써 추가로 정제하고, 완충제 C에서 세척한 다음, 연속해서 상기 생성물을 50 mM 소듐 아세테이트 완충제 pH <5.5에서 0 내지 1 M NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 이로써 생성된 용출액을 크기 배제 HPLC에 의해 분석하였다. 1.36의 계산된 흡광 계수를 이용하여 베크만(Beckman) DU520 분광광도계로 A280 분광분석함으로써 단백질 농도를 결정하였다.
TNFR2 - Fc _ VH #4의 성상 확인 방법
표준 프로토콜을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 제조업자의 지시에 따라서 엑스셀 슈레록(Xcell SureLock™) 시스템 (인비트로젠)을 이용하여 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막 (라이프 테크놀로지) 상으로 옮겼다. 이 막을 실온에서 1시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 3% (w/v) 탈지 분유로 차단시켰다. HRP-접합된 항-인간 IgG Fc-특이적 항체 (시그마)를 이용하는 표준 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯을 전개하였다.
1 ml/min의 유속으로 D-PBS (라이프 테크놀로지)의 이동 상을 수반한 페노메넥스(Phenomenex) BioSep-SEC-S3000 (300 x 7.8 mm) 칼럼이 장착된 길슨(Gilson) HPLC 시스템 (동용매 펌프-307, UV/Vis-151 검출기, 액체 핸들러-215 및 주사 모듈-819)을 이용하여 크기 배제 HPLC를 수행하였다. 25 μL 샘플을 상기 칼럼 상으로 주사하고, 단백질 종의 분리를 A280 nm 하에 모니터링하였다.
소규모로 정제된 TNFR2-Fc_VH#4의 효소적 탈글리코실화를, 제조업자의 프로토콜에 따라서 EDGLY 키트 [시그마 알드리히(Sigma Aldrich)]를 이용하여 수행하였다. 단백질을 변성 조건과 천연 조건 둘 다 하에 탈글리코실화하였다. 변성 단백질의 경우에는, 30 μg의 단백질을 37℃ 하에 3시간 동안 PNGase F, O-글리코시다제, 및 α-(2→3, 6, 8, 9)-뉴라미니다제, β-N-아세틸글루코사미니다제 및 β-(1→4)-갈락토시다제로 탈글리코실화하였다. 천연 조건하에서는, 35 μg의 단백질을 37℃ 하에 3일 동안 상기와 동일한 세트의 효소를 이용하여 탈글리코실화하였다. 이와 같이 탈글리코실화된 단백질을 쿠마시(coomassie) 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 표준 검정 프로토콜을 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
TNFR2-Fc_VH#4의 N-말단 아미노산 서열 분석을 다음과 같이 수행하였다. 대략 2 μg의 TNFR2-Fc_VH#4를, 표준 프로토콜을 이용하여 SDS-PAGE 겔 상에서 수행하였다. 제조업자의 지시에 따라서 엑스셀 슈레록™ 시스템 (인비트로젠)을 이용하여 단백질을 PVDF 막 상으로 옮겼다. 이 막을 궤도 진탕 플랫폼 상에서 대략 15분 동안 0.1% (w/v) 아미도블랙으로 염색한 다음 dH2O로 세척하여, 상기 PVDF 막의 배경 염색을 감소시켰다. 상기 막을 N-말단 서열 분석하기에 앞서 공기-건조시켰다. 관심 밴드를 커팅하고, 다중특이적 결합성 분자의 N-말단의 서열 결정을, 어플라이드 바이오시스템즈 140A 마이크로 HPLC를 이용하여 온라인 페닐티오히단토인 분석과 함께 어플라이드 바이오시스템즈 494 HT 서열 분석기 (어플라이드 바이오시스템즈; 미국 캘리포니아주 샌프란시스코) 상에서 수행하였다.
성상 확인 결과
정제된 TNFR2-Fc_VH#4 및 TNFR2-Fc 단백질을, 집합체, 단량체 및 단백질 단편화의 수준에 관하여 SEC-HPLC함으로써 프로파일링하였다 (도 2A 및 2B). 총 단백질의 대략 90%를 차지하는 단량체를 포함하는 주요 피크는 단백질 질량의 나머지 대략 10%가 고차 종 또는 접합체의 존재를 표시하는 하부 칼럼 체류 시간을 동반한다는 것을 나타낸다. 그러나, SEC-HPLC로부터의 단량체 피크는 이러한 피크 내의 단백질이 단일 종이 아니었다는 사실을 표시하는 2개의 명백한 어깨 모양을 갖고 있었다. 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE 분석 결과, 환원성 조건하에 (대략 100 및 75 kD에서) TNFR2-Fc_VH#4에 대한 2개의 별개의 밴드가 나타났고, 유사하게 (대략 70 및 45 kD에서) TNFR2-Fc 융합 단백질에 대한 2개의 별개의 밴드가 또한 나타났다 (도 2B). 비-환원성 조건 하에서는, TNFR2-Fc_VH#4에 대한 3개의 주요 밴드가 150 kD와 250 kD 사이에 제시되었고, TNFR2-Fc 융합 단백질에 대해서는 1개의 주요 밴드와 1개의 작은 밴드가 각각 대략 150 kD와 120 kD에서 제시되었다. 환원성 조건하에 상기 두 밴드 간의 분자량 차이가 scFv 단편의 크기 (대략 26.5 kD)에 대략 등가이기 때문에, 다중특이적 결합성 분자를 형성하는 것이 생성되었는지를 이해하기 위해 추가의 분석을 수행하였다. 천연 조건하에 질량 분광 분석한 결과, 2개의 별도의 정제된 단백질 제제의 경우에는 정제된 TNFR2-Fc_VH#4 제제에 존재하는 3개의 분자량이 대략 125, 152 및 176 kD에 있었다는 SDS-PAGE 데이터를 확증하였다 (도 2C).
SDS-PAGE 겔에 의해 관찰된 밴딩 패턴이 TNFR2-Fc_VH#4의 차등 글리코실화에 기인한 경우에는, 탈글리코실화시 상기 패턴이 분해되어 단일 밴드로 되돌아갈 것이다. 그러나, TNFR2-Fc_VH#4를 천연 단백질로서 또는 변성 단백질로서 탈글리코실화한 경우에는, 환원성 조건과 비-환원성 조건 둘 다하에 상기 밴딩 패턴이 유지되었다 (데이터는 제시되지 않음). 글리코실화 TNFR2-Fc_VH#4와 탈글리코실화 TNFR2-Fc_VH#4 둘 다를 폴리클로날 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 웨스턴 블롯 염색한 결과, 완전한 길이의 예상 밴드와 보다 저 분자량 밴드 둘 다가 항-Fc 특이적 항체와 반응성인 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
상기 단백질의 N-말단 아미노산을 서열 분석함으로써, 말단절단된 생성물을 최종 확인하였다. 그 결과, 이러한 말단절단된 단백질의 N-말단의 처음 8개 아미노산이 TNFR2-Fc_VH#4 서열 (서열식별번호: 14)의 아미노산 176 내지 183에 상응하는 SMAPGAVH인 것으로 밝혀졌다. 이는 TNFR2-Fc_VH#4의 N-말단에서의 175개 아미노산 말단절단물을 나타냈는데, TNFR2 도메인의 42개 아미노산만이 남게 되었다. 이로써, 본 발명자들은 SDS-PAGE, 질량 분광분석법 및 SEC-HPLC 분석으로부터 질량 데이터를 정확하게 해석할 수 있었다. TNFR2-Fc_VH#4 이량체의 3가지 가능한 조합이 있었고, 이들 모두는 정제된 단백질 제제에 존재하였다: (1) 완전한 길이의 동종이량체, (2) 완전한 길이와 말단절단된 종의 이종이량체, 및 (3) 말단절단된 종의 동종이량체. 시험관 내와 생체 내 둘 다에서의 생물학적 활성을 정확하게 측정하기 위하여, 완전한 길이의 동종이량체의 제제를 2-단계 칼럼 크로마토그래피 공정에 의해 생성하였다. 첫 번째 단계에서는, 단백질 A 정제 후, 생성물이 80.5% 단량체를 함유하였고 (도 3A), 두 번째 칼럼 정제 단계 (SP 세파로스) 후에는 단량체 비율이 97.8%였다 (도 3B). 전체 공정에 걸친 수율은 7.3%였다.
실시예 2 - 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의한 열 안정성 분석
자동화 마이크로칼(MicroCal) VP-모세관 DSC (GE 헬스케어; 미국)를 열량 측정에 사용하였다. 단백질 샘플을 25 mM 히스티딘/히스티딘-HCl 완충제 pH 6.0에서 1 mg/mL으로 시험하였다. 이러한 단백질 샘플과 완충제에, 시간당 95℃의 속도로 25℃에서 100℃ 까지의 선형 열 램프를 적용하였다. 오리진(Origin) 7 소프트웨어를 이용하여 상기 완충제를 단백질 샘플로부터 참조물로서 공제하고, 열 전이를 결정하였다.
TNFR2-Fc_VH#4에 대한 자기온도 기록도 (도 4)는 64, 67, 및 84℃의 변성 온도 (Tm)를 이용한 3가지 별개의 중첩풀림 전이를 나타낸다. 본 발명자들은 64℃의 Tm이 TNFR2 도메인과 항-NGF scFv 도메인 둘 다의 변성에 상응하고, 67℃ 및 84℃의 Tm은 IgG1 CH2 및 CH3 도메인 각각에 대한 전형적인 변성 Tm이라고 추론하였다 (예를 들어, 문헌 [Dimasi, N., et al., J Mol Biol . 393:672-92 (2009)], 및 PCT 공개 번호 WO 2013/070565). 특정 이론에 얽매이는 것는 아니지만, scFv는 일반적으로, 다른 항체 도메인보다 더 낮은 변성 온도를 가지며, 그들의 중첩풀림은 단일 전이 현상에 의해 명확히 규명된다 (Roberge et al., 2006, Jung et al., 1999, Tischenko et al., 1998).
실시예 3 - TNFR2-Fc_VH#4에 대한 항원 결합의 확증
A. ELISA에 의한 단일 및 이중 항원 결합
눈크 맥시소르프(Nunc Maxisorp) 웰을 4℃하에 밤새, PBS (pH 7.4) 중에서 5 μg ml- 1 로 희석된 50 ㎕의 TNFα [R&D 시스템즈(Systems)]로 코팅하였다. 그 다음날, 코팅 용액을 제거하고, 웰을 실온 하에 1시간 동안 150 ㎕의 차단 완충제 [3% 탈지유-PBS]로 차단시켰다. 상기 웰을 PBS에서 3회 세정한 후, 차단 완충제에서 만든 TNFR2-Fc_VH#4의 희석 시리즈 50 ㎕를 부가하였다. 실온에서 1시간 후, 상기 웰을 PBS-트윈(Tween) 20 (0.1% v/v; PBS-T)에서 3회 세척하였다. 이어서, 50마이크로리터의 바이오티닐화 NGF를 상기 웰에 가하고, 실온하에 1시간 더 인큐베이션한 후, 상기와 같이 세척하고 50 ㎕의 스트렙타비딘-HRP (1:100)를 부가하였다. 실온하에 1시간 후, 상기 웰을 PBS-T로 세척하고, 50 ㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질을 부가하였으며, 그 색상을 전개할 수 있었다. 1 M H2SO4를 부가함으로써 상기 반응을 중지시키고, 미세역가 판 판독기를 이용하여 450 nm 하에서의 흡광도를 측정하였다. 이로써 생성된 데이터를, 프리즘(Prism) 5 소프트웨어 [그래프패드 (GraphPad; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)]를 이용하여 분석하였다. 단일 항원 결합 ELISA를 위해, 상기 웰을 상기와 같이 TNFα 또는 NGF-바이오틴으로 코팅하고, 항-인간 IgG Fc 특이적 HRP 접합된 항체 (1:5000)를 이용하여 항체 결합을 검출하였으며, 색상을 상기와 같이 전개하였다.
그 ELISA 결과가 도 5에 도시되어 있다. TNFR2-Fc_VH#4는 TNFα 항원과 NGF 항원 둘 다와 결합하도록 설계되었다. 단일 항원 결합은 먼저, 하나의 항원을 96-웰 미세역가 판 상으로 고정화시킨 다음, TNFR2-Fc_VH#4의 일련의 희석물을 부가함으로써 수행하였다. 서양고추냉이 페록시다제 (HRP)-접합된 항-IgG Fc 특이적 항체를 이용함으로써 특이적 결합을 탐지하였다. 이중 항원 결합 ELISA를 위해, 첫 번째 항원인 TNFα를 ELISA 판 상에 고정화시킨 다음, TNFR2-Fc_VH#4의 일련의 희석물을 부가한 후, 두 번째 바이오티닐화 항원인 NGF를 고정된 농도로 부가하였다. 이어서, HRP-접합된 스트렙타비딘을 이용하여 특이적 결합을 탐지하였다. TNFR2-Fc_VH#4는 단일 항원 결합 ELISA에서 TNFα 및 NGF와 결합되었다 (도 5A 및 B). 이중 항원 결합 ELISA에서는, TNFR2-Fc_VH#4가 TNFα와 NGF 둘 다와 동시에 결합되었다 (도 5C).
B. 표면 플라스몬 공명에 의한 동시 항원 결합
비아코어 2000 기기 (GE 헬스케어)를 이용하여 본질적으로 문헌 ([Dimasi, N., et al., J Mol Biol . 393:672-92 (2009)])에 기재된 바와 같이, 동시 항원 결합 실험을 수행하였다. 간략하게 언급하면, CM5 센서 칩을 이용하여, 100 nM 하에서 대략 1,500 공명 단위의 TNFR2-Fc_VH#4를 고정화시켰다. 이어서, TNFα와 NGF에 대한 공동 결합을 위해 상기 센서 칩 표면을 사용하였다. 상기 항원은 HBS-EP 완충제 [10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 0.005% P20]에서 제조하였다. 30 ㎕/min의 유속을 모든 결합 측정에 사용하였다. TNFα 및 NGF에 대한 다중특이적 항체의 동시 결합을 결정하기 위하여, 1 μM의 TNFα (분자량, 17.5 kD)를 센서 칩 표면 상으로 주사하였고, 주사를 완료하면, TNFα와 NGF (분자량, 13.5 kD)의 혼합물 (둘 다 1 μM)을 주사하였다. TNFα가 NGF와의 혼합물에 포함되어, NGF 결합 상 동안 TNFα 해리에 기인한 시그널 손실을 방지하였다. 대조군으로서, 유사한 결합 과정을 수행하였고, 마지막 주사에서는 TNFα 만을 부가하였는데, 이러한 주사에 대한 공명 단위 상의 추가 증가가 없다는 것은 TNFα가 포화 수준에서 결합되었다는 것을 표시하였다. TNFα와 NGF의 주사 순서를 역전시킨 유사한 결합 및 대조군 실험을 수행하였다.
TNFR2-Fc_VH#4의 동시 항원 결합은 표면 플라스몬 공명에 의해 명확히 규명되었다. 이러한 결합 현상은 순차적 방식으로 정성적으로 분석하였다. TNFR2-Fc_VH#4를, 아민 커플링 화학을 이용하여 센서 칩 표면 상으로 공유적으로 고정화시켰다. 연속해서, 첫 번째 항원을 주사하여, TNFR2-Fc_VH#4에 대한 포화 수준의 결합을 제공한 다음, 두 번째 항원을 항원 1과 등몰 혼합물로서 주사하였다. 결합 센서그램(sensorgram)은 TNFR2-Fc_VH#4가 TNFα 및 NGF와 동시에 결합하였다는 사실을 명백하게 보여주었다 (도 6). 상기 두 항원의 동시 결합은 항원 주사 순서에 관계없이 일어났다.
실시예 4 - NGF에 의해 유도된 TF-1 세포 증식의 억제
TF-1 세포 (ECACC 카탈로그 번호 93022307)를 96 웰 조직 배양 판 [코닝 코스타르(Corning Costar)] 내의 50 ㎕ 혈청 무함유 배양 배지에서 1.5 x104개 세포/웰로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO2 하에 18시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 인간 (시그마) 또는 마우스 NGF (R&D 시스템즈)를 96 웰 환저 판 [그라이너(Greiner)]에서 37℃ 하에 30분 동안 TNFR2-Fc_VH#4, MEDI-578 IgG1 TM YTE, MEDI-578에 대한 비-결합성 IgG1 TM YTE 이소형 대조군, 또는 비-결합성 이중특이적 이소형 대조군 R347 Bs3Ab의 희석물과 미리 인큐베이션하였다. 이어서, 50마이크로리터의 각 샘플을 세포 판에 가하고, 37℃ 하에 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 기간 후, 100 ㎕의 세포 TITRE GLO® 검정 완충제 [프로메가(Promega)]를 가하고, 상기 판을 37℃ 및 5% CO2 하에 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 표준 발광 프로토콜을 이용하여 발광을 측정하였다. 항체의 부재하에서의 표준 NGF-유도된 TF-1 증식이 도 7a에 도시되어 있다.
NGF 유도된 TF-1 증식을 이용하여, TNFR2-Fc_VH#4의 기능적 활성을 결정하였다. TNFR2-Fc_VH#4는 인간과 뮤린 NGF 유도된 증식 둘 다를 완전히 억제할 수 있었다 (각각 도 7b 및 7c). 도 7b: TF-1 세포를 EC80 농도에 상응하는 재조합 인간 NGF로 자극하였다. 세포를 48시간 동안 일련의 항체 희석물을 수반한 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 세포 TITRE GLO® 검정 완충제 (프로메가)와 함께 10분 동안 배양함으로써 세포 증식을 정량화하였다. 도 7c: TF-1 세포를 EC80 농도에 상응하는 재조합 뮤린 NGF로 자극하였다. 세포를 48시간 동안 일련의 항체 희석물을 수반한 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 세포 TITRE GLO® 검정 완충제 (프로메가)와 함께 10분 동안 배양함으로써 세포 증식을 정량화하였다. 이들 데이터는 TNFR2-Fc_VH#4의 NGF 억제성 부분이 생물학상 활성이고, IgG1TM으로서의 MEDI-578과 유사한 효력으로 NGF 유도된 증식을 억제한다는 것을 입증해준다. 유사한 데이터가 또한, TNFR2-Fc_varB 및 또 다른 TNF-NGF 다중특이적 결합성 분자 엔디맙 var B에 대하여 관찰되었다 (도 7d & 7e). 엔디맙 varB는 완전한 항-TNFα 항체, 즉 2개의 완전한 중쇄와 2개의 완전한 경쇄를 H2L2 포맷으로 포함하는 항체를 포함하는데, MEDI-578 scFv는 항-TNFα 항체의 중쇄의 C-말단과 융합된다. 엔디맙 varB의 경쇄가 서열식별번호: 20에 제시되고, 엔디맙 varB의 중쇄는 서열식별번호: 22에 제시된다.
실시예 5 - TNFα에 의해 유도된 U937 세포 아폽토시스의 억제
U937 세포 (ECACC 카탈로그 번호 85011440)를 50 ㎕ 배양 배지에서 8x105개 세포/웰의 농도로, 흑색 벽으로 된 96 웰 조직 배양 판 (코닝 코스타르)에 플레이팅하였다. U937 세포를 EC80 농도에 상응하는 재조합 인간 TNFα로 자극하였다. 세포를 2시간 동안 일련의 항체 희석물을 수반한 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 카스파제 3 검정 반응 완충제와 함께 2시간 동안 배양함으로써 카스파제 3 활성을 정량화하였다. TNFR2-Fc_VH#4, 비-결합성 이중특이적 이소형 대조군, R347 Bs3Ab, 및 에타네르셉트를 37℃ 하에 30분 동안 상기 세포와 미리 인큐베이션하였다. 이어서, 50 ㎕ 재조합 인간 TNFα (R&D 시스템즈)를 부가하여 20 ng/ml의 최종 검정 농도를 수득하였고, 연속해서 37℃ 하에 2시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 50 ㎕의 카스파제 3 검정 반응 완충제 [0.2% w/v CHAPS, 0.5% v/v 이게팔(Igepal) CA-630, 200 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 μM DEVD-R110 기질 (인비트로젠)]를 가하고, 세포를 37℃ 하에 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 475 nm 하에서의 여기 및 512 nm 하에서의 발광에 의해 형광을 측정하였다. TNFα 길항제의 부재 하에서의 카스파제 활성이 도 8a에 도시되어 있다.
U937 세포에서 TNFα 유도된 카스파제 3 활성 검정을 이용하여, TNFR2-Fc_VH#4의 기능적 활성을 결정하였다. TNFR2-Fc_VH#4는 에타네르셉트와 마찬가지로, TNFα 유도된 카스파제 3 활성을 완전히 억제하였다 (도 8b). 이는 TNFR2-Fc_VH#4의 TNFα 억제성 부분이 생물학상 활성이고 에타네르셉트와 유사한 효력을 지니고 있다는 사실을 명백하게 예시한다. 유사한 데이터가 또한, TNFR2-Fc_varB 및 엔디맙 varB에 대하여 관찰되었다 (도 8c 참조).
실시예 6 - 생체내 검정
모든 생체내 과정을 영국 내무성 동물 (과학적 절차) 법률 (1986)에 따라서 수생하였고, 이는 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 암컷 C57Bl/6 마우스 [찰스 리버 (Charles River; 영국)]를 내내 사용하였다. 마우스를 12-시간씩 밝게 하고/어둡게 하는 주기 (07:00-19:00에 밝게 함) 하에 음식물과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 개별적으로 통기되는 우리 (IVC)에서, 한 우리당 5/6마리씩 무리지어 사육하였다. 사육 및 처치 룸을 24℃로 유지시키고, 종래의 무선국을 통하여 일정한 배경 소음을 유지시켰다. 각 연구를 시작하기 적어도 5일 전에 확인 목적을 위하여 모든 마우스에게 마취 (산소 중 3% 이소플루란) 하에 트랜스폰더(transponder)의 삽입을 진행하였다.
A. 신경병성 통증의 셀처 (Seltzer) 모델
아날지세미터(analgysemeter)를 이용하여 기계적 통각과민증을 결정하였다 (Randall LO, Selitto JJ, Arch Int Pharmacodyn Ther . 111:409-19 (1957)) [우고 바슬(Ugo Basile)]. 결과적으로 철회 반응이 관찰될 때까지 각 뒷발의 등쪽면에 힘을 증가시키면서 적용하였다. 이 시점에 힘의 적용을 중단하고, 체중 (그램)을 기록하였다. 데이터는 동측 및 반대측 발에 대한 철회 한계치 (그램)로서 표현되었다. 기준선 판독치의 확립 후에, 마우스를 대략적으로 동등한 동측/반대측 비율을 갖는 2개 군으로 나누고 수술을 진행하였다. 마우스를 3% 이소플루란으로 마취시켰다. 그 다음, 중간 허벅지 수준에서의 절개를 통하여 무디게 해부함으로써 대략 1 cm의 왼쪽 좌골 신경을 노출시켰다. 이어서, 봉합사 [10/0 버진 실크(Virgin Silk): 에티콘(Ethicon)]가 신경의 등쪽 3분의 1을 관통하여 단단히 묶었다. 접착제를 이용하여 상기 절개부위를 밀봉하고, 시험을 시작하기 전 적어도 7일 동안은 마우스가 회복되게 하였다. 모의 수술한 마우스에게는 신경의 노출 후에 그 상처를 접착제로 붙이고 회복시킨 것을 제외하고는 상기와 동일한 프로토콜을 진행하였다. 마우스를 대상으로 하여 수술 후 7일 및 10일째에 통각과민증에 관하여 시험하였다. 10일째 시험한 후, 수술한 마우스를 추가로 여러 군으로 세분하였는데, 이들 군에게는 CAT251 IgG1 이소형 대조군 (0.03 mg/kg s.c.), 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) 또는 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.)와 MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.)의 조합물을 투여하였다. 모의 수술한 마우스 모두에게는 CAT251 (0.03 mg/kg s.c.)을 투여하였다. 투여 후 4 h, 1일, 2일, 3일, 4일 및 7일째에 기계적 통각과민증을 측정하였다.
기계적 통각과민증 모델에서 에타네르셉트와 MEDI-578을 공동-투여하면, 모의 수술한 대조군과 비교해서 수술 후 10일째에 동측/반대측 비율이 상당히 감소한 것으로 나타났다 (도 9). 단일 용량의 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.) 또는 MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.)을 투여하면, 이러한 통각과민증을 상당히 역전시키지 못하였다. 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.)를 MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.)과 함께 공동-투여하면, 투여 후 4 h째에 기계적 통각과민증이 상당히 역전되었고, 그 효과는 투여 후 7일까지 지속적으로 유지되었다.
두 번째 연구에서는, TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 평가하였다. 기계적 통각과민증을 확립시킨 후, 수술 후 13일째에 마우스에게 R347 Bs3Ab 이소형 대조군 (0.03 mg/kg s.c.), 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.) 또는 TNFR2-Fc_VH#4 (0.01 mg/kg 또는 0.03 mg/kg s.c.)를 투여하였다. 모의 제조된 동물에게는 R347 Bs3Ab 이소형 대조군 (0.03 mg/kg s.c.)을 투여하였다. 마우스를 대상으로 하여 상기 언급된 바와 같이 투여 후 4 h째 및 투여 후 1, 2, 4 및 7일째에 기계적 통각과민증에 관하여 시험하였다.
TNFR2-Fc_VH#4를 투여하면, 모의 수술한 대조군과 비교해서 수술 후 10일째에 동측/반대측 비율이 상당히 감소되었다 (도 10a). 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.) 또는 MEDI-578 (0.03 mg/kg s.c.)을 투여하면, 이러한 기계적 통각과민증을 상당히 역전시키지 못하였다. 그러나, TNFR2-Fc_VH#4 (0.01 및 0.03 mg/kg s.c.)를 투여하면, 투여 후 4 h째에 기계적 통각과민증이 상당히 역전되었고, 그 효과는 투여 후 6일까지 지속적으로 유지되었다. R347 대조군 Bs3Ab를 투여한 후에는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. TNFR2-Fc_varB를 투여한 경우에 유사한 데이터가 관찰되었다 (도 10b 참조). 이들 데이터는 TNFR2-Fc_VH#4가 극히 낮은 용량에서도 통증을 상당히 역전시킬 수 있다는 것을 제안하는데, MEDI-578 또는 에타네르셉트 단독을 이용한 경우에는 상기와 등가의 용량이 효과가 없거나 또는 최소한도로 유효한 것으로 밝혀졌다.
B. 만성 관절 통증 모델
마우스 인커패시턴스(incapacitance) 시험기 [린톤 인스트루멘테이션(Linton Instrumentation)]를 이용하여 기계적 과민증을 결정하였다. 마우스의 뒷발을 상기 장치 내의 별도의 센서 위에 올려놓고, 4초의 주기에 걸쳐 체중 분포도를 계산하였다. 데이터는 동측 및 반대측 체중 부하 (그램)의 비율로서 표현하였다.
기준선 판독치를 확립한 후, 마우스를 대략 동등한 동측/반대측 비율을 갖는 2개 군으로 나누었다. 다음 기술을 이용하여 관절내 주사를 수행하였다: 산소 중 3% 이소플루란을 이용하여 동물을 마취시키고, 왼쪽 무릎을 면도한 다음 깨끗하게 하였다. 100 ㎕ 해밀톤(Hamilton) 주사기에 부착된 25-게이지 바늘을 이용하여, 각 마우스의 무릎 관절에 10 ㎕의 프로인트 완전 아주반트 (FCA) (10 mg/ml) 또는 비히클 (경질 미네랄 오일)을 주사하였다. 주사는 무릎 관절의 활막 공간 내로 직접 수행하였다. 마우스를 회복시킨 다음, 상기 언급된 바와 같이 주사 후 7일 및 10일째에 기계적 과민증 상의 변화를 알아보기 위하여 다시 시험하였다. 10일째 시험한 후, FCA 처리된 마우스를 추가로 무작위로 여러 군으로 배정하였고, 13일째에 마우스에게 에타네르셉트 (0.01 mg/kg i.p.) 또는 비히클을 투여한 후, 일정 용량의 MEDI-578 (0.03 mg/kg i.v.) 또는 CAT251 이소형 대조군 (0.03 mg/kg i.v.)을 투여하였다. 마우스를 대상으로 하여 상기 언급된 바와 같이, 투여 후 4 h째 및 투여 후 1, 2, 4 및 7일째에 기계적 과민증에 관하여 시험하였다.
염증성 통증의 관절내 FCA 모델을 이용하여, 에타네르셉트와 MEDI-578의 공동-투여 효과를 평가하였다. FCA를 관절내 투여하면, 기계적 과민증이 유발되었는데, 이는 비히클 대조군과 비교해서 7일 및 10일째에 동측/반대측 비율 상의 상당한 감소로써 분명히 나타났다 (도 11). 전처리 기준선 수준과 비교해서 모의 처리된 군에서는 동측/반대측 비율 상의 감소가 전혀 관찰되지 않았다. 에타네르셉트 (0.01 mg/kg i.p.) + CAT251 (0.03 mg/kg i.v.) 또는 PBS (10 ml/kg i.p.) + MEDI-578 (0.03 mg/kg i.v.)를 투여하면, 투여 후 4 h째 및 투여 후 1, 2, 4 및 7일째에 FCA 유도된 기계적 과민증이 약간 역전되었지만, 통계상 유의적 수준에 도달하지는 못하였다. 그러나, 에타네르셉트 (0.01 mg/kg i.p.) + MEDI-578 (0.03 mg/kg i.v.)을 투여하면, 투여 후 모든 시험 시간에서 FCA 유도된 기계적 과민증이 상당히 역전되었다.
두 번째 연구에서는, TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 평가하였다. FCA 유도된 기계적 과민증을 확립시킨 후, FCA 투여 후 13일째에 마우스에게 R347 Bs3Ab 이소형 대조군 (0.01 mg/kg s.c.), 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578 (0.01 mg/kg s.c.) 또는 TNFR2-Fc_VH#4 (0.003 mg/kg 또는 0.01 mg/kg s.c.)를 투여하였다. 또한, 마우스를 대상으로 하여 상기 언급된 바와 같이 투여 후 4 h째 및 투여 후 1, 2, 4 및 7일째에 기계적 과민증에 관하여 시험하였다.
에타네르셉트 및 MEDI-578 개개의 효과와 비교한 TNFR2-Fc_VH#4 ("이중특이적")의 효과가 도 12에 도시되어 있다. 에타네르셉트 (0.01 mg/kg s.c.) 또는 MEDI-578 (0.01 mg/kg s.c.) 중 어느 것도 투여 후 임의의 시점에서 FCA 유도된 기계적 과민증을 상당히 역전시키지 못하였다. 그러나, TNFR2-Fc_VH#4를 투여하면, FCA 유도된 기계적 과민증이 상당히 역전되었다. 보다 고 용량의 TNFR2-Fc_VH#4 (0.01 mg/kg s.c)는 연구 기간 동안 상당한 활성을 나타낸 반면, 보다 저 용량 (0.003 mg/kg s.c.)은 투여 후 1일째에 유의적 수준에 도달하였고, 연구 기간 동안 보다 고 용량과 유사한 수준을 유지하였다.
C. 래트에서 기계적 과민증의 확립된 FCA 유도된 모델
프로인트 완전 아주반트 (FCA)를 발바닥 내로 주사하면, 과민증과 부종을 유도시키는 염증성 반응이 유발되고, 이는 임상 염증성 염증의 일부 측면을 모방하고 있다. 체중 부하를 측정하는 장치를 이용하여 상기 효과를 조사할 수 있다. 체중 부하 방법을 이용하여 FCA 유도된 과민증에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 잠재적 항-통각과민 특정의 평가를 수행하였다. 나이브 래트는 자신의 체중을 2개의 뒷발 간에 동등하게 분배한다. 그러나, 주사된 (왼쪽) 뒷발에 염증이 생기고/생기거나 통증이 있는 경우에는, 병든 발에 체중이 덜 실리도록 체중이 재분배된다 (주사된 발에는 체중 부하가 감소된다). 래트 인커패시턴스 시험기 (린톤 인스트루멘테이션; 영국)를 이용하여, 각 뒷발에 실린 체중 부하를 측정한다. 래트의 뒷발을 상기 인커패시턴스 시험기 내의 별도의 센서 위에 올려놓고, 4초에 걸쳐 양 뒷발에 실린 평균 힘을 기록하였다.
이러한 연구를 위하여, 나이브 래트 [수컷, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트 (할런(Harlan), 영국), 198 내지 258g]가 자신의 홈 우리 내에 있는 처치 룸에 순응하도록 하였다 (음식물과 물은 무제한으로 이용 가능하다). 수 일에 걸쳐 인커패시턴스 시험기에 대한 습관화를 수행하였다. 상처를 유도하기 전에, 기준선 체중 부하를 기록하였다. 왼쪽 뒷발 내로 FCA (시그마로부터 입수 가능함, 100 ㎕의 1 mg/ml 용액)를 발바닥내 주사함으로써 염증성 과민증을 유도시켰다. FCA 투여 후 23시간째에 과민증을 평가하기 위하여 전처리 체중 부하를 측정하였다.
이어서, 라틴 정방 설계에서 체중 부하 FCA 윈도에 따라서 동물의 등급을 매기고 처리군으로 무작위 배정하였다. FCA 주사 후 24시간째에, 동물에게 TNFR2-Fc_VH#4 ("이중특이적")를 0.003, 0.01, 0.03, 0.3, 및 3 mg/kg으로 정맥내 투여하거나, 음성 대조군 항체인 NIP228 (합텐 니트로페놀과 결합하기 위해 생성된 항체)을 3 mg/kg으로 정맥내 투여하거나, 비히클 (1% 메틸셀룰로스)을 2 ml/kg으로 경구 투여하거나, 또는 인도메타신을 10 mg/kg으로 경구 투여하였다.
항체/약물 처리 후 4 및 24시간째에 체중 부하를 평가하였다. 각 시점에서 처리군을 비히클 대조군과 비교함으로써 데이터를 분석하였다. 포함된 통계 분석은 ANOVA를 반복 측정한 다음, 인비보스타트(InVivoStat) (invivostat.co.uk)를 이용하여 계획된 비교 시험을 반복 측정하였다 (p<0.05 유의적으로 간주됨). 그 결과가 도 13에 도시되어 있다. 4시간 및 24시간째에 인도메타신 (10 mg/kg)을 이용한 경우에 상기 과민증의 상당한 역전이 관찰되었다. 0.3 및 3 mg/kg으로 투여된 TNFR2-Fc_VH#4는 4시간 및 24시간째 둘 다에서 과민증의 상당한 역전을 나타냈고, 0.003 및 0.03 mg/kg으로 투여된 TNFR2-Fc_VH#4는 또한, 과민증의 상당한 역전을 나타냈지만, 그 효과는 24시간째에만 나타났다. 이소형 대조군인 NIP228은 어떠한 시점에서도 FCA 반응에 대한 유의적 효과를 나타내지 않았다.
실시예 7 - TNFα 및 NGF에 의한 p38 인산화
문헌에는 p38 인산화가 신경병성 통증의 발생에 중요한 역할을 한다고 제안되어 있다. 예를 들어, p38 억제제로 처치하는 것이 여분의 신경 손상 모델 (문헌 [Wen YR et al., Anesthesiology 2007, 107:312-321]) 및 좌골 염증성 신경병증 모델 (문헌 [Milligan ED et al., J Neurosci 2003, 23:1026-1040])에서 신경병성 통증 증상의 발생을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 본 실험에서는, p38 인산화에 대한 TNFα, NGF, 및 TNFα와 NGF의 조합물의 역할을 세포 배양 검정에서 조사하였다. 간략하게 언급하면, 뉴로스크린(Neuroscreen)-1 세포 (PC-12 래트 신경내분비 세포의 서브클론)를 증가 량의 TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물과 함께 인큐베이션하였다. 20분 인큐베이션 기간 후, 균질한 시간 분해 형광 (HTRF) 검정 [시스바이오(Cisbio)]을 이용하여 포스포-p38을 정량화하였다.
HTRF 검정: TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물로 자극한 후, 세포 상등액을 신속하게 제거하고 세포를 용해 완충액에 용해시켰다. 다음 2가지 상이한 특이적 항체를 이용하여 샌드위치 검정 포맷으로 용해물에서 포스포-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)를 검출하였다: 유로퓸 크립테이트 (공여자 형광단)와 접합된 항-포스포-p38 항체 및 d2 (수용자 형광단)와 접합된 항-p38 (전체) 항체. 항체를 세포 용해물과 함께 인큐베이션하고, 엔비전 멀티라벨(EnVision Multilabel) 판 판독기 [펄킨 엘머(Perkin Elmer)]를 이용하여 이루어진 665 nm 및 620 nm 하에서의 형광 측정치로부터 HTRF 비율을 계산하였다.
데이터는 665 nm 하에서의 발광과 620 nm 하에서의 발광 간의 비율로서 계산되는 HTRF 비율로서 제시된다. 포스포-p38 반응으로부터의 HTRF 비율을 나타내는 열 지도가 도 14에 도시되어 있다. TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물의 효과를 보여주는 용량 반응 곡선이 도 15에 도시되어 있다. 도 15로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 포스포-p38에 대한 보다 고 농도의 TNFα와 NGF의 조합 효과는 어느 하나의 인자 단독에 의해 유도된 포스포-p38 시그널의 예측되는 합보다 더 크다. 이들 데이터는 TNFα와 NGF가 함께 작용하여 p38 인산화를 유도시킬 수 있다는 사실과, 상기 두 가지 경로가 통증을 유도하는 분자 시그널링에 연루될 수 있다는 사실을 제안한다.
실시예 8 - TNFα 및 NGF에 의해 ERK 인산화
p38과 마찬가지로, ERK 또한, 신경병성 통증 발생 동안 활성화된다 (Zhuang ZY et al., Pain 2005, 114:149-159). 본 실험에서는, ERK 인산화에 대한 TNFα, NGF, 및 TNFα와 NGF의 조합물의 역할을 세포 배양 검정에서 조사하였다. 간략하게 언급하면, 뉴로스크린-1 세포 (PC-12 래트 신경내분비 세포의 서브클론)를 증가 량의 TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물과 함께 인큐베이션하였다. 20분 인큐베이션 기간 후, HTRF 검정 (시스바이오)을 이용하여 포스포-ERK를 정량화하였다.
HTRF 검정: 자극 후, 세포 상등액을 신속하게 제거하고 세포를 용해 완충액에 용해시켰다. 다음 2가지 상이한 특이적 항체를 이용하여 샌드위치 검정 포맷으로 용해물에서 포스포-ERK MAPK (Thr202/Tyr204)를 검출하였다: 유로퓸 크립테이트 (공여자 형광단)와 접합된 항-포스포-ERK 항체 및 d2 (수용자 형광단)와 접합된 항-ERK (전체) 항체. 항체를 세포 용해물과 함께 인큐베이션하고, 엔비전 멀티라벨 판 판독기 (펄킨 엘머)를 이용하여 이루어진 665 nm 및 620 nm 하에서의 형광 측정치로부터 HTRF 비율을 계산하였다.
데이터는 665 nm 하에서의 발광과 620 nm 하에서의 발광 간의 비율로서 계산되는 HTRF 비율로서 제시된다. 포스포-ERK 반응으로부터의 HTRF 비율을 나타내는 열 지도가 도 16에 도시되어 있다. TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물의 효과를 보여주는 용량 반응 곡선이 도 17에 도시되어 있다. 도 17로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 낮은 양의 TNFα 단독은 포스포-ERK를 유도하지 못하였지만, 보다 높은 양은 NGF-유도된 포스포-ERK를 증강시켰다. 이들 데이터는 TNFα와 NGF가 함께 작용하여 p38 인산화를 유도시킬 수 있다는 사실과, 상기 두 가지 경로가 통증을 유도하는 분자 시그널링에 연루될 수 있다는 사실을 제안한다.
서열 목록
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본 개시내용은 본 개시내용의 개개의 측면의 단일 예시로서 의도되는 기재된 특이적 측면으로써 그 범위가 제한되지 않고, 기능상 등가인 임의의 조성물 또는 방법이 본 개시내용의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외에 본 개시내용의 각종 변형은 전술된 설명과 첨부된 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
본 명세서 내에 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고도 개별적으로 참조로 포함된다고 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
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Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 96 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 96 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr His 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Asp Tyr Val Trp Glu Ser Tyr His Pro Ala Thr Ser Leu 100 105 110 Ser Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 97 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 97 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Pro Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met 35 40 45 Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Asp Ile Ser Glu Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Glu Phe Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 98 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 99 <211> 2205 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 99 ctgcccgccc aggtggcctt taccccttat gctcctgagc ccggctctac ctgccggctg 60 agagagtact acgaccagac cgcccagatg tgctgctcca agtgctctcc tggccagcac 120 gccaaggtgt tctgcaccaa gacctccgat accgtgtgcg actcctgcga ggactccacc 180 tacacccagc tgtggaactg ggtgcccgag tgcctgtcct gcggctccag atgttcctcc 240 gaccaggtgg aaacccaggc ctgcaccaga gagcagaacc ggatctgcac ctgtcggcct 300 ggctggtact gcgccctgtc taagcaggaa ggctgcagac tgtgcgcccc tctgcggaag 360 tgtagacctg gctttggcgt ggccagaccc ggcaccgaga catctgatgt cgtgtgcaag 420 ccttgcgccc ctggcacctt ctccaacacc acctcctcca ccgacatctg ccggcctcac 480 cagatctgca acgtggtggc catccctggc aacgcctcta tggacgccgt gtgcacctct 540 acctccccca ccagaagtat ggcccctggc gctgtgcatc tgccccagcc tgtgtctacc 600 agatcccagc acacccagcc cacccctgag ccttctaccg ccccttctac cagcttcctg 660 ctgcctatgg gccctagccc tcctgctgag ggatctacag gcgacgagcc caagtcctgc 720 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg accttccgtg 780 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca 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ccaccgccta catggaactg 1680 tcctccctgc ggagcgagga caccgccgtg tactactgcg cccggtcctc tcggatctac 1740 gacctgaacc cttccctgac cgcctactac gacatggacg tgtggggcca gggcacaatg 1800 gtcaccgtgt catctggtgg tggcggctct ggtggcggag gaagtggggg agggggttct 1860 ggggggggag gatctcagtc tgtgctgacc cagcctcctt ccgtgtctgc tgccccaggc 1920 cagaaagtga caatctcctg cagcggctcc agctccaaca tcggcaacaa ctacgtgtcc 1980 tggtatcagc agctgcccgg caccgctccc aaactgctga tctacgataa caacaagcgg 2040 ccctccggca tccccgacag attctccggc tctaagtccg gcacctctgc caccctgggc 2100 atcaccggac tgcagacagg cgacgaggcc gactactact gtggcacctg ggactcctcc 2160 ctgtccgctt gggtgttcgg ctgcggcacc aaactgactg tgctg 2205

Claims (110)

  1. NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하며, 여기서 NGF 길항제 도메인이 항-NGF scFv 단편이고, TNFα 길항제 도메인이 TNFR의 가용성, TNFα-결합성 단편을 포함하는 것인 결합성 분자이며,
    상기 항-NGF scFv 단편이 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 VH 도메인; 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR 세트를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하며,
    여기서 HCDR1이 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고,
    HCDR2가 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하고,
    HCDR3이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하고,
    LCDR1이 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하고,
    LCDR2가 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하고,
    LCDR3이 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합성 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항-NGF scFv 단편이 0.25 내지 0.44 nM의 친화도로 인간 NGF와 결합하는 것인 결합성 분자.
  3. 제1항에 있어서, 항-NGF scFv 단편이 서열식별번호: 3 또는 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함하는 것인 결합성 분자.
  4. 제1항에 있어서, 항-NGF scFv 단편이 서열식별번호: 7 또는 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 것인 결합성 분자.
  5. 제1항에 있어서, 항-NGF scFv 단편이 인간화, 키메라, 영장류화, 또는 완전한 인간인 결합성 분자.
  6. 제1항에 있어서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단에서부터 C-말단까지, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3 (서열식별번호: 15), 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 결합성 분자.
  7. 제1항에 있어서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단에서부터 C-말단까지, 서열식별번호: 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)4 (서열식별번호: 19), 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인 결합성 분자.
  8. 제1항에 있어서, TNFR이 TNFR-2인 결합성 분자.
  9. 제8항에 있어서, TNFR-2 단편이 면역글로불린 Fc 도메인과 융합되는 것인 결합성 분자.
  10. 제9항에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인이 인간 IgG1 Fc 도메인인 결합성 분자.
  11. 제8항에 있어서, TNFα 길항제가 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 것인 결합성 분자.
  12. 제1항에 있어서, 링커를 통하여 TNFα 길항제와 융합된 NGF 길항제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 결합성 분자.
  13. 제12항에 있어서, 융합 단백질의 동종이량체를 포함하는 결합성 분자.
  14. 제1항에 있어서, N-말단에서부터 C-말단까지, 서열식별번호: 13의 아미노산 1-235에 상응하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα-결합성 단편, 인간 IgG1 Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)2 (서열식별번호: 98), 서열식별번호: 3 또는 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)3 (서열식별번호: 15), 및 서열식별번호: 7 또는 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 결합성 분자.
  15. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 14의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 결합성 분자.
  16. 제1항에 있어서, N-말단에서부터 C-말단까지, 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα-결합성 75 kD 단편, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)2 (서열식별번호: 98), 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)4 (서열식별번호: 19), 및 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 결합성 분자.
  17. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 95의 위치 102, 103. 또는 104에 상응하는 아미노산 위치에서의 글리신 잔기가 시스테인 잔기로 변형되고, 서열식별번호: 94의 위치 44에 상응하는 아미노산 위치에서의 글리신 잔기가 시스테인 잔기로 변형된 것인 결합성 분자.
  18. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 결합성 분자.
  19. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 결합성 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 결합성 분자를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 프로모터와 작동가능하게 회합된 제20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  22. 20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 결합성 분자, 및 담체를 포함하는, 대상체에서 통증을 제어하기 위한 조성물.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 결합성 분자를 포함하는 키트.
  25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 결합성 분자를 포함하는, 대상체에서 통증을 제어하기 위한 의약.
  26. 제25항에 있어서, 상기 대상체에서 통증을 예방, 저하, 완화 또는 없애는 의약.
  27. 제25항에 있어서, 통증이 급성 통증, 단기간의 통증, 지속적 통각수용성 통증, 또는 지속적 또는 만성 신경병성 통증인 의약.
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