BR112016017698B1 - Molécula ligante, polinucleotídeo isolado, vetor, microrganismo transgênico, composição, kit, e, uso de uma molécula ligante - Google Patents

Abstract

MOLÉCULA LIGANTE, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UMA MOLÉCULA LIGANTE E PARA CONTROLAR DOR EM UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO, E, KIT. Esta descrição provê composições e métodos para controlar dor. Em particular a descrição provê um método para controlar dor compreendendo a coadministração de um antagonista de NGF e um antagonista de TNF(Alfa). O antagonista de NGF e o antagonista de TNF(Alfa) podem ser moléculas separadas ou parte de um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica que compreende um domínio de antagonista de NGF e um domínio de antagonista de TNF(Alfa). Esta descrição também provê polipeptídeos multifuncionais, por exemplo, moléculas ligantes multiespecíficas compreendendo um domínio de antagonista de NGF e um domínio de antagonista TNF(Alfa). O método provê controle de dor melhorado. A administração de um antagonista de NGF e um antagonista TNF(Alfa) como provido aqui pode controlar dor em um indivíduo mais efetivamente que uma quantidade equivalente do antagonista de NGF ou do antagonista de TNF(Alfa) administrados sozinhos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Ser. No. 61/934.828, depositado em 2 de fevereiro de 2014. Todas as descrições do pedido aludido acima são aqui incorporadas por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 29 de janeiro, de 2015, é denominada 110421-0054-WO1_SL.txt e tem 134.721 bites no tamanho.

FUNDAMENTOS

[003] A dor é um dos sintomas mais comuns para os quais assistência médica é procurada e é a queixa primária de metade de todos os pacientes que visitam um médico. A despeito da existência e uso disseminado de numerosas medicações para a dor, a eliminação da dor, particularmente a dor crônica, foi sem sucesso. Assim, a carga sobre a sociedade permanece alta. Vários estudos estimam que a dor resulte em 50 milhões de dias de trabalho perdidas a cada ano e 61,2 bilhões de dólares na perda de produtividade. Para os sofredores de dor crônica, apenas cerca de metade são capazes de controlar dor com as opções disponíveis de tratamento prescrito. E, o mercado de medicação de prescrição para a dor total é de aproximadamente 25 bilhões de dólares por ano. Como é sugerido por estes dados, uma grande necessidade permanece quanto a novos analgésicos seguros e eficazes.

[004] Os agentes terapêuticos que reduzem os níveis teciduais ou inibem os efeitos do fator de crescimento de nervo secretado (NGF ou beta- NGF) têm o potencial para serem exatamente tais novos analgésicos. O NGF desempenha um papel central bem conhecido no desenvolvimento do sistema nervoso; entretanto, o NGF também é um alvo bem validado para a dor visto que a mesma causa dor em animais e seres humanos. Nos adultos, o NGF, em particular, promove a saúde e sobrevivência de um subconjunto de neurônios centrais e periféricos (Huang & Reichardt, Ann. Rev. Neurosci. 24: 677-736 (2001)). O NGF também contribui para a modulação das características funcionais destes neurônios e exerce controle tônico sobre a sensibilidade, ou excitabilidade, de receptores de dor sensoriais chamados nociceptores (Priestley et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 80: 495-505 (2002); Bennett, Neuroscientist 7: 13-17 (2001)). Os nociceptores sentem e transmitem para o sistema nervoso central os vários estímulos nóxios que dão origem às percepções de dor (nocicepção). Os receptores de NGF estão localizados nos nociceptores. A expressão de NGF é aumentada no tecido ferido e inflamado e é suprarregulado nos estados de dor humanos. Assim, por causa do papel dos NGF’s na nocicepção, os agentes de ligação de NGF que reduzem os níveis de NGF possuem utilidade como produtos terapêuticos analgésicos.

[005] As injeções subcutâneas de NGF por si só produzem dor nos seres humanos e animais. O NGF injetado causa uma rápida hiperalgesia térmica, seguida pela hiperalgesia térmica retardada e alodinia mecânica (Petty et al., Ann. Neurol. 36: 244-46 (1994); McArthur et al., Neurology 54: 1080-88 (2000)). O NGF endogenamente secretado é similarmente pró- nociceptivo. A liberação induzida pela lesão de tecido de NGF e a sua ação subsequente na periferia desempenha um papel principal na indução de hiperalgesia térmica através do processo de “sensibilização periférica” (Mendell & Arvanian, Brain Res. Rev. 40: 230-39 (2002)). A lesão tecidual promove a liberação de citocinas pró-nociceptivas e pró-inflamatórias, que, por sua vez, induzem a liberação de NGF a partir de queratinócitos e fibroblastos. Este NGF liberado atua diretamente sobre nociceptores para induzir estados dolorosos ou nociceptivos dentro de minutos do insulto nóxio. Assim, o NGF também atua indiretamente para induzir e manter estados nociceptivos/dor em uma liberação de alimentação direta. O mesmo deflagra a desgranulação de mastoides, liberando agentes pró-nociceptivos tais como histamina e serotonina e, importantemente, mais NGF, e também pode estimular terminais do nervo simpático para a liberação de neurotransmissores pró-nociceptivos, tais como noradrenalina (Ma & Woolf, Neuroreport. 8: 80710 (1997)).

[006] Os níveis teciduais de NGF são elevados nos animais injetados com adjuvante de Freund completo (CFA) e carragenina (Ma & Woolf, Neuroreport. 8: 807-10 (1997); Amann & Schuligoi, Neurosci. Lett. 278: 17378 (2000)). NGF potencia a resposta de capsaicina nos DRG (gânglios da raiz dorsal) no rato. Os níveis aumentados de NGF foram documentados em pacientes que sofrem de artrite reumatoide (Aloe & Tuveri, Clin. Exp. Rheumatol. 15: 433-38 (1997)) ou cistite (Lowe et al., Br. J. Urol. 79: 572-77 (1997)). Nos roedores, a lesão de nervo periférico aumenta a expressão de mRNA de NGF em macrófagos, fibroblastos, e células de Schwann (Heumann et al., J. Cell Biol. 104: 1623-31 (1987)). A expressão excessiva de NGF em camundongos transgênicos resulta em comportamento de dor neuropática realçada a seguir da lesão do nervo acima desta de camundongos do tipo selvagem (Ramer et al., Pain, Supp. 6: S111-20 (1998)). Em horas e 15 dias, os níveis de NGF elevados desempenham um papel na promoção da “sensibilização central” - o realce da neurotransmissão nas sinapses nos caminhos nociceptivos da medula espinhal. A sensibilização central resulta na hiperalgesia e alodinia persistentes e crônicas. Este processo é considerado envolver a internalização de complexos de NGF e seu receptor de alta afinidade, tirosina cinase receptora A (trkA). O transportador retrógrado destes complexos para os corpos de célula nociceptora nos DRG potencia a secreção de neuropeptídeos nociceptivos, por exemplo, substância P, ou peptídeo relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), ativação da cinase C de proteína (PKC), e ativação do receptor da N-metil-D-aspartato (NMDA) no corno dorsal da medula espinhal (Sah et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2: 46072 (2003)) - todos os processos que promovem a sensibilização dos caminhos nociceptivos. O NGF também desempenha um papel na supra-regulagem e redistribuição de canais iônicos dependentes de voltagem e ativados por ligante, incluindo subtipos de canal de sódio e o receptor da capsaicina, membro 1 da subfamília V do canal de cátion potencial de receptor transitório (TRPV1) (Mamet et al., J. Biol. Chem. 278: 48907-13 (1999); Fjell et al., J. Neurosci. Res. 57: 39-47 (1999); Priestley et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 80: 495-505 (2002)). As atividades e/ou expressão alteradas de transmissores, receptores, e canais iônicos sustentam a sensibilidade e excitabilidade aumentada de nociceptores associados com estados de dor neuropáticas.

[007] A nocicepção/dor induzida por NGF é mediada pelo receptor de NGF de alta afinidade, trkA (tirosina cinase receptora A) (Sah, et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2: 460-72 (2003)). Cerca de 40 a 45 % de corpos celulares nociceptores nos DRGs expressam trkA. Estes são os corpos de célula das fibras de diâmetro pequeno, ou fibras C, que também expressam os peptídeos pro-nociceptivos secretados, substância P e CGRP. Estas fibras terminam nas lâminas I e II do corno dorsal, onde eles transferem para o sistema nervoso central os estímulos nóxios sentidos pelos nociceptores periféricos. As mutações ou deleções no gene trkA produzem um fenótipo caracterizado pela perda de sensação de dor tanto nos seres humanos (Indo, Clin. Auton. Res. 12 (Sup 1): I20-I32 (2002)) e em camundongos nocauteados em trkA (de Castro et al., Eur. J. Neurosci. 10: 146-52 (1998)). Significantemente, a expressão de trkA é supra-regulado nos animais submetidos aos modelos de dor artrítica (Pozza et al., J. Rheumatol. 27: 1121-27 (2000)) ou cística (Qiao & Vizzard, J. Comp. Neurol. 454: 200-11 (2002)), ou a dor inflamatória induzida pela injeção de CFA ou carragenina na pata (Cho et al., Brain Res. 716: 197-201 (1996)).

[008] NGF também se liga ao receptor de neurotrofina p75 (p75NTR). O papel de p75NTR é dependente do seu ambiente celular e a presença de outros receptores com os quais o mesmo é acreditado desempenhar uma função acessória ou co-receptora. A interação entre trkA e p75NTR resulta na formação de sítios de ligação de alta afinidade para NGF. A importância de tais interações de receptor na sinalização da dor mediada por NGF não está claro, mas estudos recentes têm implicado o p75NTR nos processos celulares que podem ser relevantes (Zhang & Nicol, Neurosci. Lett. 366: 187-92 (2004)). Entretanto, embora os camundongos nocautes em p75NTR demonstrem limiares elevados para os estímulos nóxios, eles permanecem responsivos aos efeitos hiperalgésicos de NGF, sugerindo que os receptores de trkA sozinhos são suficientes para mediar estes efeitos (Bergmann et al., Neurosci. Lett. 255: 87-90 (1998)).

[009] O bloqueio de NGF produz eficácia de troca de etapa versus NSAIDs na dor nociceptiva crônica, por exemplo, na osteoartrite, (OA) e na dor lombar crônica. Vários candidatos a anticorpo terapêutico alvejando NGF estão em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico. Tais anticorpos incluem, por exemplo, Tanezumab (PF-4383119; Pfizer), que é um anticorpo humanizado em um formato IgG2; SAR164877/REGN475 (Sanofi- Aventis/Regeneron Pharmaceuticals), que é um anticorpo humano em um formato IgG4; AMG 403 (Amgen/Johnson & Johnson), que é um anticorpo humano em um formato IgG2; PG110 (PanGenetics/Abbott), que é um anticorpo humanizado em um formato IgG4. Um outro candidato a anticorpo terapêutico é descrito na WO 2006/077441, que diz respeito a anticorpos NGF e aos métodos de tratar doenças ou distúrbios em que NGF desempenha um papel com os anticorpos descritos. MEDI-578 é um anticorpo humano em um formato IgG4. A despeito do desenvolvimento destes candidatos, permanece uma necessidade para fornecer alívio analgésico para uma faixa mais ampla de condições de dor através de um agente de ligação de NGF que tem eficácia robusta e perfis de segurança melhorados.

[0010] O fator alfa de necrose de tumor (TNFα), também chamado de caquectina, é uma citocina pleiotrópica com uma ampla faixa de atividades biológicas incluindo citotoxicidade, proliferação de célula imune, inflamação, tumorigênese, e replicação viral. Kim et al., J. Mol. Biol. 374, 1374 (2007). TNFα é primeiro produzido como uma proteína de transmembrana (tm TNFα), que é depois clivado por uma metaloproteinase para uma forma solúvel (sTNFα). Wallis, Lancet Infect. Dis. 8(10): 601 (2008). O TNFα (~17 kDa) existe como uma molécula homotrimérica rígida, que se liga ao Receptor 1 de TNF ou Receptor 2 de TNF de superfície celular, induzindo a oligomerização de receptor e transdução de sinal.

[0011] As citocinas inflamatórias, e em particular TNFα, são conhecidas ter um papel na geração de hiperalgesia. Leung, L., e Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7: 27 (2010). Alguns dados preliminares tem mostrado que os inibidores de TNFα podem ser úteis no controle da dor neuropática. Ver, por exemplo, Sommer C, et al., J. Peripher. Nerv. Syst. 6: 67-72 (2001), Cohen et al, A&A Fev 2013, 116, 2, 455-462, Genevay et al., Ann Rheum Dis 2004, 63, 1120-1123. Os resultados de estudos clínicos testando inibidores de TNFα como uma terapia única no tratamento de dor neuropática permanece inconclusiva. Ver Leung e Cahill (2010).

[0012] A despeito do desenvolvimento de candidatos que alvejam NGF e que alvejam TNFα para o tratamento de dor, permanece uma necessidade para fornecer alívio analgésico para várias condições de dor através de agentes que tenham melhor eficácia do que o padrão corrente de cuidado. Esta descrição fornece tratamentos de combinação que alvejam tanto NGF quanto TNFα, que podem aumentar a eficácia e ter o potencial para diminuir tanto a quantidade quanto a frequência de administração para sofredores de dor.

BREVE SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0013] Esta descrição fornece métodos para controlar dor em um indivíduo, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um antagonista do fator de crescimento de nervo (NGF) e um antagonista do fator alfa de necrose de tumor (TNFα), ou uma molécula ligante compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα. Em algumas modalidades, a administração controla a dor no indivíduo mas eficazmente do que uma quantidade equivalente do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα administrados sozinhos. Em algumas modalidades, o método compreende coadministrar um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF. Em algumas modalidades, o antagonista de TNFα e o antagonista de NGF são administrados sequêncial ou simultaneamente.

[0014] Em algumas modalidades, o método é suficiente para prevenir, reduzir, melhorar, ou eliminar a dor no indivíduo. Em algumas modalidades, a dor é dor aguda, dor de curta duração, persistente ou dor nociceptiva crônica, ou dor neuropática persistente ou crônica. Em algumas modalidades, o método é pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % 80 %, 90 %, ou 100 % mais eficaz no controle da dor no indivíduo do que uma quantidade equivalente do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα administrado sozinho.

[0015] Em algumas modalidades, a porção antagonista de TNFα da molécula ligante liga um polipeptídeo compreendendo a aminoácido sequência da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o antagonista de NGF liga um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

[0016] Em algumas modalidades, a porção antagonista de NGF da molécula ligante é um anticorpo anti-NGF, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento anti- NGF do mesmo pode inibir a ligação de NGF ao TrkA, p75NTR, ou tanto ao TrkA quanto ao p75NTR. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF preferencialmente bloqueia a ligação de NGF ao TrkA em relação à ligação de NGF ao p75NTR. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo liga NGF humano com uma afinidade de cerca de 0,25 a 0,44 nM. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo se liga ao mesmo epítopo como MEDI-578. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo competitivamente inibe a ligação de MEDI-578 ao NGF humano.

[0017] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3 e um domínio de anticorpo VL compreendendo um conjunto de CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a HCDR1 tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 4 com até duas substituições de aminoácido, a HCDR2 tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 5 com até duas substituições de aminoácido, a HCDR3 tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6 com até duas substituições de aminoácido, SSRIYDFNSALISYYDMDV (SEQ ID NO: 11), ou SSRIYDMISSLQPYYDMDV (SEQ ID NO: 12), a LCDR1 tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 8 com até duas substituições de aminoácido, a LCDR2 tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 9 com até duas substituições de aminoácido, e a LCDR3 tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 10 com até duas substituições de aminoácido. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VH tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VL compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VH tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VL tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VH tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VL compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 95. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VH tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VL tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 95.

[0018] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo é um anticorpo H2L2 completo, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab)2 ou um fragmento de cadeia única Fv (scFv). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo é humanizado, quimérico, primatizado, ou totalmente humano. Em algumas modalidades, o antagonista NGF é um fragmento scFv anti-NGF. Em algumas modalidades, o scFv é estabilizado em SS. Em algumas modalidades, o fragmento scFv anti-NGF compreende, do terminal N para o terminal C, um VH compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, uma sequência ligadora de 15 aminoácidos (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15), e um VL compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, o fragmento scFv anti-NGF compreende, do terminal N para o terminal C, um VH compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94, uma sequência ligadora de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19), e um VL compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 95.

[0019] Em alguns aspectos, o método compreende administrar um antagonista de TNFα que inibe a ligação de TNFα a um receptor de TNF (TNFR), bloqueando deste modo a atividade de TNFα. Em algumas modalidades, o antagonista de TNFα compreende um anticorpo anti-TNFα, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2, e HCDR3 e um domínio de anticorpo VL compreendendo um conjunto de CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que CDRs são idênticas à HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de infliximab ou à HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de adalimumab.

[0020] Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um anticorpo anti-TNFα completo e um scFv anti-NGF fundido ao terminal C da cadeia pesada do anticorpo anti-TNFα. Esta molécula ligante pode compreender uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22.

[0021] Em algumas modalidades, o antagonista de TNFα compreende um fragmento de ligação de TNFα solúvel de um TNFR. Em algumas modalidades, o TNFR é TNFR-2 ou um fragmento solúvel do mesmo. Em outras modalidades, o TNFR é TNFR-1 ou um fragmento solúvel do mesmo. Em algumas modalidades, o fragmento solúvel de TNFR-1 é um fragmento de 55 kD. Em outras modalidades, o fragmento solúvel de TNFR-2 é um fragmento de 75 kD. Em algumas modalidades, o fragmento de TNFR é fundido a um domínio Fc da imunoglobulina. Em algumas modalidades, o domínio Fc da imunoglobulina é um domínio Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, o antagonista de TNFα tem uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 13, ou um fragmento funcional do mesmo.

[0022] Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende uma proteína de fusão que compreende o antagonista de NGF fundido ao antagonista de TNFα através de um ligador. Em algumas modalidades, a molécula ligante é um homodímero da proteína de fusão.

[0023] Em algumas modalidades, o antagonista de NGF é um domínio scFv anti-NGF e o antagonista de TNFα é um fragmento de ligação de TNFα solúvel de TNFR-2 fundido no seu terminal carbóxi a um domínio de Fc. Em algumas modalidades, o scFv é fundido ao terminal carbóxi do domínio Fc da imunoglobulina via um ligador.

[0024] Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo, do terminal N para o terminal C, um fragmento de 75 kD que liga TNFα de TNFR-2, um domínio IgG1Fc humano, um ligador de 10 aminoácidos (GGGGS)2, um VH compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, uma sequência ligadora de 10 aminoácidos (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15), e um VL compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14.

[0025] Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo, do terminal N para o terminal C, um fragmento de 75 kD que liga TNFα de TNFR-2, um domínio IgG1Fc humano, um ligador de 10 aminoácidos (GGGGS)2, um VH compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94, uma sequência ligadora de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19), e um VL compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 95. Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17.

[0026] Em algumas modalidades, a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo, do terminal N para o terminal C, um fragmento de 75 kD que liga TNFα de TNFR-2, um domínio IgG1Fc humano, uma sequência ligadora, e um domínio scFv anti-NGF.

[0027] A descrição também fornece métodos para inibir a fosforilação de p38 em uma célula, em que o método compreende contatar uma célula com qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos (por exemplo, qualquer uma das moléculas de ligação compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα aqui descritos). A descrição também fornece métodos para inibir a fosforilação de ERK em uma célula, em que o método compreende contatar uma célula com qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos (por exemplo, qualquer uma das moléculas de ligação compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα aqui descritos). Em algumas modalidades, a célula é uma célula neuronal. Em outras modalidades, a célula é uma célula neuronal periférica. Ainda em outras modalidades, a célula é uma célula neuronal central. Em algumas modalidades, a célula está em um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, a célula está em uma cultura de células.

[0028] A descrição também fornece sequências de polinucleotídeo codificando as moléculas de ligação aqui descritas, vetores compreendendo aquelas sequências de polinucleotídeo, e células hospedeiras compreendendo estes polinucleotídeos ou vetores.

[0029] A descrição também fornece métodos de produzir as moléculas de ligação aqui descritas.

[0030] A descrição também fornece composições, composições farmacêuticas e kits compreendendo as moléculas de ligação aqui descritas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[0031] Figura 1: Representação esquemática de uma proteína de fusão de TNFR2-Fc (Painel A), e uma molécula ligante multiespecífica exemplar, TNFR2-Fc_VH#4, compreendendo um domínio de TNFR2-Fc fundido a um domínio de scFv anti-NGF (painel B).

[0032] A Figura 2A mostra os resultados da análise de SEC-HPLC dos níveis de agregado, monômero e fragmentação de proteína em um lote de TNFR2-Fc_VH#4 purificada.

[0033] A Figura 2B mostra a análise de SDS-PAGE de TNFR2- Fc_VH#4 purificada e a proteína TNFR2-Fc purificada sob condições reduzidas e não reduzidas. Ordem do carregamento de gel: 1. TNFR2- Fc_VH#4, 2. TNFR2-Fc_VL-VH (TNFR2-Fc fundido a um scFv anti-NGF com orientação de gene de domínio variável reverso), 3. TNFR2-Fc scFv 1 irrelevante, 4. TNFR2-Fc, 5. TNFR2-Fc scFv 2 irrelevante.

[0034] A Figura 3A mostra a pureza de TNFR2-Fc_VH#4 a seguir da purificação em coluna de proteína A. A Figura 3B mostra a pureza de TNFR2-Fc_VH#4 a seguir de uma segunda etapa de purificação em uma coluna de SP sefarose.

[0035] A Figura 4 mostra uma análise de estabilidade de TNFR2- Fc_VH#4 usando a calorimetria de varredura diferencial.

[0036] A Figura 5 mostra a ligação de TNFR2-Fc_VH#4 ao TNFα e NGF, tanto isoladamente quanto junto, como determinado pelo ELISA. A Figura 5A mostra a ligação ao NGF, a Figura 5B mostra a ligação ao TNFα, e a Figura 5C mostra simultaneamente a ligação ao TNFα e NGF.

[0037] A Figura 6 mostra um sensorgrama de um ensaio de ligação de ressonância plasmônica de superfície para TNFR2-Fc_VH#4. A ligação de antígeno concorrente do anticorpo multiespecífico de TNFR2-Fc_VH#4 foi realizado usando BIAcore 2000. A ligação de antígeno simultânea foi avaliada pela ligação em série de TNFα e NGF em TNFR2-Fc_VH#4 ligado à superfície do sensor. A primeira parte do sensorgrama mostra a ligação de quantidades saturantes de TNFα ao anticorpo multiespecífico, a segunda parte do sensorgrama mostra a ligação quando um segundo antígeno foi aplicado, TNFα mais uma vez, que mostrou que a superfície foi saturada, ou uma mistura equimolar de TNFα e NGF. Um aumento nas unidades de ressonância equivaleu à ligação do NGF à molécula multiespecífica, e consequentemente entrosamento de antígeno simultâneo. O ensaio também foi realizado com a adição de antígeno na ordem reversa confirmando estes dados.

[0038] A Figura 7 mostra a inibição da proliferação mediada por NGF de células TF-1. A. proliferação mediada por NGF na ausência de antagonista de NGF adicionado. B. Inibição da resposta de NGF humano pela TNFR2- Fc_VH#4. C. Inibição de resposta de NGF de murino pela TNFR2-Fc_VH#4. A atividade de NGF é normalmente representada como RLU - Unidade de Luminescência Relativa, e % da proliferação mediada por NGF calculada como % de resposta ao ligante de NGF sozinho usando a seguinte fórmula: 100 * (RLU do poço - RLU de fundo)/(RLU Total - RLU de fundo), em que RLU de fundo = média dos controles médios, e RLU Total = média de controles de apenas ligante. D. Inibição da resposta de NGF humano pela TNFR2-Fc_VarB e ndimab VarB. E. Inibição da resposta de NGF de murino pela TNFR2-Fc_VarB e ndimab VarB.

[0039] A Figura 8 mostra a inibição da atividade de Caspase 3 induzida pelo TNFα em células U937. A. A atividade de Caspase 3 induzida pelo TNFα em células U937 na ausência de antagonista de TNFα adicionado. B. Inibição da atividade de Caspase 3 induzida pelo TNFα nas células U937 mostrada como porcentagem de resposta na ausência de antagonista adicionado. A atividade de TNF é normalmente representada como RFU - Unidade de Fluorescência Relativa, e a % de liberação de caspase 3 mediada pelo TNF foi calculada como % de resposta ao ligante de TNF sozinho usando a fórmula como descrita acima na FIG. 7C: C. Resultados similares mostrados para uma molécula relacionada com TNFR2-Fc_varB e ndimab VarB.

[0040] A Figura 9 mostra o efeito do tratamento de combinação com etanercept e MEDI-578 em uma hiperalgesia mecânica induzida pela ligação parcial do nervo ciático. Os resultados são mostrados como a razão ipsilateral/contralateral. N = 9 a 10 por grupo. Os dados foram analisados usando uma análise de variância (ANOVA) de 2 vias com tempo e tratamento como fatores dependentes. A significância estatística subsequente foi obtida usando o teste de Post Hoc de Boniferroni. ***p<0,001 para o controle Op + CAT-251.

[0041] A Figura 10A mostra o efeito de TNFR2-Fc_VH#4 sobre a hiperalgesia mecânica induzida pela ligação parcial do nervo ciático. Os resultados são mostrados como a razão ipsilateral/contralateral. N = 10 por grupo. Os dados foram analisados usando uma análise ANOVA 2 vias com o tempo e tratamento como fatores dependentes. A significância estatística subsequente foi obtida usando o teste Post Hoc de Boniferroni. ***p<0,001 vs controle de isotipo biespecífico. A Figura 10B mostra resultados similares com uma molécula relacionada TNFR2-Fc_varB.

[0042] A Figura 11 mostra o efeito da coadministração de MEDI-578 e etanercept sobre a redução da dor em um modelo de dor de junta de hipersensibilidade mecânica. N = 9 a 10 por grupo. Os dados foram analisados usando uma análise ANOVA de 2 vias. A significância estatística subsequente foi obtida usando teste de Post Hoc de Boniferroni. *P>0,05; ***P<0,001 vs. CAT-251.

[0043] A Figura 12 mostra o efeito de TNFR2-Fc_VH#4 sobre a redução da dor em um modelo de dor de junta de hipersensibilidade mecânica. N = 9 a 10 por grupo. Os dados foram analisados usando uma análise ANOVA de 2 vias. A significância estatística subsequente foi obtida usando teste de Post Hoc de Boniferroni. ***P<0,001 vs. controle de isotipo biespecífico.

[0044] A Figura 13 mostra os efeitos de cinco doses diferentes de TNFR2-Fc_varB sobre a hiperalgesia induzida com CFA em um modelo de rato.

[0045] Figura 14: Um mapa térmico mostrando razões HTRF de reações de fosfo-p38.

[0046] Figura 15: As curvas de dose resposta mostrando o efeito de TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF na fosforilação de p38.

[0047] Figura 16: Um mapa térmico mostrando razões HTRF de reações de fosfo-ERK.

[0048] Figura 17: curvas de dose-resposta mostrando o efeito de TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF sobre a fosforilação de ERK.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0049] Deve ser mencionado que o termo “um” ou “uma” entidade se refere a uma ou mais desta entidade. Como tal, os termos “um” (ou “uma”), “um(a) ou mais,” e “pelo menos um(a)” podem ser usados aqui intercambiavelmente.

[0050] Além disso, “e/ou” onde aqui usado deve ser interpretado como descrição específica de cada um dos dois traços ou componentes com ou sem os outros. Assim, o termo “e/ou” como usado em uma frase tal como “A e/ou B” aqui é intencionado a inclui “A e B,” “A ou B,” “A” (sozinho), e “B” (sozinho). Igualmente, o termo “e/ou” como usado em uma frase tal como “A, B, e/ou C” é intencionado a abranger cada um dos seguintes aspectos: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[0051] É entendido que onde quer que aspectos sejam aqui descritos com a linguagem “compreendendo,” aspectos de outro modo análogos descritos em termos de “consistindo de” e/ou “consistindo essencialmente de” também são fornecidos.

[0052] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica com a qual esta descrição está relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, provêem uma pessoa de habilidade com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta descrição.

[0053] Unidades, prefixos, e símbolos são indicados na sua forma aceita do Système International de Unites (SI). As faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que de outro modo indicado, as sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi. Os títulos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos da descrição, que pode ser incorporado por referência ao relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo na sua totalidade.

[0054] Como aqui usado, o termo “molécula ligante” se refere no seu sentido mais amplo a uma molécula que especificamente liga um determinante antigênico, por exemplo, antígeno. Os exemplos não limitantes de uma molécula ligante incluem anticorpos ou fragmentos do mesmo, proteínas de fusão de receptor solúvel ou fragmentos das mesmas, esqueletos que não imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos, cada um retendo a ligação específica de antígeno. Esqueletos que não de imunoglobulina exemplares incluem Tn3 (Koide et al., J Mol Biol 13 de Jan de 2012; 415(2): 393-405), DARPin (Boersma & Pluckthun, Curr Opin Biotechnol. 2011 22(6): 849-57), anticalina (Gebauer & Skerra, Methods Enzymol. 2012; 503: 157-88). As proteínas de fusão de receptor solúvel exemplares e anticorpos são fornecidos abaixo. Em certas modalidades, a molécula ligante seria engenheirada para compreender combinações de tais anticorpos ou fragmentos dos mesmos, as proteínas de fusão de receptor solúveis ou fragmentos das mesmas, e esqueletos não fundamentados em imunoglobulina ou fragmento dos mesmos.

[0055] A molécula ligante, ou qualquer porção da molécula ligante que reconhece um antígeno é aqui aludido como um “domínio de ligação.” A menos que especificamente se referindo às moléculas de ligação de tamanho natural tais como anticorpos que ocorrem naturalmente, o termo “molécula ligante” abrange, sem limitação, anticorpos de tamanho natural ou outras moléculas de ligação que não de anticorpo, assim como fragmentos de ligação de antígeno, variantes, análogos, ou derivados de tais moléculas de ligação, por exemplo, moléculas de anticorpo ou imunoglobulina que ocorrem naturalmente ou moléculas de ligação engendradas ou fragmentos que ligam antígeno em uma maneira similar à molécula ligante de tamanho natural.

[0056] Em certas modalidades, a descrição fornece certas moléculas de ligação multiespecíficas, por exemplo, moléculas de ligação biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas, etc., ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos. Como aqui usado, uma molécula ligante multiespecífica pode incluir um ou mais domínios de ligação de anticorpo, um ou mais domínios de ligação que não de anticorpo, ou uma combinação dos mesmos.

[0057] O termo “fator de crescimento de nervo” (“NGF”) também aludido na literatura como fator de crescimento de nervo beta, como aqui usado se refere a uma proteína secretada que funciona no crescimento e sobrevivência de vários neurônios. O NGF humano é apresentado como Número de Acesso no Genbank NP_002497.2, e é apresentado aqui como SEQ ID NO: 1. O termo NGF como aqui usado não é limitado ao NGF humano, e inclui todas as espécies ortólogas de NGF humano. O termo “NGF” abrange a pró-forma de NGF, pró-NGF, NGF de tamanho natural, assim como qualquer forma de NGF que resulte do processamento dentro da célula. O termo também abrange variantes que ocorrem naturalmente de NGF, por exemplo, variantes de junção, variantes alélicas, e isoformas. NGF pode se ligar a dois receptores: o receptor de neurotrofina p75 (p75(NTR)) e TrkA, uma tirosina cinase de transmembrana. O NGF é um alvo bem validado para dor que é conhecido mediar a sensibilização de nociceptores.

[0058] Uma variedade de agentes está sendo testada como antagonistas da atividade de NGF. Um tal agente anti-NGF é trkA-Fc, que atua como uma isca ou descontaminante para ligar a, e deste modo inativar, NGF endógeno. TrkA-Fc é uma proteína de fusão consistindo da região de ligação de NGF de trkA ligado a um fragmento de domínio constante (Fc) de um anticorpo de IgG. TrkA-Fc produz hipoalgesia em animais naturais, diminui respostas nociceptoras, e diminui o brotamente de neurônios que sente dor não mielinados (Bennett, D. L. et al. (1998) Eur J Neurosci, 10: 1282-91).

[0059] A dor mediada por NGF é particularmente bem adaptada para tratamento seguro e eficaz com moléculas de ligação como aqui apresentado porque os níveis de NGF aumentam na periferia em resposta aos estímulos de nóxio e os anticorpos têm baixa permeabilidade da barreira hematoencefálica. Vários anticorpos anti-NGF e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que podem ser usados nas terapias e composições aqui descritas podem ser encontrados na literatura, ver, por exemplo, as Publicações PCT Nos. WO02/096458 e WO04/032870.

[0060] O termo “MEDI-578” se refere a um anticorpo que especificamente liga NGF, que é o objeto do Pedido Internacional No. PCT/GB2006/000238 e Pub. do Ped. de Patente U.S. No. 2008/0107658 A1, ambos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. As sequências de cadeia pesada e leve de MEDI-578 são mostradas nas SEQ ID NOs: 3 e 7, respectivamente.

[0061] O termo NGF-NG se refere a um anticorpo que especificamente liga NGF. as sequências de cadeia pesada e leve de NGF-NG são mostradas nas SEQ ID NOs: 24 e 26, respectivamente.

[0062] O termo “fator alfa de necrose de tumor” (“TNFα “), também aludido na literatura como caquectina, proteína APC1; fator de necrose de tumor; TNF; ou membro 2 da superfamília de ligante do fator de necrose de tumor, como aqui usados se referem à proteína de TNFα específica, e não à superfamília de ligantes de TNF. O TNFα humano é apresentado como Número de Acesso ao Genbank NP_000585.2, e é apresentado como SEQ ID NO: 2. O termo TNFα como aqui usado não é limitado ao TNF humano, e inclui todas as espécies de ortólogos de TNFα humano. O termo “TNFα “ abrange a pró-forma de TNFα, pro-TNFα, TNFα de tamanho natural, assim como qualquer forma de TNFα que resulte de processamento dentro da célula. O termo também abrange variantes que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente de TNFα, por exemplo, variantes de junção, variantes alélicas, e isoformas. TNFα pode ligar dois receptores, TNFR1 (receptor de TNF tipo 1; CD120a; p55/60) e TNFR2 (receptor de TNF tipo 2; CD120b; p75/80). TNFα funciona como uma citocina pró-inflamatória, por exemplo, funcionando na neuroinflamação. Por exemplo, TNFα é considerado estar funcionalmente envolvido na geração da dor neuropática (Leung, L., e Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7: 27 (2010)).

[0063] Um grande número de antagonistas de TNFα é conhecido na técnica, e muitos são comercialmente disponíveis como produtos terapêuticos. Os exemplos de antagonistas de TNF-alfa comercialmente disponíveis que podem ser usados nas terapias e composições aqui fornecidas incluem etanercept (ENBREL®, Amgen/Pfizer), infliximab (por exemplo, REMICADE®, Centocor), certolizumab pegol (por exemplo, CIMZIA®, UCB), golimumab (por exemplo, SIMPONI®, Centocor), e adalimumab (por exemplo, HUMIRA®/TRUDEXA®, Abbott).

[0064] Uma molécula ligante, polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, ou composição “isolados” se referem a uma molécula, polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, ou composição de ligação que estão em uma forma que não ocorrem naturalmente. As moléculas de ligação, polipeptídeos, anticorpos, polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras ou composições isolados incluem aqueles que foram mudados, adaptados, combinados, rearranjados, engenheirados, ou de outro modo manipulados a um grau que eles não estejam mais na forma na qual eles são encontrados na natureza. Em alguns aspectos uma molécula ligante, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, ou composição que são isolados são “recombinantes.”

[0065] Como aqui usado, os termos “polipeptídeo multifuncional” e “polipeptídeo bifuncional” se refere a uma molécula ligante que não ocorrem naturalmente planejada para alvejar dois ou mais antígenos. Um polipeptídeo multifuncional como aqui descrito é tipicamente uma proteína de fusão geneticamente engendrada planejada para juntar duas funções biológicas diferentes desejadas em uma única molécula ligante. Por exemplo, um polipeptídeo multifuncional pode ser uma molécula ligante multifuncional. Um polipeptídeo multifuncional exemplar aqui descrito é uma molécula ligante multifuncional compreendendo um domínio antagonista de NGF, por exemplo, um domínio de peptídeo que bloqueia, reduz, ou inibe uma ou mais funções naturais de NGF, e um domínio antagonista de TNFα, por exemplo, um domínio de peptídeo que bloqueia, reduz, ou inibe uma ou mais funções de TNFα naturais.

[0066] Um grupo de polipeptídeos multifuncionais aqui fornecidos são moléculas de ligação multiespecíficas, por exemplo, moléculas de ligação que incluem um ou mais domínios de ligação de anticorpo, por exemplo, um “anticorpo multiespecífico,” um ou mais domínios de ligação que não de anticorpo, por exemplo, um receptor isca, ou uma combinação dos mesmos. As moléculas de ligação multiespecíficas, por exemplo, incluindo um ou mais domínios de ligação de anticorpo, um ou mais domínios de ligação que não de anticorpo, ou uma combinação do mesmo, são moléculas com domínio de ligação capazes de especificamente reconhecer e ligar a pelo menos dois epítopos diferentes. Os epítopos diferentes podem estar dentro da mesma molécula (por exemplo, o mesmo NGF) ou em moléculas diferentes tal que, por exemplo, moléculas de ligação multiespecíficas que podem especificamente reconhecer e ligar NGF assim como uma outra molécula contendo epítopo, por exemplo, TNFα, tal que a molécula ligante multiespecífica especificamente reconheça NGF e TNFα.

[0067] As técnicas para a fabricação de moléculas de ligação multiespecíficas, por exemplo, incluindo um ou mais domínios de ligação de anticorpo, um ou mais domínios de ligação que não de anticorpo, ou uma combinação dos mesmos, estão disponíveis na técnica (Dimasi, N., et al., 2009, J Mol Biol. 393: 672-92; Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539; Brennan et al., 1985, Science 229: 81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol. 121: 120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152: 5368; e Patente U.S. 5.731.168). Os anticorpos com mais do que duas valências também são considerados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados (Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)).

[0068] O termo “anticorpo” significa uma molécula de imunoglobulina que reconhece e especificamente se liga a um alvo, tal como uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, ou combinações dos precedentes através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno dentro da região variável da molécula de imunoglobulina. Como aqui usado, o termo “anticorpo” abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, fragmentos de anticorpo (tais como fragmentos de Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv), mutantes Fv de cadeia única (scFv), anticorpos multiespecíficos tais como anticorpos biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, etc gerados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de determinação de antígeno de um anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um sítio de reconhecimento de antígeno contanto que os anticorpos exibem a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser de qualquer uma das cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, ou subclasses (isotipos) do mesmo (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), com base na identidade dos seus domínios constantes de cadeia pesada aludidas como alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respectivamente. As classes diferentes de imunoglobulinas têm estruturas de subunidade diferentes e bem conhecidas e configurações tridimensionais.

[0069] Em algumas modalidades, uma molécula ligante “bloqueadora”, por exemplo, um anticorpo bloqueador ou uma molécula ligante “antagonista”, tal como por exemplo, um anticorpo antagonista ou proteína de fusão é um que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual o mesmo se liga, tal como NGF ou TNFα. Em certos aspectos anticorpos bloqueadores ou moléculas de ligação antagonistas substancial ou completamente inibem a atividade biológica do antígeno. Por exemplo, a atividade biológica pode ser reduzida em 0,01 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ou mesmo 100 %. “Antagonistas” e “domínios antagonistas” como aqui usados incluem polipeptídeos ou outras moléculas que se ligam ao seu alvo (por exemplo, TNFα ou NGF), bloqueando ou inibindo deste modo o alvo de interagir com um receptor. NGF e/ou antagonistas de TNFα incluem assim moléculas que bloqueiam ou inibem a interação de NGF com trkA ou neurotrofina p75, ou interação de TNFα com TNFR-1 ou TNFR-2. NGF e/ou antagonistas de TNFα também incluem moléculas que reduzem a fosforilação de p38 e/ou fosforilação de ERK. Os antagonistas exemplares incluem, mas não são limitados aos anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno do mesmo, e peptídeos específicos do receptor alvo, solúvel, que não de sinalização (“receptores isca,” ou fragmentos de ligação de ligante do mesmo).

[0070] O termo “fragmento de anticorpo” se refere a uma porção de um anticorpo intacto e se refere às regiões determinadoras antigênicas variáveis de um anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, e Fv, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Os fragmentos de ligação de antígeno de moléculas de ligação que não anticorpo, aqui descritas alhures, são também fornecidos por esta descrição.

[0071] Um “anticorpo monoclonal” se refere a uma população de anticorpo homogênea envolvida no reconhecimento e ligação altamente específicos de um único determinante antigênico, ou epítopo. Isto está em contraste com os anticorpos policlonais que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes antigênicos diferentes. O termo “anticorpo monoclonal” abrange anticorpos monoclonais tanto intactos quanto de tamanho natural assim como fragmentos de anticorpo (tais como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), mutantes de cadeia única (scFv), proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um sítio de reconhecimento de antígeno. Além disso, “anticorpo monoclonal” se refere a tais anticorpos fabricados em qualquer número de modos incluindo, mas não limitados a, por hibridoma, seleção de fago, expressão recombinante, e animais transgênicos.

[0072] O termo “anticorpo humanizado” se refere às formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) que são cadeias de imunoglobulina específicas, imunoglobulinas, ou fragmentos do mesmo que contêm sequências não humanas mínimas (por exemplo, de murino). Tipicamente, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas em que resíduos da região determinadora de complementaridade (CDR) são substituídos pelos resíduos da CDR de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo, rato, coelho, ou hamster) que têm a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas (Jones et al., 1986, Nature, 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). Em alguns casos, os da região de matriz Fv (FR ou FW) de uma imunoglobulina de ser humano são substituídos com os resíduos correspondentes em um anticorpo de uma espécie não humana que tem a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. O anticorpo humanizado pode ser modificado ainda pela substituição de resíduos adicionais na região de matriz Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos substituídos para refinar e otimizar a especificidade, afinidade, e/ou capacidade de anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois ou três, domínios variáveis contendo todas ou substancialmente todas das regiões CDR que correspondem à imunoglobulina não humana ao passo que todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou domínio (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Os exemplos de métodos usados para gerar anticorpos humanizados são descritos na Pat. U.S. 5.225.539 ou 5.639.641.

[0073] Uma “região variável” de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve de anticorpo ou à região variável da cadeia pesada de anticorpo, sozinhas ou em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve cada uma consiste de quatro regiões de armação (FR ou FW) conectadas por três regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade imediata pelas FRs e, com as CDRs das outras cadeias, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno dos anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar CDRs: (1) um método fundamentado na variabilidade das sequência de espécies cruzadas (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a ed., 1991, National Institutes of Health, Betesda Md.)); e (2) um método com base nos estudos cristalográficos de complexos de antígeno-anticorpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948)). Além disso, combinações destes dois métodos são algumas vezes usadas na técnica para determinar CDRs.

[0074] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando da referência a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos de 1 a 107 da cadeia leve e resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, Md. (1991)).

[0075] A numeração da posição de aminoácido como em Kabat, se refere ao sistema de numeração usado para os domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais correspondendo a um encurtamento da FR ou CDR, ou inserção nas mesmas, do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) depois do resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc de acordo com Kabat) depois do resíduo 82 da cadeia pesada de FR. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento nas regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”. Chothia ao invés se refere ao local das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). O final da alça CDR-H1 de Chothia quando numerada usando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento da alça (isto é porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estão presentes, a alça termina em 32; se apenas 35A está presente, a alça termina em 33; se tanto 35A quanto 35B estão presentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um compromisso entre as CDRs de Kabat e as alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpo AbM da Oxford Molecular. Uma comparação é fornecida na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Comparação dos Sistemas de Numeração de Anticorpo

[0076] O termo “anticorpo humano” significa um anticorpo humano nativo ou um anticorpo tendo uma sequência de aminoácido correspondendo a um anticorpo humano nativo, fabricado usando qualquer técnica conhecida na técnica. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de tamanho natural, fragmentos dos mesmos, e/ou anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo humano de cadeia pesada e/ou leve tal como, por exemplo, um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve de murino e cadeia pesada humana.

[0077] O termo “anticorpos quiméricos” se refere a anticorpos em que a sequência de aminoácido da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. Tipicamente, a região variável tanto da cadeia leve quanto da pesada corresponde à região variável de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero (por exemplo, camundongo, rato, coelho, etc.) com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas enquanto que as regiões constantes são homólogas às sequências nos derivados de anticorpos de uma outra (usualmente ser humano) para evitar evocar uma resposta imune nestas espécies. As moléculas de ligação multiespecíficas, por exemplo, incluindo um ou mais domínios de ligação de anticorpo, um ou mais domínios de ligação que não de anticorpo, ou uma combinação dos mesmos, por exemplo, antagonistas de TNFα e/ou antagonistas de NGF aqui fornecidos podem compreender regiões constantes de anticorpo (por exemplo, regiões Fc) em que pelo menos uma fração de um ou mais dos domínios da região constante foram deletados ou de outro modo alterados de modo a fornecer características bioquímicas desejadas tais como localização de tumor aumentada ou meia-vida sérica reduzida quando comparada com um anticorpo de aproximadamente a mesma imunogenicidade compreendendo uma região constante nativa ou inalterada. As regiões constantes modificadas aqui fornecidas podem compreender alterações ou modificações para um ou mais dos três domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) e/ou para o domínio constante de cadeia leve (CL). Em alguns aspectos, um ou mais domínios constantes podem ser parcial ou totalmente deletados. Em alguns aspectos, o domínio CH2 inteiro pode ser deletado (construções ΔCH2). Ver, por exemplo, Oganesyan V, et al., 2008 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64: 700-4; Oganesyan V, et al., Mol Immunol. 46: 1750-5; Dall’Acqua, W.F., et al., 2006. J. Biol. Chem 281: 23514-23524; e Dall’Acqua, et al., 2002. J. Immunol. 169: 5171-5180.

[0078] Os termos “epítopo” ou “determinante antigênico” são aqui usados intercambiavelmente e se referem àquela porção de um antígeno capaz de ser reconhecida e especificamente ligada por um anticorpo particular. Quando o antígeno é um polipeptídeo, epítopos podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos quanto aminoácidos não contíguos justapostos pela dobra terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na desnaturação da proteína, ao passo que os epítopos formados pela dobra terciária são tipicamente perdidos na desnaturação da proteína. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais usualmente, pelo menos 5 ou de 8 a 10 aminoácidos em uma única conformação espacial. Um epítopo como aqui descritos não precisa ser definido abaixo dos aminoácidos específicos que formam o epítopo. Em alguns aspectos um epítopo pode ser identificado pela examinação da ligação às subunidades peptídicas de um antígeno de polipeptídeo, ou examinando-se a competição de ligação ao antígeno por um grupo de anticorpos específicos de antígeno.

[0079] Por “sujeito” ou “indivíduo” ou “animal” ou “paciente” ou “mamífero,” é intencionado qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo mamífero, para quem o diagnóstico, prognóstico, ou terapia são desejados. Os indivíduos mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda, animais esportivos, e animais de zoológico incluindo, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, porquinhos da Índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, ursos, e assim por diante.

[0080] Os termos “composição e “composição farmacêutica” se refere a uma preparação que está em tal forma como para permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contenha nenhum componente adicional que seja inaceitavelmente tóxico a um indivíduo ao qual a composição seria administrada. Tais composições podem ser estéreis.

[0081] Como aqui usado, os termos “quantidade eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz” se referem a uma quantidade de uma ou mais composições terapêuticas eficazes para controlar dor em um indivíduo. O termo “controlar dor” e equivalentes gramaticais são aqui usados para descrever qualquer efeito benéfico ou desejável em um indivíduo em necessidade de controle da dor. Por exemplo, uma quantidade eficaz de uma ou mais composições terapêuticas aqui descritas, por exemplo, pode prevenir a dor, manter um nível tolerável de dor, melhorar a dor, reduzir a dor, minimizar a dor, ou eliminar a dor no indivíduo.

[0082] O termo “administrar” como aqui usado se refere a administrar a um indivíduo uma ou mais composições terapêuticas aqui descritas, por exemplo, um polipeptídeo bifuncional compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, uma composição terapêutica compreendendo uma combinação de um antagonista de NGF e um antagonista de TNFα, ou composições terapêuticas separadas, uma compreendendo um antagonista de NGF e uma compreendendo um antagonista de TNFα. O termo “coadministrar” se refere a administrar a um indivíduo duas ou mais composições terapêuticas, por exemplo, uma compreendendo um antagonista de NGF e uma compreendendo um antagonista de TNFα. Como aqui usado, coadministrar inclui, mas não requer que as duas ou mais composições terapêuticas sejam administradas ao indivíduo simultaneamente. As duas ou mais composições terapêuticas podem ser administradas ao indivíduo sequencialmente, por exemplo, trinta minutos separadamente, uma hora separadamente, duas horas separadamente, três horas separadamente, quatro horas separadamente, ou cinco ou mais horas separadamente. A sequência e cronometragem de uma coadministração como aqui descrita podem ser fixas, ou podem ser variadas com base no julgamento de um profissional de cuidado de saúde.

[0083] Os termos “polinucleotídeo” e “ácido nucléico” se referem a um composto polimérico compreendido de resíduos de nucleotídeo covalentemente ligados. Os polinucleotídeos podem ser DNA, cDNA, RNA, de filamento único, ou de filamento duplo, vetores, plasmídeos, fago, ou vírus.

[0084] O termo “vetor” significa uma construção, que é capaz de liberar, e expressar, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Os exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, plasmídeo, cosmídeo ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.

[0085] Os termos “polipeptídeo,” “peptídeo,” e “proteína” são aqui usados intercambiavelmente para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e não aminoácidos podem interrompê-lo. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou pela intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de rotulação. Também incluídos dentro da definição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica.

[0086] Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído com um outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por exemplo, substituição de uma fenilalanina no lugar de uma tirosina é uma substituição conservativa. Em certas aspectos, as substituições conservativas nas sequências de polipeptídeos e anticorpos aqui fornecidos não anulam a ligação ou outra atividade funcional do polipeptídeo contendo a sequência de aminoácido. Métodos de identificar substituições conservativas de nucleotídeo e aminoácido que não afetam a função são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12: 879-884 (1999); e Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)).

Molécula ligante compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα

[0087] Esta descrição fornece um polipeptídeo bifuncional compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα. Em certas aspectos, a administração de uma quantidade eficaz de um polipeptídeo bifuncional aqui fornecido pode controlar dor, em um indivíduo em necessidade do mesmo, mas eficazmente do que uma quantidade equivalente do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα administrados sozinhos. Os polipeptídeos bifuncionais aqui fornecidos podem incluir o domínio antagonista de NGF e o domínio antagonista de TNFα em qualquer ordem, estrutura, ou conformação. Qualquer um dos antagonistas de NGF ou antagonistas de TNFα adequados pode ser parte de um polipeptídeo bifuncional aqui fornecido. Os antagonistas de NGF e antagonistas de TNFα exemplares são descritos em outro lugar nesta descrição.

[0088] Em certos aspectos, o antagonista de NGF é uma molécula que não de anticorpo, ou um domínio de ligação do mesmo, capaz de inibir a atividade de NGF, por exemplo, um fragmento solúvel, que liga NGF de TrkA. Em certos aspectos, o antagonista NGF é um anticorpo anti-NGF, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Os antagonistas anti-NGF adequados, por exemplo, anticorpos antagonistas podem inibir a ligação de NGF a TrkA, p75NRT, ou tanto a TrkA quanto a p75NRT. Em certos aspectos, um antagonista de anti-NGF, por exemplo, um anticorpo antagonista ou fragmento do mesmo para o uso em uma molécula bifuncional aqui fornecida, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, pode preferencialmente bloquear a ligação de NGF a TrkA em relação à ligação de NGF a p75NRT.

[0089] Os anticorpos exemplares ou fragmentos do mesmo para o uso me polipeptídeos bifuncionais, por exemplo, moléculas de ligação multiespecíficas aqui descritas estão disponíveis na Publicação do Pedido U.S. No. 2008/0107658, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo se liga ao mesmo epítopo, pode competitivamente inibir, ou pode se ligar ao NGF com uma afinidade maior do que o anticorpo anti-NGF MEDI-578. Em certas modalidades, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo liga NGF humano e/ou NGF de rato com uma afinidade de ou menor do que 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 ou 0,2 nM. Por exemplo, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode ligar NGF humano com uma afinidade de cerca de 0,2 a 0,8, 0,2 a 0,7, 0,2 a 06, 0,2 a 0,5, e/ou 0,25 a 0,44 nM e NGF de rato com uma afinidade de cerca de 0,2 a 0,9, 0,2 a 0,8, e/ou 0,25 a 0,70 nM.

[0090] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo é MEDI-578. MEDI-578 é descrito na Publicação do Pedido U.S. No. 2008/0107658 como clone 1252A5. Em outros aspectos, o anticorpo anti- NGF ou fragmento do mesmo é tanezumab (RN-624), um mAb anti-NGF humanizado (Pfizer; descrito em Kivitz et al., (2013) PAIN, 154, 9, 1603161), fulranumab, um mAb anti-NGF totalmente humano (Amgen; descrito em Sanga et al., PAIN, Volume 154, Edição 10, Outubro de 2013, Páginas 1910-1919); REGN475/SAR164877, um mAb anti-NGF totalmente humano (Regeneron/Sanafi-Aventis); ABT-110 (PG110), um mAb anti-NGF humanizado (Abbott Laboratories). Um anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo incluídos em um polipeptídeo bifuncional, por exemplo, a molécula ligante multiespecífica aqui fornecida, pode ser, por exemplo, humanizado, quimérico, primatizado, ou totalmente humano.

[0091] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo os domínios HCDR1, HCDR2, e HCDR3 de MEDI-578, variantes das CDRs de cadeia pesada de MEDI-578 com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido. Por exemplo, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um HCDR1 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 4 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Similarmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um HCDR2 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 5 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Igualmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um HCDR3 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 6 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Em certos aspectos, o HCDR3 pode compreender a sequência de aminoácido SSRIYDFNSALISYYDMDV (SEQ ID NO: 11), ou SSRIYDMISSLQPYYDMDV (SEQ ID NO: 12).

[0092] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo os domínios LCDR1, LCDR2, e LCDR3 de MEDI-578, variantes das CDRs de cadeia leve MEDI-578 com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido. Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um LCDR1 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 8 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Similarmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um LCDR2 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 9 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Igualmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um LCDR3 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 10 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido.

[0093] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VH pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo a sequência de aminoácido VH da SEQ ID NO: 3.

[0094] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo uma sequência de aminoácido VL pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo a sequência de aminoácido VL da SEQ ID NO: 7.

[0095] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VH pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo a sequência de aminoácido VH da SEQ ID NO: 94.

[0096] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo uma sequência de aminoácido VL pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 95. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo a sequência de aminoácido VL da SEQ ID NO: 95.

[0097] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo os domínios HCDR1, HCDR2, e HCDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 e 96, ou variantes dos mesmos com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido.

[0098] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo os domínios LCDR1, LCDR2, e LCDR3 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 e 97, ou variantes dos mesmos com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido.

[0099] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VH pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 e 96. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo a sequência de aminoácido VH de qualquer uma das SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 e 96.

[00100] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo uma sequência de aminoácido VL pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 e 97. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo a sequência de aminoácido VL de qualquer uma das SEQ ID NOs: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 e 97.

[00101] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo os domínios HCDR1, HCDR2, e HCDR3 de NGF-NG, variantes das CDRs de cadeia pesada de NGF-NG com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido. Por exemplo, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um HCDR1 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 88 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 88 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Similarmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um HCDR2 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 89 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 89 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Igualmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um HCDR3 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 90 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 90 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido.

[00102] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo os domínios LCDR1, LCDR2, e LCDR3 de NGF-NG, variantes das CDRs de cadeia leve NGF-NG com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido. Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um LCDR1 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 91 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 91 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Similarmente, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um LCDR2 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 92 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 92 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido. Igualmente, o anticorpo anti- NGF ou fragmento do mesmo pode compreender um LCDR3 com a sequência de aminoácido exata da SEQ ID NO: 93 ou com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 93 com uma ou mais, por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido.

[00103] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VH pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo a sequência de aminoácido VH da SEQ ID NO: 24.

[00104] Em certos aspectos, o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo uma sequência de aminoácido VL pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26. Em alguns aspectos o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo a sequência de aminoácido VL da SEQ ID NO: 26.

[00105] Um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, molécula ligante multiespecífica como fornecida por esta descrição pode compreender um anticorpo anti-NGF completo, isto é, um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas completas e duas cadeias leves completes em um formato H2L2. Onde o anticorpo anti-NGF é um anticorpo completo, um ou mais domínios antagonistas de TNFα podem ser fundidos ao terminal N ou terminal C de uma ou mais cadeias pesadas do anticorpo anti-NGF ou ao terminal N ou terminal C de uma ou mais cadeias leves do anticorpo anti- NGF. Alternativamente, um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, molécula ligante multiespecífica como fornecido por esta descrição pode compreender um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo anti- NGF. Em certos aspectos um fragmento de anticorpo anti-NGF pode compreender qualquer porção dos domínios constantes do anticorpo ou pode compreender apenas os domínios variáveis. Os fragmentos de anticorpo anti- NGF exemplares para a inclusão em um polipeptídeo bifuncional, por exemplo, molécula ligante multiespecífica, incluem, mas não são limitados a fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab)2 ou fragmentos Fv (scFv) de cadeia única.

[00106] Em certas composições exemplares aqui fornecidas, o anticorpo anti-NGF é um fragmento scFv, por exemplo, um fragmento scFv de MEDI-578, ou uma variante de ligação de NGF do mesmo. Em certas composições exemplares aqui fornecidas, o anticorpo anti-NGF é um fragmento scFv, por exemplo, um fragmento scFv de NGF-NG, ou uma variante de ligação de NGF do mesmo. Um polipeptídeo scFv anti-NGF pode compreender os domínios VH e VL em qualquer ordem, N-VH-VL-C, ou N- VL-VH-C. As moléculas ScFv são tipicamente engenheiradas tal que os domínios VH e VL sejam conectados via um ligador flexível. As estruturas scFv exemplares, incluindo vários ligadores podem ser encontradas em Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393: 672-92 (2009), e na Publicação PCT No. WO 2013/070565, ambos dos quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades. Como é entendido pelas pessoas de habilidade comum na técnica, fragmentos scFv de anticorpo podem ter estabilidade reduzida em relação aos domínios variáveis existindo em uma conformação Fab padrão. Em alguns aspectos o scFv pode ser estruturalmente estabilizado pela introdução de mutações estabilizantes ou pela introdução de ligação(ões) de dissulfeto intercadeia (por exemplo, estabilizada(s) com SS). Entretanto, as mutações estabilizantes e/ou uma ligação de dissulfeto intercadeia introduzida não é requerido e, em certos aspectos, não está presente. Vários métodos reconhecidos na técnica estão disponíveis para estabilizar polipeptídeos de scFv.

[00107] Ligadores podem ser usados para unir os domínios/regiões de polipeptídeos bifuncionais aqui fornecidos. Ligadores podem ser usados para conectar o domínio antagonista de NGF e o domínio antagonista de TNFα de uma molécula bifuncional, e também podem ser usados para interconectar as cadeia pesada e leve variáveis de um scFv. Um exemplo não limitante exemplar de um ligador é uma cadeia de polipeptídeo compreendendo pelo menos 4 resíduos. Porções de tais ligadores podem ser flexíveis, hidrofílicas e têm pouca ou nenhuma estrutura secundária delas próprias (porções ligadoras ou porções ligadoras flexíveis). Ligadores de pelo menos 4 aminoácidos podem ser usados para unir domínios e/ou regiões que estejam posicionadas próximas um dos outros depois que uma molécula de polipeptídeo bifuncional é montada. Ligadores mais longos também podem ser usados. Assim, os ligadores podem ter cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 resíduos. Os ligadores também podem ter, por exemplo, de cerca de 100 a 175 resíduos. Quando ligadores múltiplos são usados para interconectar porções de uma molécula de polipeptídeo bifuncional, os ligadores podem ser os mesmos ou diferentes (por exemplo, o mesmo comprimento e/ou sequência de aminoácido ou diferente).

[00108] O(s) ligador(es) em uma molécula de polipeptídeo bifuncional facilita a formação da estrutura desejada. Os ligadores podem compreender resíduos (Gly-Ser)n (onde n é um número inteiro de pelo menos um, dois e até, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100, ou mais), com alguns resíduos Glu ou Lys dispersos por toda a parte para aumentar a solubilidade. Alternativamente, certos ligadores não compreendem nenhum resíduo de Serina, por exemplo, onde o ligador é submetido à glicosilação ligada em O. Em alguns aspectos, os ligadores podem conter resíduos de cisteína, por exemplo, se a dimerização de ligadores é usada para levar os domínios de um polipeptídeo bifuncional na sua configuração apropriadamente dobrada. Em alguns aspectos, um polipeptídeo bifuncional pode compreender pelo menos um, dois, três, quatro, ou mais polipeptídeos ligadores que unem domínios do polipeptídeo.

[00109] Em alguns aspectos, um polipeptídeo ligador pode compreender de 1 a 50 resíduos, 1 a 25 resíduos, 25 a 50 resíduos, ou 30 a 50 resíduos. Em alguns aspectos, o polipeptídeo ligador pode compreender uma porção de uma porção Fc. Por exemplo, em alguns aspectos, o polipeptídeo ligador pode compreender uma porção de domínio de dobradiça da imunoglobulina de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, e/ou IgG4 ou uma variante do mesmo.

[00110] Em alguns aspectos, um polipeptídeo ligador pode compreender ou consiste de um ligador gly-ser. Como aqui usado, o termo “ligador gly-ser” se refere a um peptídeo que consiste de resíduos de glicina e serina. Um ligador gly-ser exemplar compreende uma sequência de aminoácido da fórmula (Gly4Ser)n, onde n é um número inteiro de pelo menos um, dois e até, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100, ou mais. Em alguns aspectos, um polipeptídeo ligador pode compreender pelo menos uma porção de uma região de dobradiça (por exemplo, derivada de uma molécula de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) e uma série de resíduos de aminoácido gly-ser (por exemplo, um ligador gly-ser tal como (Gly4Ser)n).

[00111] Quando um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, compreende um scFv, um ligador flexível pode conectar as cadeias pesada e leve do scFv. Este ligador flexível geralmente não inclui uma porção de dobradiça, mas ao invés, é um ligador gly-ser ou outro ligador flexível. O comprimento e a sequência de aminoácido de um ligador flexível interconectando domínios de um scFv podem ser facilmente selecionados e otimizados.

[00112] Em certos aspectos, um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, pode compreender um fragmento scFv anti-NGF que compreende, do terminal N para o terminal C, um VH, uma sequência ligadora de 10 aminoácidos (GGGGS)3, e um VL. Em certas modalidades, o ligador unindo o VH e VL do scFv é uma sequência ligadora de 20 aminoácidos (GGGGS)4. Em certos aspectos o VH compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. Em certos aspectos o VL compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, o VH compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 e 96. Em certas modalidades, o VL compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 e 97. Em certos aspectos, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 3, 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 e 96. Em certos aspectos, o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 e 97.

[00113] Em outros aspectos, a estabilidade do polipeptídeo pode ser melhorada pela adição de uma ligação de dissulfeto intercadeia entre o domínio VH e o domínio VL modificando-se certos resíduos dentro do domínio VH e VL para resíduos de cisteína. Ver por exemplo, Michaelson, J. S., et al. (2009) MAbs 1, 128-41; Brinkmann, U., et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7538-42; Young, N. M., et al., (1995) FEBS Lett 377, 135-9. Por exemplo, o resíduo de glicina nas posições 100, 101 ou 102 do VL pode ser modificado para um resíduo de cisteína e o resíduo de glicina na posição 44 do VH pode ser modificado para um resíduo de cisteína.

[00114] Um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica como aqui fornecida pode incluir um domínio antagonista de TNFα. Em certos aspectos, um domínio antagonista de TNFα pode inibir a ligação de TNFα a um receptor de TNF (TNFR) na superfície de células, bloqueando deste modo a atividade de TNF.

[00115] Em certos aspectos, o domínio antagonista de TNFα de um polipeptídeo multifuncional como aqui fornecido é um anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo. Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα é infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, ou um fragmento de ligação de antígeno de qualquer um desses anticorpos.

[00116] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo se liga ao mesmo epítopo como, pode INIBIR competitivamente, ou pode se ligar ao TNFα com uma afinidade maior do que qualquer um dos anticorpos anti-TNFα infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab, ou um fragmento de ligação de antígeno de qualquer um desses anticorpos. Em certos aspectos o anticorpo anti-TNFα é infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab, ou um fragmento de ligação de antígeno de qualquer um desses anticorpos. A estrutura e sequências destes anticorpos anti-TNFα são facilmente disponíveis para o técnico habilitado, e podem ser incluídos em um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como aqui descrita sem experimentação indevida. Um anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo incluídos em um polipeptídeo multifuncional podem ser, por exemplo, humanizados, quiméricos, primatizados, ou totalmente humanos.

[00117] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo os domínios HCDR1, HCDR2, e HCDR3 de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab, ou variantes das CDRs de cadeia pesada infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido.

[00118] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo os domínios LCDR1, LCDR2, e LCDR3 de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab, ou variantes das CDRs de cadeia pesada de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab com até uma, duas, três, quatro, cinco, ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, substituições conservativas de aminoácido.

[00119] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreendem um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VH pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido VH de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab. Em alguns aspectos o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo a sequência de aminoácido VH de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab.

[00120] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo uma sequência de aminoácido VL pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido VL de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab. Em alguns aspectos o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo a sequência de aminoácido VL de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab.

[00121] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VH pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28. Em alguns aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo a sequência de aminoácido VH da SEQ ID NO: 28.

[00122] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VH compreendendo uma sequência de aminoácido VL pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 29. Em alguns aspectos, o anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo compreende um domínio de anticorpo VL compreendendo a sequência de aminoácido VL da SEQ ID NO: 29.

[00123] Um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como fornecida por esta descrição pode compreender um anticorpo anti-TNFα completo, isto é, um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas completas e duas cadeias leves completas em um formato H2L2. Onde o anticorpo anti-TNFα é um anticorpo completo, um ou mais domínios antagonistas de NGF podem ser fundidos ao terminal N ou terminal C de uma ou mais cadeias pesadas do anticorpo anti-TNFα ou ao terminal N ou terminal C de uma ou mais cadeias leves do anticorpo anti-TNFα. Alternativamente, um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como fornecida por esta descrição pode compreender um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo anti- TNFα. Em certos aspectos um fragmento de anticorpo anti-TNFα pode compreender qualquer porção dos domínios constantes do anticorpo ou pode compreender qualquer um dos domínios variáveis. Os fragmentos de anticorpo anti-TNFα exemplares para a inclusão em um polipeptídeo multifuncional incluem, mas não são limitados a fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab)2 ou fragmentos Fv de cadeia única (scFv).

[00124] Em alguns aspectos, a molécula multifuncional é ndimab varB, que é uma molécula compreendendo um anticorpo anti-TNFα completo, isto é, um anticorpo compreendendo duas cadeia pesadas completas e duas cadeias leves completas em um formato H2L2, com scFv MEDI-578 fundido ao terminal C da cadeia pesada do anticorpo anti-TNFα. Ndimab varB compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 20, e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22. Em alguns aspectos, a molécula bifuncional compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 20, e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à SEQ ID NO: 22.

[00125] Em certos aspectos, o anticorpo anti-TNFα é um fragmento scFv, por exemplo, um fragmento scFv derivado de infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ou golimumab, ou uma variante de ligação de TNFα do mesmo. Um polipeptídeo scFv anti-TNFα pode compreender os domínios VH e VL em qualquer ordem, N-VH-VL-C, ou N-VL-VH-C. As moléculas de ScFv são tipicamente engenheiradas tal que os domínios VH e VL são conectados via um ligador flexível, e pode assumir várias estruturas diferentes, como descrito acima. Um polipeptídeo scFv anti-TNFα pode ser estabilizado, também como descrito acima.

[00126] Em certos aspectos, o antagonista de TNFα é um fragmento de ligação de TNFα solúvel de um receptor de TNF, por exemplo, TNFR-1 ou TNFR-2, ou uma variante do mesmo ou um fragmento solúvel do mesmo. Em certos aspectos, o fragmento solúvel de TNFR-1 é um fragmento de 55 kD. Em certas modalidades, o fragmento solúvel de TNFR-2 é um fragmento de 75 kD. Em certos aspectos o fragmento do receptor de TNF é fundido a um polipeptídeo heterólogo, por exemplo, um fragmento Fc da imunoglobulina, por exemplo, um domínio Fc de IgG1. Em certos aspectos, o antagonista de TNFα compreende um aminoácido apresentado na SEQ ID NO: 13, ou um fragmento de ligação de TNFα do mesmo. A porção de TNFR-2 compreende os aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, uma variante de um fragmento solúvel de ligação de TNFα de TNFR-2 compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica aos aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, uma variante de um fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 compreende os aminoácidos de 1 a 235 da SEQ ID NO: 13, exceto, por exemplo, para 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, ou 50 inserções, substituições, ou deleções de aminoácido. A porção Fc de IgG1 compreende os aminoácidos de 236 a 467 da SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, o fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 pode ser fundido a uma porção Fc de qualquer anticorpo humano ou não humano, ou a qualquer outra substância de proteína ou não proteína que forneceria estabilidade, por exemplo, albumina ou polietileno glicol. Em certos aspectos, uma variante de um fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica aos aminoácidos de 236 a 467 da SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, uma variante de um fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 compreende os aminoácidos de 236 a 467 da SEQ ID NO: 13, exceto, por exemplo, para 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, ou 50 inserções, substituições, ou deleções de aminoácido. Em certos aspectos, uma variante de um fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 compreende uma sequência de aminoácido pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, uma variante de um fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 compreende a SEQ ID NO: 13, exceto, por exemplo, para 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, ou 50 inserções, substituições, ou deleções de aminoácido.

[00127] Em certos aspectos, fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 é uma proteína de fusão de cadeia única. Em certos aspectos o fragmento solúvel que liga TNFα de TNFR-2 é um dímero of duas proteínas de fusão, associadas, por exemplo, através de ligações de dissulfeto entre os dois domínios Fc.

[00128] Um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como aqui fornecida pode ter uma variedade de estruturas e conformações diferentes. Em um aspecto, um polipeptídeo multifuncional como aqui fornecido compreende uma proteína de fusão onde o domínio antagonista de NGF, como descrito acima, é fundido ao domínio antagonista de TNFα, como descrito acima, através de um ligador flexível. Os exemplos de ligadores são aqui descritos em outro lugar. Em certos aspectos, o polipeptídeo multifuncional compreende um homodímero da proteína de fusão.

[00129] Em um aspecto exemplar, um polipeptídeo multifuncional é fornecido em que o antagonista de NGF é um domínio scFv anti-NGF derivado, por exemplo, de MEDI-578 e o antagonista TNFα é um fragmento solúvel, Que liga TNFα de TNFR-2 fundido no seu terminal carbóxi a um domínio Fc de imunoglobulina. O scFv anti-NGF pode ser, em alguns aspectos, fundido ao terminal carbóxi do domínio Fc da imunoglobulina via um ligador. Em certos aspectos, monômeros deste polipeptídeo multifuncional formam um homodímero com cada subunidade compreendendo, do terminal N para o terminal C, um fragmento que liga TNFα de 75kD de TNFR-2, um domínio IgG1Fc humano, um ligador de 10 aminoácidos (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 98), um VH anti-NGF compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, uma sequência ligadora de 10 aminoácidos (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15), e um VL anti-NGF compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7. Em um aspecto, o polipeptídeo multifuncional é TNFR2-Fc_VH#4, que compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14. Em alguns aspectos, o polipeptídeo multifuncional compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idêntica à SEQ ID NO: 14.

[00130] Em outro aspecto exemplar, o polipeptídeo multifuncional compreende, do terminal N para o terminal C, um fragmento que liga TNFα de 75 kD de TNFR-2, um domínio IgG1Fc humano, um ligador de 10 aminoácidos (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 98), um VH anti-NGF compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 94, uma sequência ligadora de 20 aminoácido (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19), e um VL anti-NGF compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 95. Em algum aspecto, o polipeptídeo multifuncional é TNFR2-Fc_varB, que compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17. Em alguns aspectos, o polipeptídeo multifuncional compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão compreendendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % idêntica à SEQ ID NO: 17.

Polipeptídeos

[00131] Os polipeptídeos como aqui fornecidos, por exemplo, polipeptídeos multifuncionais compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, ou polipeptídeos individuais compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, respectivamente, podem ser polipeptídeos recombinantes, derivados de polipeptídeos naturais, ou polipeptídeos sintéticos. Será reconhecido na técnica que algumas sequências de aminoácido podem ser variadas sem efeito significante da estrutura ou função da proteína. Assim, a descrição fornece ainda variações de polipeptídeos aqui fornecidos tendo atividade substancial ou que incluem domínios antagonistas de NGF e domínios antagonistas de TNFα. Tais mutantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições, e substituições de tipo.

[00132] Os polipeptídeos e análogos podem ser modificados ainda para conter porções químicas adicionais não normalmente parte da proteína. Aquelas porções derivatizadas podem melhorar a solubilidade, a meia-vida biológica ou absorção da proteína. As porções também podem reduzir ou eliminar quaisquer efeitos colaterais desejáveis das proteínas e os semelhantes. Uma vista geral para estas porções pode ser encontrada em REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

[00133] Em certos aspectos, um polipeptídeo multifuncional aqui fornecido pode incluir um domínio de ligação de NGF ou TNFα que não é um anticorpo. Uma variedade de métodos para identificar e produzir polipeptídeos que se ligam com alta afinidade a uma proteína alvo é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18: 295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15: 14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol., 17: 653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275: 2668-76 (2008), e Skerra, FEBS J., 275: 2677-83 (2008), cada uma da qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em certos aspectos, a tecnologia de demonstração de fago pode ser usada para identificar/produzir os polipeptídeos multifuncionais adequados. Em certos aspectos, um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica aqui fornecida pode compreender um esqueleto de proteína de um tipo selecionado do grupo consistindo de proteína A, uma lipocalina, um domínio de fribronectina, um domínio de repetição de consenso de anquirina, e tiorredoxina.

Polinucleotídeos, vetores, e células hospedeiras

[00134] Esta descrição fornece moléculas de ácido nucléico compreendendo polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo multifuncional compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα. Esta descrição fornece ainda moléculas de ácido nucléico compreendendo polinucleotídeos que codificam polipeptídeos individuais compreendendo, respectivamente, um antagonista de NGF e um antagonista de TNFα. Em certos aspectos tais polinucleotídeos codificam um domínio de peptídeo que especificamente liga NGF ou um fragmento do mesmo, e também liga TNFα ou um fragmento do mesmo. Por exemplo, esta descrição fornece um polinucleotídeo que codifica um domínio de polipeptídeo compreendendo um anticorpo anti-NGF ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, e um domínio de polipeptídeo compreendendo um antagonista de TNFα, tal como um anticorpo anti-TNFα ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou uma porção solúvel que liga TNFα de um receptor de TNF, por exemplo, TNFR2. Os polinucleotídeos podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA. O DNA inclui cDNA, DNA genômico, e DNA sintético; e pode ser de filamento duplo ou de filamento único, e se de filamento único pode ser o filamento codificador ou filamento não codificador (de antissentido).

[00135] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo multifuncional aqui descrito compreende a sequência de nucleotídeo das SEQ ID NOs: 16, 18 ou 99, ou fragmentos das mesmas, ou uma sequência pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica às SEQ ID NOs: 16, 18 ou 99, ou fragmentos das mesmas.

[00136] Os polipeptídeos isolados aqui descritos podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Tais métodos variam de métodos sintéticos de proteína diretos para construir uma sequência de DNA codificando sequências de polipeptídeo isoladas e expressando estas sequências em um hospedeiro transformado adequado. Em alguns aspectos, uma sequência de DNA é construída usando a tecnologia recombinante pela isolação ou sintetização uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo multifuncional compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, ou polipeptídeos individuais compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, respectivamente. Consequentemente, esta descrição fornece um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo bifuncional compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα como descrito em detalhes acima. São fornecidos ainda polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos individuais que compreendem, respectivamente, um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα.

[00137] Em alguns aspectos uma sequência de DNA codificando um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica de interesse ou polipeptídeos individuais compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, respectivamente podem ser construídos pela síntese química usando um sintetizador de oligonucleotídeo. Tais oligonucleotídeos podem ser planejados com base na sequência de aminoácido do polipeptídeo multifuncional desejado e selecionando aqueles códons que são favorecidos na célula hospedeira em que o polipeptídeo recombinante de interesse será produzido. Métodos padrão podem ser aplicados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo multifuncional de interesse. Por exemplo, uma sequência de aminoácido completa pode ser usada para construir um gene retro-traduzido. Além disso, um oligômero de DNA contendo uma sequência de nucleotídeo codificando para o polipeptídeo multifuncional particular ou polipeptídeos individuais podem ser sintetizados. Por exemplo, vários oligonucleotídeos pequenos codificando porções do polipeptídeo desejado podem ser sintetizados e depois ligados. Os oligonucleotídeos individuais tipicamente contêm projeções 5’ ou 3’ para a montagem complementar.

[00138] Em certos aspectos, polinucleotídeos aqui fornecidos podem compreender a sequência codificadora para o polipeptídeo maduro fundido na mesma matriz de leitura a uma sequência marcadora que permite, por exemplo, a purificação do polipeptídeo codificado. Por exemplo, a sequência marcadora pode ser um rótulo de hexa-histidina fornecido por um vetor pQE- 9 para fornecer a purificação do polipeptídeo maduro fundido ao marcador no caso de um hospedeiro bacteriano, ou a sequência marcadora pode ser um rótulo de hemaglutinina (HA) derivado da proteína da hemaglutinina da influenza quando um hospedeiro mamífero (por exemplo, células COS-7) é usado.

[00139] Os polinucleotídeos aqui fornecidos podem conter ainda alterações nas regiões codificadoras, regiões não codificadoras, ou ambos. Em alguns aspectos as variantes de polinucleotídeo contêm alterações que produzem substituições, adições, ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipeptídeo codificado. Em alguns aspectos, variantes de nucleotídeo são produzidas pelas substituições silenciosas devido à degeneração do código genético. As variantes de polinucleotídeo podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para optimizar a expressão de códon para um hospedeiro particular (mudança de códons no mRNA humano para aqueles preferidos por um hospedeiro bacteriano tal como E. coli).

[00140] Vetores e células compreendendo os polinucleotídeos aqui descritos também são fornecidos. Uma vez montados (pela síntese, mutagênese loco-dirigida ou um outro método), as sequências de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo isolado particular de interesse podem ser inseridas em um vetor de expressão e operativamente ligados a uma sequência de controle de expressão apropriada para a expressão da proteína em um hospedeiro desejado. Esta descrição fornece tais vetores. O sequenciamento de nucleotídeo, mapeamento de restrição, e a expressão de um polipeptídeo biologicamente ativo em um hospedeiro adequado podem confirmar a montagem apropriada. Como é bem conhecido na técnica, de modo a se obter níveis de expressão altos de um gene transfectado em um hospedeiro, o gene deve ser operativamente ligado às sequências de controle de expressão transcricional e traducional que sejam funcionais no hospedeiro de expressão escolhido.

[00141] Em certos aspectos, vetores de expressão recombinantes podem ser usados para amplificar e expressar polipeptídeos multifuncionais codificando DNA, por exemplo, as moléculas de ligação multiespecíficas, compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, ou polipeptídeos individuais compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, respectivamente. Os vetores de expressão recombinantes são construções de DNA replicáveis que têm fragmentos de DNA sintéticos ou derivados de cDNA codificando um polipeptídeo multifuncional ou polipeptídeos individuais compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα, respectivamente, operativamente ligados aos elementos reguladores transcricionais ou traducionais adequados derivados de genes mamíferos, microbianos, virais ou de inseto. Uma unidade transcricional geralmente compreende uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos tendo um papel regulador na expressão de gene, por exemplo, promotores ou realçadores transcricionais, (2) uma sequência estrutural ou codificadora que é transcrita em mRNA e traduzida em proteína, e (3) sequências apropriadas de início e término de transcrição e tradução, como descritos em detalhes abaixo. Tais elementos reguladores podem incluir uma sequência operadora para controlar a transcrição. A capacidade para replicar em um hospedeiro, usualmente conferido por uma origem de replicação, e um gene de seleção para facilitar o reconhecimento de transformantes pode ser adicionalmente incorporado. As regiões de DNA são operativamente ligadas quando elas estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, o DNA para um peptídeo de sinal (líder secretor) está operativamente ligado ao DNA por um polipeptídeo se o mesmo é expresso como um precursor que participa na secreção do polipeptídeo; um promoter é operativamente ligado a uma sequência codificadora se o mesmo controla a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossoma é operativamente ligado a uma sequência codificadora se a mesma é posicionada de modo a permitir a tradução. Os elementos traducionais pretendidos para o uso em sistemas de expressão de levedura incluem uma sequência líder que permite a secreção extracelular de proteína traduzida por uma célula hospedeira. Alternativamente, onde a proteína recombinante é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, a mesma pode incluir um resíduo de metionina de terminal N. Este resíduo pode opcionalmente ser subsequentemente clivado da proteína recombinante expressa para fornecer um produto final.

[00142] A escolha de sequência de controle de expressão e vetor de expressão dependerá da escolha do hospedeiro. Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser utilizada. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros eucarióticos incluem, por exemplo, vetores compreendendo sequências de controle de expressão de SV40, vírus do papiloma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vetores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos incluem plasmídeos bacterianos conhecidos, tais como plasmídeos de E. coli, incluindo pCR1, pBR322, pMB9 e seus derivados, plasmídeos de faixa de hospedeiro ampla, tal como M13 e fagos filamentosos de DNA de filamento único.

[00143] Esta descrição fornece ainda células hospedeiras compreendendo polinucleotídeos codificando os polipeptídeos aqui fornecidos. As células hospedeiras adequadas para a expressão dos polipeptídeos aqui fornecidos incluem células procariotas, de levedura, de inseto ou eucarióticas superiores sob o controle de promotores apropriados. As procariotas incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo E. coli ou bacilos. As células eucarióticas superiores incluem linhagens de célula estabelecidas de origem mamífera como descritas abaixo. Os sistemas de tradução isentos de célula também podem ser utilizados. Vetores de clonagem e expressão apropriados para o uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura, e mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985), a descrição relevante do qual é por meio deste incorporada por referência. Informação adicional com respeito aos métodos de produção de proteína, incluindo produção de anticorpo, podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. No. 2008/0187954, Patentes U.S. Nos. 6.413.746 e 6.660.501, e Publicação de Patente Internacional No. WO 04009823, cada uma da qual é por meio deste aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[00144] Vários sistemas de cultura de célula de mamífero ou inseto também podem ser vantajosamente utilizados para expressar proteína recombinante. A expressão de proteínas recombinantes em células de mamífero pode ser realizada porque tais proteínas são de modo geral corretamente dobradas, apropriadamente modificadas e completamente funcionais. Os exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamífero adequadas incluem HEK-293 e HEK-293T, as linhagens COS-7 de células renais de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981), e outras linhagens de célula incluindo, por exemplo, células L, C127, 3T3, linhagens de célula do ovário do hamster chinês (CHO), HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamífero podem compreender elementos não transcritos tais como uma origem de replicação, um promotor adequado e realçador ligado ao gene a ser expresso, e outras sequências flanqueadoras 5’ ou 3’ não transcritas, e sequências 5’ ou 3’ não traduzidas, tais como sítios de ligação de ribossoma necessários, um sítio de poliadenilação, doador de junção e sítios aceitadores, e sequências de terminação transcricional. Sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de inseto são revisadas por Luckow e Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988).

[00145] Esta descrição fornece ainda um método de produzir o polipeptídeo multifuncional como aqui descrito, ou para produzir polipeptídeos individuais compreendendo, respectivamente um antagonista de NGF, e um antagonista de TNFα. O método acarreta necessariamente cultivar uma célula hospedeira como descrita acima sob condições que promovam a expressão do polipeptídeo multifuncional ou polipeptídeos individuais, e recuperar o polipeptídeo multifuncional ou polipeptídeos individuais.

[00146] Para a produção de longa duração, alto desempenho de proteínas recombinantes, a expressão estável é apropriada. Por exemplo, as linhagens de célula que estavelmente expressam o polipeptídeo multifuncional podem ser engenheiradas. Ao invés de usar vetores de expressão que contenham origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado pelos elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, realçador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. A seguir da introdução do DNA estranho, as células engenheiradas podem ser deixadas crescer por 1 a 2 dias em um meio enriquecido, e depois são intercalados com um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células estavelmente se integrem no plasmídeo dentro dos seus cromossomas e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos nas linhagens de célula. Este método pode ser usado para engenheirar linhagens de célula que expressam o polipeptídeo multifuncional.

[00147] Em certas modalidades, os polipeptídeos multifuncionais aqui apresentados são expressos em uma linhagem de célula com expressão transitória do polipeptídeo multifuncional. A transfecção transitória é um processo em que o ácido nucléico introduzido em uma célula não integra no genoma ou DNA cromossômico desta célula mas é mantido como um elemento extracromossômico, por exemplo, como um epissoma, na célula. Os processos de transcrição do ácido nucléico do epissoma não são afetados e uma proteína codificada pelo ácido nucléico do epissoma é produzido.

[00148] A linhagem de célula, estável ou transitoriamente transfectada, é mantida no meio de cultura de célula e condições conhecidas na técnica resultando na expressão e produção de polipeptídeos. Em certas modalidades, o meio de cultura de célula de mamífero é fundamentado nas formulação de meio comercialmente disponíveis, incluindo, por exemplo, DMEM ou F12 de Ham. Em algumas modalidades, o meio de cultura de célula é modificado para sustentar o aumento tanto no crescimento de célula quanto na expressão de proteína biológica. Como aqui usado, os termos “meio de cultura de célula,” “meio de cultura,” e “formulação de meio” se refere a uma solução nutritiva para a manutenção, crescimento, propagação, ou expansão de células em um ambiente in vitro artificial fora de um organismo ou tecido multicelulares. O meio de cultura de célula pode ser otimizado para um uso específico da cultura de célula, incluindo, por exemplo, meio de crescimento de cultura de célula que é formulado para promover o crescimento celular, ou meio de produção de cultura de célula que é formulado para promover a produção de proteína recombinante. Os termos nutriente, ingrediente, e componente podem ser usados intercambiavelmente para se referir aos constituintes que compõem um meio de cultura de célula.

[00149] Em vários modalidades, as linhagens de célula são mantidas usando um método de lote alimentado. Como aqui usado, “método de lote alimentado,” se refere a um método pelo qual que uma cultura de célula de lote alimentado é fornecido com nutrientes adicionais depois de ser primeiro incubado com um meio basal. Por exemplo, um método de lote alimentado pode compreender adicionar meio suplementar de acordo com um programa de alimentação determinado dentro de um dado período de tempo. Assim, uma “cultura de célula de lote alimentado” se refere a uma cultura de célula onde as células, tipicamente de mamífero, e meio de cultura são fornecidos ao vaso de cultura inicialmente e nutrientes de cultura adicionais são alimentados, continuamente ou em incrementos separados, à cultura durante o cultivo, com ou sem colheita periódica de célula e/ou produto antes do término da cultura.

[00150] Em algumas modalidades, o meio de cultura de célula compreende um meio basal e pelo menos um hidrolisado, por exemplo, hidrolisado com base em soja, um hidrolisado com base em levedura, ou uma combinação dois tipos de hidrolisados resultando em um meio basal modificado. Os nutrientes adicionais podem algumas vezes incluir apenas um meio basal, tal como um meio basal concentrado, ou podem incluir apenas hidrolisados, ou hidrolisados concentrados. Os meios basais adequados incluem, mas não são limitados a Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), DME/F12, Meio Essencial Mínimo (MEM), Medio Basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, Meio Essencial Mínimo .alfa. (.alfa.-MEM), Meio Essencial Mínimo de Glasgow (G-MEM), PF CHO (ver, por exemplo, meio isento de proteína CHO (Sigma) ou Meio Isento de Soro EX-CELL® 325 PF CHO para Células CHO Isentas de Proteína (SAFC Bioscience), e Meio de Dulbecco Modificado de Iscove. Outros exemplos de meio basal que podem ser usados na tecnologia aqui incluem Meio Basal BME (Gibco- Invitrogen; Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, pó) (Gibco- Invitrogen (#31600)).

[00151] Em certas modalidades, o meio basal pode ser isento de soro, significando que o meio não contém nenhum soro (por exemplo, soro bovino fetal (FBS), soro de cavalo, soro de cabra, ou qualquer outro soro derivado de animal conhecido por uma pessoa habilitada na técnica) ou meio isento de proteína animal ou meios quimicamente definidos.

[00152] O meio basal pode ser modificado de modo a remover certos componentes não nutricionais encontrados no meio basal padrão, tais como vários tampões inorgânicos e orgânicos, orgânico(s), e cloreto de sódio. A remoção de tais componentes do meio basal de célula permite uma concentração aumentada dos componentes nutricionais remanescentes, e pode melhorar o crescimento de célula global e expressão de proteína. Além disso, os componentes omitidos podem ser adicionados de volta no meio de cultura de célula contendo o meio basal de célula modificado de acordo com as exigências das condições de cultura de célula. Em certas modalidades, o meio de cultura de célula contém um meio basal de célula modificado, e pelo menos um dos seguintes nutrientes, uma fonte de ferro, um fator de crescimento recombinante; um tampão; um orgânico; um regulador de osmolaridade; uma fonte de energia; e hidrolisados não animais. Além disso, o meio basal de célula modificado pode opcionalmente conter aminoácidos, vitaminas, ou uma combinação tanto de aminoácidos quanto de vitaminas. Em algumas modalidades, o meio basal modificado contém ainda glutamina, por exemplo, L-glutamina, e/ou metotrexato.

[00153] Em algumas modalidades, a produção de proteína é conduzida em grande quantidade por um processo de biorreator usando lote alimentado, lote, perfusão ou métodos de biorreator de alimentação contínua conhecido na técnica. Os biorreatores de larga escala têm pelo menos 50 litros de capacidade, algumas vezes de cerca de mais do que 500 litros ou 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes biorreatores podem usar pás agitadoras para distribuir oxigênio e nutrientes. Biorreatores em escala pequena se referem geralmente ao cultivo de célula em não mais do que aproximadamente 100 litros em capacidade volumétrica, e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros. Alternativamente, biorreatores de uso único (SUB) podem ser usados para o cultivo em larga escala ou escala pequena.

[00154] A temperatura, pH, agitação, aeração e densidade de inóculo podem variar dependendo das células hospedeiras usadas e da proteína recombinante a ser expressa. Por exemplo, uma cultura de célula de proteína recombinante pode ser mantida em uma temperatura entre 30 e 45 graus Celsius. O pH do meio de cultura pode ser monitorado durante o processo de cultura tal que o pH se situe em um nível ideal, que pode estar para certas células hospedeiras, dentro de uma faixa de pH de 6,0 a 8,0. Um misturador acionado por impulsor pode ser usado para tais métodos de cultura para agitação. A velocidade rotacional do impulsor pode ser de aproximadamente 50 a 200 cm/s de velocidade de ponta, mas outros sistema aéreos ou outros sistemas de mistura/aeração conhecidos na técnica podem ser usados, dependendo do tipo de célula hospedeira que é cultivada. A aeração suficiente é fornecida para manter uma concentração de oxigênio dissolvido de aproximadamente 20 % a 80 % de saturação de ar na cultura, mais uma vez, dependendo da célula hospedeira selecionada que é cultivada. Alternativamente, um biorreator pode espargir ar ou oxigênio diretamente no meio de cultura. Outros métodos de fornecimento de oxigênio existem, incluindo sistemas de aeração livre de bolhas utilizando aeradores de membrana de fibra oca.

Proteína de purificação

[00155] As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado como descrito acima podem ser purificadas de acordo com qualquer método adequado. Tais métodos padrão incluem cromatografia (por exemplo, cromatografia de coluna de troca iônica, afinidade e classificação por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteína. Os rótulos de afinidade tais como hexa-histidina, domínio de ligação de maltose, sequência de revestimento de influenza e glutationa-S-transferase pode ser ligada à proteína para permitir purificação fácil pela passagem em uma coluna de afinidade apropriada. As proteínas isoladas também podem ser fisicamente caracterizadas usando tais técnicas como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia de raio X.

[00156] Por exemplo, os sobrenadantes de sistemas que secretam proteína recombinante em meio de cultura pode ser primeiro concentrado usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. A seguir da etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada. Alternativamente, uma resina de troca de ânion pode ser utilizada, por exemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos de dietilaminoetila pendentes (DEAE). As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos habitualmente utilizados na purificação de proteína. Alternativamente, uma etapa de troca de cátion pode ser utilizada. Os trocadores de cátion adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropila ou carboximetila. Finalmente, uma ou mais etapas de cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP-HPLC) utilizando meios hidrofóbicos de RP-HPLC, por exemplo, gel de sílica tendo grupos metila pendentes ou outros alifáticos, podem ser utilizados para purificação adicional de um agente de ligação de NGF. Algumas ou todas das etapas de purificação precedentes, em várias combinações, também podem ser utilizadas para fornecer uma proteína recombinante homogênea.

[00157] A proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada, por exemplo, pela extração inicial de grânulos celulares, seguida por uma ou mais etapas de concentração, dessalinização, troca de íon aquoso ou cromatografia de exclusão de tamanho. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser utilizada para as etapas de purificação final. As células microbianas utilizadas na expressão de uma proteína recombinante podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclagem de congelamento-descongelamento, sonificação, rompimento mecânico, ou uso de agentes de lisagem de célula.

[00158] Métodos conhecidos na técnica para purificar polipeptídeos recombinantes também incluem, por exemplo, aqueles descritos na Publicação de Patente U.S. No. 2008/0312425, 2008/0177048, e 2009/0187005, cada uma das quais é por meio deste aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Métodos de uso e composições farmacêuticas

[00159] Esta descrição fornece métodos para controlar ou tratar dor em um indivíduo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo multifuncional antagonista de TNFα e NGF, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como aqui fornecida ou compreendendo a coadministração de um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF. Em certos aspectos, o indivíduo é um ser humano.

[00160] Esta descrição fornece ainda composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo multifuncional antagonista de TNFα e NGF, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como aqui fornecida ou compreendendo uma combinação de um antagonista de TNFα e um antagonista d e NGF como aqui fornecido. Em certos aspectos, as composições farmacêuticas compreendem ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições farmacêuticas são úteis no tratamento da dor, por exemplo, dor neuropática e inflamatória (por exemplo, osteo ou reumatoide-artrítica).

[00161] Os polipeptídeos multifuncionais e composições compreendendo um antagonista de NGF e um antagonista de TNFα aqui fornecidos podem ser úteis em uma variedade de aplicações incluindo, mas não limitados ao controle ou tratamento de dor, por exemplo, dor neuropática. Os métodos de uso podem ser métodos in vitro, ex vivo, ou in vivo.

[00162] Em certos aspectos, a doença, distúrbio, ou condição tratadas com o agente ligador de NGF (por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo) estão associados com dor. Em certos aspectos, a dor está associada com dor nociceptiva crônica, dor lombar crônica, dor neuropática, dor de câncer, dor da neuralgia pós-herpética (PHN), ou condições de dor visceral.

[00163] Esta descrição fornece um método para controlar dor em um indivíduo, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de controlar dor uma quantidade eficaz de um antagonista do fator de crescimento de nervo (NGF) e um antagonista do fator de necrose de tumor (TNFα), em que a administração pode controlar dor no indivíduo mas eficazmente do que uma quantidade equivalente do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα administrados sozinhos.

[00164] Em certos aspectos, a administração é uma co-administração de um antagonista de NGF e um antagonista de TNFα como uma terapia de combinação. Como aqui debatido em outro lugar, os componentes individuais pode ser administrado simultânea ou sequencialmente. O antagonista de NGF ou o antagonista de TNFα individuais podem ser qualquer antagonista de NGF ou de TNFα aqui fornecidos, por exemplo, um fragmento do receptor de TrkA que liga NGF solúvel, um anticorpo anti-NGF ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, um fragmento de um receptor de TNF que liga TNFα solúvel, por exemplo, TNFR-2, ou um anticorpo anti-TNFα ou fragmento do mesmo, por exemplo, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, ou um fragmento de ligação de antígeno de qualquer um desses anticorpos.

[00165] A coadministração pode compreender várias doses de cada um dos antagonistas como necessário para controlar dor. Em alguns aspectos, a coadministração pode incluir doses mais baixas ou doses menos frequentes de cada componente do que seria normalmente administrado como uma terapia individual, fornecendo deste modo segurança, conveniência, e economia adicionais.

[00166] Em certos aspectos, o método de controlar dor como aqui fornecido compreende a administração de um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα. Os polipeptídeos multifuncionais exemplares para o uso nesse método são aqui descritos em detalhes. Com base na descrição, polipeptídeos multifuncionais adicionais úteis nestes método estarão evidentes para a pessoa de habilidade comum na técnica.

[00167] Por controlar dor “mais eficazmente” do que os componentes administrados sozinhos é intencionado que o tratamento de combinação seja mais eficaz no controle da dor do que as quantidades equivalentes de cada um do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα administrados individualmente. Em certos aspectos, e como descrito em mais detalhes abaixo, o método de controlar dor aqui fornecido pode fornecer eficácia sinergística, por exemplo, o efeito da administração tanto do antagonista de NGF quanto do antagonista de TNFα pode fornecer mais do que um efeito aditivo, ou pode ser eficaz onde nem o antagonista de NGF nem o antagonista de TNFα são eficazes individualmente. Em certos aspectos a combinação pode permitir a dose econômica, por exemplo, as dosagens eficazes dos componentes individuais quando coadministrados podem ser menores do que as doses eficazes de cada componente individualmente.

[00168] Em certos aspectos, o método de controlar dor aqui fornecido é pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % 80 %, 90 %, ou 100 % mais eficaz no controle de dor no indivíduo do que uma quantidade equivalente do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα administrados sozinho. Em certos aspectos, as dosagens do antagonista de NGF individual ou do antagonista de TNFα co-administrado ao indivíduo ou a dose da dose relativa do antagonista de NGF ou do antagonista de TNFα fornecida na administração de um polipeptídeo bifuncional aqui fornecido pode ser mais baixa, por exemplo, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % mais baixa do que as dosagens necessárias para os componentes administrados sozinhos.

[00169] A eficácia do controle de dor pode ser medida pedindo a um paciente para classificar a qualidade e intensidade de dor experienciada de acordo com várias escalas diferentes. Uma escala de dor verbal usa palavras para descrever uma faixa de nenhuma dor, dor branda, dor moderada e dor severa com uma contagem de 0 a 3 designada para cada uma. Alternativamente um paciente pode ser pedido para classificar a sua dor de acordo com uma escala de dor numérica dor de 0 (nenhuma dor) a 10 (pior dor possível). Em uma escala visual análoga (VAS) uma linha vertical ou horizontal tem palavras para descrever a dor de nenhuma dor até a pior dor possível e o paciente é solicitado a marcar a linha no ponto que representa o seu nível corrente de dor. O índice de dor de McGill possibilita que os pacientes descrevam tanto a qualidade quanto a intensidade da dor pela seleção das palavras que melhor descrevem a sua dor de uma série de listas curtas por exemplo, percuciente, queimadura, penetrante. Outras escalas de dor podem ser usadas para adultos que experienciam dificuldades usando VAS ou escalas numéricas por exemplo, FACES ou para pacientes não verbais por exemplo, escala de classificação comportamental. A contagem da atividade funcional relata quão impedido um paciente está pela sua dor pedindo que ele realize uma tarefa relacionada com a área dolorosa. Melhoras na classificação da dor usando estes tipos de escalas potencialmente indicaria uma melhora na eficácia de um analgésico.

[00170] De acordo com o método de controlar dor aqui fornecido, a administração é suficiente para controlar dor em um indivíduo em necessidade de controle da dor, por exemplo, a coadministração de um antagonista de NGF e um antagonista de TNFα, ou administração de um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica compreendendo um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα pode prevenir, reduzir, melhorar, ou eliminar a dor no indivíduo. Em certos aspectos, a dor pode ser dor aguda, dor de curta duração, persistente ou dor nociceptiva crônica, ou dor neuropática persistente ou crônica.

[00171] Em certos aspectos, as formulações são preparadas para armazenagem e uso combinando-se um polipeptídeo multifuncional antagonista de TNFα e NGF, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica como aqui fornecida ou uma combinação de um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF como aqui fornecidos, com um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, carregador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Edição Mack Publishing, 2000). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não são limitados a, tampões não tóxicos tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; sais tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservantes (por exemplo, cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (por exemplo, menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácido); proteínas tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; carboidratos tais como monossacarídeos, dissacarídeos, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e orgânicos não iônicos tais como TWEEN ou polietileno glicol (PEG).

[00172] Os polipeptídeos multifuncionais da presente descrição podem ser formulados nas formas líquidas, semissólidas ou sólidas dependendo das propriedades físico-químicas da molécula e da via de liberação. As formulações podem incluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e orgânicos. As formulações líquidas podem incluir uma ampla faixa de concentrações de polipeptídeo e pH. As formulações sólidas podem ser produzidas pela liofilização, secagem por pulverização, ou secagem pela tecnologia de fluido supercrítico, por exemplo. Em algumas modalidades, qualquer uma das formulações aqui descritas é uma formulação liofilizada.

[00173] Em uma forma de realização específica, um polipeptídeo multifuncional da descrição é formulado em fosfato de sódio 20 mM, 50 mM de L-arginina-HCl, 150 mM de sacarose, 0,03 % (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5.

[00174] Uma composição farmacêutica aqui fornecida pode ser administrada em qualquer número de modos para o tratamento local ou sistêmico. A administração pode ser tópica (tal como às membranas mucósicas incluindo liberação vaginal e retal) tais como emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, pulverizações, líquidos e pós; pulmonar (por exemplo, pela inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmico e transdérmico); oral; ou parenteral incluindo a administração ou infusão intravenosa, intrarterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou intracraniana (por exemplo, intratecal ou intraventricular).

[00175] Um polipeptídeo multifuncional antagonista de TNFα e NGF como aqui fornecido ou uma combinação de um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF como aqui fornecida podem ser combinados ainda em uma formulação de combinação farmacêutica, ou regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo (ou terceiro) composto tendo propriedades antinociceptivas.

[00176] Para o tratamento de dor, a dosagem apropriada de um polipeptídeo multifuncional antagonista de TNFα e NGF, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica como aqui fornecida ou uma combinação de um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF como aqui fornecida depende do tipo de dor a ser tratada, da severidade e curso da dor, da responsividade da dor, se o polipeptídeo multifuncional ou combinação de polipeptídeo são administrados para propósitos terapêuticos ou profiláticos, terapia anterior, história clínica do paciente, e assim por diante todos no discrição do médico do tratamento. O polipeptídeo multifuncional ou combinação de polipeptídeo podem ser administrados de uma vez ou em uma série de tratamentos durante de vários dias a vários meses para manter eficaz o controle da dor. Os programas de dosagem ideal podem ser calculados a partir das medições de acúmulo de droga no corpo do paciente e variará dependendo da potência relativa de um anticorpo ou polipeptídeo individuais. O médico administrador pode facilmente determinar as dosagens ideais, metodologias de dosagem e taxas de repetição.

[00177] A administração de um polipeptídeo multifuncional, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, ou terapia de combinação de polipeptídeo como aqui fornecidas pode fornecer “sinergia” e se mostra “sinergística”, isto é o efeito obtido quando os ingredientes ativos usados juntos é maior do que a soma dos efeitos que resultam do uso dos compostos separadamente. Um efeito sinergístico pode ser atingido quando os ingredientes ativos são: (1) administrados como um polipeptídeo multifuncional único de fusão; (2) coformulado e administrado ou liberado simultaneamente em uma formulação de dosagem unitária, combinada; (3) liberada pela alternação ou em paralelo como formulações separadas; ou (4) por alguns outros regimes. Quando liberados em terapia de alternação, um efeito sinergístico pode ser atingido quando os compostos são administrados ou liberados sequencialmente, por exemplo, pelas injeções diferentes em seringas separadas. No geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem eficaz de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, ao passo que na terapia de combinação, as dosagens eficazes de dois ou mais ingredientes ativos são administrados juntos.

Dor

[00178] No seu uso mais amplo, “dor” se refere a um fenômeno experiencial que é altamente subjetivo para o indivíduo que o experencia, e é influenciado pelo estado mental do indivíduo, incluindo fundo ambiental e cultural. A dor “física” usualmente pode estar ligada a um estímulo percebível para uma terceira parte que é causativa de dano de tecido real ou potencial. Neste sentido, a dor pode ser considerada como uma “experiência sensorial e emocional associada com o dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de tal dano”, de acordo com a International Association for the Study of Pain (IASP). Entretanto, alguns casos de dor não têm nenhuma causa percebível. Por exemplo, dor psicogênica, incluindo exacerbação de uma dor física pré-existente pelos fatores psicogênicos ou síndromes de uma dor percebida, algumas vezes persistente em pessoas com distúrbios psicológicos sem nenhuma evidência de uma cause perceptível de dor.

Tipos de Dor

[00179] Dor inclui dor nociceptiva, dor neuropática/neurogênica, dor episódica, alodinia, hiperalgesia, hiperestesia, disestesia, parestesia, hiperpatia, dor de membro fantasma, dor psicogênica, anestesia dolorosa, neuralgia, neurite. Outras categorizações incluem dor maligna, dor anginal, e/ou dor idiopática, síndrome I da dor regional complexa, síndrome II da dor regional complexa. Os tipos e sintomas de dor não precisam ser mutuamente exclusivas. Estes termos são intencionados como definido pela IASP.

[00180] A dor nociceptiva é iniciada pelos nociceptores sensoriais especializados nos nervos periféricos em resposta aos estímulos noxiais, codificando os estímulos noxiais nos potenciais de ação. Nociceptores, geralmente nas fibras Aδ e fibras C (Polimodais), são terminações nervosas livres que terminam exatamente abaixo da pele, nos tendões, juntas, e nos órgãos do corpo. Os neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) fornecem um sítio de comunicação entre a periferia e a medula espinhal. O sinal é processado através da medula espinhal para o tronco cerebral e sítios talâmicos e finalmente para o córtex cerebral, onde o mesmo usualmente (mas nem sempre) evoca uma sensação de dor. A dor nociceptiva pode resultar de uma ampla variedade de um evento químico, térmico, biológico (por exemplo, inflamatório) ou mecânico que tem o potencial para irritar ou danificar o tecido corporal, que está geralmente acima de um certo limiar mínimo de intensidade requerida para causar a atividade nociceptiva nos nociceptores.

[00181] A dor neuropática é geralmente o resultado do funcionamento anormal no sistema nervoso periférico ou central, dando origem à dor neuropática periférica ou central, respectivamente. A dor neuropática é definida pela IASP como dor iniciada ou causada por uma lesão ou disfunção primária no sistema nervoso. A dor neuropática frequentemente envolve dano real ao sistema nervoso, especialmente nos casos crônicos. A dor nociceptiva inflamatória é geralmente um resultado do dano tecidual e do processo inflamatório resultante. A dor neuropática pode persistir bem depois (por exemplo, meses ou anos) além da cura aparente de qualquer dano observável aos tecidos.

[00182] Nos casos de dor neuropática, o processamento sensorial de uma região afetada pode se tornar estímulos anormais e inócuos (por exemplo, térmico, toque/pressão) que normalmente não causariam dor podem causar (isto é, alodinia) ou estímulos nóxios podem evocar percepções exageradas de dor (isto é, hiperalgesia) em resposta a um estímulo normalmente doloroso. Além disso, sensações similares aos formigamentos ou choques elétricos ou “alfinetes e agulhas” (isto é, parestesias) e/ou sensações tendo qualidades desagradáveis (isto é, disestesias) podem ser evocadas pelos estímulos normais. A dor episódica é um agravamento da dor crônica pré-existente. Hiperpatia é uma síndrome dolorosa que resulta de uma reação anormalmente dolorosa a um estímulo. O estímulo na maioria dos casos é repetitivo com um limiar de dor aumentado, que pode ser considerado como a última experiência de dor que um paciente pode reconhecer como dor.

[00183] Os exemplos de dor neuropática incluem alodinia táctil (por exemplo, induzida depois da lesão nervosa), neuralgia (por exemplo, neuralgia pós herpética (ou após herpes zoster), neuralgia trigeminal), distrofia/causalgia simpática reflexiva (trauma de nervo), componentes de dor de câncer (por exemplo, dor devido ao próprio câncer ou condições associadas tais como inflamação, ou devido ao tratamento tal como quimioterapia, cirurgia ou radioterapia), dor de membro fantasma, neuropatia de aprisionamento (por exemplo, síndrome do túnel carpal), e neuropatias tais como neuropatia periférica (por exemplo, devido à diabete, HIV, uso crônico de álcool, exposição a outras toxinas (incluindo muitas quimioterapias), deficiências de vitamina, e uma grande variedade de outras condições médicas). A dor neuropática inclui dor induzida pela expressão de operação patológica do sistema nervoso a seguir da lesão ao nervo devido a várias causas, por exemplo, operação cirúrgica, ferimentos, herpes zoster, neuropatia diabética, amputação de pernas e braços, câncer, e os semelhantes. As condições médicas associadas com a dor neuropática incluem lesão traumática de nervo, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, seringomielia, lesão da medula espinhal, e câncer.

[00184] Um estímulo que causa dor frequentemente evoca uma resposta inflamatória que por si só pode contribuir para uma experiência de dor. Em algumas condições a dor parece ser causada por uma mistura complexa de fatores nociceptivos e neuropáticos. Por exemplo, a dor crônica frequentemente compreende dor nociceptiva inflamatória ou dor neuropática, ou uma mistura de ambos. Uma disfunção ou lesão do sistema nervoso inicial pode deflagrar a liberação neural de mediadores inflamatórios e inflamação neuropática subsequente. Por exemplo, dores de cabeça enxaquecosas podem representar uma mistura de dor neuropática e nociceptiva. Também, dor miofascial é provavelmente secundária à entrada nociceptiva dos músculos, mas a atividade muscular anormal pode ser o resultado de condições neuropáticas.

Kits compreendendo antagonistas de TNFα e NGF

[00185] Esta descrição fornece kits que compreendem um polipeptídeo multifuncional antagonista de TNFα e NGF, por exemplo, uma molécula ligante multiespecífica, como aqui fornecida ou uma combinação de um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF como aqui fornecida, que pode ser usada para realizar os métodos aqui descritos. Em certos aspectos, um kit compreende pelo menos um polipeptídeo multifuncional de fusão compreendendo um antagonista de TNFα e um antagonista de NGF, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14 ou 17, em um ou mais recipientes, ou uma combinação de um antagonista de NGF, por exemplo, MEDI-578, e um antagonista de TNFα, por exemplo, um anticorpo anti-TNFα tal como infliximab ou adalimumab, ou um fragmento solúvel que liga TNFα de um receptor de TNF, por exemplo, TNFR2-Fc. Uma pessoa habilitada na técnica facilmente reconhecerá que os antagonistas de TNFα e NGF descritos aqui fornecidos podem ser facilmente incorporados em um dos formatos de kit estabelecidos, que são bem conhecidos na técnica.

EXEMPLOS

[00186] A descrição agora sendo geralmente descrita, será mais facilmente entendida por referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente para os propósitos de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente descrição, e não são intencionados a limitar a descrição.

Exemplo 1 - Construção e Caracterização de uma molécula ligante multiespecífica scFv Anti NGF / TNFR2-Fc

[00187] Uma molécula multifuncional, especificamente, uma molécula ligante multiespecífica compreendendo um domínio de anticorpo anti NGF e um domínio TNFR2-Fc foi produzido como segue. O fragmento de anticorpo scFv anti-NGF foi fundido ao terminal C de uma proteína de fusão TNFR2-Fc (SEQ ID NO: 13) via o domínio CH3 de cadeia pesada, de acordo com o formato Bs3Ab descrito em Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393: 672-92 (2009), e na Publicação PCT No. WO 2013/070565. Um diagrama da estrutura é mostrado na Fig. 1. As construções de DNA codificando o polipeptídeo TNFR2-Fc e a molécula ligante multiespecífica foram sintetizados pela GeneArt (Invitrogen). Para a molécula ligante multiespecífica, um scFv anti-NGF compreendendo os domínios VH (SEQ ID NO: 3) e VL (SEQ ID NO: 7) de MEDI-578 unidos juntos via uma sequência ligadora de 15 aminoácidos (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 15) foi construída. O terminal N do scFv foi fundido, via uma sequência ligadora de 10 aminoácidos (GGGGS)2, ao terminal C da SEQ ID NO: 13. Esta molécula ligante multiespecífica é aqui aludida como TNFR2-Fc_VH#4. A construção do DNA codificando a molécula ligante multiespecífica foi engenheirada para conter um códon de parada e um sítio de restrição EcoRI na extremidade 3’ para clonar no vetor de expressão Bs3Ab. A sequência de DNA codificando TNFR2-Fc_VH#4 é apresentada como a SEQ ID NO: 16 e a sua sequência de aminoácido como SEQ ID NO: 14.

[00188] A termoestabilidade da molécula ligante multiespecífica de TNF-NGF foi melhorada pela adição de uma ligação de dissulfeto intercadeia entre os domínios VH e VL da porção MEDI-578 scFv da molécula ligante multiespecífica. Isto foi feito pela introdução de uma mutação de G^C no aminoácido 44 do domínio VH (SEQ ID NO: 94) e no aminoácido 102 do domínio VL (SEQ ID NO: 95). Este clone foi designado TNFR2-Fc_varB. A sequência de aminoácido de TNFR2-Fc_varB é apresentada como SEQ ID NO: 17. Uma sequência de DNA codificando TNFR2-Fc_varB é apresentada como a SEQ ID NO: 18. Uma sequência de DNA otimizada no códon codificando TNFR2-Fc_varB é apresentada na SEQ ID NO: 99. TNFR2- Fc_varB difere ainda da TNFR2-Fc_VH#4 em que a sequência ligadora de 15 aminoácidos (GGGGS)3 unindo o VH e VL da porção scFv é substituída com um ligador de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19). A fluorimetria de varredura diferencial (DSF) foi usada para medir a Tm de TNFR2- Fc_VH#4 e TNFR2-Fc_varB. Este método mede a incorporação de um corante fluorescente, Sypro Orange (Invitrogen), que liga às superfícies hidrofóbicas reveladas durante a desdobra do domínio de proteína na exposição às temperaturas elevadas. No ensaio de DSF, a Tm de TNFR2- Fc_VH#4 foi de 62 °C, ao passo que a Tm de TNFR2-Fc_varB foi de 66 °C. Portanto, a adição da ligação de dissulfeto intercadeia na porção MEDI-578 scFv da molécula multiespecífica melhorou a termoestabilidade da molécula em 4 °C.

[00189] As proteínas TNFR2-Fc e TNFR2-Fc_VH#4 foram transitoriamente expressas em suspensão de células CHO usando Polietilenimina (PEI) (Polysciences) como o reagente de transfecção. As células foram mantidas em meio CD-CHO (Life Technologies). As colheitas de cultura de transfecções em escala pequena foram purificadas usando 1 ml de cromatografia de afinidade HiTrap MabSelect SuRe® de acordo com o protocolo do fabricante (GE Healthcare) e foram subsequentemente trocados em tampão em 1 % de sacarose, 100 mM de NaCl, 25 mM de cloridreto de L- arginina, e 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,3). A pureza das proteínas recombinantes foi analisada usando SDS-PAGE sob condições redutoras e usando a cromatografia de exclusão de tamanho analítica (ver o método abaixo), e concentrações foram determinadas lendo-se a absorbância a 280 nm usando coeficientes de extinção teoricamente determinados.

[00190] A expressão transitória em escala pequena e purificação em coluna de proteína A da proteína de fusão TNFR2-Fc e a construção multiespecífica de TNF-NGF, TNFR2-Fc_VH#4, produziu rendimentos de 36,6 e 79,9 mg L-1 respectivamente.

[00191] Um lote maior de TNFR2-Fc_VH#4 foi produzido como segue. Uma colheita de cultura bruta de uma transfecção em larga escala (até 6L) foi filtrada usando filtração profunda e carregada em uma coluna de Proteína A agarose de 1,6 x 20 cm (GE Healthcare) pré-equilibrada com tampão A (solução salina tamponada com fosfato pH 7,2). A coluna foi depois lavada com tampão A e o produto eluído em um gradiente escalonado de tampão B (50 mM de Acetato de Sódio pH <4,0). O produto foi purificado ainda pela carga em uma coluna Poros HS 50 de 1,6 x 20 cm (Applied Biosystems) pré-equilibrado em tampão C (50 mM de tampão de Acetato de Sódio pH <5,5), lavado em tampão C e depois subsequentemente o produto foi eluído em um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl em 50 mM de tampão de Acetato pH <5,5. Os eluídos resultantes foram analisados pela HPLC de Exclusão de Tamanho. A concentração de proteína foi determinada pela espectroscopia A280 com um espectrofotômetro Beckman DU520 usando um coeficiente de extinção calculado de 1,36.

Métodos para Caracterização de TNFR2-Fc_VH#4

[00192] A análise de Western blot foi realizada usando protocolos padrão. As proteínas foram transferidas sobre a membrana de fluoreto de polivinilideno (Life Technologies) usando o sistema Xcell SureLock® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A membrana foi bloqueada com 3 % (p/v) de leite em pó desnatado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 h na temperatura ambiente. As Western blots foram desenvolvidas usando protocolos padrão com anticorpo específico de Fc de IgG anti-ser humano conjugado com HRP (Sigma).

[00193] A HPLC de exclusão de tamanho foi realizada usando um sistema HPLC Gilson (Bomba isocrática-307, detector UV/Vis-151, Manuseador de líquido-215 e Módulo de Injeção-819) com uma coluna Fenomenex BioSep-SEC-S3000 (300 x 7,8 mm) com uma fase móvel de D- PBS (life Technologies) em uma taxa de fluxo de 1 ml/min. Amostras de vinte e cinco μL foram injetadas na coluna e a separação de espécies de proteína foi monitorada em A280 nm.

[00194] A desglicosilação enzimática de TNFR2-Fc_VH#4 purificada em escala pequena foi realizada usando um kit EDGLY (Sigma Aldrich) de acordo com os protocolos do fabricante. As proteínas foram desglicosiladas sob condições tanto desnaturadas quanto nativas. Para as proteínas desnaturadas, 30 μg de proteína foram desglicosiladas com PNGase F, O- glicosidase, e α-(2^3, 6, 8, 9)-neuraminidase, β-N-acetilglicosaminidase e β- (1 ^4)-gaiactosidase por 3 h a 37 °C. Sob condições nativas, 35 μg de proteína foram desglicosiladas com o mesmo conjunto de enzimas como acima por 3 dias a 37 °C. As proteínas desglicosiladas foram analisadas pela SDS-PAGE tingida com coomassie e pela western blot usando protocolos de ensaio padrão.

[00195] O sequenciamento de aminoácido de terminal N de TNFR2- Fc_VH#4 foi realizado como segue. Aproximadamente 2 μg de TNFR2- Fc_VH#4 foi conduzido em um gel de SDS-PAGE usando protocolos padrão. As proteínas foram transferidas na membrana PVDF usando o sistema Xcell SureLock® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A membrana foi tingida com 0,1 % (p/v) de negro de amido por aproximadamente 15 min em uma plataforma agitadora orbital depois lavada com dH2O para reduzir o tingimento de fundo da membrana de PVDF. A membrana foi secada ao ar antes do sequenciamento do terminal N. As faixas de interesse foram cortadas e a determinação da sequência do terminal N da molécula ligante multiespecífica foi realizada em um sequenciador 494 HT da Applied Biosystems (Applied Biosystems, San Francisco, CA, U.S.A.) com análise de feniltioidantoína on-line usando um micro HPLC 140A da Applied Biosystems.

Resultados de Caracterização

[00196] As proteínas TNFR2-Fc_VH#4 e TNFR2-Fc purificadas tiveram o perfil traçado pela SEC-HPLC quanto aos níveis de agregado, monômero e fragmentação de proteína (Figs. 2A e 2B). O pico principal compreendendo monômero constituído de aproximadamente 90 % da proteína total presente com os aproximadamente 10 % remanescentes da massa de proteína com um tempo de retenção em coluna mais baixo indicando a presença de espécies de ordem superior ou agregados. Entretanto, o pico de monômero da SEC-HPLC teve duas projeções pronunciados indicando que a proteína dentro deste pico não foi uma espécie única. A análise de SDS- PAGE com tingimento de coomassie mostrou duas faixas distintas para TNFR2-Fc_VH#4 (em aprox. 100 e 75 kD) e similarmente duas faixas distintas também para a proteína de fusão TNFR2-Fc (em aprox. 70 e 45 kD) sob condições redutoras (Fig. 2B). Sob condições não redutoras, três faixas maiores foram presentes para TNFR2-Fc_VH#4 (entre 150 e 250 kD) e uma faixa maior e uma faixa menor para a proteína de fusão TNFR2-Fc em aprox. 150 e 120 kD respectivamente. Visto que a diferença de massa molecular entre as duas faixas sob condições redutoras foi aproximadamente equivalente ao tamanho de um fragmento scFv (~26,5 kD) outra análise foi realizada de modo a entender em quais formas as moléculas de ligação multiespecíficas foram sendo gerada. A análise espectroscópica de massa sob condições nativas confirmo os dados de SDS-PAGE, que para as duas preparações de proteína purificada separadas houve três massas moleculares presentes na preparação de TNFR2-Fc_VH#4 purificada em aproximadamente 125, 152 e 176 kD (Fig. 2C).

[00197] Se o padrão de faixa observado pelo gel de SDS-PAGE foi devido à glicosilação diferencial de TNFR2-Fc_VH#4, então na desglicosilação isto seria resolvido recuando para uma única faixa. Entretanto, o padrão de faixa foi mantido sob condições tanto redutoras quanto não redutoras quando TNFR2-Fc_VH#4 foi desglicosilado como uma proteína nativa ou como proteína desnaturada (dados não mostrados). O tingimento de Western blot de TNFR2-Fc_VH#4 tanto glicosilado quanto desglicosilado com um anticorpo policlonal anti-IgG humana específico de Fc mostrou que tanto a faixa de tamanho natural esperada quanto a faixa de massa molecular mais baixa foram reativas com anticorpos anti-Fc específicos (dados não mostrados).

[00198] A identificação final do produto truncado foi feita pelo sequenciamento de aminoácido de terminal N da proteína. Isto revelou que os primeiros 8 aminoácidos do terminal N da proteína truncada foram SMAPGAVH correspondendo aos aminoácidos de 176 a 183 da sequência TNFR2-Fc_VH#4 (SEQ ID NO: 14). Isto representou uma truncagem de 175 aminoácidos no terminal N de TNFR2-Fc_VH#4, que deixou apenas 42 aminoácidos do domínio TNFR2. Isto nos permitiu interpretar acuradamente os dados de massa da SDS-PAGE, espectroscopia de massa e análise de SEC- HPLC. Houve três combinações possíveis de dímeros VH#4 de TNFR2-Fc_e todas foram presentes nas preparações de proteína purificada: (1) homodímero de tamanho natural, (2) um heterodímero de tamanho natural e espécies truncadas, e (3) um homodímero de espécies truncadas. De modo a medir acuradamente a atividade biológica tanto in vitro quanto in vivo, uma preparação do homodímero de tamanho natural foi gerada por um processo de cromatografia de coluna de duas etapas. Na primeira etapa, após a purificação em Proteína A, o produto conteve 80,5 % de monômero (Fig. 3A) e depois da segunda etapa de purificação em coluna (SP sefarose) a porcentagem de monômero foi de 97,8 % (Fig. 3B). O rendimento em relação ao processo inteiro foi de 7,3 %.

Exemplo 2 - Análise de Estabilidade Térmica pela Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC)

[00199] Uma DSC MicroCal VP-Capillary automatizada (GE Healthcare, USA) foi usada para as medições calorimétricas. As amostras de proteína foram testadas a 1 mg/ml em 25 mM de tampão de Histidina/ Histidina-HCl pH 6,0. As amostras de proteína e tampão foram submetidas a uma elevação térmica linear de 25 °C a 100 °C em uma taxa de 95 °C por hora. O tampão foi subtraído como uma referência da amostra de proteína usando software Origin 7 e as transições térmicas foram determinadas.

[00200] O termograma para TNFR2-Fc_VH#4 (Fig. 4) mostra três transições de desdobra distintas com temperaturas de desnaturação (Tm) de 64, 67, e 84 °C. Nós deduzimos que a Tm de 64 °C correspondeu com a desnaturação tanto do domínio de TNFR2 quanto do domínio scFv anti-NGF, com as Tms de 67 °C e 84 °C sendo típicas das Tms de desnaturação para domínios CH2 e CH3 de IgG1 respectivamente (por exemplo, Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393: 672-92 (2009), e Publicação PCT No. WO 2013/070565). Embora não se deseje estar ligado pela teoria, scFv geralmente tem temperaturas de desnaturação mais baixa do que os outros domínios de anticorpo, e sua desdobra é caracterizada por um único evento de transição (Roberge et al., 2006, Jung et al., 1999, Tischenko et al., 1998).

Exemplo 3 - Confirmação de ligação de antígeno ao TNFR2-Fc_VH#4 A. Ligação de antígeno único e dual pelo ELISA

[00201] Os poços Nunc Maxisorp foram revestidos a 4 °C durante a noite com 50 μl de TNFα (R&D Systems) diluído a 5 μg ml-1 em PBS (pH 7,4). No dia seguinte a solução de revestimento foi removida e os reservatórios bloqueados com 150 μl de tampão de bloqueio [3 % de leite desnatado-PBS] por 1 h na temperatura ambiente. Os reservatórios foram enxaguados três vezes em PBS, antes da adição de 50 μl de uma série de diluição de TNFR2-Fc_VH#4 fabricada em tampão de bloqueio. Depois de 1 h na temperatura ambiente, os reservatórios foram lavados três vezes em PBS- Tween 20 (0,1 % v/v; PBS-T). Cinquenta microlitros de NGF biotinilado foram depois adicionados aos reservatórios e incubados por uma hora adicional na temperatura ambiente, antes de lavar como acima e adição de 50 μl de estreptavidina-HRP (1:100). Depois de 1 hora na temperatura ambiente, os reservatórios foram lavados com PBS-T, 50 μl de substrato de 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidina adicionados e a cor deixada desenvolver. A reação foi interrompida pela adição de H2SO4 1M e a absorbância a 450 nm foi medida usando uma leitora de placa microtituladora. Os dados resultantes foram analisados usando software Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA). Para o ELISA da ligação de antígeno único, os reservatórios foram revestidos com TNFα ou NGF-biotina como acima e a ligação de anticorpo detectada com anticorpo conjugado a HRP específico de Fc anti-IgG humana (1:5000), e a cor desenvolvida como acima.

[00202] Os resultados de ELISA são mostrados na Fig. 5. TNFR2- Fc_VH#4 foi planejado para ligar aos antígenos tanto de TNFα quanto de NGF. A ligação de antígeno único foi realizada imobilizando-se primeiro um antígeno em uma placa microtituladora de 96 reservatórios, seguida pela adição de diluições em série de TNFR2-Fc_VH#4. A ligação específica foi detectada usando-se um anticorpo específico de Fc anti-IgG conjugado à peroxidase de rábano (HRP). Para ao ELISA de ligação de antígeno dual, o primeiro antígeno, TNFα foi imobilizado na placa de ELISA, e depois uma diluição em série de TNFR2-Fc_VH#4 foi adicionada, seguida pela adição do segundo antígeno biotinilado, NGF em uma concentração fixa. A ligação específica foi depois detectada usando uma estreptavidina conjugada a HRP. TNFR2-Fc_VH#4 ligado a TNFα e NGF no ELISA de ligação de antígeno único (Fig. 5A e B). No ELISA de ligação de antígeno duplo, TNFR2- Fc_VH#4 ligou simultaneamente tanto a TNFα quanto a NGF (Fig. 5C).

B. Ligação de antígeno simultânea pela ressonância plasmônica superficial

[00203] Os experimentos de ligação de antígeno simultânea foram realizados essencialmente como descrito em Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393: 672-92 (2009) usando um instrumento BIAcore 2000 (GE Healthcare). Em resumo, um chip sensor CM5 foi usado para imobilizar aproximadamente 1500 unidades de ressonância de TNFR2-Fc_VH#4 a 100 nM. As superfícies do chip sensor foram depois usadas para a ligação concorrente para TNFα e NGF. Os antígenos foram preparados em tampão HBS-EP [10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 3 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,005 % de P20]. Uma taxa de fluxo de 30 μl/min foi usada para todas as medições de ligação. Para determinar a ligação simultânea do anticorpo multiespecífico ao TNFα e NGF, 1 μM de TNFα (massa molecular, 17,5 kD) foi injetado na superfície do chip sensor, e na conclusão da injeção, uma mistura de TNFα e NGF (massa molecular, 13,5 kD), ambos a 1 μM, foi então injetada. TNFα foi incluído na mistura com NGF para prevenir a perda de sinal devido à dissociação de TNFα durante a fase de ligação de NGF. Como um controle, um procedimento de ligação similar foi realizado, e na última injeção apenas TNFα foi adicionado, nenhum aumento adicional nas unidades de ressonância para esta injeção indicou que o TNFα foi ligado no níveis de saturação. Experimentos de ligação e controle similares foram realizados em que a ordem de injeção de TNFα e NGF foi invertida.

[00204] A ligação de antígeno simultânea de TNFR2-Fc_VH#4 foi caracterizada pela ressonância plasmônica superficial. Os eventos de ligação foram analisados qualitativamente em uma maneira sequencial. TNFR2- Fc_VH#4 foi covalentemente imobilizado na superfície do chip sensor usando a química da ligação de amina. Subsequentemente, o primeiro antígeno foi injetado para dar níveis saturantes de ligação ao TNFR2-Fc_VH#4, depois o segundo antígeno foi injetado como uma mistura equimolar com antígeno 1. O sensorgrama de ligação claramente mostrou que TNFR2-Fc_VH#4 ligou simultaneamente ao TNFα e NGF (Fig. 6). A ligação simultânea dos dois antígenos ocorreu independente da ordem de injeção do antígeno.

Exemplo 4 - Inibição da proliferação de célula TF-1 induzida pelo NGF

[00205] Células TF-1 (ECACC Catálogo No. 93022307) foram semeados a 1,5 x 104 células/reservatório em 50 μl de meio de cultura isento de soro em placa de cultura de tecido de 96 reservatórios (Corning Costar) e incubado por 18 h a 37 °C com 5 % de CO2. NGF recombinante humano (Sigma) ou de camundongo (R&D Systems) foram pré-incubado com diluições de TNFR2-Fc_VH#4, MEDI-578 IgG1 TM YTE, um controle de isotipo de IgG1 TM YTE não de ligação para MEDI-578, ou um controle de isotipo biespecífico R347 Bs3Ab não de ligação por 30 min a 37 °C em placa de fundo redondo de 96 reservatórios (Greiner). Cinquenta microlitros de cada amostra foram depois adicionados à placa de célula e incubada por 48 h a 37 °C. A seguir do período de incubação, 100 μl de tampão de ensaio de célula TITRE GLO® (Promega) foi adicionado e a placa foi incubada por 10 min. a 37 °C com 5 % de CO2. A luminescência foi depois medida usando protocolo de luminescência padrão. A proliferação de TF-1 induzida por NGF padrão na ausência de anticorpo é mostrada na Fig. 7A.

[00206] A atividade funcional de TNFR2-Fc_VH#4 foi determinada usando a proliferação de TF-1 induzida por NGF. A TNFR2-Fc_VH#4 foi capaz de inibir completamente a proliferação induzida pelo NGF tanto humano quanto de murino (Fig. 7B e 7C, respectivamente). Fig. 7B: as células de TF-1 foram estimuladas com NGF recombinante humano correspondendo à concentração de EC80. As células foram incubadas com ligante com uma série de diluição de anticorpo por 48 horas, depois do que a proliferação de célula foi quantificada pela cultura por 10 mins com tampão de ensaio de célula TITRE GLO® (Promega). Fig. 7C: as células TF-1 foram estimuladas com NGF recombinante de murino correspondendo à concentração EC80. As células foram incubadas com ligante com uma série de diluição de anticorpo por 48 horas, depois do que a proliferação de célula foi quantificada pela cultura por 10 mins com tampão de ensaio de célula TITRE GLO® (Promega). Estes dados demonstram que a ação inibidora de NGF de TNFR2-Fc_VH#4 é biologicamente ativa e inibe a proliferação com uma potência similar a MEDI-578 como um IgG1®. Dados similares também foram observados para TNFR2-Fc_varB e uma outra molécula ligante multiespecífica de TNF-NGF ndimab var B (FIG. 7D & 7E). a ndimab varB compreende um anticorpo anti-TNFα completo, isto é, um anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas completas e duas cadeias leves completas em um formato H2L2, com MEDI-578 scFv fundido ao terminal C da cadeia pesada do anticorpo anti-TNFα. A cadeia leve de ndimab varB é representada na SEQ ID NO: 20 e a cadeia pesada de ndimab varB é representada na SEQ ID NO: 22.

Exemplo 5 - Inibição da apoptose de célula U937 induzida por TNFα

[00207] As células U937 (ECACC Cat. No. 85011440) foram plaqueadas em uma placa de cultura de tecido de 96 poços de parede preta (Corning Costar) a uma concentração de 8 x 105 células/reservatórios em 50 μl de meio de cultura. As células U937 foram estimuladas com TNFα humano recombinante correspondendo à concentração EC80. As células foram incubadas com ligante com uma série de diluição de anticorpo por 2 horas, depois que a atividade da caspase 3 foi quantificada pela cultura por 2 horas com tampão de reação de ensaio de Caspase 3. A TNFR2-Fc_VH#4, um controle de isotipo biespecífico de não ligação, R347 Bs3Ab, e etanercept foram pré-incubados com as células por 30 min a 37 °C. Isto foi seguido pela adição de 50 μl de TNFα recombinante humano (R&D Systems) para se obter uma concentração de ensaio final de 20 ng/ml e uma incubação subsequente de 2 h a 37 °C. A seguir do período de incubação, 50 μl de tampão de reação de ensaio de Caspase 3 (0,2 % p/v de CHAPS, 0,5 % v/v de Igepal CA-630, 200 mM de NaCl, 50 mM de HEPES, 20 μM de substrato de DEVD-R110 (Invitrogen)) foram adicionados e as células incubadas por 2,5 h a 37 °C. A fluorescência foi medida pela excitação a 475 nm e emissão a 512 nm. A atividade de Caspase na ausência de um antagonista de TNFα é mostrada na Figura 8A.

[00208] A atividade funcional de TNFR2-Fc_VH#4 foi determinada usando uma atividade de Caspase 3 induzida pelo ensaio de TNFα em células U937. TNFR2-Fc_VH#4 completamente inibiu a atividade de Caspase 3 induzida pelo TNFα como o etanercept (Fig. 8B). Isto claramente ilustra que a porção inibidora de TNFα de TNFR2-Fc_VH#4 é biologicamente ativa e tem uma potência similar ao etanercept. Dados similares também foram observados para TNFR2-Fc_varB e ndimab varB (ver a Figura 8C).

Exemplo 6 - Ensaios in vivo

[00209] Todos os procedimentos in vivo foram realizados de acordo com o UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) e aprovado por um comitê de ética local. Camundongos C57Bl/6 fêmeas (Charles River, UK) foram usados por toda a parte. Os camundongos foram alojados em grupos de 5/6 por gaiola, em gaiolas individualmente ventiladas (IVC) com acesso livre a alimento e água sob um ciclo de 12 horas de luz/escuro (luzes ligadas das 07:00 às 19:00). As salas de alojamento e procedimento foram mantidas a 24 oC e ruído de fundo constante foi mantido por via de uma estação de rádio convencional. Todos os camundongos passaram pela inserção de transmissores sob anestesia (3 % de isoflurano em oxigênio) para propósitos de identificação pelo menos 5 dias antes do início de cada estudo.

A. Modelo de Seltzer de Dor Neuropática

[00210] A hiperalgesia mecânica foi determinada usando um analgisímetro (Randall LO, Selitto JJ, Arch Int Pharmacodyn Ther. 111: 40919 (1957)) (Ugo Basile). Uma força crescente foi aplicada à superfície dorsal de cada pata traseira uma após a outra até que uma resposta de retirada foi observada. A aplicação de força foi parada neste ponto e o peso em gramas registrado. Os dados foram expressos como limiar de retirada em gramas para patas ipsilaterais e contralaterais. A seguir do estabelecimento de leituras de linha de base os camundongos foram divididos em 2 grupos com razões ipsilateral/contralateral aproximadamente iguais e passaram por cirurgia. Os camundongos foram anestesiados com 3 % de isoflurano. A seguir disto aproximadamente 1 cm do nervo ciático esquerdo foi exposto pela dissecação abrupta através de uma incisão ao nível da coxa intermediária. Uma sutura (10/0 Virgin Silk: Eticon) foi depois passada através do terço dorsal do nervo e firmemente amarrado. A incisão foi fechada usando cola e os camundongos foram deixados recuperar por pelo menos sete dias antes do começo dos testes. Os camundongos operados simulados passaram pelos mesmo protocolo, mas a seguir da exposição do nervo o ferimento foi colado e deixado recuperar. Os camundongos foram testados quanto à hiperalgesia no dia 7 e 10 após a cirurgia. A seguir do teste no dia 10, os camundongos operados foram subdivididos ainda em grupos que receberam controle de isotipo CAT251 IgG1 (0,03 mg/kg s.c.), etanercept (0,01 mg/kg s.c.), MEDI- 578 (0,03 mg/kg s.c.) ou uma combinação de etanercept (0,01 mg/kg s.c.) e MEDI-578 (0,03 mg/kg s.c.). Os camundongos operados simulados todos receberam CAT251 (0,03 mg/kg s.c.). A hiperalgesia mecânica foi medida em 4 h, 1, 2, 3, 4 e 7 dias após a dose.

[00211] A coadministração de etanercept e MEDI-578 em um modelo de hiperalgesia mecânica manifestada como uma redução significante na razão ipsilateral/contralateral no dia 10 após a cirurgia quando comparada aos controles operados simulado (Fig. 9). A administração de uma única dose de etanercept (0,01 mg/kg s.c.) ou MEDI-578 (0,03 mg/kg s.c.) falhou para reverter significantemente esta hiperalgesia. A coadministração de etanercept (0,01 mg/kg s.c.) junto com MEDI-578 (0,03 mg/kg s.c.) significantemente reverteu a hiperalgesia mecânica em 4 h após a dose e o efeito foi mantido dentro dos 7 dias após a dose.

[00212] Em um segundo estudo o efeito de TNFR2-Fc_VH#4 foi avaliado. A seguir do estabelecimento de uma hiperalgesia mecânica, os camundongos foram dosados no dia 13 após a cirurgia com controle de isotipo R347 Bs3Ab (0,03 mg/kg s.c.), etanercept (0,01 mg/kg s.c.), MEDI- 578 (0,03 mg/kg s.c.) ou TNFR2-Fc_VH#4 (0,01 mg/kg ou 0,03 mg/kg s.c.). Os animais preparados simulados receberam controle de isotipo R347 Bs3Ab (0,03 mg/kg s.c.). Os camundongos foram testados quanto à hiperalgesia mecânica em 4 h após a dose e nos dias 1, 2, 4 e 7 após a dose como descrito acima.

[00213] A administração de TNFR2-Fc_VH#4 produziu uma redução significante na razão ipsilateral/contralateral no dia 10 após a cirurgia quando comparado aos controles operados simulados (Fig. 10A). A administração de etanercept (0,01 mg/kg s.c.) ou MEDI-578 (0,03 mg/kg s.c.) falhou em reverter significantemente a hiperalgesia mecânica. Entretanto, a administração de TNFR2-Fc_VH#4 (0,01 e 0,03 mg/kg s.c.) produziu uma reversão significante da hiperalgesia mecânica em 4 h após a dose, um efeito que foi mantido dentro dos 6 dias após a dose. Nenhum efeito foi observado a seguir da administração do Bs3Ab de controle R347. Dados similares foram observados quando TNFR2-Fc_varB foi administrado (ver a Figura 10B). Estes dados sugerem que TNFR2-Fc_VH#4 pode significantemente reverter a dor em doses muito baixas onde doses equivalentes foram mostradas serem ineficazes ou minimamente eficazes com MEDI-578 ou etanercept sozinhos.

B. Modelo de dor crônica de junta

[00214] A hipersensibilidade mecânica foi determinada usando um testador de incapacitância de camundongo (Linton Instrumentation). Camundongos foram colocados no dispositivo com as suas patas traseiras nos sensores separados, e a distribuição de peso corporal calculada em um período de 4 s. Os dados foram expressos como a razão de carga de peso ipsilateral e contralateral em gramas.

[00215] A seguir do estabelecimento das leituras de linha de base, os camundongos foram divididos em 2 grupos com razões ipsilaterais/contralaterais aproximadamente iguais. As injeções intra- articulares foram realizadas usando a seguinte técnica: os animais foram anestesiados usando 3 % de isoflurano em oxigênio e o joelho esquerdo foi raspado e limpo. A junta do joelho de cada camundongo foi injetada com 10 μl de adjuvante completo de Freund (FCA) (10 mg/ml) ou veículo (óleo mineral leve) usando uma agulha calibre 25 montada em uma seringa de Hamilton de 100 μl. As injeções foram feitas diretamente no espaço sinovial da junta do joelho. Os camundongos foram deixados recuperar e foram retestados quanto a mudanças na hipersensibilidade mecânica nos dias 7 e 10 após a injeção como descrito acima. A seguir do teste no dia 10, os camundongos tratados com FCA foram randomizados ainda em grupos e no dia 13 os camundongos foram dosados com etanercept (0,01 mg/kg i.p.) ou veículo depois que eles receberam uma dose de MEDI-578 (0,03 mg/kg i.v.) ou controle de isotipo CAT251 (0,03 mg/kg i.v.). Os camundongos foram testados quanto à hipersensibilidade mecânica em 4 h após a dose e nos dias 1, 2, 4 e 7 após a dose como descrito acima.

[00216] O efeito da coadministração de etanercept e MEDI-578 foi avaliado usando o modelo FCA intra-articular de dor inflamatória. A administração intra-articular de FCA causou uma hipersensibilidade mecânica que se manifestou como uma redução significante na razão ipsilateral/ contralateral nos dias 7 e 10 quando comparado ao controle de veículo (Fig. 11). Nenhuma redução na razão ipsilateral/contralateral foi observada nos grupos tratados simulados comparados com os níveis de linha de base pré- tratamento. A administração de etanercept (0,01 mg/kg i.p.) + CAT251 (0,03 mg/kg i.v.) ou PBS (10 ml/kg i.p.) + MEDI-578 (0,03 mg/kg i.v.) causou uma leve reversão da hipersensibilidade mecânica induzida por FCA em 4 h e dias 1, 2, 4 e 7 após a dose, mas isto falhou em atingir significância estatística. Entretanto, a administração de etanercept (0,01 mg/kg i.p.) + MEDI-578 (0,03 mg/kg i.v.) causou uma reversão significante da hipersensibilidade mecânica induzida por FCA em todos os tempos de teste após a dose.

[00217] Em um segundo estudo, o efeito de TNFR2-Fc_VH#4 foi avaliado. A seguir do estabelecimento da hipersensibilidade mecânica induzida por FCA, os camundongos foram dosados no dia 13 após FCA com: controle de isotipo R347 Bs3Ab (0,01 mg/kg s.c.), etanercept (0,01 mg/kg s.c.), MEDI-578 (0,01 mg/kg s.c.) ou TNFR2-Fc_VH#4 (0,003 mg/kg ou 0,01 mg/kg s.c.). Mais uma vez os camundongos foram testados quanto à hipersensibilidade mecânica em 4 h após a dose e nos dias 1, 2, 4 e 7 após a dose como descrita acima.

[00218] O efeito de TNFR2-Fc_VH#4 (“biespecíficas”) quando comparado aos efeitos de etanercept e MEDI-578 individualmente é mostrado na Fig. 12. Nem etanercept (0,01 mg/kg s.c.) nem MEDI-578 (0,01 mg/kg s.c.) significantemente reverteu a hipersensibilidade mecânica induzida por FCA em nenhum ponto de tempo após a dose. Entretanto, a administração de TNFR2-Fc_VH#4 causou uma inversão significante da hipersensibilidade mecânica induzida por FCA. A dose mais alta de TNFR2-Fc_VH#4 (0,01 mg/kg s.c.) mostrou atividade significante pela duração do estudo ao passo que a dose mais baixa (0,003 mg/kg s.c.) atingiu significância no dia 1 após a dose e permaneceu em um nível similar à dose mais alta pela duração do estudo.

C. Modelo induzido por FCA Estabelecido de hipersensibilidade mecânica no rato

[00219] A injeção intraplantar de Adjuvante Completo de Freunds (FCA) causa uma reação inflamatória, que induz hipersensibilidade e edema, e imita alguns aspectos de dor inflamatória clínica. Estes efeitos podem ser investigados usando equipamento para medir a carga de peso. A avaliação das propriedades anti-hiperalgésicas potenciais da hipersensibilidade induzida por TNFR2-Fc_VH#4 FCA usou o método de carga de peso. Os ratos naturais distribuem seu peso corporal igualmente entre as duas patas traseiras. Entretanto, quando a pata traseira injetada (esquerda) está inflamada e/ou dolorida, o peso é redistribuído de modo que menos peso é colocado sobre a parta afetada (diminuição da carga de peso sobre a pata lesionada). A carga de peso através de cada membro traseiro é medida usando um testador de incapacitância de rato (Linton Instruments, UK). Os ratos são colocados no testador de incapacitância com as patas traseiras nos sensores separados e a força média exercida por ambos os membros traseiros são registrados em 4 segundos.

[00220] Para este estudo, ratos naturais (Ratos Sprague Dawley Machos (Harlan, UK), 198-258g) foram aclimatizados à sala de procedimento nas suas gaiolas, com alimento e água disponíveis ad libitum. A habituação ao testador de incapacitância foi realizada durante vários dias. Os registros de carga de peso da linha de base foram coletados antes da indução do insulto. A hipersensibilidade inflamatória foi induzida pela injeção intraplantar de FCA (disponível da Sigma, 100 μl de solução 1 mg/ml) na parta traseira esquerda. Uma medição da carga de peso no pré-tratamento foi coletada para avaliar a hipersensibilidade 23 horas após a FCA.

[00221] Os animais foram depois classificados e randomizados aos grupos de tratamento de acordo com a janela FCA de carga de peso em um projeto do quadrado Latin. Em 24 horas após a injeção de FCA, os animais foram tratados com TNFR2-Fc_VH#4 (“biespecífico”) dado i.v. em 0,003, 0,01, 0,03, 0,3, & 3 mg/kg, um anticorpo de controle negativo, NIP228 (um anticorpo incitado para ligar ao hapteno nitrofenol) dado i.v. a 3 mg/kg, veículo (1 % de Metilcelulose) dado p.o. 2 ml/kg, ou indometacina dada 10 mg/kg p.o.

[00222] A carga de peso foi avaliada 4 e 24 horas após o tratamento de anticorpo/droga. Os dados foram analisados comparando-se os grupos de tratamento ao grupo de controle de veículo em cada ponto de tempo. A análise estatística incluiu medidas repetidas de ANOVA seguidas pelo teste de comparação planificada usando InVivoStat (invivostat.co.uk), (p<0,05 considerado significante). Os resultados são mostrados na FIG. 13. Uma reversão significante da hipersensibilidade foi observada com indometacina (10 mg/kg) a 4 e 24 horas. TNFR2-Fc_VH#4 dosado a 0,3 e 3 mg/kg mostrou reversão significante da hipersensibilidade tanto em 4 quanto 24 horas, TNFR2-Fc_VH#4 dosado a 0,003 e 0,03 mg/kg também mostrou uma reversão significante da hipersensibilidade, mas apenas em 24 horas. O controle de isotipo, NIP228 não teve nenhum efeito significante sobre a resposta de FCA em qualquer ponto de tempo.

Exemplo 7 - Fosforilação de p38 pelo TNFα e NGF

[00223] A literatura sugere que a fosforilação de p38 desempenha um papel importante no desenvolvimento de dor neuropática. Por exemplo, o tratamento com inibidores p38 foi mostrado prevenir o desenvolvimento de sintomas de dor neuropática no modelo de lesão limitada do nervo (Wen YR et al., Anesthesiology 2007, 107: 312-321) e em um modelo de neuropatia inflamatória ciática (Milligan ED et al., J Neurosci 2003, 23: 1026-1040). No presente experimento, o papel de TNFα, NGF, e a combinação TNFα e NGF na fosforilação p38 foi investigada em um ensaio de cultura célula. Em resumo, células Neuroscreen-1 (um subclone de células neuroendócrinas de rato PC-12) foram incubadas com quantidades crescentes de TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF. A seguir de um período de incubação de 20 minutos, fosfo-p38 foi quantificado usando um ensaio de fluorescência resolvida com o tempo homogêneo (HTRF) (Cisbio). Ensaio HTRF: A seguir da estimulação com TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF, sobrenadantes de célula foram rapidamente removidos e as células lisadas em tampão de lise. Fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) foi detectado nos lisados em um formato de ensaio intercalado usando dois anticorpos específicos diferentes; um anticorpo anti-fosfo-p38 conjugado a criptato de európio (fluoróforo doador) e um anticorpo anti-p38 (total) conjugado a d2 (fluoróforo aceitador). Os anticorpos foram incubados com lisados de célula e as razões de HTRF calculadas a partir das medições de fluorescência a 665 nm e 620 nm fabricado usando uma Leitora de Placa de Rótulo Múltiplo EnVision (Perkin Elmer).

[00224] Os dados são apresentados como razões HTRF, que são calculados como a razão entre a emissão a 665 nm e a emissão a 620 nm. Um mapa térmico mostrando as razões HTRF de reações fosfo-p38 é mostrado na FIG. 14. As curvas de dose-resposta mostrando o efeito de TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF são mostradas na FIG. 15. Como pode ser observado a partir da FIG. 15, o efeito combinado de concentrações mais altas de TNFα e NGF no fosfo-p38 é maior do que a soma prognosticada do sinal de fosfo-p38 induzido pelo fator sozinho. Estes dados sugerem que TNFα e NGF podem atuar juntos para induzir a fosforilação de p38, e que os dois caminhos podem ser implicados na sinalização molecular levando à dor.

Exemplo 8 - Fosforilação de ERK pelo TNFα e NGF

[00225] Igual a p38, ERK também é ativado durante o desenvolvimento da dor neuropática (Zhuang ZY et al., Pain 2005, 114: 149159). No presente experimento, o papel de TNFα, NGF, e a combinação TNFα e NGF sobre a fosforilação de ERK foi investigada em um ensaio de cultura de célula. Em resumo, as células Neuroscreen-1 (um subclone de células neuroendócrinas de rato PC-12) foram incubadas com quantidades crescentes de TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF. A seguir de um período de incubação de 20 minutos, fosfo-ERK foi quantificado usando um ensaio de HTRF (Cisbio).

[00226] Ensaio de HTRF: A seguir da estimulação, os sobrenadantes de célula foram rapidamente removidos e as células lisadas em tampão de lise. Fosfo-ERK MAPK (Thr202/Tyr204) foi detectado em lisados em um formato de ensaio intercalado usando dois anticorpos específicos diferentes; um anticorpo anti-fosfo-ERK conjugado ao criptato de európio (fluoróforo doador) e um anticorpo anti-ERK (total) conjugado a d2 (fluoróforo aceitador). Os anticorpos foram incubados com lisados de célula e razões HTRF calculadas a partir das medições de fluorescência a 665 nm e 620 nm feitas usando uma Leitora de Placa de Rótulo Múltiplo EnVision (Perkin Elmer).

[00227] Os dados são apresentados como razões HTRF, que são calculados como a razão entre a emissão a 665 nm e a emissão a 620 nm. Um mapa térmico mostrando razões de HTRF de reações de fosfo-ERK é mostrado na FIG. 16. As curvas de dose-resposta mostrando o efeito de TNFα, NGF, ou uma combinação de TNFα e NGF são mostradas na FIG. 17. Como pode ser observado a partir da FIG. 17, quantidades baixas de TNFα sozinho não induziram fosfo-ERK, mas quantidades mais altas, realçaram fosfo-ERK induzido por NGF. Estes dados sugerem que TNFα e NGF podem atuar juntos para induzir a fosforilação de p38, e que os dois caminhos podem ser implicados na sinalização molecular levando à dor. Listagem de Sequência

[00228] A descrição não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos descritos que são intencionados como ilustrações únicas de aspectos individuais da descrição, e qualquer uma das composições ou métodos que sejam funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta descrição. De fato, várias modificações da descrição além daquelas mostradas e aqui descritas tornar-se-ão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente e desenhos anexos. Tais modificações são pretendidas situar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

[00229] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência até o mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem específica e individualmente indicados como estando incorporados por referência.

Claims (26)

1. Molécula ligante, caracterizada pelo fato de que compreende um domínio antagonista de NGF e um domínio antagonista de TNFα; em que o domínio antagonista de NGF é um anticorpo anti-NGF, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e em que o domínio antagonista de TNFα compreende um fragmento solúvel de TNFR-2; em que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio VH de anticorpo compreendendo um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3 e um domínio VL de anticorpo compreendendo um conjunto de CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SSRIYDFNSALISYYDMDV (SEQ ID NO: 11) ou SSRIYDMISSLQPYYDMDV (SEQ ID NO: 12), a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; e em que uma cisteína está presente no domínio VH no aminoácido correspondente à posição de aminoácido 44 da SEQ ID NO: 94; e em que uma cisteína está presente no domínio VL no aminoácido correspondente à posição de aminoácido 103 da SEQ ID NO: 95; em que a molécula ligante é capaz de se ligar ao NGF e é capaz de se ligar ao TNFα.

2. Molécula ligante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo pode inibir a ligação do NGF ao TrkA, p75NRT ou ambos TrkA e p75NRT.

3. Molécula ligante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de ser a que preferencialmente bloqueia a ligação de NGF a TrkA sobre a ligação de NGF a p75NRT.

4. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo se liga ao NGF humano com uma afinidade de cerca de 0,25-0,44 nM.

5. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um domínio VH de anticorpo compreendendo um conjunto de CDRs HCDR1, HCDR2, HCDR3 e um domínio VL de anticorpo compreendendo um conjunto de CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que a HCDR1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 4; a HCDR2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5; a HCDR3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 6; a LCDR1 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 8; a LCDR2 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 9; e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 10.

6. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94.

7. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo compreende um VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95.

8. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo é um anticorpo H2L2 completo, um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab)2 ou um fragmento de Fv de cadeia única (scFv).

9. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo é humanizado, quimérico, primatizado ou totalmente humano.

10. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-NGF ou fragmento do mesmo é um fragmento de svFv anti-NGF compreendendo, de N-terminal a C-terminal, um VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, uma sequência ligadora de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19), e um VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95.

11. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o fragmento de TNFR-2 é fundido a um domínio de Fc de imunoglobulina.

12. Molécula ligante de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o domínio de Fc de imunoglobulina é um domínio de Fc de IgG1 humana.

13. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o antagonista de TNFα compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:13 ou um fragmento funcional da mesma.

14. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a molécula ligante compreende uma proteína de fusão que compreende um antagonista de NGF fundido ao antagonista de TNFα através de um ligante.

15. Molécula ligante de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a molécula ligante compreende um homodímero da proteína de fusão.

16. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão que compreende, de N-terminal a C-terminal, um fragmento de ligação ao TNFα de TNFR-2 compreendendo aminoácidos 1-235 de SEQ ID NO: 13, um domínio IgG1Fc humano, uma sequência ligadora de 10 aminoácidos (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 98), um VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, uma sequência ligadora de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19), e um VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95.

17. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão que compreende, de N-terminal a C-terminal, um fragmento 75 kD de ligação ao TNFα de TNFR-2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma sequência ligadora de 10 aminoácidos (GGGGS)2 (SEQ ID NO: 98), um VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, uma sequência ligadora de 20 aminoácidos (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 19), e um VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 95.

18. Molécula ligante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a molécula ligante compreende um homodímero de um polipeptídeo de fusão que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

19. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 99.

20. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 19 operavelmente associado com um promotor.

21. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 19 ou o vetor como definido na reivindicação 20.

22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula ligante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e um carreador.

23. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula ligante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 19, o vetor como definido na reivindicação 20 e/ou a composição como definida na reivindicação 22.

24. Uso de uma molécula ligante, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para controlar dor em um indivíduo, em que a molécula ligante é a molécula ligante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

25. Uso de acordo coma reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a molécula ligante previne, reduz, melhora ou elimina dor no indivíduo.

26. Uso de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a dor é dor aguda, dor de curto prazo, dor nociceptive persistente ou dor neuropática crônica ou persistente.