KR20200089282A - 등장화제로서 라이신 염을 함유하는 아플리베르셉트 제제 및 그것의 용도 - Google Patents

등장화제로서 라이신 염을 함유하는 아플리베르셉트 제제 및 그것의 용도 Download PDF

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앨리슨 제이. 길레스피
쥴리 에이. 플로이드
브루스 에이. 커윈
크리스틴 씨. 시스카
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저스트-에보텍 바이오로직스, 아이엔씨.
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Abstract

유리 체내 또는 국소 투여에 의한 눈 장애 또는 질환의 치료 방법에 적합한 아플리베르셉트 및 라이신 염 등장화제를 포함하는 안과용 제제가 개시된다.

Description

등장화제로서 라이신 염을 함유하는 아플리베르셉트 제제 및 그것의 용도
본 출원은 2017년 11월 20일자 미국 특허청에 출원된 미국 가특허출원 제62/588,536호로부터 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그것의 전체는 본 명세서에 참조로 통합된다. 2018년 10월 26일에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 JUST0471_SL.txt이며 크기는 4,148 바이트이다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 안과 투여에 적합한 아플리베르셉트 융합 단백질의 약제학적 제제에 관한 것이다.
아플리베르셉트는 2 개의 주요 성분: 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된, 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인으로부터의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 결합 부분을 포함하는 재조합 융합 단백질이다 (참조, Papadopoulos et al., Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties, WO 00/75319 A1; US 7070959B2). 구조적으로, 아플리베르셉트는 약 96.9 킬로 달톤 (kDa)의 단백질 분자량을 갖는 이량체 당단백질이다. 그것은 대략 115 kDa의 총 분자량을 제공하기 위해 대략 15 % 글리코실화를 함유한다. 1 차 서열에 의해 예측된 각각의 폴리펩티드 사슬상의 5 개의 모든 추정적 N-글리코실화 부위는 탄수화물로 점유될 수 있고 말단 시알산 잔기에서의 이질성을 포함하는, 어느 정도의 사슬 이질성을 나타낼 수 있다.
미국 식품 의약국 (FDA)은 2011년 11월에 마케팅에 대한 아플리베르셉트를 승인했으며, 유럽 의약청 (EMA)은 2012년 11월에 이를 승인했다.
상표명 Eylea® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) 하의 아플리베르셉트 (Aflibercept)는 눈 장애 또는 질병, 예를 들어 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO)에 따른 황반 부종, 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO), 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO), 신혈관 (습식) 연령-관련 황반 변성 (AMD), 근시 맥락막 신생 혈관 형성으로 인한 시각 장애, 당뇨병 황반 부종 (DME), DME 환자의 당뇨병성 망막병증 (DR), 및 신혈관 연령-관련 황반 변성 (AMD)의 치료시 안과제로 사용된다.
상표명 Zaltrap® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) 하의 지브-아플리베르셉트 (Ziv-aflibercept)는 전이성 결장 직장암 치료용 주사제로 개발되었다.
아플리베르셉트에 대한 공지된 제제는 Furfine 등 (Furfine et al., VEGF antagonist formulations for intravitreal administration, US8092803; US9580489; EP 2364691B1; WO2007149334A2) 및 Dix 등 (Dix et al., VEGF Antagonist Formulations, WO2006104852 A2; US8921316; US9636400)에 의해 기술된 것들을 포함한다.
본 발명이 제공하는, 개선된 안정성을 갖는 아플리베르셉트의 제제가 여전히 필요하다.
본 발명은 아플리베르셉트의 안과용 제제에 관한 것으로, 상기 제제는 (a) 5-100 mg/mL 농도의 아플리베르셉트; (b) 5-50 mM 농도의 완충제; (c) 비-이온성 계면활성제; (d) 약 300 mOsm/kg의 최종 삼투압 (즉, 300 ± 50 mOsm/kg)을 갖는 등장화제로서 라이신 염을 포함하고, 상기 제제는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5이다. 본 발명의 안과용 제제는 유리체내 또는 국소 투여에 적합하다. 본 발명의 아플리베르셉트 함유 안과용 제제는 종래의 아플리베르셉트 안과용 제제에 비해 유리하거나 더욱 바람직한 안정성 특성, 예를 들어 시간에 따라 현저하게 감소된 응집 및 가시성 특성을 갖는다. 본 발명의 제제는 또한 원하는 경우 동결 건조 및 재구성될 수 있다.
본 발명의 안과용 제제는 눈 장애 또는 질병, 예를 들어 망막 정맥 폐색 (RVO)에 따른 황반 부종, 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO), 분지 망막 정맥 폐쇄 (BRVO), 신혈관 (습식) 연령-관련 황반 변성 (AMD), 근시 맥락막 신생 혈관 형성으로 인한 시각 장애, 당뇨병 황반부종 (DME), DME 환자의 당뇨병성 망막병증 (DR), 및 신생 혈관 연령-관련 황반변성 (AMD)의 치료 방법에서 의학적 안과제로 사용될 수 있다. 본 발명의 안과용 제제의 투여는 유리체내 주사, 또는 경우에 따라 의학적으로 적합한 눈에 국소 투여함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명의 제제는 이들 눈 장애 또는 질환의 치료에 사용될 수 있고, 이들 눈 장애 및 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
전술한 요약은 본 발명의 모든 양태를 정의하려는 것이 아니며, 추가 양태는 실시 예의 상세한 설명과 같은 다른 섹션에서 설명된다. 전체 문서는 통합된 공개문서로서 관련되도록 의도되었으며, 본 명세서에 설명된 특징들의 조합이 동일한 문장, 단락 또는 본 문서의 섹선에서 함께 발견되지 않더라도 본 명세서에 설명된 특징의 모든 조합이 고려된다는 것을 이해해야 한다.
전술한 것에 더하여, 본 발명은 추가적인 양태로서, 상기 특정 단락에 의해 정의된 변형 보다 임의의 방식으로 범위가 좁아진 본 발명의 모든 실시예를 포함한다. 예를 들어, 속 (genus)으로 기술된 본 발명의 특정 측면의 경우, 속의 모든 구성원이 개별적으로 본 발명의 측면이라는 것을 이해해야 한다. 또한, 속 또는 속의 구성원을 선택하는 것으로 기술된 측면은 속의 둘 이상의 구성원의 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 출원인 (들)이 본 명세서에 기술된 본 발명의 전체 범위를 발명했지만, 출원인은 다른 사람의 선행 기술에 기술된 주제를 청구하려고 하지 않는다. 따라서, 특허청 또는 다른 단체 또는 개인이 청구 범위 내에서 법정 선행 기술을 출원인이 주목할 경우, 출원인은 관련 특허법에 따라 수정 권한을 행사할 권리를 보유한다. 그러한 청구 범위의 주제로부터 그러한 법적 선행 기술 또는 명백한 법적 선행 기술의 변형을 배제하도록 청구의 주제를 재정의한다. 그러한 수정된 청구 범위에 의해 정의된 본 발명의 변형은 또한 본 발명의 양태로서 의도된다.
도 1은 SE-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 30 ℃에서 저장된 다양한 아플리베르셉트 제제에서의 HMW 형성을 나타낸다 (제제 약어의 경우 표 1을 참조).
도 2는 SE-HPLC에 의해 측정된 바와 같이 4 ℃에서 저장된 다양한 아플리베르셉트 제제에서의 HMW 형성을 나타낸다 (제제 약어의 경우 표 1을 참조).
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 따라서, 본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥 상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함하고; "세포"는 다수의 세포 집단을 포함한다.
본 발명은 환자에게 유리체내 또는 국소 투여에 적합한 수성 안과용 제제에 관한 것으로, 상기 제제는 아플리베르셉트 (Aflibercept)를 포함하며, 이는 상업적으로 Eylea®로도 알려져 있다. 아플리베르셉트는 전형적으로 재조합 DNA 발현 기술에 의해 가장 편리하게 생성되는, 아플리베르셉트 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 갖는 2 개의 동일한 융합 폴리펩티드 사슬의 어셈블리이다. 상기 아플리베르셉트 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
서열 번호 1의 아미노산 위치에 따라 시스테인 잔기 사이에 디설파이드 브릿지가 예상된다 (상기 서열 번호 1에 나타낸 밑줄친 시스테인 (C) 잔기):
30-79 (사슬내)
124-185 (사슬내)
211-211 (사슬간)
214-214 (사슬간)
246-306 (사슬내)
352-410 (사슬내).
상기 아플리베르셉트의 2 개의 융합 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 1의 아미노산 위치 211 및 214에서 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 상기 융합 단백질은 전형적으로 서열 번호 1의 위치 36, 68, 123, 196 및 282에서 아스파라긴 잔기에 공유적으로 연결된 N-글리칸으로 글리코실화된다 (상기 서열 번호 1에 나타낸 굵은/이탈릭체의 아스파라긴 (N) 잔기). 본 발명의 범위 내의 "아플리베르셉트"는 또한 융합 폴리펩티드 사슬 중 하나 또는 둘 다가 추가의 카르복시-말단 라이신 (K) 잔기를 갖는 아미노산 서열 서열 번호 1을 갖는 구현예를 포함한다. 본 발명의 안과용 제제에서 아플리베르셉트의 농도는 약 20 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 또는 약 30 mg/mL 내지 약 50 mg/mL이고; 예를 들어, 약 40 mg/mL의 농도가 제제의 많은 구현예에서 유용하다.
"안정한" 제제는 아플리베르셉트를 함유하는 약물 물질 및/또는 약물 제품의 가공 (예를 들어, 한외여과, 정용여과, 다른 여과 단계, 바이알 충전), 수송 및/또는 저장시에 그 안에 단백질이 그것의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 보유하는 것이다. 또한, 제제 중의 단백질의 물리적, 화학적 및 생물학적 안정성은 제제화된 약물 생성물 (DP)이 저장되는 조건에 특이적인 단백질 제제, 예를 들어 아플리베르셉트 제제의 "안정성"을 구현한다. 예를 들어, 영하의 온도에 저장된 의약품은 화학적, 물리적 또는 생물학적 활성에 큰 변화가 없을 것으로 예상되는 반면, 40 ℃에서 저장된 의약품은 의약품 물질 또는 의약품의 보관 시간에 따라 물리적, 화학적 및 생물학적 활성에 변화가 있을 것으로 예상된다. 단백질 제제 구성은 또한 변화율에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 응집체 형성은 단백질 농도가 높을수록 더 높은 응집 속도로 단백질 농도에 의해 크게 영향을 받는다. 부형제는 또한 예를 들어, 일부 단백질에 대한 응집 속도를 증가시키는 염의 첨가와 함께 약물 제품의 안정성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 반면, 수크로오스와 같은 다른 부형제는 저장 동안 응집 속도를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 불안정성은 또한 변형 유형 및 pH 의존성에 따라 더 높거나 낮은 분해 속도를 야기하는 pH에 의해 크게 영향을 받는다.
단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술이 당업계에서 이용 가능하고, 예를 들어 문헌 [Wang, W. (1999), Instability, stabilization and formulation of liquid protein pharmaceuticals, Int J Pharm 185:129-188]에서 검토된다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 시간 동안 측정될 수 있다. 빠른 스크리닝을 위해, 예를 들어 상기 제제는 2 주 내지 1 개월 동안 40 ℃에서 유지될 수 있으며, 이때 안정성이 측정된다. 제제가 2-8 ℃에서 저장되는 경우, 일반적으로 상기 제제는 30 ℃에서 1 개월 이상 동안, 또는 40 ℃에서 1 주일 이상 동안 안정 및/또는 2-8 ℃에서 적어도 2년 동안 안정하여야 한다.
단백질은 그것의 색상 및/또는 선명도 검사 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토 그래피, 또는 다른 적합한 방법에 의해 측정되는 2 차 및/또는 3 차 구조 (즉, 고유 구조)의 변화, 또는 응집 및/또는 침전 및/또는 변성에 대한 최소한의 징후를 나타내는 경우, 약제학적 제제에서 "그것의 물리적 안정성을 유지한다". 단백질의 물리적 불안정성, 즉 물리적 안정성의 상실은 올리고머화에 의해 이량체 및 고차 응집체, 비가시성 및 가시적 입자 형성 및 침전을 초래할 수 있다. 물리적 분해도는 목적 분해제의 유형에 따라 다양한 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 이합체 및 고차 가용성 응집체는 크기 배제 크로마토 그래피를 사용하여 정량화될 수 있는 반면, 분할가능한 입자는 광 산란, 광 차단 또는 다른 적합한 기술을 사용하여 정량화될 수 있다. 일 구체 예에서, 단백질의 안정성은 낮은 백분율의 분해된 (예를 들어, 단편화된) 및/또는 응집된 단백질을 갖는 용액 중 아플리베르셉트 단량체 단백질의 백분율에 따라 결정된다. "아플리베르셉트 단량체"는 임의의 폴리펩티드 사슬 상에 추가의 카르복시-말단 라이신 잔기를 갖거나 갖지 않는, 아플리베르셉트 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 갖는 2 개의 폴리펩티드 사슬의 어셈블리를 의미한다. "아플리베르셉트 단량체"에서, 상기 2 개의 아플리베르셉트 폴리펩티드 사슬은 상기 언급된 바와 같이 서열의 면역글로불린 Fc 도메인 부분의 회합 및 이황화 가교를 통해 어셈블리된다. 예를 들어, 안정한 단백질을 포함하는 수성 제제는 (총 단백질의 백분율로서) 95 % 이상의 아플리베르셉트 단량체, 96 % 이상의 아플리베르셉트 단량체, 97 % 이상의 아플리베르셉트 단량체, 98 % 이상의 아플리베르셉트 단량체 또는 99 % 이상의 아플리베르셉트 단량체 단백질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 수성 제제는 (총 단백질의 백분율로서) 약 5 % 응집체 및/또는 분해된 아플리베르셉트 단백질을 포함할 수 있다.
주어진 시간에서의 화학적 안정성이 공유 결합이 이루어지거나 끊어져서 예를 들어 아플리베르셉트와 같은 단백질 성분의 일차 구조에 변화를 야기하지 않도록 존재하는 경우, 단백질은 약제학적 제제에서 "그것의 화학적 안정성을 유지한다". 1 차 구조의 변화는 단백질의 2 차 및/또는 3 차 및/또는 4 차 구조의 변형을 초래할 수 있으며, 응집체의 형성 또는 이미 형성된 응집체의 반전을 초래할 수 있다. 전형적인 화학적 변형은 이성질화, 탈아미드화, N-말단 고리화, 백본 가수분해, 메티오닌 산화, 트립토판 산화, 히스티딘 산화, 베타-제거, 이황화 형성, 이황화 스크램블링, 이황화 절단 및 D-아미노산 형성을 포함하는 1 차 구조의 변화를 야기하는 그 밖의 변화를 포함할 수 있다. 화학적 불안정성, 즉 화학적 안정성의 손실은 이온-교환 크로마토 그래피, 모세관 등전점 포커싱, 펩타이드 다이제스트 분석 및 다수 유형의 질량 분석 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 조사될 수 있다. 화학적 안정성은 화학적으로 변형된 형태의 단백질을 검출하고 정량화하여 평가될 수 있다. 화학적 변경은 예를 들어 크기 배제 크로마토 그래피, SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행-시간 질량 분석법 (MALDI/TOF MS)을 사용하여 평가될 수 있는 크기 변형 (예를 들어, 클리핑)을 수반할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변경은 이온-교환 크로마토 그래피, 모세관 등전점 포커싱 또는 펩티드 맵핑과 같은 (이에 국한되지는 않음) 전하-기반 방법에 의해 평가될 수 있는 전하 변경 (예를 들어, 탈아미드화의 결과로 발생)을 포함한다.
물리적 및/또는 화학적 안정성의 상실은 변형체 및 변형되는 단백질에 따라 목적 생물학적 활성의 증가 또는 감소로서 생물학적 활성의 변화를 초래할 수 있다. 주어진 시간에서의 단백질의 생물학적 활성이 약제학적 제제가 제조될 때 나타나는 생물학적 활성의 약 30 % 내에 있는 경우, 단백질은 약제학적 제제에서 "그것의 생물학적 활성을 유지한다". 활성이 그것의 시작 값의 70 % 미만인 경우 활성이 감소된 것으로 간주된다. 생물학적 분석법은 생체내 (in vivo) 및 시험관내 (in vitro) 기반 분석법, 예를 들어 리간드 결합, 효능, 세포 증식 또는 그것의 생약제학적 활성의 다른 대리 측정법을 포함할 수 있다. 예로서, 아플리베르셉트의 생물학적 활성은 ELISA 또는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 증식 분석에 의한 PGF에 결합하는 항-태반 성장 인자의 억제와 같은 시험관내 리간드 결합 분석을 사용하여 추정될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 아플리베르셉트는 전형적으로 재조합 발현 기술에 의해 생성된다. 용어 "재조합"은 물질 (예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)이 인간의 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로 (즉, 비-천연적으로) 변경되었음을 나타낸다. 변경은 자연 환경 또는 상태 내에서 또는 그로부터 제거된 물질에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, "재조합 핵산"은 예를 들어 클로닝, DNA 셔플링 또는 다른 공지된 분자 생물학적 절차 동안 핵산을 재조하여 제조된 것이다. 이러한 분자 생물학적 절차의 예는 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)]에서 발견된다. "재조합 DNA 분자"는 이러한 분자 생물학적 기술에 의해 함께 연결된 DNA 분절을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 분자를 사용하여 발현되는 단백질 분자를 나타낸다. "재조합 숙주 세포"는 재조합 핵산을 함유 및/또는 발현하는 세포이다. 아플리베르셉트 융합 단백질을 발현하는데 유용한 재조합 DNA 분자는 예를 들어, 문헌 [Papadopoulos et al., Modified Chimeric Polypeptides with Improved Pharmacokinetic Properties, US 7,070,959 B2; 및 WO 00/75319 A1)]에 기술되어 있다.
폴리펩티드, 핵산, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 관련하여 명세서에서 발생하는 용어 "자연 발생"은 자연에서 발견되는 물질을 나타낸다.
용어 "제어 서열" 또는 "제어 신호"는 특정 숙주 세포에서 그것이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 처리에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 의존할 수 있다. 특정 구현예에서, 원핵 생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 진핵 생물에 대한 제어 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열 또는 요소, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. 제어 서열은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 짧은 DNA 어레이로 구성된다 (Maniatis, et al., Science 236 : 1237 (1987)). 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유 동물 세포 및 바이러스의 유전자를 포함하는 다양한 진핵 생물 공급원으로부터 분리된다 (유사한 제어 요소, 즉 프로모터는 또한 원핵 생물에서 발견됨). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 목적 단백질을 발현시키기 위해 어떤 세포 유형이 사용될 것인지에 달려 있다. 일부 진핵 생물 프로모터 및 인핸서는 광범위한 숙주 범위를 갖는 반면, 다른 진핵 생물은 제한된 서브 세트의 세포 유형에서 기능적이다 (Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) 및 Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987) 참조).
"프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하여 하나 이상의 다운스트림 구조 유전자에 의해 메신저 RNA의 전사를 개시하는 부위를 포함하는 DNA의 영역이다. 프로모터는 동일한 가닥 및 DNA 업스트림 (센스 가닥의 5 '영역을 향하여) 상의, 유전자의 전사 시작 부위 근처에 위치한다. 프로모터는 일반적으로 길이가 약 100-1000 bp이다.
"인핸서"는 유전자의 전사를 활성화시키기 위해 하나 이상의 이펙터 단백질 (전사 인자)과 결합될 수 있는 DNA의 짧은 (50-1500 bp) 영역이다.
본원에 사용된 용어 "작동 가능한 조합", "작동 가능한 순서" 및 "작동가능하게 연결된"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생성되는 방법으로 핵산 서열의 연결을 나타낸다. 상기 용어는 또한 기능성 단백질이 생성되는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 나타낸다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 벡터의 제어 서열은 상기에 연결되어 단백질 코딩 서열의 발현이 제어 서열의 전사 활성에 적합한 조건 하에서 달성된다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 펩티드 결합을 통해 공유 결합된 2 개 이상의 아미노산의 분자 사슬을 포함한다. 상기 용어는 제품의 특정 길이를 의미하지 않는다. 따라서, "펩티드" 및 "올리고 펩티드"는 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어는 폴리펩티드의 번역-후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 단백질 단편, 유사체, 돌연변이 또는 변이 단백질, 융합 단백질 등이 폴리펩티드의 의미 내에 포함된다. 상기 용어는 또한 공지된 단백질 공학 기술을 사용하여 재조합적으로 발현될 수 있는 하나 이상의 아미노산 유사체 또는 비-표준 또는 비천연 아미노산이 포함된 분자를 포함한다. 또한, 융합 단백질은 잘-알려진 유기 화학 기술에 의해 본원에 기술된 바와 같이 유도될 수 있다.
폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린 또는 항체)의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 대해 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
예를 들어, 아플리베르셉트와 관련하여 용어 "융합 단백질"은 단백질이 하나 이상의 모 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 성분을 포함한다는 것을 나타낸다. 전형적으로, 융합 단백질은 하나의 단백질로부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 상이한 단백질로부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 프레임으로 부착되고 임의로 링커에 의해 분리되는 "융합 유전자"로부터 발현된다. 상기 융합 유전자는 그 다음 재조합 숙주 세포에 의해 단일 단백질로서 발현될 수 있다.
"분비된" 단백질은 분비 신호 펩티드 서열의 결과로서 소포체 (ER), 분비 소포 또는 세포 외 공간으로 향할 수 있는 단백질, 및 신호 서열을 반드시 함유함이 없이 세포외 공간으로 방출되는 단백질들을 나타낸다. 분비된 단백질이 세포 외 공간으로 방출되면, 분비된 단백질은 "성숙" 단백질을 생성하기 위해 세포 외 가공을 경험할 수 있다. 세포 외 공간으로의 방출은 세포외 이입 및 단백질 분해 절단을 포함하는 많은 메커니즘에 의해 발생할 수있다. 일부 다른 구현예에서, 목적 아플리베르셉트 융합 단백질은 분비 단백질로서 숙주 세포에 의해 합성된 후 세포 외 공간 및/또는 배지로부터 추가로 정제될 수 있다.
숙주 세포에서 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 단백질과 관련하여 본원에서 사용된 "가용성"은 수용액에 존재하는 단백질이고; 단백질이 트윈-아르기닌 신호 아미노산 서열을 함유하는 경우, 상기 가용성 단백질은 그람 음성 박테리아 숙주에서 주변 세포질 공간으로 보내지거나, 분비가능한 진핵 생물 숙주 세포 또는 적절한 유전자 (예를 들어, 킬 유전자)를 보유하는 박테리아 숙주에 의해 배양 배지로 분비된다. 따라서, 가용성 단백질은 숙주 세포 내부의 봉입체에서 발견되지 않는 단백질이다. 대안적으로, 맥락에 따라, 가용성 단백질은 상당한 양의 불용성 응집체를 형성하지 않으면서 세포막에 통합되어 있지 않거나, 이온성 세제 또는 카오트로픽제, 예를 들면 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 우레아, 구아니 디늄 히드로클로라이드 또는 리튬 퍼클로레이트를 함유하지 않는 완충제와 같은 생리학적 조건 하에서 목적의 수성 완충제에 다른 단백질 없이 현탁되는 경우, 시험 관내에서, 용해되거나, 생리학적 조건 하에서 수성 완충제에 용해될 수 있는 단백질이다 (즉, 총 단백질의 10 % 미만, 전형적으로는 약 5 % 미만의 응집체를 형성함). 반대로, 불용성 단백질은 숙주 세포에서 세포질 과립 (내포체라고 함) 내부에 변성된 형태로 존재하는 것이거나, 문맥에 따라 다시 불용성 단백질은 세포질 막, 미토콘드리아 막, 엽록체 막, 소포체 망막 막 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세포막에 존재하거나, 이온성 세제 또는 카오트로픽제, 예를 들면 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 우레아, 구아니 디늄 히드로클로라이드 또는 리튬 퍼클로레이트를 함유하지 않는 완충제와 같은 생리학적 조건 하에서 목적의 수성 완충제에 (생리학적으로 호환되는 온도에서) 다른 단백질 없이 현탁되는 경우, 생리학적 조건 하의 시험관내 수성 완충제에서 상당량의 불용성 응집체를 형성하는 단백질이다 (즉, 약 10 % 이상의 응집체를 형성함).
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 둘 이상의 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 단일 가닥 뿐만 아니라 이중 가닥 뉴클레오티드 중합체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 잔기는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이들 뉴클레오티드 유형의 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형은 브로모리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2',3'-디데옥시 리보스와 같은 리보스 변형 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로졸레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드 간 연결 변형을 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 200 개 이하의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60 개인 염기이다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 개의 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 돌연변이 유전자의 구축에 사용하기 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 분석을 위한 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원 표지를 포함하는 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드 서열" 또는 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 올리고뉴클레오티드, DNA, 및 핵산, RNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 잔기의 1 차 서열, 또는 문맥에 따라 뉴클레오티드 잔기의 1 차 서열을 나타내는 문자열이다. 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열로부터, 주어진 핵산 또는 상보적 폴리뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA가 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 논의된 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 나타낸다. 초기 RNA 전사체의 5' 내지 3' 첨가의 방향은 전사 방향으로 나타내고; RNA 전사체의 5' 내지 5' 말단인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상의 서열 영역은 "업스트립 서열"이라 하고; RNA 전사체의 3' 내지 3' 말단인 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상의 서열 영역은 "다운스트림 서열"이라 한다.
본원에 사용된 "단리된 핵산 분자" 또는 "단리된 핵산 서열"은 (1) 통상적으로 핵산의 천연 공급원에 관여하는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리되거나 (2) 목적의 핵산의 서열이 결정될 수 있도록 백그라운드 핵산과 클로닝, 증폭, 태그 또는 그렇지 않으면 구별되는 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 그것이 자연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 다른 염색체 위치에 존재하는 면역 글로불린 (예를 들어, 항체)을 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자 암호화", "DNA 서열 암호화" 및 "DNA 암호화"는 데옥시리보핵산 가닥을 따라 데옥시리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 나타낸다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 mRNA 사슬을 따라 리보뉴클레오티드의 순서를 결정하고, 또한 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 DNA 서열은 RNA 서열 및 아미노산 서열을 코딩한다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 나타내기 위해 광범위하게 사용된다. 유전자는 전형적으로 코딩 서열 및/또는 이러한 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 용어 "유전자"는 특정 게놈 또는 재조합 서열뿐만 아니라 상기 서열에 의해 암호화된 cDNA 또는 mRNA에 적용된다. 유전자는 또한 예를 들어 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비-발현 핵산 세그먼트를 포함한다. 전사 단백질과 같은 조절 단백질이 결합하는 전사 제어 요소를 포함하는 비-발현 조절 서열은 인접한 또는 근처 서열의 전사를 야기한다.
"유전자의 발현" 또는 "핵산의 발현"은 DNA의 RNA로의 전사 (선택적으로 RNA의 변형, 예를 들어 스플라이싱 포함), RNA의 폴리펩티드로의 번역 (그 다음 폴리펩티드의 번역-후 변형 포함), 또는 문맥에 의해 지시된 바와 같이, 전사 및 번역 모두를 의미한다.
발현 카세트는 재조합 발현 기술의 전형적인 특징이다. 발현 카세트는 목적 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들어 아플리베르셉트 융합 단백질 서열을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 진핵 생물 "발현 카세트"는 포유 동물 세포와 같은 진핵 생물 세포에서 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터의 일부를 나타낸다. 진핵 생물 세포에서 작동할 수 있는 프로모터, mRNA 전사의 경우, 하나 이상의 목적 유전자(들) 및 mRNA 종결 및 처리 신호를 포함한다. 발현 카세트는 코딩 서열 중에서 선택 마커로서 유용한 유전자를 유용하게 포함할 수 있다. 발현 카세트에서 프로모터는 목적 외인성 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임의 5'에 작동가능하게 결합되고; 폴리아데닐화 부위는 상기 오픈 리딩 프레임의 3'에 작동가능하게 결합된다. 발현 카세트가 작동가능하게 유지되는 한 다른 적합한 제어 서열이 또한 포함 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 임의로 하나 이상의 목적 단백질에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 구조 유전자와 관련하여 사용될 때 용어 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 mRNA 분자의 번역의 결과로서 초기 폴리펩타이드에서 발견된 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 코딩 영역은 진핵 생물에서 개시자 메티오닌을 인코딩하는 뉴클레오타이드 삼중항 "ATG"에 의해 5'측에, 그리고 정지 코돈 (즉, TAA, TAG, TGA)을 구체화하는 3 개의 삼중항 중 하나에 의해 3'측에 결합된다.
재조합 발현 기술은 전형적으로 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터의 사용을 포함한다.
용어 "벡터"는 단백질 코딩 정보를 숙주 세포 내로 전달하는데 사용되는 임의의 분자 또는 실체 (예를 들어, 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 요어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 원하는 코딩 서열 및 적절한 핵산 제어 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 나타낸다. 상기 발현 벡터는 전사, 번역에 영향을 미치거나 제어하고, 인트론이 존재하는 경우 상기에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 원핵 생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 임의로 조작자 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능한 경우 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 분비 신호 펩티드 서열은 또한 원하는 경우 상기 세포로부터 목적의 폴리펩티드의 보다 용이한 분리를 위하여, 발현된 폴리펩티드가 재조합 폴리펩티드 세포에 의해 분비될 수 있도록, 선택적으로 목적의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터에 의해 암호화 될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져있다. (예를 들어, 문헌 Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences, U.S. Pat. No. 5,302,697; Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, U.S. Pat. No. 6,022,952 and U.S. Pat. No. 6,335,178; Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, U.S. Pat. No. 7,029,909; Ruben et al., 27 human secreted proteins, US 2003/0104400 A1 참조). 목적의 다중-서브 유닛 단백질의 발현을 위해, 각각의 상이한 서브 유닛 모노머에 대한 코딩 서열을 함유하는 적합한 수 및 비율의 개별 발현 벡터가 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 단일 발현 벡터가 목적의 단백질의 상이한 서브 유닛을 발현시키기 위해 사용될 수 있다 .
재조합 발현 기술은 전형적으로 재조합 발현 벡터를 포함하는 포유 동물 숙주 세포를 포함한다.
용어 "숙주 세포"는 핵산으로 형질 전환되거나 형질전환되어 목적의 유전자 또는 코딩 서열을 발현하는 세포를 의미한다. 상기 용어는 목적 유전자가 존재하는 한, 자손이 형태학에서 또는 원래의 모세포와의 유전적 구성에서 동일한지 여부와 상관없이, 모 세포의 자손을 포함한다. 다수의 이용가능하고 잘-알려진 숙주 세포 중 어느 것이라도 아플리베르셉트를 얻기 위해 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 특정 숙주의 선택은 관련 기술 분야에 의해 인식되는 다수의 인자에 의존한다. 이들은 예를 들어 선택된 발현 벡터와의 상용성, DNA 분자에 의해 코딩된 펩티드의 독성, 형질 전환 속도, 펩티드의 회복 용이성, 발현 특성, 생체-안전성 및 비용을 포함한다. 이들 인자들의 균형은 모든 숙주가 특정 DNA 서열의 발현에 동일하게 효과적일 수는 없다는 것을 이해해야 한다. 이러한 일반적인 지침 내에서, 배양에 유용한 미생물 숙주 세포는 박테리아 (예를 들면 Escherichia coli sp.), 효모 (예를 들면: Saccharomyces sp.) 및 다른 곰팡이 세포, 조류 또는 조류-유사 세포, 곤충 세포, 식물 세포를 포함한다. 포유 동물 (인간 포함) 세포, 예를 들어 CHO 세포 및 HEK-293 세포를 포함한다. DNA 수준에서도 변형도 가능하다. 펩티드-인코딩 DNA 서열은 선택된 숙주 세포와 더욱 상용성인 코돈으로 변경될 수 있다. E. coli의 경우, 최적화된 코돈이 당업계에 공지되어 있다. 코돈은 선택된 숙주 세포에서 DNA의 가공을 용이하게 하기 위하여 제한 부위를 제거하거나 침묵 제한 부위를 포함하도록 치환될 수 있다. 그 다음, 형질전환된 숙주는 배양 및 정제된다. 숙주 세포는 통상적인 발효 조건 하에서 배양되어 원하는 화합물이 발현될 수 있다. 이러한 발효 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.
유용한 포유 동물 숙주 세포주의 예는 CHO-K1 세포 (예를 들어, ATCC CCL61), DXB-11, DG-44 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR을 포함하는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO, Urlaub et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4216 (1980)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양에서 성장을 위해 서브 클로닝된 293 또는 293 세포 (Graham et al, J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4 , Mather, Biol. Reprod. 23 : 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 송곳니 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간암 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383 : 44-68 (1982)); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 또는 포유 동물 골수종 세포가 있다.
"세포", "세포주" 및 "세포 배양"은 종종 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에서 이러한 모든 명칭은 세포 자손을 포함한다. 예를 들어, CHO 세포로부터 "유래된" 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포의 세포 자손으로, 임의의 수의 세대에 의해 원래의 1 차 세포 모체로부터 제거될 수 있고, 또한 형질 전환 자손 세포를 포함할 수 있다. 형질전환체 및 형질전환된 세포는 1 차 대상 세포 및 전달 수에 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손의 DNA 함량은 정확하게 동일하지 않을 수도 있다는 것이 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.
숙주 세포는 폴리펩티드 (항체와 같은 항원 결합 단백질 포함)의 생성을 위해 상기-기술된 핵산 또는 벡터로 형질전환 또는 형질감염되고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택, 또는 원하는 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 또한, 선택적 마커에 의해 분리된 전사 단위의 다중 카피를 갖는 신규 한 벡터 및 형질감염된 세포주는 특히 항체와 같은 폴리펩티드의 발현에 유용하다.
용어 "형질 감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입될때 세포는 "형질 감염"된다. 다수의 형질감염 기술이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고 본원에 개시되어 있다. 예를 들어 문헌 [Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197] 참고. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다.
용어 "형질 전환"은 세포의 유전적 특성의 변화를 나타내고, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변형되었을 때 형질전환된다. 예를 들어, 세포는 형질감염, 형질도입 또는 다른 기술을 통해 새로운 유전자 물질을 도입함으로써 본래 상태로부터 유전자가 변경되어 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체에 물리적으로 통합함으로써 세포의 것과 재조합될 수 있거나, 복제되지 않고 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 형질전환 DNA가 세포의 분열과 함께 복제될 때 세포는 "안정적으로 형질 전환된"것 으로 여겨진다.
본 발명에 유용한 아플리베르셉트 융합 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들면 Ham's F10 (Sigma), MEM (Minimal Essential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle 's Medium, Sigma)가 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Patent Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; or U.S. Patent Re. No. 30,985]에 기술된 임의의 매체가 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 배지 내에서 또는 배지 상의 세포의 생리학적 조건이 숙주 세포에 의해 목적의 단백질의 발현을 촉진하도록 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들면: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들면: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들면: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면: Gentamycin™ 약물), 미량 원소 (일반적으로 마이크로 몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의) 및 포도당 또는 동등한 에너지 원이 보충될 수 있고; 임의의 다른 필요한 보충제가 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도 (일반적으로, 반드시는 아니지만 약 37 ℃, pH (일반적으로, 반드시는 아니지만 pH 6.5-7.5), 산소화 등과 같은 배양 조건이 목적 단백질의 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용되었으며, 당업자에게 명백한 것이다. 배양 배지는 태아 소 혈청 (FBS)과 같은 적합한 양의 혈청을 포함할 수 있거나, 바람직하게는 숙주 세포는 무-혈청 배지에서의 배양에 적합할 수 있다. 일부 구현예에서, 수성 배지는 액체이므로, 숙주 세포는 액체 배지 내의 세포 현탁액에서 배양된다. 숙주 세포는 배치 배양 또는 연속 배양 시스템에서 유용하게 성장될 수 있다.
다른 구현예에서, 포유동물 숙주 세포는 예를 들어 한천 또는 아가로스를 함유하는 고체 또는 반고체 수성 배지에서 배양되어 세포가 부착되어 접착층을 형성하는 배지 또는 기질 표면을 형성할 수 있다.
숙주 세포를 배양하는 경우, 재조합 폴리펩티드는 세포 내로, 주변세포질 공간으로, 또는 배지로 직접 분비될 수있다. 아플리베르셉트와 같은 폴리펩티드가 세포 내에서 생성되는 경우, 제 1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해물은 예를 들어 원심 분리 또는 한외 여과에 의해 제거된다.
목적 단백질, 예를 들면 아플리베르셉트는, 예를 들어, 목적 항원 또는 단백질 A 또는 단백질 G를 친화성 리간드로서 사용하여 하이드록실아파타이트 크로마토 그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 바람직하게는 친화성 크로마토 그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62 : 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소 타입 및 인간 γ3에 권장된다 (Guss et al, EMBO J. 5 : 15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스이지만 다른 매트릭스도 이용가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 빠른 유속과 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 단백질이 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, N.J. Phillipsburg)가 정제에 유용하다. 에탄올 침전, 역상 HPLC, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 암모늄 설페이트 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 회수될 항체에 따라 가능하다.
완충제 및 면역글로불린 또는 다른 결합 분석 시약과 관련하여 "생리학적 조건 하에서"는 비-공유 결합 반응과 같은 생화학적 반응의 발생을 허용하는 온도, pH 및 이온 강도 조건 하에서의 배양을 의미한다. 전형적으로, 온도는 실온 또는 주위 온도에서 최대 약 37 ℃ 및 pH 6.5-7.5이다.
물질의 조성물에 대한 "생리학적으로 허용되는 염", 예를 들어 목적 단백질의 염, 예를 들어 융합 단백질 또는 면역글로불린, 예를 들어 항체, 또는 임의의 다른 목적 단백질의 염, 또는 라이신, 히스티딘 또는 프롤린 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는 아미노산의 염은 임의의 염, 또는 약제학적으로 허용되는 것으로 알려지거나 후에 발견되는 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염의 일부 비-제한적 예는 다음과 같다: 약제학적으로 허용가능한 염의 일부 비-제한적인 예는: 아세테이트 염; 트리플루오로 아세테이트 염; 히드로할라이드드, 예를 들면 히드로클로라이드 (예를 들어, 모노히드로클로라이드 또는 디히드로클로라이드 염) 및 히드로브로마이드 염; 황산염; 시트레이트 염; 말레에이트 염; 타르트레이트 염; 글리콜레이트 염; 글루코네이트 염; 숙시네이트 염; 메실레이트 염; 베실레이트 염; PentaGalloylGlucose (PGG) 및 에피갈로카테킨갈레이트 (EGCG)와 같은 갈산 에스테르의 염 (갈산은 3,4,5 트리하이드록시벤조인산으로도 알려져 있음), 콜레스테릴 설페이트의 염, 파모에이트 염, 탄산염 및 옥살 레이트 염이 있다.
본 발명의 안과용 제제에서, 상기 라이신 염은 라이신 염이 약제학적으로 허용가능한 라이신 염 형태이기만 한다면 L-라이신 형태 및/또는 D-라이신 형태를 포함할 수 있다. 라이신 염의 예는 (2S)-2,6-디아미노헥사노인산; (2R)-2,6-디아미노헥사노인산; L-라이신 일수화물; L-라이신 수화물; (S)-2,6- 디아미노카프로인산 수화물; (2S)-2,6-비스 (아자닐)헥사노인산 수화물; L-라이신 아세테이트; L-라이신 모노아세테이트; 2,6-디아미노헥사노인산; dl-라이신 아세테이트; L-라이신 히드로클로라이드; L-라이신 모노하이드로클로라이드; (S)-2,6-다이 아미노헥사노인산 히드로클로라이드; D-라이신 하이드로클로라이드; D-라이신 모노하이드로 클로라이드; (D)-2,6-디아미노헥사노인산 히드로클로라이드; L-라이신 디하이드로클로라이드; 2,6-디아미노헥사노인산 디히드로클로라이드; L-라이신 락테이트; L-라이신 모노-(2-하이드록시프로파노에이트); L-라이신 모노(+/-)-2-하이드록시프로파노에이트); L-라이신 숙시네이트; (S)-2,6-디아미노헥사노인산 (S)-2-아미노펜탄디온산; 및 L-라이신 L-글루타메이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"반응 혼합물"은 생리학적 배양 조건 하에서 예를 들어 공유 또는 비-공유 결합 반응과 같은 목적의 시험관내 생화학적 반응을 발생시키는데 필요한 모든 시약 및 인자를 함유하는 수성 혼합물이다.
폴리뉴클레오타이드의 "도메인" 또는 "영역" (본원에서 상호교환적으로 사용됨)은 완전한 폴리뉴클레오타이드까지 포함하지만, 전형적으로 전체의 폴리뉴클레오타디 보다 덜 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 임의의 영역이다. 도메인은 나머지 폴리뉴클레오티드 사슬의 독립적인 접힘 (예를 들어, DNA 헤어핀 접힘) 및/또는 코딩 영역 또는 조절 영역과 같은 특정 생물학적, 생화학적 또는 구조적 기능 또는 위치와 상관될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.
단백질의 "도메인" 또는 "영역" (본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)은 완전한 단백질의 최대 부분을 포함하나, 전형적으로 완전한 단백질 보다 덜 포함하는 전체 단백의 임의의 부분이다. 도메인은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 접히거나 및/또는 특정 생물학적, 생화학적, 또는 구조적 기능 또는 위치 (예를 들어, 리간드 결합 도메인, 도는 세포질, 막 횡단 또는 세포 외 도메인)와 상관될 수 있지만, 반드시 그런것은 아니다.
아플리베르셉트 융합 단백질의 정량은 종종 단백질 생산을 추적하거나 또는 아플리베르셉트를 함유하는 약물 물질 또는 의약품의 로트 방출 분석에 유용하거나 필요하다. 따라서, 아플리베르셉트, 특히 모노클로날 항체에 특이적으로 결합하는 항체가 이들 목적에 유용할 수 있다.
용어 "항체" 또는 교환가능하게 "Ab"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 완전히 조립된 항체, 단일클론 항체 (인간, 인간화 또는 키메라 항체를 포함), 폴리클로날 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 한다면 상기의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항원 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체, 디아바디)에 결합할 수 있는 항체 단편을 포함한다. 화학적으로 유도체화된 항체를 포함하는 온전한 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체가 고려된다. IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함하는 임의의 이소 타입 클래스 또는 서브 클래스의 항체 또는 임의의 동종이 고려된다. 상이한 이소 타입은 상이한 효과 기능을 갖는다; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소 타입은 항체-의존성 세포 세포 독성 (ADCC) 활성을 갖는다.
"분리된" 단백질, 예를 들어, 아플리베르셉트 융합 단백질은 천연 환경 또는 그것이 생산 세포에 의해 분비된 배양 배지의 하나 이상의 성분으로부터 확인되고 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 분리된 단백질은 그것의 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 방해하는, 그것의 천연 또는 배양 배지 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물이 실질적으로 없다. 그것의 천연 환경 또는 배지의 "오염물" 성분은 단백질, 예를 들어 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물)을 용질을 포함할 수 있다. 전형적으로, "분리된 단백질"은 주어진 샘플의 약 5 % 이상, 약 10 % 이상, 약 25 % 이상 또는 약 50 % 이상을 구성한다. 일부 구현예에서, 목적 단백질, 예를 들어, 아플리베르셉트 융합 단백질 또는 항체는 (1) 단백질의 95 중량 % 초과, 가장 바람직하게는 99 중량 % 초과하거나, 또는 (2) 선택적으로 스테인, 예를 들어 쿠마시 블루 또는 은 스테인을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE, 또는 그 밖의 적합한 기술에 의해 균질성으로 정제될 것이다. 분리된 자연발생 항체는 단백질의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내에서 인시츄 (in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 전형적으로, 분리된 목적 단백질 (예를 들어, 아플리베르셉트 또는 항체)은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에 사용 된 용어 "단일 클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 예를 들면 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 항원 결합 단백질인 모노클로날 항체는 전형적으로 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 개별 항원 부위 또는 에피토프에 대해 지시되는 고도로 특이적인 결합제이다. 모노클로날 항체의 비제한적 예에는 뮤린, 토끼, 래트, 치킨, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 완전 조립된 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 항체 포함), 항원에 결합할 수 있는 항체 단편 (Fab, Fab', F(ab)2, Fv, 단일 사슬 항체, 디아바디), 맥시바디, 나노바디 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기의 CDR을 포함하는 재조합 펩타이드, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다..
개질제 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256 : 495 (1975)]에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, U.S. Pat. No. 4,816,567). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들면 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 방법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다.
용어 "면역글로불린"은 각각 경쇄 (LC)에 공유결합된 2 개의 이량체화된 중쇄 (HC); 단일의 이량체화되지 않은 면역 글로불린 중쇄 및 공유 연결된 경쇄 (HC+LC), 또는 키메라 면역글로불린 (경쇄+중쇄)-Fc 이종삼량체 (소위 "반구체")를 포함하는 전체 항체를 포괄한다. "면역글로불린"은 단백질이지만 반드시 항원 결합 단백질일 필요는 없다.
"항체"에서, 각각의 사량체는 2 개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 약 220 개 아미노산 (약 25kDa)의 하나의 "경"쇄 및 약 440 개 아미노산 (약 50-70 kDa)의 하나의 "중"쇄를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 "가변" ("V") 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 가변 영역은 항체마다 다르다. 불변 영역은 상이한 항체들 사이에서 동일하다. 각각의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에, 항원 결합 단백질인 항체의 경우에 항원에 대한 항체의 특이성을 결정하는 3 개의 초가변 하위 영역이 존재한다. 초가변 영역 사이의 가변 도메인 잔기는 프레임워크 잔기라 하며, 일반적으로 상이한 항체 중에서 다소 상동성이다. 면역글로불린은 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 배정될 수 있다. 인간 경쇄는 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄로 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10 개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] 참고. "항체"는 또한 재조합적으로 제조된 항체, 및 글리코실화되거나 글리코실화가 결여된 항체를 포함한다.
용어 "경쇄" 또는 "면역글로불린 경쇄"는 전장의 경쇄 및 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 그것의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄에는 카파 사슬 및 람다 사슬이 포함된다.
용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 전장 중쇄 및 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 그들의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH 및 3 개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카르복실-말단에 있으며, CH3 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (δ), 감마 (γ), 알파 (α) 및 엡실론 (ε)으로 분류되며, 항체의 이소 타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), IgM 및 IgE를 포함한 임의의 이소타입일 수 있다. 이들 중 몇몇은 예를 들어 서브클래스 또는 이소타입, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2으로 더욱 분류 될 수있다. 상이한 IgG 이소타입은 항체-의존적 세포질 세포 독성 (ADCC) 및 보체-의존적 세포 독성 (CDC)과 같은 상이한 이펙터 기능 (Fc 영역에 의해 매개됨)을 가질 수 있다. ADCC에서, 항체의 Fc 영역은 천연 킬러 및 대식세포와 같은 면역 효과기 세포 표면의 Fc 수용체 (FcγR)에 결합하여 표적 세포의 식균 작용 또는 용해를 초래한다. CDC에서, 항체는 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 유도함으로써 표적화된 세포를 사멸시킨다.
"Fc 영역", 또는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "Fc 도메인" 또는 "면역글로불린 Fc 도메인"은 2 개의 중쇄 단편을 함유하며, 이는 전체 항체에서 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함한다. 2 개의 중쇄 단편은 2 개 이상의 이황화 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호 작용에 의해 함께 유지된다.
용어 "살바지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.
항체의 구조 및 생성에 대한 상세한 설명은 문헌 [D. B., and Craig, N. L., Cell, 94:411-414 (1998)]를 참조하며, 그것의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 요약하면, 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 서열을 인코딩하는 DNA를 생성하는 과정은 주로 B-세포의 개발에서 발생한다. 다양한 면역글로불린 유전자 절편의 재배열 및 결합 전에, V, D, J 및 불변 (C) 유전자 절편은 일반적으로 단일 염색체에서 비교적 근접하게 발견된다. B-세포-분화 동안, V, D, J (또는 경쇄 유전자의 경우에는 V 및 J 만) 유전자 세그먼트의 각각의 적절한 패밀리 구성원 중 하나가 재조합되어 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자의 기능적으로 재배열된 가변 영역을 형성한다. 상기 유전자 세그먼트 재배열 과정은 순차적인 것으로 보인다. 먼저, 중쇄 D-J 조인트가 만들어진 다음 중쇄 V-DJ 조인트와 경쇄 V-J 조인트가 이어진다. V, D 및 J 세그먼트의 재배열에 추가하여, 경쇄의 V 및 J 세그먼트가 결합되고 중쇄의 D 및 J 세그먼트가 결합되는 위치에서 다양한 재조합에 의해 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 1 차 레퍼토리에서 추가 다양성이 발생된다. 경쇄에서의 이러한 변이는 전형적으로 V 유전자 세그먼트의 마지막 코돈 및 J 세그먼트의 첫 번째 코돈 내에서 발생한다. D와 JH 세그먼트 사이의 중쇄 염색체에서 유사한 결합 부정확이 발생하여 10 개 뉴클레오티드 이상으로 확장될 수도 있다. 또한, 게놈 DNA에 의해 코딩되지 않은 D 및 JH 사이 및 VH 및 D 유전자 세그먼트 사이에 몇몇 뉴클레오티드가 삽입될 수 있다. 이들 뉴클레오티드의 첨가는 N-영역 다양성으로 알려져 있다. 가변 영역 유전자 세그먼트에서 이러한 재배열의 순 효과 및 이러한 결합 동안 발생할 수 있는 가변 재조합은 1 차 항체 레퍼토리의 생성이다.
용어 "초가변" 영역은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로부터의 아미노산 잔기 [문헌 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에 기술된 바와 같이, 예를 들면 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)]를 포함한다. 단일 CDR 조차도 모든 CDR을 함유하는 전체 항원 결합 부위보다 낮은 친화도를 갖더라도, 항원을 인식하고 결합할 수 있다
초가변 "루프"로부터의 잔기의 대안적인 정의는 경쇄 가변 도메인 내의 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)로서 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196 : 901-917 (1987)]에 기술되어 있다.
"프레임 워크" 또는 "FR" 잔기는 초 가변 영역 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다.
"항체 단편"은 온전한 전장 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10) : 1057-1062 (1995)); 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2 개의 동일한 항원-결합 단편 및 불변 영역을 함유하는 잔류 "Fc" 단편을 생성한다. Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 뿐만 아니라 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 모두를 포함한다. Fc 단편은 탄수화물을 나타내고 한 클래스의 항체를 다른 클래스와 구별하는 많은 항체 이펙터 기능 (예를 들면: 결합 보체 및 세포 수용체)을 담당한다.
펩신 처리는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 2 개의 "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 생성하며, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇몇 추가 잔기를 포함시킴으로써 Fab' 단편과 상이하다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 검토는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인과 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하는 하나의 중쇄의 일부를 함유하여, 사슬간 이황화 결합이 2 개의 Fab' 단편의 2 개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성한다.
"F(ab')2 단편"은 2 개의 경쇄 및 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2 개의 중쇄를 함유하여, 사슬간 이황화 결합은 상기 2 개의 중쇄 사이에서 형성된다. 따라서 F(ab')2 단편은 2 개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2 개의 Fab'단편으로 구성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 단단한, 비-공유 결합으로 존재하는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 구성에서, 각각의 가변 도메인의 3 개의 CDR이 상호 작용하여 VH VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의한다. 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)은 비록 전체 결합 부위 보다 친화성이 낮더라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-사슬 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결됨으로써, 항원-결합 영역을 형성하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하는 Fv 분자이다. 단일쇄 항체는 국제 특허출원 공개 번호 WO88/01649 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호에 상세하게 논의되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전문이 참고로 포함된다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리 펩타이드 사슬로 존재하고 임의로 Fv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 포함한다 (Bird et al., Science 242:423-426, 1988, and Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). "Fd" 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 구성된다.
용어 "디아바디"는 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 상기 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH VL)에서 포함한다. 동일한 사슬상의 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루고 2 개의 항원-결합 부위를 생성하여야 한다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기술되어 있다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역 만을 함유하는 면역학적 기능성 면역글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2 개 이상의 VH 영역은 펩티드 링커와 공유 결합하여 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2 개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로할 수 있다.
용어 "항원 결합 단백질" (ABP)은 아플리베르셉트, 또는 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 및 이들이 목적 표적 항원에 특이적으로 결합하도록 원하는 항원 결합 특성을 갖는 CDR로부터 유래된 서열을 함유하는 재조합 펩티드 또는 다른 화합물을 포함한다.
일반적으로, 항원 결합 단백질, 예를 들어, 아플리베르셉트 또는 항체 또는 항체 단편은 그것이 목적 항원에 상당히 높은 결합 친화도를 가지는 경우 상기 목적 항원에 "특이적으로 결합"하므로, 유사한 결합 분석 조건 하에서 다른 비관련 단백질에 대한 친화력에 비해, 상기 항원을 구별할 수 있다. 전형적으로, 항원 결합 단백질은 해리 상수 (KD)가 10-8 M 이하일 때 그것의 표적 항원에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 항원 결합 단백질은 KD가 10-9M 이하일 때 "높은 친화도", 및 KD가 10-10M 이하일 때 "매우 높은 친화도"로 항원에 특이적으로 결합한다.
"항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 부위"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질의 부분을 의미한다. 예를 들어, 항원과 상호 작용하고 항원 결합 단백질에 항원에 대한 이의 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항원 결합 단백질의 부분을 "항원 결합 영역"이라 한다. 항원 결합 영역은 전형적으로 하나 이상의 "상보적 결합 영역" ("CDR")을 포함한다. 특정 항원 결합 영역은 또한 하나 이상의 "프레임워크" 영역 ("FR")을 포함한다. "CDR"은 항원 결합 특이성 및 친화도에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역은 항원 결합 영역과 항원 사이의 결합을 촉진하기 위하여 CDR의 적절한 형태가 유지되도록 도와줄 수 있다. 전통적인 항체에서, CDR은 항원 결합 및 인식을 담당하는 영역을 구성하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 내에 포함된다. 면역글로불린 항원 결합 단백질의 가변 영역은 프라임워크 (지정된 프레임워크 영역 1-4, FR1, FR2, FR3, 및 FR4, 상기 문헌 [Kabat et al., 1991]; 또한 문헌 [Chothia and Lesk, 1987] 참조) 영역 내에 적어도 3 개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다 (상기 참조) (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.; 또한 Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883 참조).
용어 "항원"은 항원 결합 단백질 (예를 들어, 아플리베르셉트, 또는 항원 또는 항체의 면역학적 기능성 단편을 포함)과 같은 선택적 결합제에 의해 결합될 수 있고, 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위하여 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 부분을 나타낸다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체와 상호 작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 보유할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질 (예를 들어, 아플리베르셉트 또는 항체)에 의해 결합되는 분자의 부분이다. 상기 용어는 항원 결합 단백질, 예를 들면 항체 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정 인자를 포함한다. 에피토프는 연속적이거나 비-연속적일 수 있다 (예를 들어, 단일-쇄 폴리펩티드에서, 폴리펩티드 서열에서 서로 인접하지 않지만 분자의 맥락 내에서 항원 결합 단백질에 의해 결합된 아미노산 잔기). 특정 구현예에서, 에피토프는 항원 결합 단백질을 생성하는데 사용되는 에피토프와 유사한 3 차원 구조를 포함하지만 항원 결합 단백질을 생성하는데 사용되는 에피토프에서 발견된 아미노산 잔기를 포함하지 않거나 일부만을 포함한다는 점에서 모방적일 수 있다. 가장 흔히, 에피토프는 단백질에 존재하지만, 어떤 경우에는 핵산과 같은 다른 종류의 분자에 존재할 수도 있다. 에피토프 결정 인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 포함할 수 있으며, 특정 3 차원 구조적 특성 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 표적 항원상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교하여써 결정된 바와 같이, 둘 이상의 폴리펩티드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 나타낸다. "동일성 백분율"은 비교된 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하고 비교되는 가장 작은 분자의 크기에 기초하여 계산된다. 이러한 계산의 경우, 정렬의 차이 (존재하는 경우)는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")으로 해결해야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법은 문헌 [Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 서열 동일성은 2 개의 폴리펩티드의 아미노산 위치에서의 유사성을 비교하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 2 개의 폴리펩티드 또는 2 개의 폴리뉴클레오티드 서열은 이들 각각의 잔기의 (하나 또는 둘 모두의 서열의 전체 길이를 따라 또는 하나 또는 둘 모두의 예정된-부분을 따라) 최적의 매칭을 위해 정렬된다. 프로그램은 디폴트 오프닝 페널티와 디폴트 갭 페널티를 제공하고, PAM 250 (표준 스코어링 매트릭스; Athoff of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978) 참고]은 컴퓨터 프로그램과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일성 백분율은 다음과 같이 계산될 수 있다: 동일한 일치의 총 수에 100을 곱한 다음, 두 서열을 정렬하기 위하여 일치하는 범위 내에서 더 긴 서열의 길이와 더 긴 서열에 도입된 갭의 수의 합으로 나눈다. 동일성 백분율의 계산시, 비교되는 서열은 서열 사이에서 가장 큰 매칭을 제공하는 방식으로 정렬된다.
GCG 프로그램 패키지는 퍼센트 동일성을 결정하는데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램이며, 상기 패키지는 GAP를 포함한다 (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 퍼센트가 결정될 2 개의 폴리펩타이드 또는 2 개의 폴리뉴클레오타이드를 정렬하는데 사용된다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드 (알고리즘에 의해 결정된 "일치된 스팬")의 최적 매칭을 위해 정렬된다. 갭 오프닝 페널티 (3 배로 계산됨. 평균 대각선, 여기서 "평균 대각선"은 사용 중인 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고, "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의한 각 완벽한 아미노산 매치에 할당된 점수 또는 숫자임) 및 갭 활장 페널티 (일반적으로 갭 개구 페널티의 1/10 배임) 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 구현예서, 표준 비교 매트릭스 (DPAM 250 비교 매트릭스의 경우 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62 비교 매트릭스의 경우 Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)가 알고리즘에 의해 사용된다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 권장 파라미터는 하기를 포함한다:
알고리즘 : Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443-453;
비교 매트릭스 : 상기 Henikoff et al.의 BLOSUM 62;
갭 페널티 : 12 (그러나 엔드 갭에 대한 페널티는 없음)
갭 길이 페널티 : 4
유사성 임계 값 : 0
2 개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 방식은 2 개의 서열의 짧은 영역만을 매칭시킬 수 있고, 상기 작은 정렬된 영역은 2 개의 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법 (GAP 프로그램)은 원하는 경우 표적 폴리펩티드의 50 개 이상의 인접 아미노산에 걸친 정렬을 초래하도록 조정될 수 있다.
목적 단백질과 관련하여 사용되는 경우 용어 "변형"은 하나 이상의 아미노산 변화 (치환, 삽입 또는 결실 포함); 화학적 변형; 치료 또는 진단제와의 접합에 의한 공유 변형; 표지 (예를 들어, 방사성 핵종 또는 다양한 효소로); PEG화와 같은 공유 중합체 부착 (폴리에틸렌 글리콜로의 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자에게 공지된 방법에 의해, "가공된" 단백질의 코딩 서열이 발현 카세트에 포함되기 전에 단백질은 개선된 표적 친화도, 선택성, 안정성 및/또는 제조가능성을 위해 "가공"되거나 변형될 수 있다.
목적 단백질, 예를 들면 아플리베르셉트 또는 항체와 관련하여 사용된 용어 "유도체"는 치료제 또는 진단제와의 접합, 라벨링 (예를 들어, 방사성 핵종 또는 다양한 효소를 이용), PEG화와 같은 공유 중합체 부착 (폴리에틸렌 글리콜로의 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환에 의해 공유적으로 변형된 단백질을 나타낸다.
본 발명의 범위 내에서, 아플리베르셉트 단백질은 인간 질환 또는 장애, 예를 들어 눈의 질환 또는 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는 질환의 치료를 위한 치료학적 단백질, 또는 "생물제제"일 수 있다. "치료" 또는 "치료하는"은 장애의 발병을 예방하거나 병리를 변경하려는 의도로 수행된 중재이다. 따라서, "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 환자는 이미 장애가 있는 환자 및 장애를 예방해야 하는 환자를 포함한다. "치료"는 경감; 차도와 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하고; 증상을 경감시키거나 환자가 부상, 병리 또는 상태를 견딜수 있게 하고; 악화 또는 쇠퇴의 속도를 늦추어 주며; 변성의 최종 지점을 덜 쇠약하게 만들고; 환자의 신체적 또는 정신적 안녕을 개선시키는, 질병, 병리 또는 상태의 개선에 있어서 성공의 임의의 징후(들)을 포함한다. 증상의 치료 또는 개선은 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초하여; 의사, 예를 들어 안과 의사 또는 기타 의료 제공자 또는 환자의 자기 보고에 의한 신체 검사 결과를 포함한다.
치료제의 "유효량"은 일반적으로 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키고, 증상 및/또는 근본 원인을 제거하고, 증상의 발생 및/또는 그의 근본 원인을 방지하고/하거나/에 충분하거나, 및/또는 또는 눈 장애 또는 질병으로 인한 또는 그와 관련된 손상을 개선 또는 치료할 수 있는 양이다. 일부 구현에서, 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다.
"치료적 유효량"은 질환 상태 (예를 들어, 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO)에 따른 황반 부종, 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO), 분지 망막 정맥 폐색 (BRVO), 신혈관 (습식) 연령-관련 황반 변성 (AMD), 근시 맥락막 신생 혈관 형성으로 인한 시각 장애, 당뇨병 황반 부종 (DME), DME 환자의 당뇨병성 망막병증 (DR), 및 신혈관 연령-관련 황반 변성 (AMD), 이식 거부 또는 GVHD, 염증, 다발성 경화증, 암, 심혈관 질환, 당뇨병, 신경 병증, 통증) 또는 증상, 특히 질환 상태와 관련된 상태 또는 증상을 예방하기에 충분한 양 또는 그렇지 않으면 어떠한 방법으로라도 질병 상태 또는 임의의 다른 바람직하지 않은 징후를 예방, 방해, 지연 또는 역전하기에 (즉, "치료 효능"을 제공함) 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 의도된 예방 효과를 갖는 약제학적 조성물의 양이다. 완전한 치료 또는 예방 효과가 반드시 1 회 용량의 투여에 의해 발생하는 것은 아니며, 일련의 용량의 투여 후에만 발생할 수도 있다. 따라서, 치료적 또는 예방적 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
클로닝 DNA
DNA의 클로닝은 표준 기술을 사용하여 수행된다 (예를 들어, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press 참고, 본원에 참조로 포함됨). 예를 들면, cDNA 라이브러리는 폴리A + mRNA, 바람직하게는 막-관련 mRNA, 및 인간 면역글로불린 폴리펩티드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 스크리닝된 라이브러리의 역전사에 의해 구축될 수 있다. 그러나, 한 구현에서, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 목적의 면역글로불린 유전자 세그먼트 (예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 가변 세그먼트)를 암호화하는 cDNA (또는 전장 cDNA의 일부)를 증폭시키는데 사용된다. 증폭된 서열은 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 발현 벡터, 미니 유전자 벡터 또는 파지 디스플레이 벡터로 용이하게 클로닝될 수 있다. 사용되는 특정 클로닝 방법은 목적 폴리펩티드의 일부, 예를 들어 아플리베르셉트 융합 폴리펩티드 서열의 서열을 결정할 수 있기만 한다면, 중요하지 않다는 것을 이해할 것이다.
항체 핵산의 하나의 공급원은 목적 항원으로 면역화된 동물로부터 B 세포를 수득하고 이를 불멸 세포에 융합시킴으로써 생성된 하이브리도마이다. 대안적으로, 면역화된 동물의 B 세포 (또는 전체 비장)로부터 핵산을 단리할 수 있다. 항체를 코딩하는 또 다른 핵산 공급원은 예를 들어 파지 디스플레이 기술을 통해 생성된 상기 핵산의 라이브러리이다. 목적 펩티드, 예를 들어 원하는 결합 특성을 갖는 가변 영역 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 패닝과 같은 표준 기술에 의해 확인될 수 있다.
DNA의 서열 분석은 표준 기술을 사용하여 수행된다 (예를 들어, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press 및 Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467 참고, 본원에 참조로 포함됨). 클로닝된 핵산의 서열을 공개된 유전자 및 cDNA의 서열과 비교함으로써, 당업자는 서열 분석된 영역에 따라 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 유전자 서열 정보의 한 공급원은 메릴랜드 베데스다의 국립 보건원 (National Library of Medicine)의 국립 생명 공학 정보 센터이다.
단리된 DNA는 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나 발현 벡터에 위치될 수 있으며,이어서 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포로 형질 감염되어 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 지시한다. 항체의 재조합 생산은 당업계에 잘 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결되는 것은 연결되는 DNA 서열이 연속적이며, 분비 리더의 경우 연속적이며 판독 단계임을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 사이트에서 리게이션에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관례에 따라 사용된다.
많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 벡터 성분은 다음: 신호 서열 (예를 들어, 발현된 단백질의 직접 분비; 복제 기점, 하나 이상의 선택적 마커 유전자 (예를 들어, 항생제 또는 기타 약물 내성, 보체 영양 요구성 결핍증을 부여하거나 배지에서 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급할 수 있음), 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 이들 모두는 당 업계에 잘 알려져 있다.
물 및 기타 성분의 순도. 본 발명의 안과용 제제를 제조하는데 사용되는 물 및 모든 다른 성분은 바람직하게는 목적 관할권에서 이러한 약제학적 조성물 및 약제에 요구되는 적용 가능한 법적 또는 약전 표준, 예를 들어 미국 약전 (USP), 유럽 약전, 일본 약전 또는 중국 약전 등에 부합하는 순도의 수준이다. 예를 들어 USP에 따르면, 주사 용수는 제품 내독소 함량을 제어해야하는 비경구 및 기타 제제 및 예를 들면 특정 장비 및 비경구 제품-접촉 구성요소의 세척과 같은 기타 제약 응용 제품의 생산시 부형제로 사용되고; 주사 용수 생성을 위한 최소 공급원 또는 급수의 품질은 미국 환경 보호국 (EPA), EU, 일본 또는 WHO에 의해 정의된 식수이다.
환자에게 투여하기 전에, 본 발명의 제제는 무균성, 내독소 부족 또는 바이러스 오염물 등의 목적 관할 구역에서 이러한 약제학적 조성물 및 약제에 요구되는 적용가능한 법적 또는 약전 표준을 충족시켜야 한다.
완충 시스템
본 발명의 안과용 제제는 약 5 내지 50 mM 농도의 완충제를 포함한다. 본 발명의 안과용 제제에 적합한 완충 시스템은 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제, 아세테이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 시트레이트 완충제, 글루타메이트 및 락테이트로부터 선택될 수 있거나, 완충제는 이들 완충제 시스템 중 둘 이상의 조합일 수 있다. 본 발명의 일부 유용한 구현예는 약 5 mM 내지 약 20 mM 범위의 완충제 농도를 갖고, 다른 구현예는 약 5 내지 약 10 mM의 완충제 농도를 갖는다. 히스티딘 완충제가 선택된 경우, 약 5-20 mM 범위의 히스티딘 농도가 바람직하다.
비-이온성 계면활성제
본 발명의 안과용 제제는 비-이온성 계면활성제, 바람직하게는 약 0.001 % (w/v) 내지 약 5.0 % (w/v)의 농도로 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-이온성 계면활성제의 농도는 약 0.001 % (w/v) 내지 약 2.0 % (w/v), 또는 약 0.001 % (w/v) 내지 약 1.0 % (w/v), 약 0.001 % (w/v) 내지 약 0.10 % (w/v), 또는 약 0.001 % (w/v) 내지 약 0.01 % (w/v)이다. 유용한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이스 80), Brij®35 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에테르), 폴록사머 (즉, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴록사머 188 (즉, 플루로닉 F68)과 같은 폴리(에틸렌 옥사이드-코-폴리프로필렌 옥사이드) 또는 TritonTM X-100 (즉, 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜))일 수 있다. 또한, 본 발명을 실시하기 위한 "비-이온성 계면활성제" 내에는 알킬사카라이드 또는 알킬글리코시드 (예를 들어, Aegis Therapeutics, LLC에 의해 상표명 ProTek®로 판매 됨; 예를 들어, Maggio, Stabilizing Alkylglycoside Compositions And Methods Thereof, US 8,133,863 B2)가 포함된다. 예를 들어, 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)는 전형적으로 약 0.01 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v), 바람직하게는 약 0.1 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v)의 농도에서 유용하다. 폴리소르베이스 (예를 들어, 폴리소르베이스 20 또는 폴리소르베이스 80)는 전형적으로 약 0.001 % (w/v) 내지 약 0.1 % (w/v)의 농도에서 유용하다.
등장화제
본 발명의 안과용 제제는 제제가 약 300 mOsm/kg (즉, 300 ± 50 mOsm/kg)의 최종 삼투압을 갖도록 등장화제를 포함한다. 삼투압은 물 단위당 용해된 입자의 수를 측정한 것이다. 용액에서, 물의 단위 수 (용매)에 비례하여 용질 입자의 수가 적을수록, 저-삼투압 용액이 덜 농축된다. 반-투과성 막 (용매 분자에만 투과 가능한 막)을 사용하여 다른 용질 농도의 용액을 분리하는 경우, 용매 분자가 막을 가로질러 저농도에서 고농도로 교차하여 농도 평형을 형성하는 삼투 현상이 발생한다. 상기 움직임을 구동하는 압력을 삼투압이라 하며 용액 중의 용질의 "입자"의 수에 의해 지배된다. 동일한 농도의 입자를 함유하여 동일한 삼투압을 가하는 용액을 등-삼투압이라 한다. 예를 들어, 적혈구 (red blood cell, rbc) 내의 삼투압은 주변 용액과 같아서 수축하거나 팽창하지 않는다. 만약 rbc를 물에 넣으면 물만 저-삼투압이기 때문에 그것은 파열된다. 만약 rbc를 고염 용액, 즉 0.9 % (w/v) 염화나트륨보다 높은 용액에 넣으면, 상기 용액은 고-삼투압이기 땜문에 수축될 것이다. 상기 두 예에서 rbc는 손상된다. 눈 안의 세포와 같은 생물학적 세포에서도 마찬가지이다. 만약 저-삼투압 또는 고-삼투압 용액이 눈에 배치되면, 그것은 눈을 손상시킬 수 있고, 따라서 눈에 사용되는 약물을 위한 등-삼투압 용액이 필요하다. 실제로, 0.9 % 염화나트륨 용액은 등-삼투압이며 270-300 mOsm/kg의 농도를 갖는다. 모든 용액들은 표준과 비교되며 250-350 mOsm/kg의 확장된 범위에 속하면 등-삼투압으로 간주된다. 단백질을 안정화시키는 데 사용되는 부형제는 등-삼투 용액을 생성하기 위한 농도에서 첨가된다. 예를 들어, 수크로오스 및 트레할로스와 같은 이당류는 9.25 % 농도에서 등-삼투압이고, 글루코오스 및 만노스와 같은 단당류는 5 % 농도에서 등-삼투압이며, 프롤린 또는 라이신 (또는 그것의 염)과 같은 아미노산은 약 2-3 %의 농도에서 등-삼투압이다. 삼투압은 이론적으로 또는 실험적으로 결정될 수 있다. 이론적 계산은 하기의 방정식에 따라 결정될 수 있다.
삼투압 = (g 화합물/100 mL 용액) * (화합물의 E-값).
화합물의 E-값은 하기의 방정식으로 결정된다:
E-값 = (MW NaCl/i-값 NaCl) * (i-값 화합물/MW 화합물).
상기 i-값은 이론적으로 80 %의 해리를 기준으로한 화합물의 이온 수이다. 해리되지 않은 화합물, 즉 수크로오스의 경우 i-값은 1이다. 2 이온으로 해리되는 화합물, 즉 NaCl의 경우 i-값은 1.8이고 3 이온으로 해리되는 화합물의 경우 i-값은 2.6이다. 삼투압은 용액의 응집 특성이기 때문에, 용질의 추가나 증기압의 저하로 인한 빙점의 침강은 액체 내의 총 용질 분자 수와 직접 관련있다. 이들 원리 각각은 삼투압을 측정하는 유용한 기구를 개발하기 위해 당업계에서 이용되어 왔다. 생물학적 시료에는 둘 중에 하나 또는 두 가지 유형 모두의 기기가 사용될 수 있다. 예로서, 10mM 인산 나트륨, 40mM NaCl, 5 % 수크로오스 및 0.03 % w/v 폴리소르베이트 20을 갖는 용액은 이론적으로 삼투압이 263 mOsm/kg일 것이다. 우리의 실험실에서, 동결 점 강하로 측정하여, 실제 측정 값은 270 mOsm/kg 이었다. 이는 실험 값이 이론적 값과 밀접하게 일치함을 나타내며, 본 발명을 실시하기 위해 용액이 삼투압에 기초하여 유리 체내 주사에 적합한지 여부를 결정하기 위해 이론적 또는 실험적 값이 사용될 수 있음을 추가로 입증한다.
본 발명의 안과용 제제에서, 상기 등장화제는 약제학적으로 허용되는 라이신의 염이다. 전형적으로, 상기 라이신 염 등장화제의 농도는 완충제 농도 및 다른 제제 부형제에 따라 2-4 % (w/v)의 범위이고, 몇몇 바람직한 구현예에서 라이신 염은 약 2 % (w/v) 내지 약 3 % (w/v)이다.
추가의 안정제
본 발명의 안과용 제제의 일부 구현예에서, 제제는 또한 추가의 아미노산 안정화제를 함유할 수 있다. 추가의 아미노산 안정화제는 예를 들어 프롤린, 아르기닌, 글리신, 라이신 또는 메티오닌일 수 있다. 아미노산은 약제학적으로 허용가능한 염 또는 약제학적으로 허용가능한 형태, 예를 들어 약제학적으로 허용가능한 염 형태이기만 한다면, L-아미노산 또는 D-아미노산, 또는 염 형태일 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Falconer et al., Stabilization of a monoclonal antibody during purification and formulation by addition of basic amino acid excipients, J Chem Technol Biotechnol (2011) 86: 942-948; Platts et al., Control of Globular Protein Thermal Stability in Aqueous Formulations by the Positively Charged Amino Acid Excipients, Journal of Pharmaceutical Sciences 105 (2016) 3532-3536; Wang, W., Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics 185 (1999) 129-188; Yin et al., Effects of Antioxidants on the Hydrogen Peroxide-Mediated Oxidation of Methionine Residues in Granulocyte Colony-Stimulating Factor and Human Parathyroid Hormone Fragment 13-34, Pharmaceutical Research (2004) 21(12):2377-2383; Lam et al., Antioxidants for Prevention of Methionine Oxidation in Recombinant Monoclonal Antibody HER2, Journal of Pharmaceutical Sciences 86(11): 1250-1255 (1997); Levine et al., Methionine Residues as Endogenous Antioxidants in Proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93(26):15036-15040 (1996); Maeder et al., Local tolerance and stability up to 24 months of a new 20% proline-stabilized polyclonal immunoglobulin for subcutaneous administration, Biologicals 39:43-49 (2011); Cramer et al., Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgPro10, Privigenⓒ) stabilized with L-proline, Vox Sanguinis (2009) 96, 219-225; Bolli et al., L-Proline reduces IgG dimer content and enhances the stability of intravenous immunoglobulin (IVIG) solutions, Biologicals 38 (2010) 150-157; Truong, Combination of D-Amino Acids and Lipoteichoic Acid, EP2545909 A1; Stroppolo et al., Pharmaceutical compositions containing the salts of S(+)-2-(4-isobutylphenyl)propionic acid with basic aminoacids, US5510385)] 참고). 추가의 아미노산 안정화제의 농도는 유용하게는 약 0.01-3 % (w/v)이다. 그러나, 메티오닌은 저농도, 즉 10 mM 이하에서 반응성 산소 종의 제거제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 제제
본 발명의 예시적인 안과용 제제는 완충제가 포스페이트 완충제인 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서 (a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고; (b) 포스페이트 완충제 농도는 약 10 mM이고; (c) 비-이온성 계면활성제는 약 0.03 % (w/v) 농도의 폴리소르베이트 또는 약 0.01 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v) 농도의 폴록사머이고; (d) 등장화제는 약 2 % (w/v) 내지 약 3 % (w/v) 농도의 라이신 염이고; 제제의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5이다. 상기 제제의 일부 바람직한 구현예에서, 약 30 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 아플리베르셉트 농도; 예를 들어, 약 40 mg/mL의 농도이다. 상기 제제의 일부 바람직한 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 약 0.1 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v) 농도의 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)이다.
본 발명의 예시적인 안과용 제제는 또한 완충제가 5-20 mM의 농도의 히스티딘 완충제인 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서 (a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고; (b) 히스티딘 완충제 농도는 약 10 mM이고; (c) 비-이온성 계면활성제는 약 0.03 % (w/v) 농도의 폴리소르베이트 또는 약 0.01 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v) 농도의 폴록사머이고; (d) 등장화제는 약 2 % (w/v) 내지 약 3 % (w/v) 농도의 라이신염이고; 제제의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5, 또는 일부 구현예에서 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5이다. 상기 제제의 일부 바람직한 구현예에서, 아플리베르셉트 농도는 약 30 mg/mL 내지 약 50 mg/mL; 예를 들어, 약 40 mg / mL이다. 상기 제제의 일부 바람직한 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 약 0.1 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v) 농도의 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)이다.
본 발명의 또 다른 예시적인 안과용 제제는 완충제가 아세테이트 완충제인 것을 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서 (a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고; (b) 아세테이트 완충제는 약 10 mM이고; (c) 비-이온성 계면활성제는 약 0.03 % (w/v) 농도의 폴리소르베이트 또는 약 0.01 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v) 농도의 폴록사머이고; (d) 등장화제는 약 2 % (w/v) 내지 약 3 % (w/v) 농도의 라이신염이고; 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5이다. 상기 제제의 일부 바람직한 구현예에서, 아플리베르셉트는 약 30 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 농도; 예를 들어, 약 40 mg/mL의 농도이다. 상기 제제의 일부 바람직한 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 약 0.1 % (w/v) 내지 약 1 % (w/v) 농도의 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188)이다.
추가의 예시로서, 하기의 번호를 갖는 구현예들이 본 발명에 포함된다.
구현예 1 : 안과용 제제로서
(a) 5-100 mg/mL 농도의 아플리베르셉트;
(b) 5-50 mM 농도의 완충제;
(c) 비-이온성 계면활성제;
(d) 등장화제로서 라이신 염 (여기서, 안과용 제제는 약 300 mOsm/kg의 최종 삼투압을 가짐)를 포함하고,
여기서 상기 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5인, 안과용 제제.
구현예 2 : 구현예 1에 있어서, 상기 완충제는 포스페이트 완충제인 안과용 제제.
구현예 3 : 구현예 1에 있어서, 상기 완충제는 아세테이트 완충제인 안과용 제제.
구현예 4 : 구현예 1에 있어서, 상기 완충제는 5-20 mM 농도의 히스티딘 완충제인 안과용 제제.
구현예 5 : 구현예 1 내지 4에 있어서, 상기 완충제는 포스페이트, 히스티딘, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 글루타메이트 및 락테이트로부터 선택되거나, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인 안과용 제제.
구현예 6 : 구현예 1 내지 5에 있어서, 상기 완충제 농도는 5-20 mM인 안과용 제제.
구현예 7 : 구현예 1 내지 6에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80), 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에테르 (즉, Brij®35), 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188), 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 (즉, TritonTM X-100), 알킬사카 라이드 및 알킬글리코시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 안과용 제제.
구현예 8 : 구현예 1 내지 7에 있어서, 추가의 아미노산 안정화제를 더욱 포함하는 안과용 제제.
구체예 9 : 구현예 8에 있어서, 상기 추가의 아미노산 안정화제는 프롤린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 메티오닌으로 이루어진 군에서 선택되는 안과용 제제.
구현예 10 : 구현예 1-2 및 구현예 5-9의 안과용 제제로서,
(a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고;
(b) 포스페이트 완충제 농도는 약 10mM이고,
(c) 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고,
(d) 등장화제로서 라이신 염은 약 2-3 % (w/v)의 농도이고;
상기 안과용 제제의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5인 안과용 제제.
구현예 11 : 구현예 1 내지 10에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188인 안과용 제제.
구현예 12 : 구현예 1, 3 및 5-9의 안과용 제제로서,
(a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고;
(b) 아세테이트 완충제 농도는 약 10 mM이고,
(c) 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고,
(d) 등장화제로서 라이신 염은 약 2-3 % (w/v)의 농도이고;
상기 안과용 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5인 안과용 제제.
구현예 13 : 구현예 1 내지 12에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188인 안과용 제제.
구현예 14 : 구현예 1, 4 및 5-9의 안과용 제제로서,
(a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg / mL이고;
(b) 히스티딘 완충제는 약 10mM이고;
(c) 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고;
(d) 등장화제로서 라이신 염은 약 2-3 % (w/v)의 농도이고;
상기 제제의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5인 안과용 제제.
구현예 15 : 구현예 1 내지 14에 있어서, 상기 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188인 안과용 제제.
구현예 16 : 눈 장애 또는 질환의 치료를 위한 구현예 1 내지 15의 임의의 제제의 용도.
구현예 17 : 구현예 16에 있어서, 상기 눈 장애 또는 질병은 망막 정맥 폐색 (RVO)에 따른 황반 부종, 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO), 분지 망막 정맥 폐쇄 (BRVO), 신혈관 (습식) 연령-관련 황반 변성 (AMD), 근시 맥락막 신생 혈관 형성으로 인한 시각 장애, 당뇨병 황반부종 (DME), DME 환자의 당뇨병성 망막병증 (DR), 및 신생 혈관 연령-관련 황반변성 (AMD)으로부터 선택되는 용도.
구현예 18 : 구현예 16-17에 있어서, 상기 안과용 제제은 유리 체내 주사에 의해 눈 장애 또는 질환을 가진 환자에게 투여되는 용도.
하기 실시예는 예시적인 것이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1. 안정성 연구.
물질. VEGF-특이적 아플리베르셉트 융합 단백질 길항제는 산업 표준 재조합 발현 기술 및 정제 공정을 사용하여 생성하였다. 정제된 약물 물질을 Millipore Corporation에 의해 실험실 규모 또는 벤치 규모 접선 흐름 여과 시스템을 사용하여 특정 제제 완충제와 완충 교환하였다. 제제 완충제로 희석하여 단백질 농도를 최종 목표 농도로 조정하였다. 모든 제제를 제조하는데 사용된 물은 이온 교환 카트리지를 포함하는 Milli-Q® (Millipore Corporation) 정수 시스템으로 정제하였다. 18.2 MΩ cm-1 (@ 25
Figure pct00002
℃) 보다 큰 값이 허용되는 전도도를 측정하여 물의 순도를 모니터링하였다. 제제 완충제의 제조에 사용된 모든 부형제, 완충제 및 다른 성분은 USP 등급 또는 그와 동등한 것이었다.
방법.
적정: 동일한 몰 농도로 제조된 산 및 염기 컨쥬게이트를 적절한 몰비로 함께 블렌딩하여 포스페이트 완충 시스템에 대해 원하는 제제 pH를 달성하였다. 컨쥬게이트 방법을 사용하거나 Milli-Q®-정제수에 빙초산을 첨가한 후 수산화 나트륨 적정을 사용하여 원하는 최종 pH에 도달하도록 아세테이트 제제를 제조하였다.
외관: 정성적인 외관 테스트를 수행하여 단백질 입자 또는 환경 오염물에 대한 약물 생성물을 평가하였다. 분취량 (1.1 mL)의 단백질 샘플을 사전-멸균된 유형 1 유리 바이알에 넣고 13-mm 폐쇄로 막았다. 주변 조명 조건에서 상기 샘플을 부드럽게 소용돌이 쳐서 눈에 보이는 입자를 감지하기 위해 5 초 동안 육안으로 검사하였다. 시험된 모든 샘플에 대해, 검출된 입자의 수 및 설명을 기록하였다.
색. 제품 안정성 동안 의약품 색상을 모니터링하기 위해 정성적인 시각적 색상 평가를 수행하였다. Ricca Chemicals의 시판되는 EP 2.2.2 갈색-노란색 표준 (BY1-BY7)을 사전 멸균된 타입 1 유리 바이알에 분취하였다. 분취량 (1.1 mL)의 약물 생성물을 바이알에 넣고, 동일한 양의 각각의 갈색-노란색 표준 물질과 비교하여 착색 수준을 결정하였다. 모든 샘플을 흰색 배경 앞에서 검사하고 각 샘플에 대해 채색 수준을 기록하였다.
감소된 부피 광 차분 서브-가시성 입자 분석. HRLD-150 센서 (Beckman Corporation)가 장착된 HIAC 카운터를 사용하여 빛의 가려 짐에 의해 분할 가능한 입자를 측정하였다. 센서는 1-100 μm 범위의 폴리스티렌 비드를 사용하여 보정되었다. 분석하기 전에 Milli-Q® 물을 깨끗한 기준선에 도달할 때까지 시스템 전체를 세척하고 15 μm 폴리스티렌 비드의 표준 용액을 사용하여 시스템 적합성을 확인하였다. 복제된 샘플을 유리 바이알에서 최종 부피 1.1 mL로 모으고 75 Torr에서 2 시간 동안 진공 탈기하였다. 각각의 샘플에 대해, 5 mL 분취량의 0.2 mL로 뽑아내고 10 및 25 μm보다 큰 입자를 측정하도록 상기 기기를 설정하였다. 마지막 3 회 측정의 평균을 보고하였다.
크기 배제 크로마토그래피. 크기 배제 고성능 액체 크로마토 그래피 (SE-HPLC) 분석을 Waters XBridge Protein BEH SEC 200A 컬럼을 사용하여 수행하였다. 인산염 염화나트륨 실행 완충제를 사용하여 고유 조건 하에서 분리를 수행하였다. 피크 용출을 UV 흡광도에 의해 검출하고, 통합된 순도 결과를 총 보정 면적에 대한 고 분자량 (HMW) 성분, 주성분 (단량체) 및 저 분자량 (LMW) 성분의 상대적인 피크 면적 백분율로 보고하였다.
CZE 클로라이드 이온 분석. 염화물 이온 분석은 Beckman PA 800 모세관 전기 영동 기기에서 작동하는 Microsolv Technologies CElixirOA pH 5.4 키트를 사용하여 수행하였다. 샘플 및 표준은 제조업체의 지침에 따라 준비하였다. 전형적으로, 주사는 50.2 cm 유효 길이의 베어 융합된 모세관에 1psi에서 10 초 동안 압력에 의해 주입하였다. 샘플을 광 다이오드 어레이 검출기 (PDA)에 의해 모니터링하였다. 전형적으로, 0.2 mM 내지 2 mM 클로라이드의 표준 곡선의 회귀 분석을 각각의 샘플에서 클로라이드 음이온의 농도를 정량하기 위해 사용하였다.
역가 평가. 세포-기반 VEGF-A165 의존성 증식 분석에서 아플리베르셉트의 효능을 평가하였다. 인간 제대 정맥 내피 세포를 다양한 농도의 약물 생성물 및 100 ng/mL의 VEGF-A165를 갖는 성장 인자의 부재 하의 96-웰 플레이트에 플레이팅 하였다. 형광 생존 시약을 첨가하기 전에 분석 플레이트를 37 ℃, 5 % CO에서 대략 3 일 동안 배양하였다. 약물 반응 농도 대 형광을 그래프로 나타낸 다음 4-파라미터 맞춤 방정식으로 피팅함으로써 용량 반응 곡선을 생성하였다. 상대 효능은 시험 샘플과 기준 표준 사이의 x-축을 따른 이동을 평가함으로써 측정하였다.
질량 분석법 기반 다중-속성 방법 (MAM). 안정성 샘플을 6.8 M 구아니딘으로 변성시키고, 10 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 환원시키고, 20 mM 요오도 아세트산으로 알킬화시켰다. 과량의 시약은 크기 배제 기반 탈염 컬럼으로 제거하였다. 트립신을 1:10 효소 대 기질 비로 첨가하고 샘플을 37 ℃에서 30 분 동안 소화시켰다. 생성된 펩티드를 C18 컬럼에 대한 포름산/아세토 니트릴 (FA/ACN) 구배를 갖는 RP-HPLC로 분리하고 Thermo Fisher Q-Exactive Mass Spectrometer를 사용하여 질량 분석에 의해 모니터링하였다. 개별 펩티드의 동정 및 정량은 Genedata의 Expressionist 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
삼투압 측정. 샘플의 삼투압은 Advanced Instruments, Inc. 어는점 삼투압 계를 사용하여 측정하였다. 샘플 분석 전에, 기기 보정은 290 mOsm/kg ClinitrolTM 290 Reference Solution (Fisher Scientific)을 사용하여 확인하였다. 시료에서 20μL 분취량의 하위 시료를 시료 튜브로 옮기고 기기에 어는 점 분석을 실시하였다. 이들 서브 샘플을 3 회 분석하고 이들 값의 평균 값을 보고하였다.
실시예 2. 안정성 연구
본 발명의 제제의 다양한 구현예에서 아플리베르셉트 안정성의 시험을 수행하였다. 표 1은 시험된 아플리베르셉트 (40 mg/mL) 제제 및 그들의 약어의 목록을 포함한다. 사용 된 아미노산은 L-이성질체 형태였다.
표 1. 본원에서 표 2-11에 사용된 시험된 아플리베르셉트 (40 mg/mL)의 제제 및 관련 약어.
약어 제제
P62NaSuT 10mM 인산 나트륨, 40mM 염화 나트륨, 5% (w/v) 수크로오스, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2
P62LysPl-1 10mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 1% (w/v) 폴록사머 188, pH 6.2
P62LysPl-0.1 10mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.1% (w/v) 폴록사머 188, pH 6.2
P62LysPl-0.01 10mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.01% (w/v) 폴록사머 188, pH 6.2
P62LysT 10mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.2
A52LysPl-0.1 10mM 아세테이트, 2.75% 라이신 모노하이드로클로라이드 (w/v), 0.01% (w/v) 폴록사머 188, pH 5.2
A52LysT 10mM 아세테이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 5.2
제제의 삼투압 농도. 아플리베르셉트 제제의 삼투압은 어는점 삼투압계로 측정하였다. 모든 삼투압 결과는 허용 가능한 범위 내에 있었다 (표 2 참조).
표 2. 제제의 삼투압 농도. *는 n = 1을 의미하고; 그렇지 않으면 n = 3입이다.
제제 평균
(mOsm/kg)		 + 표준 편차
P62NaSuT 258.7 4.0
P62LysPl-1 299.0 1.0
P62Ly-0.1 304.0 1.0
P62LyPl-0.01 302.7 3.2
P62LysT 294.3 1.2
A52LysPl-0.1* 307 N/A
A52LysT* 303 N/A
아플리베르셉트의 안정성. (3) 가지 상이한 로트에서 재조합적으로 생산된 아플리베르셉트를 사용하여 2 가지 제제를 다양한 생산 규모로 평가하였다. 세 가지 다른 스케일로 생산된 아플리베르셉터는 모든 로트에서 유사한 수준의 글리코실화를 포함하여 유사한 제품 특성을 나타냈다. 10mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드 및 0.1 % (w/v) 폴록사머 188 (즉, P62LysP1-0.1) 제제를 10 mM 인산 나트륨, 40 mM 염화 나트륨, 5% (w/v) 수크로오스 및 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2 (즉, P62NaSuT)로 제형화된 아플리베르셉트와 비교하였다. 4 ℃ 및 30 ℃에서 아플리베르셉트의 HMW 형성 속도를 SE-HPLC를 사용하여 조사하였다. 4 ℃ 보관 조건은 아플리베르셉트 보관을 위한 표준 "실제 세계"조건을 나타내는 반면, 30 ℃ 조건은 표준 보관 조건이 아니며 편리한 단축 또는 "가속," 학습 기간에서 장기간 저장을 자극하는 방법으로 선택된 것이다. 표 3 및 표 4에 나타난 바와 같이, 아플리베르셉트의 HMW 형성 속도에서 약간의 로트 간 차이가 명백했지만, 모든 경우에 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드 및 0.1 % (w/v) 폴록사머 188 (즉, P62LysP1-0.1) 제제는 10 mM 인산 나트륨, 40 mM 염화나트륨, 5 % (w/v) 수크로오스 및 0.03 % (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2 (즉, P62NaSuT)와 비교할 때, 낮은 HMW 형성 속도를 가졌다. 감소된 부피의 광 차단 서브-가시적 입자 분석을 사용하여, 서브-가시적 입자 형성을 또한 검사하였다. 4 ℃에서 저장 기간 동안, 서브-가시적 입자 형성은 어떠한 제제에서도 아플리베르셉트에 대해 유의하게 변화하지 않았다 (표 5).
표 3. SE-HPLC에 의해 측정된 4 ℃에서의 HMW 형성 속도.
4 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성
로트 제제 0 주 4 주 8 주 13 주 26 주 52 주 변화율
(%HMW/주)
1 P62NaSuT 0.33 0.49 0.60 0.66 0.91 1.18 0.015
1 P62LysPl-0.1 0.30 0.39 0.48 0.54 0.69 0.87 0.010
2 P62NaSuT 0.69 1.54 1.72 1.95 2.58 3.19 0.042
2 P62LysPl-0.1 0.64 1.15 1.28 1.52 1.94 2.34 0.029
3 P62NaSuT 1.27 1.48 1.81 1.96 2.36 2.17 0.016
3 P62LysPl-0.1 0.83 1.00 1.20 1.28 1.50 1.35 0.009
표 4. SE-HPLC에 의해 측정된 30 ℃에서의 HMW 형성 속도.
30 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성

로트
제제		 0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 변화율
(%HMW/주)
1 P62NaSuT 0.33 0.94 1.31 1.73 2.18 0.225
1 P62LysPl-0.1 0.30 0.78 1.04 1.34 1.67 0.164
2 P62NaSuT 0.69 2.44 3.39 3.91 4.63 0.467
2 P62LysPl-0.1 0.64 1.94 2.58 3.00 3.40 0.330
3 P62NaSuT 1.27 2.22 2.69 3.01 3.63 0.276
3 P62LysPl-0.1 0.83 1.60 1.97 2.30 2.81 0.233
표 5. 소량의 HIAC 분석에 의해 측정된 4 ℃에서 서브-가시적 입자 형성
4 ℃에서 서브-가시적 입자 형성
(값은 누적 카운트 ≥10 μm이다)
로트 제제 0 주 4 주 8 주 13 주 26 주 52 주
1 P62NaSuT 10.00 10.00 13.33 15.00 13.33 21.67
1 P62LysPl-0.1 10.00 20.00 18.33 18.33 50.00 23.33
2 P62NaSuT 20.00 13.33 15.00 20.00 16.67 8.33
2 P62LysPl-0.1 18.33 18.33 11.67 10.00 6.67 10.00
3 P62NaSuT 16.67 13.33 8.33 26.67 8.33 5.00
3 P62LysPl-0.1 13.33 8.33 3.33 11.67 13.33 10.00
상이한 계면활성제를 갖는 라이신 제제에서 아플리베르셉트의 안정성. 라이신 염을 함유하는 본 발명의 제제에서 아플리베르셉트의 안정성은 SE-HPLC를 사용하여 2 가지 계면활성제, 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 80 (각각 표 6 및 표 7) 중 하나의 존재하에 평가하였다. 고 분자량 (HMW) 종 형성은 아플리베르셉트가 10mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, pH 6.2로 제형화될 때 10mM 인산 나트륨, 40mM 염화나트륨, 5% (w/v) 수크로오스, pH 6.2에 비해 각각 폴리소르베이트 80 또는 폴록사머 188로 제제화되는 경우 약간 감소하였다. HMW 종 형성은 이들 포스페이트 완충제-기반 제제에 대한 계면활성제의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 10mM 아세테이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, pH 5.2의 아플리베르셉트는 10mM 인산 나트륨, 40mM 염화나트륨, 5 % (w/v) 수크로오스, H 6.2 제제의 아플리베르셉트에 비해 각각 솔리소르베이트 80 또는 폴록사머 188로 제제화될 때 HMW 형성 속도가 더 높았다.
표 6. SE-HPLC에 의해 측정된 30 ℃에서 비-이온성 계면활성제 폴록사머 188 (0.1 % (w/v))을 함유하는 아플리베르셉트 제제의 안정성.
30 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성
0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 10 주 12 주 변화율
(%HMW/주)
A52LysPl-0.1 0.46 0.89 1.36 2.13 2.65 3.23 3.99 0.296
P62LysPl-0.1 0.52 0.90 1.18 1.54 1.60 1.97 1.94 0.121
P62NaSuPl-0.1
0.61
1.10
1.36
1.82
2.11
2.21
2.38		 0.148
표 7. SE-HPLC에 의해 측정된 30 ℃에서 비-이온성 계면활성제 폴리소르베이트 80 (0.03 % (w/v))을 함유하는 아플리베르셉트 제제의 안정성.
30 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성
0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 10 주 12 주 변화율
(%HMW/주)
A52LysT 0.43 0.90 1.69 2.67 3.85 5.03 6.53 0.512
P62LysT 0.53 0.89 1.15 1.50 1.60 1.92 1.96 0.121
P62NaSuT
0.60
1.08
1.40
1.79
1.88
2.25
2.32		 0.143
시뮬레이션된 운송 및 계면활성제 농도의 효과에 따른 아플리베르셉트의 안정성. 모의 운송 후, 아플리베르셉트의 안정성은 다양한 계면활성제 및 계면활성제 농도를 갖는 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로 클로라이드, pH 6.2 제제 (즉, P62Lys)으로 특성화되었다. 시뮬레이션된 운송 프로토콜은 제품을 손상시키고 안정성 프로파일에 영향을 미칠 수 있는 다중 운송 모드를 설명하도록 설계하였다. SE-HPLC (표 8 및 도 2에 도시됨)에 의해 측정된 바와 같이, 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, pH 6.2 제제에서 4 ℃에서 저장된 아플리베르셉트의 HMW 형성 속도는 계면활성제의 유형 또는 계면활성제의 농도이 의존적이지 않았으며, 10mM 포스페이트, 40mM 염화나트륨, 5 % (w/v) 수크로오스, 0.03 % (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2 제제 (즉, P62NaSuT)에서 아플 리베르셉트에 대해 관찰된 것보다 적었다. 또한 30 ℃에서 HMW 형성 속도는 4 ℃보다 빠르지 만 안정성 순서는 가장 안정적인 10 mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, pH 6.2에서 변하지 않았다 (표 9 및 도 1 참조). 시뮬레이트된 운송에 이어, 감소된 부피의 광 차단 서브-가시적 입자 분석에 의해 측정된 서브-가시적 입자 수는 모든 제제에 걸쳐 유사한 정도로 증가하였다 (표 10 참조; 0 주 대조군에 대한 컬럼을 0 주에 비교). 그러나, 서브-가시적 입자 수는 제제화에 의존적인 것으로 보이지 않았다. 4 ℃의 모든 제제에서 색상은 변하지 않고 그대로 유지되었으며, 색상 표준 BY5와 BY6 사이의 결과는 52 주 시점이었다. 육안 검사에 따라 모든 제제는 가시적인 미립자가 존재하지 않았다. 제제의 서브 세트 및 저장 온도에 대해 13 주 및 52 주 시점에서 생성물 효능을 평가하였다 (표 11 참조). 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, pH 6.2 제제 및 10 mM 포스페이트, 40 mM 염화나트륨, 5 % (w/v) 수크로오스, pH 6.2 제제 간에 상대 효능 %의 차이가 검출되지 않았다. 어떤 비-이온성 계면활성제가 존재하는지에 여부에 관계없이. 이들 결과는 포스페이트 라이신 염-토닉화된 제제가 단백질을 안정화시키고 기능적 활성을 유지시킴을 나타낸다.
질량 분석법 기반 다중-속성 방법 (MAM). 아스파라긴산 잔기의 이성질체화, 아스파라긴의 탈아미드화 및 메티오닌의 산화와 같은 속성에 대한 번역 후 변형 수준의 변화를 평가하기 위해 MAM 분석을 수행하였다. 3 개의 제제로부터의 샘플을 -70 ℃ 대조군 샘플과 비교하여 4 ℃, 30 ℃ 및 40 ℃에서 3 개월 저장 후 평가하였다. 이 분석에서, 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, pH 6.2 제제, 0.1 % (w/ v) 폴록사머 188, pH 6.2 및 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.03 % (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.2를 아플리베르셉트 상용 제제 10mM 인산 나트륨, 40mM 염화나트륨, 5 % (w/v) 수크로오스, 0.03 % (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2와 비교하였다.
-70 ℃ 대조군 샘플과 비교할 때, 4 ℃ 샘플 중 어느 것에서도 번역 후 변형의 유의 한 증가가 검출되지 않았다. 상승된 온도 조건에서 메티오닌 산화, 아스파라긴 탈아미드화 및 아스파르트산 이성질화 수준의 검출 가능한 변화가 관찰되었지만, 상기 수준은 시험된 3 가지 제제에 걸쳐 측정 기술의 오류 내에서 유사하였다. 이들 결과는 본 발명의 제제, 10 mM 포스페이트, 2.75 % (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.1% (w/v) 폴록사머 188, pH 6.2 및 10 mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.2가 고온에서 보관될 때, 상용 제제 10mM 인산 나트륨, 40mM 염화나트륨, 5 % (w/v) 수크로오스, 0.03 % (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2와 같은 일반적인 분해 경로로부터 유사한 보호를 제공함을 나타낸다.
표 8. SE-HPLC에 의해 측정된 4 ℃에서의 HMW 형성 속도; * 대조는 시뮬레이션된 운송 처리를 거치지 않고 운송 연구 중에 4 ℃에서 유지된 물질을 의미한다.
4 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성
0 주
대조*		 0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 13 주 26 주 52 주 변화율
(%HMW/주)
P62NaSuT 1.18 1.27 1.48 1.48 1.48 1.81 1.96 2.36 2.17 0.018
P62LysPl-1 0.86 0.87 1.02 1.06 1.04 1.29 1.43 1.70 1.40 0.011
P62LysPl-0.1 0.82 0.83 0.96 1.00 0.98 1.20 1.28 1.50 1.35 0.010
P62LysPl-0.01 0.81 0.83 0.93 0.98 0.97 1.18 1.21 1.58 1.32 0.010
P62LysT 0.82 0.86 0.96 0.98 0.95 1.20 1.31 1.59 1.28 0.009
표 9. SE-HPLC에 의해 측정된 30 ℃에서의 HMW 형성 속도; * 대조는 시뮬레이션된 운송 처리를 거치지 않고 운송 연구 중에 4 ℃에서 유지된 물질을 의미한다.
30 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성
0 주
대조*		 0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 13 주 변화율
(%HMW/주)
P62NaSuT 1.18 1.27 2.22 2.69 3.01 3.63
4.45		 0.234
P62LysPl-1 0.86 0.87 1.72 2.14 2.46 2.99 3.75 0.212
P62LysPl-0.1 0.82 0.83 1.60 1.97 2.30 2.81 3.50 0.198
P62LysPl-0.01 0.81 0.83 1.64 2.01 2.30 2.78 3.49 0.195
P62LysT 0.82 0.86 1.60 2.06 2.32 2.80 3.54 0.198
표 10. HIAC에 의해 측정된 4 ℃에서 서브-가시적 입자 형성 속도; * 대조는 시뮬레이션된 운송 처리를 거치지 않고 운송 연구 중에 4 ℃에서 유지된 물질을 나타낸다.
4 ℃에서 서브-가시적 물질 형성
(값은 누적 카운트 ≥ 10μm를 나타냄)
0 주
대조*		 0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 13 주 26 주 52 주
P62NaSuT
16.67		 20.00 11.67 23.33 25.00 20.00
15.00		 5.00 10.00
P62LysPl-1 5.00 25.00 41.67 20.00 26.67 16.67
23.33		 13.33 8.33
P62LysPl-0.1 13.33 10.00 35.00 25.00 16.67 15.00
13.33		 6.67 18.33
P62LysPl-0.01 15.00 16.67 33.33 18.33 10.00 16.67
26.67		 11.67 6.67
P62LysT 10.00 10.00 11.67 20.00 6.67 13.33 10.00 8.33 8.33
표 11. 상대 효력; * NT-모든 온도는 역가 검정에 의해 시험되지 않았다; 그렇지 않으면 n = 3이다.
% 상대 효력- 13-주 시점 % 상대 효력 - 52-주 시점
-70 ℃ SD 4 ℃ SD 30 ℃ SD -70 ℃ SD 4 ℃ SD
P62NaSuT 98.8 8.4 101.2 2.5 NT* 88.6 6.7 98.8 2.9
P62LysPl-0.1 89.8 5.9 94.6 5.9 84.1 3.0 84.5 2.4 95.4 3.3
P62LysPl-0.01 NT* 103.8 7.2 NT* NT* 103.9 10.4
P62LysT NT* 97.2 5.9 NT* NT* 99.0 13.6
상업적으로 수득된 Eylea ® 와 비교하여 본 발명의 라이신 염-토닉화 제제에서 재조합 적으로 생산된 아플리베르셉트의 비교. 10mM 인산염, 2.75 % (w/v) 라이신, pH 6.2, 0.1 % (w/v) 폴록사머 제제에서 30 ℃에서 아플리베르셉트의 안정성을 Eylea® (아플리베르셉트; Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY)의 안정성과 비교하였다. 아플리베르셉트는 Just Biotherapeutics (Seattle, WA)에 의해 이들 연구를 위해 재조합적으로 생산되었고, 기술된 제제로 제형화되었다 (표 12 참조). Eylea®는 유럽 시장에서 구입하여 자체 용기에 안전하게 담았다. 지시된 시점에 바이알로부터 샘플을 제거하고 존재하는 HMW 종의 양을 특성화하기 위해 SE-HPLC에 의해 측정하였다. 데이터는 Just Biotherapeutics에 의해 재조합적으로 생산되고 지시된 제형으로 제형화된 아플리베르셉트가 Eylea® 의약품의 아플리베르셉트와 비교하여 시간이 지남에 따라 더 낮은 % HMW 및 유사한 비율의 HMW 종을 가짐을 입증한다.
표 12. 본 발명의 제제 및 시판되는 아플리베르셉트 제제 (Eylea®)의 구현예에 대한 30 ℃에서의 HMW 형성 속도 (SE-HPLC)의 비교.
30 ℃에서 % 고 분자량 (HMW)형성
0 주 2 주 4 주 6 주 8 주 13 주 17 주 21 주 변화율
(%HMW/주)
P62LysPl-0.1 0.30 0.78 1.0 1.34 1.67 2.36
--
--		 0.154
Eylea® 1.03 1.74 2.03 2.41 2.83 2.79 3.85 4.85 0.172
실시예 3. 토끼에서 유리 체내 투여에 의한 위약 제제의 내약성 연구
아플리베르셉트 약물 제품과 함께 사용하기 위한 본 발명의 제제의 일부 구현예의 내약성을 결정하기 위해, 위약 제제의 유리 체내 주사를 표 13에 나타낸 바와 같이 Charles River Laboratories, Inc., 640 N. Elizabeth Street, Spencerville, OH 45887, United States of America에서 토끼에 단일 용량으로 투여하였다.
표 13. 수컷 토끼에서 단일 용량으로 시험 된 위약 제제.
군 시험 물질 투여 부피 (mL) 동물 수
(수컷)
1 위약 1 (10 mM 포스페이트, 40mM NaCl, 5% (w/v) 수크로오스, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20, pH 6.2) 0.05 3
2 위약 2 (10 mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신 모노하이드로클로라이드, 0.1% (w/v) 폴록사머 188, pH 6.2) 0.05 3
3 위약 3 (10 mM 포스페이트, 2.75% (w/v) 라이신, 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 80, pH 6.2) 0.05 3
연구 설계에 따라 임상 징후, 체중, 체중 증가, 음식 소비 및 안과와 같은 파라미터 및 종점을 평가하였다.
본 연구의 대상 토끼 중에서, 조기 사망, 치료 관련 임상 징후 및 체중, 체중 증가, 음식 소비, 또는 안과적 소견에 대한 영향이 없었다. 결론적으로, 유리 체내 주사에 의한 모든 위약 제제의 투여는 토끼에서 잘 견뎌냈다.
SEQUENCE LISTING <110> JUST BIOTHERAPEUTICS, INC. <120> AFLIBERCEPT FORMULATIONS CONTAINING A LYSINE SALT AS TONICIFYING AGENT AND USES THEREOF <130> JUST0471 <140> <141> <150> 62/588,536 <151> 2017-11-20 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr 165 170 175 Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met 180 185 190 Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr 195 200 205 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 210 215 220 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 225 230 235 240 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 245 250 255 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 260 265 270 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 275 280 285 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 290 295 300 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 305 310 315 320 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 325 330 335 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 340 345 350 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 355 360 365 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 370 375 380 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 385 390 395 400 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 405 410 415 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 420 425 430

Claims (18)

  1. 안과용 제제로서,
    (a) 5-100 mg/mL 농도의 아플리베르셉트;
    (b) 5-50 mM 농도의 완충제;
    (c) 비-이온성 계면활성제; 및
    (d) 등장화제로서 라이신 염 (여기서, 상기 안과용 제제는 약 300 mOsm/kg의 최종 삼투압을 가짐)를 포함하고,
    상기 안과용 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 6.5인 것인, 안과용 제제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제는 포스페이트 완충제인 것인, 안과용 제제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제는 아세테이트 완충제인 것인, 안과용 제제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제는 5-20 mM 농도의 히스티딘 완충제인 것인, 안과용 제제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제가 포스페이트, 히스티딘, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 글루타메이트 및 락테이트로부터 선택되거나, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인 것인, 안과용 제제.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충제 농도는 5 내지 20 mM인 것인, 안과용 제제.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트, 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에테르, 폴록사머, 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, 알킬사카 라이드 및 알킬글리코시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 안과용 제제.
  8. 제 1 항에 있어서,
    추가의 아미노산 안정화제를 더욱 포함하는 것인, 안과용 제제.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 추가의 아미노산 안정화제는 프롤린, 아르기닌, 글리신, 라이신 및 메티오닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 안과용 제제.
  10. 제 2 항에 있어서,
    (a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고;
    (b) 포스페이트 완충제 농도는 약 10mM이고,
    (c) 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고,
    (d) 등장화제로서 라이신 염은 약 2-3 % (w/v)의 농도이고;
    상기 안과용 제제의 pH는 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5인 것인, 안과용 제제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188인 것인, 안과용 제제.
  12. 제 3 항에 있어서,
    (a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고;
    (b) 아세테이트 완충제 농도는 약 10 mM이고,
    (c) 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 또는 폴록사머이고,
    (d) 등장화제로서 라이신 염은 약 2-3 % (w/v)의 농도이고;
    상기 안과용 제제의 pH는 약 pH 5.0 내지 약 pH 5.5인 것인, 안과용 제제.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188인 것인, 안과용 제제.
  14. 제 4 항에 있어서,
    (a) 아플리베르셉트 농도는 20-80 mg/mL이고;
    (b) 히스티딘 완충제는 약 10mM이고;
    (c) 비-이온성 계면활성제는 폴리소르 베이트 또는 폴록사머이고;
    (d) 등장화제로서 라이신 염은 약 2-3 % (w/v)의 농도이고;
    상기 제제의 pH는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5인 것인, 안과용 제제.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188인 것인, 안과용 제제.
  16. 치료적 유효량의 제 1 항, 제 2 항, 제 3 항 또는 제 4 항의 안과용 제제를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 눈 장애 또는 질병의 치료 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 눈 장애 또는 질병은 망막 정맥 폐색 (RVO)에 따른 황반 부종, 중추 망막 정맥 폐색 (CRVO), 분지 망막 정맥 폐쇄 (BRVO), 신혈관 (습식) 연령-관련 황반 변성 (AMD), 근시 맥락막 신생 혈관 형성으로 인한 시각 장애, 당뇨병 황반부종 (DME), DME 환자의 당뇨병성 망막병증 (DR), 및 신생 혈관 연령-관련 황반변성 (AMD)으로부터 선택되는 것인, 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 안과용 제제의 투여는 유리 체내 주사에 의한 것인, 방법.
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