PT2364691E

PT2364691E - Formulações antagonistas de vegf adequadas para administração intravitreal

Info

Publication number: PT2364691E
Application number: PT111579652T
Authority: PT
Inventors: Kenneth S Graham; Daniel Dix; Eric Furfine; Kelly Frye
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2006-06-16
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2013-05-15
Also published as: CY1124265T1; WO2007149334A2; CA2654510C; CA2654510A1; IL195788A; US20210340220A1; MX2008016124A; PT2944306T; US20190031735A1; RU2432155C2; AU2007261536A1; ES2406764T3; US9340594B2; US20070293432A1; US8802107B2; AU2007261536B2; RU2432155C3; ZA200809827B; US8092803B2; US20200131246A1

Description

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DESCRIÇÃO "Formulações antagonistas de VEGF adequadas para administração intravitreal"

ESTADO DA TÉCNICA

Domínio da invenção A invenção presente diz respeito a formulações farmacêuticas adequadas para administração ao interior do vítreo, que incluem agentes capazes de inibir o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e a métodos para produzir e utilizar essas formulações. A invenção inclui formulações farmacêuticas líquidas possuindo maior estabilidade, bem como formulações que podem ser liofilizadas e reconstituídas para administração intravitreal.

Listagem do Estado da Técnica Relacionada A expressão do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) existe em praticamente todos os cancros humanos, o que é consistente com o seu papel como mediador-chave na neoangiogénese tumoral. 0 bloqueio da função do VEGF, por uma ligação à molécula ou ao seu receptor VEGFR-2, inibe o crescimento de células de tumor implantadas em 2 muitos modelos diferentes de xenotransplante (veja-se, por exemplo, Gerber et al. (2000) Câncer Res. 60: 6253-6258). Foi descrita uma proteína de fusão que é um antagonista solúvel específico de VEGF, denominada uma "armadilha para VEGF" (Kim et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 11399-404; Holash et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 11393-8). São conhecidas formulações oftálmicas, vejam-se por exemplo, as U.S. 7.033.604 e 6.777.429. Descreve-se uma formulação oftálmica de um anticorpo contra VEGF na US 6.676.941.

Utiliza-se habitualmente a liofilização (secagem do congelado em condições especiais) para armazenagem a longo termo de proteínas. A proteína liofilizada é substancialmente resistente à degradação, à agregação, à oxidação, e a outros processos de degenerescência, enquanto permanece no estado liofilizado (veja-se, por exemplo, a U.S. 6.436.897) . O WO 2006/047.325 diz respeito a um método para tratar doenças neovasculares intra-oculares. O WO 2005/020.972 diz respeito a terapia de combinação para o tratamento de patologias neovasculares intra-oculares. Os WO 2006/104.852 e US 2006/0 217.311 Al dizem respeito a formulações de antagonistas de VEGF.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO 3 São proporcionadas formulações estáveis de uma proteína de fusão, antagonista específico do VEGF. São proporcionadas formulações aceitáveis do ponto de vista farmacêutico que incluem um antagonista "armadilha" de VEGF com um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Em concretizações específicas, são proporcionadas formulações líquidas e liofilizadas.

Num primeiro aspecto, proporciona-se uma formulação oftálmica líquida estável de uma proteína de fusão antagonista específica de VEGF, incluindo uma proteína de fusão que inclui uma componente receptora essencialmente constituída por um domínio 2 semelhante ao de uma imunoglobulina (Ig) de um primeiro receptor de VEGF e um domínio 3 de Ig de um segundo receptor de VEGF, bem como uma componente multimerizante (também denominada uma "armadilha para VEGF"). A proteína de fusão antagonista específica de VEGF é constituída pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID NO: 4 que está glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308.

Num aspecto, a invenção proporciona uma formulação oftálmica de um antagonista do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo:

(a) 1-100 mg/mL de um antagonista de VEGF constituído pelos aminoácido 27-457 da SEQ ID 4

No: 4, que está glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) 0,01-5 % de um ou mais co-solvente(s) orgânico (s), que seja(m) um ou mais de entre polissorbato, polietilenoglicol (PEG), e propilenoglicol; (c) um agente de tónus 30-150 mM seleccionado de entre cloreto de sódio ou cloreto de potássio; (d) tampão fosfato de sódio 5-40 mM; e (e) 1,0-7,5 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol, a um pH de entre cerca de 5,8-7,0, em que a formulação seja adequada para administração intravitreal.

Numa ou mais concretizações específicas, o co-solvente orgânico pode ser um polissorbato, por exemplo, polissorbato 20 ou polissorbato 80, um polietilenoglicol (PEG), por exemplo, PEG 3350, ou propilenoglicol, ou uma combinação destes; o agente de tónus pode ser cloreto de sódio ou cloreto de potássio; o agente estabilizante pode ser sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, ou manitol; e o agente tamponizante incluir tampão de fosfato de sódio 5-4 0 mM. 5

Em diversas concretizações, o co-solvente orgânico é polissorbato e/ou PEG, o agente estabilizante é a sacarose, o agente tamponizante é tampão de fosfato de sódio e o agente de tónus é cloreto de sódio.

Mais especificamente, a formulação oftálmica liquida estável inclui cerca de 40-50 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato a cerca 10 mM, 0,01-3 % de polissorbato e/ou de PEG, cloreto de sódio 40-135 mM e 5,0 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

Numa concretização especifica preferida, a formulação oftálmica liquida estável inclui cerca de 50 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 50 mM, 0,1 % de polissorbato, e 5 % de sacarose, com pH de cerca de 6,2-6,3.

Numa concretização especifica preferida, a formulação oftálmica liquida estável inclui cerca de 50 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 50 mM, 3 % de PEG, e 5 % de sacarose, com pH de cerca de 6,2-6,3.

Numa concretização específica preferida, a formulação oftálmica líquida estável inclui cerca de 40 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 40 mM, 0,03 % de polissorbato, e 5 % de sacarose, com pH de cerca de 6,2-6,3. 6

Numa concretização específica preferida, a formulação oftálmica líquida estável inclui cerca de 40 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 135 mM, e 0,03 % de polissorbato, com pH de cerca de 6,2-6,3.

Noutro aspecto, proporciona-se uma formulação oftálmica líquida estável que inclui 1-100 mg/mL de proteína de fusão antagonista específica de VEGF; 0,01-5 % de um ou mais co-solventes orgânicos seleccionados de entre polissorbato, polietilenoglicol (PEG), e propilenoglicol; tampão de fosfato de sódio 5-40 mM: e um ou mais agentes de tónus 30-150 mM, seleccionados de entre cloreto de sódio e cloreto de potássio e/ou 1,0-7,5 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, ou manitol; com um pH de entre cerca de 5,8-7,0.

Em diversas concretizações, o antagonista de VEGF está presente a uma concentração de entre cerca de 10 e cerca de 80 mg/mL. Em diversas concretizações, o antagonista de VEGF está presente a uma concentração de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, ou cerca de 80 mg/mL. Numa concretização preferida, o antagonista de VEGF está presente a uma concentração de cerca de 40 mg/mL. 7

Selecciona-se o agente estabilizante como um ou mais de entre sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol.

Selecciona-se o co-solvente orgânico como sendo um ou mais de entre polissorbato, por exemplo polissorbato 20 ou polissorbato 80, polietilenoglicol (PEG), por exemplo PEG 3350, e propilenoglicol. O tampão inclui tampão de fosfato de sódio 5-40 mM. O agente de tónus é um sal seleccionado de entre cloreto de sódio e cloreto de potássio, por exemplo o agente é cloreto de sódio.

Numa concretização, a formulação oftálmica liquida estável inclui tampão de fosfato de sódio 10 mM, entre cerca de 0,03 e cerca de 0,1 % de polissorbato e/ou cerca de 3 % de PEG ou de propilenoglicol, cloreto de sódio a cerca de 40 mM, e cerca de 5 % de sacarose. Numa concretização especifica, a formulação oftálmica liquida estável inclui tampão de fosfato de sódio 10 mM, cerca de 0,03 % de polissorbato, cloreto de sódio a cerca de 40 mM, e cerca de 5 % de sacarose. Noutra concretização especifica, o pH da formulação é de entre cerca de 6,2 e cerca de 6,3. Noutra concretização especifica, consegue-se o pH misturando fosfato de sódio monobásico e dibásico até ao valor de pH pretendido sem titulação ácido/base.

Numa concretização específica preferida, a formulação oftálmica líquida estável é essencialmente constituída por um antagonista de VEGF a 40 mg/mL, tampão de fosfato de sódio 10 mM, polissorbato a 0,03 %, cloreto de sódio a 40 mM, e sacarose a 5 %, com pH 6,2-6,3.

Noutro aspecto, proporciona-se uma formulação oftálmica líquida estável que inclui entre cerca de 10 e cerca de 80 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 10 mM, cerca de 0,03 % de polissorbato, e cloreto de sódio cerca de 135 mM, com pH de 6,2 a 6,3.

Em diversas concretizações, o antagonista de VEGF está presente a uma concentração de entre cerca de 10 e cerca de 80 mg/mL. Em diversas concretizações, o antagonista de VEGF está presente a uma concentração de cerca de 10, de cerca de 20, de cerca de 30, de cerca de 40, de cerca de 50, de cerca de 60, de cerca de 70, ou de cerca de 80 mg/mL. Numa concretização específica, o antagonista de VEGF está presente a uma concentração de cerca de 40 mg/mL.

Numa concretização, a formulação oftálmica líquida estável inclui antagonista de VEGF a 40 mg/mL, tampão de fosfato de sódio 10 mM, 0,03 % de polissorbato, e cloreto de sódio 135 mM a um pH de 6,2-6,3. Numa concretização específica, a formulação oftálmica líquida estável é essencialmente constituída por 40 mg/mL de 9 antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, 0,03 % de polissorbato, e cloreto de sódio 135 mM a um pH de 6,2-6,3.

Noutro aspecto, proporciona-se uma formulação liofilizável de um antagonista de VEGF, que após liofilização seguida de uma reconstituição, proporciona uma formulação oftálmica líquida tal como se descreve neste documento.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma formulação de um antagonista de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo: (a) 5-50 mg/mL do antagonista de VEGF, preferivelmente 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL ou 40 mg/mL, constituído pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID No: 4, glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) tampão de fosfato de sódio 5-25 mM, pH de cerca de 5,8-7,0; (c) 0,01-0,15 % de um co-solvente orgânico, seleccionado de entre o conjunto constituído por polissorbato, polietilenoglicol (PEG), propilenoglicol, e uma combinação destes; e 10 (d) 1-10 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol; ou um agente de tónus 20-150 mM, preferivelmente cloreto de sódio; ou 1-10 % do agente estabilizante e o agente de tónus 20-150 mM, em que a formulação possa ser reconstituída sendo portanto adequada para administração intravitreal. Em diversas concretizações, o antagonista de VEGF está presente a cerca de 5, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, ou cerca de 40 mg/mL. Numa concretização específica, a formulação oftálmica liofilizável da invenção inclui 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, 0,03 % de polissorbato, 0,1 % de PEG, e 2,5 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3. Em concretizações adicionais, a formulação liofilizável inclui também cloreto de sódio. Numa concretização específica, o cloreto de sódio está presente a uma concentração de cerca de 20 mM. Noutra concretização específica, o cloreto de sódio está presente a uma concentração de cerca de 67,5 mM.

Noutra concretização específica, a formulação oftálmica líquida da invenção inclui 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 mM, 0,015 % de polissorbato, cloreto de sódio 20 mM, e 2,5 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3. 11

Noutra concretização, a formulação oftálmica liofilizável inclui 5 mg/mL, 10 mg/mL, ou 40 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 mM, 0,015 % de polissorbato, cloreto de sódio 20 mM, com 2,5 % de sacarose, a um pH de 6,2-6,3. Numa concretização especifica, a formulação oftálmica liofilizável é essencialmente constituída por 5 mg/mL, 10 mg/mL, ou 40 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 mM, 0,015 % de polissorbato, cloreto de sódio 20 mM, com 2,5 % de sacarose, a um pH de 6,2-6,3.

Noutra concretização específica, a formulação oftálmica liofilizável inclui 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 mM, 0,015 % de polissorbato, e cloreto de sódio 67,5 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3. Numa concretização mais específica, a formulação oftálmica liofilizável é essencialmente constituída por 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 mM, 0,015 % de polissorbato, e cloreto de sódio 67,5 mM, com um pH de 6,2-6,3.

Noutra concretização específica, a formulação oftálmica liofilizável inclui 5 mg/mL, 10 mg/mL, ou 40 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 mM, 0,015 % polissorbato, e cloreto de sódio 67,5 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3. Numa concretização mais específica, a formulação oftálmica liofilizável é essencialmente constituída por 5 mg/mL, 10 mg/mL, ou 40 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 5 12 mM, 0,015 % de polissorbato, e cloreto de sódio 67,5 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

Em geral, a formulação reconstituída tem cerca de 2 vezes a concentração da formulação previamente liofilizada, por exemplo, reconstituem-se 20 mg de proteína de fusão por mL da formulação previamente liofilizada a uma formulação final com 40 mg de proteína de fusão por mL.

Em geral, a formulação liofilizada é reconstituída com água estéril adequada para injecção. Numa concretização, o fluido de reconstituição é água bacteriostática.

Noutro aspecto, a invenção inclui um método para produzir uma formulação liofilizada de um antagonista específico para uma proteína de fusão antagonista de VEGF, incluindo submeter-se a formulação liofilizável da invenção a uma liofilização para se gerar uma formulação liofilizada. Pode liofilizar-se a formulação liofilizável por qualquer método conhecido na técnica para se liofilizar um líquido.

Noutro aspecto relacionado, a invenção proporciona um método para produzir uma formulação liofilizada reconstituída de um antagonista de VEGF, incluindo reconstituir-se a formulação liofilizada da invenção a uma formulação reconstituída. Numa concretização, a formulação reconstituída tem o dobro da 13 concentração da formulação antes de ser liofilizada, por exemplo, o método da invenção inclui: (a) produzir-se uma formulação antes da liofilização contendo proteína de fusão antagonista específica de VEGF, (b) submeter-se esta formulação do passo (a) ainda por liofilizar, a uma liofilização; e (c) reconstituir-se a formulação liofilizada do passo (b). A invenção também inclui formulações oftálmicas proporcionadas numa seringa ou num frasco cheios, adeguados em especial para uma administração intravitreal.

Outros objectos e vantagens serão aparentes a partir da descrição pormenorizada que se segue.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A invenção presente não se limita a métodos específicos, nem às condições experimentais descritas, uma vez que esses métodos e essas condições podem variar. Deve também entender-se que a terminologia utilizada neste documento tem o objectivo de descrever apenas determinadas concretizações, e não se pretende que seja limitativa a não ser aonde tal se indique, uma vez que o âmbito da invenção presente apenas será limitado pelas reivindicações apensas. A não ser aonde se indicar algo em contrário, todos os termos e frases técnicas utilizados neste documento têm o mesmo significado que é habitualmente 14 entendido por um indivíduo com conhecimentos normais da técnica à qual a invenção se reporta. Embora se possam utilizar métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento na prática ou em testes da invenção presente, os métodos e os materiais preferidos são descritos em seguida.

Descrição Geral A manipulação e a administração seguras de formulações incluindo proteínas representa desafios significativos para os formuladores farmacêuticos. As proteínas possuem propriedades químicas e físicas únicas que apresentam problemas de estabilidade: existe uma variedade de caminhos de degradaçao para as proteínas, implicando instabilidade tanto química como física. A instabilidade química inclui desaminaçao , agregação, ocorrência de ligações extra no esqueleto peptídico, e oxidação dos resíduos de metionina. A instabilidade física inclui muitos fenómenos, incluindo, por exemplo, a agregação e/ou a precipitação.

Pode promover-se a estabilidade química e física removendo água da proteína. Utiliza-se habitualmente a liofilização (secagem do congelado sob condições controladas) para a armazenagem a longo prazo de proteínas. A proteína liofilizada resiste substancialmente à degradação, agregação, oxidação, e a outro processos de degradação enquanto se encontra no estado liofilizado. Pode 15 reconstituir-se a proteina liofilizada com água contendo opcionalmente um conservante bacteriostático (por exemplo, álcool benzilico), antes da sua administração.

Definições 0 termo "veiculo" inclui um diluente, adjuvante, excipiente, ou veiculo com o qual uma composição é administrada. Podem incluir-se nos veículos líquidos estéreis, tais como, por exemplo, água e óleos, incluindo óleos de petróleo, com origem animal, vegetal ou sintética, tais como, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e outros semelhantes.

Inclui-se no termo "excipiente" um agente não terapêutico adicionado a uma composição farmacêutica para proporcionar uma consistência pretendida ou um efeito estabilizante. Incluem-se nos excipientes farmacêuticos adequados, por exemplo, amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, silicagel, estearato de sódio, monoestearato de glicerilo, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e outros semelhantes. 0 termo "liofilizado" ou "seco a partir do congelado" inclui um estado de uma substância que foi submetida a um processo de secagem tal como a liofilização, em que se removeu pelo menos 90 % da água. 16

Antagonistas de VEGF

Um antagonista de VEGF é um composto capaz de bloquear ou de inibir a acção biológica do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e inclui proteínas de fusão capazes de armadilhar VEGF. 0 antagonista de VEGF utilizado na invenção é constituído pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID NO:4 e está glicosilado nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308. Numa concretização específica, o antagonista de VEGF é expresso numa linha de células de mamífero tal como células CHO. O antagonista de VEGF dos métodos e preparações pode ser preparado por qualquer método conhecido na técnica, ou que se torne conhecido. O antagonista de VEGF está preferivelmente substancialmente isento de contaminantes proteicos na altura em que é utilizado para preparar a formulação aceitável do ponto de vista farmacêutico. A expressão "substancialmente isento de contaminantes proteicos" significa, preferivelmente, que pelo menos 90 % do peso de proteína de fusão específica como antagonista de VEGF que é utilizada para fazer a formulação é de facto proteína de fusão específica como antagonista de VEGF, mais preferivelmente pelo menos 95 %, e de preferência pelo menos 99 %. A proteína de fusão será preferivelmente substancialmente isenta de agregados. "Substancialmente isenta de agregados" significa que pelo menos 90 % do peso da proteína de fusão não está presente como agregados na altura em que se utiliza a proteína de 17 fusão para preparar a formulação eficaz do ponto de vista farmacêutico. A não ser aonde se indicar algo em contrário, os fosfatos empregues são fosfatos sódicos e consegue-se o pH pretendido para o tampão misturando quantidades apropriadas de fosfatos de sódio, monobásico e dibásico.

Formulações Oftálmicas Líquidas Estáveis

Num aspecto, a invenção proporciona uma formulação estável aceitável do ponto de vista farmacêutico incluindo um antagonista de VEGF, em que a formulação seja uma formulação liquida adequada para utilização oftálmica. Preferivelmente, a formulação líquida inclui uma quantidade aceitável do ponto de vista farmacêutico de antagonista do VEGF. A formulação também pode incluir um ou mais veículos, tampões, agentes de tónus, estabilizantes, e/ou excipientes, aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Um exemplo de uma formulação liquida aceitável do ponto de vista farmacêutico inclui uma quantidade eficaz do ponto de vista farmacêutico de um antagonista de VEGF, um tampão, um co-solvente orgânico tal como polissorbato, um agente de tónus tal como NaCl, e um estabilizante tal como sacarose ou trehalose.

Portanto, a invenção proporciona uma formulação oftálmica de um factor de um antagonista de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo: 18 (a) 1-100 mg/mL de um antagonista de VEGF constituído pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID No: 4, glicosilado nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) 0,01-5 % de um ou mais co-solventes orgânicos, que sejam um ou mais de entre polissorbato, polietilenoglicol (PEG), e propilenoglicol; (c) 30-150 mM de um agente de tónus seleccionado de entre cloreto de sódio ou cloreto de potássio; (d) tampão de fosfato de sódio 5-40 mM; e (e) 1,0-7,5 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol, com um pH de cerca de 5,8-7,0, em que a formulação seja adequada para administração intravitreal.

Determina-se a estabilidade de diversas maneiras, em altura especificadas ao longo do tempo, incluindo a determinação do pH, a inspecção visual da cor e da aparência, a determinação do conteúdo total em proteína por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, espectroscopia no UV, e a pureza é determinada por, por exemplo, SDS-PAGE, 19 HPLC de exclusão de dimensões, determinação da actividade em bioensaio, focagem isoeléctrica, e quantificação de isoaspartato. Num exemplo de um bioensaio útil para se determinar a actividade do antagonista de VEGF, utiliza-se uma linha de células BAF/3 VEGFR1/EP0R para se determinar a ligação de VEGF165 ao antagonista de VEGF da invenção.

Podem armazenar-se as formulações liquidas num meio isento de oxigénio. Podem gerar-se meios isentos de oxigénio sob um gás inerte tal como, por exemplo, azoto ou árgon. Armazenam-se as formulações liquidas preferivelmente a 5 °C.

Formulações Oftálmicas Liofilizadas

Num aspecto da invenção, proporciona-se uma formulação aceitável do ponto de vista oftálmico incluindo um antagonista de VEGF, em que a formulação seja uma formulação liofilizável. Podem reconstituir-se as formulações liofilizáveis a soluções, suspensões, emulsões, ou a qualquer outra forma aceitável para administração ou utilização. As formulações liofilizáveis são tipicamente preparadas primeiro sob a forma de líquidos, depois são congeladas e liofilizadas. 0 volume total de líquido antes da liofilização pode ser menor, igual, ou maior, do que o volume final reconstituído da formulação liofilizada. 0 processo de liofilização é bem conhecido dos indivíduos com conhecimentos médios da técnica, e inclui tipicamente a 20 sublimação da água a partir da formulação congelada, em condições controladas.

Portanto, a invenção proporciona uma formulação liofilizável de um antagonista de um factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo: (a) 5-50 mg/mL do antagonista de VEGF, preferivelmente 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL ou 40 mg/mL, constituído pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID No: 4, glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) tampão de fosfato de sódio 5-25 mM, com um pH de cerca de 5,8-7,0; (c) 0,01-0,15 % de um co-solvente orgânico, seleccionado de entre o conjunto constituído por polissorbato, polietilenoglicol (PEG), propilenoglicol, e uma combinação destes; e (d) 1-10 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol; ou um agente de tónus 20-150 mM, preferivelmente cloreto de sódio; ou 1-10 % do agente estabilizante e o agente de tónus 20-150 mM, 21 em que a formulação possa ser reconstituída de modo a ser adequada para administração intravitreal.

Podem armazenar-se formulações liofilizadas a uma larga gama de temperaturas. Podem armazenar-se as formulações liofilizadas a menos de 25°C, por exemplo, refrigeradas a 2-8°C, ou à temperatura ambiente (por exemplo, a cerca de 25°C). Preferivelmente, armazenam-se as formulações liofilizadas a menos do que cerca de 25°C, mais preferivelmente a cerca de 4-20°C; a menos do que 4°C; a menos do que cerca de -20°C; a cerca de - 40°C; a cerca de -70°C, ou a cerca de -80°C. Pode determinar-se a estabilidade da formulação liofilizada por diversas metodologias conhecidas na técnica, por exemplo, pela aparência visual do bolo e/ou por intermédio do conteúdo em humidade.

Reconstituem-se tipicamente as formulações liofilizadas para utilização, por adição de uma solução aquosa para dissolver a formulação liofilizada. Pode utilizar-se uma grande variedade de soluções aquosas para reconstituir uma formulação liofilizada. Preferivelmente, reconstituem-se as formulações liofilizadas utilizando água. Reconstituem-se preferivelmente as formulações liofilizadas com uma solução essencialmente constituída por água (por exemplo, WFI da USP, ou água para injecção) ou água bacteriostática (por exemplo, WFI da USP com 0,9 % de álcool benzílico) . No entanto, também se podem utilizar 22 soluções que incluam tampões e/ou excipientes e/ou um ou mais veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Preparam-se tipicamente as formulações secas a partir de congelado ou liofilizadas, a partir de líquidos, isto é, a partir de soluções, suspensões, emulsões, e outras semelhantes. Deste modo, o líquido que se destina a ser submetido a uma secagem depois de congelado ou liofilização inclui preferivelmente todas as componentes pretendidas para uma formulação líquida final reconstituída. Em resultado disto, quando reconstituída, a formulação seca a partir de congelado ou liofilizada proporcionará uma formulação líquida pretendida quando for reconstituída.

EXEMPLOS

Antes de se apresentarem os métodos descritos, deve entender-se que esta invenção não se limita a métodos específicos, e que as condições experimentais descritas, tal como os métodos e as condições que se apresentam, podem variar. Também se deve entender que a terminologia utilizada neste documento se destina ao objective de descrever apenas concretizações específicas, e não se pretende que seja limitativa, uma vez que o âmbito da invenção presente apenas será limitado pelas reivindicações apensas. 23 A não ser aonde se defina de outro modo, todos os termos científicos e técnicos utilizados neste documento têm os significados iguais aos habitualmente entendidos por quem tenha conhecimentos médios da técnica à qual esta invenção pertence. Embora se possam utilizar quaisquer materiais e métodos semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento quer na prática, quer para testar a invenção presente, descrevem-se agora os materiais e métodos preferidos.

Exemplo 1. Estabilidade de uma Formulação de Armadilha Liquida de VEGF a 50 mg/mL Armazenada a 5°C em frascos de vidro de 3 mL.

Armazenou-se uma formulação oftálmica líquida contendo 50 mg/mL de Armadilha de VEGF (SEQ ID NO:4), 10 mM em fosfato, 50 mM em NaCl, com 0,1 % de polissorbato 20, com 5 % de sacarose, e a pH 6,25, a 5°C em frascos de 3 mL em vidro, e testaram-se amostras aos 3, 6, 9, 12, 18 e 24 meses. Determinou-se a estabilidade por SE-HPLC. Mostram-se os resultados na Tabela 1. Mediu-se a turbidez a DO405 nm; bem como a percentagem de proteína recuperada e a sua pureza por HPLC de exclusão de dimensões.

Tabela 1. Estabilidade de uma Proteína Armadilha de VEGF a 50 mg/mL (VGFT-SS065)

Aparência Turbidez % de h del iMeses pH Visual (DO405 Armadilha Armadilha de| 24

11111111 11:1:1:1:1:1: nm) | de VEGF VEGF em | Recuperada Configuração j 1:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:::-:-:-:-::::::::1:::::::::::::::1: :::::::::::::::::::::::::::::::::1:-:-:-:-:- :::1:1:1:: :ιιιιιιιιιιιι| Nativa .....-.:.::::::1::::::::::::::::::::::::-:-:-:-:-:::::::::::-:-:-:-:-:-:-:-::::::::::::::::::::::: 0 : Passou :-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-:-::1:::::::::::::::::::::::1 0,00 1:::::::::::::::::::::::::::::::1:::-:-:-:-:-: -:1:1:1:1 6,2 11:1:1:1:1:1: 100 9 8,8 ! l.jlllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll; 3 : Passou jLllllllllllllllllllllllllllllllllll: 0,00 :1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1 :1:1:1:1 6,2; :111111111111 101 j..................9 8,7 1 6 ! Passou biiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiilllllllllllll 0,01 [:1:1:1:1:1:1:1:1:1:.:.:.:.:.: 1111111;: 5,3 lllllllllllll 100 1 98,3 Í llllllllllllllllllllllllllllllllllll.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.::: 9 i Passou 0,01 11:1:1:1:1:1:1:1:1:.:.:.:.:. :1::::::::11 6,31 çillllllllli: 101 9 8,3 :.:l.:.:.:.:.:illllllllllllllll.:.:.:.:.:.:illllll.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.ç: 12 ; Passou :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:i:i:i:i:i:i::: 0,01 ivllllllllllllllllllllll llllllv 6,3! lllllllllllll 104 9 8,4 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll.ç 18 i Passou 0,01 /η,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:,:. v.v.vll 6,3! :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.1 96 9 8,1 24 : Passou 0,01 .......| 6,3 105 98,1 I

Exemplo 2. Estabilidade de uma Formulação Liquida de Armadilha de VEGF a 50 mg/mL Armazenada a 6°C em frascos de 3 mL em Vidro.

Armazenou-se uma formulação líquida contendo 50 mg/mL de Armadilha de VEGF (SEQ ID NO: 4), fosfato 10 mM, NaCl 50 m, 3 % de polietilenoglicol 3350, 5 % de sacarose, com um pH de 6,25, a 5°C em ampolas em vidro com 3 mL, e testaram-se amostras aos 3, 6, 9, 12, 18 e 24 meses.

Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 2. Determinaram-se a turbidez, a percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima.

Tabela 2. Estabilidade de Armadilha de VEGF a 50 mg/mL

Meses

Aparência Visual

(VGFT-SS065)% de :Turbidez:: pH s Armadilha de VEGF % de Armadilha de VEGF na 25

Recuperada sí Configuração Nativa o l Passou | 0,00 Π 6,2 100 98, 9 "3........| Passou : o ; : O : v. O 6,1 104...............: ZZZZ^Z 6........| Passou .........õ7oT' 1...... zi9.................1 ' Z.....98,3 9 | Passou 0,00 ! 6 ^ 3 102 ..................97,6 12......| Passou ........õ,Õi..... 6,3 103 Z ZIFZ 18.......| Passou .........ο','οο...... "6,3 113 9 7,7 24 ] ;i Passou | ........0,00 ’’1Í6~21....... .........106................1 9 7,6

Exemplo 3. Estabilidade de Formulação Liquida de Armadilha de VEGF a 40 mg/mL Armazenada a 5°C em Ampolas em Vidro com 3 mL.

Armazenou-se uma formulação líquida contendo 40 mg/mL de Armadilha de VEGF (SEQ ID NO: 4), fosfato 10 mM, NaCl 40 mM, 0,03 % de polissorbato 20, 5 % de sacarose, com um pH 6,3, a 5°C em ampolas em vidro com 3 mL, e testaram-se amostras aos 0,5, 1, 2, 3, e 4 meses. Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 3. Determinaram-se a turbidez, a percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima.

Tabela 3. Estabilidade de Armadilha de VEGF a 40 mg/mL (VGFT-SS207)

Meses: ; Aparência Visual : Turbidez PH P“õ........| ;i Passou 0, 00 6,3 ZZZZi ii Passou 0, 00 6,3 PT........1 ^ Passou |.........0,00 : 6,2 % de : Armadilha de VEGF s Recuperada 100 99 % de

Armadilha de VEGF na Configuração Nativa .................99,'5................ ................99,4................ 26 26 Wv:::::::::::::::::::: % de ÍMeses Aparência Visual Turbidez ; pH Armadilha de VEGF Recuperada 2 Passou Po7 00.........|'6,"2] ..................95................ PTHj i Passou ........ο,οΐ.........[δ,Ίΐ ΡΊΓΗ Passou i.........Õ7Õ1.........f 6,3! % de

Armadilha de VEGF na Configuração Nativa ““""9972...........

Exemplo 4. Estabilidade de uma Formulação Liquida a 40 mg/mL de Armadilha de VEGF Armazenada a 5°C numa

Seringa em Vidro Previamente Enchida.

Armazenou-se uma formulação líquida contendo 40 mg/mL de Armadilha de VEGF (SEQ ID NO: 4), fosfato 10 mM, NaCl 40 mM, 0,03 % de polissorbato 20, 5 % de sacarose, com um pH 6,3, a 5°C numa seringa de vidro com 1 mL e fecho luer munida de um êmbolo revestido a FluroTec 4023/50, e testaram-se amostras aos 0,5, 1, 2, 3, e 4 meses. Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 4. Determinaram-se a turbidez, a percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima.

Tabela 4. Estabilidade de Proteína Armadilha de VEGF a 40 mg/mL (VGFT-SS207)

% de Armadilha de VEGF na Configuração Nativa 99,4 99,3 27 iMeses: Aparência Visual Turbidez pH % de Armadilha de VEGF Recuperada; % de : Armadilha de VEGF na : Configuração Nativa 1 i Passou 0,00 i 6,3! 100 99,4 2 Passou 0,00......... !6,3j 97 99,1 .........3........ Passou 1 0,01......... 6, 4f i 4 Passou 1-1 o o 6,31

Exemplo 5. Estabilidade de uma Formulação Liquida de Armadilha de VEGF a 40 mg/mL Armazenada a 5°C em Frascos em Vidro com 3 mL.

Armazenou-se uma formulação líquida contendo 40 mg/mL de Armadilha de VEGF (SEQ ID NO: 4), fosfato 10 mM, NaCl 40 mM, 0,03 % de polissorbato 20, 5 % de sacarose, com um pH 6,3, a 5°C em ampolas de vidro com 3 mL e testaram-se amostras aos 0,5, 1, 2, 3, e 4 meses. Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 5. Determinaram-se a turbidez, a percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima.

Tabela 5. Estabilidade de uma Proteína Armadilha de VEGF a 40 mg/mL (VGFT-SS203) ÍMesesi Aparência Visual Turbidez: PH % de | Armadilha i de VEGF ? Recuperada : % de : Armadilha de i VEGF na i Configuração i Nativa 0 Passou 0,00 6,3 | íoo 99,3 28 Meses: Aparência Visual Turbidez 1 pH % de Armadilha de VEGF Recuperada % de Armadilha de VEGF na Configuração Nativa 0,5 | Passou j 0, 00 ; 6,21 8 7 1 99,2 1 Passou i 0,00 [6,2! 88 | 99, 1 2 i Passou [ 0,00 ! 6,31 103 1 99,2 3 Passou 0,00 :6,3:: 88 | 99,0 4 Passou 0,00 6,2Í 85 98,9 5 Passou 0,00 6,31 8 4 99, 0

Exemplo 6. Estabilidade de uma Formulação Liquida de Armadilha de VEGF a 40 mg/mL Armazenada a 5°C numa Seringa em Vidro com 1 mL, Previamente enchida.

Armazenou-se uma formulação líquida contendo 40 mg/mL de Armadilha de VEGF (SEQ ID NO: 4), fosfato 10 mM, NaCl 40 mM, 0,03 % de polissorbato 20, 5 % de sacarose, com um pH 6,3,a 5°C numa seringa em vidro previamente enchida, de 1 mL e com fecho luer, munida de um êmbolo revestido a FluroTec 4023/50, e testaram-se amostras aos 0,5, 1, 2, 3, 4, e 5 meses. Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 6. Determinaram-se a turbidez, a percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima.Tabela 6. Estabilidade de Proteína Armadilha de VEGF a 40% de Armadilha de | VEGF na ii Meses i Aparência Visual mg/mL (VGFT-SS203) % de

Turbidez

PH

Armadilha de VEGF 29

Exemplo 7. Estabilidade de uma Formulação de Armadilha de VEGF a 20 mg/mL Liofilizada, Armazenada a 5°C em Frascos de 3 mL e Vidro, e Reconstituída a 40 mg/mL.

Liofilizaram-se 0,8 mL de uma formulação líquida contendo armadilha de VEGF a 20 mg/mL (SEQ ID NO: 4), fosfato 5 mM, NaCl 20 mM, 0,015 % de polissorbato 20, 2,5 % de sacarose, com pH 6,3, em frascos em vidro com 3 mL. Armazenaram-se as amostras a 5°C e testaram-se aos 1 e 2 meses. Reconstituiu-se a armadilha de VEGF a uma concentração final de 40 mg/mL em Armadilha de VEGF (volume final de 0,4 mL). Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 7 (t = tempo em meses; * = aparência vidual; ** = duração da reconstituição). Determinaram-se a turbidez, a percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima. 30

Tabela 7. Estabilidade de Proteína Armadilha de VEGF a 20 mg/mL Liofilizada (VGFT-SS216) 30 t

Vis* Ap. *

Dur. Da Reconst** (minutos)

Apar. Vis.* Líq. Reconst

Turbidez pH % de % de Armad. Armadilha de VEGF de VEGF na Recuperada Config. Nativa 0 IPassoul 0,6 | Passou 0,00 16,31 100 I 99,5 1 1 iPassoul 0,6 Passou 0,01 6,3 ! 106 I 99,4 ! 2 |Passou| 0,4 Passou 0, 01 6,2 103 1 99,3 Ϊ

Exemplo 8. Estabilidade de Formulação de Armadilha de VEGF a 20 mg/mL Liofilizada, Armazenada a 5°C em Frascos em Vidro com 3 mL.

Liofilizaram-se 0,8 mL de uma formulação líquida contendo armadilha de VEGF a 2 0 mg/mL (SEQ ID NO: 4), fosfato 5 mM, NaCl 20 mM, 0,015 % de polissorbato 20, 2,5 % de sacarose, com pH 6,3, em frascos em vidro com 3 mL. Armazenaram-se as amostras a 5°C e testaram-se aos 1, 2, e 3 meses. Reconstituiu-se a armadilha de VEGF a uma concentração final de 40 mg/mL em Armadilha de VEGF (volume final de 0,4 mL). Mostram-se os resultados de estabilidade na Tabela 7 (t = tempo em meses; * = aparência vidual; ** = duração da reconstituição). Determinaram-se a turbidez, a 31 percentagem de proteína recuperada e a pureza tal como se descreveu acima.

Tabela 8. Estabilidade de Proteína Armadilha de VEGF a 20 mg/mL Liofilizada (VGFT-SS216) Vis* Ap. * Apar. % de \ Dur. Da Vis. * Armadilha ijReconst**: ÍTurbidez pH Líq. de VEGF \ (minutos) Reconst. Recuperada 0 i Passou| 0,7 | Passou | 0,00 1 ·:· ^ | U) 100 1 |Passou| | Passou | 0, 01 6,2! 105 2|Passou| 0,4 | Passou | 0,01 16,21 103 % de ii Armad. de VEGF na

Config. :Nativa: |99,0 j | 98,9 ) | 98,9 jí

ASPECTOS DE COMPARAÇÃO NA ESPECIFICAÇÃO

Seguem-se aspectos comparativos da especificação presente. (1) uma formulação oftálmica de um antagonista de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo (a) 1-100 mg/mL de um antagonista de VEGF que inclua os aminoácidos da SEQ ID No: 4; 32 (b) 0,01-5 % de um ou mais co-solvente(s) orgânico (s), que seja(m) um ou mais de entre polissorbato, polietilenoglicol (PEG), e propilenoglicol; (c) um agente de tónus 30-150 mM seleccionado de entre cloreto de sódio ou cloreto de potássio; e (d) tampão fosfato de sódio 5-40 mM; e contendo opcionalmente também 1,0-7,5 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol, e tendo um pH de entre cerca de 5,8-7,0 (2) Uma formulação oftálmica consoante (1), incluindo cerca de 1-100 mg/mL, preferivelmente 10-80 mg/mL, do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, NaCl 40 mM, 0,03 % de polissorbato, e 5 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3. (3) Uma formulação oftálmica consoante (2), incluindo o antagonista de VEGF a uma concentração seleccionada de entre o conjunto constituído por 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, e 80 mg/mL. 33 (4) Uma formulação oftálmica consoante qualquer um de entre (1) a (3), incluindo 10-80 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, 0,03 % de polissorbato, e cloreto de sódio 135 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3. (5) Uma formulação liofilizável de um antagonista de um factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo (a) 5-50 mg/mL do antagonista de VEGF, preferivelmente 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL ou 40 mg/mL, que inclua a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; (b) tampão de fosfato de sódio 5-25 mM, com um pH de cerca de 5,8-7,0; (c) 0,01-0,15 % de um co-solvente orgânico, seleccionado de entre o conjunto constituído por polissorbato, polietilenoglicol (PEG), propilenoglicol, e uma combinação destes; e, opcionalmente (d) 1-10 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol; ou um agente de tónus 20-150 mM, preferivelmente cloreto de sódio; ou 1-10 % do 34 agente estabilizante mais agente de tónus 20-150 mM. (6) Uma formulação liofilizável de acordo com (5), incluindo cerca de 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 10 mM, cerca de 0,03 % de polissorbato, cerca de 0,1 % de PEG, e cerca de 2,5 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3. (7) Uma formulação liofilizável de acordo com (5), incluindo cerca de 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 5 mM, cerca de 0,015 % de polissorbato, cerca de 2,5 % de sacarose, e contendo também cloreto de sódio cerca de 20 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3 . (8) Uma formulação liofilizável de acordo com (5), incluindo cerca de 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 5 mM, cerca de 0,015 % de polissorbato, e contendo também cloreto de sódio cerca de 67,5 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3. (9) Um método de se produzir uma formulação liofilizada de um antagonista de VEGF, que inclua submeter-se a formulação antes da liofilização, consoante (5) a (8), a uma 35 liofilizaçao, para se gerar uma formulação liofilizada. (10) Uma seringa previamente enchida, apropriada para administração intravitreal, incluindo a formulação de (1).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Formulações de Antagonistas de VEGF Adequadas para Administração Intravitreal

<130> 5050A-WO <140> A atribuir <141> 2007-06-14 <150> 60/814.484 <151> 2006-06-16 <160> 4 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 1453 36

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 1 aagcttgggc caaccaccat tgcttctcac ccgaaattat ctaacatcac gcataatetg ggcttctgac atcgacaaac ctgttggaga acttcaactg taaaaaccca taacccggag agaacágcac caccgtgccc ccaaggacac gccacgaaga ccaagacaaa ccgtcctgca ccctcccagc aggtgtacac gcctggtcaa cggagaacaa atagcaagct tgatgcatga aatgagcggc tgcaggtcga ggtcagctac aggatctagt acacatgact tgttacttta ggacagtaga ctgtgaagca caatacaatc aaagcttgtc ggaataccct gtctgggagt tgaccaagga atttgtcagg agcacctgaa cctcatgatc ccotgaggto gccgcgggag ccaggactgg ccccatcgag cctgccccca aggcttctat ctacaagacc caccgtggac ggctctgcac cgc tcgactctag tgggacaccg tccggaggta gaaggaaggg aaaaagtttc aagggcttoa acagtcaatg atagatgtgg ttaaattgta tcttcgaagc gagatgaaga ttgtacacct gtccatgaaa cfcqctggggg tocoggacco aagttcaact gagcagcaca ctgaatggca aaaaccatct tcccgggatg cccagcgaca acgcctcccg aagagcaggt aaccactaca aggatcgatc gggtcctgct gacctttcgt agctcgtcat cacttgacac teatatcaaa ggcatttgta ttctgagtcc cagcaagaac afccagcataa aatttttgag gtgcagcatc agggcccggg gaccgtcagt ctgaggtcac ggtacgtgga acagcacgta aggagtacaa ccaaagccaa agctgaccaa tcgccgtgga tgctggactc ggcagcaggg cgcagaagag cccgggcgag gtgcgcgcCg agagatgtac tccctgccgg tttgatcoct tgc&acgtac taagacaaac gtctcatgga tgaactaaat gaaacttgta caccttaact cagtgggctg cgacaaaact cttcctcttc atgcgtggtg cggcgtggag ccgtgtggtc gtgoaaggtc agggcagccc gaaccaggtc gtgggagagc cgacggctcc gaacgtcttc cctctccctg ctogaattcg 60 ctcagctgtc 120 agtgaaatcc 190 gttacgtcac 240 gatggaaaac 300 aaagaaatag 360 tatctcacac 420 attgaactat 480 gtggggattg 540 aaccgagacc 600 atagatggtg 660 atgaccaaga 720 cacacatgce 780 cccccaaaac 840 gtggacgtga 900 gtgcataatg 960 agcgtcctca 1020 tccaacaaag 1080 cgagaaccac 1140 agcctgaect 1200 aatgggcagc 1260 ttcttcctct 1320 tcatgctccg 1380 tctccgggta 1440 1453

<210> 2 <211> 458 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 2 37

Met Vai Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu 20 25 30 Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Vai Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu 50 55 60 Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg ile Ile 65 70 75 80 Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu 85 90 95 Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly HiS Leu Tyr Lys 100 105 110 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val 115 120 125 Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val 130 135 140 Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn 145 150 155 160 Trp Glu Tyr pro Ser Ser Lys HiS Gin His Lys Lys Leu val Asn Axg 165 170 175 Asp Leu Lys Thr Gin Ser Gly ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr 180 185 190 Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gin Gly Leu Tyr Thr Cys 195 200 205 Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg 210 215 220 vai His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Vai Vai val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 Hls Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 420 425 430 Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 * 440 445 Gin Lye Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

<210> 3 <211> 1377 <212> AND <213> Sequência Artificial <220> 38 <223> Sintética <400> 3 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttccggaag tgataccggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaato 120 cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca 180 cataacatca ctgttaottt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240 cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300 gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaoa 360 catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacca 420 tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 430 gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540 ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600 gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660 aagaacagca eatttgtcag ggtccatgaa aaggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgb gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagfctcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggao tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320 gaggotctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtotccggg taaatga 1377

<210> 4 <211> 458 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sintética <400> 4 39 Met 1 Vai Ser Tyr Trp 5 Asp Thr Gly val Leu 10 Leu Cys Ala Leu Leu 15 Ser Cys Leu Leu Leu 20 Thr Gly Ser Ser Ser 25 Gly Ser Asp Thr Gly 30 Arg Pro Phe Vai Glu 35 Met Tyr Ser Glu Ile 40 Pro Glu Ile Ile His 45 Met Thr Glu Gly Arg 50 Glu Leu Vai Ile Pro 55 Cys Arg Val Thr Ser 60 Pro Asn Ile Thr Vai 65 Thr Leu Lys Lys Phe 70 Pro Leu Asp Thr Leu 75 Ile Pro Asp Gly Lye 80 Arg Ile Ile Trp Asp 85 Ser Arg Lys Gly Phe 90 lie Ile Ser Asn Ala 95 Thr Tyr Lys Glu Ile 100 Gly Leu Leu Thr Cys 105 Glu Ala Thr Val Asn 110 Gly His Leu Tyr Lys 115 Thr Asn Tyr Leu Thr 120 His Arg Gin Thr Asn 125 Thr Ile Ile Asp Vai 130 Vai Leu Ser Pro Ser 135 His Gly Ile Glu Leu 140 Ser Val Gly Glu Lys 145 Leu Vai Leu Asn Cys 150 Thr Ala Arg Thr Glu 155 Leu Asn Val Gly Ile 160 ASp Phe Asn Trp Glu 165 Tyr Pro Ser Ser Lys 170 His Gin His Lys Lys 175 Leu Vai Asn Arg Asp 180 Leu Lys Thr Gin Ser 185 Gly Ser Glu Met Lys 190 Lys Phe Leu Ser Thr 195 Leu Thr Ile Asp Gly 200 Val Thr Arg Ser Asp 205 Gin Gly Leu Tyr Thr 210 Cys Ala Ala Ser Ser 215 Gly Leu Met Thr Lys 220 Lys Asn Ser Thr Phe 225 Vai Arg Vai His Glu 230 Lys Asp Lys Thr His 235 Thr Cys Pro Pro Cys 240 Pro Ala Pro Glu Leu 245 Leu Gly Gly Pro Ser 250 Val Phe Leu Phe Pro 255 Pro Lys Pro Lys Asp 2 60 Thr Leu Met Ile Ser 265 Arg Thr Pro Glu Val 270 Thr Cys Vai Vai Vai 275 Asp Vai Ser His Glu 280 Asp Pro Glu Val Lys 285 Phe Asn Trp Tyr Vai 290 Asp Gly Vai Glu Vai 295 His Asn Ala Lys Thr 300 Lys Pro Arg Glu Glu 305 Gin Tyr Asn Ser Thr 310 Tyr Arg Val Val Ser 315 Val Leu Thr Val Leu 320 His Gin Asp Trp Leu 325 Asn Gly Lys Glu Tyr 330 Lys Cys Lys Val Ser 335 Asn Lys Ala Leu Pro 340 Ala Pro Ile Glu Lys 345 Thr He Ser Lys Ala 350 Lys Gly Gin Pro Arg 355 Glu Pro Gin Vai Tyr 3 60 Thr Leu Pro Pro Ser 365 Arg Asp Glu Leu Thr 370 Lys Asn Gin Vai Ser 375 Leu Thr Cys Leu val 380 Lys Gly Phe Tyr Pro 385 Ser Asp Ile Ala Vai 390 Glu Trp Glu Ser Asn 395 Gly Gin Pro Glu Asn 400 Asn Tyr Lys Thr Thr 405 Pro Pro Val Leu Asp 410 Ser Asp Gly Ser Phe 415 Phe Leu Tyr Ser Lys 420 Leu Thr val Asp Lys 425 Ser Arg Trp Gin Gin 430 Gly Asn Vai Gin Phe Lys 450 Ser 435 Ser Cys Leu Ser Ser Vai Leu Met Ser 455 HiS 440 Pro Glu Gly Ala Lys Leu HiS Asn 445 HiS Tyr Thr

Lisboa 9 de Maio de 2013

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação oftálmica de um antagonista de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo: (a) 1-100 mg/mL de um antagonista de VEGF constituído pelos aminoácido 27-457 da SEQ ID No: 4, que está glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) 0,01-5 % de um ou mais co-solvente(s) orgânico (s), que seja(m) um ou mais de entre polissorbato, polietilenoglicol (PEG), e propilenoglicol; (c) um agente de tónus 30-150 mM seleccionado de entre cloreto de sódio ou cloreto de potássio; (d) tampão fosfato de sódio 5-40 mM; e (e) 1,0-7,5 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol, a um pH de entre cerca de 5,8-7,0, em que a formulação seja adequada para administração intravitreal. 2

2. Uma formulação oftálmica de acordo com a reivindicação 1, incluindo cerca de 1-100 mg/mL, preferivelmente 10-80 mg/mL, do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, NaCl 40 mM, 0,03 % de polissorbato, e 5 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

3. Uma formulação oftálmica de acordo com a reivindicação 2, incluindo uma concentração do antagonista de VEGF seleccionada de entre o conjunto constituído por 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL, e 80 mg/mL.

4. Uma formulação oftálmica de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, incluindo 10-80 mg/mL de antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio 10 mM, 0,03 % de polissorbato, e cloreto de sódio 135 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

5. Uma formulação oftálmica de acordo com a reivindicação 1, incluindo: (a) 10 mg/mL ou 40 mg/mL de um antagonista de VEGF constituído pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID No: 4, que seja glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) 0,03 % de polissorbato 20; (c) cloreto de sódio a cerca de 40 mM; 3 (d) tampão de fosfato de sódio 10 mM; e (e) 5 % de sacarose, Em que o pH da formulação seja um pH de 6,2-6,3.

6. Uma formulação liofilizável de um antagonista de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), incluindo (a) 5-50 mg/mL do antagonista de VEGF, preferivelmente 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL ou 40 mg/mL, constituído pelos aminoácidos 27-457 da SEQ ID No: 4, glicosilada nos resíduos Asn 62, 94, 149, 222 e 308; (b) tampão de fosfato de sódio 5-25 mM, pH de cerca de 5,8-7,0; (c) 0,01-0,15 % de um co-solvente orgânico, seleccionado de entre o conjunto constituído por polissorbato, polietilenoglicol (PEG), propilenoglicol, e uma combinação destes; e (d) 1-10 % de um agente estabilizante seleccionado de entre o conjunto constituído por sacarose, sorbitol, glicerol, trehalose, e manitol; ou um agente de tónus 20-150 mM, 4 preferivelmente cloreto de sódio; ou 1-10 % do agente estabilizante e o agente de tónus 20-150 mM, em que a formulação possa ser reconstituída sendo portanto adequada para administração intravitreal.

7. Uma formulação liofilizável de acordo com a reivindicação 6, incluindo cerca de 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 10 mM, cerca de 0,03 % de polissorbato, cerca de 0,1 % de PEG, e cerca de 2,5 % de sacarose, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

8. Uma formulação liofilizável de acordo com a reivindicação 6, incluindo cerca de 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 5 mM, cerca de 0,015 % de polissorbato, cerca de 2,5 % de sacarose, e incluindo ainda cloreto de sódio a cerca de 20 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

9. Uma formulação liofilizável de acordo com a reivindicação 7, incluindo cerca de 20 mg/mL do antagonista de VEGF, tampão de fosfato de sódio cerca de 5 mM, cerca de 0,015 % de polissorbato, e contendo ainda cloreto de sódio a cerca de 67,5 mM, com um pH de cerca de 6,2-6,3.

10. Um método de produzir uma formulação liofilizada de um antagonista de VEGF, incluindo submeter-se a formulação antes de ser liofilizada de acordo com a 5 reivindicação 6 a 9, a uma liofilizaçao para gerar uma formulação liofilizada.

11. Uma seringa previamente cheia, adequada para uma administração intravitreal incluindo a formulação de qualquer uma das reivindicações 1 a 5. Lisboa, 9 de Maio de 2013.