CN109206522A

CN109206522A - 一种长效抗凝血融合蛋白及其应用

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Publication number: CN109206522A
Application number: CN201810723618.9A
Authority: CN
Inventors: 吴祖泽; 于爱平; 李世崇; 庞玉红; 汪坤; 靳继德
Original assignee: BEIJING SANYOU LIHEZE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Academy of military medicine, PLA Academy of Military Sciences; BEIJING SH BIO-TECH Corp.
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2038-07-04
Also published as: CN109206522B

Abstract

本发明涉及生物技术和疾病治疗领域，特别是血栓性疾病治疗领域。具体而言，本发明涉及包含抗凝血蛋白及免疫球蛋白Fc结构域的融合蛋白，以及此类融合蛋白的医药用途。

Description

一种长效抗凝血融合蛋白及其应用

技术领域

背景技术

心血管疾病是近年来威胁人类健康和生命的头号杀手，血栓形成是许多心血管疾病的重要诱因，抗凝剂是防治血栓形成的重要药物。目前临床上广泛应用的抗凝剂主要是肝素，其作用是通过与抗凝血酶III(antithrombin III)结合来抑制凝血酶(thrombin)的活性，因而可能引起抗凝血酶III的减少，肝素的一个重要缺点是引发血小板减少症(thrombocytopenia)。现在又发展的低分子量肝素可以减轻肝素应用中的风险程度，但不能根本克服它的缺点。水蛭素是近年来欧洲已经上市的一个新型抗凝药物，它是凝血酶的直接抑制剂，但它对凝血酶的强抑制作用，可导致凝血相关参数，如APTT、TT等急剧升高，从而伴有全身或系统性出血风险。新蛭素(Neorudin，简称EH)与水蛭素相比就有良好的特异靶向性，能降低水蛭素非特异性导致的全身出血副作用，然而，EH是一条短肽，其分子量只有7.3KD，很容易被肾小球过滤，经尿液排出，这就是使得EH在体内血浆半衰期较短，只有1-2h。

现有抗凝药物存在的上述问题已经越来越多的受到人们的关注，作为一个理想的特异性抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明确的抗栓效果，又不引起出血副作用的同时，且具有长效性，不仅使临床用药安全性提高，而且减少给药次数。因此，针对血栓性疾病患者发展新型的、安全的、长效的特异性防治血栓剂是迫切而必要的。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料的发现，将新蛭素通过特定方式融合至特定免疫球蛋白Fc结构域后不仅能够显著延长所述新蛭素的体内半衰期，并且能够保持新蛭素的特异性抗凝血活性。基于这一发现，本发明人开发了新的长效抗凝血融合蛋白以及基于该融合蛋白的血栓性疾病治疗方法。

融合蛋白

因此，在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含：

(a)新蛭素或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸的置换(例如，保守置换)，且基本保留了其所源自的序列的生物学功能；

(b)人IgG的Fc结构域或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸的置换(例如，保守置换)，且基本保留了其所源自的序列的生物学功能。

在本发明中，“变体”是指具有以下特征的多肽：与其所源自的序列相比具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸的置换、缺失或添加，或者与其所源自的序列相比具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的序列的生物学功能。

因此，表述“新蛭素的变体”是指具有以下特征的多肽：与新蛭素相比具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸的置换、缺失或添加，或者与新蛭素相比具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了新蛭素的生物学功能(例如特异性抗凝血活性，即在血栓部位特有的凝血因子作用下显示的抗凝血活性)。

表述“人IgG的Fc结构域的变体”是指具有以下特征的多肽：与人IgG的Fc结构域相比具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸的置换、缺失或添加，或者与新蛭素相比具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了人IgG的Fc结构域的生物学功能(即，能够延长与其融合的活性成分(例如抗凝血蛋白)的体内半衰期)。

变体可以是天然存在的，例如等位基因或拼接变体，或者可以是人工构建的(例如，通过使用重组DNA技术对原始序列进行体外改造)。

在某些实施方案中，所述新蛭素具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述人IgG的Fc结构域是人IgG1或IgG4的Fc结构域。

在某些实施方案中，所述人IgG4的Fc结构域具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述人IgG1的Fc结构域具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述新蛭素或其变体任选地通过接头(例如柔性肽接头或刚性肽接头)连接至所述人IgG的Fc结构域或其变体的N端或C端。

在某些实施方案中，所述新蛭素(或其变体)任选地通过接头连接至所述人IgG的Fc结构域(或其变体)。

在某些实施方案中，所述新蛭素(或其变体)任选地通过接头连接至所述人IgG的Fc结构域(或其变体)的N端或C端。

在某些实施方案中，所述人IgG的Fc结构域(或其变体)是人IgG4的Fc结构域(或其变体)。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含新蛭素或其变体、以及人IgG4的Fc结构域或其变体，并且所述新蛭素(或其变体)直接连接至所述人IgG4的Fc结构域(或其变体)的C端。在某些示例性实施方案中，本发明的融合蛋白具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述融合蛋白包含新蛭素或其变体、以及人IgG4的Fc结构域或其变体，并且所述新蛭素(或其变体)通过接头(例如肽接头)连接至所述人IgG4的Fc结构域(或其变体)的N端。在某些示例性实施方案中，本发明的融合蛋白具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述融合蛋白还包含另外的抗凝血蛋白，所述另外的抗凝血蛋白任选地通过接头(例如肽接头)连接至所述人IgG4的Fc结构域(或其变体)的C端，所述另外的抗凝血蛋白选自新蛭素、水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒、以及它们的变体。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含新蛭素或其变体、人IgG4的Fc结构域或其变体、以及包含水蛭素或其变体，其中：所述新蛭素(或其变体)通过接头(例如肽接头)连接至所述人IgG4的Fc结构域(或其变体)的N端，所述水蛭素(或其变体)直接连接至所述人IgG4的Fc结构域(或其变体)的C端。在某些示例性实施方案中，本发明的融合蛋白具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述接头是柔性肽接头或刚性肽接头。

在某些实施方案中，所述接头是柔性肽接头。此类接头通常包含一个或多个(例如，1-20个，1-18个，或1-16个)选自下列的氨基酸残基或由其组成：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)。在某些实施方案中，所述接头为由一个或多个(例如，1-20个，1-18个，或1-16个)G和/或S组成的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述柔性肽接头包含如下所示的氨基酸序列或由其组成：(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。在某些示例性实施方案中，所述柔性肽接头具有如下所示的氨基酸序列：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4)。

在某些实施方案中，所述接头是刚性肽接头。在某些实施方案中，所述刚性肽接头包含如下所示的氨基酸序列或由其组成：(EAAAK)n，其中n是大于或等于1的整数。在某些示例性实施方案中，所述刚性肽接头具有如下所示的氨基酸序列：AEAAAKEAAAKEAAAKA(SEQID NO:5)。

在某些示例性实施方案中，本发明的融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQID NOs:7、9、11、13、15。

在某些示例性实施方案中，本发明的融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQID NOs:9、11、15。

在某些实施方案中，与新蛭素相比，所述融合蛋白具有基本相同或至少可比较的生物学活性(例如，特异性抗凝血活性，即在血栓部位特有的凝血因子作用下显示的抗凝血活性)，并且具有延长的体内半衰期(例如，血浆半衰期)。可以使用本领域公知的方法(例如ELISA法或放射性同位素标记法)证明半衰期的增加，示例性的测定方法描述于实施例2。可以通过本领域公知的方法测定所述生物学活性，示例性的测定方法描述于实施例1。在某些实施方案中，与新蛭素相比，所述融合蛋白的体内半衰期至少延长了20倍，例如至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍或至少60倍。

融合蛋白的制备

本发明的融合蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列。

在另一个方面，本发明还提供了一种载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。在某些实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的融合蛋白。

在另一个方面，本发明还提供了包含本发明的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞。

在另一个方面，本发明还提供了制备本发明的融合蛋白的方法，其包括，在允许所述融合蛋白表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述融合蛋白。

治疗方法和药物组合物

本发明的融合蛋白能够在无血栓部位不显示抗凝血活性而在有血栓部位显示长效抗凝血活性从而防治血栓形成，因此可用于预防和/或治疗血栓性疾病(例如，冠状动脉血栓、静脉血栓或弥散性血管内凝血)。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的融合蛋白、分离的核酸分子、载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的融合蛋白。

在另一个方面，本发明提供了用于在受试者中预防和/或治疗血栓性疾病的方法，其包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白、分离的核酸分子、载体或宿主细胞的步骤。在某些实施方案中，所述方法包括，给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的融合蛋白的步骤。

在另一个方面，本发明还涉及本发明的融合蛋白、分离的核酸分子、载体或宿主细胞用于在受试者中预防和/或治疗血栓性疾病的用途，或者用于制备在受试者中预防和/或治疗血栓性疾病的药物的用途。

在另一个方面，本发明还涉及本发明的分离的多肽(或其变体)、融合蛋白、分离的核酸分子、载体或宿主细胞，其用作药物。

在另一个方面，本发明还涉及本发明的融合蛋白、分离的核酸分子、载体或宿主细胞，其用于在受试者中预防和/或治疗血栓性疾病。

在本发明中，所述血栓性疾病包括但不限于肺栓塞(pulmonary embolism)、心肌梗死(myocardial infarction)、不稳定型心绞痛(unstable angina)、动脉粥样硬化(atherothrombosis)、急性冠脉综合征(acute coronarysyndrome)、缺血性卒中(ischemicstroke)、肢体缺血(limb ischemia)等。

本发明的融合蛋白或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)等形式。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白或药物组合物可以配制成注射液或冻干粉剂。

此外，本发明的融合蛋白可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。

本发明的融合蛋白或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白或药物组合物通过静脉推注或注射给予。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的融合蛋白。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如血栓性疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的融合蛋白的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

在本发明中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。

在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有血栓性疾病，或者，具有患血栓性疾病的风险。

本发明还包含以下示例性实施方案：

1.包含抗凝物质、可选的短肽连接头与人免疫球蛋白IgG的Fc部分融合的抗凝血蛋白。优选地，还包括与其他延长EH半衰期的蛋白例如人血清白蛋白、以及胶原蛋白、转铁蛋白等。

2.项目1的抗凝血物质，选自EH、水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒等，或它们的突变体。

3.项目2的抗凝血蛋白，优选EH、水蛭素或其突变体。

4.项目1的短肽连接头，包括柔性(GGGGS)n、刚性连接短肽(EAAAK)n等。

5.项目1的人免疫球蛋白IgG的Fc部分，包括IgG不同亚型：IgG1、IgG4，或他们的突变体。

6.项目1的含有人免疫球蛋白IgG的Fc抗凝血蛋白，包括在EH的C末端连接Fc的抗凝血蛋白EH-Fc；EH的N末端与Fc通过连接短肽连接的抗凝蛋白Fc-EH；EH的N末端与Fc直接相连接的抗凝蛋白Fc-EH；Fc的C末端、N末端同时利用连接短肽连接EH的抗凝蛋白EH-L-Fc-HV2。

7.制备含有人免疫球蛋白IgG的Fc部分抗凝血蛋白的方法，融合蛋白基因，然后这些基因在CHO等真核表达系统中表达。

8.含有人免疫球蛋白IgG的Fc的抗凝血蛋白及药用载体或赋形剂的药物组合物。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“新蛭素(EH)”是指，一种经修饰的水蛭素，其由68个氨基酸组成。与水蛭素相比，新蛭素(EH)的氨基端被可被凝血因子Xa(FXa)和凝血因子XIa(FXIa)识别并切割的短肽谷氨酸-脯氨酸-精氨酸(EPR)封闭，其详细教导可参见例如中国专利申请CN200780046340.6。在本发明中，当提及新蛭素(EH)的氨基酸序列时，其使用SEQID NO:1所示的序列来进行描述。然而，本领域技术人员理解，在EH的氨基酸序列中，可人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“新蛭素(EH)”应包括所有此类序列，即包括例如SEQ ID NO:1所示的序列以及其变体。

如本文中所使用的，术语“Fc结构域”具有免疫学领域通常赋予该术语的涵义，尤其指通过从抗体去除两个抗原结合区(Fab片段)而得到的抗体片段。Fc结构域由通过非共价相互作用和二硫键结合的抗体的两个重链恒定区组成。Fc结构域可以包含铰链区，并经CH2和CH3结构域延伸到抗体C末端。人和小鼠免疫球蛋白的代表性铰链区可以见AntibodyEngineering，APractical Guide，Borrebaeck，C.A.K.，ed.，W.H.Freeman andCo.，1992。在本发明中，术语“Fc结构域”包括天然Fc或其变体。所述变体与其所源自的野生型序列相比，具有一个或多个突变(如，氨基酸替换、插入或删除)，该突变不影响Fc结构域的延长体内半衰期的活性(即，延长与其融合的新蛭素的体内半衰期的活性)，但是可能影响或参与，或者不影响不参与：(1)二硫键形成，(2)与选择的宿主细胞的不相容性，(3)在选择的宿主细胞表达时N-末端异质性，(4)糖基化作用，(5)与补体的相互作用，(6)与补救受体以外的Fc受体结合，或(7)抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)。在某些实施方案中，所述人IgG的Fc结构域含有CH2和CH3结构域、以及铰链区。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂，稳定剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性(例如抗凝血活性)，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。

如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈疾病(例如血栓性疾病)，延缓疾病(例如血栓性疾病)的症状的发作，和/或延缓疾病(例如血栓性疾病)的发展。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，预防、抑制或延缓疾病(例如血栓性疾病)的发生。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指，可以有效实现预期目的的量。例如，治疗有效量可以是有效地或足以治疗或治愈疾病(例如血栓性疾病)，延缓疾病(例如血栓性疾病)症状的发作和/或延缓疾病(例如血栓性疾病)发展的量。预防有效量可以是有效地或足以预防、抑制或延缓疾病(例如血栓性疾病)发生的量。这样的有效量可以由本领域技术人员或医生容易地确定，并且可以与预期目的(例如治疗或预防)、受试者的一般健康状况、年龄、性别、体重、待治疗的疾病的严重程度、并发症、施用方式等相关。这样的有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有血栓性疾病，或者，具有患血栓性疾病的风险。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的融合蛋白具有显著的有利方面。特别地，本发明的融合蛋白在维持新蛭素的特异性抗凝血活性的同时，能够明显延长其体内半衰期。因此，本发明的融合蛋白特别适用于预防和/或治疗血栓性疾病，具有重大的临床价值。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了EH-L-IgG1Fc、EH-L-IgG4Fc的构建体的示意图。

图2显示了EH-L-IgG4Fc-HV2的构建体的示意图。

图3显示了IgG4Fc-L-EH的构建体的示意图。

图4显示了IgG4Fc-EH的构建体的示意图。

图5显示了EH-L-IgG1Fc的SDS-PAGE结果图。1：还原电泳；2：非还原电泳。

图6显示了EH-L-IgG4Fc、EH-L-IgG4Fc-HV2、IgG4Fc-L-EH和IgG4FcEH的SDS-PAGE结果图。左边是还原电泳，右边是非还原电泳。

图7显示了重组表达载体pcDNAEH-L-IgG4Fc的NheI/XhoI双酶切鉴定结果。

图8显示了重组表达载体pcDNAEH-L-IgG4Fc-HV2的NheI/XhoI双酶切鉴定结果。

图9显示了重组表达载体pcDNAIgG4Fc-L-EH的NheI/XhoI双酶切鉴定结果。

图10显示了重组表达载体pcDNAIgG4FcEH的NheI/XhoI双酶切鉴定结果。

图11显示了大鼠静脉注射IgG4Fc-EH(FcEH)后的平均药时曲线。

序列信息

本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1:融合蛋白的制备及体外抗凝血活性测定

1.1融合蛋白的制备

通过全基因合成按照表2中所示的各融合蛋白的构建方式构建编码该融合蛋白的核苷酸序列，其中，EH-L-IgG1Fc、EH-L-IgG4Fc的构建体的示意图如图1所示，EH-L-IgG4Fc-HV2的构建体的示意图如图2所示，IgG4Fc-L-EH的构建体的示意图如图3所示，IgG4Fc-EH的构建体的示意图如图4所示。通过双酶切法将编码上述各融合蛋白的核苷酸序列导入表达载体中，并将获得的重组表达载体利用脂质体转染至CHO细胞中，通过加压筛选、克隆化获得稳定表达的细胞株，从而获得融合蛋白。

表2：各重组蛋白的构建方式

具体而言，各融合蛋白的表达载体构建方式如下：

将EH-L-IgG1Fc的编码核酸序列上下游分别加上HindIII和XhoI酶切位点，将经HindIII和XhoI双酶切得到的编码核酸序列和经HindIII和XhoI双酶切得到的pcDNA3.1表达载体连接，从而获得EH-L-IgG1Fc的表达载体。

将EH-L-IgG4Fc的编码核酸序列上下游分别加上NheI和XhoI酶切位点，将经NheI和XhoI双酶切得到的编码核酸序列和经NheI和XhoI双酶切得到的pcDNA3.1表达载体连接，从而获得EH-L-IgG4Fc的表达载体(pcDNAEH-L-IgG4Fc)，其双酶切鉴定结果如图7所示。

将EH-L-IgG4Fc-HV2的编码核酸序列上下游分别加上NheI和XhoI酶切位点，将经NheI和XhoI双酶切得到的编码核酸序列和经NheI和XhoI双酶切得到的pcDNA3.1表达载体连接，从而获得EH-L-IgG4Fc-HV2的表达载体(pcDNAEH-L-IgG4Fc-HV2)，其双酶切鉴定结果如图8所示。

将IgG4Fc-L-EH的编码核酸序列上下游分别加上NheI和XhoI酶切位点，将经NheI和XhoI双酶切得到的编码核酸序列和经NheI和XhoI双酶切得到的pcDNA3.1表达载体连接，从而获得IgG4Fc-L-EH的表达载体(pcDNAIgG4Fc-L-EH)，其双酶切鉴定结果如图9所示。

将IgG4Fc-EH的编码核酸序列上下游分别加上NheI和XhoI酶切位点，将经NheI和XhoI双酶切得到的编码核酸序列和经NheI和XhoI双酶切得到的pcDNA3.1表达载体连接，从而获得IgG4Fc-EH的表达载体(pcDNAIgG4FcEH)，其双酶切鉴定结果如图10所示。

最终获得的各融合蛋白的氨基酸序列如表3所示。对获得的融合蛋白进行SDS-PAGE方法验证，EH-L-IgG1Fc的结果如图5所示，EH-L-IgG4Fc、EH-L-IgG4Fc-HV2、IgG4Fc-L-EH和IgG4Fc-EH结果如图6所示。

表3：各融合蛋白的氨基酸序列

融合蛋白	氨基酸序列
		EH-L-IgG1Fc	SEQ ID NO:7
EH-L-IgG4Fc	SEQ ID NO:9
		EH-L-IgG4Fc-HV2	SEQ ID NO:11
IgG4Fc-L-EH	SEQ ID NO:13
		IgG4Fc-EH	SEQ ID NO:15

1.2体外抗凝血活性的测定

进一步，通过体外凝块法检测各融合蛋白的抗凝血活性，具体步骤如下：

(1)各取30μl稀释的融合蛋白与1μl凝血因子Xa(NEB公司)混匀，37℃裂解6h；

(2)将裂解的融合蛋白做倍比稀释，取10μl不同稀释倍数的样品于EP管中，然后各加入20μl，8IU/mL凝血酶(中检院)，轻轻混匀；

(3)分别再往每个EP管内加入20μl，2.5％纤维蛋白原(中检院)，室温环境静置15min，然后轻弹EP管壁，观察EP管内纤维蛋白凝块形成的情况。

(4)等体积的去离子水替代融合蛋白裂解液和凝血酶溶液作为实验空白对照组；等体积的去离子水替代融合蛋白裂解液为实验阳性对照组；未裂解处理的融合蛋白溶液替代裂解处理的融合蛋白溶液作为裂解前对照组。其他条件不变，同法操作，分别观察各个对照组别的纤维蛋白凝块形成情况。

(5)抗凝血活性的计算：

由于融合蛋白的活性是通过其抗凝血酶活性反应的，因此，抗1比活凝血酶单位的融合蛋白，它的活性定义为1融合蛋白单位，记作1ATU/mg。当反应体系中，刚好没有凝块形成，说明融合蛋白和凝血酶的含量相等，刚好抑制溶液中全部凝血酶的活性，反应体系中加入的凝血酶单位和抗凝血酶单位相等。

融合蛋白的抗凝活性＝凝血酶活性/未出现凝块最低融合蛋白浓度＝(凝血酶活性单位×凝血酶体积)/(融合蛋白浓度÷稀释倍数×样品体积)＝16×无凝块最高稀释倍数(ATU/mg)。

体外凝块法的检测结果如表4所示。其中，未经FXa切割的融合蛋白，均没有抗凝功能，但经FXa裂解后的融合蛋白均释放出抗凝活性。通过计算得到各融合蛋白的抗凝血活性，其中EH-L-IgG4Fc、EH-IgG4Fc-HV2、IgG4Fc-EH的抗凝血活性均为256ATU/mg，EH-L-IgG1Fc、IgG4Fc-L-EH的抗凝血活性均为64ATU/mg，表明EH-L-IgG4Fc、EH-IgG4Fc-HV2、IgG4Fc-EH具有显著的抗凝血活性，并且显著优于EH-L-IgG1Fc、IgG4Fc-L-EH。这一结果凸显，EH-L-IgG4Fc、EH-IgG4Fc-HV2、IgG4Fc-EH不仅具有特异性抗凝血活性(即，只有在血栓部位特有的被凝血因子的作用下才显示抗凝血活性)，因而全身出血副作用明显降低，并且具有显著优于EH-L-IgG1Fc、IgG4Fc-L-EH的抗凝血活性，从而特别适用于预防和/或治疗血栓性疾病。

表4：各融合蛋白的抗凝血活性

注：“+”表示有凝块形成，“-”表示无凝块形成；空白对照：超纯水30μl+纤维蛋白原20μl；阳性对照：超纯水10μl+凝血酶20μl+纤维蛋白原20μl；未裂解对照：未裂解处理的融合蛋白10μl+凝血酶20μl+纤维蛋白原20μl。

实施例2:融合蛋白的血浆半衰期测定

2.1实验动物

Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重200-250g，购自于北京维通利华公司，在军事医学研究院实验动物房中饲养，给予实验动物相应的动物福利，并按照动物实验的3R原则开展实验。

2.2实验方法

将Wistar大鼠随机分为3组，每组6只，低、中、高剂量分别单次尾静脉注射IgG4Fc-EH(FcEH)(化学剂量分别为4.5、13.5、27mg/kg)。分别给药前和给药后0.5h、1h、2h、4h、12h、24h、48h、72h、96h、120h和144h大鼠眼眶静脉丛取血，3.8％的枸橼酸钠(国药集团化学试剂公司)溶液抗凝，分离血浆(转速3000r/min，离心15min)。利用CLIA法检测血浆中IgG4Fc-EH(FcEH)含量，具体步骤如下：

(1)取水蛭素化学发光免疫检测试剂盒(福瑞润康生物技术公司)；

(2)取IgG4Fc-EH(FcEH)标准品储备液，用空白血浆分别稀释至64、32、16、8、4、2μg/mL，再往化学发光包被板中加入标准品和待测样品10μl，再加入稀释液90μl，混匀震荡30s，37℃条件下，孵育40min，洗涤液反复洗7次，将板子甩干；

(3)往各孔中加入100μl酶结合物(山羊抗人IgG-Fc抗体，用HRP进行标记)，37℃条件下，孵育20min，洗涤液洗板7次，将板子甩干；

(4)往板中每个孔加入50μl化学发光底物，震荡1min，室温环境下，静置3min，将板放入光子计数仪中测量每孔中样品的光子数(底物加完后3-20min内测量最佳)。

(5)记录并保存数据。

(6)用微孔板发光分析仪(北京滨松光子技术公司)进行四参数运算进行非线性拟合，得到标准曲线。将样品检测的光子数代入标准曲线，计算出检测样品中IgG4Fc-EH(FcEH)的浓度，Prism 6软件作图，用方差分析和组间非配对t-检验进行统计学判断，比较数据之间的差异性。用WinNonlin 5.2.1软件的非房室模型计算IgG4Fc-EH(FcEH)的药代动力学参数。

2.3实验结果

用CLIA法检测融合蛋白IgG4Fc-EH(FcEH)的可靠浓度范围是2-64μg/mL，在此范围内标准品与光子计数的强度呈良好浓度依赖关系，最低定量限为2μg/mL。检测样品浓度超过检测范围，可以用空白血浆稀释后检测。标准曲线以血浆中的IgG4Fc-EH(FcEH)浓度为横坐标，测定的光子数为纵坐标，利用四参数运算进行非线性拟合，所得回归方程即为标准曲线。表5是化学发光免疫法测定大鼠血浆IgG4Fc-EH(FcEH)的标准曲线参数。

表5：标准曲线参数

注：标准曲线方程为y＝A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)

进一步，通过化学发光免疫法检测大鼠给药后不同采血时间点血浆中融合蛋白的含量，利用Prism软件绘制大鼠静脉注射IgG4Fc-EH(FcEH)后的平均药时曲线(图11)。通过WinNonlin软件进行计算，大鼠静脉注射4.5mg/kg、13.5mg/kg和27mg/kg融合蛋白IgG4Fc-EH(FcEH)后药代动力学参数，结果如表6所示。

表6：Wistar大鼠静脉注射融合蛋白后的药代动力学参数

以上体内药代动力学结果表明，低(4.5mg/kg)、中(13.5mg/kg)和高(27mg/kg)剂量的融合蛋白IgG4Fc-EH(FcEH)体内半衰期依次为33.9±8.4h、39.4±4.9h和53.9±7.5h，显著长于EH的半衰期1.3h。由此可见，与EH相比IgG4Fc-EH(FcEH)在体内的半衰期明显延长，可较长时间地在体内发挥抑制血栓形成的作用，同时由IgG4Fc-EH(FcEH)发挥抗凝活性需要凝血因子对其识别切割释放EH，因此IgG4Fc-EH(FcEH)半衰期的延长不会明显增加药物的出血副作用，为开发出安全、特异性和长效的新型抗栓药奠定基础。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京三有利和泽生物科技有限公司

<120> 一种长效抗凝血融合蛋白及其应用

<130> IDC170088

<150> CN201710550675.7

<151> 2017-07-07

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新蛭素（EH）氨基酸序列

<400> 1

Glu Pro Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu

1 5 10 15

Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile

20 25 30

Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr

35 40 45

Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu

50 55 60

Glu Tyr Leu Gln

65

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4-Fc氨基酸序列

<400> 2

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1-Fc氨基酸序列

<400> 3

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性接头

<400> 4

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 刚性接头

<400> 5

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 6

<211> 65

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 水蛭素（HV）氨基酸序列

<400> 6

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro

35 40 45

Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

50 55 60

Gln

65

<210> 7

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EH-L-IgG1Fc的氨基酸序列

<400> 7

Glu Pro Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu

1 5 10 15

Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile

20 25 30

Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr

35 40 45

Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu

50 55 60

Glu Tyr Leu Gln Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu

65 70 75 80

Ala Ala Ala Lys Ala Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

85 90 95

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

100 105 110

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

115 120 125

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

130 135 140

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

145 150 155 160

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

165 170 175

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

180 185 190

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

195 200 205

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

210 215 220

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

225 230 235 240

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

245 250 255

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

260 265 270

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

275 280 285

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

290 295 300

Ser Pro Gly Lys

305

<210> 8

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EH-L-IgG1Fc的编码核酸序列

<400> 8

atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc 60

gaacctcgta tcacgtacac tgactgcacc gaatctggtc agaacctgtg cctgtgtgaa 120

ggttctaacg tgtgtggtaa aggcaacaag tgcatcctgg gttccaacgg caaaggtaac 180

cagtgcgtta ccggcgaagg caccccgaaa ccagaaagcc acaataacgg cgatttcgaa 240

gaaattccgg aggagtatct gcaagccgaa gctgccgcaa aagaagctgc agcaaaagaa 300

gccgcagcaa aagcaacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 360

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 420

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 480

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 540

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 600

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 660

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 720

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 780

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 840

tccgacggcc ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 900

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 960

agcctctccc tgtctccggg taaa 984

<210> 9

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EH-L-IgG4Fc的氨基酸序列

<400> 9

Glu Pro Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu

1 5 10 15

Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile

20 25 30

Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr

35 40 45

Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu

50 55 60

Glu Tyr Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

85 90 95

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

100 105 110

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

115 120 125

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

130 135 140

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

145 150 155 160

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

165 170 175

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

180 185 190

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

195 200 205

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

210 215 220

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

225 230 235 240

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

245 250 255

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

260 265 270

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

275 280 285

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

305 310

<210> 10

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EH-L-IgG4Fc的编码核酸序列

<400> 10

gctagcgccg ccaccatgcc tctgctgctg ctgctgccac tgctgtgggc tggcgctctg 60

gccgagccaa ggatcaccta cacagactgc accgagagcg gccagaacct gtgcctgtgc 120

gagggctcta acgtgtgcgg caagggcaat aagtgtatcc tgggctccaa cggcaagggc 180

aatcagtgcg tgaccggcga gggcacacct aagccagaga gccacaacaa tggcgatttc 240

gaggagatcc ctgaggagta cctgcaggga tctggaggag gatccggagg aggaggctct 300

ggcggcggcg gctccgccga gtctaagtat ggcccccctt gcccaccctg tccagctcct 360

gaggctgctg gaggaccatc cgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga caccctgatg 420

atctctagga cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccagga ggatccagag 480

gtgcagttca actggtatgt ggatggcgtg gaggtgcaca atgctaagac aaagcccaga 540

gaggagcagt ttaatagcac ctaccgcgtg gtgtctgtgc tgacagtgct gcatcaggac 600

tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata agggcctgcc ttccagcatc 660

gagaagacca tctctaaggc taagggccag ccaagagagc cccaggtgta cacactgccc 720

ccttcccagg aggagatgac caagaaccag gtgagcctga catgtctggt gaagggcttc 780

tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag 840

accacaccac ccgtgctgga ctccgatggc agcttctttc tgtattccag gctgaccgtg 900

gataagagcc ggtggcagga gggcaacgtg ttttcttgtt ccgtgatgca tgaggccctg 960

cacaatcatt acacacagaa gagcctgtct ctgtccctgg gctgatgact cgag 1014

<210> 11

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> EH-L-IgG4Fc-HV2的氨基酸序列

<400> 11

Glu Pro Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu

1 5 10 15

Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile

20 25 30

Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr

35 40 45

Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu

50 55 60

Glu Tyr Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

85 90 95

Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

100 105 110

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

115 120 125

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

130 135 140

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

145 150 155 160

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

165 170 175

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

180 185 190

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

195 200 205

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

210 215 220

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

225 230 235 240

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

245 250 255

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

260 265 270

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

275 280 285

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

290 295 300

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr

305 310 315 320

Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly

325 330 335

Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys

340 345 350

Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp

355 360 365

Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

370 375

<210> 12

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EH-L-IgG4Fc-HV2的编码核酸序列

<400> 12

gctagcgccg ccaccatgcc cctgctgctg ctgctgcctc tgctgtgggc tggcgctctg 60

gccgagccca ggatcaccta cacagactgc accgagagcg gccagaacct gtgcctgtgc 120

gagggctcta acgtgtgcgg caagggcaat aagtgtatcc tgggctctaa cggcaagggc 180

aatcagtgcg tgaccggcga gggcacacct aagccagagt cccacaacaa tggcgatttc 240

gaggagatcc cagaggagta cctgcaggga tctggaggag gatccggagg aggaggatcc 300

ggaggcggcg gctccgccga gtctaagtat ggcccccctt gcccaccatg tccagctcct 360

gaggctgctg gaggaccatc cgtgttcctg tttcctccaa agcccaagga caccctgatg 420

atcagcagga cccccgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtctcagga ggatcctgag 480

gtgcagttca actggtatgt ggatggcgtg gaggtgcaca atgctaagac aaagccaaga 540

gaggagcagt ttaatagcac ctaccgcgtg gtgtctgtgc tgacagtgct gcatcaggac 600

tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgtccaata agggcctgcc ctccagcatc 660

gagaagacca tcagcaaggc taagggccag cctagagagc cacaggtgta cacactgccc 720

ccttcccagg aggagatgac caagaaccag gtgagcctga catgtctggt gaagggcttc 780

tatccttctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agccagagaa caattacaag 840

accacaccac ccgtgctgga ctccgatggc agcttctttc tgtattccag gctgaccgtg 900

gataagagcc ggtggcagga gggcaacgtg ttttcttgct ccgtgatgca cgaggccctg 960

cacaatcatt acacccagaa gagcctgtct ctgtccctgg gcatcaccta tacagactgt 1020

acagagtctg gtcaaaacct gtgcctgtgc gaaggctcca acgtgtgcgg caagggtaat 1080

aagtgtatcc tgggcagcaa tggcaagggt aatcagtgcg tgaccggaga gggaacacca 1140

aagccagagt ctcataacaa tggcgatttt gaggagatcc ccgaggagta cctgcagtga 1200

tgactcgag 1209

<210> 13

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4Fc-L-EH的氨基酸序列

<400> 13

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Glu Pro Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser

245 250 255

Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly

260 265 270

Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr

275 280 285

Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu

290 295 300

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

305 310

<210> 14

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4Fc-L-EH的编码核酸序列

<400> 14

gctagcgccg ccaccatgcc tctgctgctg ctgctgccac tgctgtgggc tggcgctctg 60

gccgagtcta agtacggacc accttgccca ccatgtcctg ctccagaggc tgctggagga 120

ccatccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc taggacccct 180

gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtcc caggaggatc cagaggtgca gttcaactgg 240

tatgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagacaaagc ccagagagga gcagtttaac 300

agcacctacc gcgtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcatc aggactggct gaacggcaag 360

gagtataagt gcaaggtgag caataagggc ctgccttcca gcatcgagaa gaccatctct 420

aaggctaagg gccagccaag agagccccag gtgtacacac tgccccctag ccaggaggag 480

atgaccaaga accaggtgtc tctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc atctgacatc 540

gccgtggagt gggagtccaa tggccagccc gagaacaatt acaagaccac accacccgtg 600

ctggacagcg atggctcttt ctttctgtat tccaggctga ccgtggataa gagccggtgg 660

caggagggca acgtgttttc ttgttccgtg atgcacgagg ctctgcacaa tcattacaca 720

cagaagagcc tgtctctgtc cctgggcgga tccggaggag gaagcggagg aggcggctct 780

ggcggcggcg gctccgagcc aaggatcacc tatacagact gcaccgagtc cggccagaat 840

ctgtgcctgt gcgagggcag caacgtgtgc ggcaagggca ataagtgtat cctgggctcc 900

aacggcaagg gcaatcagtg cgtgaccgga gagggaacac caaagcctga gagccataac 960

aatggcgatt tcgaggagat ccctgaggag tacctgcagt gatgactcga g 1011

<210> 15

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4Fc-EH的氨基酸序列

<400> 15

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Glu Pro Arg Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser

225 230 235 240

Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly

245 250 255

Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr

260 265 270

Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu

275 280 285

Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

290 295

<210> 16

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4Fc-EH的编码核酸序列

<400> 16

gctagcgccg ccaccatgcc tctgctgctg ctgctgccac tgctgtgggc tggcgctctg 60

gccgagagca agtacggacc accttgccca ccatgtcctg ctccagaggc tgctggagga 120

ccatccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatcag caggacccct 180

gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtct caggaggatc cagaggtgca gttcaactgg 240

tatgtggatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagacaaagc ccagagagga gcagtttaac 300

tccacctacc gcgtggtgag cgtgctgaca gtgctgcatc aggactggct gaacggcaag 360

gagtataagt gcaaggtgtc caataagggc ctgccttcca gcatcgagaa gaccatcagc 420

aaggctaagg gccagccaag agagccccag gtgtacacac tgcccccttc ccaggaggag 480

atgaccaaga accaggtgag cctgacatgt ctggtgaagg gcttctatcc aagcgacatc 540

gccgtggagt gggagtctaa tggccagccc gagaacaatt acaagaccac accacccgtg 600

ctggacagcg atggctcttt ctttctgtat tctaggctga ccgtggataa gtcccggtgg 660

caggagggca acgtgttttc ttgctccgtg atgcacgagg ctctgcacaa tcattacacc 720

cagaagagcc tgtctctgtc cctgggcgag ccaaggatca cctatacaga ctgtacagag 780

tctggccaga atctgtgcct gtgcgagggc tccaacgtgt gcggcaaggg caataagtgt 840

atcctgggct ctaacggcaa gggcaatcag tgcgtgaccg gagagggaac accaaagcct 900

gagtcccata acaatggcga tttcgaggag atccctgagg agtacctgca gtgatgactc 960

gag 963

Claims

1.一种融合蛋白，其包含：

(b)人IgG4的Fc结构域或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸的置换(例如，保守置换)，且基本保留了其所源自的序列的生物学功能；

其中，所述新蛭素或其变体直接连接至所述人IgG4的Fc结构域或其变体的C端，或者，所述新蛭素或其变体通过接头(例如柔性肽接头或刚性肽接头)连接至所述人IgG4的Fc结构域或其变体的N端；

优选地，所述新蛭素具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述人IgG4的Fc结构域具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述新蛭素或其变体直接连接至所述人IgG4的Fc结构域或其变体的C端；

优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述新蛭素或其变体通过所述接头连接至所述人IgG4的Fc结构域或其变体的N端；

优选地，所述接头是柔性肽接头；

优选地，所述柔性肽接头为由一个或多个(例如，1-20个，1-18个，或1-16个)甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)组成的氨基酸序列；优选地，所述柔性肽接头包含如下所示的氨基酸序列或由其组成：(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1；优选地，所述柔性肽接头具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

4.权利要求3所述的融合蛋白，其还包含另外的抗凝血蛋白，所述另外的抗凝血蛋白任选地通过接头连接至所述人IgG4的Fc结构域或其变体的C端；

优选地，所述另外的抗凝血蛋白选自新蛭素、水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒、以及它们的变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸的置换(例如，保守置换)，且基本保留了其所源自的序列的生物学功能；

优选地，所述另外的抗凝血蛋白是水蛭素或其变体，并且所述水蛭素或其变体直接连接至所述人IgG4的Fc结构域或其变体的C端；优选地，所述水蛭素具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

5.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。

6.一种载体，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子。

7.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的分离的核酸分子或权利要求6所述的载体。

8.制备权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述融合蛋白。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的分离的核酸分子、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；

优选地，所述药物组合物包含权利要求1-4任一项所述的融合蛋白。

10.权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的分离的核酸分子、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞用于制备在受试者中预防和/或治疗血栓性疾病的药物的用途；

优选地，所述血栓性疾病选自肺栓塞、心肌梗死、不稳定型心绞痛、动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、缺血性卒中或肢体缺血。