KR101860572B1 - Ｆｇｆ２１ 돌연변이체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 및 그와 같은 핵산, 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 대사 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

ＦＧＦ２１ 돌연변이체 및 이의 용도{FGF21 MUTANTS AND USES THEREOF}
본원은 미국 가출원 No. 61/175,736 (2009년 5월 5일 출원) 및 미국 가출원 No. 61/285,118 (2009년 12월 9일 출원)의 우선권을 주장하고, 이들 모두는 본원에 참고로 통합된다.
본 발명은 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 및 그와 같은 핵산, 폴리펩타이드, 또는 약제학적 조성물을 사용하여 대사 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
FGF21은 FGF19, FGF21 및 FGF23을 포함하는 섬유모세포 성장 인자(FGF)의 서브패밀리에 속하는 분비형 폴리펩타이드이다 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 563-69). FGF21은 헤파린 비의존성이고 글루코스, 지질 및 에너지 대사의 조절에서 호르몬으로서 기능한다는 점에서 비정형적 FGF이다.
FGF21은 간 분비형 인자로서 간 cDNA 라이브러리로부터 단리되었다. 이것은 간 및 췌장에서 고도로 발현되고, 간에서 주로 발현되는 FGF 패밀리의 유일한 구성원이다. FGF21을 과다발현하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스는 느린 성장 속도, 낮은 혈장 글루코스 및 트리글리세라이드 수준의 대사 표현형, 및 노화 연관 2형 당뇨병, 소도 과형성 및 비만의 부재를 보인다. 설치류 및 영장류 모델에서 재조합 FGF21 단백질의 약물학적 투여는 표준화 수준의 혈장 글루코스, 감소된 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수준, 및 개선된 글루코스 내성 및 인슐린 감수성을 생성시킨다. 또한, FGF21은 에너지 소비, 물리적 활성 및 대사율을 증가시킴으로써 체중 및 체지방을 감소시킨다. 실험 연구는 인간에서 2형 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 및 다른 대사 병태 또는 질환의 치료를 위한 FGF21의 약물학적 투여에 대한 기반을 제공한다.
인간 FGF21은 생체내 반감기가 짧다. 마우스에서, 인간 FGF21의 반감기는 1 내지 2시간이고, 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이에서 반감기는 2.5 내지 3시간이다. 2형 당뇨병의 치료에서 치료제로서 사용하기 위해 FGF21 단백질을 개발하는데 있어서, 반감기 증가가 바람직할 것이다. 반감기가 향상된 FGF21 단백질은 단백질을 투여하는 환자에게 덜 빈번한 투약을 허용할 것이다. 그와 같은 단백질을 본원에서 설명한다.
발명의 요약
서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고, (a) 위치 180에서의 적어도 하나의 아미노산 치환; 및 (b) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환: (i) 위치 171에서의 치환; 및 (ii) 위치 98에서의 치환; 및 (c) 이의 조합을 추가로 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 개시한다.
하나의 구현예에서, 단리된 폴리펩타이드는 위치 98에서의 치환 및 위치 180에서의 치환을 포함하고, 여기서, (a) 위치 98에서의 치환은 아르기닌, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 리신, 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및 (b) 위치 180에서의 치환은 글리신, 프롤린, 세린 또는 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; (c) 이의 조합이다. 하나의 구현예에서, 위치 98에서의 잔기는 아르기닌이고, 위치 180에서의 잔기는 글루탐산이다. 이종 아미노산 서열에 융합된 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 또한 제공한다. 하나의 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 Fc 도메인 또는 이의 단편이고 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 링커를 통해 Fc 도메인에 융합되고, 또 다른 구현예에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 31)을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 47을 포함한다. 융합 폴리펩타이드 중 2개 이상을 포함하는 다량체를 또한 개시한다. 상기 단리된 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 제형 제제, 예컨대 히드로겔을 포함하는 약제학적 조성물을 또한 개시한다. 다른 양태에서, 대사 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 하나의 구현예에서, 이는 대사 장애의 치료가 필요한 인간 환자에게 본원에 제공된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병이고, 다른 구현예에서, 대사 장애는 비만증이다. 상기 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 또한 제공하고, 하나의 구현예에서, 핵산은 서열번호: 46을 포함한다. 핵산은 벡터 내에 존재할 수 있고, 이 벡터 자체는 숙주세포 내에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 하기를 포함한다: (a) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음); (b) 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음); 또는 (c) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 및 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음). 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리머, 예컨대 PEG에 공유결합된다.
다른 구현예에서, 단리된 폴리펩타이드는 위치 171에서의 치환 및 위치 180에서의 치환을 포함하고, 여기서, (a) 위치 180에서의 치환은 글리신, 프롤린, 세린 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 위치 171에서의 치환은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 세린, 트레오닌, 트립토판, 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; (c) 이의 조합이다. 하나의 구현예에서, 위치 171에서의 잔기는 글리신이고 위치 180에서의 잔기는 글루탐산이다. 이종 아미노산 서열에 융합된 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 또한 제공한다. 하나의 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 Fc 도메인 또는 이의 단편이고 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 링커를 통해 Fc 도메인에 융합되고, 또 다른 구현예에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 31)을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 47을 포함한다. 융합 폴리펩타이드 중 2개 이상을 포함하는 다량체를 또한 제공한다. 상기 단리된 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 제형 제제, 예컨대 히드로겔을 포함하는 약제학적 조성물을 또한 개시한다. 다른 양태에서는, 대사 장애의 치료 방법을 제공하고, 하나의 구현예에서, 이는 대사 장애의 치료가 필요한 인간 환자에게 본원에 제공된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병이고, 또 다른 구현예에서, 대사 장애는 비만증이다. 상기 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 또한 제공하고, 하나의 구현예에서, 핵산은 서열번호: 46을 포함한다. 핵산은 벡터 내에 존재할 수 있고, 이 벡터 자체는 숙주세포 내에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 하기를 포함한다: (a) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음); (b) 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음); 또는 (c) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 및 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음). 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리머, 예컨대 PEG에 공유결합된다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 4의 위치 98에서의 치환, 위치 171에서의 치환 및 위치 180에서의 치환을 포함하고, 여기서: (a) 위치 171에서의 치환은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 세린, 트레오닌, 트립토판, 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; (b) 위치 98에서의 치환은 아르기닌, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 리신, 또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및 (c) 위치 180에서의 치환은 글리신, 프롤린, 세린 또는 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 이의 조합이다. 추가 구현예에서, 위치 98에서의 잔기는 아르기닌이고, 위치 171에서의 잔기는 글리신이고, 위치 180에서의 잔기는 글루탐산이다. 이종 아미노산 서열에 융합된 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 또한 제공한다. 하나의 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 Fc 도메인 또는 이의 단편이고, 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 링커를 통해 Fc 도메인에 융합되고, 또 다른 구현예에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 31)을 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 47을 포함한다. 융합 폴리펩타이드 중 2개 이상을 포함하는 다량체를 또한 개시한다. 상기 단리된 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 제형 제제, 예컨대 히드로겔을 포함하는 약제학적 조성물을 또한 개시한다. 다른 양태에서는, 대사 장애의 치료 방법을 제공하고, 하나의 구현예에서, 이는 대사 장애의 치료가 필요한 인간 환자에게 본원에 제공된 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 대사 장애는 당뇨병이고, 또 다른 구현예에서, 대사 장애는 비만증이다. 상기 단리된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 또한 제공하고, 하나의 구현예에서, 핵산은 서열번호: 46을 포함한다. 핵산은 벡터 내에 존재할 수 있고, 이 벡터 자체는 숙주세포 내에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 하기를 포함한다: (a) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음); (b) 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음); 또는 (c) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 및 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단 (여기서, 상기 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음). 또 다른 구현예에서, 폴리펩타이드는 하나 이상의 폴리머, 예컨대 PEG에 공유결합된다.
본 발명의 특정 구현예는 어떤 구현예의 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명확해질 것이다.
도 1a-1b는 FGF21 말단절단 돌연변이체 7-181 및 8-181 (도 1a) 및 FGF21 말단절단 돌연변이체 1-172, 1-171, 1-169, 및 1-164 (도 1b)에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 도시한 것이고; 각각의 패널은 인간 FGF21 대조군에 대해 얻어진 결과를 도시한 것이다.
도 2는 인간 FGF21 대조군 및 FGF21 말단절단 돌연변이체 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181, 및 1-149에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 3은 PBS (진한 막대), 인간 FGF21 대조군 (빈 막대) 또는 FGF21 말단절단 돌연변이체 8-181 (회색 막대) 및 9-181 (점묘 (stippled) 막대)를 주사한 마우스에서 관찰된 혈당 수준을 도시한 것이다.
도 4는 PBS (진한 원), Fc-(L15)-FGF21 대조군 (WT) (빈 원) 또는 아미노산 잔기 5-181 (진한 삼각형) 또는 7-181 (빈 삼각형)을 포함하는 말단절단된 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질을 주사한 마우스에서 측정한 혈당 수준의 변화 비율을 도시한 것이다.
도 5는 PBS (진한 원), FGF21-Fc 대조군 (WT) (빈 원), 잔기 1-175를 포함하는 말단절단된 FGF21-Fc 융합 단백질 (진한 삼각형) 또는 아미노산 잔기 1-171을 포함하는 말단절단된 Fc-(L15)-FGF21 단백질 (빈 삼각형)을 주사한 마우스에서 측정한 혈당 수준의 변화 비율을 도시한 것이다.
도 6a-6d는 인간 Fc-(G5)-FGF21 (서열번호: 107) 대조군 샘플 (도 6a) 및 주사 후 6시간 (샘플 D6; 도 6b), 24시간 (샘플 D24; 도 6c), 및 48시간 (샘플 D48; 도 6d)에 마우스로부터 채취한 Fc-(G5)-FGF21의 샘플의 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS) 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 7a-7d는 포유동물 유래 인간 FGF21-(G3)-Fc (서열번호: 105) 대조군 샘플 (도 7a) 및 주사 후 6시간 (샘플 E6; 도 7b), 24시간 (샘플 E24; 도 7c), 및 48시간 (샘플 E48; 도 7d)에 마우스로부터 채취한 FGF21-(G3)-Fc의 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8a-8d는 Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) 대조군 샘플 (도 8a) 및 주사 후 6시간 (도 8b), 24시간 (도 8c), 및 48시간 (도 8d)에 마우스로부터 채취한 Fc-(L15)-FGF21의 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 9a-9d는 FGF21-(L15)-Fc (서열번호: 41) 대조군 샘플 (도 9a) 및 주사 후 6시간 (도 9b), 24시간 (도 9c), 및 48시간 (도 9d)에 마우스로부터 채취한 FGF21-(L15)-Fc의 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 10a-10b는 마우스에 주사된 Fc-(L15)-FGF21 (도 10a, 서열번호: 49) 및 FGF21-(L15)-Fc (도 10b, 서열번호: 41) 융합 단백질의 LC-MS 분석에 의해 확인된 절단 부위를 보여준다.
도 11는 PBS (진한 막대), Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) (빈 막대), 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (회색 막대), Fc-(L15)-FGF21 P171A (서열번호: 53) (점묘 막대), Fc-(L15)-FGF21 S172L (서열번호: 55) (빈 대각선으로 그물선 표시된(crosshatched) 막대), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (서열번호: 59) (진한 수형으로 그물선 표시된 막대), 또는 Fc-(L15)-FGF21 G151A (서열번호: 61) (빈 대각선으로 그물선 표시된 막대)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 도시한 것이다.
도 12는 PBS (진한 원), Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) (빈 원), 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (진한 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 P171A (서열번호: 53) (빈 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 S172L (서열번호: 55) (진한 다이아몬드), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (서열번호: 59) (빈 다이아몬드), 또는 Fc-(L15)-FGF21 G151A (서열번호: 61) (진한 정사각형)을 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준의 변화 퍼센트를 도시한 것이다.
도 13은 PBS (진한 막대), Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) (빈 막대), 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V) (회색 막대), Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 대각선으로 그물선 표시된 막대), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A) (서열번호: 63) (회색 대각선으로그물선 표시된 막대), 또는 Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (서열번호: 67) (빈 대각선으로 그물선 표시된 막대)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 도시한 것이다.
도 14는 PBS (진한 정사각형), Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) (빈 정사각형), 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V) (서열번호: 65) (진한 역삼각형), Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 역삼각형), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A) (서열번호: 63) (진한 원), 또는 Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (서열번호: 67) (빈 원)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준의 변화 퍼센트를 도시한 것이다.
도 15는 PBS (진한 막대) 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 막대), Fc-(L15)-FGF21 G170A (서열번호: 69) (회색 막대), Fc-(L15)-FGF21 G170C (서열번호: 71) (빈 그물선 표시된 막대), Fc-(L15)-FGF21 G170D (서열번호: 73) (회색 및 백색 막대), Fc-(L15)-FGF21 G170N (서열번호: 75) (진한 그물선 표시된 막대), 또는 Fc-(L15)-FGF21 G170S (서열번호: 77) (빈 그물선 표시된 막대)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 도시한 것이다.
도 16은 PBS (진한 원) 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 원), Fc-(L15)-FGF21 G170A (서열번호: 69) (진한 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 G170C (서열번호: 71) (빈 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 G170D (서열번호: 73) (진한 다이아몬드), Fc-(L15)-FGF21 G170N (서열번호: 75) (빈 다이아몬드), 또는 Fc-(L15)-FGF21 G170S (서열번호: 77) (진한 역삼각형)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준의 변화 퍼센트를 도시한 것이다.
도 17은 PBS (진한 막대) 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 막대), Fc-(L15)-FGF21 P171E (서열번호: 79) (회색 막대), Fc-(L15)-FGF21 P171H (서열번호: 81) (진한 그물선 표시된 막대), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (서열번호: 83) (빈 그물선 표시된 막대), Fc-(L15)-FGF21 P171T (서열번호: 85) (점묘 막대), 또는 Fc-(L15)-FGF21 P171Y (서열번호: 87) (회색 그물선 표시된 막대)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 도시한 것이다.
도 18은 PBS (진한 원) 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 원), Fc-(L15)-FGF21 P171E (서열번호: 79) (진한 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 P171H (서열번호: 81) (빈 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (서열번호: 83) (진한 다이아몬드), Fc-(L15)-FGF21 P171T (서열번호: 85) (빈 다이아몬드), 또는 Fc-(L15)-FGF21 P171Y (서열번호: 87) (진한 정사각형)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준의 변화 퍼센트를 도시한 것이다.
도 19a-19d는 Fc-(L15)-FGF21 대조군 샘플 (도 19a, 서열번호: 49) 및 주사 후 6시간 (도 19b), 24시간 (도 19c), 및 48시간 (도 19d)에 마우스로부터 채취한 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 20a-20d는 Fc-(L15)-FGF21 G170E 대조군 샘플 (도 20a, 서열번호: 51) 및 주사 후 6시간 (도 20b), 24시간 (도 20c), 및 48시간 (도 20d)에 마우스로부터 채취한 Fc-(L15)-FGF21 G170E의 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 21a-21d는 Fc-(L15)-FGF21 P171A 대조군 샘플 (도 21a, 서열번호: 53) 및 주사 후 6시간 (도 21b), 24 (도 21c), 및 48시간 (도 21d)에 마우스로부터 채취한 Fc-(L15)-FGF21 P171A의 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 22a-22d는 Fc-(L15)-FGF21 S172L 대조군 샘플 (도 22a, 서열번호: 55) 및 주사 후 6시간 (도 22b), 24시간 (도 22c), 및 48시간 (도 22d)에 마우스로부터 채취한 Fc-(L15)-FGF21 S172L의 샘플의 LC-MS 분석 결과를 도시한 것이다.
도 23a-23d는 마우스에 주사된 Fc-(L15)-FGF21 (도 23a, 서열번호: 49), Fc-(L15)-FGF21 G170E (도 23b, 서열번호: 51), Fc-(L15)-FGF21 P171A (도 23c, 서열번호: 53), 및 Fc-(L15)-FGF21 S172L (도 23d, 서열번호: 55) 융합 단백질의 의 LC-MS 분석에 의해 확인된 절단 부위를 보여준다.
도 24a-24c는 FGF21 돌연변이체 FGF21 L99R (서열번호: 109), FGF21 L99D (서열번호: 111), 및 FGF21 A111T (서열번호: 113) (도 24a); FGF21 돌연변이체 FGF21 A129D (서열번호: 115), FGF21 A129Q (서열번호: 117), 및 FGF21 A134K (서열번호: 119) (도 24b); 및 FGF21 돌연변이체 FGF21 A134Y (서열번호: 121), FGF21 A134E (서열번호: 123), 및 FGF21 A129K (서열번호: 125) (도 24c)에 대해 수행된 ELK-루시페라제 활성 검정의 결과를 보여준다; 각각의 패널은 인간 FGF21 대조군에 대해 얻은 결과는 보여준다.
도 25a-25d는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 P171G (서열번호: 89), Fc-(L15)-FGF21 P171S (서열번호: 91), 및 Fc-(L15)-FGF21 P171T (서열번호: 85) (도 25a); Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 P171Y (서열번호: 87), Fc-(L15)-FGF21 P171W (서열번호: 93), 및 Fc-(L15)-FGF21 P171C (서열번호: 95) (도 25b); Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (서열번호: 97), 및 FGF21 A45K (서열번호: 99) (도 25c); 및 Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49), Fc-(L15)-FGF21 P171E (서열번호: 79), 및 Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (서열번호: 97) (도 25d)에 대해 수행된 ELK-루시페라제 활성 검정의 결과를 보여준다; 각각의 패널은 인간 FGF21 대조군에 대해 얻은 결과는 보여준다.
도 26a-b는 야생형 성숙 FGF21 및 다양한 FGF21 돌연변이체에 대한 시간의 함수로서 응집을 도시한 것이고; 도 26a는 65 mg/mL 단백질을 4℃에서 1, 2, 및 4일 동안 인큐베이팅한 후 FGF21 대조군 (WT, 진한 다이아몬드) 및 FGF21 A45K (진한 원)에 대한 응집 비율의 변화를 도시한 것인 반면, 도 26b는 65 mg/mL 단백질을 4℃에서 1, 6, 및 10일 동안 인큐베이팅한 후 FGF21 대조군 (WT) (서열번호:4) 및 FGF21 P78C (서열번호:127), FGF21 P78R (서열번호:129), FGF21 L86T (서열번호:131), FGF21 L86C (서열번호:133), FGF21 L98C (서열번호:135), FGF21 L98R (서열번호:137), FGF21 A111T (서열번호:113), FGF21 A129D (서열번호:115), FGF21 A129Q (서열번호:117), FGF21 A129K (서열번호:125), FGF21 A134K (서열번호:119), FGF21 A134Y (서열번호:121), 및 FGF21 A134E (서열번호:123) (모두 플롯 (plot) 상에 표지됨) 에 대한 응집 비율의 변화를 도시한 것이다
도 27은 인간 FGF21 대조군 및 FGF21 돌연변이체 FGF21 A45K (서열번호: 99), FGF21 L52T (서열번호: 139), 및 FGF21 L58E (서열번호: 141) 에 대해 수행된 ELK-루시페라제 활성 분석의 결과를 도시한 것이다.
도 28a는 4℃에서 1, 4, 및 8일 동안 인큐베이팅한 후 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21(6-181, G170E) (서열번호: 101) (진한 다이아몬드), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (서열번호: 97) (빈 정사각형), Fc-(L15)-FGF21 P171E (서열번호: 79) (진한 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 P171A (서열번호: 53) (X표), Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51) (빈 삼각형), 및 FGF21 대조군 (진한 원)에 대한 응집 수준의 변화를 보여주는 플롯이고, 도 28b는 또한 인큐베이션의 결과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 29는 PBS (비히클) (진한 원) 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21(A45K, G170E) (서열번호: 97) (빈 원), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, P171G) (서열번호: 103) (진한 삼각형), 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) (빈 삼각형)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 도시한 것이다.
도 30은 인간 FGF21 (진한 원, 진한 선), Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) (빈 원, 진한 선) 및 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) (진한 삼각형, 점선)에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 보여주는 플롯이다.
도 31은 FGF21 (서열번호: 4) (진한 원, 진한 선), Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) (빈 원, 진한 선) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) (진한 삼각형, 점선) 에 대해 실온 (도 31a) 및 4℃ (도 31b)에서 9일 후에 관찰된 고분자량 응집물 퍼센트를 보여주는 플롯이다.
도 32는 168시간 기간에 걸쳐 다양한 시점에 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 의 관찰된 변화를 보여주는 일련의 MALDI 질량 분광법 트레이스 (trace)이다.
도 33은 각각의 PBS 비히클 대조군 (빈 원), 야생형 성숙 FGF21 (진한 정사각형), 및 FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) (진한 역삼각형); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) (서열번호: 143) (빈 다이아몬드), 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (서열번호: 145) (진한 원) 에 대한 ob/ob 마우스에서 혈당 수준의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이다.
도 34는 각각의 PBS 비히클 대조군 (진한 원), 및 FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) (진한 삼각형); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G) (서열번호: 147) (빈 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (서열번호: 145) (진한 다이아몬드) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) (서열번호: 143) (빈 다이아몬드)에 대한 ob/ob 마우스에서 혈당 수준의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이다.
도 35는 각각의 PBS 비히클 대조군 (빈 원), 및 FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) (진한 정사각형); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179S) (서열번호: 149) (빈 삼각형), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A) (서열번호: 153) (진한 역삼각형), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180S) (서열번호: 155) (빈 다이아몬드) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180G) (서열번호: 157) (진한 원)에 대한 ob/ob 마우스에서 혈당 수준의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이다.
도 36은 각각의 PBS 비히클 대조군 (진한 원), 및 FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (서열번호: 43) (빈 정사각형); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F) (서열번호: 151) (진한 삼각형), 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57) (빈 다이아몬드)에 대한 ob/ob 마우스에서 혈당 수준의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이다.
도 37은 붉은털 (Rhesus) 원숭이에서 수행한 6-주 용량 증가 연구에 대한 연구 설계를 그래프로 도시한 표이다. 도면에서, 음영진 기호는 공복 상태에 채취한 혈액을 나타내고, 점묘 기호는 식후 상태에 채취한 혈액을 나타낸다.
도 38a-d는 붉은털 원숭이를 OGTT 프로파일, OGTT AUC 및 체중에 무작위로 배정하는 방법을 도시하는 일련의 플롯이고; 도 38a는 화합물 또는 비히클을 각각의 군에 배정하기 전에 OGTT1에서 기준선 글루코스 수준을 도시한 것이고, 진한 정사각형은 A군에 상응하고, 진한 원, 진한 선은 B군에 상응하고, 빈 원, 대시선(dashed line)은 C군에 상응하고; 도 38b는 화합물 또는 비히클을 각각의 군에 배정하기 전에 OGTT2에서 기준선 글루코스 수준을 도시한 것이고, 진한 정사각형은 A군에 상응하고, 진한 원, 진한 선은 B군에 상응하고, 빈 원, 진한 선은 C군에 상응하고; 도 38c는 AUC의 면에서 나타낸 OGTT 1 및 2에 대한 기준선 글루코스 수준을 보여주고, 점묘 막대는 A군에 상응하고, 음영진 막대는 B군에 상응하고, 빈 막대는 C군에 상응하고; 도 38d는 기준선 체중을 보여주고, 점묘 막대는 A군에 상응하고, 음영진 막대는 B군에 상응하고, 빈 막대는 C군에 상응한다.
도 39는 붉은털 원숭이에서 비히클, FGF21 (서열번호: 4) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (서열번호: 43)의 기준선에 대한 체중의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이고; 음영진 막대 1 및 2는 저용량에서 제1 및 2주에 상응하고, 빈 막대 3 및 4는 중간 용량에서 제3 및 4주에 상응하고, 진한 막대 5 및 6은 고용량에서 제5 및 6주에 상응하고, 점묘 막대 7, 8 및 9는 약효세척 (washout) 기간 동안 제7-9주에 상응한다.
도 40은 붉은털 원숭이에서 공복 인슐린 수준에 대한 비히클, FGF21 (서열번호: 4) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)의 기준선에 비교한 공복 인슐린 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이고; 음영진 막대 1 및 2는 저용량에서 제1 및 2주에 상응하고, 빈 막대 3 및 4는 중간 용량에서 제3 및 4주에 상응하고, 진한 막대 5 및 6은 고용량에서 제5 및 6주에 상응하고, 점묘 막대 7 및 8은 약효세척 (washout) 기간 동안 제7 및 8주에 상응한다.
도 41은 연구의 제5 및 6주 동안 얻은 붉은털 원숭이의 식후 인슐린 수준에 대한 고용량으로 제공된 비히클, FGF21 (서열번호: 4) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)의 효과를 보여주는 플롯이고; 진한 막대는 제5주에 상응하고, 음영진 막대는 제6주에 상응한다.
도 42는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 를 사용한 2주 고용량 처리의 끝에 수행된 OGTT5의 글루코스 프로파일을 보여주는 플롯이고; 진한 원, 진한 선은 비히클에 상응하고, 빈 정사각형, 점선은 FGF21에 상응하고, 진한 삼각형, 진한 선은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)에 상응한다.
도 43은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 를 사용한 2주 고용량 처리의 끝에 수행된 OGTT5의 인슐린 프로파일을 보여주는 플롯이고; 진한 원, 진한 원, 진한 선은 비히클에 상응하고, 빈 정사각형, 점선은 FGF21에 상응하고 진한 삼각형, 진한 선은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)에 상응한다.
도 44는 붉은털 원숭이의 각각의 용량 기간 (저용량, 중간 용량 및 고용량)의 끝에 결정한 글루코스 OGTT AUC3-5의 기준선으로부터의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이고; 빈 막대는 OGTT3 동안 글루코스 측정치로부터 계산한 AUC3에 상응하고, 진한 막대는 OGTT4 동안 글루코스 측정치로부터 계산한 AUC4에 상응하고, 음영진 막대는 OGTT5 동안 글루코스 측정치로부터 계산한 AUC5에 상응한다.
도 45는 각각의 군의 붉은털 원숭이로부터 공복 혈장 트리글리세라이드 수준의 기준선으로부터의 변화 퍼센트에 대한 비히클, FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 의 효과를 보여주는 그래프이고; 음영진 막대 1 및 2는 저용량에서 제1 및 2주에 상응하고, 빈 막대 3 및 4는 중간 용량에서 제3 및 4주에 상응하고, 진한 막대 5 및 6은 고용량에서 제5 및 6주에 상응하고, 점묘 막대 7, 8 및 9는 약효세척 기간 동안 제7-9주에 상응한다.
도 46은 고용량에서 비히클, FGF21 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)을 사용한 처리의 제5 및 6주 동안 측정될 때, 각각의 군의 붉은털 원숭이로부터 식후 혈당 수준을 보여주는 그래프이고; 음영진 막대는 제5주에 상응하고, 진한 막대는 제6주에 상응한다
도 47은 투여전 및 5, 12, 19, 및 26일에 측정한 개별 원숭이에서의 인간 FGF21 수준을 보여주는 플롯이고, 샘플은 각각의 주사의 약 21시간 후에 얻는다.
도 48은 투여전 및 5, 12, 19, 및 26일에 측정한 개별 원숭이 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 수준을 보여주는 플롯이고, 샘플은 각각의 주사의 약 5일 후에 얻는다.
도 49는 각각의 저용량, 중간 용량 및 고용량 후에 수행된 3개의 OGTT로부터 측정된 FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 수준의 평균 농도를 보여주는 플롯이고; 음영진 막대는 저용량에서 OGTT3에 상응하고, 진한 막대는 중간 용량에서 OGTT4에 상응하고, 빈 막대는 고용량에서 OGTT5에 상응한다.
도 50은 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) 융합 단백질 (서열번호: 47)의 아미노산 서열이고; IgG1 Fc 잔기 (서열번호: 11)는 굵은 글자이고, (G4S)3 링커 (서열번호: 31)는 이탤릭체이고, FGF21 서열 (서열번호: 39)에서의 점 돌연변이는 굵은 글씨이고, 밑줄로 되어 있다.
도 51은 Erk-루시페라제 검정에서 시험 화합물의 용량 반응을 보여주는 플롯이고; Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57), 야생형 FGF21, 및 야생형 FGF21와의 Fc 융합이 시험되었다.
도 52는 인간 (우측) 및 cyno β-Klotho (좌측)에 대한 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)의 비아코어(Biacore) 용액 평형 결합 검정으로부터의 결과를 보여주는 플롯이다.
도 53은 단일 주사 후 db/db 마우스에서 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 용량 반응을 보여주는 한 쌍의 플롯이고; 도 53a는 비히클 또는 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) 주사 후 다양한 시점에서 db/db 마우스에서 혈당 수준을 보여주고, 반면 도 53b는 db/db 마우스에의 단일 주사 후 체중에 대한 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)의 효과를 보여준다.
도 54는 DIO 마우스에서 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)의 복용 빈도 연구를 그래프로 제공하는 도식이다.
도 55는 상이한 복용 빈도에서 비히클, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47) 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)로 처리된 마우스의 GTT 프로파일을 보여주는 플롯이다.
도 56은 상이한 복용 빈도에서 비히클, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47) 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43)로 처리된 마우스에서 기준선 (제0일)로부터 체중의 변화를 보여주는 플롯이다.
도 57은 FGF21 (L98R, P171G)) (서열번호: 37) FGF21 돌연변이체를 포함하는 히드로겔의 시험관내 연구의 결과는 보여주는 플롯이다.
도 58은 다양한 히드로겔 제형을 복용한 8주령 db/db 마우스의 혈당 수준에 대한 효과를 보여주는 플롯이다.
도 59는 다양한 히드로겔 제형을 복용한 8주령 db/db 마우스의 혈당 수준에 대한 효과를 보여주는 플롯이다.
도 60은 다양한 히드로겔 제형을 복용한 8주령 db/B6 마우스의 혈당 수준에 대한 효과를 보여주는 플롯이고; 진한 원은 히드로겔 대조군을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 정사각형은 10 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 37)을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 삼각형은 30 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G)을 복용한 마우스를 나타내고, 역삼각형은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57) 단독을 복용한 마우스를 나타낸다.
도 61은 다양한 히드로겔 제형을 복용한 8주령 db/B6 마우스의 혈당 수준에서 변화 퍼센트를 나타내는 플롯이고; 진한 원은 히드로겔 대조군을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 정사각형은 10 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 37)을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 삼각형은 30 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G)을 복용한 마우스를 나타내고, 역삼각형은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57) 단독을 복용한 마우스를 나타낸다.
도 62는 다양한 히드로겔 제형을 복용한 8주령 db/B6 마우스의 체중에 대한 효과를 보여주는 플롯이고; 진한 원은 히드로겔 대조군을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 정사각형은 10 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 37)을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 삼각형은 30 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G)을 복용한 마우스를 나타내고, 역삼각형은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57) 단독을 복용한 마우스를 나타낸다.
도 63은 다양한 히드로겔 제형을 복용한 8주령 db/B6 마우스의 체중에서의 변화 퍼센트를 보여주는 플롯이고; 진한 원은 히드로겔 대조군을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 정사각형은 10 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 37)을 복용한 마우스를 나타내고, 진한 삼각형은 30 mg/kg에서 히드로겔 중 FGF21 (L98R, P171G)을 복용한 마우스를 나타내고, 역삼각형은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57) 단독을 복용한 마우스를 나타낸다.
도 64는 당내인성 장애 (IGT)를 갖는 사이노몰구스 원숭이에서 수행된 9주 복용 상승 연구에 대한 연구 설계를 그래프로 묘사한 도식이다.
도 65는 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 AM 식사 음식 섭취에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 묘사하는 플롯이다.
도 66은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 과일 섭취에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 묘사하는 플롯이다.
도 67은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 PM 식사 음식 섭취에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 묘사하는 플롯이다.
도 68은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 체중에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 묘사하는 플롯이다.
도 69는 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 체질량 지수에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 70은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 피부 주름 두께에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 71은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 배 둘레에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 72는 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 혈당 수준에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 73은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 글루코스 내성에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 74는 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 혈장 트리글리세라이드 수준에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 75는 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 혈장 총 콜레스테롤 수준에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 76은 연구된 IGT 사이노몰구스 원숭이의 혈장 HDL-콜레스테롤 수준에 대한 비히클, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 47)의 효과를 보여주는 플롯이다.
도 77은 168시간 기간에 걸쳐 다양한 지점에서 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (좌측 패널, 서열번호: 43) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (우측 패널, 서열번호: 57)에서의 관찰된 변화를 보여주는 일련의 MALDI 질량 분광법 트레이스(trace)이다.
도 78은 Asp-N 소화 후 MRM LC/MS/MS에 의해 분석된 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) 모두로부터 유래된 총 C-말단 펩타이드 단편에 걸친 전체길이 C-말단 펩타이드의 상대 존재 (%)를 보여주는 플롯이다.
도 79는 마우스에서 정맥내 주사 후 240시간의 기간에 걸쳐 무손상 전체길이 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (서열번호: 43) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (서열번호: 57)의 혈장 농도에 대한 ELISA 검정의 결과를 보여주는 플롯이다.
도 80은 음성 대조군, 인간 FGF21 (서열번호: 4) 및 FGF21 글리코실화 돌연변이체 FGF21 (Y179N, S181T) (서열번호: 161), FGF21 Y179N (서열번호: 163) 및 FGF21 P124S (서열번호: 165)에 대해 수행된 ELK-루시페라제 활성 검정의 결과를 보여주는 플롯이다.
발명의 상세한 설명
향상된 특성, 예를 들어 증가된 반감기 및/또는 감소된 응집을 갖는 인간 FGF21 단백질은 본원에 개시된 방법 및 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 임의로, 반감기는 항체 또는 그의 일부를 야생형 FGF21 서열의 N-말단 또는 C-말단부에 융합시킴으로써 추가로 연장될 수 있다. 아미노산 치환을 단백질 내로 도입함으로써, 야생형 FGF21 단백질의 반감기를 추가로 연장시키거나 응집을 감소시키는 것이 또한 가능하다. 상기 변형된 단백질을 본원에서 돌연변이체 또는 FGF21 돌연변이체로서 칭하고, 이는 본 발명의 구현예를 형성한다.
실시예를 포함하여 본원에서 사용되는 재조합 핵산 방법은 일반적으로 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., GreenPublishers Inc. and Wiley and Sons 1994)]에 제시된 것이다.
1. 일반적인 정의
용어 "단리된 핵산 분자"란 (1) 총 핵산이 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 적어도 약 50％의 단백질, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질로부터 분리되거나, (2) 천연에서 "단리된 핵산 분자"가 그에 대해 연결되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 연결되지 않거나, (3) 그가 천연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나 또는 (4) 보다 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 천연에서 생성되지 않는 본원에 제공된 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 핵산 분자에는 폴리펩타이드 생산 또는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도에서 그의 사용을 방해하는 그의 자연 환경에서 발견되는 임의의 다른 오염 핵산 분자 또는 다른 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
용어 "벡터"란 암호화 정보를 숙주 세포에게 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 (예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 의미하기 위해 사용된다.
용어 "발현 벡터"란 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 삽입된 이종 핵산 서열의 발현을 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 나타낸다. 발현은 전사, 번역, 및 인트론이 존재하는 경우 RNA 스플라이싱(splicing)과 같은 과정을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 그의 통상적인 기능을 수행하도록 입체형태를 갖거나 조립되는 인접 서열의 배열을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 인접하는 서열은 암호화 서열의 복제, 전사 및/또는 번역을 실행시킬 수 있다. 예를 들어, 암호화 서열은 프로모터가 암호화서열의 전사를 지시할 수 있을 경우에 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이다. 인접하는 서열은 적정하게 기능하기만 한다면 암호화 서열과 연속될 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 전사되지만 번역되지 않는 개재 서열이 프로모터 서열과 암호화서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 암호화 서열에 "작동가능하게 연결된"것으로 간주될 수 있다.
용어 "숙주 세포"란 본원에 제공된 핵산 등의 핵산 서열로 형질전환되었거나 또는 형질전환될 수 있어서 관심있는 선택된 유전자를 발현하는 세포를 의미하기 위해 사용된다. 상기 용어는 선택된 유전자가 존재하는 한, 자손체가 형태 또는 유전자 구성에서 원래의 모 세포에 동일하거나 동일하지 않거나 관계없이 모 세포의 자손체를 포함한다.
용어 "단리된 폴리펩타이드"란 (1) 공급원 세포로부터 단리될 때 그와 함께 자연에서 발견되는 적어도 약 50％의 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질로부터 분리되거나, (2) 천연에서 "단리된 폴리펩타이드"가 그에 대해 연결되는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연결되지 않거나, (3) 그가 천연에서 연결되지 않는 폴리펩타이드에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동가능하게 연결되거나 또는 (4) 천연에서 생성되지 않는 본원에 제공된 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩타이드에는 그의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도를 방해하는 그의 자연 환경에서 발견되는 임의의 다른 오염 폴리펩타이드 또는 다른 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
생물학적 물질, 예를 들어 핵산 분자, 폴리펩타이드, 숙주 세포 등과 관련하여 사용될 때 용어 "천연 발생"이란 천연에서 발견되고 인간에 의해 조작되지 않은 물질을 의미한다. 이와 유사하게, 본원에서 사용되는 "비-천연 발생"이란 천연에서 발견되지 않거나 인간에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 의미한다. 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "천연 발생"이란 염기 아데닌 (A), 시토신 (C), 구아닌 (G), 티민 (T), 및 우라실 (U)을 의미한다. 아미노산과 관련하여 사용될 때, 용어 "천연 발생"이란 20개의 아미노산, 즉 알라닌 (A), 시스테인 (C), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 페닐알라닌 (F), 글라이신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 라이신 (K), 류신 (L), 메티오닌 (M), 아스파라긴 (N), 프롤린 (P), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V), 트립토판 (W), 및 티로신 (Y)을 의미한다.
용어 "FGF21 폴리펩타이드"란 인간에서 발현되는 천연 발생 야생형 폴리펩타이드를 의미한다. 본원의 설명을 위해, 용어 "FGF21 폴리펩타이드"는 임의의 전체길이 FGF21 폴리펩타이드, 예를 들어 209개의 아미노산 잔기로 구성되고 각각 서열번호: 1 및 5의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 서열번호: 2 및 6; 폴리펩타이드의 임의의 성숙 형태, 예를 들어 181개의 아미노산 잔기로 구성되고 각각 서열번호 3 및 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 전체길이 FGF21 폴리펩타이드의 아미노-말단부의 28개의 아미노산 잔기 (즉, 신호 펩타이드를 구성하는 것)가 제거된 서열번호: 4 및 8을 나타내기 위해 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 전체길이 및 성숙 FGF21 폴리펩타이드는 조작에 의해 또는 박테리아 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌을 포함할 수 있으나, 반드시 그런 것은 아니다.
용어 "FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체" 및 "FGF21 돌연변이체"란 상호교환적으로 사용될 수 있고, 천연 발생 FGF21 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호: 2, 4, 6 또는 8)이 변형된 FGF21 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 비-천연 발생 아미노산 및 비-천연 발생 아미노산 유사체로의 치환, 및 말단절단을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 따라서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 본원에서 설명되는 바와 같은 부위 지정 FGF21 돌연변이체, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드, 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체, 응집 감소 FGF21 돌연변이체, FGF21 조합 돌연변이체, 및 FGF21 융합 단백질을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 FGF21 돌연변이체의 특이적인 말단절단 및 아미노산 치환을 확인하기 위해, 말단절단된 또는 돌연변이된 아미노산 잔기의 넘버링(numbering)은 성숙 181-잔기 FGF21 폴리펩타이드의 넘버링에 대응한다. FGF21 돌연변이체는 조작에 의해 또는 박테리아 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌을 포함할 수 있으나, 반드시 그런 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 돌연변이체 FGF21의 아미노산 서열에 적어도 약 85％ 동일한 아미노산 서열을 포함하지만, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 바람직한 특성, 예를 들어, 단백질분해 내성, 반감기 증가 또는 응집 감소 특성 및 이들의 조합을 부여하는 특이적인 잔기는 추가로 변형되지 않았다. 환원하면, 단백질분해 내성, 응집 감소 또는 다른 특성을 부여하기 위해 변형된 FGF21 돌연변이체 서열 내의 잔기를 제외하고, FGF21 돌연변이체 서열 내의 약 15％의 모든 다른 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 예를 들어, FGF21 돌연변이체 Q173E에서, 위치 173에서 글루타민을 대신한 글루탐산 잔기 이외의 다른 15％이하의 모든 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 또 다른 구현예에서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 돌연변이체 FGF21의 아미노산 서열에 적어도 약 90％ 또는 약 95, 96, 97, 98 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하지만, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 단백질분해 내성 또는 응집 감소 특성을 부여하는 특이적인 잔기는 추가로 변형되지 않았다. 상기 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 보유한다.
또한, 본 발명은 돌연변이체 FGF21의 아미노산 서열에 적어도 약 85％ 동일한 아미노산 서열을 포함하지만, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 바람직한 특성, 예를 들어, 단백질분해 내성, 반감기 증가 또는 응집 감소 특성 및 이들의 조합을 부여하는 특이적인 잔기는 추가로 변형되지 않은 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
환언하면, 단백질분해 내성, 응집 감소 또는 다른 특성을 부여하기 위해 변형된 FGF21 돌연변이체 서열 내의 잔기를 제외하고, FGF21 돌연변이체 서열 내의 약 15％의 모든 다른 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 예를 들어, FGF21 돌연변이체 Q173E에서, 위치 173에서 글루타민을 대신한 글루탐산 잔기 이외의 다른 15％ 이하의 모든 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 본 발명은, FGF21 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 적어도 약 90％ 또는 약 95, 96, 97, 98 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 암호화된 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 단백질분해 내성 또는 응집 감소 특성을 부여하는 아미노산 잔기를 암호화하는 뉴클레오티드는 추가로 변형되지 않은 핵산 분자를 추가로 포함한다. 그와 같은 핵산 분자는 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 보유하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 암호화한다.
용어 "생물학적 활성 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체"란 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 내로 도입된 변형의 종류 또는 수와 무관하게 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 활성, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤을 낮추고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 갖는, 본원에서 설명되는 임의의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 의미한다. 야생형 FGF21 폴리펩타이드에 비해 FGF21 활성이 다소 감소된 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 그럼에도 불구하고 생물학적 활성 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체로 간주될 수 있다.
용어 "유효량" 및 "치료 유효량"이란 각각 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤을 낮추고; 체중을 감소시키고; 글루코스 내성, 에너지 소비 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력의 관찰가능한 수준을 지지하기 위해 사용되는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 양을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용가능한 담체는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 인간 또는 비-인간 대상체의 신체로의 전달을 수행 또는 향상시키는데 적당한 하나 이상의 제형 제제를 의미한다. 상기 용어는 생리적으로 상용성이 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 제제, 등장 및 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 등장 제제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 약제학적 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 수명 또는 효능을 향상시키는 약제학적으로 허용가능한 물질, 예컨대 습윤 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 버퍼는 담체로서 작용할 수 있거나, 담체의 성분을 형성할 수 있다.
용어 "항원"은 항체가 결합할 수 있고 추가로 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생산하도록 동물 내에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
용어 "천연 Fc"란 단량체 또는 다량체 형태 여부와 상관없이 전체 항체의 소화에 의해 또는 다른 수단에 의해 생성되는 비-항원 결합 단편의 서열을 포함하고 힌지 영역을 포함할 수 있는 분자 또는 서열을 의미한다. 천연 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 바람직하게는, 하지만 필수적이지는 않는 것으로, 인간 기원의 것이고, 임의의 면역글로불린일 수 있지만, IgG1 및 IgG2가 바람직하다. IgG4가 또한 이용될 수 있다. 천연 Fc 분자는 공유 (즉, 디술피드 결합) 및 비-공유 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩타이드로 이루어진다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디술피드 결합의 수는 클래스 (예를 들어, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgGA2)에 따라 1 내지 4개이다. 천연 Fc의 한 예는 IgG의 파파인 소화에 의해 생성되는 디술피드 결합 이량체이다 ([Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9] 참조). 본원에서 사용되는 용어 "천연 Fc"는 단량체, 이량체, 및 다량체 형태에 대한 총칭이다. Fc 폴리펩타이드 서열의 예를, 인간 IgG1 분자로부터 유래하는 서열번호: 11에 제시한다. 천연 Fc는 필수적이지는 않게, 조작에 의해 또는 박테리아 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌을 포함할 수 있고; 그와 같은 Fc 분자는 "천연 Fc" 분자로 또한 간주된다.
용어 "Fc 변이체"란 천연 Fc로부터 변형되지만 샐비지(salvage) 수용체인 FcRn (신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 계속 포함하는 분자 또는 서열을 의미한다. 국제 특허 출원 공개 WO 97/34631 및 WO 96/32478은 예시적인 Fc 변이체, 및 샐비지 수용체와의 상호작용을 설명하고 있고, 본원에 참고로 포함된다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 천연 Fc로부터 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 또한, 천연 Fc는, 본 발명의 FGF21 돌연변이체의 융합 분자에 필요하지 않은 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 (1) 디술피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포에 대한 부적합성, (3) 선택된 숙주 세포에서 발현시에 N-말단 불균일성, (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 샐비지 수용체 이외의 다른 Fc 수용체에 대한 결합 또는 (7) 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 주거나 이에 관여하는 하나 이상의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결여되거나 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함한다. Fc 변이체는 이하에서 보다 상세하게 설명된다. Fc 변이체는 필수적이지는 않게, 조작에 의해 또는 박테리아 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌을 포함할 수 있고; 그와 같은 Fc 분자는 "Fc 변이체"로 또한 간주된다.
용어 "Fc 도메인"은 천연 Fc 및 상기한 바와 같은 Fc 변이체 및 서열을 포함한다. Fc 변이체 및 천연 Fc 분자에서처럼, 용어 "Fc 도메인"은 전체 항체의 소화에 의해 또는 다른 수단에 의해 생성되는지의 여부와 무관하게 단량체 또는 다량체 형태의 분자를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, Fc 도메인은 예를 들어 Fc 도메인과 FGF21 서열 사이의 공유 결합을 통해 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 (FGF21의 말단절단된 형태 또는 FGF21 돌연변이체 포함)에 융합될 수 있다. 그와 같은 융합 단백질은 Fc 도메인의 회합을 통해 다량체를 형성할 수 있고, 상기 융합 단백질과 그의 다량체 둘 모두가 본 발명의 측면에 포함된다. Fc 도메인은 필수적이지는 않게, 조작에 의해 또는 박테리아 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌을 포함할 수 있다.
2. FGF21 돌연변이체
용어 "FGF21 돌연변이체"란 천연 발생 FGF21 폴리펩타이드 서열의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호: 2, 4, 6 또는 8과 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 의미한다. FGF21 돌연변이체는 FGF21 폴리펩타이드의 특정 위치에서 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산을 사용하여 하나 이상의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환을 도입함으로써 생성될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 제시된 위치의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대해 효과가 거의 또는 전혀 존재하지 않도록 천연 아미노산 잔기 (즉, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열의 제시된 위치에서 발견되는 잔기)를 비천연 잔기 (즉, 야생형 FGF21 폴리펩타이드 서열의 제시된 위치에서 발견되지 않는 잔기)로 치환하는 것을 수반할 수 있다. 또한, 보존적 아미노산 치환은 생물학적 시스템에서의 합성에 의하기보다는, 일반적으로 화학적 펩타이드 합성에 의해 도입되는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 잔기는 펩타이드모방체, 및 아미노산 모이어티 (moiety)의 다른 역전 (reversed) 또는 도립 (inverted) 형태를 포함한다.
천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 클래스로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
보존적 치환은 상기 클래스 중의 하나의 구성원으로 동일한 클래스의 다른 구성원을 교체하는 것을 수반할 수 있다. 비-보존적 치환은 상기 클래스 중의 하나의 구성원으로 다른 클래스의 구성원을 교체하는 것을 수반할 수 있다.
요구되는 아미노산 치환 (보존적 또는 비-보존적 치환 여부와 무관하게)은 상기 치환이 요구되는 시점에서 당업자에 의해 결정될 수 있다. 아미노산 치환의 예시적인 (비제한적인) 목록을 표 1에 제시한다.
<표 1>
Figure 112011096586550-pct00001

3. 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드
본 발명의 하나의 구현예는 성숙 FGF21 폴리펩타이드 또는 FGF21 돌연변이체의 말단절단된 형태에 관한 것이다. 본 발명의 상기 구현예는 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 비말단 절단된 형태와 유사한, 일부 경우에 이보다 더 우수한 활성을 제공할 수 있는 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드를 확인하기 위한 노력을 통해 밝혀진 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말단절단된 FGF21 폴리펩타이드"란 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩타이드의 아미노-말단부 (또는 N-말단부)로부터 제거되거나, 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩타이드의 카르복실-말단부 (또는 C-말단부)로부터 제거되거나 또는 아미노산 잔기가 FGF21 폴리펩타이드의 아미노-말단 및 카르복실-말단부 모두로부터 제거된 FGF21 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본원에 개시된 다양한 말단절단은 본원에서 설명되는 실시예 3 및 6에 기재된 바와 같이 제조하였다.
N-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드 및 C-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 활성은 실시예 4에서 설명되는 시험관내 ELK-루시퍼라제 분석을 사용하여 분석할 수 있다. 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 활성을 조사하기 위해 사용될 수 있는 시험관내 분석에 대한 구체적인 내용은 실시예 4에서 볼 수 있다.
또한, 본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 활성은 생체내 분석, 예를 들어 실시예 5 및 7에 제시된 db/db 마우스 또는 ob/ob 마우스에서 분석될 수 있다. 일반적으로, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 생체내 활성을 평가하기 위해서, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드를 시험 동물에게 복강 내로 투여할 수 있다. 요구되는 인큐베이션 기간 (예를 들어, 1시간 이상) 후에, 혈액 샘플을 채취하고, 혈당 수준을 측정할 수 있다. 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 활성을 조사하기 위해 사용될 수 있는 생체내 분석에 대한 구체적인 내용은 실시예 5 및 7에서 볼 수 있다.
a. N-말단 말단절단
본 발명의 일부 구현예에서, N-말단 말단절단은 성숙 FGF21 폴리펩타이드 또는 FGF21 돌연변이체의 N-말단부로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 실시예 5 및 도 3에 예시된 바와 같이, 9개 미만의 아미노산 잔기가 N-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 개체에서 혈당을 낮추는 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 능력을 보유한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 잔기가 N-말단에서 말단절단된 성숙 FGF21 폴리펩타이드 또는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 말단절단된 형태를 포함한다.
b. C-말단 말단절단
본 발명의 일부 구현예에서, C-말단 말단절단은 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 C-말단부로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 실시예 4 및 도 1b에 예시된 바와 같이, 13개 미만의 아미노산 잔기가 C-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 시험관내 ELK-루시퍼라제 분석에서 야생형 FGF21의 효능의 적어도 50％의 효능을 보였고, 이것은 상기 FGF21 돌연변이체가 개체에서 혈당을 낮추는 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 능력을 보유함을 나타낸다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 잔기가 C-말단에서 말단절단된 성숙 FGF21 폴리펩타이드 또는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 말단절단된 형태를 포함한다.
c. N-말단 및 C-말단 말단절단
본 발명의 일부 구현예에서, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 N-말단 및 C-말단 말단절단의 조합을 가질 수 있다. N-말단 및 C-말단 말단절단의 조합을 갖는 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 N-말단 또는 C-말단 말단절단만을 갖는 상응하는 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 활성을 공유한다. 환원하면, 9개 미만의 아미노산 잔기가 N-말단에서 말단절단되고 13개 미만의 아미노산 잔기가 C-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 9개 미만의 아미노산 잔기가 N-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드 또는 13개 미만의 아미노산 잔기가 C-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드와 유사하거나 더 큰 생물학적 활성, 예를 들어 혈당 저하 활성을 보유한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산 잔기가 N-말단에서 말단절단되고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 잔기가 C-말단에서 말단절단된 성숙 FGF21 폴리펩타이드 또는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 말단절단된 형태를 포함한다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체처럼, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드 및 FGF21 돌연변이체는 유도(directed) 돌연변이에 의해 또는 세균 발현 과정의 결과로서 도입될 수 있는 아미노-말단 메티오닌 잔기를 임의로 포함할 수 있다.
본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 실시예 3 및 6에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 잘 알고 있는 당업자는 본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 제조 및 사용을 위해 본원의 개시내용과 관련된 지식을 이용할 수 있다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션 (lipofection))을 위해 표준 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌]을 참고한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 수행되거나 본원에서 설명되는 바와 같이 제조자의 설명에 따라 수행할 수 있다. 구체적인 정의가 제시되지 않으면, 본원에서 설명되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명칭 및 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학적 합성; 화학적 분석; 제약 제제, 제형, 및 전달; 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 또한 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드에 추가의 특성을 부여할 수 있는 다른 엔티티 (entity)에 융합될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드는 Fc 서열에 융합될 수 있다. 상기 융합은 공지의 분자 생물학적 방법 및/또는 본원에서 제시되는 지침을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드의 잇점, 및 상기 융합 폴리펩타이드의 제조 방법은 본원에서 보다 상세하게 논의된다.
4. 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체
실시예 8에 기재된 바와 같이, 성숙 FGF21은 생체내 분해를 겪는 것으로 밝혀졌고, 이것은 궁극적으로 단백질 분해 공격에 의해 발생하는 것으로 결정되었다. 성숙 FGF21의 생체내 분해는 보다 짧은 유효 반감기를 야기하는 것으로 밝혀졌고, 분자의 치료 잠재력에 나쁜 영향을 줄 수 있다. 따라서, 단백질 분해에 대한 내성을 보이는 FGF21 돌연변이체를 확인하기 위한 유도 연구를 수행하였다. 상기 조사 결과, 특히 단백질 분해에 감수성인 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 부위는 위치 4-5, 20-21, 151-152, 171-172 및 178-181의 아미노산 잔기 사이의 펩타이드 결합을 포함한다.
허용되지 않는 정도로 단백질의 활성에 영향을 주지 않으면서 관찰되는 단백질 분해에 의한 효과를 제거하는 특정 치환을 확인하기 위해 광범하지만 집중된 유도 연구를 수행하였다. 표 8 및 11은 제조되고 시험된 몇몇 돌연변이체를 강조한 것이다. 예를 들어, 실시예 13 및 14에 기재된 바와 같이, 모든 FGF21 돌연변이체가 이상적인 프로파일을 보이지는 않았고; 몇몇 돌연변이체는 단백질분해 내성을 부여하지만, FGF21 활성이 손상되었다. 다른 돌연변이는 FGF21 활성을 보유하지만, 단백질분해 내성을 부여하지 않았다. 예를 들어 FGF21 P171G를 포함하는 여러 돌연변이체는 야생형 FGF21과 유사한 수준의 활성을 보유하면서, 또한 단백질 분해에 의한 분해에 내성을 보였다.
바람직한 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체를 확인하기 위한 한가지 선택 기준은 FGF21 돌연변이체의 활성이 야생형 FGF21의 활성과 본질적으로 동일하거나 이보다 더 큰 것이었다. 따라서, 본 발명의 또다른 구현예는 단백질 분해에 내성을 보이면서 야생형 FGF21과 본질적으로 동일하거나 이보다 더 큰 활성을 계속 보유하는 FGF21 돌연변이체에 관한 것이다. 일부 경우에 덜 바람직하지만, 단백질 분해에 내성을 보이지만 다소 감소된 활성을 보이는 FGF21 돌연변이체가 본 발명의 또다른 구현예를 형성한다. 일부 경우에, 일정 정도의 단백질 분해 수준을 유지하는 것이 바람직할 수 있고, 따라서, 일정 정도의 단백질 분해를 허용하는 FGF21 돌연변이체도 본 발명의 또다른 구현예를 형성한다.
본원에서 제공된 모든 FGF21 돌연변이체처럼, 본 발명의 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체는 본원에서 설명된 바와 같이 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 잘 알고 있는 당업자는 본원에 개시된 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체의 제조 및 사용을 위해 본원의 개시내용과 관련된 지식을 이용할 수 있다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌]을 참고한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 수행되거나 본원에서 설명되는 바와 같이 제조자의 설명에 따라 수행할 수 있다. 구체적인 정의가 제시되지 않으면, 본원에서 설명되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명칭 및 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학적 합성; 화학적 분석; 제약 제제, 제형, 및 전달; 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체는 또한 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체에 추가의 특성을 부여할 수 있는 다른 엔티티에 융합될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체는 IgG Fc 서열, 예를 들어 서열번호: 11에 융합될 수 있다. 상기 융합은 공지의 분자 생물학적 방법 및/또는 본원에서 제시되는 지침을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드의 잇점, 및 상기 융합 폴리펩타이드의 제조 방법은 본원에서 보다 상세하게 논의된다.
5. 응집 감소 FGF21 돌연변이체
실시예 15에서 설명되는 바와 같이, 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 한 특성은 그의 응집하는 경향이다. 약 5 mg/mL 초과의 농도에서, 응집 속도는 실온에서 높다. 본원에서 제시되고 설명되는 바와 같이, 야생형 FGF21 폴리펩타이드의 응집 속도는 농도 및 온도 의존성이다.
응집은 예를 들어 치료 제형과 관련하여 상기 농도의 야생형 FGF21을 사용할 때 문제가 되는 것으로 증명될 수 있다. 따라서, 감소된 FGF21 응집을 보이는 FGF21 돌연변이체를 확인하기 위한 유도 연구를 수행하였다. 그 다음, 생성되는 FGF21 돌연변이체를 다양한 농도에서 응집하는 경향에 대해 시험하였다.
허용되지 않는 정도로 단백질의 활성에 영향을 주지 않으면서 야생형 FGF21의 관찰되는 응집 효과를 제거하거나 감소시키는 특정 치환을 확인하기 위해 광범하지만 집중된 유도 연구를 수행하였다. 적합한 응집 감소 돌연변이체의 확인 방법은 실시예 15에 기재되어 있다. 표 16은 제조되고 시험된 몇몇 돌연변이체를 강조한 것이다. 예를 들어, 실시예 16에 기재된 바와 같이, 모든 FGF21 돌연변이체가 이상적인 프로파일을 보이지는 않았다. 몇몇 돌연변이체, 예를 들어 FGF21 L58E는 손상된 FGF21 활성을 보였고, 추가로 연구되지 않았다. 다른 돌연변이, 예를 들어 FGF21 A134E는 FGF21 활성을 보유하지만, 감소된 응집 특성을 부여하지 않았다. FGF21 L98R과 같은 여러 돌연변이체는 FGF21 활성을 보유하고, 또한 감소된 응집을 보였다. 한 돌연변이체 FGF21 A45K는 놀랍게도 증가된 FGF21 활성을 보이면서 동시에 감소된 응집 특성을 보였다.
바람직한 응집 감소 FGF21 돌연변이체를 확인하기 위한 한 가지 선택 기준은 FGF21 돌연변이체의 활성이 야생형 FGF21의 활성과 본질적으로 유사하거나 이보다 더 큰 것이었다. 따라서, 본 발명의 또다른 구현예는 야생형 FGF21과 유사하거나 이보다 더 큰 FGF21 활성을 계속 보유하면서 감소된 응집 특성을 보이는 FGF21 돌연변이체에 관한 것이다. 일부 경우에 덜 바람직하지만, 감소된 응집 특성을 보이지만 다소 감소된 FGF21 활성을 보이는 FGF21 돌연변이체가 본 발명의 또 다른 구현예를 형성한다. 일부 경우에, 일정 정도의 응집을 유지하는 것이 바람직할 수 있고, 따라서, 일정 정도의 응집을 허용하는 FGF21 돌연변이체도 본 발명의 또다른 구현예를 형성한다.
본원에 제공된 모든 FGF21 돌연변이체처럼, 본원에 제공된 응집 감소 FGF21 돌연변이체는 본원에서 설명된 바와 같이 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 잘 알고 있는 당업자는 본 발명의 응집 감소 FGF21 돌연변이체의 제조 및 사용을 위해 본원의 개시내용과 관련된 지식을 이용할 수 있다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 상기 문헌]을 참고한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 수행되거나 본원에서 설명되는 바와 같이 제조자의 설명에 따라 수행할 수 있다. 구체적인 정의가 제시되지 않으면, 본원에서 설명되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명칭 및 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학적 합성; 화학적 분석; 제약 제제, 제형, 및 전달; 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 응집 감소 FGF21 돌연변이체는 또한 응집 감소 FGF21 돌연변이체에 추가의 특성을 부여할 수 있는 다른 엔티티에 융합될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 응집 감소 FGF21 돌연변이체는 IgG Fc 서열, 예를 들어, 서열번호: 11에 융합될 수 있다. 상기 융합은 공지의 분자 생물학적 방법 및/또는 본원에 서 제시되는 지침을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드의 잇점, 및 상기 융합 폴리펩타이드의 제조 방법은 본원에서 보다 상세하게 논의된다.
6. FGF21 조합 돌연변이체
본원에서 설명되는 바와 같이, 야생형 FGF21 서열은 FGF21이 치료 분자로서 사용될 때 유의한 문제를 제시할 수 있는 여러 특성을 갖는다. 상기 문제에는, 분해에 대한 단백질의 감수성 및 높은 농도에서 그의 응집 경향이 존재한다. 각각의 상기 문제를 극복하는 FGF21 폴리펩타이드를 확인하기 위해 철저하게 조사한 후에, 단백질분해 내성을 부여하는 아미노산 치환 및 응집 감소 특성을 부여하는 아미노산 치환이, 야생형 FGF21의 활성과 동일하거나 이보다 큰 활성 수준을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 서열 내에 상가적 또는 상승적 방식으로 조합될 수 있는지를 결정하기 위한 유도 연구를 수행하였다. 이것은 제시된 폴리펩타이드에 다수의 돌연변이를 도입하는 것은 때때로 단백질의 발현, 활성, 및 후속적인 단백질의 제조에 유해한 영향을 줄 수 있음이 당업계에 알려져 있기 때문에 유의한 문제를 제시하였다.
놀랍게도, 예를 들어, 실시예 19 및 20에서 입증되는 바와 같이, 여러 FGF21 돌연변이체의 바람직한 특성은 향상된 제약 특성을 갖는 FGF21 돌연변이체를 생성시키기 위해 상가적 또는 상승적 방식으로 실제로 조합될 수 있음이 밝혀졌다. 단백질 분해에 내성이고, 감소된 응집 비율을 갖고, 야생형 FGF21과 동일하거나 이보다 더 큰 활성을 계속 보유하는 FGF21 돌연변이체가 본원에 개시된다.
바람직한 FGF21 조합 돌연변이체를 확인하기 위한 한 가지 선택 기준은 FGF21 돌연변이체의 활성이 야생형 FGF21의 활성과 유사하거나 이보다 더 큰 것이었다. 따라서, 본 발명의 또다른 구현예는 단백질 분해에 내성을 보이면서 감소된 응집 특성을 갖고, 야생형 FGF21과 유사하거나 이보다 더 큰 FGF21 활성을 계속 보유하는 FGF21 돌연변이체에 관한 것이다. 일부 경우에 덜 바람직하지만, 단백질 분해에 내성을 보이고 감소된 응집 특성을 갖지만 다소 감소된 FGF21 활성을 보이는 FGF21 돌연변이체가 본 발명의 또다른 구현예를 형성한다. 일부 경우에, 일정 정도의 단백질 분해 및/또는 응집 수준을 유지하는 것이 바람직할 수 있고, 따라서, 일정 정도의 단백질 분해 및/또는 응집을 허용하는 FGF21 돌연변이체도 본 발명의 또다른 구현예를 형성한다.
본 발명의 모든 FGF21 돌연변이체처럼, 본 발명의 FGF21 조합 돌연 변이체는 본원에서 설명된 바와 같이 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 잘 알고 있는 당업자는 본 발명의 FGF21 조합 돌연변이체의 제조 및 사용을 위해 본원의 개시내용과 관련된 지식을 이용할 수 있다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양, 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)을 위해 표준 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al ., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 상기 문헌]을 참고한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 통상적으로 수행되거나 본원에서 설명되는 바와 같이 제조자의 설명에 따라 수행할 수 있다. 구체적인 정의가 제시되지 않으면, 본원에서 설명되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명칭 및 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학적 합성; 화학적 분석; 제약 제제, 제형, 및 전달; 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 FGF21 조합 돌연변이체는 또한 FGF21 조합 돌연변이체에 추가의 특성을 부여할 수 있는 다른 엔티티에 융합될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, FGF21 조합 돌연변이체는 IgG Fc 서열, 예를 들어, 서열번호: 11에 융합될 수 있다. 상기 융합은 공지의 분자 생물학적 방법 및/또는 본원에서 제시되는 지침을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드의 잇점, 및 상기 융합 폴리펩타이드의 제조 방법은 본원에서 보다 상세하게 논의된다.
7. FGF21 융합 단백질
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FGF21 융합 폴리펩타이드" 또는 "FGF21 융합 단백질"이란 본원에서 설명되는 임의의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기 (예를 들어 이종 단백질 또는 펩타이드)의 융합체를 의미한다.
이종 펩타이드 및 폴리펩타이드는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 검출 및/또는 단리를 가능하게 하는 에피토프; 막횡단 수용체 단백질 또는 그의 일부, 예를 들어 세포외 도메인 또는 막횡단 및 세포내 도메인; 막횡단 수용체 단백질에 결합하는 리간드 또는 그의 일부; 촉매 활성을 갖는 효소 또는 그의 일부; 올리고머화를 촉진하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 예를 들어 류신 지퍼 도메인; 안정성을 증가시키는 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 불변 영역 (예를 들어, Fc 도메인); FGF21 돌연변이체를 위한 대부분의 친수성 또는 대부분의 소수성 융합 파트너를 형성하도록 설계된 2개 이상 (예를 들어, 2, 5, 10, 15, 20, 25 등)의 천연 발생 또는 비-천연 발생 하전 및/또는 비하전된 아미노산 (예를 들어, 세린, 글리신, 글루탐산 또는 아스파르트산)의 조합을 포함하는 반감기 연장 서열; 기능성 또는 비-기능성 항체 또는 그의 중쇄 또는 경쇄; 및 본 발명의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체와 상이한 활성, 예를 들어 치료 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 인간 혈청 알부민 (HSA)에 융합된 FGF21 돌연변이체가 또한 본 발명에 포함된다.
FGF21 융합 단백질은 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 N-말단 또는 C-말단에 이종 서열을 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 이종 서열은 아미노산 서열 또는 비-아미노산 함유 중합체일 수 있다. 이종 서열은 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 직접 또는 링커 또는 어댑터 (adapter) 분자를 통해 융합될 수 있다. 링커 또는 어댑터 분자는 하나 이상의 아미노산 잔기 (또는 -머(mer)), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 잔기 (또는 -머), 바람직하게는 10 내지 50개의 아미노산 잔기 (또는 -머), 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 잔기 (또는 -머), 보다 바람직하게는 15 내지 35개의 아미노산 잔기 (또는 -머)일 수 있다. 또한, 링커 또는 어댑터 분자는 융합된 모이어티의 분리를 가능하게 하기 위해 DNA 제한 엔도뉴클레아제 또는 프로테아제에 대한 절단 부위를 갖도록 설계될 수 있다.
a. Fc 융합체
본 발명의 한 구현예에서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 Fc 도메인, 예를 들어 인간 IgG의 Fc 영역의 하나 이상의 도메인에 융합된다. 항체는 2개의 기능적으로 독립적인 부분, 즉 항원에 결합하는 "Fab"로 알려진 가변 도메인 및 효과기 기능, 예를 들어 보체 활성화 및 포식 세포에 의한 공격에 관련되는 "Fc"로 알려진 불변 도메인을 포함한다. Fc는 긴 혈청 반감기를 갖고, Fab는 수명이 짧다 (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). 치료 단백질과 함께 연결될 때, Fc 도메인은 보다 긴 반감기를 제공하거나 또는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 고정, 및 아마도 심지어 태반 전달과 같은 기능을 통합시킬 수 있다 (Capon et al., 1989).
생체내 약동학적 분석은 인간 FGF21이 신속한 소거 (clearance) 및 생체내 분해에 의해 마우스에서 약 1시간의 짧은 반감기를 갖는다는 것을 나타내었다. 따라서, FGF21의 반감기를 연장하기 위해서, 천연 Fc 서열은 FGF21 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단부에 융합되었다. 야생형 FGF21에 대한 Fc 서열의 융합체, 특히 야생형 FGF21의 N-말단에 융합된 Fc는 예상된 바와 같이 반감기를 연장하지 않았지만, 이러한 관찰은 생체내에서 FGF21의 단백질 분해의 조사 및 상기 분해에 내성인 FGF21 돌연변이체의 확인을 유도하였다. 그와 같은 돌연변이체는 예를 들어 실시예 9 및 11에서 설명되고, 야생형 FGF21보다 더 긴 반감기를 보인다. 상기 및 다른 FGF21 융합 단백질은 본 발명의 구현예를 형성한다.
본 명세서 전체에서, Fc-(L15)-FGF21은 Fc 서열이 FGF21의 N-말단에 융합된 융합 단백질을 의미한다. 이와 유사하게, 명세서 전체에서, FGF21-Fc는 Fc 서열이 FGF21의 C-말단에 융합된 융합 단백질을 의미한다.
생성되는 FGF21 융합 단백질은 예를 들어 단백질 A 친화도 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다. Fc 영역에 융합된 펩타이드 및 단백질은 융합되지 않은 대응물보다 생체내에서 실질적으로 더 긴 반감기를 보이는 것으로 밝혀졌다. 또한, Fc 영역에 대한 융합은 융합 폴리펩타이드의 이량체화/다량체화를 허용한다. Fc 영역은 천연 발생 Fc 영역일 수 있거나 또는 특정 품질, 예를 들어 치료 품질, 순환 시간 또는 감소된 응집을 개선하기 위해 변경될 수 있다.
항체의 "Fc" 도메인과의 융합에 의한 단백질 치료제의 유용한 변형은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 00/024782에 상세하게 논의되어 있다.
b. 융합 단백질 링커
본 발명의 융합 단백질을 형성할 때, 링커는, 그럴 필요는 없지만, 사용될 수 있다. 존재할 경우, 링커의 화학 구조는 1차적으로 스페이서로서 기능하기 때문에 중요하지 않을 수 있다. 링커는 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 링커는 펩타이드 결합에 의해 연결된 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어지고, 아미노산은 20개의 천연 발생 아미노산으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 1 내지 20개의 아미노산은 아미노산 글라이신, 세린, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 라이신으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 링커는 입체적으로 방해된 대부분의 아미노산, 예를 들어 글라이신 및 알라닌으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 링커는 폴리글라이신 (예를 들어 (Gly)4 (서열번호: 29) 및 (Gly)5 (서열번호: 30)), 폴리알라닌, 글라이신 및 알라닌의 조합 (예를 들어 폴리(Gly-Ala)) 또는 글라이신 및 세린의 조합 (예를 들어 폴리(Gly-Ser))이다. 다른 적합한 링커는 (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (서열번호: 28), (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (서열번호: 31), (Gly)3-Lys-(Gly)4 (서열번호: 32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2 (서열번호: 33), (Gly)3-Cys-(Gly)4 (서열번호: 34), 및 Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (서열번호: 35)을 포함한다. 15개 아미노산 잔기의 링커는 FGF21 융합 단백질에서 특히 잘 작용하는 것으로 밝혀졌고, 본 발명은 임의의 길이 또는 조성의 링커를 고려한다. 링커가 이종 서열, 예컨대 Fc 도메인, 및 FGF21 폴리펩타이드 또는 FGF21 돌연변이체를 연결하기 위해 사용되었을 때, 링커는 괄호로 표현된다.
본원에서 설명되는 링커는 예시적인 것이고, 훨씬 더 길고 다른 잔기를 포함하는 링커가 본 발명에서 고려된다. 또한, 비-펩타이드 링커도 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, 알킬 링커, 예를 들어 -NH-(CH2)S-C(O)- (여기서, s = 2 내지 20)가 사용될 수 있다. 상기 알킬 링커는 저급 알킬 (예를 들어, C1-C6), 저급 아실, 할로겐 (예를 들어, Cl, Br), CN, NH2 또는 페닐을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 비-입체 방해 기로 추가로 치환될 수 있다. 예시적인 비-펩타이드 링커는 폴리에틸렌 글리콜 링커이고, 링커의 분자량은 100 내지 5000 kD, 예를 들어, 100 내지 500 kD이다.
8. 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체
본원에서 설명되는 FGF21의 말단절단된 형태를 비롯하여, 본원에서 설명되는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 화학적으로 변형된 형태는 본원에서 설명되는 개시내용을 고려하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. 상기 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체가 FGF21 돌연변이체에 천연에서 부착되는 분자의 종류 또는 위치에서 비변형된 FGF21 돌연변이체와 상이하도록 변경된다. 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 하나 이상의 천연에서 부착되는 화학기의 결실에 의해 형성된 분자를 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 하나 이상의 중합체의 공유 부착에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 선택된 중합체는 그가 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들어 생리학적 환경에서 침전되지 않도록 일반적으로 수용성이다. 적합한 중합체의 범위 내에는 중합체의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료 용도를 위해, 중합체는 제약상 허용되는 것일 것이다. 또한, 본 발명의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 접합된 수-불용성 중합체도 본 발명의 측면을 형성한다.
예시적인 중합체는 각각 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 중합체의 평균 분자량은 각각 일반적으로 약 2 kDa 내지 약 100 kDa이다 (용어 "약"은 수용성 중합체의 제제에서 일부 분자는 언급된 분자량보다 더 크고 일부 분자는 더 작음을 나타낸다). 각각의 중합체의 평균 분자량은 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 보다 바람직하게는 약 12 kDa 내지 약 40 kDa, 가장 바람직하게는 약 20 kDa 내지 약 35 kDa이다.
적합한 수용성 중합체 또는 그의 혼합물은 N-연결 또는 O-연결 탄수화물, 당, 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (단백질의 유도체화를 위해 사용된 PEG의 형태, 예를 들어 모노-(C1-C10), 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 포함), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란 (예를 들어 약 6 kD의 저분자량 덱스트란), 셀룰로스 또는 다른 탄수화물 기반 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 프로파일렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로파일렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 및 폴리비닐 알콜을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에는 공유 부착된 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 다량체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 이기능성 가교결합 분자가 포함된다. 또한, 본 발명에는 폴리시알산에 공유 부착된 FGF21 돌연변이체가 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서, FGF21 돌연변이체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로파일렌 글리콜을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 수용성 중합체를 포함하도록 공유 또는 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 및 4,179,337을 참조한다. 본 발명의 일부 구현예에서, FGF21 돌연변이체는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스, 다른 탄수화물-기반 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로파일렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로파일렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 또는 상기 중합체의 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 중합체를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, FGF21 돌연변이체는 PEG 서브유닛으로 공유 변형된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 FGF21 돌연변이체의 하나 이상의 특정 위치에서 (예를 들어, N-말단에서) 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 FGF21 돌연변이체의 하나 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 일부 구현예에서, PEG가 FGF21 돌연변이체의 치료능을 개선하기 위해 사용된다. 이러한 특정 방법은 예를 들어 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,133,426에 논의되어 있다.
중합체가 PEG인 본 발명의 구현예에서, PEG 기는 임의의 편리한 분자량일 수 있고, 선형이거나 분지될 수 있다. PEG 기의 평균 분자량은 바람직하게는 약 2 kD 내지 약 100 kDa, 보다 바람직하게는 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 예를 들어 10, 20, 30, 40 또는 50 kDa일 것이다. PEG 기는 일반적으로 PEG 모이어티 상의 반응성 기 (예를 들어, 알데히드, 아미노, 티올 또는 에스테르기)를 통한 FGF21 돌연변이체 상의 반응성 기 (예를 들어, 알데히드, 아미노 또는 에스테르기)에 대한 아실화 또는 환원 알킬화를 통해 FGF21 돌연변이체에 부착될 것이다.
본 발명의 FGF21 돌연변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 PEG화는 당업계에 공지된 임의의 PEG화 반응을 사용하여 특이적으로 수행할 수 있다. 상기 반응은 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다: [Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10]; 유럽 특허 0 154 316 및 0 401 384; 및 미국 특허 4,179,337. 예를 들어, PEG화는 본원에서 설명되는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행될 수 있다. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체는 하나의 반응성 에스테르기를 가져야 한다. 환원 알킬화를 위해, 선택된 중합체는 하나의 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 반응성 알데히드는 예를 들어 물 안전성의 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드 또는 모노 C1-C10 알콕시 또는 그의 아릴옥시 유도체이다 (예를 들어, 미국 특허 5,252,714 참조).
본 발명의 일부 구현예에서, PEG 기의 폴리펩타이드에 대한 부착을 위한 유용한 전략은 용액 내에서 접합체 연결의 형성을 통해, 각각 서로에 대해 상호 반응성인 특수 관능기를 갖는 펩타이드와 PEG 모이어티를 조합하는 것을 수반한다. 펩타이드는 통상적인 고상 합성으로 쉽게 제조될 수 있다. 펩타이드는 특정 부위에서 적절한 관능기로 "예비활성화"된다. 전구체는 PEG 모이어티와 반응하기 전에 정제되고, 완전히 특성 결정된다. 펩타이드와 PEG의 라이게이션은 대체로 수성상에서 발생하고, 역상 분석 HPLC에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다. PEG화 펩타이드는 예비 HPLC에 의해 쉽게 정제되고, 분석 HPLC, 아미노산 분석 및 레이저 탈착 질량 분광법에 의해 특성결정될 수 있다.
다당류 중합체는 단백질 변형을 위해 사용될 수 있는 다른 유형의 수용성 중합체이다. 따라서, 다당류 중합체에 융합된 본 발명의 FGF21 돌연변이체는 본 발명의 구현예를 형성한다. 덱스트란은 주로 알파 1-6 연결에 의해 연결된 글루코스의 개별 서브유닛으로 이루어진 다당류 중합체이다. 덱스트란 자체는 많은 분자량 범위로 이용가능하고, 약 1 kD 내지 약 70 kD의 분자량을 쉽게 이용할 수 있다. 덱스트란은 비히클 단독으로서 또는 다른 비히클 (예를 들어, Fc)과 조합하여 사용하기 적합한 수용성 중합체이다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 96/11953을 참조한다. 치료 또는 진단 면역글로불린에 접합된 덱스트란의 용도가 보고된 바 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 유럽 특허 공개 0 315 456을 참조한다. 또한, 본 발명은 약 1 kD 내지 약 20 kD의 덱스트란의 사용을 포함한다.
일반적으로, 화학적 변형은 단백질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키기 위해 사용되는 임의의 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 화학적으로 변형된 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체가 하나 이상의 중합체 분자에 부착되는 조건 하에 폴리펩타이드를 활성화된 중합체 분자 (예를 들어 중합체 분자의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)와 반응시키고, (b) 반응 생성물을 얻는 단계를 포함할 것이다. 최적 반응 조건은 공지의 파라미터 및 요구되는 결과를 기초로 하여 결정될 것이다. 이의 예는, 중합체 분자 대 단백질의 비가 클수록, 부착된 중합체 분자의 비율이 더 크다. 본 발명의 한 구현예에서, 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 아미노-말단에 하나의 중합체 분자 모이어티를 가질 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,234,784 참조).
본 발명의 또다른 구현예에서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 비오틴에 화학적으로 커플링될 수 있다. 그 다음, 비오틴/FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 아비딘에 결합하여 4가 아비딘/비오틴/FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 생성시킬 수 있다. 또한, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 디니트로페놀 (DNP) 또는 트리니트로페놀 (TNP)에 공유 커플링되고, 생성되는 접합체는 항-DNP 또는 항-TNPIgM으로 침전시켜 10가의 십량체 접합체를 형성할 수 있다.
일반적으로, 본 개시된 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체의 투여에 의해 완화 또는 조절될 수 있는 병태는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체에 대해 본원에서 설명되는 병태를 포함한다. 그러나, 본원에 개시된 화학적으로 변형된 FGF21 돌연변이체는 비변형된 FGF21 돌연변이체에 비해 추가의 활성, 향상 또는 감소된 생물학적 활성 또는 다른 특징, 예를 들어 증가 또는 감소된 반감기를 가질 수 있다.
9. FGF21 돌연변이체의 약제학적 조성물 및 이의 투여
FGF21 돌연변이체를 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 범위에 포함되고, 향상된 특성을 보이는 여러 돌연변이체 FGF21 서열의 확인의 측면에서 구체적으로 고려된다. 그와 같은 FGF21 돌연변이체 약제학적 조성물은 투여 방식에 적합하게 선택된 제약상 또는 생리학상 허용되는 제형 물질과 혼합된 치료 유효량의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 포함할 수 있다.
허용되는 제형 제제는 바람직하게는 사용되는 용량 및 농도에서 피투여자에게 무독성이다.
약제학적 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 투과의 변형, 유지 또는 보존을 위한 제형 제제를 함유할 수 있다. 적합한 제형 제제는 아미노산 (예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신), 항미 생물제, 항산화제 (예를 들어 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨), 버퍼 (예를 들어 보레이트, 비카르보네이트, Tris-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산), 증량제 (예를 들어 만니톨 또는 글라이신), 킬레이팅제 (예를 들어 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA)), 착화제 (예를 들어 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로파일-베타-시클로덱스트린), 충전제, 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물 (예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린), 단백질 (예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린), 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩타이드, 염-형성 반대이온 (예를 들어 나트륨), 보존제 (예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알콜, 메틸파라벤, 프로파일파라벤, 클로르헥시딘, 소르빈산 또는 과산화수소), 용매 (예를 들어 글리세린, 프로파일렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알콜 (예를 들어 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제 (예를 들어 플루로닉스 (pluronics); PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 향상제 (예를 들어 수크로스 또는 소르비톨), 긴장성 (tonicity) 향상제 (예를 들어 알칼리 금속 할라이드 - 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨 - 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 제약 보조제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, 임의의 목적을 위해 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)], 및 그의 후속 개정판 참조).
최적 약제학적 조성물은 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 방식 및 요구되는 용량에 따라 당업자가 결정할 것이다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌] 참조). 상기 조성물은 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 물리적인 상태, 안정성, 생체내 방출율 및 생체내 소거율에 영향을 미칠 수 있다.
약제학적 조성물 내의 1차 비히클 또는 담체는 성질이 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들어, 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 일반적인 다른 물질을 보충한 물, 생리학적 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 약제학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 Tris 버퍼 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 버퍼를 포함하고, 소르비톨 또는 그에 대한 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 조성물은 동결건조 케이크 (cake) 또는 수용액의 형태로 요구되는 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적인 제형 물질 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)과 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다. 더욱이, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 생성물은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결 건조물로서 제형될할 수 있다.
FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 별법으로, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한, 예를 들어 경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 상기 제약상 허용되는 조성물의 제조는 당업계의 기술 범위 내에 있다.
제형 성분은 바람직하게는 투여 부위에 허용되는 농도로 존재한다. 예를 들어, 버퍼는 생리학적 pH 또는 약간 더 높은 pH, 일반적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 조성물을 유지하기 위해 사용된다.
비경구 투여가 고려될 때, 본 발명에서 사용하기 위한 치료 조성물은 제약상 허용되는 비히클 내에 요구되는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 포함하는, 발열원이 없는 비경구로 허용되는 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주사를 위한 특히 적합한 비히클은 멸균 증류수이고, 여기에서 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 적절하게 보존된 멸균 등장액으로 제형화된다. 다른 제제는 데포(depot) 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 제어 또는 지속 방출을 제공할 수 있는 주사가능 미세구, 생분해성 입자, 중합체 화합물 (예를 들어 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 (bead) 또는 리포좀과 같은 물질을 사용하는 요구되는 분자의 제형화를 포함할 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있고, 이것은 순환계 내의 지속 기간을 증진시키는 효과를 가질 수 있다. 요구되는 분자를 도입하기 위한 다른 적합한 수단은 이식가능한 약물 전달 장치를 포함한다.
한 구현예에서, 약제학적 조성물은 흡입을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 건조한 흡입 분말로서 제형화될 수 있다. FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위한 추진제를 사용하여 제형화될 수 있다. 다른 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다. 폐 투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 설명하고 있는, 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 공개 WO 94/20069에 추가로 설명되어 있다.
제형이 경구로 투여될 수 있음이 또한 고려된다. 본 발명의 한 구현예에서, 상기 방식으로 투여되는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여형의 조제에서 관습적으로 사용되는 담체를 사용하거나 사용하지 않고 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 전신 도입전 파괴가 최소화되는 위장관 내의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 흡수를 용이하게 하기 위해 추가의 물질이 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁제, 정제, 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
다른 약제학적 조성물은 유효량의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 정제의 제조에 적합한 무독성 부형제와의 혼합물로 포함할 수 있다. 정제를 멸균수 또는 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액은 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 지속- 또는 제어-전달 제형 내에 포함하는 제형을 비롯하여 추가의 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 약제학적 조성물은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속- 또는 제어-전달 수단, 예를 들어 리포좀 담체, 생분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제를 제형화하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 중합체 미세입자의 제어 방출을 설명하는 국제 특허 출원 공개 WO 93/15722, 및 미세구/미세입자 제조 및 용도를 논의하고 있는 문헌 [Wischke & Schwendeman, 2008, Int . J. Pharm. 364: 298-327], 및 [Freiberg & Zhu, 2004, Int . J. Pharm . 282: 1-18] 참조). 본원에 기재된 바와 같이, 히드로겔은 지속 또는 제어 전달 제형의 한 예이다.
지속-방출 제제의 추가의 예는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919 및 유럽 특허 0 058 481), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) ([Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277] 및 [Langer, 1982, Chem . Tech . 12:98-105]), 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer et al., 상기 문헌) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 0 133 988)을 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Epstein et al., 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 82:3688-92]; 유럽 특허 0 036 676; 0 088 046 및 0 143 949 참조).
생체내 투여를 위해 사용되는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 약제학적 조성물은 대개 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성할 수 있다. 조성물을 동결건조할 때, 상기 방법을 이용하는 멸균은 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 또한, 비경구 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트(access port)가 있는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼(stopper)가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣어진다.
일단 약제학적 조성물이 제형화되면, 이를 멸균 바이알 내에 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체로서 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 저장할 수 있다. 상기 제형은 바로 사용되는 (ready-to-use) 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태 (예를 들어, 동결건조 형태)로 저장될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 단일-용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 각각 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 범위 내에, 단일 및 다수-챔버의 예비-충전된 시린지 (syringe) (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지 (lyosyringe))를 포함하는 키트가 포함된다.
치료를 위해 사용될 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체 약제학적 조성물의 유효량은 예를 들어 치료 환경 및 목표에 따라 결정될 것이다. 당업자는 치료를 위한 적절한 투여량 수준이 부분적으로는 전달되는 분자, FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체가 사용되는 적응증, 투여 경로 및 환자의 체격 (체중, 체표면적 또는 장기 크기) 및 상태 (연령 및 전반적인 건강)에 따라 변할 것임을 알 것이다. 따라서, 임상의는 최적 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형시킬 수 있다. 전형적인 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 투여량은 0.1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg; 또는 5 ㎍/kg, 10 ㎍/kg, 15 ㎍/kg, 20 ㎍/kg, 25 ㎍/kg, 30 ㎍/kg, 35 ㎍/kg, 40 ㎍/kg, 45 ㎍/kg, 50 ㎍/kg, 55 ㎍/kg, 60 ㎍/kg, 65 ㎍/kg, 70 ㎍/kg, 75 ㎍/kg, 내지 약 100 mg/kg일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 50 ㎍/kg, 100 ㎍/kg, 150 ㎍/kg, 200 ㎍/kg, 250 ㎍/kg, 300 ㎍/kg, 350 ㎍/kg, 400 ㎍/kg, 450 ㎍/kg, 500 ㎍/kg, 550 ㎍/kg, 600 ㎍/kg, 650 ㎍/kg, 700 ㎍/kg, 750 ㎍/kg, 800 ㎍/kg, 850 ㎍/kg, 900 ㎍/kg, 950 ㎍/kg, 100 ㎍/kg, 200 ㎍/kg, 300 ㎍/kg, 400 ㎍/kg, 500 ㎍/kg, 600 ㎍/kg, 700 ㎍/kg, 800 ㎍/kg, 900 ㎍/kg, 1000 ㎍/kg, 2000 ㎍/kg, 3000 ㎍/kg, 4000 ㎍/kg, 5000 ㎍/kg, 6000 ㎍/kg, 7000 ㎍/kg, 8000 ㎍/kg, 9000 ㎍/kg 또는 10 mg/kg일 수 있다.
투여 빈도는 사용된 제형 내의 특정 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 약동학 파라미터에 따를 것이다. 대개, 임상의는 요구되는 효과를 달성하는 투여량이 도달될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서, 조성물은 시간이 지남에 따라 단일 용량으로서 또는 2회 이상의 용량 (동일한 양의 요구되는 분자를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는)으로서 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입으로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 미세조정은 통상적으로 당업자에 의해 이루어지고, 이들이 통상적으로 수행하는 업무의 범위 내에 있다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이타의 사용을 통해 확인될 수 있다.
약제학적 조성물의 투여 경로는 공지의 방법에 따르고, 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내, 뇌내 (실질내), 뇌실내, 근육내, 눈내, 동맥내, 문맥내 또는 병변내 경로에 의해 주사를 통해; 지속 방출 시스템 (주사될 수도 있음) 또는 이식 장치에 의한다. 요구되는 경우에, 조성물은 볼러스 (bolus) 주사에 의해 또는 주입에 의해 연속적으로 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 조성물은 또한 요구되는 분자가 그 위해 흡수되거나 캡슐화되는 막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우에, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 장기 내로 이식될 수 있고, 요구되는 분자의 전달은 확산, 지연 방출형 볼러스 또는 연속 투여를 통할 수 있다.
약물 농도가 장기간에 걸쳐 원하는 치료적 효과 수준에서 유지될 수 있는 정도로 예정된 속도로 약물, 예를 들어, 본원에 개시된 FGF21 돌연변이체를 전달하기 위해, 다양한 상이한 접근법이 이용될 수 있다. 하나의 예에서, 폴리머, 예컨대 젤라틴 (예를 들어, 소(bovine) 젤라틴, 인간 젤라틴, 또는 다른 공급원으로부터의 젤라틴) 또는 천연 발생 또는 합성 생성 폴리머를 포함하는 히드로겔이 이용될 수 있다. 폴리머 (예를 들어, 젤라틴)의 임의 백분율이 히드로겔에서 이용될 수 있는데, 예컨대 5, 10, 15 또는 20%가 이용될 수 있다. 적절한 농도의 선택은 다양한 인자, 예컨대 원하는 치료 프로파일 및 치료 분자의 약동학적 프로파일에 의존할 수 있다.
히드로겔에 혼입될 수 있는 폴리머의 예는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG", 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드-코-폴리프로필렌 옥사이드, 코-폴리에틸렌 옥사이드 블록 또는 랜덤 코폴리머, 폴리비닐 알콜, 폴리(비닐 피롤리디논), 폴리(아미노산), 덱스트란, 헤파린, 다당류, 폴리에테르 등을 포함한다.
히드로겔 제형을 생성할 때에 고려될 수 있는 다른 인자는 히드로겔 및 가교결합제에서의 가교결합도이다. 일 구현예에서, 가교결합은 메타크릴산 무수물을 수반하는 메타크릴화 반응을 통해 달성될 수 있다. 일부 상황에서는, 높은 가교결합도가 바람직할 수 있고, 한편, 다른 상황에서는 낮은 가교결합도가 바람직하다. 일부 경우에, 더 높은 가교결합도는 더 긴 지속 방출을 제공한다. 더 높은 가교결합도는 더 단단한 히드로겔을 제공하고, 더 장기간 동안 약물이 전달되도록 할 수 있다.
원하는 물성을 갖는 히드로겔을 생성하기 위해 폴리머 대 가교결합제 (예를 들어, 메타크릴산 무수물)의 임의 비가 이용될 수 있다. 예를 들어, 폴리머 대 가교제의 비는 예를 들어, 8:1, 16:1, 24:1, 또는 32:1일 수 있다. 예를 들어, 히드로겔 폴리머가 젤라틴이고 가교제는 메타크릴레이트일 때, 8:1, 16:1, 24:1, 또는 32:1 비의 메타크릴산 무수물:젤라틴이 이용될 수 있다.
10. FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체의 치료 용도
FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체는 대사 질환을 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 질병, 질환 또는 병태의 치료, 진단, 개선 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 치료되는 대사 질환은 당뇨병, 예를 들어, 2형 당뇨병이다. 다른 구현예에서, 대사 질환은 비만이다. 다른 구현예는 대사 병태 또는 질환, 예를 들어 이상지질혈증; 고혈압; 간지방증, 예를 들어 비-알콜성 지방간염 (NASH); 심혈관 질병, 예를 들어 죽상경화증; 및 노화를 포함한다.
적용시에, 당뇨병 또는 비만과 같은 질환 또는 병태는 그를 필요로 하는 환자에게 치료 유효 용량의 본원에서 설명되는 FGF21 폴리펩타이드 돌연변이체를 투여함으로써 치료될 수 있다. 투여는 본원에서 설명되는 바와 같이, 예를 들어 IV 주사, 복강내 주사, 근내 주사에 의해 또는 정제 또는 액체 형태로 경구로 수행될 수 있다. 대부분의 상황에서, 요구되는 용량은 본원에서 설명되는 바와 같이 임상의에 의해 결정될 수 있고, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 치료 유효 용량을 나타낼 수 있다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 치료 유효 용량은 투여 계획, 투여되는 제제의 단위 용량, 핵산 분자 또는 폴리펩타이드가 다른 치료제와 조합되어 투여되는지의 여부, 피투여자의 면역 상태 및 건강에 따라 결정될 것임을 당업자는 분명하게 알 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "치료 유효 용량"이란 치료되는 질병 또는 질환의 증상 완화를 포함하여, 연구자, 의사 또는 다른 임상의가 달성하고자 하는 조직 시스템, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의약 반응을 유발하는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 양을 의미한다.
11. 항체
본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지만 야생형 FGF21 폴리펩타이드에는 특이적으로 결합하지 않는 항체 및 항체 단편이 고려되고, 본 발명의 범위에 포함된다. 항체는 일특이적 폴리클로날을 포함하는 폴리클로날 항체; 모노클로날 (MAb) 항체; 재조합 항체; 키메라 (chimeric) 항체; 인간화 항체, 예를 들어 상보성-결정 영역 (CDR) 그라프팅된 (grafted) 항체; 인간 항체; 단일쇄 항체; 및/또는 이중특이적 항체; 및 이들의 단편; 변이체; 또는 화학적으로 변형된 분자일 수 있다. 항체 단편은 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 일부를 포함한다. 그와 같은 단편의 예는 전체길이 항체의 효소에 의한 절단에 의해 생성되는 Fab 및 F(ab') 단편을 포함한다. 다른 결합 단편은 재조합 DNA 기술, 예를 들어 항체 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 플라스미드의 발현에 의해 생성되는 것을 포함한다.
항체와 관련하여 사용될 때의 용어 "특이적 결합"은, 항체가 단백질 및/또는 다른 생물학적 물질의 이종 모집단의 존재 하에서 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 더욱 특히, 항체가 그의 표적에 특이적으로 결합할 때, 이는, 예정된 면역검정 조건 하에서, 항체가 그의 표적에 결합하고 샘플에 존재하는 다른 단백질에는 유의미한 양으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 그의 표적에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하기 위해 임의의 편리한 면역검정 형식이 이용될 수 있고, 그 예는 고상 ELISA 면역검정이다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York]을 참고한다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해 작용하는 폴리클로날 항체는 일반적으로, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 및 어주번트(adjuvant)의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 동물 (예를 들어, 토끼 또는 마우스)에서 생산된다. 면역화되는 종에서 면역원성인 담체 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청, 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 접합하는 것이 유용할 수 있다. 또한, 응집제, 예를 들어 백반이 면역반응을 향상시키기 위해 사용된다. 면역화 후에, 동물에서 채혈하고, 혈청을 항-FGF21 돌연변이체 항체 역가에 대해 분석한다.
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해 작용하는 모노클로날 항체는 배양에서 연속적인 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 모노클로날 항체의 생산에 적합한 방법의 예는 하이브리도마 방법 (Kohler et al., 1975, Nature 256: 495-97) 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법 ([Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987])을 포함한다. 또한, 본 발명에서 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 반응성인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주가 제공된다.
본 발명의 모노클로날 항체는 치료제로서 사용하기 위해 변형될 수 있다. 한 구현예에서, 모노클로날 항체는 "키메라" 항체이고, 여기서 중쇄 (H) 및/또는 경쇄 (L)의 일부는 특정 종으로부터 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이다. 또한, 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 상기 항체의 단편이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567; 문헌 [Morrison et al., 1985, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 81: 6851-55]을 참조한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 "인간화" 항체이다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,585,089 및 5,693,762를 참조한다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내로 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화는 예를 들어, 인간 항체의 대응하는 영역에 대해 설치류 상보성-결정 영역의 적어도 일부를 치환함으로써, 예를 들어 당업계에서 설명된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jones et al., 1986, Nature 321: 522-25]; [Riechmann et al., 1998, Nature 332: 323-27]; [Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-36] 참조).
또한, 본 발명의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체가 본 발명에 포함된다. 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 레퍼토리 (repertoire)를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어 마우스)을 사용하여, 상기 항체는 임의로 담체에 접합된 FGF21 돌연변이체로부터 유래된 항원 (즉, 6개 이상의 연속 아미노산을 갖는 것)을 사용한 면역화에 의해 생산된다. 예를 들어, 문헌 ([Jakobovits et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90:2551-55]; [Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58]; 및 [Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33])을 참조한다. 한 방법에서, 상기 트랜스제닉 동물은 내부의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬을 암호화하는 내인성 로커스를 불능화시키고, 그의 게놈 내로 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 암호화하는 로커스를 삽입함으로써 생산된다. 그 다음, 부분 변형된 동물, 즉 변형의 완전 미만의 보완을 갖는 동물을 교잡시켜 모든 요구되는 면역계 변형을 갖는 동물을 얻는다. 면역원을 투여하면, 이들 트랜스제닉 동물은 상기 항원에 면역특이적인 가변 영역을 포함하는, 인간 (예를 들어, 쥐가 아니라) 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다. 예를 들어 WO96/33735 및 WO94/02602를 참조한다. 추가의 방법은 미국 특허 5,545,807; 국제 특허 출원 공개 WO91/10741, WO90/04036, 및 유럽 특허 0 546 073에 기재되어 있다. 또한, 인간 항체는 본원에서 설명되는 숙주 세포에서의 재조합 DNA의 발현에 의해 또는 하이브리도마 세포에서의 발현에 의해 생산될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. 179-69 Biol. 227:381]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol . Biol . 222:581] 참조). 이 과정은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 항체 레퍼토리의 디스플레이를 통한 면역 선택, 및 선택되는 항원에 대한 그의 결합에 의한 파지의 후속적인 선택을 모방한다.
키메라, CDR 그라프팅된, 및 인간화 항체는 일반적으로 재조합 방법에 의해 생산된다. 항체를 암호화하는 핵산은 숙주 세포 내로 도입되고, 본원에서 설명되는 물질 및 절차를 사용하여 발현된다. 한 구현예에서, 항체는 포유동물, 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 생산된다. 모노클로날 (예를 들어, 인간) 항체는 숙주 세포에서 재조합 DNA의 발현에 의해 또는 본원에서 설명되는 하이브리도마 세포에서의 발현에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 항-FGF21 돌연변이체 항체는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 검출 및 정량을 위해 임의의 공지의 분석 방법, 예를 들어 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에 사용될 수 있다 (예를 들어, 그전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)] 참조). 항체는 사용되는 분석 방법에 적절한 친화도로 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 결합할 것이다.
진단 용도를 위해, 특정 구현예에서, 항-FGF21 돌연변이체 항체는 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 방사성 동위원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In 또는 67Ga; 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 또는 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 호스래디시 (horseradish) 퍼옥시다제일 수 있다 (Bayer et al., 1990, Meth . Enz . 184: 138-63).
경쟁적 결합 검정은 제한된 양의 항-FGF21 돌연변이체 항체에 결합하기 위해 시험 샘플 분석물 (예를 들어, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드)과 경쟁하는 표지된 표준물질 (예를 들어, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 그의 면역 반응성 부분)의 능력에 의존한다. 시험 샘플 내의 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 양은 항체에 결합된 표준물질의 양에 반비례한다. 결합된 표준물질의 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 항체는 일반적으로 항체에 결합된 표준물질 및 분석물이 결합되지 않은 표준물질 및 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있도록 결정 전 또는 후에 불용화된다.
샌드위치 분석은 일반적으로 각각 검출 및/또는 정량되는 단백질의 상이한 면역원성 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 수반한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 일반적으로 고체 지지체 상에 고정된 제1 항체에 의해 결합된 후, 제2 항체가 분석물에 결합하여 불용성의 3 부분 복합체를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 4,376,110을 참조한다. 제2 항체는 그 자체가 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 분석) 또는 검출 가능한 모이어티로 표지된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 분석). 예를 들어, 한 유형의 샌드위치 분석은 검출가능한 모이어티가 효소인 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA)이다.
또한, 본 발명의 항-FGF21 돌연변이체 항체는 생체내 영상화에도 유용하다. 검출가능한 모이어티로 표지된 항체는 동물에게, 바람직하게는 혈류 내로 투여되고, 숙주 내의 표지된 항체의 존재 및 위치를 분석할 수 있다. 항체는 핵 자기 공명, 방사선 검사 또는 당업계에 공지된 다른 검출 수단에 의해 동물에서 검출가능한 임의의 모이어티로 표지될 수 있다.
본 발명의 FGF21 돌연변이체 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 상기 치료제는 각각 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 향상시키거나 감소시키기 때문에 일반적으로 작용제 또는 길항제이다. 한 구현예에서, 본 발명의 길항제 항체는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있고 생체내에서 또는 시험관 내에서 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 기능 활성을 억제하거나 제거할 수 있는 항체 또는 그의 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 길항제 항체는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 기능 활성을 적어도 약 50％, 바람직하게는 적어도 약 80％ 억제할 것이다. 다른 구현예에서, 항-FGF21 돌연변이체 항체는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드와 FGF 수용체 사이의 상호작용을 저해하여 시험관 내에서 또는 생체내에서 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 활성을 억제하거나 제거할 수 있다. 작용제 및 길항제 항-FGF21 돌연변이체 항체는 당업계에 공지된 스크리닝 분석에 의해 확인된다.
또한, 본 발명은 FGF21 돌연변이체 항체 및 생물학적 샘플에서 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 수준의 검출에 유용한 다른 시약을 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 시약은 검출가능한 표지, 차단 혈청, 양성 및 음성 대조군 샘플, 및 검출 시약을 포함할 수 있다.
실시예
아래의 실시예는 본 발명의 구체적인 구현예, 및 그의 다양한 용도를 예시한다. 실시예는 단지 설명의 목적으로 제시되고, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
FGF21 발현 구성체의 제조
성숙 FGF21 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 성숙 FGF21 서열의 5' 및 3' 단부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 얻었다. 표 2는 성숙 FGF21 서열을 증폭시키기 위해 사용된 프라이머를 나열한다.
<표 2>
Figure 112011096586550-pct00002

성숙 FGF21 발현 구성체를 제조하기 위해 사용된 프라이머는 적합한 발현 벡터 (예를 들어, pET30 (Novagen/EMD Biosciences; 미국 캘리포니아주 샌디에고) 또는 pAMG33 (Amgen; 미국 캘리포니아주 사우전드 오크스)) 내로 서열의 방향성 클로닝을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위(NdeI 부위는 또한 박테리아 발현을 위한 N-말단 메티오닌을 포함함) 를 포함하였다. 발현 벡터 pAMG33은 저-카피수 R-100 복제 기원, 변형된 lac 프로모터, 및 카나마이신 내성 유전자를 함유한다. 발현 벡터 pET30은 pBR322 유래 복제 기원, 유도가능 T7 프로모터, 및 카나마이신 내성 유전자를 함유한다. pAMG33으로부터의 발현이 보다 높은 것으로 밝혀졌지만, pET30은 보다 신뢰 가능한 클로닝 벡터인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 대다수의 구성체는 먼저 pET30 내에서 생성된 후, 효능에 대해 스크리닝되었다. 그 다음, 선택된 서열을 추가의 증폭을 위해 pAMG33으로 전달하였다.
FGF21 서열을 40.65 ㎕ dH2O, 5 ㎕ PfuUltra II 반응 버퍼 (10x), 1.25 ㎕ dNTP Mix (40 mM - 4×10 mM), 0.1 ㎕ 주형 (100 ng/ml), 1 ㎕ Primer1 (10 μM), 1 ㎕ Primer2 (10 μM), 및 1 ㎕ PfuUltra II 융합 HS DNA 중합효소 (Stratagene; 미국 캘리포니아주 라 졸라))를 함유하는 반응 혼합물 내에서 증폭시켰다. 증폭 반응은 2분 동안 95℃에서; 그 다음, 목적하는 생성물 1 킬로염기당 95℃에서 20초, 60℃에서 20초 (사이클마다 추가로 1℃를 뺌), 및 72℃에서 15초의 10회 사이클; 이어서 목적하는 생성물 1 킬로염기당 94℃에서 20초, 55℃에 서 20초, 및 72℃에서 15초의 20회 사이클; 그 다음, 72℃에서 3분 동안 가열함으로써 수행하였다. 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI, DpnI, 및 EcoRI로 소화시키고; 적합한 벡터 내로 라이게이팅한 후; 전능성 (competent) 세포 내로 형질전환시켰다.
실시예 2
세균으로부터 FGF21 단백질의 정제
아래 실시예에서, 야생형 FGF21 폴리펩타이드, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체, 및 FGF21 융합 단백질을 포함하는 다양한 FGF21 단백질을 세균 발현 시스템 내에서 발현시켰다. 아래 설명되는 발현 후에, FGF21 단백질을 달리 지시되지 않으면 본 실시예에 기재된 바와 같이 정제하였다.
세균 봉입체로부터 야생형 FGF21 폴리펩타이드, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드, 및 FGF21 돌연변이체를 정제하기 위해, 이중-세척된 봉입체 (DWIB)를 Tris 버퍼 (pH 8.5) 내의 구아니딘 염산염 및 DTT를 함유하는 가용화 버퍼 내에 가용화시켰다. 그 다음, 이들을 1시간 동안 실온에서 혼합하고, 가용화 혼합물을 우레아, 아르기닌, 시스테인 및 시스타민 염산염 (pH 9.5)을 함유하는 리폴드 (refold) 버퍼에 첨가한 후, 24시간 동안 5℃에서 혼합하였다 (예를 들어, 문헌 ([Clarke, 1998, Curr . Opin . Biotechnol. 9: 157-63]; [Mannall et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34]; [Rudolph et al., 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99]; 및 [Ishibashi et al., 2005, Protein Expr . Purif . 42: 1-6]) 참조).
가용화 및 리폴딩 후에, 혼합물을 0.45 미크론 필터를 통해 여과하였다. 그 다음, 리폴드 풀 (pool)을 10 kD 분자량 컷오프 (cut-off) Pall Omega 카세트를 이용하여 20 psi의 막횡단 압력 (TMP)에서 약 10배 농축시키고, 3 컬럼 부피의 20 mM Tris (pH 8.0)를 사용하여 20 psi의 TMP에서 투석여과하였다.
그 다음, 청정화된 샘플을 Q 세파로스 (Sepharose) HP 수지를 사용하는 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피로 처리하였다. 20 mM Tris 내의 0 내지 250 mM NaCl의 선형 염 구배를 pH 8.0에서 5℃에서 실행하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE 에 의해 분석하고 모았다.
그 다음, AEX 용출액 풀을 페닐 세파로스 HP 수지를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 처리하였다. 단백질을 0.7 M 내지 0 M 황산암모늄의 감소하는 선 구배를 사용하여 pH 8.0 및 주변 온도에서 용출시켰다. 피크 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) 모았다.
HIC 풀을 10 kD 분자량 컷오프 Pall Omega 0.2 m2 카세트를 이용하여 20 psi의 TMP에서 7 mg/mL로 농축시켰다. 농축물을 5 컬럼 부피의 제형 버퍼를 사용하여 20 psi의 TMP에서 투석여과하고, 회수된 농축물을 5 mg/mL로 희석하였다. 마지막으로, 용액을 Pall 미니-클린팩 (mini-Kleenpac) 0.2 μM 포시다인 (Posidyne) 막을 통해 여과하였다.
세균 봉입체로부터 FGF21 융합 단백질 및 FGF21 융합 돌연변이체 단백질을 정제하기 위해, 이중-세척된 봉입체 (DWIB)를 Tris 버퍼 (pH 8.5) 내의 구아니딘 염산염 및 DTT를 함유하는 가용화 버퍼 내에 가용화시킨 후, 1시간 동안 실온에서 혼합했다. 그 다음, 가용화 혼합물을 우레아, 아르기닌, 시스테인 및 시스타민 염산염 (pH 9.5)을 함유하는 리폴드 버퍼에 첨가한 후, 24시간 동안 5℃에서 혼합하였다 (예를 들어, 문헌 ([Clarke, 1998, Curr . Opin . Biotechnol . 9: 157-63]; [Mannall et al., 2007, Biotechnol . Bioeng . 97: 1523-34]; [Rudolph et al., 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., New York, IRL Press) 57-99]; 및 [Ishibashi et al., 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6]) 참조).
가용화 및 리폴딩 후에, 혼합물을 10 kD 투석 튜브를 사용하여 5 부피의 20 mM Tris (pH 8.0)에 대해 투석하였다. 투석된 리폴드의 pH를 50％ 아세트산으로 5.0으로 조정한 후, 30분 동안 4K에서 원심분리에 의해 청정화하였다.
그 다음, 청정화된 샘플을 Q 세파로스 HP 수지를 사용하는 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피로 처리하였다. 20 mM Tris 내의 0 내지 250 mM NaCl의 선형 염 구배를 pH 8.0에서 5℃에서 실행하였다. 피크 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) 모았다.
그 다음, AEX 용출액 풀을 페닐 세파로스 HP 수지를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)로 처리하였다. 단백질을 0.6 M 내지 0 M 황산암모늄의 감소하는 선 구배를 사용하여 pH 8.0 및 주변 온도에서 용출시켰다. 피크 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 모았다.
HIC 단계 후에, 풀을 60배 부피의 제형 버퍼를 사용하여 투석하였다. 투석된 풀을 폴 점보세프 (Pall Jumbosep)를 사용하여 5 mg/mL로 농축하였다. 마지막으로, 용액을 Pall 미니-클린팩 0.2 μM 포시다인 막을 통해 여과하였다.
실시예 3
말단절단된 FGF21 단백질의 제조 및 발현
표 3에 나열된 말단절단된 FGF21 단백질을 암호화하는 구성체를 아래 설명된 바와 같이 야생형 FGF21 발현 벡터의 PCR 증폭에 의해 제조하였다 (야생형 FGF21 발현 벡터의 구성은 실시예 1에 기재되어 있다).
<표 3>
Figure 112011096586550-pct00003

말단절단된 FGF21 단백질 구성체는 결실시킬 (말단절단을 일으키는) 코돈 (들)의 상류 및 하류의 영역에 상동성인 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 제조하였다. 그와 같은 증폭 반응에서 사용된 프라이머는 또한 증폭된 생성물, 환원하면, 이제 목적하는 돌연변이 또는 말단절단을 갖는 전체 벡터의 재고리화를 허용하도록 약 15개 뉴클 레오티드의 겹치는 서열을 제공하였다.
성숙 FGF21 서열의 위치 1의 히스티딘 잔기가 결핍되는 FGF21 단백질을 암호화하는 예시적인 말단절단된 FGF21 구성체 (즉, 2-181 말단절단 돌연변이체)는 표 4에 제시된 프라이머를 사용하여 제조하였다.
<표 4>
Figure 112011096586550-pct00004

표 4에 제시된 프라이머는 아래 제시된 바와 같이 히스티딘 잔기의 결실을 허용하고, 여기서 상부 서열 (서열번호: 9)은 N-말단 메티오닌을 포함하는 성숙 FGF21 폴리펩타이드의 일부이고, 제2 서열은 센스 프라이머 (서열번호: 14)이고, 제3 및 제4 서열 (서열번호: 17 및 18)은 FGF21 발현 구성체의 일부이고, 제5 서열은 안티센스 프라이머 (서열번호: 16)이다:
Figure 112011096586550-pct00005

말단절단된 FGF21 단백질 구성체는 본질적으로 실시예 1에 기재된 PCR 조건을 이용하여 제조하였다. 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 DpnI로 소화시킨 후, 전능성 세포 내로 형질전환시켰다. 생성되는 클론을 중합효소로 인해 발생되는 오류 (error)의 부재를 확인하기 위해 서열 결정하였다.
말단절단된 FGF21 단백질은 전능성 BL21 (DE3) 또는 BL21 Star (Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스바드)) 세포를 특정 말단절단된 FGF21 단백질을 암호화하는 구성체로 형질전환시킴으로써 발현시켰다. 형질전환체를 40 ㎍/mL 카나마이신을 보충한 TB 배지 내에서 제한 통기시키면서 밤새 성장시키고, 다음날 아침에 통기시키고, 짧은 회수 기간 후에, 0.4 mM IPTG 내에서 유도하였다. FGF21 돌연변이체를 유도 18-20시간 후에 원심분리에 의해 수거하였다.
실시예 4
말단절단된 FGF21 단백질의 시험관내 활성
실험은 ELK-루시퍼라제 시험관내 분석에서 야생형 FGF21 활성을 보유하는 말단절단된 FGF21 단백질을 확인하기 위해 수행하였다. 표 5는 N-말단, C-말단 또는 N-말단과 C-말단 모두에서 말단절단을 갖는 FGF21 단백질에 대해 얻어진 결과를 요약한다. ELK-루시퍼라제 분석은 재조합 인간 293T 신장 세포계를 사용하여 수행하였고, 여기서 293T 세포는 β-Klotho 및 루시퍼라제 리포터 구성체를 과다발현한다. 이들 구성체는 또한 GAL4-ELK1 및 5xUAS-Luc, 즉 5개의 탠덤 (tandem) 카피의 Gal4 결합 부위를 함유하는 프로모터에 의해 진행되는 루시퍼라제 리포터를 암호화하는 서열을 함유한다. β-Klotho는 그의 FGF 수용체의 활성화 및 세포내 신호전달의 유도 (이는 다시 Erk 및 ELK 인산화를 유도함)를 위해 FGF21이 필요로 하는 동시-수용체이다. 루시퍼라제 활성은 인산화된 Erk/ELK1의 수준에 의해 조절되고, 간접적으로 FGF21 활성을 모니터링하고 정량하기 위해 사용된다.
ELK-루시퍼라제 분석은 293T 세포를 상이한 농도의 야생형 FGF21 또는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드의 존재 하에 6시간 동안 배양한 후, 세포 용해물을 루시퍼라제 활성에 대해 분석함으로써 수행하였다. 도 1a-1b는 FGF21 말단절단 돌연변이체 7-181 및 8-181 (도 1a) 및 FGF21 말단절단 돌연변이체 1-172, 1-171, 1-169 및 1-164 (도 1b)에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 보여준다. 각각의 FGF21 말단절단 돌연변이체 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 및 1-149에 대한 ELK-루시퍼라제 분석에서 얻어진 발광을 도 2에 제시한다.
FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 야생형 FGF21 표준물질과 비교하였고, 야생형 FGF21의 효능의 적어도 50％의 효능을 보이는 돌연변이체를 FGF21 활성이 상실되지 않은 것으로 간주하고, 표 5에 "+"로서 표시하였다.
<표 5>
Figure 112011096586550-pct00006

종합하면, 표 5에 제시된 결과는 14개 이상의 아미노산 잔기의 C-말단 결실 (즉, 아미노산 잔기 1-167로 구성된 C-말단에서 말단절단된 FGF21 단백질 및 더 짧은 단백질)이 FGF21의 활성을 제거함을 나타낸다. 또한, 표 5는 7개 이상의 아미노산 잔기의 N-말단 결실 (즉, 아미노산 잔기 8-181로 구성된 N-말단에서 말단절단된 FGF21 단백질 및 더 짧은 단백질)이 FGF21의 활성을 제거함을 나타낸다. 놀라울 것도 없이, 8 내지 14개의 잔기의 N-말단 말단절단 및 12 또는 32개의 잔기의 C-말단 말단절단이 모두 있는, 말단절단된 FGF21 단백질은 ELK-루시퍼라제 분석에서 활성이 결여된 것으로 밝혀졌다.
표 5에 제시된 데이타와 일치하게, 7개 미만의 아미노산 잔기의 N-말단 말단절단이 있는 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드가 본 발명의 구현예를 구성한다. 이와 유사하게, 13개 미만의 아미노산 잔기의 C-말단 말단절단이 있는 말단 절단된 FGF21 폴리펩타이드가 본 발명의 구현예를 구성한다.
실시예 5
말단절단된 FGF21 단백질의 생체내 활성
FGF21은 많은 생물학적 활성, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나; 체중을 감소시키거나; 글루코스 내성, 에너지 소비 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 갖는다. 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드를, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드를 인슐린 내성 ob/ob 마우스 내로 도입하고 특정 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 혈당을 낮추는 능력을 측정함으로써 생체내 FGF21 활성에 대해 추가로 분석하였다. 시험할 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드를 8주령의 ob/ob 마우스 (Jackson Laboratory)에게 복강 내로 주사하고, 1회 주사 후 다양한 시점에, 예를 들어, 주사 0, 6, 24, 72, 120 및 168시간 후에 혈액 샘플을 얻었다. 혈당 수준을 원터치 글루코미터 (OneTouch Glucometer) (LifeScan, Inc., 미국 캘리포니아주 밀피타스))로 측정하고, 그 결과를 혈당의 기준선 수준 (즉, 시점 0에서)에 비해 혈당의 변화비율로서 표현하였다.
하나의 실험 결과를 도 3에 제시하고, 이는 FGF21 말단절단 돌연변이체 8-181 및 9-181을 주사한 마우스에서 검출된 혈당의 양을 보여준다. 상기 실험은 아미노산 잔기 8-181을 포함하는 말단절단된 FGF21 융합 단백질이 주사 3 및 6시간 후에 야생형 FGF21의 활성보다 경미하게 더 작은 생체내에서 혈당 저하 활성을 보이지만, 아미노산 잔기 9-181을 포함하는 말단절단된 FGF21 융합 단백질은 그와 같은 활성을 보이지 않음을 입증하였다. 따라서, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 생체내 분석은 성숙 FGF21의 N-말단으로부터 7개 이하의 아미노산의 결실이 분자의 생물학적 활성을 제거하지 않음을 나타내었다 (성숙 FGF21의 N-말단으로부터 7개의 아미노산의 결실이 활성을 제거할 것임을 제안한 시험관내 분석과 대조적임).
시험관내 및 생체내 분석에서 특정 N-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드 (예를 들어, FGF21 8-181)를 사용하여 얻은 상이한 결과는 신호 전달시에 FGF21과 β-Klotho 및 FGF 수용체의 상호작용에 의해 설명될 수 있다. 특히, FGF21은 티로신 키나제를 수반한 신호전달 캐스케이드를 개시시키는, 공동 수용체 β-Klotho 및 FGF 수용체 (FGFR)를 포함하는 이중 수용체 복합체를 활성화시킨다. FGF21의 N-말단은 FGFR의 결합 및 활성화에 관여하는 것으로 밝혀진 한편, FGF21의 C-말단은 β-Klotho 상호작용에 필요하다 (Yie et al., 2009 FEBS Lett. 583:19-24). ELK-루시퍼라제 시험관내 분석을 공동 수용체 β-Klotho가 과다발현되고 FGFR이 정상 수준으로 발현되는 293 신장 세포에서 수행한다. FGFR의 양은 β-Klotho에 비해 적고, 따라서 293 세포 내의 β-Klotho 대 FGFR의 비는 비-생리학적 수준이어서, 수용체 복합체 형성 및 궁극적으로 FGFR의 리간드 결합 및 활성화에 영향을 줄 수 있다. 293 시험관내 시스템은 N-말단에서 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드에 보다 취약한 것으로 보이고, 따라서 시험된 몇몇 N-말단에서 말단절단된 돌연변이체, 예를 들어 FGF21 8-181에 대해 활성 상실을 일으킬 수 있다. 따라서, 특정 N-말단에서 말단절단된 FGF21 돌연변이체가 야생형 FGF21 활성을 보유하는지를 결정하는데 있어서, 생체내 분석에서 FGF21 돌연변이체의 활성이 방향을 결정하는 것으로 간주되었다. 따라서, 8개 미만의 아미노산 잔기의 N-말단 말단절단이 있는 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드가 본 발명에 포함된다.
실시예 6
말단절단된 FGF21 융합 단백질의 제조 및 발현
단백질의 반감기는 단백질을 Fc 서열에 융합함으로써 증가될 수 있기 때문에, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제조하고 분석하였다. 표 6에 나열된 말단절단된 FGF21 융합 단백질을 증폭된 FGF21 서열로부터 SOEing (중복 연장에 의한 유전자 스플라이싱) PCR에 의해 제조하였다. 인간 면역 글로불린 IgG1 유전자의 Fc 부분 (서열번호: 11)이 FGF21 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 융합되도록 FGF21 융합 단백질을 제조하였다.
<표 6>
Figure 112011096586550-pct00007

특히, 본질적으로 실시예 1에서 설명된 반응 조건을 사용하는 일련의 3개의 증폭 반응으로 FGF21 융합 단백질 구성체 (말단절단된 FGF21 융합 단백질을 암호화하는 구성체 포함)를 제조하였다. 제1 반응에서, NdeI 클로닝 부위 (박테리아 발현을 위한 N-말단 메티오닌을 포함함), Fc 영역, 및 링커 서열을 함유하는 서열을 생산하기 위한 한 쌍의 프라이머를 설계하였다. 제2 반응에서, 링커의 겹치는 부분, FGF21 암호화 서열의 일부, 및 EcoRI 클로닝 부위를 함유하는 서열을 생산하기 위한 한 쌍의 프라이머를 설계하였다. 마지막으로, 제3 반응에서, 처음 2개의 반응의 생성물을 연결하기 위한 한 쌍의 프라이머를 설계하였다. Fc-(L15)-FGF21 1-181의 구성을 위한 프라이머의 예시적인 세트를 표 7에 제시한다.
<표 7>
Figure 112011096586550-pct00008

최종 반응의 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 EcoRI로 소화시키고, pET30 벡터 내로 라이게이팅시킨 후, 전능성 세포 내로 형질전환시켰다. 생성되는 클론을 중합효소로 인해 발생되는 오류의 부재를 확인하기 위해 서열 결정하였다.
실시예 7
말단절단된 FGF21 융합 단백질의 생체내 활성
Fc 서열에 융합된 말단절단된 FGF21 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성시키고, 생체내 활성에 대해 분석하였다. 말단절단된 FGF21 융합 단백질은 단일의 연속적인 서열을 형성하도록 IgG1 Fc 분자를 말단절단된 FGF21 단백질의 N-말단 또는 C-말단부에 융합시킴으로써 제조하였다. N-말단 및 C-말단 융합체 사이를 구분하기 위해, Fc 분자가 FGF21 단백질의 N-말단부에 융합된 FGF21 융합 단백질을 Fc-(L15)-FGF21로서 지정하고, Fc 분자가 FGF21 단백질의 C-말단부에 융합된 융합 단백질을 FGF21-Fc로서 지정한다.
FGF21은 많은 생물학적 활성, 예를 들어 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나; 체중을 감소시키거나; 글루코스 내성, 에너지 소비 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 갖는다. 생체내 FGF21 활성을 평가하기 위해, FGF21 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드, 및 FGF21 융합 폴리펩타이드를 인슐린 내성 ob/ob 마우스 내로 도입하고, 특정 FGF21 단백질의 혈당 수준을 낮추는 능력을 측정하였다. 시험할 FGF21 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 FGF21 융합 폴리펩타이드를 8주령의 ob/ob 마우스 (잭슨 래보러토리)에게 복강 내로 주사하고, 단일 주사 후 다양한 시점에, 예를 들어, 주사 0, 6, 24, 72, 120 및 168시간 후에 혈액 샘플을 얻었다. 혈당 수준을 원터치 글루코미터 (라이프스캔, 인크. (미국 캘리포니아주 밀피타스))로 측정하고, 그 결과를 혈당의 기준선 수준 (즉, 시점 0에서)에 비해 혈당의 변화 비율로서 표현하였다.
하나의 실험 결과를 도 4에 제시하고, 이는 PBS 대조군, 아미노산 잔기 1-181을 포함하는 야생형 Fc-(L15)-FGF21 대조군, 또는 아미노산 잔기 5-181 또는 7-181을 포함하는 말단절단된 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질을 주사한 마우스에서 관찰된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 상기 실험은 아미노산 잔기 5-181 또는 7-181을 포함하는 말단절단된 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질이 주사 6시간 후에 야생형 Fc-(L15)-FGF21의 활성과 유사한 혈당 저하 활성을 보인다는 것을 입증하였다. 따라서, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 생체내 분석은 성숙 FGF21의 N-말단으로부터 6개 이하의 아미노산의 결실이 분자의 생물학적 활성에 영향을 주지 않음을 보여주었다. 그러나, 생체내 분석은 또한 혈당을 낮추는 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드의 능력이 감소되고, 혈당 수준은 주사 24시간 후에 기준선으로 되돌아감을 나타냈다 (야생형 FGF21을 사용하여 유사한 결과를 얻었다). 짧은 생체내 활성은 실시예 8에 기재된 바와 같이, FGF21의 단백질 분해에 의한 분해의 결과인 것으로 밝혀졌다.
다른 실험의 결과를 도 5에 제시하고, 이는 PBS 대조군, 아미노산 잔기 1-181을 포함하는 야생형 FGF21-Fc 대조군, 잔기 1-175를 포함하는 말단절단된 FGF21-Fc 융합 단백질, 또는 아미노산 잔기 1-171을 포함하는 말단절단된 Fc-(L15)-FGF21 단백질을 주사한 마우스에서 관찰된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 상기 실험은 아미노산 잔기 1-181을 포함하는 야생형 FGF21-Fc가 지속적인 글루코스-저하 활성을 가져서, 주사 후 24시간 내지 120시간의 기간에 걸쳐 약 30％의 혈당 수준을 감소시킴을 입증한다. 아미노산 잔기 1-171을 포함하는 말단절단된 Fc-(L15)-FGF21 단백질은 주사 72시간 후에만 명백한 지연된 혈당 저하 활성을 보인다. 그러나, 관찰된 활성은 야생형 FGF21-Fc의 활성과 동일하다. 잔기 1-175를 포함하는 말단절단된 FGF21-Fc 융합 단백질은 혈당을 낮출 때 생체내에서 활성을 보이지 않는다.
종합하면, 본원에 기재된 말단절단 실험은 N-말단 말단절단이 있는 말단절단된 FGF21 융합 단백질이 야생형 FGF21 융합 단백질의 활성과 유사한 혈당 저하 활성을 보이고, 또한 Fc 분자가 말단절단된 FGF21 단백질의 N-말단부에 융합된 말단절단된 FGF21 융합 단백질은 Fc 분자가 말단절단된 FGF21 단백질의 C-말단부에 융합된 융합 단백질보다 더 큰 활성을 보임을 입증한다.
실시예 8
FGF21 의 관찰된 생체내 분해
FGF21 분해는 실시예 7에 기재된 바와 같이 FGF21 Fc 융합 단백질 구성체를 사용하여 먼저 관찰하였다. 생체내 약동학적 분석은 인간 FGF21이 신속한 소거 및 생체내 분해로 인해 마우스에서 약 1시간의 짧은 반감기를 갖는 것을 보여주었다. 따라서, FGF21의 반감기를 연장하기 위해, Fc 서열을 FGF21 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단부에 융합시켰다. 그러나, Fc 서열이 FGF21 폴리펩타이드의 N- 또는 C-말단부에 융합된 융합 단백질 (및 특히 Fc 서열이 성숙 FGF21의 N-말단에 융합된 Fc-(L15)-FGF21 융합체)이 예상된 생체내 효능을 보이지 않고, 대신 ob/ob 마우스에서 24시간 이내의 시간 동안 혈당 저하 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌기 때문에, Fc 영역의 융합이 반감기 문제를 완전히 해결하지는 못하였다. 도 4에 기재된 바와 같이, Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질은 주사 6시간 후에 당 수준을 약 30-40％ 감소시켰지만, 24시간에 혈당 수준이 기준선 수준으로 되돌아갔다.
후속적으로 야생형 FGF21의 단백질 분해에 의한 분해를 조사하였고, Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질의 생체내 활성의 신속한 상실은 FGF21의 생체내 분해의 결과인 것으로 밝혀졌다. 단백질 분해에 의한 분해는 생체내에서 분자의 생물학적 활성의 감소 및 이에 따른 보다 짧은 유효 반감기를 일으키고, 그와 같은 분해는 분자의 치료 용도에 유해한 효과를 갖는다. 따라서, FGF21 Fc 융합 단백질의 관찰된 분해로 인해 생체내에서 FGF21의 단백질 분해에 의한 분해를 조사하고, 그와 같은 분해에 내성인 FGF21 돌연변이체를 확인하게 되었다.
분해 부위를 결정하기 위해, LC-MS 분석 및 에드만 (Edman) 서열 결정을 야생형 인간 FGF21, 및 수컷 C57B6 마우스에게 주사한 후 다양한 시점에서 얻은 FGF21 Fc 융합 단백질에 대해 수행하였다. 에드만 서열 결정은 단백질의 N-말단 또는 C-말단부가 분해를 겪었는지 여부의 확인에 도움을 주었다. Fc 서열이 인간 FGF21의 N-말단에 융합될 때, 분해는 융합 분자의 인간 FGF21 부분의 아미노산 잔기 151과 152 사이 및 아미노산 잔기 171과 172 사이의 펩타이드 결합에서 발생하는 것으로 밝혀졌다 (상기 잔기 넘버링은 성숙 FGF21 서열을 기초로 하고, 융합 단백질의 Fc 부분을 포함하지 않았다). 171-172에서 분해가 먼저 일어난 후, 151-152에서 분해가 일어난 것으로 밝혀졌다. 171-172에서 분해는 속도 제한 단계로 보이고, 분자의 반감기에서 일정 역할을 수행한다. Fc 서열이 FGF21의 C-말단에 융합될 때, 분해는 아미노산 잔기 4와 5 사이 및 아미노산 잔기 20과 21 사이의 펩타이드 결합에서 일어나는 것으로 밝혀졌다. 이들 실험의 결과로서, Fc 서열은 Fc 서열에 인접한 FGF21 서열의 부분을 분해로부터 보호하는 것으로 보인다고 결정되었다. 야생형 FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질의 생체내 분해에 대한 분석을 사이노몰구스 원숭이에서 추가로 수행하였다. 이들 연구를 통해, 아미노산 잔기 171-172에서 FGF21의 절단 부위가 원숭이에서 주요 분해 부위이고, 상기 분해 부위는 쥐 및 영장류에서 보존됨을 확인하였다.
실시예 9
FGF21 단백질분해 내성 돌연변이체의 확인
적합한 FGF21 돌연변이체는 단백질 분해에 의한 주요 활성 부위인 야생형 FGF21 서열의 위치를 실험에 의해 결정함으로써 확인하고, 특이적 아미노산 치환을 이들 부위에 도입하였다. 아미노산 치환은 다른 종과의 FGF21 서열 보존 (실시예 8에 기재된 바와 같이) 및 다른 아미노산 잔기와의 생화학적 보존을 기초로 하여 이루어졌다. 야생형 FGF21 단백질 내로 도입되었거나 도입될 수 있는 아미노산 치환을 표 8에 제시하지만, 표 8은 단지 예시적인 것으로서 다른 치환이 이루어질 수 있다. 표 8에 제시된 위치의 번호는 181개의 아미노산 잔기로 구성되는 성숙 FGF21 단백질 내의 잔기 위치에 상응한다.
<표 8>
Figure 112011096586550-pct00009

실시예 10
Fc - FGF21 및 FGF21 - Fc 분해의 생체내 분석
FGF21 Fc 융합 단백질의 생체내 안정성은 마우스에게 융합 단백질을 주사하고, 다양한 시점에 마우스로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS)에 의해 분석함으로써 결정하였다. 특히, 마우스에게 10 mg/kg의 Fc-(G5)-FGF21 (서열번호: 107) (이. 콜라이 (E. coli) 내에서 발현되고 실시예 2에 설명된 바와 같이 정제됨) 또는 FGF21-(G3)-Fc (서열번호: 105) (포유동물 세포 내에서 발현되고 표준 절차에 따라 정제된)를 복강 내로 주사하였다. 주사 후 6, 24 및 48시간에 마우스로부터 혈액을 채취하고 (표 9), 프로테아제 억제제 칵테일 (cocktail) (Roche Diagnostics)로 예비처리한 EDTA 튜브 내로 모았다. 샘플을 12,000xg에서 10분 동안 원심분리함으로써 혈장을 분리하였다. 항-인간-Fc 아가로 스 수지를 사용하여 혈액으로부터 FGF21 단백질을 친화도 정제하였다.
<표 9>
Figure 112011096586550-pct00010

친화도 정제된 샘플을 LC-MS에 의해 분석하기 전에, Fc-(G5)-FGF21 및 FGF21-(G3)-Fc 단백질 표준물질을 참조물질로서 분석하였다. 단백질 표준물질을 트리스[2-카르복시에틸] 포스핀 (TCEP)으로 환원시키거나 환원시키지 않았다. 환원된 및 비-환원된 표준물질을 컬럼 용출액을 LCQ 클래식 (Classic) 이온-트랩 질량 분광계 내로 분무하면서, ACE 시아노 0.3 mm×30 cm 컬럼을 사용하는 LC-MS에 의해 분석하였다. 환원된 샘플의 데콘벌루션된 (deconvoluted) 스펙트럼이 보다 선명하므로, LC-MS 분석 전에 친화도 정제된 샘플을 환원시켰다.
환원된 Fc-(G5)-FGF21 표준물질 및 샘플 D6, D24 및 D48에 대해 관찰된 질량을 도 6a-6d에 도시한다. 환원된 FGF21-(G3)-Fc 표준물질 및 샘플 E6, E24 및 E48에 대해 관찰된 질량을 도 7a-7d에 도시한다. 단백질의 N-말단 및 LC-MS에 의해 결정될 때 단편을 확인하기 위해, 일부의 표준물질 및 샘플 용출물을 에드만 서열 결정으로 처리하였다. 표준물질 및 샘플의 LC-MS 분석의 결과를 표 10에 제시한다.
<표 10>
Figure 112011096586550-pct00011

표 10에 나타낸 바와 같이, 모든 친화도 정제된 샘플은 6시간 순환 후에만 일정 정도의 분해를 보였다. 24시간 순환 후에, Fc-(G5)-FGF21의 주요 생성물은 D 및 E 샘플 모두에서 관찰된 아미노산 잔기 1-404로 구성된 단편이었다. 그러나, E 샘플에서, FGF21-(G3)-Fc의 주요 생성물은 아미노산 잔기 5-410으로 구성된 단편이었다. 시험된 두 융합 단백질 모두에서, 융합 단백질의 FGF21 부분이 단백질의 Fc 부분보다 분해에 더 감수성이었다.
실시예 11
단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체 및 융합 단백질의 제조 및 발현
표 11에 나열된 FGF21 돌연변이체를 암호화하는 구성체는 아래 설명된 바와 같이 야생형 FGF21 발현 벡터의 PCR 증폭에 의해 제조하였다 (야생형 FGF21 발현 벡터의 구성은 실시예 1에 기재되어 있다). 링커가 구성체 내에 포함될 때, 사용된 링커는 GGGGGSGGGSGGGGS ("L15", 서열번호: 28)였다. 이들 실험의 목적은 단백질 분해에 내성을 보이고 보다 긴 반감기를 갖는 FGF21 돌연변이체를 생성시키는 것이었다.
<표 11>
Figure 112011096586550-pct00012

Figure 112011096586550-pct00013

Figure 112011096586550-pct00014

FGF21 돌연변이체 구성체는 돌연변이시킬 코돈(들)의 상류 및 하류의 영역에 상동성인 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 제조하였다. 그와 같은 증폭 반응에서 사용된 프라이머는 또한 증폭된 생성물, 환원하면, 이제 목적하는 돌연변이체를 갖는 전체 벡터의 재고리화를 허용하도록 약 15개 뉴클레오티드의 겹치는 서열을 제공하였다.
위치 170에서 천연 글라이신 잔기 대신에 글루탐산 잔기를 갖는 FGF21 돌연변이체 (즉, G170E 돌연변이체)를 암호화하는 예시적인 FGF21 돌연변이체 구성체는 표 12에 제시된 프라이머를 사용하여 제조하였다.
<표 12>
Figure 112011096586550-pct00015

표 12에 제시된 프라이머는 아래 제시된 바와 같이 글라이신 잔기의 글루탐산 잔기로 치환을 허용하고, 여기서 상부 서열은 센스 프라이머 (서열번호: 23)이고, 제2 및 제3 서열 (서열번호: 25 및 27)은 FGF21 발현 구성체의 일부이고, 제4 서열은 안티센스 프라이머 (서열번호: 26)이다:
Figure 112011096586550-pct00016

FGF21 돌연변이체 구성체는 본질적으로 실시예 1에 기재된 PCR 조건을 이용하여 제조하였다. 증폭 생성물을 제한 엔도뉴클레아제 DpnI로 소화시킨 후, 전능성 세포 내로 형질전환시켰다. 생성되는 클론을 중합효소로 인해 발생되는 오류의 부재를 확인하기 위해 서열 결정하였다. Fc-(L15)-FGF21 및 FGF21-(L15)-Fc 융합 단백질은 본원에서, 예를 들어, 실시예 6에 설명되는 바와 같이 생성하였다.
FGF21 돌연변이체는 전능성 BL21 (DE3) 또는 BL21 Star (인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드)) 세포를 특정 돌연변이체를 암호화하는 구성체로 형질전환시킴으로써 발현시켰다. 형질전환체를 40 ㎍/mL 카나마이신을 보충한 TB 배지 내에서 제한 통기시키면서 밤새 성장시키고, 다음날 아침에 통기시키고, 짧은 회수 기간 후에, 0.4 mM IPTG 내에서 유도하였다. FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드를 유도 18-20시간 후에 원심분리에 의해 수거하였다.
FGF21 돌연변이체를 또한 예측된 면역원성에 대해 분석하였다. 단백질에 대한 면역 반응은 주요 조직적합 복합체 (MHC) 클래스 II 결합 부위에서 항원 처리 및 제시에 의해 향상된다. 상기 상호작용은 T 세포가 단백질을 인식하는 항체의 성숙을 돕는데 요구된다. MHC 클래스 II 분자의 결합 부위는 특성 결정되었으므로, 단백질이 일련의 공통 인간 대립유전자에 결합할 수 있는 특이적 서열을 갖는지 여부를 예측하는 것이 가능하다. 선형 아미노산 펩타이드 서열이 면역 관용을 깰 가능성이 있는지 여부를 결정하기 위해, 참고 문헌 및 MHC 클래스 II 결정 구조에 기초하여 컴퓨터 알고리즘을 생성하였다. 특정 FGF21 돌연변이체 내의 점 돌연변이가 대부분의 인간에서 항원 특이적 T 세포를 증가시킬 것인지 결정하기 위해, TEPITOPE 컴퓨터 프로그램을 사용하였다. 각각의 FGF21 돌연변이체의 선형 단백질 서열의 분석에 기초하여, 어떠한 돌연변이체도 면역원성을 향상시키는 것으로 예측되지 않았다.
실시예 12
FGF21 분해에 대한 링커 서열의 효과
Fc 서열과 FGF21 서열 사이의 보다 긴 아미노산 링커의 존재가 FGF21 분해에 영향을 주는지 결정하기 위해서, 마우스에게 Fc 영역이 서열 GGGGGSGGGSGGGGS ("L15"로 지칭, 서열번호: 28)을 갖는 15개 아미노산의 링커에 의해 FGF21 서열과 분리되어 있는 FGF21 융합 단백질을 주사하고, 혈액을 다양한 시점에 마우스로부터 채취하고, 혈청을 LC-MS에 의해 분석하였다. 특히, 마우스에게 Fc-(L15)-FGF21 또는 FGF21-(L15)-Fc (이. 콜라이로부터 얻음)를 23 mg/kg로 주사하고, 혈액을 6, 24 및 48시간에서 채취하고, 채취한 혈액을 항-인간-Fc 아가로스 수지를 사용하여 친화도 정제하였다.
정제된 샘플을 LC-MS에 의해 분석하기 전에, Fc-(L15)-FGF21 및 FGF21-(L15)-Fc 단백질 표준물질을 참조물질로서 분석하였다. 단백질 표준물질을 TCEP로 환원시키거나 환원시키지 않았다. 환원된 및 비-환원된 표준물질을 컬럼 용출액을 LCQ 클래식 이온-트랩 질량 분광계 내로 분무하면서, ACE 시아노 0.3 mm×30 cm 컬럼을 사용하는 LC-MS에 의해 분석하였다. 환원된 샘플의 데콘벌루션된 스펙트럼이 보다 선명하므로, LC-MS 분석 전에 친화도 정제된 샘플을 환원시켰다.
환원된 Fc-(L15)-FGF21 표준물질, 및 다양한 시점에 채취한 상응하는 친화도 정제된 샘플에 대해 관찰된 질량을 도 8a-8d에 도시한다. 환원된 FGF21-(L15)-Fc 표준물질, 및 다양한 시점에 채취한 상응하는 친화도 정제된 샘플에 대해 관찰된 질량을 도 9a-9d에 도시한다. 단백질의 N-말단을 확인하고 LC-MS에 의해 관찰된 단편의 정체를 예측하는 것을 돕기 위해, 일부의 표준물질 및 샘플 용출물을 에드만 서열 결정으로 처리하였다. 표준물질 및 샘플의 LC-MS 분석의 결과, 및 예측된 단편의 표시를 표 13에 제시한다.
<표 13>
Figure 112011096586550-pct00017

표 13에 나타낸 바와 같이, 모든 친화도 정제된 샘플은 6시간 순환 후에만 일정 정도의 분해를 보였다. 24시간 순환 후에, Fc-(L15)-FGF21의 주요 생성물은 아미노산 잔기 1-414 (샘플의 85％) 및 1-394 (샘플의 15％)로 구성된 단편이고, FGF21(15)Fc의 주요 생성물은 아미노산 잔기 1-423 (샘플의 40％), 6-423 (샘플의 35％) 및 22-423 (샘플의 25％)으로 구성된 단편이었다. Fc-(L15)-FGF21 및 FGF21-(L15)-Fc 단백질에 대한 확인된 절단 지점을 각각 도 10a 및 10b에 제시한다.
실시예 13
주사 1-7일 후에 단백질분해 내성 Fc -( L15 )- FGF21 돌연변이체의 생체내 활성
본원에 설명된 바와 같이, FGF21 Fc 융합 단백질의 단백질 분해에 의한 절단은 Fc 서열의 배양에 의존성이고, 여기서, 융합 단백질의 Fc 단부는 융합 단백질의 FGF21 단부보다 더 안정하다 (즉, Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질의 N-말단 부분 및 FGF21-(L15)-Fc 융합 단백질의 C-말단 부분이 더 안정한 것으로 밝혀졌다). 예를 들어, 절단은 FGF21-(L15)-Fc의 위치 5와 21, 및 Fc-(L15)-FGF21의 위치 151과 171에서 확인되었다.
이들 관찰의 결과로서, 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체를 확인하기 위해 조사를 수행하였다. Fc-(L15)-FGF21의 LC-MS 분석으로 생체내 단백질 분해에 의한 분해가 먼저 아미노산 잔기 171-172 사이에서 일어난 후, 아미노산 잔기 151-152 사이의 분해가 일어남을 입증한다. 위치 171에서 단백질 분해에 의한 분해를 차단함으로써, 위치 151에서 절단이 방지될 수 있고, 이는 분자의 반감기를 효과적으로 연장시킨다. 그러나, 절단이 위치 151에서 방지되는 단백질분해 내성 돌연변이체는 여전히 프로테아제 공격에 감수성인 위치 171의 잔기를 가질 수 있어서, 리간드 수용체 친화도, 및 시험관내 및 생체내 효력의 결정자인 공동 수용체 β-Klotho의 결합에 관여하는 것으로 알려져 있는 마지막 10개 아미노산을 손실한 분자를 생성시킨다. 따라서, 성숙 FGF21에서 위치 171을 둘러싸는 아미노산 잔기의 돌연변이 유발이 분자의 생체내 안정성, 효력 및 효능을 향상시키기 위해 보다 중요한 것으로 보인다.
특정 단백질분해 내성 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체의 생체내 활성은 ob/ob 마우스에게 FGF21 돌연변이체를 복강 내로 주사하고, 주사 0, 0.25, 1, 3, 5, 및 7일 후에 주사한 마우스로부터 혈액 샘플을 채취한 후, 샘플 내의 혈당 수준을 측정함으로써 분석하였다. 하나의 실험 결과를 도 11에 제시하고, 이는 PBS 대조군, Fc-(L15)-FGF21 (서열번호: 49) 대조군, 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51), Fc-(L15)-FGF21 P171A (서열번호: 53), Fc-(L15)-FGF21 S172L (서열번호: 55), Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A, S172L) (서열번호: 59) 또는 Fc-(L15)-FGF21 G151A (서열번호: 61)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 보여준다. 도 12는 상기 실험에서 결정된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 상기 실험은 Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, Fc-(L15)-FGF21 S172L, 및 Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A, S172L) 돌연변이체가 5일 이내 동안 지속적인 혈당 저하 활성을 보임을 입증하고, 이는 야생형 Fc-(L15)-FGF21의 활성보다 뛰어나다. Fc-(L15)-FGF21 G151A 돌연변이체는 야생형 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질에 비해 혈당 저하 활성의 지속시간을 부분적으로만 개선하였다. 놀랍게도, Fc-(L15)-FGF21 S172L 돌연변이체는 단백질분해 내성 돌연변이체가 아니고, 따라서 야생형 Fc-(L15)-FGF21 폴리펩타이드와 유사한 분해 프로파일을 갖지만, 상기 돌연변이체는 야생형 Fc-(L15)-FGF21 폴리펩타이드에 비해 개선된 생체내 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다.
다른 실험의 결과를 도 13에 제시하고, 이는 PBS 대조군, Fc-(L15)-FGF21 대조군, 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A,I152V) (서열번호: 65), Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51), Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A) (서열번호: 63) 또는 Fc-(L15)-FGF21 (G170E, S172L) (서열번호: 67)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 보여준다. 도14는 상기 실험에서 결정된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 상기 기재된 실험에서와 같이, 야생형 Fc-FGF21 융합 단백질 및 Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A,I152V) 돌연변이체는 지속적인 혈당 저하 활성을 보이지 않고, 이는 가능하게는 171 부위에서 분해가 여전히 일어날 수 있기 때문이고, 이들 단백질을 주사한 동물에서 혈당 수준은 주사 24시간 후에 기준선으로 되돌아갔다. 그러나, Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A) 또는 Fc-(L15)-FGF21 (G170E, S172L)은 주사 후 5일까지 최대 혈당 저하 활성을 보이고, 이는 야생형 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질 및 Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A,I152V) 돌연변이체보다 뛰어나다.
다른 실험의 결과를 도 15에 제시하고, 이는 PBS 대조군 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51), Fc-(L15)-FGF21 G170A (서열번호: 69), Fc-(L15)-FGF21 G170C (서열번호: 71), Fc-(L15)-FGF21 G170D (서열번호: 73), Fc-(L15)-FGF21 G170N (서열번호: 75) 또는 Fc-(L15)-FGF21 G170S (서열번호: 77)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 보여준다. 도 16은 상기 실험에서 결정된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 상기 실험에서 시험된 모든 FGF21 돌연변이체는 주사 후 5일까지 지속적인 혈당 저하 활성을 보였다.
다른 실험의 결과를 도 17에 제시하고, 이는 PBS 또는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 G170E (서열번호: 51), Fc-(L15)-FGF21 P171E (서열번호: 79), Fc-(L15)-FGF21 P171H (서열번호: 81), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (서열번호: 83), Fc-(L15)-FGF21 P171T (서열번호: 85) 또는 Fc-(L15)-FGF21 P171Y (서열번호: 87)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 보여준다. 도 18은 상기 실험에서 결정된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 상기 실험에서 시험된 모든 FGF21 돌연변이체는 야생형 Fc-(L15)-FGF21에 비교할 때 개선된 혈당 저하 활성을 보였다.
실시예 14
주사 6 내지 120시간 후에 단백질분해 내성 Fc -( L15 )- FGF21 돌연변이체의 생체내 분해
선택된 FGF21 돌연변이체의 생체내 안정성은 마우스에게 FGF21 돌연변이체를 주사하고, 다양한 시점에 마우스로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 LC-MS에 의해 분석함으로써 분석하였다. 특히, 마우스에게 주사 전에 각각 약 180 ㎕의 10 mM HCl 내에 희석시킨 Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A 또는 Fc-(L15)-FGF21 S172L 돌연변이체 (실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이로부터 얻음)를 주사하고, 혈액을 6, 24, 48, 72, 및 120시간에 채취하였다. 채취한 혈액으로부터 FGF21 단백질을 항-인간-Fc 아가로스 수지 컬럼을 사용하여 친화도 정제하였다. 샘플을 컬럼으로부터 10 mM HCl을 사용하여 용출시켰다. 모든 FGF21 구성체는 Fc 영역 및 FGF21 단백질의 아미노-말단부에 15개의 아미노산 링커를 포함한다. 마우스에게 야생형 FGF21 대조군을 또한 주사하였다.
친화도 정제된 샘플을 LC-MS에 의해 분석하기 전에, 처리되지 않은 야생형 FGF21 및 처리되지 않은 FGF21 돌연변이체를 참조물질로서 분석하였다. 모든 표준물질 및 시점 샘플을 TCEP로 환원시킨 후, 컬럼 용출액을 LCQ 클래식 이온-트랩 질량 분광계 내로 분무하면서, ACE 시아노 0.3 mm×30 cm 컬럼을 사용하는 LC-MS에 의해 분석하였다. 친화도 정제된 샘플을 아세트산암모늄으로 희석하고, TCEP로 환원시킨 후, 상기한 바와 같이 LC-MS에 의해 분석하였다.
주사 0, 6, 24, 및 48시간 후에 야생형 Fc-(L15)-FGF21에 대해 관찰된 질량을 각각 도 19a-19d에 도시한다. 주사 0, 6, 24, 및 48시간 후에 Fc-(L15)-FGF21 G170E에 대해 관찰된 질량을 각각 도 20a-20d에 도시한다. 주사 0, 6, 24, 및 48시간 후에 Fc-(L15)-FGF21 P171A에 대해 관찰된 질량을 각각 도 21a-21d에 도시한다. 주사 0, 6, 24, 및 48시간 후에 Fc-(L15)-FGF21 S172L에 대해 관찰된 질량을 각각 도22a-22d에 도시한다.
72 및 120시간에 채취한 모든 샘플이 나머지 Fc-(L15)-FGF21 융합 단백질보다 훨씬 더 풍부한 피브리노겐의 고분자량 (비-환원성 SDS-PAGE에 의해 >200 kDa) 성분을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 다른 표준물질 및 샘플의 LC-MS 분석 결과를 표 14에 제시한다.
<표 14>
Figure 112011096586550-pct00018

표 14에 나타낸 바와 같이, 야생형 Fc-(L15)-FGF21 및 S172L 돌연변이체의 분해는 24시간 순환 후에, 융합 단백질의 주요 생성물이 아미노산 잔기 1-414로 구성된 단편이라는 점에서 유사하게 보인다. Fc-(L15)-FGF21 G170E 및 Fc-(L15)-FGF21 P171A 돌연변이체의 분해 생성물도 또한, 24시간 순환 후에 채취한 샘플이 70-80％ 무손상 단백질 (아미노산 1-424) 및 20-30％의 아미노산 잔기 1-421로 구성된 단편을 함유한다는 점에서 유사하게 보인다. 심지어 48시간 후에도, Fc-(L15)-FGF21 G170E 및 Fc-(L15)-FGF21 P171A 돌연변이체는 아미노산 잔기 1-421로 구성된 단편의 양 증가를 보이면서 여전히 무손상 단백질을 보유한다. Fc-(L15)-FGF21 구성체의 사전 분석에서 관찰된 바와 같이, 융합 단백질의 FGF21 부분의 분해가 검출되었고, Fc 부분은 안정한 것으로 밝혀졌다. 야생형, Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, 및 Fc-(L15)-FGF21 S172L에 대해 확인된 절단 부위를 각각 도 23a-23d에 제시한다.
실시예 15
응집 감소 FGF21 돌연변이체의 확인
야생형 FGF21의 하나의 특성은 그의 응집하는 경향이다. 이러한 특성의 관점에서, 응집 감소 FGF21 돌연변이체를 생성하는 것이 바람직하였다. 응집 감소 FGF21 돌연변이체는 2가지 가설에 기초하여 확인되었다. 첫 번째 가설은 FGF21에 관하여, 응집 (또는 이량체화)은 친수성 수계 용매 환경에 노출되는 소수성 잔기에 의해 유발되는 FGF21 분자들 사이의 소수성 상호작용 및 판 데어 발스 (van der Waals) 상호작용에 의해 촉발된다는 것이다. 두 번째 가설은 이들 노출된 소수성 잔기가 FGF21 활성을 손상시키지 않으면서 FGF21 아미노산 서열에서 응집 감소 점 돌연변이를 생성하도록 치환될 수 있다는 것이다.
FGF21 내에서 노출된 소수성 잔기를 확인하기 위해 체계적 합리적 단백질 공학처리 방법 (engineering approach)을 이용하였다. 노출된 소수성 잔기를 확인하기 위해 사용될 수 있는 FGF21의 X-선 또는 NMR 구조가 공지되지 않았기 때문에, 프로테인 데이타뱅크 (Protein Databank; PDB)로부터 얻어진 FGF19 (1PWA)의 고해상력 (1.3 Å) X-선 결정 구조를 이용하여, MOE (Molecular Operating Environment; 케미컬 컴퓨팅 그룹 (Chemical Computing Group; 캐나다 퀘벡 몬트리올)) 모델링 소프트웨어를 사용하여 FGF21의 3D 상동 모델을 생성하였다. PDB에 기탁된 단백질 중에서, 아미노산 서열 상동성의 면에서 FGF19가 FGF21에 가장 밀접하게 관련된 단백질이므로, FGF19를 주형으로서 선택하였다.
용매 접근가능성은 MOE를 사용하여 다음 방법에 의해 계산하였다. 표면적의 제1 측정치 (SA1)은 잔기의 접근가능한 표면의 면적 (Å2)으로서 정의된다. 특정 아미노산 잔기가 단백질의 일차 서열 내에 다수로 나타나지만, 잔기의 각각의 발생은 특히, 단백질 표면에 대한 잔기의 근접성, 잔기의 측쇄의 배향, 및 인접한 아미노산 잔기의 공간 위치에서의 차이로 인해 상이한 표면적을 가질 수 있다. 따라서, 관심있는 잔기가 잔기의 이웃하는 또는 인접한 잔기와 함께 단백질 구조로부터 추출되는 표면적의 제2 측정치 (SA2)를 구한다. 상기 공간상 인접한 잔기를 컴퓨터 내에서 (in silico) 글라이신으로 돌연변이시켜 그들의 측쇄를 제거한 후, 관심있는 잔기에 대한 SA2를 계산하여, 그의 특정 형상에서 그 잔기에 대한 총 가능한 표면적 측정치를 제공한다. 이어서, SA1 대 SA2의 비(SA1/SA2)는 실제 노출되는 잔기에 대한 가능한 표면적의 백분율의 측정치를 제공한다.
용매에 고도로 노출되는 몇몇 소수성 잔기를 추가의 분석을 위해 선택하고, 선택된 잔기를 다른 천연 발생 아미노산 잔기로 교체하기 위해 이들 잔기에 대해 컴퓨터 내 점 돌연변이를 수행하였다. 상이한 치환으로 인해 생성되는 단백질 열 안정성의 변화를 FGF21 모델 및 상호작용식 웹-기반 프로그램 CUPSAT (쾰른 유니버시티 단백질 안정성 분석 툴 (Cologne University Protein Stability Analysis Tools))을 사용하여 CUPSAT 웹사이트에서 제공되는 지시에 따라 계산하였다 ([Parthiban et al., 2006, Nucleic Acids Res . 34: W239-42]; [Parthiban et al., 2007, BMC Struct . Biol . P 7:54] 참조). 유의하게 탈안정화시키는 또는 소수성 돌연변이는 응집 감소 점 돌연변이 FGF21 돌연변이체의 설계에서 제외된다. 개선된 친수성 및/또는 이온성 특징을 도입하는 안정화시키는 (또는 드문 경우에 경미하게 탈안정화시키는) 치환이 응집 감소 FGF21 돌연변이체에 대한 후보로서 간주되었다.
상기 합리적 단백질 공학처리 방법을 통해 생성된 데이타의 요약을 표 15에 제시하고, 이는 또한 감소된 단백질 응집 및 개선된 안정성을 갖는 것으로 예상되는 예시적인 FGF21 돌연변이체를 나열한다.
<표 15>
Figure 112011096586550-pct00019

Figure 112011096586550-pct00020

실시예 16
응집 감소 FGF21 돌연변이체 및 융합 단백질의 제조 및 발현
표 16에 나열된 FGF21 돌연변이체를 암호화하는 구성체를 실시예 11에 기재된 바와 같이 야생형 FGF21 발현 벡터의 PCR 증폭에 의해 제조하였다 (야생형 FGF21 발현 벡터의 구성은 실시예 1에 기재되어 있다). 융합 단백질은 본원에서, 예를 들어, 실시예 6에서 설명되는 바와 같이 생성하였다. 링커가 이용되었을 때, 그 링커는 GGGGGSGGGSGGGGS ("L15", 서열번호: 28)였다.
<표 16>
Figure 112011096586550-pct00021

Figure 112011096586550-pct00022

야생형 FGF21, 말단절단된 FGF21 폴리펩타이드, FGF21 돌연변이체, 및 FGF21 융합 단백질을 포함하는 다양한 FGF21 단백질의 응집을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하였다. 분석할 샘플을 다양한 시점에 대해 4℃, 실온 또는 37℃에서 인큐베이팅한 후, SEC 분석으로 처리하였다. 실험은 SEC 컬럼이 설치된 벡맨 (Beckman) HPLC 시스템 상에서 수행하였다. 야생형 FGF21에 대해, 이동상으로서 2％ 이소프로파일 알콜을 함유하는 2x PBS를 이용하는 TOSOHAAS TSK-Gel G2000 SEC 컬럼을 사용하였다. FGF21 Fc 융합 단백질 및 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 대해, 이동상으로서 2x PBS를 이용하는 TOSOHAAS TSK-Gel G3000 SEC 컬럼을 사용하였다.
실시예 17
응집 감소 FGF21 돌연변이체의 시험관내 활성
ELK-루시퍼라제 시험관내 분석에서 야생형 FGF21 활성을 보유하는 응집 감소 돌연변이체를 확인하기 위해 실험을 수행하였다. ELK-루시퍼라제 분석을 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 24a-24c는 FGF21 돌연변이체 FGF21 L99R (서열번호: 109), FGF21 L99D (서열번호: 111), 및 FGF21 A111T (서열번호: 113) (도 24a); FGF21 돌연변이체 FGF21 A129D (서열번호: 115), FGF21 A129Q (서열번호: 117), 및 FGF21 A134K (서열번호: 119) (도 24b); 및 FGF21 돌연변이체 FGF21 A134Y (서열번호: 121), FGF21 A134E (서열번호: 123), 및 FGF21 A129K (서열번호: 125) (도 24c)에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 보여준다. 이들 실험의 결과는 ELK-루시퍼라제 분석으로 분석할 때 응집 감소 돌연변이의 일부가 FGF21 활성에 불리한 영향을 미치지 않았음을 입증한다.
실시예 18
보다 긴 반감기 및 보다 낮은 수준의 응집을 보이는 Fc -( L15 )- FGF21 조합 돌연변이체의 제조 및 발현
응집을 감소시키고 또한 단백질 분해에 의한 분해를 파괴함으로써 반감기를 증가시키는 것으로 나타난 돌연변이를 포함하는 많은 FGF21 조합 돌연변이체를 제조하고 IgG1 Fc 분자 (서열번호: 11)에 접합하였다. 이들 FGF21 돌연변이체는 본질적으로 실시예 11에 기재된 바와 같이 제조하였다.
실시예 19
보다 긴 반감기 및 보다 낮은 응집 수준을 보이는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체의 시험관내 연구
ELK-루시퍼라제 시험관내 분석에서 야생형 FGF21 활성을 보유하는 FGF21 조합 돌연변이체를 확인하기 위해 실험을 수행하였다. ELK-루시퍼라제 분석은 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
도 25a-25d는 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 P171G, Fc-(L15)-FGF21 P171S, 및 Fc-(L15)-FGF21 P171T (도 25a); Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 P171Y, Fc-(L15)-FGF21 P171W, 및 Fc-(L15)-FGF21 P171C (도 25b); Fc-(L15)-FGF21, Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), 및 FGF21 A45K (도 25c); 및 Fc-(L15)-FGF21, Fc-(L15)-FGF21 P171E, 및 Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (도 25d)에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 보여준다. 이들 실험의 결과는 안정성 또는 안정성과 용해도를 모두 개선하는 것을 목적으로 하는 돌연변이가 야생형 Fc-(L15)-FGF21에 비해 시험관내 활성을 손상시키지 않았음을 입증한다. 흥미롭게도, FGF21 A45K 돌연변이체는 야생형 Fc-(L15)-FGF21에 비해 개선된 효력을 보였다.
도 26a는 65 mg/mL 단백질을 4℃에서 1, 2, 및 4일 동안 인큐베이팅한 후 FGF21 대조군 (WT) 및 FGF21 A45K에 대한 응집 비율의 변화를 보여준다. 데이타는 A45K 돌연변이가 야생형 단백질에 비해 단백질 응집을 감소시킴을 나타낸다.
도 26b는 65 mg/mL 단백질을 4℃에서 1, 6, 및 10일 동안 인큐베이팅한 후 FGF21 대조군 (WT) 및 FGF21 P78C, FGF21 P78R, FGF21 L86T, FGF21 L86R, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129D, FGF21 A129Q, FGF21 A129K, FGF21 A134K, FGF21 A134Y, 및 FGF21 A134E에 대한 응집 비율의 변화를 보여준다. 데이타는 FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129Q, 및 FGF21 A129K가 야생형 단백질에 비해 단백질 응집을 감소시킴을 나타낸다.
도 27은 인간 FGF21 대조군, 및 FGF21 돌연변이체 FGF21 A45K, FGF21 L52T, 및 FGF21 L58E에 대해 수행된 ELK-루시퍼라제 활성 분석의 결과를 보여준다. 상기 실험은 FGF21 A45K 돌연변이체가 야생형 FGF21의 전체 효능을 보유하고, 야생형 FGF21보다 훨씬 더 큰 효력을 보임을 입증한다. 그러나, FGF21 L52T 및 FGF21 L58E 돌연변이체는 야생형 FGF21에 비해 감소된 효력 및 효능을 보였다.
도 28a-28b는 4℃에서 1, 4, 및 8일 동안 인큐베이팅한 후 Fc-(L15)-FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (6-181, G170E), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), Fc-(L15)-FGF21 P171E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, Fc-(L15)-FGF21 G170E, 및 FGF21 대조군에 대한 응집 수준의 변화를 보여준다. 상기 실험은 8일 기간에 걸쳐, Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) 돌연변이체가 Fc-(L15)-FGF21 G170E 또는 Fc-(L15)-FGF21 P171E 돌연변이체보다 더 적은 응집을 보였지만, 3개의 모든 돌연변이체가 Fc-(L15)-FGF21 대조군보다 더 적은 응집을 보였음을 입증한다. 표 17은 4℃ 또는 실온에서 0, 2, 3, 4 또는 7일 동안 인큐베이팅한 후 Fc-(L15)-FGF21 대조군 및 Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) 돌연변이체에 대해 얻어진 응집 비율을 보여준다.
<표 17>
Figure 112011096586550-pct00023

실시예 20
Fc - FGF21 융합 조합 돌연변이체의 제조 및 발현
상기한 바와 같이, FGF21의 안정성 및 용해도는 특이적 말단절단 및 아미노산 치환의 도입을 통해 조절될 수 있다. 또한, FGF21 안정성은 그와 같은 변형된 FGF21 단백질을 인간 면역글로불린 IgG1 유전자의 Fc 부분에 융합시킴으로써 더욱 향상될 수 있다. 또한, 상기 변형의 조합을 도입함으로써, 향상된 안정성 및 용해도를 모두 갖는 FGF21 분자가 생성될 수 있다. 표 18에 나열된 FGF21 조합 돌연변이체를 암호화하는 핵산 서열을 상기 설명된 기술을 이용하여 제조하였다. 사용된 링커는 L15 링커, GGGGGSGGGSGGGGS (서열번호: 28)였다.
<표 18>
Figure 112011096586550-pct00024

도 29는 Fc-(L15)-FGF21 조합 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, P171G) 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)를 주사한 마우스에서 측정된 혈당 수준을 도시한 것이다.
다른 실험에서, FGF21 돌연변이체 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)를 야생형 성숙 FGF21 및 Fc-FGF21과 나란히 연구하였다. 하나의 실험에서, 재조합 293T 세포주를 상이한 농도의 FGF21, Fc-(L15)-FGF21 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)의 존재 하에 6시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포 용해물을 루시퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 Fc-(L15)-FGF21에 유사한 활성을 가졌고, 이는 2개의 점 돌연변이의 도입이 분자의 시험관내 활성을 변경시키지 않았음을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 65 mg/mL에서 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)의 안정성을 9일 동안 2가지 상이한 온도, 환원하면, 실온 및 4℃에서 FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21과 나란히 평가하였다. 이어서, 인큐베이션 기간 후에, 세포 용해물을 SEC-HPLC로 분석하여 다양한 온도에서 응집 대 시간 프로파일을 결정하였다. 도 31a 및 31b에 제시된 데이타는 응집 형성 속도가 실온 (진한 삼각형, 점선 (도 31a)) 및 4℃ (진한 삼각형, 점선 (도 31b))에서 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에서 유의하게 감소되었음을 나타낸다.
실시예 21
C-말단 돌연변이를 포함하는 단백질분해 내성 FGF21 돌연변이체
조합 돌연변이체의 생체내 안정성을 또한 연구하였다. 구체적으로, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)의 생체내 안정성을 쥐 및 사이노몰구스 모델에서 Fc-(L15)-FGF21의 안정성과 비교하였다. 결과는 두 종에서 유사한 것으로 밝혀졌다. 사이노몰구스 연구에서, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 및 Fc-(L15)-FGF21을 23.5 mg/kg로 IV 주사하고, 혈청 및 혈장의 분취액을 투여 후 840시간까지 일정 시점에 수집하였다. 168시간까지의 시점을 분석하였다. 시점 샘플을 항-Fc 시약을 사용하여 친화도 정제한 후, MALDI 질량 분광법을 이용하여 분석하였다. 결과는 2가지 분석 사이에서 상호관련이 좋았다.
면역친화도-MALDI를 이용하여 생성된 데이타를 분석하면, P171 부위에서 클리핑 (clipping)은 P171에서 P171G로의 돌연변이의 결과로서 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 분자에서 제거된 것으로 보였다. 그러나, 3개 이하의 C-말단 잔기의 손실을 일으키는 근소하고 느린 분해가 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 대해 관찰되었다(도 32). 3개의 C-말단 잔기에서 근소한 절단이 또한 아미노산 잔기 171 및 172 사이의 보다 감수성인 절단 부위가 도 20 및 21에 도시된 바와 같이 차단된 후 다른 FGF21 돌연변이체에서 관찰되었다. 3개의 C-말단 잔기 절단은 순차적인, 잔기-대-잔기 방식으로 카르복시펩티다제에 의한 분자의 C-말단부로부터 절단의 중단, 또는 아미노산 잔기 179-180 및 180-181에서 비-특이적 클리핑과 함께 아미노산 잔기 178 및 179에서 특이적 프로테아제 공격을 나타낼 수 있다. C-말단에서 2-3개의 아미노산의 손실은 β-Klotho 결합을 감소시키고, 궁극적으로 분자의 효력 및 생체내 활성을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, [Yie et al., 2009, FEBS Lett. 583:19-24] 참조). C-말단의 명백한 카르복시펩티다제 분해를 처리하기 위해, 다양한 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드에 아미노산 잔기 "캡 (cap)"을 추가하는 영향을 연구하였다. 표 19에 제시된 것을 포함한 다양한 구성체를 본원에 기재된 기술을 이용하여 제조하고 분석하였다. 표 19는 시험관내 ELK 루시퍼라제 분석의 결과를 요약한다.
적합한 아미노산 캡은 길이가 1 내지 15개 아미노산, 예를 들어 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 15개의 아미노산일 수 있다. 임의의 수 및 종류의 아미노산(들), 예를 들어, 단일 프롤린 잔기, 및 단일 글라이신 잔기, 2개의 글라이신 잔기, 5개의 글라이신 잔기, 및 다른 조합이 캡으로서 사용될 수 있다. 캡의 추가의 예는 본 실시예 및 표 19에 제시된다.
추가로, 아미노산 잔기 178 및 179에서 명백한 프로테아제 공격을 처리하기 위해, 위치 179, 180 및 181에서 아미노산 잔기의 돌연변이를 연구하였다. 다시, 표 19에 제시된 것을 포함한 다양한 구성체를 본원에 기재된 기술을 이용하여 제조하고 분석하였다. 상기 부위에서 캡 및 돌연변이의 조합의 영향을 또한 탐구하였다. 표 19는 제조되고, 본원에 기재된 바와 같이 수행된 시험관내 ELK-루시퍼라제 분석으로 연구된 예시적인 구성체를 요약한다. 본원에 사용되는 용어에 일치하게, hFc는 인간 Fc 서열 (즉, 서열번호: 11)을 의미하고, L15는 L15 링커 (즉, GGGGGSGGGSGGGGS, 서열번호: 28)을 의미한다.
<표 19>
Figure 112011096586550-pct00025

도 33은 PBS 대조군, 야생형 천연 FGF21, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), 및 프롤린 또는 글라이신 잔기가 C-말단부에 추가된 2개의 캐핑된 분자, 즉 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G)를 주사한 당뇨병 db/db 마우스 (C57B6 배경)에서 관찰된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 잔기를 야생형 또는 돌연변이체 FGF21 폴리펩타이드의 C-말단에 추가할 때, 잔기는 생성되는 단백질 내의 그의 위치에 의해 칭해진다. 따라서, "182G"는 글라이신 잔기가 성숙 181개 잔기 야생형 또는 돌연변이체 단백질의 C-말단에 추가되었음을 나타낸다. 도 33은 천연 FGF21이 6시간 동안 혈당 수준을 저하시킨 반면, 연구된 3가지 모든 Fc-FGF21 돌연변이체는 적어도 120시간 동안 지속적인 혈당 저하 활성을 보였음을 보여주었다. 융합 분자의 FGF21 성분의 C-말단에 프롤린 잔기가 추가된 분자인 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P)는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G)에 비해 가장 강력하게 보였고 최저 혈당 수준을 일으켰다.
후속 실험에서, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P)의 생체내 활성을 연구하고, C-말단에 2개의 글라이신이 추가된 캐핑된 분자, 즉 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G)의 생체내 활성에 비교하였다. 도34는 실험의 결과를 보여준다. 도 34는 PBS 대조군, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P)를 주사한 ob/ob 마우스에서 관찰된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다.
도 34에 도시된 바와 같이, 연구된 모든 분자가 PBS 대조군에 비해 지속적인 글루코스-저하 활성을 보여주었다. 상기 실험은 C-말단에 프롤린이 첨가된 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P)이 프롤린 캡이 없는 분자, 예를 들어 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 비해 경미하게 향상된 글루코스-저하 효능을 보여준 선행 결과(도 33)를 확인하였다. 그러나, C-말단에 2개의 글라이신 잔기의 추가, 예를 들어 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G)는 분자의 생체내 효력을 감소시키고 생체내 글루코스-저하 효과의 지속 시간을 단축시키는 것으로 나타났다.
도 35는 PBS 대조군 또는 FGF21 돌연변이체 폴리펩타이드 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179S), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180S), 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180G)를 주사한 당뇨병 db/db 마우스 (C57B6 배경)에서 관찰된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. 모든 돌연변이체는 유사한 작용 지속시간을 가지면서 유사한 글루코스-저하 활성을 보여주었다.
도 36은 비히클 대조군, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F), 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E)을 주사한 당뇨병 db/db 마우스 (C57B6 배경)에서 관찰된 혈당 수준의 변화 비율을 보여준다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 비해, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F)는 혈당을 저하시키는데 있어서 덜 효과적이었다. 그러나, 아미노산 위치 180의 알라닌이 글루탐산으로 돌연변이된 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E)는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)보다 더 효과적이었고, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 비해 혈당 수준을 추가로 20％ 감소시켰다. 이들 데이타는 A180E 돌연변이가 생체내에서 C-말단 분해를 감소시키고, 그에 의해 분자의 생체내 효력 및 효능을 개선시킬 수 있음을 제안한다.
실시예 22
붉은털 원숭이 연구
Fc-링커-FGF21 구성체를 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성하였다. 구성체는 C-말단에서 L15 (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser 링커 서열(서열번호: 28)에 융합된 IgG1 Fc 서열 (서열번호: 11)을 포함하였고, 이는 이후 C-말단에서 성숙 FGF21 서열 (서열번호: 4)의 N-말단에 융합되고, 그 내부로 2개의 돌연변이, L98R 및 P171G가 도입되었다. 이어서, 상기 구성체를 본원에서 설명되는 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 단백질의 이량체 형태를 단리하였는데, 그 단백질은 각각의 단량체의 Fc 영역 사이에서 분자간 디술피드 결합을 통해 연결되었다. 상기 분자는 본 실시예 22에서 "Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)"로서 칭해지고, 서열번호: 43의 아미노산 서열을 갖고 서열번호: 42에 의해 암호화된다. 본 실시예에서, FGF21은 성숙 형태의 FGF21, 즉 서열번호: 4를 나타낸다.
22.1 연구 설계
Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 구성체를 BMI > 35인 비-당뇨병 수컷 붉은털 원숭이에게 만성적으로 피하 ("SC") 투여하였다. 2개의 다른 군의 원숭이 (군 당 n=10)를 성숙 FGF21 (즉, 서열번호: 4) 또는 비히클 대조군으로 처리하였다.
동물을 임의의 시험 화합물의 투여 전에 42일 동안 적응시킨 후, 10마리의 군으로 나누고, 도 37에 그래프로 도시된 바와 같이 맹검 방식으로 시험 화합물 또는 대조군 물질의 다수 SC 주사를 투여하였다. 간단히 설명하면, 각각의 동물에게 화합물 또는 비히클을 매일 1회 주사하였다. FGF21은 매일 투여한 반면, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 매주 투여하였다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 및 FGF21 용량을 도 37에 제시된 바와 같이 2주마다 증가시켰다. 체중 및 사료 섭취를 연구 전체 동안 모니터링하였다. CRO는 처리에 대해 몰랐다.
처리 개시 전에 2회의 경구 글루코스 내성 시험 (OGTT)을 수행하였다. OGTT1은 동물을 곡선하 면적 (AUC) 및 체중에 기초하여 동물의 유사한 분포를 갖는 3개의 동등한 군으로 분류하기 위해 사용하였다. 제2 OGTT (OGTT2)의 결과는 제1 OGTT (OGTT1)의 분류를 확인하기 위해 사용하였다. 하나의 시험 (OGTT1)이 다음 실험 (0GTT2)과 불일치한 OGTT 프로파일을 갖는 원숭이는 제외하였다. OGTT1 및 OGTT2의 결과를 도 38a 및 38b에 제시하고, 여기서 AUC 측정치를 도 38c에 제시한다. 기준선 체중을 도 38d 및 표 20에 제시한다.
OGTT3, OGTT4 및 OGTT5는 저용량, 중간 용량 및 고용량의 각각의 용량 처리의 끝에 2주마다 수행하였다. 혈액 샘플을 공복의 동물로부터 매주 수집하고, 글루코스, 인슐린, 트리글리세라이드 수준, 및 시험 화합물의 수준을 측정하기 위해 사용하였다. 혈액 샘플을 또한 3주의 약효세척 기간 동안 매주 수집하였다.
기준선 OGTT1 및 OGTT2는 정상 동물에서 보이는 것과 같은 예상 글루코스 프로파일을 보여주었고, 여기서 최대 혈장 글루코스는 30분에 얻어졌고, 3개의 상이한 군에 대해 안정한 AUC를 나타냈다.
혈장 화학에 대한 공복 기준선 값을 표 20에 제시한다. 혈장 화학 측정은 처리 개시 전에 수집한 혈액 샘플에 대해 수행하였다.
<표 20>
Figure 112011096586550-pct00026

3가지 상이한 용량 수준을 선택하였고, FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 대해 각각 저용량은 0.1 및 0.3 mg/kg이고, 중간 용량은 0.3 및 1 mg/kg이고, 고용량은 1 및 5 mg/kg이었다. 용량 수준은 마우스에서 관찰된 용량-반응에 기초하여 선택되었고, 여기서 투약 방식은 인간에서 예상된 주사 빈도에 기초하였다. 저용량 및 중간 용량에 대해 등몰 용량의 FGF21를 사용하였고, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 고용량은 5 mg/kg로 상승시켰다 (즉, 1 mg/kg FGF21 용량에 등몰인 3 mg/kg 대신).
22.2 체중에 대한 시험 화합물의 효과
본 실험에서, 매주 측정된 체중에 대한 시험 화합물의 효과를 측정하기 위해, 기준선으로부터 체중 변화 비율을 3개의 상이한 군의 붉은털 원숭이에서 매주 계산하였다. 3주의 약효세척 기간 동안 체중을 또한 측정하였다. 각각의 군에 대한 기준선 체중값을 표 20에 포함시킨다.
체중을 시험 화합물의 투여 전 및 투여 후 모두에서 연구 전체 동안 추적하였다. 비히클 동물의 기준선으로부터 체중 변화 비율은 시간이 지남에 따라 증가한 반면, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 및 FGF21로 처리한 동물의 체중은 도 39에 도시된 바와 같이 6주 처리 기간에 걸쳐 용량-의존 방식으로 감소하였다. 설치류에서 이전에 관찰된 바와 같이 (Xu et al., Diabetes 58(1):250-9 (2009)), FGF21을 사용한 처리는 체중을 통계상 유의하게 감소시켰다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 FGF21에서보다 더 큰 노출이 있었고 (각각 도 48 및 도 47), 이는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)가 FGF21보다 더 현저한 체중 감소를 보였다는 관찰에 대한 가능한 설명을 제공한다.
22.3. 인슐린 수준에 대한 시험 화합물의 효과
인슐린 수준을 철야 공복 후 또는 오후 식사 후에 수집한 혈액 샘플 내에서 측정하였다.
공복 혈장 인슐린 수준을 붉은털 원숭이에서 비히클, FGF21 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 처리한 동물에서 매주 및 3주의 약효세척 기간 동안 측정하였다. 공복의 혈액 샘플은 마지막 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 주사의 약 5일 후에 및 마지막 FGF21 주사의 약 21시간 후에 채취하였다.
식후 혈장 인슐린 수준은 고용량 처리 동안 비히클 또는 FGF21를 사용한 제5 및 제6주의 처리 동안 붉은털 원숭이에서 측정하였다. 식후 혈액 샘플은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 주사의 약 3일 후에 및 마지막 FGF21 주사의 약 2시간 후에 채취하였다. 도 40은 전체 9주 연구에 걸쳐 공복 인슐린 수준에 대한 비히클, FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)의 효과를 보여주는 한편, 도 41은 제5 및 6주 동안 채취한 샘플로부터 결정한 식후 인슐린 수준을 보여준다.
요약하면, 2개의 최고 용량에서, FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 모두 공복 및 식후 혈장 인슐린 수준을 통계상 유의하게 감소시켰다. FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 처리한 동물의 인슐린 수준이 증가된 글루코스 수준이 관찰되지 않으면서 감소하였다는 관찰은 증가된 인슐린 감수성을 표시한다.
22.4 OGTT ( 글루코스 및 인슐린)에 대한 시험 화합물의 효과
처리를 개시한 후에 3개의 OGTT (OGTT 3, 4 및 5)를 수행하였다. OGTT5 글루코스 및 인슐린 수준 프로파일은 고용량 증가 방법의 마지막 2주에 상응하는 비히클, FGF21 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 6주 동안 처리한 동물에서 측정하였다. OGTT5는 마지막 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 주사의 약 7일 후에 및 마지막 FGF21 주사의 약 21시간 후에 수행하였다. OGTT5 글루코스 및 인슐린 프로파일을 각각 도 42 및 도 43에 제시한다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 처리한 동물은 도 42에 도시된 바와 같이 최고 용량 및 측정된 마지막 시점에서만 비히클-처리 동물에 비해 개선된 글루코스 소거를 보였다. 마지막 용량의 끝에, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 글루코스 소거에서 가장 강한 개선을 보였다. FGF21은 글루코스 소거에서 개선을 보이지 않았다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 FGF21보다 더 큰 노출을 가졌고 (각각 도 48 및 도 47), 이는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)가 FGF21보다 글루코스 소거에서 더 현저한 효과를 보였다는 관찰에 대한 가능한 설명을 제공한다. OGTT5 동안 인슐린 수준은 비히클로 처리한 동물에 비해 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 처리한 동물에서 측정된 마지막 시점에 통계학상 유의하게 낮아졌다.
기준선으로부터 글루코스 AUC 변화 비율을 도 44에 도시된 바와 같이 3개의 상이한 군의 붉은털 원숭이에서 각각의 저용량, 중간 용량 및 고용량의 끝에 수행된 3개의 OGTT (OGTT 3, 4 및 5)에 대해 계산하였다. OGTT5는 마지막 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 주사의 약 7일 후에 및 마지막 FGF21 주사의 21시간 후에 수행하였고, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)가 AUC5를 통계상 유의하게 감소시켰음을 보여주었다. 각각의 군에 대한 기준선 OGTT 값을 도 38c에 제시한다.
공복 혈장 글루코스 수준은 OGTT가 수행되지 않은 날에 측정하였다. 3개의 군의 동물들 사이에서 측정된 공복 혈장 글루코스 수준에서 유의한 통계상 차이가 관찰되지 않았다.
22.5 트리글리세라이드 수준에 대한 시험 화합물의 효과
공복 혈장 트리글리세라이드 수준의 변화 비율을 붉은털 원숭이에서 비히클, FGF21 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 처리한 동물에서 매주 및 3주의 약효세척 기간 동안 계산하였다. 공복의 혈액 샘플은 마지막 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 주사의 약 5일 후에 및 마지막 FGF21 주사의 약 21시간 후에 채취하였다. 트리글리세라이드 수준은 처리를 개시한 후 매주 측정하였고, 기준선으로부터 변화 비율을 도 45에 제시하였고, 여기서 공복 기준선 값은 표 20에 제시된다.
도 45에 도시된 바와 같이, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 또는 FGF21로 처리한 동물은 트리글리세라이드 수준의 용량-의존적 감소를 보여주었고, 여기서 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)가 FGF21에 비해 가장 큰 저하 효과를 가졌다.
도 46은 비히클 또는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 또는 FGF21를 사용한 처리의 제5 및 제6주 동안 식후 상태의 붉은털 원숭이에서 채취한 샘플 내의 혈장 트리글리세라이드 수준을 보여준다. 식후 혈액 샘플은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 주사의 약 3일 후에 및 마지막 FGF21 주사의 약 2시간 후에 채취하였다. FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)로 처리한 동물의 식후 혈장 트리글리세라이드 수준은 비히클로 처리한 동물의 트리글리세라이드 수준에 비해 통계상 유의하게 감소되었다 (도 46).
22.6 시험 화합물의 농도
대략 등몰 용량 수준에서 투여된 시험된 화합물의 노출을 연구 기간 전체 동안 평가하였다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)의 농도를 투여 전에 및 마지막 주사의 약 5일에 측정하였다. FGF21 수준을 투여 전에 및 5, 12, 19, 및 26일에 측정하였다. 혈액 샘플을 마지막 주사의 약 21시간 후에 채취하였다.
각각의 원숭이에서 시험된 화합물의 개별 농도를 도 47 및 48에 제시한다. 도 47에 도시된 바와 같이, FGF21-처리군 내의 대다수의 동물은 정량 한계 미만의 농도를 가졌다. 도 48은 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)-처리군 내의 동물이 각각의 투약기 (동일한 용량 강도에서 2회의 매주 용량) 동안 검출가능한 수준의 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)를 가졌음을 보여준다. 각각의 투약기로부터의 평균 농도는 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 대해 0.3에서 5 mg/kg로 대략 용량-비례적으로 증가하였다. 두 화합물에 대해 각각의 용량 증가기 내에서 제1 및 제2 매주 용량 후에 항정 (steady) 농도에 의해 나타나는 바와 같이 최소의 축적이 존재한다. 무처리기 (약효세척 기간) 동안, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 수준은 대략 제47일 (마지막 용량의 12일 후)까지 검출가능하였고, 그 후 정량 하한 (LLOQ) 미만이었다.
시험 화합물의 노출을 또한 각각의 OGTT 동안 모니터링하였다. FGF21은 저용량 및 중간용량 FGF21 처리 후에 OGTT 3 및 4 동안 검출가능하지 않았다. 그러나, 고용량 처리 후에 OGTT5 동안 측정가능한 수준이 관찰되었다. 도 49에 도시된 바와 같이, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 수준에서 용량 비례적 증가가 용량 수준을 증가시킴에 따라 제3 내지 제5 OGTT에서 관찰되었다.
화합물 수준 데이타는 동물을 용량 증가 방식으로 예상된 양의 각각의 화합물, 즉 FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)에 노출시켰음을 확인한다. 측정된 FGF21의 양에서 큰 가변성이 관찰되었고, 샘플링이 마지막 용량의 약 21시간 후에 수행되었고, FGF21의 반감기가 약 1시간임을 고려하면 이것은 예상된 결과였다.
22.7 결론
FGF21은 최고 용량에서 공복 및 식후 혈장 트리글리세라이드 및 인슐린 수준을 감소시키고 체중을 감소시켰다. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 최고 용량에서 OGTT를 개선시키고 인슐린 수준을 감소시켰고, 공복 및 식후 혈장 트리글리세라이드 수준 및 체중을 용량 의존적으로 감소시켰다. FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 모두 비-당뇨병 붉은털 원숭이에서 많은 대사 파라미터를 감소시켰다. 인슐린 및 트리글리세라이드 수준 감소는 순환 화합물 수준이 식후 상태에서 유사한 범위 내에 있을 때 FGF21 및 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) 사이에서 동일하였다. 그의 개선된 특성으로 인해, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)는 측정된 대부분의 파라미터에서 FGF21에 비해 뛰어났고, 대사 파라미터에 대한 효능을 관찰하기 위해 주 1회 투여될 수 있다.
실시예 23
Fc -( G4S )3- FGF21 ( L98R , P171G , A180E) Fc 융합 분자
FGF21 돌연변이체를 포함하며 링커에 의해 IgG1 Fc 성분에 연결된 Fc 융합체를 생성하였다. Fc 융합체의 FGF21 성분은 FGF21의 폴리펩타이드 서열 내에 조작된 세 개의 점 돌연변이, 즉 L98R, P171G, A180E를 포함하였다(번호 지정은 서열번호: 4에 나타낸 성숙형 FGF21을 기준으로 함). GGGGSGGGGSGGGGS 서열(서열번호: 31)을 포함하는 15개 아미노산 링커를 통해 인간 Fc(서열번호: 11)를 L98R, P171G, A180E 돌연변이 FGF21(서열번호: 39)의 N-말단에 결합시켜 상기 분자를 구축하였다. 상기 분자를 "Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)"로 명명하고, 그 전체길이 아미노산 서열을 도 50 및 서열번호: 47에 나타낸다; 이는 서열번호: 46의 핵산에 의해 암호화된다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 시험관 내 평가는 상기 분자가 β-Klotho를 과발현하는 재조합 세포주에서 Erk 인산화의 강력한 자극제임을 나타내었다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 또한 야생형 FGF21의 Fc 융합체 또는 FGF21-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G)(서열번호: 45)의 Fc 융합체에 비해 증강된 β-Klotho 결합 친화도를 나타내었다. 당뇨병 동물 모델에 주사하는 경우, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 혈당 수준을 낮추고 체중을 감소시켰으며, 격주 1회 주사에 적합하였다.
23.1
Fc -( G4S )3- FGF21 ( L98R , P171G , A180E)의 시험관 내 활성
Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 ELK-루시퍼라아제 시험관 내 검정에서 야생형 FGF21의 Fc 융합체 또는 야생형 천연 FGF21과 유사한 활성을 보유하는지 여부를 조사하기 위해 실험을 수행하였다.
293T 세포가 β-Klotho 및 루시퍼라아제 리포터 구성체를 과발현하는 재조합 인간 293T 신장 세포 시스템을 이용하여 ELK-루시퍼라아제 검정을 수행하였다. β-Klotho는 FGF 수용체를 활성화시키고 Erk 인산화를 포함하는 세포내 신호 전달을 유도하기 위해 FGF21에 필요한 보조 수용체이다. Erk-루시퍼라아제 리포터 구성체는 GAL4-ELK1 및 5×UAS-루시퍼라아제 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다. 5×UAS-루시퍼라아제 리포터는 Gal4 결합 부위의 5개의 일렬반복 복제본을 포함하는 프로모터에 의해 유도된다. 이의 리포터 활성은 인산화된 Erk 수준에 의해 조절되며, FGF21 활성을 간접적으로 모니터링하고 정량하는데 이용된다.
6시간 동안 상이한 농도의 야생형 FGF21, 야생형 FGF21의 Fc 융합체, Fc-L15-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 존재 하에 293T 세포를 배양한 후 세포 용해물을 루시퍼라아제 활성에 대해 분석함으로써 ELK-루시퍼라아제 검정을 수행하였다. 각각의 FGF21 구성체에 대해 ELK-루시퍼라아제 검정에서 수득한 발광도를 y-축에 표시하고, 화합물 농도를 x-축에 표시하였다.
도 51은 Erk-루시퍼라아제 검정에서 평가된 화합물의 용량 반응을 나타낸다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 FGF21 야생형의 Fc 융합체와 유사한 활성을 보유하여, L98R, P171G 및 A180E의 돌연변이 조합이 FGF21의 생체 활성을 변화시키지 않는다는 것을 시사하였다. 천연 야생형 FGF21에 비해, Fc 융합 구성체는 상기 보조 수용체 β-Klotho가 과발현된 세포 기반 분석에서 약간 감소한 역가와 최대 활성을 나타내었다.

23.2
상이한 링커 서열을 포함하는 Fc - FGF21 ( L98R , P171G , A180E) 융합체의 시험관 내 활성
유사한 Fc 융합 유사체를 상이한 링커 서열 GGGGGSGGGSGGGGS(서열번호: 28)를 통해 인간 IgG1 Fc를 FGF21(L98R, P171G, A180E)에 융합시켜 생성하였다. 상기 링커를 L15로 명명하고, 생성 융합 분자를 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G, A180E)(서열번호: 57)로 명명하였다. 이 실험에서는 Fc-FGF21(L98R, P171G, A180E) 융합체의 활성에 대한 상이한 링커 서열의 영향을 연구하였다.
6시간 동안 상이한 농도의 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 존재 하에 293T 세포를 배양한 후 세포 용해물을 루시퍼라아제 활성에 대해 분석함으로써 ELK-루시퍼라아제 검정을 수행하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G, A180E)과 유사한 활성을 나타내어, 상이한 링커 서열, 예컨대 (G4S)3 또는 L15 링커가 Fc-FGF21 융합체의 생체 활성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 시사하였다.
23.3
결합 검정에서 β- Klotho 에 대한 Fc -( G4S )3- FGF21 ( L98R , P171G , A180E)의 시험관 내 결합 친화도
인간 및 사이노몰구스 β-Klotho에 대한 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 결합을 Biacore 용액 평형 결합 검정에서 평가하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 친화도를 또한 L98R 및 P171G 돌연변이만을 갖는 Fc-융합 FGF21 유사체, 즉 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G)(서열번호: 43)과도 비교하였다.
뉴트라비딘을 아민 커플링을 이용하여 CM5 칩 상에 고정하였다. 바이오틴-FGF21을 2번째로 흘리는 세포 상에 ~1500RU로 포획하였다. 첫 번째로 흘리는 세포는 백그라운드 대조군으로 이용하였다. 5×희석도(0.03~2000nM)의 FGF21 돌연변이체를 PBS + 0.1mg/ml BSA, 0.005% P20 중의 10nM 인간 또는 25nM 사이노몰구스 β-Klotho와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합 용액 중 자유 β-Klotho의 결합을 바이오틴-FGF21 표면에 걸쳐 주입하여 측정하였다. 용액 중 FGF21 돌연변이체의 부재 하에 100% β-Klotho 결합 신호를 측정하였다. FGF21 돌연변이체의 농도 증가에 따른 β-Klotho 결합 반응의 감소는 β-Klotho가 용액 중에 FGF21 돌연변이체에 결합하여 β-Klotho가 고정된 바이오틴-FGF21 표면에 결합하는 것이 차단됨을 시사하였다. FGF21의 몰 농도에 대한 혼합물의 상대 결합을 GraphPad Prizm 5를 이용하여 도식화하였다. EC50은 동일한 소프트웨어에서 단일 부위 경쟁 비선형 적합모델을 이용하여 계산하였다.
도 52는 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G)의 인간(우측) 및 사이노몰구스 β-Klotho(좌측)에 대한 Biacore 용액 평형 결합 검정 결과를 나타낸다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G)에 비해 인간 및 사이노몰구스 β-Klotho 모두에 대해 2배 이상 개선된 결합 활성을 나타내었다.
23.4
당뇨병 db / db 마우스에서의 Fc -( G4S )3- FGF21 ( L98R , P171G , A180E)의 생체내 효능
Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 당뇨병 db/db 마우스에서 혈당을 줄이고 체중을 감소시키는 것과 같은 대사상 유익한 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 연구하였다. 상기 연구는 또한 단회 주사 후 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 지속 기간 및 용량 반응을 조사하기 위해 수행하였다. 0.1, 0.3, 1 및 3mg/kg 용량의 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 당뇨병 db/db 마우스에 복강 내 주사하였다. 비히클(10mM Tris, 2.2% 수크로오스, 3.3% 소르비톨, pH 8.5)-처리군도 연구에 포함시켰다. 기준선에서(주사 전), 그리고 주사 후 6, 24, 72, 120 및 168시간에 각 동물로부터(군당 n=10) 혈액 샘플을 수득하였다. 혈당 수준은 OneTouch Glucometer(LifeScan, Inc. Milpitas, CA)로 측정하였다. 체중은 기준선(0시간), 주사 후 24, 72, 120, 및 168시간에 측정하였다.
도 53a는 비히클 또는 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 주사 후 다양한 시점에서의 db/db 마우스의 혈당 수준을 나타낸다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 db/db 마우스에서 혈당 수준의 용량-의존적 감소를 일으켰다. 최대 혈당 감소는 기준선으로부터 또는 비히클-처리군에 비해 약 50%였다. 최대 효과는 주사 후 6시간 내에 도달되어 주사 후 120시간 동안 유지되었다. 혈당 수준은 약 168시간에 기준선으로 복귀하기 시작하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)에 있어서 절반 최대 효과에 도달하는데 필요한 용량인 추정 ED50는 db/db 마우스에서 약 1mg/kg이었다.
도 53b는 db/db 마우스로의 단회 주사 후 체중에 대한 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 효과를 나타낸다. 결과는 0시간(주사 전)으로부터의 체중 변화로 나타낸다. 비히클-처리 마우스는 7일의 연구 기간 동안 점진적이고 안정한 체중 증가를 나타내었다. 그러나 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 처리한 마우스에서는 체중 증가율이 용량 의존적 방식으로 저해되었다. 용량이 높을수록 증가 저해가 더 길었다. 한 예에서는, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 3mg/kg에서 5일간, 1mg/kg에서 3일간, 또는 0.3mg/kg에서 1일간 체중 증가를 둔화시켰다. 이후에는 증가율이 회복되었다. 체중 감소에 대한 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 추정 ED50은 상기 실험에서 약 1mg/kg이었다.
23.5
상이한 주사 빈도를 이용한 DIO 마우스에서의 Fc -( G4S )3- FGF21 ( L98R , P171G , A180E) 및 Fc -( L15 )- FGF21 ( L98R , P171G )의 효능 비교
상기 연구는 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)보다 덜 자주 주사해도 유사 효능을 얻을 수 있는지 여부를 결정하기 위한 것이었다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 주 1회(Q7D) 또는 격주 1회(Q14D) 투여한, 또는 Fc-L15-FGF21(L98R, P171G)을 주 2회(BIW), Q7D 또는 Q14D로 투여한 DIO 마우스에서 연구를 수행하였다.
4주령 웅성 C57BL/6 마우스에 포화 지방산이 농축된 지방을 통한 60% 에너지를 포함하는 고지방 식사(D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)를 섭식시켜 DIO 마우스를 준비하였다. 　고지방 식사 공급 12주 후, 체중 및 혈당 수준을 측정하였다. 이어서 DIO 마우스를 비히클군 또는 처리군으로 무작위 분류하여 유사한 기준선 평균 혈당 수준 및 체중을 얻었다. 본　연구에는 총 7개 군이 포함되었다: Q7D로 투여한 비히클군; Q7D 또는 Q14D로 투여한 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 처리군; 또는 BIW, Q7D 또는 Q14D로 투여한 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 처리군. 복강 내 주사하고 31일 동안 연구를 수행하였다. 체중은 매주 측정하였다. 연구 28일째에 GTT를 수행하고, 31일째에 연구를 종료하였다. 연구 설계를 도 54에 도식적으로 나타낸다.
도 55는 상이한 투여 빈도에서 비히클, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)을 처리한 마우스에서의 GTT 프로파일을 나타낸다. 당 부하는 비히클에 비해 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 Q7D 또는 Q14D로 처리한 마우스에서 통계적으로 유의미하게 개선되어, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 유효하며 DIO 마우스에서 Q14D 투여에 적합함을 시사하였다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)은 BIW 또는 Q7D로 투여 시 당 부하를 개선시켰으나 Q14D에서는 개선시키지 못하여, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)이 마우스에서 Q14D 주사에 있어서는 덜 적합함을 시사하였다. Q7D 또는 Q14D로의 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 효능은 각각 BIW 또는 Q7D로의 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비견되어, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 보다 2배 덜 빈번하게 투여할 수 있음을 시사하였다.
도 56은 상이한 투여 빈도로 비히클, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)로 처리한 마우스에서 기준선(0일)으로부터의 체중 변화를 나타낸다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)로 Q7D 처리한 마우스에서는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)로 BIW 처리한 마우스에서와 마찬가지로 체중이 현저하게 감소하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)로 Q14D 처리한 마우스 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)로 Q7D 처리한 마우스에서는 체중이 중간 정도로 감소하였다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)로 Q14D 처리한 마우스에서는 유의미한 체중 효과가 관찰되지 않았다. 체중에 대한 효과는 상술된 GTT에 대한 효과와 일치하여, Fc-(G4S)4-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 Q14D 투여에서 유효하며, 동일한 효과를 얻기 위해 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 보다 약 2배 덜 빈번한 주사가 필요함을 시사하였다.
실시예 24
FGF21 돌연변이체를 포함하는 히드로겔 제형물
단백질 기반 치료제를 위한 제형 제제로서, 히드로겔은 여러 바람직한 특성을 제공한다. 예를 들어, 히드로겔은 히드로겔 내에 도입되는 단백질의 천연 구조 및 기능을 보존시킨다. 또한, 이들은 잘 관용되며 중합체 및 가교 유형에 의존하고, 생분해성을 지닐 수 있다. 추가로 히드로겔은 단백질의 지속 방출을 위해 이미 성공적으로 이용되어 왔다. 따라서 히드로겔을 본원에 개시된 FGF21 돌연변이체를 위한 가능한 전달 방법으로서 조사하였다.
본 실시예에 기재된 모든 실험에서는 히드로겔을 다음과 같이 제조하였다. PBS 중 1.25% 소 젤라틴(Sigma) 용액을 제조하였다. 가교제인 메타크릴산 무수물을 16:1, 24:1 또는 32:1의 몰비(MA 대 젤라틴)로 첨가하였다. 생성 용액을 물에서 투석하여 모든 미중합 메타크릴아미드를 제거하고 히드로겔 비히클을 생성하였다. 마지막으로 FGF21 돌연변이체를 포함하는 히드로겔을 제조하기 전까지 히드로겔 비히클을 동결건조하여 4℃에서 보관하였다. 이 제조물을 이용하여 본원에 개시된 임의의 FGF21 돌연변이체를 포함하도록 후속 변형시킬 수 있는 젤라틴 기재 히드로겔 비히클을 제조할 수 있다.
이어서, 특정 FGF21 돌연변이체를 포함하는 히드로겔을 제조하였다. 10% 동결건조 메타크릴산 젤라틴 히드로겔 비히클로 시작하여, 용액을 제조하였다. 히드로겔 비히클을 가온한 후 원심분리하여 동결건조된 MA 젤라틴 히드로겔 비히클을 용해시키고 액화하였다. 이어서 본 실시예에서 선택된 FGF21 단백질(FGF21(L98R, P171G),(서열번호: 37))을 소정 농도로 액화 젤라틴 용액에 첨가하였다. 이후 TEMED 원액을 첨가하였다. 이어서 KPS 원액을 첨가하고 용액을 부드럽게 혼합하였다. 1ml 시린지에 200㎕로 채우고, 실온에서 1.5 내지 2시간 동안 정치시켰다. 상기 시린지를 -20℃에서 보관하고, 사용 전에 하룻밤 동안 4℃에서 해동하였다. 10mM Tris, 9% 수크로오스를 포함하고(pH 8.5) FGF21 돌연변이체를 넣지 않은 히드로겔 비히클을 대조군으로 사용하였다.
생체내 실험을 위해, 상기 시린지를 동물에게 주사 전 약 10분 동안 37℃ 가열 패드 상에 놔두었다.
24.1
다양한 가교비를 갖는 10% 히드로겔로부터 방출되는 FGF21 ( L98R , P171G )의 시험관 내 활성
본 실험의 목적은 ELK-루시퍼라아제 시험관 내 검정에서 천연형 FGF21(L98R, P171G)에 비해 히드로겔로부터 방출되는 FGF21(L98R, P171G)이 생물학적으로 활성을 갖는지 여부를 평가하는 것이었다.
FGF21(L98R, P171G)을 제조하고, 10% 메타크릴산 젤라틴 용액 내로 기재된 바와 같이 16:1, 24:1 및 32:1의 메타크릴산 젤라틴 가교비로 도입하였다. 이어서 히드로겔을 시험관 내 완충 용액 내에 분산하여 FGF21(L98R, P171G)을 방출시켰다. 100 또는 150시간 후 매질을 수집하여 FGF21(L98R, P171G) 활성에 대해 시험관 내 검정하였다. 분석적 검정(예컨대 SDS-PAGE, 크기 배제 HPLC, 및 역상 HPLC) 결과, 방출되는 FGF21(L98R, P171G)이 모든 시점에서 온전한 것으로 나타났다.
293T 세포가 β-Klotho 및 루시퍼라아제 리포터 구성체를 과발현하는 재조합 인간 293T 신장 세포 시스템을 이용하여 ELK-루시퍼라아제 검정을 수행하였다. β-Klotho는 FGF 수용체의 활성화를 위해 FGF21에 필요한 보조 수용체이다. 상기 검정에 사용된 FGF 수용체는 293T 신장 세포에서 발현되는 내인성 FGF 수용체이다. 루시퍼라아제 리포터 구성체는 GAL4-ELK1 및 Gal4 결합 부위의 5개 일렬반복 복제본(5×UAS-Luc)을 포함하는 프로모터에 의해 유도되는 루시퍼라아제 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다. 루시퍼라아제의 활성은 인산화된 Erk/ELK1 수준에 의해 조절되며, FGF21 활성을 간접적으로 모니터링하고 정량하는데 이용된다.
상이한 농도의 천연형 FGF21(L98R, P171G) 또는 히드로겔 방출 FGF21(L98R, P171G)의 존재 하에 6시간 동안 293T 세포를 배양한 후 세포 용해물을 루시퍼라아제 활성에 대해 분석함으로써 ELK-루시퍼라아제 검정을 수행하였다. 도 57은 ELK-루시퍼라아제 검정의 시험관 내 결과를 나타낸다. 메타크릴산 젤라틴 가교비 16:1, 24:1 및 32:1을 갖는 히드로겔로부터 방출된 FGF21(L98R, P171G)은 천연형 FGF21(L98R, P171G)과 동등한 생물학적 활성을 지녔다. 데이터로부터, 히드로겔이 도입된 단백질의 구조 및 기능을 보존하고 방출된 FGF21(L98R, P171G)은 매질 중에서 10~15시간 후에도 활성을 띄며 안정한 것으로 나타났다.
24.2
ob / ob 마우스에서 상이한 가교비의 히드로겔 FGF21 ( L98R , P171G )의 생체내 효능
본 실험의 목적은 메타크릴산 젤라틴 가교비 24:1 및 32:1로 제조된 FGF21(L98R, P171G) 히드로겔이 생물학적 활성 FGF21(L98R, P171G)을 생체내에서 지속적으로 방출하여 궁극적으로 천연형 FGF21(L98R, P171G)에 비해 더 긴 생체내 효능을 일으키는지 여부를 결정하는 것이었다. 또한, 시험관 내 방출 속도 평가에 근거하여, 더 높은 가교비의 메타크릴산 젤라틴이 도입된 FGF21(L98R, P171G)을 더 양호하게 지속적으로 방출하는지를 결정하였다. 따라서, 본 실험의 또 다른 목적은 메타크릴산 젤라틴 가교비 24:1 및 32:1로 제조된 두 가지 FGF21(L98R, P171G) 히드로겔을 비교하는 것이었다.
FGF21은 혈당, 인슐린, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤 수준을 낮추거나; 체중을 감소시키거나; 당 부하, 에너지 소비 또는 인슐린 감수성을 개선시키는 능력을 포함하는 여러 생물학적 활성을 보유하고 있다. FGF21(L98R, P171G) 히드로겔을 인슐린 내성 ob/ob 마우스에 도입하고, FGF21(L98R, P171G) 히드로겔이 혈당을 낮추고 체중을 감소시키는 능력을 측정하였다. 생체내 작업 절차는 다음과 같았다.
히드로겔을 상술된 절차를 이용하여 제조하였다. 8주령 ob/ob 마우스(Jackson Laboratory)의 주사 부위 털을 면도하고 주사 직전에 이소플루란 및 O2로 마취하였다. 히드로겔(0.2ml)을 피부 아래에 천천히 주사하고 Vetbond를 주사 후 주사 부위에 붙였다. 비히클(10mM Tris, 9% 수크로오스 pH 8.5) 또는 천연 FGF21(L98R, P171G)도 실험에 포함시켜서 히드로겔과 유사하게 주사하였다. 마취에서 깨어난 후 동물들을 우리에 되돌려 넣었다. 주사 전 및 주사 후 다양한 시점에, 예컨대 주사 0, 3, 6, 24, 72, 120, 192 및 264 시간 후에 혈액 샘플을 수득하였다. 혈당 수준은 OneTouch Glucometer(LifeScan, Inc. Milpitas, CA)로 측정하였다. 체중도 모니터링하였다.
도 58 및 59에 실험 결과를 요약한다. 비히클 또는 대조군 히드로겔에 비해, 천연형 FGF21(L98R, P171G)은 주사 3 및 6시간 후 혈당 수준을 신속하게 낮추었다. 그러나 주사 24시간 후 천연형 FGF21(L98R, P171G)의 생체내 활성은 약해져서 혈당 수준이 기준선으로 복귀하였다. FGF21(L98R, P171G) 히드로겔은 주사 후 3시간만큼 일찍부터 혈당을 감소시켰으며, 활성은 8일까지 지속되었다. 가교비 24:1 또는 32:1 간에 유의차는 없었다. FGF21(L98R, P171G) 히드로겔군은 또한 비히클 또는 히드로겔 단독 처리 마우스에 비해 더 느린 체중 증가를 보였다. 이러한 결과는 메타크릴산 젤라틴 가교비 24:1 및 32:1로 제조한 FGF21(L98R, P171G) 히드로겔이 생체내에서 생물학적 활성 FGF21(L98R, P171G)을 지속 방출하고, 궁극적으로 천연형 FGF21(L98R, P171G)에 비해 더 긴 생체내 효능을 일으킬 수 있음을 나타내었다.
24.3
db /B6 마우스에서 상이한 가교비의 히드로겔 FGF21 ( L98R , P171G ) 및 FGF21( L98R , P171G, A180E)의 생체내 효능
소 젤라틴(Sigma) 및 몇몇 FGF21 돌연변이체 및 구성체, 즉 FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 이용하여 히드로겔 제형물을 제조하였다. 히드로겔 대조군도 제조하였다. 히드로겔 0.2mL을 21G 바늘을 갖는 1ml 시린지에 넣었다.
히드로겔 대조군 및 FGF21 돌연변이체를 포함하는 히드로겔을 상술한 바와 같이 제조하였다. 8주령 db/B6 마우스(Jackson Laboratory)의 주사 부위 털을 면도하고 주사 직전에 이소플루란 및 O2로 마취하였다. 히드로겔(0.2ml)을 피부 아래에 천천히 주사하고 Vetbond를 주사 후 주사 부위에 붙였다. 비히클(10mM Tris, 9% 수크로오스 pH 8.5) 또는 천연 FGF21(L98R, P171G)도 실험에 포함시켜서 히드로겔과 유사하게 주사하였다. 마취에서 깨어난 후 동물들을 우리에 되돌려 넣었다. 주사 전 및 주사 후 다양한 시점에, 예컨대 주사 0, 24, 96, 168, 240, 312 시간 후에 혈액 샘플을 수득하였다. 혈당 수준은 OneTouch Glucometer(LifeScan, Inc. Milpitas, CA)로 측정하였다. 체중도 모니터링하였다.
실험 설계는 다음과 같았다:
Figure 112011096586550-pct00027

다양한 매개변수를 측정하였으며, 실험 결과를 도 60~63에 나타낸다. 도 60은 실험 14일에 걸친 혈당 변화를 나타내며, 도 61은 동일한 기간에 걸친 혈당 백분율 변화를 나타낸다. 도 62는 실험 14일에 걸친 체중 변화를 나타내며, 도 63은 동일한 기간에 걸친 체중 백분율 변화를 나타낸다.
도 60~63에 그래프로 나타낸 실험 결과를 다음과 같이 요약할 수 있다:
FGF21(L98R, P171G) 32:1(10%) MA:HU4(10mg/kg)은 주사 24시간 후 혈당을 낮추는데 유효했으며, 혈당 수준은 4~7일 사이에 기준선으로 복귀하였다.
FGF21(L98R, P171G) 32:1(10%) MA:HU4(30mg/kg)은 10mg/kg 용량보다 혈당을 낮추는데 더 유효했으며, 혈당 수준은 7~10일 사이에 기준선으로 복귀하는 것으로 관측되었다.
Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)(3mg/kg) 자체는 주사 24시간 후 히드로겔에서 방출되는 30mg/kg의 FGF21(L98R, P171G)과 유사한 정도로 혈당을 낮추었다.
히드로겔 대조군(FGF21 돌연변이를 포함하지 않음)은 혈당 저하에 대한 어떠한 효과도 갖지 않았다.
FGF21(L98R, P171G) 히드로겔군 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)(히드로겔 내에서 제공되지 않음)은 히드로겔 대조군으로 처리한 마우스에 비해 감소된 체중 증가를 나타내었다.
실시예 25
사이노몰구스 ( Cynomolgus ) 원숭이 연구
본원에 기재된 방법을 이용하여 2개의 Fc-링커-FGF21 구성체를 생성하였다. 첫 번째 구성체에는 (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser 링커 서열(서열번호: 28)에 C-말단이 융합되고 이어서 두 개의 돌연변이 L98R 및 P171G가 도입된 성숙 FGF21 서열(서열번호: 4)의 N-말단에 융합된 IgG1 Fc 서열(서열번호: 11)이 포함되었다. 본 실시예에서는 상기 분자를 "Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)"(서열번호: 43)로 부른다. 두 번째 구성체에는 (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser 링커 서열(서열번호: 31)에 C-말단이 융합되고 이어서 세 개의 돌연변이 L98R, P171G 및 A180E가 도입된 성숙 FGF21 서열(서열번호: 4)의 N-말단에 융합된 IgG1 Fc 서열(서열번호: 11)이 포함되었다. 본 실시예에서는 상기 분자를 "Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)"(서열번호: 47)로 부른다. 이어서 이들 구성체를 본원에 기재된 대로 발현 및 정제하고, 각 단량체의 Fc 영역 사이에 분자간 디술피드 결합을 통해 각 단량체가 연결된 이량체 형태의 단백질로 단리하였다.
25.1 연구 설계
당 부하가 손상된(IGT) 특징을 갖는 사이노몰구스 원숭이로 연구를 수행하였다. 원숭이들은 8~18연령이었다. 이들의 체중은 5~15kg 범위였으며, BMI는 32~70kg/m2범위였다. 화합물 투여 개시 전 6주 동안 44마리 원숭이를 순응시켰다. 순응 기간 동안, 원숭이들을 4주간 주당 4회씩 훈련하여 의자 속박, 피하 주사(PBS, 0.1ml/kg), 위관영양(물, 10ml/kg), 비OGTT 및 OGTT 샘플을 위한 채혈을 포함하는 절차에 익숙하도록 하였다. 훈련 4주 후, 기준선 OGTT 및 혈장 대사 매개변수를 측정하였다. 44마리 원숭이 중 40마리를 선택하여 무작위로 3개 처리군으로 분류하고, 체중, OGTT AUC 반응, 및 혈장 글루코스 및 트리글리세라이드 수준에 대해 유사한 기준선 수준을 얻었다.
연구는 맹검 방식으로 수행하였다. 비히클(n=14), Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(n=13) 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)(n=13)을 화합물 A, B 및 C로 표지하고, 피하 주사를 통해 주 1회 투여하였다. 화합물은 증량 방식으로 낮은 수준(0.3mg/kg)에서부터, 중간 수준(1mg/kg), 높은 수준(3mg/kg)까지 투여하고, 매 3주마다 용량을 높였다. 화합물 처리 9주 후, 화합물 약효세척 및 처리로부터의 회복을 위해 추가 3주 동안 동물을 모니터링하였다. 식품 섭취, 체중, 임상 화학 및 OGTT는 연구 기간 전체에 걸쳐 모니터링하였다. 식품 섭취는 매 식사때마다 측정하였다. 체중은 매주 측정하였다. 각 주사 후 5일째에 매주 혈액 샘플을 수집하여 글루코스, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL- 및 LDL-콜레스테롤 수준을 측정하였다. OGTT는 처리 개시 후 매 3주마다(각 용량 수준 말기에) 수행하였다. 처리 시작일을 0일로 명명하며, 상세 연구 계획을 도 64에 나타낸다.
본 실시예에서 나타내는 결과는 9주 처리 말기에 수집한 데이터이다.
25.2 식품 섭취에 대한 시험 화합물의 효과
각 동물은 순응 기간 동안 확립된 120g의 제형화 식품을 섭취하도록 1일 2회 먹이를 주었다. 각 식사 후 남은 식품을 제거하고 칭량하여 식품 섭취를 계산하였다. 먹이를 주는 시간은 8:00 AM내지 8:30AM(±30분), 그 후 4:30PM 내지 5:00PM(±30분)이었다. 위안을 주기 위해, 각 동물에게 매일 11:30 내지 12:30PM(±30분)에 사과(150g)를 주었다.
비히클에 비해, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 모두 원숭이에서 식품 섭취를 감소시켰다(도 65, 66 및 67). Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 0.3mg/kg 용량에서 AM, 과일 및 PM 식사를 포함하여 모든 식사 시 식품 섭취를 저해하였다. 그러나 용량을 1mg/kg으로 증량하면 효과가 약해지고 식품 섭취가 처리 약 30일 후에는 기준선 또는 대조군 수준에 가깝게 복귀하였다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)은 AM 식품 섭취 상에는 유의미한 효과를 갖지 않았으며, 용량을 1 및 3mg/kg으로 증량했을 때 PM 식사 시의 식품 섭취만 약간 감소시켰다. 그러나 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)은 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)과 유사하게 과일 섭취를 줄였다. 전체적으로 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 식품 섭취 저해에 대해 더 큰 효과를 나타내었다. 식품 섭취에 대한 효과는 단기적인 것으로 나타났으며, 처리 약 30일 후에는 식품 섭취가 회복되었다.
25.3. 체중에 대한 시험 화합물의 효과
연구 기간 전체에 걸쳐 체중을 매주 모니터링하였다. 9주 처리 과정에 걸쳐 비히클을 처리한 동물의 체중은 일정하게 유지된 반면, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 처리한 동물의 체중은 점진적으로 감소하였다. 도 68에 나타낸 바와 같이, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 보다 현저한 체중 감소를 일으켰다.
25.4. 체질량 지수( BMI ), 피부 주름 두께( SFT ) 및 복부 둘레( AC )에 대한 시험 화합물의 효과
연구 기간 전체에 걸쳐 체중을 측정할 때 시험 화합물의 투여 전과 후에 모두 BMI, SFT 및 AC를 매주 모니터링하였다. BMI는 신장의 제곱으로 나눈 개인별 체중으로 정의된다. SFT는 해당 부위 상에 일정한 장력이 가해지는 특정 구경에서의 피부 이중층 및 하부 지방의 두께이다. BMI, SFT 및 AC는 체성분에 대한 상대적으로 정확하고 간단하며 저렴한 측정으로서, 특히 피하 지방의 척도이다. 비히클을 처리한 동물은 연구 기간 전체에 걸쳐 상대적으로 안정한 BMI, SFT 및 AC를 나타내었다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 처리한 동물은 연구 9주 과정에 걸쳐 감소한 수준의 BMI, SFT 및 AC를 나타내어, 두 화합물이 모두 지방 질량을 감소시킴을 시사하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 BMI, SFT 및 AC에 있어서 보다 효과적이었으며 보다 현저한 감소를 일으켰다. 결과를 도 69, 70 및 71에 각각 나타낸다.
25.5 공복 혈당 수준에 대한 시험 화합물의 효과
하룻밤 동안 절식시킨 동물로부터 혈액을 수집하였다. 주사 후 5일째에 매주 채혈을 수행하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 모두 공복 혈당 수준을 낮추었다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 0.3mg/kg 용량에서 공복 혈당 수준을 낮췄으며, 1mg/kg으로 증량했을 때 최대 혈당 감소에 도달하였다. 그러나 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)은 평가한 최대 용량(3mg/kg)에서만 혈당 수준을 중간 정도로 감소시켰다. 따라서 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 더 효과적이었으며 보다 현저한 혈당 감소를 일으켰다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)로 처리한 어느 원숭이에서도 저혈당은 관찰되지 않았다. 도 72는 연구 과정 동안의 공복 혈장 글루코스 수준을 나타낸다.
25.6 경구 당 부하 시험( OGTT )에 대한 시험 화합물의 효과
치료 개시 전후에 OGTT를 수행하였다. 각 용량 수준에서 화합물 효과를 평가하기 위해 투여 후 OGTT를 매 3주마다 수행하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 0.3 내지 3mg/kg의 모든 평가 용량에서 당 부하를 개선하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 처리에 반응하여 글루코스 수준이 감소되었으며 글루코스 일시 투여 후 글루코스 가동역이 증가하였다. 용량-반응은 관찰되지 않아서, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 0.3mg/kg 용량에서 그 최대 효과에 도달하였음을 시사하였다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)은 1mg/kg 용량에서만 당 부하를 개선시켰으며, 3mg/kg으로 증량했을 때 그 효과가 약해진 이유는 명확하지 않았다. 도 73은 사전 및 사후-OGTT 곡선 프로파일과 OGTT 곡선 하 면적을 나타낸다.
25.7 트리글리세라이드 수준에 대한 시험 화합물의 효과
하룻밤 동안 절식시킨 동물로부터 혈액을 수집하였다. 각 주사 후 5일째에 매주 채혈을 수행하였다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 처리한 동물에서 트리글리세라이드 수준이 유의미하게 감소되었다. 그러나 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 더 효과적이었다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 0.3mg/kg에서 혈장 트리글리세라이드 수준의 최대 감소를 일으킨 반면 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)은 최대 평가 용량(3mg/kg)으로 트리글리세라이드 수준을 단지 중간 정도 감소시켰다. 도 74는 연구 과정 동안 공복 혈장 트리글리세라이드 수준을 나타낸다.
25.8 총 콜레스테롤 및 HDL -콜레스테롤 수준에 대한 시험 화합물의 효과
하룻밤 동안 절식시킨 동물로부터 혈액을 수집하였다. 각 주사 후 5일째에 매주 채혈을 수행하였다. 혈장 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 수준은 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 처리 후 증가하는 경향을 보였다. 도 75 및 76은 연구 과정에 걸친 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 수준을 나타낸다.
25.9 결론
Fc 접합된 FGF21 돌연변이체, 즉 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)을 처리한 동물인 웅성 IGT 사이노몰구스 원숭이에서 수행한 증량 연구에서, 대사 매개변수의 개선이 나타났다. 체중이 감소하고 체성분이 개선되었다. 식품 섭취의 단기 감소가 관찰되었으며, 연구 중간에 식품 섭취가 기준선 또는 대조군 수준으로 회복되었다. 공복 혈당 및 트리글리세라이드 수준도 또한 두 화합물 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) 또는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 모두에 의해 감소되었다. OGTT가 개선되고 HDL-콜레스테롤 수준이 약간 상승하였다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 모든 평가 용량에서 측정한 모든 매개변수에 있어서 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 보다 우수한 것으로 나타났다. Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 0.3mg/kg 투여 시에 측정된 대부분의 매개변수에 대해 최대 효과를 나타내었다. 따라서 고등 생물종에서의 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 치료 유효 용량은 0.3mg/kg 미만일 수 있다.
실시예 26
사이노몰구스 원숭이에서의 안정성 연구
본 연구는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)(서열번호: 57)이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(서열번호: 43)에 비해 더 프로테아제에 내성을 갖는지 여부를 결정하기 위해 고안되었다. 실시예 21에 나타낸 바와 같이 마우스 또는 원숭이로의 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 주사 후에 카르복시 말단 프로세싱이 관찰되었다. 분해로 인해 C-말단의 1 내지 3개 아미노산 잔기의 연속 소실이 일어났다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)의 C-말단을 캡핑하거나 C-말단 내로 추가 돌연변이를 도입하는 시도에 의해 더 우수한 분자 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 얻었다. 본 연구는 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 개선된 생체내 안정성을 갖는지 여부를 평가하기 위해 고안되었다.
Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 구성체를 생성하였다. 이들 구성체는 C-말단에서 (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser 링커 서열(서열번호: 28)에 융합되고, 이어서 두 개의 돌연변이 L98R, P171G, 또는 세 개의 돌연변이 L98R, P171G, 및 A180E가 도입된 성숙 FGF21 서열(서열번호: 4)의 N-말단에 융합된 IgG1 Fc 서열(서열번호: 11)을 포함하였다. 이어서 이들 구성체를 본원에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하고, 각 단량체의 Fc 영역 사이에서 분자간 디술피드 결합을 통해 각 단량체가 연결된 이량체 형태의 단백질로 단리하였다.
Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 생체내 안정성을 웅성 사이노몰구스 원숭이에서 비교하였다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 23.5mg/kg 사이노몰구스 원숭이에게 복강 내 주사하였다. 단회 iv 주사 후 다양한 시점에 혈액 샘플을 수집하였다. 면역친화도-MALDI-TOF 질량 분광측정을 이용하여 주사 후 각 시점에서 대사물을 모니터링하였다. 결과를 도 77에 나타낸다.
Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 무손상 분자의 모 피크에 인접한 더 소수의 검출가능한 질량 피크를 가지며 현저히 감소된 C-말단 분해를 나타내어, A180E 돌연변이가 C-말단 펩티다아제 분해를 지연시킴을 시사하였다. [1-376], [1-394] 및 [1-401]로 추정되는 질량 감소를 나타내는 더 큰 절단물도 또한 FGF21 폴리펩타이드 서열에서 133-134, 153-154 및 158-159에 해당하는 부위에서 관찰되었다. 내부 엔도펩티다아제의 클리핑이 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E) 둘 다의 전체적 대사에 기여하여, A180E 돌연변이는 내부 엔도펩티다아제 분해 속도에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
해상도를 증가시키고 분해 혼합물의 상세 정보를 제공하기 위해, MRM(다중-반응-모니터링) LC-MS 질량 분광측정도 수행하여 C-말단 분해 절편의 다양한 형태를 모니터링하였다. 원숭이 샘플을 친화도에 따라 정제한 후 Asp-N으로 분해시켰다. 이어서 C-말단의 소화된 펩타이드를 MRM으로 모니터링하였다. 다양한 형태의 C-말단 분해 절편의 결과를 도 78에 나타낸 전체길이 펩타이드 종에 대한 상대량으로(%) 표시한다. MALDI 스펙트럼과 일치하게, C-말단 절편의 MRM 반정량적 분석에서도 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)을 투여한 원숭이에서 C-말단으로부터의 1~3개 아미노산이 소실된 펩타이드 절편의 상대적 풍부함이 감소되고 무손상 분자의 상대적 풍부함이 증가한 것으로 나타났다.
요약하면, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 사이노몰구스 원숭이에서 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 C-말단 분해가 감소되고 생체내 안정성이 증강된 것으로 나타났다.
실시예 27
마우스에서 Fc -( L15 )- FGF21 ( L98R , P171G , A180E) 및 Fc -( L15 )- FGF21 ( L98R , P171G )의 약동역학
본 연구는 웅성 C57BL/6 마우스에서 단회 정맥 내 투여 후 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)(서열번호: 57) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(서열번호: 43)의 약동역학을 평가하기 위해 고안되었다.
Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)을 정맥내 주사를 통해 20mg/kg 투여하였다. 혈액 샘플은 투여 후 0.083시간(5분), 1, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 168, 및 240 시간째에 수집하였다. 무손상 전체길이 분자의 혈장 농도를 결정하기 위해, N-말단 및 C-말단 FGF21에 대한 면역반응성을 갖는 ELISA 검정을 진행하였다. 이 검정에서 무손상 전체길이 분자에는 다른 분해 산물에서 유래하는 오염물이 거의 없는 것으로 나타났다. 마우스에서 정맥 내 주사 후 240시간에 걸쳐 무손상 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E) 및 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)의 혈장 농도를 도 79에 나타낸다.
Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 혈장 농도는 주사 후 24 내지 168시간에 걸쳐 동일 용량 수준으로 투여한 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)의 혈장 농도에 비해 현저히 더 높았다. 상당량의 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)이 마우스에서 주사 168시간 후에도 측정가능하였다. 결과적으로 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)은 마우스에서 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)에 비해 2배 증가된 혈장 순환 반감기 및 AUC 범위를 나타내었다. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G, A180E)의 반감기는 16.6시간이었고, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)의 반감기는 9.4시간이었다. 두 화합물 모두 투여 240시간 후에는 검출가능한 수준 미만으로 떨어졌다.
실시예 28
용해도를 개선시키거나 C-말단 클리핑 을 감소시켜 반감기를 증가시키기 위한 N-연관 글리코실화 돌연변이체의 생성
천연 아미노산 서열 손상을 최소화하면서 포유류에서 발현하기 위해 잠재적 N-연관 글리코실화 부위를 생성하도록 FGF21 돌연변이체를 설계하여 생성하였다. 이 돌연변이체는 FGF21(Y179N, S181T)(서열번호: 161), FGF21 Y179N(서열번호: 163) 및 FGF21 P124S(서열번호: 165)를 포함하도록 구축되었다.
293-6E 세포에서 상기 돌연변이체의 일시적 발현을 수행하고, 조건화 배지를 ELK-루시퍼라아제 시험관 내 검정에서 활성에 대해 평가하였다. 상이한 농도의 정제 단백질이 아닌 조건화 배지의 연속 희석액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4에 기재된 바와 같이 ELK-루시퍼라아제 검정을 수행하였다.
조건화 배지의 분석에서 일시 발현 시스템에서는 야생형에 비해 증가된 글리코실화가 성취되지 않은 것으로 드러났다. 도 80은 ELK-루시퍼라아제 활성 검정 결과를 나타낸다. 도 80에 나타낸 결과는 FGF21 P124S 돌연변이가 FGF21 활성에는 악영향을 미치지 않지만 FGF21 Y179N 및 FGF21(Y179N, S181T) 돌연변이체는 글리코실화의 부재 하에서 ELK-루시퍼라아제 검정에서 분석된 바와 같이 감소된 활성을 야기한 것을 나타내었다.
본 발명을 다양한 구현예과 관련하여 설명하였지만, 당업자에게 변경 및 변형이 나타날 것은 물론이다. 따라서, 첨부되는 청구의 범위는 특허청구되는 본 발명의 범위 내에 포함되는 그와 같은 모든 동등한 변경을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에서 사용되는 섹션의 제목은 단지 조직적인 구성을 위한 것으로서, 본원에서 설명되는 주제를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
본원에서 언급되는 모든 참고문헌은 임의 목적으로 본원에 참고로 통합된다.
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Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg gcc ctg tat gga 336 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc cgg gag ctg ctt ctt 384 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg 432 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac cct gca ccc cga gga 480 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc ccc gca ccc ccg gag 528 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg ggc tcc tcg gac 576 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc ccc agc tac gct 624 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 tcc tga 630 Ser <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 3 <211> 546 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(546) <400> 3 cac ccc atc cct gac tcc agt cct ctc ctg caa ttc ggg ggc caa gtc 48 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca gaa gcc cac 96 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag agc 144 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att caa 192 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg 240 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc cgg 288 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac 336 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac cct 384 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc ccc 432 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg 480 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc 528 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 ccc agc tac gct tcc tga 546 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 4 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp 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gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg 432 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac cct gca ccc cga gga 480 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc ccc gca ctc ccg gag 528 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg ggc tcc tcg gac 576 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc ccc agc tac gct 624 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 tcc tga 630 Ser <210> 6 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser <210> 7 <211> 546 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(546) <400> 7 cac ccc atc cct gac tcc agt cct ctc ctg caa ttc ggg ggc caa gtc 48 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 cgg cag cgg tac ctc tac aca 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ctg cca cta cca ggc ctg ccc ccc 432 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 gca ctc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg 480 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc 528 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 ccc agc tac gct tcc tga 546 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 8 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> portion of a mature human FGF21 polypeptide <400> 9 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 681 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(681) <400> 10 gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg ggg 48 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg 96 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 atc tcc cgt acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac 144 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg 192 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 cat aat gcc aag aca aag ccg cgt gag gag cag tac aac agc acg tac 240 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc 288 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc 336 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg 384 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 tac acc ctg ccc cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc 432 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag 480 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 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tagtgagctc gaattcttag gaagcgtagc tgg 33 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ggagatatac atatgccaat tccagattct tctccattat t 41 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 catatgtata tctccttctt aaagttaaac aaaa 34 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 16 aaaacaaatt gaaattcttc ctctatatgt atac 34 <210> 17 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand from a portion of an FGF21 expression construct <400> 17 ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgcatcca attccagatt cttctccatt 60 att 63 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense strand from a portion of an FGF21 expression construct <400> 18 aaaacaaatt gaaattcttc ctctatatgt atacgtaggt taaggtctaa gaagaggtaa 60 taa 63 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 19 aggaggaata acatatggac aaaactcaca catg 34 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 20 ggatccacca ccaccgctac cac 23 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 ggtggtggtg gatcccatcc aattccagat tcttctcca 39 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 tagtgagctc gaattcttag gaagcgtagc tgg 33 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 atggtggaac cttcccaggg ccgaagc 27 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 ggaaggttcc accatgctca gagggtccga 30 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand from a portion of an FGF21 expression construct <400> 25 ctcctcggac cctctgagca tggtgggacc ttcccagggc cgaagcccca 50 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 26 agcctgggag actcgtacca ccttggaagg 30 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> antisense strand from a portion of an FGF21 expression 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cgt gag cgt ctt ctt gag gac ggt tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc 336 Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgt gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg ggt ggt tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc taa 549 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 37 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 38 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 RGE <220> <221> CDS <222> (1)..(546) <400> 38 cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg ggc caa gtc 48 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 cgg cag cgt tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca gaa gcc cac 96 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 ctg gag atc agg gag gac ggg acg gtg ggg ggt gct gct gac cag agc 144 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg ggt gtt att caa 192 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 atc ttg ggt gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg 240 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc cgt 288 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg 85 90 95 gag cgt ctt ctt gag gac ggt tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac 336 Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His 100 105 110 ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgt gac cct 384 Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro 115 120 125 gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc ccc 432 Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro 130 135 140 gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg 480 Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val 145 150 155 160 ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg ggt ggt tcc cag ggc cga agc 528 Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln Gly Arg Ser 165 170 175 ccc agc tac gaa tcc taa 546 Pro Ser Tyr Glu Ser 180 <210> 39 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val 1 5 10 15 Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser 35 40 45 Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln 50 55 60 Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser 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ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att 192 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat 240 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc 288 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc 336 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg cca 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc 576 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 180 185 190 ggt ggt ggt gga tcc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca 624 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 195 200 205 cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 672 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 210 215 220 aag gac acc ctc atg atc tcc cgt acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg 720 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 225 230 235 240 gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 768 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 245 250 255 gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgt gag gag cag 816 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 260 265 270 tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 864 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 275 280 285 gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 912 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 290 295 300 ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 960 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 305 310 315 320 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc 1008 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 325 330 335 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 1056 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 340 345 350 gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 1104 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 355 360 365 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat 1152 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 370 375 380 agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 1200 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 385 390 395 400 tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 1248 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 405 410 415 agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1272 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 <210> 41 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu 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cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 144 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 192 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgt gag gag cag tac aac agc acg 240 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 288 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg 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Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct 864 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 275 280 285 gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga 912 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg 960 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 305 310 315 320 cca gat ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc 1008 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 325 330 335 agc ttc cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc 1056 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 340 345 350 gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac 1104 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 355 360 365 cgg gac cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc 1152 Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 370 375 380 ctg ccc ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc 1200 Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 385 390 395 400 ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga gct tcc cag 1248 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Ala Ser Gln 405 410 415 ggc cga agc ccc agc tac gct tcc taa 1275 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 420 <210> 53 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc cgt tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc 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tac aat gtt tac cag tcc 1056 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 340 345 350 gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac 1104 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 355 360 365 cgg gac cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc 1152 Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 370 375 380 ctg ccc ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc 1200 Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 385 390 395 400 ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct ctg cag 1248 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Leu Gln 405 410 415 ggc cga agc ccc agc tac gct tcc taa 1275 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 420 <210> 55 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 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672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct 864 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 275 280 285 gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga 912 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg 960 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 305 310 315 320 cca gat ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc 1008 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 325 330 335 agc ttc cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc 1056 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 340 345 350 gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac 1104 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 355 360 365 cgg gac cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc 1152 Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 370 375 380 ctg ccc ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc 1200 Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 385 390 395 400 ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gaa gct ctg cag 1248 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Ala Leu Gln 405 410 415 ggc cga agc ccc agc tac gct tcc taa 1275 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 420 <210> 59 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 59 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tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc cgt tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 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290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg 960 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 305 310 315 320 cca gat ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc 1008 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 325 330 335 agc ttc cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc 1056 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 340 345 350 gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac 1104 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 355 360 365 cgg gac cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc 1152 Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 370 375 380 ctg ccc ccc gca ccc ccg gag cca gcc gca gtt ctg gcc ccc cag ccc 1200 Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Ala Ala Val Leu Ala Pro Gln Pro 385 390 395 400 ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag 1248 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser 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Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 385 390 395 400 ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg tgc cct tcc cag 1248 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Cys Pro Ser Gln 405 410 415 ggc cga agc ccc agc tac gct tcc taa 1275 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 420 <210> 71 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 71 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr 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tac gtg gac ggc gtg gag 192 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgt gag gag cag tac aac agc acg 240 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 288 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc cgt tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag 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gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct 864 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 275 280 285 gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga 912 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg 960 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 305 310 315 320 cca gat ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc 1008 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 325 330 335 agc ttc cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc 1056 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 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Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct 864 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 275 280 285 gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga 912 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg 960 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 305 310 315 320 cca gat ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc 1008 Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys 325 330 335 agc ttc cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc 1056 Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser 340 345 350 gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac 1104 Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His 355 360 365 cgg gac cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc 1152 Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly 370 375 380 ctg ccc ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc 1200 Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro 385 390 395 400 ccc gat gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga ggt tcc cag 1248 Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Gly Ser Gln 405 410 415 ggc cga agc ccc agc tac gct tcc taa 1275 Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 420 <210> 89 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 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cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct 864 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 275 280 285 gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga 912 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg 960 Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg 305 310 315 320 cca gat ggg gcc ctg tat 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288 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 336 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 384 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc cgt tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct 864 Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala 275 280 285 gac cag agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga 912 Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly 290 295 300 gtt att caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg 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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly His Pro Ile Pro Asp Ser Ser 225 230 235 240 Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr 245 250 255 Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly 260 265 270 Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu 275 280 285 Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser 290 295 300 Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His 305 310 315 320 Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly 325 330 335 Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro 340 345 350 Gly Asn Lys Ser 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tac cag tcc gaa gcc 336 Arg Glu Leu Asp Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc taa 549 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 111 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 111 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile 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cag cag aca gaa gcc 96 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag 144 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att 192 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat 240 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc 288 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa acc 336 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Thr 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta 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His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca aaa cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Lys Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc taa 549 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 119 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 119 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg 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Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att 192 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat 240 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc 288 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc 336 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca tat cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Tyr Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc taa 549 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 121 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Tyr 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Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cgt gat 240 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Arg Asp 65 70 75 80 ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc 288 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 cgg gag ctg ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc 336 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro 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His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc taa 549 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 133 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 133 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Cys His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 134 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 L98C <220> <221> CDS <222> (1)..(549) <400> 134 atg cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg ggc caa 48 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca gaa gcc 96 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag 144 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att 192 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat 240 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 ggg gcc ctg tat gga tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc 288 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 cgg gag tgc ctt ctt gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc 336 Arg Glu Cys Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 cac ggc ctc ccg ctg cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac 384 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 cct gca ccc cga gga cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg ccc 432 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 ccc gca ccc ccg gag cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat 480 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 gtg ggc tcc tcg gac cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga 528 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 agc ccc agc tac gct tcc taa 549 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 135 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 135 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 70 75 80 Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe 85 90 95 Arg Glu Cys Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala 100 105 110 His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp 115 120 125 Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro 130 135 140 Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp 145 150 155 160 Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg 165 170 175 Ser Pro Ser Tyr Ala Ser 180 <210> 136 <211> 549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 L98R <220> <221> CDS <222> (1)..(549) <400> 136 atg cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg ggc caa 48 Met His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln 1 5 10 15 gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca gaa gcc 96 Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala 20 25 30 cac ctg gag atc agg gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag 144 His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln 35 40 45 agc ccc gaa agt ctc ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att 192 Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile 50 55 60 caa atc ttg gga gtc aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat 240 Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp 65 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ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc cgt tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt gga tcc cat cca att cca gat tct tct cca tta tta caa ttc ggg 768 Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly 245 250 255 ggc caa gtc cgg cag cgg tac ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca 816 Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr 260 265 270 gaa gcc 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cca tcc cgt gat gag ctg acc aag aac cag gtc 432 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 480 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 528 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc 576 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 gtg gac aag agc cgt tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 624 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 672 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 tct ccg ggt aaa ggt gga ggt ggt ggt tct ggt ggt ggt agc ggt ggt 720 Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 ggt 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Glu Ile Arg 50 55 60 gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag agc ccc gaa agt ctc 240 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att caa atc ttg gga gtc 288 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg gcc ctg tat gga 336 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc cgg gag ctg ctt ctt 384 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg 432 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 cac ctg cca ggg aac aag tcc cca cac cgg gac cct gca ccc cga gga 480 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg cca ccc gca ccc ccg gag 528 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg ggc tcc tcg gac 576 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc ccc agc aac gct 624 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Asn Ala 195 200 205 tcc tga 630 Ser <210> 163 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 163 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Asn Ala 195 200 205 Ser <210> 164 <211> 630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF21 P124S, 28 AA signal sequence removed during processing <220> <221> CDS <222> (1)..(630) <400> 164 atg gac tcg gac gag acc ggg ttc gag cac tca gga ctg tgg gtt tct 48 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 gtg ctg gct ggt ctt ctg ctg gga gcc tgc cag gca cac ccc atc cct 96 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 gac tcc agt cct ctc ctg caa ttc ggg ggc caa gtc cgg cag cgg tac 144 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 ctc tac aca gat gat gcc cag cag aca gaa gcc cac ctg gag atc agg 192 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 gag gat ggg acg gtg ggg ggc gct gct gac cag agc ccc gaa agt ctc 240 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 ctg cag ctg aaa gcc ttg aag ccg gga gtt att caa atc ttg gga gtc 288 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 aag aca tcc agg ttc ctg tgc cag cgg cca gat ggg gcc ctg tat gga 336 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 tcg ctc cac ttt gac cct gag gcc tgc agc ttc cgg gag ctg ctt ctt 384 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 gag gac gga tac aat gtt tac cag tcc gaa gcc cac ggc ctc ccg ctg 432 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 cac ctg cca ggg aac aag tcc tca cac cgg gac cct gca ccc cga gga 480 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Ser His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 cca gct cgc ttc ctg cca cta cca ggc ctg cca ccc gca ccc ccg gag 528 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 cca ccc gga atc ctg gcc ccc cag ccc ccc gat gtg ggc tcc tcg gac 576 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 cct ctg agc atg gtg gga cct tcc cag ggc cga agc ccc agc tac gct 624 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 tcc tga 630 Ser <210> 165 <211> 209 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 165 Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr 35 40 45 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg 50 55 60 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val 85 90 95 Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly 100 105 110 Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu 130 135 140 His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Ser His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala 195 200 205 Ser

Claims (67)

  1. 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하고,
    위치 180의 알라닌이 글리신, 세린 또는 클루탐산으로 치환되고,
    위치 171의 프롤린이 글리신으로 치환되며, 위치 98의 류신이 아르기닌으로 치환된,
    단리된 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 위치 180의 알라닌이 글루탐산으로 치환된 단리된 폴리펩타이드.
  3. 이종 아미노산 서열에 융합된 제1항 또는 제2항의 단리된 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 이종 아미노산 서열이 Fc 도메인 또는 이의 단편인 융합 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, Fc 도메인이 서열번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 폴리펩타이드가 링커를 통해 Fc 도메인에 융합되는 융합 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 링커가 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호: 31)을 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  8. 제3항의 융합 폴리펩타이드를 2개 이상 포함하는 다량체.
  9. 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 제형 제제를 이를 필요로 하는 인간 환자에 투여하는 것을 포함하는 대사 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 제형 제제가 히드로겔인 약제학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 대사 장애가 당뇨병인 약제학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 대사 장애가 비만증인 약제학적 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호: 46을 포함하는 단리된 핵산.
  15. 제13항의 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 제15항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 폴리펩타이드:
    (a) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단, 여기서, 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음;
    (b) 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단, 여기서, 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음; 또는
    (c) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 및 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단, 여기서, 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 폴리머에 공유결합되는 단리된 폴리펩타이드.
  19. 제18항에 있어서, 폴리머가 PEG인 단리된 폴리펩타이드.
  20. 하기를 포함하는 폴리펩타이드:
    (a) 서열번호: 4의 폴리펩타이드, 여기서,
    (i) 위치 98에서의 류신은 아르기닌으로 치환되고,
    (ii) 위치 171에서의 프롤린은 글리신으로 치환되며,
    (iii) 위치 180에서의 알라닌은 글루탐산으로 치환됨,
    (b) 서열번호: 31을 포함하는 링커 서열, 및
    (c) 서열번호: 11을 포함하는 Fc 도메인.
  21. 서열번호: 47의 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
  22. 서열번호: 46의 핵산 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드.
  23. 제20항의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용가능한 제형 제제를 필요로 하는 인간 환자에게 투여하는 것을 포함하는 대사 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 제형 제제가 히드로겔인 약제학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 대사 장애가 당뇨병인 약제학적 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 대사 장애가 비만증인 약제학적 조성물.
  27. 제20항 또는 제21항의 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산.
  28. 제27항의 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제28항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  30. 제20항에 있어서, 하기를 포함하는 폴리펩타이드:
    (a) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단, 여기서, 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음;
    (b) 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단, 여기서, 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음; 또는
    (c) 8개 이하의 아미노산 잔기의 아미노-말단 말단절단 및 12개 이하의 아미노산 잔기의 카복실-말단 말단절단, 여기서, 폴리펩타이드는 포유동물의 혈당을 낮출 수 있음.
  31. 제20항에 있어서, 하나 이상의 폴리머에 공유결합되는 폴리펩타이드.
  32. 제31항에 있어서, 폴리머가 PEG인 폴리펩타이드.
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