BRPI1011404B1 - Polipeptídeos mutantes fgf21, polipeptídeo de fusão, multímero, composição farmacêutica, ácido nucleico isolado, vetor e célula hospedeira - Google Patents

Polipeptídeos mutantes fgf21, polipeptídeo de fusão, multímero, composição farmacêutica, ácido nucleico isolado, vetor e célula hospedeira Download PDF

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Agnes Eva Hamburger
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Abstract

MUTANTES FGF21 E USOS DOS MESMOS. A invenção provê moléculas de ácido nucleio codificando polipeptídios mutantes FGF21, polipeptídios mutantes FGF21, composições farmacêuticas compreendendo polipeptídios mutantes FGF21 e métodos para tratar distúrbios metabólicos utilizando tais ácidos nucléicos, polipeptídios ou composições farmacêuticas.

Description

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisional US número 61/175.736 depositado em 6 de maio de 2009 e pedido provisional US número 61/285.118 depositado em 9 de dezembro de 2009, todos os quais são incorporados a título de referência aqui.
Campo da invenção
[002] A invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídios mutantes FGF21, polipeptídios mutantes FGF21, composições farmacêuticas compreendendo polipeptídios mutantes FGF21, e métodos para tratar distúrbios metabólicos utilizando tais ácidos nucléicos, polipeptídios ou composições farmacêuticas.
Antecedentes da invenção
[003] FGF21 é um polipeptídio secretado que pertence a uma subfamília de fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs) que inclui FGF19, FGF21 e FGF23 (Itoh e outros, 2004, Trend Genet. 20:563-69). FGF21 é um FGF atípico em que é independente de heparina e funciona como um hormônio na regulação de glicose, lipídeo e metabolismo de energia.
[004] FGF21 foi isolado de uma biblioteca de cDNA de fígado como um fator secretado hepático. É altamente expresso em fígado e pâncreas e é o único membro da família FGF a ser expresso principalmente no fígado. Camundongos transgênicos superexpressando FGF21 apresentam fenótipos metabólicos de taxa de crescimento lento, níveis baixos de glicose em plasma e triglicerídeo, e uma ausência de diabetes tipo 2 associado à idade, hiperplasia de ilha, e obesidade. A administração farmacológica de proteína FGF21 recombinante em modelos de roedor e primata resulta em níveis normalizados de glicose em plasma, níveis reduzidos de triglicerídeo e colesterol, e tolerância a glicose e sensibilidade a insulina, aperfeiçoadas. Além disso, FGF21 reduz peso corporal e gordura corporal por aumentar o gasto de energia, atividade física, e taxa metabólica. Pesquisa experimental provê suporte para a administração farmacológica de FGF21 para o tratamento de diabetes tipo 2, obesidade, dislipidemia e outras condições ou distúrbios metabólicos e seres humanos.
[005] FGF21 humano tem uma meia-vida curta in vivo. Em camundongos, a meia-vida de FGF21 humano é de 1 a 2 horas, e em macacos cynomolgus, a meia vida é 2,5 a 3 horas. No desenvolvimento de uma proteína FGF21 para uso como terapêutico no tratamento de diabetes tipo 2, um aumento em meia-vida seria desejável. Proteínas FGF21 tendo uma meia-vida aumentada permitiriam dosagem menos freqüente de pacientes sendo administrados com a proteína. Tais proteínas são descritas aqui.
Sumário da invenção
[006] Um polipeptídio isolado que compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e compreendendo ainda: (a) pelo menos uma substituição de aminoácidos na posição 180; e (b) pelo menos uma substituição de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: (i) uma substituição na posição 171; e (ii) uma substituição na posição 98; e (c) combinações das mesmas, é revelada.
[007] Em uma modalidade, o polipeptídio isolado compreende uma substituição na posição 98 e uma substituição na posição 180 e em que: (a) a substituição na posição 98 é selecionada do grupo que consiste em arginina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, lisina, e treonina; e (b) a substituição na posição 180 é selecionada do grupo que consiste em glicina, prolina, serina ou ácido glutâmico; e (c) combinações dos mesmos. Em uma modalidade o resíduo na posição 98 é arginina e o resíduo na posição 180 é ácido glutâmico. Também é fornecido um polipeptídio de fusão compreendendo o polipeptídio isolado fundido com uma seqüência de aminoácido heterólogo. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácido heterólogo é um domínio Fc ou fragmento do mesmo, e pode compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade o polipeptídio é fundido com o domínio Fc através de um ligador e ainda em outra modalidade o ligador compreende GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31). Em uma modalidade específica o polipeptídio compreende SEQ ID NO: 47. Também é revelado um multímero que compreende dois ou mais dos polipeptídios de fusão. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídio isolado e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável, como um hidrogel, também é revelada. Em outro aspecto, um método de tratar um distúrbio metabólico é fornecido e em uma modalidade compreende administrar a um paciente humano necessitando da mesma uma composição farmacêutica fornecida aqui. Em uma modalidade o distúrbio metabólico é diabetes e em outro o distúrbio metabólico é obesidade. Ácidos nucléicos codificando o polipeptídio isolado são também fornecidos e em uma modalidade o ácido nucléico compreende SEQ ID NO: 46. O ácido nucléico pode estar presente em um vetor, que pode ele próprio estar presente em uma célula hospedeira. Ainda em outra modalidade, o polipeptídio compreende: (a) um truncamento terminal-amino não maior do que 8 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir a glicose no sangue em um mamífero; (b) truncamento terminal- carboxi não maior do que 12 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir a glicose no sangue em um mamífero; ou (c) um truncamento terminal-amino não maior do que 8 resíduos de aminoácido e um truncamento terminal- carboxila não maior do que 12 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir glicose no sangue em um mamífero. Ainda em outras modalidades o polipeptídio é covalentemente ligado a um ou mais polímeros, como PEG.
[008] Em outra modalidade, o polipeptídio isolado compreende uma substituição na posição 171 e uma substituição na posição 180 e em que: (a) a substituição na posição 180 é selecionada do grupo que consiste em glicina, prolina, serina ou ácido glutâmico; (b) a substituição na posição 171 é selecionada do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptofano e tirosina; e (c) combinações dos mesmos. Em uma modalidade o resíduo na posição 171 é glicina e o resíduo na posição 180 é ácido glutâmico. Também é fornecido um polipeptídio de fusão compreendendo o polipeptídio isolado fundido com uma seqüência de aminoácido heterólogo. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácido heterólogo é um domínio Fc ou fragmento do mesmo, e pode compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade o polipeptídio é fundido com o domínio Fc através de um ligador e ainda em outra modalidade o ligador compreende GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31). Em uma modalidade específica o polipeptídio compreende SEQ ID NO: 47. Também é revelado um multímero que compreende dois ou mais dos polipeptídios de fusão. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídio isolado e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável, como um hidrogel, também é revelada. Em outro aspecto, um método de tratar um distúrbio metabólico é fornecido e em uma modalidade compreende administrar a um paciente humano necessitando da mesma uma composição farmacêutica fornecida aqui. Em uma modalidade o distúrbio metabólico é diabetes e em outro o distúrbio metabólico é obesidade. Ácidos nucléicos codificando o polipeptídio isolado são também fornecidos e em uma modalidade o ácido nucléico compreende SEQ ID NO: 46. O ácido nucléico pode estar presente em um vetor, que pode ele próprio estar presente em uma célula hospedeira. Ainda em outra modalidade, o polipeptídio compreende: (a) um truncamento terminal-amino não maior do que 8 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir a glicose no sangue em um mamífero; (b) truncamento terminal-carboxi não maior do que 12 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir a glicose no sangue em um mamífero; ou (c) um truncamento terminal-amino não maior do que 8 resíduos de aminoácido e um truncamento terminal- carboxila não maior do que 12 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir glicose no sangue em um mamífero. Ainda em outras modalidades o polipeptídio é covalentemente ligado a um ou mais polímeros, como PEG.
[009] Ainda em outra modalidade, o polipeptídio compreende uma substituição na posição 98, uma substituição na posição 171 e uma substituição na posição 180 da SEQ ID NO: 4 e em que: (a) a substituição na posição 171 é selecionada do grupo que consiste em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, lisina, serina, treonina, triptofano ou tirosina; (b) a substituição na posição 98 é selecionada do grupo que consiste em arginina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, lisina, e treonina; e (c) a substituição na posição 180 é selecionada do grupo que consiste em glicina, prolina, serina ou ácido glutâmico; e (c) combinações dos mesmos. Em uma modalidade adicional o resíduo na posição 98 é arginina e o resíduo na posição 171 é glicina e o resíduo na posição 180 é ácido glutâmico. Também é fornecido um polipeptídio de fusão compreendendo o polipeptídio isolado fundido com uma seqüência de aminoácido heterólogo. Em uma modalidade, a seqüência de aminoácido heterólogo é um domínio Fc ou fragmento do mesmo, e pode compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11. Em outra modalidade o polipeptídio é fundido com o domínio Fc através de um ligador e ainda em outra modalidade o ligador compreende GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31). Em uma modalidade específica o polipeptídio compreende SEQ ID NO: 47. Também é revelado um multímero que compreende dois ou mais dos polipeptídios de fusão. Uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptídio isolado e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável, como um hidrogel, também é revelada. Em outro aspecto, um método de tratar um distúrbio metabólico é fornecido e em uma modalidade compreende administrar a um paciente humano necessitando da mesma uma composição farmacêutica fornecida aqui. Em uma modalidade o distúrbio metabólico é diabetes e em outro o distúrbio metabólico é obesidade. Ácidos nucléicos codificando o polipeptídio isolado são também fornecidos e em uma modalidade o ácido nucléico compreende SEQ ID NO: 46. O ácido nucléico pode estar presente em um vetor, que pode ele próprio estar presente em uma célula hospedeira. Ainda em outra modalidade, o polipeptídio compreende: (a) um truncamento terminal-amino não maior do que 8 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir a glicose no sangue em um mamífero; (b) truncamento terminal-carboxi não maior do que 12 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir a glicose no sangue em um mamífero; ou (c) um truncamento terminal-amino não maior do que 8 resíduos de aminoácido e um truncamento terminal- carboxila não maior do que 12 resíduos de aminoácido, em que o polipeptídio é capaz de diminuir glicose no sangue em um mamífero. Ainda em outras modalidades o polipeptídio é covalentemente ligado a um ou mais polímeros, como PEG.
[0010] Modalidades específicas da invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição mais detalhada de certas modalidades e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] As figuras 1A-1B mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase-ELK realizado nos mutantes de truncamento FGF21 7-181 e 8-181 (Figura 1A) e os mutantes de truncamento FGF21 1-172, 1-171, 1-169, e 1- 164 (Figura IB); cada painel mostra os resultados obtidos para um controle de FGF21 humano.
[0012] A figura 2 mostra os resultados de um ensaio de atividade luciferase-ELK realizado em um controle FGF21 humano e os mutantes de truncamento FGF21 3-181, 4-181, 5181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1174, 1-173, 1-172, 9-181, e 1-149.
[0013] A figura 3 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida), controle de FGF21 humano (barra aberta) ou os mutantes de truncamento FGF21 8-181 (barra cinza) e 9-181 (barra pontilhada).
[0014] A figura 4 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos), um controle de Fc- FGF21 (WT) (círculos abertos) ou proteínas de fusão Fc- FGF21 truncadas compreendendo resíduos de aminoácidos 5-181 (triângulos sólidos) ou 7-181 (triângulos abertos).
[0015] A figura 5 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos), um controle FGF21 (WT) (círculos abertos), uma proteína de fusão GFG21-Fc truncada compreendendo resíduos 1-175 (triângulos sólidos), ou uma proteína Fc-FGF21 truncada compreendendo resíduos de aminoácidos 1-171 (triângulos abertos).
[0016] As figuras 6A-6D mostram os resultados de análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) de uma amostra de controle Fc-(G5)-FGF21 humano (SEQ ID NO: 107) (figura 6A) e amostras de Fc-(G5)-FGF21 tiradas de camundongos em 6 horas (amostra D6; figura 6b), 24 horas (amostra D24; figura 6C) e 48 horas (amostra D48; figura 6D) após injeção.
[0017] As figuras 7A-7D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle FGF21-(G3)-Fc humana derivada de mamífero (SEQ ID NO: 105) (figura 7A) e amostras de FGF21-(G3)-Fc tiradas de camundongos em 6 horas (amostra E6; figura 7B), 24 horas (amostra E24; figura 7C) e 48 horas (amostra E48; figura 7D) após injeção.
[0018] As figuras 8A-8D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (Figura 8A) e amostras de Fc-(L15)-FGF21 tiradas de camundongos em 6 horas (Figura 8B), 24 horas (Figura 8C), e 48 horas (Figura 8D) após injeção.
[0019] As figuras 9A-9D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle FGF21-(L15)-Fc (SEQ ID NO:41) (Figura 9A) e amostras de FGF21-(L15)-Fc tiradas de camundongos em 6 horas (Figura 9B), 24 horas (Figura 9C), e 48 horas (Figura 9D) após injeção.
[0020] As figuras 10A-10B mostram os sítios de clivagem identificados por análise LC-MS de proteínas de fusão Fc-(L15)-FGF21 (Figura 10A, SEQ ID NO:49) e FGF21- (L15)-Fc (Figura 10B, SEQ ID NO:41) injetadas em camundongos.
[0021] A Figura 11 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (barra aberta), ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (barra cinza), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (barra pontilhada), Fc-(L15)-FGF21 S172L (SEQ ID NO:55) (barra diagonalmente em linha cruzada aberta), Fc-(L15)- FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO:59) (barra horizontalmente em linha cruzada sólida), ou Fc-(L15)-FGF21 G151A (SEQ ID NO:61) (barra diagonalmente em linha cruzada aberta).
[0022] A Figura 12 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos), Fc-(L15)- FGF21 (SEQ ID NO:49) (círculos abertos), ou os mutantes Fc- (L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (triângulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (triângulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 S172L (SEQ ID NO:55) (losangos sólidos), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO:59) (losangos abertos), ou Fc-(L15)-FGF21 G151A (SEQ ID NO:61) (quadrados sólidos).
[0023] A Figura 13 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (barra aberta), ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V) (barra cinza), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (barra diagonalmente em linha cruzada aberta), Fc-(L15)- FGF21(G170E, P171A) (SEQ ID NO:63) (barra diagonalmente em linha cruzada cinza), ou Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (SEQ ID NO:67) (barra diagonalmente em linha cruzada aberta).
[0024] A Figura 14 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (quadrados sólidos), Fc- (L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (quadrados abertos), ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V) (SEQ ID NO:65) (triângulos invertidos sólidos), Fc-(L15)- FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (triângulos invertidos abertos), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A) (SEQ ID NO:63) (círculos sólidos), ou Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (SEQ ID NO:67) (círculos abertos).
[0025] A Figura 15 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida) ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (barra aberta), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69) (barra cinza), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71) (barra em linha cruzada aberta), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO:73) (barra cinza e branca), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO:75) (barra em linha cruzada sólida), ou Fc-(L15)- FGF21 G170S (SEQ ID NO:77) (barra em linha cruzada aberta).
[0026] Figura 16 mostra a percentagem em alteração em níveis de glicose em sangue medidos em camundongos injetados com PBS (círculos sólidos) ou os mutantes Fc- (L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (círculos abertos), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69) (triângulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71) (triângulos abertos), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO:73) (losangos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO:75) (losangos abertos), ou Fc-(L15)-FGF21 G170S (SEQ ID NO:77) (triângulos sólidos invertidos).
[0027] A Figura 17 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (barra sólida) ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (barra aberta), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (barra cinza), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO:81) (barra em linha cruzada sólida), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83) (barra em linha cruzada aberta), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (barra pontilhada), ou Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87) (barra em linha cruzada cinza).
[0028] Figura 18 mostra a percentagem em alteração em níveis de glicose em sangue medidos in camundongos injetados com PBS (círculos sólidos) ou os mutantes Fc- (L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (círculos abertos), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (triângulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO:81) (triângulos abertos), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83) (losangos soldos), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (losangos abertos), ou Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87) (quadrados sólidos).
[0029] As figuras 19A-19D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle Fc-(L15)-FGF21 (Figura 19A, SEQ ID NO:49) e amostras tiradas de camundongos no tempo de 6 horas (Figura 19B), 24 horas (Figura 19C), e 48 horas (Figura 19D) após injeção.
[0030] As figuras 20A-20D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle Fc-(L15)-FGF21 G170E (Figura 20A, SEQ ID NO:51) e amostras de Fc-(L15)- FGF21 G170E tiradas de camundongos em 6 horas (Figura 20B), 24 horas (Figura 20C), e 48 horas (Figura 20D) após injeção.
[0031] As figuras 21A-21D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle Fc-(L15)-FGF21 P171A (Figura 21A, SEQ ID NO:53) e amostras de Fc-(L15)- FGF21 P171A tiradas de camundongos em 6 horas (Figura 2IB), 24 (Figura 21C), e 48 horas (Figura 2ID) após injeção.
[0032] As figuras 22A-22D mostram os resultados de análise LC-MS de uma amostra de controle Fc-(L15)-FGF21 S172L (Figura 22A, SEQ ID NO:55) e amostras de Fc-(L15)- FGF21 S172L tiradas de camundongos em 6 horas (Figura 22B), 24 horas (Figura 22C), e 48 horas (Figura 22D) após injeção.
[0033] As figuras 23A-23D mostram os sítios de clivagem identificados por análise LC-MS de proteínas de fusão Fc-(L15)-FGF21 (Figura 23A, SEQ ID NO:49), Fc-(L15)- FGF21 G170E (Figura 23B, SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 P171A (Figura 23C, SEQ ID NO:53), e Fc-(L15)-FGF21 S172L (Figura 23D, SEQ ID NO:55) injetadas em camundongos.
[0034] As figuras 24A-24C mostram os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase executado nos mutantes FGF21 FGF21 L99R (SEQ ID NO:109), FGF21 L99D (SEQ ID NO: 111), e FGF21 All IT (SEQ ID NO: 113) (Figura 24A); os mutantes FGF21 FGF21 A129D (SEQ ID NO:115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO:117), e FGF21 A134K (SEQ ID NO:119) (Figura 24B); e os mutantes FGF21 FGF21 A134Y(SEQ ID NO:121), FGF21 A134E (SEQ ID NO:123), e FGF21 A129K (SEQ ID NO: 125) (Figura 24C); cada painel mostra os resultados obtidos para um controle FGF21 humano.
[0035] As figuras 25A-25D mostram os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase realizado nos mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 P171G (SEQ ID NO:89), Fc-(L15)-FGF21 P171S (SEQ ID NO:91), e Fc-(L15)- FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (Figura 25A); os mutantes Fc- (L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87), Fc-(L15)- FGF21 P171W (SEQ ID NO:93), e Fc-(L15)-FGF21 P171C (SEQ ID NO:95) (Figura 25B); Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49), Fc- (L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97), e FGF21 A45K (SEQ ID NO:99) (Figura 25C); e Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79), e Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (Figura 25D); cada painel mostra os resultados obtidos para um controle FGF21 humano.
[0036] As figuras 26A-B mostram a agregação como uma função de tempo para FGF21 maduro do tipo selvagem e vários mutantes FGF21; a figura 26A mostra a alteração em percentagem de agregação para um controle FGF21 (WT, losangos sólidos) e FGF21 A45K (círculos sólidos) após incubação de 65 mg/ml de proteína a 4°C por 1, 2 e 4 dias, enquanto a figura 26B mostra a alteração em percentagem de agregação para um controle FGF21 (WT) (SEQ ID NO:4) e FGF21 P78C (SEQ ID NO: 127), FGF21 P78R (SEQ ID NO:129), FGF21 L86T (SEQ ID NO:131), FGF21 L86C (SEQ ID NO:133), FGF21 L98C (SEQ ID NO:135), FGF21 L98R (SEQ ID NO:137), FGF21 A111T (SEQ ID NO:113), FGF21 A129D (SEQ ID NO:115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO:117), FGF21 A129K (SEQ ID NO: 125), FGF21 A134K (SEQ ID NO: 119), FGF21 A134Y (SEQ ID NO: 121), e FGF21 A134E (SEQ ID NO: 123) (todos rotulados no gráfico) após incubação de 65 mg/mL de proteína a 4°C por 1, 6 e 10 dias.
[0037] A figura 27 mostra os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase em um controle FGF21 humano e os mutantes FGF21 FGF21 A45K (SEQ ID NO:99), FGF21 L52T (SEQ ID NO: 139), e FGF21 L58E (SEQ ID NO: 141).
[0038] A Figura 28A é um gráfico que mostra a alteração em níveis de agregação para os mutantes Fc-(L15)- FGF21 Fc-(L15)-FGF21(6-181, G170E) (SEQ ID NO: 101) (losangos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (quadrados abertos), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (triângulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (cruzes), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (triângulos abertos) e um controle FGF21 (círculos sólidos) após incubação a 4°C por 1, 4 e 8 dias, e a figura 28B é um gráfico de barras também mostrando os resultados da incubação.
[0039] A figura 29 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS (veículo) (círculos sólidos) ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)- FGF21(A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (círculos abertos), Fc- (L15)-FGF21 (A45K, P171G) (SEQ ID NO:103) (triângulos sólidos), ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (triângulos abertos).
[0040] A Figura 30 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase realizado em FGF21 humano (círculos sólidos, linha sólida), Fc-(L15)- FGF21 (SEQ ID NO:49) (círculos abertos, linha sólida) e Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (triângulos sólidos, linha pontilhada).
[0041] A Figura 31 é um gráfico que mostra a percentagem de agregados com elevado peso molecular observados após nove dias em temperatura ambiente (Figura 31 A) e a 4°C (Figura 3 IB) em relação à FGF21 (SEQ ID NO:4) (círculos sólidos, linha sólida), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (círculo aberto, linha sólida) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (triângulos sólidos, linha pontilhada).
[0042] A Figura 32 é uma série de traços de espectrometria de massa MALDI mostrando alterações observadas em Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) em vários pontos durante um período de tempo de 168 horas.
[0043] A Figura 33 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose em sangue em camundongos ob/ob para cada de um controle de veículo PBS (círculos abertos), FGF21 maduro do tipo selvagem (quadrados sólidos), e os mutantes FGF21 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (triângulos sólidos invertidos); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) (SEQ ID NO:143) (losangos abertos), e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (SEQ ID NO: 145) (círculos sólidos).
[0044] A Figura 34 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue em camundongos ob/ob para cada de um controle de veículo PBS (círculos sólidos), e os mutantes FGF21 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (triângulos sólidos); Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G) (SEQ ID NO:147) (triângulos abertos), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (SEQ ID NO: 145) (losangos sólidos) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) (SEQ ID NO:143) (losangos abertos).
[0045] A figura 35 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue em camundongos ob/ob camundongos para cada de um controle de veículo PBS (círculos abertos), e os mutantes FGF21 Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (quadrados sólidos); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179S) (SEQ ID NO:149) (triângulos abertos), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A) (SEQ ID NO: 153) (triângulos sólidos invertidos), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180S) (SEQ ID NO:155) (losangos abertos) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180G) (SEQ ID NO: 157) (círculos sólidos).
[0046] A Figura 36 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue em camundongos ob/ob para cada de um controle de veículo PBS (círculos sólidos), e PS mutantes FGF21 Fc-(L15)- FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (quadrados abertos); Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F) (SEQ ID NO:151) (triângulos sólidos), e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) (losangos abertos).
[0047] A Figura 37 é um diagrama que representa graficamente o desenho de estudo para um estudo de escalação de dose de seis semanas realizado em macacos Rhesus. Na figura, símbolos sombreados indicam tiradas de sangue no estado em jejum e símbolos pontilhados indicaram tiradas de sangue no estado alimentado.
[0048] As figuras 38A-D são uma série de gráficos que representam como os macacos rhesus foram randomizados em perfis OGTT, AUCs OGTT e peso corporal; a figura 38A representa níveis de glicose de linha de base em OGTT1, quadrado sólido corresponde ao grupo A, círculo sólido, a linha sólida corresponde ao grupo B e círculo aberto, linha tracejada corresponde ao grupo C antes dos compostos ou veículo serem atribuídos a cada grupo; a figura 38B representa níveis de glicose de linha de base em OGTT2, quadrado sólido corresponde ao grupo A, círculo sólido, linha sólida corresponde ao grupo B e círculo aberto, linha sólida corresponde ao grupo C antes dos compostos ou veículos serem atribuídos a cada grupo; a figura 38C mostra níveis de glicose de linha de base para OGTTs 1 e 2 mostrados em termos de AUC, a barra pontilhada corresponde ao grupo A, a barra sombreada corresponde ao grupo B e a barra aberta corresponde ao grupo C; e a figura 38D mostra o peso corporal de linha de base, a barra pontilhada corresponde ao grupo A, a barra sombreada corresponde ao grupo B e a barra aberta corresponde ao grupo C.
[0049] A Figura 39 é um gráfico mostrando a percentagem de alteração em peso corporal relativo à linha de base de veículo, FGF21 (SEQ ID NO:4) e Fc-(L15)- FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) em macacos Rhesus; barras sombreadas 1 e 2 correspondem a semanas 1 e 2 na base baixa, barras abertas 3 e 4 correspondem às semanas 3 e 4 na dose média, barras sólidas 5 e 6 correspondem a semanas 5 e 6 na dose elevada e barras pontilhadas 7, 8 e 9 correspondem a semanas 7-9 durante o período de depuração total.
[0050] A figura 40 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em insulina em jejum em relação à linha de base de veículo, FGF21 (SEQ ID NO:4) e Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) em níveis de insulina em jejum em macacos Rhesus; barras sombreadas 1 e 2 correspondem a semanas 1 e 2 na base baixa, barras abertas 3 e 4 correspondem às semanas 3 e 4 na dose média, barras sólidas 5 e 6 correspondem a semanas 5 e 6 na dose elevada e barras pontilhadas 7 e 8 correspondem a semanas 7 e 8 durante o período de depuração total.
[0051] A figura 41 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, FGF21 (SEQ ID NO:4) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43), dado na dose elevada, em níveis de insulina com alimentação de macacos Rhesus adquirido durante semanas 5 e 6 do estudo; barras sólidas correspondem à semana 5 e barras sombreadas correspondem à semana 6.
[0052] A figura 42 é um gráfico que mostra os perfis de glicose de OGTT4 realizado no término do tratamento de dose elevada de duas semanas com Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43); círculo sólido, linha sólida corresponde a veículo, quadrado aberto, linha pontilhada corresponde a FGF21 e triângulo sólido, linha sólida corresponde a Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43).
[0053] A figura 43 é um gráfico que mostra os perfis de insulina de OGTT5 realizado no término do tratamento de dose elevada de duas semanas com Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43); círculo sólido, linha sólida corresponde ao veículo, quadrado aberto, linha pontilhada corresponde a FGF21 e triângulo sólido, linha sólida corresponde a Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43).
[0054] A figura 44 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração de linha de base de glicose OGTT AUC3-5 determinado ao término de cada período de dose (dose baixa, media e elevada) dos macacos Rhesus; barras abertas correspondem a AUC3 calculado de medições de glicose durante OGTT3, barras sólidas correspondem a AUC4 calculado de medições de glicose durante OGTT4 e barras sombreadas correspondem a AUC5 calculado a partir de medições de glicose durante OGTT5.
[0055] A Figura 45 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) sobre percentagem de alteração a partir da linha de base dos níveis de triglicerídeo em plasma, em jejum de cada grupo de macacos Rhesus; barras sombreadas 1 e 2 correspondem a semanas 1 e 2 na dose baixa, barras abertas 3 e 4 correspondem a semanas 3 e 4 na dose média, barras sólidas 5 e 6 correspondem a semanas 5 e 6 na dose elevada e barras pontilhadas 7, 8 e 9 correspondem a semanas 7-9 durante o período de depuração total.
[0056] A figura 46 é um gráfico que mostra níveis de triglicerídeo em plasma com alimentação de cada grupo dos macacos Rhesus; como medido durante a quinta e sexta semanas de tratamento com veículo, FGF21 ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) na dose elevada; barras sombreadas correspondem à semana 5 e barras sólidas correspondem à semana 6.
[0057] A figura 47 é um gráfico que mostra níveis FGF21 em macacos individuais medidos em pré-dose, e 5, 12, 19 e 26 dias, com amostras adquiridas em aproximadamente 21 horas após cada injeção.
[0058] A figura 48 é um gráfico que mostra níveis de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) de macacos individuais medidos em pré-dose, e 5, 12, 19 e 26 dias, com amostras adquiridas aproximadamente 5 dias após cada injeção.
[0059] A figura 49 é um gráfico que mostra concentrações médias de níveis de FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) medidos a partir de três OGTTs executados após cada das doses baixa, média e elevada; barras sombreadas correspondem a OGTT3 na dose baixa, barras sólidas correspondem a OGTT4 na dose média e barras abertas correspondem a OGTTs na dose elevada.
[0060] A figura 50 é a seqüência de aminoácidos da proteína de fusão Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G,A180E) (SEQ ID NO:47); resíduos IgGl Fc (SEQ ID NO: 11) estão em negrito, o ligador (G4S)3 (SEQ ID NO:31) está em itálico e as mutações de ponto na seqüência FGF21 (SEQ ID NO:39) estão em negrito e sublinhadas.
[0061] A figura 51 é um gráfico que mostra a resposta de dose dos compostos testados em ensaios de Erk- luciferase; Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57), FGF21 tipo selvagem , e uma fusão Fc com FGF21 do tipo selvagem foram testados.
[0062] A figura 52 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de ligação de equilíbrio de solução Biacore de
[0063] Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) a humano (direito e cino (3-Klotho (esquerdo).
[0064] A figura 53 é um par de gráficos que mostra a resposta de dose de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) em camundongos db/db após uma injeção única; a figura 53A mostra os níveis de glicose no sangue em camundongos dB/dB em vários pontos de tempo após injeção de veículo ou Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E), enquanto a figura 53B mostra o efeito de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) sobre o peso corporal após uma única injeção em camundongos db/db.
[0065] A figura 54 é um diagrama esquemático que apresenta graficamente um estudo de freqüência de dose de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) e Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) em camundongos DIO.
[0066] A figura 55 é um gráfico que mostra os perfis GTT de camundongos tratados com veículo, Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) em freqüências de dosagem diferentes.
[0067] A figura 56 é um gráfico que mostra alteração de peso corporal de linha de base (dia 0) em camundongos tratados com veículo, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) em freqüências de dosagem diferentes.
[0068] A figura 57 é um gráfico que mostra os resultados de um estudo in vitro de hidrogeis compreendendo o mutante FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) FGF21.
[0069] A Figura 58 é um gráfico que mostra o efeito de nível de glicose em sangue de camundongos dB/dB com 8 semanas de idade com várias formulações de hidrogel.
[0070] A figura 59 é um gráfico que mostra o efeito sobre nível de glicose no sangue de camundongos db/db com 8 semanas de idade dosados com várias formulações de hidrogel.
[0071] A figura 60 é um gráfico que mostra o efeito do nível de glicose no sangue de camundongos db/B6 com 8 semanas de idade dosados com várias formulações de hidrogel; círculos sólidos representam um camundongo dosado com um controle de hidrogel, quadrados sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) em um hidrogel a 10 mg/kg, triângulos sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) em um hidrogel a 30 mg/kg, e triângulos invertidos representam camundongos dosados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) individualmente.
[0072] A figura 61 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em nível de glicose no sangue de camundongos dB/B6 com 8 semanas de idade com várias formulações de hidrogel; círculos sólidos representam um camundongo dosado com um controle de hidrogel, quadrados sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) em um hidrogel a 10 mg/kg, triângulos sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) em um hidrogel a 30 mg/kg, e triângulos invertidos representam camundongos dosados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) individualmente.
[0073] A figura 62 é um gráfico que mostra o efeito sobre peso corporal de camundongos dB/B6 com 8 semanas de idade dosados com várias formulações de hidrogel; círculos sólidos representam um camundongo dosado com um controle de hidrogel, quadrados sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) em um hidrogel a 10 mg/kg, triângulos sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) em um hidrogel a 30 mg/kg, e triângulos invertidos representam camundongos dosados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) individualmente.
[0074] As figura 63 é um gráfico que mostra a percentagem de alteração em peso de camundongos dB/B6 com 8 semanas de idade dosados com várias formulações de hidrogel; círculos sólidos representam um camundongo dosado com um controle de hidrogel, quadrados sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) em um hidrogel a 10 mg/kg, triângulos sólidos representam camundongos dosados com FGF21 (L98R, P171G) em um hidrogel a 30 mg/kg, e triângulos invertidos representam camundongos dosados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) individualmente.
[0075] A figura 64 é um diagrama que representa graficamente o desenho de estudo para um estudo de escalação de dose de nove semanas realizado em macacos cynomolgus com tolerância prejudicada à glicose (IGT).
[0076] A figura 65 é um gráfico que representa os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre ingestão de alimento em refeições até meio-dia dos marcados cynomolgus IGT estudados.
[0077] A figura 66 é um gráfico que representa os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) um ingestão de frutas dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0078] A Figura 67 é um gráfico que representa os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre ingestão de alimento de refeições até meia- noite dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0079] A Figura 68 é um gráfico que representa os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre peso corporal dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0080] A Figura 69 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre índice de massa corporal dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0081] A Figura 70 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre espessura de dobra de pele dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0082] A Figura 71 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre circunferência abdominal dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0083] A Figura 72 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre níveis de glicose em plasma macacos cynomolgus IGT estudados.
[0084] A Figura 73 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre tolerância a glicose dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0085] A Figura 74 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre níveis de triglicerídeo de plasma dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0086] A Figura 75 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre níveis de colesterol total em plasma dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0087] A Figura 76 é um gráfico que mostra os efeitos de veículo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) sobre níveis de colesterol-HDL em plasma dos macacos cynomolgus IGT estudados.
[0088] A Figura 77 é uma série de traços de espectrometria de massa MALDI mostrando alterações observadas em Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (painel esquerdo, SEQ ID NO:43) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (painel direito, SEQ ID NO:57) em vários pontos durante um período de tempo de 168 horas.
[0089] A figura 78 é um gráfico que mostra a abundância relativa (%) de peptídeo terminal-C de comprimento total sobre os fragmentos totais de peptídeo terminal-C derivados de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) como analisados por MRM LC/MS/MS após digestão de Asp-N.
[0090] A Figura 79 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio ELISA para a concentração de plasma de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) e Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) de comprimento total intacto durante um período de 240 horas após injeção intravenosa em camundongos.
[0091] A Figura 80 é um gráfico que mostra os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase realizado em um controle negativo, FGF21 humano (SEQ ID NO:4) e os mutantes de glicosilação FGF21 FGF21 (Y179N, S181T) (SEQ ID NO: 161), FGF21 Y179N (SEQ ID NO: 163) e FGF21 P124S (SEQ ID NO: 165).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0092] Uma proteína FGF21 humana tendo propriedades aumentadas como meia vida aumentada e/ou agregação diminuída pode ser preparada utilizando os métodos revelados aqui e métodos de biologia molecular padrão. Opcionalmente, a meia-vida pode ser adicionalmente estendida por fundir um anticorpo, uma porção do mesmo, ao terminal-N ou extremidade terminal-C da seqüência FGF21 do tipo selvagem. Também é possível estender adicionalmente a meia-vida ou diminuir agregação da proteína FGF21 do tipo selvagem por introduzir substituições de aminoácidos na proteína. Tais proteínas modificadas são mencionadas aqui como mutantes, ou mutantes FGF21, e formam modalidades da presente invenção.
[0093] Métodos de ácido nucléico recombinante utilizados aqui, incluindo nos Exemplos, são genericamente aqueles expostos em Sambrook e outros, Molecular cloning: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou Current Protocols in Molecular biology (Ausubel e outros, Eds., Green Publishers Inc. e Wiley and Sons 1994), os quais são ambos incorporados aqui a título de referência para qualquer finalidade.
[001] Definições gerais
[0094] o termo “molécula de ácido nucléico isolada” se refere a uma molécula de ácido nucléico fornecida aqui que (1) foi separada de pelo menos aproximadamente 50 por cento de proteínas, lipídeos, carboidratos, ou outros materiais com os quais é naturalmente encontrado quando ácido nucléico total é isolado das células de fonte, (2) não é ligado a todo ou uma porção de um polinucleotídeo ao qual a “molécula de ácido nucléico isolada” é ligada em natureza, (3) é operativamente ligada a um polinucleotídeo que não é ligado em natureza, ou (4) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência de polinucleotídeo maior. Preferivelmente, uma molécula de ácido nucléico isolada é substancialmente livre de quaisquer outras moléculas de ácido nucléico contaminantes ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam em seu uso em produção de polipeptídio ou seu uso terapêutico, diagnóstico, profilático ou de pesquisa.
[0095] O termo “vetor” é utilizado para se referir a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucléico, plasmídeo, ou vírus) utilizada para transferir informações de codificação a uma célula hospedeira.
[0096] O termo “vetor de expressão” se refere a um vetor que é apropriado para transformação de uma célula hospedeira e contém seqüências de ácido nucléico que dirigem e/ou controlam a expressão de seqüências de ácido nucléico heterólogas inseridas. A expressão inclui, porém não é limitada a, processos como transcrição, translação, e junção de RNA, se introns estiverem presentes.
[0097] O termo “operativamente ligado” é utilizado aqui para se referir a um arranjo de seqüências de flanquear em que as seqüências de flanquear assim descritas são configuradas ou montadas de modo a executar sua função normal. Desse modo, uma seqüência de flanquear operativamente ligada a uma seqüência de codificação pode ser capaz de efetuar a replicação, transcrição e/ou translação da seqüência de codificação. Por exemplo, uma seqüência de codificação é operativamente ligada a um promotor quando o promotor é capaz de orientar transcrição daquela seqüência de codificação. Um seqüência de flanquear não necessita ser contígua com a seqüência de codificação, desde que funcione corretamente. Desse modo, por exemplo, seqüências intermediárias não traduzidas ainda assim transcritas podem estar presentes entre uma seqüência promotora e a seqüência de codificação e a seqüência promotor pode ser ainda considerada “operativamente ligada” à seqüência de codificação.
[0098] O termo “célula hospedeira” é utilizado para se referir a uma célula que foi transformada, ou é capaz de ser transformada com uma seqüência de ácido nucléico, como um ácido nucléico fornecido aqui, e então de expressar um gene de interesse selecionado. O termo inclui a progênie da célula de origem, quer ou não a progênie seja idêntica em morfologia ou em composição genética ao pai original, desde que o gene selecionado esteja presente.
[0099] O termo “polipeptídio isolado” se refere a um polipeptídio fornecido aqui que (1) foi separado de pelo menos aproximadamente 50 por cento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos,ou outros materiais com os quais é naturalmente encontrado quando isolado da célula de fonte, (2) não é ligado (por interação covalente ou não covalente) a todo ou uma porção de um polipeptídio, ao qual o “polipeptídio isolado” é ligado em natureza, (3) é operativamente ligado (por interação covalente ou não covalente) a um polipeptídio com o qual não é ligado na natureza, ou (4) não ocorre na natureza. Preferivelmente, o polipeptídio isolado é substancialmente livre de quaisquer polipeptídios contaminantes ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam em se uso terapêutico, diagnóstico, profilático ou de pesquisa.
[00100] O termo “de ocorrência natural” quando utilizado com relação a materiais biológicos como moléculas de ácido nucléico, polipeptídios, células hospedeiras, e similar, se refere a materiais que são encontrados na natureza e não são manipulados pelo homem. Similarmente, “ocorrência não natural” como utilizado aqui se refere a um material que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. Quando utilizado com relação a nucleotídeos, o termo “que ocorre naturalmente” se refere às bases adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), e uracila (U). quando utilizado com relação a aminoácidos, o termo “que ocorre naturalmente” se refere aos 20 aminoácidos alanina (A), cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), fenil alanina (F), glicina (G), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), leucina (L), metionina (M), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q), arginina (R), serina (S), treonina (T), valina (V), triptofano (W) e tirosina (Y).
[00101] O termo “polipeptídio FGF21” se refere a um polipeptídio do tipo selvagem que ocorre naturalmente expresso em seres humanos. Para fins da presente revelação, o termo “polipeptídio FGF21” pode ser utilizado de modo intercambiável para se referir a qualquer polipeptídio FGF21 de comprimento total, por exemplo, SEQ ID NOS; 2 e 6, que consiste em 209 resíduos de aminoácido e que são codificados pelas seqüências de nucleotídeo das SEQ ID NOS: 1 e 5, respectivamente; qualquer forma madura do polipeptídio, por exemplo, SEQ ID NOS: 4 e 8, que consistem em 181 resíduos de aminoácido e que são codificados pelas seqüências de nucleotídeo das SEQ ID NOS: 3 e 7, respectivamente, e nas quais 28 resíduos de aminoácidos na extremidade terminal-amino do polipeptídio FGF21 de comprimento total (isto é, que constituem o peptídeo de sinal) foram removidos. Polipeptídios FGF21 maduro e de comprimento total podem, porém não necessitam compreender uma metionina terminal-amino, que pode ser introduzida por engenharia ou como resultado de um processo de expressão bacteriana.
[00102] Os termos “mutante de polipeptídio FGF21” e “mutante FGF21” podem ser utilizados de forma intercambiável e se referem a um polipeptídio FGF21 no qual uma seqüência de aminoácido FGF21 que ocorre naturalmente (por exemplo, SEQ ID Nos: 2, 4, 6 ou 8) foi modificada. Tais modificações incluem, porém não são limitadas a, uma ou mais substituições de aminoácidos incluindo substituições com aminoácidos de ocorrência não natural e análogos de aminoácido de ocorrência não natural e truncamentos. Desse modo, mutantes de polipeptídio FGF21 incluem, porém não são limitados a, mutantes FGF21 dirigidos ao sítio, polipeptídios FGF21 truncados, mutantes FGF21 resistentes a proteólise, mutantes FGF21 que reduzem agregação, mutantes de combinação de FGF21, e proteínas de fusão FGF21, como descrito aqui. Para fins de identificar truncamentos específicos e substituições de aminoácidos dos mutantes FGF21 da presente invenção, a numeração dos resíduos de aminoácidos truncados ou mudados corresponde àquela do polipeptídio FGF21 de 181-resíduo maduro. Mutantes FGF21 podem porém não necessitam compreender uma metionina terminal-amino, que pode ser introduzida por engenharia ou como resultado de um processo de expressão bacteriana. Em outras modalidades da presente invenção, um mutante polipeptídio FGF21 compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos aproximadamente 85 por cento idêntica à seqüência de aminoácido FGF21 mutante, porém em que resíduos específicos que conferem uma propriedade desejável ao mutante de polipeptídio FGF21, por exemplo, resistência a proteólise, propriedades de reduzir agregação e meia vida aumentada e combinações dos mesmos, não foram adicionalmente modificadas. Em outras palavras, com a exceção de resíduos na seqüência mutante FGF21 que foram modificados para conferir resistência à proteólise, redução de agregação ou outras propriedades, aproximadamente 15 por cento de todos os outros resíduos de aminoácido na seqüência mutante FGF21 podem ser modificados. Por exemplo, no mutante FGF21 Q173E, até 15 por cento de todos os resíduos de aminoácido diferente do resíduo de ácido glutâmico, que foi substituído para glutamina na posição 173, poderiam ser modificados. Ainda em outras modalidades, um mutante de polipeptídio FGF21 compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 90 por cento, ou aproximadamente 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à seqüência de aminoácidos de FGF21 mutante, porém em que os resíduos específicos que conferem as propriedades de reduzir agregação ou resistência a proteólise de mutante de polipeptídio FGF21 não foram adicionalmente modificadas. Tais mutantes de polipeptídio FGF21 possuem pelo menos uma atividade do polipeptídio FGF21 do tipo selvagem.
[00103] A presente invenção também abrange uma molécula de ácido nucléico que codifica um mutante de polipeptídio FGF21 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos aproximadamente 85 por cento idêntica à seqüência de aminoácido de FGF21 mutante porém em que resíduos específicos conferindo uma propriedade desejável ao mutante de polipeptídio FGF21, por exemplo, resistência à proteólise, meia vida aumentada ou propriedades de reduzir agregação e combinações das mesmas não foram adicionalmente modificadas.
[00104] Em outras palavras, com a exceção de resíduos na seqüência mutante FGF21 que foram modificados para conferir resistência à proteólise, redução de agregação ou outras propriedades, aproximadamente 15 por cento de todo os outros resíduos de aminoácido na seqüência mutante FGF21 podem ser modificados. Por exemplo, no mutante FGF21 Q173E, até 1r por cento de todos os resíduos de aminoácido diferente do resíduo de ácido glutâmico, que foi substituído por glutamina na posição 173, poderia ser modificado. A presente invenção abrange ainda uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos aproximadamente 90 por cento, ou aproximadamente 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica à seqüência de nucleotídeos codificando um mutante FGF21, porém em que os nucleotídeos que codificam resíduos de aminoácidos conferindo as propriedades de redução de agregação ou resistência à proteólise do mutante de polipeptídio FGF21 codificado não foram adicionalmente modificados. Tais moléculas de ácido nucléico codificam polipeptídios mutantes FGF21 que possuem pelo menos uma atividade do polipeptídio FGF21 do tipo selvagem.
[00105] O termo “mutante de polipeptídio FGF21 biologicamente ativo” se refere a qualquer mutante de polipeptídio FGF21 descrito aqui que possui uma atividade do polipeptídio FGF21 do tipo selvagem, como a capacidade de diminuir glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; reduzir peso corporal; e melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina, independente do tipo ou número de modificações que foram introduzidas no mutante de polipeptídio FGF21. Mutantes de polipeptídio FGF21 possuindo um nível de certo modo diminuído de atividade FGF21 em relação ao polipeptídeoFGF21 do tipo selvagem podem ser, não obstante, considerados como sendo mutantes de polipeptídio FGF21 biologicamente ativos.
[00106] Os termos “quantidade eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz” se referem cada à quantidade de um mutante de polipeptídio FGF21 utilizado para suportar um nível observável de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídio FGF21 do tipo selvagem, como a capacidade de diminuir níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; reduzir peso corporal; ou melhorar a tolerância à glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina.
[00107] O termo “veículo farmaceuticamente aceitável” ou “veículo fisiologicamente aceitável” como utilizado aqui se refere a um ou mais agentes de formulação apropriados para realizar ou aumentar a distribuição de um mutante de polipeptídio FGF21 no corpo de um sujeito humano ou não humano. O termo inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardar absorção e isotônicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Os exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similar, bem como combinações dos mesmo. Em alguns casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoois como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio em uma composição farmacêutica. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis como umectantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes umectantes ou emulsificantes, preservativos ou tampões, que aumentam a vida de armazenagem ou eficácia do mutante de polipeptídio FGF21 podem atuar também como, ou formar um componente de um veículo.
[00108] O termo “antígeno” se refere a uma molécula ou uma porção de uma molécula que é capaz de ser ligada por um anticorpo, e adicionalmente que é capaz de ser utilizada em um animal para produzir anticorpos que são capazes de se ligar a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos.
[00109] O termo “Fc nativo” se refere à molécula ou seqüência compreendendo a seqüência de um fragmento de ligação não antígeno resultando da digestão de anticorpo inteiro ou produzido por outro meio, quer em forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região de articulação. A fonte de imunoglobulina original do Fc nativo é preferivelmente, porém não necessariamente de origem humana e pode ser quaisquer das imunoglobulinas, embora IgG1 e IgG2 sejam preferidas. IgG4 pode ser também empregada. Moléculas Fc nativas são compostas de polipeptídios monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto) e não covalente. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas de Fc nativo varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, e IgE) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2). Um exemplo de um Fc nativo é um dímero de ligação por dissulfeto que resulta da digestão de papaína de um IgG (vide Ellison e outros, 1982, Nucleic Acids Res. 10:40719). O termo “Fc nativo” como utilizado aqui é genérico para as formas monomérica, dimérica e multimérica. Um exemplo de uma seqüência de polipeptídio Fc é apresentada na SEQ ID NO: 11, que é derivada de uma molécula de IgG1 humano. Um Fc nativo pode, porém não necessita, compreender uma metionina terminal-amino, que pode ser introduzido por engenharia ou como resultado de um processo de expressão bacteriana; tais moléculas Fc são ainda consideradas como sendo moléculas “Fc nativo”.
[00110] O termo “variante Fc” se refere a uma molécula ou seqüência que é modificada de um Fc nativo porém ainda compreende um sítio de ligação para o receptor de salvamento, FcRn (receptor Fc neonatal). Publicações internacionais nos. WO 97/34631 e WO 96/32478 descrevem variantes FC exemplares, bem como interação com o receptor de salvamento, e são pelo presente incorporados a título de referência. Desse modo, o termo “variante Fc” pode compreender uma molécula ou seqüência que é humanizada de um Fc nativo não humano. Além disso, um Fc nativo compreende regiões que podem ser removidas porque fornecem aspectos estruturais ou atividade biológica que não são necessária para as moléculas de fusão dos mutantes FGF21 da presente invenção. Desse modo, o termo “variante Fc” compreende uma molécula ou seqüência que não tem um ou mais sítios Fc nativo ou resíduos, ou em que um ou mais sítios Fc ou resíduos foi modificado, que afetam ou são envolvidos em: (1) formação de ligação de dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada, (3) heterogeneidade terminal-N após expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor Fc diferente de um receptor de salvamento, ou (7) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Variantes Fc como descrito em detalhe adicional a seguir. Uma variante Fc pode, porém não necessita, compreender uma metionina terminal-amino, que pode ser introduzida por engenharia ou como resultado de um processo de expressão bacteriana; tais moléculas Fc são ainda consideradas como sendo “variantes Fc”.
[00111] O termo “domínio Fc” abrange Fc nativo e variantes de Fc e seqüências como definido acima. Como com variantes Fc e moléculas Fc nativas, o termo “domínio Fc” inclui moléculas em forma monomérica ou multimérica, quer digeridas do anticorpo inteiro ou produzidas por outro meio. Em algumas modalidades da presente invenção, um domínio Fc pode ser fundido a FGF21 ou um mutante FGF21 (incluindo uma forma truncada de FGF21 ou um mutante FGF21) através, por exemplo, de uma ligação covalente entre o domínio Fc e a seqüência FGF21. Tais proteínas de fusão podem formar multímeros através da associação dos domínios Fc e tanto essas proteínas de fusão como seus multímeros são um aspecto da presente invenção. Um domínio Fc pode, porém não necessita compreender uma metionina terminal- amino, que pode ser introduzida por engenharia ou como resultado de um processo de expressão bacteriana.
Mutantes FGF21
[00112] O termo “mutante FGF21” se refere a um polipeptídio mutante FGF21 tendo uma seqüência de aminoácido que difere da seqüência de aminoácido de uma seqüência de polipeptídio FGF21 de ocorrência natural, por exemplo, SEQ ID NOS: 2, 4, 6 ou 8, por um ou mais aminoácidos. Mutantes FGF21 podem ser gerados por introduzir uma ou mais substituições de aminoácidos, quer conservativas ou não conservativas e utilizando aminoácidos de ocorrência natural ou não natural, em posições específicas do polipeptídio FGF21.
[00113] Uma “substituição de aminoácido conservativa” pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo (isto é, um resíduo encontrado em uma dada posição da seqüência de polipeptídio FGF21 do tipo selvagem) com um resíduo não nativo (isto é, um resíduo que não é encontrado em uma dada posição da seqüência de polipeptídio FGF21 do tipo selvagem) de tal modo que haja pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou carga do resíduo de aminoácido naquela posição. Substituições de aminoácido conservativas também abrangem resíduos de aminoácido que ocorrem não naturalmente que são tipicamente incorporadas por síntese de peptídeo químico em vez de por síntese em sistemas biológicos. Esses incluem peptidomimética, e outras formas revertidas ou invertidas de frações de aminoácido.
[00114] Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades de cadeia lateral comum: (1) Hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) Hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr; (3) Acido: Asp, Glu; (4) Básico: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam orientação de cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromático: Trp, Typ, Phe.
[00115] Substituições conservativas podem envolver a permuta de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Substituições não conservativas podem envolver a permuta de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.
[00116] Substituições de aminoácido desejadas (quer conservativas ou não conservativas) podem ser determinadas por aqueles versados na técnica no momento em tais substituições são desejadas. Uma lista exemplar (porém não limitadora de substituições de aminoácidos é exposta na tabela 1. Tabela 1 Substituições de aminoácidos
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Polipeptídios FGF21 truncados
[00117] Uma modalidade da presente invenção é dirigida a formas truncadas de um polipeptídio FGF21 maduro ou mutante FGF21. Essa modalidade da presente invenção originou de um esforço para identificar polipeptídios FGF21 truncados que são capazes de fornecer uma atividade que é similar, e em alguns casos superior, a formas não truncadas do polipeptídio FGF21 maduro.
[00118] Como utilizado aqui, o termo “polipeptídio FGF21 truncado” se refere a um polipeptídio FGF21 no qual resíduos de aminoácido foram removidos da extremidade terminal-amino (OU N-terminal) do polipeptídio FGF21, resíduos de aminoácido foram removidos da extremidade de terminal-carboxila (ou terminal-C) do polipeptídio FGF21, ou resíduos de aminoácidos foram removidos das extremidades tanto terminal-amino como terminal-carboxila do polipeptídio FGF21. Os vários truncamentos revelados aqui foram preparados como descrito aqui nos exemplos 3 e 6.
[00119] A atividade de polipeptídios FGF21 truncadas N-terminalmente e polipeptídios FGF21 truncados C- terminalmente pode ser ensaiada utilizando um ensaio de luciferase-ELK in vitro como descrito no exemplo 4. Detalhes específicos dos ensaios in vitro que podem ser utilizados para examinar a atividade de polipeptídios FGF21 truncados podem ser encontradas no exemplo 4.
[00120] A atividade dos polipeptídios FGF21 truncados da presente invenção pode ser também avaliada em um ensaio in vivo, como camundongos dB/dB, ou camundongos ob/ob como mostrado nos exemplos 5 e 7. Genericamente, para avaliar a atividade in vivo de um polipeptídio FGF21 truncado, o polipeptídio FGF21 truncado pode ser administrado em um animal de teste por via intraperitoneal. Após um período de incubação desejado (por exemplo, uma hora ou mais), uma amostra de sangue pode ser tirada, e níveis de glicose no sangue podem ser medidos. Detalhes específicos dos ensaios in vivo que podem ser utilizados para examinar a atividade de polipeptídios FGF21 truncados podem ser encontrados nos exemplos 5 e 7.
a. truncamento de terminal-N
[00121] Em algumas modalidades da presente invenção, truncamentos de terminal-N compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos a partir da extremidade N- terminal do polipeptídio FGF21 maduro ou mutante FGF21. Como demonstrado em, por exemplo, exemplo 5 e figura 3, polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-N de número menor do que 9 resíduos de aminoácidos retêm a capacidade do polipeptídio FGF21 maduro diminuir a glicose no sangue em um indivíduo. Por conseguinte, em modalidades específicas, a presente invenção abrange formas truncadas do polipeptídio FGF21 maduro ou mutantes de polipeptídio FGF21 tendo truncamentos de terminal-N de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácido.
b. Truncamentos de terminal-C
[00122] Em algumas modalidades da presente invenção, truncamentos de terminal-C compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácidos a partir da extremidade C-terminal do polipeptídio FGF21 maduro. Como demonstrado em, por exemplo, exemplo 4 e figura IB, polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-C de número menor do que 13 resíduos de aminoácidos apresentaram uma eficácia de pelo menos 50% da eficácia de FGF21 do tipo selvagem em um ensaio ELKluciferase in vitro, indicando que esses mutantes FGF21 retêm a capacidade do polipeptídio FGF21 maduro diminuir a glicose em sangue em um indivíduo. Por conseguinte, em modalidades específicas, a presente invenção abrange formas truncadas do polipeptídio FGF21 maduro ou mutantes de polipeptídio FGF21 tendo truncamentos de terminal-C de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácido.
c. Truncamentos de terminal-N e terminal-C
[00123] Em algumas modalidades da presente invenção, polipeptídios FGF21 truncados podem ter uma combinação de truncamentos de terminal-N e terminal-C. polipeptídios FGF21 truncados tendo uma combinação de truncamentos de terminal-N e terminal-C compartilham a atividade de polipeptídios FGF21 truncados correspondentes tendo os truncamentos de terminal-N ou terminal-C sozinhos. Em outras palavras, polipeptídios FGF21 truncados tendo tanto truncamentos de terminal-N de um número menor do que 9 resíduos de aminoácidos como truncamentos de terminal-C de um número menor do que 13 resíduos de aminoácidos possuem atividade biológica similar ou maior, por exemplo, atividade de diminuir glicose no sangue, como polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-N de número menor do que 9 resíduos de aminoácido ou polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-C menor do que 13 resíduos de aminoácido. Por conseguinte, em modalidades específicas, a presente invenção abrange formas truncadas do polipeptídio FGF21 maduro ou mutantes de polipeptídio FGF21 tendo truncamentos de terminal-N de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácido e truncamentos de terminal-C de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 resíduos de aminoácidos.
[00124] Como com todos os mutantes FGF21 da presente invenção, polipeptídios FGF21 truncados e mutantes FGF21 podem opcionalmente compreender um resíduo de metionina terminal-amino, que pode ser introduzido por mutação direta ou como resultado de um processo de expressão bacteriana.
[00125] Os polipeptídios FGF21 truncados da presente invenção podem ser preparados como descrito nos exemplos 3 e 6. Aqueles com conhecimentos comuns na técnica, familiarizados com técnicas de biologia molecular padrão, podem empregar esse conhecimento, acoplado à presente revelação, para fazer e utilizar os polipeptídios FGF231 truncados da presente invenção. Técnicas padrão podem ser utilizados para DNA recombinante, síntese de oligonuleotídeo, cultura de tecido, e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular cloning: a laboratory Manual, supra, que é incorporado aqui a título de referência para qualquer finalidade. Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica, ou como descrito aqui. A menos que definições específicas sejam fornecidas, as nomenclaturas utilizadas com relação a, e os procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética, e química farmacêutica e medicinal descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na arte. Técnicas padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas; análises químicas; preparação farmacêutica, formulação e distribuição; e tratamento de pacientes.
[00126] Os polipeptídios FGF21 truncados da presente invenção podem ser também fundidos com outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao polipeptídio FGF21 truncado. Em uma modalidade da presente invenção, um polipeptídio FGF21 truncado pode ser fundido a uma seqüência FC. Tal fusão pode ser realizada utilizando métodos biológicos moleculares conhecidos e/ou orientação fornecida aqui. Os benefícios de tais polipeptídios de fusão, bem como métodos para fazer tais polipeptídios de fusão, são discutidos em mais detalhe aqui.
Mutantes de FGF21 resistentes a proteólise
[00127] Como descrito no exemplo 8, verificou-se que FGF21 mudado estava sendo submetido à degradação in vivo, que foi finalmente determinada como se originado de ataque proteolítico. Verificou-se que a degradação in vivo de FGF21 madura leva à meia-vida eficaz mais curta, que pode afetar adversamente o potencial terapêutico de uma molécula. Por conseguinte, um estudo dirigido foi realizado para identificar mutantes FGF21 que apresentam uma resistência à proteólise. Como resultado dessa investigação, os sítios no polipeptídio FGF21 maduro que foram determinados como sendo particularmente suscetíveis à proteólise incluem a ligação de peptídeo entre os resíduos de aminoácidos em posições 4-5, 20-21, 151-152, 171-172 e 178-181.
[00128] Um estudo amplo porém focalizado e dirigido foi realizado para identificar substituições específicas que eliminam o efeito proteolítico observado enquanto não afeta a atividade da proteína a um grau inaceitável. As tabelas 8 e 11 destacam alguns dos mutantes que foram preparados e testados. Como descrito, por exemplo, nos exemplos 13 e 14, nem todos os mutantes FGF21 apresentaram um perfil ideal; alguns mutantes conferiram resistência à proteólise porém à custa de atividade de FGF21 comprometida. Outras mutações retiveram atividade FGF21 porém não conferiram resistência à proteólise. Vários mutantes, incluindo, por exemplo, FGF21 P171G, retiveram um nível de atividade similar como FGF21 do tipo selvagem enquanto também apresentam resistência à degradação proteolítica.
[00129] Um critério de seleção para identificar mutantes FGF21 resistentes à proteólise desejáveis foi que a atividade do mutante FGF21 seja essencialmente igual, ou maior do que a atividade de FGF21 do tipo selvagem. Portanto, outra modalidade da presente invenção é dirigida a mutantes FGF21 que são resistentes à proteólise e ainda retêm atividade que é essencialmente igual a, ou maior do que, FGF21 do tipo selvagem. Embora menos desejável em alguns casos, mutantes FGF21 que são resistentes à proteólise porém apresentam atividade de certo modo diminuída formam outra modalidade da presente invenção. Em alguns casos pode ser desejável manter um grau de proteólise, e conseqüentemente, mutantes FGF21 que permitem que algum grau de proteólise ocorra também formam outra modalidade da presente invenção.
[00130] Como com todos os mutantes FGF21 fornecidos aqui, os mutantes FGF21 resistentes à proteólise da presente invenção podem ser preparados como descrito aqui. Aqueles com conhecimentos comuns na técnica, por exemplo, aqueles familiarizados com as técnicas de biologia molecular padrão, podem empregar esse conhecimento, acoplado à presente revelação, para fazer e utilizar os mutantes FGF21 resistentes à proteólise revelados aqui. Técnicas padrão podem ser utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido, e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular cloning: a laboratory manual, supra, que é incorporado aqui a título de referência para qualquer finalidade. Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. A menos que definições específicas sejam fornecidas, as nomenclaturas utilizadas com relação a, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética, e química farmacêutica e medicinal descritas aqui são àquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na arte. Técnicas padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas; análises químicas; preparação, formulação e distribuição farmacêutica; e tratamento de pacientes.
[00131] Os mutantes FGF21 resistentes à proteólise da presente invenção podem ser fundidos com outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao mutante FGF21 resistente à proteólise. Em uma modalidade da presente invenção, um mutante FGF21 resistente à proteólise pode ser fundido com uma seqüência Fc IgG, por exemplo, SEQ ID NO: 11. Tal fusão pode ser realizada utilizando métodos biológicos moleculares conhecidos e/ou a orientação fornecida aqui. Os benefícios de tais polipeptídios de fusão, bem como métodos para fazer tais polipeptídios de fusão, são conhecidos e são discutidos em mais detalhe aqui.
Mutantes de FGF21 que reduzem agregação
[00132] Como descrito no exemplo 15, uma propriedade do polipeptídio FGF21 do tipo selvagem é sua propensão à agregação. Em concentrações acima de aproximadamente 5 mg/mL, a taxa de agregação é elevada em temperatura ambiente. Como mostrado e descrito aqui, a taxa de agregação para o polipeptídio FGF21 do tipo selvagem é tanto dependente de temperatura como de concentração.
[00133] Agregação pode provar ser um desafio ao trabalhar com FGF21 do tipo selvagem nessas concentrações, como no contexto de uma formulação terapêutica. Por conseguinte, um estudo dirigido foi realizado para identificar mutantes FGF21 que apresentam agregação de FGF21 reduzida. Os mutantes FGF21 resultantes foram então testados em relação à propensão para agregar em várias concentrações.
[00134] Um estudo amplo porém focalizado e dirigido foi realizado para identificar substituições específicas que eliminam ou reduzem o efeito de agregação observado de FGF21 do tipo selvagem enquanto não afeta a atividade da proteína a um grau inaceitável. A abordagem para identificar mutantes de reduzir agregação apropriados é descrita no exemplo 15. A tabela 16 destaca alguns dos mutantes que foram preparados e testados. Como descrito, por exemplo, no exemplo 17, nem todos os mutantes FGF21 apresentaram um perfil ideal. Alguns mutantes, como FGF21 L58E tinham atividade de FGF21 comprometida e não foram mais estudados. Outras mutações, como FGF21 A134E, retiveram a atividade FGF21 porém não conferiram propriedades de agregação reduzida. Vários mutantes, como FGF21 L98R, retiveram atividade FGF21 e também apresentaram agregação reduzida. Um mutante, FGF21 A45K, apresentou surpreendentemente atividade FGF21 aumentada enquanto também apresenta propriedades de agregação reduzida.
[00135] Um critério de seleção para identificar mutantes FGF21 que reduzem agregação desejáveis foi que a atividade do mutante FGF21 seja essencialmente similar a, ou maior do que a atividade de FGF21 do tipo selvagem. Portanto, outra modalidade da presente invenção é dirigida a mutantes FGF21 tendo propriedades de agregação reduzida enquanto ainda retém uma atividade de FGF21 que é similar a, ou maior do que, FGF21 do tipo selvagem. Embora menos desejável em alguns casos, mutantes FGF21 tendo propriedades de agregação reduzida porém apresentando atividade de FGF21 de certo modo diminuída formam outra modalidade da presente invenção. Em alguns casos pode ser desejável manter um grau de agregação, e conseqüentemente, mutantes FGF21 que permitem que algum grau de agregação ocorra também formam outra modalidade da presente invenção.
[00136] Como com os mutantes FGF21 fornecidos aqui, os mutantes FGF21 que reduzem agregação fornecidos aqui podem ser preparados como descrito aqui. Aqueles com conhecimentos comuns na técnica, familiarizados com técnicas de biologia molecular padrão, podem empregar esse conhecimento, acoplado à presente revelação, para fazer e utilizar os mutantes FGF que reduzem agregação da presente invenção. Técnicas padrão podem ser utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido, e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular cloning: a laboratory manual, supra, que é incorporado aqui a título de referência para qualquer finalidade. Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. A menos que definições específicas sejam fornecidas, as nomenclaturas utilizadas com relação a, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética, e química farmacêutica e medicinal descritas aqui são àquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na arte. Técnicas padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas; análises químicas; preparação, formulação e distribuição farmacêutica; e tratamento de pacientes.
[00137] Os mutantes FGF21 que reduzem a agregação da presente invenção podem ser fundidos com outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao mutante FGF21 que reduz agregação. Em uma modalidade da presente invenção, um mutante FGF21 que reduz agregação pode ser fundido com uma seqüência Fc IgG, por exemplo, SEQ ID NO: 11. Tal fusão pode ser realizada utilizando métodos biológicos moleculares conhecidos e/ou a orientação fornecida aqui. Os benefícios de tais polipeptídios de fusão, bem como métodos para fazer tais polipeptídios de fusão, são conhecidos e são discutidos em mais detalhe aqui.
Mutantes de combinação de FGF21
[00138] Como descrito aqui, a seqüência FGF21 do tipo selvagem possui várias propriedades que podem apresentar desafios significativos quando FGF21 é utilizado como uma molécula terapêutica. Entre esses desafios estão a suscetibilidade da proteína à degradação e sua propensão para agregação em concentração elevada. Após um esforço exaustivo para identificar polipeptídios FGF21 que superam cada desses desafios, um estudo dirigido foi realizado para determinar se as substituições de aminoácidos que conferem resistência à proteólise e aquelas que conferem propriedades de reduzir agregação poderiam ser combinadas em um aditivo ou modo sinergista em uma seqüência de polipeptídios única enquanto mantém níveis de atividade que são iguais a ou maior do que a atividade de FGF21 do tipo selvagem. Isso representou um desafio significativo, como sabido na técnica que a introdução de múltiplas mutações em um dado polipeptídio pode às vezes afetar adversamente a expressão, atividade, e fabricação subseqüente da proteína.
[00139] Surpreendentemente, como demonstrado, por exemplo, nos exemplos 19 e 20, verificou-se que as propriedades desejáveis de vários mutantes FGF21 poderiam realmente ser combinadas em um modo sinergista ou aditivo para gerar um mutante FGF21 tendo propriedades farmacêuticas aumentadas. Mutantes FGF21 que são resistentes à proteólise, têm uma taxa reduzida de agregação, e que ainda retêm atividade que é igual a, ou maior do que, FGF21 do tipo selvagem, são revelados aqui.
[00140] Um critério de seleção para identificar mutantes de combinação de FGF21 desejáveis foi que a atividade do mutante FGF21 seja similar a, ou maior do que a atividade de FGF21 do tipo selvagem. Portanto, outra modalidade da presente invenção é dirigida a mutantes FGF21 que são resistentes à proteólise e têm propriedades de agregação reduzida enquanto ainda retém uma atividade de FGF21 que é similar a, ou maior do que, FGF21 do tipo selvagem. Embora menos desejável em alguns casos, mutantes FGF21 que sejam resistentes à proteólise e tenham propriedades de agregação reduzida porém apresentando atividade de FGF21 de certo modo diminuída formam outra modalidade da presente invenção. Em alguns casos pode ser desejável manter um grau de proteólise e/ou agregação, e conseqüentemente, mutantes FGF21 que permitem que algum grau de proteólise e/ou agregação ocorra também formam outra modalidade da presente invenção.
[00141] Como com todos os mutantes FGF21 da presente invenção, os mutantes de combinação FGF21 da presente invenção podem ser preparados como descrito aqui. Aqueles com conhecimentos comuns na técnica, familiarizados com técnicas de biologia molecular padrão, podem empregar esse conhecimento, acoplado à presente revelação, para fazer e utilizar os mutantes de combinação FGF da presente invenção. Técnicas padrão podem ser utilizadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, cultura de tecido, e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular cloning: a laboratory manual, supra, que é incorporado aqui a título de referência para qualquer finalidade. Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como descrito aqui. A menos que definições específicas sejam fornecidas, as nomenclaturas utilizadas com relação a, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética, e química farmacêutica e medicinal descritas aqui são àquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na arte. Técnicas padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas; análises químicas; preparação, formulação e distribuição farmacêutica; e tratamento de pacientes.
[00142] Os mutantes de combinação FGF21 da presente invenção podem ser fundidos com outra entidade, que pode transmitir propriedades adicionais ao mutante de combinação FGF21. Em uma modalidade da presente invenção, um mutante de combinação FGF21 pode ser fundido com uma seqüência Fc IgG, por exemplo, SEQ ID NO: 11. Tal fusão pode ser realizada utilizando métodos biológicos moleculares conhecidos e/ou a orientação fornecida aqui. Os benefícios de tais polipeptídios de fusão, bem como métodos para fazer tais polipeptídios de fusão, são conhecidos e são discutidos em mais detalhe aqui.
Proteínas de fusão FGF21
[00143] Como utilizado aqui, o termo “polipeptídio de fusão FGF21” ou “proteína de fusão FGF21” se refere a uma fusão de um ou mais resíduos de aminoácido (como peptídeo ou proteína heteróloga) na extremidade-N ou extremidade-C de qualquer mutante de polipeptídio FGF21 descrito aqui.
[00144] Peptídeos heterólogos e polipeptídios incluem, porém não são limitados a, um epítopo para permitir a detecção e/ou isolamento de um mutante de polipeptídio FGF21; uma proteína de receptor de transmembrana ou uma porção da mesma, como um domínio extracelular ou uma transmembrana e domínio intracelular; um ligando ou uma porção do mesmo que se liga a uma proteína de receptor de transmembrana; uma enzima ou porção da mesma que é cataliticamente ativa; um polipeptídio ou peptídeo que aumenta estabilidade, como uma região constante de imunoglobulina (por exemplo, um domínio Fc); uma seqüência que estende meia vida compreendendo uma combinação de dois ou mais (por exemplo, 2, 5, 10, 15, 20, 25, etc.) aminoácidos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural carregados e/ou não carregados (por exemplo, serina, glicina, ácido glutâmico ou aspártico) projetado para formar um partner de fusão predominantemente hidrofílico ou predominantemente hidrofóbico para um mutante FGF21; um anticorpo funcional ou não funcional, ou uma cadeia pesada ou leve do mesmo; e um polipeptídio que tenha uma atividade como atividade terapêutica, diferente dos mutantes de polipeptídio FGF21 da presente invenção. São também abrangidos pela presente invenção mutantes FGF21 fundidos com albumina de soro humano (HSA).
[00145] Proteínas de fusão FGF21 podem ser feitas por fundir seqüências heterólogas na extremidade N ou extremidade C de um mutante de polipeptídio FGF21. Como descrito aqui, uma seqüência heteróloga pode ser uma seqüência de aminoácidos ou um polímero não contendo aminoácidos. Seqüências heterólogas podem ser fundidas diretamente ao mutante de polipeptídio FGF21 ou através de um molécula adaptadora ou de ligação. Uma molécula adaptadora ou de ligação pode ser um ou mais resíduos de aminoácido (ou -mers), por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ou 9 resíduos (ou -mers), preferivelmente de 10 a 50 resíduos de aminoácidos (ou -mers), por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 resíduos (ou -mers), e mais preferivelmente de 15 a 35 resíduos de aminoácido (ou -mers). Uma molécula adaptadora ou de ligação pode ser também projetada com um sítio de clivagem para uma endonuclease de restrição de DNA ou para uma protease para permitir a separação das frações fundidas.
Fusões de Fc
[00146] Em uma modalidade da presente invenção, um mutante de polipeptídio FGF21 é fundido com um domínio Fc, por exemplo, um ou mais domínios de uma região Fc de um IgG humano. Anticorpos compreendem duas partes funcionalmente independentes, um domínio variável conhecido como “Fab”, que liga um antígeno, e um domínio constante conhecido como “Fc”, que é envolvido em funções efetoras como ativação de complemento e ataque por células fagocíticas. Um Fc tem uma meia-vida de soro longa, ao passo que um Fab é de vida curta (Capon e outros, 1989, Nature 337: 525-31). Quando unido com uma proteína terapêutica, um domínio Fc pode fornecer meia-vida mais longa ou incorporar tais funções como ligação de receptor Fc, ligação de proteína A, fixação de complemento, e talvez mesmo transferência placental (Capon e outros, 1989).
[00147] Análise farmacocinética in vivo indicou que FGF21 humano tem uma meia-vida curta de aproximadamente 1 hora em camundongos devido à clearance rápida e degradação in vivo. Portanto, para estender a meia-vida de FGF21 uma seqüência Fc nativa foi fundida com a extremidade terminal- N ou C do polipeptídio FGF21. A fusão da seqüência Fc com FGF21 do tipo selvagem, em particular Fc fundido com a extremidade-N do FGF21 do tipo selvagem, não estendeu a meia-vida como esperado, entretanto, essa observação levou a uma investigação da degradação proteolítica de FGF21 in vivo e a identificação de mutantes FGF21 que eram resistentes a tal degradação. Tais mutantes são descritos, por exemplo, nos exemplos 9 e 11, e apresentam meias-vidas mais longas do que FGF21 do tipo selvagem. Essas e outras proteínas de fusão FGF21 formam modalidades da presente invenção.
[00148] Em toda a presente revelação, Fc-FGF21 se refere a uma proteína de fusão na qual a seqüência Fc é fundida com a extremidade-N de FGF21. Similarmente, em toda a revelação, FGF21-Fc se refere a uma proteína de fusão na qual a seqüência Fc é fundida à extremidade-C de FGF21.
[00149] A proteína de fusão FGF21 resultante pode ser purificada, por exemplo, pelo uso de uma coluna de afinidade de proteína A. Verificou-se que peptídeos e proteínas fundidas com uma região Fc apresentam uma meia- vida substancialmente maior in vivo do que a cópia não fundida. Além disso, uma fusão com uma região Fc permite dimerização/multimerização do polipeptídio de fusão. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural, ou pode ser alterada para melhorar certas qualidades, como qualidades terapêuticas, tempo de circulação, ou agregação reduzida.
[00150] Modificações úteis de agentes terapêuticos de proteína por fusão com o domínio “Fc” de um anticorpo são discutidas em detalhe na publicação internacional no. WO 00/024782, que é pelo presente incorporada a título de referência na íntegra.
Ligadores de proteína de fusão
[00151] Ao formar as proteínas de fusão da presente invenção, um ligador pode, porém não necessita, ser empregado. Quando presente, a estrutura química do ligador pode não ser crítica, uma vez que serve principalmente como espaçador. O ligador pode ser composto de aminoácidos ligados juntos por ligações de peptídeo. Em algumas modalidades da presente invenção, o ligador é composto de 1 a 20 aminoácidos ligados por ligações de peptídeo, em que os aminoácidos são selecionados de 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em várias modalidades os 1 a 20 aminoácidos são selecionados dos aminoácidos glicina, serina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Em algumas modalidades, o ligador é composto de uma maioria de aminoácidos que são estericamente não impedidos, como glicina e alanina. Em algumas modalidades, ligadores são poliglicinas (como (GlY)4 (SEQ ID NO: 29) e (Gly)5 (SEQ IDNO: 30)), polialaninas, combinações de glicina e alanina (como poli(Gly-Ala)), ou combinações de glicina e serina (como poli(Gly-Ser)). Outros ligadores apropriados incluem: (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 28), (Gly)4-Ser- (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 31), (Gly)3-Lys-(Gly)4 (SEQ ID NO: 32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2 (SEQ ID NO: 33), (Gly)3-Cys-(Gly)4 (SEQ ID NO: 34) e Gly-Pro-Asn-Gly_Gly (SEQ ID NO: 35). Embora um ligador de 15 resíduos de aminoácidos tenha sido verificado funcionar particularmente bem para proteínas de fusão FGF21, a presente invenção considera ligadores de qualquer comprimento ou combinação. Quando um ligador foi empregado para unir uma seqüência heteróloga, como um domínio Fc, e um polipeptídio FGF231 ou mutante FGF21, o ligador é expresso em parênteses.
[00152] Os ligadores descritos aqui são exemplares, e ligadores que são muito mais longos e que incluem outros resíduos são considerados pela presente invenção. Ligadores não peptídeo são também considerados pela presente invenção. Por exemplo, ligadores de alquila como -NH- (CH2)s-C(O)-, em que s = 2 a 20, poderiam ser utilizados. Esses ligadores de alquila podem ser adicionalmente substituídos por qualquer grupo não estericamente impedido, incluindo, porém não limitado a, uma alquila inferior (por exemplo, C1-C6), acila inferior, halogênio (por exemplo, Cl, Br), CN, NH2, ou fenila. Um ligador não peptídeo exemplar é um ligador de polietileno glicol, em que o ligador tem um peso molecular de 100 a 5000 kD, por exemplo, 100 a 500 kD.
Mutantes FGF21 quimicamente modificados
[00153] Formas quimicamente modificadas dos mutantes de polipeptídio FGF21 descritos aqui, incluindo as formas truncadas de FGF21 descrito aqui, podem ser preparadas por uma pessoa versada na técnica, dada as revelações descritas aqui. Tais mutantes FGF21 quimicamente modificados são alteradas de tal modo que o mutante FGF21 quimicamente modificado seja diferente do mutante FGF21 não modificado, no tipo ou localização das moléculas naturalmente ligadas ao mutante FGF21. Mutantes FGF21 quimicamente modificados podem incluir moléculas formadas pela deleção de um ou mais grupos químicos de ligação natural.
[00154] Em uma modalidade, mutantes de polipeptídio FGF21 da presente invenção podem ser modificados pela ligação covalente de um ou mais polímeros. Por exemplo, o polímero selecionado é tipicamente solúvel em água de modo que a proteína à qual é ligado não precipite em um ambiente aquoso, como ambiente fisiológico. É incluída no escopo de polímeros apropriados uma mistura de polímeros. Preferivelmente, para uso terapêutico da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. Polímeros não solúveis em água conjugados com mutantes de polipeptídio FGF21 da presente invenção também formam um aspecto da invenção.
[00155] Polímeros exemplares podem ser individualmente de qualquer peso molecular e podem ser ramificados ou não ramificados. Os polímeros têm cada tipicamente um peso molecular médio entre aproximadamente 2 kDa e aproximadamente 100 kDa (o termo “aproximadamente” indicando que nos preparados de um polímero solúvel em água, algumas moléculas pesarão mais e algumas menos do que o peso molecular mencionado). O peso molecular médio de cada polímero é preferivelmente entre aproximadamente 5 kDa e aproximadamente 50 kDa, mais preferivelmente entre aproximadamente 12 kDa e aproximadamente 40 kDa, e mais preferivelmente entre aproximadamente 20 kDa e aproximadamente 35 kDa.
[00156] Polímeros solúveis em água apropriados ou misturas dos mesmos incluem, porém não são limitados a carboidratos ligados por N ou ligados por O, açucares, fosfatos, polietileno glicol (PEG) (incluindo as formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar proteínas, incluindo mono-(C1-C10), alcoxi ou ariloxi-polietileno glicol), monometoxi-polietileno glicol, dextrano (como dextrano com baixo peso molecular de, por exemplo, aproximadamente 6 kD), celulose, ou outros polímeros à base de carboidrato, poli-(N-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool de polivinila. São também abrangidos pela presente invenção moléculas de reticulação bifuncionais que podem ser utilizadas para preparar multímeros mutantes de polipeptídio FGF21 covalentemente ligados. São também abrangidos pela presente invenção mutantes FGF21 covalentemente ligados a ácido polisiálico.
[00157] Em algumas modalidades da presente invenção, um mutante FGF21 é covalentemente ou quimicamente modificado para incluir um ou mais polímeros solúveis em água, incluindo, porém não limitado a, polietileno glicol (PEG), polioxietileno glicol, ou polipropileno glicol. Vide, por exemplo, as patentes US números 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; e 4.179.337. em algumas modalidades da presente invenção, um mutante FGF21 compreende um ou mais polímeros, incluindo, porém não limitados a, monometoxi-polietileno glicol, dextrano, celulose, outro polpímero à base de carboidrato, poli-(N vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool de polivinil, ou misturas de tais polímeros.
[00158] Em algumas modalidades da presente invenção, um mutante FGF21 é covalentemente modificado com subunidades PEG. Em algumas modalidades, um ou mais polímeros solúveis em água são ligados a uma ou mais posições específicas (por exemplo, na extremidade-N) do mutante FGF21. Em algumas modalidades, um ou mais polímeros solúveis em água são aleatoriamente fixadas em uma ou mais cadeias laterais de um mutante FGF21. Em algumas modalidades, PEG é utilizado para melhorar a capacidade terapêutica de um mutante FGF21. Certos desses métodos são discutidos, por exemplo, na patente US número 6.133.426, que é pelo presente incorporado a título de referência para qualquer finalidade.
[00159] Em modalidades da presente invenção em que o polímero é PEG, o grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente, e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do grupo PEG variará preferivelmente de aproximadamente 2 kD a aproximadamente 100 kDa, e mais preferivelmente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, por exemplo, 10, 20, 30, 40 ou 50 kDa. Os grupos PEG serão genericamente ligados ao mutante FGF21 através de acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo na fração PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no mutante FGF21 (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster).
[00160] A PEGuilação de um polipeptídio, incluindo os mutantes FGF21 da presente invenção, pode ser especificamente realizada utilizando quaisquer das reações de PEGuilação conhecidas na técnica. Tais reações são descritas, por exemplo, nas seguintes referências: Francis, e outros, 1992, Focus on growth factors 3: 4-10; patentes européias no.s 0 154 316 e 0 401 384; e patente US número 4.179.337. por exemplo, PEGuilação pode ser realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativo (ou um polímero solúvel em água reativo análogo) como descrito aqui. Para as reações de acilação, um polímero selecionado deve ter um grupo de éster reativo único. Para alquilação redutiva, um polímero selecionado deve ter um grupo de aldeído reativo único. Um aldeído reativo é, por exemplo, propionaldeído de poletileno glicol, que é estável em água, ou derivados de mono alcoxi C1-C10 ou ariloxi do mesmo (vide, por exemplo, a patente US número 5.252.714).
[00161] Em algumas modalidades da presente invenção, uma estratégia útil para a ligação do grupo PEG a um polipeptídio envolve combinar, através da formação de uma ligação de conjugado em solução, um peptídeo e uma fração PEG, cada contendo uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa em direção à outra. Os peptídeos podem ser facilmente preparados com síntese de fase sólida convencional. Os peptídeos são “pré-ativados” com um grupo funcional apropriado em um sítio específico. Os precursores são purificados e totalmente caracterizados antes da reação com a fração PEG. A ligação do peptídeo com PEG normalmente ocorre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada por HPLC analítica de fase inversa. Os peptídeos PEGUilados podem ser facilmente purificados por HPLC preparativo e caracterizados por HPLC analítico, análise de aminoácido e espectrometria de massa de dessorção a laser.
[00162] Polímeros de polissacarídeo são outro tipo de polímero solúvel em água que pode ser utilizado para modificação de proteína. Portanto, os mutantes FGF21 da presente invenção fundidos com um polímero de polissacarídeo formam modalidades da presente invenção. Dextranos são polímeros de polissacarídeo compreendidos de subunidades individuais de glicose predominantemente ligado por ligações alfa 1-6. O próprio dextrano é disponível em muitas faixas de peso molecular, e é prontamente disponível em pesos moleculares de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 70 kD. Dextrano é um polímero solúvel em água apropriado para uso como um veículo por si só ou em combinação com outro veículo (por exemplo, Fc). Vide, por exemplo, a publicação internacional no. WO 96/11953. O uso de dextrano conjugado com imunoglobulinas de diagnóstico ou terapêutica foi relatado. Vide, por exemplo, a publicação de patente européia no. 0 315 456, que é pelo presente incorporada a título de referência. A presente invenção também abrange o uso de dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD.
[00163] Em geral, modificação química pode ser realizada sob qualquer condição apropriada utilizada para reagir uma proteína com uma molécula de polímero ativada. Os métodos para preparar polipeptídios quimicamente modificados compreenderão genericamente as etapas de: (a) reagir o polipeptídio com a molécula de polímero ativado (como um éster reativo ou derivado de aldeído da molécula de polímero) sob condições pelo que um mutante de polipeptídio FGF21 se torna ligado a uma ou mais moléculas de polímero, e (b) obter os produtos de ração. As condições de reação ótima serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e o resultado desejado. Um exemplo disso é, quanto maior a razão de moléculas de polímero para proteína, maior a percentagem de molécula de polímero ligada. Em uma modalidade da presente invenção, mutantes FGF21 quimicamente modificados podem ter uma fração de molécula de polímero único na extremidade amino (vide, por exemplo, a patente US número 5.234.784).
[00164] Em outra modalidade da presente invenção, mutantes de polipeptídio FGF21 podem ser quimicamente acoplados a biotina. Os mutantes de polipeptídio FGF21/biotina resultando são então deixados se em mutantes de ligar a avidina, polipeptídio FGF21/biotina/avidina tetravalente. Mutantes de polipeptídio FGF21 também podem ser covalentemente acoplados a dinitrofenol (DNP) ou trinitrofenol (TNP) e os conjugados resultantes precipitados com anti-DNP ou anti- TNP-IgM para formar conjugados decaméricos com uma valência de 10.
[00165] Genericamente, condições que podem ser aliviadas ou moduladas pela administração dos mutantes FGF21 quimicamente modificados revelados incluem aquelas condições descritas aqui para mutantes de polipeptídio FGF21. Entretanto, os mutantes FGF21 quimicamente modificados revelados aqui podem ter atividades adicionais, atividade biológica aumentada ou reduzida, ou outras características, como meia-vida aumentada ou diminuída, em comparação com mutantes FGF21 não modificados.
Composições farmacêuticas de Mutantes FGF21 e administração das mesmas
[00166] Composições farmacêuticas compreendendo mutantes FGF21 estão compreendidas no escopo da presente invenção, e são especificamente consideradas à luz da identificação de várias seqüências de FGF21 mutante apresentando propriedades aumentadas. Tais composições farmacêuticas de mutantes FGF21 podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um mutante de polipeptídio FGF21 em mistura com um agente de formulação farmacêutica ou fisiologicamente aceitável selecionado para adequação com o modo de administração.
[00167] Agentes de formulação aceitáveis são preferivelmente não tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações empregadas.
[00168] A composição farmacêutica pode conter agente(s) de formulação para modificar, manter, ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção, ou penetração da composição. Agentes de formulação apropriados incluem, porém não são limitados a, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sódio, ou sulfito-hidrogênio de sódio), tampões (como borato, bicarbonato, Tris-HCl,citratos, fosfatos, ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (como manitol ou glicina), agentes de quelação (como ácido tetraacético etileno diamina (EDTA)), agentes de complexar (como cafeína, polivinil pirrolidona, beta-ciclodextrina, ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina), materiais de enchimento, monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos (como glicose, manose, ou dextrinas), proteínas (como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas), agentes de coloração, aromatizantes ou de diluição, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (como polivinil pirrolidona), polipeptídios de baixo peso molecular, contra-íons de formação de sal (como sódio), preservativos (como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetil, metil paraben, propil paraben, clorexidina, ácido sórbico, ou peróxido de hidrogênio), solventes (como glicerina, propileno glicol, ou polietileno glicol), alcoóis de açúcar (como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, tensoativos ou agentes umectantes (como pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polisorbatos como polisorbato 20 ou polisorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de aumentar estabilidade (como sacarose ou sorbitol), agentes de aumentar tonicidade (como haletos de metal alcalino - preferivelmente cloreto de potássio ou sódio - ou manitol sorbitol), veículos de distribuição, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18a Ed., A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subseqüentes da mesma, incorporada aqui a título de referência para qualquer finalidade).
[00169] A composição farmacêutica ótima será determinada por um técnico especializado dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de distribuição, e dosagem desejada (vide, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra). Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de clearance in vivo do mutante de polipeptídio FGF21.
[00170] O veículo ou portador primário em uma composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou portador apropriado para injeção pode ser água, solução salina fisiológica, ou fluido cérebro-espinhal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina de soro são veículos exemplares adicionais. Outras composições farmacêuticas exemplares compreendem tampão Tris de aproximadamente 7,0 - 8,5, ou tampão de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pode incluir ainda sorbitol ou um substituo apropriado. Em uma modalidade da presente invenção, composições de mutante de polipeptídio FGF21 podem ser preparadas para armazenagem por misturar a composição selecionada tendo o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de uma massa liofilizada ou uma solução aquosa. Além disso, o produto mutante de polipeptídio FGF21 pode ser formulado como um liofilizado utilizando excipientes apropriados como sacarose.
[00171] As composições farmacêuticas mutantes de polipeptídio FGF21 podem ser selecionadas para distribuição parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para distribuição através do trato digestivo, como via oral. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está compreendida nos conhecimentos da técnica.
[00172] Os componentes de formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, tampões são utilizados para manter a composição em pH fisiológico ou em um pH levemente mais baixo, tipicamente compreendido em uma faixa de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
[00173] Quando a administração parenteral é considerada, as composições terapêuticas para uso na presente invenção podem ter a forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável isenta de pirógeno compreendendo o mutante de polipeptídio FGF21 desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente apropriado para injeção parenteral é água destilada estéril na qual um mutante de polipeptídio FGF21 é formulado como uma solução isotônica, estéril adequadamente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com uma gente, como microesferas injetáveis, partículas bio-desgastáveis, compostos poliméricos (como ácido poliláctico ou ácido poliglicolico), contas, ou lipossomas, que fornece a liberação controlada do produto que pode ser então distribuído através de injeção de depósito. Ácido hialurônico também pode ser utilizado e esse pode ter o efeito de promotor duração controlada na circulação. Outros meios apropriados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de distribuição de droga implantáveis.
[00174] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, um mutante de polipeptídio FGF21 pode ser formulado como um pó seco para inalação. Soluções de inalação de mutante de polipeptídio FGF21 podem ser também formuladas com um propelente para distribuição de aerossol. Ainda em outra modalidade, soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é adicionalmente descrita na publicação internacional no. WO 94/20069, que descreve a distribuição pulmonar de proteínas modificadas quimicamente.
[00175] Também se considera que certas formulações podem ser administradas por via oral. Em uma modalidade da presente invenção, mutantes de polipeptídio FGF21 que são administrados desse modo podem ser formulados com ou sem aqueles veículos costumeiramente utilizados na composição de formas de dosagem sólida como tabletes e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrointestinal quando biodisponibilidade é maximizada e degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar absorção do mutante de polipeptídio FGP21. Diluentes, aromatizantes, ceras com baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegrar tablete e aglutinantes também podem ser empregados.
[00176] Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de mutantes de polipeptídio FGF21 em uma mistura com excipientes não tóxicos que são apropriados para a fabricação de tabletes. Por dissolver os tabletes em água estéril, ou outro veículo apropriado, soluções podem ser preparadas em forma de dose unitária. Excipientes apropriados incluem, porém não são limitados a, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, como amido, gelatina ou acácia; ou agentes de lubrificação como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
[00177] Composições farmacêuticas de mutante de polipeptídio FGF21 adicionais serão evidentes para aqueles versados na técnica, incluindo formulações que envolvem mutantes de polipeptídio FGF21 em formulações de distribuição controlada. Técnicas para formular uma variedade de outros meios de distribuição controlada, como veículos de lipossoma, micropartículas bio-desgastáveis ou contas porosas e injeções de depot, são também conhecidas por aqueles versados na técnica (vide, por exemplo, a publicação internacional no. WO 93/15722, que descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a distribuição de composições farmacêuticas, e Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, e Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, que discutem preparação e uso de microesfera/micropartícula. Como descrito aqui, um hidrogel é um exemplo de formulação de distribuição controlada.
[00178] Exemplos adicionais de preparados de liberação controlada incluem matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Matrizes de liberação controlada podem incluir poliésteres, hidrogeis, polilactides (patente US número 3.773.919 e patente européia no. 0 058 481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman e outros, 1983, Biopolymers 22:547-56), poli(2- hidroxietil-metacrilato) (Langer e outros, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15 : 167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), acetato de vinil etileno (Langer e outros, supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxi butírico (patente européia no. 0 133 988). Composições de liberação controlada podem incluir também lipossomas, que podem ser preparadas por quaisquer de vários métodos conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Epstein e outros, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 82:3688-92; e patentes européias nos. 0 036 676, 0 088 046 e 0 143 949.
[00179] A composição farmacêutica de mutante de polipeptídio FGF21 a ser utilizada para administração in vivo deve ser tipicamente estéril. Isso pode ser realizado por filtração através de membranas de filtração estéril. Onde a composição é liofilizada, esterilização utilizando esse método pode ser realizada antes de, ou após, liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser armazenada em forma liofilizada ou em uma solução. Além disso, composições parenterais são genericamente colocadas em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa tendo um tampo perfurável por uma agulha de injeção hidrodérmica.
[00180] Após formulação da composição farmacêutica, pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que requer reconstituição antes da administração.
[00181] Em uma modalidade específica, a presente invenção é dirigida a kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits podem conter tanto um primeiro recipiente tendo uma proteína seca como um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. São também incluídos no escopo da presente invenção kits contendo seringas pré-cheias de câmara única e múltiplas câmaras (por exemplo, seringas de líquido e lioseringas).
[00182] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica mutante de polipeptídio FGF21 a ser empregada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto terapêutico e objetivos. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá que os níveis de dosagem apropriados para tratamento variarão desse modo dependendo, em parte, da molécula distribuída, indicação para a qual o mutante de polipeptídio FGF21 está sendo utilizado, via de administração, e o tamanho (peso corporal, superfície do corpo, ou tamanho do órgão) e condição (idade e saúde geral) do paciente. Por conseguinte, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo. Uma dosagem típica pode variar de aproximadamente 0,1 μg/kg até aproximadamente 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em outras modalidades, a dosagem pode variar de 0,1 μg/kg até aproximadamente 100 mg/kg; ou 1 μg/kg até aproximadamente 100 mg/kg; ou 5 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 25 μg/kg, 30 μg/kg, 35 μg/kg, 40 μg/kg, 45 μg/kg, 50 μg/kg, 55μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg, até aproximadamente 100 mg/kg. Ainda em outras modalidades, a dosagem pode ser 50 μg/kg, 100 μg/kg, 150 μg/kg, 200 μg/kg, 250 μg/kg, 300 μg/kg, 350 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 650 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 850 μg/kg, 900 μg/kg, 950 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg, 300 μg/kg, 400 μg/kg, 500 μg/kg, 600 μg/kg, 700 μg/kg, 800 μg/kg, 900 μg/kg, 1000 μg/kg, 2000 μg/kg, 3000 μg/kg, 4000 μg/kg, 5000 μg/kg, 6000 μg/kg, 7000 μg/kg, 8000 μg/kg, 9000 μg/kg ou 10 mg/kg.
[00183] A freqüência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacêuticos do mutante de polipeptídio FGF21 na formulação sendo utilizada. Tipicamente, um clínico administrará a composição até que uma dosagem seja atingida que obtém o efeito desejado. A composição pode ser, portanto, administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem conter ou não a mesma quantidade da molécula desejada) com o passar do tempo, ou como uma infusão contínua através de um cateter ou dispositivo de implantação. Refinamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramente feito por aqueles com conhecimentos comuns na técnica e está compreendido no âmbito de tarefas rotineiramente realizadas pelos mesmos. Dosagens apropriadas podem ser determinadas através do uso de dados de resposta de dose apropriados.
[00184] A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, por via oral; através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação controlada (que também podem ser injetados); ou por dispositivos de implante. Onde desejado, as composições podem ser administradas por injeção de bolo ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implante.
[00185] Alternativa ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente através de implante de uma membrana, esponja, ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Onde um dispositivo de implante é utilizado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão apropriado, e distribuição da molécula desejada pode ser através de difusão, bolo de liberação regulada ou administração contínua.
[00186] Para distribuir droga, por exemplo, um mutante FGF21 revelado aqui, em uma taxa predeterminada de tal modo que a concentração de droga possa ser mantida em um nível terapeuticamente eficaz desejado durante um período prolongado, uma variedade de abordagens diferentes pode ser empregada. Em um exemplo, um hidrogel compreendendo um polímero como uma gelatina (por exemplo, gelatina bovina, gelatina humana, ou gelatina de outra fonte) ou um polímero de ocorrência natural ou sinteticamente gerado pode ser empregada. Qualquer percentagem de polímero (por exemplo, gelatina) pode ser empregada em hidrogel, como 5, 10, 15 ou 20%. A seleção de uma concentração apropriada pode depender de uma variedade de fatores, como o perfil terapêutico desejado e o perfil farmacocinético da molécula terapêutica.
[00187] Os exemplos de polímeros que podem ser incorporados em um hidrogel incluem polietileno glicol (“PEG”), óxido de polietileno, óxido de polietileno-co- óxido de polipropileno, copolímeros aleatórios ou de bloco de óxido co-polietileno, álcool de polivinl, poli(vinil pirrolidinona) (poli(aminoácidos), dextrano, heparina, polissacarídeos, poliéteres e similares.
[00188] Outro fator que pode ser considerado ao gerar uma formulação de hidrogel é o grau de reticulação no hidrogel e agente de reticulação. Em uma modalidade, a reticulação pode ser obtida através de uma reação de metacrilação envolvendo anidrido metacrílico. Em algumas situações, um alto grau de reticulação pode ser desejável enquanto em outras situações um grau inferior de reticulação é preferido. Em alguns casos um grau mais elevado de reticulação provê uma liberação controlada mais longa. Um grau mais elevado de reticulação pode fornecer um hidrogel mais firme e um período mais longo no qual a droga é distribuída.
[00189] Qualquer razão de polímero para agente de reticulação (por exemplo, anidrido metacrílico) pode ser empregada para gerar um hidrogel com propriedades desejadas. Por exemplo, a razão de polímero para reticulador pode ser, por exemplo, 8:1, 16:1, 24:1, ou 32:1. Por exemplo, quando o polímero de hidrogel é gelatina e o reticulador é metacrilato, razões de 8:1, 16:1, 24:1, ou 32:1 de anidrido metálico: gelatina podem ser empregadas.
Usos terapêuticos de mutantes de polipeptídio FGF21
[00190] Mutantes de polipeptídio FGF21 podem ser utilizados para tratar, diagnosticar, melhorar ou evitar diversas doenças, distúrbios ou condições incluindo, porém não limitado a distúrbios metabólicos. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico a ser tratado é diabetes, por exemplo, diabetes tipo 2. Em outra modalidade, o distúrbio metabólico é obesidade. Outras modalidades incluem condições metabólicas ou distúrbios como dislipidimia; hipertensão; hepatosteaotose, como esteatoepatite não alcoólica (NASH); doença cardiovascular, como aterosclerose; e envelhecimento.
[00191] Em aplicação, um distúrbio ou condição como diabetes ou obesidade pode ser tratada por administrar um mutante de polipeptídio FGF21 como descrito aqui a um paciente necessitando do mesmo na quantidade de uma dose terapeuticamente eficaz. A administração pode ser realizada como descrito aqui, como por injeção IV, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, ou oralmente na forma de um tablete ou formação de líquido. Na maioria das situações, uma dosagem desejada pode ser determinada por um clínico, como descrito aqui, e pode representar uma dose terapeuticamente eficaz do polipeptídio mutante FGF21. Será evidente para aqueles com conhecimentos na técnica que uma dose terapeuticamente eficaz de polipeptídio mutante FGF21 dependerá, entre outras coisas, do programa de administração, a dose unitária de agente administrado, se a molécula de ácido nucléico ou polipeptídio é administrada em combinação com outros agentes terapêuticos, o estado imune e a saúde do receptor. O termo “dose terapeuticamente eficaz”, como utilizado aqui, significa que a quantidade de polipeptídio mutante FGF21 que elicia a resposta médica ou biológica em um sistema de tecido, animal, ou ser humano buscado por um pesquisador, médico, ou outro clínico, que inclui alívio dos sintomas da doença ou distúrbio sendo tratado.
Anticorpos
[00192] Anticorpos e fragmentos de anticorpo que especificamente se ligam aos polipeptídios mutantes FGF21 da presente invenção porém não se ligam especificamente a polipeptídios FGF21 do tipo selvagem são considerados e estão compreendidos no escopo da presente invenção. Os anticorpos podem ser policlonais, incluindo policlonais não específicos; monoclonais (MAbs); recombinantes; quiméricos; humanizados como região de determinar complementaridade (CDR)-enxertada; humano; cadeia única; e/ou biespecífica; bem como fragmentos; variantes ou moléculas quimicamente modificadas dos mesmos. Fragmentos de anticorpo incluem aquelas porções do anticorpo que especificamente se ligam a um epítopo em um polipeptídio mutante FGF21. Os exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos Fab e F(ab’) gerados por clivagem enzimática de anticorpos de comprimento total. Outros fragmentos de ligação incluem aqueles gerados por técnicas de DNA recombinante, como a expressão de plasmídeos recombinantes contendo seqüências de ácido nucléico que codificam regiões variáveis de anticorpo.
[00193] O termo “ligando especificamente”, quando utilizado no contexto de um anticorpo, significa que o anticorpo liga seu alvo na presença de uma população heterogênea de proteínas e/ou outro material biológico. Mais particularmente, quando um anticorpo especificamente liga seu alvo, isso significa que sob condições de imunoensaio predeterminadas, o anticorpo se liga a seu alvo e não liga em uma quantidade significativa a outra proteínas presentes na amostra. Qualquer formato de imunoensaio conveniente pode ser empregado para identificar um anticorpo que liga especificamente seu alvo, por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida. Vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova York. Anticorpos policlonais dirigidos para um polipeptídio mutante FGF21 são genericamente produzidos em animais (por exemplo, coelhos ou camundongos) por intermédio de injeções múltiplas subcutâneas ou intraperitoneais do polipeptídio mutante FGF21 e um adjuvante. Pode ser útil conjugar um polipeptídio mutante FGF21 com uma proteína portadora que é imunogênica na espécie a ser imunizada, como hemocianina de molusco de buraco de fechadura, soro, albumina, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja. Além disso, agentes de agregação como alum são utilizados para aumentar a resposta imune. Após imunização, os animais são sangrados e o soro é ensaiado para título de anticorpo mutante anti-FGF21.
[00194] Anticorpos monoclonais dirigidos para polipeptídios de mutante FGF21 podem ser produzidos utilizando qualquer método que provê a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de célula contínuas em cultura. Os exemplos de métodos apropriados para preparar anticorpos monoclonais incluem os métodos de hibridoma de Kohler e outros, 1975, Nature 256: 495-97 e o método de hibridoma de célula-B humano (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur e outros, Monoclonal antibody production techniques and applications, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). São também fornecidas pela invenção linhagens de células de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais reativos com polipeptídios mutante FGF21.
[00195] Anticorpos monoclonais da invenção podem ser modificados para uso como terapêutica. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal é um anticorpo “quimérico” no qual uma porção da cadeia pesada (H) e/ou leve (L) é idêntica a ou homóloga a uma seqüência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie específica ou que pertence a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da cadeia(s) é/são idêntica(s) a ou homóloga(s) a uma seqüência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo à outra classe ou subclasse de anticorpo. São também incluídos fragmentos de tais anticorpos, desde que apresentem a atividade biológica desejada. Vide, por exemplo, patente US no. 4.816.567; Morrison e outros, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55.
[00196] Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal da invenção é um anticorpo “humanizado”. Métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Vide, poro exemplo, as patentes US números 5.585.089 e 5.693.762. genericamente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo de uma fonte que é não humano. Humanização pode ser realizada, por exemplo, utilizando métodos descritos na técnica (vide, por exemplo, Jones e outros, 1986, Nature 321: 522-25; Riechmann e outros, 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen, e outros, 1988, Science 239:1534-36), por substituir pelo menos uma porção de uma região de determinar complementaridade de roedor para as regiões correspondentes de um anticorpo humano.
[00197] São também abrangidas pela invenção anticorpos humanos que ligam os polipeptídios mutantes FGF21 da presente invenção. Utilizando animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena tais anticorpos são produzidos por imunização com um antígeno derivado de um mutante FGF21 (isto é, tendo pelo menos 6 aminoácidos contíguos), opcionalmente conjugado com um veículo. Vide, por exemplo, Jakobovits e outros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A 90: 2551-55; Jakobovits e outros, 1993, Nature 362: 255-58; Bruggermann e outros, 1993, Year in immuno. 7: 33. Em um método, tais animais transgênicos são produzidos por incapacitar os locais endógenos codificando as cadeias de imunoglobulina pesada e leve nos mesmos, e inserindo locais que codificam proteínas de cadeia pesada e leve humanas no genoma dos mesmos. Animais parcialmente modificados, isto é, animais tendo menos do que o complemento total de modificações, são então cruzados para obter um animal tendo todas as modificações de sistema imune desejadas. Quando administrado um imunógeno, esses animais transgênicos produzem anticorpos com seqüências de aminoácido humano (em vez de, por exemplo, murino), incluindo regiões variáveis que são imunoespecíficas para esses antígenos. Vide, por exemplo,as publicações internacionais nos. WO 96/33735 e WO 94/02602. Métodos adicionais são descritos na patente US no. 5.545.807, publicação internacional nos. WO 91/10741 e WO 90/04036, e na patente européia no. 0 546 073. Anticorpos humanos também podem ser produzidos pela expressão de DNA recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma com descrito aqui.
[00198] Em uma modalidade alternativa, anticorpos humanos também podem ser produzidos de bibliotecas de exibição de fago (vide, por exemplo, Hoogenboom e outros, 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks e outros, 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). Esses processos simulam seleção imune através da exibição de repertórios de anticorpo na superfície de bacteriófago filamentoso, e seleção subseqüente de fago por sua ligação a um antígeno de escolha.
[00199] Anticorpos quiméricos, enxertados CDR e humanizados são tipicamente produzidos por métodos recombinantes. ácidos nucléicos que codificam os anticorpos são introduzidos em células hospedeiras e expressos utilizando materiais e procedimentos descritos aqui. Em uma modalidade, os anticorpos são produzidos em células hospedeiras de mamífero, como células CHO. Anticorpos monoclonais (por exemplo, humanos) podem ser produzidos pela expressão de DNA recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma como descrito aqui.
[00200] Os anticorpos mutante anti-FGF21 da invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitivos, ensaios de encaixe direto e indireto, e ensaios de imunoprecipitação (vide, por exemplo, Sola, Monoclonal antibodies: a manual of techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), incorporado aqui a título de referência na íntegra) para a detecção e quantificação de polipeptídios mutantes FGF21. Os anticorpos ligarão polipeptídios mutantes FGF21, com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio sendo empregado.
[00201] Para aplicações de diagnóstico, em certas modalidades anticorpos mutantes anti-FGF21 podem ser rotulados com uma fração detectável. A fração detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a fração detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In, ou 67Ga; um composto fluorescente ou quimiluminescente, como isotiocinato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina; ou uma enzima, como fosfatase alcalina, B-galactosidase, ou peroxidase de raiz forte (Bayer e outros, 1990, Meth. Enz. 184: 138-63).
[00202] Ensaios de ligação competitivos se baseiam na capacidade de um padrão rotulado (por exemplo, um polipeptídio mutante FGF21, ou uma porção imunologicamente reativa do mesmo) de competir com o analisado de amostra de teste (por exemplo, um polipeptídio mutante FGF21) para ligar com uma quantidade limitada de anticorpo mutante anti-FGF21. A quantidade de um polipeptídio mutante FGF21 na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se torna ligada aos anticorpos. Para facilitar determinar a quantidade de padrão que se torna ligada, os anticorpos são tipicamente insolubilizados antes ou após a competição, de modo que o padrão e analisado que são ligados aos anticorpos possam se convenientemente separados do padrão e analisado que permanecem não ligados.
[00203] Ensaios de encaixe envolvem tipicamente o uso de dois anticorpos, cada capaz de se ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epítopo, da proteína a ser detectada e/ou quantificada. Em um ensaio de encaixe, o analisado de amostra de teste é tipicamente ligado por um primeiro anticorpo que é imobilizado em um suporte sólido, e posteriormente um segundo anticorpo se liga ao analisado, desse modo formando um complexo de três partes insolúvel. Vide, por exemplo, a patente US no. 4.376.110. o segundo anticorpo pode ele próprio ser rotulado com uma fração detectável (ensaios de encaixe diferentes) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina que é rotulado com uma fração detectável (ensaios de encaixe indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio de encaixe é um ensaio imunosorvente ligado por enzima (ELISA) em cujo caso a fração detectável é uma enzima.
[00204] Os anticorpos mutantes anti-FGF21 da presente invenção são também úteis para imageamento in vivo. Um anticorpo rotulado com uma fração detectável pode ser administrado a um animal, preferivelmente na corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo rotulado no hospedeiro ensaiado. O anticorpo pode ser rotulado com qualquer fração que seja detectável em um animal, quer por ressonância magnética nuclear, radiologia, ou outro meio de detecção conhecido na técnica.
[00205] Os anticorpos mutantes FGF21 da invenção podem ser utilizados como terapêutica. Esses agentes terapêuticos são genericamente agonistas ou antagonistas, em que aumentam ou reduzem, respectivamente, pelo menos uma das atividades biológicas de um polipeptídio mutante FGF21. Em uma modalidade, anticorpos antagonistas da invenção são anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos que são capazes de ligar especificamente a um polipeptídio mutante FGF21 e que são capazes de inibir ou eliminar a atividade funcional de um polipeptídio mutante FGF21 in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista inibirá a atividade funcional de um polipeptídio mutante FGF21 em pelo menos aproximadamente 50%, e preferivelmente pelo menos aproximadamente 80%. Em outra modalidade, o anticorpo mutante anti-FGF21 é capaz de interferir na interação entre o polipeptídio mutante FGF21 e um receptor FGF desse modo inibindo ou eliminando atividade de polipeptídio mutante FGF21 in vitro ou in vivo. Anticorpos mutantes anti-FGF21 agonista e antagonista são identificados por ensaios de triagem que são bem conhecidos na técnica.
[00206] A invenção também se refere a um kit que compreende anticorpos mutantes FGF21 e outros reagentes úteis para detectar níveis de polipeptídio mutante FGF21 em amostras biológicas. Tais reagentes podem incluir um rótulo detectável, soro de bloqueio, amostras de controle positiva e negativa e reagentes de detecção.
EXEMPLOS
[00207] Os exemplos que seguem são ilustrativos de modalidades específicas da invenção e vários usos da mesma. São expostos para fins explanatórios somente, e não devem ser interpretados como limitando de modo algum o escopo da invenção.
Exemplo 1 Preparação de construções de expressão FGF21
[00208] Uma seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídio de fGF21 maduro foi obtida por amplificação de ração de cadeia de polimerase (PCR) utilizando iniciadores tendo seqüências de nucleotídeo correspondendo às extremidades 5’ e 3’ da seqüência FGF21 madura. A tabela 2 lista os iniciadores que foram utilizados para amplificar a seqüência FGF21 madura. Tabela 2 Iniciadores PCR para preparar construção FGF21
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[00209] Os iniciadores utilizados para preparar a construção de expressão FGF21 madura incorporaram sítios de endonuclease de restrição (o sítio NdeI também compreende uma metionina de terminal-N para expressão bacteriana) para clonagem direcional da seqüência em um vetor de expressão apropriado (por exemplo, pET30 (NOvagen/EMD Biosciences; San Diego, CA) ou pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA)). O vetor de expressão pAMG33 contém uma origem de replicação de R-100 de número de cópia baixa, um promotor lac modificado, e um gene de resistência a canamicina. O vetor de expressão pET30 contém uma origem de replicação derivada de pBR322, um promotor T2 induzível, e um gene de resistência à canamicina. Embora a expressão de pAMG33 tenha sido verificada como mais elevada, verificou-se que pET30 é um vetor de clonagem mais seguro. Desse modo, a maioria das construções descritas na presente revelação foi primeiramente gerada em pET30 e então selecionada para eficácia. Seqüências selecionadas foram então transferidas para pAMG33 para amplificação adicional.
[00210] A seqüência FGF21 foi amplificada em uma mistura de ração contendo 40,65 uL dH2O, 5 uL PfuUltra II tampão de reação (10x), 1,25 uL dNTP mistura (40 mM - 4 x 10 mM), 0,1 uL Gabarito (100 ng/mL), 1 uL IniciadorI (10 uM), 1 uL Iniciador2 (10 uM), e 1 uL PfuUltra II fusão HS DNA polimerase (Stratragene; La Jolla, CA). Reações de amplificação foram realizadas por aquecimento por 2 minutos a 95°C; seguido por dez ciclos a 95°C por 20 segundos, 60°C por 20 segundos (com um 1°C adicional subtraído por ciclo) e 72°C por 15 segundos/kilobase de produto desejado; seguido por 20 ciclos a 94°C por 20 segundos, 55°C por 20 segundos, e 72°C por 15 segundos/kilobase de produto desejado; seguido por 72°C por 3 minutos. Produtos de amplificação foram digeridos com as endonucleases de restrição NdeI, DpnI e EcoRI; ligados em um vetor apropriado, e então transformados em células competentes.
Exemplo 2 Purificação de proteínas FGF21 de bactérias
[00211] Nos exemplos que seguem, várias proteínas FGF21, incluindo o polipeptídio FGF21 do tipo selvagem, polipeptídios FGF21 truncados, mutantes FGF21, e proteínas de fusão FGF21, foram expressos em um sistema de expressão bacteriano. Após expressão, que é descrito abaixo, as proteínas FGF21 foram purificadas como descrito nesse exemplo, a menos que indicado de outro modo.
[00212] Para purificar o polipeptídio FGF21 do tipo selvagem, polipeptídios FGF21 truncados, e mutantes FGF231 de corpos de inclusão bacteriana, corpos de inclusão de lavagem dupla (DWIBs) foram solubilizados em um tampão de solubilização contendo cloridrato de guanidina e DTT em tampão Tris em pH 8,5. Foram então misturados por uma hora em temperatura ambiente, e a mistura de solubilização foi adicionada a um tampão de redobrar contendo uréia, arginina, cisteína, e cloridrato de cistamina em pH 9,5 e então misturado por 24 horas a 5°C (vide, por exemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall e outros, 2007, Biotechnol. Bioeng. 95: 1523-34; Rudolf e outros, 1997, “Folding proteins”, Protein function: a practical approach (Creighton, Ed., Nova York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi e outros, 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).
[00213] Após solubilização e redobramento, a mistura foi filtrada através de um filtro de 0,45 mícron. O pool de redobrar foi então concentrado aproximadamente 10 vezes com um cassete Pall Omega de corte de peso molecular de 10 kD em uma pressão de transmembrana (TMP) de 20 psi, e diafiltrado com 3 volumes de coluna de 20 mM Tris, pH 8,0 a um TMP de 20 psi.
[00214] A amostra clarificada foi então submetida à cromatografia de permuta de anion (AEX) utilizando uma resina HP de Q Sefarose. Um gradiente de sal linear de 0 a 250 mM NaCl em 20 mM Tris foi feita em pH 8,0 a 5°C. frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE e agrupadas.
[00215] O pool de eluado AEX foi então submetido à cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) utilizando uma resina Sefarose HP de fenila. Proteína foi eluída utilizando um gradiente linear de diminuição de 0,7 M a 0 M sulfato de amônio em pH 8,0 e temperatura ambiente. Frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227:68085) e agrupadas.
[00216] O pool HIC foi concentrado com um cassete de 0,2 m2 Pall Omega de corte de peso molecular de 10 kD a 7 mg/mL em um TMP de 20 psi. o concentrado foi diafiltrado com 5 volumes de coluna de tampão de formulação em um TMP de 20 psi, e o concentrado recuperado foi diluído a 5 mg/mL. Finalmente, a solução foi filtrada através de uma membrana Posidyne 0,2 uM mini-Kleenpac Pall.
[00217] Para purificar proteínas de fusão FGF21 e proteínas mutantes de fusão FGF21 de corpos de inclusão bacterianos, corpos de inclusão de lavagem dupla (DWIBs) foram solubilizados em um tampão de solubilização contendo cloridrato de guanidina e DTT em tampão Tris em pH 8,5 e então misturados por uma hora em temperatura ambiente. A seguir a mistura de solubilização foi adicionada a um tampão de redobrar contendo uréia, arginina, cisteína, e cloridrato de cistamina em pH 9,5 e então misturado por 24 horas a 5°C (vide, por exemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall e outros, 2007, Biotechnol. Bioeng. 95: 1523-34; Rudolf e outros, 1997, “Folding proteins”, Protein function: a practical approach (Creighton, Ed., Nova York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi e outros, 2005, Protein Expr. Purif. 42: 1-6).
[00218] Após solubilização e redobramento, a mistura foi dialisada contra 5 volumes de 20 mM Tris, pH 8,0 utilizando tubulação de diálise de 10 kD. O pH do redobramento dialisado foi ajustado a 5,0 com ácido acético 50%, e então clarificada por centrifugação por 30 minutos em 4K.
[00219] A amostra clarificada foi então submetida à cromatografia de permuta de anion (AEX) utilizando uma resina Q Sefarose HP. Um gradiente de sal linear de 0 a 250 mM NaCl em 20 mM Tris foi feito em pH 8,0 a 5°C. frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) e agrupadas.
[00220] O pool eluado AE foi então submetido à cromatografia de interação hidrofobia (HIC) utilizando uma resina de Sefarose HP de fenila. Proteína foi eluída utilizando um gradiente linear de diminuição de 0.6 M a 0 M de sulfato de amônio em pH 8,0 em temperatura ambiente. Frações de pico foram analisadas por SDS-PAGE e agrupadas.
[00221] Após a etapa HIC, o pool foi então dialisado 60 volumes de tampão de formulação. O pool dialisado foi concentrado a 5 mg/mL utilizando um Pall Jumbosep. Finalmente, a solução foi filtrada através de uma membrane Posidyne 0,2 uM mini-Kleenpac Pall.
Exemplo 3 Preparação e expressão de proteínas FGF21 truncadas
[00222] Construções que codificam as proteínas FGF21 truncadas listadas na Tabela 3 foram preparadas por amplificação de PCR do vetor de expressão FGF21 do tipo selvagem como descrito abaixo (a construção do vetor de expressão FGF21 do tipo selvagem é descrita no exemplo 1). Tabela 3 FGF21 mentos FGF21
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* relativo a polipeptídio FGF21 maduro
[00223] Construções de proteína FGF21 truncadas foram preparadas utilizando iniciadores tendo seqüências que são homólogas a regiões a montante e a jusante de um códon (ou códons) a ser deletado (resultando no truncamento). Os iniciadores utilizados em tais reações de amplificação também forneceram aproximadamente 15 nucleotídeos de seqüência de sobreposição para permitir recircularização do produto amplificado, a saber o vetor inteiro agora tendo o mutante ou truncamento desejado.
[00224] Uma construção FGF21 truncada exemplar, codificando uma proteína FGF21 sem o resíduo de histidina na posição 1 da seqüência FGF21 madura (isto é, o mutante de truncamento 2-181), foi preparado utilizando os iniciadores mostrados na tabela 4. Tabela 4 Iniciadores de PCR para prepara mutante FGF21 de truncamento exemplar
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[00225] Os iniciadores mostrados na tabela 4 permitem a deleção do resíduo de histidina como mostrado abaixo, em que a seqüência superior (SEQ ID NO: 9) é uma porção de um polipeptídio FGF21 maduro compreendendo uma metionina terminal-N, a segunda seqüência é o iniciador de sentido (SEQ ID NO: 14), as terceira e quarta seqüências (SEQ ID NOS: 17 e 18) são porções de uma construção de expressão FGF21, e a quinta seqüência é o iniciador anti- sentido (SEQ ID NO: 16).
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[00226] Construções de proteína FGF21 truncadas foram preparadas utilizando essencialmente as condições PCR descritas no exemplo 1. Produtos de amplificação foram digeridos com a endonuclease de restrição DpnI, e então transformados em células competentes. Os clones resultantes foram seqüenciados para confirmar a ausência de erros gerados por polimerase.
[00227] Proteínas FGF21 truncadas foram expressas por transformar células BL21 (DE3) ou BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) com a construção codificando uma proteína FGF21 truncada particular. Transformantes foram crescidos durante a noite com aeração limitada em meio TB suplementado com 40 ug/mL de canamicina, foram aerados na manhã seguinte, e após um período de recuperação curto, foram induzidos em 0,4 mM IPTG. Mutantes FGF21 foram colhidos por centrifugação 18-20 após indução.
Exemplo 4 Atividade in vitro de proteínas FGF21 truncadas
[00228] Experimentos foram realizados para identificar proteínas FGF21 truncadas que retêm atividade FGF21 do tipo selvagem em um ensaio in vitro ELKluciferase. A tabela 5 resume os resultados obtidos para proteínas FGF21 tendo truncamento na extremidade-N, extremidade-C ou em ambas as extremidades-N e extremidade- C. ensaios ELK-luciferase foram realizados utilizando um sistema de célula de rim 293T humano recombinante, no qual as células 293T superexpressam construções de repórter luciferase e B-Klotho. Essas construções também contêm seqüências que codificam GAL4-ELK1 e 5x UAS-Luc, um repórter de luciferase acionado por um promotor que contém cinco cópias tandem do sítio de ligação Gal4. B-Klotho é um co-receptor que é exigido por FGF21 para ativação de seus receptores FGF e indução de transdução de sinais intracelulares, que por sua vez leva a Erk e fosforilação ELK. A atividade de luciferase é regulada pelo nível de Erk/ELK1 fosforilado e é utilizada para monitorar indiretamente e quantificar a atividade FGF21.
[00229] Os ensaios de ELK-luciferase foram realizados por cultivar as células 293T na presença de concentrações diferentes de polipeptídio mutante FGF21 ou FGF21 do tipo selvagem por 6 horas, e então ensaiar os lisados de células em relação à atividade de luciferase. As figuras 1A-1B mostram os resultados de um ensaio de atividade de luciferase-ELK realizado nos mutantes de truncamento FGF21 7-181 e 1-164 (figura 1B). a luminescência obtida nos ensaios de luciferase-ELK para cada dos mutantes de truncamento FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1173, 1-172, 9-181, e 1-149 é mostrada na figura 2.
[00230] Polipeptídio mutantes FGF21 foram comparados com um padrão FGF21 do tipo selvagem e mutantes que mostram uma eficácia de pelo menos 50% da eficácia de FGF21 do tipo selvagem foram considerados como não tendo perdido a atividade FGF21 e foram atribuídos um “+” na Tabela 5. Tabela 5 Proteínas FGF21 truncadas: ensaio in vitro
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[00231] Coletivamente, os resultados apresentados na tabela 5 indicam que deleções de terminal-C de 14 ou mais resíduos de aminoácidos (isto é, uma proteína FGF21 truncada terminalmente C consistindo em resíduos de aminoácidos 1-167 e proteínas mais curtas) eliminam a atividade de FGF21. Além disso, a tabela 5 indica que deleções de terminal-N de 7 ou mais resíduos de aminoácidos (isto é, uma proteína FGF21 truncada terminalmente-N consistindo em resíduos de aminoácidos 8-181 e proteínas mais curtas) eliminam a atividade de FGF21. Não surpreendentemente, proteínas FGF21 truncadas possuindo tanto um truncamento de terminal-N de 8 a 14 resíduos e um truncamento de terminal-C de 12 ou32 resíduos foram verificados não ter atividade em ensaios de luciferase-ELK.
[00232] Compatível com os dados apresentados na tabela 5, polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-N de um número menor do que 7 resíduos de aminoácidos constituem modalidades da presente invenção. Similarmente, polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-C com um número menor do que 12 resíduos de aminoácidos constituem modalidades da presente invenção.
Exemplo 5 Atividade in vivo de proteínas FGF21 truncadas
[00233] FGF21 possui diversas atividades biológicas, incluindo a capacidade de diminuir níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; reduzir peso corporal; ou melhorar tolerância a glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina. Polipeptídios FGF21 truncados foram adicionalmente analisados para atividade FGF21 in vivo, por introduzir polipeptídios FGF21 truncados em camundongos ob/ob resistentes a insulina, e medir a capacidade de um polipeptídio FGF21 truncado específico diminuir a glicose no sangue. O polipeptídio FGF21 truncado a ser testado foi injetado por via intraperitoneal em um camundongo ob/ob com 8 semanas de idade (Jackson Laboratory) e amostras de sangue foram obtidas em vários pontos de tempo após uma única injeção, por exemplo, 0, 6, 24, 72, 120 e 168 horas após injeção. Níveis de glicose no sangue foram medidos com um Glucometer OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), e os resultados expressos como uma percentagem de alteração de glicose no sangue em relação ao nível de linha de base de glicose no sangue (isto é, no tempo 0).
[00234] Os resultados de um experimento são fornecidos na figura 3, que mostra a quantidade de glicose no sangue detectada em camundongos injetados com os mutantes de truncamento FGF21 8-181 e 9-181. Esse experimento demonstrou que proteínas de fusão FGF21 truncadas compreendendo resíduos de aminoácidos 8-181 apresentam atividade de diminuir glicose no sangue in vivo, entretanto, a atividade é levemente menor do que a atividade de FGF21 do tipo selvagem em 3 e 6 horas após injeção, porém que proteínas de fusão FGF21 truncadas compreendendo resíduos de aminoácido 9-181 não apresentam tal atividade. Desse modo, a análise in vivo de polipeptídios FGF21 truncados indicou que a deleção de até 7 aminoácidos a partir da extremidade-N de FGF21 maduro não abole a atividade biológica de molécula (em contraste com a análise in vitro, que sugeriu que a deleção de 7 aminoácidos a partir da extremidade-N de FGF21 maduro aboliria a atividade).
[00235] Os resultados diferentes obtidos com polipeptídios FGF21 truncados terminalmente-N específicos (por exemplo, FGF21 8-181) em ensaios in vitro e in vivo podem ser explicados pela interação de FGF21 e B-Klotho e receptor FGF em efetuar transdução de sinais. Em particular, FGF21 ativa o complexo de receptor dual compreendendo o co-receptor B-Klotho e receptor FGF (FGFR), que inicia uma cascata de sinalização envolvendo tirosina cinase. A extremidade-N de FGF21 foi mostrada estar envolvida na ligação e ativação de FGFR enquanto a extremidade-C de FGF21 é necessária para interação de B- Klotho (Yie e outros, 2009 FEBS Lett. 583-19-24). O ensaio de in vitro de ELK-luciferase é realizado em 293 células de rim nas quais o co-receptor K-Blotho é superexpresso e FGFR é expresso em níveis normais. A quantidade de FGFR é baixa em relação àquela de B-Klotho e a razão de B-Klotho para FGFR em 293 células é portanto não fisiológica, que pode afetar formação de complexo receptor e finalmente ligação de ligando e ativação de FGFR. O sistema in vitro 293 parece ser mais vulnerável a polipeptídios FGF21 truncados terminalmente N e portanto pode ter resultados de perda de atividade produzidos para alguns dos mutantes truncados terminalmente N testados, como FGF21 8-181. Desse modo, na determinação de se um mutante FGF21 truncado terminalmente N específico reteve atividade FGF21 do tipo selvagem, a atividade daquele mutante FGF21 no ensaio in vivo foi considerada como sendo dispositiva. Por conseguinte, polipeptídios FGF21 truncados tendo truncamentos de terminal-N de um número menor do que 8 resíduos de aminoácidos são abrangidos pela invenção.
Exemplo 6 Preparação e expressão de proteínas de fusão FGF21 truncadas
[00236] Como à meia vida de uma proteína pode ser aumentada por fundir a proteína com uma seqüência Fc, proteínas de fusão compreendendo polipeptídios FGF21 truncados foram preparados e analisados. As proteínas de fusão FGF21 truncadas listadas na tabela 6 foram preparadas de seqüências FGF21 amplificadas por PCR SOEing (junção de gene por extensão de sobreposição). Proteínas de fusão FGF21 foram preparadas de tal modo que a porção Fc do gene IgG1 de imunoglobulina humana (SEQ ID NO: 11) foi fundida com a extremidade N ou extremidade C da proteína FGF21. Tabela 6 Proteínas de fusão FGF21 truncadas
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[00237] Em particular, construções de proteína de fusão FGF21 (incluindo aquelas que codificam proteínas de fusão FGF21 truncadas) foram preparadas em uma série de três reações de amplificação utilizando essencialmente as condições de reação descritas no exemplo 1. Na primeira reação, um par de iniciadores foi projetado para produzir uma seqüência contendo um sítio de clonagem NdeI (incluindo uma metionina terminal-N para expressão bacteriana), região Fc, e seqüência de ligador. Na segunda ração, um par de iniciadores foi projetado para produzir uma seqüência contendo uma porção de sobreposição do ligador, uma porção da seqüência de codificação FGF21, e um sítio de clonagem EcoRI. Finalmente, na terceira reação, um par de iniciadores foi projetado para fins de ligar os produtos das duas primeiras reações. Um conjunto exemplar de iniciadores para a construção de Fc-FGF21 1-181 é listado na tabela 7. Tabela 7 Iniciadores de PCR para preparar construção de proteína de fusão FGF21 exemplar
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[00238] O produto da reação final foi digerido com as endonucleases de restrição NdeI e EcoRI, ligadas no vetor pET30, e então transformado em células competentes. Os clones resultantes foram seqüenciados para confirmar a ausência de erros gerados por polimerase.
Exemplo 7 Atividade in vivo de proteínas de fusão FGF21 truncadas
[00239] Proteínas de fusão compreendendo uma seqüência FGF21 truncada fundida com uma seqüência Fc foram geradas e ensaiadas em relação à atividade in vivo. Proteínas de fusão FGF21 truncadas foram preparadas por fundir uma molécula Fc IgG1 a extremidade de terminal-C ou terminal C de uma proteína FGF21 truncada para formar uma seqüência contígua única. Para distinguir entre fusões de terminal-C e terminal-C, proteínas de fusão FGF21 nas quais a molécula Fc foi fundida à extremidade terminal N da proteína FGF21 são designadas como Fc-FGF21, e proteínas de fusão nas quais a molécula Fc foi fundida com a extremidade terminal-C da proteína FGF21 são designadas como FGF21-Fc.
[00240] FGF21 possui diversas atividades biológicas, incluindo a capacidade de diminuir níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; reduzir peso corporal; ou melhorar tolerância a glicose, gasto de energia, ou sensibilidade à insulina. Para avaliar atividade FGF21 in vivo, polipeptídios FGF21, polipeptídios mutantes FGF21, e polipeptídios de fusão FGF21 foram introduzidas nos camundongos ob/ob resistentes a insulina, e a capacidade de uma proteína FGF21 específica para diminuir níveis de glicose no sangue foi medida. O polipeptídio FGF21, polipeptídio mutante FGF21, ou polipeptídio de fusão FGF21 a ser testado foi injetado por via intraperitoneal em um camundongo ob/ob com 8 semanas de idade (Jackson Laboratory) e amostras de sangue foram obtidas em vários pontos de tempo após uma única injeção, por exemplo, 0, 6, 24, 72, 120 e 168 horas após injeção. Níveis de glicose no sangue foram medidos com um Glucometer OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA), e os resultados expressos como uma percentagem de alteração de glicose no sangue em relação ao nível de linha de base de glicose no sangue (isto é, no tempo 0).
[00241] Os resultados de um experimento são fornecidos na figura 4, que mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue observados em camundongos injetados com um controle PBS, um controle Fc- FGF21 do tipo selvagem compreendendo resíduos de aminoácidos 1-181, ou proteínas de fusão Fc-FGF21 truncado compreendendo resíduos de aminoácidos 5-181 ou 7-181. Esse experimento demonstrou que proteínas de fusão Fc-FGF21 truncado compreendendo resíduos de aminoácidos 5-181 ou 7181 apresentam atividade de diminuir glicose no sangue que é similar à atividade de Fc-FGF21 do tipo selvagem em 6 horas após injeção. Desse modo, a análise in vivo de polipeptídios FGF21 truncados indicou que a deleção de até 6 aminoácidos a partir da extremidade-N de FGF21 maduro não afeta a atividade biológica de molécula. A análise in vivo também indicou, entretanto, que a capacidade de polipeptídios FGF21 truncados em diminuir glicose no sangue foi reduzida e que níveis de glicose no sangue retornaram à linha de base em 24 horas após injeção (resultados similares foram obtidos com FGF21 do tipo selvagem). Verificou-se que a atividade in vivo curta é um resultado de degradação proteolítica de FGF21, como descrito no exemplo 8.
[00242] Os resultados de outro experimento são fornecidos na figura 5, que mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue observados em camundongos injetados com um controle PBS, um controle FGF21-Fc do tipo selvagem compreendendo resíduos de aminoácidos 1-181, uma proteína de fusão FGF21-Fc truncada compreendendo resíduos 1-175, ou uma proteína Fc-FGF21 truncada compreendendo resíduos de aminoácidos 1-171. Esse experimento demonstra que o FGF21-Fc do tipo selvagem compreendendo resíduos de aminoácidos 1-181 tem uma atividade de diminuir glicose controlada resultando em uma redução de níveis de glicose no sangue de aproximadamente 30% durante o período de tempo de 24 horas a 120 horas após injeção. A proteína Fc-FGF21 truncada compreendendo resíduos de aminoácidos 1-171 apresenta atividade de diminuir glicose no sangue retardada evidente somente em 72 horas após injeção. Entretanto, a atividade observada é igual à atividade do FGF21-Fc do tipo selvagem. A proteína de fusão FGF21-truncada compreendendo resíduos 1-175 não é ativada in vivo em diminuir glicose no sangue.
[00243] Coletivamente, os experimentos de truncamento descritos aqui demonstram que proteínas de fusão FGF21 truncado tendo um truncamento terminal-N apresentam atividade de diminuir glicose no sangue que é similar àquela de proteína de fusão FGF21 do tipo selvagem, e ainda, que proteínas de fusão FGF21 truncado no qual a molécula Fc foi fundida com a extremidade terminal-N da proteína FGF21 truncada apresentam mais atividade do que proteínas de fusão nas quais a molécula Fc foi fundida com a extremidade de terminal-C da proteína FGF21 truncada.
Exemplo 8 Degradação in vivo observada de FGF21
[00244] A degradação FGF21 foi primeiramente observada com construções de proteína de fusão FGF21 Fc como descrito no exemplo 7. A análise farmacocinética in vivo indicou que FGF21 humano tem uma meia-vida curta de aproximadamente 1 hora em camundongos devido à clearance rápida e degradação in vivo. Portanto, para estender a meia vida de FGF21 uma seqüência Fc foi fundida com a extremidade terminal N ou C do polipeptídio FGF21. Entretanto, a fusão de uma região Fd não resolveu totalmente a questão de meia vida uma vez que proteínas de fusão nas quais uma seqüência Fc foi fundida com a extremidade terminal N ou C do polipeptídio FGF21 (e em particular fusões Fc-FGF21, isto é, nas quais a seqüência Fc é fundida com a extremidade N de FGF21 maduro), não apresentou a eficácia in vivo esperada, e em vez disso verificou-se que mantém atividade de diminuir glicose no sangue por não mais do que 24 horas em camundongos ob/ob. Como descrito na figura 4, as proteínas de fusão Fc-FGF21 reduziram níveis de glicose no sangue em aproximadamente 30-40% em 6 horas após injeção, enquanto os níveis de glicose no sangue retornaram a níveis de linha de base em 24 horas.
[00245] A degradação proteolítica de FGF21 do tipo selvagem foi subseqüentemente pesquisa, e verificou-se que a perda rápida de atividade in vivo com proteínas de fusão Fc-FGF21 é o resultado de degradação in vivo de FGF21. A degradação proteolítica leva à atividade biológica diminuída da molécula in vivo e desse modo uma meia vida eficaz mais curta, e tal degradação impacta adversamente o uso terapêutico daquela molécula. Por conseguinte, a degradação observada de proteínas de fusão FGF21 Fc levou à investigação da degradação proteolítica de FGF21 in vivo e para identificar mutantes FGF21 que eram resistentes a tal degradação.
[00246] Para determinar os sítios de degradação, análise LC-MS e seqüenciamento Edman foi realizado em proteínas de fusão FGF21 FC e FGF21 humano do tipo selvagem obtidas em vários pontos de tempo após injeção em camundongos C57B6 manchos. O seqüenciamento Edman ajudou a confirmar se a extremidade terminal-N ou terminal-C da proteína estava sendo submetida à degradação. Quando uma seqüência Fc foi fundida com a extremidade-N de FGF21 humano, verificou-se que a degradação ocorre na ligação de peptídeo entre resíduos de aminoácidos 151 e 152 e entre resíduos de aminoácido 171 e 172 da porção FGF21 humana da molécula de fusão (a numeração de resíduo acima se baseia na seqüência FGF21 madura e não inclui a porção Fc da proteína de fusão). Verificou-se que a degradação em 171172 ocorre primeiramente, e foi seguida por degradação em 151-152. A degradação em 171-172 parece ser a etapa de limitar taxa e desempenha um papel na meia-vida da molécula. Quando uma seqüência Fc foi fundida com a extremidade C de FGF21, verificou-se que a degradação ocorre na ligação de peptídeo entre resíduos de aminoácido 4 e 5 e entre resíduos de aminoácido 20 e 21. Como resultado desses experimentos, foi determinado que a seqüência Fc parecesse proteger a porção da seqüência FGF21 que está adjacente à seqüência Fc contra degradação. Uma análise da degradação in vivo de FGF21 do tipo selvagem e proteínas de fusão Fc-FGF21 foi adicionalmente conduzida em macacos cynomolgus. Esses estudos confirmaram que o sítio de clivagem de FGF21 em resíduos de aminoácido 171-172 é o sítio principal de degradação e que esse sítio de degradação é conservado entre murino e primata.
Exemplo 9 Identificação de mutantes resistentes a proteólise FGF21
[00247] Mutantes FGF21 apropriados foram identificados por determinar experimentalmente as posições da seqüência FGF21 do tipo selvagem que são sítios de atividade proteolítica maior, e substituições de aminoácidos específicos foram introduzidas nesses sítios. Substituições de aminoácidos foram baseadas em conservação de seqüência FGF21 com outras espécies (como descrito no exemplo 8) e conservação bioquímica com outros resíduos de aminoácido. Uma lista de substituições de aminoácidos que eram ou podem ser introduzidos na proteína FGF21 do tipo selvagem é fornecida na tabela 8, embora a tabela 8 seja somente exemplar e outras substituições possam ser feitas. Os números das posições dadas na tabela 8 correspondem à posição de resíduo na proteína FGF21 madura, que consiste em 181 resíduos de aminoácidos. Tabela 8 Resíduos FGF21 mudados
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Exemplo 10 Análise in vivo de degradação de FGF21-FC e3 Fc-FGF21
[00248] A estabilidade de proteínas de fusão FGF21 Fc in vivo foi determinada por injetar camundongos com uma proteína de fusão, retirar sangue dos camundongos em vários pontos de tempo, e analisar o soro por espectrometria de massa-cromatografia de líquido (LC-MS). Em particular, camundongos foram injetados intraperitonealmente com 10 mg/kg de Fc-(G5)-FGF21 (SEQ ID NO: 107) (expresso em E. coli e purificado como descrito no exemplo 2) ou FGF21- (G3)-Fc (SEQ ID NO. 105) (expresso em células de mamíferos e purificado de acordo com procedimentos padrão). O sangue foi tirado dos camundongos em 6, 24 e 48 horas após injeção (tabela 9) e coletado em tubos EDTA pré-tratados com coquetéis de inibidor de protease (Roche Diagnostics). Plasma foi separado por centrifugar as amostras a 12.000xg por 10 minutos. Proteínas de FGF21 foram purificadas por afinidade do sangue utilizando uma resina de agarose Fc- anti-humana. Tabela 9 Amostras de FGF21
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[00249] Antes de analisar as amostras purificadas por afinidade por LC-MS, padrões de proteína de Fe-(G5)- FGF21 e FGF21-(G3)-F3 foram analisados como referência. Padrões de proteína foram reduzidos com tris[2-carboxietil] fosfina (TCEP) ou não reduzidos. Padrões reduzidos ou não reduzidos foram analisados por LC-MS utilizando uma coluna de 0,3 mm x 30 cm ciano ACE com o efluente de coluna pulverizando em um espectrômetro de massa de retenção de íon LCQ Classic. Uma vez que os espectros deconvolutos das amostras reduzidas eram mais limpos, as amostras purificadas por afinidade foram reduzidas antes de análise LC-MS.
[00250] As massas observadas para o padrão Fc-(G5)- FGF21 reduzido e amostras D6, D24 e D48 são mostradas nas figuras6A-6D. as massas observadas para o padrão FGF21- (G3)-Fc reduzido e amostras E6, E24 e E48 são mostradas nas figuras 7A-7D. alguns dos eluados de amostra e padrão foram submetidos a seqüenciamento Edman para confirmar a extremidade-N das proteínas e os fragmentos como determinado por LC-MS. Os resultados da análise LC-MS dos padrões e amostras são fornecidos na tabela 10. Tabela 10 Resultados de análise LC-MS e fragmentos previstos
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[00251] Como indicado na tabela 10, todas as amostras purificadas por afinidade mostraram algum grau de degradação após somente 6 horas de circulação. Após 24 horas de circulação, o produto principal de Fc-(G5)-FGF21 era um fragmento consistindo em resíduos de aminoácidos 1404, que foi visto nas amostras tanto D como E. nas amostras E, entretanto, o produto principal de FGF21-(G3)- Fc era um fragmento consistindo em resíduos de aminoácidos 5-410. Para ambas as proteínas de fusão testadas, a porção FGF21 da proteína de fusão era mais suscetível à degradação do que a porção Fc da proteína.
Exemplo 11 Preparação e expressão de proteínas de fusão e mutantes FGF21 resistentes à proteólise
[00252] Construções que codificam os mutantes FGF21 listados na tabela 1 foram preparados por amplificação PCR do vetor de expressão FGF21 do tipo selvagem como descrito abaixo (a construção do vetor de expressão FGF21 do tipo selvagem é descrita no exemplo 1). Quando um ligador foi incluído na construção, o ligador utilizado foi GGGGGSGGGSGGGGS (“L15”, SEQ IDNO: 28). O objetivo desses experimentos era gerar mutantes FGF21 que são resistentes à proteólise e apresentam meias-vidas mais longas. Tabela 11 Mutantes FGF21 resistentes à proteólise
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[00253] Construções mutantes FGF21 foram preparadas utilizando iniciadores tendo seqüências que são homólogas às regiões a montante e a jusante de um códon (ou códons) a ser mudado. Os iniciadores utilizados em tais reações de amplificação também forneceram aproximadamente 15 nucleotídeos de seqüência de sobreposição para permitir recircularização do produto amplificado, a saber o vetor inteiro agora tendo o mutante desejado.
[00254] Uma construção mutante FGF21 exemplar, codificando um mutante FGF21 tendo um resíduo de ácido glutâmico na posição 170 em vez do resíduo de glicina nativo (isto é, o mutante G170E) foi preparado utilizando os iniciadores mostrados na tabela 12. Tabela 12 Iniciadores PCR para preparar mutante FGF21 exemplar
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[00255] Os iniciadores mostrados na tabela 12 permitem a substituição do resíduo de glicina com um resíduo de ácido glutâmico como mostrado abaixo, em que a seqüência superior é o iniciador de sentido (SEQ ID NO: 23), as segunda e terceira seqüências (SEQ ID NO: 25 e 27) são porções de uma construção de expressão FGF21, e a quarta seqüência é o iniciador anti-sentido (SEQ ID NO: 2 6):
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[00256] Construções mutantes de FGF21 foram preparadas utilizando essencialmente as condições PCR descritas no exemplo 1. Produtos de amplificação foram digeridos com a endonuclease de restrição DpnI, e então transformados em células competentes. Os clones resultantes foram seqüenciados para confirmar a ausência de erros gerados por polimerase. Proteínas de fusão Fc-(L15)-FGF21 e FGF21-(L15)-Fc foram geradas como descrito aqui, por exemplo, no exemplo 6.
[00257] Mutantes FGF21 foram expressos por transformar células BL21 competentes (DE3) ou BL21 Start (Invitrogen; Carlsbad, CA) com a construção codificando um mutante específico. Transformantes foram crescidos durante a noite com aeração limitada em meios TB suplementados com 40 ug/mL canamicina, foram aerados na manhã seguinte, e após um curto período de recuperação, foram induzidos em 0.4 mM IPTG. Polipeptídios mutantes FGF21 foram colhidos por centrifugação 18-20 horas após indução.
[00258] Mutantes FGF21 foram também analisados em relação à imunogenicidade prevista. Respostas imunes contra proteínas são aumentadas por processamento de antígeno e apresentação no sítio de ligação classe II de complexo de histocompatibilidade maior (MHC). Essa interação é necessária para ajudar a célula T em maturação de anticorpos que reconhecem a proteína. Uma vez que os sítios de ligação de moléculas classe II MHC foram caracterizados, é possível prever se proteínas têm seqüências específicas que pode se ligar a uma série de alelos humanos comuns. Algoritmos de computador foram criados com base em referência de literatura e estruturas de cristal classe II MHC para determinar se seqüências de peptídeo de aminoácidos lineares têm o potencial de romper a tolerância imune. O programa de comutador TEPITOPE foi utilizado para determinar se mutações de ponto em particular mutantes FGF 21 aumentariam células T específicas de antígeno em uma maioria dos seres humanos. Com base em uma análise da seqüência de proteína linear de cada mutante FGF21, nenhum dos mutantes foi previsto aumentar a imunogenicidade.
Exemplo 12 Impacto de seqüência ligadora em degradação de FGF21
[00259] Para determinar se a presença de um ligador de aminoácido mais longo entre a seqüência Fc e a seqüência FGF21 afeta a degradação FGF21, camundongos foram injetados com proteínas de fusão FGF21 nas quais a região Fc foi separada da seqüência FGF21 por um ligador de 15 aminoácidos tendo a seqüência GGGGGSGGGSGGGGS (designada “L15”, SEQ ID NO: 28), sangue foi tirado dos camundongos em vários pontos de tempo, e o soro foi analisado por LC-MS. Em particular, camundongos foram injetados com Fc-(L15)- FGF21 ou FG21-(L15)-Fc (obtido de E.coli) em 23 mg/kg, sangue foi tirado em 6, 24 e 48 horas, e sangue tirado foi purificado por afinidade utilizando uma resina de agarose anti-humana-Fc.
[00260] Antes de analisar as amostras purificadas por LC-MS, padrões de amostra Fc-(L15)-FGF21 e FGF21-(L15)- Fc foram analisados como referência. Padrões de proteína foram reduzidos com TCEP ou não reduzidos. Padrões reduzidos e não reduzidos foram analisados por LC-MS utilizando uma coluna de 0,3 mm x 30 cm ciano ACE com o efluente de coluna pulverizando em um espectrômetro de massa de retenção de íon LCQ Classic. Uma vez que os espectros deconvolutos das amostras reduzidas eram mais limpos, as amostras purificadas por afinidade foram reduzidas antes de análise LC-MS.
[00261] As massas observadas para o padrão Fc-(L5)- FGF21 reduzido e amostras purificadas por afinidade correspondentes retiradas em vários pontos são mostradas nas figuras 8A-8D. As massas observadas para o padrão FGF21-(L15)-Fc reduzido e amostras purificadas por afinidade correspondentes retiradas em vários pontos de tempo são mostradas nas figuras 9A-9D. Alguns dos eluados de amostra e padrão foram submetidos a seqüenciamento Edman para confirmar a extremidade-N das proteínas e auxiliar na previsão da identidade dos fragmentos observados por LC-MS. Os resultados da análise LC-MS dos padrões e amostras e indicação de fragmentos previstos são fornecidos na tabela 13. Tabela 13 Resultados de análise LC-MS e fragmentos previstos
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[00262] Como indicado na tabela 13, todas aas amostras purificadas por afinidade mostraram algum grau de degradação após somente 6 horas de circulação. Após 24 horas de circulação, os produtos principais de Fc-(L15)- FGF21 eram fragmentos que consiste em resíduos de aminoácido 1-414 (85% de amostra) e 1-394 (15% de amostra), e os produtos principais de FGF21(15)Fc eram fragmentos consistindo em resíduos de aminoácido 1-423 (40% de amostra), 6-423 (35% de amostra) e 22-423 (25% de amostra). Pontos de clivagem identificados para as proteínas FC- (L15)-FGF21 e FGF21-(L15)-Fc são mostrados nas figuras 10A e 10B, respectivamente.
Exemplo 13 Atividade in vivo de mutantes Fc-(L15)-FGF21 resistentes a proteólise em 1-7 dias após injeção
[00263] Como descrito aqui, clivagem proteolítica de proteínas de fusão FGF21 Fc depende da orientação da seqüência Fc, com a extremidade Fc da proteína de fusão sendo mais estável do que a extremidade FGF21 da proteína de fusão (isto é, a porção terminal-N de proteínas de fusão Fc-(L15)-FGF21 e verificou-se que a porção terminal-C de proteínas de fusão FGF21-(L15)-Fc é mais estável). Por exemplo, a clivagem foi identificada nas posições 5 e 21 de FGF21-(L15)Fc e posições 151 e 171 de Fc-(L15)-FGF21.
[00264] Como resultado dessas observações, uma pesquisa foi realizada para identificar mutantes FGF21 resistentes à proteólise. A análise de LC-MS de Fc-(L15)- FGF21 demonstra que degradação in vivo ocorre primeiramente entre resíduos de aminoácidos 171-172, seguido por degradação entre resíduos de aminoácidos 151-152. Por bloquear degradação proteolítica na posição 171, a clivagem na posição 151 pode ser evitada, estendendo efetivamente a meia-vida da molécula. Entretanto, mutantes resistentes à proteólise nos quais a clivagem é evitada na posição 151 podem ainda possuir resíduos na posição 171 que são suscetíveis ao ataque de protease, desse modo resultando em uma molécula não tendo os 10 últimos aminoácidos, que são conhecidos como estando envolvidos na ligação do co-receptor B-Klotho, que é um determinantes de afinidade de receptor de ligando e potência in vitro e in vivo. Portanto, a mutagênese de resíduos de aminoácido que circundam a posição 171 em FGF21 maduro parece ser mais crítica para melhorar a estabilidade in vivo, potência e eficácia da molécula.
[00265] A atividade in vivo de mutantes Fc-(L15)- FGF21 resistentes a proteólise foi ensaiada por injetar intraperitonealmente camundongos ob/ob com um mutante FGF21, retirar amostras de sangue de camundongos injetados em 0, 0,25, 1, 3, 5, e 7 dias após injeção, e então medir níveis de glicose no sangue nas amostras. Os resultados de um experimento são fornecidos na figura 11, que mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com um controle de PBS, um controle de Fc-(L15)- FGF21 (SEQ ID NO:49) ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 e Fc- (L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53), Fc-(L15)-FGF21 S172L (SEQ ID NO:55), Fc-(L15)- FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO:59), ou Fc-(L15)- FGF21 G151A (SEQ ID NO:61); a figura 12 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue como determinada nesse experimento. Esse experimento demonstra que os mutantes Fc-(L15)-FGF21, Fc-(L15)-FGF21 P171A, Fc-(L15)-FGF21 S172L) e Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) apresentam atividade de diminuir glicose no sangue controlada por até 5 dias, que é superior à atividade de Fc-(L15)-FG21 do tipo selvagem. O mutante Fc-(L15)-FG21 G151A somente parcialmente melhorou a duração de atividade de diminuir glicose no sangue em comparação com proteína de fusão Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem. De modo surpreendente, embora o mutante Fc-(L15)-FGF21 S172L não seja um mutante resistente a proteólise, e portanto tenha perfil de degradação similar ao polipeptídio Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem, verificou-se que esse mutante apresenta eficácia in vivo aperfeiçoada em comparação com o polipeptídio Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem.
[00266] Os resultados de outro experimento são fornecidos na figura 13, que mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com um controle PBS, um controle Fc(L15)-FGF21, ou os mutantes Fc-(L15)- FGF21 Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V)( SEQ ID NO: 65), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)- FGF21(G170E, P171A) (SEQ ID NO:63) ou Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (SEQ ID NO:67). A Figura 14 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue como determinada nesse experimento. Como no experimento descrito acima, a proteína de fusão Fc-FGF21 do tipo selvagem e o mutante Fc- (L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V) não apresentam atividade de diminuir glicose no sangue controlada, possivelmente porque a degradação no sítio 171 ainda pode ocorrer, e níveis de glicose no sangue em animais injetados com aquelas proteínas retornam à linha de base em 24 horas após injeção. Entretanto, Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A) ou Fc-(L15)- FGF21(G170E, S172L) apresentam atividade máxima de diminuir glicose no sangue até 5 dias após injeção, que é superior à proteína de fusão Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem e o mutante Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A, 115V).
[00267] Os resultados de outro experimento são fornecidos na figura 15, que mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO:73), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO:75), ou Fc-(L15)-FGF21 G170S. A figura 16 mostra a percentagem em alteração em níveis de glicose como determinada nesse experimento. Todos os mutantes FGF21 testados nesse experimento apresentaram atividade de diminuir glicose no sangue controlada por até 5 dias após injeção.
[00268] Os resultados de outro experimento são fornecidos na figura 17, que mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com PBS ou os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)- FGF21 P171E (SEQ ID NO:79), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO:81), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85), ou Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87). A figura 18 mostra a percentagem em alteração em níveis de glicose em sangue como determinado nesse experimento. Todos os mutantes FGF21 testados nesse experimento apresentaram atividade aperfeiçoada de diminuir glicose no sangue quando comparado com Fc-FGF21 do tipo selvagem.
Exemplo 14 Degradação in vivo de mutantes Fc-(L15)-FGF21 resistentes a proteólise em 6 a 120 horas após injeção
[00269] A estabilidade in vivo de mutantes FGF21 selecionados foi analisada por injetar camundongos com um mutante FGF21, tirar sangue dos camundongos em vários pontos de tempo, e analisar o soro por LC-MS. Em particular, camundongos foram injetados com os mutantes Fc- (L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, ou Fc-(L15)-FGF21 S172L (obtidos de E. coli como descrito no exemplo 2), cada um dos quais foi diluída em aproximadamente 180 uL de 10 mM HCl antes da injeção, e sangue foi tirado em 6, 24, 48, 72 e 120 horas. Proteínas FGF21 foram purificadas por afinidade a partir do sangue tirado utilizando uma coluna de resina de agarose Fc anti-humana. As amostras foram eluídas a partir da coluna utilizando 10 mM HCl. Todas as construções FGF21 compreendem uma região Fc e ligador de 15 aminoácidos na extremidade terminal-amino da proteína FGF21. Os camundongos foram também injetados com um controle FGF21 do tipo selvagem.
[00270] Antes de analisar as amostras purificadas por afinidade por LC-MS, mutantes de FGF21 do tipo selvagem não processados e FGF21 não processados foram analisados como referência. Todos os padrões e amostras de ponto de tempo foram reduzidas com TCEP e então analisadas por LC-MS utilizando uma coluna de 0,3 mm x 30 cm ciano ACE com o efluente de coluna pulverizando em um espectrômetro de massa de retenção de íon LCQ Classic. Amostras purificadas por afinidade foram diluídas com acetato de amônio, reduzidas com TCEP, e então analisadas por LC-MS como descrito acima.
[00271] As massas observadas para Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas figuras 19A-19D, respectivamente. As massas observadas para Fc-(L15)-FGF21 G170E em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas figuras 20A-20D, respectivamente. As massas observadas para Fc-(L15)-FGF21 P171A em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas figuras 21A-21D, respectivamente. As massas observadas para Fc-(L15)-FGF21 S172L em 0, 6, 24 e 48 horas após injeção são mostradas nas figuras 22A-22D, respectivamente.
[00272] Verificou-se que todas as amostras tiradas em 72 e 120 horas contêm um componente de fibrinogênio com peso molecular elevado (>200 kDa por SDS-PAGE não redutor) que é muito mais abundante do que a proteína de fusão Fc- (L15)-FGF21 restante. Os resultados da análise LC-MS dos outros padrões e amostras são fornecidos na tabela 14. Tabela 14 Resultados de análise LC-MS e fragmentos previstos
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[00273] Como indicado na tabela 14, a degradação de Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem e o mutante S172L parecem similares, em que após 24 horas de circulação, o produto principal da proteína de fusão era um fragmento consistindo em resíduos de aminoácido 1-414. Os produtos de degradação dos mutantes Fc-(l15)-FGF21 G170E e Fc-(L15)-FGF21 P171A também parecem similares em que as amostras tiradas após 24 horas de circulação contêm 70-80% de proteína intacta (aminoácidos 1-424) e 20-30% de um fragmento consistindo em resíduos de aminoácidos 1-421. Mesmo após 48 horas, os mutantes Fc-(l15)-FGF21 G170E e Fc-(L15)-FGF21 P171A ainda retêm proteína intacta enquanto mostram um aumento na quantidade do fragmento consistindo em resíduos de aminoácidos 1-421. Como observado nas análise anteriores de construções Fc-FGF21, a degradação da porção FGF21 da proteína de fusão foi detectada e verificou-se que a porção Fc permanece estável. Os sítios de clivagem identificados para tipo selvagem, Fc-(l15)-FGF21 G170E e Fc-(L15)-FGF21 P171A e Fc-(L15)-FGF21 S172L são mostrados nas figuras 23A- 23D, respectivamente.
Exemplo 15 Identificação de mutantes FGF21 que reduzem agregação
[00274] Uma propriedade de FGF21 do tipo selvagem é sua propensão à agregação. Em vista dessa propriedade, foi desejado gerar mutantes FGF21 que reduzem agregação. Mutantes FGF21 que reduzem agregação foram identificados com base em duas hipóteses. A primeira hipótese é que, com relação a FGF21, agregação (ou dimerização) é desencadeada por interações hidrofóbicas e interações van der Waals entre moléculas FGF21 causadas por resíduos hidrofóbicos que são expostos a ambiente de solvente baseado em água hidrofílica. A segunda hipótese é que esses resíduos hidrofóbicos expostos podem ser substituídos para criar mutações de ponto de reduzir agregação na seqüência de aminoácido FGF21 sem comprometer a atividade de FGF21.
[00275] Uma abordagem de engenharia de proteína racional sistemática foi utilizada para identificar resíduos hidrofóbicos expostos em FGF21. Como não havia estruturas NMR ou de raios-X conhecidas de FGF21 que poderiam ser utilizadas para identificar residues hidrofóbicos expostos, uma estrutura de cristal de raios-X de resolução elevada (1.3 Å) de FGF19 (1PWA) obtida do Banco de Dados de proteína (PDB) foi utilizada para criar um modelo de homologia 3D de FGF21 utilizando software de modelagem MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal,Quebec,Canadá). FGF19 é a proteína mais estreitamente relacionada com FGF21 em termos da homologia de seqüência de aminoácidos.
[00276] A acessibilidade de solvente foi calculada pelo seguinte método utilizando MOE. Uma primeira medição de área superficial (SA1) é definida como a área da superfície acessível de resíduo em Å2. Embora um resíduo de aminoácido específico apareça em uma seqüência primária de proteína múltiplas vezes, cada ocorrência do resíduo pode ter uma área superficial diferente devido a diferenças em, entre outras coisas, a proximidade do resíduo à superfície de proteína, a orientação da cadeia lateral de resíduo, e a posição espacial de resíduos de aminoácido adjacentes. Portanto, uma segunda medição de área superficial (SA2) é feita em que o resíduo de interesse é extraído da estrutura de proteína juntamente com os resíduos vizinhos ou adjacentes daquele resíduo. Esses resíduos espacialmente adjacentes são mudados in silico para glicinas para remover suas cadeias laterais, e então o SA2 para o resíduo de interesse é calculado, dando uma medição da área superficial total possível para aquele resíduo em sua conformação específica. Uma razão de SA1 para SA2 (SA1/SA2) pode então fornecer uma medição da percentagem da área superficial possível para aquele resíduo que é efetivamente exposto.
[00277] Vários resíduos hidrofóbicos que são altamente expostos ao solvente foram selecionados para análise adicional, e mutações de ponto in silico foram feitas a esses resíduos para substituir o resíduo selecionado com os outros resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente. As alterações em estabilidade térmica de proteína resultando de substituições diferentes foram calculadas utilizando o modelo FGF21 e o programa baseado em rede interativa CUPSAT (Cologne University Protein Stability analysis tools) de acordo com instruções fornecidas no website CUPSAT. Vide Parthiban e outros, 2006, Nucleic Acids Res. 34: W239-42; Parthiban e outros, 2007, BMC Struct. Biol. 7:54. Mutações hidrofóbicas ou de desestabilização significativa foram excluídas no desenho de mutantes FGF21 de mutação de ponto que reduzem agregação. Substituições de estabilização (ou em casos raros, de desestabilização leve) que introduzem características hidrofílicas e/ou iônicas aperfeiçoadas foram consideradas como candidatos para mutantes FGF21 que reduzem agregação.
[00278] Um sumário dos dados gerados através dessa abordagem de engenharia de proteína racional é fornecida na tabela 15 que também lista mutantes FGF21 exemplares que se espera ter agregação de proteína reduzida e estabilidade aperfeiçoada. Tabela 15 Efeito calculado de mutantes FGF21 sobre estabilidade
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Exemplo 16 Preparação e expressão de proteínas de fusão e mutantes FGF21 que reduzem agregação
[00279] Construções que codificam os mutantes FGF21 listados na tabela 16 foram preparados por amplificação de PCR do vetor de expressão FGF21 do tipo selvagem como descrito no exemplo 11 (a construção do vetor de expressão FGF21 do tipo selvagem é descrita no exemplo 1). Proteínas de fusão foram geradas como descrito aqui, por exemplo, no exemplo 6. Quando um ligador foi empregado foi GGGGGSGGGSGGGGS (“L15”, SEQ ID NO: 28). Tabela 16 Mutantes FGF21 que reduzem agregação
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[00280] A agregação de várias proteínas FGF21, incluindo FGF21 do tipo selvagem, polipeptídios FGF21 truncados, mutantes FGF21, e proteínas de fusão FGF21 foi ensaiada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As amostras a serem analisadas foram incubadas em 4°C, temperatura ambiente, ou 37°C por vários pontos de tempo, e então submetidas à análise SEC. Os experimentos foram realizados em um sistema HPLC Beckman equipado com uma coluna SEC. Para FGF21 do tipo selvagem, uma coluna SEC TOSOHAAS TSK-Gel G2000 foi utilizada com 2x PBS contendo álcool isopropila a 2% como a fase móvel. Para proteínas de fusão Fc FGF21 e polipeptídios mutantes FGF21, uma coluna SEC G3000 TOSOHAAS TSK-Gel foi utilizada com 2x PBS como a fase móvel.
Exemplo 17 Atividade in vitro de mutantes FGF21 que reduzem agregação
[00281] Os experimentos foram realizados para identificar mutantes que reduzem agregação que retêm atividade FGF21 do tipo selvagem em um ensaio in vitro ELKluciferase. Ensaios ELK-luciferase foram realizados como descrito no exemplo 4. As figuras 24A-C mostram os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase realizado nos mutantes FGF21 FGF21 FGF21 L99R (SEQ ID NO:109), FGF21 L99D (SEQ ID NO: 111), e FGF21 All IT (SEQ ID NO: 113) (Figura 24A); os mutantes FGF21 FGF21 A129D (SEQ ID NO:115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO:117), e FGF21 A134K (SEQ ID NO:119) (Figura 24B); e os mutantes FGF21 FGF21 A134Y(SEQ ID NO:121), FGF21 A134E (SEQ ID NO:123), e FGF21 A129K (SEQ ID NO: 125) (Figura 24C). os resultados desses experimentos demonstram que algumas das mutações que reduzem agregação não impactam adversamente atividade FGF21 como ensaiado em ensaios ELK-luciferase.
Exemplo 18 Preparação e expressão de mutantes de combinação Fc- (L15)-FGF21 que mostram meia-vida mais longa e níveis de agregação, inferiores
[00282] Um número de mutantes de combinação FGF21, contendo mutantes mostrados como reduzindo agregação bem como aumentando meia-vida por romper a degradação proteolítica, foi preparado e conjugado com moléculas Fc IgG1 (SEQ ID NO: 11). Esses mutantes FGF21 foram preparados essencialmente como descrito no exemplo 11.
Exemplo 19 Estudos in vitro de mutantes Fc-(L15)-FGF21 mostrando meia vida mais longa e níveis de agregação inferiores
[00283] Experimentos foram realizados para identificar mutantes de combinação FGF21 que retêm atividade FGF21 do tipo selvagem em um ensaio in vitro ELKluciferase. Ensaios ELK-luciferase foram realizados como descrito no exemplo 4.
[00284] As figuras 25A-25D mostram os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase realizado nos mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 P171G, Fc-(L15)- FGF21 P171S, e Fc-(L15)-FGF21 P171T (Figura 25A); os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21 P171Y, Fc-(L15)- FGF21 P171W, e Fc-(L15)-FGF21 P171C (Figura 25B); Fc-(L15)- FGF21, Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), e FGF21 A45K (Figura 25C); e Fc-(L15)-FGF21, Fc-(L15)-FGF21 P171E, e Fc-(L15)- FGF21 (A45K, G170E) (Figura 25D). os resultados desses experimentos demonstram que mutações direcionadas a aperfeiçoar a estabilidade, ou tanto estabilidade como solubilidade, não comprometeram a atividade in vitro em comparação com Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem. De modo interessante, o mutante FGF21 A45K mostrou potência aperfeiçoada em relação à Fc-(L15)-FGF21 do tipo selvagem.
[00285] A figura 26A mostra a alteração em percentagem de agregação para um controle FGF21 (WT) e FGF21 A45K após incubação de 65 mg/mL de proteína a 4°C por 1, 2 e 4 dias. Os dados indicaram que a mutação A45K leva a uma diminuição em agregação da proteína, em comparação com a proteína do tipo selvagem.
[00286] A figura 26B mostra a alteração em percentagem de agregação para um controle FGF21 (WT) e FGF21 P78C, FGF21 P78R, FGF21 L86T, FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129D, FGF21 A129Q, FGF21 A129K, FGF21 A134K, FGF21 A134Y, e FGF21 A134E após incubação de 65 mg/mL de proteína a 4°C por 1, 6 e 10 dias. Os dados indicaram que FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129D, FGF21 A129Q e FGF21 A129K levam a uma diminuição em agregação da proteína, em comparação com a proteína do tipo selvagem.
[00287] A figura 27 mostra os resultados de um ensaio de atividade de ELK-luciferase realizado em um controle FGF21 humano e os mutantes FGF21 FGF21 A45K, FGF21 L52T e FGF21 L58E. esse experimento demonstra que o mutante FGF21 A45K retém a eficácia total de FGF21 do tipo selvagem e apresenta uma potência que é mesmo maior do que FGF21 do tipo selvagem. Entretanto, os mutantes FGF21 L52T e FGF21 L58E mostram potência reduzida e eficácia em comparação com FGF21 do tipo selvagem.
[00288] As figuras 28A-28B mostram a alteração em níveis de agregação para os mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc- (L15)-FGF21(6-181, G170E), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), Fc-(L15)-FGF21 P171E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, Fc-(L15)-FGF21 G170E e um controle FGF21 após incubação a 4°C por 1, 4 e 8 dias. Esse experimento demonstra que durante o período de 8 dias, o mutante Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) mostrou menos agregação do que os mutantes Fc-(L15)-FGF21 G170E ou Fc- (L15)-FGF21 P171E, porém todos os três mutantes mostraram menos agregação do que o controle Fc-(L15)-FGF21. A tabela 17 mostra a percentagem de agregação obtida para um controle Fc-(L15)-FGF21 e o mutante Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) após incubação a 4°c ou temperatura ambiente por 0, 2 3, 4 ou 7 dias. Tabela 17 Percentagem de agregação para Fc-FGF21 e mutante Fc- FGF21
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Exemplo 20 Preparação e expressão de mutantes de combinação de fusão Fc-FGF21
[00289] Como descrito acima, a estabilidade e solubilidade de FGF21 pode ser modulada através da introdução de truncamentos específicos e substituições de aminoácidos. Além disso, a estabilidade de FGF21 pode ser adicionalmente aumentada por fusão de tais proteínas FGF21 modificadas com a porção Fc do gene IgG1 de imunoglobulina humano. Além disso, por introduzir combinações das modificações acima, moléculas FGF21 tendo tanto estabilidade aumentada como solubilidade podem ser geradas. Seqüências de ácido nucléico que codificam os mutantes de combinação FGF21 listados na tabela 18 foram preparadas utilizando as técnicas descritas acima. O ligador empregado foi o ligador L15, GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28). Tabela 18 Mutantes de combinação FGF21
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[00290] A figura 29 mostra os níveis de glicose no sangue medidos em camundongos injetados com os mutantes de combinação Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15)-FGF21(A45K, G170E), Fc- (L15)-FGF21 (A45K, P171G), ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
[00291] Em outro experimento, o mutante FGF21 Fc- (L15) FGF21 (L98R, P171G) foi estudado lado a lado com FGF21 maduro do tipo selvagem e Fc-FGF21. Em um experimento, uma linhagem de célula 293T recombinante foi cultivada na presença de concentrações diferentes de FGF21 Fc-(L15) FGF21, ou FGF21 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) por 6 horas. Lisados de células foram então ensaiados em relação à atividade de luciferase. Como mostrado na figura 30, FGF21 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) teve atividade similar a FGF21 Fc-(L15) FGF21, indicando que a introdução das mutações de dois pontos não alterou a atividade in vitro da molécula.
[00292] Ainda em outro experimento, a estabilidade de FGF21 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) em 65 mg/mL foi avaliada por nove dias em duas temperaturas diferentes, a saber temperatura ambiente e 4°C, lado a lado com FGF21 e Fc-(L15)-FGF21. Após o período de incubação lisados de célula foram então analisados com SEC-HPLC para determinar um perfil de agregação versus tempo em várias temperaturas. Os dados mostrados na figura 31A e 31B indicam que a taxa de formação de agregação foi significativamente reduzida no FGF21 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) em temperatura ambiente (triângulos sólidos, linha pontilhada na figura 31A) e a 4°C (triângulos sólidos, linha pontilhada na figura 31B0.
Exemplo 21 Mutantes FGF21 resistentes à proteólise compreendendo mutações de terminal-C
[00293] A estabilidade in vivo de mutantes de combinação foi também estudada. Especificamente, a estabilidade in vivo de FGF21 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) foi comparada com a estabilidade de Fc-(L15)-FGF21 em modelos de cynomolgus e murino. Verificou-se que os resultados eram similares nas duas espécies. No estudo cynomolgus, FGF21 Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) e Fc-(L15)- FGF21 foram injetados IV em 23,5 mg/kg e alíquotas de soro e plasma foram coletadas em pontos de tempo para 840 horas pós-dose. Pontos de tempo para 168 horas foram analisados. Amostras de ponto de tempo foram purificadas por afinidade utilizando reagentes anti-Fc, a seguir analisados utilizando espectrometria de massa MALDI. Os resultados correlacionam bem entre as duas análises.
[00294] A análise de dados gerados utilizando imunoafinidade-MALDI, clipping no sítio P171 foi visto como sendo eliminado na molécula Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) como um resultado da mutação de P171 a P171G. entretanto, uma degradação menor e lenta resultando em uma perda de até 3 resíduos de terminal-C foi observada para Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) (figura 32). As clivagens menores nos três resíduos de terminal-C foram também observadas com outros mutantes FGF21 após o sítio de clivagem mais suscetível entre resíduos de aminoácidos 171 e 172 ser bloqueado como mostrado nas figuras 20 e 21. A clivagem de 3 resíduo de terminal-C pode representar a cessação de clivagem da extremidade de terminal-C da molécula por um carboxipeptidase em um modo resíduo por resíduo, seqüencial ou um ataque de protease específica nos resíduos de aminoácido 178 e 179 com clipping não específico nos resíduos de aminoácido 179-180 e 180—181. A perda de 2-3 aminoácidos na extremidade-C poderia causar ligação reduzida de B-klotho e finalmente potência diminuída e atividade in vivo da molécula. Vide, por exemplo, Yie e outros, 2009, FEBS Lett. 583:19-24. Para tratar da degradação de carboxipeptidase aparente da extremidade-C, o impacto de adicionar um resíduo de aminoácido “cap” a vários polipeptídios mutantes FGF21 foi estudado. Uma variedade de construções, incluindo aquelas apresentadas na tabela 19, foi feita e ensaiada utilizando as técnicas descritas aqui. A tabela 19 resume os resultados do ensaio de ELK luciferase in Vitor.
[00295] Capeamentos de aminoácido apropriados podem estar entre 1 e 15 aminoácidos em comprimento, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 aminoácidos de comprimento. Qualquer número e tipo de aminoácido(s) pode ser empregado como um cap, por exemplo, um único resíduo de prolina, e único resíduo de glicina, dois resíduos de glicina, cinco resíduos de glicina, bem como outras combinações. Exemplos adicionais de caps são fornecidos no presente exemplo e na tabela 19.
[00296] Adicionalmente, para tratar do ataque de protease aparente em resíduos de aminoácidos 178 e 179, mutação de resíduos de aminoácido nas posições 179, 180 e 181 foi estudada. Novamente, uma variedade de construções, incluindo aquelas apresentadas na tabela 19, foi feita e ensaiada utilizando as técnicas descritas aqui. O impacto de combinações de capear e mutações nesses sitos também foi explorado. A tabela 19 resume construções exemplares que foram feitas e estudadas no ensaio ELK- luciferase in vitro, que foi realizado como descrito aqui. Compatível com a terminologia utilizada aqui, hFc significa uma seqüência Fc humana (isto é, SEQ ID NO: 11), L15 se refere ao ligador L15 (isto é, GGGGGSGGGSGGGGS, SEQ ID NO: 15). Tabela 19 Eficácia e valores EC50 para polipeptídios FGF21 compreendendo modificações de terminal-C
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[00297] A figura 33 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose em sangue observados em camundongos ob/ob diabéticos (C57B6 background) injetados com um controle de PBS, FGF21 nativo do tipo selvagem, Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) e duas moléculas capeadas às quais um resíduo de prolina ou glicina foi adicionado na extremidade terminal-C, isto é, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G). Quando um resíduo foi adicionado à extremidade-C de um polipeptídio FGF21 mutante ou do tipo selvagem, o resíduo é mencionado por sua posição na proteína resultante. Desse modo, “182G” indica que um resíduo de glicina foi adicionado à extremidade-C da proteína mutante ou do tipo selvagem de 181 resíduos maduro. A figura 33 mostra que os níveis de glicose em sangue diminuídos FGF21 nativo para 6 horas enquanto todos os três mutantes Fc-FGF21 estudados mostraram atividade de diminuir glicose no sangue controlada por pelo menos 120 horas. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P), uma molécula compreendendo a adição de um resíduo de prolina na extremidade-C do componente FGF21 da molécula de fusão, pareceu mais potente e resultou em níveis mais baixos de glicose no sangue em comparação com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171GP) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G).
[00298] Em um experimento subseqüente, a atividade in vivo de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) e Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G, 182P) foi estudada e comparada com a atividade in vivo de uma molécula capeada compreendendo com a atividade in vivo de uma molécula capeada compreendendo uma adição de duas glicinas na extremidade C, a saber, Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G). A figura 34 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue observados em camundongos ob/ob injetados com controle de PBS, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P).
[00299] Como mostrado na figura 34, todas as moléculas estudadas mostraram atividade controlada de diminuir glicose em comparação com o controle PBS. Esse experimento confirmou os resultados anteriores (figura 33) de que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) com uma adição de prolina na extremidade-C mostrou eficácia de diminuir glicose levemente aumentada em comparação com a molécula sem um capeamento de prolina, por exemplo Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). entretanto, a adição de dois resíduos de glicina na extremidade-C, por exemplo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G) pareceu reduzir a potência in vivo da molécula e encurtou a duração do efeito de diminuir glicose in vivo.
[00300] A figura 35 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose no sangue observados em camundongos ob/ob diabéticos (C57B6 background) injetados com controle de PBS ou os polipeptídios mutantes FGF21 FGF21 Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179S), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A), Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180S) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180G). todos os mutantes mostraram atividade de diminuir glicose similar com duração de ação similar.
[00301] A figura 36 mostra a percentagem de alteração em níveis de glicose em sangue observados em camundongos dB/dB diabéticos (C57B6 background) injetados com controle de veículo, FGF21 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F), e Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G, A180E). Em comparação com FGF21 Fc- (L15)-FGF21(L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F) foi menos eficaz em diminuir glicose no sangue. Entretanto, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), no qual alanina na posição de aminoácido de 180 foi mudada para ácido glutâmico, foi mais eficaz do que Fc-(L15)- FGF21(L98R, P171G) e causou redução adicional de 20% de níveis de glicose no sangue em comparação com Fc-(L15)- FGF21(L98R, P171G). Esses dados sugerem que mutação A180E pode ter reduzido a degradação de terminal-C in vivo e desse modo potência in vivo e eficácia aperfeiçoadas da molécula.
Exemplo 22 Estudo de macaco Rhesus
[00302] Uma construção Fc-Ligador-FGF21 foi gerada utilizando metodologia descrita aqui. A construção compreendida uma seqüência Fc IgG1 (SEQ ID NO: 11) fundida na extremidade C com a seqüência de ligador L15 (Gly)5-Ser- (Gly)3-Ser-(Gly)-4-Ser (SEQ ID NO. 28) que foi então fundida na extremidade C com a extremidade N de uma seqüência FGF21 madura (SEQ ID NO: 4) na qual duas mutações L98R e P171G, tinham sido introduzidas. Essa construção foi então expressa e purificada como descrito aqui. Uma forma dimérica da proteína foi isolada, que foi ligada através de ligações de dissulfeto intermoleculares entre a região Fc de cada monômero. Essa molécula é mencionada no presente exemplo 22 como “Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)” e tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 43 e é codificada por SEQ ID NO: 42. Nesse exemplo, FGF21 se refere à forma madura de FGF21, a saber SEQ ID NO: 4.
2.1 desenho de estudo
[00303] A construção Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foi administrada cronicamente e subcutaneamente (“SC”) em macacos Rhesus machos não diabéticos com um BMI > 35. Dois outros grupos de macacos (n = 10 por grupo) foram tratados com FGF21 maduro (isto é, SEQ IDN O: 4) ou um controle de veículo.
[00304] Animais foram aclimatados por 42 dias antes da administração de qualquer composto de teste e foram então divididos em grupos de 10 e administrados múltiplas injeções SC de compostos de teste ou artigo de controle em um modo cedo, como representado graficamente na figura 37. Em resumo, cada animal foi injetado uma vez por dia com composto ou veículo. FGF21 foi administrado diariamente, ao passo que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foi administrado semanalmente. Doses de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e FGF21 foram aumentadas a cada 2 semanas, como mostrado na figura 37. O peso do corpo e ingestão de alimento foram monitorados durante todo o estudo. O CRO foi cego para o tratamento.
[00305] Dois testes de tolerância a glicose oral (OGTTs) foram realizados antes do início do tratamento. OGTTI foi utilizado para separar os animais em três grupos equivalentes tendo uma distribuição similar de animais com base em área sob a curva (AUC) e peso corporal. Os resultados do segundo OGTT (OGTT2) foram utilizados para confirmar a separação do primeiro OGTT (OGTT1). Macacos com perfis OGTT que eram incompatíveis de um teste (OGTT1) para o seguinte (OGTT2) foram excluídos. Os resultados de OGTTs 1 e 2 são mostrados nas figuras 38A e 38B, com medições de AUC mostradas nas figura 38C. o peso corporal de linha de base é mostrado na figura 38D e tabela 20.
[00306] OGTTs 3, 4 e 5 foram realizados a cada 2 semanas ao término de cada tratamento de dose de doses baixa, média e elevada. Amostras de sangue foram coletadas de animais em jejum semanalmente e foram utilizadas para medir níveis de glicose, insulina, triglicerídeo, bem como os níveis de composto de teste. Amostras de sangue foram também coletadas semanalmente durante o período de depuração total de 3 semanas.
[00307] OGTT1 e OGTT2 de linha de base mostraram um perfil esperado de glicose como visto em animais normais, com uma glicose máxima de plasma obtida em 30 minutos, e demonstraram AUCs estáveis para os 3 grupos diferentes.
[00308] Valores de linha de base em jejum para química de plasma são mostrados na tabela 20. Medições de química de plasma foram realizadas em amostras de sangue coletadas antes do início do tratamento. Tabela 20 Valores de linha de base para peso corporal, níveis de glicose, insulina e triglicerídeo em plasma, em jejum dos três grupos de macacos Rhesus
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[00309] Três níveis de dose diferentes foram selecionados, a dose baixa era 0,1 e 0,3 mg/kg, a dose média era 0,3 e 1 mg/kg e a dose elevada era 1 e 5 mg/kg para FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), respectivamente. Níveis de dose foram escolhidos com base na resposta de dose observada em camundongos, com um regime de dosagem com base na freqüência prevista de injeção em humanos. Doses equimolares de FGF21 foram utilizadas para as doses baixa e média, e a dose elevada de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foi elevada para 5 mg/kg (isto é, em vez de 3 mg/kg, que teria sido equimolar à dose de 1 mg/kg de FGF21).
22.2 efeito de compostos de teste sobre peso corporal
[00310] Nesse experimento para medir o efeito dos compostos de teste sobre peso corporal medido semanalmente, a percentagem de alteração em peso de corpo de linha de base foi calculada semanalmente nos três grupos diferentes de macacos Rhesus. O peso corporal foi também medido durante as três semanas de período de depuração total. Valores de peso de corpo de linha de base para cada grupo são incluídos na tabela 20.
[00311] O peso corporal foi seguido durante todo o estudo, tanto pré- como pós-administração de compostos de teste. A alteração em percentagem de peso corporal de linha de base dos animais de veículo aumentou com o tempo, ao passo que o peso corporal de animais tratados com Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) e FGF21 diminuiu em um modo dependente de dose durante o curso do período de tratamento de 6 semanas, como mostrado na figura 39. Como observado anteriormente em roedores (Xu e outros, Diabetes 58(1):250- 9 (2009)), o tratamento com FGF21 diminuiu estatisticamente significativamente o peso corporal. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) teve uma exposição maior do que FGF21 (figura 48 e figura 47, respectivamente), oferecendo uma possível explicação para a observação de que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) mostrou uma diminuição mais acentuada em peso corporal do que FGF21.
22.3 efeito de compostos de teste sobre níveis de insulina
[00312] Níveis de insulina foram medidos em amostras de sangue que tinham sido coletadas após jejum durante a noite ou após uma refeição à tarde.
[00313] Níveis de insulina em plasma em jejum foram medidos em macacos Rhesus semanalmente em animais tratados com veículo, FGF21 ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e durante o período de depuração total de 3 semanas. Amostras de sangue em jejum foram tiradas aproximadamente cinco dias após a última injeção de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G e aproximadamente 21 horas após a última injeção de FGF21.
[00314] Níveis de insulina em plasma com alimentação foram medidos em maçados Rhesus durante a quinta e sexta semana de tratamento com veículo ou FGF21 durante o tratamento com dose elevada. Amostras de sangue com alimentação foram tiradas aproximadamente três dias após injeção de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e aproximadamente 2 horas após a última injeção de FGF21. A figura 40 mostra o efeito de veículo, FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) em níveis de insulina em jejum durante o estudo de nove semanas completo, enquanto a figura 41 representa níveis de insulina com alimentação determinados a partir de amostras tiradas durante as semanas 5 e 6.
[00315] Em resumo, nas duas doses mais elevadas, tanto FGF21 como Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) diminuíram estatisticamente significativamente níveis de insulina em plasma em jejum e com alimentação. A observação de que níveis de insulina de animais tratados com FGF21 e Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) foram diminuídos sem observar níveis de glicose aumentados é indicativa de sensibilidade aumentada de insulina.
22.4 efeito de compostos de teste em OGTT (glicose e insulina)
[00316] Três OGTTs (OGTTs 3, 4 e 5) foram realizados após tratamento ser iniciado. Perfis de nível de insulina e glicose OGTT5 foram medidos em animais tratados por 6 semanas com veículo, FGF21 ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) correspondendo as duas ultimas semanas do regime de aumento de dose elevada. OGTT5 foi conduzido aproximadamente 7 dias após a última injeção de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), e aproximadamente 21 horas após a última injeção de FGF21. Os perfis de insulina e glicose OGTT5 são mostrados na figura 42 e 43, respectivamente. Animais tratados com Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) mostraram uma clearance aperfeiçoada de glicose em comparação com animais tratados com veículo somente na dose mais elevada e no último ponto de tempo medido, como mostrado na figura 42. Ao término da última dose, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) mostrou o aperfeiçoamento mais intenso em clearance de glicose. FGF21 não mostrou aperfeiçoamento em clearance de glicose. Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) teve uma maior exposição do que FGF21 (figura 48 e figura 47, respectivamente), oferecendo uma possível explicação para a observação de que Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) mostrou um efeito mais acentuado em clearance de glicose do que FGF21. Níveis de insulina durante OGTT5 foram estatisticamente significativamente diminuídos no último ponto de tempo medido em animais tratados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) em comparação com animais tratados com veículo.
[00317] Percentagem de alteração de AUC em glicose a partir da linha de base foi calculada para os três OGTT (OGTTs 3, 4 e 5) realizados ao término de cada das doses baixa, média e elevada nos três grupos diferentes de macacos Rhesus como mostrado na figura 44. OGTT5 foi conduzido aproximadamente sete dias após a última injeção Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e 21 horas após a última injeção FGF21 e mostrou que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) reduziu estatisticamente significativamente AUC5. Valores de OGTT de linha de base para cada grupo são mostrados na figura 38C.
[00318] Níveis de glicose em plasma em jejum foram medidos nos dias quando nenhum OGTTs foi realizado. Não houve diferença estatística significativa observada em níveis de glicose em plasma em jejum medidos entre os três grupos de animais.
22.5 Efeito de compostos de teste sobre níveis de triglicerídeos
[00319] A percentagem de alteração de níveis de triglicerídeo em plasma em jejum foi calculado em macacos Rhesus semanalmente em animais tratados com veículo, FGF21 ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e durante o período de depuração total de 3 semanas. Amostras de sangue em jejum foram tiradas aproximadamente cinco dias após a última injeção de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e aproximadamente 21 horas após a última injeção de FGF21. Níveis de triglicerídeo foram medidos semanalmente após tratamento ser iniciado e percentagem de alterações de linha de base são mostrados na figura 45, valores de linha de base em jejum são mostrados na tabela 20.
[00320] Como representado na figura 45, animais tratados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) ou FGF21 mostraram uma diminuição dependente de dose em níveis de triglicerídeo, com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) tendo o maior efeito de diminuição em comparação com FGF21.
[00321] A figura 46 mostra os níveis de triglicerídeo em plasma em amostras adquiridas de macacos Rhesus em um estado com alimentação, durante a quinta e sexta semana de tratamento com veículo ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) ou FGF21. Amostras de sangue com alimentação foram tiradas aproximadamente 3 dias após injeção de Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) e aproximadamente 2 horas após a última injeção de FGF21. Níveis de triglicerídeo em plasma com alimentação, de animais tratados com FGF21 e Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) foram estatisticamente significativamente reduzidos, em comparação com os níveis de triglicerídeo de animais tratados com veículo (figura 46).
22.6 concentração de composto de teste
[00322] A exposição dos compostos testados administrados em níveis de dose molar aproximadamente equivalentes foi avaliada durante todo o período do estudo. A concentração de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foi medida em pré-dose, e aproximadamente 5 dias após a última injeção. Níveis de FGF21 foram medidos em pré-dose e em 5, 12, 19 e 26 dias. Amostras de sangue foram tiradas em aproximadamente 21 horas após a última injeção.
[00323] A concentração individual dos compostos testados em cada macaco é mostrada nas figuras 47 e 48. Como mostrado na figura 47, a maioria dos animais no grupo tratado com FGF21 tinha concentrações abaixo do limite de quantificação. A figura 48 mostra que animais no grupo tratado com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) tiveram níveis detectáveis de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) durante cada fase de dosagem (duas doses semanais na mesma intensidade de dose). A concentração média a partir de cada fase de dosagem aumentou aproximadamente proporcionalmente em dose de 0,3 a 5 mg/kg para Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). há acúmulo mínimo como demonstrado pelas concentrações constantes após a primeira e segunda dose de semana em cada fase de aumento de dose para os dois compostos. Durante a fase sem tratamento (período de depuração total) níveis de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foram detectáveis até aproximadamente o dia 47 (12 dias após a última dose) e estavam abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ) posteriormente.
[00324] A exposição dos compostos de teste também foi monitorada durante cada OGTT. FGF21 não era detectável durante OGTTs 3 e 4, após tratamento com FGF21 de baixa e média dose. Entretanto, níveis mensuráveis foram observados durante OGTT5, após tratamento com dose elevada. Um aumento proporcional em dose em níveis de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foi observado através do terceiro até quinto OGTT com níveis de dose em aumento, como mostrado na figura 49.
[00325] Os dados de níveis de composto confirmam que os animais foram expostos à quantidade esperada de cada composto, a saber FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), em um modo de aumento de dose. Uma grande variabilidade foi observada na quantidade de FGF21 medida, que foi um resultado esperado considerando que a amostragem foi realizada aproximadamente 21 horas após a última dose e a meia vida de FGF21 é aproximadamente 1 hora.
22.7 conclusões
[00326] FGF21 diminuiu níveis de insulina e triglicerídeo em plasma em jejum e com alimentação e diminuiu o peso corporal nas doses mais elevadas. Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) melhorou OGTT e diminuiu níveis de insulina na dose mais elevada, e diminuiu dependentemente de dose níveis de triglicerídeo em plasma em jejum e com alimentação bem como peso corporal. Tanto FGF21 como Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) diminuíram um número de parâmetros metabólicos nos macacos Rhesus não diabéticos. Diminuições de nível de insulina e triglicerídeo foram idênticos entre FGF21 e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)quando níveis de composto em circulação estavam em uma faixa similar, na condição com alimentação. Devido a suas propriedades aperfeiçoadas, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) era superior a FGF21 na maioria dos parâmetros medidos e podia ser administrado uma vez por semana para observar eficácia em parâmetros metabólicos.
Exemplo 23 Molécula de fusão de Fc Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)
[00327] Uma fusão Fc compreendendo um mutante FGF21, que foi unido a um componente Fc IgG1 por um ligador, foi gerada. O componente FGF21 da fusão Fc compreendia três mutações de ponto construídas na seqüência de polipeptídio de FGF21, a saber, L98R, P171G, A180E (a numeração baseada na forma madura de FGF21, fornecida como SEQ ID NO: 4). Essa molécula foi construída por conjugada um Fc humano (SEQ ID NO: 4) com a extremidade-N do mutante L98R, P171G, A180E FGF21 (SEQ IDNO: 39) através de um ligador de 15 aminoácidos compreendendo a seqüência de GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31). Essa molécula foi designada como Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e sua seqüência de aminoácido de comprimento total é mostrada na figura 50 e na SEQ ID NO: 47; é codificada pelo ácido nucléico de SEQ ID NO: 46. Teste in vitro de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrou ser um estimulador potente de fosforilação Erk em uma linhagem de célula recombinante superexpressando B-Klotho. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) também mostrou afinidade de ligação de BV-Klotho aumentada em comparação com fusão Fc de FGF21 do tipo selvagem ou fusão de Fc de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 45). Quando injetado em modelos de animais diabéticos, Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) reduziu níveis de glicose em sangue, diminuiu o peso corporal e foi apropriado para injeção bi semanal.
23.1 Atividade de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) in vitro
[00328] Os experimentos foram realizados para examinar se Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) retém atividade similar à fusão Fc do FGF21 do tipo selvagem ou FGF21 nativo do tipo selvagem em um ensaio in vitro ELK-luciferase.
[00329] Ensaios de ELK-luciferase foram realizados utilizando um sistema de célula de rim 293T humano recombinante, no qual as células 293T superexpressam B- Klotho e construções de repórter de luciferase. B-Klotho é um co-receptor necessário para FGF21 ativar receptores de FGF e induzir transdução de sinal intracelular, incluindo fosforilação Erk. As construções de repórter de Erk- luciferase contêm seqüências que codificam GAL4-ELK2 e 5x UAS-reporter Luciferase. O repórter Luciferase 5xUAS é acionado por um promotor que contém cinco cópias tandem do sítio de ligação Ga14. A atividade de repórter é regulada pelo nível de Erk regulado, e é utilizado para monitorar indiretamente e quantificar atividade FGF21.
[00330] Ensaios de ELK-luciferase foram realizados por cultivar as células 293T na presença de concentrações diferentes de FGF21 do tipo selvagem, fusão de FGF21 do tipo selvagem, Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) por 6 horas, e então ensaiar os lisados de células em relação à atividade de luciferase. As luminescências obtidas em ensaios de luciferase-ELK para cada das construções FGF21 foram expressas em eixo geométrico-y e as concentrações de composto foram expressas em eixo geométrico x.
[00331] A figura 51 mostra a resposta de dose dos compostos testados em ensaios de Erk-luciferase. Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) reteve similarmente atividade em comparação com fusão Fc de FGF21 do tipo selvagem, sugerindo que uma combinação de mutações com L98R, P171G e Al80E não alterou a bioatividade de FGF21. Em comparação com FGF21 do tipo selvagem nativo, construções de fusão Fc mostraram potência levemente reduzida e a atividade máxima nesse ensaio baseado em células com o co-receptor B-Klotho superexpresso.
23.2 Atividade in vitro de fusões Fc-FGF21(L98R, P171G, A180E) compreendendo seqüências ligadoras diferentes
[00332] Um análogo de fusão Fc similar foi gerado por fundir o Fc IgG1 humano a FGF21 (L98R, P171G, A180E) através de uma seqüência ligadora diferente, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28). Esse ligador foi designado L15 e a molécula de fusão resultante foi designada Fc-L15- FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57). Nesse experimento, o efeito de seqüências ligadoras diferentes sobre a atividade de fusões de Fc-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi estudado.
[00333] Ensaios de ELK-luciferase foram realizados por cultivar as células 293T na presença de concentrações diferentes de Gc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc- L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) por 6 horas, e então ensaiar os lisados de célula para atividade de luciferase. Fc- (G4S)-3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrou atividade similar a Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) indicando que seqüências ligadoras diferentes, por exemplo (G4S)3 ou ligadores L15, não tiveram impacto significativo sobre a bioatividade de fusões Fc-FGF21,]23.3
[00334] Afinidade de ligação in vitro de Fc-(G4S)3- FGF21-(L98R, P171G, A180E) para B-Klotho em ensaios de ligação
[00335] A ligação de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) a humano e cino B-Klotho foi testada em um ensaio de ligação de equilíbrio de solução Biacore. A afinidade de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi também compara com um análogo FGF21 de fusão Fc somente com mutações L98R e P171G, a saber, Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ IDNO: 43).
[00336] Neutravidina foi imobilizada em um chip CM5 utilizando acoplamento de amina. Biotina-FGF21 foi capturado na segunda célula de fluxo a ~1500RU. A primeira célula de fluxo foi utilizada como um controle de segundo plano. Mutantes FGF21 em 5x de diluições (0,03 ~2000 nM) foram incubados com 10 nM B-Klotho humano ou 25 nM cino em PBS mais 0,1 mg/ml BSA, 0,005% P20 em temperatura ambiente por 1 hora. a ligação do B-Klotho livre nas soluções misturadas foi medida por injetar sobre a superfície de biotina-FGF21. 100% de sinal de ligação de B-Klotho foi determinado na ausência de mutantes FGF21 na solução. Uma resposta de ligação de B-Klotho diminuída com concentrações crescentes de mutantes FGF21 indiciou que B-Klotho estava ligando a mutantes FGF21 em solução, que bloqueou B-Klotho de se ligar à superfície de FGF21- biotina imobilizada. Ligação relativa da mistura versus concentração molar de FGF21 foi traçada utilizando GraphPad Prizm 5. EC50 foi calculado utilizando ajuste não linear de competição de um sítio no mesmo software.
[00337] A figura 52 mostrou os resultados de um ensaio de ligação de equilíbrio de solução Biacore de Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) a B-Klotho humano (direito) e cino (esquerdo). (SEQ ID NO:43) a humano (direito e cino (3-Klotho (esquerdo). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrou pelo menos 2x atividade de ligação aperfeiçoada a B-Klotho tanto humano como cino em comparação com Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G).
23.4 Eficácia in vivo de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em camundongos db/db diabéticos
[00338] A questão de se Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) poderia exercer efeitos benefícios metabólicos, como diminuir glicose no sangue e reduzir peso corporal, em camundongos db/db diabéticos foi estudada. O estudo também foi destinado a examinar a duração e resposta de dose de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) após uma injeção única. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em doses de 0,1, 0,3, 1 e 3 mg/kg foi injetada intraperitonealmente em camundongos dB/db diabéticos. Um grupo tratado com veículo (10mM Tris, 2,2% de sacarose, 3,3% de Sorbitol, pH 8,5) foi também incluído no estudo. Amostras de sangue foram obtidas de cada animal (n=10 por grupo) em linha de base (antes da injeção) e 6, 24, 72, 120 e 168 horas após injeção. Níveis de glicose no sangue foram medidos com um Glucometer OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, VA). O peso corporal foi medido na linha de base (tempo 0) 24, 72, 120 e 168 horas após injeção.
[00339] A figura 53A mostra os níveis de glicose no sangue em camundongos dB/dB em vários pontos de tempo após injeção com veículo ou Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) resultou em uma diminuição dependente de dose em níveis de glicose no sangue em camundongos dB/db. A redução máxima de glicose foi de aproximadamente 50% a partir da linha de base ou comparado com o grupo tratado com veículo. O efeito máximo foi atingido em 6 horas após injeção e mantido por 120 horas pós-injeção. Os níveis de glicose no sangue começaram a retornar à linha de base em aproximadamente 168 horas. O ED50 estimado, a dose necessária para obter a metade efeito máximo, para Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi aproximadamente 1 mg/kg em camundongos dB/db.
[00340] A figura 53B mostra o efeito de Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) sobre peso corporal após uma única injeção em camundongos dB/dB. Os resultados são expressos como alteração de peso corporal do tempo 0 (antes da injeção). Camundongos tratados com veículo mostraram ganho de peso corporal estável e progressivo durante o período de estudo de 7 dias. Entretanto, a taxa de crescimento de peso corporal foi inibida em camundongos tratados com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em um modo dependente de dose. Quanto mais elevada a dose, mais longa a inibição de crescimento. Em um exemplo, Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) moderou o ganho de peso corporal por 5 dias em 3 mg/kg, 3 dias em 1 mg/kg, ou 1 dia em 0,3 mg/kg. As taxas de crescimento foram recuperadas posteriormente. O ED50 estimado de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) na redução de peso corporal foi aproximadamente 1 mg/kg nesse experimento.
23.5 Comparação de eficácia de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) em camundongos DIO com freqüências de injeção diferentes
[00341] O estudo foi para determinar se Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) poderia ser injetado menos freqüentemente do que Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) porém obter eficácia similar. O estudo foi conduzido em camundongos DIO com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) dado uma vez por semana (Q7D) ou uma vez a cada duas emanas (Q14D), ou Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) administrado duas vezes por semana (BIW), Q7D ou Q14D.
[00342] Camundongos DIO foram preparados por alimentar camundongos C57BL/6 com 4 semanas de idade com uma dieta elevada em gordura que continha 60% de energia de gordura enriquecida com ácidos graxos saturados (D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ). Após 12 semanas de alimentação em dieta com elevado teor de gordura, níveis de glicose no sangue peso corporal foram medidos. Camundongos DIO foram então randomizados em grupos de tratamento ou veículo para obter níveis de glicose no sangue médios de linha de base similar e peso corporal. Um total de 7 grupos foi incluído no estudo: veículo administrado em Q7D; Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) administrado em Q7D ou Q14D; ou Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) administrado em BIW, Q7D ou Q14D. A injeção era intraperitoneal e o estudo foi realizado por 31 dias. O peso corporal foi medido semanalmente. Um GTT foi realizado no dia 28 do estudo e o estudo terminou no dia 31. O desenho do estudo é mostrado graficamente na figura 54.
[00343] A figura 55 mostra os perfis de GTT em camundongos tratados com veículo, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) em freqüências de dosagem diferentes. Tolerância a glicose foi estatisticamente significativamente aperfeiçoada em camundo gos tratados com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em dosagem Q7D ou Q14D quando comparado com veículo, sugerindo que Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) é eficaz e apropriado para administração Q14D em camundongos DIO. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) melhorou a tolerância a glicose quando administrado em BIW ou Q7D, porém não Q14D, sugerindo que Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) pode ser menos apropriado para injeção Q14D em camundongos. A eficácia de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em Q7D ou Q14D foi comparável com aquela de Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) em BIW ou Q7D respectivamente, sugerindo que Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) poderia ser dado 2 vezes menos freqüentemente do que Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G).
[00344] A figura 56 mostra alterações de peso corporal a partir da linha de base (dia 0) em camundongos tratados com veículo, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) em freqüências de dosagem diferentes. Camundongos tratados Q7D com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) perderam peso corporal significativo como perderam camundongos tratados BIW com Fc-(L15)- FGF21(L98R, P171G). o peso corporal foi moderadamente reduzido em camundongos tratados Q14D com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Q7D com Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G). Nenhum efeito em peso corporal significativo foi observado em camundongos tratados Q14D com Fc-(L15)- FGF21(L98R, P171G). O efeito sobre peso corporal foi compatível com aquele em GTT como descrito acima, sugerindo que Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) era eficaz em dosagem Q14D e exibiu aproximadamente injeções 2 vezes menos freqüentes do que Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) para obter o mesmo efeito.
Exemplo 24 Formulações de hidrogel compreendendo mutantes FGF21
[00345] Como um agente de formulação para terapêutica baseada em proteína, hidrogeis oferecem diversas propriedades desejads. Por exemplo, hidrogeis conservam a estrutura nativa e função da proteína incorporada no hidrogel. Além disso, são bem tolerados e dependendo do polímero e tipo de reticulação, podem ser biodegradáveis. Adicionalmente, hidrogeis foram anteriormente utilizados com sucesso para liberação controlada de proteínas. Por conseguinte, hidrogeis foram pesquisados como ummétodo de distribuição possível para os mutantes FGF21 revelados aqui.
[00346] Para todos os experimentos descritos nesse exemplo, hidrogeis foram preparados como a seguir. Uma solução de gelatina bovina a 1,25% (Sigma) em PBS foi preparada. O agente de reticulação anidrido metacrílico foi adicionado em uma razão molar (MA para gelatina) de 16:1, 24:1 ou 32:1. A solução resultanet foi dialisada contra água para remover qualquer metacrilamida não polimerizada para criar um veículo de hidrogel. Finalmente, o veíuclo dehidrogel foi liofilizado e armazenado a 4°C até estar pronto para fazer hidrogeis compreendendo um mutante FGF21. Essa prep. pode ser utilizada para preparar veíuclos de hidrogel à base de gelatina que pode ser subsequentemente adaptada para compreender quaisquer dos mutantes FGF21 revelados aqui.
[00347] Hidrogeis commutantes FGF21 específicos foram então preparados. Começando com um veículo de hidrogel de gelatina metacrílica, liofilizado a 10%, soluções foram preparadas. Os veículos de hidrogel foram aquecidos e então centrifugados para dissolver e liquefazer o veíuclo de hidrogel de gelatina MA liofilizado. A proteína FGF21 selecionada (FGF21 (L989R, P171G), (SEQ IDNO: 37) no presente exemplo), foi então adicionada à solução de gelatina liquefeita a uma concentração predeterminada. Uma solução de material TEMED foi então adicionada. Uma solução de material KPS foi então adicionada e a solução foi misturada suavemente. Serings de 1 ml foram cheias a 200 ul e deixadas assentar por 1,5 a 2 horas em temperatura ambinete. As seringas foram armazenadas a -20°C e descongeladas a 4°C durante a noite antes do uso. Veículo de hidrogel compreendendo 10 mM Tris, 9% de sacarose, pH 8,5 sem mutante FGF21 adicionado foi uitlizado como controle.
[00348] Para os experimentos in vivo, as seringas foram colocads em pad de aquecimenot a 37°C por aproximadmente 10 minutos antse da injeção nos animais.
24.1 Atividade in vitro de FGF21 (L98R, P171G) liberado de hidrogeis a 10% com várias razões de reticulação
[00349] Um objetivo dese experimento foi testar se FGF21 (L98R, P171G) liberado de hidrogel é biologicamente ativo em comparação com a forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) em um ensaio in vitro de ELK-luciferase.
[00350] FGF21 (L98R, P171G) foi preparado e incorpordo em soluções de gelatina metacrílica a 10% com razões d reticulação de gelatina metacrílica a 16:1 24:1 e 32:1 como descrito. Os hidrogeis foram então dispersos em uma solução de tampão in vitro para permitir liberação de FGF21 (L98R, P171G). o meio foi coletado após 100 ou 150 horas e submetido a ensaios in vitro para atividade de FGF21 (L98R, P171G). ensaisos analíticos (por exemplo, SDS- PAGE, HPLC de exclusão de tamanho, e HPLC de fase inversa) mostram o FGF21 (L98R, P171G) liberado erstava intacto em todos os pontos de tmepo.
[00351] Ensaios de ELK-luciferase foram realizados utiliznado um sistema de célula de rim 293T humana recombinante, no qual as células 293T superexpressam B- Klotho e construções de repórter de luciferase. B-Klotho é um co-receptor que é exigido por FGF21 para ativação de seus receptores FGF. Os receptores FGF utilizados nesse ensaio são receptores de FGF endógeno expressos em célula de rim 293T. as construções de repórter de luciferase contêm sequências que codificam GAL4-ELK1 e um repórter de luciferase acionado por um promotor contendo cinco cópias tandem do sítio de ligação Gal1 (5xUAS-Luc). A atividade de luciferase é regulada pelo nível de Erk/ELK1 fosforilado e é uitlizado para monitorar indirtamente e quantificar atividade FGF21.
[00352] Ensaios de ELK-luciferase foram realizados por cultivar as células 293T na presença de concentrações diferentes da forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) ou FGF21 (L98R, P171G) liberado por hidrogel por 6 horas, e então ensaiar os lisados de célula em relação à atividade de luciferase. A figura 57 mostra os resultados in vitro do ensaio de ELK-luciferase. FGF21 (L98R, P171G) liberado de hidrogenis com razões de reticulação de gelatina metacrílica a 16:1, 24:1 e 32:1 foi biologictamente ativo com atividade equivalente à forma nativa de FGF21 (L98R, P171G). os dados demonstraram que o hidrogel preservou a estrutura e função da proteína incorporada e o FGF21 (L98R, P171G) liberado é ativo e estável mesmo após 10-15 horas no meio.
24.2 Eficácia in vivo de hidrogel FGF21 (L98R, P171G) em diferentes razões de reticulação em camundonogs ob/ob
[00353] O objetivo desse experimento foi determinar se um hidrogel FGF21 (L98R, P171G) preparado com razões de reticulação de gelatina metacrílica em 24:1 e 32:1 forneceu uma liberação controlada de FGF21 (L98R, P171G) biologicamente ativo in vivo e finalmente resultando em eficácia in vivo mais longa em comparação com a forma nativa de FGF21 (L98R, P171G). Além disso, com base na avaliação de taxas de liberação in vitro, foi determinado que razões de reticulação mais elevadas de gelatina metacrílica fornece liberação controlada melhor do FGF21 (L98R, P171G) incorporado. Portanto, outro obejtivo desse experimento foi comparar dois hidrogeis de FGF21 (L98R, P171G) preparados com razoes de reticulação de gelatina metacríica em 24:1 e 32:1.
[00354] FGF21 possui diversas atividades biológicas, incluindo a capacidade de diminuir níveis de glicose, insulina, triglicerídeo ou colesterol no sangue; reduzir o peso corporal; ou melhorar a tolerância a glicose, gasto de energia, ou sensiblidade à insulina. Ihdrogeis de FGF21 (L98R, P171G) foram introduzidos em camundongos ob/ob resistentes à insulina, e as capacidades de hidrogel FGF21 (L98R, P171G) diminuírem glicose no sangue e reduzirem peso corporal foram medidas. O proceidmenot para o trabalho in vivo foi como a seguir.
[00355] Hidrogeis foram preparados utilizando o proceidmenot descrito acima. Camundongoas ob/bo com 8 semanas de idade (Jackson Laboratory) foram raspados no local da injeção e foram anestesiados com isoflurane e O2 pouco antes da injeção. Hidrogeis (0,2 ml) foram lentamente injetados sob a pele e Vetbond foi aplicado no local da injeção após injeção. O veículo (10 mM Tris, 9% de sacarose pH 8,5) ou FGF21 (L98R, P171G) nativo foram também incluídos no experimento e injetados similarmente como hidrogeis. Os animais foram retornados a sua gaiola após acordar da anestesia. Amostras de sangue foram obtidas antes da injeção e em vários pontos de tempo após injeção, por exemplo, 0, 3, 6, 24, 72, 120, 192 e 264 horas após injeção. Níveis de glicose no sangue foram medidos com um Glucometer OneTouch (LifeScan, Inc., Milpitas, CA). O peso corporal também foi monitorado.
[00356] As figuras 58 e 59 resumem os resultados do experimento. Em comparação com o veículo ou hidrogel de controle, a forma nativa FGF21 (L98R, P171G) reduziu rapidamente níveis de glicose no sangue em 3 e 6 h após injeção. Entretanto, a atividde in vivo da forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) waned e os níveis de glicose no sangue retornaram à linha de base 24 horas após injeção. Hidrogeis de FGF21 (L98R, P171G) resultaram em redução em glicose no sangue tão cedo quanto 3 h após injeção e a atividade foi mantida até 8 dias. Não houve diferença significativa entre as razões de reticulação em 24:1 ou 32:1. Grupos de hidrogel FGF21 (L98R, P171G) tambémmostraram ganho de peso corporal mais lento do que camundongos tratados com veículo ou hidrogel sozinho. Eses resultados demonstram que hidrogeis de FGF21 (L98R, P171G) peparados com razões de reticulação de gelatina metacrílica em 24:1 e 32:1 são capazes de fornecer uma liberçaão controlada de FGF21 (L98R, P171G) biologicametne ativo in vivo e finalmente resultando em eficácia in vivo mais longa em comparação com a forma nativa de FGF21 (L98R, P171G).
24.3 Eficácia in vivo de hidrogel FGF21 (L98R, P171G) e FGF21 (L98R, P171G, A180E) em razões de reticulação diferentes em camundongos dB/B6
[00357] Formulações de hidrogel foram preparadas utilizando gelatina bovina (Sigma) e vários mutantes FGF21 e construções, a saber, FGF21 (L98R, P171G) e FGF21 (L98R, P171G, A180E). Um controle de hidrogel foi também preparado. 0,2 mL de hidrogel foi colocado em uma seringa de 1 ml tendo uma agulha 21G.
[00358] Controles de hidrogel e hidrogeis compreendendo um mutante FGF21 foram preparados como descrito acima. Camundongos dB/B6 com 8 semanas de idade (Jackson Laboratory) foram raspados no local da injeção e foram anestesiados com isoflurane e O2 pouco antes da injeção. Hidrogeis (0,2 ml) foram lentamente injetados sob a pele e Vetbond foi aplicado no local da injeção após injeção. O veículo (10 mM Tris, 9% de sacarose pH 8,5) ou FGF21 (L98R, P171G) nativo foram também incluídos no experimento e injetados similarmente como hidrogeis. Os animais foram retornados a sua gaiola após acordar da anestesia. Amostras de sangue foram obtidas antes da injeção e em vários pontos de tempo após injeção, por exemplo, 0, 24, 96, 168, 240, 312 horas após injeção. Níveis de glicose no sangue foram medidos com um Glucometer OneTouch (LifeScan, Inc., Milpitas, CA). O peso corporal também foi monitorado.
[00359] O desenho experimental foi como a seguir: Grupo de animais (n=9 por grupo) A. Hidrogel de controle 32:1 (10% MA:HU4 200 ul B. Hidrogel FGF21 (L98R, P171G) 32:1 (10%) MA:HU4 0,5 mg/camundongo (200 ul, ~10 mg/kg) C. Hidrogel FGF21 (L98R, P171G) 32:1 (10%) MA:HU4 1,5 mg/camundongo (200 ul, ~30 mg/kg) D. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (sem hidrogel) 3 mg/kg
[00360] Vários parâmetros foram medidos e os resultados dos experimentos são mostrados nas figuras 60- 63. A figura 60 mostra a alteração em glicose no sangue durante o curso do experimento de 14 dias, enquanto a figura 61 mostra a percentagem de alteração em glicose no sangue durante o mesmo período. A figura 62 mostra a alteração em peso corporal durante o curso do experimento de 14 dias, enquanto a figura 63 mostra a percentagem de alteração em peso corporal durante o mesmo período.
[00361] Os resultados do experimento mostrado graficamente nas figuras 60-63 podem ser resumidos como a seguir: FGF21 (L98R, P171G) 32:1 (10%) MA:HU4 em 10 mg/kg foi eficaz em reduzir glicose no sangue em 24 horas após injeção e o nível de glicose no sangue retornou à linha de base entre 4-7 dias. FGF21 (L98R, P171G) 32:1 (10%) MA:HU4 em 30 mg/kg foi mais eficaz em reduzir glicose no sangue do que a dosagem de 10 mg/kg, e o nível de glicose no sangue foi visto como retornando à linha de base entre 7-10 dias. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em 3 mg/kg reduziu glicose no sangue em 24 horas após injeção a um grau que foi similar a FGF21 (L98R, P171G) em 30 mg/kg de hidrogeis.
[00362] O controle de hidrogel (que não compreendeu um mutante FGF21) não teve nenhum efeito na redução de glicose no sangue.
[00363] Os grupos de hidrogel de FGF21 (L98R, P171G) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (que não estava apresentado em um hidrogel) mostraram ganho de peso corporal reduzido em comparação com camundongos tratados com um controle de hidrogel.
Exemplo 25 Estudo com macaco Cynomolgus
[00364] Duas construções de Fc_ligador-FGF21 foram geradas utilizando metodologia descrita aqui. Uma construção compreendendo uma seqüência Fc IgG1 (SEQ ID NO: 11) fundida na extremidade C com uma seqüência de ligador (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 28) que foi então fundido com a extremidade N de uma seqüência FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), na qual duas mutações, L98R e P171G, foram introduzidas. Essa molécula é mencionada no presente exemplo como “Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)” (SEQ ID NO: 43). Uma segunda construção compreendeu uma seqüência Fc IgG1 (SEQ ID NO: 11) fundida na extremidade C a uma seqüência ligadora de (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 31) que foi então fundida com a extremidade N de uma seqüência FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), na qual três mutações L98R, P171G e A180R, foram introduzidas. Essa molécula é mencionada no presente exemplo como “Fc-(G4S)-3- FGF21 (L98R, P171G, A180E)” (SEQ ID NO: 47). Essas construções foram então expressas e purificadas como descrito aqui, e foram isoladas como uma forma dimérica da proteína, cada monômero da qual foi ligado através de ligações de dissulfeto intermoleculares entre a região Fc de cada monômero.
25.1 desenho do estudo
[00365] O estudo foi realizado em macacos cynomolgus com características de tolerância prejudicada à glicose (IGT). Os macacos tinham 8-18 anos de idade. Seus pesos corporais variaram de 5-15 kg e BMI variou de 32-70 kg/m2. 44 macacos foram aclimatados por 6 semanas antes da iniciação de administração de composto. Durante o período de aclimatação, macacos foram treinados 4 vezes por semana por 4 semanas para familiarizar-se com os procedimentos incluindo reter cadeira, injeção subcutânea (PBS, 0,1 ml/kg), gavagem (água, 10 ml/kg), sangue tirado de amostras OGTT e não OGTT. Após 4 semanas de treinamento, parâmetros metabólicos de plasma e OGTT de linha de base foram medidos. 40 de 44 macacos foram selecionados e randomizados em três grupos de tratamento para obter níveis de linha de base similares de peso corporal, resposta AUC OGTT, e níveis de triglicerídeo e glicose em plasma.
[00366] O estudo foi conduzido em um modo cego. Veículo (n=14), Fc (L15)-FGF21 (L98R, P171G) (n=13) e Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (n=13) foram rotulados como composto A, B e C e administrado uma vez por semana através de injeção subcutânea. Os compostos foram fornecidos em um modo de aumento de dose de níveis baixo (0,3 mg/kg), médio (1 mg/kg) até elevado (3 mg/kg) e a dose foi aumentada a cada três semanas. Após 9 semanas de tratamentos com composto, os animais foram monitorados por mais 3 semanas para depuração total do composto e recuperação dos tratamentos. Ingestão de alimento, peso corporal, química clinica e OGTT foram monitorados durante todo o estudo. Ingestão de alimento foi medida a cada refeição. O peso corporal foi medido semanalmente. Amostras de sangue foram coletadas semanalmente 5 dias após cada injeção para medir níveis de glicose, triglicerídeo, colesterol total, colesterol HDL e LDL. OGTTs foram conduzidos a cada três semanas após o início de tratamentos (ao término de cada nível de dose). O dia de início de tratamento é designado como 0 e o plano de estudo detalhado é mostrado na figura 64.
[00367] Os resultados mostrados nesse exemplo são dados coletados ao término de tratamento de 9 semanas.
25.2 efeito de compostos de teste sobre ingestão de alimento
[00368] Os animais foram alimentados duas vezes por dia, com cada animal recebendo 120g de alimento formulado estabelecido durante o período de aclimatação. O alimento restante foi retirado e pesado após cada refeição para calcular ingestão de alimento. O tempo de alimentação foi de 8:00 h da manhã até 8:30 (± 30 minutos) e então das 16h30 até 17h00 (± 30 minutos). Para produzir regalos, maçã (150 g) foi fornecida a cada animal às 11h30 até 12h30 (± 30 minutos) todo dia.
[00369] Em comparação com o veículo, tanto Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) como Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) reduziram ingestão de alimentos em macacos (figuras 65, 66 e 67). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) inibiu a ingestão de alimento em cada refeição incluindo as refeições de manhã, fruta e de tarde/noite a 0,3 mg/kg de dose. Entretanto, O efeito diminuiu e a ingestão de alimento retornou próximo aos níveis de controle ou linha de base após aproximadamente 30 dias de tratamento quando a dose foi aumentada para 1 mg/kg. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) não teve efeito significativo sobre ingestão de alimento de manhã e somente reduziu pouco a ingestão de alimento em refeição de tarde/noite quando a dose foi aumentada para 1 e 3 mg/kg. Entretanto, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) reduziu a ingestão de fruta similarmente a Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). No geral, Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrou um efeito mais forte sobre a inibição de ingestão de alimento do que Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G). o efeito sobre a ingestão de alimento pareceu ser de curto prazo e a ingestão de alimento foi recuperada após aproximadamente 30 dias de tratamento.
25.3 Efeito de compostos de teste sobre peso corporal
[00370] O peso corporal foi monitorado semanalmente durante todo o estudo. Durante o curso dos tratamentos de 9 semanas, o peso corporal de animais tratados com veículo permaneceu constante enquanto o peso corporal de animais tratados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) diminuiu progressivamente. Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E resultou em uma diminuição mais acentuada do peso do corpo do que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) como mostrado na figura 68.
25.4 efeito de compostos de teste sobre índice de massa corporal (BMI), espessura de dobra de pele (SFT) e circunferência abdominal (AC)
[00371] BMI, SFT e AC foram monitorados semanalmente durante todo o estudo, tanto pré- como pós-administração de compostos de teste quando o peso do corpo foi feito. BMI é definido como o peso corporal do indivíduo dividido pelo quadrado de sua altura. SFT é a espessura de uma camada dupla de pele e a gordura embaixo da mesma com um calibre especial que exerce uma tensão constante sobre o local. BMI, SFT e AC são medições relativamente precisas, simples e baratas de composição de corpo particularmente indicativas de gordura subcutânea. Animais tratados com veículo mostraram BMI, SFT e AC relativamente estáveis durante todo o estudo. Animais tratados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostraram níveis diminuídos de BMI, SFT e AC durante o curso do estudo de 9 semanas, sugerindo que os dois compostos resultaram em redução de massa de gordura. Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi mais eficaz e resultou em reduções mais acentuadas em BMI, SFT e AC do que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). os resultados são mostrados nas figuras 69, 70 e 71, respectivamente.
25.2 Efeito de compostos de teste sobre níveis de glicose no sangue, em jejum
[00372] Sangue foi coletado de animais em jejum durante a noite. O sangue tirado foi conduzido semanalmente em 5 dias após cada injeção. Tanto Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) como Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) reduziram níveis de glicose no sangue em jejum. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) reduziu níveis de glicose no sangue em jejum na dose de 0,3 mg/kg e a redução máxima de glicose foi obtida quando a dose foi aumentada para 1 mg/kg. Entretanto, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) somente resultou em uma redução modesta de níveis de glicose no sangue na dose mais elevada testada (3 mg/kg). Portanto, Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi mais eficaz e produziu redução de glicose no sangue mais acentuada do que Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G). Nenhuma hipoglicemia foi observada em quaisquer dos macacos tratados com Fc-(G4S)3- FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). a figura 72 mostra os níveis de glicose em plasma em jejum durante o curso de estudo.
25.6 Efeito de compostos de teste sobre teste de tolerância à glicose oral (OGTT)
[00373] OGTTs foram realizados antes e após início de tratamentos. OGTTs pós-dose foram realizados a cada três semanas para efeito de composto de teste em cada nível de dose. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) melhorou a tolerância a glicose em todas as doses testadas de 0,3 a 3 mg/kg. Níveis de glicose foram reduzidos e a excursão de glicose após um desafio de bolo de glicose aumentou em resposta ao tratamento com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Não houve resposta de dose observada sugerindo que Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) obteve seu efeito máximo na dose de 0,3 mg/kg. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) somente resultou em uma melhora de tolerância a glicose em 1 mg/kg e não foi evidente porque o efeito diminuiu quando a dose foi aumentada para 3 mg/kg. A figura 73 mostra perfis de curva pré- e pós-OGTT e a área sob a curva OGTT.
35.7 Efeito de compostos de teste sobre níveis de triglicerídeo
[00374] Sangue foi coletado de animais em jejum durante a noite. O sangue tirado foi conduzido semanalmente em 5 dias após cada injeção. Níveis de triglicerídeo foram significativamente reduzidos em animais tratados com Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Entretanto, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi mais eficaz do que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) resultou em uma redução máxima de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) somente resultou em uma redução intermediária de níveis de triglicerídeo com a dose testada mais elevada (3 mg/kg). A figura 74 mostra os níveis de triglicerídeos em plasma em jejum durante o curso de estudo.
25.8 Efeito de compostos de teste sobre níveis de colesterol total e colesterol HDL
[00375] Sangue COI coletado de animais em jejum durante a noite. O sangue tirado foi conduzido semanalmente em 5 dias após cada injeção. Níveis de colesterol total e colesterol HDL em plasma tenderam a aumentar após tratamento com Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G). As figuras 75 e 76 mostram os níveis de colesterol total e colesterol HDL durante o curso do estudo.
25.9 Conclusões
[00376] Em um estudo de aumento de dose conduzido em macacos cynomolgus IGT machos, animais tratados com mutantes FGF21 conjugados Fg a saber, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) mostraram parâmetros metabólicos aperfeiçoados. Peso corporal foi reduzido e a composição do corpo foi melhorada. Redução de curto prazo de ingestão de alimento foi observada e a ingestão de alimento recuperada até níveis de controle ou linha de base no meio do estudo. Níveis de triglicerídeo e glicose em sangue em jejum foram também reduzidos para os dois compostos Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ou Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). OGTT foi melhorado e níveis de colesterol HDL foram levemente elevados. Em comparação com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) pareceu ser superior a Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) em todos os parâmetros medidos em qualquer dose testada. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) obteve seus efeitos máximos para a maioria dos parâmetros medidos quando administrado a 0,3 mg/kg. Portanto, a dose eficaz terapêutica de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em espécies mais elevadas pode ser mais baixa do que 0,3 mg/kg.
Exemplo 26 Estudo de estabilidade em macacos cynomolgus
[00377] Esse estudo foi projetado para determinar se Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57) era mais resistente a protease do que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43). Processamento de terminal carboxi foi observado após injeção de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) em camundongos ou macacos como mostrado no exemplo 21. A degradação resultou em perda sucessiva de 1 a 3 resíduos de aminoácido da extremidade-C. os esforços por capear a extremidade-C ou introduzir mutações adicionais na extremidade-C de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) forneceram uma molécula superior Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Esse estudo foi projetado para avaliar se Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) tinha melhorado estabilidade in vivo em comparação com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
[00378] Construções Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foram geradas. Essas construções compreendiam uma seqüência Fc IgG1 (SEQ ID NO: 11) fundida na extremidade C com uma seqüência ligadora (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 28) que foi então fundida com a extremidade N de uma seqüência FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), na qual duas mutações L98R, P171G ou três mutações L98R, P171G e A180E, foram introduzidas. Essas construções foram então expressas e purificadas como descrito aqui, e foram isoladas como uma forma dimérica da proteína, cada monômero da qual foi ligado via ligações de dissulfeto intermolecular entre a região Fc de cada monômero.
[00379] A estabilidade in vivo de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi comparada em macacos cynomolgus machos. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foram injetados por via intravenosa em macacos cynomolgus a 23,5 mg/kg. Amostras de sangue foram coletadas em vários pontos de tempo após uma única injeção iv. Espectrometria de massa MALD-TOF-imunoafinidade foi utilizada para monitorar metabólitos em cada ponto de tempo após injeção. Os rutilados são mostrados na figura 77.
[00380] Em comparação com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrou degradação de terminal-C significativamente reduzida com menos picos de massa detectáveis adjacentes ao pico parental da molécula intacta, sugerindo que a mutação A180E diminuiu a degradação de peptidase terminal-C. truncamentos maiores com perdas de massa estimadas em [1-376], [1-394] e [1-401] foram também observados e os sítios correspondiam a 133-134, 153-154 e 158-159 na seqüência de polipeptídio FGF21. O clipping de endopeptidase interna contribuiu para o metabolismo geral tanto de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) como Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e a mutação A180E não pareceu impactar significativamente a taxa de degradação de endopeptidase interna.
[00381] Para aumentar a resolução e fornecer detalhes da mistura de degradação, espectrometria de massa LC-MS MRM (monitoração de reação múltipla) também foi realizada para monitorar várias formas dos fragmentos de degradação de terminal-C. amostras de macaco foram purificadas por afinidade e então submetidas à digestão Asp-N. os peptídeos digeridos de terminal-C foram então monitorados por MRM. Os resultados para várias formas dos fragmentos de degradação de terminal-C são expressos como quantidade relativa para espécie de peptídeo de comprimento total (%) mostrada na figura 78. Compatível com espectros MALDI, a análise semi-quantitativa MRM dos fragmentos de terminal-C também mostraram abundancia relativa reduzida dos fragmentos de peptídeo sem 1-3 aminoácidos a partir da extremidade-C e abundancia relativa aumentada da molécula intacta em macacos administrados com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) em comparação com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
[00382] Em resumo, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E)mostrou degradação de terminal-C reduzida e estabilidade in vivo aumentada em comparação com Fc-(L15)- FGF21 (L98R, P171G) em macacos cynomolgus.
Exemplo 27 Farmacocinética de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) em camundongos.
[00383] Esse estudo foi projetado para avaliar a farmacocinética de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57) Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) após uma única dose intravenosa em camundongos C57BL/6 machos
[00384] Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) foram dados em 20mg/kg através de injeção intravenosa. Amostras de sangue foram coletadas em 0,083 (5 minutos) 1, 4, 8, 16, 24, 28, 72, 96, 168 e 240 horas após dosagem. Para determinar concentrações de plasma de molécula de comprimento total intacta, um ensaio ELISA com a imunorreatividade dirigida para o FGF21 de terminal-C e terminal-N foi desenvolvido. O ensaio rastreia a molécula intacta de comprimento total com contaminações desprezíveis a partir de outros produtos de degradação. As concentrações de plasma de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) e Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) intacta durante um período de 240 horas após injeção intravenosa em camundongos são mostradas na figura 79.
[00385] As concentrações de plasma de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foram significativamente mais elevadas do que aquelas de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) administrado no mesmo nível de dose de 24 a 168 horas após injeção. Uma quantidade significativa de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi mensurável em 168 horas após injeção em camundongos. Como resultado Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrou cobertura de AUC aumentada e meia-vida em circulação de plasma por 2 vezes com Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)em camundongos. A meia vida de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) foi de 16,6 horas e aquela de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) foi de 9,4 horas. Os dois compostos estavam abaixo do nível detectável em 240 horas após dose.
Exemplo 28 Geração de mutantes de glicosilação ligado-N para melhorar a solubilidade ou diminuir clipping de terminal-C para aumentar a meia-vida
[00386] Mutantes FGF21 foram projetados e gerados para criar sítios de glicosilação ligados N em potencial para expressão de mamífero com ruptura mínima para a seqüência de aminoácido nativa. Os mutantes construídos incluem FGF21 (Y179N, S181T) (SEQ ID NO: 161), FGF21 Y179N (SEQ ID NO: 163) e FGF21 P124S (SEQ ID NO: 165).
[00387] A expressão dos mutantes foi realizada de forma transiente em células 293-6E e meios condicionados foram testados em relação à atividade em um ensaio in vitro ELK-luciferase. Ensaios ELK- luciferase foram realizados como descrito no exemplo 4, com a exceção de que diluições serial de meio condicionado foram utilizadas em vez de concentrações diferentes de proteínas purificadas.
[00388] A análise do meio condicionado revelou que glicosilação aumentada comparada com o tipo selvagem não foi obtida no sistema de expressão transiente. A figura 80 mostra os resultados de um ensaio de atividade ELK-luciferase. Os resultados mostrados na figura 80 demonstram que o mutante FGF21 P124S não impactou adversamente a atividade de FGF21 porém os mutantes FGF21 Y179N e FGF21 (Y179N, S181T), na ausência de glicosilação resultou em atividade reduzida como ensaiado no ensaio de ELK-luciferase.
[00389] Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de várias modalidades, entende-se que variações e modificações ocorrerão para aqueles versados na técnica. Portanto, pretende-se que as reivindicações apenas cubram todas essas variações equivalentes que estão compreendidas no escopo da invenção como reivindicada. Além disso, os cabeçalhos de seção utilizados aqui são somente para fins de organização e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita.
[00390] Todas as referências citadas nesse pedido são expressamente incorporadas a título de referência aqui para qualquer finalidade.

Claims (14)

1. Polipeptídio isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e caracterizado por: o resíduo de aminoácido na posição 180 ser substituído por ácido glutâmico; o resíduo de aminoácido na posição 171 ser substituído por glicina; e o resíduo de aminoácido na posição 98 ser substituído por arginina.
2. Polipeptídio de fusão caracterizado por compreender o polipeptídio isolado, conforme definido na reivindicação 1, fundido com uma sequência de aminoácido heteróloga.
3. Polipeptídio de fusão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido heteróloga é um domínio Fc ou fragmento do mesmo.
4. Polipeptídio de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o domínio Fc compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
5. Polipeptídio de fusão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio é fundido com o domínio Fc através de um ligador.
6. Polipeptídio de fusão, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ligador compreende GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31).
7. Polipeptídio de fusão, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio compreende SEQ ID NO: 47.
8. Multímero caracterizado por compreender dois ou mais dos polipeptídios de fusão conforme definidos na reivindicação 7.
9. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o polipeptídio isolado, conforme definido na reivindicação 2, e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o agente de formulação farmaceuticamente aceitável é um hidrogel.
11. Ácido nucléico isolado caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico compreende SEQ ID NO: 46.
12. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico conforme definida na reivindicação 11.
13. Polipeptídio isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio é covalentemente ligado a um ou mais polímeros.
14. Polipeptídio isolado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polímero é PEG.
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