RS65153B1 - Fgf21 mutanti i njihove upotrebe - Google Patents

Fgf21 mutanti i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS65153B1
RS65153B1 RS20240141A RSP20240141A RS65153B1 RS 65153 B1 RS65153 B1 RS 65153B1 RS 20240141 A RS20240141 A RS 20240141A RS P20240141 A RSP20240141 A RS P20240141A RS 65153 B1 RS65153 B1 RS 65153B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fgf21
seq
polypeptide
amino acid
mutants
Prior art date
Application number
RS20240141A
Other languages
English (en)
Inventor
Edward John Belouski
Murielle Marie Ellison
Agnes Eva Hamburger
Randy Ira Hecht
Yue-Sheng Li
Mark Leo Michaels
Jeonghoon Sun
Jing Xu
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42455356&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65153(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of RS65153B1 publication Critical patent/RS65153B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Description

Opis pronalaska
[0001] Ova prijava ima pravo prvenstva u odnosu na Privremenu SAD prijavu br.61/175,736 podnetu 5.maja 2009. godine i i Privremenu SAD prijavu br.61/285,118 podnetu 9. decembra 2009. godine.
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0002] Pronalazak se odnosi na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju FGF21 mutantne polipeptide, FGF21 mutantne polipeptide, farmaceutske kompozicije koje sadrže FGF21 mutantne polipeptide i postupke za lečenje metaboličkih poremećaja upotrebom takvih nukleinskih kiselina, polipeptida ili farmaceutskih kompozicija.
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0003] FGF21 je polipeptid koji se izlučuje i pripada subfamiliji faktora rasta fibroblasta (FGF) koja uklјučuje FGF19, FGF21 i FGF23 (Itoh i saradnici, 2004, Trend Genet. 20: 563-69). FGF21 je atipičan FGF po tome što je nezavisan od heparina i funkcioniše kao hormon u regulaciji glukoznog, lipidnog i energetskog metabolizma.
[0004] FGF21 je izolovan iz cDNK biblioteke jetre kao faktor koji se izlučuje iz jetre. Visoko se eksprimira u jetri i pankreasu i jedini je član FGF familije koji se primarno eksprimira u jetri. Transgeni miševi koji prekomerno eksprimiraju FGF21 ispoljavaju metaboličke fenotipove sa sporom stopom rasta, niskim nivoima glukoze i triglicerida u plazmi, kao i odsustvo dijabetesa tipa 2 povezanog sa starenjem, a dalje i hiperplazije ostrvaca pankreasa i gojaznosti. Rezultat farmakološkog davanja rekombinantnog FGF21 proteina u modelima glodara i primata su normalizovani nivoi glukoze u plazmi, smanjeni nivoi triglicerida i holesterola i pobolјšane tolerancija na glukozu i osetlјivost na insulin. Dodatno, FGF21 smanjuje telesnu težinu i telesnu masnoću povećanjem potrošnje energije, fizičke aktivnosti i metaboličke stope. Eksperimentalna istraživanja obezbeđuju podršku za farmakološko davanje FGF21 za lečenje dijabetesa tipa 2, gojaznosti, dislipidemije i drugih metaboličkih stanja ili poremećaja kod lјudi.
[0005] Humani FGF21 ima kratak poluživot in vivo. Kod miševa, poluživot humanog FGF21 je 1 do 2 sata, a kod Cynomolgus majmuna, poluživot je 2,5 do 3 sata. U razvoju FGF21 proteina za upotrebu u vidu terapeutika za lečenje dijabetesa tipa 2, bilo bi poželјno povećanje poluživota. FGF21 proteini sa proboljšanim poluživotom bi omogućili ređe davanje doza pacijentima kojima se daje protein. Takvi proteini su ovde opisani.
WO2006/028595 i WO2006/065582 opisuju FGF21 mutante na pozicijama 167 i 121.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0006] Polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, koja sadrži: (a) aminokiselinsku supstituciju na poziciji 180; i (b) jednu aminokiselinsku supstituciju izabranu iz grupe koju čine: (i) supstitucija na poziciji 171; i (ii) supstitucija na poziciji 98; kao što je specifično navedeno u priloženim patentnim zahtevima.
[0007] U jednom primeru izvođenja, izolovani polipeptid sadrži supstituciju na poziciji 98 i supstituciju na poziciji 180, pri čemu: (a) supstitucija na poziciji 98 je arginin, i (b) supstitucija na poziciji 180 je izabrana iz grupe koju čine glicin, prolin, serin ili glutaminska kiselina. U jednom primeru izvođenja, ostatak na poziciji 98 je arginin, a ostatak na poziciji 180 je glutaminska kiselina. Takođe je obezbeđen fuzioni polipeptid koji sadrži izolovani polipeptid fuzionisan sa heterolognom aminokiselinskom sekvencom. U jednom primeru izvođenja, heterologna aminokiselinska sekvenca je Fc domen ili njegov fragment, i može sadržavati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11. U drugom primeru izvođenja, polipeptid je fuzionisan sa Fc domenom preko linkera, a u još jednom primeru izvođenja, linker sadrži GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:31). Takođe je opisan multimer koji sadrži dva ili više fuzionih polipeptida. Farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovani polipeptid i farmaceutski prihvatlјivo sredstvo za formulisanje, kao što je hidrogel, takođe je opisana. Prema drugom aspektu, obezbeđen je postupak lečenja metaboličkog poremećaja i, u jednom primeru izvođenja, obuhvata davanje humanom pacijentu kome je to potrebno, farmaceutske kompozicije koja je ovde obezbeđena. U jednom primeru izvođenja, metabolički poremećaj je dijabetes, a u drugom, metabolički poremećaj je gojaznost. Nukleinske kiseline koje kodiraju izolovani polipeptid su takođe obezbeđene. Nukleinska kiselina može biti prisutna u vektoru, koji sam po sebi može biti prisutan u ćeliji domaćinu. U još jednom primeru izvođenja, polipeptid sadrži: (a) skraćenje na amino-kraju, od ne više od 8 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara; (b) skraćenje na karboksi-kraju, od ne više od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara; ili (c) skraćenje na amino-kraju, od ne više od 8 aminokiselinskih ostataka, i skraćenje na karboksi-kraju, od ne više od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara. U još drugim primerima izvođenja, polipeptid je kovalentno vezan za jedan ili više polimera, kao što je PEG.
[0008] U drugom primeru izvođenja, izolovani polipeptid sadrži supstituciju na poziciji 171 i supstituciju na poziciji 180, pri čemu: (a) supstitucija na poziciji 180 je izabrana iz grupe koju čine glicin, prolin, serin i glutaminska kiselina; (b) supstitucija na poziciji 171 je glicin, U jednom primeru izvođenja, ostatak na poziciji 171 je glicin, a ostatak na poziciji 180 je glutaminska kiselina. Takođe je obezbeđen fuzioni polipeptid koji sadrži izolovani polipeptid fuzionisan sa heterolognom aminokiselinskom sekvencom. U jednom primeru izvođenja, heterologna aminokiselinska sekvenca je Fc domen ili njegov fragment, i može sadržavati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11. U drugom primeru izvođenja, polipeptid je fuzionisan sa Fc domenom preko linkera, a u još jednom primeru izvođenja, linker sadrži GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:31). Takođe je opisan multimer koji sadrži dva ili više fuzionih polipeptida. Farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovani polipeptid i farmaceutski prihvatlјivo sredstvo za formulisanje, kao što je hidrogel, takođe je opisan. Prema drugom aspektu, obezbeđen je postupak lečenja metaboličkog poremećaja i u jednom primeru izvođenja, obuhvata davanje humanom pacijentu kome je to potrebno, farmaceutske kompozicije koja je ovde obezbeđena. U jednom primeru izvođenja, metabolički poremećaj je dijabetes, a u drugom, metabolički poremećaj je gojaznost. Nukleinske kiseline koje kodiraju izolovani polipeptid su takođe obezbeđene. Nukleinska kiselina može biti prisutna u vektoru, koji sam po sebi može biti prisutan u ćeliji domaćinu. U još jednom primeru izvođenja, polipeptid sadrži: (a) skraćenje na amino-kraju, od ne više od 8 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara; (b) skraćenje na karboksi-kraju, od ne više od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara; ili (c) skraćenje na amino-kraju, od ne više od 8 aminokiselinskih ostataka, i skraćenje na karboksi-kraju, od ne više od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara. U još drugim primerima izvođenja, polipeptid je kovalentno vezan za jedan ili više polimera, kao što je PEG.
[0009] Specifični primeri izvođenja pronalaska postaće očigledni iz detalјnijeg opisa određenih primera izvođenja koji sledi i iz patentnih zahteva.
KRATAK OPIS SLIKA
[0010]
Slike 1A-1B prikazuju rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa FGF21 mutantima sa 7-181 i 8-181 skraćenjima (Slika 1A) i FGF21 mutantima sa 1-172, 1-171, 1-169 i 1-164 skraćenjima (Slika 1B); svaki panel prikazuje rezultate dobijene sa kontrolnim humanim FGF21.
Slika 2 prikazuje rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa kontrolnim humanim FGF21 i FGF21 mutantima sa 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 i 1-149 skraćenjima.
Slika 3 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjen stubić), kontrolni humani FGF21 (neispunjen stubić) ili FGF21 mutanti sa 8-181 (sivi stubić) i 9-181 skraćenjem (šrafirani stubić).
Slika 4 prikazuje procentualne promene u nivoima glukoze u krvi izmerenim kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjeni kružići), kontrolni Fc-FGF21 (WT) (neispunjeni kružići) ili skraćeni Fc-FGF21 fuzioni proteini koji sadrže aminokiselinske ostatke 5-181 (ispunjeni trouglići) ili 7-181 (neispunjeni trouglići).
Slika 5 prikazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi izmerenim kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjeni kružići), kontrolni Fc-FGF21 (WT) (neispunjeni kružići), skraćeni FGF21-Fc fuzioni protein koji sadrži ostatke 1-175 (ispunjeni trouglići) ili skraćeni Fc-FGF21 protein koji sadrži aminokiselinske ostatke 1-171 (neispunjeni trouglići).
Slike 6A-6D prikazuju rezultate analize tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS) humanog Fc-(G5)-FGF21 (SEQ ID NO: 107) kontrolnog uzorka (Slika 6A) i uzoraka Fc-(G5)-FGF21, uzorkovanih iz miševa 6 sati (Uzorak D6; Slika 6B), 24 sata (Uzorak D24; Slika 6C) i 48 sati (Uzorak D48; Slika 6D) nakon injeciranja.
Slike 7A-7D pokazuju rezultate ukoliko LC-MS analiza humanog FGF21-(G3)-Fc (SEQ ID NO: 105) izvedenog iz sisara, kontrolnog uzorka (Slika 7A) i uzoraka FGF21-(G3)-Fc, uzorkovanih iz miševa 6 sati (Uzorak E6; Slika 7B), 24 sata (Uzorak E24; Slika 7C) i 48 sati (Uzorak E48; Slika 7D) nakon injeciranja.
Slike 8A-8D prikazuju rezultate LC-MS analize Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) kontrolnog uzorka (Slika 8A) i uzoraka Fc-(L15)-FGF21, uzorkovanih iz miševa 6 sati (Slika 8B), 24 sata (Slika 8C) i 48 sati (Slika 8D) nakon injeciranja.
Slike 9A-9D prikazuju rezultate LC-MS analize FGF21-(L15)-Fc (SEQ ID NO:41) kontrolnog uzorka (Slika 9A) i uzoraka FGF21-(L15)-Fc, uzorkovanih iz miševa 6 sati (Slika 9B), 24 sata (Slika 9C) i 48 sati (Slika 9D) nakon injeciranja.
Slike 10A-10B prikazuju mesta cepanja identifikovana LC-MS analizom za Fc-(L15)-FGF21 (Slika 10A, SEQ ID NO:49) i FGF21-(L15)-Fc (Slika 10B, SEQ ID NO:41) fuzione proteine injecirane miševima. Slika 11 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjen stubić), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (neispunjen stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (sivi stubić), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (šrafiran stubić), Fc-(L15)-FGF21 S172L (SEQ ID NO:55) (neispunjen, dijagonalno ukršteno šrafiran stubić), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO:59) (ispunjen, horizontalno šrafiran stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 G151A (SEQ ID NO:61) (neispunjen, stepenasto šrafiran stubić).
Slika 12 prikazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjeni kružići), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (neispunjeni kružići) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (ispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (neispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 S172L (SEQ ID NO:55) (ispunjeni rombovi), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO:59) (neispunjeni rombovi) ili Fc-(L15)-FGF21 G151A (SEQ ID NO:61) (ispunjeni kvadratići).
Slika 13 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjen stubić), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (neispunjen stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, 1152V) (sivi stubić), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjen, dijagonalno unakrsno šrafiran stubić), Fc-(L15)-FGF21(G170 E, P171A) (SEQ ID NO:63) (sivo dijagonalno unakrsno šrafiran stubić) ili Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (SEQ ID NO:67) (neispunjen, dijagonalno unakrsno šrafiran stubić).
Slika 14 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjeni kvadratići), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (neispunjeni kvadratići) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21(P150A, G151A, I152V) (SEQ ID NO:65) (ispunjeni obrnuti trouglići), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjeni obrnuti trouglići), Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A) (SEQ ID NO:63) (ispunjeni kružići) ili Fc-(L15)-FGF21(G170E, S172L) (SEQ ID NO:67) (neispunjeni kružići).
Slika 15 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjen stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjen stubić), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69) (sivi stubić), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71) (neispunjen, šrafiran stubić), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO:73) (siv i beli stubić), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO:75) (ispunjen, unakrsno šrafiran stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 G170S (SEQ ID NO:77) (neispunjen, horizontalno šrafiran stubić).
Slika 16 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjeni kružići) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjeni kružići), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69) (ispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71) (neispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO:73) (ispunjeni rombovi), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO:75) (neispunjeni rombovi) ili Fc-(L15)-FGF21 G170S (SEQ ID NO:77) (obrnuti ispunjeni trouglići).
Slika 17 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjen stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjen stubić), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (sivi stubić), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO:81) (ispunjen, šrafiran stubić), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83) (neispunjen šrafiran stubić), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (unakrsno šrafiran stubić) ili Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87) (sivo horizontalno šrafiran stubić).
Slika 18 prikazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (ispunjeni kružići) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjeni kružići), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (ispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO:81) (neispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83) (ispunjeni rombovi), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (neispunjeni rombovi) ili Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87) (ispunjeni kvadratići).
Slike 19A-19D prikazuju rezultate LC-MS analize Fc-(L15)-FGF21 kontrolnog uzorka (Slika 19A, SEQ ID NO:49) i uzoraka uzorkovanih iz miševa u vremenskim tačkama od 6 sati (Slika 19B), 24 sata (Slika 19C) i 48 sati (Slika 19D) nakon injeciranja.
Slike 20A-20D prikazuju rezultate LC-MS analize Fc-(L15)-FGF21 G170E kontrolnog uzorka (Slika 20A, SEQ ID NO:51) i uzoraka Fc-(L15)-FGF21 G170E uzorkovanih iz miševa 6 sati (Slika 20B), 24 sata (Slika 20C) i 48 sati (Slika 20D) nakon injeciranja.
Slike 21A-21D prikazuju rezultate LC-MS analize Fc-(Ll5)-FGF21 P171A kontrolnog uzorka (Slika 21A, SEQ ID NO:53) i uzoraka Fc-(L15)-FGF21 P171A uzorkovanih iz miševa 6 sati (Slika 21B), 24 (Slika 21C) i 48 sati (Slika 21D) nakon injeciranja.
Slike 22A-22D prikazuju rezultate LC-MS analize Fc-(L15)-FGF21 S172L kontrolnog uzorka (Slika 22A, SEQ ID NO:55) i uzoraka Fc-(L15)-FGF21 S172L uzorkovanih iz miševa 6 sati (Slika 22B), 24 sata (Slika 22C) i 48 sati (Slika 22D) nakon injeciranja.
Slike 23A-23D prikazuju mesta cepanja identifikovana LC-MS analizom za Fc-(L15)-FGF21 (Slika 23A, SEQ ID NO:49), Fc-(L15)-FGF21 G170E (Slika 23B, SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 P171A (Slika 23C, SEQ ID NO:53) i Fc-(L15)-FGF21 S172L (Slika 23D, SEQ ID NO:55) fuzione proteine injecirane kod miševa.
Slike 24A-24C pokazuju rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti urađenog sa FGF21 mutantima FGF21 L99R (SEQ ID NO:109), FGF21 L99D (SEQ ID NO:111) i FGF21 A111T (SEQ ID NO:113) (Slika 24A); FGF21 mutantima FGF21 A129D (SEQ ID NO:115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO:117) i FGF21 A134K (SEQ ID NO:119) (Slika 24B); i FGF21 mutantima FGF21 A134Y (SEQ ID NO:121), FGF21 A134E (SEQ ID NO:123) i FGF21 A129K (SEQ ID NO:125) (Slika 24C); svaki panel prikazuje rezultate dobijene za kontrolni humani FGF21.
Slike 25A-25D prikazuju rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa Fc-(L15)-FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 P171G (SEQ ID NO:89), Fc-(L15)-FGF21 P171S (SEQ ID NO:91) i Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (Slika 25A); Fc-(L15)-FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87), Fc-(L15)-FGF21 P171W (SEQ ID NO:93) i Fc-(L15)-FGF21 P171C (SEQ ID NO:95) (Slika 25B); Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) i FGF21 A45K (SEQ ID NO:99) (Slika 25C); i Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) i Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (Slika 25D); svaki panel prikazuje rezultate dobijene za kontrolni humani FGF21.
Slike 26A-B prikazuju agregaciju kao funkciju vremena za zreli FGF21 divlјeg tipa i razne FGF21 mutante; Slika 26A prikazuje promenu procenta agregacije za FGF21 kontrolu (WT, ispunjeni rombovi) i FGF21 A45K (ispunjeni kružići) nakon inkubacije 65 mg/mL proteina na 4°C tokom 1, 2 i 4 dana, dok Slika 26B prikazuje promena procenta agregacije za FGF21 kontrolu (WT) (SEQ ID NO:4) i FGF21 P78C (SEQ ID NO:127), FGF21 P78R (SEQ ID NO:129), FGF21 L86T (SEQ ID NO:131), FGF21 L86C (SEQ ID NO:133), FGF21 L98C (SEQ ID NO:135), FGF21 L98R (SEQ ID NO:137), FGF21 A111T (SEQ ID NO:113), FGF21 A129D (SEQ ID NO:115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO:117), FGF21 A129K (SEQ ID NO:125), FGF21 A134K (SEQ ID NO:119), FGF21 A134Y (SEQ ID NO:121) i FGF21 A134E (SEQ ID NO:123) (sve označeno na grafiku) nakon inkubacije 65 mg/mL proteina na 4°C tokom 1, 6 i 10 dana.
Slika 27 prikazuje rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa humanom FGF21 kontrolom i FGF21 mutantima FGF21 A45K (SEQ ID NO:99), FGF21 L52T (SEQ ID NO:139) i FGF21 L58E (SEQ ID NO:141).
Slika 28A je dijagram koji pokazuje promenu nivoa agregacije za Fc-(L15)-FGF21 mutante Fc-(L15)-FGF21(6-181, G170E) (SEQ ID NO:101) (ispunjeni rombovi), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (neispunjeni kvadratići), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (ispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (krstići), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (neispunjeni trouglići) i FGF21 kontrolu (ispunjeni kružići) nakon inkubacije na 4°C tokom 1, 4 i 8 dana, dok je Slika 28B grafik sa stubićima koji takođe pokazuje rezultate inkubacije.
Slika 29 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS (nosač) (ispunjeni kružići) ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21(A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (neispunjeni kružići), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, P171G) (SEQ ID NO:103) (ispunjeni trouglići) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (neispunjeni trouglići).
Slika 30 je dijagram koji prikazuje rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa humanim FGF21 (ispunjeni kružići, puna linija), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (neispunjeni kružići, puna linija) i Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (ispunjeni trouglići, isprekidana linija).
Slika 31 je dijagram koji prikazuje procenat agregata visoke molekulske težine uočenih nakon devet dana na sobnoj temperaturi (Slika 31A) i na 4°C (Slika 31B) za FGF21 (SEQ ID NO:4) (ispunjeni kružići, puna linija), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) (neispunjeni kružići, puna linija) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (ispunjeni trouglići, isprekidana linija).
Slika 32 je serija zapisa MALDI masene spektrometrije koji pokazuju uočene promene u Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) u različitim tačkama tokom vremenskog perioda od 168 sati. Slika 33 je dijagram koji pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi ob/ob miševa za svaki od: kontrolnog tretmana PBS-om kao nosačem (neispunjeni kružići), tretmana zrelim FGF21 divlјeg tipa (ispunjeni kvadratići) i FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (obrnuti ispunjeni trouglići); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) (SEQ ID NO:143) (neispunjeni rombovi) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (SEQ ID NO:145) (ispunjeni kružići).
Slika 34 je dijagram koji pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi ob/ob miševa za svaki od: kontrolnog tretmana PBS-om kao nosačem (ispunjeni kružići) i tretmana FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (ispunjeni trouglići); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G) (SEQ ID NO:147) (neispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (SEQ ID NO:145) (ispunjeni rombovi) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) (SEQ ID NO:143) (neispunjeni rombovi). Slika 35 je dijagram koji pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi ob/ob miševa za svaki od: kontrolnog tretmana PBS-om kao nosačem (neispunjeni kružići) i i tretmana FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (ispunjeni kvadratići); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179S) (SEQ ID NO:149) (neispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A) (SEQ ID NO:153) (obrnuti ispunjeni trouglići), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180S) (SEQ ID NO:155) (neispunjeni rombovi) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180G) (SEQ ID NO:157) (ispunjeni kružići). Slika 36 je dijagram koji pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi ob/ob miševa za svaki od: kontrolnog tretmana PBS-om kao nosačem (ispunjeni kružići) i tretmana FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (neispunjeni kvadratići); Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F) (SEQ ID NO:151) (ispunjeni trouglići) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) (neispunjeni rombovi).
Slika 37 je dijagram koji grafički prikazuje dizajn studije za šestonedelјnu studiju eskalacije doze koja je urađena na Rhesus majmunima. Na slici, osenčeni simboli označavaju uzrokovanja krvi u stanju gladovanja, dok šrafirani simboli označavaju uzorkovanja krvi u stanju nahranjenosti.
Slike 38A-D su serija dijagrama koji prikazuje kako su Rhesus majmuni nasumično raspodeljeni na osnovu OGTT profila, OGTT AUC i telesne težine; Slika 38A prikazuje bazalne nivoe glukoze u OGTT1, pri čemu ispunjeni kvadratić odgovara grupi A, ispunjeni kružić i puna linija odgovaraju grupi B, a neispunjeni kružić i isprekidana linija odgovaraju grupi C pre raspodele grupa u one koje će primiti jedinjenja ili nosač; Slika 38B prikazuje bazalne nivoe glukoze u OGTT2, pri čemu ispunjeni kvadratić odgovara grupi A, ispunjeni kružić i puna linija odgovaraju grupi B, a neispunjeni kružić i puna linija odgovaraju grupi C pre raspodele grupa u one koje će primiti jedinjenja ili nosač; Slika 38C prikazuje bazalne nivoe glukoze u OGTT1 i OGTT2, prikazane u vidu AUC, pri čemu šrafiran stubić odgovara grupi A, osenčen stubić odgovara grupi B, a neispunjen stubić odgovara grupi C; i Slika 38D prikazuje bazalnu telesnu težinu, pri čemu šrafiran stubić odgovara grupi A, osenčen stubić odgovara grupi B, a neispunjen stubić odgovara grupi C.
Slika 39 je dijagram koji prikazuje procenat promene telesne težine u odnosu na bazalni nivo kod Rhesus majmuna tretiranih nosačem, FGF21 (SEQ ID NO:4) i Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO:43); osenčeni stubići 1 i 2 odgovaraju nedelјama 1 i 2 pri niskoj dozi, neispunjeni stubići 3 i 4 odgovaraju nedelјama 3 i 4 pri srednjoj dozi, ispunjeni stubići 5 i 6 odgovaraju nedelјama 5 i 6 pri visokoj dozi i šrafirani stubići 7, 8 i 9 odgovaraju nedelјama 7-9 tokom perioda „ispiranja”.
Slika 40 je dijagram koji prikazuje procenat promene insulina nakon gladovanja u odnosu na bazalni nivo insulina nakon gladovanja kod Rhesus majmuna tretiranih nosačem, FGF21 (SEQ ID NO:4) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43); osenčeni stubići 1 i 2 odgovaraju nedelјama 1 i 2 pri niskoj dozi, neispunjeni stubići 3 i 4 odgovaraju nedelјama 3 i 4 pri srednjoj dozi, ispunjeni stubići 5 i 6 odgovaraju nedelјama 5 i 6 pri visokoj dozi i šrafirani stubići 7 i 8 odgovaraju nedelјama 7 i 8 tokom perioda „ispiranja”.
Slika 41 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, FGF21 (SEQ ID NO:4) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43), datih u visokoj dozi, na nivoe insulina nakon hranjenja kod Rhesus majmuna koji su stečeni tokom 5. i 6. nedelјe studije; ispunjeni stubići odgovaraju 5. nedelji, a osenčeni stubići odgovaraju 6. nedelji.
Slika 42 je dijagram koji prikazuje profile glukoze iz OGTT5 rađenog na kraju dvonedelјnog tretmana visokim dozama sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43); ispunjen kružić i puna linija odgovaraju nosaču, neispunjen kvadratić i isprekidana linija odgovaraju FGF21, a ispunjen trouglić i puna linija odgovaraju Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43).
Slika 43 je dijagram koji prikazuje insulinske profile iz OGTT5 rađenog na kraju dvonedelјnog tretmana visokim dozama sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43); ispunjen kružić i puna linija odgovaraju nosaču, neispunjen kvadratić i isprekidana linija odgovaraju FGF21, a ispunjen trouglić i puna linija odgovaraju Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43).
Slika 44 je dijagram koji pokazuje procentualne promene u odnosu na bazalni nivo glukoze u OGTT AUC3-5, određene na kraju svakog doznog perioda (niska, srednja i visoka doza) kod Rhesus majmuna; neispunjeni stubići odgovaraju AUC3 izračunatom iz merenja glukoze tokom OGTT3, ispunjeni stubići odgovaraju AUC4 izračunatom iz merenja glukoze tokom OGTT4, a osenčeni stubići odgovaraju AUC5 izračunatom iz merenja glukoze tokom OGTT5.
Slika 45 je grafik koji prikazuje efekte nosača, FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) na procentualne promene u odnosu na bazalni nivo triglicerida u plazmi nakon gladovanja u okviru svake grupe Rhesus majmuna; osenčeni stubići 1 i 2 odgovaraju nedelјama 1 i 2 pri niskoj dozi, neispunjeni stubići 3 i 4 odgovaraju nedelјama 3 i 4 pri srednjoj dozi, ispunjeni stubići 5 i 6 odgovaraju nedelјama 5 i 6 pri visokoj dozi, dok išrafirani stubići 7, 8 i 9 odgovaraju nedelјama 7-9 tokom perioda „ispiranja”.
Slika 46 je grafik koji prikazuje nivoe triglicerida u plazmi hranjenih u okviru svake grupe Rhesus majmuna; što je mereno tokom pete i šeste nedelјe tretmana sa nosačem, FGF21 ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) u visokoj dozi; osenčeni stubići odgovaraju 5. nedelјi, a ispunjeni stubići odgovaraju 6. nedelјi.
Slika 47 je dijagram koji prikazuje nivoe humanog FGF21 kod pojedinačnih majmuna, izmerene pre davanja doze i nakon 5, 12, 19 i 26 dana, u uzorcima dobijenim približno 21 sat nakon svakog injeciranja.
Slika 48 je dijagram koji prikazuje nivoe Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) kod pojedinačnih majmuna, izmerene pre davanja doze i nakon 5, 12, 19 i 26 dana, u uzorcima dobijenim približno 5 dana nakon svakog injeciranja.
Slika 49 je dijagram koji prikazuje srednje koncentracije nivoa FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) izmerene u tri OGTT rađena nakon svake od niskih, srednjih i visokih doza; osenčeni stubići odgovaraju OGTT3 pri niskoj dozi, ispunjeni stubići odgovaraju OGTT4 pri srednjoj dozi i neispunjeni stubići odgovaraju OGTT5 pri visokoj dozi.
Slika 50 je aminokiselinska sekvenca Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fuzionog proteina (SEQ ID NO:47); IgG1 Fc ostaci (SEQ ID NO:11) su označeni podebljanim slovima, (G4S)3 linker (SEQ ID NO:31) je u kurzivu, a tačkaste mutacije u FGF21 sekvenci (SEQ ID NO:39) su podvučene i označene podebljanim slovima.
Slika 51 je dijagram koji prikazuje krivu doze i odgovora za ispitivana jedinjenja u testovima Erk/luciferaze; ispitivani su Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57), FGF21 divlјeg tipa i fuzija Fc sa FGF21 divlјeg tipa.
Slika 52 je dijagram koji prikazuje rezultate testa ravnotežnog vezivanja u Biacore rastvoru za Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P17) (SEQ ID NO:43) sa humanim (desno) i β-Kloto Cynomolgus majmuna (levo).
Slika 53 je par dijagrama koji prikazuju odgovor na dozu za Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) kod db/db miševa nakon jednokratnog injeciranja; Slika 53A prikazuje nivoe glukoze u krvi db/db miševa u raznim vremenskim tačkama nakon injeciranja nosača ili Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E), dok Slika 53B prikazuje efekat Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) na telesnu težinu nakon jednokratnog injeciranja db/db miševima.
Slika 54 je šematski prikaz koji grafički predstavlјa studiju učestalosti davanja doza za Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) DIO miševima.
Slika 55 je dijagram koji prikazuje GTT profile kod miševa tretiranih nosačem, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) pri različitim učestalostima doziranja.
Slika 56 je dijagram koji prikazuje promenu telesne težine u odnosu na bazalni nivo (dan 0) kod miševa tretiranih nosačem, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) pri različitim učestalostima doziranja.
Slika 57 je dijagram koji prikazuje rezultate in vitro studije za hidrogelove koji sadrže FGF21 mutant (L98R, P171G)) (SEQ ID NO:37) FGF21.
Slika 58 je dijagram koji pokazuje efekat na nivo glukoze u krvi db/db miševa starih 8 nedelјa kojima su date doze u raznim formulacijama hidrogelova.
Slika 59 je dijagram koji pokazuje efekat na nivo glukoze u krvi db/db miševa starih 8 nedelјa kojima su date doze u raznim formulacijama hidrogelova.
Slika 60 je dijagram koji pokazuje efekat na nivo glukoze u krvi db/B6 miševa starih 8 nedelјa kojima su date doze u raznim formulacijama hidrogelova; ispunjeni kružići predstavlјaju miševe kojima je dat kontrolni hidrogel, ispunjeni kvadratići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) u hidrogelu od 10 mg/kg, ispunjeni trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) u hidrogelu od 30 mg/kg, a obrnuti trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza sa samo Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57).
Slika 61 je dijagram koji pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi db/B6 miševa starih 8 nedelјa kojima su date doze u raznim formulacijama hidrogelova; ispunjeni kružići predstavlјaju miševe kojima je dat kontrolni hidrogel, ispunjeni kvadratići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) u hidrogelu od 10 mg/kg, ispunjeni trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) u hidrogelu od 30 mg/kg, a obrnuti trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza sa samo Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57).
Slika 62 je dijagram koji pokazuje efekat na telesnu težinu db/B6 miševa starih 8 nedelјa kojima su date doze u raznim formulacijama hidrogelova; ispunjeni kružići predstavlјaju miševe kojima je dat kontrolni hidrogel, ispunjeni kvadratići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) u hidrogelu od 10 mg/kg, ispunjeni trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) u hidrogelu od 30 mg/kg, a obrnuti trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza sa samo Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57).
Slika 63 je dijagram koji pokazuje procentualnu promenu težine db/B6 miševa starih 8 nedelјa kojima su date doze u raznim formulacijama hidrogelova; ispunjeni kružići predstavlјaju miševe kojima je dat kontrolni hidrogel, ispunjeni kvadratići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) u hidrogelu od 10 mg/kg, ispunjeni trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza FGF21 (L98R, P171G) u hidrogelu od 30 mg/kg, a obrnuti trouglići predstavlјaju miševe kojima je data doza sa samo Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57).
Slika 64 je dijagram koji grafički prikazuje dizajn studije za devetnedelјnu studiju eskalacije doze koja je sprovedena u Cynomolgus majmunima sa poremećenom tolerancijom na glukozu (IGT). Slika 65 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na unos hrane prilikom prepodnevnog obroka kod ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 66 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na unos voća kod ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 67 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na unos hrane prilikom popodnevnog obroka kod ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 68 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na telesnu težinu ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 69 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na indeks telesne mase ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 70 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na deblјinu kožnog nabora kod ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 71 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na obim stomaka ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 72 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na nivoe glukoze u plazmi ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 73 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na toleranciju glukoze kod ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 74 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na nivoe triglicerida u plazmi ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 75 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na nivoe ukupnog holesterola u plazmi ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 76 je dijagram koji prikazuje efekte nosača, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) na nivoe HDL holesterola u plazmi ispitivanih IGT Cynomolgus majmuna.
Slika 77 je serija zapisa MALDI masene spektrometrije koji pokazuju uočene promene u Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (levi panel, SEQ ID NO:43) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (desni panel, SEQ ID NO:57) u raznim tačkama tokom vremenskog perioda od 168 sati.
Slika 78 je dijagram koji pokazuje relativnu zastupljenost (%) C-terminalnog peptida pune dužine u odnosu na ukupne fragmente C-terminalnog peptida izvedene iz Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), što je analizirano MRM LC/MS/MS postupkom nakon Asp-N digestije.
Slika 79 je dijagram koji prikazuje rezultate ELISA testa za koncentraciju intaktnog Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) pune dužine (SEQ ID NO:43) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) u plazmi, tokom perioda od 240 sati nakon intravenskog injeciranja kod miševa.
Slika 80 je dijagram koji prikazuje rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa negativnom kontrolom, humanim FGF21 (SEQ ID NO:4) i FGF21 glikozilacionim mutantima FGF21 (Y179N, S181T) (SEQ ID NO:161), FGF21 Y179N (SEQ ID NO: 163) i FGF21 P124S (SEQ ID NO: 165).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0011] Humani FGF21 protein sa pobolјšanim osobinama, kao što su produžen poluživot i/ili smanjena sklonost agregaciji, može biti pripreman upotrebom postupaka koji su ovde opisani i standardnih postupaka molekularne biologije. Izborno, poluživot dalje može biti produžen fuzionisanjem antitela, ili njegovog dela, sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem FGF21 sekvence divlјeg tipa. Moguće je takođe dodatno produžiti poluživot ili smanjiti sklonost agregaciji FGF21 proteina divlјeg tipa uvođenjem aminokiselinskih supstitucija u protein. Takvi modifikovani proteini se ovde navode kao mutanti, ili FGF21 mutanti, i oni su predmet primera izvođenja predmetnog pronalaska.
[0012] Postupci za rekombinantne nukleinske kiseline koji se ovde upotrebljavaju, uključujući postupke navedene u Primerima, generalno su oni koji su navedeni u Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ili Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i saradnici, izd. Green Publishers Inc. i Wiley and Sons 1994),
1. Opšte definicije
[0013] Termin "izolovani molekul nukleinske kiseline" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je ovde obezbeđen i koji (1) je razdvojen od najmanje oko 50 procenata proteina, lipida, uglјenih hidrata ili drugih materijala sa kojima se nalazi u prirodi, kada se ukupna nukleinska kiselina izoluje iz ćelija koje su izvor, (2) nije vezan za sve ili deo polinukleotida sa kojim je „izolovani molekul nukleinske kiseline“ povezan u prirodi, (3) operativno je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili (4) se ne javlјa u prirodi kao deo veće polinukleotidne sekvence. Poželјno, izolovani molekul nukleinske kiseline je suštinski oslobođen od bilo kojih drugih kontaminirajućih molekula nukleinske kiseline ili drugih kontaminanata koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju, a koji bi ometali njegovu upotrebu u proizvodnji polipeptida ili njegovu terapijsku, dijagnostičku, profilaktičku ili upotrebu u istraživanju.
[0014] Termin "vektor" upotrebljava se tako da se odnosi na bilo koji molekul (npr. nukleinsku kiselinu, plazmid ili virus) koji se upotrebljava za prenos kodirajućih informacija u ćeliju domaćina.
[0015] Termin "ekspresioni vektor" odnosi se na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i sadrži sekvence nukleinskih kiselina koje usmeravaju i/ili kontrolišu ekspresiju insertovanih heterolognih sekvenci nukleinskih kiselina. Ekspresija uklјučuje, ali nije ograničena na, procese kao što su transkripcija, translacija i obrada RNK, ukoliko su prisutni introni.
[0016] Termin "operativno povezan" se ovde upotrebljava tako da se odnosi na raspored bočnih sekvenci, pri čemu su tako opisane bočne sekvence konfigurisane ili sastavlјene tako da obavlјaju njihovu uobičajenu funkciju. Prema tome, bočna sekvenca koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom može biti sposobna da utiče na replikaciju, transkripciju i/ili translaciju kodirajuće sekvence. Na primer, kodirajuća sekvenca je operativno povezana sa promotorom kada je promotor sposoban da usmerava transkripciju te kodirajuće sekvence. Bočna sekvenca ne mora biti u nizu sa kodirajućom sekvencom, sve dok ispravno funkcioniše. Tako, na primer, intervenišuće netraslatirane, ali traskribovane sekvence mogu biti prisutne između promotorske sekvence i kodirajuće sekvence, a promotorska sekvenca se i dalјe može smatrati "operativno povezanom" sa kodirajućom sekvencom.
[0017] Termin "ćelija domaćin" upotrebljava se tako da se odnosi na ćeliju koja je bila transformisana, ili je sposobna da bude transformisana sa sekvencom nukleinske kiseline, kao što je nukleinska kiselina koja je ovde obezbeđena, a zatim i da eksprimira izabrani gen od interesa. Termin uklјučuje i potomstvo roditelјske ćelije, bez obzira da li potomstvo jeste ili nije identično sa originalnim roditelјem po morfologiji ili genetičkom sastavu, sve dok je izabrani gen prisutan.
[0018] Termin "izolovani polipeptid" odnosi se na polipeptid koji je ovde obezbeđen koji (1) razdvojen je od najmanje oko 50 procenata polinukleotida, lipida, uglјenih hidrata ili drugih materijala sa kojima se nalazi u prirodi, kada je izolovan iz ćelije izvora, (2) nije vezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) za ceo ili deo polipeptida sa kojim je „izolovani polipeptid“ vezan u prirodi, (3) operativno je vezan (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom za koji nije vezan u prirodi, ili (4) ne javlјa se u prirodi. Poželјno, izolovani polipeptid je suštinski oslobođen od bilo kojih drugih kontaminirajućih polipeptida ili drugih kontaminanata koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju, koji bi ometali njegovu terapijsku, dijagnostičku, profilaktičku ili upotrebu u istraživanju.
[0019] Termin "javlja se u prirodi" kada se upotrebljava u vezi sa biološkim materijalima kao što su molekuli nukleinskih kiselina, polipeptidi, ćelije domaćini i slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi i kojima čovek ne manipuliše. Slično, "koji se ne javlja u prirodi", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na materijal koji se ne nalazi u prirodi ili koji je strukturno modifikovan ili sintetisan od strane čoveka. Kada se upotrebljava u vezi sa nukleotidima, termin "javlja se u prirodi" odnosi se na baze adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T) i uracil (U). Kada se upotrebljava u vezi sa aminokiselinama, termin „javlja se u prirodi” odnosi se na 20 aminokiselina: alanin (A), cistein (C), asparaginsku kiselinu (D), glutaminsku kiselinu (E), fenilalanin (F), glicin (G), histidin (H), izoleucin (I), lizin (K), leucin (L), metionin (M), asparagin (N), prolin (P), glutamin (Q), arginin (R), serin (S), treonin (T), valin (V), triptofan (W) i tirozin (Y).
[0020] Termin "FGF21 polipeptid" odnosi se na polipeptid divlјeg tipa koji se javlja u prirodi i eksprimiran je kod lјudi. Za potrebe ovog opisa, termin "FGF21 polipeptid" može biti upotrebljavan naizmenično, da bi se označio bilo koji FGF21 polipeptid pune dužine, npr. SEQ ID NO:2 i 6, koji se sastoje od 209 aminokiselinskih ostataka i koji su kodirani nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 1 i 5, tim redom; bilo koji zreli oblik polipeptida, npr. SEQ ID NO:4 i 8, koji se sastoji od 181 aminokiselinskog ostatka i koji su kodirani nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO:3 i 7, tim redom, a u kojima je uklonjeno 28 aminokiselinskih ostataka na amino-terminalnom kraju FGF21 polipeptida pune dužine (tj. koji čine signalni peptid). Zreli FGF21 polipeptidi pune dužine mogu, ali ne moraju, sadržavati amino-terminalni metionin, koji može biti uveden genetičkim inženjeringom ili biti rezultat procesa ekspresije u bakterijama.
[0021] Termini "FGF21 polipeptidni mutant" i "FGF21 mutant" mogu biti upotrebljavani naizmenično i odnose se na FGF21 polipeptid u kome je modifikovana aminokiselinska sekvenca FGF21 koja se javlja u prirodi (npr. SEQ ID NO:2, 4, 6 ili 8). Takve modifikacije uklјučuju, ali nisu ograničene na, jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, uklјučujući supstitucije sa aminokiselinama koje se ne javljaju u prirodi i analozima aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi, kao i skraćivanja. Prema tome, FGF21 polipeptidni mutantni uklјučuju, ali nisu ograničeni na, FGF21 mutante sa mutacijama usmerenim na mesto, skraćene FGF21 polipeptide, FGF21 mutante rezistentne na proteolizu, FGF21 mutante sa smanjenom sklonošću agregaciji, kombinovane FGF21 mutante i FGF21 fuzione proteine, kao što je ovde opisano. U svrhu identifikacije specifičnih skraćenja i aminokiselinskih supstitucija FGF21 mutanata predmetnog pronalaska, numerisanje aminokiselinskih ostataka skraćenih ili mutiranih oblika odgovara onom za zreli FGF21 polipeptid sa 181 ostatkom. FGF21 mutanti mogu, ali ne moraju, sadržavati amino-terminalni metionin, koji može biti uveden genetičkim inženjeringom ili biti rezultat procesa ekspresije u bakterijama. U drugim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 polipeptidni mutant sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85 procenata identična aminokiselinskoj sekvenci FGF21 mutanta, ali pri čemu specifični ostaci koji obezbeđuju želјenu osobinu FGF21 polipeptidnom mutantu, npr. osobine rezistencije na proteolizu, produženje poluživota ili smanjenje sklonosti agregaciji i njihove kombinacije, nisu dalјe modifikovani. Drugim rečima, sa izuzetkom ostataka u sekvenci FGF21 mutanta koji su modifikovani da bi se obezbedila rezistencija na proteolizu, smanjenje sklonosti agregaciji ili druge osobine, oko 15 procenata svih ostalih aminokiselinskih ostataka u sekvenci FGF21 mutanta može biti modifikovano. Na primer, u FGF21 mutantu Q173E, do 15 procenata svih aminokiselinskih ostataka drugačijih od ostatka glutaminske kiseline, koji je supstituisan glutaminom na poziciji 173, može biti modifikovano. U još drugim primerima izvođenja, FGF21 polipeptidni mutant sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90 procenata, ili oko 95, 96, 97, 98 ili 99 procenata identična aminokiselinskoj sekvenci FGF21 mutanta, ali gde specifični ostaci koji obezbeđuju osobine rezistencije na proteolizu ili smanjenje sklonosti agregaciji FGF21 polipeptidnog mutanta nisu dalјe modifikovani. Takvi FGF21 polipeptidni mutanti poseduju najmanje jednu aktivnost FGF21 polipeptida divlјeg tipa.
[0022] Predmetni pronalazak takođe obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira FGF21 polipeptidnog mutanta koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 85 procenata identična aminokiselinskoj sekvenci FGF21 mutanta, ali pri čemu specifični ostaci koji obezbeđuju poželјnu osobinu FGF21 polipeptidnom mutantu, npr. osobine rezistencije na proteolizu, produžen poluživot ili smanjenje sklonosti agregaciji i njihove kombinacije, nisu dalјe modifikovani.
[0023] Drugim rečima, sa izuzetkom ostataka u skevenci FGF21 mutanta koji su modifikovani da bi se obezbedila rezistencija na proteolizu, smanjenje sklonosti agregaciji ili druge osobine, oko 15 procenata svih ostalih aminokiselinskih ostataka u sekvenci FGF21 mutanta može biti modifikovano. Na primer, u FGF21 mutantu Q173E, do 15 procenata svih aminokiselinskih ostataka drugačijih od ostatka glutaminske kiseline, koji je supstituisan glutaminom na poziciji 173, može biti modifikovano. Predmetni pronalazak dalјe obuhvata molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 90 procenata, ili oko 95, 96, 97, 98 ili 99 procenata identična nukleotidnoj sekvenci koja kodira FGF21 mutant, ali gde nukleotidi koji kodiraju aminokiselinske ostatke koji obezbeđuju kodiranom FGF21 polipeptidnom mutantu osobene rezistencije na proteolizu ili smanjenje sklonosti agregaciji, nisu dalјe modifikovani. Takvi molekuli nukleinske kiseline kodiraju FGF21 mutantne polipeptide koji poseduju najmanje jednu aktivnost FGF21 polipeptida divlјeg tipa.
[0024] Izraz "biološki aktivan FGF21 polipeptidni mutant" odnosi se na bilo koji FGF21 polipeptidni mutant koji je ovde opisan i koji poseduje aktivnost FGF21 polipeptida divlјeg tipa, kao što je sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida ili holesterola u krvi; smanjenje telesne težine; i pobolјšanja tolerancije na glukozu, potrošnje energije ili osetlјivosti na insulin, bez obzira na tip ili broj modifikacija koje su uvedene u FGF21 polipeptidnog mutanta. FGF21 polipeptidni mutanti koji poseduju donekle smanjen nivo FGF21 aktivnosti u odnosu na FGF21 polipeptid divlјeg tipa, mogu se ipak smatrati biološki aktivnim FGF21 polipeptidnim mutantima.
[0025] Svaki od termina "efektivna količina" i "terapijski efektivna količina" odnosi se na količinu FGF21 polipeptidnog mutanta koja se upotrebljava da se podrži uočljiv nivo jedne ili više bioloških aktivnosti FGF21 polipeptida divlјeg tipa, kao što su sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida ili holesterola u krvi; smanjenje telesne težine; ili pobolјšanje tolerancije na glukozu, potrošnje energije ili osetlјivosti na insulin.
[0026] Termin "farmaceutski prihvatlјiv nosač" ili "fiziološki prihvatlјiv nosač", kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili više agenasa za formulisanje koji su pogodni za postizanje ili pobolјšavanje isporuke FGF21 polipeptidnog mutanta u telo čoveka ili subjekta koji nije čovek. Termin uklјučuje bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično, a koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatlјivih nosača uklјučuju jedno ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom, dekstroze, glicerola, etanola i sličnog, kao i njihove kombinacije. U pojedinim slučajevima, biće poželјno uklјučiti u farmaceutsku kompoziciju izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Farmaceutski prihvatlјive supstance kao što su sredstva za vlaženje ili manje količine pomoćnih supstanci poput sredstava za vlaženje ili emulgovanje, konzervanasa ili pufera, koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost FGF21 polipeptidnog mutanta, takođe mogu delovati kao, ili obrazovati komponentu nosača.
[0027] Termin "antigen" odnosi se na molekul ili deo molekula koji je sposoban da bude vezan antitelom, a dodatno i koji je sposoban da se upotrebljava kod životinje za proizvodnju antitela sposobnih da se vezuju za epitop tog antigena. Antigen može imati jedan ili više epitopa.
[0028] Termin "nativni Fc" odnosi se na molekul ili sekvencu koja sadrži sekvencu fragmenta koja se ne vezuje za antigen i rezultat je digestije celokupnog antitela, ili je proizvedena na drugi način, bilo u monomernom ili multimernom obliku, a koji može sadržavati zglobni region. Originalni imunoglobulinski izvor nativnog Fc je poželјno, ali ne nužno, humanog porekla i može biti bilo koji od imunoglobulina, iako su IgG1 i IgG2 poželјni. IgG4 se takođe može koristiti. Nativni Fc molekuli se sastoje od monomernih polipeptida koji mogu biti povezani u dimerne ili multimerne oblike kovalentnim (tj. disulfidnim vezama) i nekovalentnim udruživanjima. Broj međumolekularnih disulfidnih veza između monomernih subjedinica nativnih Fc molekula opsega je od 1 do 4, u zavisnosti od klase (npr. IgG, IgA i IgE) ili subklase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgGA2). Jedan primer nativnog Fc je disulfidno vezan dimer koji je rezultat digestije IgG proteina papainom (pogledati Ellison i saradnici, 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). Termin "nativni Fc", kako se ovde upotrebljava, generički je za monomerne, dimerne i multimerne oblike. Primer Fc polipeptidne sekvence je predstavlјen u SEQ ID NO:11, koja je izvedena iz humanog IgG1 molekula. Nativni Fc može, ali ne mora, sadržavati amino-terminalni metionin, koji može biti uveden genetičkim inženjeringom ili biti rezultat procesa ekspresije u bakterijama; takvi Fc molekuli se i dalјe smatraju "nativnim Fc" molekulima.
[0029] Termin "Fc varijanta" odnosi se na molekul ili sekvencu koja je modifikovana iz nativnog Fc, ali još uvek sadrži mesto vezivanja za receptor „spasavanja”, FcRn (neonatalni Fc receptor). Međunarodne objave br. WO 97/34631 i WO 96/32478 opisuju Fc primere izvođenja za primer, kao i interakcije sa receptorima „spasavanja”. Prema tome, termin "Fc varijanta" može sadržavati molekul ili sekvencu koja je humanizovana iz nativnog Fc koji nije humanog porekla. Štaviše, nativni Fc obuhvata regione koji mogu biti uklonjeni pošto obezbeđuju strukturne karakteristike ili biološku aktivnost koja nije potrebna za fuzione molekule FGF21 mutanata predmetnog pronalaska. Dakle, termin "Fc varijanta" obuhvata molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedno ili više od nativnih Fc mesta ili ostataka, ili u kojima je modifikovano jedno ili više Fc mesta ili ostataka, a koji utiču ili su uklјučeni u: (1) obrazovanje disulfidnih veza, (2) nekompatibilnost sa izabranom ćelijom domaćinom, (3) heterogenost N-kraja nakon ekspresije u izabranoj ćeliji domaćinu, (4) glikozilaciju, (5) interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor drugačiji od receptora „spasavanja” ili (7) ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Fc primere izvođenja su dalje detalјnije opisane u nastavku teskta. Fc varijanta može, ali ne mora, sadržavati amino-terminalni metionin, koji može biti uveden genetičkim inženjeringom ili biti rezultat procesa ekspresije u bakterijama; takvi Fc molekuli se i dalјe smatraju „Fc varijantama“.
[0030] Termin "Fc domen" obuhvata nativne Fc i Fc primere izvođenja i sekvence, kao što je prethodno definisano. Kao i kod Fc varijanti i nativnih Fc molekula, termin "Fc domen" uklјučuje molekule u monomernom ili multimernom obliku, bilo da su nastali digestijom iz celokupnog antitela ili da su proizvedeni na drugi način. U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, Fc domen može biti fuzionisan sa FGF21 ili FGF21 mutantom (uklјučujući skraćeni oblik FGF21 ili FGF21 mutanta) preko, na primer, kovalentne veze između Fc domena i FGF21 sekvence. Takvi fuzioni proteini mogu obrazovati multimere preko udruživanja Fc domena i oba ova fuziona proteina i njihovi multimeri su takođe predmet ovog pronalaska. Fc domen može, ali ne mora, sadržavati amino-terminalni metionin, koji može biti uveden genetičkim inženjeringom ili biti rezultat procesa ekspresije u bakterijama.
2. FGF21 mutanti
[0031] Termin "FGF21 mutant" odnosi se na FGF21 mutantni polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja se u jednoj ili više aminokiselina razlikuje od aminokiselinske sekvence FGF21 polipeptidne sekvence koja se javlјa u prirodi, npr. SEQ ID NO:2, 4, 6 ili 8. FGF21 mutanti mogu biti generisani uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, bilo konzervativnih ili nekonzervativnih, kao i upotrebom aminokiselina koje se javljaju ili ne javljaju u prirodi, na određenim pozicijama FGF21 polipeptida.
[0032] "Konzervativna aminokiselinskih supstitucija" može uklјučivati supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka (tj. ostatka koji se nalazi na datoj pozicije polipeptidne sekvence FGF21 divlјeg tipa) sa nenativnim ostatkom (tj. ostatkom koji se ne nalazi na datoj poziciji polipeptidne sekvence FGF21 divlјeg tipa) tako da postoji mali ili nikakav efekat na polarnost ili naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na toj poziciji. Konzervativne aminokiselinske supstitucije takođe obuhvataju aminokiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi i koji se obično ugrađuju hemijskom sintezom peptida, a ne sintezom u biološkim sistemima. Navedeno uklјučuje peptidomimetike i druge revertovane ili invertovane oblike aminokiselinskih ostataka.
[0033] Ostaci koji se javljaju u prirodi mogu biti podeljeni u klase na osnovu uobičajenih osobina bočnih lanaca:
(1) hidrofobni: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr;
(3) kiseli: Asp, Glu;
(4) bazni: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i
(6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.
[0034] Konzervativne supstitucije mogu uklјučivati izmenu člana jedne od ovih klasa sa drugim članom iste klase. Nekonzervativne supstitucije mogu uklјučivati izmenu člana jedne od ovih klasa sa članom iz druge klase.
[0035] Poželjne aminokiselinske supstitucije (bilo konzervativne ili nekonzervativne) mogu biti utvrđene od strane stručnjaka iz oblasti tehnike u trentuku kada su takve supstitucije poželјne. Lista aminokiselinskih supstitucija za primer (ali ne i ograničavajuća) navedena je u Tabeli 1.
Tabela 1
3. Skraćeni FGF21 polipeptidi
[0036] Jedan primer izvođenja predmetog pronalaska je usmeren na skraćene oblike zrelog FGF21 polipeptida ili FGF21 mutanta. Ovaj primer izvođenja predmetog pronalaska je nastao iz nastojanja da se identifikuju skraćeni FGF21 polipeptidi koji su sposobni da obezbede aktivnost koja je slična, a u pojedinim slučajevima i superiornija, u odnosu na neskraćene oblike zrelog FGF21 polipeptida.
[0037] Kao što se ovde upotrebljava, termin „skraćeni FGF21 polipeptid“ odnosi se na FGF21 polipeptid u kome su aminokiselinski ostaci uklonjeni sa amino-terminalnog (ili N-terminalnog) kraja FGF21 polipeptida, aminokiselinski ostaci su uklonjeni sa karboksi-terminalnog (ili C-terminalnog) kraja FGF21 polipeptida ili su aminokiselinski ostaci uklonjeni i sa amino-terminalnog i karboksilterminalnog kraja FGF21 polipeptida. Razna skraćenja koja su ovde opisana pripremana su kao što je ovde opisano u Primerima 3 i 6.
[0038] Aktivnost N-terminalno skraćenih FGF21 polipeptida i C-terminalno skraćenih FGF21 polipeptida može biti ispitana upotrebom in vitro ELK-luciferaznog testa, kao što je opisano u Primeru 4. Specifični detalјi o in vitro testovima koji mogu biti upotrebljeni za ispitivanje aktivnosti skraćenih FGF21 polipeptida mogu se pronaći u Primeru 4.
[0039] Aktivnost skraćenih FGF21 polipeptida predmetog pronalaska takođe može biti procenjivana u in vivo testu, kao kod db/db miševa ili ob/ob miševa, kao što je pokazano u Primerima 5 i 7. U principu, da bi se ispitala in vivo aktivnost skraćenog FGF21 polipeptida, skraćeni FGF21 polipeptid može biti davan ispitivanoj životinji intraperitonealno. Nakon želјenog perioda inkubacije (npr. jednog sata ili više), mogu se uzorkovati krv i izmeriti nivoi glukoze u krvi. Specifični detalјi o in vivo testovima koji mogu biti upotrebljeni za ispitivanje aktivnosti skraćenih FGF21 polipeptida mogu se pronaći u Primerima 5 i 7.
a. Skraćenja na N-kraju
[0040] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, skraćenja N-kraja obuhvataju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih ostataka sa N-terminalnog kraja zrelog FGF21 polipeptida ili FGF21 mutanta. Kao što je pokazano u, na primer, Primeru 5 i na Slici 3, skraćeni FGF21 polipeptidi sa skraćenjima N-kraja koja su manja od 9 aminokiselinskih ostataka, zadržavaju sposobnost zrelog FGF21 polipeptida da snižava glukozu u krvi kod pojedinca. Shodno tome, u posebnim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata skraćene oblike zrelog FGF21 polipeptida ili FGF21 polipeptidnih mutanata koji imaju skraćenja na N-kraju od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih ostataka.
b. Skraćenja na C-kraju
[0041] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, skraćenja C-kraja obuhvataju 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka sa C-terminalnog kraja zrelog FGF21 polipeptida. Kao što je pokazano u, na primer, Primeru 4 i na Slici 1B, skraćeni FGF21 polipeptidi sa skraćenjima C-kraja koja su manja od 13 aminokiselinskih ostataka, ispoljili su efikasnost od najmanje 50% u odnosu na efikasnost FGF21 divlјeg tipa u in vitro ELK-luciferaznom testu, što ukazuje da ovi FGF21 mutanti zadržavaju sposobnost zrelog FGF21 polipeptida da snižava glukozu u krvi kod pojedinca. Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata skraćene oblike zrelih FGF21 polipeptida ili FGF21 polipeptidnih mutanata koji imaju skraćenje C-kraja od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka.
c. Skraćenja na N-kraju i C-kraju
[0042] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, skraćeni FGF21 polipeptidi mogu imati kombinaciju skraćenja N-kraja i C-kraja. Skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju kombinaciju skraćenja N-kraja i C-kraja dele aktivnost odgovarajućih skraćenih FGF21 polipeptida koji imaju bilo samo N-terminalna ili C-terminalna skraćenja. Drugim rečima, skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju i skraćenja N-kraja manja od 9 aminokiselinskih ostataka i skraćenja C-kraja manja od 13 aminokiselinskih ostataka, poseduju sličnu ili veću biološku aktivnost, npr. aktivnost snižavanja glukoze u krvi, poput skraćenih FGF21 polipeptida koji imaju skraćenje N-kraja manje od 9 aminokiselinskih ostataka ili skraćenih FGF21 polipeptida koji imaju skraćenje C-kraja manje od 13 aminokiselinskih ostataka. Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata skraćene oblike zrelog FGF21 polipeptida ili FGF21 polipeptidnih mutanata koji imaju i skraćenje N-kraja od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih ostataka i skraćenje C-kraja od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka.
[0043] Kao i kod svih FGF21 mutanata predmetnog pronalaska, skraćeni FGF21 polipeptidi i FGF21 mutanti mogu izborno sadržavati amino-terminalni metioninski ostatak, koji može biti uveden usmerenom mutacijom ili biti rezultat procesa ekspresije u bakterijama.
[0044] Skraćeni FGF21 polipeptidi predmetog pronalaska mogu biti pripremljeni kao što je opisano u Primerima 3 i 6. Prosečno iskusni stručnjaci iz oblasti tehnike, na primer, oni koji su upoznati sa standardnim tehnikama molekularne biologije, mogu iskoristiti to znanje, zajedno sa predmetnim opisom, da naprave i upotrebe skraćene FGF21 polipeptide predmetnog pronalaska. Za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu tkiva i transformaciju (npr. elektroporaciju, lipofekciju) mogu biti upotrebljene standardne tehnike. Pogledati, npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, navedeno iznad, Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu biti izvedene u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u oblasti tehnike, ili kao što je ovde opisano. Ukoliko nisu date posebne definicije, nomenklature koje se koriste u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane, one su koje su dobro poznate i koje se obično upotrebljavaju u oblasti tehnike. Mogu stoga biti upotrebljene standardne tehnike za hemijske sinteze; hemijske analize; farmaceutsku pripremu, formulisanje i isporuku; i lečenje pacijenata.
[0045] Skraćeni FGF21 polipeptidi predmetog pronalaska takođe mogu biti fuzionisani sa drugim entitetom, koji može doprineti nastanku dodatnih osobina skraćenog FGF21 polipeptida. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, skraćeni FGF21 polipeptid može biti fuzionisan sa Fc sekvencom. Takva fuzija može biti ostvarena upotrebom poznatih postupaka molekularne biologije i/ili smernica koje su ovde obezbeđene. Prednosti takvih fuzionih polipeptida, kao i postupaka za pravlјenje takvih fuzionih polipeptida, detalјnije su ovde razmotrene u nastavku teksta.
4, FGF21 mutanti rezistentni na proteolizu
[0046] Kao što je opisano u Primeru 8, pronađeno je da zreli FGF21 podleže in vivo degradaciji, za koju je konačno utvrđeno da nastaje usled proteolitičkog napada. Utvrđeno je i da in vivo degradacija zrelog FGF21 dovodi do kraćeg efektivnog poluživota, što može negativno uticati na terapijski potencijal molekula. Shodno tome, sprovedena je usmerena studija da bi se identifikovali FGF21 mutante koji ispoljavaju rezistenciju na proteolizu. Kao rezultat ovog istraživanja, definisana su mesta u zrelom FGF21 polipeptidu za koje je utvrđeno da su posebno osetlјiva na proteolizu, a koja uklјučuju peptidnu vezu između aminokiselinskih ostataka na pozicijama 4-5, 20-21, 151-152, 171-172 i 178-181.
[0047] Izvršena je zatim i široka, ali fokusirana i usmerena studija, da bi se identifikovale određene supstitucije koje eliminišu uočeni proteolitički efekat, pritom ne utičući na aktivnost proteina u neprihvatlјivom stepenu. Tabele 8 i 11 ističu pojedine od mutanata koji su pripremani i ispitivani. Kao što je opisano u, na primer, Primerima 13 i 14, nisu svi FGF21 mutanti pokazali idealan profil; pojedini mutanti su obezbedili rezistenciju na proteolizu, ali po cenu narušene aktivnosti FGF21. Druge mutacije su zadržale aktivnost FGF21, ali nisu obezbedile rezistenciju na proteolizu. Nekoliko mutanata, uklјučujući, na primer, FGF21 P171G, zadržalo je sličan nivo aktivnosti kao FGF21 divlјeg tipa, ispoljavajući ipak i rezistenciju na proteolitičku degradaciju.
[0048] Jedan kriterijum selekcije za identifikaciju poželјnih mutanata FGF21 koji su rezistentni na proteolizu bio je da aktivnost FGF21 mutanta bude suštinski ista kao, ili veća od, aktivnosti FGF21 divlјeg tipa. Prema tome, drugi primer izvođenja predmetog pronalaska je usmeren na FGF21 mutante koji su rezistentni na proteolizu i još uvek zadržavaju aktivnost koja je suštinski ista kao, ili veća od FGF21 divlјeg tipa. Iako su manje poželјni u pojedinim slučajevima, FGF21 mutanti koji su rezistentni na proteolizu, ali ispoljava donekle smanjenu aktivnost, čine drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska. U pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se održi određeni stepen proteolize i, posledično, FGF21 mutanti koji omogućavaju da se desi određen stepen proteolize takođe čine još jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0049] Kao i kod svih FGF21 mutanata koji su ovde obezbeđeni, FGF21 mutanti rezistentni na proteolizu predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni kao što je ovde opisano. Prosečno iskusni stručnjaci iz oblasti tehnike, na primer, oni koji su upoznati sa standardnim tehnikama molekularne biologije, mogu iskoristiti to znanje, zajedno sa predmetnim opisom, da naprave i upotrebe FGF21 mutante rezistentne na proteolizu koji su ovde opisani. Za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu tkiva i transformaciju (npr. elektroporaciju, lipofekciju) mogu biti upotrebljene standardne tehnike. Pogledati, npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, navedeno iznad,. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu biti izvedene u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u oblasti tehnike, ili kao što je ovde opisano. Ukoliko nisu date posebne definicije, nomenklature koje se koriste u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane, one su koje su dobro poznate i koje se obično upotrebljavaju u oblasti tehnike. Mogu stoga biti upotrebljene standardne tehnike za hemijske sinteze; hemijske analize; farmaceutsku pripremu, formulisanje i isporuku; i lečenje pacijenata.
[0050] FGF21 mutanti koji su rezistentni na proteolizu predmetnog pronalaska, mogu biti fuzionisani sa drugim entitetom, koji može obezbediti dodatne osobine FGF21 mutantu koji je rezistentan na proteolizu. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 mutant rezistentan na proteolizu može biti fuzionisan sa IgG Fc sekvencom, npr. SEQ ID NO:11. Takva fuzija može biti ostvarena upotrebom poznatih molekularno bioloških postupaka i/ili smernica koje su ovde obezbeđene. Prednosti takvih fuzionih polipeptida, kao i postupaka za pravlјenje takvih fuzionih polipeptida, poznate su i detalјnije su ovde razmotrene u nastavku teksta.
5. FGF21 mutanti sa smanjenom sklonošću agregaciji
[0051] Kao što je opisano u Primeru 15, jedna od osobina FGF21 polipeptida divlјeg tipa je njegova sklonost agregaciji. Pri koncentracijama preko oko 5 mg/mL, stopa agregacije je visoka na sobnoj temperaturi. Kao što je prikazano i opisano ovde, stopa agregacije za FGF21 polipeptid divlјeg tipa zavisi i od koncentracije i od temperature.
[0052] Agregacija se može pokazati kao izazov kada se radi sa FGF21 divlјeg tipa u ovim koncentracijama, kao što je to u pripremi terapijske formulacije. U skladu sa navedenim, sprovedena je usmerena studija da bi se identifikovali FGF21 mutanti koji ispoljavaju smanjenu sklonost agregaciji FGF21. Dobijeni FGF21 mutanti su zatim ispitivani u kontekstu sklonosti ka agregaciji u različitim koncentracijama.
[0053] Urađena je zatim široka, ali fokusirana i usmerena studija, da bi se identifikovale određene supstitucije koje eliminišu ili smanjuju uočeni efekat agregacije FGF21 divlјeg tipa, ne utičući pritom na aktivnost proteina u neprihvatlјivom stepenu. Pristup za identifikaciju pogodnih mutanata sa smanjenom sklonošću agregaciji je opisan u Primeru 15. Tabela 16 naglašava pojedine od mutanata koji su bili pripremlјeni i ispitivani. Kao što je opisano u, na primer, Primeru 17, nisu svi FGF21 mutanti pokazali idealan profil. Pojedini mutanti, kao što je FGF21 L58E, ispoljili su narušenu aktivnost FGF21 i nisu dalјe proučavani. Druge mutacije, kao što je FGF21 A134E, zadržale su aktivnost FGF21, ali nisu obezbedile osobine smanjenjenja agregacije. Nekoliko mutanata, kao što je FGF21 L98R, zadržalo je aktivnost FGF21 i takođe je pokazale smanjenje sklonosti ka agregaciji. Jedan mutant, FGF21 A45K, iznenađujuće je ispoljio povećanu aktivnost FGF21 uz istovremeno ispoljavanje osobine smanjenja sklonosti agregaciji.
[0054] Jedan od kriterijuma selekcije za identifikaciju poželјnih mutanata FGF21 sa smanjenom sklonošću agregaciji bio je da aktivnost FGF21 mutanta bude suštinski slična, ili veća od, aktivnosti FGF21 divlјeg tipa. Prema tome, drugi primer izvođenja predmetog pronalaska je usmeren na FGF21 mutante koji imaju osobine smanjenja sklonosti agregaciji, uz zadržavanje aktivnost FGF21 koja je slična ili veća od FGF21 divlјeg tipa. Iako su manje poželјni u pojedinim slučajevima, FGF21 mutanti koji imaju osobine smanjenja sklonosti agregaciji, ali ispoljavaju i donekle smanjenu aktivnost FGF21, čine drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska. U pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se održi stepen agregacije, i posledično, FGF21 mutanti koji dozvolјavaju da se desi određeni stepen agregacije takođe čine drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0055] Kao i kod svih FGF21 mutanata koji su ovde obezbeđeni, FGF21 mutanti koji redukuju sklonost agregaciji koji su ovde obezbeđeni, mogu biti pripremljeni kao što je ovde opisano. Prosečno iskusni stručnjaci iz oblasti tehnike, upoznati sa standardnim tehnikama molekularne biologije, mogu iskoristiti to znanje, zajedno sa predmetnim opisom, da naprave i upotrebe FGF21 mutante sa smanjenom sklonošću agregaciji predmetnog pronalaska. Za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu tkiva i transformaciju (npr. elektroporaciju, lipofekciju) mogu biti upotrebljene standardne tehnike. Pogledati, npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, navedeno iznad, Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu biti izvedene u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u oblasti tehnike, ili kao što je ovde opisano. Ukoliko nisu date posebne definicije, nomenklature koje se koriste u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane, one su koje su dobro poznate i koje se obično upotrebljavaju u oblasti tehnike. Mogu stoga biti upotrebljene standardne tehnike za hemijske sinteze; hemijske analize; farmaceutsku pripremu, formulisanje i isporuku; i lečenje pacijenata.
[0056] FGF21 mutanti sa smanjenom sklonošću agregaciji predmetnog pronalaska mogu biti fuzionisani sa drugim entitetom, koji može obezbediti dodatne osobine FGF21 mutantu u pogledu smanjenja sklonosti agregaciji. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 mutant koji sa smanjenom sklonošću agregaciji može biti fuzionisan sa IgG Fc sekvencom, npr. SEQ ID NO:11. Takva fuzija se može postići upotrebom poznatih molekularno bioloških postupaka i/ili smernica koje su ovde obezbeđene. Prednosti takvih fuzionih polipeptida, kao i postupaka za pravlјenje takvih fuzionih polipeptida, detalјnije su ovde razmotrene u nastavku teksta.
6. Kombinovani FGF21 mutanti
[0057] Kao što je ovde opisano, sekvenca FGF21 divlјeg tipa poseduje nekoliko osobina koja mogu predstavlјati značajne izazove kada se FGF21 upotrebljava kao terapijski molekul. Među ovim izazovima su podložnost proteina degradaciji i njegova sklonost agregaciji pri visokim koncentracijama. Nakon iscrpnog napora da se identifikuju FGF21 polipeptidi koji prevazilaze svaki od ovih izazova, sprovedena je usmerena studija da bi se utvrdilo da li se aminokiselinske supstitucije koje obezbeđuju rezistenciju na proteolizu i one koje obezbeđuju osobine smanjenja sklonosti agregaciji mogu kombinovati na aditivan ili sinergistički način u jednoj polipeptidnoj sekvenci, uz zadržavanje nivoa aktivnosti koji su jednaki ili veći od aktivnosti FGF21 divlјeg tipa. Navedeno je predstavlјalo značajan izazov, pošto je u oblasti tehnike poznato da uvođenje višestrukih mutacija u dati polipeptid ponekada može negativno uticati na ekspresiju, aktivnost i kasniju proizvodnju proteina.
[0058] Iznenađujuće, kao što je pokazano u, na primer, Primerima 19 i 20, utvrđeno je da se poželјna osobine nekoliko FGF21 mutanata zaista mogu kombinovati na aditivan ili sinergistički način da bi se dobio FGF21 mutant koji ima pobolјšane farmaceutska osobine. Ovde su stoga opisani FGF21 mutanti koji su rezistentni na proteolizu, imaju smanjenu stopu agregacije i koji i dalјe zadržavaju aktivnost koja je ista ili veća od FGF21 divlјeg tipa.
[0059] Jedan od kriterijuma selekcije za identifikaciju poželјnih kombinovanih FGF21 mutanata bio je da aktivnost FGF21 mutanta bude slična ili veća od aktivnosti FGF21 divlјeg tipa. Prema tome, drugi primer izvođenja predmetog pronalaska je usmeren na FGF21 mutante koji su rezistentni na proteolizu i imaju osobine smanjenja sklonosti agregaciji uz zadržavanje aktivnosti FGF21 koja je slična ili veća od FGF21 divlјeg tipa. Iako su manje poželјni u pojedinim slučajevima, FGF21 mutanti koji su rezistentni na proteolizu i imaju osobine smanjenja sklonosti agregaciji, ali ispoljavaju donekle smanjenu aktivnost FGF21, čine drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska. U pojedinim slučajevima, može biti poželјno da se održi stepen proteolize i/ili agregacije, a posledično, drugi primer izvođenja predmetnog pronalaska takođe čine FGF21 mutanti koji dozvolјavaju određeni stepen proteolize i/ili agregacije.
[0060] Kao i kod svih FGF21 mutanata predmetnog pronalaska, kombinovani FGF21 mutanti predmetnog pronalaska mogu biti pripremljeni kao što je ovde opisano. Prosečno iskusni stručnjaci iz oblasti tehnike, upoznati sa standardnim tehnikama molekularne biologije, mogu iskoristiti to znanje, zajedno sa predmetnim opisom, da naprave i upotrebe kombinovane FGF21 mutante predmetnog pronalaska. Za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu tkiva i transformaciju (npr. elektroporaciju, lipofekciju) mogu biti upotrebljene standardne tehnike. Pogledati, npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, navedeno iznad, Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu biti izvedene u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u oblasti tehnike, ili kao što je ovde opisano. Ukoliko nisu date posebne definicije, nomenklature koje se koriste u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane, one su koje su dobro poznate i koje se obično upotrebljavaju u oblasti tehnike. Mogu stoga biti upotrebljene standardne tehnike za hemijske sinteze; hemijske analize; farmaceutsku pripremu, formulisanje i isporuku; i lečenje pacijenata.
[0061] Kombinovani FGF21 mutanti predmetnog pronalaska mogu biti fuzionisani sa drugim entitetom, koji može obezbediti dodatne osobine kombinovanom FGF21 mutantu. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kombinovani FGF21 mutant može biti fuzionisan sa IgG Fc sekvencom, npr. SEQ ID NO:11. Takva fuzija se može ostvariti upotrebom poznatih molekularno bioloških postupaka i/ili smernica koje su ovde obezbeđene. Prednosti takvih fuzionih polipeptida, kao i postupaka za pravlјenje takvih fuzionih polipeptida, detalјnije su ovde razmotrene u nastavku teksta.
7. FGF21 fuzioni proteini
[0062] Kao što se ovde upotrebljava, termin "FGF21 fuzioni polipeptid" ili "FGF21 fuzioni protein" odnosi se na fuziju jednog ili više aminokiselinskih ostataka (kao što je heterologni protein ili peptid) na N-kraju ili C-kraju bilo kog FGF21 polipeptidnog mutant koji je ovde opisan.
[0063] Heterologni peptidi i polipeptidi uklјučuju, ali nisu ograničeni na, epitop koji omogućava detekciju i/ili izolaciju FGF21 polipeptidnog mutanta; protein transmembranskog receptora ili njegov deo, kao što je vanćelijski domen ili transmembranski i unutarćelijski domen; ligand ili njegov deo koji se vezuje za protein transmembranskog receptora; enzim ili njegov deo koji je katalitički aktivan; polipeptid ili peptid koji pospešuje oligomerizaciju, kao što je domen tipa leucinskog rajsferšlusa; polipeptid ili peptid koji povećava stabilnost, kao što je konstantni region imunoglobulina (npr. Fc domen); sekvenca koja produžava poluživot i koja se sastoji od kombinacije dve ili više (npr.2, 5, 10, 15, 20, 25, itd.) naelektrisanih i/ili nenaelektrisanih aminokiselina koje se javljaju ili ne javljaju u prirodi (npr. serina, glicina, glutaminske ili asparaginske kiseline) dizajniranih tako da obrazuju pretežno hidrofilnog ili pretežno hidrofobnog partnera za fuziju sa FGF21 mutantom; funkcionalno ili nefunkcionalno antitelo, ili njegov teški ili laki lanac; i polipeptid koji ima aktivnost, kao što je terapijska aktivnost, različitu od FGF21 polipeptidnog mutanata predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak takođe obuhvata FGF21 mutante fuzionisane sa humanim serumskim albuminom (HSA).
[0064] FGF21 fuzioni proteini mogu biti napravlјeni fuzionisanjem heterolognih sekvenci bilo na N-kraju ili na C-kraju FGF21 polipeptidnog mutanta. Kao što je ovde opisano, heterologna sekvenca može biti aminokiselinska sekvenca ili polimer koji ne sadrži aminokiseline. Heterologne sekvence mogu biti fuzionisane bilo direktno sa FGF21 polipeptidnim mutantom ili preko linkera ili molekula adaptera. Molekul linkera ili adaptera mogu činiti jedan ili više aminokiselinskih ostataka (ili -mera), npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 ostataka (ili -mera), poželјno od 10 do 50 aminokiselinskih ostataka (ili -mera), npr.10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 ostataka (ili -mera), a poželјnije od 15 do 35 aminokiselinski ostaci (ili -meri). Molekul linkera ili adaptera takođe može biti dizajniran sa mestom cepanja za DNK restrikcionu endonukleazu ili za proteazu, da bi se omogućilo razdvajanje fuzionisanih ostataka.
a. Fusions Fc
[0065] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 polipeptidni mutant je fuzionisan sa Fc domenom, npr. sa jednim ili više domena Fc regiona humanog IgG. Antitela se sastoje od dva funkcionalno nezavisna dela, varijabilnog domena poznatog kao "Fab", koji vezuje antigen, i konstantnog domena poznatog kao "Fc", koji je uklјučen u efektorske funkcije kao što su aktivacija komplementa i napad od strane fagocitnih ćelija. Fc ima dug poluživot u serumu, dok je Fab kratkoživeći (Capon i saradnici, 1989, Nature 337: 525-31). Kada se spoji zajedno sa terapijskim proteinom, Fc domen može obezbediti duži poluživot ili inkorporirati funkcije kao što su vezivanje Fc receptora, vezivanje proteina A, fiksacija komplementa i možda čak i prenos kroz placentu (Capon i saradnici, 1989).
[0066] In vivo farmakokinetička analiza je ukazala da humani FGF21 ima kratak poluživot od oko 1 sat kod miševa usled brzog uklanjanja i in vivo degradacije. Prema tome, da bi se produžio poluživot FGF21, nativna Fc sekvenca je bila fuzionisana na N- ili C-terminalnim krajem FGF21 polipeptida. Fuzija Fc sekvence sa FGF21 divlјeg tipa, posebno Fc fuzionisanom sa N-krajem FGF21 divlјeg tipa, nije produžila poluživot kako se očekivalo, međutim, ovo zapažanje je dovelo do istraživanja proteolitičke degradacije FGF21 in vivo i identifikacije FGF21 mutanata koji su bili rezistentni na takvu degradaciju. Takvi mutanti su opisani u, na primer, Primerima 9 i 11, i ispoljavaju duži poluživot od FGF21 divlјeg tipa. Ovi i drugi FGF21 fuzioni proteini čine primere izvođenja predmetnog pronalaska.
[0067] Kroz predmetni opis, Fc-FGF21 se odnosi na fuzioni protein u kome je Fc sekvenca fuzionisana sa N-krajem FGF21. Slično navedenom, u celom opisu, FGF21-Fc se odnosi na fuzioni protein u kome je Fc sekvenca fuzionisana sa C-krajem FGF21.
[0068] Dobijeni FGF21 fuzioni protein može biti prečišćen, na primer, upotrebom afinitetne kolone sa Proteinom A. Utvrđeno je i da peptidi i proteini fuzionisani sa Fc regionom ispoljavaju značajno duži poluživot in vivo nego nefuzionisani parnjak. Takođe, fuzija sa Fc regionom omogućava dimerizaciju/multimerizaciju fuzionog polipeptida. Fc region može biti Fc region koji se javlјa u prirodi, ili on može biti izmenjen, da bi se pobolјšali određeni kvaliteti, kao što su terapijski kvaliteti, vreme cirkulisanja ili smanjenje agregacije.
[0069] Korisne modifikacije proteinskih terapijskih sredstava fuzijom sa "Fc" domenom antitela detalјno su razmotrene u Međunarodnoj objavi br. WO 00/024782,
b. Linkeri fuzionih proteina
[0070] Kada se obrazuju fuzioni proteini predmetnog pronalaska, linker može, ali ne mora, biti iskorišćen. Kada je prisutan, hemijska struktura linkera možda nije kritična, pošto on prevashodno služi kao „čuvar prostora”. Linker može biti sačinjen od aminokiselina povezanih zajedno peptidnim vezama. U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, linker se sastoji od 1 do 20 aminokiselina povezanih peptidnim vezama, pri čemu su aminokiseline izabrane od 20 aminokiselina koje se javlјaju u prirodi. U raznim primerima izvođenja, 1 do 20 aminokiselina je izabrano od aminokiselina kao što su glicin, serin, alanin, prolin, asparagin, glutamin i lizin. U pojedinim primerima izvođenja, linker se sastoji od većine aminokiselina koje su bez steričkog naboja, kao što su glicin i alanin. U pojedinim primerima izvođenja, linkeri su poliglicini (kao što je (Gly)4(SEQ ID NO:29) i (Gly)5(SEQ ID NO:30)), polialanini, kombinacije glicina i alanina (kao što je poli(Gly-Ala)) ili kombinacije glicina i serina (kao što je poli(Gly-Ser)). Drugi pogodni linkeri uklјučuju: (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO:28), (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO:31), (Gly)3-Lys-(Gly)4(SEQ ID NO:32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser-(Gly)2(SEQ ID NO:33), (Gly)3-Cys-(Gly)4(SEQ ID NO:34) i Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO:35). Dok je utvrđeno da linker od 15 aminokiselinskih ostataka radi posebno dobro za FGF21 fuzione proteine, predmetni pronalazak razmatra linkere bilo koje dužine ili sastava. Kada je linker iskorišćen za spajanje heterologne sekvence, kao što je Fc domen, i FGF21 polipeptid ili FGF21 mutant, linker je izražen u kockastim zagradama.
[0071] Linkeri koji su ovde opisani su primeri, a linkeri koji su mnogo duži i koji uklјučuju druge ostatke, takođe se razmatraju predmetnim pronalaskom. Nepeptidni linkeri su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Na primer, alkilni linkeri kao što je -NH-(CH2)s-C(O)-, gde je s = 2 do 20, mogu takođe biti upotrebljeni. Ovakvi alkilni linkeri mogu biti dalje supstituisani bilo kojom nesterički ometajućom grupom, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, niži alkil (npr. C1-C6), niži acil, halogen (npr. Cl, Br), CN, NH2ili fenil. Nepeptidni linker za primer je polietilen glikolni linker, pri čemu linker ima molekulsku težinu od 100 do 5000 kD, na primer, 100 do 500 kD.
8. Hemijski modifikovani FGF21 mutanti
[0072] Hemijski modifikovani oblici FGF21 polipeptidnih mutanata koji su ovde opisani, uklјučujući ovde opisane skraćene oblike FGF21, mogu biti pripremlјeni od strane stručnjaka iz oblasti tehnike, s obzirom da je ovde naveden opis. Takvi hemijski modifikovani FGF21 mutanti se menjaju tako da se hemijski modifikovani FGF21 mutant razlikuje od nemodifikovanog FGF21 mutanta, bilo po tipu ili lokaciji molekula koji su prirodno vezani za FGF21 mutanta. Hemijski modifikovani FGF21 mutanti mogu uklјučivati molekule obrazovane delecijom jedne ili više prirodno vezanih hemijskih grupa.
[0073] U jednom primeru izvođenja, FGF21 polipeptidni mutanti predmetog pronalaska mogu biti modifikovani kovalentnim vezivanjem jednog ili više polimera. Na primer, izabrani polimer je obično rastvorlјiv u vodi, tako da se protein za koji je vezan ne taloži u vodenoj sredini, kao što je fiziološka sredina. U okviru obima pogodnih polimera uklјučena je stoga mešavina polimera. Poželјno, za terapijsku upotrebu preparata krajnjeg proizvoda, polimer će biti farmaceutski prihvatlјiv. Polimeri koji nisu rastvorlјivi u vodi, kada su konjugovani sa FGF21 polipeptidnim mutantima predmetog pronalaska, takođe obrazuju aspekt pronalaska.
[0074] Svaki od polimera za primer može biti bilo koje molekulske težine i može biti razgranat ili nerazgranat. Svaki od polimera obično ima prosečnu molekulsku težinu od između oko 2 kDa do oko 100 kDa (termin "oko" označava da će u preparatima polimera rastvorlјivog u vodi, pojedini molekuli težiti više, a pojedini manje od navedene molekulske težine). Prosečna molekulska težina svakog polimera je poželјno između oko 5 kDa i oko 50 kDa, poželјnije između oko 12 kDa i oko 40 kDa, a najpoželјnije između oko 20 kDa i oko 35 kDa.
[0075] Pogodni polimeri koji su rastvorlјivi u vodi ili njihove mešavine uklјučuju, ali nisu ograničeni na, N-vezane ili O-vezane uglјene hidrate, šećere, fosfate, polietilen glikol (PEG) (uklјučujući oblike PEG-a koji su upotrebljavani za derivatizaciju proteina, uklјučujući mono-(C1-C10), alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol), monometoksi-polietilen glikol, dekstran (kao što je dekstran male molekulske težine od, na primer, oko 6 kD), celulozu ili druge polimere na bazi uglјenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidon) polietilen glikol, homopolimere propilen glikola, kopolimere polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol) i polivinil alkohol. Takođe su predmetanim pronalaskom obuhvaćeni bifunkcionalni umrežavajuži molekuli koji mogu biti upotrebljeni za pripremu kovalentno vezanih FGF21 polipeptidnih mutantnih multimera. Predmetnim pronalaskom su obuhvaćeni i FGF21 mutanti kovalentno vezani sa polisijalinskom kiselinom.
[0076] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 mutant je kovalentno, ili hemijski, modifikovan tako da uklјučuje jedan ili više polimera rastvorlјivih u vodi, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, polietilen glikol (PEG), polioksietilen glikol ili polipropilen glikol. Pogledati, npr. SAD patente br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; i 4,179,337. U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 mutant sadrži jedan ili više polimera, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celulozu, drugi polimer na bazi uglјenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilen glikol, homopolimere propilen glikola, kopolimer polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol ili smeše takvih polimera.
[0077] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 mutant je kovalentno modifikovan sa PEG subjedinicama. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više polimera rastvorlјivih u vodi vezani su na jednoj ili više specifičnih pozicija (na primer, na N-kraju) FGF21 mutanta. U pojedinim primerima izvođenja, jedan ili više polimera rastvorlјivih u vodi su nasumično vezani za jedan ili više bočnih lanaca FGF21 mutanta. U pojedinim primerima izvođenja, PEG se upotrebljava za pobolјšanje terapijskog kapaciteta FGF21 mutanta. O pojedinim takvim postupcima se diskutuje, na primer, u SAD patentu br.6,133,426,
[0078] U primerima izvođenja predmetnog pronalaska gde je polimer PEG, PEG grupa može biti bilo koje pogodne molekulske težine, a može biti linearna ili razgranata. Prosečna molekulska težina PEG grupe će poželјno biti opsega od oko 2 kD do oko 100 kDa, a poželјnije od oko 5 kDa do oko 50 kDa, npr. 10, 20, 30, 40, ili 50 kDa. PEG grupe će generalno biti vezane za FGF21 mutant putem acilacije ili reduktivne alkilacije preko reaktivne grupe na PEG ostatku (npr. aldehidne, amino, tiolne ili estarske grupe) sa reaktivnom grupom na FGF21 mutantu (npr. aldehidnom, amino ili estarskom grupom).
[0079] PEGilacija polipeptida, uklјučujući FGF21 mutante predmetnog pronalaska, može biti specifično izvedene upotrebom bilo koje od reakcija PEGilacije koje su poznate u oblasti tehnike. Takve reakcije su opisane, na primer, u sledećim referencama: Francis i saradnici, 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Evropskim patentima br.0154316 i 0401384; i SAD patentu br.4,179,337. Na primer, PEGilacija može biti izvedena putem reakcije acilacije ili reakcije alkilacije sa reaktivnim molekulom polietilen glikola (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorlјivim u vodi) kao što je ovde opisano. Za reakcije acilacije, izabrani polimer bi trebao da ima jednu reaktivnu estarsku grupu. Za reduktivnu alkilaciju, izabrani polimer bi trebao da ima jednu reaktivnu aldehidnu grupu. Reaktivni aldehid je, na primer, polietilen glikol propionaldehid, koji je stabilan u vodi, ili njegovi mono C1-C10alkoksi ili ariloksi derivati (pogledati, npr. SAD patent br.5,252,714).
[0080] U pojedinim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, korisna strategija za vezivanje PEG grupe za polipeptid uklјučuje kombinovanje, putem obrazovanja konjugatne veze u rastvoru, peptida i PEG ostatka, od kojih svaki nosi posebnu funkcionalnu grupu koja je reaktivna u odnosu na drugu. Peptidi mogu biti lako pripremljeni konvencionalnom sintezom na čvrstoj fazi. Peptidi se "prethosno aktiviraju" sa odgovarajućom funkcionalnom grupom na određenom mestu. Prekursori se prečišćavaju i u potpunosti karakterišu pre reakcije sa PEG ostatkom. Ligacija peptida sa PEG se obično odvija u vodenoj fazi i može se lako pratiti analitičkim HPLC postupkom reverzne faze. PEGilovani peptidi mogu biti lako prečišćeni preparativnim HPLC i okarakterisani analitičkom HPLC postupkom, analizom aminokiselina i masenom spektrometrijom sa laserskom desorpcijom.
[0081] Polisaharidni polimeri su još jedan tip polimera rastvorlјivih u vodi koji može biti upotrebljen za modifikaciju proteina. Prema tome, FGF21 mutanti predmetnog pronalaska fuzionisani sa polisaharidnim polimerom čine primere izvođenja predmetnog pronalaska. Dekstrani su polisaharidni polimeri koji se sastoje od pojedinačnih subjedinica glukoze, koje su pretežno povezane alfa 1-6 vezama. Sam dekstran je dostupan u mnogim opsezima molekulske težine, i lako je dostupan u molekulskim težinama od oko 1 kD do oko 70 kD. Dekstran je pogodan polimer koji je rastvorlјiv u vodi, za upotrebu u vidu nosača samostalno ili u kombinaciji sa drugim nosačem (npr. Fc). Pogledati, npr. Međunarodnu objavu br. WO 96/11953. Prijavlјena je upotreba dekstrana konjugovanog sa terapijskim ili dijagnostičkim imunoglobulinima. Pogledati, npr. Evropsku patentnu objavu br. 0315 456, Predmetni pronalazak takođe obuhvata upotrebu dekstrana od oko 1 kD do oko 20 kD.
[0082] U principu, hemijska modifikacija može biti izvršena pod bilo kojim pogodnim uslovima koji se upotrebljavaju za reakciju proteina sa aktiviranim polimernim molekulom. Postupci za pripremu hemijski modifikovanih polipeptida će generalno obuhvatati korake: (a) reagovanja polipeptida sa aktiviranim polimernim molekulom (kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat polimernog molekula) pod uslovima u kojima FGF21 polipeptidni mutant postaje vezan za jedan ili više polimernih molekula, i (b) dobijanje reakcionog proizvoda. Optimalni uslovi reakcije biće utvređeni na osnovu poznatih parametara i želјenog rezultata. Primer navedenog je da što je veći odnos polimernih molekula u odnosu na protein, veći je procenat vezanog polimernog molekula. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, hemijski modifikovani FGF21 mutanti mogu imati jedan ostatak polimernog molekula na amino-kraju (pogledati, npr. SAD patent br.5,234,784)
[0083] U drugom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 polipeptidni mutanti mogu biti hemijski kuplovani sa biotinom. Biotin/FGF21 polipeptidnim mutantima se zatim dozvolјava da se vežu za avidin, što dovodi do nastaka tetravalentnih avidin/biotin/FGF21 polipeptidnih mutanata. FGF21 polipeptidni mutanti takođe mogu biti kovalentno kuplovani sa dinitrofenolom (DNP) ili trinitrofenolom (TNP), a rezultujući konjugati su se taložili sa anti-DNP ili anti-TNP-IgM, da bi se obrazovali dekamerički konjugati sa valentnošću od 10.
[0084] U principu, stanja koja mogu biti ublažena ili modulisana davanjem opisanih hemijski modifikovanih FGF21 mutanata uklјučuju ona stanja koja su ovde opisana za FGF21 polipeptidne mutante. Ipak, hemijski modifikovani FGF21 mutanti koji su ovde opisani mogu imati dodatne aktivnosti, pojačanu ili smanjenu biološku aktivnost ili druge karakteristike, kao što je produžen ili smanjen poluživot, u poređenju sa nemodifikovanim FGF21 mutantima.
9. Farmaceutske kompozicije FGF21 mutanata i njihovo davanje
[0085] Farmaceutske kompozicije koje sadrže FGF21 mutante su u okviru obima predmetog pronalaska, a posebno se razmatraju u pogledu identifikacije nekoliko mutiranih FGF21 sekvenci koje ispoljavaju pobolјšane osobine. Farmaceutske kompozicije takvih FGF21 mutanata mogu sadržavati terapijski efektivnu količinu FGF21 polipeptidnog mutanta u mešavini sa farmaceutski ili fiziološki prihvatlјivim sredstvom za formulisanje, izabranim tako da odgovara načinu primene.
[0086] Prihvatlјiva sredstva za formulisanje su poželјno netoksična za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama.
[0087] Farmaceutska kompozicija može sadržavati sredstvo(a) za formulisanje radi modifikacije, održavanja ili očuvanja, na primer, pH, osmolarnosti, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, stope rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije. Pogodni sredstva za formulisanje uklјučuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin), antimikrobne lekove, antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit), pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline), sredstva za povećanje mase (kao što su manitol ili glicin), sredstva za heliranje (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)), sredstva za obrazovanje kompleksa (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropilbeta-ciklodekstrin), sredstva za ispunjavanje, monosaharidi, disaharidi i drugi uglјeni hidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini), proteini (kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini), boje, arome i razblaživači, emulgatori, hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpirolidon), polipeptidi male molekulske težine, kontrajoni koji čine soli (kao što je natrijum), konzervansi (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid), rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol), šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol), sredstva za resuspendovanje, surfaktanti ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici; PEG; sorbitan estri; polisorbati poput polisorbata 20 ili polisorbata 80; triton; trometamin; lecitin; holesterol ili tiloksapal), sredstva za pobolјšanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol), sredstva za pojačavanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala - poželјno natrijum ili kalijum hlorid - ili manitol sorbitol), sredstva za isporuku, razblaživači, ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi (pogledati, npr. Remington’s Pharmaceutical Sciences (18. izd., A.R. Gennaro, ur., Mack Publishing Company 1990.) i naredna izdanja istog,
[0088] Optimalna farmaceutska kompozicija će biti utvrđena od strane iskusnog stručnjaka u zavisnosti od, na primer, predviđenog puta primene, formata isporuke i želјene doze (pogledati, npr. Remington’s Pharmaceutical Sciences, navedeno iznad). Takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, stopu in vivo oslobađanje i stopu in vivo klirensa FGF21 polipeptidnog mutanta.
[0089] Primarni nosač ili rastvarač u farmaceutskoj kompoziciji po prirodi može biti bilo vodeni ili nevodeni. Na primer, pogodan nosač ili rastvarač za injeciranje mogu biti voda, fiziološki rastvor soli ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno dopunjeni sa drugim materijalima koji su uobičajeni u kompozicijama za parenteralno davanje. Neutralno puferisan fiziološki rastvor, ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom, dodatni su nosači za primer. Drugi primeri farmaceutskih kompozicija sadrže Tris pufer sa pH oko 7,0-8,5, ili acetatni pufer sa pH oko 4,0-5,5, koji dalјe mogu uklјučivati sorbitol ili odgovarajuće zamene. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, kompozicije FGF21 polipeptidnih mutanata mogu biti pripremljene za skladištenje mešanjem izabrane kompozicije, koja ima željeni stepen čistoće, sa izbornim sredstvima za formulisanje (Remington’s Pharmaceutical Sciences, navedeno iznad) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Štaviše, FGF21 polipeptidni mutantni proizvod može biti formulisan kao liofilizat, upotrebom odgovarajućih ekscipijenasa, poput saharoze.
[0090] Farmaceutske kompozicije FGF21 polipeptidnih mutanta mogu biti izabrane za parenteralnu isporuku. Alternativno, kompozicije mogu biti izabrane za inhalaciju ili za isporuku preko digestivnog trakta, kao što oralnim putem. Priprema takvih farmaceutski prihvatlјivih kompozicija je u okviru poznatih znanja iz oblasti tehnike.
[0091] Komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatlјive za mesto primene. Na primer, puferi se upotrebljavaju za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično unutar pH opsega od oko 5 do oko 8.
[0092] Kada se razmatra parenteralna primena, terapijske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti u obliku parenteralno prihvatlјivog vodenog rastvora oslobođenog od pirogena, koji sadrži želјeni FGF21 polipeptidni mutant u farmaceutski prihvatlјivom nosaču. Posebno pogodan nosač za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je FGF21 polipeptidni mutant formulisan kao sterilan, izotoničan rastvor koji je pravilno očuvan. Još jedan preparat može uklјučivati formulaciju želјenog molekula sa sredstvom, kao što su mikrosfere za injeciranja, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), smole ili lipozomi, koji omogućavaju kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda, koji se zatim može isporučiti putem depo injekcija. Hijaluronska kiselina takođe može biti upotrebljena, a navedeno može imati efekat pospešivanja produženog trajanja u cirkulaciji. Drugi pogodni načini za uvođenje želјenog molekula uklјučuju implantabilne uređaje za isporuku lekova.
[0093] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija može biti formulisana za inhalaciju. Na primer, FGF21 polipeptidni mutant može biti formulisan u vidu suvog praha za inhalaciju. Rastvori FGF21 polipeptidnih mutanata za inhalaciju takođe mogu biti formulisani sa potisnim gasom za isporuku aerosola. U još jednom primeru izvođenja, rastvori mogu biti nebulizovani. Plućna primena je dalje opisana u Međunarodnoj objavi br. WO 94/20069, koji opisuje plućnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.
[0094] Razmatra se takođe da određene formulacije mogu biti date oralno. U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, FGF21 polipeptidni mutanti koji se primenjuju na ovaj način mogu biti formulisani sa ili bez onih nosača koji se uobičajeno koriste u pripremi čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može biti dizajnirana tako da oslobodi aktivan deo formulacije na mestu u gastrointestinalnom traktu kada je biodostupnost dovedena do maksimuma, a razgradanja koja prethodi sistemskoj degradaciji je svedena na minimum. Mogu biti uključena i dodatna sredstva, da bi se olakšala apsorpcija FGF21 polipeptidnog mutanta. Takođe, mogu biti iskorišćeni i razblaživači, arome, voskovi niske tačke toplјenja, bilјna ulјa, lubrikanti, sredstva za resuspendovanje, sredstva za raspadanje tableta i sredstva za povezivanje.
[0095] Druga farmaceutska kompozicija može uklјučivati efektivnu količinu FGF21 polipeptidnih mutanata u smeši sa netoksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi ili drugom odgovarajućem nosaču, rastvori mogu biti pripremljeni obliku jedinične doze. Pogodni ekscipijensi uklјučuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili sredstva za povezivanje, kao što su skrob, želatin ili gel akacije; ili lubrikatni kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk.
[0096] Dodatne farmaceutske kompozicije FGF21 polipeptidnih mutanata biće očigledne stručnjacima iz oblasti tehnike, uklјučujući formulacije koje uklјučuju FGF21 polipeptidne mutante u formulacijama sa produženom ili kontrolisanom isporukom. Tehnike za formulisanje niza drugih sredstava za produženu ili kontrolisanu isporuku, kao što su lipozomski nosači, bio-erodibilne mikročestice ili porozne smole i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima iz oblasti tehnike (pogledati, npr. Međunarodnu objavu br. WO 93/15722, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija, kao i Wischke i Scliwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, i Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, koje razmatraju pripremu i upotrebu mikrosfera/mikročestica). Kao što je ovde opisano, hidrogel je primer formulacije sa produženom ili kontrolisanom isporukom.
[0097] Dodatni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uklјučuju polupropusne polimerne matrice u vidu oblikovanih artikala, npr. filmova ili mikrokapsula. Matrice sa produženim oslobađanjem mogu uklјučivati poliestre, hidrogelove, polilaktide (SAD patent br.3,773,919 i Evropski patent br.0 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman i saradnici, 1983, Biopolymers 22: 547-56), poli(2-hidroksietil-metakrilat) (Langer i saradnici, 1981, J. Biomed. Mater. Res.15: 167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.12: 98-105), etilen vinil acetat (Langer i saradnici, navedeno iznad) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (Evropski patent br.0133988). Kompozicije sa produženim oslobađanjem mogu takođe uklјučivati lipozome, koji mogu biti pripremani bilo kojim od nekoliko postupaka koji su poznati u oblasti tehnike. Pogledati, npr. Epstein i saradnici, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82: 3688-92; i Evropske patente br.0036676, 0088046 i 0143949.
[0098] Farmaceutske kompozicije FGF21 polipeptidnih mutanata koje će biti upotrebljene za in vivo primenu, obično bi trebale da budu sterilne. Navedeno se može postići filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizirana, sterilizacija upotrebom ovog postupka može biti sprovedena bilo pre ili nakon liofilizacije i rekonstituisanja. Kompozicija za parenteralnu primenu može biti čuvana u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Dodatno, parenteralne kompozicije se generalno stavlјaju u kontejner koji ima sterilan pristupni otvor, na primer, u vrećicu za intravenski rastvor ili bočicu sa čepom koji se može probiti iglom za hipodermno injeciranje.
[0099] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može biti skladišena u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidriran ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu biti skladištene bilo u obliku koji je spreman za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji zahtevaju rekonstituciju pre primene.
[0100] U specifičnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na komplete za proizvodnju jedinice za jednokratno davanje doze. Svaki komplet može sadržavati i prvi kontejner koji ima osušeni protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. U okviru obima predmetog pronalaska su takođe uklјučeni kompleti koji sadrže jedno- i višekomorne špriceve koji se prethodno pune (npr. špriceve sa tečnošću ili liošpriceve).
[0101] Efektivna količina farmaceutske kompozicije FGF21 polipeptidnog mutanta koja će biti iskorišćena u terapiji zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i cilјeva. Za stručnjaka iz oblasti tehnike je bitna napomena da će odgovarajući dozni nivoi za lečenje stoga varirati u zavisnosti, delom, od vrste isporučenog molekula, indikacija za koje se upotrebljava FGF21 polipeptidni mutant, načina primene i veličine (telesne težine, površinu tela ili veličinu organa), kao i stanja (starost i opšte zdravlјa) pacijenta. Lekar može stoga titirati dozu i modifikovanti put primene da bi se dobio optimalan terapijski efekat. Uobičajena doza će biti opsega od oko 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora koji su prethodno navedeni. U drugim primerima izvođenja, doza može biti opsega od 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 µg/kg, 10 µg/kg, 15 µg/kg, 20 µg/kg, 25 µg/kg, 30 µg/kg, 35 µg/kg, 40 µg/kg, 45 µg/kg, 50 µg/kg, 55 µg/kg, 60 µg/kg, 65 µg/kg, 70 µg/kg, 75 µg/kg, do oko 100 mg/kg. U još drugim primerima izvođenja, doza može biti 50 µg/kg, 100 µg/kg, 150 µg/kg, 200 µg/kg, 250 µg/kg, 300 µg/kg, 350 µg/kg, 400 µg/kg, 450 µg/kg, 500 µg/kg, 550 µg/kg, 600 µg/kg, 650 µg/kg, 700 µg/kg, 750 µg/kg, 800 µg/kg, 850 µg/kg, 900 µg/kg, 950 µg/kg, 100 µg/kg, 200 µg/kg, 300 µg/kg, 400 µg/kg, 500 µg/kg, 600 µg/kg, 700 µg/kg, 800 µg/kg, 900 µg/kg, 1000 µg/kg, 2000 µg/kg, 3000 µg/kg, 4000 µg/kg, 5000 µg/kg, 6000 µg/kg, 7000 µg/kg, 8000 µg/kg, 9000 µg/kg ili 10 mg/kg.
[0102] Učestalost davanja doza zavisiće od farmakokinetičkih parametara FGF21 polipeptidnog mutanta u formulaciji koja se upotrebljava. Obično, lekar će primenjivati kompoziciju sve dok se ne dostigne doza koja postiže želјeni efekat. Kompozicija stoga može biti davana u vidu jednokratne doze, u vidu dve ili više doza (koje mogu, ali ne moraju sadržavati istu količinu želјenog molekula) tokom vremena, ili u vidu kontinuirane infuzije preko uređaja za implantaciju ili katetera. Dalјe podešavanje odgovarajuće doze se vrši rutinski od strane uobičajeno iskusnih stručnjaka iz oblasti tehnike i unutar je veština koje oni rutinski obavlјaju. Odgovarajuće doze mogu biti utvrđene putem upotrebe odgovarajućih podataka o dozi i odgovoru.
[0103] Put primene farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr. oralnim; putem injeciranja intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intraparenhimskim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intraokularnim, intraarterijskim, intraportalnim ili intralezijskim putevima; preko sistema sa produženim oslobađanjem (koji takođe mogu upotrebljavati injeciranje); ili uređaja za implantaciju. Kada je poželjno, kompozicije mogu biti date bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom, ili putem uređaja za implantaciju.
[0104] Alternativno ili dodatno, kompozicija može biti data lokalno, putem ugradnje membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je želјeni molekul apsorbovan ili u kome je inkapsuliran. Kada se upotrebljava uređaj za implantaciju, uređaj može biti ugrađen u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a isporuka želјenog molekula može biti difuzijom, bolusom sa vremenskim otpuštanjem ili kontinuiranim davanjem.
[0105] Da bi se lek isporučio, npr. FGF21 mutant koji je ovde opisan, pri unapred određenoj stopi i tako da se koncentracija leka može održavati na želјenom terapijski efikasnom nivou tokom dužeg perioda, mogu biti upotrebljeni raznovrsni pristupi. U jednom primeru, može biti iskorišćen hidrogel koji sadrži polimer kao što je želatin (npr. goveđi želatin, humani želatin ili želatin iz drugog izvora) ili polimer koji se javlja u prirodi ili je sintetički generisan. U hidrogelu može biti upotrebljen bilo koji procenat polimera (npr. želatina), kao što je 5, 10, 15 ili 20%. Izbor odgovarajuće koncentracije može zavisiti od niza faktora, kao što su želјeni terapijski profil i farmakokinetički profil terapijskog molekula.
[0106] Primeri polimera koji mogu biti ugrađeni u hidrogel uklјučuju polietilen glikol („PEG“), polietilen oksid, polietilen oksid-ko-polipropilen oksid, blok ko-polietilen oksida ili nasumične kopolimere, polivinil alkohol, poli(vinil pirolidinon), poli(aminokiseline), dekstran, heparin, polisaharide, polietre i slično.
[0107] Drugi faktor koji može biti uzeti u obzir prilikom pripreme formulacija hidrogela je stepen umrežavanja u hidrogelu i sredstvo za umrežavanje. U jednom primeru izvođenja, umrežavanje može biti postignuto reakcijom metakrilacije koja uklјučuje metakrilni anhidrid. U pojedinim situacijama, može biti poželјan visok stepen umrežavanja, dok je u drugim situacijama poželјan niži stepen umrežavanja. U pojedinim slučajevim, veći stepen umrežavanja obezbeđuje duže produženo oslobađanje. Veći stepen umrežavanja može obezbediti čvršći hidrogel i duži period tokom koga se lek isporučuje.
[0108] Za dobijanje hidrogela sa poželjnim osobinama, može se iskoristiti bilo koji odnos polimera prema sredstvu za umrežavanje (npr. metakrilnom aldehidu). Na primer, odnos polimera i umreživača može biti, npr. 8:1, 16:1, 24:1 ili 32:1. Na primer, kada je polimer hidrogela želatin, a sredstvo za umrežavanje metakrilat, mogu se koristiti odnosi od 8:1, 16:1, 24:1 ili 32:1 metilakril anhidrida i želatina.
10. Terapijske upotrebe FGF21 polipeptidnih mutanata
[0109] FGF21 polipeptidni mutanti mogu biti upotrebljeni za lečenje, dijagnozu, ublažavanje ili prevenciju brojnih bolesti, poremećaja ili stanja, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na metaboličke poremećaje. U jednom primeru izvođenja, metabolički poremećaj koji je potrebno lečiti je dijabetes, npr. dijabetes tipa 2. Prema drugom aspektu, metabolički poremećaj je gojaznost. Drugi primeri izvođenja uklјučuju metabolička stanja ili poremećaje kao što su dislipidimija; hipertenzija; hepatosteaotoza, poput nealkoholnog steatohepatitisa (NASH); kardiovaskularne bolesti, kao što je ateroskleroza; i starenje.
[0110] U prijavi, poremećaj ili stanje kao što su dijabetes ili gojaznost mogu biti lečeni davanjem FGF21 polipeptidnog mutanta kao što je ovde opisano, pacijentu kome je to potrebno, u količini terapijski efektivne doze. Primena može biti izvedena kao što je ovde opisano, kao što je IV injeciranjem, intraperitonealnim injeciranjem, intramuskularnim injeciranjem ili oralno, u obliku tablete ili tečne formulacije. U većini situacija, želјenu dozu može odrediti kliničar, kao što je ovde opisano, a ista može predstavlјati terapijski efektivnu dozu FGF21 mutantnog polipeptida. Za stručnjake iz oblasti tehnike je bitno napomenuti da će terapijski efektivna doza FGF21 mutantnog polipeptida zavisiti, između ostalog, od rasporeda davanja, jedinične doze sredstva koje će biti dato, bilo da se daje molekul nukleinske kiseline ili polipeptid u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvima, kao i od imunskog statusa i zdravlјa primaoca. Termin "terapijski efektivna doza", kako se ovde upotrebljava, označava onu količinu FGF21 mutantnog polipeptida koja izaziva biološki ili medicinski odgovor u tkivnom sistemu, životinji ili ljudskom biću koji istraživač, lekar ili drugi kliničar i potražuje, što uklјučuje ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja koji se leči.
PRIMERI
[0111] Primeri koji slede ilustruju specifične primere izvođenja pronalaska i njihove razne upotrebe.
PRIMER 1
Priprema ekspresionih konstrukata za FGF21
[0112] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira zreli FGF21 polipeptid dobijena je amplifikacijom sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR), upotrebom prajmera sa nukleotidnim sekvencama koje odgovaraju 5' i 3' krajevima sekvence zrelog FGF21. Tabela 2 navodi prajmere koji su upotrebljavani za amplifikaciju sekvence zrelog FGF21.
Tabela 2
[0113] Prajmeri upotrebljeni za pripremu ekspresionog konstrukta za zreli FGF21 uključivali su mesta za restrikcione endonukleaze (NdeI mesto takođe sadrži N-terminalni metionin za ekspresiju u bakterijama) radi usmerenog kloniranja sekvence u odgovarajući ekspresioni vektor (npr. pET30 (Novagen/EMD Biosciences; San Dijego, Kalifornija) ili pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, Kalifornija)). Ekspresioni vektor pAMG33 sadrži nizak broj kopija početka replikacije R-100, modifikovani lac promotor i gen rezistencije na kanamicin. Ekspresioni vektor pET30 sadrži početak replikacije izveden iz pBR322, inducibilni T7 promotor i gen rezistencije na kanamicin. Iako je utvrđeno da je ekspresija sa pAMG33 veća, nađeno je i da je pET30 pouzdaniji vektor za kloniranje. Prema tome, većina konstrukata opisanih u predmetnom pronalasku je najpre generisana u pET30, a zatim je ispitivana njihova efikasnost. Izabrane sekvence su potom prebacivane u pAMG33 radi dalјe amplifikacije.
[0114] FGF21 sekvenca je amplifikovana u reakcionoj smeši koja je sadržavala 40,65 µL dH2O, 5 µL PfuUltra II reakcionog pufera (10x), 1,25 µL dNTP smeše (40 mM - 4 x 10 mM), 0,1 µL matrice (100 ng/mL), 1 µL Prajmera 1 (10 µM), 1 µL Prajmera 2 (10 µM) i 1 µL PfuUltra II fuzionisane HS DNK polimeraze (Stratagene; La Jolla, Kalifornija). Reakcije amplifikacije su sprovođene zagrevanjem tokom 2 minuta na 95°C; nakon čega je sledilo deset ciklusa sa 95°C u trajanju od 20 sekundi, 60°C u trajanju od 20 sekundi (uz dodatno oduzimanje od po 1°C po ciklusu) i 72°C u trajanju od 15 sekundi/kilobazi želјenog proizvoda; praćeno sa 20 ciklusa sa 94°C tokom 20 sekundi, 55°C tokom 20 sekundi i 72°C tokom 15 sekundi/kilobazi želјenog proizvoda; a zatim i sa 72°C tokom 3 minuta. Proizvodi amplifikacije su podvrgavani digestiji sa restrikcionim endonukleazama NdeI, DpnI i EcoRI; ligaciji u odgovarajući vektor; a konačno su njima transformisane kompetentne ćelije.
PRIMER 2
Prečišćavanje FGF21 proteina iz bakterija
[0115] U Primerima koji slede, razni FGF21 proteini, uklјučujući FGF21 polipeptid divlјeg tipa, skraćene FGF21 polipeptide, FGF21 mutante i FGF21 fuzione proteine, bili su eksprimirani u bakterijskom sistemu za ekspresiju. Nakon eksprimiranja, koje je opisano u nastavku teksta, FGF21 proteini su prečišćeni kao što je opisano u ovom primeru, ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0116] Za prečišćavanje FGF21 polipeptida divlјeg tipa, skraćenih FGF21 polipeptida i FGF21 mutanata, od bakterijskih inkluzionih tela, dvostruko isprana inkluziona tela (DWIB) su solubilizovana u puferu za solubilizaciju koji je sadržavao guanidin hidrohlorid i DTT u Tris puferu na pH 8,5. Smeša je zatim mešana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je dodata smeša za solubilizaciju u pufer za ponovno uvijanje, koji je sadržavao ureu, arginin, cistein i cistamin hidrohlorid na pH 9,5, pa je smeša mešana 24 sata na 5°C (pogledati, npr. Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall i saradnici, 2007, Biotechnol. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph i saradnici, 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ur., New York, IRL Press) 57-99; i Ishibashi i saradnici, 2005, Protein Expr. Purif.42: 1-6).
[0117] Nakon solubilizacije i ponovnog uvijanja, smeša je profiltrirana kroz filter od 0,45 mikrona. Sadržaj ponovo uvijenih proteina je zatim koncentrovan približno 10 puta sa Pall Omega kasetom granične molekulske težine od 10 kD, pri transmembranskom pritisku (TMP) od 20 psi, nakon čega je smeša podvrgnuta dijafiltraciji sa 3 zapremine kolone 20 mM Trisa, pH 8,0, pri TMP od 20 psi.
[0118] Prečišćen uzorak je dalje podvrgnut anjon-izmenjivačkoj hromatografiji (AEX) upotrebom Q sefarozne HP smole. Linearni gradijent soli od 0 do 250 mM NaCl u 20 mM Tris je propuštan pri pH 8,0, na 5°C. Pikovi frakcija su analizirane SDS-PAGE postupkom, nakon čega su frakcije objedinjene.
[0119] Spojeni AEX eluati su zatim podvrgnut hromatografiji razdvajanja po hidrofobnim interakcijama (HIC) upotrebom Fenil sefarozne HP smole. Protein je eluiran upotrebom opadajućeg linearnog gradijenta od 0,7 M do 0 M amonijum sulfata, pri pH 8,0 i na ambijentalnoj temperaturi. Pikovi frakcija su analizirane SDS-PAGE postupkom (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85), nakon čega su frakcije objedinjene.
[0120] Objedinjene HIC fakcije su koncentrovane upotrebom Pall Omega 0,2 m<2>kasete sa graničnom molekulskom težinom od 10 kD do 7 mg/mL, pri TMP od 20 psi. Koncentrat je dalje podvrgnut dijafiltraciji sa puferom za formulisanje u zapremini od 5 zapremina kolone, pri TMP od 20 psi, nakon čega je izdvojeni koncentrat razblažen do 5 mg/mL. Konačno, rastvor je profiltriran kroz Pall mini-Kleenpac 0,2 µM Posidyne membranu.
[0121] Za prečišćavanje FGF21 fuzionih proteina i FGF21 fuzionih mutantnih proteina od bakterijskih inkluzionih tela, dvostruko isprana inkluziona tela (DWIB) su rastvarana u puferu za solubilizaciju koji je sadržavao guanidin hidrohlorid i DTT u Tris puferu sa pH 8,5, nakon čega je smeša mešana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Smeša za solubilizaciju je zatim dodata u pufer za ponovno uvijanje koji je sadržavao ureu, arginin, cistein i cistamin hidrohlorid pri pH 9,5, nakon čega je smeša mešana tokom 24 sata na 5°C (pogledati, npr. Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall i saradnici, 2007, Biotechnol. Bioeng.97: 1523-34; Rudolph i saradnici, 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ur., New York, IRL Press) 57-99; i Ishibashi i saradnici, 2005, Protein Expr. Purif.42: 1-6).
[0122] Nakon solubilizacije i ponovnog uvijanja proteina, smeša je podvrgnuta dijalizi sa 5 zapremina 20 mM Tris, pH 8,0, upotrebom 10 kD tube za dijalizu. pH dijalizovane smeše ponovno uvijenih proteina podešen je na 5,0, sa 50% sirćetnom kiselinom, nakon čega je smeša izbistrena centrifugiranjem od 30 minuta na 4K.
[0123] Izbistren uzorak je zatim podvrgnut anjon-izmenjivačkoj hromatografiji (AEX) upotrebom Q sefarozne HP smole. Linearni gradijent soli od 0 do 250 mM NaCl u 20 mM Tris je propušten pri pH 8,0, na 5°C. Pikovi frakcija su analizirani SDS-PAGE postupkom (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85), nakon čega su frakcije objedinjene.
[0124] Objedinjeni AEX eluati su zatim podvrgnut hromatografiji razdvajanja po hidrofobnim interakcijama (HIC) upotrebom Fenil sefarozn HP smole. Protein je eluiran upotrebom opadajućeg linearnog gradijenta od 0,6 M do 0 M amonijum sulfata, pri pH 8,0 i naambijentalnoj temperaturi. Pikovi frakcija su analizirani SDS-PAGE postupkom, nakon čega su frakcije objedinjene.
[0125] Nakon HIC koraka, objedinjene frakcije su podvrgnute dijalizi sa 60 zapremina pufera za formulisanje. Objedinjene frakcije su nakon dijalize koncentrovane do 5 mg/mL, upotrebom Pall Jumbosep uređaja. Konačno, rastvor je profiltriran kroz Pall mini-Kleenpac 0,2 µM Posidyne membranu.
PRIMER 3
Priprema i ekspresija skraćenih FGF21 proteina
[0126] Konstrukti koji su kodirali skraćene FGF21 proteine, navedene u Tabeli 3, pripremani su PCR amplifikacijom ekspresionog vektora sa FGF21 divlјeg tipa, kao što je opisano u nastavku teksta (konstruisanje ekspresionih vektora sa FGF21 divlјeg tipa je opisano u Primeru 1).
Tabela 3
[0127] Konstrukti skraćenih FGF21 proteina su pripremani upotrebom prajmera sa sekvencama homolognim regionima uzvodno i nizvodno od kodona (ili više kodona) koji su bili uklonjeni delecijom (rezultat čega je skraćenje). Prajmeri upotrebljavani u takvim reakcijama amplifikacije takođe su obezbedili približno 15 nukleotida preklapajuće sekvence, da bi se omogućila ponovna ciklizacija amplifikovanog proizvoda, odnosno dobijanje celokupnog vektora koji tada sadrži želјenog mutanta ili skraćenje.
[0128] Konstrukt skraćenog FGF21 za primer, koji kodira FGF21 protein kome nedostaje histidinski ostatak na poziciji 1 u sekvenci zrelog FGF21 (tj. mutanta sa 2-181 skraćenjem), pripreman je upotrebom prajmera koji su prikazani u Tabeli 4.
Tabela 4
[0129] Prajmeri prikazani u Tabeli 4 omogućavaju deleciju histidinskog ostatka, kao što je prikazano u nastavku teksta, pri čemu je gornja sekvenca (SEQ ID NO:9) deo zrelog FGF21 polipeptida koji sadrži N-terminalni metionin, dok je druga sekvenca sens prajmer (SEQ ID NO:14), a treća i četvrta sekvenca (SEQ ID NO:17 i 18) su delovi FGF21 ekspresionog konstrukta i peta sekvenca je antisens prajmer (SEQ ID NO:16):
[0130] Konstrukti skraćenih FGF21 proteina su pripremani upotrebom suštinski istih PCR uslova koji su opisani u Primeru 1. Proizvodi amplifikacije su zatim podvrgavani digestiji sa Dpnl restrikcionom endonukleazom, nakon čega su njima transformisane kompetentne ćelije. Dobijeni klonovi su sekvencirani, da bi se potvrdilo odsustvo grešaka generisanih polimerazom.
[0131] Skraćeni FGF21 proteini su eksprimirani transformisanjem kompetentnih BL21 (DE3) ili BL21 Star ćelija (Invitrogen; Carlsbad, Kalifornija) sa konstruktom koji kodira određeni skraćeni FGF21 protein. Transformanti su uzgajani preko noći uz ograničenu aeraciju, u TB medijumu sa dodatkom 40 µg/mL kanamicina, pa su sledećeg jutra aerirani i, nakon kratkog perioda oporavka, indukovani su u 0,4 mM IPTG. FGF21 mutanti su prikuplјani centrifugiranjem, 18-20 sati nakon indukcije.
PRIMER 4
In vitro aktivnost skraćenih FGF21 proteina
[0132] Eksperimenti su sprovođeni da bi se identifikovali skraćeni FGF21 proteini koji zadržavaju aktivnost FGF21 divlјeg tipa u ELK-luciferaznom in vitro testu. Tabela 5 sumira rezultate dobijene za FGF21 proteine koji imaju skraćenja na N-kraju, C-kraju ili na oba, i N-kraju i C-kraju. ELK-luciferazni testovi su rađeni upotrebom rekombinantnog sistema humanih 293T ćelija bubrega, u kome 293T ćelije prekomerno eksprimiraju β-Kloto i luciferazne reporterske konstrukte. Ovakvi konstrukti takođe sadrže sekvence koje kodiraju GAL4-ELK1 i 5xUAS-Luc, reporter luciferaze koga pokreće promotor koji sadrži pet tandemskih kopija mesta vezivanja Gal4. β-Kloto je ko-receptor koji je potreban FGF21 za aktivaciju njegovih FGF receptora i indukciju unutarćelijskog prenosa signala, što zauzvrat dovodi do Erk i ELK fosforilacije. Aktivnost luciferaze je regulisana nivoom fosforilisanog Erk/ELK1 i upotrebljava se za indirektno praćenje i kvantifikaciju aktivnosti FGF21.
[0133] ELK-luciferazni testovi su izvođeni kultivisanjem 293T ćelija u prisustvu različitih koncentracija FGF21 polipeptida divlјeg tipa ili FGF21 mutantnog polipeptida tokom 6 sati, a zatim ispitivanjem aktivnosti luciferaze u ćelijskim lizatima. Slike 1A-1B prikazuju rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa FGF21 mutantima sa 7-181 i 8-181 skraćenjima (Slika 1A) i FGF21 mutantima sa 1-172, 1-171, 1-169 i 1 -164 skraćenjima (Slika 1B). Luminiscencija dobijena u ELK-luciferaznim testovima za svaki od FGF21 mutanata sa 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 i 1-149 skraćenjima, prikazan je na Slici 2.
[0134] FGF21 mutantni polipeptidi su upoređivani sa standardom FGF21 divlјeg tipa i mutanti koji su pokazivali efikasnost koja je iznosila najmanje 50% od efikasnosti FGF21 divlјeg tipa, razmatrani su kao oni koji nisu izgubili aktivnost FGF21 i dodelјen im je "+" u Tabeli 5.
Tabela 5
[0135] Zajedno, rezultati predstavlјeni u Tabeli 5 ukazuju da delecije C-kraja veće od 14 ili više aminokiselinskih ostataka (tj. C-terminalno skraćeni FGF21 protein koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1-167, kao i kraći proteini) eliminišu aktivnost FGF21. Dodatno, Tabela 5 ukazuje da delecija na N-kraju od 7 ili više aminokiselinskih ostataka (tj. N-terminalno skraćeni FGF21 protein koji se sastoji od aminokiselinskih ostataka 8-181, kao i kraći proteini) eliminišu aktivnost FGF21. Nije iznenađujuće da je opisano da skraćeni FGF21 proteini koji poseduju i skraćenje N-kraja od 8 do 14 ostataka i skraćenje C-kraja od 12 ili 32 ostatka nemaju aktivnost u ELK-luciferaznim testovima.
[0136] U skladu sa podacima predstavlјenim u Tabeli 5, skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju skraćenje na N-kraju manje od 7 aminokiselinskih ostataka, predstavlјaju primere izvođenja predmetnog pronalaska. Slično navedenom, skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju skraćenje C-kraja manje od 13 aminokiselinskih ostataka, predstavlјaju primere izvođenja predmetnog pronalaska.
PRIMER 5
In vivo aktivnost skraćenih FGF21 proteina
[0137] FGF21 poseduje brojne biološke aktivnosti, uklјučujući sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida ili holesterola u krvi; smanjenje telesne težine; ili pobolјšanje tolerancije na glukozu, potrošnje energije ili osetlјivosti na insulin. Dalje su stoga analizirani skraćeni FGF21 polipeptidi u kontekstu in vivo aktivnosti FGF21, uvođenjem skraćenih FGF21 polipeptida u ob/ob miševe rezistentne na insulin i zatim merenjem sposobnosti određenog skraćenog FGF21 polipeptida da snizi glukozu u krvi. Ispitivani skraćeni FGF21 polipeptid intraperitonealno je injeciran u ob/ob miša starog 8 nedelјa (Jackson Laboratory), a uzorci krvi su uzimani u različitim vremenskim tačkama nakon jednokratnog injeciranja, npr. 0, 6, 24, 72, 120 i 168 sati nakon injeciranja. Nivo glukoze u krvi su mereni OneTouch glukometrom (LifeScan, Inc. Milpitas, Kalifornija), a rezultati su izražavani kao procentualna promena glukoze u krvi u odnosu na bazalni nivo glukoze u krvi (tj. u vremenu 0).
[0138] Rezultati jednog eksperimenta su dati na Slici 3, koja pokazuje količinu glukoze u krvi detektovanu kod miševa kojima su injecirani FGF21 mutanti sa 8-181 i 9-181 skraćenjima. Ovaj eksperiment je pokazao da skraćeni FGF21 fuzioni proteini, koji sadrže aminokiselinske ostatke 8-181, ispoljavaju aktivnost snižavanja glukoze u krvi in vivo međutim, aktivnost je bila neznatno manja u odnosu na aktivnost FGF21 divlјeg tipa 3 i 6 sati nakon injeciranja, ali takođe i da skraćeni FGF21 fuzioni proteini koji sadrže aminokiselinske ostatke 9-181 ne ispoljavaju takvu aktivnost. In vivo analiza skraćenih FGF21 polipeptida je stoga pokazala da delecija do 7 aminokiselina na N-kraju zrelog FGF21 ne ukida biološku aktivnost molekula (za razliku od in vitro analize, koja je ukazala da bi delecija 7 aminokiselina sa N-kraja zrelog FGF21 ugrozila aktivnost).
[0139] Različiti rezultati dobijeni sa određenim N-terminalno skraćenim FGF21 polipeptidima (npr. FGF218-181) u in vitro i in vivo testovima, mogu biti objašnjeni interakcijom FGF21 sa β-Kloto i FGF receptorom u ostvarenju signalne transdukcije. Preciznije, FGF21 aktivira dualni receptorski kompleks koji sadrži β-Kloto ko-receptor i FGF receptor (FGFR), a koji pokreće signalnu kaskadu koja uklјučuje tirozin kinazu. Pokazano je takođe da je N-kraj FGF21 uklјučen u vezivanje i aktivaciju FGFR, dok je C-kraj FGF21 potreban za interakciju sa β-Kloto (Yie i saradnici, 2009 FEBS Lett. 583:19-24). ELK-luciferazni in vitro test je izvođen u 293 ćelijama bubrega u kojima je β-Kloto ko-receptor prekomerno eksprimiran, a FGFR je eksprimiran u normalnim nivoima. Količina FGFR je niska u odnosu na β-Kloto i odnos β-Kloto prema FGFR u 293 ćelijama stoga nije fiziološki, što može uticati na obrazovanje receptorskog kompleksa i konačno na vezivanje liganda i aktivaciju FGFR. Deluje da je in vitro 293 sistem osetljiviji na N-terminalno skraćene FGF21 polipeptide i stoga je možda proizveo gubitak rezultata aktivnosti za nekoliko ispitivanih N-terminalno skraćenih mutanata, kao što je FGF218-181.
Prema tome, pri određivanju da li je određeni N-terminalno skraćeni FGF21 mutant zadržao aktivnost FGF21 divlјeg tipa, aktivnost tog FGF21 mutanta in vivo se razmatra kao odlučujuća. Prema tome, skraćeni FGF21 polipeptidi sa skraćenjima na N-kraju manjim od 8 aminokiselinskih ostataka, obuhvaćeni su pronalaskom.
PRIMER 6
Priprema i ekspresija skraćenih FGF21 fuzionih proteina
[0140] Pošto poluživot proteina može biti povećan fuzijom proteina sa Fc sekvencom, pripremani su i analizirani fuzioni proteini koji sadrže skraćene FGF21 polipeptide. Skraćeni fuzioni proteini FGF21, navedeni u Tabeli 6, pripremani su iz amplifikovanih sekvenci FGF21, upotrebom SOEing (uz obradu gena preklapanjem ekstenzija) PCR-a. FGF21 fuzioni proteini su pripremani i tako da Fc deo humanog imunoglobulinskog IgG1 gena (SEQ ID BR:11) bude fuzionisan ili sa N-krajem ili C-krajem FGF21 proteina.
Tabela 6
[0141] Preciznije, konstrukti FGF21 fuzionih proteina (uklјučujući one koji kodiraju skraćene FGF21 fuzione proteine) bili su pripremani u serijama od po tri reakcije amplifikacije, upotrebom suštinski istih reakcionih uslova koji su opisani u Primeru 1. U prvoj reakciji, par prajmera je dizajniran tako da proizvede sekvencu koja sadrži NdeI mesto za kloniranje (uklјučujući N-terminalni metionin za ekspresiju u bakterijama), Fc region i linkersku sekvencu. U drugoj reakciji, par prajmera je kreiran tako da proizvede sekvencu koja sadrži preklapajući deo linkera, deo kodirajuće sekvence FGF21 i EcoRI mesto za kloniranje. Konačno, u trećoj reakciji, dizajniran je par prajmera u svrhu povezivanja produkata prve dve reakcije. Set prajmera za primer za konstruisanje Fc-FGF211-181 je naveden u Tabeli 7.
Tabela 7
[0142] Proizvod finalne reakcije je dalje podvrgavan digestiji sa restrikcionim endonukleazama NdeI i EcoRI, nakon čega je ligiran u pET30 vektor, a zatim su njime transformisane kompetentne ćelije. Dobijeni klonovi su sekvencirani, da bi se potvrdilo odsustvo grešaka generisanih polimerazom.
PRIMER 7
In vivo aktivnost skraćenih FGF21 fuzionih proteina
[0143] Fuzioni proteini koji sadrže skraćenu sekvencu FGF21 fuzionisanu sa Fc sekvencom, generisani su i analizirani, da bi se odredila in vivo aktivnost. Skraćeni fuzioni FGF21 proteini su pripremani fuzionisanjem IgG1 Fc molekula sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem skraćenog FGF21 proteina, da bi se obrazovala jedna kontinualna sekvenca. Da bi se napravila jasna razlika između N-terminalnih i C-terminalnih fuzija, FGF21 fuzioni proteini u kojima je molekul Fc fuzionisan sa N-terminalnim krajem FGF21 proteina su označavani kao Fc-FGF21, dok su fuzioni proteini u kojima je molekul Fc spojen sa C-terminalnim krajem FGF21 proteina su označavani kao FGF21-Fc.
[0144] FGF21 poseduje brojne biološke aktivnosti, uklјučujući sposobnost smanjenja nivoa glukoze, insulina, triglicerida ili holesterola u krvi; smanjenja telesne težine; ili pobolјšanje tolerancije na glukozu, potrošnje energije ili osetlјivosti na insulin. Da bi se procenila in vivo aktivnost FGF21, FGF21 polipeptidi, FGF21 polipeptidni mutanti i fuzioni FGF21 polipeptidi su uvođeni u ob/ob miševe rezistentne na insulin i merena je sposobnost određenog FGF21 proteina da snizi nivoe glukoze u krvi. Ispitivani FGF21 polipeptid, FGF21 mutantni polipeptid ili FGF21 fuzioni polipeptid su intraperitonealno injecirani u ob/ob miševe stare 8 nedelјa (Jackson Laboratory), a uzorci krvi su uzimani u različitim vremenskim tačkama nakon jednokratnog injeciranja, npr.0, 6, 24, 72, 120 i 168 sati nakon injeciranja. Nivoi glukoze u krvi su mereni OneTouch glukometrom (LifeScan, Inc. Milpitas, Kalifornija), a rezultati su izražavani kao procentualna promena glukoze u krvi u odnosu na bazalni nivo glukoze u krvi (tj. u vremenu 0).
[0145] Rezultati jednog eksperimenta su prikazani na Slici 4, koja pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi uočene kod miševa kojima su injecirani kontrolni PBS, kontrolni Fc-FGF21 divljeg tipa koji je sadržavao aminokiselinske ostatke 1-181 ili skraćeni Fc-FGF21 fuzioni proteini koji su sadržavali aminokiselinske ostatke 5-181 ili 7-181. Ovaj eksperiment je pokazao da skraćeni Fc-FGF21 fuzioni proteini koji sadrže aminokiselinske ostatke 5-181 ili 7-181, pokazuju aktivnost smanjenja nivoa glukoze u krvi koja je slična aktivnosti Fc-FGF21 divljeg tipa, 6 sati nakon injeciranja. In vivo analiza skraćenih FGF21 polipeptida je stoga pokazala da delecija do 6 aminokiselina sa N-kraja zrelog FGF21 ne utiče na biološku aktivnost molekula. In vivo analiza je takođe pokazala, međutim, da je sposobnost skraćenih FGF21 polipeptida da smanje količinu glukoze u krvi bila smanjena i da su se nivoi glukoze u krvi vratili na bazalni nivo 24 sata nakon injeciranja (slični rezultati su dobijeni za FGF21 divljeg tipa). Pokazano je i da je kratkotrajna in vivo aktivnost rezultat proteolitičke razgradnje FGF21, kao što je opisano u Primeru 8.
[0146] Rezultati drugog eksperimenta su prikazani na Slici 5, koja pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi uočene kod miševa kojima su injecirani kontrolni PBS, kontrolni Fc-FGF21 divljeg tipa koji je sadržavao aminokiselinske ostatke 1-181, skraćeni FGF21-Fc fuzioni protein koji je sadržavao ostatke 1-175 ili skraćeni Fc-FGF21 protein koji je sadržavao aminokiselinske ostatke 1-171. Ovaj eksperiment je pokazao da FGF21 divljeg tipa koji sadrži aminokiselinske ostatke 1-181, vezan sa Fc, ima dugotrajnu aktivnost smanjenja količine glukoze, a koji dovodi do smanjenja nivoa glukoze u krvi od približno 30% tokom vremenskog perioda od 24 sata do 120 sati nakon injeciranja. Skraćeni Fc-FGF21 protein koji sadrži aminokiselinske ostatke 1-171, ispoljava odloženu aktivnost smanjena količine glukoze u krvi, koja je očigledna tek 72 sata nakon injeciranja. Ipak, uočena aktivnost je ista kao aktivnost FGF21 divljeg tipa vezanog za Fc. Skraćeni fuzioni FGF21-Fc protein koji sadrži ostatke 1-175 nije bio aktivan in vivo u kontekstu smanjenja glukoze u krvi.
[0147] Zajedno, eksperimenti skraćivanja koji su ovde opisani su pokazali da skraćeni FGF21 fuzioni proteini, koji imaju N-terminalno skraćenje, ispoljavaju aktivnost snižavanja glukoze u krvi koja je slična aktivnosti FGF21 fuzionog proteina divljeg tipa, a zatim i da skraćeni FGF21 fuzioni proteini, u kojima je Fc molekul fuzionisan sa N-terminalnim krajem skraćenog FGF21 proteina, ispoljavaju veću aktivnost od fuzionih proteina u kojima je Fc molekul fuzionisan sa C-terminalnim krajem skraćenog FGF21 proteina.
PRIMER 8
Utvrđena in vivo degradacija FGF21
[0148] Degradacija FGF21 je najpre uočena sa konstruktima FGF21 Fc fuzionih proteina, kao što je opisano u Primeru 7. In vivo farmakokinetička analiza je pokazala da humani FGF21 ima kratak poluživot od oko 1 sata kod miševa, usled brzog klirensa i in vivo degradacije. Prema tome, da bi se produžio poluživot FGF21, Fc sekvenca je fuzionisana sa N- ili C-terminalnim krajem FGF21 polipeptida. Ipak, fuzija Fc regiona nije u potpunosti rešila pitanje poluživota, pošto fuzioni proteini u kojima je Fc sekvenca fuzionisana sa N- ili C-terminalnim krajem FGF21 polipeptida (a posebno Fc-FGF21 fuzije, tj. u kojima je Fc sekvenca fuzionisana sa N-krajem zrelog FGF21), nisu pokazali očekivanu in vivo efikasnost, a umesto toga je utvrđeno da održavaju aktivnost snižavanja glukoze u krvi ne duže od 24 sata kod ob/ob miševa. Kao što je opisano na Slici 4, Fc-FGF21 fuzioni proteini su smanjili nivo glukoze u krvi za oko 30-40% tokom 6 sati nakon injeciranja, dok se nivo glukoze u krvi vratio na bazalni nivo nakon 24 sata.
[0149] Proteolitička degradacija FGF21 divljeg tipa je naknadno istražena i utvrđeno je da je brz gubitak aktivnosti in vivo Fc-FGF21 fuzionih proteina rezultat in vivo degradacije FGF21. Proteolitička degradacija dovodi do smanjenja biološke aktivnosti molekula in vivo, samim tim i do skraćenog njegovog efektivog poluživota. Takva degradacija stoga nepovoljno utiče na terapijsku upotrebu tog molekula. Uočena degradacija FGF21 Fc fuzionih proteina je posledično vodila istraživanju proteolitičke degradacije FGF21 in vivo i identifikaciji FGF21 mutanata rezistentnh na takvu degradaciju.
[0150] Da bi se odredila mesta degradacije, LC-MS analiza i Edmanovo sekvenciranje su izvođeni na humanom FGF21 divljeg tipa i FGF21 Fc fuzionim proteinima dobijenim u raznim vremenskim tačkama nakon injeciranja u mužjake C57B6 miševa. Edmanovo sekvenciranje je doprinelo potvrdi da li je N-terminalni ili C-terminalni kraj proteina bio podvrgnut degradaciji. Kada je Fc sekvenca bila fuzionisana sa N-krajem humanog FGF21, uočeno je da se degradacija odvijala u okviru peptidne veze između aminokiselinskih ostataka 151 i 152, kao i između aminokiselinskih ostataka 171 i 172 u delu humanog FGF21 fuzionog molekula (predhodno navedeni broj ostataka se zasniva na sekvenci zrelog FGF21 i ne uklјučuje Fc deo fuzionog proteina). Utvrđeno je i da se najpre dešava degradacija u okviru 171-172, nakon čega sledi degradacija između ostataka 151-152. Deluje da je degradacija između 171-172 ograničavajući korak i da ista određuje poluživot molekula. Kada je Fc sekvenca fuzionisana sa C-krajem FGF21, utvrđeno je da je degradovana peptidna veza između aminokiselinskih ostataka 4 i 5, kao i između aminokiselinskih ostataka 20 i 21. Kao rezultat ovih eksperimenata, zaključeno je da Fc sekvenca štiti od degradacije deo FGF21 sekvence koji se nalazi susedno od Fc sekvence. Analiza in vivo degradacije FGF21 divljeg tipa i Fc-FGF21 fuzionih proteina je dalјe sprovedena u Cynomolgus majmunima. Ove studije su potvrdile da je mesto isecanja u FGF21 između aminokiselinskih ostataka 171-172 zapravo glavno mesto degradacije u majmunima, kao i da je ovo mesto razgradnje očuvano između miševa i primata.
PRIMER 9
Identifikacija FGF21 mutanata rezistentnih na proteolizu
[0151] Pogodni FGF21 mutanti su identifikovani eksperimentalnim određivanjem pozicija u sekvenci FGF21 divlјeg tipa koje su mesta glavne proteolitičke aktivnosti, kao i uvođenjem specifičnih aminokiselinskih supstitucija na ovim mestima. Aminokiselinske supstitucije su bile zasnovane na očuvanju FGF21 sekvence među vrstama (kao što je opisano u Primeru 8), kao i biohemijskom očuvanju sa drugim aminokiselinskim ostacima. Spisak aminokiselinskih supstitucija koje su bile ili mogu biti uvedene u FGF21 protein divlјeg tipa obezbeđen je u Tabeli 8, iako je Tabela 8 samo primer i mogu biti uvedene i druge supstitucije. Brojevi pozicija koji su navedeni u Tabeli 8 odgovaraju pozicijama ostataka u zrelom FGF21 proteinu, koji se sastoji od 181 aminokiselinskih ostataka.
Tabela 8
PRIMER 10
In vivo analiza razgradnje Fc-FGF21 i FGF21-Fc
[0152] Stabilnost FGF21 Fc fuzionih proteina in vivo, određivana je injeciranjem miševa sa fuzionim proteinom, uzorkovanjem krvi iz miševa u različitim vremenskim tačkama i analizom seruma sa postupkom tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Preciznije, miševima je intraperitonealno injecirano 10 mg/kg Fc-(G5)-FGF21 (SEQ ID NO:107) (eksprimiranog u E. coli i prečišćenog kao što je opisano u Primeru 2) ili FGF21-(G3)-Fc (SEQ ID NO:105) (eksprimiranog u sisarskim ćelijama i prečišćenog u skladu sa standardnim procedurama). Krv je uzorkovana iz miševa 6, 24 i 48 sati nakon injeciranja (Tabela 9) i prikuplјana je u EDTA epruvete prethodno tretirane koktelima inhibitora za proteaze (Roche Diagnostics). Plazma je izdvojena centrifugiranjem uzoraka na 12,000xg tokom 10 minuta. FGF21 proteini su afinitetno prečišćeni iz krvi, upotrebom agarozne smole sa anti-humanim-Fc.
Tabela 9
[0153] Pre analize uzoraka koji su bili afinitetno prečišćeni LC-MS postupkom, standardi Fc-(G5)-FGF21 i FGF21-(G3)-Fc proteina su analizirani kao referentni. Protinski standardi su bili redukovani sa tris[2-karboksietil] fosfinom (TCEP) ili nisu bili redukovani. Redukovani i neredukovani standardi su analizirani LC-MS postupkom, upotrebom ACE cijano 0,3 mm x 30 cm kolone, uz raspršivanje efluenta na koloni, u klasičnom LQK masenom spektrometru sa jonskom zamkom. Pošto su dekonvolucioni spektri redukovanih uzoraka bili čistiji, afinitetno prečišćeni uzorci su dalje redukovani pre LC-MS analize.
[0154] Uočene mase za redukovani Fc-(G5)-FGF21 standard i uzorke D6, D24 i D48, prikazane su na Slikama 6A-6D. Uočene mase za redukovani FGF21-(G3)-Fc standard i uzorke E6, E24 i E48, prikazane su na Slikama 7A-7D. Pojedini od eluata standarda i uzoraka su podvrgavani Edmanovom sekvenciranju da bi se potvrdio N-kraj proteina i fragmenata koji su utvrđivani LC-MS postupkom. Rezultati LC-MS analize standarda i uzoraka dati su u Tabeli 10.
Tabela 10
[0155] Kao što je naznačeno u Tabeli 10, svi afinitetno prečišćeni uzorci su pokazali određen stepen degradacije nakon samo 6 sati cirkulisanja. Nakon 24 sata cirkulisanja, glavni proizvod Fc-(G5)-FGF21 je bio fragment koji se sastojao od aminokiselinskih ostataka 1-404, što je viđeno i u D i E uzorcima. U E uzorcima, međutim, glavni proizvod FGF21-(G3)-Fc je bio fragment koji se sastojao od aminokiselinskih ostataka 5-410. Za oba ispitivana fuziona proteina, FGF21 deo fuzionog proteina je bio podložniji degradaciji od Fc dela proteina.
PRIMER 11
Priprema i ekspresija FGF21 mutanata i fuzionih proteina rezistentnih na proteolizu
[0156] Konstrukti koji kodiraju FGF21 mutante navedene u Tabeli 11, pripremani su PCR amplifikacijom ekspresionog vektora sa FGF21 divlјeg tipa, kao što je opisano u nastavku teksta (konstruisanje ekspresionog vektora sa FGF21 divlјeg tipa je opisano u Primeru 1). Kada je linker bio uklјučen u konstrukt, upotrebljeni linker je bio GGGGGSGGGSGGGGS („L15,“ SEQ ID NO:28). Cilј ovih eksperimenata je bio da se generišu FGF21 mutanti koji su rezistentni na proteolizu i ispoljavaju duži poluživot.
Tabela 11
[0157] Konstrukti FGF21 mutanata su pripremani upotrebom prajmera sa sekvencama homolognim regionima uzvodno i nizvodno od kodona (ili više kodona) koji će biti mutirani. Prajmeri upotrebljeni u takvim reakcijama amplifikacije takođe su obezbeđivali preklapajuće sekvence od približno 15 nukleotida, da bi se omogućila ponovna ciklizacija amplifikovanog proizvoda, odnosno dobijanje celokupnog vektora koji tada sadrži želјenog mutanta.
[0158] Konstrukt FGF21 mutanta za primer, koji kodira FGF21 mutant sa ostatkom glutaminske kiseline na poziciji 170 umesto nativnog glicinskog ostatka (tj. G170E mutant), pripreman je upotrebom prajmera prikazanih u Tabeli 12.
Tabela 12
[0159] Prajmeri prikazani u Tabeli 12 omogućavaju supstituciju glicinskog ostatka sa ostatkom glutaminske kiseline, kao što je prikazano u nastavku teksta, pri čemu je gornja sekvenca sens prajmer (SEQ ID NO:23), druga i treća sekvenca (SEQ ID NO:25 i 27) su delovi ekspresionog konstrukta FGF21, a četvrta sekvenca je antisens prajmer (SEQ ID NO:26):
[0160] Konstrukti FGF21 mutanta su pripremani upotrebom suštinski istih PCR uslova koji su opisani u Primeru 1. Proizvodi amplifikacije su zatim podvrgavani digestiji sa DpnI restrikcionom endonukleazom, nakon čega su njima transformisane kompetentne ćelije. Dobijeni klonovi su sekvencirani, da bi se potvrdilo odsustvo grešaka generisanih polimerazom. Fc-(L15)-FGF21 i FGF21-(L15)-Fc fuzioni proteini su generisani kao što je ovde opisano, npr. u Primeru 6.
[0161] FGF21 mutanti su eksprimirani transformisanjem kompetentnih BL21 (DE3) ili BL21 Star ćelija (Invitrogen; Carlsbad, Kalifornija) sa konstruktom koji je kodirao određenog mutanta. Transformanti su uzgajani preko noći uz ograničenu aeraciju, u TB medijumu sa dodatkom 40 µg/mL kanamicina, nakon čega su sledećeg jutra aerirani, i nakon kratkog perioda oporavka, indukovani u 0,4 mM IPTG. FGF21 mutantni polipeptidi su prikuplјani centrifugiranjem, 18-20 sati nakon indukcije.
[0162] FGF21 mutanti su takođe analizirani u kontekstu predviđanja imunogenosti. Imunski odgovori na proteine su pojačavani obradom i prezentacijom antigena na mestu vezivanja glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II. Ovakva interakcija je potrebna za pomoć T-ćelijama u sazrevanju antitela koja prepoznaju protein. Pošto su mesta vezivanja molekula MHC klase II okarakterisana, moguće je predvideti da li proteini imaju specifične sekvence koje mogu biti vezane za niz uobičajenih humanih alela. Na osnovu referenci iz literature i kristalnih struktura MHC klase II, kreirani su kompjuterski algoritmi, da bi se utvrdilo da li linearne aminokiselinske peptidne sekvence imaju potencijal da naruše imunsku toleranciju. Kompjuterski program TEPITOPE je upotrebljavan da bi se utvrdilo da li bi tačkaste mutacije, posebno u FGF21 mutantima, povećale T-ćelije specifične za antigen kod većine lјudi. Na osnovu analize linearne proteinske sekvence svakog FGF21 mutanta, nije bilo predviđeno da bilo koji od mutanata pojača imunogenost.
PRIMER 12
Uticaj sekvence linkera na degradaciju FGF21
[0163] Da bi se utvrdilo da li prisustvo dužeg aminokiselinskog linkera između Fc sekvence i FGF21 sekvence utiče na degradaciju FGF21, miševima su injecirani FGF21 fuzioni proteini u kojima je Fc region bio razdvojen od FGF21 sekvence linkerom od 15 aminokiselina sekvence GGGGGSGGGSGGGGS (označenim kao "L15," SEQ ID NO:28), nakon čega je iz miševa uzorkovana krv u različitim vremenskim tačkama i serum je analiziran LC-MS postupkom. Preciznije, miševima je injeciran Fc-(L15)-FGF21 ili FGF21-(L15)-Fc (dobijen iz E. coli) u dozi od 23 mg/kg, krv je uzorkovana nakon 6, 24 i 48 sati i uzeta krv je afinitetno prečišćena upotrebom agarozne smole sa anti-humanim-Fc.
[0164] Pre analize prečišćenih uzoraka LC-MS postupkom, standardi Fc-(L15)-FGF21 i FGF21-(L15)-Fc proteina su analizirani kao referentni. Proteinski standardi su bili ili redukovani sa TCEP ili nisu bili redukovani. I redukovani i neredukovani standardi su analizirani LC-MS postupkom, upotrebom ACE cijano kolone od 0,3 mm x 30 cm, uz raspršivanje efluenta na kolini, u klasičnom LQK masenom spektrometru sa jonskom zamkom. Pošto su dekonvolucioni spektri redukovanih uzoraka bili čistiji, afinitetno prečišćeni uzorci su redukovani pre LC-MS analize.
[0165] Uočene mase za redukovani Fc-(L15)-FGF21 standard i odgovarajuće afinitetno prečišćene uzorke uzorkovane u različitim vremenskim tačkama, prikazane su na Slikama 8A-8D. Uočene mase za redukovani FGF21-(L15)-Fc standard i odgovarajuće afinitetno prečišćene uzorke uzorkovane u različitim vremenskim tačkama, prikazane su na Slikama 9A-9D. Pojedini od standardnih i uzorkovanih eluata bili su podvrgnuti Edmanovom sekvenciranju, da bi se potvrdio N-kraj proteina i pomoglo u predviđanju identiteta fragmenata uočenih LC-MS postupkom. Rezultati LC-MS analize standarda i uzoraka, kao i naznake predviđenih fragmenata obezbeđeni su u Tabeli 13.
Tabela 13
[0166] Kao što je naznačeno u Tabeli 13, svi afinitetno prečišćeni uzorci su pokazali određeni stepen degradacije nakon samo 6 sati cirkulisanja. Nakon 24 sata cirkulisanja, glavni proizvodi Fc-(L15)-FGF21 su bili fragmenti koji su se sastojali od aminokiselinskih ostataka 1-414 (85% uzorka) i 1-394 (15% uzorka), dok su glavni proizvodi FGF21 (15)Fc bili fragmenti koji su se sastojali od aminokiselinskih ostataka 1-423 (40% uzorka), 6-423 (35% uzorka) i 22-423 (25% uzorka). Identifikovane tačke cepanja za Fc-(L15)-FGF21 i FGF21-(L15)-Fc proteine su prikazane na Slikama 10A i 10B, tim redom.
PRIMER 13
In vivo aktivnost Fc-(L15)-FGF21 mutanata rezistentnih na proteolizu, 1-7 dana nakon injeciranja
[0167] Kao što je ovde opisano, proteolitičko cepanje FGF21 Fc fuzionih proteina zavisi od orijentacije Fc sekvence, pri čemu je Fc kraj fuzionog proteina stabilniji od FGF21 kraja fuzionog proteina (tj. utvrđeno je da su N-terminalni deo Fc-(L15)-FGF21 fuzionih proteina i C-terminalni deo FGF21-(L15)-Fc fuzionih proteina stabilniji). Na primer, cepanje je identifikovano na pozicijama 5 i 21 u FGF21-(L15)Fc i na pozicijama 151 i 171 u Fc-(L15)-FGF21.
[0168] Kao rezultat ovih zapažanja, sprovedeno je istraživanje da bi se identifikovali FGF21 mutanti koji su rezistentni na proteolizu. LC-MS analiza Fc-(L15)-FGF21 pokazuje da se in vivo proteolitička degradacija najpre odvija između aminokiselinskih ostataka 171-172, nakon čega sledi degradacija između aminokiselinskih ostataka 151-152. Blokiranjem proteolitičke degradacije na poziciji 171, cepanje na poziciji 151 može biti sprečeno, efektivno produžavajući poluživot molekula. Ipak, mutanti rezistentni na proteolizu kod kojih je cepanje sprečeno na poziciji 151 i dalјe mogu posedovati ostatke na poziciji 171 koji su podložni napadu proteaza, što dovodi do molekula kome nedostaje poslednjih 10 aminokiselina, a za koje je poznato da su uklјučeni u vezivanje β-Kloto ko-receptora, koji je determinanta afiniteta ligandnog receptora, kao i in vitro i in vivo potencije. Deluje stoga da je mutageneza aminokiselinskih ostataka koji okružuju poziciju 171 u zrelom FGF21 kritičnija za pobolјšanje in vivo stabilnost, potencije i efikasnost molekula.
[0169] In vivo aktivnost određenih Fc-(L15)-FGF21 mutanata rezistentnih na proteolizu je analizirana intraperitonealnim injeciranjem FGF21 mutanta ob/ob miševima, nakon čega je sledilo uzorkovanje krvi iz injeciranih miševa 0, 0,25, 1, 3, 5 i 7 dana nakon injeciranja, a zatim i merenje nivoa glukoze u krvi u uzorcima. Rezultati jednog eksperimenta su dati na Slici 11, koja prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani kontrloni PBS, kontrolni Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO:49) ili Fc-(L15) -FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 P171A (SEQ ID NO:53), Fc-(L15)-FGF21 S172L (SEQ ID NO:55), Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO:59), or Fc-(L15)-FGF21 G151A (SEQ ID NO:61). Slika 12 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi, koji su utvrđeni u ovom eksperimentu. Ovaj eksperiment pokazuje da Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, Fc-(L15)-FGF21 S172L i Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A, S172L) mutant ispoljavaju produženu aktivnost u snižavanju glukoze u krvi do 5 dana, što je superiornije u odnosu na aktivnosti Fc-(L15)-FGF21 divlјeg tipa. Fc-(L15)-FGF21 G151A mutant je samo delimično pobolјšao trajnost aktivnosti snižavanja glukoze u krvi u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 fuzionim proteinom divlјeg tipa. Iznenađujuće, iako Fc-(L15)-FGF21 S172L mutant nije bio mutant rezistentan na proteolizu i stoga je imao sličan profil degradacije kao Fc-(L15)-FGF21 polipeptid divlјeg tipa, utvrđeno je da ovaj mutant ispoljava pobolјšanu in vivo efikasnost u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 polipeptidom divlјeg tipa.
[0170] Rezultati drugog eksperimenta su navedeni na Slici 13, koja prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani kontrloni PBS, kontrolni Fc-(L15)-FGF21 ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A, I152V) (SEQ ID NO:65), Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A) (SEQ ID NO:63) ili Fc-(L15)-FGF21 (G170E, S172L) (SEQ ID NO:67). Slika 14 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi, koji su utvrđeni u ovom eksperimentu. Kao u prethodno opisanom eksperimentu, fuzioni protein Fc-FGF21 divlјeg tipa i Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A, I152V) mutanta, ne ispoljava trajnu aktivnost snižavanja glukoze u krvi, verovatno pošto se degradacija na 171 mestu može i dalje odvijati, a nivoi glukoze u krvi kod životinja kojima su injecirani ovi proteini su se vratili na bazalni nivo 24 sata nakon injeciranja. Ipak, Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A) ili Fc-(L15)-FGF21 (G170E, S172L) ispoljavaju maksimalnu aktivnost snižavanja glukoze u krvi do 5 dana nakon injeciranja, što je superiornije u odnosu na fuzioni protein Fc-(L15)-FGF21 divlјeg tipa i Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A, I152V) mutanta.
[0171] Rezultati drugog eksperimenta su dati na Slici 15, koja prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani kontrolni PBS ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO:73), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO:75) ili Fc-(L15)-FGF21 G170S (SEQ ID NO:77). Slika 16 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi koji su utvrđeni u ovom eksperimentu. Svi od FGF21 mutanata ispitivanih u ovom eksperimentu su ispoljili trajnu aktivnost snižavanja glukoze u krvi do 5 dana nakon injeciranja.
[0172] Rezultati drugog eksperimenta su obezbeđeni na Slici 17, koja prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima su injecirani PBS ili Fc-(L15)-FGF21 mutanti Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO:79), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO:81), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) ili Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87). Slika 18 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi koji su utvrđeni u ovom eksperimentu. Svi od FGF21 mutanata koji su ispitivani u ovom eksperimentu pokazali su pobolјšanu aktivnost snižavanja glukoze u krvi u poređenju sa Fc-FGF21 divljeg tipa.
PRIMER 14
In vivo degradacija Fc-(L15)-FGF21 mutanata rezistentnih na proteolizu, 6 do 120 sati nakon injeciranja
[0173] In vivo stabilnost izabranih FGF21 mutanata je analizirana injeciranjem miševa sa FGF21 mutantom, uzorkovanjem krvi iz miševa u različitim vremenskim tačkama i analizom seruma LC-MS postupkom. Preciznije, miševima su injecirani bilo Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A ili Fc-(L15)-FGF21 S172L mutanti (dobijeni iz E. coli kao što je opisano u Primeru 2), od kojih je svaki razblaživan u približno 180 µL 10 mM HCl pre injeciranja, nakon čega je krv uzorkovana nakon 6, 24, 48, 72 i 120 sati. FGF21 proteini su afinitetno prečišćeni iz izvađene krvi, upotrebom kolone sa agaroznom smolom za koju je bio vezan anti-humani-Fc. Uzorci su eluirani iz kolone upotrebom 10 mM HCl. Svi od FGF21 konstrukata su sadržavali Fc region i linker od 15 aminokiselina na aminoterminalnom kraju FGF21 proteina. Miševima je takođe injeciran kontrolni FGF21 divlјeg tipa.
[0174] Pre analize afinitetno prečišćenih uzoraka LC-MS postupkom, neobrađeni FGF21 divljeg tipa i neobrađeni FGF21 mutanti su analizirani kao referentni. Svi standardi i uzorci iz vremenskih tačaka su najpre bili redukovani sa TCEP, a zatim su analizirani LC-MS postupkom, upotrebom ACE cijano 0,3 mm x 30 cm kolone, uz raspršivanje efluenta u koloni, na klasičnom LCQ masenom spektrometru sa jonskom zamkom. Afinitetno prečišćeni uzorci su razblaživani amonijum acetatom i redukovani sa TCEP, a zatim su analizirani LC-MS postupkom, kao što je prethodno opisano.
[0175] Uočene mase za Fc-(L15)-FGF21 divljeg tipa, 0, 6, 24 i 48 sati nakon injeciranja, prikazane su na Slikama 19A-19D, tim redom. Uočene mase za Fc-(L15)-FGF21 G170E, 0, 6, 24 i 48 sati nakon injeciranja, prikazane su na Slikama 20A-20D, tim redom. Uočene mase za Fc-(L15)-FGF21 P171A, 0, 6, 24 i 48 sati nakon injeciranja prikazane su na Slikama 21A-21D, tim redom. Uočene mase za Fc-(L15)-FGF21 S172L, 0, 6, 24 i 48 sati nakon injeciranja, prikazane su na Slikama 22A-22D, tim redom.
[0176] Utvrđeno je da svi od uzoraka uzetih nakon 72 i 120 sati sadrže fibrinogensku komponentu visoke molekulske težine (>200 kDa, neredukujući SDS-PAGE) koja je mnogo zastuplјenija od preostalog Fc-(L15)-FGF21 fuzionog proteina. Rezultati LC-MS analize ostalih standarda i uzoraka navedeni su u Tabeli 14.
Tabela 14
[0177] Kao što je navedeno u Tabeli 14, degradacija Fc-(L15)-FGF21 divlјeg tipa i S172L mutanta izgledaju slično, po tome što je nakon 24 sata cirkulisanja, glavni proizvod fuzionog proteina bio fragment koji se sastojao od aminokiselinskih ostataka 1-414. Proizvodi razgradnje Fc-(L15)-FGF21 G170E i Fc-(L15)-FGF21 P171A mutanata takođe su izgledali slično po tome što uzorci, uzeti nakon 24 sata cirkulisanja, sadržavali 70-80% intaktnog proteina (aminokiseline 1-424) i 20-30% fragmenta koji se sastojao od aminokiselinskih ostataka 1-421. Čak i nakon 48 sati, Fc-(L15)-FGF21 G170E i Fc-(L15)-FGF21 P171A mutanti su i dalje zadržali intaktni protein uz ispoljavanje povećane količine fragmenta koji se sastojao od aminokiselinskih ostataka 1-421. Kao što je zapaženo u prethodnim analizama Fc-FGF21 konstrukata, detektovana je degradacija FGF21 dela fuzionog proteina i utvrđeno je da je Fc deo ostao stabilan. Mesta cepanja identifikovana za protein divljeg tipa, Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fc-(L15)-FGF21 P171A i Fc-(L15)-FGF21 S172L, prikazana su na Slikama 23A-23D, tim redom.
PRIMER 15
Identifikacija FGF21 mutanata sa smanjenom sklonošću agregaciji
[0178] Jedna od osobina FGF21 divlјeg tipa je njegova sklonost agregaciji. S obzirom na ovu osobinu, bilo je poželјno generisati FGF21 mutante sa smanjenim sklonošću agregaciji. FGF21 mutanti sa smanjenim sklonošću agregaciji identifikovani su na osnovu dve hipoteze. Prva hipoteza je da, u odnosu na FGF21, sklonost agregaciji (ili dimerizaciji) pokreću hidrofobne interakcije i van der Valsove interakcije između FGF21 molekula, koje su prouzrokovane hidrofobnim ostacima izloženim hidrofilnom okruženju rastvarača na bazi vode. Druga hipoteza je da ovi izloženi hidrofobni ostaci mogu biti supstituisani, da bi se stvorile tačkaste mutacije u FGF21 aminokiselinskoj sekvenci koje smanjuju sklonost agregaciji, bez ugrožavanja aktivnosti FGF21.
[0179] Sistematizovan racionalni pristup za genetički inženjering upotrebljen je za identifikaciju izloženih hidrofobnih ostataka u FGF21. Pošto nije bilo poznatih rendgenskih ili NMR struktura FGF21 koje bi se mogle upotrebljavati za identifikaciju izloženih hidrofobnih ostataka, upotrebljena je rendgenska kristalna struktura visoke rezolucije (1,3 Å) za FGF19 (1PWA), dobijena iz Banke podataka za proteine (PDB, od engl. Protein Databank), a da bi se kreirao 3D homologni model FGF21 upotrebom MOE kompjuterskog programa za modeliranje (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal, Kvebek, Kanada). FGF19 je izabran kao matrica, pošto je među proteinima deponovanim u PDB, FGF19 najsrodniji protein sa FGF21 u pogledu homologije aminokiselinskih sekvenci.
[0180] Dostupnost rastvarača je izračunavana sledećim postupkom, upotrebom MOE. Prva mera površine (SA1) je definisana kao površina pristupačna ostacima, u Å<2>. Dok se određeni aminokiselinski ostatak pojavlјuje u primarnoj sekvenci proteina više puta, svako pojavlјivanje ostatka može imati različitu površinu usled razlika u, između ostalog, blizini ostatka površini proteina, u orijentaciji bočnog lanca ostatka i prostornog položaja susednih aminokiselinskih ostataka. Prema tome, napravljena je i druga mera površine (SA2), gde je ostatak od interesa ekstrahovan iz proteinske strukture zajedno sa svojim susednim ili bliskim ostacima. Ovakvi prostorno susedni ostaci su mutirani in silico u glicine, da bi se uklonili njihovi bočni lanci, a zatim je izračunavana SA2 za ostatak od interesa, generišući time meru ukupne moguće površine za taj ostatak u njegovoj konkretnoj konformaciji. Odnos SA1 prema SA2 (SA1/SA2) može tada obezbediti meru procenta moguće površine za taj ostatak koji je stvarno izložen.
[0181] Nekoliko hidrofobnih ostataka koji su visoko izloženi prema rastvaraču, izabrano je za dalјu analizu, i in silico su uvedene tačkaste mutacije na ovim ostacima, da bi se izabrani ostatak zamenio sa drugim aminokiselinskim ostacima koji se javljaju u prirodi. Promene u termičkoj stabilnosti proteina koje su rezultat različitih supstitucija, izračunavane su upotrebom FGF21 modela i interaktivnog CUPSAT internet programa (Alati za analizu stabilnosti proteina Univerziteta u Kelnu) prema uputstvima obezbeđenim na internet stranici CUPSAT-a. Pogledati, Parthiban i saradnici, 2006, Nucleic Acids Res.34: W239-42; Parthiban i saradnici, 2007, BMC Struct. Biol.7:54. Značajno destabilišuće ili hidrofobne mutacije isklјučene su iz dizajna FGF21 mutanata sa tačkastim mutacijama koje smanjuju sklonost agregaciji. Stabilišuće (ili, u retkim slučajevima, blago destabilišuće) supstitucije koje uvode pobolјšane hidrofilne i/ili jonske karakteristike, smatrane su kandidatima za FGF21 mutante sa smanjenom sklonošću agregaciji.
[0182] Rezime podataka dobijenih kroz ovakav racionalni pristup genetičkog inženjeringa proteina, obezbeđen je u Tabeli 15, koja takođe navodi FGF21 mutante za primer, a kod kojih se očekuje da ispoljavaju smanju sklonost proteinskoj agregaciji i pobolјšanu stabilnost.
Tabela 15
PRIMER 16
Priprema i ekspresija FGF21 mutanata i fuzionih proteina sa smanjenom sklonošću agregaciji
[0183] Konstrukti koje kodiraju FGF21 mutante navedene u Tabeli 16, pripremani su PCR amplifikacijom ekspresionog vektora FGF21 divlјeg tipa kao što je opisano u Primeru 11 (konstrukcija ekspresionog vektora sa FGF21 divlјeg tipa je opisana u Primeru 1). Fuzioni proteini su generisani kao što je ovde opisano, na primer, u Primeru 6. Kada je upotrebljavan linker, to je bio GGGGGSGGGSGGGGS ("L15," SEQ ID NO:28)
Tabela 16
[0184] Agregacija raznih FGF21 proteina, uklјučujući FGF21 divljeg tipa, skraćene FGF21 polipeptide, FGF21 mutante i FGF21 fuzione proteine, analizirana je hromatografijom isklјučivanja po veličini (SEC). Uzorci za analizu su inkubirani na 4°C, sobnoj temperaturi ili 37°C, u raznim vremenskim tačkama, nakon čega su podvrgavani SEC analizi. Eksperimenti su izvođeni na Beckman HPLC sistemu opremlјenom sa SEC kolonom. Za FGF21 divlјeg tipa, upotrebljavani su TOSOHAAS TSK-Gel G2000 SEC kolona i 2x PBS koji je sadržavao 2% izopropil alkohol (mobilna faza). Za FGF21 Fc fuzione proteine i FGF21 mutantne polipeptide, upotrebljavani su TOSOHAAS TSK-Gel G3000 SEC kolona i 2x PBS kao mobilna faza.
PRIMER 17
In vitro aktivnost FGF21 mutanata sa smanjenom sklonošću agregaciji
[0185] Eksperimenti su urađeni da bi se identifikovali mutanti sa smanjenom sklonošću agregaciji, a koji zadržavaju aktivnost FGF21 divlјeg tipa u ELK-luciferaznom in vitro testu. ELK-luciferazni testovi su izvođeni kao što je opisano u Primeru 4. Slike 24A-24C pokazuju rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa FGF21 mutantima FGF21 L99R (SEQ ID NO:109), FGF21 L99D (SEQ ID NO:111) i FGF21 A111T (SEQ ID NO:113) (Slika 24A); FGF21 mutantima FGF21 A129D (SEQ ID NO:115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO:117) i FGF21 A134K (SEQ ID NO:119) (Slika 24B); i FGF21 mutantima FGF21 A134Y (SEQ ID NO:121), FGF21 A134E (SEQ ID NO:123) i FGF21 A129K (SEQ ID NO:125) (Slika 24C). Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da pojedine od mutacija koje smanjuju sklonost agregaciji nisu negativno uticale na aktivnost FGF21, kao što je ispitano u ELK-luciferaznim testovima.
PRIMER 18
Priprema i ekspresija Fc-(L15)-FGF21 kombinovanih mutanata koji pokazuju duži poluživot i niže nivoe agregacije
[0186] Izvestan broj FGF21 kombinovanih mutanata, koji sadrže mutacije za koje je pokazano da smanjuju sklonost agregaciji, kao i da produžavaju poluživot ometanjem proteolitičke degradacije, pripremani su i konjugovani sa IgG1 Fc molekulima (SEQ ID NO:11). Ovakvi FGF21 mutanti su pripremani suštinski na isti način kao što je opisano u Primeru 11.
PRIMER 19
In vitro studije Fc-(L15)-FGF21 mutanata
Koji pokazuju duži poluživot i niže nivoe agregacije
[0187] Eksperimenti su urađeni da bi se identifikovali kombinovani FGF21 mutanti koji zadržavaju aktivnost FGF21 divlјeg tipa u ELK-luciferaznogm in vitro testu. ELK-luciferazni testovi su izvođeni kao što je opisano u Primeru 4.
[0188] Slike 25A-25D pokazuju rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa Fc-(L15)-FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 P171G, Fc-(L15)-FGF21 P171S i Fc-(L15)-FGF21 P171T (Slika 25A); Fc-(L15)FGF21 mutantima Fc-(L15)-FGF21 P171Y, Fc-(L15)-FGF21 P171W i Fc-(L15)-FGF21 P171C (Slika 25B); Fc-(L15)-FGF21, Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) i FGF21 A45K (Slika 25C); kao i Fc-(L15)-FGF21, Fc-(L15)-FGF21 P171E i Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (Slika 25D). Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da mutacije koje imaju za cilј pobolјšanje stabilnosti, ili i stabilnosti i rastvorlјivosti, nisu kompromitovale in vitro aktivnost u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 divljeg tipa. Zanimlјivo je da je FGF21 mutant A45K pokazao pobolјšanu potenciju u odnosu na Fc-(L15)-FGF21 divljeg tipa.
[0189] Slika 26A pokazuje promenu u procentu agregacije za kontrolni FGF21 (WT) i FGF21 A45K nakon inkubacije u koncentraciji od 65 mg/mL proteina, na 4°C, tokom 1, 2 i 4 dana. Podaci su ukazali da A45K mutacija dovodi do smanjenja sklonti agregacije proteina, u poređenju sa proteinom divlјeg tipa.
[0190] Slika 26B prikazuje promenu u procentima agregacije za kontrolni FGF21 (WT) i FGF21 P78C, FGF21 P78R, FGF21 L86T, FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129D, FGF21 A129Q, FGF21 A129K, FGF21 A134K, FGF21 A134Y i FGF21 A134E nakon inkubacije 65 mg/mL proteina na 4°C tokom 1, 6 i 10 dana. Podaci su ukazali da FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129Q i FGF21 A129K dovode do smanjenje sklonosti agregaciji proteina, u poređenju sa proteinom divlјeg tipa.
[0191] Slika 27 prikazuje rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti, urađenog sa humanom FGF21 kontrolom i FGF21 mutantima FGF21 A45K, FGF21 L52T i FGF21 L58E. Ovaj eksperiment pokazuje da FGF21 mutant A45K zadržava punu efikasnost FGF21 divlјeg tipa i ispoljava potenciju koja je čak veća od FGF21 divlјeg tipa. Ipak, mutanti FGF21 L52T i FGF21 L58E ispoljavaju smanjenu potenciju i efikasnost u poređenju sa FGF21 divljeg tipa
[0192] Slike 28A-28B pokazuju promenu nivoa agregacije za Fc-(L15)-FGF21 mutante Fc-(L15)-FGF21 (6-181, G170E), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), Fc-(L15)-FGF21 P171E, Fc-(L15)-FGF21 P171A, Fc-(L15)-FGF21 G170E i FGF21 kontrolu, nakon inkubacije na 4°C tokom 1, 4 i 8 dana. Ovaj eksperiment pokazuje da je tokom perioda od 8 dana, Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) mutant pokazao manju sklonost agregaciji od Fc-(L15)-FGF21 G170E ili Fc-(L15)-FGF21 P171E mutanti, ali sva tri mutanta su pokazala manju sklonost agregaciji od Fc-(L15)-FGF21 kontrola. Tabela 17 pokazuje procenat agregacije dobijen za Fc-(L15)-FGF21 kontrolu i Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) mutant nakon inkubacije na 4°C ili sobnoj temperaturi, tokom 0, 2, 3, 4, ili 7 dana.
Tabela 17
PRIMER 20
Priprema i ekspresija kombinovanih Fc-FGF21 fuzionih mutanata
[0193] Kao što je prethodno opisano, stabilnost i rastvorlјivost FGF21 mogu biti modulisati uvođenjem specifičnih skraćenja i aminokiselinskih supstitucija. Dodatno, stabilnost FGF21 može biti dalje pobolјšana fuzionisanjem takvih modifikovanih FGF21 proteina sa Fc delom humanog imunoglobulinskog IgG1 gena. Štaviše, uvođenjem kombinacija prethodno navedenih modifikacija, mogu biti generisani FGF21 molekuli koji imaju i pobolјšanu stabilnost i rastvorlјivost. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju kombinovane FGF21 mutante, a navedene su u Tabeli 18, pripremane su upotrebom tehnika koje su prethodno opisane. Korišćeni linker je bio L15 linker, GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:28).
Tabela 18
[0194] Slika 29 prikazuje nivoe glukoze u krvi izmerene kod miševa kojima je injecirana kombinacija Fc-(L15)-FGF21 mutanata Fc-(L15)-FGF21 (A45K, G170E), Fc-(L15)-FGF21 (A45K, P171G) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
[0195] U drugom eksperimentu, FGF21 mutant Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) proučavan je istovremeno sa zrelim FGF21 i Fc-FGF21 divlјeg tipa. U jednom eksperimentu, rekombinantna ćelijska linija 293T je kultivisana tokom 6 sati u prisustvu različitih koncentracija FGF21, Fc-(L15)-FGF21 ili Fc(L15) FGF21 (L98R, P171G). Ćelijski lizati su zatim analizirani u pogledu luciferazne aktivnosti. Kao što je prikazano na Slici 30, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je imao sličnu aktivnost kao Fc-(L15)-FGF21, što ukazuje da uvođenje dve tačkaste mutacije nije promenilo in vitro aktivnost molekula.
[0196] U još jednom eksperimentu, stabilnost Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), u koncentraciji od 65 mg/mL, procenjivana je tokom devet dana, na dve različite temperature, odnosno na sobnoj temperaturi i na 4°C, istovremeno sa FGF21 i Fc-(L15)-FGF21. Nakon perioda inkubacije, ćelijski lizati su analizirani SEC-HPLC postupkom, da bi se utvrdio profil agregacije u odnosu na vreme, na različitim temperaturama. Podaci prikazani na Slikama 31A i 31B ukazuju da je stopa obrazovanja agregata bila značajno smanjena u Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), na sobnoj temperaturi (ispunjeni trouglići, isprekidana linija na Slici 31A) i na 4°C (ispunjeni trouglići, isprekidana linija na Slici 31B).
PRIMER 21
FGF21 mutanti rezistentni na proteolizu koji sadrže C-terminalne mutacije
[0197] Ispitivana je takođe in vivo stabilnost kombinovanih mutanata. Preciznije, in vivo stabilnost Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je upoređivana sa stabilnošću Fc-(L15)-FGF21, u mišjim i modelima na Cynomolgus majmunima. Utvrđeno je da su rezultati bili slični kod obe vrste. U studiji na Cynomolgus majmunima, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(L15)-FGF21 su bili IV injecirani u dozi od 23,5 mg/kg, a alikvoti seruma i plazme su prikuplјani u vremenskim tačkama do 840 sati nakon davanja doze. Analizirane su vremenske tačke do 168 sati. Uzorci iz svake vremenske tačke su afinitetno prečišćavani upotrebom anti-Fc reagenasa, nakon čega su analizirani upotrebom MALDI masene spektrometrije. Rezultati su dobro korelirali između ove dve analize.
[0198] Analiziranjem podatake generisanih upotrebom imunoafinitetnog-MALDI postupka, zapaženo je da je isecanje na P171 mestu eliminisano u Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) molekulu kao rezultat mutacije P171 u P171G. Ipak, za Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je uočena manja i spora degradacija, čiji je rezultat bio gubitak do 3 C-terminalna ostatka (Slika 32). Manja cepanja na tri C-terminalna ostatka takođe su uočena kod drugih FGF21 mutanata, nakon što je podložnije mesto cepanja između aminokiselinskih ostataka 171 i 172 bilo blokirano, kao što je prikazano na Slikama 20 i 21. Cepanje 3 C-terminalnog ostatka može predstavlјati prestanak cepanja sa C-terminalnog kraja molekula usled sekvencijalnog isecanja karboksipeptidazom, ostatak po ostatak, ili specifičnim napadom proteaze na aminokiselinske ostatke 178 i 179 uz nespecifično odsecanje na aminokiselinskim ostacima 179-180 i 180-181. Gubitak 2-3 aminokiseline na C-kraju može prouzrokovati smanjeno vezivanje β-Kloto proteina i na kraju smanjenu potenciju i in vivo aktivnost molekula Pogledati, npr. Yie i saradnici, 2009, FEBS Lett.583:19-24. Da bi se rešila očigledna degradacija C-kraja karboksipeptidazom, proučavan je i uticaj dodavanja aminokiselinskog ostatka tipa „kape” na razne FGF21 mutantne polipeptide. Raznovrsni konstrukti, uklјučujući one predstavlјene u Tabeli 19, napravlјeni su i analizirani upotrebom tehnika koje su ovde opisane. Tabela 19 sumira rezultate in vitro ELK luciferaznog testa.
[0199] Pogodne aminokiselinske „kape” mogu biti dužine između 1 i 15 aminokiselina, na primer, dužine od 1, 2, 3, 4, 5, 10 ili 15 aminokiselina. Bilo koji broj i tip aminokiseline(a) može biti iskorišćen kao „kapa”, na primer, istu mogu činiti jedan prolinski ostatak i jedan glicinski ostatak, dva glicinska ostatka, pet glicinskih ostataka, kao i druge kombinacije. Dodatni primeri „kapa” su obezbeđeni u ovom Primeru i u Tabeli 19.
[0200] Dodatno, da bi se rešio očigledan napad proteaze na aminokiselinske ostatke 178 i 179, proučavana je mutacija aminokiselinskih ostataka na pozicijama 179, 180 i 181. Ponovo, napravlјeni su i analizirani raznovrsni konstrukti, uklјučujući one predstavlјene u Tabeli 19, upotrebom tehnika koje su ovde opisane. Istražen je takođe i uticaj kombinacija „kapa” i mutacija na ovim mestima. Tabela 19 sumira konstrukte za primer koji su napravlјeni i zatim proučavani u in vitro ELK-luciferaznom testu, a koji je izveden kao što je ovde opisano. U skladu sa terminologijom koja se ovde upotrebljava, hFc označava humanu Fc sekvencu (tj. SEQ ID NO:11), a L15 se odnosi na L15 linker (tj. GGGGGSGGGSGGGGS, SEQ ID NO:28).
Tabela 19
[0201] Slika 33 prikazuje procentualne promene u nivoima glukoze u krvi uočene kod db/db miševa sa dijabetesom (na C57B6 osnovi) kojima su injecirani kontrolni PBS, nativni FGF21 divljeg tipa, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i dva molekula sa strukturom „kape”, odnosno kojima su na C-terminalni kraj bili dodati bilo prolinski ili glicinski ostatak, tj. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G). Kada je ostatak bio dodat na C-kraj FGF21 polipeptida divlјeg tipa ili FGF21 polipeptidnog mutanta, ostatak je označavan njegovom pozicijom u rezultujućem proteinu. Prema tome, "182G" označava da je ostatak glicina bio dodat na C-kraj 181. ostatka u zrelom proteinu divlјeg tipa ili u mutantnom proteinu. Slika 33 pokazuje da je nativni FGF21 snizio nivo glukoze u krvi tokom 6 sati, dok su sva tri proučavana Fc-FGF21 mutanta pokazala kontinuiranu aktivnost snižavanja glukoze u krvi najmanje nakon 120 sati. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P), molekul koji je sadržavao adiciju prolinskog ostatka na C-kraju FGF21 komponente fuzionog molekula, pokazao se najpotentnijim i rezultat je bio najniži nivo glukoze u krvi, u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G).
[0202] U narednom eksperimentu, in vivo aktivnost Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) ispitivana je i upoređivana sa in vivo aktivnošću molekula sa strukturom „kape” koji je sadržavao adiciju dva glicina na C-kraju, odnosno Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G). Slika 34 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi uočene kod ob/ob miševa kojima su injecirani kontrolni PBS, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) andi Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P).
[0203] Kao što je prikazano na Slici 34, svi proučavani molekuli su pokazali trajnu aktivnost snižavanja glukoze u poređenju sa PBS kontrolom. Ovaj eksperiment je potvrdio prethodne rezultate (Slika 33), odnosno da je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) sa adicijom prolina na C-kraju pokazao blago povećanu efikasnost snižavanja glukoze u poređenju sa molekulom bez prolinske strukture „kape”, npr. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Ipak, deluje da adicija dva glicinska ostatka na C-kraj, npr. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G), smanjuje in vivo potenciju molekula i skraćuje trajanje in vivo efekta snižavanja glukoze.
[0204] Slika 35 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi uočene kod db/db miševa sa dijabetesom (na C57B6 osnovi) kojima su injecirani kontrolni PBS ili FGF21 mutantni polipeptidi Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179S), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180S) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180G). Svi mutanti su pokazali sličnu aktivnost snižavanja glukoze, sa sličnim trajanjem delovanja.
[0205] Slika 36 pokazuje procentualne promene nivoa glukoze u krvi uočene kod db/db miševa sa dijabetesom (na C57B6 osnovi) kojima su injecirani kontrolni nosač, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E). U poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179F) je bio manje efikasan u snižavanju glukoze u krvi. Ipak, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), u kome je alanin na aminokiselinskoj poziciji 180 mutiran u glutaminsku kiselinu, bio je efikasniji od Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i prouzrokovao je dodatnih 20% smanjenja nivoa glukoze u krvi u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Ovi podaci ukazuju da je mutacija A180E možda smanjila degradaciju C-kraja in vivo i time pobolјšala in vivo potenciju i efikasnost molekula.
PRIMER 22
Sudija na Rhesus majmunima
[0206] Fc-Linker-FGF21 konstrukt je generisan upotrebom metodologije koja je ovde opisana. Konstrukt je sadržavao IgG1 Fc sekvencu (SEQ ID NO:11) na C-kraju fuzionisanu sa L15 (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser linkerskom sekvencom (SEQ ID NO:28), koja je zatim na C-kraju bila fuzionisana sa N krajem sekvence zrelog FGF21 (SEQ ID NO:4), u koju su bile uvedene dve mutacije, L98R i P171G. Ovakav konstrukt je zatim eksprimiran i prečišćen kao što je ovde opisano. Izolovan je dimerni oblik proteina, koji je bio i dalje povezan intermolekulskim disulfidnim vezama između Fc regiona svakog monomera. Ovaj molekul se u predmetnom Primeru 22 označava kao "Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)" i ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:43, a kodiran je sa SEQ ID NO:42. U ovom Primeru, FGF21 se odnosi na zreli oblik FGF21, odnosno na SEQ ID NO:4.
22.1 Dizajn studije
[0207] Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) konstrukt je davan hronično i subkutano („SC“)mužjacima Rhesus majmuna sa BMI > 35 koji nisu imali dijabetes. Dve druge grupe majmuna (n=10 po grupi) tretirane su bilo sa zrelim FGF21 (tj. SEQ ID NO:4) ili sa kontrolnim nosačem.
[0208] Životinje su aklimatizovane tokom 42 dana pre davanja bilo kog ispitivanog jedinjenja, a zatim su podelјene u grupe od po 10 i davane su im višestruke SC injekcije ispitivanih jedinjenja ili kontrolnih artikala na način koji nije bio poznat eksperimentatoru, kao što je grafički prikazano na Slici 37. Ukratko, svaka životinja je bila injecirana jednom dnevno sa jedinjenjem ili nosačem. FGF21 je davan svakodnevno, dok je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) bio davan nedelјno. Doze Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i FGF21 su bile povećavane na svake 2 nedelјe, kao što je prikazano na Slici 37. Telesna težina i unos hrane su praćeni tokom čitave studije. Eksperimentator nije bio upoznat sa režimom lečenja.
[0209] Dva oralna testa tolerancije glukoze (OGTT) su obavlјena pre početka lečenja. OGTT1 je bio upotrebljen za sortiranje životinja u tri ekvivalentne grupe koje su imale sličnu distribuciju životinja na osnovu površine ispod krive (AUC) i telesne težine. Rezultati drugog OGTT (OGTT2) upotrebljeni su za potvrdu sortiranja prvog OGTT (OGTT1). Majmuni sa OGTT profilima koji su bili nedosledni od jednog testa (OGTT1) do sledećeg (OGTT2) bili su isklјučeni. Rezultati OGTT 1 i 2 su prikazani na Slikama 38A i 38B, sa merenjima AUC prikazanim na Slici 38C. Bazalna telesna težina je prikazana na Slici 38D i u Tabeli 20.
[0210] OGTT 3, 4 i 5 su rađeni svake 2 nedelјe, na kraju tretmana svakim od doznih opsega tipa niskih, srednjih i visokih doza. Uzorci krvi su prikuplјani od životinja svake nedelјe, nakon gladovanja, i upotrebljeni su za merenje nivoa glukoze, insulina, triglicerida, kao i nivoa ispitivanog jedinjenja. Uzorci krvi su takođe prikuplјani nedelјno tokom perioda „ispiranja” od 3 nedelјe.
[0211] Bazalne vrednosti OGTT1 i OGTT2 su pokazale očekivani profil glukoze koji se uočava kod normalnih životinja, sa maksimalnom glukozom u plazmi dobijenom u 30. minutu, a 3 različite grupe su pokazale i stabilne AUC.
[0212] Bazalne vrednosti za hemiju plazme nakon gladovanja su prikazane u Tabeli 20. Merenjea hemije plazme je vršeno na uzorcima krvi koji su bili prikuplјeni pre početka tretmana.
Tabela 20
[0213] Izabrana su tri različita nivoa doze i to niska doza koja je iznosila 0,1 i 0,3 mg/kg, srednja doza koja je iznosila 0,3 i 1 mg/kg i visoka doza koja je iznosila 1 i 5 mg/kg za FGF21 i Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G). Dozni nivoi su bili izabrani na osnovu uočenog odnosa doze i odgovora kod miševa, sa doznim režimom zasnovanom na predviđenoj učestalosti injeciranja kod lјudi. Ekvimolarne doze FGF21 upotrebljene su za niske i srednje doze, a visoka doza Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) je bila podignuta na 5 mg/kg (tj. umesto 3 mg/kg, što bi bilo ekvimolarno dozi FGF21 od 1 mg/kg).
22.2 Uticaj ispitivanih jedinjenja na telesnu težinu
[0214] U ovom eksperimentu, da bi se izmerilo dejstvo ispitivanih jedinjenja na telesnu težinu koja je merena nedelјno, procenat promene telesne težine u odnosu na bazalni nivo izračunavan je takođe nedelјno, u tri različite grupe Rhesus majmuna. Telesna težina je merena i tokom tri nedelјe perioda „ispiranja”. Bazalne vrednosti telesne težine za svaku grupu su uključene u Tabeli 20.
[0215] Telesna težina je praćena tokom čitave studije, i pre i nakon davanja ispitivanog jedinjenja. Procenat promene telesne težine u odnosu na bazalni nivo kod životinja tretiranih nosačem se povećavao tokom vremena, dok se telesna težina životinja tretiranih sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i FGF21 smanjivala na način koji je bio zavisan od doze, tokom perioda tretmana od 6 nedelјa, kao što je prikazano na Slici 39. Kao što je prethodno uočeno za glodare (Xu i saradnici, Diabetes 58(1):250-9 (2009)), tretman sa FGF21 je statistički značajno smanjio telesnu težinu. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je imao veću izloženost nego FGF21 (Slika 48 i Slika 47, tim redom), nudeći moguće objašnjenje za zapažanje da je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) pokazao izraženije smanjenje telesne težine u odnosu na FGF21.
22.3. Uticaj ispitivanih jedinjenja na nivoe insulina
[0216] Nivoi insulina su mereni u uzorcima krvi koji su prikuplјani nakon gladovanja preko noći ili nakon popodnevnog obroka.
[0217] Nivoi insulina u plazmi Rhesus majmuna nakon gladovanja su mereni svake nedelјe, kod životinja tretiranih bilo sa nosačem, FGF21 ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), kao i tokom 3-nedelјnog perioda „ispiranja”. Uzorci krvi nakon gladovanja su uzimani približno pet dana nakon poslednjeg injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i približno 21 sat nakon poslednjeg injeciranja FGF21.
[0218] Izmereni su nivoi insulina u plazmi Rhesus majmuna i nakon hranjenja, tokom pete i šeste nedelјe tretmana, bilo sa nosačem ili FGF21, a tokom tretmana visokim dozama. Uzorci krvi nakon hranjenja su uzimani približno tri dana nakon injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i približno 2 sata nakon poslednjeg injeciranja FGF21. Slika 40 pokazuje efekat nosača, FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) na nivoe insulina nakon gladovanja tokom čitave devetnedelјne studije, dok Slika 41 prikazuje nivoe insulina nakon hranjenja koji su utvrđivani iz uzoraka uzimanih tokom 5. i 6. nedelјe.
[0219] Ukratko, pri dve najveće doze, i FGF21 i Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) su statistički značajno smanjile nivoe insulina u plazmi nakon gladovanja i hranjenja. Zapažanje da su nivoi insulina kod životinja tretiranih sa FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) bili smanjeni bez uočavanja povećanih nivoa glukoze indikativno je za povećanu osetlјivost na insulin.
22.4 Uticaj ispitivanih jedinjenja na OGTT (glukozu i insulin)
[0220] Tri OGTT-a (OGTT 3, 4 i 5) su obavlјena nakon početka lečenja. OGTT5 profili nivoa glukoze i insulina mereni su kod životinja koje su 6 nedelјa bile lečene nosačem, FGF21 ili Fc-FGF21 (L98R, P171G), što odgovara dvema poslednjim nedeljama režima eskalacije visokih doza. OGTT5 je rađen približno 7 dana nakon poslednjeg injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i približno 21 sat nakon poslednjeg injeciranja FGF21. OGTT5 profili glukoze i insulina prikazani su na Slici 42 i Slici 43, tim redom. Životinje tretirane sa Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) pokazale su pobolјšan klirens glukoze u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem, samo pri najvišoj dozi i u poslednjoj izmerenoj vremenskoj tački, kao što je prikazano na Slici 42. Na kraju poslednje doze, Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) je pokazao najjače pobolјšanje klirensa glukoze. FGF21 nije pokazao pobolјšanje klirensa glukoze. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je imao veću izloženost nego FGF21 (Slika 48 i Slika 47, tim redom), nudeći moguće objašnjenje za zapažanje da je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) pokazao izraženiji efekat u klirensu glukoze nego FGF21 Nivoi insulina tokom OGTT5 su bili statistički značajno sniženi u poslednjoj vremenskoj tački izmerenoj kod životinja tretiranih sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem.
[0221] Procenat promene u AUC glukoze u odnosu na bazalni nivo, izračunavan je za tri OGTT (OGTT 3, 4 i 5) izvedena na kraju svakog od tretmana sa niskim, srednjim i visokim dozama, u tri grupe različite grupe Rhesus majmuna, kao što je prikazano na Slici 44. OGTT5 je sproveden približno sedam dana nakon poslednjeg injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i 21 sat nakon poslednjeg injeciranja FGF21, a pokazao je da je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) statistički značajno smanjio AUC5. Bazalne OGTT vrednosti za svaku grupu su prikazane na Slici 38C.
[0222] Nivoi glukoze u plazmi nakon gladovanja mereni su u danima kada nisu rađeni OGTT. Nisu uočene značajne statističke razlike u nivoima glukoze u plazmi, izmerenim u tri grupe životinja nakon gladovanja.
22.5 Uticaj ispitivanih jedinjenja na nivoe triglicerida
[0223] Procenat promene nivoa triglicerida u plazmi Rhesus majmuna nakon gladovanja izračunavan je svake nedelјe, kod životinja tretiranih nosačem, sa FGF21 ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), kao i tokom 3-nedelјnog perioda „ispiranja”. Uzorci krvi nakon gladovanja su uzimani približno pet dana nakon poslednjeg injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i približno 21 sat nakon poslednjeg injeciranja FGF21. Nivoi triglicerida su mereni svake nedelјe nakon početka lečenja i procentualne promene u odnosu na bazalni nivo su prikazane na Slici 45, dok su bazalne vrednosti nakon gladovanja prikazane u Tabeli 20.
[0224] Kao što je prikazano na Slici 45, životinje tretirane bilo sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) ili FGF21 pokazale su dozno-zavisno smanjenje nivoa triglicerida, pri čemu je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) imao najveći efekat smanjenja u poređenju sa FGF21.
[0225] Slika 46 prikazuje nivoe triglicerida u plazmi u uzorcima dobijenim iz Rhesus majmuni u nahranjenom stanju, tokom pete i šeste nedelјe tretmana nosačem ili sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) ili FGF21. Uzorci krvi nakon hranjenja su uzimani približno 3 dana nakon injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i približno 2 sata nakon poslednjeg injeciranja FGF21. Nivoi triglicerida u plazmi hranjenih životinja koje su bile tretirane sa FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) bili su statistički značajno smanjeni, u poređenju sa nivoima triglicerida kod životinja tretiranih nosačem (Slika 46).
22.6 Koncentracija ispitivanih jedinjenja
[0226] Izloženost ispitivanim jedinjenjima koja su bila davana u približno ekvivalentnim nivoima molarnih doza, procenjivana je tokom čitavog perioda studije. Koncentracija Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je merena pre davanja doze i približno 5 dana nakon poslednjeg injeciranja. Nivoi FGF21 su mereni pre davanja doze i nakon 5, 12, 19 i 26 dana. Uzorci krvi su uzimani približno 21 sat nakon poslednjeg injeciranja.
[0227] Pojedinačne koncentracije ispitivanih jedinjenja kod svakog majmuna su prikazane na Slikama 47 i 48. Kao što je prikazano na Slici 47, većina životinja u grupi tretiranoj sa FGF21 je imala koncentracije ispod granice kvantifikacije. Slika 48 pokazuje da su životinje u grupi tretiranoj sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) imale nivoe Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) koji su se mogli detektovanti tokom svake faze davanja doza (dve nedelјne doze u istoj jačini doze). Prosečna koncentracija iz svake faze doziranja se povećala približno proporcionalno dozi od 0,3 do 5 mg/kg za Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Postojala je i minimalna akumulacija, što je pokazano stabilnim koncentracijama nakon prve i druge nedelјne doze u svakoj fazi eskalacije doza za oba jedinjenja. Tokom faze bez tretmana (period ispiranja) nivoi Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) su se mogli detektovati do približno 47. dana (12 dana nakon poslednjeg doze) i bili su nakon toga ispod donje granice kvantifikacije (LLOQ).
[0228] Izloženost ispitivanom jedinjenju je takođe praćena tokom svakog OGTT. FGF21 nije mogao biti detektovan tokom OGTT 3 i 4, nakon tretmana niskim i srednjim dozama FGF21. Ipak, merlјivi nivoi su uočeni tokom OGTT5, nakon tretmana visokim dozama. Uočeno je i povećanje nivoa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) proporcionalno dozi od trećeg do petog OGTT sa eskalacijom nivoa doze, kao što je prikazano na Slici 49.
[0229] Podaci o nivoima jedinjenja potvrđuju da su životinje bile izložene očekivanoj količini svakog jedinjenja, odnosno FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), na način koji uključuje eskalaciju doze. Uočena je i velika varijabilnost u količini izmerenog FGF21, što je bio očekivan rezultat s obzirom da je uzorkovanje obavlјano približno 21 sat nakon poslednje doze i da je poluživot FGF21 približno 1 sat.
22.7 Zaklјučci
[0230] FGF21 je smanjio nivoe triglicerida i insulina u plazmi nakon gladovanja i hranjenja, a smanjio je i telesnu težinu u najvišim dozama. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je pobolјšao OGTT i smanjio nivoe insulina u najvišoj dozi, dok je smanjenje nivoe triglicerida u plazmi nakon gladovanja i hranjenja, kao i telesne težine zavisilo od doze. Oba, i FGF21 i Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G), smanjili su broj metaboličkih parametara kod Rhesus majmuna bez dijabetesa. Smanjenje nivoa insulina i triglicerida bilo je identično između FGF21 i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) u nahranjenom stanju, kada su nivoi jedinjenja u cirkulaciji bili u sličnom opsegu. Usled svojih pobolјšanih osobina, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je bio superiorniji od FGF21 u većini izmerenih parametara i mogao je da se daje jednom nedelјno da bi se uočila efikasnost na metaboličke parametre.
REFERENTNI PRIMER 23
Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) Fc fuzioni molekul
[0231] Generisana je fuzija Fc i koja je sadržavala FGF21 mutanta, spojenog sa IgG1 Fc komponentom, upotrebom linkera. FGF21 komponenta Fc fuzije je sadržavala tri tačkaste mutacije koje su bile uvedene genetičkim inženjeringom u polipeptidnu sekvencu FGF21, odnosno bili su uvedeni L98R, P171G, A180E (numeracija je zasnovana na zrelom obliku FGF21, obezbeđenom kao SEQ ID NO:4).
Ovaj molekul je konstruisan konjugovanjem humanog Fc (SEQ ID NO:11) na N-kraj L98R, P171G, A180E FGF21 mutanta (SEQ ID NO:39) preko linkera od 15 aminokiselina koji je sadržavao sekvencu GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:31). Ovaj molekul je označen kao „Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)” i njegova aminokiselinska sekvenca pune dužine je prikazana na Slici 50 i u SEQ ID NO:47; kodira ga nukleinska kiselina sa SEQ ID NO:46. In vitro ispitivanje Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) pokazalo je da je to potentan stimulator Erk fosforilacije u rekombinantnoj ćelijskoj liniji koja prekomerno eksprimira β-Kloto. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je takođe pokazao pojačan afinitet vezivanja za β-Kloto u poređenju sa fuzijom Fc i FGF21 divlјeg tipa ili fuzijom Fc i FGF21-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:45). Kada se injecira u životinjske modele sa dijabetesom, Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) je smanjivao nivo glukoze u krvi, smanjivao je telesnu težinu i bio je pogodan za injeciranje dva puta nedeljno.
23.1 In vitro aktivnost Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E)
[0232] Eksperimenti su sprovedeni da bi se ispitalo da li Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) zadržava sličnu aktivnost kao fuzija Fc i FGF21 divlјeg tipa ili nativnog FGF21 divlјeg tipa u ELK-luciferazom in vitro testu.
[0233] ELK-luciferazni testovi su izvođeni upotrebom rekombinantnog sistema humanih 293T ćelija bubrega, u kome 293T ćelije prekomerno eksprimiraju β-Kloto i luciferazne reporterske konstrukte. βkloto je ko-receptor potreban za FGF21, da bi se aktivirali FGF receptori i indukola unutarćelijska signalna transdukcija, uključujući Erk fosforilaciju. Erk-luciferazni reporterski konstrukti sadrže sekvence koje kodiraju GAL4-ELK1 i 5xUAS-Luciferazni reporter. 5xUAS-Luciferazni reporter pokreće promotor koji sadrži pet tandemskih kopija mesta vezivanja Gal4. Aktivnost reportera je regulisana nivoom fosforilisanog Erk-a i upotrebljava se za indirektno praćenje i kvantifikaciju aktivnosti FGF21.
[0234] ELK-luciferazni testovi su izvođeni kultivisanjem 293T ćelija u prisustvu različitih koncentracija FGF21 divlјeg tipa, Fc fuzije FGF21 divlјeg tipa, Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) tokom 6 sati, a zatim ispitivanjem ćelijskih lizata u pogledu luciferazne aktivnosti. Luminiscencije dobijene u ELK-luciferaznim testovima za svaki od FGF21 konstrukata su izražane na y-osi, dok su koncentracije jedinjenja izražavane na x-osi.
[0235] Slika 51 prikazuje odnos doze i odgvora za ispitivana jedinjenja u Erk-luciferaznim testovima. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je zadržao sličnu aktivnost u poređenju sa Fc fuzijom FGF21 divlјeg tipa, što ukazuje da kombinacija mutacija sa L98R, P171G i A180E nije promenila bioaktivnost FGF21. U poređenju sa nativnim FGF21 divljeg tipa, Fc fuzioni konstrukti su pokazali blago smanjenu potenciju i maksimalnu aktivnost u ovom testu zasnovanom na ćelijama sa prekomerno eksprimiranim β-Kloto ko-receptorom.
23.2 In vitro aktivnost Fc-FGF21(L98R, P171G, A180E) fuzija koje sadrže različite linkerske sekvence
[0236] Sličan Fc fuzioni analog je generisan fuzionisanjem humanog IgG1 Fc sa FGF21 (L98R, P171G, A180E) preko različite linkerske sekvence, GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO:28). Ovaj linker je označen kao L15, a rezultujući fuzioni molekul je označen kao Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57). U ovom eksperimentu proučavan je efekat različitih linkerskih sekvenci na aktivnost Fc-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fuzija.
[0237] ELK-luciferazni testovi su izvođeni kultivisanjem 293T ćelija u prisustvu različitih koncentracija Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u trajanju od 6 sati, a zatim ispitivanjem ćelijskih lizata u pogledu luciferazne aktivnosti. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) pokazao je sličnu aktivnost kao Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E), što ukazuje da različite linkerske sekvence, npr. (G4S)3 ili L15 linkeri, nemaju značajan uticaj na bioaktivnost Fc-FGF21 fuzija.
23.3 In vitro afinitet vezivanja Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) za β-Kloto u testovima vezivanja
[0238] Vezivanje Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) za humani i β-Kloto Cynomolgus majmuna ispitivano je testom ravnotežnog vezivanja u Biacore rastvoru. Afinitet Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je takođe upoređivan sa Fc-fuzionim FGF21 analogom sa samo L98R i P171G mutacijama, odnosno za Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43).
[0239] Neutravidin je bio imobilisan na CM5 čipu, upotrebom aminskog kuplovanja. Biotin-FGF21 je uhvaćen na drugoj protočnoj ćeliji na -1500RU. Prva protočna ćelija je upotrebljavana kao pozadinska kontrola. FGF21 mutanti u 5x razblaženjima (0,03-2000 nM) su inkubirani sa 10 nM humanog ili 25 nM β-Kloto Cynomolgus majmuna u PBS-u sa 0,1 mg/ml BSA, 0,005% P20, na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Vezivanje slobodnog β-Kloto proteina u mešanim rastvorima je mereno injeciranjem preko površine sa vezanim biotinizovanim FGF21. Signal vezivanja β-Kloto od 100% je određivan u odsustvu FGF21 mutanata u rastvoru. Smanjen odgovor vezivanja β-Kloto sa povećanjem koncentracija FGF21mutanata ukazivao je da β-Kloto vezivao za FGF21 mutante u rastvoru, što je blokiralo vezivanje β-Kloto za površinu sa imobilisanim biotinizovanim FGF21. Relativno vezivanje smeše u odnosu na molarnu koncentraciju FGF21 je unošeno na grafik upotrebom GraphPad Prizm 5 programa. Izračunavan je i EC50upotrebom nelinearnog uklapanja po jednog mesta kompeticije u istom softveru.
[0240] Slika 52 pokazuje rezultate testa ravnotežog vezivanja u Biacore rastvoru za Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) sa humanim (desno) i β-Klotho Cynomolgus majmuna (levo). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je pokazao pobolјšanu aktivnost vezivanja za humani i i β-Klotho Cynomolgus majmuna od najmanje 2x u poređenju sa Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G).
23.4 In vivo efikasnost Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) kod db/db miševa sa dijabetesom
[0241] Pitanje da li Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) može ispoljiti metabolički korisne efekte, kao što je snižavanje glukoze u krvi i smanjenje telesne težine, istraživano je i kod db/db miševa sa dijabetesom. Studija je takođe imala za cilј da ispita trajanje i odgovor na dozu Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) nakon jednokratnog injeciranja. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u dozama od 0,1; 0,3; 1 i 3 mg/kg intraperitonealno je injeciran db/db miševima sa dijabetesom. U studiju je takođe bila uklјučena grupa koja je tretirana nosačem (10 mM Tris, 2,2% saharoza, 3,3% sorbitol, pH 8,5). Uzorci krvi su dobijani od svake životinje (n=10 po grupi) na početku (pre injeciranja) i 6, 24, 72, 120 i 168 sati nakon injeciranja. Nivoi glukoze u krvi su mereni OneTouch glukometrom (LifeScan, Inc. Milpitas, Kalifornija). Telesna težina je merena na početku (vreme 0), 24, 72, 120 i 168 sati nakon injeciranja.
[0242] Slika 53A prikazuje nivoe glukoze u krvi db/db miševa u različitim vremenskim tačkama nakon injeciranja nosača ili Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je doveo do dozno-zavisnog smanjenja nivoa glukoze u krvi db/db miševa. Maksimalno smanjenje glukoze bilo je oko 50% u odnosu na bazalnu vrednost ili u poređenju sa grupom koja je bila tretirana nosačem. Maksimalan efekat je postignut u roku od 6 sati nakon injeciranja i održavan je 120 sati nakon injeciranja. Nivo glukoze u krvi je počeo da se vraća na bazalni nivo za oko 168 sati. Procenjen ED50, doza potrebna za postizanje polovine maksimalnog efekta, kod db/db miševa, iznosio je približno 1 mg/kg za Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)
[0243] Slika 53B prikazuje efekat Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) na telesnu težinu nakon jednokratnog injeciranja db/db miševima. Rezultati su izraženi kao promena telesne težine od vremena 0 (pre injeciranja). Miševi tretirani nosačem su pokazali progresivan i stabilan prirast telesne težine tokom perioda ispitivanja od 7 dana. Ipak, stopa rasta telesne težine je bila inhibirana kod miševa tretiranih sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) na način koji je bio zavisan od doze. Što je doza bila veća, to je bila duža i inhibicija rasta. U jednom primeru, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je smanjio prirast telesne težine tokom 5 dana u dozi 3 mg/kg, 3 dana u dozi 1 mg/kg ili 1 dan u dozi 0,3 mg/kg. Stope rasta su se kasnije oporavile. Procenjen ED50 za Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) na smanjenje telesne težine iznosio je približno 1 mg/kg u ovom eksperimentu.
23.5 Poređenje efikasnosti Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) kod DIO miševa i uticaj različitih učestalosti injeciranja
[0244] Cilj studije je bio da se utvrdi da li Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) može biti injeciran ređe nego Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), uz postizanje sličnog stepena efikasnosti. Studija je sprovedena na DIO miševima, sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) davanim jednom nedelјno (Q7D) ili jednom na svake dve nedelјe (Q14D), ili sa Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) davanim dva puta nedelјno (BIW), Q7D ili Q14D.
[0245] DIO miševi su pripremani ishranom mužjaka C57BL/6 miševa starih 4 nedelje hranom sa visokim sadržajem masti, koja je zapravo sadržavala 60% energije iz masti obogaćene zasićenim masnim kiselinama (D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ). Nakon 12 nedelјa ishrane sa visokim sadržajem masti, mereni su telesna težina i nivo glukoze u krvi. DIO miševi su zatim nasumično raspoređeni u grupe tretirane nosačem i predmetnim proteinima, da bi se postigli slični bazalni nivoi prosečnog nivoa glukoze u krvi i telesne težine. U studiju je bilo uključeno ukupno 7 grupa: nosač je davan Q7D; Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je davan Q7D ili Q14D; ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je davan BIW, Q7D ili Q14D. Injeciranje je bilo intraperitonealno i studija je sprovođena tokom 31 dana. Telesna težina je merena nedelјno. GTT je izvođen 28. dana studije, a studija je prekinuta 31. dana. Dizajn studije je grafički prikazan na Slici 54.
[0246] Slika 55 prikazuje GTT profile kod miševa tretiranih nosačem, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) i sa različitim učestalostima doziranja. Tolerancija glukoze je bila statistički značajno pobolјšana kod miševa tretiranih sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u poređenju sa nosačem, bilo u doznom režimu Q7D ili Q14D, što ukazuje da je Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) bio efikasan i pogodan za Q14D davanje kod DIO miševa. Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) je pobolјšao toleranciju glukoze kada je davan BIW ili Q7D, ali ne i Q14D, što ukazuje da Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) može biti manje pogodan za Q14D injeciranja kod miševa. Efikasnost Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u režimu Q7D ili Q14D bila je uporediva sa efikasnošću BIW ili Q7D davanja Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G), tim redom, što ukazuje da Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) može biti davani 2 puta ređe nego Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G).
[0247] Slika 56 prikazuje promene telesne težine u odnosu na bazalni nivo (dan 0) kod miševa tretiranih nosačem, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i uticaj različitih učestalosti doziranja. Miševi tretirani Q7D sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) izgubili su značajnu telesnu težinu kao i miševi tretirani BIW sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Telesna težina je bila umereno smanjena kod miševa tretiranih Q14D sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Q7D sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Nije uočen značajan efekat na telesnu težinu kod miševa tretiranih Q14D sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Dejstvo na telesnu težinu bilo je u skladu sa onim na GTT, kao što je prethodno opisano, što ukazuje da je Fc-(G4S)4-FGF21 (L98R, P171G, A180E) bio efikasan uQ14D režimu i zahtevao je oko 2 puta manje češća injeciranja nego Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) da bi se postigao isti efekat.
PRIMER 24
Formulacije hidrogela koje sadrže FGF21 mutante
[0248] Kao sredstva za formulisanje terapeutika na bazi proteina, hidrogelovi nude niz želјenih osobina. Na primer, hidrogelovi čuvaju nativnu strukturu i funkciju proteina ugrađenog u hidrogel. Štaviše, dobro se tolerišu i u zavisnosti od polimera i vrste umrežavanja, mogu biti biorazgradivi. Dodatno, hidrogelovi su se ranije uspešno upotrebljavali za produženo oslobađanje proteina. Hidrogelovi su stoga ispitivani kao mogući postupak isporuke za FGF21 mutante koji su ovde opisani.
[0249] Za sve eksperimente opisane u ovom primeru, hidrogelovi su pripremani na sledeći način. Pripremlјen je najpre 1,25% rastvor goveđeg želatina (Sigma) u PBS-u. Dodavano je zatim sredstvo za umrežavanje, metakrilni anhidrid, u molarnom odnosu (MA prema želatinu) od 16:1, 24:1 ili 32:1. Dobijeni rastvor je zatim podvrgavan dijalizi, da bi se izdvojila voda i uklonio bilo kakav nepolimerizovani metakrilamid,a time i stvorio nosač tipa hidrogela. Konačno, nosač tipa hidrogela je liofilizovan i čuvan na 4°C dok nije bilo sve spremno za pravlјenje hidrogelova koji sadrže FGF21 mutanta. Ovakav preparat može biti upotrebljen za pripremu nosača tipa hidrogela na bazi želatina koji se kasnije mogu prilagoditi tako da sadrže bilo koji od FGF21 mutanata koji su ovde opisani.
[0250] Pripremani su zatim hidrogelovi sa specifičnim FGF21 mutantima. Polazeći od 10% liofilizovanog metakril želatinskog hidrogelnog nosača, pripremlјeni su rastvori. Hidrogel nosači su zagrevani i zatim centrifugirani, da bi se rastvorili i liofilizovani MA želatinski hidrogel nosač pretvorio u tečnost. U tečni rastvor želatina je zatim dodavan izabrani FGF21 protein, (FGF21 (L98R, P171G), (SEQ ID NO:37)) u ovom Primeru), do unapred određene koncentracije. Zatim je dodavan štok rastvor TEMED-a, a dalji i štok rastvor KPS-a i rastvor je nežno promešan. Špricevi od 1 ml su zatim ispunjavani do 200 μl i ostavlјani su da se gle steže tokom 1,5 do 2 sata na sobnoj temperaturi. Špricevi su čuvani na -20°C i pre upotrebe su odmrzavani na 4°C preko noći. Hidrogel nosač koji je sadržavao10 mM Tris, 9% saharoze, pH 8,5, a u koji nije bio dodat FGF21 mutant, upotrebljen je kao kontrola.
[0251] Za in vivo eksperimente, špricevi su stavlјeni na grejnu podlogu, na 37°C, približno 10 minuta pre injeciranja u životinje.
24.1 In vitro aktivnost FGF21 (L98R, P171G) oslobođenog iz 10% hidrogelova sa raznim odnosima umrežavanja
[0252] Cilј ovog eksperimenta je bio da se ispita da li je FGF21 (L98R, P171G) oslobođen iz hidrogela biološki aktivan u poređenju sa nativnim oblikom FGF21 (L98R, P171G) upotrebom ELK-luciferaznog in vitro testa.
[0253] FGF21 (L98R, P171G) je pripremlan i ugrađen u 10% rastvore metakril želatina sa odnosom umreženosti metakrila i želatina od 16:1, 24:1 i 32:1, kao što je opisano. Hidrogelovi su zatim dispergovani u in vitro puferski rastvor, da bi se omogućilo oslobađanje FGF21 (L98R, P171G). Medijum je prikuplјan nakon 100 ili 150 sati i podvrgavan je in vitro testovima u pogledu aktivnosti FGF21 (L98R, P171G). Analitički testovi (npr. SDS-PAGE, HPLC sa isklјučivanjem po veličine i reverzno-fazni HPLC) pokazuju da je oslobođeni FGF21 (L98R, P171G) bio intaktan u svim vremenskim tačkama.
[0254] ELK-luciferazni testovi su izvođeni upotrebom rekombinantnog sistema humanih 293T ćelija bubrega, u kome 293T ćelije prekomerno eksprimiraju β-Kloto i luciferazne reporterske konstrukte. β-Kloto je ko-receptor koji je potreban FGF21 za aktivaciju njegovih FGF receptora. FGF receptori upotrebljeni u ovom testu su endogeni FGF receptori eksprimirani u 293T ćeliji bubrega. Luciferazni reporterski konstrukti sadrže sekvence koje kodiraju GAL4-ELK1 i reporter luciferaze, koga pokreće promotor koji sadrži pet tandemskih kopija mesta vezivanja Gal4 (5xUAS-Luc). Aktivnost luciferaze je regulisana nivoom fosforilisanog Erk/ELK1 koji se i upotrebljavaju za indirektno praćenje i kvantifikaciju aktivnosti FGF21.
[0255] ELK-luciferazni testovi su izvođeni kultivisanjem 293T ćelija u prisustvu različitih koncentracija nativnog oblika FGF21 (L98R, P171G) ili FGF21 (L98R, P171G) oslobođenog iz hidrogela tokom 6 sati, a zatim ispitivanjem luciferazne aktivnosti ćelijskih lizata. Slika 57 prikazuje in vitro rezultate ELK-luciferaznog testa. FGF21 (L98R, P171G) oslobođen iz hidrogelova sa odnosom umreženosti metakrila i želatina od 16:1, 24:1 i 32:1, bio je biološki aktivan i sa aktivnošću ekvivalentnom nativnom obliku FGF21 (L98R, P171G). Podaci su pokazali da je hidrogel sačuvao strukturu i funkciju ugrađenog proteina, odnosno da je oslobođeni FGF21 (L98R, P171G) bio aktivan i stabilan čak i nakon 10-15 sati u medijumu.
24.2 In vivo efikasnost hidrogela sa FGF21 (L98R, P171G) pri različitim odnosima umrežavanja, kod ob/ob miševa
[0256] Cilј ovog eksperimenta je bio da se utvrdi da li hidrogel sa FGF21 (L98R, P171G), pripremlјen u odnosu umreženosti metakrila i želatina od 24:1 i 32:1 obezbeđuje produženo oslobađanje biološki aktivnog FGF21 (L98R, P171G) in vivo i konačno dovodi do duže in vivo efikasnost u poređenju sa nativnim oblikom FGF21 (L98R, P171G). Dodatno, na osnovu procene in vitro stope oslobađanja, utvrđeno je da veći odnosi umrežavanja metakrila i želatina obezbeđuju bolјe produženo oslobađanje ugrađenog FGF21 (L98R, P171G). Drugi cilј ovog eksperimenta je stoga bio da se uporede dva hidrogela sa FGF21 (L98R, P171G) koji su pripremani sa odnosom umreženosti metakrila i želatina od 24:1 i 32:1.
[0257] FGF21 poseduje brojne biološke aktivnosti, uklјučujući sposobnost snižavanje nivoa glukoze, insulina, triglicerida ili holesterola u krvi; smanjenje telesne težine; ili pobolјšanje tolerancije na glukozu, potrošnje energije ili osetlјivost na insulin. FGF21 (L98R, P171G) hidrogelovi su uvođeni u ob/ob miševe sa rezistencijom na insulin i merene su sposobnosti FGF21 (L98R, P171G) hidrogelova da snize nivo glukoze u krvi i smanje telesnu težinu. Procedura za in vivo rad je bila sledeća.
[0258] Hidrogelovi su pripremani prema prethodno opisanoj proceduri. Ob/ob miševi stari 8 nedelјa (Jackson Laboratory) brijani su na mestu injeciranja i anestezirani su izofluranom i O2neposredno pre injeciranja. Hidrogelovi (0,2 ml) su polako injecirani pod kožu i na mesto injeciranja je nakon injekcije nanet Vetbond. Nosač (10 mM Tris, 9% saharoza pH 8,5) ili nativni FGF21 (L98R, P171G) takođe su uklјučeni u eksperiment i injecirani su slično kao hidrogelovi. Životinje su vraćene u njihov kavez nakon buđenja iz anestezije. Uzorci krvi su uzimani pre injeciranja i u raznim vremenskim tačkama nakon injeciranja, npr. 0, 3, 6, 24, 72, 120, 192 i 264 sata nakon injeciranja. Nivoi glukoze u krvi su mereni OneTouch glukometrom (LifeScan, Inc. Milpitas, Kalifornija). Praćena je i telesna težina.
[0259] Na Slikama 58 i 59 su sumirani rezultati eksperimenta. U poređenju sa nosačem ili kontrolnim hidrogelom, nativni oblik FGF21 (L98R, P171G) brzo je smanjio nivo glukoze u krvi 3 i 6 sati nakon injeciranja. Ipak, in vivo aktivnost nativnog oblika FGF21 (L98R, P171G) je opala i nivoi glukoze u krvi su se vratili na bazalni nivo 24 sata nakon injeciranja. Hidrogelovi sa FGF21 (L98R, P171G) su doveli do smanjenja glukoze u krvi već 3 sata nakon injeciranja, a aktivnost se održala do 8 dana. Nije bilo značajne razlike između odnosa umreženosti od 24:1 ili 32:1. Hidrogelovi grupe sa FGF21 (L98R, P171G) su takođe pokazali sporiji prirast telesne težine u odnosu na miševe koji su bili tretirani samo nosačem ili hidrogelom. Ovi rezultati su pokazali da su hidrogelovi sa FGF21 (L98R, P171G), koji su pripremani sa odnosom umreženosti metakrila i želatina od 24:1 i 32:1, sposobni da obezbede produženo oslobađanje biološki aktivnog FGF21 (L98R, P171G) in vivo i da konačno dovedu do duže in vivo efikasnosti u poređenju sa nativnim oblikom FGF21 (L98R, P171G).
24.3 In vivo efikasnost hidrogela sa FGF21 (L98R, P171G) i FGF21 (L98R, P171G, A180E) pri različitim odnosima umrežavanja kod db/B6 miševa
[0260] Formulacije hidrogela su pripremane upotrebom goveđeg želatina (Sigma) i nekoliko FGF21 mutanata i konstrukata, odnosno FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Pripreman je takođe i kontrolni hidrogel. Po 0,2 mL hidrogela je stavlјeno u špric od 1 ml sa iglom od 21G.
[0261] Kontrolni hidrogel i hidrogelovi koji sadrže FGF21 mutanta pripremani su kao što je prethodno opisano. db/B6 miševi stari 8 nedelјa (Jackson Laboratory) brijani su na mestu injeciranja i anestezirani su izofluranom i O2neposredno pre injeciranja. Hidrogelovi (0,2 ml) su polako injecirani pod kožu i na mesto injeciranja je nakon injekcije nanet Vetbond. Nosač (10 mM Tris, 9% saharoza pH 8,5) ili nativni FGF21 (L98R, P171G) takođe su uklјučeni u eksperiment i injecirani su slično kao hidrogelovi. Životinje su vraćene u njihov kavez nakon buđenja iz anestezije. Uzorci krvi su uzimani pre injeciranja i u raznim vremenskim tačkama nakon injeciranja, npr. 0, 24, 96, 168, 240, 312 sati nakon injeciranja. Nivoi glukoze u krvi su mereni OneTouch glukometrom (LifeScan, Inc. Milpitas, Kalifornija). Praćena je i telesna težina.
[0262] Dizajn eksperimenta je bio sledeći: Grupa životinja (n=9 po grupi)
A. Kontrolni hidrogel 32:1 (10%) MA:HU4 200µl
B. FGF21 (L98R, P171G) hidrogel 32:1 (10%) MA:HU4 0,5 mg/mišu (200 µl, ∼ 10 mg/kg) C. FGF21 (L98R, P171G) hidrogel 32:1 (10%) MA:HU4 1,5 mg/mišu (200 µl ∼ 30 mg/kg) D. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (bez hidrogela)
3 mg/kg
[0263] Izmereni su različiti parametri i rezultati eksperimenata su prikazani na Slikama 60-63. Slika 60 prikazuje promenu glukoze u krvi tokom eksperimenta trajanja od 14 dana, dok Slika 61 prikazuje promenu glukoze u krvi u procentima tokom istog perioda. Slika 62 pokazuje promenu telesne težine tokom 14-dnevnog eksperimenta, dok Slika 63 pokazuje procentualne promene telesne težine tokom istog perioda.
[0264] Rezultati eksperimenta prikazani grafički na Slikama 60-63 mogu se sumirati na sledeći način: FGF21 (L98R, P171G) 32:1(10%) MA:HU4 u dozi od 10 mg/kg bio je efikasan u smanjenju glukoze u krvi 24 sata nakon injeciranja i nivo glukoze u krvi se vratio na bazalni nivo između 4-7 dana.
[0265] FGF21 (L98R, P171G) 32:1(10%) MA:HU4 u dozi od 30 mg/kg bio je efikasniji u smanjenju glukoze u krvi od doze od 10 mg/kg, a nivo glukoze u krvi se vratio na bazalni nivo između 7- 10 dana.
[0266] Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) u dozi od 3 mg/kg samostalno je smanjio glukozu u krvi 24 sata nakon injeciranja do stepena koji je bio sličan hidrogelu sa FGF21 (L98R, P171G) u dozi od 30 mg/kg.
[0267] Kontrolni hidrogel (koja nije sadržavao FGF21 mutanta) nije imao nikakav efekat na smanjenje glukoze u krvi.
[0268] Grupe tretirane sa FGF21 (L98R, P171G) hidrogelovima i Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (koji nije bio u vidu hidrogela) pokazale su smanjen prirast telesne težine u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnom hidrogelom.
PRIMER 25
Studija na Cynomolgus majmunima
[0269] Dva Fc-Linker-FGF21 konstrukta su generisana upotrebom metodologije koja je ovde opisana. Jedan konstrukt je sadržavao IgG1 Fc sekvencu (SEQ ID NO:11) fuzionisanu na C-kraju sa (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser linkerskom sekvencom (SEQ ID NO:28), koja je zatim fuzionisana na N kraj sekvence zrelog FGF21 (SEQ ID NO:4) u koju su bile uvedene dve mutacije, L98R i P171G. Ovaj molekul se u ovom primeru označava kao „Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G)” (SEQ ID NO:43). Drugi konstrukt je sadržavao IgG1 Fc sekvencu (SEQ ID NO:11) na C-kraju fuzionisanu sa (Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser linkerskom sekvencom (SEQ ID NO:31), koja je zatim fuzionisana na N kraj sekvence zrelog FGF21 (SEQ ID NO:4) u koju su bile uvedene tri mutacije, L98R, P171G i A180E. Ovakav molekul se u ovom primeru označava kao „Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)” (SEQ ID NO:47). Ovi konstrukti su zatim eksprimirani i prečišćeni kao što je ovde opisano, nakon čega su izolovani u vidu dimernih oblika u kojima je svaki monomer bio vezan međumolekulskim disulfidnim vezama između Fc regiona svakog monomera.
25.1 Dizajn studije
[0270] Studija je sprovedena na Cynomolgus majmunima sa karakteristikama poremećene tolerancije na glukozu (IGT). Majmuni su bili stari 8-18 godina. Nјihove telesne težine su bile opsega od 5-15 kg, a BMI je bio opsega od 32-70 kg/m2. Pre početka primene jedinjenja, tokom 6 nedelja su aklimatizovana 44 majmuna. Tokom perioda aklimatizacije, majmuni su obučavani 4 puta nedelјno tokom 4 nedelјe, da bi se upoznali sa procedurama, uklјučujući vezivanje za stolicu, potkožno injeciranje (PBS, 0,1 ml/kg), gavažu (voda, 10 ml/kg), vađenje krvi za uzorke koji su ili nisu upotrebljavani za OGTT. Nakon 4 nedelјe treninga, izmereni su osnovni OGTT i metabolički parametri u plazmi. Od 44 majmuna, 40 je izabrano i nasumično raspodeljeno u tri grupe tretmana, da bi se postigli slični bazalni nivoi telesne težine, OGTT AUC odgovora i nivoa glukoze i triglicerida u plazmi.
[0271] Studija je sprovedena na način u kome eksperimentator nije bio upoznat sa terapijskim režimom. Nosač (n=14), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (n=13) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (n=13) bili su označeni kao jedinjenja A, B i C i davani su jednom nedelјno subkutanim injecirenjm. Jedinjenja su davana po principu eskalacije doze, od niskih (0,3 mg/kg), srednjih (1 mg/kg) do visokih (3 mg/kg) nivoa i doza je povećavana na svake tri nedelјe. Nakon 9 nedelјa tretmana jedinjenjima, životinje su praćene dodatne 3 nedelјe radi praćenja perioda „ispiranja” jedinjenja i oporavka od tretmana. Unos hrane, telesna težina, klinička hemija i OGTT su praćeni tokom čitave studije. Unos hrane je meren pri svakom obroku. Telesna težina je merena nedelјno. Uzorci krvi su prikuplјani svake nedelјe, 5 dana nakon svakog injeciranja, da bi se izmerili nivoi glukoze, triglicerida, ukupnog holesterola, HDL- i LDL-holesterola. OGTT je rađen na svake tri nedelje nakon početka tretmana (po završetku svakog doznog nivoa). Dan početka lečenja označen je sa 0, a detalјan plan studije je prikazan na Slici 64.
[0272] Rezultati prikazani u ovom primeru su podaci prikuplјeni na kraju tretmana od 9 nedelјa.
25.2 Uticaj ispitivanih jedinjenja na unos hrane
[0273] Životinje su hranjene dva puta dnevno, pri čemu je svaka životinja dobijala 120 g formulisane hrane utvrđene tokom perioda aklimatizacije. Hrana koja je ostajala nakon svakog obroka je uklanjana i merena, da bi se izračunao unos hrane. Vreme hranjenja je bilo od 8:00 do 8:30 (±30 minuta), a zatim od 16:30 do 17:00 (±30 minuta). Za dobijanje efekta poslastice, svakoj životinji je svakog dana davana jabuka (150 g) u 11:30 do 12:30 popodne (±30 minuta).
[0274] U poređenju sa nosačem, i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) su smanjili unos hrane kod majmuna (Slike 65, 66 i 67). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je inhibirao unos hrane pri svakom obroku uklјučujući prepodnevne, voćne i popodneven obroke u dozi od 0,3 mg/kg. Ipak, efekat se značajno smanjio i unos hrane se vratio blizu početnih ili kontrolnih nivoa nakon oko 30 dana tretmana, kada je doza povećana na 1 mg/kg. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) nije imao značajan uticaj na prepodnevni unos hrane i samo je skromno smanjio unos hrane tokom popodnevnog obroka, kada je doza bila povećana na 1 i 3 mg/kg. Ipak, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je smanjio unos voća slično kao i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Sveukupno, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je pokazao jači efekat na inhibiciju unosa hrane od Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Delovalo je da je efekat na unos hrane kratkotrajan i unos hrane je oporavlјen nakon približno 30 dana tretmana.
25.3. Uticaj ispitivanih jedinjenja na telesnu težinu
[0275] Telesna težina je praćena nedelјno tokom čitave studije. Tokom tretmana od 9 nedelјa, telesna težina životinja tretiranih nosačem je ostala konstantna, dok se telesna težina životinja tretiranih sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) progresivno smanjivala. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je doveo do izraženijeg smanjenja telesne težine od Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), kao što je prikazano na Slici 68.
25.4. Uticaj ispitivanih jedinjenja na indeks telesne mase (BMI), deblјinu nabora kože (SFT) i obim stomaka (AC)
[0276] BMI, SFT i AC su praćeni nedelјno tokom studije, i pre i nakon davanja ispitivanih jedinjenja, kada je merena i telesna težina. BMI se definiše kao telesna težina pojedinca koja je podelјena kvadratom njegove ili njene visine. SFT je deblјina dvostrukog sloja kože i masti ispod njega, što se meri posebnim kalibrom koji vrši stalnu napetost na datom mestu. BMI, SFT i AC su relativno precizna, jednostavna i jeftina merenja telesnog sastava koja prevashodno ukazuju na potkožne masnoće. Životinje tretirane nosačem su pokazale relativno stabilne BMI, SFT i AC tokom čitave studije. Životinje tretirane sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) pokazale su smanjene nivoe BMI, SFT i AC tokom 9-nedelјne studije, što ukazuje da oba jedinjenja dovode do smanjenja mase masnog tkiva. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je bio efikasniji i doveo je do izraženijeg smanjena BMI, SFT i AC u odnosu na Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Rezultati su prikazani na Slikama 69, 70 i 71, tim redom.
25.5 Uticaj ispitivanih jedinjenja na nivoe glukoze u krvi nakon gladovanja
[0277] Krv je prikuplјana od životinja koje su gladovale preko noći. Vađenje krvi je vršeno svake nedelje, 5 dana nakon svakog injeciranja. I Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) su smanjili nivoe glukoze u krvi nakon gladovanja. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je smanjio nivo glukoze u krvi nakon gladovanja u dozi od 0,3 mg/kg, a maksimalno smanjenje glukoze je postignuto kada je doza povećana na 1 mg/kg. Ipak, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je samo doveo do skromnog smanjenja nivoa glukoze u krvi u najvišoj ispitivanoj dozi (3 mg/kg). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je stoga bio efikasniji i proizveo je izraženije smanjenje glukoze u krvi od Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Nije uočena hipoglikemija ni kod jednog od majmuna tretiranih sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Slika 72 prikazuje nivoe glukoze u plazmi tokom studije, nakon gladovanja.
25.6 Uticaj ispitivanih jedinjenja na oralni test tolerancije glukoze (OGTT)
[0278] OGTT su sprovedeni pre i nakon početka lečenja. OGTT nakon davanja doza su vršeni na svake tri nedelјe, da bi se ispitao uticaj jedinjenja za svaki dozni nivo. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je pobolјšao toleranciju glukoze u svim ispitivanim dozama od 0,3 do 3 mg/kg. Nivoi glukoze su bili smanjeni, a ispad glukoze nakon bolusa kao izazova glukozom povećao se kao odgovor na tretman sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Nije uočen odnos doze i odgovora koji ukazuje da je Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) postigao svoj maksimalan efekat pri dozi od 0,3 mg/kg. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) je samo doveo do pobolјšanja tolerancije glukoze u dozi od 1 mg/kg i nije bilo jasno zašto se efekat značajno smanjio kada je doza povećana u studiji ekskalacije na 3 mg/kg. Slika 73 prikazuje profile OGTT krive i površinu ispod OGTT krive pre i nakon davanja doze.
25.7 Uticaj ispitivanih jedinjenja na nivoe trigilcerida
[0279] Krv je prikuplјana od životinja koje su gladovale preko noći. Vađenje krvi je vršeno svake nedelje, 5 dana nakon svakog injeciranja. Nivoi triglicerida su bili značajno smanjeni kod životinja tretiranih sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Ipak, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je bio efikasniji od Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je doveo do maksimalnog smanjenja nivoa triglicerida u plazmi u dozi od 0,3 mg/kg, dok je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) doveo samo do osrednjeg smanjenja nivoa triglicerida u najvišoj ispitivanoj dozi (3 mg/kg). Slika 74 prikazuje nivoe triglicerida u plazmi nakon gladovanja tokom studije.
25.8 Uticaj ispitivanih jedinjenja na nivo ukupnog holesterola i HDL-holesterola
[0280] Krv je prikuplјana od životinja koje su gladovale preko noći. Vađenje krvi je vršeno svake nedelje, 5 dana nakon svakog injeciranja. Nivoi ukupnog holesterola i HDL holesterola u plazmi su imali tendenciju povećanja nakon tretmana sa Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Slike 75 i 76 prikazuju nivoe ukupnog holesterola i HDL-holesterola tokom studije.
25.9 Zaklјučci
[0281] U studiji eskalacije doze sprovedenoj kod IGT mužjaka Cynomolgus majmuna, životinje tretirane sa Fc konjugovanim FGF21 mutantima, odnosno Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), pokazale su pobolјšane metaboličke parametre. Telesna težina je bila smanjena i telesni sastav je bio pobolјšan. Zapaženo je kratkoročno smanjenje unosa hrane, a unos hrane se vratio na početni ili kontrolni nivo u sredini studije. Nivo glukoze i triglicerida u krvi nakon gladovanja su takođe bili smanjeni sa oba jedinjenja, Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ili Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G). OGTT je bio pobolјšan, a nivoi HDL holesterola su bili blago povišeni. U poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), delovalo je da je Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) superiorniji u odnosu na Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) po svim parametrima koji su mereni prilikom davanja bilo koje ispitivane doze. Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je postigao svoje maksimalne efekte za većinu izmerenih parametara kada je primenjivan u dozi od 0,3 mg/kg. Terapijski efektivna doza Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) kod viših vrsta može stoga biti niža od 0,3 mg/kg.
PRIMER 26
Studija stabilnosti u Cynomolgus majmunima
[0282] Ova studija je dizajnirana tako da utvrdi da li je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) bio rezistentniji na proteazu od Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43). Obrada karboksilnog kraja je uočena nakon injeciranja Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) u miševe ili majmune, kao što je prikazano u Primeru 21. Rezultat degradacije je bio uzastopni gubitak od 1 do 3 aminokiselinskih ostataka sa C-kraja. Napori da se na C-kraj doda struktura „kape” ili da se uvedu dodatne mutacije na C-kraj Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) dali su superiorni molekul Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E). Ova studija je dizajnirana tako da se proceni da li je Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) pobolјšao in vivo stabilnost u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
[0283] Generisani su konstrukti Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Ovi konstrukti su sadržavali IgG1 Fc sekvencu (SEQ ID NO:11) fuzionisanu na C-kraju sa (Gly)5-Ser-(Gly)3-Ser-(Gly)4-Ser linkerskom sekvencom (SEQ ID NO:28) koji je zatim fuzionisana na N kraj sekvence zrelog FGF21 (SEQ ID NO:4), u koju su bile uvedene bilo dve mutacije, L98R, P171G, ili tri mutacije, L98R, P171G i A180E. Ovakvi konstrukti su zatim eksprimirani i prečišćeni kao što je ovde opisano, nakon čega su izolovani u vidu dimernih oblika u kojima je svaki monomer bio vezan međumolekulskim disulfidnim vezama između Fc regiona svakog monomera.
[0284] In vivo stabilnost Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) upoređivana je kod mužjaka Cynomolgus majmuna. Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) su bili intravenski injecirani Cynomolgus majmunima u dozi od 23,5 mg/kg. Uzorci krvi su prikuplјani u različitim vremenskim tačkama nakon jedne iv injekcije. Imunoafinitetna-MALDI-TOF masena spektrometrija je upotrebljena za praćenje metabolita u svakoj vremenskoj tački nakon injeciranja. Rezultati su prikazani na Slici 77.
[0285] U poređenju sa Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je pokazao značajno smanjenu degradaciju C-kraja, sa manje detektabilnih pikova mase u blizini originalnog pika intaktnog molekula, što ukazuje da je mutacija A180E usporila degradaciju C-kraja peptidazom. Uočena su takođe veća skraćenja sa gubicima mase procenjenim kao [1-376], [1-394] i [1-401] i mestima koja su odgovarala 133-134, 153-154 i 158-159 u FGF21 polipeptidnoj sekvenci. Isecanje internom endopeptidazom je doprinelo ukupnom metabolizmu i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), a deluje da mutacija A180E nije značajno uticala na stopu degradacije internom endopeptidazom.
[0286] Da bi se povećala rezolucija i obezbedili detalјi o mešavini nastaloj degradacijom, urađena je i MRM (monitoring višestrukih reakcija) LC-MS masena spektrometrija, odnosno da bi se ispratili razni oblici fragmenata koji su nastali degradacijom C-kraja. Uzorci iz majmuna su afinitetno prečišćeni i zatim podvrgnuti Asp-N digestiji. Peptidi nastali degradacijom C-kraja su zatim praćeni upotrebom MRM postupka. Rezultati za razne oblike nastale degradacijom C-kraja su izražavani kao relativna količina u odnosu na peptidne vrste pune dužine (%), kao što je prikazano na Slici 78. U skladu sa MALDI spektrima, semikvantitativna MRM analiza C-terminalnih fragmenata takođe je pokazala smanjenu relativnu zastupljenost peptidnih fragmenata kojima nedostaju 1-3 aminokiseline na C-kraju, kao i povećanu relativnu zastupljenost intaktnih molekula u majmunima kojima je davan Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
[0287] Ukratko, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je u Cynomolgus majmunima pokazao smanjenu degradaciju C-kraja i pobolјšanu in vivo stabilnost u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G).
PRIMER 27
Farmakokinetike Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) kod miševa
[0288] Ova studija je dizajnirana tako da se procene farmakokinetički parametri za Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) nakon jednokratnog intravenskog davanja doza mužjacima C57BL/6 miševa.
[0289] Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) su davani u dozi od 20 mg/kg, intravenskim injeciranjem. Uzorci krvi su prikuplјani 0,083 (5 minuta), 1, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 168 i 240 sati nakon davanja doze. Da bi se utvrdile koncentracije intaktnog molekula pune dužine u plazmi, razvijen je ELISA test sa imunoreaktivnošću usmerenom na N-kraj i C-kraj FGF21. Test prati intaktni molekul pune dužine sa zanemarlјivom kontaminacijom od strane drugih proizvoda razgradnje. Koncentracije intaktnog Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) i Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) u plazmi tokom perioda od 240 sati nakon intravenskog injeciranja kod miševa prikazane su na Slici 79.
[0290] Koncentracije Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u plazmi bile su značajno veće od onih za Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) kada su oba proteina davana u istom doznom nivou, a od 24 do 168 sati nakon injeciranja. Značajna količina Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je bila merlјiva 168 sati nakon injeciranja kod miševa. Kao rezultat, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je kod miševa pokazao povećanu pokrivenost AUC i porast poluživota cirkulisanja u plazmi od 2 puta u poređenju sa Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Poluživot Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) je iznosio 16,6 sati, dok je za Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) iznosio 9,4 sata. Oba jedinjenja su bila ispod nivoa koji može biti detektovan tokom 240 sati nakon davanja doze.
PRIMER 28
Generisanje N-vezanih glikozilacionih mutanata za pobolјšanje rastvorlјivosti ili smanjenje isecanja na C-kraju u svrhu povećanja poluživota
[0291] FGF21 mutanti su dizajnirani i generisani tako da se stvore potencijalna mesta N-vezane glikozilacije za ekspresiju u sisarima, uz minimalno remećenje nativne aminokiselinske sekvence. Konstruisani mutanti uklјučuju FGF21 (Y179N, S181T) (SEQ ID NO:161), FGF21 Y179N (SEQ ID NO:163) i FGF21 P124S (SEQ ID NO:165).
[0292] Ekspresija mutanata je vršena tranzijentno, u 293-6E ćelijama, a aktivnost kondicioniranog medijuma je ispitivana u pogledu aktivnosti upotrebom ELK-luciferaznog in vitro testa. ELK-luciferazni testovi su izvođeni kao što je opisano u Primeru 4, osim što su upotrebljavana serijska razblaženja kondicioniranih medijuma umesto različitih koncentracija prečišćenih proteina.
[0293] Analiza kondicioniranog medijuma je otkrila da povećana glikozilacija u poređenju sa proteinom divljeg tipa nije bila postignuta u sistemu tranzijentne ekspresije. Slika 80 prikazuje rezultate ELK-luciferaznog testa aktivnosti. Rezultati prikazani na Slici 80 pokazuju da FGF21 mutant P124S nije negativno uticao na aktivnost FGF21, ali i da su FGF21 mutanti Y179N i FGF21 (Y179N, S181T) u odsustvu glikozilacije, doveli do smanjene aktivnosti analizirane u ELK-luciferaznom testu.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, gde:
(a) aminokiselinski ostatak na poziciji 180 u SEQ ID NO:4 je supstituisan sa aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine glicin, prolin, serin i glutaminska kiselina; i
(b) aminokiselinski ostatak na poziciji 98 u SEQ ID NO: 4 je supstituisan sa argininom ili je aminokiselinski ostatak na poziciji 171 u SEQ ID NO: 4 glicin,
i pri čemu je polipeptid sposoban da snižava nivoe glukoze u krvi kod sisara.
2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, koji dalјe sadrži linkersku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO:31.
3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koji dalјe sadrži Fc domen koji sadrži SEQ ID NO:11.
4. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde (i) polipeptid iz SEQ ID NO:4 sadrži: (a) skraćenje amino-kraja od ne više od 8 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara; (b) skraćenje karboksi-kraja od ne više od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara; ili (c) skraćenje amino-kraja od ne više od 8 aminokiselinskih ostataka, i skraćenje karboksi-kraja od ne više od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je polipeptid sposoban da snižava glukozu u krvi kod sisara, ili (ii) polipeptid je kovalentno vezan za jedan ili više polimera, izborno polimer je PEG.
5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, i farmaceutski prihvatlјivo sredstvo za formulisanje.
6. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 5, gde je farmaceutski prihvatlјivo sredstvo za formulisanje hidrogel.
7. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 5 ili 6, za upotrebu u postupku lečenja metaboličkog poremećaja.
8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je metabolički poremećaj dijabetes tipa 2 ili gojaznost.
9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je metabolički poremećaj nealkoholni steatohepatitis (NASH).
10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 koja dalјe sadrži supstituciju argininskog ostatka sa leucinskim ostatkom na poziciji 98, glicinskog ostatka sa prolinskim ostatkom na poziciji 171 i glutaminske kiseline sa alaninom na poziciji 180.
11. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3.
12. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10.
13. Ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10.
14. Multimer koji sadrži dva ili više od polipeptida prema patentnom zahtevu 3.
15. Multimer prema patentnom zahtevu 14, koji sadrži prvi i drugi lanac, pri čemu prvi lanac sadrži:
(a.1) polipeptid iz SEQ ID NO: 4, gde (i) leucin na poziciji 98 je supstituisan sa argininom; (ii) prolin na poziciji 171 je supstituisan sa glicinom; i (iii) alanin na poziciji 180 je supstituisan sa glutaminskom kiselinom;
(b.1) linkersku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO:31; i
(c.1) Fc domen koji sadrži SEQ ID NO:11; i
drugi lanac koji sadrži:
(a.2) polipeptid iz SEQ ID NO:4, gde (i) leucin na poziciji 98 je supstituisan sa argininom; (ii) prolin na poziciji 171 je supstituisan sa glicinom; i (iii) alanin na poziciji 180 je supstituisan sa glutaminskom kiselinom;
(b.2) linkersku sekvencu koja sadrži SEQ ID NO:31; i
(c.2) Fc domen koji sadrži SEQ ID NO:11.
RS20240141A 2009-05-05 2010-05-04 Fgf21 mutanti i njihove upotrebe RS65153B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17573609P 2009-05-05 2009-05-05
US28511809P 2009-12-09 2009-12-09
EP17167682.8A EP3248610B1 (en) 2009-05-05 2010-05-04 Fgf21 mutants and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65153B1 true RS65153B1 (sr) 2024-02-29

Family

ID=42455356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240141A RS65153B1 (sr) 2009-05-05 2010-05-04 Fgf21 mutanti i njihove upotrebe

Country Status (37)

Country Link
US (4) US8188040B2 (sr)
EP (3) EP4353247A3 (sr)
JP (1) JP5823954B2 (sr)
KR (2) KR101860572B1 (sr)
CN (2) CN107188950B (sr)
AR (1) AR076541A1 (sr)
AU (1) AU2010246108B2 (sr)
BR (1) BRPI1011404B1 (sr)
CA (1) CA2760196C (sr)
CL (1) CL2011002768A1 (sr)
CO (1) CO6470863A2 (sr)
CR (1) CR20110639A (sr)
DK (1) DK3248610T5 (sr)
EA (1) EA021425B1 (sr)
ES (2) ES2632742T3 (sr)
FI (1) FI3248610T3 (sr)
HR (1) HRP20240135T1 (sr)
HU (1) HUE065036T2 (sr)
IL (2) IL215937A (sr)
JO (1) JO3469B1 (sr)
LT (1) LT3248610T (sr)
MA (1) MA33716B1 (sr)
MX (1) MX2011011709A (sr)
MY (1) MY156542A (sr)
NZ (1) NZ596037A (sr)
PE (2) PE20160718A1 (sr)
PH (1) PH12015502433B1 (sr)
PL (1) PL3248610T3 (sr)
PT (1) PT3248610T (sr)
RS (1) RS65153B1 (sr)
SG (3) SG175861A1 (sr)
SI (1) SI3248610T1 (sr)
SM (1) SMT202400036T1 (sr)
TW (2) TWI560197B (sr)
UY (2) UY38740A (sr)
WO (1) WO2010129503A1 (sr)
ZA (1) ZA201108371B (sr)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA024751B8 (ru) 2008-06-04 2020-01-31 Амген Инк. Мутанты fgf21 и их применение
EP2358749B1 (en) 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
SMT202400036T1 (it) 2009-05-05 2024-03-13 Amgen Inc Mutanti fgf21 e loro utilizzi
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
AU2010262927A1 (en) 2009-06-17 2012-01-19 Amgen Inc. Chimeric FGF19 polypeptides and uses thereof
MX2012006397A (es) 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
US9517264B2 (en) 2010-04-15 2016-12-13 Amgen Inc. Human FGF receptor and β-Klotho binding proteins
CA2796459C (en) 2010-04-16 2016-05-24 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf-1
US20140189893A1 (en) * 2011-05-10 2014-07-03 Amgen Inc. Method of identifying compounds that specifically modulate the interaction of fgfr1 and beta klotho
PL2726511T3 (pl) 2011-07-01 2019-12-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Kompozycje, zastosowania i sposoby leczenia zaburzeń oraz chorób metabolicznych
CA2845357A1 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating type 1 diabetes using fgf21
AU2015202304C1 (en) * 2011-09-26 2017-03-09 Novartis Ag Fusion proteins for treating metabolic disorders
UY34347A (es) 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de función dual para tratar trastornos metabólicos
UY34346A (es) 2011-09-26 2013-04-30 Novartis Ag Proteínas de fusión para tratar trastornos metabólicos
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
US9475856B2 (en) 2012-03-02 2016-10-25 New York University Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders
JP6254146B2 (ja) 2012-03-27 2017-12-27 エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコーポレーテッド 代謝障害を治療するための組成物および方法
WO2013172967A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
KR20150006059A (ko) 2012-06-11 2015-01-15 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유모세포 성장 인자 21 변이체
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
EP3798228A1 (en) 2012-11-28 2021-03-31 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
SG11201504815QA (en) 2012-12-27 2015-07-30 Ngm Biopharmaceuticals Inc Methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
KR101993714B1 (ko) 2013-01-30 2019-06-28 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
US20160235810A1 (en) 2013-10-18 2016-08-18 Novartis Ag Methods of treating diabetes and related disorders
CA2928135A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (fgf) 1 and methods of use
NZ718962A (en) 2013-10-28 2019-12-20 Ngm Biopharmaceuticals Inc Cancer models and associated methods
AU2015209131B2 (en) 2014-01-24 2020-06-25 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
WO2015138278A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Novartis Ag Methods of treating metabolic disorders associated with lipodystrophies and defects in insulin production or signaling
US10519240B2 (en) 2014-03-25 2019-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-FGFR1c antibody-FGF21 fusion proteins
CN103923207B (zh) * 2014-04-08 2016-03-09 东北农业大学 一种fgf-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用
WO2015183890A2 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases
EP3155005A4 (en) 2014-06-16 2018-07-11 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
UA123432C2 (uk) 2014-07-30 2021-04-07 Нджм Біофармасьютікалз, Інк. Димер та спосіб його застосування для лікування метаболічних розладів
US9585934B2 (en) 2014-10-22 2017-03-07 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
CN114129709A (zh) 2014-10-23 2022-03-04 恩格姆生物制药公司 包含肽变异体的药物组合物及其使用方法
MD20170035A2 (ro) 2014-10-31 2017-09-30 Ngm Biopharmaceuticals Inc Compoziţii şi metode de utilizare pentru tratamentul tulburărilor metabolice
US10434144B2 (en) 2014-11-07 2019-10-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
HUE044783T2 (hu) 2014-12-23 2019-11-28 Novo Nordisk As FGF21 származékok és alkalmazásaik
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US20180071981A1 (en) 2015-03-31 2018-03-15 The Regents Of The University Of California System and method for tunable patterning and assembly of particles via acoustophoresis
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
RU2752530C2 (ru) 2015-08-03 2021-07-29 Новартис Аг Способы лечения расстройств, связанных с fgf21
JP2018529729A (ja) * 2015-10-01 2018-10-11 アムジエン・インコーポレーテツド 胆汁酸障害の処置
KR102670157B1 (ko) * 2015-10-28 2024-05-29 주식회사유한양행 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR102668200B1 (ko) 2015-10-28 2024-05-23 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
AU2016344134A1 (en) 2015-10-30 2018-05-31 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (FGF) 1 analogs
CA3003616C (en) 2015-11-09 2020-07-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
TW201731867A (zh) 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
CN117986363A (zh) 2016-03-31 2024-05-07 恩格姆生物制药公司 结合蛋白及其使用方法
CN107759694B (zh) * 2016-08-19 2023-01-13 安源医药科技（上海）有限公司 双特异性抗体及其制备方法与用途
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN109689079A (zh) * 2016-08-22 2019-04-26 伊兰科美国公司 牛成纤维细胞生长因子21和乳畜中的酮病
CA3034399A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
CN110121355B (zh) * 2016-11-10 2023-09-12 株式会社柳韩洋行 用于预防或治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化的包含融合蛋白的药物组合物
EP3558341A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 Sanofi Fgf21 compound / glp-1r agonist combinations with optimized activity ratio
CN108570109B (zh) 2017-03-14 2022-04-26 广东东阳光药业有限公司 包含免疫球蛋白Fc部分的双靶点融合蛋白
AU2018256256B2 (en) 2017-04-21 2023-02-23 Yuhan Corporation Method for producing dual function proteins and its derivatives
CN107056925B (zh) * 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
US12359195B2 (en) 2017-10-27 2025-07-15 Svar Life Science Ab Secreted reporter-peptides for optimizing cell-based assays for analysis on immuno-assay platforms
IL275499B2 (en) 2017-12-22 2024-03-01 Novartis Ag Methods of treating metabolic disorders with fgf21 variants
AU2019218147B2 (en) * 2018-02-08 2023-06-08 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. FGF21 variant, fusion protein and application thereof
EP3586860A1 (en) * 2018-06-22 2020-01-01 Universität Ulm Complement inhibitors and uses thereof
US12226451B2 (en) 2018-07-03 2025-02-18 Bristol-Myers Squibb Company FGF-21 formulations
CN109836486B (zh) * 2019-01-30 2020-09-08 北京双因生物科技有限公司 成纤维生长因子21变体、其融合蛋白及其用途
EP3935075A4 (en) * 2019-03-05 2023-01-18 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. POLYPEPTIDE MOLECULE AND APPLICATION THEREOF
CN111944055B (zh) 2019-05-16 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
KR102495299B1 (ko) * 2020-11-03 2023-02-06 토드제약 주식회사 Fgf21의 열탄력성을 이용한 fgf21 생산 방법
US20240165202A1 (en) * 2021-03-19 2024-05-23 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Uses of fgf21 polypeptides and fusion polypeptides thereof
CN113583142A (zh) * 2021-08-20 2021-11-02 赣江中药创新中心 双靶点融合蛋白、编码基因、载体或宿主细胞及其应用与表达和纯化方法
AU2022341345A1 (en) * 2021-09-08 2024-03-28 Leto Laboratories Co., Ltd Fgf21 mutant protein and use thereof
KR20240067092A (ko) 2021-09-23 2024-05-16 지앙수 헨그루이 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드 항-klb 항체 및 용도
AU2022361936A1 (en) 2021-10-13 2024-05-09 Akero Therapeutics, Inc. Pharmaceutical compositions of efruxifermin
AU2023343076A1 (en) 2022-09-12 2025-03-27 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides
US12233115B2 (en) 2022-09-30 2025-02-25 Extend Biosciences, Inc. Long-acting parathyroid hormone
WO2024123812A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Shattuck Labs, Inc. Fusion proteins for the treatment of cardiometabolic diseases
CN118530374B (zh) * 2023-06-02 2025-11-04 东北农业大学 犬成纤维细胞生长因子21融合蛋白制备及其在治疗特应性皮炎中的用途
WO2025155843A1 (en) 2024-01-19 2025-07-24 Akero Therapeutics, Inc. Method of treating liver or lung injury

Family Cites Families (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
DE3889853D1 (de) 1987-11-05 1994-07-07 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte Immunglobuline mit reduziertem immunogenem Potential oder verbesserter Pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
JP2989002B2 (ja) 1988-12-22 1999-12-13 キリン―アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾顆粒球コロニー刺激因子
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
HU215581B (hu) 1989-07-06 1999-01-28 Regents Of The University Of California Eljárás fibroblaszt növekedési faktor receptorok előállítására és terápiás alkalmazására
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
HK1000547A1 (en) 1989-12-22 1998-04-03 Merck Serono Sa Endogenous gene expression modification with regulatory element by way of homologous recombination
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
EP1403285A1 (en) 1990-07-06 2004-03-31 Gencell S.A. Fibroblast growth factor receptors
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
EP0646182B1 (en) 1992-06-18 1996-08-28 The Whittier Institute For Diabetes And Endocrinology Process for detection of neoplastic disease
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
GB9313210D0 (en) * 1993-06-25 1993-08-11 Sandoz Ltd Novel combinations
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
JPH08509870A (ja) 1993-05-26 1996-10-22 オンタリオ キャンサー インスティテュート 特定のｃｄ４５イソ型タンパク質の発現を遮断するトランスジェニック哺乳動物
EP0705334A1 (en) 1993-06-14 1996-04-10 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
US5469743A (en) * 1993-06-24 1995-11-28 Zorn; Roger H. Dynamic surface wave roll inspection device
JP4098355B2 (ja) 1993-08-12 2008-06-11 ニューロテック ユーエスエー， インコーポレイテッド 遺伝的に改変された細胞を含む生体適合性免疫隔離カプセル
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5654166A (en) * 1994-11-09 1997-08-05 Kurth; Gerhard P. Process of preparing hormone-free bovine cartilage for dosage form
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CN1191568A (zh) 1995-05-26 1998-08-26 曾尼卡有限公司 包含蜕皮激素受体的基因开关
CA2219080A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based regulation of biological events
AU705035B2 (en) 1995-06-07 1999-05-13 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US5849303A (en) 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
CA2244363C (en) 1996-02-28 2006-11-14 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Synthetic derivatives of rapamycin as multimerizing agents for chimeric proteins with immunophilin-derived domains
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
AU739057B2 (en) 1996-12-26 2001-10-04 Shirankai Kyoto University Faculty Of Medicine Alumni Association Inc. Novel polypeptide, novel DNA, and novel antibody
EP0861900A1 (en) * 1997-02-21 1998-09-02 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Immunological detection of prions
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US6150096A (en) * 1997-09-26 2000-11-21 Universite De Sherbrooke Molecular markers for the diagnosis of human diseases including Crohn's disease
KR100506786B1 (ko) 1997-11-25 2005-08-08 제넨테크, 인크. 섬유아세포 성장인자-19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000027885A1 (en) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel chimeric polypeptide
US6656728B1 (en) 1999-02-08 2003-12-02 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
EP1183051A2 (en) 1999-03-15 2002-03-06 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
EP2163626A1 (en) 1999-11-18 2010-03-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Human FGF-21 gene and gene expression products
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
AU1628101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US7108984B2 (en) 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
WO2001049849A1 (en) 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
AU5056501A (en) 2000-03-31 2001-10-08 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20060223114A1 (en) 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
CA2450793A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
WO2003006501A2 (en) 2001-07-11 2003-01-23 Maxygen Holdings, Ltd. G-csf conjugates
US20040259780A1 (en) 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
US20050187150A1 (en) 2001-10-31 2005-08-25 New York University Structure-based design and synthesis of FGF inhibitors and FGF modulator compounds
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
JP2005530687A (ja) 2002-01-31 2005-10-13 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ Ｆｇｆｒアゴニスト
EP1332761A1 (en) 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
IL149562A0 (en) 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
AU2003265057A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
US20060263774A1 (en) 2002-11-01 2006-11-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
EP1579218A2 (en) 2002-12-20 2005-09-28 Enkam Pharmaceuticals A/S Method of modulation of interaction between receptor and ligand
TWI300430B (en) * 2003-01-10 2008-09-01 Ritek Corp Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof
WO2004066286A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Lg Electronics Inc. Recording medium with copy protection information formed in intermittent or alternate wobbled pits and apparatus and methods for forming, recording, and reproducing the recording medium
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
CN1802167A (zh) 2003-06-12 2006-07-12 伊莱利利公司 融合蛋白质
EA008831B1 (ru) 2003-06-12 2007-08-31 Эли Лилли Энд Компани Слитые белки аналогов glp-1
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
SI1680140T1 (sl) 2003-10-16 2011-08-31 Imclone Llc Inhibitorji receptorja-1 za fibroblastni rastni faktor in metode za zdravljenje z le-temi
AU2004303783A1 (en) 2003-12-10 2005-07-07 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
EP1697420A2 (en) 2003-12-19 2006-09-06 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
EP1727559A1 (en) 2004-01-26 2006-12-06 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and a thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
US7887790B2 (en) * 2004-02-20 2011-02-15 Cornell Research Foundation, Inc. Polymers and polymer coatings
JP2007531715A (ja) 2004-03-17 2007-11-08 イーライ リリー アンド カンパニー グリコール結合ｆｇｆ−２１化合物
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
DK1751184T3 (da) 2004-05-13 2009-11-23 Lilly Co Eli FGF-21 fusionsproteiner
MX2007002616A (es) 2004-09-02 2007-05-16 Lilly Co Eli Muteinas de factor de crecimiento de fibroblasto 21.
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
US7655627B2 (en) * 2004-12-14 2010-02-02 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
US20080261875A1 (en) 2005-01-21 2008-10-23 Eli Lilly And Company Method For Treating Cardiovascular Disease
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
EP2083081A1 (en) 2005-07-22 2009-07-29 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
CA2619577A1 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US7395962B2 (en) 2005-10-28 2008-07-08 United Parcel Service Of America, Inc. Pick up notice and method of using same
WO2007055789A2 (en) 2005-10-31 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble therapeutic proteins
EP1996215A2 (en) 2006-02-28 2008-12-03 Trustees Of Boston University Metabolic regulators and uses thereof
US8101721B2 (en) 2006-06-15 2012-01-24 Fibron Ltd. Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
JP2010511382A (ja) 2006-12-01 2010-04-15 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 癌関連タンパク質キナーゼ
PL2068909T3 (pl) 2007-03-30 2012-09-28 Ambrx Inc Modyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowanie
RS57149B1 (sr) 2007-04-02 2018-07-31 Genentech Inc Kloto-beta agonist antitelo za primenu u tretmanu dijabetes melitusa ili otpornosti na insulin
WO2008123625A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-16 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology 補助因子による受容体の活性化方法並びにリガンド活性の利用方法
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
US20100330062A1 (en) 2007-05-08 2010-12-30 Koeffler H Phillip Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer
CA2687746A1 (en) 2007-05-22 2008-12-18 Novartis Ag Methods of treating, diagnosing and detecting fgf21-associated disorders
US8481497B2 (en) 2007-05-29 2013-07-09 Sapporo Medical University Therapeutic agent for cancer, and method for treatment of cancer
CN101778937A (zh) 2007-06-04 2010-07-14 诺和诺德公司 使用n-乙酰葡糖胺转移酶的o-联糖基化
JP2010535781A (ja) 2007-08-03 2010-11-25 イーライ リリー アンド カンパニー 肥満に対する処置
US20090038530A1 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Thieu Truong Watercraft drogue system
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
EA024751B8 (ru) * 2008-06-04 2020-01-31 Амген Инк. Мутанты fgf21 и их применение
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
BRPI0916904A2 (pt) 2008-08-04 2016-10-11 Fiveprime Therapeutics Inc polipeptídeos, moléculares de fusão ecd fgfr4, composições farmacêuticas, polinucleotídio e métodos de tratamento de desordem angiogênica, câncer em paciente e degeneração macular em paciente e respectivos usos
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
SMT202400036T1 (it) 2009-05-05 2024-03-13 Amgen Inc Mutanti fgf21 e loro utilizzi

Also Published As

Publication number Publication date
HK1247134A1 (en) 2018-09-21
SI3248610T1 (sl) 2024-03-29
ES2969528T3 (es) 2024-05-21
PE20160718A1 (es) 2016-08-03
US20120177646A1 (en) 2012-07-12
US8795985B2 (en) 2014-08-05
CN107188950B (zh) 2021-09-28
KR20180014235A (ko) 2018-02-07
DK3248610T5 (da) 2024-10-07
AR076541A1 (es) 2011-06-22
BRPI1011404B1 (pt) 2022-05-03
AU2010246108A1 (en) 2011-11-24
MX2011011709A (es) 2012-02-29
SG10201707763PA (en) 2017-11-29
CN102655877B (zh) 2017-04-05
PE20120358A1 (es) 2012-04-26
IL215937A0 (en) 2011-12-29
EP2427208A1 (en) 2012-03-14
EA021425B1 (ru) 2015-06-30
NZ596037A (en) 2013-10-25
HUE065036T2 (hu) 2024-04-28
EA201171220A1 (ru) 2012-05-30
CA2760196C (en) 2019-02-26
CN102655877A (zh) 2012-09-05
BRPI1011404A2 (pt) 2016-03-15
WO2010129503A1 (en) 2010-11-11
CO6470863A2 (es) 2012-06-29
DK3248610T3 (da) 2024-01-15
US20100285131A1 (en) 2010-11-11
TWI436776B (zh) 2014-05-11
KR101860572B1 (ko) 2018-05-24
PH12015502433A1 (en) 2017-01-16
MY156542A (en) 2016-02-26
EP4353247A2 (en) 2024-04-17
JO3469B1 (ar) 2020-07-05
US8618053B2 (en) 2013-12-31
US8835385B2 (en) 2014-09-16
IL215937A (en) 2015-11-30
SG175861A1 (en) 2011-12-29
JP5823954B2 (ja) 2015-11-25
EP2427208B1 (en) 2017-04-26
ZA201108371B (en) 2012-07-25
CA2760196A1 (en) 2010-11-11
CN107188950A (zh) 2017-09-22
US20120213779A1 (en) 2012-08-23
FI3248610T3 (fi) 2024-01-18
US8188040B2 (en) 2012-05-29
UY38740A (es) 2020-12-31
JP2012525844A (ja) 2012-10-25
HRP20240135T1 (hr) 2024-04-12
US20120178685A1 (en) 2012-07-12
TW201446793A (zh) 2014-12-16
MA33716B1 (fr) 2012-11-01
AU2010246108B2 (en) 2014-10-23
KR20120068764A (ko) 2012-06-27
CL2011002768A1 (es) 2012-08-24
PT3248610T (pt) 2024-02-01
IL242377A (en) 2016-12-29
TW201105345A (en) 2011-02-16
CR20110639A (es) 2012-01-06
PH12015502433B1 (en) 2017-01-16
TWI560197B (en) 2016-12-01
LT3248610T (lt) 2024-01-25
EP3248610A1 (en) 2017-11-29
SG10201402038WA (en) 2014-07-30
SMT202400036T1 (it) 2024-03-13
ES2632742T3 (es) 2017-09-15
UY32607A (es) 2010-12-31
EP4353247A3 (en) 2024-07-17
PL3248610T3 (pl) 2024-04-02
EP3248610B1 (en) 2023-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7191076B2 (ja) Ｆｇｆ２１突然変異体及びその使用
RS65153B1 (sr) Fgf21 mutanti i njihove upotrebe
US9493530B2 (en) FGF21 mutants comprising a mutation at position 98, 171 and/or 180
HK40110187A (en) Fgf21 mutants and uses thereof
AU2014202582A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof
HK1247134B (en) Fgf21 mutants and uses thereof
HK1168537A (en) Fgf21 mutants and uses thereof
HK1168537B (en) Fgf21 mutants and uses thereof
HK1155669A (en) Fgf21 mutants and uses thereof
HK1155669B (en) Fgf21 mutants and uses thereof