UA123432C2 - Димер та спосіб його застосування для лікування метаболічних розладів - Google Patents

Димер та спосіб його застосування для лікування метаболічних розладів Download PDF

Info

Publication number
UA123432C2
UA123432C2 UAA201700670A UAA201700670A UA123432C2 UA 123432 C2 UA123432 C2 UA 123432C2 UA A201700670 A UAA201700670 A UA A201700670A UA A201700670 A UAA201700670 A UA A201700670A UA 123432 C2 UA123432 C2 UA 123432C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
polypeptide
sequence
amino acid
polypeptides
dimer
Prior art date
Application number
UAA201700670A
Other languages
English (en)
Inventor
Даррін Ентоні Ліндхаут
Даррин Энтони ЛИНДХАУТ
Радж ХАЛДАНКАР
Хой Тянь
Джер-Юань ХСУ
Original Assignee
Нджм Біофармасьютікалз, Інк.
НДжМ БИОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нджм Біофармасьютікалз, Інк., НДжМ БИОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. filed Critical Нджм Біофармасьютікалз, Інк.
Publication of UA123432C2 publication Critical patent/UA123432C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується димеру, який містить два поліпептиди, ковалентно приєднані один до одного. Також винахід стосується N-глікозильованого димеру, фармацевтичної композиції, молекули нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна, способу одержання димеру, способу лікування ожиріння в суб’єкта-ссавця та способу лікування гіперглікемії у суб’єкта-ссавця, що містить вказаний димер.

Description

Включення списку послідовностей у вигляді текстового файлу за допомогою посилання
У даній заявці представлений список послідовностей у вигляді текстового файлу "ЧОМВ- 139УМО Зеагівіх" розміром 133 кб, створений 22 липня 2015 року. Вміст зазначеного текстового файлу повністю включений в даний документ за допомогою посилання.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА РОДИННІ ЗАЯВКИ
Дана заявка претендує на пріоритет відповідно до попередньої заявки США Мо 62/031063, що подана 30 липня 2014р., і попередньої заявки США Мо 62/195908, що подана 23 липня 2015 р., які повністю включені в дану заявку за допомогою посилань.
Область винаходу
Даний винахід відноситься, у числі іншого, до поліпептидів та їх композицій, які можна застосовувати для лікування станів, пов'язаних з метаболізмом.
Введення
Причиною ожиріння найчастіше є надмірне споживання їжі в сполученні з обмеженою витратою енергії та/або відсутністю фізичних вправ. Ожиріння збільшує ймовірність розвитку різних захворювань, наприклад, цукрового діабету, гіпертензії, атеросклерозу, захворювання коронарних артерій, синдрому апное у сні, подагри, ревматизму й артриту. Крім того, ризик смертності прямо корелює з ожирінням, так що, наприклад, індекс маси тіла більше 40 призводить до середнього зниження очікуваної тривалості життя більше ніж на 10 років.
Сучасні способи фармацевтичного лікування включають пригнічувачі апетиту, що чинять адресний вплив на рецептори певних класів (наприклад, СВІ, 5-НТос і МРУ); регулятори ланцюгів апетиту в гіпоталамусі та молекулярній дії греліну; та інгібітори поглинання живильних речовин, які чинять адресний вплив на ліпазу. На жаль, жоден із існуючих способів не забезпечує ефективне лікування ожиріння, не викликаючи несприятливих ефектів, деякі з яких можуть бути дуже серйозними.
Високий рівень глюкози в крові стимулює секрецію інсуліну бета-клітинами підшлункової залози. Інсулін, у свою чергу, стимулює проникнення глюкози в м'язи та жирові клітини, що призводить до накопичення глікогену і тригліцеридів, і синтезу білків. Активація рецепторів інсуліну на клітинах різних типів знижує рівень глюкози в кровотоці за рахунок збільшення поглинання й утилізації глюкози, а також зниження утворення глюкози у печінці. Роз'єднання в
Зо цій регуляторній мережі може призвести до діабету та пов'язаних з ним патологічним синдромам, які спостерігаються в значної та зростаючої частини населення.
Пацієнти з розладами метаболізму глюкози можуть страждати від гіперглікемії, гіперінсулінемії та/або непереносимості глюкози. Прикладом розладу, який часто асоціюється з патологічним рівнем глюкози й/або інсуліну є інсулінрезистентність, при якій клітини печінки, жирові та м'язові клітини втрачають здатність реагувати на рівень інсуліну в крові.
З урахуванням поширеності та тяжкості ожиріння, діабету та пов'язаних з ними метаболічних і неметаболічних розладів, зберігається інтерес до способів лікування, які модулюють, наприклад, апетит, рівні глюкози й/або інсуліну і підсилюють біологічну реакцію на коливання рівня глюкози у пацієнта.
СОЕ15 дикого типу, також відомий як МІС-1 (інгібіторний цитокін макрофагів-1), пов'язаний з регуляцією маси тіла (Тзаї УМУ, еї аІ., РГо5 Опе 2013; 8 (2): е55174; Ш58,192,735).
ЗВЕДЕНА ІНФОРМАЦІЯ
Запропоновані поліпептиди з безперервною амінокислотною послідовністю, щонайменше на 90 95 ідентичною амінокислотній послідовності зрілого СООЕ15 дикого типу людини (5ЕО ІЮ МО: 1). Поліпептиди відповідно до даного винаходу включають мутеїни ЗОЕ15, модифікований
СОРН15 ії модифіковані мутеїни СОРЕ15. Крім того, запропоновані композиції цих поліпептидів. У даному винаході передбачене застосування поліпептидів, описаних у даному документі, а також їхніх композицій, для лікування або профілактики розладів, пов'язаних з масою тіла, і/або порушень метаболізму глюкози.
Як відзначено вище, запропонований поліпептид, який містить безперервну амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності 5ЕОО ІЮ МО: 1.
Безперервна амінокислотна послідовність містить щонайменше одну з наступних пар замін відповідних амінокислот у послідовності зХЕО ІЮ МО: 1: ї) О5Т/5 і К21М; ії) К1І6М ї НІ18Т/5; її) 52ЗМ і Е25Т/5; ім) /24М і 026Т/5; м) З50М і Е52Т/5 або Е52М і А54Т/5; мі) О51М і Е53Т/5 або
Е5ЗМ їі А55Т/5; мі) 564М і НббТ/5; мії) І 65М і К67Т/5; мії) 582М і М84Т/5; їх) КУ1ТМ і 093Т/5 або розм і 5957/5; х) Т94М і М96Т/5 або М9БМ і 1 987/5; хі) 597М і 099Т/5; і хі) АТО6М і 01087/5.
Наприклад, безперервна амінокислотна послідовність може містити щонайменше одну з наступних пар замін відповідних амінокислот у послідовності «ЕО ІЮ МО: 1: ї) О5Т і К21М або р55 їі К21М; її) К16М їі НІ8Т або К16М ії НІ185; ії) 523М і Е25Т або 523М і Е255; ім) І24М і 0267 60 або 124М і 0265; м) 550М і Е52Т; 550М і Е525; Е52М і А5Б4Т; або Е52М і А545; мі) О51М і К53Т;
О51М і К535; К5ЗМ і А55Т; або К5ЗМ і А555; мі) 564М і НбЄТ або 564М і Нбб5; мії) І 65М і К67тТ або І 65М і К675; мії) 582М і М84Т або 582М і М845; їх) КО1ТМ і 093; КО1ТМ і 0935; 093М і 5957; або 093М і 5955; х) Т94М і МУ6Т; Т94М і М965; М9БМ і І 98; або М9БМ і 1985; хі) 597М і 0997 або 597М і 0995; і хі) АТО6ЄМ і 01087 або АТОбМ і 01085.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити щонайменше одну з наступних пар замін відповідних амінокислот у послідовності з«ЕО ІЮ МО: 1: О5Т і К21М; 523М і Е25Т/5; К5ЗМ і
А5Б5Т/5; З64М і НбОбТ/5; КО1ТМ і 0937Т/5; 093М і 595Т/5; 597М і 099Т/5; і АТО6М і 01087/5.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити щонайменше одну з наступних пар замін відповідних амінокислот у послідовності ХЕО ІЮО МО: 1: 057 і К21М; 055 і К21М; 523М і
Е25Т; 523М і Е2555; К5ЗМ і А55Т; К5ЗМ і А555; 564М і НбЄТ; 564М і Нбб5; КОМ і 093; КОМ і роз; 093М і 595Т; 093М і 5955; 597М і 20997; 597М і 9995; АТО6М і 01087; і АТОЄМ і 01085.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити щонайменше одну з наступних пар замін відповідних амінокислот у послідовності «ЕО ІЮ МО: 1: Ю5Т і К21М; 564М і НбЄТ/5; КОМ і розт/5; 093М і 5957/5; і 597М і 099Т/5.
В інших варіантах реалізації поліпептид може містити щонайменше одну з наступних пар замін відповідних амінокислот у послідовності ФЕО ІЮО МО: 1: КО1ТМ їі 093Т або КУМ і 0935; і розм і 5957 або БеЗМ їі 5955. В інших варіантах реалізації поліпептид може містити наступну пару замін відповідних амінокислот у послідовності БЕО ІЮ МО: 1: КО1ТМ і 093Т.
У типових варіантах реалізації безперервна амінокислотна послідовність може бути щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІЮ МО: 1.
В інших варіантах реалізації довжина безперервної амінокислотної послідовності може становити щонайменше 98 амінокислот, і зазначена послідовність може бути щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності БХЕО ІЮО МО: 1, причому С-кінцева амінокислота поліпептиду відповідає ізолейцину у положенні 112 5ЕО ІЮ МО: 1.
В інших варіантах реалізації довжина безперервної амінокислотної послідовності може становити щонайменше 98 амінокислот, і зазначена послідовність може бути щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності БХЕО ІЮО МО: 1, причому С-кінцева амінокислота поліпептиду відповідає ізолейцину у положенні 112 5ЕО ІЮ МО: 1.
Типові поліпептиди, описані у даному документі, містять безперервну амінокислотну послідовність, довжина якої становить щонайменше 98 амінокислот, і яка щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності зБЕО ІЮО МО: 1 і містить делецію амінокислот у порівнянні з ЗЕО ІО МО: 1. Наприклад, поліпептиди можуть бути вкорочені за М-кінцем у порівнянні з ЗЕО
ІО МО: 1. Поліпептид може бути вкорочений на 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше амінокислот у порівнянні з 5ЕО ІО МО: 1, наприклад, на 1-14 амінокислот, на 3-14 амінокислот, на 6-14 амінокислот або на 3-6 амінокислот.
У деяких випадках безперервна амінокислотна послідовність, довжина якої становить щонайменше 98 амінокислот, щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності
ЗБО ІО МО: 1 ії не містить перші три амінокислоти, що відповідають першим трьом амінокислотам, які є присутніми на М-кінці ЗЕО ІО МО: 1, причому С-кінцева амінокислота відповідає ізолейцину у положенні 112 5ЕО ІЮ МО: 1.
У деяких випадках довжина безперервної амінокислотної послідовності становить щонайменше 98 амінокислот, зазначена послідовність щонайменше на 9095 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 1 і не містить перші шість амінокислот, що відповідають першим шести амінокислотам, що є присутніми на М-кінці з«»ЕО ІЮ МО: 1, причому
С-кінцева амінокислота відповідає ізолейцину у положенні 112 5ЕО ІЮ МО: 1.
У деяких випадках довжина безперервної амінокислотної послідовності становить щонайменше 98 амінокислот, зазначена послідовність щонайменше на 9095 ідентична амінокислотній послідовності БЕО ІЮО МО: 1 і не містить перші чотирнадцять амінокислот, які відповідають першим чотирнадцяти амінокислотам, що є присутніми на М-кінці ЗЕО ІЮ МО: 1, причому С-кінцева амінокислота відповідає ізолейцину у положенні 112 5ЕО ІЮО МО: 1.
У деяких випадках поліпептид може містити сигнальну послідовність на М-кінці, наприклад, сигнальну послідовність (ЯК. Сигнальну послідовність можна кон'югувати з поліпептидом за допомогою лінкеру, причому зазначений лінкер може бути віддеплювальним лінкером.
Крім того, у даному документі запропонований гібридний білок, який містить від М-кінця до
Сб-кінця: гетерологічний поліпептид |((545)|-О0ОЕ15; гетерологічний поліпептид |(((545)|5-АМ3-
СОЕ15; або гетерологічний поліпептид |((545)|5-АМб-СОЕ15.
У типових варіантах реалізації гетерологічний поліпептид може бути сироватковим альбуміном, білком, що зв'язує мальтозу, або імуноглобуліновим Ес-поліпептидом.
Сироватковий альбумін може являти собою сироватковий альбумін людини, сироватковий 60 альбумін яванської макаки або бичачий сироватковий альбумін. Гібридний білок може містити сигнальну послідовність на М-кінці. Сигнальна послідовність може являти собою сигнальну послідовність ДК.
Крім того, у даному документі запропонована молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує вищеописані поліпептиди або гібридні білки. Молекула нуклеїнової кислоти може бути функціонально зв'язана з елементом, контролюючим експресію, що забезпечує експресію молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид або гібридний білок, іп міго або іп мімо. Крім того, розглядається вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти. Вектор може бути вірусним вектором.
Деякі варіанти реалізації включають трансформовані клітини або клітини-хазяїни, експресуючі один або більше з вищезгаданих поліпептидів.
У конкретних варіантах реалізації даного винаходу один або більше з вищезгаданих поліпептидів призначений для одержання фармацевтичної композиції, причому зазначена композиція також містить один або більше з фармацевтично прийнятних розріджувачів, носіїв або допоміжних речовин. У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція також містить щонайменше один додатковий профілактичний або терапевтичний агент.
Подальші варіанти реалізації даного винаходу містять антитіло, що специфічно зв'язується з одним із вищезгаданих мутеїнових поліпептидів. У деяких варіантах реалізації антитіло містить варіабельну область легкого ланцюга та варіабельну область важкого ланцюга в складі окремих поліпептидів або одного поліпептиду. Антитіло відповідно до даного винаходу зв'язує поліпептид із спорідненістю від приблизно 107 М" до приблизно 1072 М" у деяких варіантах реалізації. В інших варіантах реалізації антитіло містить константну область важкого ланцюга ізотипу ІдС1, Ідс2, ІдсСЗ або Ідс4. У додаткових варіантах реалізації антитіло мічене виявляємою міткою, причому антитіло являє собою Ем, 5сЕм, Бар, Е(аб)2 або Рар' в інших варіантах реалізації.
У даному винаході також розглядаються антитіла, що містять ковалентно зв'язаний неполіпептидний полімер (наприклад, полімер полі(етиленгліколю)). В інших варіантах реалізації антитіло містить ковалентно зв'язану групу, вибрану з ліпідної групи, залишку жирної кислоти, полісахаридної групи та вуглеводної групи.
У деяких варіантах реалізації антитіло являє собою одноланцюгове Ем (5сЕм) антитіло, а в
Зо інших зсЕм представлене у формі мультимеру.
Антитіла відповідно до даного винаходу можуть являти собою моноклональні антитіла, поліклональні антитіла або гуманізовані антитіла, але не обмежуються ними.
Крім того, у даному винаході розглядаються фармацевтичні композиції, що містять антитіло, описане вище, у складі з щонайменше однією фармацевтично прийнятною допоміжною речовиною, носієм або розріджувачем. Такі фармацевтичні композиції також можуть містити щонайменше один додатковий профілактичний або терапевтичний агент.
Деякі варіанти реалізації даного винаходу передбачають стерильний контейнер, який містить одну із зазначених вище фармацевтичних композицій та опціонально один або декілька додаткових компонентів. Як необмежуючий приклад, стерильний контейнер може являти собою шприц. У подальших варіантах реалізації стерильний контейнер є одним із компонентів набору; набір також може містити, наприклад, другий стерильний контейнер, який містить щонайменше один профілактичний або терапевтичний агент.
Крім того, у даному документі описаний спосіб виготовлення вищезгаданих поліпептидів або гібридних білків. Зазначений спосіб може включати культивування клітини-хазяїна, експресуючої поліпептид або гібридний білок; і очищення експресованого поліпептиду або гібридного білка.
У даному винаході також розглядається спосіб лікування або профілактики розладу метаболізму глюкози в суб'єкта (наприклад, людини) шляхом введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості вищезгаданого поліпептиду або гібридного білка. У деяких способах лікування або профілактика призводить до зниження рівня глюкози у плазмі суб'єкта, зниження рівня інсуліну в плазмі суб'єкта, зниження маси тіла та/"або споживання їжі або підвищення переносимості глюкози в суб'єкта. У конкретних варіантах реалізації зазначений розлад метаболізму являє собою цукровий діабет.
Крім того, описаний спосіб лікування або профілактики розладу маси тіла в суб'єкта. Спосіб може включати введення суб'єкту поліпептиду або гібридного білка відповідно до даного винаходу, причому зазначений поліпептид або гібридний білок вводять у кількості, ефективній для лікування або профілактики розладу маси тіла в суб'єкта. У деяких способах лікування або профілактика призводить до зниження маси тіла та/або споживання їжі в суб'єкта.
У деяких варіантах реалізації суб'єкт страждає ожирінням і/або розладом маси тіла.
Хоча даний винахід не обмежується яким-небудь конкретним шляхом введення або схемою прийому, у деяких варіантах реалізації введення здійснюють шляхом парентеральної (наприклад, підшкірної) ін'єкції.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
На фігурі 1 показане вирівнювання амінокислотної послідовності мутеїнів СОЕ15, описаної у даному документі, з амінокислотною послідовністю зрілого (ОЕ15 дикого типу (дт) людини.
На фігурі 2 показане вирівнювання амінокислотної послідовності мутеїнів АМ3-СОРЕ15, описаної у даному документі, з амінокислотною послідовністю зрілого ЗОЕ15 дт людини.
Мутеїни АМЗ3-ПООЕ15 не містять З амінокислот (АКМ), присутніх на М-кінці зрілого ПНООЕ15.
На фігурі З зображені два гібридних білки (конструкти МІ і М2), що містять від М-кінця до С- кінця: сигнальну послідовність ЇЯК (нижній регістр) (І9К) - амінокислотну послідовність (025-
Їб09) людського сироваткового альбуміну (/ЛСА) - невідщеплюваний (сіІу-Сіу-Сту-сту-5ег)з лінкер, (б45)|з (підкреслений шрифт) - амінокислотну послідовність зрілого ЗОЕ15 людини (пООг15) (напівжирний шрифт). Конструкт Мі! (ІЗ9К-ЛСА-(С25)|-пООР15) містить повнорозмірний зрілий пПСООЕ15, у той час як конструкт М2 (ІДК-ЛСА-(Сі45)|--АМЗ-ПИОЕ15) містить АМЗ3-пООЕ15, в якому перші З амінокислоти (АКМ), що відповідають М-кінцевим амінокислотам зрілого НООЕ15, делетовані.
На фігурі 4 зображений невідновлений, пофарбований кумасси ДСН-ПААГ-гель експресії конструктів МІ М2 із середовища стабільної лінії клітин СНОКІЗМ О5КО. Зірочками () позначені вкорочені варіанти, що зустрічаються в М' при секреції з СНОКІ5МУ. РХ/МО- ідентифікація сайтів вкорочування призводить до розробки конструкта з підвищеною стабільністю (М2), вкороченого на З амінокислоти (ДАЕМ або ДМ) на М-кінці зрілого ПБОГЕ15.
На фігурі 5 зображені дві гібридні молекули з амінокислотною послідовністю людського сироваткового альбуміну (025-609) з сигнальною послідовністю /ІдК (нижній регістр), приєднаною до М-кінця амінокислотної послідовності зрілого ЗОЕ15 людини (напівжирний шрифт) за допомогою невідщеплюваного |((545)|5; лінкера (підкреслений шрифт). Конструкт М3 (9К-ЛОСА-(Сі5)|5--АМ3-пПООЕ15) вкорочений на З амінокислоти (ДАМ) з М-кінця зрілого ПСО 15; у той час як конструкт М4 (ІЗ9К-ЛСА-((Сі5))|--АМб-пПООР15) вкорочений на 6 амінокислот (ДАКМООН) у порівнянні з М-кінцем зрілого ПООЕ15.
Зо На фігурі 6 показаний вплив на споживання їжі в мишей з аліментарним ожирінням (0ІО) після однократного гострого підшкірного введення середовища-носія, гібридних молекул МІ, М3 і М4 (40 нмоль/кг). Як відзначено на фігурі, параметри споживання їжі визначали через 24 години після введення та через 7 днів після введення. У кожній групі мишей (п-8) значення р (", ре0,05;5 и, ре0,015 и, р«е0,001) визначали за допомогою Т-критерію для незалежних вибірок при порівнянні груп, що одержували різні дози, з контрольною групою, яка одержувала носій, у кожний зазначений момент часу.
На фігурі 7 показаний вплив на масу тіла БІО мишей після однократного гострого підшкірного введення середовища-носія, гібридних молекул МІ, МЗ і М4 (40 нмоль/кг). Як зазначено на фігурі, параметри маси тіла визначали через 24 години після введення та через 7 днів після введення у порівнянні зі значеннями маси в групі до введення. У кожній групі мишей (п-8) значення р (С, р«0,05; и, р«е0,01; и, р«0,001) визначали за допомогою Т-критерію для незалежних вибірок при порівнянні груп, які одержували різні дози, з контрольною групою, яка одержувала носій, у кожний зазначений момент часу.
На фігурі 8А показані амінокислотні послідовності моноглікозильованих і диглікозильованих мутеїнів, отриманих шляхом впровадження консенсусних сайтів М-зв'язаного глікозилювання (М5-М21). Ці послідовності містять сигнальну послідовність ІДК (нижній регістр), об'єднану з М- кінцем амінокислотної послідовності зрілого ЗОР15 людини (напівжирний шрифт). На фігурі 88 показані нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, зображені на фігурі 8А. На фігурі 8С показані амінокислотні послідовності АМ3-М16 і нуклеотидні послідовності, що кодують ЛМЗ3-М16. На фігурі 80 показана амінокислотна послідовність зрілого
СОБЕ15 дт людини, яка містить сигнальну послідовність ЯК (ІдК-дт-ЗОЕ15), і нуклеотидна послідовність, що кодує ІДК-дт-ОЕ15.
На фігурі 9 представлена зведена інформація про секрецію й утворення димера поряд із поліпшеннями відносної розчинності для кожного сконструйованого М-глікозильованого мутеїну
СОГЕ15 людини, наведеного на фігурі 8А, і для АМ3-М16.
На фігурі 10 показаний вплив на споживання їжі в мишей з аліментарним ожирінням (01) після однократного гострого підшкірного введення середовища-носія (РВ5), поліпептидів
СОЕ15, М16, АМ3-М16 і М17 (1 мг/кг (40 нмоль/кг)).
На фігурі 11 показаний вплив на масу тіла в БіО-мишей після однократного гострого 60 підшкірного введення середовища-носія (РВ5), поліпептидів ЗОБ15, М16, АМ3-М16 і М17
(1 мг/кг (40 нмоль/кг)).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Перед подальшим описом способів і композицій відповідно до даного винаходу варто розуміти, що даний винахід не обмежується конкретними варіантами реалізації, описаними у даному документі, а також варто розуміти, що термінологія, використовувана у даному документі, наведена винятково з метою опису конкретних варіантів реалізації та не призначена для обмеження.
Якщо представлений діапазон величин, варто розуміти, що кожне проміжне значення, до десятої частини одиниці нижньої межі діапазону, якщо з контексту явно не слідує інше, між верхньою та нижньою межею цього інтервалу, і будь-яке інше задане або проміжне значення в цьому заданому інтервалі, перебувають у рамках винаходу. Верхня та нижня межі цих менших інтервалів можуть незалежно бути включені в менші інтервали і також перебувають у рамках винаходу, крім будь-якої спеціально виключеної межі в заданому інтервалі. Якщо заданий інтервал включає один або обидві межі, то інтервали без однієї або обох меж також включені у винахід. Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, використовувані у даному документі, мають ті самі значення, що зазвичай розуміє фахівець в даній області техніки, до якої відноситься даний винахід.
Слід зазначити, що при використанні у даному документі та прикладеній формулі винаходу форми однини включають посилання на множину, якщо з контексту очевидно не слідує інше.
Так, наприклад, згадування "мутантного поліпептиду" включає згадування одного або більше мутантних поліпептидів і так далі. Додатково слід зазначити, що може бути складений план формули винаходу, щоб виключити будь-який необов'язковий елемент. У зв'язку 3 цим передбачається, що дане твердження служить як попередня основа для таких термінів, що виключають, як "винятково", "тільки" і тому подібних у зв'язку з перерахуванням елементів формули винаходу, або для використання "негативних" обмежень.
Публікації, обговорювані в даній заявці, наведені винятково для їх опису до дати подання даної заявки. Ніяку інформацію в даній заявці не слід тлумачити як визнання того, що даний винахід не має права датувати подібну публікацію більш раннім числом у силу дії попереднього винаходу. Більше того, дані представлених публікацій можуть відрізнятися від фактично
Зо опублікованих даних, що може потребувати незалежного підтвердження.
Визначення
Терміни "пацієнт" або "суб'єкт" використовуються взаємозамінно для позначення людини або тварини, що не є людиною (наприклад, ссавця).
Терміни "лікувати", "лікування" і тому подібне відносяться до порядку дій (наприклад, введенню агента, наприклад, поліпептиду або фармацевтичної композиції, що містить поліпептид), які починаються після діагностики, виявлення та тому подібне. Захворювання, розлади або стани, або їхні симптоми з метою усунення, зниження, придушення або полегшення, тимчасового або постійного, щонайменше однієї з основних причин захворювання, розлади або стани, від якого страждає суб'єк, або щонайменше одного з симптомів асоційованих із захворюванням, розладом або станом, від якого страждає суб'єкт. Таким чином, лікування включає придушення (тобто припинення розвитку або подальшого розвитку захворювання, розладу або стану, або клінічні симптоми, асоційовані з ними) активного захворювання (наприклад, з метою зниження рівня інсуліну та/або глюкози в кровотоці, підвищення переносимості глюкози з метою мінімізації коливань рівня глюкози та/або захисту від захворювань, викликаних роз'єднанням гомеостазу глюкози).
Термін "потребуючий лікування", використовуваний у даному контексті, відноситься до рішення, зробленого лікарем або іншою особою, доглядаючою за пацієнтом, про те, що пацієнт має необхідність у лікуванні або таке лікування піде йому на користь. Це рішення приймається на основі цілого ряду факторів, які перебувають у сфері компетенції лікаря або особи, яка доглядає за пацієнтом.
Терміни "запобігати", "запобігання", "профілактика" і тому подібне відносяться до порядку дій (наприклад, введення агента, наприклад, поліпептиду або фармацевтичної композиції, що містить поліпептид), які починаються в такий спосіб (наприклад, до проявлення захворювання, розладу або стану або їх симптому) з метою запобігання, пригнічення, інгібування або зниження, тимчасового або постійного, ризику розвитку захворювання, розладу або стану і тому подібне (наприклад, на підставі відсутності клінічних симптомів) у суб'єкта або затримки їх прояву, головним чином у суб'єкта, схильного до конкретного захворювання, розладу або стану.
У деяких випадках терміни також відносяться до вповільнення прогресування захворювання, розладу або стану, або інгібування його прогресування до шкідливого або іншим способом 60 небажаного стану.
Термін "потребує запобігання", використовуваний у даному контексті, відноситься до рішення, зробленого лікарем або іншою особою, яка доглядає за пацієнтом, про те, що пацієнт має необхідність у профілактичному догляді або такий профілактичний догляд піде йому на користь. Цей висновок роблять на підставі ряду факторів, що входять у компетенцію лікаря або особи, яка здійснює догляд.
Фраза "терапевтично ефективна кількість" відноситься до введення агента суб'єкту окремо або в складі фармацевтичної композиції, однократно або в рамках серії доз, у кількості, здатній вчинити виявлений позитивний вплив на який-небудь симптом, аспект або характеристики захворювання, розлади або стани при введенні пацієнту. Терапевтично ефективну кількість можна встановити шляхом вимірювання відповідних фізіологічних ефектів. Наприклад, у випадку гіперглікемічного стану зниження або зменшення рівня глюкози в крові або поліпшення тесту переносимості глюкози можна використовувати для визначення ефективності лікування гіперглікемічного стану за рахунок зазначеної кількості агента. Наприклад, терапевтично ефективна кількість являє собою кількість, достатню для зниження або зменшення рівня (наприклад, вихідного рівня) глюкози у плазмі натще (ЕРС), причому, наприклад, зазначеної кількості досить для зниження рівня ГРО з більше 200 мг/дл до менше 200 мг/дл, причому зазначеної кількості досить для зниження рівня ЕРО з 175-200 мг/дл до рівня менше вихідного, причому зазначеної кількості досить для зниження рівня ЕРО з 150-175 мг/дл до рівня менше вихідного, причому зазначеної кількості досить для зниження рівня ЕРО з 125-150 мг/дл до рівня менше вихідного і так далі. (наприклад, зниження рівня до менше 125 мг/дл, менше 120 мг/дл, менше 115 мг/дл, менше 110 мг/дл і так далі). У випадку рівня НЬАїЇс ефективна кількість являє собою кількість, достатню для зниження або зменшення рівня більше ніж на приблизно 10-9 95, більше ніж на приблизно 9-8 95, більше ніж на приблизно 8-7 95, більше ніж на приблизно 7-6 95, більше ніж на приблизно 6-5 95 і так далі. Зокрема, зниження або зменшення рівня НБАї1с на приблизно 0,1 то, 0,25 то, 0,4 то, 0,5 то, 0,6 то, 0,7 то, 0,8 то, 0,9 то, 1 то, 1,5 то, 2 то, З то, 4 Зо, З У, 10 96, 20 96, 30 бо, ЗЗ бо, Зо Зо, 40 Уо, 45 95, 50 95 або більше розглядається у даному винаході.
Терапевтично ефективну кількість можна скорегувати залежно від схеми введення, діагностичного аналізу стану суб'єкта і тому подібного.
Фраза "у кількості, достатній, щоб викликати зміну" означає, що існує детектована різниця
Зо між рівнем показника, виміряного перед (наприклад, базовий рівень) і після введення певної терапії. Показники включають будь-який об'єктивний (наприклад, рівень глюкози або інсуліну або споживання їжі) або суб'єктивний параметр (наприклад, гарне самопочуття або апетит суб'єкта).
Фраза "переносимість глюкози" у даному документі відноситься до здатності суб'єкта контролювати рівень глюкози у плазмі й/(або інсуліну в плазмі при коливаннях споживання глюкози. Наприклад, переносимість глюкози охоплює здатність суб'єкта знижувати рівень глюкози у плазмі до рівня, визначеного до споживання глюкози, протягом приблизно 120 хвилин.
Терміни "діабет" і "діабетичний" відносяться до прогресуючого захворювання, пов'язаного з метаболізмом вуглеводів, яке включає недостатнє продукування або утилізацію інсуліну, що часто характеризується гіперглікемією та глюкозурією. Терміни "предіабет" і "предіабетичний" відносяться до стану, при якому в суб'єкта немає характерних ознак, симптомів і тому подібне, що зазвичай спостерігаються при діабеті, але є характерні ознаки, симптоми і тому подібне, які при відсутності лікування можуть прогресувати до діабету. Наявність цих станів можна визначити за допомогою, наприклад, аналізу глюкози у плазмі натще (ЕРО) або тесту на пероральну переносимість глюкози (ОТ). Обидва ці аналізи вимагають, щоб суб'єкт не приймав їжу протягом щонайменше 8 годин до початку аналізу. При аналізі ЕР рівень глюкози в крові суб'єкта вимірюють після голодування; як правило, суб'єкт не приймає їжу протягом ночі, а глюкозу в крові вимірюють ранком, перше ніж суб'єкт поїсть. У здорового суб'єкта, як правило, концентрація ЕРОС становить від приблизно 90 до приблизно 100 мг/дл, у суб'єкта з "преддіабетом", як правило, концентрація ЕРС становить від приблизно 100 до приблизно 125 мг/дл, і в суб'єкта з "діабетом", як правило, рівень ЕР перевищує приблизно 126 мг/дл. При
ОСТТ глюкозу в крові суб'єкта вимірюють після голодування та повторно через дві години після прийому напою, збагаченого глюкозою. Через дві години після прийому напою, збагаченого глюкозою, концентрація глюкози в крові здорового суб'єкта, як правило, становить менше приблизно 140 мг/дл, концентрація глюкози в крові суб'єкта з преддіабетом, як правило, становить від приблизно 140 до приблизно 199 мг/дл, а концентрація глюкози в крові суб'єкта з діабетом, як правило, становить приблизно 200 мг/дл або більше. У той час як вищезгадані значення глікемії відносяться до суб'єктів-людей, у суб'єктів-мишей нормоглікемію, помірну бо гіперглікемію та виражену гіперглікемію визначають по-іншому. У здорового суб'єкта-миші після чотиригодинного голодування, як правило, концентрація ЕРО становить від приблизно 100 до приблизно 150 мг/дл, у суб'єкта-миші з "преддіабетом", як правило, концентрація ЕРО становить від приблизно 175 до приблизно 250 мг/дл, і в суб'єкта-миші з "діабетом", як правило, концентрація ЕРС перевищує приблизно 250 мг/дл.
Термін "Іінсулінрезистентність" у даному документі відноситься до стану, коли нормальна кількість інсуліну не може призвести до нормальної фізіологічної або молекулярної реакції. У деяких випадках гіперфізіологічна кількість інсуліну, продукована ендогенно або введена ззовні, може повністю або частково перебороти інсулінрезистентність та призвести до біологічної реакції.
Термін "метаболічний синдром" відноситься до взаємозалежної групи ознак, яка включає гіперінсулінемію, патологічну переносимість глюкози, ожиріння, перерозподіл жиру в черевній порожнині або верхній частині тіла, гіпертензію, дисфібриноліз і дисліпідемію, що характеризується високим рівнем тригліцеридів, низьким рівнем холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ЛИВЩ) та високим рівнем частинок ліпопротеїнів низької щільності (ЛЛНЩ), але не обмежується ними. Суб'єкти з метаболічним синдромом піддаються ризику розвитку діабету 2 типу та/або інших розладів (наприклад, атеросклерозу).
Фраза "розлад метаболізму глюкози" охоплює будь-який розлад, що характеризується клінічним симптомом або комбінацією клінічних симптомів, пов'язаних з підвищеним рівнем глюкози та/або підвищеним рівнем інсуліну в суб'єкта у порівнянні зі здоровим індивідом.
Підвищений рівень глюкози й/або інсуліну може проявлятися при наступних захворюваннях, розладах і станах, у числі іншого: гіперглікемії, цукровому діабеті ІІ типу, гестаційному діабеті, цукровому діабеті і! типу, інсулінрезистентності, порушенні переносимості глюкози, гіперінсулінемії, порушенні метаболізму глюкози, преддіабеті, інших метаболічних розладах (наприклад, метаболічному синдромі, що також називають синдромом ХХ) й ожирінні.
Поліпептиди відповідно до даного винаходу та їх композиції можна застосовувати, наприклад, для досягнення та/або підтримки гомеостазу глюкози, наприклад, для зниження рівня глюкози в кровотоці та/або зниження рівня інсуліну до діапазону, характерного для здорового суб'єкта.
Термін "гіперглікемія" у даному документі відноситься до стану, при якому в плазмі крові суб'єкта циркулює підвищена кількість глюкози у порівнянні із здоровим індивідом. Гіперглікемію можна діагностувати, використовуючи способи, відомі в даній області техніки, включаючи вимірювання рівня глюкози в крові натще, як описано у даному документі.
Термін "гіперінсулінемія" у даному документі відноситься до стану, при якому підвищений рівень циркулюючого інсуліну при супутньому підвищеному або нормальному рівні глюкози в крові. Гіперінсулінемія може бути викликана інсулінрезистентністю, яка асоційована з дисліпідемією, наприклад, високим рівнем тригліцеридів, високим рівнем холестерину, високим рівнем ліпопротеїнів низької щільності (/ЛІНЩ) та низьким рівнем ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ); високим рівнем сечової кислоти; синдромом полікістозних яєчників; діабетом
І типу й ожирінням. Гіперінсулінемію можна діагностувати як рівень інсуліну в плазмі, що перевищує 2 мкОд/мл.
У даному документі фраза "розлад маси тіла" відноситься до станів, асоційованих з надмірною масою тіла та/"або підвищеним апетитом. Для визначення наявності в суб'єкта надлишкової маси тіла у порівнянні з еталонним здоровим індивідом використовують різні параметри, у тому числі вік, ріст, стать та стан здоров'я суб'єкта. Наприклад, можна вважати, що в суб'єкта надлишкова вага або ожиріння, за рахунок оцінки індексу маси тіла (ІМТ) суб'єкта, який розраховують шляхом розподілу маси тіла суб'єкта в кілограмах на квадрат росту суб'єкта в метрах. Вважається, що в дорослого суб'єкта з ІМТ у діапазоні від «18,5 до «24,9 кг/м2 нормальна вага; у дорослого суб'єкта з ІМТ між - 25 і -29,9 кг/м надлишкова вага (предожиріння); і можна вважати, що дорослий суб'єкт із ІМТ - 30 кг/м2 або вище страждає ожирінням. Підвищений апетит часто сприяє надлишковій вазі. Існує декілька станів, асоційованих з підвищеним апетитом, у тому числі, наприклад, синдром нічного харчування, який характеризується ранковою анорексією та вечірньою поліфагією, і часто асоціюється з безсонням, але може бути пов'язаний з ушкодженням гіпоталамуса.
Термін "активатори" відноситься до агентів, які, наприклад, стимулюють, підвищують, активують, полегшують, підсилюють активацію, сенсибілізують або індукують функцію або дію одного або більше агентів, наприклад, поліпептидів, що використовують для лікування або профілактики метаболічного розладу. Крім того, активатори включають агенти, які діють за тим самим механізмом, що й поліпептиди відповідно до даного винаходу (тобто агенти, які модулюють той самий сигнальний шлях, що й зазначені поліпептиди, аналогічно зазначеним поліпептидам) і здатні викликати біологічну реакцію, порівняну (або перевищуючу) з реакцією,
викликаною зазначеними поліпептидами. Приклади активаторів включають агоністи, наприклад, низькомолекулярні сполуки.
Термін "модулятори" спільно відноситься до поліпептидів відповідно до даного винаходу й активаторів.
Терміни "модулювати", "модуляція" і тому подібне відносяться до здатності агента (наприклад, активатора) прямо або побічно підсилювати функцію або активність одного або більше з поліпептидів (або молекул нуклеїнових кислот, що кодують їх); або здатності агента викликати ефект, порівняний з ефектом одного або більше з поліпептидів.
Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок", використовувані у даному документі взаємозамінно, відносяться до полімерної форми амінокислот будь-якої довжини, що може містити в собі генетично кодовані та не генетично кодовані амінокислоти, хімічно або біохімічно модифіковані або похідні амінокислот, і поліпептиди, які мають модифіковану первинну структуру білка. Дані терміни включають гібридні білки, у тому числі гібридні білки з гетерологічною амінокислотною послідовністю, гібридні білки з гетерологічними та гомологічними лідерними послідовностями, з
М-кінцевими залишками метіоніну або без них; імунологічно мічені білки; і тому подібне, але не обмежуються ними. У конкретних варіантах реалізації зазначені терміни відносяться до амінокислотної полімерної форми будь-якої довжини, що містить генетично кодовані амінокислоти. У конкретних варіантах реалізації зазначені терміни відносяться до амінокислотної полімерної форми будь-якої довжини, що містить генетично кодовані амінокислоти, об'єднані з гетерологічною амінокислотною послідовністю. У конкретних варіантах реалізації зазначені терміни відносяться до амінокислотної послідовності довжиною 112 амінокислот, необов'язково об'єднаною з гетерологічною послідовністю. У конкретних варіантах реалізації у відповідних випадках при згадуванні білків і молекул, описаних у даному документі, терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" відносяться до поліпептидів, що відповідають визначенню у даному документі.
Варто брати до уваги, що на протязі всього даного винаходу посилання робиться на амінокислоти відповідно до однобуквеного або трибуквеного коду. Для зручності читача, однобуквені та трибуквені коди амінокислот наведені нижче: сіусте У (РДегйяє (рю
А Аталіпе (Аа МУ але 01
Ко фесюсте 00 (ее | воїсюсіте (пе
МіМетіолпе (ме | С|Сулете (Су
Б |Рпспуізілтє рве | (М|туюмте (ТУ
М Ттурюрнан хр (ОДНОНіяате (Нв
Кфсуте 00 (5 КАтйте ЗА о Оннатне ов | ДМАзрагавте Аза в ДОшатіс ля Ом | ДО |Аврапіс лсія |Ахр.
Б бепле Бе | Дгутвеопійє (тяг
Зо
У даному документі термін "варіант" охоплює природні варіанти (наприклад, гомологи й алельні варіанти) і варіанти неприродного походження (наприклад, рекомбінантно модифіковані). Природні варіанти включають гомологи, тобто, нуклеїнові кислоти та поліпептиди, нуклеотидні або амінокислотні послідовності яких, відповідно, розрізняються у різних видів. Природні варіанти включають алельні варіанти, тобто, нуклеїнові кислоти та поліпептиди, нуклеотидні або амінокислотні послідовності яких, відповідно, розрізняються в різних індивідів у межах виду. Варіанти неприродного походження включають нуклеїнові кислоти та поліпептиди, що містять зміни в нуклеотидній або амінокислотній послідовності, відповідно, де зазначена зміна у послідовності внесена штучно, наприклад, отримана в лабораторії або іншій установі за рахунок людського втручання ("людськими руками").
Термін "нативний" або "дикого типу" стосовно СОЕ15 відноситься до біологічно активного природного СОР15, у тому числі біологічно активного природного варіанта СОЕ15. Даний термін включає послідовність зрілої ЗОЕР15 людини довжиною 112 амінокислот (ЗЕО ІЮО МО: 1).
Термін "мутеїни" у даному документі в широкому змісті відноситься до рекомбінантних білків, тобто поліпептиду, який містить штучно введену зміну в амінокислотній послідовності, наприклад, зміну в амінокислотній послідовності, отриману в лабораторії або іншій установі за рахунок людського втручання ("людськими руками"). Ці поліпептиди зазвичай містять одиночну або множинні амінокислотні заміни або делеції та часто походять від клонованих генів, що піддалися сайт-специфічному або випадковому мутагенезу, або від повністю синтетичних генів. "Мутеїни СОЕ15" відповідно до даного винаходу, таким чином, охоплюють, наприклад, амінокислотні заміни й/або амінокислотні делеції (наприклад, укорочування за М-кінцем на 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 14 або більше амінокислот) у порівнянні з еталонним поліпептидом, наприклад, у порівнянні зі зрілим ЗОЕ15 людини (5ЕО ІО МО: 1).
У даному документі терміни "модифікований", "модифікація" і так далі щодо нативного
СОБ15 людини або мутеїну ЗОЕ15 відносяться до однієї або більше змін, що міняють властивості ЗОР15 людини, природного варіанта СОЕ15 або мутеїну СОРЕ15, причому зазначені зміни не впливають на первинну амінокислотну послідовність зЗОЕ15. Така властивість включає, наприклад, розчинність, період напівжиття в кровотоці, стабільність, кліренс, імуногенність або алергенність та технологічність (наприклад, вартість й ефективність). "Модифікація" включає ковалентну хімічну модифікацію, яка не впливає на саму первинну амінокислотну послідовність поліпептиду ЗОБЕ15 (нативного або мутеїну). Можливі зміни ЗОЕ15 людини, природного варіанта ЗОГ15 або мутеїну ООЕ15 включають ПЕГілювання (ковалентне приєднання однієї або більше молекул поліетиленгліколю (ПЕГ) або їх похідних); глікозилювання (наприклад, М- глікозилювання), полісіалування та приєднання ГЕК; об'єднання з мальтоз-сполучним білком; об'єднання з альбуміном (наприклад, з ЛСА); зв'язування з альбуміном через, наприклад, кон'югований ланцюг жирної кислоти (ацилювання); об'єднання з Ес; і об'єднання з імітатором
ПЕГ, але не обмежуються ними. Деякі конкретні варіанти реалізації призводять до модифікацій, пов'язаних з полієтиленгліколем, інші конкретні варіанти реалізації призводять до модифікацій, пов'язаних з альбуміном, а інші конкретні варіанти реалізації призводять до модифікацій, пов'язаних із глікозилюванням, або комбінаціям вищевказаного.
Терміни "ДНК", "нуклеїнова кислота", "молекула нуклеїнової кислоти", "полінуклеотид" і тому подібні використовуються в даному описі взаємозамінно для позначення полімерної форми
Ко) нуклеотидів будь-якої довжини, дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів, або їх аналогів.
Приклади, що не мають обмежувального характеру, включають лінійні та циклічні нуклеїнові кислоти, матричну РНК (мРНК), комплементарну ДНК (кДНК), рекомбінантні полінуклеотиди, вектори, зонди, праймери та тому подібні.
Термін "зонд" відноситься до фрагмента ДНК або РНК, що відповідає досліджуваному гену або послідовності, причому зазначений фрагмент мічений радіоактивною (наприклад, шляхом включення ЗР або 355) або деякими іншими виявляємими молекулами, наприклад, біотином, дигоксигеніном або флуоресцеїном. Оскільки ланцюги ДНК або РНК з комплементарними послідовностями повинні гібридизуватися, зонд можна застосовувати, наприклад, для мічення вірусних бляшок, бактеріальних колоній або смуг в гелі, що містять досліджуваний ген. Зонд може являти собою клоновану ДНК або синтетичний ланцюг ДНК; останній варіант можна використовувати для одержання кКкДНК або геномного клону з виділеного білка, наприклад, виконавши мікросеквенування частини білка, одержавши нуклеотидну послідовність, що кодує білок, синтезувавши олігонуклеотид, що несе цю послідовність, позначивши послідовність радіоактивною міткою та використовуючи її як зонд для скринінгу бібліотеки КДНК або геномної бібліотеки.
Термін "гетерологічний" відноситься до двох компонентів, заданих структурами, що походять з різних джерел. Наприклад, у контексті поліпептиду, "гетерологічний" поліпептид може містити функціонально зв'язані амінокислотні послідовності, що походять від різних поліпептидів (наприклад, перший компонент, що містить рекомбінантний поліпептид, і другий компонент, що походить від нативного поліпептиду ЗОЕ15). Аналогічним чином, у контексті полінуклеотиду, що кодує химерний поліпептид, "гетерологічний" полінуклеотид може містити функціонально зв'язані нуклеотидні послідовності, що походять від різних генів (наприклад, перший компонент із нуклеїнової кислоти, що кодує рекомбінантний поліпептид відповідно до варіанта реалізації, описаного у даному документі, і другий компонент із нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид-носій). Інші типові "гетерологічні" нуклеїнові кислоти включають експресуючі конструкти, в яких нуклеїнова кислота, що містить кодуючу послідовність, функціонально пов'язана з регуляторним елементом (наприклад, промотором), генетичне походження якого відрізняється від походження кодуючої послідовності (наприклад, з метою забезпечити експресію в досліджуваній клітині-хазяїні генетичне походження якої може бо відрізнятися від походження кодуючого промотору послідовності або як промотору, так і кодуючої послідовності). Наприклад, промотор Т7, функціонально пов'язаний з полінуклеотидом, що кодує поліпептид ЗОЕ15 або його домен, називають гетерологічною нуклеїновою кислотою. У контексті рекомбінантних клітин термін "гетерологічний" може відноситись до наявності нуклеїнової кислоти (або продукту гена, наприклад, поліпептиду), генетичне походження якої відрізняється від клітини-хазяїна, в якій вона присутня.
Термін "функціонально зв'язаний" відноситься до зв'язку між молекулами, що забезпечує бажану функцію. Наприклад, "функціонально зв'язані" у контексті нуклеїнових кислот відноситься до функціонального зв'язку між нуклеотидними послідовностями. Наприклад, послідовність, що контролює експресію нуклеїнової кислоти (наприклад, промотор, сигнальна послідовність або масив сайтів зв'язування факторів транскрипції) може бути функціонально зв'язана з другим полінуклеотидом, причому зазначена послідовність, що контролює експресію, впливає на транскрипцію та/або трансляцію другого полінуклеотиду. У контексті поліпептиду термін "функціонально зв'язані" відноситься до функціонального зв'язку між амінокислотними послідовностями (наприклад, різними доменами), що забезпечує описану активність поліпептиду.
Використовуваний в даному описі у контексті структури поліпептиду, "М-кінець" (або "аміно- кінець") ії С-кінець (або "карбоксильний кінець") відносяться до крайніх аміно- і карбоксильних кінців поліпептиду, відповідно, у той час як терміни "М-кінцевий" та "С-кінцевий" відносяться до відносних положень в амінокислотній послідовності поліпептиду в напрямку до М- ї С-кінця, відповідно, і можуть включати залишки на М- і С-кінці, відповідно. "БТезпосередньо М-кінцевий" або "безпосередньо С-кінцевий" відноситься до положення першого амінокислотного залишку щодо другого амінокислотного залишку, де перший та другий амінокислотні залишки ковалентно зв'язані для забезпечення безперервної амінокислотної послідовності.
Термін "що походить від" у контексті амінокислотної послідовності або полінуклеотидної послідовності (наприклад, амінокислотна послідовність, "яка походить від" поліпептиду СОР 15), призначений для позначення, що поліпептид або нуклеїнова кислота містять послідовність, засновану на послідовності еталонного поліпептиду або нуклеїнової кислоти (наприклад, природного поліпептиду СОЕ15 або нуклеїнової кислоти, що кодує СОРЕ15), і не призначений для обмеження джерела або способу, за допомогою якого отриманий білок або нуклеїнова кислота. Наприклад, термін "відбувається від" включає гомологи або варіанти еталонних амінокислотних послідовностей або послідовностей ДНК.
У контексті поліпептиду термін "виділений" відноситься до досліджуваного поліпептиду, що (якщо він є природним поліпептидом) перебуває в середовищі, яке відрізняється від середовища, в якому він може зустрічатися у природних умовах. Під терміном "виділений" мають она увазі поліпептиди, які перебувають у зразках, грунтовно збагачених на представляючий інтерес поліпептид і/або в яких такий поліпептид є частково або значно очищеним. Якщо поліпептид не зустрічається у природних умовах, термін "виділений" означає, що поліпептид відділений від середовища, в якому він був отриманий з використанням синтетичних або рекомбінантних засобів. "Збагачений" означає, що зразок піддавали штучним маніпуляціям (наприклад, у лабораторії, наприклад, вчений або клініцист), так що досліджуваний поліпептид присутній у а) підвищеній концентрації (наприклад, щонайменше в З рази перевищуючої, щонайменше в 4 рази перевищуючої щонайменше в 8 разів перевищуючої, щонайменше в 64 рази перевищуючої або більше) у порівнянні з концентрацією поліпептиду у вихідному зразку, наприклад, біологічному зразку (наприклад, зразку, в якому поліпептид зустрічається у природних умовах або в якому він присутній після введення), або Б) концентрації, що перевищує концентрацію в середовищі, в якому зазначений поліпептид був отриманий (наприклад, у бактеріальній клітині).
Термін "в основному чистий" означає, що компонент (наприклад, поліпептид) становить
БО більше ніж близько 50 95 від загального вмісту композиції, і, як правило, більше, ніж близько 60 95 від загального вмісту поліпептиду. Більш типово, "в основному чистий" відноситься до композицій, в яких щонайменше 7595, щонайменше 8595, щонайменше 9095 або більша кількість від загальної композиції становить компонент інтересу. У деяких випадках поліпептид буде становити більше ніж близько 90 95, або більше ніж близько 95 95 від загального вмісту композиції.
Терміни "антитіла" (Ат) та "імуноглобуліни" (Ід) відносяться до глікопротеїнів, що мають однакові структурні характеристики. У той час як антитіла демонструють специфічність зв'язування з конкретними антигенами, імуноглобуліни включають як антитіла, так й інші антитілоподібні молекули, які не мають специфічність до антигена. Антитіла докладно описані 60 далі у даному документі.
Термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, отриманого з популяції практично однорідних антитіл, тобто, окремі антитіла, що становлять популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у незначних кількостях.
Моноклональні антитіла є високоспецифічними та спрямовані проти єдиного антигенного сайту.
На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які можуть містити різні антитіла проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло спрямоване проти єдиної детермінанти антигена.
У контексті антитіла термін "виділене" відноситься до антитіла, відділеного й/або очищеного від забруднюючих компонентів природного середовища; такі забруднюючі компоненти включають матеріали, які можуть заважати діагностичному або терапевтичному застосуванню антитіла, і можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини.
Фраза "консервативна амінокислотна заміна" відноситься до заміни амінокислотних залишків у наступних групах: 1) Г.І, М, М, Е; 2) К,К; 3, М, НН, М, 4) б, А, Т, 55530, М; 16) О,
Е. Консервативні амінокислотні заміни можуть зберігати активність білка при заміні амінокислот(и) у складі білка амінокислотою, що містить бічний ланцюг з аналогічними кислотними, лужними властивостями, зарядом, полярністю або розміром. Посібник із заміни, інсерції або делеції може бути заснований на вирівнюванні амінокислотних послідовностей різних варіантів білків або білків із різних видів.
Фактор диференціювання росту 15 (5015)
СОБ15, також відомий як МіІС-1 (інгібіторний цитокін макрофагів-1), РОБ (фактор диференціювання передміхурової залози), РАВ (плацентарний кістковий морфогенетичний білок), МАС-1 (ген, який активується нестероїдними протизапальними препаратами (НПЗП)),
ТФР-РІ і РТОЕВ, є членом над сімейства трансформуючого фактора росту В (ТФР-Д). СОР15, що синтезується у вигляді 62-кДа внутрішньоклітинного білка-попередника, згодом розщеплюваного фурин-подібною протеазою, секретується у вигляді 25-кДа білка, зв'язаного дисульфідними зв'язками. |Див., наприклад, Раїпіє еї а!., У. ГеиКос. Віо! 65:2-5 (1999)). мРНК
СОРН15 зустрічається в декількох тканинах, у тому числі у печінці, нирках, підшлунковій залозі, товстій кишці та плаценті, і експресію ЗОЕ15 у печінці може в значній мірі підсилюватися при
Зо ушкодженні таких органів, як печінка, нирки, серце та легені.
Попередник СОЕ15 являє собою 308-амінокислотний поліпептид (Мо послідовності в МОВІ
МР 004855.2), що містить 29-амінокислотний сигнальний пептид, 167-амінокислотний продомен і зрілий домен довжиною 112 амінокислот, що вирізається з продомена фурин-подібними протеазами. 308-амінокислотний поліпептид СООРЕ15 називають "повнорозмірним" поліпептидом
СОБ15; 112-амінокислотний поліпептид СОЕ15 (амінокислоти 197-308 "повнорозмірного"
СОЕ15) являє собою "зрілий" поліпептид СОРБ15 (5ЕО ІЮ МО: 1). Якщо не зазначено інше, термін "СОЕ15" відноситься до зрілої послідовності людини довжиною 112 амінокислот. Крім того, чисельні згадування конкретних залишків ЗОРЕ15 відносяться до зрілої послідовності довжиною 112 амінокислот (тобто залишок 1 являє собою Ла (А), а залишок 112 являє собою
Пе (І); див. зЕО ІЮО МО: 1). Слід зазначити, що хоча амінокислотна послідовність попередника
СОРГ15 дозволяє передбачити три сайти вирізання, що призводить до трьох гіпотетичних форм "зрілого" ЗОЕ15 людини (тобто довжиною 110, 112 і 115 амінокислот), 112-амінокислотна зріла послідовність прийнята за правильний варіант.
Рамки даного винаходу включають ортологи СОРЕ15 та їхні модифіковані форми, отримані з інших видів ссавців, у тому числі миші (МР 035949), шимпанзе (ХР 524157), орангутанга (ХР. 002828972), резусу (ЕНН29815), гігантської панди (ХР. 002912774), гібону (ХР. 003275874), морської свинки (ХР 003465238), тхора (АЕК9У8997), корови (МР 001193227), свині (МР 001167527), собаки (ХР 541938) і качкодзьоба (Огпійпогпупспи5 апаїйійпиб5; АЕМб61279), а також їхнє застосування. Зріла форма СОЕ15 людини має приблизно 67 95 ідентичність амінокислотної послідовності у порівнянні з ортологом миші.
Для зручності, модифіковані молекули СООЕ15 людини, варіанти СОРЕ15 (наприклад, мутеїни) та модифіковані мутеїни ЗОРЕ15, описані далі, спільно називаються далі у даному документі "поліпептидом(ами)». Слід зазначити, що будь-яке згадування "людини" у зв'язку з поліпептидами та молекулами нуклеїнових кислот відповідно до даного винаходу не означає обмеження відносно способу або джерела одержання зазначеного поліпептиду або нуклеїнової кислоти, а лише відноситься до послідовності, оскільки вона може відповідати послідовності природного поліпептиду або молекули нуклеїнової кислоти людини. У конкретних варіантах реалізації молекули модифікованого ЗОЕ15 людини являють собою М-глікозильовані димери. У певних варіантах реалізації молекули модифікованого ЗОБ15 людини являють собою М- бо глікозильовані гомодимери. Крім поліпептидів людини та молекул нуклеїнових кислот, що кодують їх, у даному винаході розглядаються поліпептиди, родинні ЗОЕ15, і відповідні молекули нуклеїнових кислот із інших видів.
А. Поліпептиди з бажаними фізичними властивостями
У даному винаході, зокрема, розглядаються поліпептиди, що містять безперервну амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 9о, 85 95, 90 95, 95 95, 96 9Уо, 97 90, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентичну амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 (зріллму СОЕ15 людини довжиною 112-амінокислот). Поліпептиди можуть містити одну або більше амінокислотних замін і або делецій у порівнянні з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІО МО: 1. У певних варіантах реалізації, крім амінокислотних замін, поліпептиди відповідно до даного винаходу можуть також містити делеції амінокислот у порівнянні з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 1.
У деяких варіантах реалізації поліпептиди відповідно до даного винаходу можуть містити делеції амінокислот у порівнянні з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 1.
Для зручності й ясності, амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1 використовують як еталонну послідовність для поліпептидів, представлених у даному документі. Отже, положення амінокислот у даному документі пронумеровані стосовно 5ЕО ІЮО МО: 1. Послідовність 5ЕО ІЮ
МО: 1 представлена нижче:
АВМарНсСРІ ЧРОВССВІ НТУВАБІ ЕОЇ СМ АОМУМІ БРАЕМОМТМСІСАСРООГНААММНАСІКТ
ЗІ НВ КРОТМРАРССУРАБУМРММОКТОТОИамМ5І ОТМООІ І АКОСНСІ
У деяких варіантах реалізації поліпептиди відповідно до даного винаходу можуть включати одну, дві, три або більше амінокислотні заміни, додавання або делеції, що впроваджують один або більше консенсусний(х) сайт(ів) М-зв'язаного глікозилювання в області, де такий сайт відсутній в зЗЕО ІЮ МО: 1. Консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання містить послідовність
МХ5/Т, де М являє собою Авп; Х - будь-яка амінокислота, крім проліну, після якої перебуває 5Бег (5) або Тпг (Т).
Приклади поліпептидів відповідно до даного винаходу включають поліпептиди, що містять один, два, три, чотири або більше консенсусних сайти глікозилювання (наприклад, консенсусних сайтів М-зв'язаного глікозилювання) в амінокислотному положенні, де такий сайт відсутній в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити амінокислотну заміну в порівнянні з
Зо ЗБО 10 МО: 1, що забезпечує утворення одного консенсусного сайту М-зв'язаного глікозилювання у положенні заміщення (наприклад, послідовність МОЮ в 5ЕО ІЮ МО: 1 можна замінити на МОТ/5 шляхом однієї заміни; положення заміщення підкреслене). В інших випадках поліпептид може містити дві амінокислотні заміни у порівнянні з ФЕО ІЮ МО: 1, що забезпечують утворення одного консенсусного сайту М-зв'язаного глікозилювання у положеннях заміщення (наприклад, послідовність КТО в 5ЕО ІЮО МО: 1 можна замінити на МТТ/5 шляхом двох замін; положення заміщення підкреслені). У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити три амінокислотні заміни у порівнянні з ЗЕО І МО: 1, що забезпечують утворення одного консенсусного сайту М-зв'язаного глікозилювання у положеннях заміщення (наприклад, послідовність ЗРО в ЗЕО ІЮ МО: 1 можна замінити на МТТ/5 шляхом трьох замін; положення заміщення підкреслене).
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити одну або більше амінокислотну делецію у порівнянні з зЗЕО ІЮ МО: 1, що забезпечують утворення одного консенсусного сайту
М-зв'язаного глікозилювання у положенні делеції. Наприклад, послідовність
МООНСРІГОРОКССКІНТ в 5ЕБО ІО МО: 1 можна змінити шляхом делеції амінокислот 0-Н (підкреслені)), тим самим забезпечуючи утворення консенсусного сайту М-зв'язаного глікозилювання: МОТ.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити додавання однієї або більше амінокислоти у порівнянні з БЕО ІЮО МО: 1, що забезпечує утворення одного консенсусного сайту
М-зв'язаного глікозилювання у положенні(ях) додавання. Приклад впровадження консенсусного сайту М-зв'язаного глікозилювання шляхом додавання однієї амінокислоти включає додавання
М до послідовності І НТ в ЗЕО ІЮО МО: 1, що дозволяє одержати послідовність І МНТ, де МНТ - консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання.
Як відзначено вище, поліпептид може містити одну або більше амінокислотну заміну в порівнянні з БЕО ІЮО МО: 1, і заміни можна нумерувати, як положення відповідної амінокислоти у послідовності зЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити безперервну амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 8595, 90 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичну амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 1, причому зазначена безперервна амінокислотна послідовність містить щонайменше одну з наступних пар замін у порівнянні з 60 відповідними амінокислотами у послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1:
ї) О5Т їі К21М або 055 і К21М; ії) К1І6ЄМ і НІ8Т або К16М і НІ185; ії) 523М і Е25Т або 523М і Е255; їм) Г24М і 026 або 124М і 0265; м) 550М і Е52Т; 550М і Е525; Е52М і А54Т; або Е52М і А545; мі) О051М і К53Т; О51М і К535; Е5ЗМ і АБ55Т; або К5ЗМ і А555; мі) 564М і НббЄТ або 564М і Нбб5; мії) 65М і К67Т або І165М і К675; мії) 582М і М84Т або 582М і М845; їх) КО1М і 093; КО1ТМ і 0935; 093М і 595Т; або БеЗМ і 5955; х) Т9АМ і МО6Т; Т94М і М965; МОБбМ і І 987; або М9БбМ і 1 985; хі) 597М і 20997 або 597М і 0995; і хії) АТО6М і 0108Т або А1О6М і 01085.
Наприклад, заміни, представлені вище у пункті ї), означають, що поліпептид містить треонін (7) або серин (5) в амінокислотному положенні, що відповідає амінокислотному положенню 5 в
ЗЕО ІЮ МО: 1, причому в 5ЕО ІЮ МО: 1 в амінокислотному положенні 5 присутній аспартат (0).
Заміну Ю у положенні 5 на Т або 5 можна позначити як Ю5Т/5. Положення відповідної амінокислоти у поліпептиді у порівнянні з з«ЕО ІЮ МО: 1 можна визначити шляхом вирівнювання амінокислотних послідовностей.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити дві амінокислотні заміни (пари замін), що забезпечують утворення однієї консенсусної послідовності М-глікозилювання у положенні, де консенсусна послідовність М-глікозилювання відсутня в 5ЕО ІЮО МО: 1. Приклади таких замін включають К16М і НІ8Т/5; КО1ТМ і 093Т/55; Т94М ї М96Т/5; та інші заміни, перераховані вище.
КІ1Т6М ї НІ8Т/5 означають, що поліпептид містить М у положенні, що відповідає положенню 16
ЗЕО ІЮ МО: 1, причому в ЗЕО ІЮО МО: 1 там є присутній К, і поліпептид містить Т або 5 у положенні, що відповідає положенню 18 в 5БО ІЮ МО: 1, де є присутнім Н. Оскільки послідовність ЕХН (у положеннях 16-18) в 5ЕБО ІЮ МО: 1 не містить залишків консенсусної послідовності М-зв'язаного глікозилювання, зазначена пара замін призводить до впровадження консенсусної послідовності М-зв'язаного глікозилювання.
Зо В альтернативних варіантах реалізації одиночної амінокислотної заміни може бути досить для появи консенсусної послідовності М-зв'язаного глікозилювання, наприклад, оскільки послідовність МОЮ (у положенні 3-5) є присутньою в ЗЕО ІЮ МО: 1, єдина заміна О на Т або 5 призводить до утворення послідовності МОТ або МО5, відповідно, які являють собою консенсусні послідовності М-глікозилювання.
У деяких випадках в СОЕ15 дикого типу можна впровадити більше однієї консенсусної послідовності М-глікозилювання. Наприклад, амінокислотну послідовність (ОЕ15 дикого типу можна модифікувати шляхом заміни та/або делеції, одержуючи одну, дві, три, чотири або більше консенсусні послідовності М-глікозилювання. У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити 112-амінокислотну безперервну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичність амінокислотної послідовності зХЕО ІЮ МО: 1, де 112 суміжних амінокислот містять одну, дві, три, чотири або більше консенсусних послідовності М-глікозилювання, наприклад, 1- 12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4, 1-3 або 1-2 консенсусні послідовності М-глікозилювання.
Приклад поліпептиду з двома консенсусними послідовностями М-глікозилювання включає мутеїн СОЕ15, що містить Т/С у положенні 5 (у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1 ї М у положенні 21 (у порівнянні з БЕО ІО МО: 1).
Типові поліпептиди відповідно до даного винаходу включають поліпептиди, що містять дві або більше консенсусні послідовності М-зв'язаного глікозилювання. Наприклад, поліпептид може містити комбінацію двох або більше з наступних пар заміни: ї) О5Т їі К21М або 055 і К21М; ії) К1І6ЄМ і НІ8Т або К16М і НІ185; ії) 523М і Е25Т або 523М і Е255; їм) Г24М і 026 або 124М і 0265; м) 550М і Е52Т; 550М і Е525; Е52М і А54Т; або Е52М і А545; мі) О051М і К53Т; О51М і К535; Е5ЗМ і АБ55Т; або К5ЗМ і А555; мі) 564М і НбЄТ; або 564М і Неб5З; мії) 65М і К67Т; або І 65М і К675; мії) 582М і М84Т або 582М і М845; їх) КО1М і 093; КО1ТМ і 0935; 093М і 595Т; або БеЗМ і 5955; х) Т9АМ і МО6Т; Т94М і М965; МОБбМ і І 987; або М9БбМ і 1 985; бо хі) 597М і 20997; або 597М і 0995; і хії) АТО6М і 0108 або АТО6М і 01085.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити безперервну амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 8595, 90 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичну амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, причому зазначена безперервна амінокислотна послідовність містить щонайменше одну з наступних пар замін у порівнянні з відповідними амінокислотами у послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1: ї) О57Т ї Е21М або 055 і К21М; ї) Е16М і НІ8Т або КІ16М і НІ185; ії) З2З3М і Е25Т або 523М і Е255; їм) Б5ОМ і Е52Т; 550М й Е525; Е52М і А5А4Т; або Е52М і А545; мі) 951М і К53Т; О51М і К535; К5ЗМ і А55Т; або Е5ЗМ і А555; мі) З64М і НбЄТ; або 564М і Нбб5; мії) КОУТМ і 093Т; КІМ і 09355 093М і 595Т; або БОЗМ і 5955; мії) Т94М і МУ6Т; Т94М і М965; М9БМ і 1987; або М9БМ і 1 985; їх) 597М і 0997; або 597М і 0995; і х) АТО6М і 0108 або АТО6М і 01085; де заміна створює один або більше консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання, що містить послідовність МХ5/Ї, де М являє собою Авп; Х - будь-яка амінокислота, крім проліну, після якої перебуває Зег (5) або Тпг (Т), і, крім того, один або більше з консенсусних сайтів М- зв'язаного глікозилювання пов'язані з М-гліканом. У додатковому варіанті реалізації поліпептид утворить димер. У додатковому варіанті реалізації поліпептид укорочений за М-кінцем і/або С- кінцем у порівнянні з ФЕО ІЮ МО: 1. Поліпептид може бути вкорочений на 1, 2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше амінокислот у порівнянні з еталонним поліпептидом, наприклад,
ЗЕО ІО МО: 1. У конкретному варіанті реалізації поліпептид укорочений на перші три М-кінцевих залишки СОР15 (ДАЕМ або АМ3). У додатковому варіанті реалізації поліпептид має розчинність щонайменше 0,5 мг/мл, наприклад, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше
З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 20 мг/мл або щонайменше 25 мг/мл, наприклад, розчинністю в діапазоні від 0,5 мг/мл до 25 мг/мл, від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл, від 1 мг/мл до 25 мг/мл, від 1 мг/мл до 20 мг/мл, від З мг/мл до 25 мг/мл, від З мг/мл до 20 мг/мл, від 5 мг/мл до 25 мг/мл, від 5 мг/мл до 20 мг/мл або від 5 мг/мл до 18 мг/мл у буферному розчині. У деяких випадках поліпептид має розчинність щонайменше 0,5 мг/мл, наприклад, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 20 мг/мл або щонайменше 25 мг/мл, наприклад, розчинністю в діапазоні від 0,5 мг/мл до 25 мг/мл, від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл, від 1 мг/мл до 25 мг/мл, від 1 мг/мл до 20 мг/мл, від З мг/мл до 25 мг/мл, від З мг/мл до 20 мг/мл, від 5 мг/мл до 25 мг/мл, від 5 мг/мл до 20 мг/мл або від 5 мг/мл до 18 мг/мл у буферному розчині. Буфер може являти собою фосфатний буфер, трис-буфер,
НЕРЕ5-буфер, МОРЗ-буфер, РІРЕ5-буфер і тому подібне або їх комбінацію. У деяких випадках буфер може містити фізіологічний розчин з фосфатним буфером. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію та хлорид натрію. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію, хлорид натрію та мурашину кислоту. Наприклад, буфер може містити 10- 100 мМ трис (рН 7), 1-50 мМ фосфату калію, 100-200 мМ хлориду натрію та 10-30 мСм/см мурашиної кислоти. У додаткових варіантах реалізації поліпептид знижує рівень глюкози в крові, масу тіла та/або споживання їжі щонайменше на 10 95, 20 95, ЗО У, 50 9, 60 Фо, 70 95, 80 95 або 90 95 у порівнянні зі станом до введення поліпептиду.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити безперервну амінокислотну послідовність щонайменше на 80 95, 8595, 90 95, 9595, 9695, 97 95, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичну амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 1, причому зазначена безперервна амінокислотна послідовність містить щонайменше одну з наступних пар замін у порівнянні з відповідними амінокислотами у послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1: її О57Т і К21М; ї) 523М і Е25Т; її) Е52М і АБАТ; їм) Е5ЗМ і А55Т; м) З64М і НебТ; мі) КО1ТМ і 0937; мії) 093М і 5957; мії) 597М і 0991; і 60 їх) АЛОЄМ і 01087;
де заміна створює один або більше консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання, що містить послідовність МХ5/Ї, де М являє собою Авп; Х - будь-яка амінокислота, крім проліну, після якої перебуває Зег (5) або Тпг (Т), і, крім того, один або більше з консенсусних сайтів М- зв'язаного глікозилювання пов'язані з М-гліканом. У додатковому варіанті реалізації поліпептид утворить димер. У додатковому варіанті реалізації поліпептид укорочений за М-кінцем і/або С- кінецем у порівнянні з зЕО ІЮ МО: 1. Поліпептид може бути вкорочений на 1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше амінокислот у порівнянні з еталонним поліпептидом, наприклад,
ЗЕО ІО МО: 1. У конкретному варіанті реалізації поліпептид укорочений на перші три М-кінцевих залишки СОР15 (ДАМ або АМ3З). У додатковому варіанті реалізації поліпептид має розчинність щонайменше 0,5 мг/мл, наприклад, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше
З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 20 мг/мл або щонайменше 25 мг/мл, наприклад, розчинністю в діапазоні від 0,5 мг/мл до 25 мг/мл, від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл, від 1 мг/мл до 25 мг/мл, від 1 мг/мл до 20 мг/мл, від З мг/мл до 25 мг/мл, від З мг/мл до 20 мг/мл, від 5 мг/мл до 25 мг/мл, від 5 мг/мл до 20 мг/мл або від 5 мг/мл до 18 мг/мл у буферному розчині. У деяких випадках поліпептид має розчинність щонайменше 0,5 мг/мл, наприклад, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 20 мг/мл або щонайменше 25 мг/мл, наприклад, розчинністю в діапазоні від 0,5 мг/мл до 25 мг/мл, від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл, від 1 мг/мл до 25 мг/мл, від 1 мг/мл до 20 мг/мл, від З мг/мл до 25 мг/мл, від З мг/мл до 20 мг/мл, від 5 мг/мл до 25 мг/мл, від 5 мг/мл до 20 мг/мл або від 5 мг/мл до 18 мг/мл у буферному розчині. Буфер може являти собою фосфатний буфер, трис-буфер, НЕРЕ5- буфер, МОРЗ-буфер, РІРЕЗ-буфер і тому подібне або їх комбінацію. У деяких випадках буфер може містити фізіологічний розчин з фосфатним буфером. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію та хлорид натрію. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію, хлорид натрію та мурашину кислоту. Наприклад, буфер може містити 10-100 мМ трис (рН 7), 1-50 мМ фосфату калію, 100-200 мм хлориду натрію та 10-30 мСм/см мурашиної кислоти. У додаткових варіантах реалізації поліпептид знижує рівень глюкози в крові, масу тіла та/або споживання їжі щонайменше на 10 95, 20 95, ЗО Зо, 50 95, 60 Зо, 70 95, 80 95 або 90 95 у
Зо порівнянні зі станом до введення поліпептиду. У конкретних варіантах реалізації поліпептид містить або складається в основному з: ЗЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, БЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО І МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕО ІО МО: 18 або 5ЕО ІЮ МО: 30. У конкретних варіантах реалізації поліпептид містить або складається в основному з: ЗЕО ІЮ
МО: 81, 5ЕО ІО МО: 83, 5ЕО ІО МО: 87, 5ЕО ІЮ МО: 88, 5ЕО ІЮО МО: 89, 5ЕО ІЮ МО: 92, 5ЕО І
МО: 93, 5ЕО ІЮ МО: 96, 5ЕО ІЮ МО: 97 або 5ЕО ІЮО МО: 100. У певних варіантах реалізації поліпептид може містити безперервну амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 95 ідентичну амінокислотній послідовності ЗЕО ІО МО: 1, причому зазначена безперервна амінокислотна послідовність містить щонайменше одну з наступних пар замін у порівнянні з відповідними амінокислотами у послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1: її О57Т і К21М; ї) 564М і НбЄТ; ії) К91М і 0937; їм) 093М і 5957; і м) 597М і 0997; де заміна створює один або більше консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання, що містить послідовність МХ5/ї, де М являє собою Ап; Х - будь-яка амінокислота, крім проліну, після якої перебуває 5ег (5) або ТНг (Т), і, крім того, один або більше з консенсусних сайтів М-зв'язаного глікозилювання зв'язані з М-гліканом; крім того, поліпептид утворює димер; і, крім того, поліпептид має розчинність щонайменше 1 мг/мл у буферному розчині.
У додаткових варіантах реалізації поліпептид має розчинність щонайменше 5 мг/мл у буферному розчині. Буфер може являти собою фосфатний буфер, трис-буфер, НЕРЕЗ-буфер,
МОРБ-буфер, РІРЕ5-буфер і тому подібне або їх комбінацію. У деяких випадках буфер може містити фізіологічний розчин з фосфатним буфером. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію та хлорид натрію. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію, хлорид натрію та мурашину кислоту. Наприклад, буфер може містити 10-100 мМ трис (рн 7), 1-50 мМ фосфату калію, 100-200 мМ хлориду натрію та 10-30 мСм/см мурашиної кислоти. У додаткових варіантах реалізації поліпептид знижує рівень глюкози в крові, масу тіла та/або споживання їжі щонайменше на 10 95, 20 95, 30 У, 50 90, 60 9, 70 9о, 80 95 або 90 95 у порівнянні зі станом до введення поліпептиду. У додатковому варіанті реалізації поліпептид укорочений за 60 М-кінцем і/або С-кінцем у порівнянні з БЕО ІО МО: 1. Поліпептид може бути вкорочений на 1, 2,
3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше амінокислот у порівнянні з еталонним поліпептидом, наприклад, 5ЕО 10 МО: 1. У конкретному варіанті реалізації поліпептид укорочений на перші три М-кінцевих залишки СОЕ15 (ДАКМ або АМ3). У конкретних варіантах реалізації поліпептид містить або складається в основному з: ЗЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮ МО: 10,
ЗЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 14, 5БЕО ІО МО: 17 або 5ЕО ІЮ МО: 30. У конкретних варіантах реалізації поліпептид містить або складається в основному з: ЗЕО ІЮ МО: 81, 5ЕО ІЮО МО: 89,
ЗЕО ІЮ МО: 92, ЗЕО ІЮ МО: 93, 5ЕО ІЮО МО: 96 або 5ЕО ІЮ МО: 100.
У деяких варіантах реалізації поліпептид може містити 112-амінокислотну безперервну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичність амінокислотної послідовності зЕО ІЮ МО: 1, де 112 суміжних амінокислот містять одну, дві, три, чотири або більше з пар замін, представлених вище.
На фігурі 1 зображені амінокислотні послідовності типових поліпептидів (з номерами від 1 до 17), розглянуті у даному винаході, вирівняні з амінокислотною послідовністю зрілого СОЕ15 дикого типу людини (дт ПООЕ15; ЗЕО ІЮ МО: 1). На фігурі 1 зображені поліпептиди, що містять два консенсусних сайти М-зв'язаного глікозилювання (мутант номер 1; 5ЕО ІЮ МО: 2), а також поліпептиди, що містять один консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання (мутанти номер 2- 17; 5ЕО І МО: 3-18, відповідно).
У деяких варіантах реалізації даного винаходу розглядається модифікований /М- глікозильований димер СОЕ15, причому зазначений димер містить два поліпептиди, описаних у даному документі, ковалентно приєднані один до одного. У конкретних варіантах реалізації зазначені два поліпептиди містять амінокислотну послідовність, вибрану з: БЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО
ІО МО: 4, БЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮ
МО: 17, 5ЕО ІЮО МО: 18 або 5ЕО ІЮО МО: 30 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 5 амінокислот; причому зазначені поліпептиди містять щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М-глікозильованим. У конкретних варіантах реалізації зазначені два поліпептиди містять амінокислотну послідовність, вибрану з: БЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО
ІО МО: 4, БЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІО МО: 14, 5ЕО І
МО: 17, 5ЕО ІЮО МО: 18 або 5ЕО ІЮО МО: 30 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 2 амінокислот; причому зазначені поліпептиди містять щонайменше
Зо один сайт М-глікозилювання, що є М-глікозильованим. У конкретних варіантах реалізації кожний із зазначених двох поліпептидів складається з амінокислотної послідовності, вибраної з: БЕО ІЮ
МО: 81, 5ЕО ІО МО: 83, 5ЕО ІО МО: 87, 5ЕО І МО: 88, 5ЕО ІО МО: 89, 5ЕО ІО МО: 92, 5ЕО 10
МО: 93, 5ЕО ІЮ МО: 96, 5ЕО ІЮО МО: 97 або 5ЕО ІО МО: 100 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 5 амінокислот; причому зазначені поліпептиди містять щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М-глікозильованим. У конкретних варіантах реалізації кожний із зазначених двох поліпептидів складається з амінокислотної послідовності, вибраної з: БЕО ІЮ МО: 81, ЗЕО ІЮ МО: 83, ЗЕО ІЮ МО: 87, 5ЕО ІЮ МО: 88, 5ЕО ІЮ МО: 89, ЗЕО
І МО: 92, 5ЕО ІО МО: 93, 5БО ІО МО: 96, 5БО І МО: 97 або 5БО ІЮО МО: 100 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 2 амінокислот; причому зазначені поліпептиди містять щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М- глікозильованим. У додаткових варіантах реалізації модифікований М-глікозильований димер
СОБ15 є гомодимером, з'єднаним міжланцюговим дисульфідним зв'язком. У додаткових варіантах реалізації модифікований М-глікозильований димер ЗОБЕ15 є гомодимером, що містить два поліпептиди, описані у даному документі, кожний з яких містить однакову амінокислотну послідовність, причому зазначені поліпептиди містять щонайменше один сайт М- глікозилювання, що є М-глікозильованим.
У даному винаході також розглядаються поліпептиди, що являють собою активні фрагменти (наприклад, підпослідовності) поліпептидів, описаних вище. Довжина активних фрагментів або підпослідовностей може становити від 40 до 111 амінокислот, наприклад, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 106, 109 або до 111 амінокислот.
Поліпептиди мають задану ідентичність послідовності у порівнянні з еталонною послідовністю протягом безперервної послідовності амінокислот заданої довжини (наприклад, "вікна порівняння"). Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній області техніки. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології Сміта-Ватермана (5тіїй 5
Умаїегтап), Адм. Аррі. Май. 2:482 (1981), за допомогою алгоритму вирівнювання гомології
Нідлмана-Вунша (Меедіетап 54 УМУип5сп), у. Мої. Віої. 48:443 (1970), за допомогою методу пошуку подібності Пірсона-Ліпмана (Реагзоп 4 Гіртап), Ргос. Магі. Асад. 5сі. ОБА 85:2444 (1988), шляхом комп'ютеризованої реалізації цих алгоритмів (САР, ВЕЗТРЇІТ, ЕРАЗТА і ТЕА5ЗТА у 60 Муівсопвіп Сзепейс5 Боймаге РасКаде, Медісон, штат Вісконсин, США), або ручного вирівнювання та візуального огляду (див., наприклад, Сигтепі Ргоїосоі5 іп Моїесшіаг Віоіоду (А!цзибеї еї аї., еа5. 1995 додаток)).
Наприклад, підходящий поліпептид може містити амінокислотну послідовність, щонайменше на приблизно 7595, щонайменше на приблизно 8095, щонайменше на приблизно 85 965, щонайменше на приблизно 90 95, щонайменше на приблизно 95 95, щонайменше на приблизно 98 95, або щонайменше на приблизно 99 95 ідентичну безперервному ланцюгу з 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 або до 112 амінокислот з ЗЕО ІО МО: 1.
Типові фрагменти поліпептидів, описаних у даному документі, включають поліпептиди, що містять амінокислотні делеції у порівнянні з «ЕО ІЮ МО: 1. Наприклад, поліпептиди можуть бути вкорочені за М-кінцем і/або за С-кінцем у порівнянні з 5ЕО ІЮ МО: 1. Поліпептид може бути вкорочений на 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше амінокислот у порівнянні з еталонним поліпептидом, наприклад, ЗЕБО ІО МО: 1. У деяких варіантах реалізації досліджуваний поліпептид може містити одну або більше замін, що дозволяють впровадити консенсусну послідовність М-зв'язаного глікозилювання, наприклад, описану в даному документі, і вкорочений за М-кінцем і/або С-кінцем у порівнянні з ХЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах реалізації довжина поліпептиду може становити щонайменше 98 амінокислот, а його амінокислотна послідовність може бути щонайменше на 90 95 ідентична відповідного 98-амінокислотного ланцюга ЗЕО ІЮ МО: 1. Поліпептид може не містити перших трьох-чотирнадцяти амінокислот (наприклад, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 14 амінокислот), присутніх на М-кінці ХЕО ІО МО: 1, але зберігати амінокислоти, що є присутніми на
С-кінці ЗЕО ІЮ МО:1. Інакше кажучи, вилучена(ї) амінокислота(и) відповідають М-кінцевим амінокислотам 5ЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах реалізації довжина мутеїну СООЕ15 може становити щонайменше 106 амінокислот, а його амінокислотна послідовність може бути щонайменше на 90 95 ідентична відповідного 10б-амінокислотного ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 1. Мутеїн СОЕ15 може не містити перші шість амінокислот, що є присутніми на М-кінці ЗЕО ІЮ МО: 1.
У деяких варіантах реалізації довжина поліпептиду може становити щонайменше 109 амінокислот, а його амінокислотна послідовність може бути щонайменше на 90 95 ідентична відповідного 109-амінокислотного ланцюга 5ЕО ІЮ МО: 1. Мутеїн СОЕ15 може не містити перші три амінокислоти, що є присутніми на М-кінці ЗЕО ІЮ МО: 1.
Типові поліпептиди відповідно до даного винаходу зображені на фігурі 2. Типові поліпептиди (номери 1-17), показані на малюнку 1, мають таку саму довжину, як і дт ЛНЗОЕ15. Довжина типових поліпептидів (номера 18-34; 5ЕО ІЮО МО: 19-35), зображених на фігурі 2, становить 109 амінокислот, і вони містять делецію трьох М-кінцевих амінокислот (АМ3) у порівнянні з дт
ПООЕ15. Однак при згадуванні положення амінокислотних замін зазначений номер залишку являє собою залишок, що відповідає положенню в зрілому ПНСОРЕ15 дт (дт; хЕО ІЮО МО: 1). Таким чином, амінокислота С на М-кінці поліпептидів відноситься до залишку 4, хоча вона являє собою першу амінокислоту в амінокислотній послідовності поліпептиду.
Як відзначалося вище, фрагменти поліпептидів можуть містити одну або більше з амінокислотних замін, що впроваджують консенсусну послідовність М-глікозилювання у порівнянні з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1, наприклад, одну, дві або більше амінокислотні заміни, описаних у даному документі.
Як зазначено вище та докладно описано нижче, поліпептиди відповідно до даного винаходу можна модифікувати шляхом, наприклад, ПЕГілювання (ковалентного приєднання однієї або більше молекул поліетиленгліколю (ПЕГ) або їх похідних); глікозилювання (наприклад, М- глікозилювання), полісіалування; утворення гібридних молекул з альбуміном, що містять сироватковий альбумін (наприклад, людський сироватковий альбумін (ЛСА), сироватковий альбумін яванської макаки або бичачий сироватковий альбумін (БСА)); зв'язування з альбуміном через, наприклад, кон'югований ланцюг жирної кислоти (ацилування); об'єднання з
Ес; і об'єднання з імітатором ПЕГ. У деяких варіантах реалізації модифікації вводять сайт- специфічним чином. В інших варіантах реалізації модифікація включає лінкер. Лінкер може кон'югувати модифікуючу групу з поліпептидом.
У конкретних варіантах реалізації даного винаходу розглядається модифікація зрілого
СОНЕ15 людини і мутеїнів СОЕ15 (наприклад, поліпептидів, описаних вище) шляхом кон'югації з альбуміном. В інших варіантах реалізації даного винаходу розглядається модифікація поліпептидів за допомогою М-глікозилювання або О-глікозилювання. Характеристики кон'югатів альбумінів і поліпептиду (наприклад, гібридних білків) і глікозильованих поліпептидів описані далі.
Конкретні модифікації з метою зміни й/або імітації функції ЗОБ15
Поліпептид може включати одну або більше з модифікацій, що поліпшують бажані властивості білка в складі для терапії (наприклад, період напівжиття в сироватці), що дозволяють викликати утворення антитіл для використання в аналізах, які виявляють (наприклад, маркери епітопів), що забезпечують простоту очищення білка і так далі. Такі модифікації включають ПЕГілювання (ковалентне приєднання однієї або більше молекул поліетиленгліколю (ПЕГ) або їх похідних); глікозилювання (М - і О-зв'язане); полісіалування; об'єднання з альбуміном; зв'язування з альбуміном через кон'югований ланцюг жирної кислоти (ацилювання); Ес-гібридні білки; і об'єднання з імітатором ПЕГ, але не обмежуються ними.
Як викладено у даному документі, у даному винаході розглядаються гібридні молекули, що містять зрілий поліпептид СОЕ15 (наприклад, зрілий СОЕ15 людини) або мутеїновий поліпептид
СОГ15 (наприклад, мутеїн зрілого ОЗОР15 людини), де зрілий поліпептид СООЕ15 або мутеїновий поліпептид (ОЕ15 містить щонайменше одну модифікацію, що не впливає на його амінокислотну послідовність, яка модифікація поліпшує хоча б одну фізичну властивість поліпептиду або мутеїнового поліпептиду. В одному варіанті реалізації модифікація поліпептиду
СОЕ15 або мутеїнового поліпептиду ООЕ15 включає кон'югування з сироватковим альбуміном (наприклад, людським сироватковим альбуміном (ЛСА), сироватковим альбуміном яванської макаки або бичачий сироватковий альбумін (БСА)). У деяких варіантах реалізації фізична властивість являє собою розчинність.
У варіантах реалізації, де гібридна молекула містить модифікований поліпептид СОЕ15 або мутеїн СОЕ15 (наприклад, поліпептиди, описані вище), кожний 3 яких кон'югований з альбуміном, загальна розчинність гібридної молекули поліпшується у порівнянні з некон'югованим рекомбінантним СОЕ15 людини. У деяких варіантах реалізації гібридна молекула має розчинність, що становить щонайменше 1 мг/мл у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (РВ5) при рН 7,0. В інших варіантах реалізації гібридна молекула має розчинність, що становить щонайменше 2 мг/мл, щонайменше З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл або щонайменше 5 мг/мл. В інших варіантах реалізації гібридна молекула має розчинність, що становить щонайменше 6 мг/мл у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (РВ5) при рн 7,0, щонайменше 7 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 9 мг/мл або щонайменше 10 мг/мл. У конкретних варіантах реалізації гібридна молекула має розчинність більше 10 мг/мл.
Зо ПЕГілювання: Клінічна ефективність білкових терапевтичних засобів часто обмежена коротким часом напівжиття у плазмі та схильністю до розкладання за рахунок протеаз.
Дослідження різних терапевтичних білків (наприклад, філграстиму) показали, що такі складності можна перебороти за рахунок різних модифікацій, включаючи кон'югування або зв'язування послідовності о поліпептиду з кожним із різних небілкових полімерів, наприклад, поліетиленгліколем (ПЕГ), поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами (див., наприклад, зазвичай за рахунок сполучної групи, ковалентно зв'язаної з білком і небілковим полімером, наприклад, ПЕГ). Показано, що такі ПЕГ-кон'юговані біомолекули мають клінічно корисні властивості, включаючи поліпшену фізичну та термічну стабільність, захист від ферментативного розкладання, підвищену розчинність, більш тривалий час напівжиття в кровотоці іп мімо та знижений кліренс, знижену імуногенність й антигенність, і знижену токсичність.
Молекули ПЕГ, що підходять для кон'югування з послідовністю поліпептиду, зазвичай розчинні у воді при кімнатній температурі та мають загальну формулу К(О-СНо-СНг)пО-Е, де В - атом водню або захисна група, наприклад, алкільна або алканольна група, і де п -- ціле число від 1 до 1000. Якщо К являє собою захисну групу, вона зазвичай містить від 1 до 8 атомів вуглецю. ПЕГ, кон'югованний з послідовністю поліпептиду, може бути лінійним або розгалуженим. Розгалужені похідні ПЕГ, "зірчасті ПЕГ" ії багатопроменеві ПЕГ розглядаються у даному винаході. Молекулярна маса ПЕГ, використовуваного у даному винаході, не обмежується яким-небудь певним діапазоном, однак у деяких варіантах реалізації молекулярна маса становить від 500 до 20000, а в інших варіантах реалізації - від 4000 до 10000.
У даному винаході також розглядаються композиції кон'югатів, де ПЕГ характеризується різними значеннями п і, таким чином, присутні різні ПЕГ у певних співвідношеннях. Наприклад, деякі композиції містять суміш кон'югатів, де п-1, 2, З і 4. У деяких композиціях частка кон'югатів, де п-1, становить 18-25 96, частка кон'югатів, де п-2, становить 50-66 95, частка кон'югатів, де п-З3, становить 12-16 905 і частка кон'югатів, де п-4, становить до 5 905. Такі композиції можна одержати з використанням умов реакції та способів очищення, відомих в даній області техніки. Наприклад, катіонообмінну хроматографію можна використовувати для поділу кон'югатів, а потім визначити фракцію, що містить кон'югат з, наприклад, бажаною кількістю приєднаних молекул ПЕГ, очистити від немодифікованих білкових послідовностей і від бо кон'югатів з іншою кількістю приєднаних молекул ПЕГ.
ПЕГ можна приєднати до поліпептиду відповідно до даного винаходу за рахунок кінцевої реакційноздатної групи. Кінцева реакційноздатна група може опосередковувати зв'язок між вільною аміно- або карбоксильною групою однієї або більше з поліпептидних послідовностей і поліетиленгліколем. Кінцеву реакційноздатну групу можна приєднати до поліетиленгліколевого спейсеру дискретної довжини. Ці ПЕГ-спейсери збільшують розчинність реагенту і кон'югату, мінімізують токсичні й імунологічні ефекти у порівнянні зі спейсерами, що не містять ПЕГ, і дозволяють одержати декілька варіантів конкретних дистанцій перехресного зшивання між ПЕГ і поліпептидом. Типові ПЕГ-спейсери з реакційноздатними групами містять реакційноздатні стосовно аміногруп пегільовані перехресні лінкери (наприклад, біс(сукцинімід)пента(етиленгліколь) (ВБ(ПЕГ)»5)); реакційноздатні стосовно сульфгідрильних груп пегільовані перехресні лінкери (1,11-біс-малеімідтриетиленгліколь (ВМ(ПЕГ)»з)); біфункціональні пегільовані перехресні лінкери (складний ефір МН5З-ПЕГп-малеїімідсукцинімідил-(|М- малеїмідпропіонамід|-етиленгліколю) (ЗМ(ПЕГ)п); п-2-24). ПЕГ-спейсер можна зв'язати з вільною аміногрупою. ПЕГ-спейсери включають М-гідроксисукцинілімідполіетиленгліколь, які можна одержати шляхом активації складного ефіру бурштинової кислоти та поліетиленгліколю
М-гідроксисукцинілімідом. Ще один активований поліетиленгліколь, який можна зв'язати з вільною аміногрупою, являє собою 2,4-біс-(О-метоксиполіетиленгліколь)-б-хлор-5-триазин, який можна одержати шляхом взаємодії монометилового ефіру поліетиленгліколю з ціанурхлоридом.
Активований поліетиленгліколь, зв'язаний 3 вільною карбоксильною групою, включає поліоксіетилендіамін.
Кон'югування однієї або більше з поліпептидних послідовностей відповідно до даного винаходу з ПЕГ, що містить спейсер, можна здійснити різними відомими способами. Наприклад, реакцію кон'югування можна здійснити в розчині при рН від 5 до 10, при температурі від 4 "С до кімнатної температури, протягом часу від 30 хвилин до 20 годин, використовуючи молярне відношення реагенту до білка від 4:11 до 30:11. Можна вибрати умови реакції, що направляють реакцію вбік переважного одержання бажаного ступеня заміщення. У цілому, низька температура, низький рН (наприклад, рН - 5) і короткий час реакції, як правило, знижують кількість приєднаних молекул ПЕГ, у той час як висока температура, нейтральний або високий рН (наприклад, рн 2 7), а також більш тривалий час реакції, як правило, збільшують кількість
Зо приєднаних молекул ПЕГ. Для зупинки реакції можна використовувати різні засоби, відомі в даній області техніки. У деяких варіантах реалізації реакцію зупиняють шляхом підкислення реакційної суміші та заморожування, наприклад, при -20 "С.
У даному винаході також розглядається застосування імітаторів ПЕГ. Розроблені рекомбінантні імітатори ПЕГ, що зберігають властивості ПЕГ (наприклад, підвищений час напівжиття в сироватці) і при цьому надають кон'югату деякі додаткові вигідні властивості.
Наприклад, прості поліпептидні ланцюги (які містять, наприклад, Аа, Сім, Су, Рго, зег і ТНг), здатні утворювати розгорнуту конформацію, аналогічну ПЕГ, можна одержати рекомбінантними способами у вже об'єднаному вигляді з досліджуваним пептидним або білковим лікарським засобом (наприклад, за допомогою технології Атипіх ХТЕМ, Маунтін-Вью, штат Каліфорнія,
США). Це усуває необхідність у додатковому етапі кон'югування у процесі виробництва. Крім того, встановлені молекулярно-біологічні методики дозволяють контролювати склад бічного ланцюга поліпептидних ланцюгів, що дозволяє оптимізувати імуногенність та виробничі властивості.
Глікозилювання: Для цілей даного винаходу мається на увазі, що "глікозилювання" у широкому змісті відноситься до ферментативного процесу приєднання гліканів з білками, ліпідами або іншими органічними молекулами. Використання терміна "глікозилювання" у сполученні з даним винаходом, як правило, означає додавання або видалення однієї або більше з вуглеводних груп (шляхом видалення основного сайту глікозилювання або шляхом усунення глікозилювання хімічними та/(або ферментативними засобами), і/або додавання одного або більше сайтів глікозилювання, які можуть або не можуть бути присутніми у нативній послідовності. Крім того, ця фраза включає якісні зміни глікозилювання нативних білків, пов'язані зі зміною природи та пропорції різних присутніх вуглеводних залишків.
Глікозилювання може істотно впливати на фізичні властивості білків і може мати важливе значення для стабільності, секреції та субклітинної локалізації білка. Фактично, глікозилювання мутеїнових поліпептидів (ЇОЕ15, описаних у даному документі, вигідно поліпшує їхні фізичні властивості. Як необмежуючий приклад, розчинність мутеїнів ЗОЕ15 можна поліпшити шляхом глікозилювання, і таке поліпшення може бути значним (див. розділ "Приклади"). Глікозильовані мутеїнові поліпептиди СОРЕ15, описані у даному документі, мають більш високу розчинність у порівнянні з неглікозильованим СОРЕ15 дикого типу. У деяких варіантах реалізації глікозильовані 60 мутеїни СЗОЕ15, описані у даному документі, мають розчинність щонайменше 0,5 мг/мл,
наприклад, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 15 мг/мл, щонайменше 20 мг/мл або щонайменше 25 мг/мл, наприклад, розчинністю в діапазоні від 0,5 мг/мл до 25 мг/мл, від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл, від 1 мг/мл до 25 мг/мл, від 1 мг/мл до 20 мг/мл, від З мг/мл до 25 мг/мл, від З мг/мл до 20 мг/мл, від 5 мг/мл до 25 мг/мл, від 5 мг/мл до 20 мг/мл або від 5 мг/мл до 18 мг/мл у буферному розчині. У деяких випадках глікозильовані мутеїни СОЕ15, описані у даному документі, можуть мати розчинність щонайменше 0,5 мг/мл, наприклад, щонайменше 1 мг/мл, щонайменше 2 мг/мл, щонайменше З мг/мл, щонайменше 4 мг/мл, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 8 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше мг/мл, щонайменше 20 мг/мл або щонайменше 25 мг/мл, наприклад, розчинністю в діапазоні від 0,5 мг/мл до 25 мг/мл, від 0,5 мг/мл до 20 мг/мл, від 1 мг/мл до 25 мг/мл, від 1 мг/мл до мг/мл, від З мг/мл до 25 мг/мл, від З мг/мл до 20 мг/мл, від 5 мг/мл до 25 мг/мл, від 5 мг/мл до 20 мг/мл або від 5 мг/мл до 18 мг/мл у буферному розчині. Буфер може являти собою фосфатний буфер, трис-буфер, НЕРЕ5-буфер, МОРБЗ-буфер, РІРЕЗ-буфер і тому подібне або 15 їх комбінацію. У деяких випадках буфер може містити фізіологічний розчин з фосфатним буфером. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію та хлорид натрію. У деяких випадках буфер може містити трис, фосфат калію, хлорид натрію та мурашину кислоту.
Наприклад, буфер може містити 10-100 мМ трис (рН 7), 1-50 мМ фосфату калію, 100-200 мМ хлориду натрію та 10-30 мСм/см мурашиної кислоти. 20 Глікозильовані мутеїнові поліпептиди СОРЕ15, описані у даному документі, перевершують зрілий поліпептид ЗОЕ15 дикого типу. Ці глікозильовані мутеїнові поліпептиди ЗОЕ15 мають поліпшені характеристики у порівнянні зі зрілим поліпептидом СОРЕ15 дикого типу, включаючи одне або більше з: підвищений вихід у культурі клітин, поліпшене утворення димерів, підвищену розчинність, а також знижену імуногенність, але не обмежуючись ними. Поліпшення розчинності, демонстровані такими модифікованими мутеїнами СЗОРЕ15, може, наприклад, включати одержання складів, які більше підходять для фармацевтичного введення, ніж неглікозильований СОЕ15/мутеїни СОЕ15. Глікозильований СОЕ15/мутеїнові поліпептиди
СОГ15 також можуть демонструвати підвищену стабільність. Крім того, можна поліпшити одну або декілька з фармакокінетичних властивостей поліпептидів, наприклад, період напівжиття.
Додавання сайтів глікозилювання можна здійснити шляхом зміни амінокислотної послідовності, як описано вище. Зміну поліпептиду можна здійснити, наприклад, шляхом додавання або заміни одного або більше із залишків серину або треоніну (для сайтів О- зв'язаного глікозилювання) або аспарагіну (для сайтів М-зв'язаного глікозилювання). Структури
М-зв'язаних і О-зв'язаних олігосахаридів і залишків вуглеводів, що знаходять при кожному типі, можуть розрізнятися. Один із вуглеводів, зазвичай присутній при обох варіантах, являє собою
М-ацетилнейрамінову кислоту (далі називається сіаловою кислотою). Сіалова кислота зазвичай є кінцевим залишком як М-зв'язаних, так і О-зв'язаних олігосахаридів і, за рахунок свого негативного заряду, може надавати глікопротеїну кислі властивості. Конкретний варіант реалізації даного винаходу включає одержання та застосування варіантів М-глікозилювання, описаних вище.
Ще одним способом збільшення кількості вуглеводних залишків у складі поліпептиду є хімічне або ферментативне приєднання глікозидів до поліпептиду.
Клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), дефіцитні за дигідрофолатредуктазою (ОНЕК), являють собою клітини-хазяїни, які зазвичай використовують для одержання рекомбінантних глікопротеїнів. Ці клітини не експресують фермент бета-галактозид-альфа-2,6- сіалілтрансферазу і тому не приєднують сіалову кислоту за допомогою альфа-2,6 зв'язку до М- зв'язаних олігосахаридів глікопротеїнів, продукованих у цих клітинах.
Полісіалування: У даному винаході також розглядається застосування полісіалування, кон'югування пептидів і білків із природною біорозкладаною альфа-(2--8) -зв'язаною полісіаловою кислотою ("РБА") з метою поліпшення їх стабільності та фармакокінетики іп мімо.
РБА є біорозкладаним, нетоксичним природним полімером, що має високу гідрофільність, яка надає йому значну гадану молекулярну масу в крові та підвищує його період напівжиття в сироватці. Крім того, полісіалування ряду пептидних і білюових терапевтичних засобів призвело до помітно зниженого протеолізу, збереження активності іп мімо та зниження імуногенності й антигенних властивостей (див., наприклад, с. Осгедогіадів еї аї., Іл. У. Рпагтасецііс5 300(1- 2)125-30). Як й у випадку з модифікаціями за рахунок інших кон'югатів (наприклад, ПЕГ), доступні різні методики сайт-специфічного полісіалування (див, наприклад, Т. І іпапоцї еї аї.,
РМАБ 108(18)7397-7402 (2011)).
Гібридні білки. У даному винаході розглядаються гібридні білки на основі зрілого СООЕ15 60 дикого типу (наприклад, ЗОЕ15 людини), а також гібридні білки на основі поліпептидів відповідно до даного винаходу (наприклад, модифіковані молекули СОЕ15 людини, мутетни
СОГ15 людини, модифіковані мутеїни ЗОРЕ15 і тому подібне). Такі гібридні білки, як правило, містять поліпептид, що не є СОЕ15 (наприклад, альбумін (наприклад, ЛСА) або його фрагмент: альбумін-сполучний домен (АВ); Рс-полипептид; мальтоз-сполучний домен (МВО), які можуть називатися у даному документі "партнером за об'єднанням", кон'юговані з поліпептидом СОЕ15 дикого типу або поліпептидом відповідно до даного винаходу за його М-кінцем або С-кінцем.
Партнер за об'єднанням необов'язково можна кон'югувати з (СОЕ15 дикого типу або поліпептидом за допомогою поліпептидного лінкеру. Лінкерний поліпептид необов'язково може являти собою розщеплюваний лінкер, наприклад, ферментативно розщеплюваний лінкер.
Приклади партнерів за об'єднанням описані нижче.
Гібриди з альбуміном: Підходящі для кон'югування партнери за об'єднанням включають альбуміни, наприклад, людський сироватковий альбумін (ЛСА), сироватковий альбумін яванської макаки та бичачий сироватковий альбумін (БСА).
Зрілий ЛСА, поліпептид довжиною 585 амінокислот (- 67 кДа), що має період півжиття в сироватці -- 20 днів, у першу чергу відповідає за підтримку колоїдного осмотичного тиску крові, рН крові, а також транспортування та розподіл численних ендогенних й екзогенних лігандів.
Білок містить три структурно гомологічних домени (домени І, ЇЇ ії І), що майже повністю перебувають в альфа-спіральній конформації та жорстко стабілізовані 17 дисульфідними містками. Три основні області в складі альбуміну, що зв'язують лікарські речовини, перебувають у кожному з трьох доменів у межах піддоменів ІВ, ПА ї ША.
Синтез альбуміну відбувається у печінці, що продукує короткоживучий первинний продукт препроальбумін. Таким чином, повнорозмірний ЛСА містить сигнальний пептид довжиною 18 амінокислот з наступним продоменом довжиною б амінокислот; цей пептид довжиною 24 амінокислотних залишки можна називати препродоменом. ЛСА можна експресувати та секретувати, використовуючи його ендогенний сигнальний пептид в якості препродомена. Як альтернатива, ЛСА можна експресувати та секретувати, використовуючи сигнальний пептид
ІМК, об'єднаний зі зрілим ЛСА. Препроальбумін швидко розщеплюється одночасно з трансляцією у просвіті ендоплазматичного ретикулума за М-кінцем з утворенням стабільного поліпептиду-(попередника довжиною 609 амінокислот, проальбуміну. Потім проальбумін
Зо транспортується в апарат Гольджи, де він перетвориться в зрілий альбумін довжиною 585 амінокислот шляхом фуринзалежного М-кінцевого розщеплення. Якщо не зазначено інше, "альбумін" або "зрілий альбумін" відноситься до ЛСА.
Первинна амінокислотна послідовність, структура та функції альбумінів є висококонсервативними серед різних видів, як і процеси синтезу та секреції альбуміну.
Сироваткові альбумінові білки, порівнянні з ЛСА, виявлені, наприклад, в яванських макаків, корів, собак, кроликів і пацюків. Серед видів тварин, що не є людиною, бичачий сироватковий альбумін (БСА) найбільше структурно подібний з ЛСА. |Див., наприклад, Коза еї аї., У Рпапт збі. 96(11):3117-24 (Мом 2007)). У даному винаході розглядається застосування альбуміну видів тварин, що не є людиною, включаючи альбумін вищевикладених тварин, наприклад, у гібридах з поліпептидом СОЕ15, але не обмежуючись ними. У деяких варіантах реалізації вид тварини, що не є людиною, є коровою. У деяких варіантах реалізації вид тварини, що не є людиною, є яванським макаком.
Відповідно до даного винаходу, альбумін можна кон'югувати з молекулою лікарської речовини (наприклад, поліпептидом, описаним у даному документі) за С-кінцем, М-кінцем, як С-, так і М-кінцем, або внутрішньої частини (див., наприклад, ЮШЗР 5876969 і ОБР 7056701). Крім того, у даному винаході розглядаються гібридні білки на основі альбуміну, що містять більше однієї гомологічної (наприклад, декілька молекул мутеїну СОЕ15) або гетерологічної (наприклад, молекулу мутеїну СОРЕ15 й окремий антидіабетичний агент) молекули лікарської речовини.
У кон'югатах ЛСА-поліпептид, розглянутих у даному винаході, можна застосовувати різні форми альбуміну, наприклад, варіанти, наприклад, фрагменти ЛСА. Такі форми, як правило, мають одну або більше з бажаних активностей альбуміну. У додаткових варіантах реалізації даний винахід включає гібридні білки, що містять молекулу поліпептидного лікарського засобу, прямо або побічно об'єднану з альбуміном, фрагмент альбуміну та варіант альбуміну і так далі, причому гібридний білок має більш високу стабільність у плазмі, ніж негібридна молекула лікарської речовини, і/або гібридний білок зберігає терапевтичну активність негібридної молекули лікарської речовини. У деяких варіантах реалізації непряме об'єднання здійснюють за допомогою лінкера, наприклад, пептидного лінкера або його модифікованого варіанта.
ЛСА можна кон'югувати за допомогою лінкера з поліпептидом, описаним у даному бо документі, з утворенням гібридного білка. Приклади підходящих лінкерів описані нижче. У деяких варіантах реалізації розглядається пептидний лінкер, наприклад, довжиною від чотирьох до тридцяти амінокислот.
У варіантах реалізації, де гібридний білок містить лінкер, зазначений лінкер може бути нерозщеплюваним лінкером. Наприклад, в одному варіанті реалізації даного винаходу описана гіоридна молекула, в якій амінокислотну послідовність попередника ЛСА або зрілого ЛСА поєднують з М-кінцем амінокислотної послідовності зрілого СОР15 людини або мутеїну СООЕ15 за допомогою нерозщеплюваного (45)з лінкера.
В інших варіантах реалізації, де гібридний білок містить лінкер, зазначений лінкер може бути розщеплюваним лінкером. Наприклад, у даному винаході розглядається гібридна молекула, в якій амінокислотну послідовність попередника ЛСА або амінокислотну послідовність зрілого
ЛСА поєднують з М-кінцем амінокислотної послідовності зрілого ЗОР15 людини або мутеїну
СОЕ15, представлені у даному документі, за допомогою протеаза-чуттєвого (б45)2 лінкера, розщеплюваного фактором Ха.
Молекули конструктів ЛСоА-розщеплюваний лінкер-зрілий рекомбінантний. СОЕ15/мутеїн
СОЕ15, а також гібридні молекули конструктів зрілий рекомбінантний СОЕ15/мутеїн СОБЕ15- розщеплюваний лінкер-ЛСА можна використовувати для полегшення оцінки, наприклад, розчинності та визначення ефективності ЗОЕ15/мутеїну ЗОБЕ15 іп мімо. У таких варіантах реалізації (ЗОБЕ15/мутеїн ЗОЕ15 можна вирізати з шаперону ЛСА за допомогою внутрішньоклітинного розщеплення або за допомогою ферментативного розщеплення іп міїго. У деяких варіантах реалізації вирізання здійснюють шляхом протеолітичного гідролізу розщеплюваного лінкера з використанням будь-якої життєздатної протеази. В інших варіантах реалізації мутевїни ЗОЕ15 також можна одержати у вигляді гібридів, що не містять ЛСА, за допомогою конструкта на основі сигнального пептиду, об'єднаного з поліпептидами, які представлені у даному документі.
Внутрішньоклітинне розщеплення можна здійснювати ферментативним шляхом, наприклад, з використанням фурину або каспази. Клітина-хазяїн, експресуюча гібридний білок, може на низькому рівні експресувати ці ендогенні ферменти, здатні розщеплювати фрагмент гібридних молекул всередині клітини; так, деякі з цих поліпептидів секретуються клітиною в некон'югованому з ЛСА вигляді, у той час як деякі з поліпептидів секретуються у вигляді
Зо гібридних молекул, що містять ЛСА. У варіантах реалізації даного винаходу розглядається застосування різних гібридних конструктів фурину. Наприклад, можна розробити конструкти, що містять послідовність ЕОР (5ЕО ІЮ МО: 36), ЕККККЕ (5ЕО ІЮ МО: 37), ЕЄККК (ЗЕО ІО МО: 38) або ЕККККЕ (5ЕО ІЮ МО: 39). Такі конструкти можуть містити наступну загальну структуру: Ідк-
ЛСА-(С45)2-послідовність фурину-пООЕ15.
У даному винаході також розглядається позаклітинне розщеплення (наприклад, розщеплення ех мімо), при якому гібридні молекули виділяють з клітини, піддають очищенню, потім розщеплюють (наприклад, використовуючи, наприклад, лінкер, чутливий до протеази фактора Ха або ентерокінази). Варто розуміти, що зазначене вирізання може призвести до відщеплення від поліпептиду (наприклад, зрілого СООЕ15 або мутеїну ООЕ15) всього комплексу
ЛСА-лінкер, або фрагмента меншого розміру, ніж весь комплекс ЛСА-лінкер.
Як описано вище, об'єднання альбуміну з одним або більше поліпептидами відповідно до даного винаходу можна, наприклад, здійснити за рахунок генетичної маніпуляції, так, що ДНК, яка кодує ЛСА або його фрагмент, приєднують до ДНК, яка кодує одну або більше з поліпептидних послідовностей. Після цього можна трансформувати або трансфікувати підходящого хазяїна гібридними нуклеотидними послідовностями у вигляді, наприклад підходящі плазміди, з метою експресії гібридного поліпептиду. Експресію можна здійснювати іп міго, наприклад, у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах, або іп мімо, наприклад, в трансгенному організмі. У деяких варіантах реалізації даного винаходу експресію гібридних білків здійснюють у лініях клітин ссавців, наприклад, лініях клітин СНО. Термін "трансформація" широко використовують у даному документі для позначення генетичної модифікації клітини, виникаючої внаслідок безпосереднього поглинання, включення й експресії екзогенного генетичного матеріалу (екзогенної ДНК) з оточення клітини та через клітинну мембрану(и).
Трансформація відбувається у природних умовах у деяких видів бактерій, однак її також можна здійснити штучним шляхом в інших клітинах.
Крім того, сам альбумін можна модифікувати для збільшення періоду його напівжиття в кровотоці. Об'єднання модифікованого альбуміну з одним або більше поліпептидами відповідно до даного винаходу можна здійснити шляхом генетичної маніпуляції/рекомбінантних методик, описаних вище, або хімічного кон'югування; отримана гібридна молекула має період напівжиття, що перевищує період напівжиття гібридів із немодифікованим альбуміном. (див., наприклад, (510) МО2011/051489).
Існують налагоджені технологічні платформи для генетичного синтезу та хімічного кон'югування поліпептидів (наприклад, поліпептидів, описаних у даному документі) і рекомбінантного альбуміну. Наприклад, гнучку платформу АСВОРОБЕФ (Момогутез Віорпагта
А/5; Данія) можна застосовувати для генетичного об'єднання однієї або більше з рекомбінантних молекул альбуміну з одним або більше з поліпептидів, що призводить до одержання безперервної кКДНК, яка кодує поліпептид(и) й альбумін(и), для одержання єдиного гомогенного білка. Цю платформу можна використовувати, наприклад, з системами експресії на основі хазяїнів-дріжджів і ссавців. Як додатковий приклад, гнучку платформу КЕСОМВОМІМО (Момогуте5 Віорпагпта А/5; Данія) можна застосовувати для хімічного кон'югування поліпептидів відповідно до даного винаходу з рекомбінантним альбуміном без подальшої модифікації альбуміну. Хоча кон'югування можна виконувати за декількома амінокислотними залишками (наприклад, лізину і тирозину), вільна тіолова група при Суб5х34 являє собою розповсюджену стратегію через сайт-специфічність, що дозволяє одержати більш однорідний кінцевий продукт.
Альтернативні стратегії зв'язування альбуміну: Як альтернатива прямому об'єднанню розроблено декілька стратегій зв'язування альбуміну, у тому числі зв'язування альбуміну за допомогою кон'югованого ланцюга жирної кислоти (ацилювання). Оскільки сироватковий альбумін є транспортним білком для жирних кислот, ці природні ліганди з альбумін-сполучною активністю застосовують для збільшення періоду напівжиття невеликих терапевтичних білків.
Наприклад, інсулін детермір (ЕМЕМІК), схвалений продукт для лікування діабету, містить ланцюг міристилової кислоти, кон'юговану з генетично модифікованим інсуліном, що призводить до одержання аналога інсуліну тривалої дії.
У даному винаході також розглядаються гібридні білки, що містять поліпептидну послідовність альбумін-сполучного домена (АВО) та послідовність одного або більше з поліпептидів, описаних у даному документі. Будь-яка послідовність АВО-поліпептиду, описана у даному документі або в літературі, може бути одним із компонентів гібридних білків.
Компоненти гібридних білків можна при необхідності ковалентно зв'язати за допомогою лінкера, наприклад, лінкерів, описаних у даному документі. У деяких варіантах реалізації даного винаходу гібридні білки містять послідовність АВО-поліпептиду у вигляді М-кінцевої групи та
Зо поліпептиди, описані у даному документі, у вигляді С-кінцевої групи.
У даному винаході також розглядаються гібридні білки, що містять фрагмент альбумін- сполучного поліпептиду, причому зазначений фрагмент у значній мірі зберігає здатність до зв'язування альбуміну; або мультимер альбумін-сполучних поліпептидів або їх фрагментів, що містить щонайменше два альбумін-сполучні поліпептиди або їх фрагмент в якості мономерних одиниць.
Безвідносно до якої-небудь конкретної теорії, вважається, що поліпептиди, описані у даному документі, зв'язуються з послідовністю АВО-поліпептиду, тим самим секвестуючи поліпептиди в організмі суб'єкта, що призводить до збільшення тривалості дії в організмі суб'єкта.
Загальне обговорення АВО і пов'язаних з ними технологій див. у МО 2012/050923, МО 2012/050930, УМО 2012/004384 і УМО 2009/016043.
Гібридні білки, що містять мальтоза-сполучні білки або їх фрагменти: У даному винаході також розглядаються гібридні білки, що містять мальтоза-сполучний білок (МВР) або його фрагмент й амінокислотну послідовність одного або більше з поліпептидів, описаних у даному документі. У деяких варіантах реалізації фрагмент МВР містить мальтоза-сполучний домен (МВО). Будь-яка послідовність МВР або його фрагмента або МВО-поліпептиду, описана у даному документі або в літературі, може бути одним із компонентів гібридних білків відповідно до даного винаходу. Компоненти гібридних білків можна при необхідності ковалентно зв'язати за допомогою лінкера, наприклад, лінкерів, описаних у даному документі. У деяких варіантах реалізації даного винаходу гібридні білки містять послідовність МВР або його фрагмент або послідовність МВО-поліпептиду у вигляді М-кінцевої групи та поліпептиди, описані у даному документі, у вигляді С-кінцевої групи.
У даному винаході також розглядаються гібридні білки, що містять фрагмент МВР або МВО- поліпептиду, причому зазначений фрагмент у значній мірі зберігає мальтоза-сполучну активність; або мультимер мальтоза-сполучних поліпептидів або їх фрагментів (наприклад, мультимер МВО), що містить щонайменше два мальтоза-сполучні поліпептиди або їх фрагмент в якості мономерних одиниць (наприклад, два або більше МВО-поліпептиди).
Загальне обговорення МВР і МВО, і пов'язаних з ними технологій див., наприклад, у роботі
Каризві єї а). (1999) Ргоївіп 5сі 8(8):1668-74.
Ес-гібридні білки. У даному винаході також розглядаються гібридні білки, що містять Ес- 60 поліпептид або його фрагмент й амінокислотну послідовність одного або більше з поліпептидів,
описаних у даному документі (наприклад, молекули СОЕ15 людини, модифіковані молекули
СОЕ15 людини, мутеїни ЗОЕ15 і модифіковані мутеїни ЗОРЕ15). Будь-яка послідовність Ес- поліпептиду, описана у даному документі або в літературі, може бути одним із компонентів гібридних білків відповідно до даного винаходу. Компоненти гібридних білків можна при необхідності ковалентно зв'язати за допомогою лінкера, наприклад, лінкерів, описаних у даному документі. У деяких варіантах реалізації даного винаходу гібридні білки містять послідовність
Ес-поліпептиду у вигляді М-кінцевої групи та поліпептиди, описані у даному документі, у вигляді
С-кінцевої групи.
У даному винаході також розглядаються партнери з об'єднання Ес-поліпептиду та гібридні білки, що містять такі молекули, де партнер з об'єднання Ес-поліпептиду модифікований і є одним із партнерів зарядженої пари Ес. "Партнер зарядженої пари Ес" відноситься до (Її) "негативно зарядженої" Ес-послідовності (з необов'язково відсутньою шарнірною областю), що містить мутацію зарядової пари або (і) "позитивно зарядженої" ГРос-послідовності (з необов'язково відсутньою шарнірною областю), що містить мутацію зарядової пари. Терміни "позитивно заряджений" і "негативно заряджений" використовуються у даному документі для зручності опису природи мутації зарядової пари у послідовностях Ес, а не для вказівки, що послідовність або конструкт у цілому обов'язково має позитивний або негативний заряд.
Амінокислотні послідовності зарядженого Ес, придатні для використання в конструктах поліпептиду (наприклад, мутеїну СОЕ15, модифікованих мутеїнів ЗОЕ15) відповідно до даного винаходу описані у, наприклад, МО 2013/113008.
Приклади позитивно зарядженого Ес ("Ес(ї)") включають Ес, що містить мутацію заміни аспарагінової кислоти на лізин (ЕЗ5бК) і мутацію заміни глутамінової кислоти на лізин (0399К)
Ес-послідовності з відсутньою шарнірною областю. Приклади негативно зарядженого Ес ("Ее(-)") включають Ес, що містить дві мутації заміни лізину на аспартат (К3920, К4090) у Бо- послідовності з відсутньою шарнірною областю. С-кінцевий лізин (К477) також можна необов'язково видалити. При спільному інкубуванні гібридного білка на основі Ес(ж)-поліпептиду (наприклад, гібридного білка Ес(ж)-мутеїн СОР15) і гібридного білка на основі Ес(-)-поліпептиду (наприклад, гібридного білка Ес(-)-мутеїн СОЕ15) залишки аспартату асоціюють із залишками лізину за допомогою електростатичних сил, що полегшує утворення Ес-гетеродимерів між Ес(к) і Ес(-)-послідовностями гібридних білків на основі поліпептиду СОРЕ15.
У даному винаході також розглядаються конструкти, які називаються конструктами "гемі" або "гемі-Ес", що містять дві Есо-послідовності, з'єднані тандемом за допомогою лінкера, що з'єднує М-кінець першої Ес-послідовності з С-кінцем другої Ес-послідовності. У деяких варіантах реалізації мономер містить послідовність поліпептиду (наприклад, зрілого модифікованого
СОЕ15 або мутеїну СОЕ15), пов'язану з першою послідовністю Ес за допомогою першого лінкера, що з'єднує М-кінець послідовності ЗОЕ15 з С-кінцем першої Ес-послідовності, причому перша Ес-послідовність з'єднана з другою послідовністю Ес за допомогою другого лінкера, що з'єднує М-кінець першої Ес-послідовності з С-кінцем другої Ес-послідовності. Перша та друга Ес- послідовності також зв'язані за допомогою шарнірних областей Ес. Два таких мономери асоціюють, утворюючи димер, у якому мономери зв'язані за допомогою міжланцюгового дисульфідного зв'язку між двома послідовностями поліпептиду. Приклади гемі-Рс-поліпептидів, придатні для використання з мутетїнами СЗОРЕ15 відповідно до даного винаходу, див. у УМО 2013/113008.
У даному винаході також розглядаються гібридні білки, що містять мультимер Ес- поліпептидів або їх фрагментів, включаючи партнер зарядженої пари Ес (наприклад, мультимер
Ес).
Кон'югування з іншими молекулами: Додаткові підходящі для кон'югації компоненти та молекули включають, наприклад, тиреоглобулін; анатоксин правця; дифтерійний анатоксин; поліамінокислоти, такі як полі (О-лізин: О-глутамінова кислота); поліпептиди МРб ротавірусів; гемаглютинін вірусу грипу, нуклеопротеїд вірусу грипу; Гемоціанін Лімфи Равлика (ГЛР); і білок ядра вірусу гепатиту В і поверхневий антиген; або будь-яку комбінацію перераховану вище.
Таким чином, у даному винаході розглядається кон'югування одного або більше з додаткових компонентів або молекул за М- і/або С-кінцем поліпептидної послідовності, наприклад, ще одного білка (наприклад, білка, що містить амінокислотну послідовність, гетерологічну стосовно білка суб'єкта) або молекули-носія. Таким чином, зразкова поліпептидна послідовність може бути представлена у вигляді кон'югату з іншим компонентом або молекулою.
Кон'югатна модифікація може призвести до одержання поліпептидної послідовності, що зберігає активність додаткової або комплементарної функції або активності другої молекули. 60 Наприклад, поліпептидну послідовність можна кон'югувати з молекулою, наприклад, для полегшення розчинності, зберігання, періоду напівжиття або стабільності іп мімо або при зберіганні, зниженні імуногенності, уповільненого або контрольованого вивільнення іп мімо і так далі. Інші функції або активності включають кон'югат із зниженою токсичністю у порівнянні з некон'югованою поліпептидною послідовністю, кон'югат, який адресно впливає на клітини певного типу або орган, з більшою ефективністю, ніж некон'югована поліпептидна послідовність, або лікарська речовина для наступної протидії причинам або ефектам, асоційованим з розладом або захворюванням, викладеними у даному документі (наприклад, діабетом).
Поліпептид можна також кон'югувати з великими, повільно метаболізованими макромолекулами, наприклад, білками; полісахаридами, наприклад, сефарозою, агарозою, целюлозою, гранулами целюлози; полімерними амінокислотами, наприклад, поліглутаміновою кислотою, полілізином; співполімерами амінокислот; інактивованими вірусними частинками; інактивованими бактеріальними токсинами, наприклад, анатоксинами дифтерії, правця, холери, молекулами лейкотоксинів; інактивованими бактеріями; і дендритними клітинами. Такі кон'юговані форми при бажанні можна використовувати для одержання антитіл проти поліпептиду відповідно до даного винаходу.
Додаткові кандидати-компоненти та молекули для кон'югування включають молекули, які підходять для виділення або очищення. Конкретні необмежуючі приклади включають сполучні молекули, наприклад, біотин (специфічна сполучна пара біотин-авідин), антитіло, рецептор, ліганд, лектин або молекули, що містять твердий носій, у тому числі, наприклад, пластикові або полістиролові гранули, планшети або гранули, магнітні гранули, тест-смужки та мембрани.
Для поділу кон'югатів за різницею заряду можна використовувати такі способи очищення, як катіонообмінну хроматографію, що ефективно розділяє кон'югати різної молекулярної маси.
Наприклад, можна завантажити катіонообмінну колонку, промити її х 20 мМ ацетатом натрію, рН --4, а потім елюювати лінійним (0-0,5 М) градієнтом Масі, забуференого при рН від З до 5,5, наприклад, при рН -- 4,5. Вміст фракцій, отриманих при катіонообмінній хроматографії, можна ідентифікувати за молекулярною масою з використанням звичайних способів, наприклад, мас- спектроскопії, електрофорезу в ДСН-ПААГ або інших відомих способів поділу молекулярних структур за молекулярною масою.
Інші Модифікації У даному винаході розглядається застосування інших модифікацій
Зо поліпептидів, відомих у цей час або розроблювальних у майбутньому, з метою поліпшення однієї або більше властивостей. Одним із таких способів збільшення періоду напівжиття в кровотоці, підвищення стабільності, зниження кліренсу або зміни імуногенності або алергенності поліпептиду відповідно до даного винаходу включає модифікацію поліпептидних послідовностей за допомогою ГЕК, при якій використовують похідні гідроксіетилюрохмалю, пов'язані з іншими молекулами, для зміни характеристик молекули. Різні аспекти модифікації за допомогою ГЕК описані, наприклад, у патентних заявках США Мо 2007/0134197 і 2006/0258607.
У даному винаході також розглядаються гібридні молекули, що містять ЗОМО як маркер об'єднання (І їебепзоге, Іпс.; Малверн, штат Пенсильванія, США). Об'єднання поліпептиду, описаного у даному документі, 3 «ЮОМО може додати поліпептиду ряд вигідних властивостей, включаючи посилення експресії, поліпшення розчинності та/або сприяння при розробці способів очищення. ЗОМО-протеази розпізнають третинну структуру БЗОМО та розщеплюють гібридний білок за С-кінцем ЗОМО, тим самим вивільняючи поліпептид, описаний у даному документі, що містить бажану М-кінцеву амінокислоту.
Лінкери: Будь-який з вищевказаних компонентів і молекул, які використовують для зміни поліпептидних послідовностей відповідно до даного винаходу, при необхідності можна кон'югувати за допомогою лінкера. Підходящі лінкери включають "гнучкі лінкери", які, як правило, мають достатню довжину, що забезпечує деякий рух модифікованих поліпептидних послідовностей і зв'язаних компонентів і молекул. Довжина лінкерних молекул може становити приблизно 6-50 атомів. Лінкерні молекули можуть також являти собою, наприклад, арилацетилен, олігомери етиленгліколю, що містять 2-10 мономерних одиниць, діаміни, дикислоти, амінокислоти або їх комбінації. Підходящі лінкери легко вибрати; вони можуть мати будь-яку підходящу довжину, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 амінокислот.
Типові гнучкі лінкери включають полімери гліцину (С)п, полімери гліцину-аланіну, полімери аланіну-серину, полімери гліцину-серину (наприклад, (Сто), (С5СС5)й, (СтОоСт/и, (СтОЗоСітбосіт)п, (Б5(0СОт)п, (9015) п і (5005), та їх комбінації, де кожний з коефіцієнтів т, п і о незалежно вибрані з цілих чисел від 1 до 20, наприклад, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10,1,2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10) та інші гнучкі лінкери. Полімери гліцину та гліцин-серину є відносно неструктурованими, і, отже, можуть служити як нейтральний трос між компонентами. Типові гнучкі лінкери включають с5о505, (5050505, (505505, 5565050, 5550 і 55550, але не обмежуються ними.
Додаткові гнучкі лінкнери включають полімери гліцину (б)л0 або полімери гліцину-серину (наприклад, (55), (451(:1045) 0, (2005) п і (БО), де п - від 1 до 50, наприклад, 1,2, 3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50). Типові гнучкі лінкери включають 550 (ЗЕО ІЮ МО: 40), бОСО5 (ЗЕО І МО: 41), ССБО (5ЕО ІО МО: 42), СС0/ЇІБОСІ (ЗБОЮ МО: 43), 0БаБО (5ЕО ІО МО: 44), оБОоСсЄ (5БО ІЮО МО: 45), ссОо565 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 46) і 5555065 (ЗЕО ІЮ МО: 47). Мультимер (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 або 30-50) зазначених лінкерних послідовностей можна зв'язати один з одним, одержуючи гнучкі лінкери, які можна застосовувати для кон'югування гетерологічної амінокислотної послідовності з поліпептидами, описаними у даному документі. Як описано у даному документі, гетерологічна амінокислотна послідовність може являти собою сигнальну послідовність та/або партнер за об'єднанням, наприклад, альбумін, Ес-послідовність і тому подібне.
Приклади лінкерів включають, наприклад, (((03(35)4, де п -- ціле число від 1 до 10 (наприклад, п-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10); ОСО5ОСО5ІЄОК (ЗЕО ІО МО: 48); ССООО (ЗЕ
ІО МО: 49); ЄС (ЗЕО ІЮ МО: 50).
У деяких випадках лінкер може являти собою розщеплюваний лінкер, наприклад, ферментативно розщеплюваний лінкер. В інших випадках лінкер може являти собою не розщеплюваний лінкер, наприклад, лінкер, що не піддається ферментативному розщепленню при нормальних фізіологічних умовах іп мімо.
Наприклад, протеолітично розщеплюваний лінкер може включати сайт розщеплення металопротеїнази матриксу (ММР), наприклад, сайт розщеплення ММР, вибраної з колагенази- 1, -2 ї -3 (ММР-1, -8 і -13), желатинази А і В (ММР-2 і 9), стромелізину 1, 2 і З (ММР-3, -10 ї -11), матрилізину (ММР-7) і мембранних металопротеїназ (МТ1-ММР і МТ2-ММР). Послідовність розщеплення МІМР-9 являє собою Рго-Х-Х-Ну (де Х являє собою довільний залишок; Ну - гідрофобний залишок) (ЗЕО ІО МО: 51), наприклад, Рго-Х-Х-Ну-(Зе/Т) (ЗЕО ІЮО МО: 52), наприклад, Рго-Геш/(Іп-Стіу-Меї-Тп-Зег (ЗЕО ІЮ МО: 53) або Рго-І еш/сІп-Стіу-Меї-ТАг (ЗЕО ІО
МО: 54). Ще один приклад сайту розщеплення протеази являє собою сайт розщеплення активатора плазміногену, наприклад, активатора плазміногену урокіназного типу (иРА) або сайт
Зо розщеплення тканинного активатора плазміногену (РА). Конкретні приклади послідовностей розщеплення РА і ТРА включають послідовності, що містять МаІ-Сіу-Агд. Ще одним прикладом є сайт розщеплення тромбіну, наприклад, СОЇ МРАОЗОР (5ЕО ІЮ МО: 55). Додаткові підходящі лінкери, що містять сайти розщеплення протеаз, включають лінкери, що містять одну або більше з наступних амінокислотних послідовностей: 1) БІГ К5еЕММРМЕМ (5ЕО ІЮ МО: 56) або
ЗІ ПАКЕМРМЕМ (ЗЕО ІЮО МО: 57), розщеплювані катепсином В; ЗКІ МОАБЗАБОММ (5ЕО ІЮ МО: 58) або 55! КАБОАРОМ (ЗЕО ІЮ МО: 59), розщеплювані протеазою вірусу Епштейна-Барр;
ЕРКРООРЕСІЇ ММ (ЗЕО ІЮ МО: 60), розщеплювані ММР-3 (стромелізином); ЗІ КЕРІ АЇ М/КЗЕМ (ЗЕО ІЮ МО: 61), розщеплювані ММР-7 (матрилізином); БРОСІАСОКМЕМ (5ЕБО ІЮО МО: 62), розщеплювані ММР-9; ОМОЕКОМКОБАБЕРІ (5БО 10 МО: 63), розщеплювані термолізин- подібною ММР; ЗІ РІ СІ М/АРМЕМ (ЗЕО ІЮО МО: 64), розщеплювані металопротеїназою матриксу 2 (ММР-2); Б ШЕКЗУМАМЕМ (ЗЕО ІО МО: 65), розщеплювані катепсином І; ЗСУМАТМІМІТ (ЗЕО
ІО МО: 66), розщеплювані катепсином 0; 5 ОРОСІМИСОРМ (ЗЕБО ІЮ МО: 67), розщеплювані металопротеїназою матриксу 1 (ММР-1); КК5ЕЄРОКУМОС5М (ЗЕБО ІЮО МО: 68), розщеплювані активатором плазміногену урокіназного типу; РОС І ЗАРОСІЇ о (5ЕО ІЮО МО: 69), розщеплювані металопротеїназою матриксу 1 мембранного типу (МТ-ММР);
НаРЕСІАМаєМЕВОУМаванНАВІМУНМЕЕРНТ (5ЕО ІО МО: 70), розщеплювані стромелізином З (або ММР-11), термолізином, колагеназою фібробластів і стромелізином-1; СРОСІ АСОВИЇМ (ЗБЕО 10 МО: 71), розщеплювані металопротеїназою матриксу 13 (колагеназою-3);
СОБСОКОККАЇ Е (5ЕО ІЮ МО: 72), розщеплювані активатором плазміногену тканинного типу (РА); 5І ЗАГ І ЗБОЇЕМ (5ЕО І МО: 73), розщеплювані простатоспецифічним антигеном людини;
ЗІ РЕРКИОСЕМ (ЗЕО ІЮ МО: 74), розщеплювані калікреїном (КЗ); ЗІ І СІАМРОМЕМ (5ЕО ІО МО: 15), розщеплювані еластазою нейтрофілів; і РЕЕКМІМТРКТРР (ЗЕО І МО: 76), розщеплювані калпаїном (кальцій-активованою нейтральною протеазою).
На фігурі З зображена амінокислотна послідовність двох гібридних білків МІ (5ЕО ІЮО МО: 77) і М2 (ЗЕО І МО: 78), розглянутих у даному документі. Гібридний білок МІ містить від М- кінця до С-кінця: сигнальну послідовність ДК (нижній регістр), об'єднану з амінокислотною послідовністю ЛСА, об'єднану з лінкером (С1Іу-Сспіу-Ссту-сіу-5ег)з (підкреслений шрифт) на М-кінці зрілого ООЕ15 людини (напівжирний шрифт). Гібридний білок М2 містить від М-кінця до С-кінця: сигнальну послідовність ДК (нижній регістр), об'єднану з амінокислотною послідовністю ЛСА,
об'єднану з лінкером (сіу-Стіу-стіу-Сіу-5ег)з (підкреслений шрифт) на М-кінці зрілого СОЕ15 людини (напівжирний шрифт), що містить делецію З амінокислот (ДАКМ).
На фігурі 5 зображена амінокислотна послідовність двох гібридних білків МЗ3 (5ЕО ІЮ МО: 79) і М4 (ЗЕО І МО: 80), розглянутих у даному документі. Гібридний білок МЗ містить від М- кінця до С-кінця: сигнальну послідовність ДК (нижній регістр), об'єднану з амінокислотною послідовністю ЛСА, об'єднану з лінкером (С1Іу-Сспіу-Ссту-сіу-5ег)5 (підкреслений шрифт) на М-кінці амінокислотної послідовності зрілого ЗОЕ15 людини (напівжирний шрифт), що містить делецію
З амінокислот (позначені як А АЕМ або А М3). Гібридний білок МА містить від М-кінця до С-кінця: сигнальну послідовність ДК (нижній регістр), об'єднану з амінокислотною послідовністю ЛСА, об'єднану з лінкером (С1Іу-Стіу-СсСіу-Сіу-Зег)» (підкреслений шрифт) на М-кінці амінокислотної послідовності зрілого ЗОЕ15 людини (напівжирний шрифт), вкорочену на б амінокислот
ААКМСОН) у порівнянні з М-кінцем зрілого ПНООЕ15.
У даному винаході також розглядаються рекомбінантні нуклеотидні послідовності, кодуючі послідовності, поліпептиди та димери, описані у даному документі. У деяких варіантах реалізації рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, що містить безперервну амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 9о, 85 95, 90 95, 95 95, 96 9Уо, 97 90, 98 95, 99 90 або 10095 ідентичну амінокислотній послідовності 5ЕО ІО МО: 1, причому зазначена безперервна амінокислотна послідовність містить щонайменше одну з наступних пар замін у порівнянні з відповідними амінокислотами у послідовності 5Е0 ІЮ МО: 1: ї) О57Т ї Е21М або 055 і К21М; ї) Е16М і НІ8Т або КІ16М і НІ185; її) З2З3М і Е25Т або 523М і Е255; їм) 55ОМ і Е52Т; 550М і Е525; Е52М і АБАТ; або Е52М і А545; мі) 951М і К53Т; О51М і К535; К5ЗМ і А55Т; або Е5ЗМ і А555; мі) З64М і НбЄТ; або 564М і Нбб5; мії) КОУТМ і 093Т; КІМ і 09355 093М і 595Т; або Б9ЗМ і 5955; мії) Т94М і МУ6Т; Т94М і М965; М9БбМ і 1 987; або У9БбМ і І 985; їх) 597М і 0997; або 597М і 0995; і х) АТО6М і 0108 або АТО6М і 01085; де заміна створює один або більше консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання, що містить послідовність МХ5/Ї, де М являє собою Авп; Х - будь-яка амінокислота, крім проліну, після якої перебуває Зег (5) або Тпг (Т), і, крім того, один або більше з консенсусних сайтів М- зв'язаного глікозилювання при експресії зв'язані з М-гліканом. У додатковому варіанті реалізації рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, що при експресії утворює димер. У додатковому варіанті реалізації рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, вкорочений за М-кінцем і/або С-кінцем у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО: 1. Поліпептид може бути вкорочений на 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше амінокислот у порівнянні з еталонним поліпептидом, наприклад, 5ЕО ІО МО: 1. У конкретному варіанті реалізації рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, вкорочений на перші три М-кінцевих залишки СОБЕ15 (ДАКМ або АМ3) У конкретних варіантах реалізації даного винаходу розглядаються рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з: БЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, ЗЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 13, ЗЕО ІЮ МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 17, ЗЕО ІЮ МО: 18 або ЗЕО ІЮ МО: 30 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 5 амінокислот; причому зазначений поліпептид при експресії містить щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М-глікозильованим. У конкретних варіантах реалізації даного винаходу розглядаються рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, які кодують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з: БЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕО ІО МО: 18 або 5ЕО ІО МО: 30 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 5 амінокислот; причому зазначений поліпептид при експресії містить щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М- глікозильованим. У конкретних варіантах реалізації рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з: БЕО ІЮ МО: 81, 5ЕО ІЮ МО: 83,
ЗЕО І МО: 87, 5ЕО ІЮО МО: 88, 5ЕО ІО МО: 89, 5ЕО ІЮ МО: 92, 5ЕО ІЮО МО: 93, 5ЕО ІО МО: 96,
ЗЕО ІЮ МО: 97 або 5ЕО ІЮ МО: 100 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 5 амінокислот; причому зазначений поліпептид при експресії містить щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М-глікозильованим. У конкретних варіантах реалізації рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з: БЕО ІЮ МО: 81, 5ЕО ІЮ МО: 83, 5ЕО ІЮ МО: 87, 5ЕО 10 МО: 88, 5ЕО 10 (510) МО: 89, БЕО ІЮ МО: 92, ЗЕО ІЮ МО: 93, ЗЕО ІЮО МО: 96, 5ЕО ІЮ МО: 97 або ЗЕО ІО МО: 100 або амінокислотної послідовності, яка відрізняється від них не більше ніж на 5 амінокислот; причому зазначений поліпептид при експресії містить щонайменше один сайт М-глікозилювання, що є М- глікозильованим. У даному винаході також розглядається спосіб одержання модифікованого М- глікозильованого гомодимера СОРЕ15, що включає етап експресії вищеописаної рекомбінантної нуклеїнової кислоти в клітині ссавця, наприклад, клітині СНО. Даний винахід також включає модифікований М-глікозильований гомодимер СОЕ15, отриманий вищеописаним способом.
На доповнення до специфічних амінокислотних і нуклеотидних послідовностей, запропонованих у даному документі, у винаході також розглядаються поліпептиди та нуклеїнові кислоти, що містять послідовності, щонайменше на 80 9565, щонайменше на 85 95, щонайменше на 9095 або щонайменше на 9595 ідентичні зазначеним амінокислотним і нуклеотидним послідовностям. Терміни "ідентичний" або відсоток "ідентичності" у контексті двох або більше полінуклеотидних послідовностей або двох або більше амінокислотних послідовностей відносяться до двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які є однаковими або містять певний відсоток амінокислотних залишків або нуклеотидів, що є однаковими (наприклад, щонайменше на 8095, щонайменше на 8595, щонайменше на 9095 або щонайменше на 95 95 ідентичні в межах заданої області) при порівнянні та вирівнюванні з урахуванням максимальної відповідності в заданій області У даному винаході особливо розглядаються поліпептиди, що містять амінокислотні послідовності, щонайменше на 80 95, щонайменше на 85 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 965, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентичні амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО. 2-35 або 77-97.
Способи одержання поліпептидів
Поліпептид відповідно до даного винаходу можна одержати будь-яким підходящим способом, у тому числі з використанням рекомбінантних і нерекомбінантних способів (наприклад, хімічного синтезу).
А. Хімічний синтез
Якщо поліпептид є хімічно синтезованим, синтез може йти в рідкій або твердій фазі.
Твердофазний синтез пептидів (ЗРР5) дозволяє включати неприродні амінокислоти та/або модифікації каркаса пептиду/білка. Для синтезу поліпептидів відповідно до даного винаходу
Зо доступні різні форми 5РРБ, наприклад, Етос і Вос. Докладна інформація про хімічний синтез відома в даній області техніки (наприклад, Сапезап А. 2006 Міпі Кеу. Мей. Спет. 6:3-10; і
Сатагего ..А. єї а!., 2005 Ргоївіп Рері І ейї. 12:723-8).
Твердофазний синтез пептидів можна виконати, як описано нижче. Альфа-функціональні групи (Мо), а також реакційноздатні бічні ланцюги захищають кислотно-лабільними або основно- лабільними групами. Захисні групи стабільні в умовах для зв'язування амідних зв'язків, але можуть легко розщеплюватися, не впливаючи на утворений пептидний ланцюг. Підходящі захисні групи для а-аміногруп включають: трет-бутилоксикарбоніл (Вос), бензилоксикарбоніл (7), о-хлорбензилоксикарбоніл, біфенілізопропілоксикарбоніл, трет-амілоксикарбоніл (АМОС), а, а-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбоніл, о-нітросульфеніл, 2-ціан-трет-бутоксикарбоніл, 9-флуоренілметоксикарбоніл (Рітос), 1-(4,4-диметил-2,6-діоксоциклогекс-1-иліден)етил (Оає) і тому подібне, але не обмежуються ними.
Підходящі захисні групи для бічних ланцюгів включають: ацетил, аліл (АЇЇ), алілоксикарбоніл (АПос), бензил (В2І), бензилоксикарбоніл (7), трет-бутилоксикарбоніл (Вос), бензилоксиметил (Вот), о-бромбензилоксикарбоніл, трет-бутил (ІВи), трет-бутилдиметилсиліл, 2-хлорбензил, 2- хлорбензилоксикарбоніл (2-С12), 2,6-дихлорбензил, циклогексил, циклопентил, 1-(4,4-диметил- 2,6-діоксоциклогекс-1-иліден)етил (Оаеє), ізопропіл, 4-метокси-2,3-6-триметилбензилсульфоніл (М), 2,3,5,7,8-пентаметилхроман-б-сульфоніл (Рітс), піваліл, тетрагідропіран-2 -іл, тозил (То5), 2,4,6-триметоксибензил, триметилсиліл і тритил (ТІ), але не обмежуються ними.
При твердофазному синтезі С-кінцева амінокислота приєднана до підходящого матеріалу носія. Підходящими матеріалами носія є матеріали, інертні стосовно реагентів й умов реакцій ступеневої конденсації та розщеплення у процесі синтезу, і нерозчинні у використовуваному реакційному середовищі. Приклади доступних для придбання матеріалів носія включають співполімери стирол/дивінілбензолу, модифіковані реакційноздатними групами та/або поліетиленгліколем; хлорметиловані співполімери стиролу/дивінілбензолу; гідроксиметиловані або амінометиловані співполімери стиролу/дивінілбензолу і т.п. Можна використовувати полістирол (1 95)-дивінілбензол або Тепіасеї|Ф, модифіковані 4-бензилоксибензиловим спиртом (смола Ванга) або 2-хлортритилхлоридом, якщо необхідно одержати пептидну кислоту. У випадку пептидного аміду можна використовувати полістирол (1 95)-дивінілбензол або
Тепіасе, модифіковані 5-(4'-амінометил)-35'-диметоксифенокси) валеріановою кислотою бо (смола РАЇ) або р-(2,4-диметоксифеніламінометил)-феноксигрупою (амідна смола Рінка).
Зв'язок з полімерним носієм можна одержати за допомогою реакції С-кінцевої Етос- захищеної амінокислоти з матеріалом носія з додаванням активуючого реагенту в етанолі, ацетонітрилі, М, М-диметилформаміді (ДМФ), дихлорметані, тетрагідрофурані, /- М- метилпіролідоні або аналогічних розчинниках при кімнатній температурі або підвищених температурах (наприклад, між 40 і 60 "С) і при часі реакції, наприклад, від 2 до 72 годин.
Приєднання Ма-захищеної амінокислоти (наприклад, Етос-амінокислоти) до смоли РАЇ,
Ванка або Рінка можна, наприклад, здійснити з використанням приєднуючих реагентів, наприклад, М, М'-дициклогексилкарбодіїміду (0СС), М, М'-дізопропілкарбодіїміду (0ІС), або інших карбодіїмідівб, тетрафторборату 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (ТВТУ) або інших солей уронію, о-ацилсечовини, гексафторфосфату бензотриазол-1-іл-трис- піролідинфосфонію (РУВОР) або інших солей фосфонію, М-гідроксисукцинімідів, інших М- гідроксіїмідів або оксимів у присутності або за відсутності 1-гідроксибензотриазолу або 1- гідроксі-7-азабензотриазолу, наприклад, Кк! використанням твт Кк! додаванням гідроксибензотриазолу (НОВО, з додаванням або без додавання основи, наприклад, діізопропілетиламіну (ОІЕА), триетиламіну або М-метилморфоліну, наприклад, діізопропілетиламіну, з часом реакції від 2 до 72 годин (наприклад, З години при 1,5-3-кратному надлишку амінокислоти та приєднуючих реагентів, наприклад, при 2-кратному надлишку та при температурі між приблизно 10 і 50С, наприклад, 25"С у розчиннику, наприклад, диметилформаміді, М-метилпіролідоні або дихлорметані, наприклад, диметилформамі ді).
Замість приєднуючих реагентів також можна використовувати активні складні ефіри (наприклад, пентафторфеніловий, п-нітрофеніловий і тому подібні), симетричний ангідрид Ма-
Етос-амінокислоти, його кислий хлорид або кислий фторид при умовах, описаних вище.
Моа-захищені амінокислоти (наприклад, Етос-амінокислоти) можна приєднати до 2- хлортритильної смоли в дихлорметані з додаванням ОІЕА при часі реакції від 10 до 120 хв, наприклад, 20 хвилин, але не обмежуючись використанням цього розчинника та цієї основи.
Послідовне зв'язування захищених амінокислот може бути здійснене відповідно до стандартних методів синтезу пептидів, як правило, в автоматичному синтезаторі пептидів. Після відщеплення Ма-Етос-захисної групи приєднаної амінокислоти на твердій фазі шляхом обробки, наприклад, піперидином (10-50 95) у диметилформаміді протягом від 5 до 20 хвилин,
Зо наприклад, 2 х 2 хвилин з використанням 50 95 піперидину в ДМФ і 1 х 15 хв з використанням 2095 піперидину в ДМФ, наступну захищену амінокислоту при 3-10-кратному надлишку, наприклад, при 10-кратному надлишку, приєднують до попередньої амінокислоти в інертному неводному полярному розчиннику, наприклад, дихлорметані, ДМФ або їх суміші та при температурі між приблизно 10 і 50 "С, наприклад, при 25 "С. Раніше згадані реагенти для приєднання першої Ма-Ртос амінокислоти до смоли РАЇ, Ванга або Рінка, підходять для використання в якості приєднуючіх реагентів. Крім того, як альтернативу можна використовувати активні складні ефіри або хлориди, або фториди, або симетричні ангідриди захищеної амінокислоти.
В кінці твердофазного синтезу пептид відщеплюють від матеріалу носія, одночасно відщеплюючи захисні групи бічних ланцюгів. Відщеплення можна здійснювати з використанням трифтороцтової кислоти або іншого сильно кислого середовища з додаванням 5-20 об.95 акцепторів, наприклад, диметилсульфіду, етилметилсульфіду, тіоанізолу, тіокрезолу, м-крезолу, анізолу, етандитіолу, фенолу або води, наприклад, 15 об. 956 диметилсульфіду/ етандитіолу/м- крезолу (1:1:1), протягом від 0,5 до З годин, наприклад, 2 годин. Пептиди з повністю захищеними бічними ланцюгами одержують відщепленням 2-хлортритильної смоли крижаною оцтовою кислотою/ трифторетанолом/ дихлорметаном (2:2:6). Захищений пептид можна очистити хроматографією на силікагелі. Якщо пептид зв'язаний з твердою фазою за допомогою смоли Ванга й якщо потрібно одержати пептид із С-кінцевим алкіламідуванням, відщеплення можна здійснити шляхом амінолізу алкіламіном або фторалкіламіном. Аміноліз виконують при температурі від приблизно -10 "С до 50 "С (наприклад, приблизно 25 С), і при часі реакції між приблизно 12 і 24 годинами (наприклад, приблизно 18 годин). Крім того, пептид можна відщепити від носія шляхом переетерифікації, наприклад, з метанолом.
Одержуваний кислий розчин можна змішати з 3-20-кратною кількістю холодного ефіру або н- гексану, наприклад, 10-кратним надлишком діетилового ефіру для осадження пептиду і, отже, відділення акцепторів і відщеплених захисних груп, що залишалися в ефірі. Подальше очищення можна здійснити шляхом багаторазового повторного осадження пептиду з крижаної оцтової кислоти. Отриманий осад можна ресуспендувати у воді або трет-бутанолі або суміші цих двох розчинників, наприклад, 1:11 суміші трет-бутанол/вода, і піддавати сублімаційному сушінню.
Отриманий пептид можна очистити за допомогою різних хроматографічних методик, у тому числі іонообмінної хроматографії зі слабоосновною смолою у формі ацетату; гідрофобної адсорбційної хроматографії на немодифікованих співполімерах полістиролу/дивінілбензолу (наприклад, АтрБрегійе? ХА); адсорбційної хроматографії на силікагелі; іонообмінної хроматографії, наприклад, на карбоксиметилцелюлозі; розподільної хроматографії, наприклад, на Зерпадежб (0-25; протиточної розподільної хроматографії; або рідинної хроматографії високого тиску (РХВТ), наприклад, зворотньо-фазної ВЕРХ на октиловій або октадецилсилілкремнеземній (005) фазах.
В. Рекомбінантна продукція
При одержанні поліпептиду з використанням рекомбінантних методик поліпептид можна одержати у вигляді внутрішньоклітинного білка або секретованого білка з використанням будь- якого підходящого конструкта та будь-якої підходящої клітини-хазяїна, що може бути прокаріотичною або еукаріотичною клітиною, наприклад, бактеріальною (наприклад, Е.соїї) або дріжджовою клітиною-хазяїном, відповідно. Інші приклади еукаріотичних клітин, які можна використовувати як клітини-хазяїни, включають клітини комах, клітини ссавців і/або клітини рослин. При використанні клітин-хазяїнів ссавців вони можуть включати клітини людини (наприклад, клітини НегГа, 293, НО і дика); клітини миші (наприклад, МІНЗТЗ, І -клітини і клітини
С127); клітини приматів (наприклад, Со5 1, Со5 7 і СМІ) і клітини хом'яка (наприклад, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО)). У конкретних варіантах реалізації поліпептид продукують у клітинах СНО. В інших варіантах реалізації поліпептид продукують у клітинах дріжджів, і у конкретних варіантах реалізації за допомогою генної інженерії можна одержати клітини дріжджів, які продукують глікопротеїни з М-гліканами, аналогічними М-гліканам ссавців.
Різні системи хазяїн-вектор, придатні для експресії поліпептиду, можна використовувати згідно зі стандартними процедурами, відомими в даній області техніки. Див., наприклад, затьгоок еї аї., 1989 Сиггепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоїоду Соїа 5ргіпд Нагброг Ргез5, Мем/ МогК; і
А!йзиеї! єї а. 1995 Сигепі Ргоїосої5 іп МоІесшіаг Віоіоду, Ед5. УМіІеу апа 5оп5. Способи введення генетичного матеріалу в клітини-хазяїни містять в собі, наприклад, трансформацію, електропорацію, кон'югацію, методи з використанням фосфату кальцію та інші. Можна вибрати спосіб переносу, який забезпечує стабільну експресію введеної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, можна представити у вигляді наслідуваного епісомального елемента (наприклад, плазміди), або можна інтегрувати в геном.
Доступні для придбання різні вектори, що підходять для використання при продукції досліджуваного поліпептиду.
Вектори можуть забезпечити екстрахромосомну підтримку в клітині-хазяїні або інтеграцію в геном клітини-хазяїна. Експресуючий вектор містить регуляторні послідовності транскрипції та трансляції, і може забезпечити індуцибельну або конститутивну експресію, причому кодуюча область функціонально зв'язана з ними та перебуває під транскрипційним контролем області ініціації транскрипції, а також області термінації транскрипції та трансляції. У цілому, регуляторні послідовності транскрипції та трансляції можуть включати послідовності промоторів, сайти зв'язування рибосом, послідовності ініціації та припинення транскрипції, послідовності ініціації та припинення трансляції, і послідовності енхансерів або активаторів.
Промотори можуть бути конститутивними або індуцибельними, і можуть являти собою сильний конститутивний промотор (наприклад, 17).
Експресуючі конструкти зазвичай містять зручні сайти рестрикції, розташовані поблизу послідовності промотору з метою забезпечити інсерцію нуклеотидних послідовностей, що кодують досліджувані білки. Селективний маркер, який працює в експресуючій клітині-хазяїні, може бути присутнім з метою полегшення селекції клітин, що містять вектор. Крім того, експресуючий конструкт може містити додаткові елементи. Наприклад, експресуючий вектор може містити одну або дві системи реплікації, що дозволяє йому підтримуватися в організмах, наприклад, у клітинах ссавців або комах для експресії й у прокаріотичній клітині-хазяїні для клонування й ампліфікації. Крім того, експресуючий конструкт може містити селективний маркерний ген, що забезпечує селекцію трансформованих клітин-хазяїнів. Селективні гени добре відомі в даній області техніки та залежать від використовуваних клітин-хазяїнів.
Виділення й очищення білка можна виконати згідно зі способами, відомими в даній області техніки. Наприклад, білок можна виділити з лізату генетично модифікованих клітин, що здійснюють експресію білка конститутивно та/або при індукції, або із синтетичної реакційної суміші шляхом імуноафінного очищення, що зазвичай включає контакт зразка з антитілом проти білка, промивання для видалення неспецифічно зв'язаного матеріалу, і елюювання специфічно зв'язаного білка. Виділений білок можна додатково очистити за допомогою діалізу та інших 60 способів, які зазвичай використовують при способах очищення білка. В одному варіанті
Зо реалізації білок можна виділити з використанням способів металохелатної хроматографії. Білки можуть містити модифікації, що полегшують виділення.
Поліпептиди можна одержати практично у чистому вигляді або у виділеній формі (наприклад, що не містять інших поліпептидів). Поліпептиди можуть бути присутніми у композиції, збагаченій зазначеним поліпептидом стосовно інших компонентів, які можуть бути присутніми в ній (наприклад, іншим поліпептидам або іншим компонентам клітини-хазяїна).
Наприклад, очищений поліпептид можна одержати таким чином, що поліпептид присутній у композиції, що практично не містить інших експресованих білків, наприклад, менше 90 95, менше 60 95, менше 50 95, менше 40 95, менше 30 95, менше 20 95, менше 10 95, менше 5 95 або менше 1 95 композиції складається з інших експресованих білків.
Антитіла
У даному винаході запропоновані антитіла, у тому числі виділені антитіла, які специфічно зв'язуються з поліпептидом або гібридним білком відповідно до даного винаходу. Термін "антитіло" включає інтактні моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), утворені щонайменше з двох інтактних антитіл, і сполучні фрагменти антитіл, включаючи Раб і (аб), за умови, що вони специфічно зв'язуються з поліпептидом або гібридним білком відповідно до даного винаходу. Найпростіша структурна одиниця цілого антитіла містить тетрамер, і кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара містить один "легкий" (приблизно 25 кДа) й один "важкий" ланцюг (приблизно 50-70 кДа). М-кінцева область кожного ланцюга містить варіабельну область від близько 100 до 110 або більше амінокислот, головним чином відповідальну за розпізнавання антигена. Навпроти, С-кінцневий фрагмент кожного ланцюга визначає константну область, головним чином відповідальну за ефекторну функцію. Легкі ланцюги людини підрозділяються на каппа- і лямбда-, у той час як важкі ланцюги людини підрозділяються на гамма-, мю-, альфа-, дельта- або епсилон-, і визначають ізотип антитіла -
ІЗ9М, дО, до, ІДА й ІЗЕ, відповідно. Сполучні фрагменти одержують за допомогою методик рекомбінантних ДНК, або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Сполучні фрагменти включають ЕРар-, Барі, Е(ар)2-, Ем-фрагменти й одноланцюгові антитіла.
Зо На одному кінці кожного важкого ланцюга перебуває варіабельний домен (МН), а потім - ряд константних доменів. На одному кінці кожного легкого ланцюга перебуває варіабельний домен (МУ), а на іншому кінці - константний домен; константний домен легкого ланцюга вирівняний з першим константним доменом важкого ланцюга, а варіабельний домен легкого ланцюга вирівняний з варіабельним доменом важкого ланцюга. У межах легкого та важкого ланцюга варіабельні та константні області з'єднуються ")"-областю з приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг також містить "О"-область з приблизно 10 або більше амінокислот. Всі ланцюги антитіла мають аналогічну загальну структуру порівняно консервативних каркасних областей (ЕК), з'єднаних трьома гіперваріабельними областями, також називаними областями, що визначають комплементарність, або СОК. СОК з двох ланцюгів кожної пари вирівнюються за каркасними областями, забезпечуючи зв'язування із специфічним епітопом. Від М-кінця до С-кінця як важкі, так і легкі ланцюги містять домени ЕК,
СОМ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ і ЕКА4.
Інтактне антитіло містить два сайти зв'язування та, за винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, зазначені два сайти зв'язування є ідентичними. Біспецифічне або біфункціональне антитіло є штучним гібридним антитілом, що містить дві пари різних важких/легких ланцюгів і два різних сайти зв'язування. Біспецифічні антитіла можна одержати за допомогою різних способів, включаючи злиття гібридом або зв'язування Раб'-фрагментів.
Як зазначено вище, зв'язуючі фрагменти можна одержати шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Гідроліз антитіл ферментом папаїном призводить до одержання двох ідентичних антигенсполучних фрагментів, також відомих як "Бар"-фрагменти, і "Бс"-фрагменти, що не мають антигенсполучну активність. Гідроліз антитіл ферментом пепсином призводить до одержання Е(аб')»-фрагмента, в якому обидва плеча молекули антитіла залишаються зв'язаними та містять два антигенсполучних сайти. Е(аб)2-фрагмент має здатність перехресно зв'язувати антиген.
У даному документі термін "Рар" відноситься до фрагмента антитіла, що містить МН- ї МІ - області, а також константний домен легкого ланцюга та СНІ1-домен важкого ланцюга.
У даному документі термін "Бм" відноситься до мінімального фрагмента антитіла, що зберігає як антигенрозпізнавальний, так й антигенсполучний сайти. У дволанцюгових різновидах Ем ця область містить димер одного варіабельного домена важкого ланцюга й 60 одного варібельного домена легкого ланцюга, з'єднаних нековалентним зв'язком. В одноланцюгових різновидах Ем один варіабельний домен важкого ланцюга й один варіабельний домен легкого ланцюга можуть бути ковалентно зв'язані гнучким пептидним лінкером таким чином, що легкий і важкий ланцюги можуть утворювати "димерну" структуру, аналогічну структурі дволанцюгових різновидів Ем. Саме в цій конфігурації три СОК кожного варіабельного домена взаємодіють з утворенням антигенсполучного домена на поверхні димера МН-МЇ. Хоча шість СОК спільно надають антитілу антигенсполучну специфічність, навіть один варіабельний домен (або половина Ем, що містить тільки три СОК, специфічних стосовно антигена) має здатність розпізнавати та зв'язувати антиген.
У даному документі термін "гіперваріабельні області" або "СОК" відноситься до фрагмента імунологічних рецепторів, що контактує із специфічним лігандом і визначає його специфічність.
Термін "гіперваріабельна" область відноситься до амінокислотних залишків антитіла, відповідальних за зв'язування антигена. Гіперваріабельна область зазвичай містить амінокислотні залишки з СОК і/або залишки з "гіперваріабельної петлі".
У даному документі термін "епітоп" відноситься до антитіл-сполучних сайтів білкових антигенів. Епітопні детермінанти зазвичай містять хімічно активні поверхневі групи молекул, наприклад, амінокислоти або вуглеводні бічні ланцюги, а також мають специфічні тривимірні структурні та зарядові характеристики. Говорять, що антитіло зв'язується з антигеном, якщо константа дисоціації становить «1 мкМ, х 100 нМ або «х 10 нМ. Збільшена константа рівноваги ("Ко") означає меншу спорідненість між епітопом й антитілом, у той час як зменшена константа рівноваги означає більшу спорідненість між епітопом й антитілом. Антитіло з Ко "не більше" певного значення означає, що антитіло повинне зв'язуватись з епітопом із заданою Ко або більш сильне зв'язування. У той час як Ко описує характеристики зв'язування епітопа й антитіла, "специфічна активність" характеризує ефективність самого антитіла стосовно функції антитіла. Кореляція між константою рівноваги та специфічною активністю не є обов'язковою; так, наприклад, відносно низька Ко не обов'язково має на увазі високу специфічну активність.
Термін "селективно зв'язується" стосовно антитіла означає не те, що антитіло зв'язується тільки з однією речовиною, а те, що Ко антитіла стосовно першої речовини менше, ніж Ко антитіла стосовно другої речовини. Антитіло, що вийнятково зв'язується з епітопом, зв'язується тільки із зазначеним єдиним епітопом.
При введенні в організм людини антитіла, які містять варіабельні та/або константні області, характерні для гризунів (тобто миші або пацюки), іноді асоціюються з, наприклад, швидким виведенням з організму або формуванням імунної відповіді організму проти антитіла. Щоб уникнути використання антитіл, що походять від гризунів, можна одержати повністю людські антитіла шляхом введення функції людського антитіла в організм гризуна таким чином, щоб гризун продукував повністю людські антитіла. Якщо це спеціально не зазначено у даному документі, терміни антитіла "людини" та "повністю людські" антитіла можна використовувати як взаємозамінні. Термін "повністю людське" можна використовувати при розрізненні антитіл, що є лише частково людськими, від повністю людських антитіл. Досвідченому фахівцю відомо про різні способи одержання повністю людських антитіл.
Щоб не допустити можливої гуморальної відповіді організму людини на антитіла миші, можна використовувати химерні або іншим способом гуманізовані антитіла. Химерні антитіла містять константну область, характерну для людини, і варіабельну область, характерну для миші, і тому в деяких пацієнтів може спостерігатися гуморальна відповідь на химерні антитіла.
Таким чином, бажано одержати повністю людські антитіла проти мультимерних ферментів, щоб уникнути можливої гуморальної відповіді організму людини на антитіла миші або химерні антитіла.
Повністю людські моноклональні антитіла можна одержати, наприклад, шляхом утворення ліній гібридомних клітин за допомогою способів, відомих фахівцю в даній області техніки. Інші способи одержання включають використання послідовностей, які кодують специфічні антитіла для трансформації підходящої клітини-хазяїна ссавця, наприклад, клітини СНО. Трансформацію можна здійснити будь-яким відомим способом введення полінуклеотидів у клітину-хазяїна, у тому числі, наприклад, шляхом упакування полінуклеотиду у вірус (або у вірусний вектор) і трансдукції клітини-хазяїна вірусом (або вектором), або за допомогою процедур трансфекції, відомих в даній області техніки. Способи введення гетерологічних полінуклеотидів у клітини ссавців добре відомі в даній області техніки та включають декстран-опосередковану трансфекцію, преципітацію з фосфатом кальцію, полібрен-опосередковану трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, інкапсуляцію полінуклеотиду(ів) в ліпосоми та пряму мікроін'єкцію ДНК в ядра. Лінії клітин ссавців, доступні як хазяїни для експресії, добре відомі в даній області техніки та включають клітини СНО, клітини Неї а та клітини гепатоцелюлярної 60 карциноми людини, але не обмежуються ними.
Антитіла можна використовувати для виявлення поліпептиду відповідно до даного винаходу. Наприклад, антитіла можна використовувати як діагностичний засіб за допомогою виявлення рівня одного або більше з поліпептидів відповідно до даного винаходу в організмі суб'єкта, і порівняння виявленого рівня із стандартним контрольним рівнем або з вихідним рівнем в організмі суб'єкта, визначеним раніше (наприклад, до захворювання).
Ще один варіант реалізації даного винаходу припускає використання одного або більше доменних антитіл людини (дАт). дАт являють собою найменші функціональні сполучні одиниці людських антитіл (40) і мають вигідні характеристики стабільності та розчинності. Ця технологія має на увазі використання дАт, кон'югованих із ЛСА (з утворенням "АІриадАб"; див, наприклад, ЕР15179218, М/02005/118642 і УМО2006/051288) та досліджуваною молекулою (наприклад, поліпептидною послідовністю відповідно до даного винаходу). АІридАБб часто характеризуються меншим розміром і простіше продукуються в мікробних експресуючих системах, наприклад, бактеріях або дріжджах, ніж сучасні технології, використовувані для продовження часу напівжиття поліпептидів у сироватці. Оскільки період напівжиття ЛСА становить приблизно три тижні, отримані кон'юговані молекули збільшують період напівжиття досліджуваної молекули. Використання технології дАт також може підвищити ефективність досліджуваної молекули.
Терапевтичне та профілактичне застосування
У даному винаході запропоновані способи лікування або профілактики метаболічних й асоційованих з метаболізмом захворювань, наприклад, ожиріння та інших розладів, пов'язаних з масою тіла, гіперглікемії, гіперінсулінемії, порушення переносимості глюкози, а також розладів метаболізму глюкози, шляхом введення поліпептидів або їх композицій, описаних у даному документі. Такі способи також можуть впливати на один або більше симптомів, асоційованих із захворюванням, розладом або станом, наприклад, знижуючи вагу або частоту симптому. У конкретних варіантах реалізації даного винаходу запропоновані способи лікування розладу метаболізму глюкози або маси тіла шляхом введення поліпептидів, їх М-глікозильованих димерів або композицій. У конкретних варіантах реалізації даного винаходу запропоновані способи зниження споживання їжі або зменшення маси тіла шляхом введення поліпептидів, їх
М-глікозильованих димерів або композицій. У даному винаході також запропоноване застосування вищевказаних послідовностей, поліпептидів, їх М-глікозильваних димерів або композицій при виробництві лікарського засобу для лікування стану, вибраного з метаболічних й асоційованих з метаболізмом захворювань, наприклад, ожиріння та інших розладів маси тіла, гіперглікемії, гіперінсулінемії, порушення переносимості глюкози, а також розладів метаболізму глюкози. У даному винаході також запропоноване застосування вищевказаних послідовностей, поліпептидів, їх М-глікозильованих димерів або композицій при виробництві лікарського засобу для лікування розладу метаболізму глюкози або маси тіла. У даному винаході також запропоноване застосування вищевказаних послідовностей, поліпептидів, їх М-глікозильованих димерів або композицій при виробництві лікарського засобу для зниження споживання їжі або маси тіла.
Щоб визначити, чи може суб'єкт бути кандидатом для лікування або профілактики розладу маси тіла (наприклад, ожиріння) за допомогою способів, представлених у даному документі, варто виконати оцінку таких параметрів, як етіологія та ступінь стану суб'єкта (наприклад, наскільки надлишкова маса тіла суб'єкта у порівнянні із здоровим індивідом), але не обмежуючись ними. Наприклад, можна вважати, що дорослий суб'єкт із ІМТ між « 25 і 29,9 кг/м страждає надлишковою вагою (предожирінням), у той час як дорослий суб'єкт із ІМТ - 30 кг/м або вище страждає ожирінням. Як обговорювалося у даному документі, поліпептиди відповідно до даного винаходу можуть пригнічувати апетит, наприклад, знижувати апетит, призводячи до зниження маси тіла.
Щоб визначити, чи може суб'єкт бути кандидатом для лікування або профілактики гіперглікемії, гиперінсулінемії, порушення переносимості глюкози та/або розладів метаболізму глюкози за допомогою запропонованих у даному документі способів, можна використовувати різні діагностичні способи, відомі в даній області техніки. Такі способи включають способи, описані в інших розділах даного документа (наприклад, оцінку рівня глюкози у плазмі натще (ЕРС) та пероральний тест переносимості глюкози (017)).
Поліпептиди та гібридні білки, запропоновані у даному документі, при введенні суб'єкту для лікування або профілактики метаболічних й асоційованих з метаболізмом захворювань, наприклад, ожиріння та інших розладів, пов'язаних з масою тіла, гіперглікемії, гіперінсулінемії, порушення переносимості глюкози, розладів метаболізму глюкози можуть призвести до зниження рівня глюкози в крові, зниження маси тіла та/або зниження споживання їжі.
У деяких варіантах реалізації поліпептиди та гібридні білки, розглянуті у даному документі, можуть знижувати рівень глюкози в крові, масу тіла та/або споживання їжі щонайменше на 5 95 у порівнянні із зазначеними показниками під час відсутності введення поліпептидів або гібридних білків. Наприклад, поліпептиди та гібридні білки, розглянуті у даному документі, можуть знижувати рівень глюкози в крові, масу тіла та/або споживання їжі щонайменше на 10 95, 20 95,
ЗО о, 50 90, бО Зо, 7095, 8095 або 9095 у порівнянні зі станом до початку лікування або профілактики.
Фармацевтичні композиції
Поліпептиди відповідно до даного винаходу можуть перебувати у вигляді композиції, придатної для введення суб'єкту. В цілому, такі композиції являють собою "фармацевтичні композиції", що містять один або більше з поліпептидів й один або більше з фармацевтично прийнятних або фізиологічно прийнятних розріджувачів, носіїв або допоміжних речовин. У деяких варіантах реалізації поліпептиди присутні в терапевтично ефективній кількості.
Фармацевтичні композиції можна використовувати в способах відповідно до даного винаходу; так, наприклад, фармацевтичні композиції можна вводити ех мімо або іп мімо в організм суб'єкта з метою здійснення терапевтичних і профілактичних способів і варіантів застосування, описаних у даному документі.
Можна скласти фармацевтичні композиції відповідно до даного винаходу, сумісні з передбачуваним способом або шляхом введення; типові шляхи введення викладені у даному документі. Крім того, фармацевтичні композиції можна використовувати в комбінації з іншими терапевтично активними агентами або сполуками (наприклад, агентами, що знижують рівень глюкози), описаними у даному документі, з метою лікування або профілактики захворювань, розладів і станів, розглянутих у даному винаході.
Фармацевтичні композиції зазвичай містять терапевтично ефективну кількість щонайменше одного з поліпептидів, розглянутих у даному винаході, й один або більше з фармацевтично та фізіологічно прийнятних агентів для одержання складу. Підходящі фармацевтично прийнятні або фізіологічно прийнятні розріджувачі, носії або допоміжні речовини включають антиоксиданти (наприклад, аскорбінову кислоту та бісульфат натрію), консерванти (наприклад, бензиловий спирт, метил-, етил- або н-пропілпарабени, р-гідроксибензоат), емульгатори, суспендуючі агенти, диспергуючі агенти, розчинники, наповнювачі, об'ємоутворюючі агенти, детергенти, буфери, середовища-носії, розріджувачі й/або ад'юванти, але не обмежуються ними. Наприклад, підходяще середовище-носій може являти собою фізіологічний розчин або фізіологічний розчин із цитратним буфером, можливо, з додаванням інших матеріалів, що часто зустрічаються у фармацевтичних композиціях для парентерального введення. Нейтральний забуферений фізіологічний розчин або фізіологічний розчин, змішаний з сироватковим альбуміном, являють собою додаткові типові середовища-носії. Фахівці в даній області техніки можуть легко назвати різні буфери, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях і лікарських формах. Типові буфери включають фармацевтично прийнятні слабкі кислоти, слабкі основи або їх суміші, але не обмежуються ними. Наприклад, компоненти буфера можуть являти собою водорозчинні матеріали, наприклад, фосфорну кислоту, винну кислоту, молочну кислоту, бурштинову кислоту, лимонну кислоту, оцтову кислоту, аскорбінову кислоту, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту та їх солі. Прийнятні буферні агенти включають, наприклад, трис- буфер, М-(2-гідроксіетил)піперазин-М'-(2-етансульфонову кислоту) (НЕРЕЗ), 2-(М- морфолін)етансульфонову кислоту (МЕ5), натрієву сіль 2-(М-морфолін)етансульфонової кислоти (МЕ5), 3-(М-морфолін)упропансульфонову кислоту (МОРБ) і М- трисігідроксиметил|метил-3-амінопропансульфонову кислоту (ТАР5Б).
Після складання фармацевтичної композиції її можна зберігати в стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердого тіла або зневодненого або ліофілізованого порошку. Такі склади можна зберігати у вигляді готової до використання форми, ліофілізованої форми, що потребує відновлення перед використанням, рідкої форми, що потребує розведення перед використанням, або іншої прийнятної форми. У деяких варіантах реалізації запропонована фармацевтична композиція в одноразовому контейнері (наприклад, одноразовому флаконі, ампулі, шприці або автоматичному інжекторі (наприклад, ЕріРепФф)), у той час як в інших варіантах реалізації запропонований багаторазовий контейнер (наприклад, багаторазовий флакон). Для доставки поліпептидів можна використовувати будь-який апарат для доставки ліків, у тому числі імплантати (наприклад, імплантовані насоси) та катетерні системи, які добре відомі фахівцям. Ін'єкції речовин уповільненого всмоктування, які зазвичай вводять підшкірно або внутрішньом'язово, можна також використовувати для вивільнення поліпептидів, описаних у даному документі, протягом певного часу. Ін'єкції речовин бо уповільненого всмоктування, як правило, складені на твердій або масляній основі й у загальному випадку містять щонайменше один із компонентів складу, викладених у даному документі. Фахівець в даній області техніки повинен бути знайомий з можливими складами та варіантами застосування ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування.
Фармацевтичні композиції можуть перебувати у формі стерильної водної або масляної суспензії для ін'єкції. Цю суспензію можна скласти згідно зі способами, відомими в даній області техніки, використовуючи підходящі диспергуючі агенти або зволожувачі та суспендуючі агенти, згадані у даному документі. Стерильний препарат для ін'єкції також може являти собою стерильний розчин або суспензію для ін'єкції в нетоксичному прийнятному для парентерального застосування розріджувачі або розчиннику, наприклад, розчин в 1,3-бутандіолі. Прийнятні розріджувачі, розчинники та диспергуючі середовища, які можна використовувати, включають воду, розчин Рінгера, ізотонічний розчин хлориду натрію, Стеторпог ЕЇ "м (ВА5БЕ, Парсипанні, штат Нью-Джерсі, США) або фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5), етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь та рідкий поліетиленгліколь) та їх підходящі суміші. Крім того, стерильні нелетучі масла традиційно застосовують як розчинник або середовища для суспендування. З цією метою можна використовувати будь-яке м'яке нелетуче масло, у тому числі синтетичні моно- або дигліцериди. Крім того, при одержанні розчинів для ін'єкції знаходять застосування жирні кислоти, наприклад, олеїнова кислота. Пролонговане всмоктування конкретних ін'єкційних композицій можна забезпечити шляхом включення агента, що сповільнює всмоктування (наприклад, моностеарату алюмінію або желатину).
Фармацевтичні композиції, які містять активний інгредієнт (наприклад, поліпептиди відповідно до даного винаходу), можуть перебувати у формі, придатній для перорального застосування, наприклад, таблеток, капсул, пастилок, льодяників, водних або масляних суспензій, диспергованих порошків або гранул, емульсій, твердих або м'яких капсул або сиропів, розчинів, мікрогранул або еліксирів. Фармацевтичні композиції для перорального застосування одержують відповідно до будь-якого способу, відомого в даній області техніки для одержання фармацевтичних композицій, і такі композиції можуть містити один або більше з таких агентів, як підсолоджувачі, ароматизатори, барвники та консерванти, з метою одержання фармацевтично вишуканих і приємних на смак препаратів. Таблетки, капсули і тому подібне містять активний інгредієнт у суміші з нетоксичними фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами, що підходять для виготовлення таблеток. Такі допоміжні речовини можуть являти собою, наприклад, розріджувачі, наприклад, карбонат кальцію, карбонат натрію, лактозу, фосфат кальцію або фосфат натрію; гранулюючі агенти, і розпушувачі, наприклад, кукурудзяний крохмаль або альгінову кислоту; сполучні агенти, наприклад, крохмаль, желатин або гуміарабік; і ковзні агенти, наприклад стеарат магнію, стеаринову кислоту або тальк.
Таблетки, капсули і тому подібне, придатні для перорального введення, можуть не містити покриття або бути покриті відомими способами для вповільнення розпаду та всмоктування у шлунково-кишковому тракті, тим самим забезпечуючи пролонговану дію. Наприклад, можна застосовувати матеріал з відстроченим вивільненням, наприклад, гліцерилмоностеарат або гліцерилдистеарат. На них також можна нанести покриття відповідно до методик, відомих в даній області технікиь, з метою формування оосмотичних терапевтичних таблеток з контрольованим вивільненням. Додаткові агенти включають біорозкладані або біосумісні частинки, або полімерні речовини, наприклад, поліефіри, поліамінокислоти, гідрогель, полівінілпіролідон, поліангідриди, полігліколеву кислоту, етиленвінілацетат, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу, сульфат протаміну або лактид/гліколідні співполімери, полілактид/гліколідні співполімери або співполімери етиленвінілацетату, для контролю доставки введеної композиції. Наприклад, агент для перорального застосування можна включити в мікрокапсули, отримані за допомогою методик коацервації або міжфазної полімеризації, з використанням гідроксиметилцелюлозних або желатинових мікрокапсул або мікрокапсул полі(метилметакрилату), відповідно, або в колоїдну систему доставки лікарських засобів.
Колоїдні дисперсійні системи включають макромолекулярні комплекси, нанокапсули, мікросфери, мікрогранули та системи на основі ліпідів, у тому числі емульсії типу "масло у воді", міцели, змішані міцели та ліпосоми. Способи одержання ліпосом описані, наприклад, у патентах
США Мо 4235871, 4501728 і 4837028. Способи одержання вищезгаданих складів очевидні для фахівців у даній області техніки.
Склади для перорального застосування можуть бути представлені у вигляді твердих желатинових капсул, де активний інгредієнт змішаний з інертним твердим розріджувачем, наприклад, карбонатом кальцію, фосфатом кальцію або каоліном або мікрокристалічною целюлозою, або у вигляді м'яких желатинових капсул, де активний інгредієнт змішаний з водним або масляним середовищем, наприклад, арахісовим маслом, рідким парафіном або 60 маслиновим маслом.
Водні суспензії містять активні матеріали в суміші з допоміжними речовинами, придатними для їх виробництва. Такі допоміжні речовини можуть являти собою суспендуючі агенти, наприклад, карбоксиметилцелюлозу натрію, метилцелюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу, альгінат натрію, полівінілпіролідон, трагакантову камідь та гуміарабік; диспергуючі агенти або зволожувачі, наприклад, природні фосфатиди (наприклад, лецитин), або продукти конденсації алкіленоксиду з жирними кислотами (наприклад, поліоксіетиленстеарат), або продукти конденсації етиленоксиду з довголанцюговими аліфатичними спиртами (наприклад, гептадекаєтиленоксицетанол), або продукти конденсації етиленоксиду з неповними ефірами -- похідними жирних кислот і гекситу (наприклад, поліоксіетиленсорбітмоноолеат) або продукти конденсації етиленоксиду з неповними ефірами - похідними жирних кислот й ангідридів гекситу (наприклад, поліеєтиленсорбітунмоноолеат). Водні суспензії можуть також містити один або більше з консервантів.
Масляні суспензії можна скласти шляхом суспендування активного інгредієнта в рослинному маслі, наприклад, арахісовому маслі, маслиновому маслі, кунжутному маслі або кокосовому маслі, або в мінеральному маслі, наприклад, рідкому парафіні. Масляні суспензії можуть містити загущувач, наприклад, бджолинний віск, твердий парафін або цетиловий спирт.
Підсолоджувачі, наприклад, представлені вище, і ароматизатори можна додавати для одержання приємного на смак препарату для перорального застосування.
Дисперговані порошки та гранули для одержання водної суспензії шляхом додавання води містять активний інгредієнт у суміші з диспергуючим агентом або зволожувачем, суспендуючим агентом й одним або більше з консервантів. Підходящі диспергуючі агенти або зволожувачі та суспендуючі агенти наведені у даному документі.
Фармацевтичні композиції відповідно до даного винаходу можуть також перебувати у вигляді емульсій "масло-у-воді". Масляна фаза може являти собою рослинне масло, наприклад, маслинове масло або арахісове масло, або мінеральне масло, наприклад, рідкий парафін, або їх суміші. Підходящі емульгатори можуть являти собою природні камеді, наприклад, гуміарабік або трагакантову камідь; природні фосфатиди, наприклад, фосфатиди сої, лецитин й ефіри або неповні ефіри - похідні жирних кислот; ангідриди гекситу, наприклад, сорбітанмоноолеат; і продукти конденсації неповних ефірів із етиленоксидом, наприклад,
Зо поліоксіетиленсорбітанмоноолеат.
Склади також можуть містити носії для захисту композиції від швидкого розкладання або виведення з організму, наприклад, склади з контрольованим вивільненням, у тому числі імплантати, ліпосоми, гідрогелі, проліки або мікрокапсульовані системи доставки. Наприклад, можна застосовувати матеріал з відстроченим вивільненням, наприклад, гліцерилмоностеарат або гліцерилстеарат окремо або в комбінації з воском.
У даному винаході розглядається введення поліпептидів у вигляді супозиторіїв для ректального введення лікарської речовини. Супозиторії можна одержати шляхом змішування лікарської речовини з підходящою неподразнюючою допоміжною речовиною, твердою при звичайних температурах, але рідкою при ректальній температурі, що, таким чином, буде плавитися у прямій кишці, вивільняючи лікарську речовину. Такі матеріали включають масло какао та поліетиленгліколі, але не обмежуються ними.
Поліпептиди, розглянуті у даному винаході, можуть перебувати у формі будь-якої іншої підходящої фармацевтичної композиції (наприклад, спреїв для назального або інгаляційного застосування), відомої в цей час або розробленої в майбутньому.
Концентрація поліпептиду або його фрагмента в складі може варіюватися в широких межах (наприклад, від менше ніж приблизно 0,1 мас. 95, як правило, 2 мас. 95 або щонайменше приблизно 20 мас. 95 до50 мас. 95 або більше); її вибирають, як правило, головним чином з урахуванням об'єму рідини, в'язкості та факторів, що залежать від суб'єкта, відповідно до, наприклад, конкретного вибраного способу введення.
У даному документі розглядається застосування технології доставки речовин з уповільненим всмоктуванням компанії Мапо Ргесізіоп Меаіїсаї (Мапо Ргесізіоп Меадіса!; Емервілл, штат Каліфорнія, США). Ця технологія використовує мембрани на основі нанотрубок із діоксиду титану, що забезпечують швидкості вивільнення нульового порядку для макромолекул, наприклад, білкових і пептидних терапевтичних засобів. Біосумісну мембрану розташовують у невеликому підшкірному імплантаті, що забезпечує довгострокову (наприклад, до одного року) доставку терапевтичних макромолекул з постійною швидкістю. У цей час проходить оцінку технологія доставки агоністів СІ Р-1 для лікування діабету ІІ типу. У деяких варіантах реалізації поліпептид(и), описаний() у даному документі, може (можуть) являти собою склад з мембраною. Наприклад, можна просочити мембрану поліпептидом або оточити поліпептид мембраною. Мембрана може мати форму диска, трубки або кулі. У деяких варіантах реалізації трубка може являти собою нанотрубку, або куля може являти собою наносферу.
У деяких варіантах реалізації поліпептиди, описані у даному документі, можна вводити суб'єкту за допомогою носимої системи доставки, яку можна закріпити на тілі пацієнта й яка може доставляти заздалегідь задану дозу поліпептиду пацієнту. Типові носимі системи доставки включають пластирі або насоси. У деяких випадках носимі системи доставки, наприклад носимі інжектори, використовувані для доставки МешавіафФ, можна застосовувати для введення поліпептидів, описаних у даному документі. В інших варіантах реалізації для доставки поліпептиду, описаного у даному документі, в організм пацієнта можна використовувати осмотичні насоси, наприклад, імплантовані осмотичні насоси (наприклад, насос ООКО5Ф або осмотичний насос АІЛЕТФ)).
Шляхи введення
У даному винаході розглядається введення описаних поліпептидів та їх композицій будь- яким підходящим способом. Підходящі шляхи введення включають парентеральний (наприклад, внутрішньом'язовий, внутрішньовенний, підшкірний (наприклад, впорскування або використання імплантата), внутрішньочеревинний, інтрацистернальний, внутрішньосуглобний, внутрішньочеревинний, внутрішньоцеребральний (інтрапаренхіматозний) та інтрацеребровентрикулярний), оральний, назальний, вагінальний, сублінгвальний, внутрішньоочний, ректальний, місцевий (наприклад, трансдермальний), сублінгвальний та інгаляційний.
Ін'єкції речовин вповільненого всмоктування, які зазвичай вводять підшкірно або внутрішньом'язово, можна також використовувати для вивільнення поліпептидів, описаних у даному документі, протягом певного часу. Ін'єкції речовин уповільненого всмоктування, як правило, складені на твердій або масляній основі й у загальному випадку містять щонайменше один із компонентів складу, викладених у даному документі. Фахівець в даній області техніки повинен бути знайомий з можливими складами та варіантами застосування ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування.
Що стосується антитіл, у типовому варіанті реалізації антитіло або фрагмент антитіла відповідно до даного винаходу зберігали при концентрації 10 мг/мл в стерильному ізотонічному
Зо водному розчині хлориду натрію для ін'єкцій при 4 "С і розбавляли 100 мл або 200 мл 0,9 95 хлориду натрію для ін'єкцій до введення пацієнту. Антитіло вводили шляхом внутрішньовенного вливання протягом 1 години в дозі від 0,2 до 10 мг/кг. В інших варіантах реалізації антитіло вводять шляхом внутрішньовенного вливання протягом від 15 хвилин до 2 годин. В інших варіантах реалізації процедуру введення здійснюють шляхом підшкірної болюсної ін'єкції.
У даному винаході розглядаються способи, в яких поліпептид або антитіло або фрагмент антитіла відповідно до даного винаходу вводять суб'єкту щонайменше два рази на день, щонайменше раз на день, щонайменше кожні 48 годин, щонайменше кожні 72 години, щонайменше раз на тиждень, щонайменше раз на 2 тижні, щонайменше раз на місяць, щонайменше раз на 2 місяці або щонайменше раз на З місяці або рідше.
Комбінована терапія
У даному винаході розглядається застосування поліпептидів у комбінації з одним або більше з активних терапевтичних агентів або іншими профілактичними або терапевтичними процедурами. При такій комбінованій терапії різні активні агенти часто мають різні механізми дії.
Така комбінована терапія може бути особливо вигідною за рахунок зниження дози одного або більше з агентів, за рахунок чого послабляються або усуваються небажані ефекти, асоційовані з одним або більше агентів; крім того, така комбінована терапія може чинити синергетичну терапевтичну або профілактичну дію на основні захворювання, розлад або стан.
У даному документі термін "комбінація" має на увазі включення терапевтичних засобів, які можна вводити окремо, наприклад, в різних складах для роздільного введення (наприклад, як вони можуть бути представлені в комплекті) та терапевтичних засобів, які можна вводити спільно в одному складі (наприклад, "спільному складі").
У деяких варіантах реалізації поліпептиди вводять або застосовують послідовно, наприклад, коли один агент вводять до одного або більше інших агентів. В інших варіантах реалізації поліпептиди вводять одночасно, наприклад, коли два або більше з агентів вводять в один або приблизно той самий час; зазначені два або більше з агентів можуть перебувати у двох або більше окремих складах або бути об'єднані в одному складі (наприклад, спільному складі).
Незалежно від послідовного або одночасного введення двох або більше агентів, вважається, що їх вводять у комбінації для цілей даного винаходу.
Поліпептиди відповідно до даного винаходу можна застосовувати в комбінації з іншими бо агентами, корисними для лікування, профілактики, пригнічення або полегшення захворювань,
розладів або станів, викладених у даному документі, включаючи речовини, які зазвичай вводять суб'єктам, що страждають від ожиріння, розладу харчового поводження, гіперглікемії, гіперінсулінемії, непереносимості глюкози та інших розладів метаболізму глюкози.
У даному винаході розглядається комбінована терапія з використанням численних агентів (і їх класів), включаючи 1) інсулін, імітатори інсуліну й агенти, що стимулюють секрецію інсуліну, в тому числі похідні сульфонілсечовини (наприклад, хлорпропамід, толазамід, ацетогексамід, толбутамід, глібенкламід, глімепірид, гліпізид) і меглітиніди (наприклад, мітиглінід, репаглінід (РКАМОІМ) і натеглінід (5ТАКІІХ)); 2) бігуаніди (наприклад, метформін (БІ ЮСОРНАСЕ) і його фармацевтично прийнятні солі, зокрема, метформіну гідрохлорид і його склади з пролонгованим вивільненням, наприклад, СіІштпеїга"мМ, Ропйатеї"мМ ії Сіисорпадехк М) та інші агенти, що діють за рахунок стимуляції утилізації глюкози, зниження продукції глюкози у печінці та/або зниження виходу глюкози в кишечнику; 3) інгібітори альфа-глюкозидази (наприклад, акарбозу, воглібозу і міглітол) та інші агенти, які сповільнюють переварювання вуглеводів і, отже, їхнє поглинання в кишечнику та знижують постпрандіальну гіперглікемію; 4) тіазолідиндіони (наприклад, росиглітазон (АМАМОІА), троглітазон (КЕ2ОІМ), піоглітазон (АСТОЗ5), гліпізид, балаглітазон, ривоглітазон, нетоглітазон, АМО 131, МВХ2044, мітоглітазон, лобеглітазон, ІЮК-105, троглітазон, енглітазон, сиглітазон, адаглітазон, дарглітазон, які підсилюють дію інсуліну (наприклад, шляхом сенсибілізації інсуліну), включаючи інсулін й імітатори інсуліну (наприклад, інсулін деглудек, інсулін гларгін, інсулін ліспро, інсулін детемір, інсулін глулізин й інгаляційні склади кожного з них), тим самим стимулюючи утилізацію глюкози у периферичних тканинах; 5) глюкагон-подібні пептиди, включаючи інгібітори ОРР-ЇМ (наприклад, алогліптин, омаригліптин, лінагліптин, вілдагліптин (ЗАЇ МОБ) і ситагліптин (ФАМИОМІА)), ії глюкагон-подібний пептид-! ((3Ї Р-1), і агоністи, і аналоги СІ Р-1 (наприклад, ексенатид (ВМЕТТА й ІТСА 650 (осмотичний насос, імплантований під шкіру, що здійснює доставку аналога ексенатиду протягом 12 місяців; Іпіагсіа, Бостон, штат Массачусетс, США)) й агоністи рецептора СІ Р-1 (наприклад, дулаглютид, семаглютид, альбіглютид, ексенатид, ліраглютид, ліксисенатид, таспоглютид, СОС-1131 і ВІМ-51077, включаючи їх склади для інтраназального, трансдермального застосування та застосування раз на тиждень); 6) і ОРР-ЇМ- стійкі аналоги (імітатори інкретину), агоністи РРАК-гамма, агоністи РРАК-альфа, наприклад,
Зо похідні фенофібрової кислоти (наприклад, гемфіброзил, клофібрат, ципрофібрат, фенофібрат, безафібрат), агоністи РРАК подвійної дії (наприклад, 2УН2, 2УНІ, СЕТ505, чиглітазар, мураглітазар, алеглітазар, соделглітазар і навеглітазар), агоністи РРАБК загальної дії, інгібітори
РТРІВ (наприклад, І5І5З-113715 і ТТРВ14), інгібітори ЗОЇ Т (наприклад, АЗРІ1941, 501. Т-3, емпагліфлозин, дапагліфлозин, санагліфлозин, ВІ-10773, РЕ-04971729, ремогліфлозин, 75-071, тофогліфлозин, іпрагліфлозин і І Х-4211), стимулятори секреції інсуліну, інгібітори ангіотензин- перетворюючого ферменту (наприклад, алацеприл, беназеприл, каптоприл, церонаприл, цилазаприл, делаприл, еналаприл, еналаприлат, фозиноприл, імідаприл, лізиноприл, мовелтиприл, периндоприл, хінаприл, раміприл, спіраприл, темокаприл або трандолаприл), антагоністи рецептора ангіотензину !| (наприклад, лозартан, СО2ААКІ, валсартан, кандесартан, олмесартан, телмісартан і кожний з цих лікарських засобів, які використовують в комбінації з гідрохлортіазидом, наприклад, НУ2ААК. ) або інші антигіпертензивні препарати, наприклад, ЇС2 696, агоністи КХК, інгібітори кінази-3 глікогенсинтази, імуномодулятори, симпатолітики, бета-адреноблокатори (наприклад, пропранолол, атенолол, бісопролол, карведилол, метопролол або метопрололу тартрат), альфа-адреноблокатори (наприклад, доксазозин, празозин або альфа-метилдофу), центральні агоністи альфа-адренергічних рецепторів, периферичні вазодилататори (наприклад, гідралазин); агоністи бета-3- адренергічних рецепторів, інгібітори 11-бета-Н5О1, інгібітори нейтральної ендопептидази (наприклад, тіофан і фосфорамідон), антагоністи альдостерону, інгібітори альдостеронсинтази, інгібітори реніну (наприклад, похідні сечовини та ди- і трипептидів (див. патент США Мо 5116835), амінокислоти та їх похідні (патенти США 5095119 і 5104869), ланцюги амінокислот, зв'язаних непептидними зв'язками (патент США 5114937), похідні ди- і трипептидів (патент США 5106835), пептидиламінодіоли (патенти США 5063208 і 4845079) і пептидил-бета- аміноациламінодіолкарбамати (патент США 5089471); крім того, ряд інших пептидних аналогів, описаних у наступних патентах США: 5071837; 5064965; 5063207; 5036054; 5036053; 5034512 і 4894437, і низькомолекулярні інгібітори реніну (включаючи діолсульфаніламіди та сульфініли (патент США 5098924), М-морфоліно-похідні (патент США 5055466), М-гетероциклічні спирти (патент США 4885292) та піролімідазолони (патент США 5075451); крім того, похідні пепстатину (патент США 4980283) і фтор- і хлорпохідні статон-вмісних пептидів (патент США 5066643), еналкірен, КО 42-5892, А 65317, СР 80794, ЕБ5 1005, Е5 8891, 50 34017, аліскірен (510) (2(5),4(5),5(5),7(5)-М-(2-карбамоїл-2-метилпропіл)-5-аміно-4-гідрокси-2, 7-діізопропіл-8-(4-
метокси-3-(З-метоксипропокси)-феніл|-октанаміду геміфумарат) 5РРбБОО, 5РРбЗО і 5РРБбЗБ), антагоністи рецептора ендотеліну, інгібітори фосфодіестерази-5 (наприклад, силденафіл, тадалафіл і варденафіл), вазодилататори, блокатори кальцієвих каналів (наприклад, амлодипін, ніфедипін, верапаміл, дилтіазем, галопаміл, нілудипін, німодипін, нікардипін), активатори калієвих каналів (наприклад, нікорандил, пінацидил, кромакалім, міноксидил, априлкалім, лопразолам), агенти, що знижують рівень ліпідів, наприклад, інгібітори ГМГ-КоА- редуктази, наприклад, симвастатин і ловастатин, доступні у продажу як 2ОСОКФО і МЕМАСОКФ у формі лактону-проліків і діючі як інгібітори після введення, і фармацевтично прийнятні солі інгібіторів ГМГ-КоА-редуктази на основі дигідроксикислот з розірваним кільцем, наприклад, аторвастатину (особливо кальцієву сіль, доступну в продажу як ГІРІТОКФ), розувастатину (особливо кальцієву сіль, доступну в продажу як СКЕБТОКФ)), правастатину (особливо натрієву сіль, доступну в продажу як РКАМАСНОЇ Ф)), церивастатину і флувастатину (особливо натрієву сіль, доступну в продажу як ГЕ5БСОЇ Ф); інгібітори всмоктування холестерину, наприклад, езетиміб (2ЕТІАФ) й езетиміб у комбінації з іншими агентами, що знижують рівень ліпідів, наприклад, інгібіторами ГМГ-КоА-редуктази, зазначеними вище, і особливо з симвастатином (МУТОВІМФ) або з аторвастатин-кальцієм; лікарські засоби, що підвищують рівень ЛІВЩ (наприклад, ніацин й агоністи рецептора нікотинової кислоти та їх варіанти з уповільненим або контрольованим вивільненням, і/або в комбінації з інгібітором ГМГ-КоА-редуктази; агоністи рецептора ніацину, наприклад, аципімокс й ацифран, а також часткові агоністи рецептора ніацину; антагоністи рецептора глюкагону (наприклад, МК-3577, МК-0893, І У-2409021 і КТ6- 971); агенти, що поглинають жовчні кислоти (наприклад, колестилан, колестимід, колесевеламу гідрохлорид, колестипол, холестирамін і діалкіламіноалкільні похідні перехресно зшитого декстрану), інгібітори ацил-КоА: холестеринацилтрансферази, (наприклад, авазиміб); агенти для застосування при запальних станах, наприклад, аспірин, нестероїдні протизапальні препарати, або НПЗП, глюкокортикоїди та селективні інгібітори циклооксигенази-2, або СОХ-2; активатори глюкокінази (СОСКА) (наприклад, А7О6370); інгібітори 118- гідроксистероїддегідрогенази 1 типу, (наприклад, описані у патенті США Мо 6730690 і /х- 2523199); інгібітори СЕТР (наприклад, анацетрапіб, евацетрапіб і торцетрапіб); інгібітори фруктозо-1,6-бісфосфатази, (наприклад, описані у патентах США Мо 6054587; 6110903;
Зо 6284748; 6399782; і 6489476); інгібітори ацетил-КоА-карбоксилази-1ї або 2 (АСС1 або АСС2); інгібітори РОЗКОУ; часткові агоністи ОРК-40; модулятори 5С0; інгібітори синтази жирних кислот; амілін й аналоги аміліну (наприклад, прамлінтид); включаючи фармацевтично прийнятні солі вищевказаних активних агентів, якщо це можливо з хімічної точки зору.
Крім того, у даному винаході розглядається комбінована терапія з використанням агентів і способів для стимуляції втрати ваги, наприклад, агентів, що стимулюють обмін речовин або знижують апетит, і зміною дієти та/або схем фізичного навантаження, що сприяє втраті ваги.
Поліпептиди відповідно до даного винаходу можна використовувати в комбінації з одним або більше з інших агентів будь-яким чином, що відповідають обставинам. В одному варіанті реалізації лікування із застосуванням щонайменше одного активного агента та щонайменше одного поліпептиду відповідно до даного винаходу підтримують протягом певного часу. В ще одному варіанті реалізації лікування із застосуванням щонайменше одного активного агента знижують або припиняють (наприклад, при стабільному стані суб'єкта), у той час як лікування із застосуванням поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу підтримують без зміни схеми прийому. У додатковому варіанті реалізації лікування із застосуванням щонайменше одного активного агента знижують або припиняють (наприклад, при стабільному стані суб'єкта), у той час як лікування із застосуванням поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу знижують (наприклад, знижуючи дозу, частоту прийому або тривалість схеми прийому). В ще одному варіанті реалізації лікування із застосуванням щонайменше одного активного агента знижують або припиняють (наприклад, при стабільному стані суб'єкта), а лікування із застосуванням щонайменше поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу підсилюють (наприклад, підвищуючи дозу, частоту прийому або тривалість схеми прийому). В ще одному варіанті реалізації лікування із застосуванням щонайменше одного активного агента підтримують, а лікування із застосуванням поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу знижують або припиняють (наприклад, знижуючи дозу, частоту прийому або тривалість схеми прийому). В ще одному варіанті реалізації лікування із застосуванням щонайменше одного активного агента та лікування із застосуванням поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу знижують або припиняють (наприклад, знижуючи дозу, частоту прийому або тривалість схеми прийому).
Схема прийому
Поліпептиди відповідно до даного винаходу можна вводити суб'єкту в кількості, що 60 залежить, наприклад, від мети введення (наприклад, бажаного ступеня нормалізації стану); віку,
ваги, статі, стану здоров'я та фізичного стану суб'єкта, що підлягає лікуванню; природи поліпептиду, що вводять, та/або складу; шляхи введення; і характеру захворювання, розладу, стану або їх симптомів (наприклад, тяжкості порушення регуляції глюкози/інсуліну та стадії розладу). Схему прийому можна також розробляти з урахуванням наявності, характеру і ступеня небажаних ефектів, пов'язаних із вводеним(и) агентом(ами). Ефективні дози та схеми прийому легко визначити, наприклад, на підставі досліджень безпеки та досліджень із збільшенням дози, досліджень іп мімо (наприклад, на тваринних моделях) та інших способів, відомих фахівцю в даній області техніки.
У загальному випадку, параметри режиму прийому визначають, що доза в кількісному відношенні повинна бути менше кількості, яка може бути незворотньо токсичною для суб'єкта (тобто максимально переносимої дози, МТО) і не менше кількості, необхідної для вимірюваного впливу на суб'єкта. Такі кількості визначаються, наприклад, фармакокінетичними та фармакодинамічними параметрами, пов'язаними з поглинанням, розподілом, метаболізмом і виведенням (АЮМЕ"), з урахуванням шляху введення та інших факторів.
Ефективна доза (ЕД) є дозою або кількістю препарату, що дає терапевтичну відповідь або бажаний ефект у деякої частки пацієнтів, що приймають його. "Медіанна ефективна доза" або
ЕД5БО агента являє собою дозу або кількість агента, що дозволяє одержати терапевтичну відповідь або бажаний ефект у 50 95 популяції суб'єктів, яким вводять даний агент. Хоча ЕД5БО зазвичай використовують як показник обгрунтованої ймовірності ефекту агента, вона не обов'язково являє собою дозу, яку клініцист може вважати доцільною з урахуванням всіх відповідних факторів. Так, у деяких ситуаціях ефективна кількість перевищує розрахункове значення ЕД5БО, в інших ситуаціях ефективна кількість становить менше розрахункового значення ЕД5БО, а в інших ситуаціях ефективна кількість аналогічна розрахунковому значенню
ЕД5БО.
Крім того, ефективна доза поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу може являти собою кількість, яка при введенні суб'єкту у вигляді однієї або декількох доз дозволяє одержати бажаний результат у порівнянні із здоровим суб'єктом. Наприклад, ефективна доза може являти собою дозу, яка при введенні суб'єкту з підвищеним рівнем глюкози й/або інсуліну в плазмі дозволяє досягти бажаного зниження у порівнянні з рівнем у здорового суб'єкта, щонайменше
Зо приблизно на 1095, щонайменше приблизно на 2095, щонайменше приблизно на 25 965, щонайменше приблизно на 30 95, щонайменше приблизно на 40 95, щонайменше приблизно на 5095, щонайменше приблизно на 6095, щонайменше приблизно на 7095, щонайменше приблизно на 80 95 або більше ніж на 80 95.
Доцільний рівень дозування зазвичай становить від приблизно 0,001 до 100 мг/кг маси тіла пацієнта на день, які можна вводити у вигляді однієї або декількох доз. У деяких варіантах реалізації рівень дозування становить від приблизно 0,01 до приблизно 25 мг/кг на день, а в інших варіантах реалізації - від приблизно 0,05 до приблизно 10 мг/кг на день. Підходящий рівень дозування може становити від приблизно 0,01 до 25 мг/кг на день, від приблизно 0,05 до 10 мг/кг на день, або від приблизно 0,1 до 5 мг/кг на день. У межах цього діапазону дозування може становити від 0,005 до 0,05, від 0,05 до 0,5 або від 0,5 до 5,0 мг/кг на день.
Для перорального введення агента композицію можна представити у формі таблеток, капсул і тому подібного, що містять від 1,0 до 1000 мг активного інгредієнта, зокрема, 1,0, 3,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 і 1000,0 мг активного інгредієнта. Поліпептид(и) можна вводити за схемою, наприклад, від 1 до 4 разів на день, і часто один або два рази на день.
Прийом поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу можна повторювати з відповідною частотою, що може перебувати в межах від одного разу на день до одного разу на три місяці, залежно від фармакокінетики поліпептиду(ів) (наприклад, часу напівжиття) та фармакодинамічної відповіді (наприклад, тривалості терапевтичного ефекту поліпептиду(ів)). У деяких варіантах реалізації прийом часто повторюють від одного разу на тиждень до одного разу кожні З місяці. В інших варіантах реалізації поліпептид(и) вводять приблизно один раз на місяць.
У деяких варіантах реалізації дозування описаного(их) поліпептиду(ів) знаходиться в "дозованій лікарській формі". Фраза "дозована лікарська форма" відноситься до фізично дискретних одиниць, причому кожна одиниця містить заздалегідь визначену кількість поліпептиду(ів) відповідно до даного винаходу окремо або в комбінації з одним або більше додатковими агентами, достатню для одержання бажаного ефекту. Варто брати до уваги, що параметри дозованої лікарської форми залежать від конкретного агента та планованого ефекту.
Набори
У даному винаході також розглядаються набори, які містять описаний(і) поліпептид(и) та їх фармацевтичні композиції. Набори, як правило, представлені у вигляді фізичної структури, в якій розміщені різні компоненти, описані нижче, яку можна використовувати, наприклад, при практичній реалізації способів, описаних вище (наприклад, введенні поліпептиду(ів) суб'єкту, що потребує зниження маси тіла).
Набір може містити один або більше з поліпептиду(ів), описаного(их) у даному документі (наприклад, у стерильному контейнері), що може бути присутнім у формі фармацевтичної композиції, придатної для введення суб'єкту. Поліпептид(и) можуть бути присутніми у формі, готовій до застосування, або у формі, що вимагає, наприклад, відновлення або розведення перед введенням. Якщо поліпептид(и) перебувають у формі, що вимагає відновлення користувачем, набір може також містити буфери, фармацевтично прийнятні допоміжні речовини та тому подібне, упаковані з поліпептидом(ами) або окремо. Якщо розглядається комбінована терапія, набір може містити декілька агентів окремо, або вони вже можуть бути об'єднані в складі набору. Кожний компонент набору можна помістити в окремий контейнер, і всі контейнери можуть перебувати в одному упакуванні. Набір відповідно до даного винаходу може передбачати умови, необхідні для належної підтримки компонентів, розміщених в ньому (наприклад, охолодження або заморожування).
Набір може містити етикетку або вкладиш в упакування, що містять ідентифікуючу інформацію про компоненти, що входять в його склад, а також інструкції з їх застосування (наприклад, параметри прийому, клінічну фармакологію активного(их) інгредієнта(ів), у тому числі механізм дії, фармакокінетику і фармакодинаміку, побічні ефекти, протипоказання і так далі). Етикетки або вкладиші можуть містити інформацію про виробника, наприклад, номера партій і дати закінчення строку придатності. Етикетку або вкладиш в упакування можна, наприклад, інтегрувати у фізичну структуру, в якій розміщені компоненти, окремо помістити в зазначену фізичну структуру, або прикріпити до компонента набору (наприклад, ампули, пробірки або флакону). Типові інструкції включають інструкції зі зменшення або зниження рівня глюкози в крові, лікування гіперглікемії, лікування цукрового діабету і так далі із застосуванням описаних модуляторів і фармацевтичних композицій на їх основі.
Етикетки або вкладиші можуть додатково містити або міститися на машинозчитуваному носії, наприклад, диску (наприклад, жорсткому диску, карті, носії пам'яті), оптичному диску, наприклад, СО- або ЮОМО-КОМ/КАМ, ОМО, МРЗ, магнітній стрічці або електричному носії інформації, наприклад, ОЗП і ПЗП або їх гібридах, наприклад, магнітно/оптичних носіях, флеш- носіях або картах пам'яті. У деяких варіантах реалізації інструкції фактично відсутні в наборі, однак надані засоби для одержання інструкцій з видаленого джерела, наприклад, мережі
Інтернет.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Наступні приклади представлені з метою забезпечити фахівців у даній області техніки повним описом способів реалізації та застосування даного винаходу та не призначені для обмеження рамок того, що автори винаходу вважають своїм винаходом; крім того, автори винаходу не мають намір сказати, що експерименти, описані нижче, являють собою всі виконані експерименти або єдині виконані експерименти. Були початі зусилля для забезпечення точності використовуваних чисельних значень (наприклад, кількостей, температури і так далі), однак варто враховувати можливість деяких експериментальних помилок і відхилень.
Якщо не зазначено інше, частки є масовими частками, молекулярна маса є середньою молекулярною масою, температура наведена в градусах Цельсію ("С), а тиск дорівнює або близький до атмосферного. Використані стандартні скорочення, у тому числі: п.о. - пара основ; т.п.о. 5 тисяч пар основ; пл - піколітр(и); с або сек - секунда(и); хв - хвилина(и); год. - годинаси); АК - амінокислотакци); т.п.о. - тисяч пар основ; нт - нуклеотид(и); нг - нанограм; мкг - мікрограм; мг - міліграм; г - грам; кг - кілограм; дл - децилітр; мкл - мікролітр; мл - мілілітр; л - літр; мкм - мікромолярний; мм - мілімолярний; М - молярний; кда - кілодальтон; в/м - внутрішньом'язово(ий); в/ч - внутрішньочеревинно(ий); п/ш - підшкірно(ий); р/д- два рази на день; ВЕРХ - високоефективна рідинна хроматографія; МТ - маса тіла; Од - одиниця; нс - не є статистично значимим; РО - рівень глюкози у плазмі натще; ЕРІ - рівень інсуліну в плазмі натще; ІТТ - тест переносимості інсуліну; РТТ - тест переносимості пірувату; ОСТТ - пероральний тест переносимості глюкози; 5515 - секреція інсуліну під дією глюкози; РВЗ - фізіологічний розчин з фосфатним буфером; ПЛР «- полімеразна ланцюгова реакція; МНЗАМ- гідроксисукцинімід; ОМЕМ - середовище Ігла, модифіковане за Дульбекко; С - копія геному;
ЕДТА - етилендіамінтетраоцтова кислота.
Матеріали та способи бо Наступні способи та матеріали використані у прикладах, описаних нижче.
Тварини. Самців мишей С57ВІ /6) з аліментарним ожирінням (Те Чдаскзхоп І арогайогу, Бар-
Харбор, штат Мейн) тримали на кормі з високим вмістом жирів (012492, Кезеагс Оівїв5, Іпс.,
Нью-Брансуїк, штат Нью-Джерсі, США), що містить 60 ккалоуо жиру, 20 ккалою білка та 20 ккал вуглеводів протягом 12-20 тижнів. Всі дослідження на тваринах були схвалені комітетом з догляду за тваринами та їх використанням МОМ. Миші БІО С57ВІ /52У являють собою модель ожиріння, аналогічну ожирінню в людини, де ожиріння засноване на споживанні надмірної кількості калорій. Миші С57ВІ/6.) схильні до ожиріння, при якому спостерігається виражене збільшення маси тіла, а також гіперінсулінемія й іноді гіперглікемія. Ця лінія являє собою найбільш часто використовувану лінію мишей для моделювання аліментарного ожиріння. (Міївзоп С., вї а)., Аста Рпнаптасоїодіса 5іпіса (2012) 33: 173-181).
Нуклеотидні й амінокислотні послідовності. Послідовність з обліковим номером СепВапк
ВСО00529.2 являє собою кКДНК ОРС, що кодує варіанти СОРБ15 людини, а послідовність з обліковим номером СепВапк МР 004855.2 являє собою амінокислотну послідовність, що кодує зазначену кКДНК. кКДНК сироваткового альбуміну Ното зарієп5 придбали в Огідепе (52319937), обліковий номер СепеВапк ММ 000477.3, МР 000468).
Елемент Козака та послідовність ІдДК-сигнальний пептид людини (Б'САССАТОВАСАТОАДОСОСТоССсСсОоСстТсАосТостовоестоестастАстота,астоСсаАаата
ССАСАТОТЗ3") (ЗЕО ІЮО МО: 98) вмонтували у вектор ртт5 (Маїйопа! Кезеагсп Соишпсії, Канада) між сайтами Ріте й ЕсоКІ. Хоча обидва зазначені сайти рестрикції були вилучені, для подальшого клонування в рамці зчитування створили сайт Аде. Для створення конструкта пІдк-
СОЕ15 ДНК СОЕ15 ампліфікували за допомогою ПЛР з використанням прямого праймера: 5'-
СТоеСОАООСТОССАСАТОТОСОСОСААСОООбБАССАСТОТССОСТОСОоОО 3" (5ЕО ІЮ МО: 102) і зворотного праймера: ве-сстсалассасСсастТАасСТСАТАТаСАС,СТасаСАатТсСТтт сОасСтТААСАА 3" (ЗЕО І МО: 99) і ПЛР-суміші Заррпіге (СІопіесі). Продукт ПЛР очищали в гелі (набір для виділення з гелю Оіадеп Сеї! Ехігасіоп Кі) та клонували у рТТ5-ПІдЧК (лінеаризовану за допомогою Аде!/Ніпа!пІ) з використанням Іп-Ривіоп (СіІопіесі). Для створення конструкта пПІДдК-
ЛОСА-лінкер-ЗОБ15 ЛСА-лінкер і СЗОБЕ15 окремо ампліфікували за допомогою ПЛР з використанням відповідних праймерів: Після очищення в гелі збирали два ПЛР-фрагменти та лінеаризований вектор рТТ5 за допомогою мастер-мікса для збирання сібзоп Аззетбріу Мазівг
Зо Міх. Клітини Зіейаг або МЕВ 5а, трансформовані за допомогою реакцій Іп-Ривіоп і (ібзоп, відповідно, висіювали на І В-агар, що містить карбеніцилін, і інкубували протягом ночі при 37 о б. Одиночні колонії збирали й аналізували за допомогою секвенування. ДНК позитивних колоній очищали (ДНК-Махі-ргер, Оіадеп), підтверджували за допомогою повного секвенування та використовували для трансфекції клітин ссавців з метою експресії рекомбінантного білка.
Для створення специфічних мутеїнів виконували сайт-специфічний мутагенез (із використанням набору ОцікСпапде Гідніпіпу (АдіїепО) і відповідних праймерів.
Тимчасова експресія. Всі мутеїни ЗОБЕ15 трансфікували в клітини Ехрі 293Е (Іпмігодеп
Согрогайоп, Карлобад, штат Каліфорнія, США). Клітини в робочому порядку пересіювали в середовищі для експресії Ехрі (Іпмігодеп) та підтримували у вигляді суспензійних культур в колбах різного розміру. Як правило, клітини пересіювали при щільності клітин 5е5 життєздатних клітин/мл і вирощували протягом 3-х днів до пересіювання. Колби підтримували у зволоженому
СоО»-інкубаторі при 37 "С і 5 95 рівні СО». Клітини підтримували на шейкерах Мем" Вгип5уУлсК (Мехж/
Вгипоміск Зсіепійіс Сотрапу, Едісон, штат Нью-Джерсі, США) при швидкості перемішування 120 об/хв.
Трансфекцію виконували за досягненням щільності клітин у культурі, рівній 2,5е6 життєздатних клітин/мл при більше ніж 95 95 життєздатності. Як правило, для 50-мл трансфекції інокулювали 2,5е6 клітин/мл Х 50 мл в 250-мл струшувану колбу в об'ємі культури 42,5 мл. 50 мкг плазмідної ДНК, що складається з експресуючого вектора, що містить досліджуваний ген, спочатку розбавляли 2,5 мл відновленого сироваткового середовища ОРТІ-МЕМ (Іпмігодеп). У той самий час реагент для трансфекції експіфектамін (Іпийгодеп) в 2,67-кратному об'ємі (у порівнянні з кількістю плазмідної ДНК) також розбавляли 2,5 мл відновленого сироваткового середовища ОРТІ-МЕМ. Після 5 хвилин інкубування при кімнатній температурі розведений реагент для трансфекції повільно додавали до розведеного плазмідною ДНК для утворення трансфекційних компетентних комплексів. Після 20 хвилин інкубування при кімнатній температурі 5 мл трансфекційних комплексів додавали до 42,5 мл клітинної культури. Потім трансфіковані клітини поміщали у зволожений СОг-інкубатор на орбітальний шейкер із швидкістю перемішування 120 об/хв. Через двадцять чотири години після трансфекції в трансфіковану культуру вносили 250 мкл енхансерного розчину 1 (Іпмйгодеп) і 2,5 мл енхансерного розчину 2 (Іпмйгодеп). Потім культуру знову поміщали у зволожений СО2- 60 інкубатор на орбітальний шейкер. Через 6-7 днів після трансфекції культури збирали центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 30 хв, а потім фільтрували через 0,2-мкм фільтр (МаІдепе). Потім зразки аналізували на предмет експресії в гелі з фарбуванням кумасси.
Стабільна експресія в клітинах СНО. Мутеїни СОЕ15 стабільно експресували в системі 55
Хсева"М з використанням лінії клітин-хазяїнів СНОКІ5М С5-КО, заснованої на добре вивченій системі експресії компанії Гопла для клітин СНОКІ5М. Система 5 Хсеей забезпечує одержання ліній клітин з високим рівнем експресії, придатних для продукції цГІМФ. Система включає клітини-хазяїни СНОКІ5М (35-КО, що накопичують цГМФ, (з5-експресуючі вектори, повні протоколи культивування клітин, трансфекції, селекції та скринінгу ліній клітин і процесів продукції версії 8 (середовища та реакційні суміші). При розробці ліній клітин для мутеїнів
СОрЕ15 дотримувались рекомендацій виробника, спочатку одержавши неклоновані лінії клітин.
Потім неклоновані лінії клітин піддавали клонуванню з обмеженим розведенням для виділення генетично однорідних клонів клітин високим рівнем експресії.
Очищення рекомбінантного білка ЗОРЕ15. Гібриди ЛСА-СОЕ15 очищали від культурального середовища, використовуючи афінне захоплення на блакитній сефарозі або іонообмінне захоплення. В обох випадках гібриди ЛСА-ЗОБ15 елюювали з використанням градієнта відповідної солі/рН, що підходить для оптимального елюювання та відділення від домішок білка клітини-хазяїна. Потім всі гібриди ЛСА-СОРЕ15 очищали з використанням колонки СЕ Неайнсаге зирегадех 200 (26/60) і 1Х РВ5 в якості рухомого буфера. Потім досліджували характеристики та підтверджували послідовність очищених гібридів за допомогою РХ/МС (Адіїепі 6500-5егієв О-
ТОРГ), підтверджували монодисперсність гель-фільтрацією-«ВЕРХ (Адієпі 1200-ВЕРХ) й електрофорезом у ДСН-ПААГ (невідновлюючому і відновлюючому) з фарбуванням кумасси та/або сріблом. Для експериментів іп мімо підтверджували, що вміст ендотоксинів був менше 5
ЕЄ/мг при підшкірній ін'єкції.
Глікозильовані мутетни ЗОЕ15 очищали від культурального середовища за допомогою іонообмінного захоплення. У всіх випадках мутеїни ЗООЕ15 елюювали з використанням градієнта відповідної солі/рН, що підходить для оптимального елюювання та відділення від домішок білка клітини-хазяїна. Потім всі мутетїни СОЕ15 додатково очищали за допомогою СЕ НіТгар РПепуї
НР при рН 8,0 з використанням лінійного градієнта, що знижується, сульфату амонію. Фракції оцінювали та поєднували на підставі чистоти і параметрів глікозилювання за допомогою
Зо зрушення гелю при електрофорезі в ДСН-ПААГ в невідновлюваних умовах. Потім додатково оцінювали характеристики остаточних об'єднаних зразків кожного мутеїну СОР15 і підтверджували послідовність/присутність глікану (ї/- ПНГазу Е, Мо у каталозі МЕВ РО7045) за допомогою РХ/МС (Адієпі 6500-вепйез О-ТОР), підтверджували монодисперсність гель- фільтрацією-ВЕРХ (Адіепі 1200-ВЕРХ) й електрофорезом у ДСН-ПААГ (невідновлюючому і відновлюючому) з фарбуванням кумасси та/або сріблом. Склади всіх мутеїнів БОЕ15 одержували в 10 мМ ацетаті натрію рН 4,0.
Оцінка розчинності мутеїнів ЗОР15 людини. Мутеїни діалізували в 0,01 95 (06/06) мурашину кислоту (рН 2,0) і концентрували за допомогою відцентрових фільтрів Атісоп Ойга Сепігтидаї
Еійег5 з регенерованої нітроцелюлози 10000 ММУМ. (ОЕС901096) у деяких випадках до концентрації більше 10 мг/мл. Початкову концентрацію кожного мутеїну визначали за оптичною щільністю при довжині хвилі 280 нм за законом Бера (коефіцієнт екстинкції - 14400, молекулярна маса - 12287 Да). Потім кожний мутеїн послідовно дворазово розбавляли 0,01 95 мурашиною кислотою, і 90 мкл кожного розведення додавали в 96-ямковий планшет. 10 мкл
Т1ОХ РВ5З (що містить 0,5 М трис, рН 7,0) додавали в кожну ямку і підтверджували, що рН був рівний 7. Після інкубування при кімнатній температурі протягом ночі при струшуванні вимірювали мутність при довжині хвилі 370 нм. Граничне значення, при якому виникала мутність, приймали за максимальну розчинність кожного мутеїну. Мутеїни відносили до однієї з п'яти груп залежно від рівня їх розчинності: « 0,2 мг/мл - ж; 2 0,2 мг/мл - вк; 2 0,5 мг/мл ж вк; 1,0 мг/мл - ж----к; 2» 5,0 мг/мл хх Аж.
Приклад 1: Конструювання стабілізованої гібридної молекули ЛСА-СЯ40Е15
Експресія конструкта МІ виявила проблеми продукції в стабільній лінії клітин СНОКІ5М
СОБКО (фігура 4). У середовищі для культивування клітин відзначали значне укорочування димерної гібридної молекули ЛСА-СЗОЕ15. Укорочені різновиди виділяли за допомогою іонообмінної та/або гідрофобної хроматографії та/"або гель-фільтрації з метою одержання джерела збагачених різновидів для подальшої оцінки характеристик. Після РХ/МС-аналізу на приладі Адіїепі 6500-5егієв О-ТОЕ виявили сайти укорочування на С-кінці ЛСА-гібриду, в лінкері та на М-кінці ЗОЕ15. Виявлено наступні основні різновиди конструкта М1 (лінкер - підкреслений шрифт, СОЕ15 - напівжирний шрифт):
Різновид 1 (ЗЕО ІЮО МО:103):
РАНКЗЕМАНАЕКОЇ аЕЕМЕКАСМ ТАРАОМ ООСРЕЄОНУКІ ММЕМТЕРАКТОМАВЕЗАЕМСОКЬ
ГНТ РаОКІ СТМАТІ ВЕТУСЕМАОССАКОЕРЕВМЕСЕІ ОНКООМРМІ РАІ МАРЕМОММСТАЕЄНОМЕ
ЕТЕРККМІ МЕІАВАНРУЕМАРЕГІЇ ЕЕАКАУКААЕТЕССОААОКААСІІ РКІ ОСОБІ ВОЕСКАЗЗАКОВІ К
САБІ ОКЕСЕВАРКАМАМАВІ БОВЕРКАЕРАЕМУЗКІ МУТОЇ ТКУНТЕССНОаОІ І ЕСАВОВАВІ АКМІСЕ
МОО5ІЗОКІ КЕССЕКРИ ЕКЗНСІАЕМЕМОЕМРАОВІ РОБ ААРЕМЕЗКОУСКММАЕАКОМБІ СМР МЕУ
АВАНРОУБУМЦ ШІ ВІ АКТУЕТТ ЕКССАААОРНЕСТМАКМЕРЕРЕКРІ МЕЕРОМИКОМСЕЇ ГЕО! СЕУК
ЕОМАГ УВУТККУРОУЗТРТІ МЕУЗАМ аКМаЗКОССКНРЕАКАМРСАЕОТМІ ЗУМІ МОЇ СМІ НЕКТРУ
ЗОАМТКОССТЕБІ УМААРСЕЗАГЕМОЕЄТУУРКЕРМАЄЕТЕТЕНАВІСТІ БЕКЕНОЇІККОТАЇ МЕ МКНКРК
АТКЕОЇ КАММОБЕААЕМЕКССКАВОКЕТСЕАЕЕСККІ МА
Різновид 2 (ЗЕО ІЮ МО:104):
РАНКЗЕМАНАЕКОЇ аЕЕМЕКАСМ ТАРАОМ ООСРЕЄОНУКІ ММЕМТЕРАКТОМАВЕЗАЕМСОКЬ
ГНТ РаОКІ СТМАТІ ВЕТУСЕМАОССАКОЕРЕВМЕСНЕІ ОНКООМРМІ РАІ МАРЕМОУМСТАЄНОМЕ
ЕТЕККМІ МЕІАВАНРУЕМАРЕГІЇ ЕЕАКАУКААЕТЕССОААОКААСІІ РКІ СОБІ АРЕСКАБЗЗАКОНІ К
САБІ ОКЕСЕВАРКАМАМАВІ БОВЕРКАЕРАЕМУЗКІ МУТОЇ ТКУНТЕССНОаОІ І ЕСАВОВАВІ АКМІСЕ
МОО5ІЗОКІ КЕССЕКРИ ЕКЗНСІАЕМЕМОЕМРАОВІ РОБ ААРЕМЕЗКОУСКММАЕАКОМБІ СМР МЕУ
АВАНРОУБУМИІ ВІ АКТУЕТТ ЕКССАААОРНЕСТМАКМЕРЕРКРІ МЕЕРОМИКОМСЕЇ ГЕО! СЕУК
ЕОМАГ УВУТККУРОУЗТРТІ МЕУЗА М аКМаЗКОСКНРЕАКАМРСАЕОМІ ЗУМІ МОЇ СМІ НЕКТРУ
ЗОАМТКОССТЕБІ УМААРСЕЗАГЕМОЕЄТУУРКЕРМАЄЕТЕТЕНАВІСТІ БЕКЕНОЇІККОТАЇ МЕ МКНКРК
АТКЕОЇ КАММОБЕААЕМЕКССКАВОКЕТСЕАЕЕСККІ МААБОААЇ С
Різновид З (ЗЕО ІЮ МО:105):
РАНКЗЕМАНАЕКОЇ аЕЕМЕКАСМ ТАРАОМ ООСРЕЄОНУКІ ММЕМТЕРАКТОМАВЕЗАЕМСОКЬ
ГНТ РаОКІ СТМАТІ ВЕТУСЕМАОССАКОЕРЕВМЕСЕІ ОНКООМРМІ РАІ МАРЕМОММСТАЕЄНОМЕ
ЕТЕККМІ МЕІАВАНРУЕМАРЕГІЇ ЕЕАКАУКААЕТЕССОААОКААСІІ РКІ СОБІ АРЕСКАБЗЗАКОНІ К
САБІ ОКЕСЕВАРКАМАМАВІ БОВЕРКАЕРАЕМУЗКІ МУТОЇ ТКУНТЕССНОИбІ І ЕСАВОВАВІ АКМІСЕ
МОО5ІЗОКІ КЕССЕКРИ ЕКЗНСІАЕМЕМОЕМРАОВІ РОБ ААРЕМЕЗКОУСКММАЕАКОМБІ СМР МЕУ
АВАНРОУБУМЦ ШІ ВІ АКТУЕТТ ЕКССАААОРНЕСТМАКМЕРЕРЕКРІ МЕЕРОМИКОМСЕЇ ГЕО! СЕУК
ЕОМАГ УВУТККУРОУЗТРТІ МЕУЗА М аКМаЗКОСКНРЕАКАМРСАЕОМІ ЗУМІ МОЇ СМІ НЕКТРУ
ЗОАМТКОССТЕБІ УМААРСЕЗАГЕМОЕЄТМУРКЕЕМАЄЕТЕТЕНАВІСТІ БЕКЕНОЇІККОТАЇ МЕ УКНКРК
АТКЕОЇ КАММОЮЕРААЕМЕКССКАВОКЕТСЕАЕЕСККІ МААБОААЇ СІ С
Відзначено, що різновид З містить амінокислотну послідовність зрілого людського сироваткового альбуміну й одну (першу) амінокислоту послідовності лінкера. У різновидах 1 і 2 не вистачає восьми останніх амінокислот й однієї останньої амінокислоти на сС-кінці амінокислотної послідовності зрілого людського сироваткового альбуміну.
Різновид 4 (5ЕО ІЮ МО:106):
РАНКЗЕМАНАЕКОЇ аЕЕМЕКАСМ ТАРАОМ ООСРЕЄОНУКІ ММЕМТЕРАКТОМАВЕЗАЕМСОКЬ
ГНТ РаОКІ СТМАТІ ВЕТУСЕМАОССАКОЕРЕВМЕСЕІ ОНКООМРМІ РАІ МАРЕМОММСТАЕЄНОМЕ
ЕТЕККМІ МЕІАВАНРУЕМАРЕГІЇ ЕЕАКАУКААЕТЕССОААОКААСІІ РКІ СОБІ АРЕСКАБЗЗАКОНІ К
САБІ ОКЕСЕВАРКАМАМАВІ БОВЕРКАЕРАЕМУЗКІ МУТОЇ ТКУНТЕССНОаОІ І ЕСАВОВАВІ АКМІСЕ
МОО5ІЗОКІ КЕССЕКРИ ЕКЗНСІАЕМЕМОЕМРАВІ РО ААРЕМЕЗКОУСКММАЕАКОМРІ СМР МЕМ
АВАНРОУБУМЦ ШІ ВІ АКТУЕТТ ЕКССАААОРНЕСТМАКМЕРЕРЕКРІ МЕЕРОМИКОМСЕЇ ГЕО! СЕУК
ЕОМАГ УВУТККУРОУЗТРТІ МЕУЗА М аКМаЗКОСКНРЕАКАМРСАЕОМІ ЗУМІ МОЇ СМІ НЕКТРУ
ЗОАМТКОССТЕБІ УМААРСЕЗАГЕМОЕЄТУУРКЕРМАЄЕТЕТЕНАВІСТІ БЕКЕНОЇІККОТАЇ МЕ МКНКРК
АТКЕОЇ КАММОБЕААЕМЕКССКАВОКЕТСЕАЕЕСККІ МААБОАА Сі аа ссЗасаваЗасаИасеАН
Різновид 5 (ЗЕО ІЮ МО:107):
РАНКЗЕМАНАЕКОЇ аЕЕМЕКАСМ ТАРАОМ ООСРЕЄОНУКІ ММЕМТЕРАКТОМАВЕЗАЕМСОКЬ
ГНТ РаОКІ СТМАТІ ВЕТУСЕМАОССАКОЕРЕВМЕСЕІ ОНКООМРМІ РАІ МАРЕМОММСТАЕЄНОМЕ
ЕТЕККМІ МЕІАВАНРУЕМАРЕГІЇ ЕЕАКАУКААЕТЕССОААОКААСІІ РКІ СОБІ АРЕСКАБЗЗАКОНІ К
САБІ ОКЕСЕВАРКАМАМАВІ БОВЕРКАЕРАЕМУЗКІ МУТОЇ ТКУНТЕССНОаОІ І ЕСАВОВАВІ АКМІСЕ
МОО5ІЗОКІ КЕССЕКРИ ЕКЗНСІАЕМЕМОЕМРАОВІ РОБ ААРЕМЕЗКОУСКММАЕАКОМБІ СМР МЕУ
АВАНРОУБУМЦ ШІ ВІ АКТУЕТТ ЕКССАААОРНЕСТМАКМЕРЕРЕКРІ МЕЕРОМИКОМСЕЇ ГЕО! СЕУК
ЕОМАГ УВУТККУРОУЗТРТІ МЕУЗАМ аКМаЗКОСКНРЕАКАМРСАЕОМІ ЗУМІ МОЇ СМІ НЕКТРУ
ЗОАМТКОССТЕБІ УМААРСЕЗАГЕМОЕЄТУУРКЕРМАЄЕТЕТЕНАВІСТІ БЕКЕНОЇІККОТАЇ МЕ МКНКРК
АТКЕОЇ КАММОБЕААЕМЕКССКАВОКЕТСЕАЕЕСККІ ХААБОАА а ссСОааЗаа,аасааСаСсавАВМ
Для мінімізації та виправлення проблем з укорочуванням поблизу лінкерної області гібридної молекули конструкт М2 зробили еквівалентним конструкту М', хоча він був укорочений на перші три М-кінцевих залишки ЗОРЕ15 (ДАКМ або АМ3) (фігура 3). Отриманий стабілізований конструкт М2 при експресії в стабільній лінії клітин СНОКІ5М О5КО0 демонстрував мінімальні проблеми з укорочуванням, що спостерігалися для МІ, при порівнянні кондиціонованих середовищ для кожного експресованого конструкта. На фігурі 4 продемонстроване значне укорочування, що спостерігалося для МІ, і стабільність конструкта
М2.
На підставі поліпшеної стабільності, спостережуваної для конструкта М2, подальше проектування дозволило визначити оптимальну довжину лінкера та можливість укорочування. Лінкери оптимізованої довжини |(545)|: одержали та приєднали до М-кінцевих делецій З залишків (М3 - ДАКМ або ДАМ). ) або 6 залишків (М4 - ДАЕМСООН або АМІ ) (див. фігуру 5).
Приклад 2: Вплив стабільності поліпшених гібридних молекул ЛСА-СОРГ15 на масу тіла та прийом їжі в моделі БІО миші
Вплив підшкірного введення гібридної молекули, що містить рекомбінантний ЛеСА, об'єднаний з рекомбінантним СОЕ15 людини, на масу тіла та прийом їжі оцінювали протягом 7 днів. Коротко, гібридні білки МІ (фігура 3), М3 ї М4 (фігура 5) вводили в дозах 4 нмоль/кг, 12 нмоль/кг і 40 нмоль/кг у вигляді однократної підшкірної болюсної ін'єкції (10 мл/кг) ОІО-мишам масою приблизно 38-40 г. Через 24 години та 7 днів після введення контрольного середовища- носія або гібридних білків виконували моніторинг маси тіла та прийому їжі з метою моніторингу ефективності. Результати, отримані для ОІО-мишей, що одержали дозу 40 нмоль/кг, представлені на фігурах 6 і 7.
Як показано на фігурі 6, введення гібридних білків у дозі 40 нмоль/кг (4 нмоль/кг і 12 нмоль/кг не показані) призвело до значного поліпшення з погляду зниження споживання їжі. У кожній групі мишей (п-8) значення р С. р 0,057 рак 0015, р « 0,001, нз - не значиме) визначали за допомогою Т-критерію Стьюдента для незалежних вибірок при порівнянні споживання їжі при одержанні різних концентрацій з контрольною групою, що одержувала носій, у кожний зазначений момент часу.
На фігурі б показано, що введення гібридних білків у порівнянні з контрольним середовищем-носієм через 24 години (1 день) призвело до зниження споживання їжі (середовище-носій - 2,8 г /-0,13 гр.): група, що одержувала 4 нмоль/кг (М1-1,9 г ж/-0,25 гр., 77;
М3-1,8 г /-0,18 г, и М4-1,8 г /-0,10 г, "У, група, що одержувала 12 нмоль/кг (М1-1,5 г /-0,19 г, М3-1,9 г /-0,16 г, Є М4-1,7 г /-0,12 г, У), ії група, що одержувала 40 нмоль/кг (М1-1,3 г /-0,11 г, и М3-1,8 г /-0,06 г, и М4-1,5 г я/- 0,15 г, "У. Введення гібридних молекул у порівнянні з контрольним середовищем-носієм через 7 днів призвело до зниження споживання
Зо їжі (середовище-носій - 2,7 г /- 0,09 г): група, що одержувала 4 нмоль/кг (М1-2,0 ж/-0,18 г, 77;
М3-2,5 г /-0,08 г, нз; М4-2,5 г /-0,09 г, нз), група, що одержувала 12 нмоль/кг (М1-2,0 г /-0,20 г, М3-2,2 г /-0,17 г, "7; М4-2,4 г /-0,28 г, нз) і група, що одержувала 40 нмоль/кг (М1-1,7 г ж/- 0,14 г, М3-2,4 г /-0,25 г, нз; М4-2,2 г /-0,24 г, нз).
Як показано на фігурі 7, введення гібридних молекул у дозі 40 нмоль/кг (4 нмоль/кг і 12 нмоль/кг не показані) призвело до значного зниження маси тіла. У кожній групі мишей (п-8) значення р (, р«0,05;5 и, р«0,01; и, р«0,001, нз - не значиме) визначали за допомогою Т- критерію Стьюдента для незалежних вибірок при порівнянні споживання їжі при одержанні різних концентрацій з контрольною групою, що одержувала носій, у кожний зазначений момент часу.
На фігурі 7 показано, що під час обробки (день - 0) до введення гібридних білків або контрольного середовища-носія були зареєстровані наступні значення маси тіла (середовище- носій -39,0 г /-0,92 г): група, що одержувала 4 нмоль/кг (М1-39,2 г /-0,66 г; М3-39,4 г /-0,91 г;
М4-39,3 г /-0,77 г), група, що одержувала 12 нмоль/кг (М1-39,4 г /-0,78 г; М3-39,3 г /-1,09 г;
М4-39,3 г /-0,81 г), і група, що одержувала 40 нмоль/кг (М1-39,2 г /-0,64 г; М3-39,2 г /-0,68 г;
М4-38,9 г /-0,60 г). Через 24 години (день -1) після введення гібридних молекул і контрольного середовища-носія зареєстрували наступні значення маси тіла (95 зниження - дельта (різниця) у порівнянні з масою тіла в групі до введення дози). Середовище-носій - 0,3 г /-0,11 г, 0,6 Об), група, що одержувала 4 нмоль/кг (М1 --0,6 г /-0,21 г, -1,5 96, 7; М3 --0,6 г /-0,17 г, -1,6 95, 77;
МА --0,9 г /-0,13 г, -2,4 95, 7), група, що одержувала 12 нмоль/кг (М1 - -0,9 г я/-0,11 г, -2,3 Фо,
М - -0,7 г /-0,18 г, -1,6 96, 77 МА - -0,6 г /-0,16 г, -1,7 96, У), ї група, що одержувала 40 нмоль/кг (МІ --1,0 г /-0,14 г, -2,5 96, 77 М3 --0,6 г /-0,09 г, -1,5 96, 7 МА --0,8 г /-0,22 г, - 2,1 95, 3. Через 7 днів після введення гібридних молекул і контрольного середовища-носія зареєстрували наступні значення маси тіла (96 зниження - дельта (різниця) у порівнянні з масою тіла в групі до введення дози). Середовище-носій --1,2 г /-0,25 г, 3,1 95), група, що одержувала 4 нмоль/кг (М1 --1,3 г /-0,30 г, -3,93 Зв, 77 М --1,1 г /-0,32 г, -2,8 96, 77; Ма --2,0 г -/-0,29 г, -5,0 96, 77, група, що одержувала 12 нмоль/кг (М1 --1,8 г /-0,34 г, -4,7 96, 77 М3 --1,4 го/-0,43 г, -3,6 96, 77 МА --1,5 г /-0,32 г, -3,7 90, 7, і група, що одержувала 40 нмоль/кг (М1 -- 2,6 г /-0,28 г, -6,7 Ув, 777 МЗ --2,1 г /-0,28 г, -5,4 Фо, 777 Ма --2,6 г /- 0,31 г, -6,7 дю, 77.
Дані на фігурах б і 7 показують, що гібриди ЛСА з оптимізованим лінкером і ЗОЕ15, укороченим за М-кінцем, є активними, і що такі гібридні молекули являють собою життєздатний підхід для підвищення певних вигідних властивостей молекул СОЕ15.
Приклад 3: Мутеїни ООЕ15 людини з поліпшеними фізичними властивостями
Дані, викладені у прикладі 3, спрямовані на усунення обмежень розчинності, пов'язані з гідрофобністю та гідрофільністю поверхні, властиву зрілому СООЕ15 людини. Крім того, виконана оцінка впливу введення консенсусного(их) сайту(ів) М-зв'язаного глікозилювання у послідовність зрілого ЗОЕ15 людини на розчинність. Для полегшення оцінки характеристик експресії; параметрів глікозилювання та розчинності зрілих рекомбінантних мутеїнів ЗОБЕ15 людини, всі мутеїни сконструювали у вигляді зрілих мутеїнів, об'єднаних з послідовністю сигнального пептиду ІДК, зображених на фігурі ВА. Одержали 17 мутеїнів ООЕ15 (позначені як М5-М21; 5ЕО
ІО МО: 81-97, відповідно). Для М16 одержали варіант із М-кінцевою делецією: мутеїн ЛМ3-М16, і виконали оцінку його розчинності. Мутеїн М5 містив два консенсусних сайти М-зв'язаного глікозилювання, впроваджені шляхом заміни О у положенні 5 в ЗОЕ15 дт (5ЕО ІЮ МО: 1) на Ті заміни К у положенні 21 БОЕ15 дт (ЗЕБО ІЮ МО: 1) на М. У мутеїни Мб-М21 ввели один консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання (див. фігуру 8А). Слід зазначити, що, хоча мутеїни містять сигнальну послідовність ІЯК на М-кінці з метою вказівки положення заміни, залишки нумерують відповідно до положення відповідного залишку в 5ЕО ІО МО: 1. Так, наприклад, хоча Т присутній у мутеїні М5 у положенні 27, його вважають положенням 5, оскільки положення відповідного залишку О в ЗЕО ІО МО: 1 відповідає 5.
Оцінку розчинності виконували стосовно мутеїнів (в 0,01 95 мурашиній кислоті), додаючи 10Х
РВЗ 0,5 М трис рН 7,0, твердий буфер, у якому можна виконати оцінку поліпшення розчинності мутеїну в порівнянні зі зрілим ЗОЕ15 людини.
Оцінку розчинності виконували на підставі оптичної щільності при довжині хвилі 280 нм за законом Бера, розраховуючи її з використанням коефіцієнта екстинкції (зрілий ООЕ15 людини - 14400/мономер) і молекулярної маси (зрілий ООЕ15 людини - 12278 Да/мономер).
Перед оцінкою розчинності кожний з сконструйованих М-глікозильованих мутеїнів на фігурі 8А та мутеїн АМ3-М16 оцінювали на предмет секреції у вигляді укладеного гомодимера СОРЕ15 в середовище для тканинних культур ссавців і на зайнятість сайту М-гліканом. Як зазначено на
Зо фігурі 9, чотирнадцять з вісімнадцяти глікозильованих мутеїнів секретувались у вигляді укладених гомодимерів ЗОЕ15, у той час як М8, М10, М14 ії М15 не утворювали димерів й експресувались у вигляді агрегатів. Потім всі чотирнадцять експресованих глікозильованих мутеїнів, що секретувались у вигляді гомодимерів, оцінювали за допомогою РХ/МС, і зрушення гелю при електрофорезі в ДСН-ПААГ з метою визначення присутності М-гліканових груп у консенсусному сайті після очищення від кондиціонованого середовища. У всіх 14 випадках експресовані мутеїни характеризувалися високим ступенем зайнятості, і даний субнабір аналізували на предмет поліпшення фізичних властивостей, наприклад, розчинності.
Сконструйовані М-глікозильовані мутеїни СОРЕ15, що секретувались у вигляді гомодимерів і мали високий ступінь зайнятості консенсусного сайту гліканом, піддавали моніторингу на предмет поліпшення розчинності у порівнянні із зрілим СОЕ15 людини. Граничне значення, при якому виникала мутність, приймали за максимальну розчинність кожного мутеїну. Мутеїни відносили до однієї з п'яти груп залежно від рівня їх розчинності: « 0,2 мг/мл -ж; 20,2 мг/мл жк; 20,5 мг/мл ж; 21,0 мг/мл шк; 25,0 мг/мл -ж--- Кожний з М-глікозильованих мутеїнів
СОРЕ15, що піддавалися оцінці, демонстрував поліпшену розчинність у порівнянні із зрілим
СОЕ15 людини: М5: ж, М: ж--, М11: --, М12: --, М13: ж--- М16: ---н--я, АМ3-М16: яан-я-я, М17: я-------, М20: з---, М21: з--к.
Приклад 4: Вплив мутеїнів М16, АМ3-М16 і М17 на споживання їжі в моделі 0ІО миші
Оцінювали вплив підшкірно введених глікомутеїнів на споживання їжі. Глікомутеїн М16 (ЗЕО
ІЮО МО: 92) і М17 (ЗЕО ІЮ МО: 93) описані вище у прикладі 3. Крім того, виконали оцінку глікомутеїну, позначеного як ДАМ3-М16. Послідовність глікомутетну АМ3-М16 представлена нижче: татгурадіаШмгдагтаОНоСРІ ЧаСРЕВССВІ НТУВАБІ ЕС! СУАОМ/МІ БРАЕМОМТМСІСАСРБЗО
ЕВААММНАОІКТ5ОІ НВ КРОТУРАРССУРАБУМРМУ ОМ Там ОТО АКОСНСІ (5ЕО І
МО: 100)
Слід зазначити, що поліпептиди, які вводять мишам, не містили сигнальної послідовності ДК (татгмрадідіШуУлидагс, ЗЕО ІО МО: 101), оскільки сигнальна послідовність ІДК відщеплялася від секретованого поліпептиду сигнальною пептидазою, експресованою клітинами (клітинами 293).
На фігурі 10 показано, що підшкірне введення однократної дози 1,0 мг/кг (40 нмоль/кг) середовища-носія (РВ5), зрілого СОРЕ15 людини або М-глікозильованого мутеїну здійснювали бо 17-тижневим самцям СІО мишей (п-:9). Виконували моніторинг споживання їжі (грам/тварина)
протягом 24 годин після підшкірного введення. Значення р визначали за допомогою Т-критерію
Стьюдента для незалежних вибірок у порівнянні з групою, що одержувала середовище-носій (РВ5).
Як показано на фігурі 10, введення глікомутеїнів призвело до зниження споживання їжі. У кожній групі мишей значення р (", р«0,05; их, р«0,01; и, р«е0,001) визначали за допомогою Т- критерію Стьюдента для незалежних вибірок при порівнянні споживання їжі з контрольною групою, що одержувала середовище-носій. ЗОЕ15 дикого типу також знижував споживання їжі.
Приклад 5: Вплив мутеїнів М16, АМ3-М16 і М17 на масу тіла в моделі СІО миші
Оцінювали вплив підшкірно введених глікомутеїнів на масу тіла. Підшкірне введення однократної дози 1,0 мг/кг (40 нмоль/кг) середовища-носія (РВ5), зрілого ЗОЕ15 людини або М- глікозильованого мутеїну (М16, М17 ії АМ3-М16) здійснювали 17-тижневим самцям 0ІО мишей (п-9). Виконували моніторинг маси тіла протягом 24 годин після підшкірного введення.
Значення р визначали за допомогою Т-критерію Стьюдента для незалежних вибірок у порівнянні з групою, що одержувала середовище-носій (РВ5Б).
Введення глікомутеїнів призвело до зниження маси тіла (фігура 11). У кожній групі мишей значення р (, р«е0,05;5 7, р«е0,01; и, р«0,001) визначали за допомогою Т-критерію Стьюдента для незалежних вибірок при порівнянні споживання їжі з контрольною групою, що одержувала середовище-носій. ЗОЕ15 дикого типу також знижував масу тіла.
У даному документі описані конкретні варіанти реалізації даного винаходу, включаючи найкращі способи його здійснення, відомі авторам. При читанні вищенаведеного опису для осіб, що працюють в даній області техніко, можуть стати очевидні зміни описаних варіантів реалізації, і очікується, що досвідчені фахівці можуть при необхідності використовувати такі зміни. Відповідно, передбачається, що на практиці винахід буде використаний інакше, ніж описано у даному документі, і що даний винахід включає всі модифікації та еквіваленти предмета винаходу, викладені у формулі винаходу, прикладеної до даного документа відповідно до діючого законодавства. Крім того, будь-яка комбінація вищеописаних елементів у всіх їх можливих варіантах охоплюється винаходом, якщо інше не зазначено у даному документі, або іншим способом явно не суперечить контексту.
Всі публікації, патентні заявки, облікові номери та інші джерела, згадані в даному описі, включені у даний документ за допомогою посилань для всіх цілей, як якби кожна окрема публікація, патент або патентна заявка були спеціально й окремо включені за допомогою посилання.
ПЕВЕНІХ ПОСВІДСОВНОСТЕЙ
«Що» Мом віорнаттасеміісзів. їпе.
Кіпбновж, Овгтія А наїйвикаг, Ка)
Тідя, Ну «ЛО» КОМПОЗИЦІЇ тА СПОСОБИ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВаОННЯ МЕТАБОЛІЧНИХ РОЗЛАДІВ «1505 вМома-13550 «50» у5 Б2/О Т.О «ї5ї1х 2038-05-30 «іо» 187 «150» вБдтевтІв версія 3,5 «0» 1 «тії 315 «832» вВТ І «13» Нощто 5арівпе «Юа 1 аій ага дк біу Ар Ні Суя бго зво б3іу Рго біУ Ага Сук що Ага 3 5 15 1 йан нів тк Ома! Ага Ав баб їв ої» Абрам боіу тгр о Аїа АБИ Тгв за чаї фев его рго Аго бій уді бій узі тт Має Кух Тів Б1у Аїд Суб рго ет? бів Ре АгО Аа Аді Авп мет нів дів бій Ї1е ух ТАК обеє 5о 55 50 зуео нія аг іо фу рРго Або о тТнг Уаі Ро лід Бо Сув бух мат вго
БЕ 70 75 хо дів Баг тук ал вгО Мет маі зву Хе зів вух тнК Абе ТВ біх ма ав без бій Тнг Тук АБ АЗр Кен ви Ав вуз Азо суб Ні Сух 216 100 м мо «аійх» «3із У «ах ВЕЖ «813 щтучниа послідовність «аа» «ЯЯЇ» синтетична поліпейтидна послідовність «НКЮ» 7 із Ага ахп сіу ТВге нів Сух го сво біу вк Б1у Ага Суб Суб Аг 1 5 ів 5 мец ніх Тйг о УаЇ деп Аа бег ім бір Азр овен бу тгр АТ Ахротге 20 5 БІВ
Уві се баг вро агу бів ма! бій ма? тйгомет Сух хів віу АЇЗ су
35 40 45
Рг Бег бій Не аАго АТ А Ахп мет ні Аїа бій 318 вух ТВгобаг 55 БО іви Ні5 Ага їев ух го АБрОтТВг Уві Бго дія Рго Сув Сує маї Вго 65 70 їв йо аа бБег ТУуг аЕМи йго Меї Уа! івци Зі біп уз Тйг Ар ТВгосіу Уві вх за 85
Заг ів Фів ВГ тує ар Ахр ін ів діз бу Ах Су Ні Сух Хв 100 но ЦО «ех З «гії» 313 «а» КВТ й І «її» Штучна послідовність «ЕЙ «23» смитетизна поліпептидна послідовність «ЗО» 3
АЇВ аго Ахп о біу АБО ніх Су рго іви 01у Бго біу аг Суб Суб Ап і 5 30 15
Бен тк твВг Уа! Аг Аа бег бен бів Аб5в фе бім тгв АЇа Ар отр» за
Уаї фей баг о Бго Аго біц узі сій уді Тр веб Сух 116 Б1У Аа Су зо 45
Бго баг бій вне Аго Аа Аіз аби мет Мія Аїв біп Хі уз ТВг ЗВ 5 55 во із нів Ага ви рух Рго Ар ОТГ УВІ Рго дів бго Сух Суб маі его 05 7о 75 во
Аж бЗег Туг дай го Мех Уа іез хів бів бу5 ТВг ар о ТВг Є1у уд! 85 За ЗЕ ваг ізо зійб Ту Туг дзр Аз ви ів віз БУу5 АВ Суз Ні Су 11е 100 105 що «ВО» 4 «іі 1 «Віа» ВАТ й «ії» штучна послідовність «220х «3» синтетична лоліпейтидиа послідовність «Не я
Аа АгО Авп Біу А5роніх Сух кго збем оУіу кго сіу Ага сСуз суз го 1 5 18 15 їво нів ТвВгоУаї АКО Аза Ав грец ТК о АБроіен Біу Тер оаів аю ттгр
20 ях8 30
Ущі їіеци бег Рго Ага бі Уді бій уді таг омеї Суб та БІУу Аза сух за 45
Бго хегобійп Ре Агу Аіз Аїа деп меї ніх Аїа бів Хі фу ТВг ек 50 55 Ба їви Міз Агд ів фує Рго ахр о ТВгоУді вго АТа Рго Суб Суб Уві ро 55 79 75 во аіз Баг туг ази бго меї маі ер Її бів уз ТВР о Ахр ок сім ха 85 що 95 зекоіен сій ТНгоТук Ах аАБор іец івн Ав ух АхроСуб ні Сх їїв мо 305 31о «2302 5 «іх 115 «іб» РЕК й «233» Втучна послідовність «2» . ше «йЕЯх синтетична поліпептидна послідовність «Нюх 5
А1Б Ага АхВ сіу абр нНіжх Су вго ів біу вга бБіу Ага Сух сує Ага 3 5 10 15 зви Мі ТВР УЗ! АгГО АТа бек оаха бів ТВгоїви Ту Ттр о АїВ Аво тгр 75 ЗО
Уаї фе) как о вко Ага бій ха! бів уз! тТнг о Мех Суб Хі бу АТа сСух 80 45 вго бек сій РВе Агу Аа АЗа Ап Мет ні Аїа сів Зі Бу5 ТВг хеє бо ів. Мі Ага іен о збух рго Ар отТВг Уа Рго дій вго суз Сук уді ве 55 75 5 ка
Аїа Зег Тук Аж Рго Меї чаї бен тів віп вуз ТВг оазв Тнг о біу Уді 85 За ЗЕ его бен бів ТйгоТук А5р о аАврогцен оз Ав був Азрв о Сув Ні5 Сув Т16 100 105 ії «М» 6 «Ії 1 «Еій» ВКЕТ «Кі» штучна послідовність «ай «ЙЯ3» синтетична поліпейтидна послідовність «НО» 5
Аїа Ага деп БІУ АхроМНіб Су Рго ів біу Рго 51У Аг Су Суб АгГд ке нів Твг оуді АгО Аа его ден бід Авр бен біу Тгр АВ Ар ОТеВ а 25 хо маї ев авг вго Аго біб У! бій чаї тТйгоМеї Сух Хв с1у дів сСує 35 «о 45
Бго ахп бів ТВе Аго АЇв А АБАа мес Ні Аїв бів Хе ух ТВг дет
Бо їж Ні5 агБ цеч губ бго АЗрОїйг Маї Рго дій Рго Суб Сух уві ого 5 20 75 а
Аїв Заг тук Аби го меї Узі їжу їїе сій буб5 Тк о Ахр Тв біт мі 5 во 95 аг Бен бі ТВе отТуг АзроаАжхр ем івц А уз дер сСух Ні Су5 Ї18
Мю 105 130 «83» 7 «ях 1 «122 РЕ й І «йіЗУ Штучна послідовність кЕох «Ва3» синтетечна повіпелтидма песлідовність «300 2
Аіа аго йвп Фу Ахроніх Суз бго бен бОіу Рго Бі АгЯ сСух сує Ага 3 5 1 1 ім нія тВг маі Аго АТяа бЗегомву Біб Ар овен біу Тр о АТВ Або Тер 28 25 30
Уаі сви бек орго аг іо маі сій уз) тйк омеє сух 118 щу із сух 3 45 45 вго бер АБ КВе Уйг АВ АВ АХА Мет Ні АТа сій Хв губ ТНК жег в 55 Бо рем ніх ака Бей вух Рго АБИ о Тйг оМмаі Рго АЇа рго був Суз уді го ге 70 75 80
АТЯ бек Туг дп го Мет маї їши Хі бій куб ТАК АБО ТР Об уУ УЖ 855 оо 35
Заг гей бів тВг отТуг Ахроазр ен оіву Аза ву» азр сук ні Суб ХЇ6 зо ще їю «2305 В «2іїх ЗМ «й3Зйз ВЕЖ «213 штучна вослідовність «Кай» «Ф8ї» смнтетична поліпептидна послідовність
«МЮх В
АТа Аг аби Сіу АБО МНіз Сух РО ів0 Б1у его Біу Ага Ку СУ Аго 1 5 10 15 рем нія тВг ом3і Ага А1а хек БВ в ажхр ів біж ТИ ща дев їта
В х5 г:
УЗ ее бег РКО Ага бів уаї бій Ууаі їйг мет сСух Зі біу дія Суй 48 45
Рга бек бів Ал Аго ТНК АВ Аби Меї Ні дів бій Т1е ух ТВг Заг що ви Ні Аг фрез Гуз Бго Або о ТвгоУді Бго АЇв Рго Кух Су УаР бга 55 7 75 йо
Аїв Бек Туг Ажа Рго меї уві ев хів бій ух ТТГ Авр тв оіу уд! 85 За 95 аг іец Бі Їй Тук АЗр ав рев ям Аїд фу ахр Сух Мія Суз 11: 00 135 То «ащ В «каії» 312 «бій» ЕТ . «й13» штучна лослідовнікть «йїЇх синтетична поліпейтидна послідовність «дах В вів ага Ахп щу ги нів бух вго ев У го Ту ак Су Суз Аг і х о їх ви і ве Уа! Ага Аіз хег ви сів ар ви віу тго дів Аз Тгв
Уаї ів зви Рго Ага Бін Узі вій уві Те мех Сух іє біу аїз су 35 «й 45
Ро хег бій Ре Ачп АЇа Те АЗп Мех міх дів Ффіа 316 фуб ТВг оЯег 5о 55 БО іч Ніж АгО ів фу Рго Азр їйг Уаі бго дів Рго бух Сух уд 2го 65 7 75 ва
Аїв бег туг ав вго мех мві мер хів Фі мує Тйг Або тйг оіу Уді 85 що з5
БЕК біо бів ТВгоТуг Ахр Ар івц зво аїз бує дер Сух Ні Су5 хів 100 цк іЮю «30 1 «ії 312 «ій» Кт
«Ріїх штучна посвідовність «ККД» й , , «ОЗ» синтетична поліпептидна послідовність «Не 10
Аїв Ага аха Оу дв ні Сух Вго івь віу вго Біу Аго Суб Суб Ага 1 5 10 15 іец ніх Тк Уві ага аїз бег іши бів дар ва біу Тгродіз АБО тгр
Узі із баг йо Ага бій заї бій маі Тк мет Суз Ї1в5 бБіу А1а сух 30 45
Рго бег бій ке Ага АЇЗ АЇВЗ АБАа Мех мів АЇз Бія ів ух ТР Ах
КТ 55 50 ен ТВгОАгО ем огух РРО АБрОТВг уд) РКО із Бго Су Суб уві Рго 55 70 75 хо
Аїа бек тТук аз вго Мех Узі без Х1в бій куб ТВг о абр Тиг о біу уві 85 0 95
Бег сам бів ТВг о тТук Авр Ахроіви ів АЇв вує АБО Су нів Суб 11е що 305 мо «Ох М хиїїх 332 «К3й» ВАТ «213» штучна послідовність «их , й Й «223» синтетична лоліпептидна послідовність «я 1 діз Аго Ахв біу Ар Ні Суб Рго ке біу Вго оіу аго Су5 Суб Ага ї 5 18 15 іво Ні ТВгОУд! АгРО Аа Бак обец бів азр цем су Тгр дія Ав го 20 25 КІН
УВі ви его Рг Аго бів узі бів Уві тТВгомеж Сух хів оіу від Су їв ча 45 тго бек бій бйж Ага АТа дій дза мек о ніє Аїд сій Ті цу ТВ 5ег
Ба ап ніх ТНгосео гух вго АхротВг Уві Рго Аїа рео Сух Суб Уа! рго 55 70 75 ко
АЇв жег Туг ах РгО Меє ма) іви хіе бій ух ТйР о Ахе ТВР су М 85 БІВ З хек ми бій тТйг оТуг Ар оабБрігн зву АЇа фу Ар Су» Міз Суб їЇїв
Мо 105 1
«каш «і» 315 «Ф1йх Ву , «213» штучна послідовність
СУД й . й «ле3У кУинтатична полійенптидня послідовність «400х 15 дій Ага аби біу а5р Ні Су го сви Біу го Бі Аго Суб сСух АГО 3 У 13 15 зви нії ТВг УЗ Ага АТа бег іо сій Ахр їв Біу Ткр Аа Авротго хо 25 за ма)! іє) бек вгОо аг бін узі бій Уві ТВгомех сує Хв сіу аа суб 35 я 45
Рго хег сів Рпе Ага Аїя Аа Аза Меї мі5 АЇа біп Х)в ух Тйг Бек 50 55 що іє Ні5 агЕ цви ух йго АБротТНг ота го дій го Су Сух Уді Рго 55 70 75 о діа деп Тук ТВГ Рго Мет уві івц Ті бій вуз ТВт дев ТВг біу Уді 85 до 95 баг іа біп тк ТУг АХ АБросви бен АТа вух ахр сСух Ні Сух Її: 100 305 Мо «міх 13 «иіїх «312» РВУ , й «?1їх Втучна послідовність «220 І «ийїх ««нтатична паліпептидна послідовність «Нюх 3
Аій Ага деп Біу др оНі5 Суз Рго ви біу го піу Ако Сух сСух Агу 1 5 10 не зуже Мі тт ха! аго АЇа бег ву з АБвовеи бу тгр вів Ав То чаї жо бек вгРО Аг бі) уві бій Уві тТве Бет сСуз хів Біу дів Суб
К 30 45
Бго Зеє бій БВєЄ Аго АТ Аїа Аби Мех ніх Аза сій її ув ТНг 5ег що 55 що івз ніх Ага Мем вух РГО Аво тТВгоУуВі Рго Аа Рго Суз сСух уд! Рго
Б 70 75 о дід бєг тТуг АЗпОоВгО Меї чаї іо тів Бій Аби їйР Ота ТВРобіу ма 950 95 квгоцев біп т тує Ахр ар іен зву Аїд вух АБросух ні Су Тв цю 155 То «й» 18 «тії «кйід» РЕТ | І «еі3» штучма послідовність «ай» й ; ; «03» ємнтЕтична поліпептидна послідовність «с» 15 із Ага Ахп о піу Ар оНів Суб Рго бен біу Рго біу Аг СУБ Суб Ага 1 5 ів 15 мем нів тВг Ууаі Ага Аїа бег сем бір дер ги біу Тгр АЇВ дю ОтТРиВ я 30
Узі зМецу бек его Аго біз Ууаї бій Уа! ТВг мех Суз У1в Ту Аїд Суб вго Заг бів рве Ага Аїз аїв Ап оМмеє нНіє дій бій їв фу5 ТВгоЗет
КУ) 55 БО і5и Ніє аг іев (ух Ро Ар оте маї Рго іа РК Сух Сук УДВ вго 65 70 75 що
Аїда 5ег тТуг Ап рРго Меж Уаї ів лів бій Бу5 ТК Аа ве тТВе уд 85 о 95 ек ів сів ТВг о Тук Абр о Ахроівец ів Ав вух Ар осух нів сух 112 що 155 чо «230» 35 «Ії 1 хаійх ВТ й «21ї» штучна послідовність хегох «ді» сунтетична поліпейтидна послідовність «00» 15 діа Ага Аз сік АБр ОНіх Суб віч іви біу бго бік Ага Сув Суб Ага 1 5 10 15 ви ні Ткг узі Ага АЇз бег мец бів А5роіев біу тТеВ АїВ АБО гр 23 25 30
Узі сви его вго АгО Є» уаї бі» Уаї Тк мес Сух хів Біу Аїя Су 35 30 45
Бго авг бів рРВе Ага АЇв лів Ап мех нів дія біп їі рух ТВг Зав о ци Ні АгО вец губ Рго АБИ ТНг оУаї Бго Аза вго Суб бує Уаї рго 55 70 75 що
«їз щас Туг Ахп вго Мет ма! сен їв бій уз ТНг АБО АБ біу ТК 85 жа 95
Бег зви бів Тийг Туг Ав аеро їви вен АЇВ вух Ар ОСув мів Сук З1е що ще о «М» 15 «Її» 315 кам» РЕК І й «33: штучна послідовність ках І Й І «Й23» синтетична поліпентидна послідовність «їв віз ага Аха бі вхр Ні Суб Рго ви біу Рго 61У Ага Суб сСух Аго 1 5 18 5 імез ніх ТНг Уа) Аго Аа бег ів сій АХр ев Фу Тер АТВ дер Кр 20 т 30
Уві вецй бег вго Ага біз ма)і бів хаї тб Мет Суб хів біу дів Су я 40 45 го бек бій вне Агй ліз Аїд АЗп мет Ні АЇВ біп Хе вуз ТВг охетг 50 55 що іев ніх Ага фец мух го аБроїйк Узі рго дії вго Суб сухо уві Рго 55 70 75 ЩО
Аа баг Тут А5п Бго меж уді цЕз 318 бій Куб тВг АХО ТВк Оіу АБ о 95
Бек те оів тТВгР тТук азр дхр ви ге) лій вуб Ар су» Нів суб хів 306 105 о «8105 17 «Віїх 315 «аії» РКЕТ й «вії» втучна послідовність «Ве» й , І «ФАЗ» синтетична поліпептидна послідовність «800» 1
АЇа Ага ап оіу Абр нів Суб вічі бі кго Сіу аг Су Сух АГО 1 5 о 15 іву нів тТпг о Ууді ако Аіз бегоїіев Бір АВ бен сіу ТР АЇя вжхр Те 36
УВІ дец бег Рг Ага бін Уві бів уУуаї ТвВг Мет Суз 12 біу Аїа сКух вго бек сій ве аАго Аїв АЇз АБа мех нів Аа бій Хі губ ТВгобег
БО іец МНіз Ага ев бух гео Ахо ТВгомЗі Рго Аїа го Суб Сух маї Рго 55 7о 75 За іа его Туг аха Рго мех ма! цви Хіе бій вух ТАК АБО тТаг о бТу Уві 85 БІВ 95
Ахп о їво ТВг о тТВг о Тук др одяр сви во Ав бух АБО Суб Ніж Суб Х1е 100 То5 119 «10» 18 «їі 41 «Кіа» ВВ , й «тії» штучна послідовніств «й» ; , «?23У синтетична лоліпептидна послідовність «Ю» 15 аї8 Аго Аби Су Ахр нія Сух го ев біу вго біУ Аго Сух Су Аго 1 5 10 15 ваиу Ні ТВг У! АРО АТ бер іши бів Азов бен бі Тер АТ АБО ТВ зо
Маі мез бег го АгУ Зів ма! бів Узі тВг о Меє су їі б1у лів Суб 0 45 го бБег біп вве Ага АЇЗ Аа Ази Мех ніх Аа бів Ї16 вух Тйг бек що вес ніх АгОд ес гух Рго Ар о ТВе Уді Рго Аїд бго Суз Суб Ууді рго 55 70 75 о
АЇа Зег Туг АБ рРго мет Уаї іец хв бій уз ТВг ахр о тйг біу Уві 85 що 55 ве дви бій ТВ о Туг Ахв о АБроїео іев яв губ ТВгГОСу5 Мі Сух Хв 105 305 це «М» 13 «21» 109 «215» РЕТ «еї3» Втучна послідовність «ех «223» смитетична попіпептидна послідовність «щюх 15
Оіу твгоніз сух рго сен біу Ро біу Аг Суб Сух ага іви мів ТВг 1 5 18 ї5
Уаі дєлп Аз Зек ев оЇб Азробен б1у Тео АЇя Ахр Тер о маї во Зв 29 5 за
Рго АгО бі Уві бій Ущі ТВ мет Суз 18 сіу Аа Суб рга Бек бів 35 СІ 45 вве Аго АЇй аЇ3 Аа мех ні Аза бів іє вух ТК б5ег цен нії Агу 50 55 Бо іен куб РРО АЮ ТЛ уз! РО АТа рго Сух Суб узі РО Аа хаг о Тук 55 Та 75 80 делобго Меї Уві ен їіє бій бує ТВР Ар ТАК біу ді Зег їв СВ 85 що Кн
ТВг Тур Ар Ар Бви ен АЇв вух АБО Су Ні Сух Тв
НН 105 «210» 20 «21ії» що «йієе РЕТ й І «213» штучна послідовність «йо» і «23» синтетична поліпенвтидна послідовність хай» 20 соіу Абр нів Сух го меи іх вго Б1У Аге бух Сух дай мец тгОтТВе ї 5 30 15 маї Ага АЇй бегоіви бі АБробемн сію тгр Аїд Аяротгроуді цу хек 28 25 зо
Бго Аго бів уві віп ма! ТК ОМеє Сух ї1е бі Ааїв су: реа баб бів
БІ Я
ТЕ Ага Аза Ай аАБи мет міх діа Бій Ї1і6 уз ТВг бр ква Ні Ага 58 55 о іеб о фуз БРО АБ ТР УВІ вго аів вго Сух бух уві Рго АїВ бек туг 70 75 ко
АБ Рго мех Уаї фев тів біб бує ТВгоАБо ТВ об1у маї хаб ми бій 85 що ях
ТВР Тук АВ Аяр о іен сем АіЗ Куй ле Суз нів сух 318 100 18 «2105 «аїїх ЩЕ «Кай» РЕТ й «13» щтучна послідовність «ва й й , «223» синтетична поліпептидня послідовність «цюх 21 5БіУ Ав ніх Суз рго фей БУ РКО бБіу Ага Сує Сух АгО їец МіБ ТНг ї 5 в 15
Уа ага Аа аби вБеи ТВгОоАаБроїву Ф1у Тр АЇВ Ах ТероУуді фев обег ха 5 30
Рго ага БІШ маі бів уаї ТВгомебє Сує 316 ФУ їв ув РКО Бек вів 35 30 35 віє аг Аа АЇв А5п Мет нів Аїв сія її6 ру ТВгоЗек фер Ні5 Аго 5о 55 во зво зує Рго дар тТиг уді Рго ді Бго Сух сух Уа! го дій 5ег Тук 655 78 75 8о
Ажи Бко Мет маі ів Хі сіп руб ТВг оАзр оТВг о біу маії бек ів бій ко За КО
ТНг Тут Ар Ар ів бен АЇЗ цу5 аз Сує ніх Сув Ще 00 35 «ій» 32 «вм Ма «210» ВТ «13» тучна послідовність «ай» й І «2й3» синтетична подіпейтидна лослідовність «МЮ»
ОіУ Ар нів Суб го сцеу біу рго біуУ Аге Су Суз АР Бе нія ТВе 3 ЕІ 10 15
Уві дга віз Заг Аа із Те обеи б1у те дія а5рв Тр уві фец 5ег за го Ага бів мі бів уаї ТВгомеї Сух Хе біу дів Су5 Бго бек бій те ага АЇВ Аїд Ав Меї ніз Аїа бій 316 бук ТВг бак це Ні Ак хо 55 50 іев вуз го АБО ТВР УВІ РРО Аїд вро Сух Су узі Рго АТ бер Туг 70 75 80 деп вВго Меї уаі фен Її Бій ух ТВг дю ТНг Біу Уаї 5ег ви БІВ 85 да З5
ЯВг Тут АЗБ АВр ів ви АВ ув зер Суб Мі Суб Ще що 05 «аі0» 53 «Щі» ЦО «ій» ВЕ «213» штучна лослідавність «229У й «ав» синтетична поліпептидна лослідовність «З00» 23
Фіу АБр НіЗ Суб Рго цен біу Рго бі Ага Сух Сук Ага ев Ні ТЛ 1 5 ке) 15 чаї Ага ків заг ї89 16 АБО ер ФУ Тр аїв Ар ттр ча! звв 5ат
Бгто Ага бів Уві сій Уві ТВе Мет Суб тів Ту АЇв Су Рго двп іп 35 0 45
Тв" АгО АТА Аа Аа Мет Ні АТа біб їТе Цу« Тйг 5ек їве Ні5 Аго 50 55 що це уз го аАБроТНг Уа! бго Аїд Рго Суб Сух Ма! вВго дія Бего тТуг 65 73 75 во
А5А Бго меї Узі во її бів ву5 ТВг о Ахр тТВгоФфіу маі 5ег іву бій 85 9О 95
ТВг о тук Ар АБО без сец дів Суб щев Сук ні сСух Хе що КО «23йх 24 «іі» 309 «21їх вщт «2313» Штучна послідовність «АЙ , й ; «83» синтетична поліпептидна послідовність «ЩО» 28 зіу Ахро ніх бух го сен біу вго сіу Ага Сух Су ага Кей Мі ТВг 1 5 10 15 .
Уві ага аїв Зег о йеу оц Ахр ем біу Ттр Аїд АБО Тгроуаї без 5ег 20 25 КІ рРго Ага бій уві Єїв Уа) ТНг Омез Сух ів біу АЇа Суб Рго 5вг АЙ ча 45 вве твг АЇв А! Ап мес ніх Аїа бій 112 Му5 ТВГОбег бе Ніб Ага 50 55 во їец цуб го АбрдоТвгоУуаі Бго Аїв Кко Суб Су» уаі бро дів бек щи 55 то 75 г
Ай го Мет Уа! Бе їі2 Бій Му ТВг АБО ТАг о Біу уві 5ег вен бів 55 ща Зк
ТК оту Ах с: зіва бен дій губ пер сСуз Ні Суб 118 10 «30» 25 «йіїїМ це «32» Ву й «ТіїЇх Штучна поспідовність» «ад» й «83» синтетична поліпнептидна послідовність «ах 25 бо сіу азр ні5 Суб Рг іви біу Рго бБіу Ага Суб Суб ага без ніх ТАг
ІЗ 5 19 15
Уві Ага АЇв бек офец бій Ар огец сіу тр оАіЗ аБротТгр Уві бен бег 20 5 30 го Аго бім ма! бій узі ТВгоМек су їі Б1у Аїд Сух вго бег бів 35 40 45 два аго їВйк аїа Ах Меї ніх Аза бів Хі уз ТВг хек сем Ні ага «о 55 Бо їжи ух Бго АБр ОтТНг о Уді Рго Аїд Бго Суб був уаї КгО Аїй бик отут 85 73 75 бо а«п вгОо меї Уві іец її бів у« ТВг Ахр о ТВг Біу Уаї бег сви дів 55 ЗО 95
Тиг тТуг вер Ар оїеи ев Аїз ух др Суб нів Су5 ЩА тай я «210 8 хіх ЦВ «Яі2» РВТ І І «213» штучна послідовність «вд» й й . «ЯЗ» синтетична поліпептидна послідовність «НО» 25
ФУ ар Мі Сух го цен біу го біу аб Суб Су АГ Бу ія ТАг 1 м 10 15
Уді Аго АЇз Зег сви біб АБр ішу бік тгроАїа аБр оТгроуді фей бек 20 25 30
Рго Ага бій: уві біп Уа! ТВг Мет Сух Її б1у Ав сув руч бег бів ї5 Яй й ве ах АЇВ ТВгоАхп мет ні5 АЇз бій 36 фу« ТйК бек цец нії Ага 50 55 що ви ух Рго АБр ТИг Уві! Рго АЇа РгО Сух Сув маї Рго Аїя аг па 55 70 75 ва
АБА Рго меж УВІ іеи ї16 бій вує ТМг обр ТНг оФіу ма) баг орви бій що 5
ТВг Тут АБр АБр їжи цей Аа бує ажр Су Ні Сух Ї1е 100 5 «М» 27 «2312 08 «ійх РЕ «13» штучна послідовність
«аг» «283» свнтетична поліпептидна послідовність «й» а? сіу Ахр нів сСує РРО ву сіу Вго бі Ага Сух Суєх ага фец нія ТВ ча) Ага Аза его їв) 0ів АБроіву іх ТРр о АїЗ АБО о тТгроууа! ве 5ег 75 Ки
Рго Аго бій маї 5іп ха! Тйг мес сух ї1е б1у АТїа Суб Рг) Жак сій
Зх Ай 35 вав аго аіа ді Аха мех нів аіа зів 116 мух ТВг аАжВ це те аг що 55 50 мен ус вго АБО Тк о Ууді Бго Аїа РКО Суб Сух УВІ Вго Аїд бек Туг
Кк 70 75 о дап ро Мат маї сви Хі біб обу» ТВгГОАБо ТВу біу маі Бег вец бій 55 За . 5
ТВг Туг ар АБр ем мей Аїа ух Ар Сух ні Сух Х16 мю ще «30» 28 «ії» М кі» РЕК «13» щтучна послідовність «Е20х й й . кеа3» синтетична поліпептилна посзідовність «00» 8 чу АБрОНія Су Бго зе б1у рРго ФУ гл Суз Суз Аг Кен із виз , 5 18 І
УЖІ АгГО АЇЯ Бег ей біб Азрозео сіу Тр АЇВ АБр ОТиВ УЖІ Бей Зек 70 25 КІ
Го Ага 51 ма) оіа ма) Твгомеф суб Хіе Б1у А1ї Суб еко Бек бів 48 35
Ріє АгО Аїа дів АБп мет Нія АТа сій їЇ1е фу5 ТВг охег дви Мія ТЕР 55 во ів іму вго азв о Твг Ома) вго аів рго Суб ще Уві вго ів бек тує 55 70 75 80
Ах вго меж Уві ем їїе бі» Бу« тТйг одер о твВг обі уаї бек о гви бів 85 50 95
ТВе туг Ар Ар сео ви АЇа ув аер суз Ні Сх Ті1г
Мю их «і» 28
«їх ЗОЗ «2142 рРЕТ і й «фії» тучна люслідовність «Йадх й й . «23» синтетичма полівептидна послідовність «002: 23
ЗУ аяр ніх Суз Рго мезо біу го Біу ато Сух Суб Аго фбео НІ ОТВР 1 5 в 15
Уві Ага аід хег о кбен ІН АБ цер Бі ТРр АТ АБО Тер оузі фе 5ег за 25 30
Рго ага бів узі бів маї тйг мес сук хів Зіу АЇз сСух го баг вів 35 40 45 вне Ага діа дія ах Ме: ні Аїв біп Х3ів бух ТИР бег іецу Ні АгО 50 55 50 іев муз го Ар Тйг Уа! го АЇв Рго Су Суз Уді Рго Аїа Аа Туг йо 70 75 80
ТвВговго меє Уа! ви їіе бій вуз Те дев ТВг Одіу Маф Бек сво єїй 85 Зо 55
ТВг о тТуг АБИ а5Б Ге вен Аїд кує вар су« ні сСух тів 3 Кк «А» ЗО кіз МВ «і» ВДТ ктіЯ» тучна послідовність «еф : «23» сивтетична поліпелтидма послідовність «Я»
Оіу аеро ніх Суб вго квц Шіу Рго ТУ дка Сує Суб Ага цец нів ТНК ї 5 18 15
Чі АгО АЇа 5БЕ ви бір Азр о Бео фіуУу Ткр Ав Азо їгроуві зв бе 73 75 За вго Ага Бій узі біб Уа! ТвВгомет сух ї1е біу АЇа су Рг оваг ти 35 за 3
РВе АгО АЇВ АЇїа Ахи мех ніз Аїд сій ї18 рух ТНК о хагє цви Щі дО 50 вв ух РгОо ар отТаг Уа! Рго Ав Бго Су5 З чаї бро Аїв его тук 65 70 75 во
АБ ргО Мет Ма! во Хі Оп Аа ТВЕ ОТВг тТве Ту маї его рев БІВ 85 Зо 35
ТвК о тТуг АБО АВ Мем ів АЇВ ж АжроСух нів Сух Х18
190 з «ЩО» 31 «їх МО «дій» ВВ каіЗ» Штучна послідовність «220» ; «ф23» смитетична поліпентидна послідовність «ДО» З бу АБр о ні сСух го дви бу го БіУ Ага Сух Сух АРО фев Ніх ТВ 1 5 19 15
Уа! Ага Аїд заг Мен Оу АБріву вІУ Тер діа Авр Тгр ув! Гец Баг
Рго Ага бр УВІ сів маі ТОг мех Су Хе біу Аїа Суб рго баг ФфІв
Рв АгРО АЇа Аїд Ах Мет нії АЇйа бій Хе уз Твг о Зек рев ні Аг що 55 5 їей муз рге АшО ТВг Узі го АЇа Рго Суб Сух уді Рго АЇВ баг на 55 7) 75 8
Ахп о рго меж Уді цем тів бій тує таг свя Жаг оте о Ууді Зат Сем ів
ТЕ Тук дер з55 їви бен Ав Су вве Су ніх суб 116 іх 10 «я» 35 «33» З «ій ВАТ й й «ії» Штучна послідовність «0» . «Тай» синтетична поліпейтидна послідовність «Ю» 35 пу Ав ох Суб рго цен сіу Рго ФУ си Сук Сук ага ау ні Тв чаї ага АЇй баг о іве Є Ахроівц біу Тер Аїа б5в тго Щі мец баг 28 75 30 го Аг бів УВІ бів уві ТВг мет Су ів біу ай Су вго вк Бій 35 ай 45 те Ага АЇвВ АВ Ахп Мет ніх АЇв сіп 318 ух ТВг оБг о гец Ні Аг 5 і6н цу Ро Ахр о ТНг Уа! Бго Аа рго Сух Сух маї йго Аід бер Туг 55 70 75 о
АБв Ро Мет Уа! іви їі бів ух Тнг о Ахродяп бі ТВг бек о мец бій
5: зо З
ТВг тут А5В АБ Мен о гви Аїя вух Ар осух ніх Су ї16
ЗВО 185 «і» 33 «і» ща «бій» РЕЖ «2413» штучна послідавнікть «Яд» й І «ай» синтетична полівелтидма послідовність «400» 33 віу ахр Ні Суя Бго ів біУу бго Б1іу Ага сСух Су АгЯ фе Ні ТР 1 5 16 ї5 чі Ага АЇВ Кег сев 010 АБО сен біу тго АЇїК Азр отв уві ев баг о 25 КВ го Ага біз маі бів мар; тТйг Мет сСух Х118 Ф1у АЇа сук бго бег Ой ча 45
Ре АгО Аїя АЇв АБа ме нів Аїа сій жів Бу» Тк 5ебг зав Мі АКЕ 50 55 БО ів ух го А5р о тТйг уві Рго ліз го Су5 Су ма! го Аїд Зег ви 55 70 75 8 азп орга Мет УВІ іем же 5іп їух ТВг АБО ТВРоіу Ай беб ТВгГОБів 55 З 95
ТВг тТуг АБО азв іви ву АЇа їух Ар о сСуз міх Сух З 105 «210 38 «їі З «вії» ВАТ «813х Втучна послідовність «Ох «23» синтетична поліпептидна послідовність «Ко 3
Оу АБро міх Суб Бгто їеч БІу Рго біу Аг Сух суб Ако Шви Ні тТВг ї 5 18 не чі Ага Аа Ук ів сіц аБроіво біу Тгроаіа АБроТКгр маф ви бог
БЕЗ вго ага піз маї зів змаї твгомеж сСує ї1е біу АЇа суя его зве бій 5 38 45
ТБ Ага дія аіз Ах Мек мі Аіз іп їі рух ТРК ек ке Ніб Ага що ги мух РРО АБр оТвйг охУаі го Аза вго Су Сух уУді вБре Аїд бер о тук
Б 70 75 ВО деп го Меї уаї ів ї1і8 бів уз тТВг аз Тне сім ув) Аза фен ТАг щ5 о З
Тиг отТуг бр дяв ву ви дів бух су Суз нів Суз тів що 10 «230» 35 «йіїх Ма «832» ЩІ «213» штучна послідовність «га» й й й хийїЇ» синтетична поліпептидна посяїдовністьв «НЮХ 35 сіу вер ні Суб Рга івц Біу Ро піу аг бух Суб Ага бац нія тВг ії х 10 І
Уві Ага Аа Зак мви 10 Ар гг су Тр аїа дер тгр ук! івеи Баг
Рго АгО бін уяі біб уві ТВг мет Суз Ха біу Аїд а Бго хек бів
Бпе Аго Аїа Аїд Ал Мет Мі АТ бій 136 вує ТВг Бек бем Ні Агу во іви фу го Ар ОТГ Уві его АТа рго Сух БЕ Узі его АЇЗ Бек ту 55 70 7 що азп о вго меї Уаї ів жів бів фуб тВг одер оїйт біу уві 5ег обу СІВ ях до 95
Те Туг д5р ар ін ієв два уз ТВг оСув Ні Суб Щ18 100 305 «ві» 36 хеЩіії» й «гій» ЕТ й «иїії» штучна послідовність «кад» й й . «ЯЯ» синтетична поліпептидна послідовність «00» 35
АГ 5іЖ Ага Аг ії «0» У «іі» й «аЇй» вит І , «213» штучна послідовність «230» «в2їх синтетична повійвитидна весяздовність «Ах 37
Агп обу ага бу5 Куб Ага ї 5 «30» 38 «31» 4 «ій» КВТ й , «ії» йтучна послідовність «280» й ; ; «аї» синтетична поліпвнтидна послідовність «ХХ ЗВ аг МУуб5 був Ага «ам» 59 «гії» 5 «Фіг ВЕ й «233» Штучна послідовність «ад» І й й «2232 синтетична поліпелтидна послідовність «М» 38
АгО АГО Ага губ Гу АгО 3 5 «Від» 40 «іі» 4 «24» ВАТ й І «21ї» втучна послідовність «ох й ; ; «?йй» синтетична поліпвнитидна песлідовність «цюх 40
Фу Фіу бі баг «2302 41 хвії» 5 «йійз ВТ й «й13х Штучна послідовність «020» І Й й «дЖЯ» сянтетична полійевйнтидна послідовність «М» і сі біу ві бу бек і 5 «3» 42 киії» 4 «біб» КТ й І «213» штучна послідовність «ваДх «й23У синтівтична поліпептидна послідовні стк «ВУ 4 щіу біу баг бу
«10» 43 «2 5 «Вій ВАТ , «2335» Штучна таелідоавність «хх | І , «ей: Синтетична поліпептидна послідовність «400» 43 біУ Б1у 5ег ЗУ Фу 3 5 «ВМх 44 «231» 5 «212» КТ й «ХіУх» штучна песлідовність «кегйх , , Й «23» синтетична пелійвлптидна яосяздовність «0» 44
Біу бвег Біу бек біу 1 5 «Ох 45 «із 5 хаїй» КТ І , «2335 Штучна послідовність «20» й й й «Тйі3» синтетична поліпвептидна послідовність «40» 45 сіу зег сіу БУ су 3 х «23» 86 «й1ї» 5 «й1йх ВТ , «ії» штучна послідовність «ей» й й й «83» сентетична поліпептидних послідовність «МН» 46 щу віу «Ту ек ФУ 1 5 «10» 4 «ії» 5 «шій» ву «З» штучна яослідоввість «2йї» сУмієтична подіпептидна послідавнієть «Я 47 біу щег бек Баг бу і 5
«Вій» й «11» 12 «біо» Рв «Кіїх Штучна послідовність «АД «223» симтетична воліпептидна послідовність «Я» В сіу Фі сіу Зак обіу біу б1у хег їів бів є1у аго 1 5 З «М» «9 «21» 5 «312» РЕТ й «КІї3» штучна послідовність «ЗВ» й , «23Уу синтетична поліпеятидня послідовність «НО» 8 біу Є1у біу Ту «Му 3 5 «йійх 50 «І 5 «йЇ2» ВАТ й «вії» щуучна послідовність хх Й Й й «23» синтетична поліпептидна послідовність «Нюх Зо бів віу Біу Фіу 5ег
І 5 «а» 51 «ії» 8 «еій» ЕТ й й «аіЗ» штучна послідовність «20» , й «йеї» синтетична поліпейтидна послідовність «Ййй» хай» МЗС ЛРЕАТУНЕ «ве» СК. . й Й І «3» амінокиспота у цьому положенні може бути будь-якою змінокислатею «ВИД» хаФїх МІБС РЕАТУВЕ «два» (І.О й й й «К2їйх амінокислота у цеому положенні може бути будь-якою гідпофобною закла тТою «400» 5 г» Хаз Хай Хаз ї «іх 52 кіз 5 «їх ват
«У» штучна вослідовність «йо2Йх , ; «ЄЙХ» синтетична поліпептидна послідовність «их «гої» МІ5С КЕАТИВЕ «аг» (2300 І «кеї» амінокислота у цьвму положенні може бути будь-якою змінокислотов «ВД» «Бої» МІ5С КРЕАТИВНЕ «Едх» 3.3 Й «АХ» вмінокисвота у цьому половенні може бути будь-якою гідпробобною змінокислотаю «вад» «ІДУ МІБС КБАТИВЕ «важ» (83.00 І . . «УЗ» вмінокислота у цьому повоженні може бути бек або ТВг «Ай» 52
Рго хХва хаа Хай хаз 1 5 «8105 5 «Я» 5 «237» ВЕК й і «13х штучна песлідовність «вах «к23» синтетична поліпаптидиз послідовність «КО» «281» МІБСРЕАТОВЕ «аййх (23..233 й «23» амінокислота у цьому полюженні може бути сеци або бів «НЮ» 53
Ттго Хваа Біх Мех тТВЕ ех ї 5 «МН» 54 хгїїх 5 «Кфй» РК й . «213 штучна послідовність «г2бх І й і «айїЇ» сентетична подіпайтидна паслідевність «МІЙ» «Іа МЗС уКЕАТУВЕ «ейае (а «-ї83 й . Й «КЖїх вМмінокислота у цьому положенні може бути сцеи збо ців «Зх Я
Бго хаа біу мет тве ї 5 «230» 55 «ії» ЗО «232 виї «КІ1їх втТучна послідовність
«0» І «виїх сннтетична поліпептидна послідовність «ВО» 55
Суб Ту іец Уді рРго Аів йіу бек Оу рго
Н 5 30 «21» 55 «2ііз 19 «837» ВТ о «21ї» Штучна послідовність «Кеб» х х ах «223» синтетична поліпептидна послідовність «А» 55
Зег ев іє ух бек Аго Меї Уві рРго дай Не Ав 1 іч о «230» 57 «иії» 15 «32» ВТ І «213» штучна послідовність «иа» | і й «223з синтетични поліпептидна послідовність «002 57 его івги івен Хі6 АЇЗ АгРО Ага Мет БгО Ази РВЕ Аза 1 5 18 «3» В «А» ЇХ «В1йх ЕТ І «ії» Штучна послідовність хакох І й й «823» синтетична попіпенчттидна послідоаність «0» 58 5ег вуз ви Уві бій Аа бег Аа бер біу Уві АВ 3 5 ко «Ох 5 «иії» 3 «302 РКТ «8і3У штучна послідовність «ВИД І , «225У синтетична поліпептидна послідавніств «ОО» 59
Баг баг Туг ред фу Аїа бег або Аїв го й5р Ба 3 5 КК «ав» Бо «ії» 17 «ай» ВТ , , хвіЗх штучна послідовність «Уаох
«веї» Кинтетична поліпептидна вослідовність «ЗОох во па Бго Був вго сіп бій вве Рбе 51у ви Мет Ав ї 5 3 «М» 5 «ії» 1 хаїйх Ра «2і3» Штучна послідовність «220» І ще «ДЖ» синтетична поліпептихна послідовність «00»
Беговжи аге Рго Бец АЇВ фев Тер АК бек РВЕ Аби ї х їй «іх 5 «із З «ах ВЕ «33» Вучна послідовність «ке» , й , «83» синтетична поліпептидна послідовність «НЮ» 8 хек рго бій бі хів Аа Біу бів Агу Ап Ре Аза ї 5 їй «230» 6 «ії» 4 «вій» ВЕК й «13» штучна послідовність «ай» й Й й «23» синтатичмиа поліпептидна послідааність «ВК 83 дБ УВІ Ар Осій Аго АБО о УВі Ага біу Ре АїВ бвг РВв ів; 3 5 10 «А» «ії» «9432з ВЕК й «ії» штучна послідовність кг . : «23» синтетична поліпептидна песлідовність «ШУ аг фен бто зіес Біу мен Тгр о Аїа Бго Ах рРБе Ав ії 5 30 «30 55 «вії ІЗ «32» РИ , й «213» Втучна восвідовність «вх й І «23» сунтетична лоліпентидна послідовність
«Ой» 85 зе бец о цев те Се Ага бБег Тер 818. дви вве дп 1 «ій» 5 «83» 19 «її» РЕК «13» йтучна послідовність «УаЙ , , «223» синтетична полілейтидиа послідовність «НН» 85 аг діу узі уді Хіе дія їВг Узі хів Ууаії 1318 тв 1 5 10 «іх 87 «53Ї» 12 «ій ВТ , , «2433» штучна лослідовніств «ад» й , «23» синтетична полілептидня послідовність «МОХ В заг Кев бі вго біг сіу тів Тер обу сів Ве дБА ; Е Ки «30» ОВ «1» 37 «тій» ВНТ , «Ті13» штучна послідовність «кед «23» сянтівтична поліпейтидна послідовність «БВ вух муз чек РКО ЗІУ Ага Уа) Уві З1у біу хек Уді 1 5 КК «ві» 653 «іх 3 «й1оз ЕТ Й й «21Ї» штучна послідовність «еад» , , й «Зх суютетична поліпевтедна паслідовність «Я» БО
Рго бів бі сем огем біу АЇа го Фіу хів гемо діу 3 5 їв «УМ» 70 «іі» 3 кфі12» РАТ «ії» штучна лЛОосСлідОоВність «22» «саї» синтетична поліпептидня послідовність «НЮ» 70 ніх Фіу вге січ біу цечз аке уаї б1у Ре тує бі 5ег др уд! мех 1 5 10 15
Фу Ага Б1У Між Аа Ак іви уві нів мі 610 бій Бгто мі5 тТВе 28 25 30 «Ай» 73 «іх «від» РЕТ . «213» штучна послідовність «йог «23» сянтеатвчна поліпевптидна послідовність «3»
Зіу вго щів біу фев АЇВ Зіу бій Ага є1у хів ма? 1 5 10 «ій» 72 «і» 12 «ЯЗ» РЕХ «й13» Щтучна послідовність «КО» , й ; «їх синтетична поліпептидна послідовність «МН» 75 «Ту біу бек обіх ів Ага ЗІу Агу вуз Аїш сво Фів 1 5 Ка «210» 73 «їх |З «218» РКК й й «йіЗх штучна послідовність «а2бх й . «йй3» синтетична поліпептидна послідовність «НІШ» 73
Зег рез хек аід іви іец хег бег ажр хів вне ахп ії 5 юю хаійх 74 «і 33 хаій» Вт «УЗ» Штучна послідовність «о» х?23» семуєтична поліпеотидна послідовність «НН тА
Бет мах ро Аг све ук хів хів бі Ех ее деп х і: 30 «іх 75 «її» 12 «ФБіх рат «33» Штучна послідовність «Ох «225» синтетична поліпептидна послідовність
«0» 75
Те іви ївь Бу пе іа мі Ркго біу вве Ра АБИ «2305 76 «2 12 «21у2 ват і й «213» Штучна послідовність «ведх «й» синтетична поліпаептидна послідовність «300» б їве тре бух ахп Ії ді Тву вто вго Тве Рго Рго ї 5 «10» 77 х»ії» 734 «510» РЕТ , «аАЗ» штучна послідовність
Кай» , й «843» синтетична доліпейтидна плеслідовність «Ябх 77
МЕТ АБр о Мект агО Узі Кго Аїа 5іп ван ве) сіу ем бен бен гед тгр 3 5 Не їі; і2и Ага біУ дев Ага Сув Ар Аза із їу5 Зак біб чаї ве Ні Агу ке У 2
Ра уз Аяроіви сіу Сі» бі) Ап ве іух АЇа іец Уа веб їв 813 а 35
Рйе АЇа бів туго іви бій» бів сСух кго вве біб Ав о Ніз маі ву зе» 5О ні Ап бім ма! ТВе обі Ре АЇЯ вує ТК су Ма Аїа а5р бімМ ат 55 70 75 о
Аів сів дело сСух йбр фух бег рев Ні ТЯг ши РНе Ту АББ кує іме 85 За Кх
Сух тТйг Уа! Аіа ВГ омес Аго Фів те тує Ффіу ЗР МОЖ АТ АБО Суб що 105 мо
Су АЇв їух бів бів Кго бі» В зви бів сСух вв бвБи бів Мі бух ке 12 125
Ар АБ АБИ РгО АБИ ем рБго Ага свв о Ууаї Ме вго із ма) Ар май 135 їв 140
Мет сув тВг Аїя вве ніх Ахр о АхВ бів сів ТВе РВЕФ ре) вух ух Тук 155 153 155 150
Мен о Туг бів їі АВ Аго Аг Ні вго 15 вве Туг АЇз рго бід зву 155 То 175 іже Ре Ре Аїд уч Аг Туг ух дів Аїв Ре Те бів сув Су дія 150 155 130
Аів АЇВ АБроіух АЇа АВ Суб ви дей Рго був їви АЕр сів ей Ага 135 що 25
АВ бів оіу ух Аїд Зег 5ег АЇВ бух бій Аго іє) ух сСуз їв баг 210 715 220 ен бій мух РМа біу біз Ага АТа кВе вує 8із Ткро ів Уа) АТа Аго 23о 235 740 іви баг бів Аго вБа ргРо бу Аїд біз Ве АЇа бін ма! 5ег цу Кер 245 250 255
Уві тТаг АБроїву ТйК бух ма) нія Те обі су5 Суз нів ТУ А5рогем 760 265 270 мем 5із Суб АЇЗ Ар АБр Ага Аїд Аяроієм Аїд суб Тук 116 Сух бів 775 зва 285
Аза бій дяр баг її бег бег вуз ів фу Бін Суз Суб БТ фу вга аю 295 зао іен бец бі фу его ні Суб хе Аїя бів уз! біб АБ АБробів мех 305 що 315 20
Рго Аа АБроіви РО 5ег бу АТ Аза Ахр вне ма! 615 Збоку дер 325 330 3х5
Уаї сСух іу« Ахп туго віа сін АЇЗз цуб5 дер узі РВе сен біу меж вл 34о 345 350 зе Туг Бі тут Аа Аго Ага Мі го АББб Туг бег Щі Маі Сеч їв 355 зво 385 ев дев іем о аів вух Тйг о тТук ти ТВгОТВг ої бів фу5 Су Суб Аа 37 375 380 іа АВ АаБо Рг нів Бій бух тує ліз цуб5 маі й дробів Ра бух 385 390 395 Зо рго гви узі сф бів его бій Аа жу Ті вух бів Аа Суб сім ем 405 іа 415 вне біз вій сем сту бін Тук ух вве бів Абб АЇВ ем овен уві Ага 450 455 430
Туг ТВг ру був Уві бго біп Уа! бег ТвгоБго ТВгосву Ув! бів ха 435 ЕК 445 авг во Аж" Мей Ф1У уз уві біу 5ег іух Суч« Суб цу Ні вго бів 455 4850 діа уз Ага мех рго суг Аа бій Ахр Тує іеи бег ма! маї бебй Ахи 455 47й 475 480 сій бен Сух Уві іец ні біб вує Тйг о вго та! Зек Ахр Ака Уві ТВг 485 490 495
Ку Суз Сух ТВПг сід бег цей узі Аби Аго Ага го Су Ре бек АЇВ 505 го
Мей Бі хаі ар 10 ТВг тує ма? Рго фу« 516 ВАе дей АЇа бів ТВ 515 во 525
Ме так оре ніх ліз Ар Хі Сух ТВГобео бегобів рух бін Аг бій 53 535 540
Хі мух уз біп тйг Аїд ви У! Бім ау Уві уз Ні ух ргО фуз 545 550 555 о
Аїа ТВг губ біб біз дез бух АЇя маі Меї й5р Ахр вне лів Аїв ле 555 570 575 чаї бі Бу Суб Суб ку АЇВ Ар о АЖО іу5 сів таг Суб Ре АВ В со ВЕ 530 ві бу щу мує рен ма! АЇТя Аа бег осів АЇд Аїя во с1у сей Оу 595 500 6505 сім біу біу бег сіу б1у бі б1у бЗ6г біу бБіу біу 5іу бер АЇй Ага вій 515 520 дхап Біу Або нів Суб го Мец біу рго біу дко Сух Суб аг Кви ні
БІБ У во б3 540
Тигозаї Аг Аз ЗБК оба Оіш АЗрозен біу тго Аза АзроТгроуві во 545 5 655 его РГО Ага бій Уві бів уві тб Мет сСух ів о1у АВ су ро вт
ББО Бе 6570
Бій вве АгЗ діз Аїв Ах Мет Ні Аза бів її фуз ТК Бак бен Ні 575 БО 58х ага бен бух рго Ах отиг оУді рго Аіа го Су Су» Уді Бго Аїа 5ег ща що 790 туг Ап РгОо Меї Уді бен жів бій вуз ТВг Або ТК Б1У ма1 бег іву пе 710 715 728 бів тТйг о тТуг Ар зер ам о ьеци Аа вух ав Сух НІ Суб Те 79 730 «ЕМО» 78 «23» 731 хійїї» ВЕ «2132 штучна послідовність «22О» «АїЇх синтетична поліпептиди послідовність «Й» 75
Мет АБр мех Агу узі вго аїз дій рем овен 0іу феи веб ве) бе То ії 5 10 15 ів ага біу АЇз Аго Су двр о АЇВ ніх уз бег сіб ма! АТа Ні Агу
КН ве вуз акрів с1іу Бім біб Аа вве фу АЇз іву уві іву Хв Аїд 4б 45 вне Аіа бів Туг ем бій бій Сує вто Ре бір Ар ніх ма! вух зви 5а 55 КО ча аБп осів маф ТВгобіз ее Аїв вух ТНгоСуб ма! АЇЖ АЗр обі Баг 7 75 во кіз сім Аба Сух АБроБух бБег іви Мі5 ТИг офец Ра бу Ар губ їв) 85 Зо 95
Сух ТВгОУаТ АТа тТйКоген ага сів твВг туго біу бів мет діа авр су; 150 105 що
Сух Аід куб біп бій вго сім адгб ака бів Суб Ре ім сЇй Ні ух 115 120 1975
Ар Акор Ахи РГО А5п рем РгОо Аго бен Ма! Аго Рго біц УЗ АБр о Уді 130 135 148 мес Су» ТВе дів РВЕ Ні5 Ар АВ 5 Зі Те РВЕ фец куб мує тТуг 345 159 155 М іен тук біб їв АТа Ага Або Ні Рго тує рве туг АЇЗ РКО Зіц іев 1655 15 15 і: кре Ре діа зу АгО туго фу Аа Аа ве так ої) Суз Су Бій зво 185 15
Ав Аа Ав ух АЇВ АТ Суз це іец РО цу5 ем АБО І Кен АгО 195 20 205
Аврооаїв біу ух Аїя его бек А1а вух О1й Аг зви Був Суб Аїа Баг 210 2515 72
Кен бів бух РНе сіу бій АгО АЇа РАе губ Ав Тгр Аз УВІ АТа Ага 255 230 235 348 ім бег біп Аго ве рго цу Аїя шій виє Аа бю МАї бек огру»х рем 245 250 255
Уа! Твг ахріец ТНг обу Уді ні5 ТВР ОБ Сух Суб Ні чу АВ ев яко 55 27 іви Фів Сж5 Аїд а5р АБО Ага АЇа ароїви А18 КУБ ТЖ Хі Сух вів 275 УЯВ 285
А«п бій аяр бег їЇе Звгохег сухо фев вуз піц Суз сСув Бім Кук го 290 295 300 ієц ви піз Бу Бег ні Сух їі дів бій уві Шіш АБИ АБр обін мех
ЩА з 5 328
Бго АЇз а5рівц Бго бек оіез Аїа АїВ й5р Ре уд) бів бег вуз АБО 325 330 335
Уві Су» куб дхп тТук дів Бій Аа зуб азромаі РВЕ їв щу меї ре 340 345 35 іви ТУР ОЇ Тут А1а Аго АгО Мі Рго А5роТуг Зек мі Уві ів ге 355 зва 305 іви В Кеш АТа бує ТВ ОТук бій Тк отв обев оф вух Суб Су АВ 37 395 18
Аїа Аа Аяр вко ні бів бух тТуг АЇй гу а) рАФ АБробін вве гух
ВХ зо 395 з
Рго сви маї ів бід вго бій А5а фен жів бух бів аа Сух ЇВ фем 435 ря по
Ре Бій бій їви біу Біб Туг цу Ре БІВ аби АЇїа іев іа Уа Аге 920 425 Я
Туг ТвВг іуз буз уаї его бій маї Заг о твг вто тВг зи УВІ аб Уа 835 540 345
Бек Аго Ах іги Біу ву« маї біу 5ег кує Сух Суб уз Нів РРО У
Я 455 яко дів рух ага Меї Вго Суз Аза біб аБо Тук фев 5ег уві Уві рев Аз 455 470 475 ЗВО іп мен су маії ву нів бів вуз ТВг обго Уві 5ег ар ака маі тТВг 485 «950 4395
Бу Су5 Суб тяг о біц баг гео ха| Ахп АгО Ага Рго Суб РВе аг АВ що 505 5що ін бін ма)? Або Бій ТвВг тує уві вго суб бі ве ап Аа під тв 515 528 25 бе Тс РВє Ні АЇа дер ої1е Су» ТВгоїем бек озім губ січ су бів 530 535 Б їі уз уз шій ТР оАід вв уаї бів бею уві ух ніє ух кго ух 545 550 555 За
Аіз твг рух Бі бій (ем їу5 Аів Уві Меї Або Ар ве із дій Ре 585 570 525
Ууі 51в ув СК Суз іуз АЇ3 Ар Азов ух бів Твт Сух Не Аа 18 5яо вх БИ ів Оу Був ух вежу уві АЇЗ Аїа Зег бій АТ АВ зво бі ви Оу 555 бай 505
Щіу Біу біу заг біу бБіу бі 61у зег е1у біу біу біу бек Біу Або о щі 528
Ні Су РгО Мей біу Бго бу Ага Су Суб Ага їжи нів Тк хв! Ага 525 5 35 5
Аїа бек іви ЇВ АхВ Сем оіу тгр Аїд ЕЕ Тгр УДІ Мед бег Рг Аго 545 5 655 5ін ма? бів уві ТБк мес сух 112 бі Аза Суб рко Бег сію Ре Аг 60 565 570
Аа дія Ап Мет нів Аія бій Хі їуз ТМг бег бе) ні Ага цен цу 575 58о Бах вБго дер ТК оУаї го дія бро Сех Сув уаї РКО Аїа бег тую деп рРго
Зо 5935 70
Ммеї уаії сви їі Біб ух ТВг одер ТВгОБіУ уаЗф бак озво бій тВг М ще ла 715 Та2й дев аАхр овен сей Аа Бу Ар о сСух іх Ку те 725 730 «Ай» 78 «ЕМ 7 «Ф1й2 ВИТ й й «ЖіЗ» штучна послідовність «го» й , «Тяї» синтетична полілейтидна послідовність «ану 79 меж ар мет агу Уа вго Аїд бів феміви бі ів їєм рев ем тур і 5 13 35
Мем аг Біу 318 Ага Су Ар лід нів муз бег Бім Ууаї ДЯ МІ5 Ага 2а 25 за
РВеє вуз дероїво бі бів бін ази РНе бух Аіз іви Уві сем ї1е 518 55 о 45
Те діа сія Туг ін осів бій Суб рго РВа Бім дбо Ні маї уз ів ща чаї деп біз уві ТНК бій еВе АЇвз ух Тиг Суб УДі Аїа АБИ бів Заг 55 70 75 во ліз Бім Аа Суб Ахрогух его івц ні тйеорев вве біу а5р губ ев 85 Фо Ки су ТНК о УЖі Аза ТВР о їен ага БЮ тТВг Тук Бім Бім Мес ліз Ар Сух оо 105 ТО
Сує АТа вух бів ОТи РРО бір Аг Абп би Суб РНе ему сій нія кує це 129 125 ер АБО А5И го Абп о фец Ро Ага іши уві Аг го Бі узі АБО Уві 159 135 140 мет сух тВг АЇа Рйе міх АБр о АБА бів Сію ТВг РЙЄ ви фу5 фу тТуг 145 150 155 15 іви тує бів їі АЇз Ага ага нія рРго Туг вне тує АЇ РгО в ем 165 120 175 і2и вне РВе дій ух Ака Ту Куб аа Аїд вне тпг дію не Суя бів 180 185 156
Аїа ва вер іу5 Аїд АЇВ Суб ів ін РгОо руб іву Аз ОіН фен Аг 195 205 205
Авр бій іу уз АЇа Зег бег АЇз ув бій АгО зви їує Суб Аа 5ег 210 2315 220 ів бій вує пе біу бій АгФ АТа Бе муз Аїй Тер Аїа уді АЇВ АгО 275 230 35 240 мви Бег бій Аго Рйе го цух АТа біб РМе АТа біз узі бего був ів 245 250 255
Уа! ТВт Ар рен ТР бує маі Ні5 ТВК Біб Сух суб ніх 9 АБр ому 250 255 ау іви Бій Суб а АБО АхВ ага аіа АБроіен АЇй їуб Тук Їїв Суб бів 275 7ВО 285
Ах БІВ дер бег Їі8 бег бЗег фу5 цем іух бів Сух Суб бін ух рга 255 00 іви ей біб фу» бег нія Суз їі Аїа Бій уаї бів А5а а5р ої мех
З 330 315 320
Бто АТа Авріен Ро баг гео АЇВ АЇВ Ар РВЕ УВІ Бій Ха зуб АБЕ 325 330 335
УВІ Сух 1у5 дп Туг А1з бів АЇВ ух Ар Уві РВЕ їв ві меж рве 380 545 35 ви ту бів Туг АЇа Аго Ага ні5 го А5ротТує бегоуді уді фен ва 155 зво 355
Ге) Аг їев аіз вух ТигоТуг бід ТВ тТве бен обід муз Суз Суб Аа
ЗВ 375 380
Ав Аїх аАБр обро Ніб бів Сух Туг А1а Куб уві РБеа Ар БІ вне гух 385 350 355 Во
Бго сей у! біз біб го бій АБА Се ж) КУБ бій АБа Суя Бір вер 305 чо 315 вне бі) бій бен біу біб тує бу5 Рве бів Абп аїв зем сви Уа Аг го 425 430
Тук тт рух Куб МаЇ Рг біпоуві Заг ТВг РКО ТВг ов; узі бів уві 425 40 445
Бег Аго ахв іви біу ув Ууді Бу бак гу Суб СЕ вуз Ні Рго біц 850 ак5 АБО
АЇй вуз дгу мех га сув Аза біб ар туг ви ек маі Уді Кеи АБВ «55 433 375 ЗВО
Фів вен Су ма) фем Ні біб Бу ТВ о рго УВі бек дер аку Уві ТВг
ЯК Я 495 іх Суб Суб Тіт бій бЗегофео уді Аа АГФ Ага Ро бух Бе бег АЇа 5щОЮ 505 50 іез бів Узі Ар бін ТВготТук уві Кго уз Зі бе ахп АТа бім ТВ 515 520 525 ре ТВг Ре Ні Аїд азр їв Суб Тйг фен Зег бів бух бі) Ага 018 530 535 540 їі уз су БІВ ТВг діа се Удії біз іван уві руб НІ бух Бго Су 545 550 5а 550
АЇВ ТВг обу біб бій цец мух АЇа маі Мет АЗр Ар вне 818 Аїд РБа 555 «7о чих
Уа Бін кує су Сук ух АЇВ АБр Аж дух Бі Те оСух Ре а18 518 5ВО 585 530 у ще іу5 ви УВІ АЇВ діа Зевг біп Аїв Аза ів біу во бу 555 50 605 «Ту біу біу хек бБіу бі Фіу Є1їу Бек біу б1у біу біу бег біу «Ту що БІ 525
На оіу Бег Бі щу віх Фу хег 5! а5р нів Сужх Рго цев бу рго
Гея о 835 ща
«іу Аго Су Сух вагу ем Ніб тТВгоМаі Ага аїй бек бе біб Ар се 55 65О 655
Зіу їкв АТ аб Тер ові вени Беб оБго Аг бім уаї сій Уді твг мех б БЕ5 570
Суз хів біу Аіа сСух Бго Зек осів вве агО АЇа аЇв Аби меж нів Аа 575 во 585 бій Ж1е фух Тйг Берг ву Ні Агб іву бух рго Ар отТйг о Уаі вго АЇВ 590 зх 700 віч» Суб сСуз узі Бго дія бег о тТує ах» о Рго меб Уві Кв жів Бій ув 705 7 715 720
Твг Аж Тве О1у уві заг ке бів Твг мя Ар Ар мер івм дів ух 725 7 735
Аз Сук Ні сСух Їїе 240 «їх 80 «5ії» 38 «12 ВК й «йЇ3» штучна послідовність «З20х «223» синтетична поліпевтидна послідовність «Я» ВО мех Ахр мех Ага Уді Кго Аїв Бій меи без сіу ев сен ей ву тро 3 5 10 15 іен аАго Бім Аа Ага Су АзроАЇв нія бух вк бів Уді аія Ні Агу
ХХ 30 не ух Ахроієем Ту ій 61) деп вне вух А1а ієц Уаі Бей їв дів «В 45
Бне Аіа пів тує вво яЯіЇй бів сСух РРО бе біб ав оніз уд) Куб цеу що 55 бо
Ууаі АБа бій та? тТВг бів РАВ Аа груз ТУвВе че чаї АЇЗ Ар ів баг 655 70 75 Ва
Аїв бів А5п Сух Ахр гук Бег ів ніх ТБ обеи Не Сіу АБрогух ее 85 ІВ ч5
Сух Твг У АїТа тВг овен аку біо ТВгозує біу бів Мет АТа дер Суб зо 155 вет) сСу5 Аа ху» Бій бі бге і що аа ців Сує Ве (Фу БІВ Між зу 115 120 125
АБО АВ АБИ РгО Абп осец бг) Аго Бее УДі Аг Рго бін Уві яр ма 330 135 140 меж Суб ТВгоАів Фе ні ар дкп Зіч Бі ТВ ве бац фу 5 Тур ке 150 155 15 іец Тук бі: Х12 Аїд АгО АРО Мі Рго тує Ре Тук А1а его бій іо 155 179 15 вец вне йМе аа фух Аг Туг цує аа Ав РВЕ ТВг у су су сп 180 185 ї9о
Аа Аїд ахв губ Ав АТа Сух ви зво го уз ем або бів еВ Аг 155 200 25
Аяр сій біу вує АТа Хек бак дів мує БІВ заго фем ух Сух АЇВ кер 218 7515 дао іже бій уз РВе Оу біб Аг Аа вве вуз із ТгроАЇз Уа! АЇТа Аго 925 230 235 240 іви Бек бів Ага рве РМ ух Аа бів рве АТ бі) Уві Баг ву: ев 2435 25 255
Узі тТВг а5роіво тТвВе бух уві ні твРоЗій Сух Сух із біу дер ец
У 255 770 іво сій суб Ав Ахр о Авр Ага Аїа АБробем Аа руб Туг Хі Су їм 775 тво 285 а5п бій Азробеве їі 5еб Заг ух свв фу бін Су5 Сух іш му ВгО 290 255 Зо ім іву бім мух бег Ніз Суз Хі Аа бів УДІ бій АБИ АЗОВ мех 3а5 0 15 320 го аа Ар фед рко его обан АВ АВ дав бне маії бій бек фу Ар 325 33 335 маї Суб уз аби о тук А1а бій Аїа ух Ар Узі йо іди біу мет бве
ЗАЙ 345 о іжу тує біц тут АЇВ АгО АгО ніх Бго Ар туго Бег уді ха цем їв 555 380 385
Меи Ага іє Аа ух ТАК ОТук бів тає ТВК огмез Сі ву Сух сСух Аа 370 375 Зо
Аіз аіа двр о рго ні бід Суб Туг Аів фу уаї Вк Ар ОМ РИЄ зу5 385 380 355 о вго йви узі бів сід го біп Аа ден хів ув бів дев сух сів їгу 405 чю 415 рве бів бій феу сіу ої туго фуз кВе бій абп АТй бец фо щі Ага 420 425 430
Туг Твг вух губ уді Рго бів маї Зег ТНК Рго ТВг фев уві бів уві 335 440 445 щег Арго АБп іев біу ух ма СТУ бек вуз Суб Су ух Мі Ро ЗШ
С ч55 Бо кіз суб Ага мех рРгоОо Суз віз Бі А5р о Туг без баг ма Маії зей Аа 465 420 475 480 бів бен сСух узі! іви нів бій був ТВгобго уді 5ег АБр АГО УВІ ТВе з85 «що 425 мух Сук сСух ТВг о біц бек ви Узі А5а аг Ага Бго Су Ре 5ег Аїд 500 505 510 івю ЄВ Уа! Авр оо тТве тТуг уві ко уз Бій ре да Аїд СИ ТА 515 520 ех вве Тнг вне нів дів Ажр о їта Суб ТАК обви 5ег бів бух СТЬ Ага св 530 535 550
Тік вуз суб Бій твг Ах зе уді Зі їер узі Кух Ні вух вро Гу 545 550 555 УБО аіа тВг огрув Бін бів цем вух Аїв жаі Мет АБр Ар Ре дів дія вве 5655 5уа 55
Уаі сін ух Сух Суб муз Аа АБр Ар ух Бій тб осСуз Ре АЇВ би 580 «НЕ 590 ів Фу щу мух кви Узі Аїа Аа Бек бій Аїа Аз без біу мем бу 535 5юЮ Ох віх 5 Зіу бег біч віх щу 5іу баг о1у сіу йіх шіу баг Ф1у іЖ 53 «5 520 бі Біу вет су су віх піу бег Су» го іво бі Ре) Біу Ага сСуз 625 є3 535 Бо
Сук ага зви нія їВкомаї Ага АЇВ ек оівв Біб Азр о їец сіу Тгр о АЇВ 8545 Б 55 аБЕ Тер оУМаі рес хек Рго Ага бій Ууаі бів мзі твгоМек Сув хі Б1у
Бо БЕ 520 аїв Сух вБго зЗвг осів РВе Аго АЇЗ АЇз ап мет нів Аа дій ха кух в» 5 БУ
ТВг Бег це віб5 Аго цеч зу рго АВ ТВгомаі вго Аїа его Суб Су 90 595 290
Уді его Аїд БегоТуг дей го мех Уа! їев (16 бій бух ТВгодротає м 7 та т8о 5іу уві ек іч бій тТаг Туг ар дрів ів 813 ух АБр се Мі5 725 7 715
Суб 3і1в «830» ВІ «іх 1 «242» РЕ й й «яі3У Штучна послідовність «Абу й й й «2ХХ2 синтетична поліпептидна послідовність «00» 8 мех Ахр мет Ага маі кго Аїа бій без ів Ту їез бен це ем тку 1 в. 10 ї5 іеи Ага Бі Аїа ака Суб їз аг а5а біу Твгоніх суб Бго це біу 20 25 за вго ОіУ Ага Суб Сух Ага зву Ні ТВг УВІ Ахап АЇв Зег ви СТВ Ар 35 чо 45 іем оту тгр аїЇз А5р о тгр о Уаї ви баг о Рго АгО бін маі біл уді Тве 50 55 Ба мет Су хів Єіу Аїа Сух Рго бек бів РВе Аго Аза АЇа АБИ МЕТ 5 55 70 75 ВО аіа бій Хі ух тик бег цен Мі Ага цен куя Бго дер о ТВг Узі го 85 Фо 95 аїа Рго Сух Сує Ууді Рг Аїд бЗвгоТуг дяй го мес Ууйі рей хе Фів 1 305 о
Ту» ТВг Ав Так обФіу Ууді Зек ово бій тТвг отТуг Ахо вер іви зви віз 150 125 уз АБЮ Су Ні Су5 Т1Е 150 «10» 82 «9232 338 «йійх РКТ «13» штучна послідовність кае0» «ФЯЇ» схивтетична повіпеятидна послідовність «НИ» йо
Мет АБр Мет Ага у) Рго АТа бів вем ів біу ме) фен ів їв тер 1 5 10 15 і5и Ага 01у Ав Агу Суб АТ АгРО дей ОТу ар оНіх Суз Вго мезо БУ і; 25 30
Рго біу Ага сСух бух АБ іви таг тТВк Уві аг Аа Бек вжи 019 Авр 35 40 45 іі біу тТкроаїв Ахротгроуді фео бег Рго Аг бів ма! бів маї ТАг 50 55 Ба мет суз Хе піу Аа сСух го Бег бій Ре Аго Аза АТ Ап Мет нів
БЕ 79 т да
Аїа бій ї1е іу5 Тк бек ів Ні Агя ін бух Ре Ахр отВг Уа) рго 55 96 3 віз го сує сух уві Рга Аа Бег 1ХЕ Авпобго мес уві іез Х16 бів 00 м їю
Муз ТВг АВ ТВе о бБіу Уа! 5ег іви бів ТВг оТує Ар аеро сео їв АВ 115 129 125
Муз азрд Суб нія Суб Хв 138 «210» 81 «гії» 334 «сефіх РЕТ Й І «733» штучна послідовність І «о Й й й «ейї» кинтетична поліпентидна послідовність «З330х 8 меї ази мМеї ага маі Рго із віп вец бе обіу вен бен сен ай тер 1 5 то 15 ім Ага Біу АЇВ АгО Су 8318 Аго ах Біу вжр мія бух бро ви щіТуУ за
Рго біу ага Сук Сух Ага Мем Ні ТВг Уаї ага АЇа деп ви ТК АВ за 45 іем біу Тгр Аїв Авроткрома! бен его бго Агу Фі) за! бів ма! ТВг ва
Мек суб Хі Ру дів ще го БЕК бій Рле АКУ Аїа АТ АБ Мет 15 ях 70 28 во
Аіа бій Хїєе Муз ТВг обег оре Мі Ага іви Гуз го Ар оТВу Уві вто 85 КН 95
Азіа рРго суб Сух Уві Рг Аза ет т А5п оБРО Меї Уді ів хів бій 300 105 110 ух тВг АхВ ТВк біу аї бак оіоц 61 тТВгоТук Або дв ге ве Ай ц і20 125 іух а5р Су Ні Сук Те «8» ВА «Зі» 334 «Фіїх ВВ й , хі3» Штучна послідовність как» Й й . «ФУ3» синтетична поліпептидна послідавність «Я 84
Ме АБр оМеє Аг уд! Рко Аза бій кем івв біу мецосен вец веб тт ї і: 10 15 іа ага біу дів Ага сСуз АїВ Ага дів оіу Ах мів Сух все ви Ту
Бго Фіу Агу Сук Суб аг веу нія ТНК ха Ак Ав баг одяло бів Тр 35 30 35 мви бі ТгроАЇа АЗр о Тгроуа) бео бЗего РКО Ага бів Уві сій уаії ТР 50 55 во
Мет Суз тїв біу АЇВ Суб Бго бек бій ее Аго Аа аіЗ деп мех нів 55 70 їх во
АТа Бів їі Цу5 ТВг Зак ге) Ні5 Ак іще вуз Ргш аБротТНгоуаі РКО 8х КІ ЗЕ
АЇд ргОо Су су чаї вБго Аа бег Тур дя РРО меж маї ів 312 бів 1 КН по вух ТВг Ар о тве Фіу Уві бегофец ій ТВгоОТук Ар зор Кап ів АїВ це 120 12
Муз АЮ Суз Ві Суб Хв «230» 85 «вії» 334 «2317» рат й «яї3» Штучна послідовність «ВОх й «223» симтатична поліпенатидня послідовність «400» 85 мех АБИ меж АгО ув! Рга Аза бів геу їви біу цез цей дам во Тева
Мец Ага 5іу 8іа аку сСух Аа Агу абп о біу ах мів Сух Бго фею су 7 75 30
Рго БІУ Ага сух сух Ага ви нів ТвВгомзі Ага АЇз Хек ве бів Ар а 45
Шви Біу тТгр о АЇа Ар оттрохаї цем обег о рго Аго бію уві бів уві тег хо 55 БО мес сук Кі Біу А1а су зго хи вів тВг ака Аїа АЇВ АБ меж нів 55 ? 75 о
Аїіа їй жів уз ТНг ек фен Ні АР ін ух РГО АБО ТК Уа) рго 85 За 95
Аїа Рго Суж Суб УВІ вго АЇВ бек Тук Ах го Меї Уаії ви Те біп 190 155 мо іух ТНг Ар от біу Уві бегоїец бій ТАг оТуг Ар о дхр бец їн ліз о 150 1Хх ух АБ» Сух міб5 Сух хтів 136 «М» б «ії» 135 «48 РТ й «ії» Втучна послідовність «220» ! ще «Жаї» синтетична йоліпептидна нослідовність «з б
Меї Ахр мет аАго Уві Рго АЇв Бій бемоіво бі ев Бем ем іо тго 1 5 16 15 ївац ага Біу щи дга су Аїз Ага АБв сіу АБО Ні Сух вдо іже ЩіУ
Я шк ре вго Бі Ага Сух бух Аг іем нів ТВг Уві Аго із Бр Мен біо АБр 35 «0 45 ієн Б1Уу тТРр Аз Або Тгроуаї бен ет бго Аго бів ма? бів ув! ТВг 5а 5 56 мек Суз Хі бі Аїв Суз РРО Бег дяп ве ТВг олія Аїв ап Мет нів 55 ТО 75 о дів Бі» їіе Ку ТВг 5Зег грец нів аг ів фу рго дер тТАг Ома Рго 85 о 95
Аїд вго суб Сує ма! Бго Аїа 5ег не Ажп го меї маї се їів бів щю 305 ко: їув тТВг азр те біу ущі бек зіву бій Тиг Туг Ахр АБр йео це Ав 35 120 155 зу вар сук ніх Суб ті
«30» й «іі» 134 «ії» РЕТ Й й хі» Штучма послідовність «ах : . й «8232 синтетична полінентидна покдідавність «ве 8 мес Ар омМеж ака УВІ Рга діа бій ев гав Бі фе фви ам фев тв 1 5 30 15 зво агО Ту Аа ага Суб Аа АКО Ав біу АвроМНіб5 Суб рго веи Фу 23 25 30 го Ф1іУу Агя Су Сух АгО ем нів ТВгоуУуВі Ак АЇа Бег їви бів АВ 35 30 «5 іїем Ф1у Ткр о Аїа або отгроуаї сви бег бго Ак 5 ма? біз Уві ТВК 50 55 5
Мет Сух хів 5іу лів Су РгОо Кег бій Ап АгО ТВгОАЇЯ Аа меж Ні 55 70 75 що зів віп хів бук те 5ег зву ніх Ага ев був РГО АхрОтТВг Уві вго к5 що м дів рга Су Суб чаї Рго дій хег Не ап вго мет маі івц зів вій 10 195 ло вує Твг яБо їВг о біу маї чего бео Зі Те тує Ар оАБв мм їез АВ о 125 мух АБр Су нів Суб Ї1Е 139 «430» 88 «йіїх 15 «а» РЕК й й каїїх штучна послідовність «ех І й й кеЖі» синтетична поліпептидна послідовність «ах ВХ мет аБр мет дгу Уві Рго Аіа бів ви веб Зі цем сезон ви Тгр ї 5 зо 15 меч ага йіу аз Ага Суз Аа Аг Ачап сіу Ар оніз Суб Рго іо щБ1у 28 75 30
Рго біуУ Аг Су5 Су Ага фе Ні ТВгоУВі аку Аа Бег іеу піц Аа «а 45
Мен сія тгроаіз Ар отго Узі бец бек о бко ага сів уві сій Уві ТВг 5 55 во мех сСух ЇТе піу Аїа Суб го бег бів РВЕ Ахп Аа ТВг ода Меї Ні 655 70 75 во аЇв бій хіе уз ТИР о5ег іви Ні5 АгРО Бен суз Рго Азр ТНК уд! вто 85 о 95 аАЇВ его Су бух Узі го АЇа Заг її дяп рго Меж Узі рев хів Фів 180 105 цоео
Буз ТВг Або ТВЕ бу уві шег о мву сія ТЕО тТУук Ар зве Кви бен Аїд ца 120 12 руб дер Су нів Су Те 130 «230» 85 «х3іїх 334 «гій» РАХ й «ХАї» штучна послідовність «иЦ» й «223» синтетична поліпейтидна послідовність «800» 59
Мет Аяр мех Ага Уа! РРО АЇТа біп рем оіво бі во ев бен ви ТКА ії 5 й ки і2ги агу віх віз аку Суб АТ Ага Абп Ту др о Ніб Сух вра бе Ту 25 755 30
Бго біу ага сСуз Су« Ага іемоніз ТВ Уві Ак Аа бек іви БІ Ар 35 30 45 іез біх тер АЇа АБО Тгроуді ев его рго аге бів ма? бій кі ТВг 5о 55 50
Мет Суз хіе бїу Аїа Суб Кго бек бій рНе Аго Аа АЇВ Аа Ммеє Ні 85 70 75 що
Аз вів їіе бух Тк Ап іви їйг о ага ем бує Вго ар ТАК ма рга 85 ЗО 35 аі3 вго Суз Суз Узі Рго Аїд бег тує деп вго меї Уа ів З бів 100 Ще о
Був ТВе ар Те біу ма)! бек оіви Зі ТВг туго Ар о АБв фер ем Аа 328 125 іув5 Аза сСуз нія Су їЇїв 130 «10» Зо «и4їх 134 «У1йх вит І й «233» штучна послідовність «250»
«223» синтетична полінейтидна послідовність «ен» 0 мет ахр мех Аго Узі Рг АЇВв бів сем ів біу меш іеб ев фев тТгр їечз аг біу Аів дго Суб А1З Ага ав 5іу Ар оні Кух рсо сечо біу 28 25 зо го Б5іу Ага сСуз СУ Аго ізо міх ТВгоУуві Аа АЇВ бегоцев бів Ар 35 о 45 мен біу тгв АЇВ Ар тРроУді іже бег вро Ага бін ма! біп уві Тве 50 55 о мет Су» Хі с1у іа сСух вто ог сів Ре ло із лій язп мет нів 55 7а 75 ко дій біп Хіе фу» ТВг бег 85п ні ТНг обец іух РКО а5р ОТГ УВІ РгО 85 ва Зк аід вго суб Суз уві Ро АЇЗ аг Туг АБа го Меї м3Ї ів їі бів що це То їУуб тТАйе АБО ТВА Бі Уа бек рено дій Тйг о тує Ар ар їжи фез ді8 ї20 3153 ух АЖр сСу5 мі» сСух Ів о «2302 З хиііїх» 154 «ій» КТ «йїї» штучна послідовність «йКйх «233» синтетична полійентидна послідовність «Ю» я
Мех дер Мет Аг УЖІ Рг АТа біп сем зви с1іу їз Бей фев геч Тер 1 5 ях 15 ієцз аго 51іУ Аї8 Ага сСух Аіа Ага дяй 51У яв ні Сух рго виз піу 28 25 30
Бго БіУ Ага Суз Су дго фегм Мі тТВг ові ага 818 бог омей Зі ав 0 45
Мем 1 тгроАЇа Ар отТкрома! си Заг о бго аго бін Уві бій уаї ТВ
З 5 мет сСуз Хів бБіу діз Суб Рго бек ЗІЗ вве ага Аа А13 АБ Меї нів 7 75 во
Аіїа бій 316 вух ТВг оБВг грец Мі5 Аго ів бух Бго аяв ТВК Уа) Бгто 85 9о 95
Аї8 его сух сує маі вго АТ Аха тек їВгоБко ЗБ УЩі фею Х18 бій цю ще що рук ТАг зер ТвВгобіу Уві баб фей біп Тйг ОТуг АЗОВ Або іжц рей дід 315 120 1 рух Аз Су Ні» Сук 116 1 «ЩО» З; «21їх 134 «8310» ВВ й , «кій» Втучна посяздовність хе» «ФАЗ» синтетична полідевптидна послідовність «АН Я
Мет АБИ Ме Аго й Рез Аїа віп ке сен ЗУ ін ів ів вч тев 3 5 ї 15 їеу Ага ої яра Агу сСуз Ав Аг вв 5іу ар нів Суб сг їен оіу вто сіу ага сСух Суб ага вен Мі ТР Уа! Аго аіз 5ег цей Бін дер 35 40 45 вки сіу Тер АЇБ АБО тТгр жд! вен бек овго Ага бів ув) бів маі ТВе 50 55 БО
Ме Суб їі Зіу АВ Суб Рго Жег Зі РН АгО АЇВ Аїд Ай Мет Мі
Бо 7 75 яо
Аіз бів 16 ух ТВгобег о іви Ніб АБО зви бух Рго АзротВг Уві вго 85 що Зх кіз го Суб Сух уд! вро Аза Баг Тук Аби бБго Меє узі Кен їі БВ
Ме 15 що аБпоуйг Тйг Тнеодіу узі бегофев дій ТВб оту др кер рей іви Аа 720 125 зує Акр Су Мі Суя Х1е що «830» 93 «ії» 1 «18» ВЕТ «вії» Штучна вослідовніств «220» хв23» сентетична подіпептидна послідовність «ЗО 93 меж хр меї аг уа! Рго Аів іп іви рев СУ іем цем їв ев тер ї 5 1 15 меч Ага Фіу 3іа Ага Суб АЇв Ага дви біу ахр мів Сух рго му Ту 20 25 за рго біу ага Су Су Ага ін ніх твг Узі ага АЇЗ бек ів ЗВ АхЮ 35 БІ 45 їв біу Тгр АЇЯ АБротгроуаї ен бег Бо аго сім Уа? білоУВІ ТАг мет сСуз Хі сіу АВ Ск рго бег Біп вне ага Аїа АїЗ Ахп о Меї мів 55 7 Те а
Аїа бій жі Муз ТНК о бек зев Ні Або бен ух рго АБО Тома! вка 55 о 95
АЇЖ Бго Суб Суб узі Рго АТа бек тур аби вго мет мі феу Х18 Фів цю 05 110 ув Твг аа ТВ о тТВгР Уа) бегбобац сій ТВг Ту Ар зев йенм ме АВ ев 129 19 вуз Ахв Суз нія Сух ХВ 1 «23» «й» 338 «Дах ВАТ п «КіЗ» йтУчна послідовність хо» «23» сентетична поліпелтядна лослідовність «щЮз 94
Мет АхвВ Меї ага Уа) Рго Аїда бій іейи їв Біу се ем обей о іву тгр ї їх 10 15 цер Аго ФІУ АТ Аг Суз Аа Аго Ази біу ажр ні Сух Ро ми Ту 20 75 30 то ФіуУ Ага Суб СУБ АГРО Бен Ні ТВгОУВі АРО АЇВ бек оре ств АВо 35 38 Зх іец бі Тер оАЗЇа АБр отр Уаі ем баб Рго Аге бів ма! бів УВІ тТАг що 55 5 мак су» Хі (Ту АТа се тго бег дій Ре ага Аїз АЇВ АБИ Мет нів 53 Є а 80
Аіж а 316 фу Те 5ег іви Ні5 Агд фем фує го АхротТнк ма! Ро що 5 аів во суз сСух УВІ Рго АВ жег Тук азп вго Меї ма! бен їв сіп ї190 105 пло
ЦУб ТВг оахр АБ Біу ТВгобег о іву БІВ Тйг о тТук А5р о Ахр осей гей Аїд це 120 155 іж5 або Сук Ні Суз їв 130 «8105 «8331» 134 «Рій» РТ «2ї3У штучна послідовність «ойОх «ДЗ» севнтетична поліпентидна послідовність «АЮ» 95
Меї йбр мех Аго мі Рго АТ сів бер овен бі бевоїеу вен огеу тер 3 5 10 15
Те Ага Фіу АТ АгО Су Аа Аго АхаА біУу аїр Ні Сух рго ів Фу за 25 30 го БІУ ага Сух Суб Ага іаи ніх ЇВгОУді Ага Аїд Заг орео и Абр їви біу Тгроаїв АБр оТРо мя! Кеш бег кго АРО бін ма? бій маї ТАг в 55 БО
Ме Суб тіе Я1у АТ Сує его бег шій вве Ако Аіз Аз АБ Меї Нв 655 20 75 о діз біз 116 уз ТВ бег іву Ні5 Ага вч вух Рго ар отТвг ма го
КЗ за 95 дід вго Сує Суб уві РКО Аїд бег їх дай Рка Меї Уаі ем їів бів цею 105 1310 фу ТАК АБО Тйг діу А5а Щек тТВг обі тНе тТуг Ар ав мен іви Аїд
М Зо 325 тує АБИ Суз ні Сух тів 130 «230» 95 хаііз 15 «й» ВВ , . «ВІЗ» Штучна поспідовність «220 й й «ФАЇ» синтетична поліпептидна послідовність «00» ЗБ
Меє Ар Меє АгО ай Вго аід бів вер їв Фіу меч сви їео мем тер ї 35 15 і29 Ак біу лій Ага Сух Аїй Ага ап о сіу АбБронНів Суб вго зей бу хо та 30 его щіу все Су» су Ага Кей нів твер омаі ага ді зе іечз 515 ао 35 45 45 іїви біу Тгтв Аа АЗроТтр у! фіто ек го Аго сій узі біп уві тТвт 50 55 50
Моє Суз Х16 б1У АЇа Суз Бго Бег бій НЄ АгО АЇа АВ АБп мет Ні 655 70 75 до із бів Хі2 вух тик о5ег іви ні Ага без іух Бто дбр тик ма рга 55 що 95
Мі вго сух су Ма Різ» АЇа бег Туг ах Кго мет чаї вен її ів 140 155 о цу» таг ахр ТВе біу ма! Азпогши ТВгОТвК тує АБО АБробео ем АТЗ що 120 125 їув ах Су нів сСуя 116 330 «ійх 97 «23їз 334 «10» ВВ й й «213» Штучна послідовність «ЙоО» ШИ «ТАЗ» синтетична довпійпейптадиай восАЗзВОанНіСстТь «З» 55
Мет др Мет агд уві Рго Аік біпоіем оіве бБіу веи мжв без рев Трр 1 5 10 їх іє Ага су діа Ага Суз Аіа аАго ве ЗУ Ар НІВ Сух цк мам сіу го сіу Ага Су5 Сух агод о цве Ні Твг Уві Абу АВ 5ег о їви бій Ар 35 БІ 45 ін бі Тер оаій Ар о Тгромаї ви баб орго Аг бів Уа) 5іп Уа? ТВг 5о
Меї Суз 112 біу АЇв Суб Рго бек бій Ре Аг А)з Аїд АБа Ммеї нія
Б 70 75 86
Ав бій їїе уз Тгобаг їео Ніб Аго цей іуз Рго АвротТйг уд! Рго
ВХ зо 5
Аїд Рго Суб Су УДі Кго АЇЗ хг Ці Ап вго Меї Узі мер хів бів 190 це що зуб Жнге ар отак діу Узі бег івчз бів ТВ Туг дер АВ Сем ви Ах 315 120 125 ух ТВг Сух нів Сух Ще 3130
«0» 98 «ії» 70 «Ф35» ДНК , І «вій» йтучна лослідовність «о0У й й «Ф8ї» кинтЕтизчна полінуклестидна поклідовність «НО» ЗЕ свссаїбувс атохообксс ссосісВосЕ сстодоВсіс стостасісї достссоао «о зе садаци то «іх За «211» 48 «12» ДНК і й «233» Штучна послідовність «ОД» : «ТЇ3» синтетична полінуклестидна послідовність «цк сстсовосод ссоствастс віаіосавіо Зсадісїсто осізасаз Зк «ій» 30 «із 1 хеій» РК й й «213» штучна послідовність «да» І І , «23» синтатична поліпептидна послідовність «НЮз Мю Я мес Ажр Мет Агу Уа! го аїа сів бен вец шіу цем це) цен ен тТгр 1 5 16 15 іви аг Фіу аіза Ага Суб б1іу ажр ніх Сук Бго цем О1у Рго і Ага хв то 36
Су Су дгу ем нія тйгомаї Ага Аїй Зек озво бів аброівв віу Тгр
Кі 40 45
Аіз Ар тгроуаї зво бег обро Аго бі) уві бів уаі тве Ме Суб Хе щи 55 50
ФУ АЇВ Суб Рго баг бій ве Ага діа Аїа а5п Мет нія Аа бів 12 655 70 75 о
ГУ ТНг Баг веб Нів Аго ви руб рго Або ТК о УаР Рго Аїя РКО Сух 85 зо з5
Сух уді рго ад 5ег Тук Ах Бго Мет ма? ем Хіє бія Ахв ТВгОТВу
КК це їюЮ
Твеобіу узі бек рео дій ТЕ це АВ Ар ем іі АВ УББ Ар Сух 1270 125 ні сух Хе їх
«Ме 0 «і» 25 «ій» РТ й , «213» Штучна послідовність «ліц «723» кинтетична поліпепткдна послідовність «М» 1 мех аАзвВ Мет Аг узі Рго АТ бів іви цей біу сен зви цем без ттр 1 5 у 15
Бай Ага су вла агар Су» «НІХ ЦІ «йії» 88 «йійх ДНК й «М33» штучна послідовність «ВА | й й «КЗ» смитетична полінуклеотидна песлідовність «0 303 сіссзаоота ссзоаттос зсосаасаоо зассвссатк суссова 48 «М» МИ «о» 7 «вій» РТ ШИ «813» штучна послідовність «ох Й й «23» Синтетичний поліпентид «Нюх 133
Ав дів ніх ух Зак бін уві аі5 Ні Ага Не фух Ар іви аіу від а 5 18 15 бів дай Ве вух Аа іеу за! ев їі А1за вне дія бів М іви бів з 75 З іп Су» го вве сів дер ніх за! вуз Кео ча) дви бів маі твг МЕ 35 0 Се
ТНе дія цу Тйг Суб ма! А1й Ар обів Бек А1а Фів АВ Суб Ар оку 5О 55 Бо чег ів Ні Твгоїец) Ре б1у АБроруз ієц сСув ТВе мні АЇ8 ТВгР рев 55 70 75 во
Ага Бін тт о Тук о біу бі) мех Аза Ар Су Сув АТа бух сій 013 вго 55 з) 95
Фій Аго хв бів сСух Ре іеи бі Ні5 ух АБр ОАБр Али РгО Ап се
Я ї195 о
Рго Агд овен узі АгО Рго бій уші Абе Уа Меї Сух тик Аа РНе нів 120 155
Азроажв сів бі ТВРОРНе ів) фу5 ух Туг іен Туг бЇн Те Аїа ко 130 135 130
Аг ніз вго Туг РВа Тух Аіа го дій іви рев ква Ре Аїд Гуз вв ех 150 155 169 туг вуз віз їз Ре тТВг о бів Суз Сух бій Аі8 Аїз Ар ух діа АВ 165 170 175 сух цес ве) вго ух Мео Ар СТВ ем АГО Ар обій Біу ух Ав Звг 180 185 190
Заг дія фу БІВ ага ів вух су діа Бек їву БІВ Сх рве діу Фіц ії 2 205
Ага Аїя Ве ух із тТгр Аїд Уві А1з Аг ем Бег бів дгО вве вго 2 215 220 1у5 Аї бів Рне АЇЗ бів узі Зак губ ем уві УВг Ар бе тТВг вух 725 730 235 40
Ууаії нія твг бін Су« Суб ні сіу 450 ви ей бід Суб 818 з5В дев 245 250 я
Аго Аїа Ар Бен АЇЗ вуз Тук ХЇв сСує бін дев оп АБО баг Зв Заг 260 255 270 ак вух івм бух ів Суб Суз сім Бук Рго іє Бем біб вух б5ег ніх 75 28о 285 суз ї1і2 АЇз бім узі бів Ахп Ар обід мес его Ай АБробви Бго 5ег 290 795 Зоо іез Аїв Аїа Азр ре Уа! бір хег бух аБр уд! Су5 Куб Аа Туг АВ 305 зю зр 320 бів Аїа фу5 Або Ууаі Ре іец Біу МебЄ Бе ем тує 5Б1З Тук 813 Агд
Зах 350 335
АгО нів Вго АБО тТук бек уві зі фе іви ей АК зе) АЇВ ух ТВг 330 345 З5О тТуг 510 тТвг о ТВгорен іч су СЕ суз дів Аїа ів АБО РГО Ні БІВ 355 ЗБо 65
Суз Туг АТЖ ух Ууді вне зв Фін Ра уз вго фец УВІ Бін Бім Рго 3970 375 зва дів ап фе жів губ іп Аа Сух Зів цем вве бів бій Бей Бі 919 385 390 395 400
ТУР ух ВВе Бі Ап АЇВ ем цен Маї еВ Тугє ТВгобув муз ма! рРго а зу 515 іп Уві бег тик о рго Тнгоїви уаї бід Уві Бек Ага ажай ре Фу ух 320 425 430 "Ві біу бег вує Суз Суб муз Ні Рго бів АЇвВ ух Аг мех Ро Сух 335 440 445
Аз біз хр тує зву хегоуаї узі без дай бів ів Су щі фев ні 450 455 аю би ух ВГ обго чаї бег йзр Ага узі ТНК фу Сух Сех Тк обі) Зег 485 470 475 4во
Меє уд! АЗА Аг ги. Рго Суз Ре бег Аїа фен бів уаі АБр обі тТВг 48 БИ з55
Туг УВІ вто ЗЕ бій Ре А5а Аа Зі ТВг о Ре ВК ра Ніз 18 Ахр 505 кій
ТТе Суб ТВгобам бек бій вух бі) Ага сій Же вух вуз бів так Аа 55 520 щез іве ма)! 5із і8о Уа? вуз Ніх був Рго їу5 АЇЗ Те був 1 Бій фев 530 535 546 зує Аа узі мех Азр Ахр Не АЇз Аїд вне Уаї бів ух Суб СУХ був ах 55 555 55 ій Ахр Ахр цу бін тТВгоСу5 РВа Аа бів біз біу вуб уз ви хв! 555 520 575 дів «210» 305 «231» 584 «іх» РЕТ й й «813» Штучна послідовність «о» й «Ех Синтетичний поліпептид «ах ЦЕ
Ах АїЇв нія Куб бег Бім ха) Аїд Мі5 АГЯ Ра їу5 АяВ сви біу 18 ї 5 ій 15 бів АБ рве рух АЇя зей у! іме ЗТ Аа РВе АЇа сів їх ев вій 70 5 Ке бів Сух рго бе бів Ахр ні Узі ух без ха Аа ів Уві тТве 1 430 45
Бі Аїв фу ТБгосСуб Уді Аїа Ар сім бег Аїд біз АБп Су АВ уз 5о 55 що
Жег фно Ні5 ТАгРобен вве с1у дер ух ев Суб Те ові Аїд ТВгоіву 65 70 75 ва
Ага бів тйг тує бБіу Бін Мет Аз Авр сух Сух Аїа йу5 віп бій РКО
З) я5 бів Ага аяй пів Суб ве іем бій Мі у Ар Ар АБа РРО АчИ Бе 190 305 3
Бго ага ей Узі Ага Бго ОМ УЗ! Ар омаї Ме сСух ТАК ОАЇЗ РВЕ ніх
Мо 129 125
Ахр ах БІв біз ТВгОРНе бен ух бу Туг бе) Туг біз 118 АВ Аго 330 135 138
СИ; нів Вго Тук рве Ту; Аіа вго бій ів іш) РВЕ РВЕ АТ вує аг 145 150 355 150
Туг вух аїа дів РВЕ ТР бів бух Сух біпй а13 Аїх АБВ Кух Аа дів 155 . 1 175
Сух ква ви бо цу5 ам АБО біб бен Ага АБО бій у у Аа 5ег ї186 185 150
Зак аія бух Біп АгЯ ам фух ме АЇїа Хек ви 18 не вве бі сів 155 200 ях ага діз Ре їуз Аа тгр Аїя УЗ АТа Ак іву 5жк Вів вагу РВЕ го 210 215 20 іув дід Ффіц вйе ліз бін УаЇ бег ог уз ен уді ТАк дер ен ТВгГ г ув їх25 230 235 840 чаї ні тВе Бі» Су Сух Мія 5іу Аяр бен вен бів Суб 18 АБО АБВ 245 250 255 заго Аїд АБр рез АЇа суб тує ів Сух Ів Аа біп Абр бег ХіЄ г
Бо 755 о аг іх ви суб біз бух Су ів вуз вго іввоіев бій уз ек нів 275 280 285 бух Хі8 АТа сів У«і! 51 АБА Або біб Мах Рго Афв Ахроіви РГО 5ег зо 255 3 ів аіа Ах Ахр вне узі бій бек ух абр Уа! Су« ух ден Туг АЇ8 305 310 315 320
ОіЧ АЇВ уз Ар ома! Ре і5Бо біу Меї РбеЄ во тТуг З1м Туг Аї8 Ага 325 33 335
Ага нія БРО АбЮр Туг чего Уві Уяі ем во бев Аг Бей АТ БУуб ТВг 330 345 350
Тут бін Твготне їв сб вуз Сух Сує АЇїв Аза АЇВ АБО РгО нів бін 355 зво 365
Ку Туг АТ Муз Уві РБе дев сів РВЕ губ Рг вав Уа! бів бів рго 370 375 ЗВО іп АБп бе Хе губ біб а5п Сух єї бео вне бів бів рен Ту 616
З8Е 350 595 Бе їуг бує ве чіп Аа Аїа ін бен ма 8 тТуг ТВг Куб бух Мяі Рг 405 41 315 бів хуві бег Тйг Рго Тнг о бМвци УВІ «10 Уа) бег Аг АВ ів бу ух 480 425 439
Уві Біу бег уз Су« Сух суб Ніж Рго бін Аза вух Ага Мет вго сує 435 4430 345
Аїа бій Абр Тук цен бек уаї ма іее аяп бій ем Суб уд ви нія 58 55 а
Фів Куб ТВг оБРо Узі бер Азов Аг Уві ТВЕ уз Сух Суб Тиг обі дек 465 470 475 480
Меч Уді Ап АгО Ага Бго Су бе бег дів зви їм Уаі Ар бі ТВ 485 я90 435
Тук уві вБго фу БІ РБе Ах Аза бід ТВг РВЕ ТВг о РВеа Ні Аз Аве що 505 510 ї18 Суб ТР мво Бер Ов ух 16 АгО бій жів вух ув бів твг Аїд 515 525 ах ісп уаі бів ер мі мух міх мух Рг вух аїВ тиг оруб Бій бій фер 530 535 540 іу5 Аїз ма! Мет Ар Ахо РВЄ із Аіа Ра Уві сій вує Суз Суб Ку 545 550 555 55
Аїй Ар АчрВ Бу О1ци Твгосух Не о Аїа сів бів су уз вух зви ха 555 «а 575
Аїв АЇВ бег бів діях Аїа івци біу
ЗВО
«2303 МЕ «яії» 585 «е3йз ВВЕ й «АХ» штучна послідовність «ВО «ЯЗ» синтетичний поліпептид «Ме 305 захв АЇа Мі ух заго біз Ущі діа Ні дго вне ух Ар ібец сту 51 і 5 10 15
ЯМ Аєп о вВе ву Аа ец Уді сеу їв Аза ре Аїв п Ту цей бій ях КЗ бі» Су вгОо не сім Ажронів уді вух шу уві аби бід Уві тйг вів 35 за 45
Ре АЇВ бух ТНгоСух чаї діз Ар обі) хг аїв бій АБ Су АВ Був 50 55 «3 бег іеи нів ТР оіау Ре біу а5р вух інв Се Тйг уві АТ ТАК вви 55 70 75 що
Ага Бін Тве туго біу бід Мет А1а Ахр ск сСух дія ку іп Бі вго 45 Е З: ій Ага А5а бів Суб РВе іву БІВ Ні уз Ар АБр АБИ РКО АХ Му 106 105 о
Рго Ага сви Уді аАго Рг бін Уві Ахромні Мет Су Тг о АЗа вне міх їв 20 123
АБр Аа ів біб ТВе Ре ібеи вує вуз Тук кам тук Офіц їі2 Аїа Ага 130 135 їю
Ага мів Вго тук РНЕ їх Аза вго віц фез іец ра не 313 ух Ага 145 150 155 150
Туг уз Аїа АТа РЕЖ ТВг Обі Суб сух бій Аа АЇЗ Ахр о Сух АТа Ав 155 170 175
Сує ішйи ей вго ух рез А5р БІ ів аку Або бів ТУ Був АТ ет 180 185 130
Зак діа Куб іп Аг Кей ух сух АТя бЗег їви бій щує вве біу 01 195 о 505 ага дів РВє ух Аіз тТгр аа Узі АТя Ага ев ер бій Ага ве рго 26 515 228
МуУх Аїа біш рРйе АЇЗз бін Узі его суб рев Уді ТИР АБ Цеу ТВг губ 25 230 235 о
Уаї ні так біо був Суз ніх бу Ар іо цез Біб Суб АТА АБО АХВ 245 250 255
Ага Віа Ахр ем Азія бух Туг К1е Суз бін дело сій Ар бак Те бек 255 275
Хек Кук ім вух бі Су Суз Бім рух Бго Бен осо Ту Бух бек нії 75 яВо 285 сук хів АЇж бін Узі бів дей АБО сів мех го лід ахр Бен рго дек 250 235 306 зви Аїа АЇЗ Абр ввє Уа! бів бек рух ажр ов! Суб бух ах тТуг А1В 305 зіай 3їх КУ бів аів ух АБр уді РИш ред Б1Уу МЕ БАР ін Туг Її Тук 418 агу 325 330 335
Ага мі Рг 358 Туг 5ег уві Узі ів зер ів га іви Аа ту ТВ 34 345 350 туг щіц тТВР ОТВк рев їн вує СУЯ сСуз аіз Аїв яід Ак Рго ні «и 355 350 355
Су» Туг Аїд мух Уаі еНе АБ бій ве ув его цен Уві бів сів его їі 375 їяо 5ій джип ви Хв фуз Біп ахВ Сух біпіви вве вів бій мев Ту и зх 190 195 яю
Туг бух Рйв бій Аби Аїа ен без Уаї Акб тує ТВг губ ув Уді Рго 405 о ЗК бів ма! Жег тВг РРО ТВг ода Уві бів Ул! Хег Ага Ап ве бі бух 43 5 330
Уді біу Бек іуз Суб Су ух Ні Рго ії Аїа уз АГО Мек его Кух 435 ча 445 аіа біз абротуг іви баг у! Уа! Бен А5а бів ви Сув уді ей ніх 450 455 450 віз ух Тк РМЗ Уа бек Ар Аг Уа ТВ вух су сСух те обім Жак 385 470 475 40 ме хаї Ал АгУ Ага вго Су РВЕ ев АЇз беу об Ма) Авр Бі тТвг 485 390 495
Туг Уа)! Рго фу бій Раш Ахл о АЇВ Бін Тит РНя ТВгОРНе Ні АЇЯ Ар в 505 5
Х16 Сух ТВгоїез баг обін рух біб АгЯ бів жі суб туз Бій тТвг лів 33х 523 525 іч уаї біб їв Уві фу Ні суб го ух АТ ТВг Суб БІ ой зе 530 515 іо іу5 Аз Маі Меї Ар оАБо Ре Аза АїАа Ра УВІ бів Ку Сух Сух вуз 545 о 55 БО
Аіа Авр аБр вух Зі ТАК оСух РВе о АЇя Зів Бів Зі ух гу веб Уж 565 5783 575
АТа АТ бек бів Аїз Аа ів оіу ев Б1У 580 585
«а» 106 «иії» 02 «817» РЕВТ , «ії» Штучна пасяідовність кад» «ойї» Синтетичний поліпептид «а» 306
Ар Аїд нів іух бек Зі) уз! Аа Ні ака ББе ух Ахр ів 6і1у 51И 1 ін 10 15 ів дян ре З Аїв ік уаї сен хів аїд й Аїд Фів тут їво бів ді 55 ЗО
Фіп Суб Бго Бве оз Абе о МНіз узі ув бен уві Ап бів уді Тег бів 35 40 45 ває АЇВ ух Тк оСух уаї АТа Ав сі Хеб Аїя бів Аа бу5 АВ огКух 50 5 Ба ек їез Ні ТВг ва) Ре ЗУ Ар орує ве сує ТАе о Уаї Аїа твк ви 70 5 Що ага бів Тве о тук біу біз меї дій Ар обу» Сух Аїа Бук бів бій гео 5 Зо 95 «іш аго ахп бін Сух Ве фев бій Ніб Куб АЗр АР АБИ РРО Аяп во до 105 мо го Ага іви ма! Аго вго бій Уві Ахроуді меж Су Тк аз вне нів це 120 125 зжхр деп бі) оїй ТВг о зйе сец мух ух Тук сам тує Бій Хів Аа АгЗ 138 155 їі ас МНіх вро тТУуг вне ТУР АЇй вто Зіц ів ій бе РВЕ дів фу го за 150 55 150 чук вух А1З Ав Ре ТВт З» Суб Сух Бі» дів Аа АБ губ дів Аа 155 ї70 175 суз ви фев его уз сем ар 1 іеи аАгО Ав Фів ду гу Аа дег 150 15 190
Бек АЇФ вуз БІЙ АР ви фу Сух дід его бен Б1п хе те щу 1 155 ОВ 205
Ага Аа вве ух 5іа Тр Аа Уаї АЇа аг гец бак іп Ага вве вро 218 215 та ув Аїа бій вМе Аа біб Уяі 5ег зуб цей уві ТВЕР АБрорец ТВг губ 255 250 235 250 чаї нів твг обім сух суб міз сіу ар ен ьжи ії сСуз дів Ах Ер 235 250 25
Ага іх Ахровєв АЇВ Цує туг 312 Суб бію А5ап бів Ар обек Ї16 бек 260 265 270
Бек вух феч їу5 бін Суз СУБ б1Ц ух йго ев ви йій ух бер Ні 275 ТВО 285 су хів яв біб Уві біш АБИ АБр бів меж Р АТа Ар ем вго Заг хяо 255 з цец Аа АВ Аби Ре уді сій Зеє мух вхо чаї Сух цуб Ап Туг Аїд 305 що 315 За із Аа уз ар УВІ вне і6м біу Меб Не вен туго бів Туг АЇа АгО 355 330 335
Ага нії РгО АБ тує бег уді ущі фецй мез мен аго це АТА бук ТВР 340 345 350
Тук біо тТАг о тТиговец бій бує Суб Суб АТа Аа дія АБробго Ні Ти 355 Б) 365
Суб тує Аїа іу5 уаї РВЕ Ав бів РВЕ огує го фен уві 10 Бі Рг 3 375 БЕН бій Аза фен Зв уз бій Ахи Суз їм фев й діб бій ее бу 910 585 390 395 ща
Тук уз Ре бів Ахп о АЇя бе ївц ма? Аго тук тВгофух куб маї Рго 405 210 415 сів узі бег тве о вго Тйг оіви Узі «фу Уві 5ег о АКЗ Аа зво Фі ух 420 425 430 узі біу бег ух Сук Су цу міх вго бів АЇВ уз Аг Мет го Кух 335 3405 445 аіа бід Ар Туг ви бБег Уві уаі бец Аква біп бен Суз Уві ву Ні 450 455 450
Фім вуб тйг ого уві 5ег Ахр о аго узі ТВгогу5 Сух Суб ВР бТи Заг 465 о 25 480 зви Уві А5п Агд я Бгто Сух ВНе Бек Аїд і бін Уа)? Азр бі Те 48! 330 Я95
Ту уві вго ще бін вве аяп А бі те вве тТве рБе нів Аа Абе
Б 5 що
Ті Суб її іви 5ег обіб уз бі Ага біп ї18 Куб вуз бій тйг Аа 515 20 5а5 івч уві сіб вен ма! губ МНіх суб Рго уз Аїв ТВг о бу5 019 бів їв 530 535 550
Гух А1ЇВ Уві Мет дер во РНе АТа АЇВ вве уді сій був сСух Суб Ку 545 55 5355 5О
АЇЕ Ахр АБО гу бі ТВР оСу5 РВе 818 бій бів Фіу вуз ух вет У! 555 570 575
АЇЖ АЇв Зег дів аз АТа із о1у зеу Фі біу біу біу Бек біу б1у
ВО ща 550
Зі еіу абс ту оіу біу Біу бек Ай Ага 5955 БО «10» 307 «ії» 533 «232» вит й й «2і3» штучна послідовність «йй0х й «РЕЯ» Смитетичний поліпептид «Ох 107
Ахр Аїв ні ух Бек дім уві АЇВ Мія Аго Бре фу АБр іє БІ1У СВ 1 5 10 15 ів Аа вне цу Аіа сен уаї Кей же Аїї кВе Аїх БІВ її Ми вів 2 25 - бів суб вго ква бів АБО оніб маі Куб без уві ази бів ха) ТР БТ» 35 А) 35
Те аіз муз ТВг Суз чаї із Ар 1; ет Аа ої Аза Суб Ар ух 50 55 Бо ес цев ніх ТВг бе рве сіу АБО мух сво бух ТВгома? Аїа те ев 55 70 75 що
Ага бів ТВР тує сіу біз мет АЇа 855 су: сух Аїа ух бів бій бра 85 щ 5 бін Ага Ай Бім Су ие іс бів нії уз АБр о Ахр АБ рго ах їБи 100 це 310 вго Ага каву Узі Агу кго бів узі Ахр ма мех Сух ТВг о Аіа ре ні го 125
Ажр Ах біз сів ТвгоРБа фен обу бух Тук бу туг бів хі Аїа агу 130 335 150
Ага Мі вка Туг впе Туг Аід рго біз фей о беоу Ре РВЕ АЇА ух АгЗ 145 150 155 159
Тутг уз А! АЇїа РНе тТвб осів Сух Сук бій АЇа АВ АБО Гуз АЇВ Аа 155 170 175 тую вес їжи Рго уз Цец Азр біз сен ага а5р ов біу уз АЇЗ зер зво 185 о
Бек Ав Куб ій Ага цею щу гу Аїа Бгто єв ія рух РВЕ 01у БІВ 155 200 205
Ага АіЗ Рае іУХ АТ тро АЇВ Уді АТ Аго іБи баг бій аг РВЕ Бго 216 755 220 щу Аіз єї ве АЇш сі Уа! бек ух гей уві ТР дяр Цен тйР ру 225 2 235 240
Уві нів Тнг обі сСух сух нів б1У дер іек іо бів Суз АЇТА АБО АБО 245 50 755
АГРО АВ АВ зво АЇВ уз тТуг хів сСуз ім дз піп Ар обетг Х16 Бог 2850 255 о его фу во вух сів Суб Сух 16 Куб Вго ви бео бі ух Бек нів 875 м т85
Суз Хіє Ав бі) Ух! Бій деп Авр оц меї Рг АТа Ар оваи го 5ег 285 Зоо іїви Аа діЖ АБО ве УВІ сій 5ег губ Ажр ма! Сує фує АЗп Тук 314 305 310 що Зо бів АЇВ ух Ар уві Ре цен біу мет ей ем о туг Бін тук ДІЯ Аг 355 З30 35 ага ніх го АБО Туг бег уді узі зев сви івм Ако мен Аїа ух ТВе 540 345 З56 тТуг бін тв тТВе рез Фо уз сСух суб АВ АТА Аа АБО Рго ні ОЇ 355 350 365 суб ту дій іуз Уаї Ре ав сій РНЕА гух вго зе уаі Сів 1 его 370 37 180 сіп АБ без жів Бу5 сій ай Су БТ гей вне сів сій сер Біу 51 385 390 зах що тТуг ву РНе сій А5 п Аа сем ів УВІ Ага Туг ТВгОозфув куб мі Рго «а 316 415 іп омаї Бег тТВг РКО ТВЕР обец уві ів Ухі Жег аАго АБ ви біу Дуб 358 325 АХ чаї шіу Зег ву Су Суз цух Ні Ро 5Тб АТа уз агу Меї рго сСуз 415 зо 445
АТХ біо АБО Туг ієм Зег Уві Уді цей ап бій ієм Суз ув) ви нів 450 455 збо
Зіз фу ТВг РгОо за) баг Ахр Ага Уді ТВк фу Су Суз ТВ вії 5етг 455 Уа 475 380 їз маї Ап Аго Аго Бго Суз Бйе бек АТа ів бів Уві Ар осів Те зве я 335 тук ма! бВгб цу 610 РБе абп дія бій ТВг оба ТВ оРНе Ні А1а АхВ 500 505 510
І16 сух ТВР іо Зег бЇю ух бі: Ак бій Хі губ руб біп тТВг Аїя іх 5УО 525 іжи ма! сій і Уві фу5 Ні ух Рго ух Аза їйг суб бів бій сей 530 535 ав мух АЇа ві мех АВ Абр ве Аїв Ав бВе уві бі бух сСуз Су5 ух 550 555 550
Аз АР АБО вух бін тТвВгоСубх РНе АЇз бів ін біу ух бух Кави мщі 585 570 575
Аїв Аїз Бек бій Аза Аіа ів о1Уу їв бу у Біу біу баг бі у 58О 585 580 сі пбіу бек бБіу сіу б1у біу Бег АТЯ Аг джй 595 ОО «йі0х 108 «ії» пу «лах ДНК й , «ФАЗ» втучна йоОснідовність «0» «КЗ» Синтетичний влігонукластид «4002 308 акддасасва чадтссссоас хсвостсстЗ зоВстсктас астсеівасє сезаВассе БО аЗзаєвіссясє чсаасадаас ссассассся сксазоасссо восетасто ссвтстасах 120 вкодісавка саїкостуои зосстаовс садоссдатх заобассахс яссясовово І80 зс(вказвіЗа сксаїсосяах созссосвс ссозоссвої сссЗаосвас аавсатвсає 230 шосвовіса вовсоацєст Зсассоессто задсссався соодтаєсваає вес ЗО шіасксосся зстзсазтсс саїоовтастс акїсававоа ссожсассоз зас З сзуасствІЯ зтовсттоєї зоссваазвє тОссвстоса татуз 305 «ЗО» 309 «3їх 405 «ій» дик , кі» штучна послідовність «Ох «23» Синтетичний олігонуклеютид «Нв НВ атосзсатва додіссссос гсадстсстО оБостсстоє хаєтстодся ссозоотаєсс Бо зоасатасус зсаасопоооа ссястс стсзЗосксо оосоєтОсто сааїствасе 120 веоЗтссясав сВісостоада звасстооас фовоссоЯвВех вуста зссасвдово 380 шсзадтоз ссатвтосат содсокоатоє ссоаоссвах сссоцосонс дазсвсосво 20 ососзовссвз здасоащосї зсвссессто заВсссаака спасає зе 390 зїзсссдссв зстасаатсс сатодіостс зуїсаззаЗа ссуасвссуя ЗК 35 казасстзтє аїЗасткусєї зпссазаоас тассястчса таїоа 05 «ЕМ 110 «іі» Б «21й» ДНК , «Аі5» штучна послідовність «ХО» й «Тай» Синтетичний олігонуклаеотид «МЮ» 3130 ахоозсатоз Фі сесссос гсвостсста ваастосізє тастеєтоцєє сеозоцЯсс 5 заваївтези псвасвозоай ссаскаїссв стсвоаЗсеся осеїтасто сек ас о зсачфсссясЗ сазасочнс застає сад азс вссасоЗаЗ що втосзаятоз ссатососяї спрасотос ссозоссвує гссовдсооє заасатасає ко вдсосаваїса вопзсязасст всгассосств задсссодаса судтоссяде асестаскоє Зп
Вівкссясса зксізсаатск ска ЗКтс діхсавахова ссдасассво падхЯсасте з савзсстят зкозсттоК здссзаввас їссвктвєя гаКоз як «30» ЩО «233» 405 «вія» ДНК й «213» Втучна послідовність «во» «Я» Симуєтичний овігонуклаютид «8005 ДІ затоцасзтяз подісессос ссвостєсто зеостісстве тассстаосі сеововтосе 5 заатасасяс Ясвасвавнв сеастокссо стсдусссо поса сс яс 120 асцесксоко суссовасва зассстооє сЗопссовВе пашостомс дссасодово 180 порсааотоа ссвсокасаЄ софсосотос ссдаєсяяї гссопзосопс авасатосає 8 зсосвоаєси аасовесст осассрссто аздссковса собіЗесвос ЗссстВсОє 35 засссоєся зсіасавїсс саївоїстіс атісвазаца ссдасзссоа атак 60 садасстатз відає ттосї здссзавнас іїзссвстоса сатох в «2302 333 «Іі» 405 «012» ДНК «13» штучна послідовність «Каб» «айЯ» Смитетичний опігомуклвотий «4002 2 зІдзасякая озоксессас тсазктсско зодстсстеє хасестоосє ссозаціВес о зпатзтвос зсваєтідов ссасіВїссо стспоксся осот СОН 120 звсоЗсссоса сзїсастода зовсстааоює сЗофссвате закастос зссасооао 150 укасзазтіва ссяїтаквкатї совкосатос ссдазсказа сссовасває зазсакосее 240 шосзодтса зоасавссх Ясен сїЗ авшессоаса сопіссвоє зссстоссЯс зо шідссстса зствсввТсс са оєто агісавзаза ссоасвесоя Зав 35 свозсстзсЯ зхязсттоаК зоссаззанс сссвстоаса така 435 «и» 3 «21ї» 405 «иїй» ДНК й й «813» щтучна послідовність «Ох й «23» Синтетичний полігонуклестаа «юЮ» ЗІ й авідсвсаїов ост сескоє ссадсксств ЗепстссКоЄ свВессКоКх ссдавОєкс 50 щвритштосос псазсотшююа ссастотссп сесооосссо зрсетасто скотстосає 120 дгЗзатссока кос тоЗа зЗасстоЗзас сеавссоа зоуїока ЗзсеасОоза ї5О зІзсяизатоа ссактососає соососотас ссозосвасх ссозсзусавс звасикасве 54) ссЗсвоЗатсз зозсозассї Зсассессто задсссоаса сзркоуссавс сет Оє Зо
Чтасссосса зсізсавісс сасовкоссс зіїсзазаоз ссоасзесоЗ Засаесосе ЩО сззасстасоЗ зсозескУуєу зоассзаацасє тоссастоса тасов 315 «М» 34 «її» 405 «йій» ДНК й «ії» Штучні послідовність «вах «Їх Сянтетичний салігонуклезтид «Нюх 14 зкЗдвкатсва доасгтссссоЯс ссаостссто зоЗкЕсстаєс тасестоасі ссовпвдсе 50 звзаІзкасас шлакочоЗа сскастатссоа стсовоссся застає ссухстосає 128 асвдутскосо суїсостовЗа здасссоадес созуссоах Заст с дссасозозо 185о пезсзветаа скатхасах кЗасосагоє «созоссвоя зссЗовсос: аазсвіЗсах АВ асясаваїтса зуасвазскї зсассасстоа задсссоася содіоссацс ссср За окоссспеса дсізсаватсє саїощтостс зіжсзавзоай ссвасвссоО ФІЗ се ЗМ савасстато зксовсткЗї зоссвавває сассастосєд така 405 «М» 315 кУїіх 405 «їй» Щтучна послідовність кигОх «3» Кимтетичний олігонуклеотид «ДК 5 зсрнеакда азс гсвостсстВ пост ссоує свстстодсх ссоаовтасе що зозсутЗсої дсзасаоваоя ссастзїско стсодосссо досвєцаста ссвсстосве то зедоасссвсв сатсострах звасстозоє хооуссовтї достаток Ффосвеовова зва укзсзазіза ссаїЗкусах споасисятос ссцарссваї їсавсвсоас ззасатосає 280 песавасса возсзаоскі зсассзксто задсссзвсв сефсассавс чес Зо
Ідсоссуєся дстасавтсс саїцесостс втісазавов ссувсассоо авїсВсе 35О свуасстатоа абрастїв зоссазавас тоскеазствса ката 35 «30» 36 «711: 5 «іфйх ДНК й й «213» штучна послідовність «вх Ох й І кфгйї» Синтетичний олігонуклеатий «не» ЦІ щи акдовсятча цодіссссвс тсзастссто Заст естоує сасессуєт соц 5 «васштасис ссазвсовоза ссаставссо сезасесо пасок сексі акас 125 шен ссевоО сотсостЯва ззасствоцє сера ваВіастяте зссасоово 156
Зхосазватав сквтіатасат суасясатує ссопздесазї сесоазасцас вавсвтосає 240 ссосзЗатся завсозасет опвсососстЯ аздсссоаса созїоссвос зссстостис Зо зтасссасса осізсзатсс сатецтостс актсвазава ссзасассоа засос З карасстз згзасекако зоссавацас оскассвка свтода 505 «Ма «2» 402 «їй» ДНК Й й «2433» штучна послідовність
У
«-Я3» Синтетичний олігонуклертид «хх У ахозасаєоа зватесксВс ксвоестссто возєтессток састстаеї ссозадтоєс БО взатякосис осазкоавода ссветатеса стспосссо дасоктоско ссоасестосає 320 зепзїссЗсо сеїсесточа азасстізацє содиссуасх дозіостахс зесвевдазаЗ зво едсазосоз ссзеососах сзодсосотос ссзазссауї тссовасвоє завквтасає 240 дсецсавассв зоз:озасав ссасасссто зазсссоаса сокоссває вссстасє щю вінсечнеа Зстасваєсс саїтаскс аіїсзавава ссвасаксоЗ зе 350 саЗзасстату вівасткокх доссававас тссастока та Ох «Я» 18 «211» 405 «кі» ДНК , , «Ті5» Штучна послідовність кох «баЯх синтетичний опігонуклертий «МЮх ЗІ зкоззсвтає зоЗуссесяс їсазскксто оуосксскщє тасістуВсї ссозаЗтосе Бо зозцчиоєц: есвасочвов ссасткссв сісзавсксо «сао сус 123 асодіссосЗ коїсЗстцов заасстоцзас тазссових зафостЯс сен 15 зкосвазізз ссатуїасає спосдсокчє ссозасєвеах кксвоосос завасатнає 230
Чедсзавкся зозсавосст сассоссто задсссоаса сеоіоскавс псестоктВє ие псвсссЗсся астасастсс саїодтостє зіїсазавцй скозвсяссоу око сосе 350 свозсстасс аїзасттЗї зоассазава: сассастєв тата 495 «5105 а «КЗ» 405 «із дик й . «иїї» Штучна послідовність «ейОх «Тйї» Синтетичний одзігонуклаотид «003 ЦО й зхозасатоз подтсскссос хсадстссто зовстсско тасістовеї ссозоВЕВес во зозссатасос зсязсуооза ссзстатссЯ сова сссю асист се тасас 120 зсаассвсв суастава азасстваВє саоакеватї заз зесасводзаз 130 пізсзадтов ссзтвтасаї сопсосотає ссозассаої тсосоповсдас вазвсвтосає ко сзсачатся зоасузасеї осассоєсто азосєсовка содтаєсаоє дскстастоє щюЮ
Зтостсвсса ставав сатОасВсс втіх авваса соВскассов ЗО ОСКЕ З саорвщстато атаксії зрссазазає тоскастоса так9а 5 «Ме 120 «2їіїх 405 «2302 ДНК й й «хі3» Штучна песлідввність «220» «ййЯ» Синтетичний олігомуклеотид «Нюх 120 акздасатов зоддтєсссує ксадстсста поапетестоє тастставех ссозавіоке що возіотясяс осаакододЗа ссастятсся сісоЗасссЗ ооасаїтасто ссосстосас 120 зсниссосЗ сегсястода авасстоаас тяЗцссЗаїх зЧаотасіїс оссвсЗдозЯ 188 півсваціоа ссзтотосаї сооксосетес ссозоассаве сссодасцвоє зазсатосаєс 80 цсосзоакса зовсвазксї зсассуссто азасссваса совтоссадє зссстоссае ЗюЮ чсдсссезсса зстасазтсс саїтвотастс зіїсвааава ссзасасеєяє зате зва сзавсстатЯа асозсітосх зоссзавЗас суссвсцва їато5 405 «Ох 121 хаії» 405 «Від» ДНК «Я3ї» тучна послідовність «Ох шо «й2Їх Синтетичний опігонуквеотид «НМ 123 -есззасатза звесссксос ксвасксстВ ЯЗЯстсстє Бастствасї серии БО завтотоасос дсвасюєнв ссастатксй сісздасксо оса тоєто севтстосас 120 зсодіссоясоЗ соаїсостоЗа адасстодуас тоочесЗа одокоссуЕ десасовано 180 псдсвадтив ссасотосах созсасесоє ссзаоссзеах сосерасосє аавкатусае 230 зосвязісєв зЗасяасст Зсвссосстя заЗсссазсв соаівссває весно 3 зсасссоєсз Зсїзсазісс сатудкостс аіїсавазоз ссасявся пасує 350 сзоав:стахв зідзеттаКх зоассавваве тассастзса тата 405 «40» 353 «2311» 405 «йі8» ДНК , й «813з Вучнз песлідовність «5» . й «Її» Синтетичний олігонуклеотид «Вб 32 зхздЗасаїва зоіссесоє ссадстсст пзастескяс кастстасє сс 50 здасатисЗє ЗзсзасвоЗзоз ссаствтссо ставка паса ссосстасає 120 зсвЗїссаса соссостодв азасстовас їЗпассазіє адзасосєдєс зссвєувазо 180 шШіосавуїва ссзтотасвє судсЗсосвс ссвавссває сскодасвоє ваасатаєв 290
Вдскесацавтка зджеовасст зсвссассто авзессазвеса сОвтоссвос ЗсскіУсТОє ЕН
Зсзсссосєса Зстзсваксс саіоцтасес аітсззвазцй ссдасассод пзастсоасе Зо каозсстата зхвсікщіЕ зоссазазас тоссвстоса або БІ «Б 123 «кії» 405 «ій дик й «33» Штучна послідовність «ВО» «ееї3» жинтТетичний олігонуклевтидй «ай 33 й агодасвтця оЗпткессос ссвостесто опостсктЗє тастстоазсї «сао що азатвтасяс зсазсовав скастатссВ сісуакесВ весвітасто ссуїстоесає о асдатссесо сЗссВескооя зЗасствозк тодаєсоасї озотостеєс зссасоцова 1Ко чтдсавиатоа ссаквіЗкає супсосикеє ссозоскаці сссооаЗкаце заасакосає за песевсавзасса ззвсВадкех застосо ззесссрасв сват оскацє вес еос 58 псдескасся пссасанксс світ схс актсаазава ссопасассою зоївазвссс зо зсвасстяте атдасттотє аоссзаздає соссастоса хазсоа 435 хіх 158 «2335 АВ «вігх ДНК й «813» йтучна послідовність : і «23» Синтетичний зпігонуклестидй «ВО Я зсзозвсасоз язоаїгссссяЯс їслостссту звасесстос састстуасо ссозоВсосе 5 зззеЗтоасас опсаасоаоца ссастяаїско сссорасссо засзїтоєто ссатетсає 120 зічтссдсо сдісЗстода зовесстоцас тост ЯаТОсТс десвеоувно 150 отасвазтвв ссаїзкасає соусЗсосос ссдазссвиї їссовосозчє азасакуєак 233 зсосаоатса азасозваске Зсаєсессто азвсссоавка сотоссвос пссскоусео дю зкосссасез осіасватсс саіоуїастс віїсавазоа сезасвесоа зас ссусе 55 свуассєзіч атоасстЗсх аазасазвавсс кажасіЗка тата 305 «305 1525 «ії» 395 «від» ДНК , «гії» щтучна послідовність кг» й «ий» сСиктетичний олігонукавотид, «4002 425 й зтІдовсаїза зодтскссВс ссавстссто Зп КВСссВОК сосок 50 впатаїссооз зссастаїсс зсісповссс ззпсЯєтасі оссоїстяаса сасоцесоє 120 зЗспїсоство запзесєдоЗ стпрзоссозт сопотустає соссасзоаца затосвацте 180 авссатцкоса сспзсосЯїо сесувассво сжссодосоЗ сзазсатаса сесасзоаЕе 240 задасовасс тосассєст заззсссдас зсоадтоссво суссстоєто саїосссвясе ою застасватс ссзсЧососЄ саїссазавс зссвссассо пзоасеїсасє сеззасствх 360 заїзасттсє тадссазаца стоссвстос зсатда 396 «230» Лав «ії» 335 «Ай» РК й «йі3» штучна послідовність «Кох «Ж» Смнтетичний лоліпаптид «4005 36
Ме а5р мех ага уУуаі го Аіз бій вен фен Біу іец їжи Кец су тер і 5 19 15 ев Ага су дів Ага Суз Аїа АгГУ во сіУу Ахр нія Су5 рве мен ЯМУ
Ж х З
Рго біу Ага Су Су Аго оіен нії ТНгоуаї Ага дід Бер рен 51 АБО 43 45
Кец ех Тир АТа Ар тро НУ ен Заг о рго Агу бів Уаї бів уді те м ї меж сух Хі іу аіз Сух РгОо его бів РВЕ Аг Аз дів Ап омеє Ніє
БІ 70 75 Б лів сів 316 гу Тйк бег ів Ні гів іу5 РКО АЗОВ ОТГ Ма) вко що 95 аа Рго Сух Су Уа! Рго дія баг Туг ахп о рго мет Уді бец тів бів що 5 що
Ку ТВг ще твВгоБіу Уві бер ів Бій ТВг Зуг АБр АБО Сец кеи АВ на 1580 125
МУ Ав сув нів Суб Те ке «ЗО» 397 «Ме 405 «ах ДЕ І І «3» Штучна прілідовність «сойВ» І «Ей» Сяентетичний олігонуклевтид «00» 13У зхцзасатоаз чодссссЗс ссвастсстя здастсстаЄ свссстпоєї ссзаацкосс 5 зодастоагосяс спсзасодоЗза ссастатссо сісодоссс срсастаска сезсствсас зга акдосесска сржастюща заасстацдеє сооБссоаїх ого ЗссзсоцоаЗ 158
ЗІдсваосова ссясакасаї сЗзасОсакос ссоваєсвах їссадасоВе заасахосас 240 дсюеоавбаїса зажчвнист дсассоєсто азосссдаса спотоссацє псссстостос за півсссоцсса зсізсавтсс сатоцтастс атісазаза ссовсассов адтоссвстк зво сзаасстато атазсі зоассдзвавас СмевзстЗка сатов Я05

Claims (31)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Димер, який містить два поліпептиди, ковалентно приєднані один до одного, причому кожен із зазначених двох поліпептидів містить одну з таких амінокислотних послідовностей: її) «ЕО ІЮО МО: 30; або ії) ЗЕО ІО МО: 30 із заміною треоніну (Т) у положенні 90 серином (5).
2. Димер за п. 1, причому кожен із зазначених двох поліпептидів містить амінокислотну послідовність: БЕО ІЮО МО: 30.
З. Димер за п. 1, причому кожен із зазначених двох поліпептидів містить амінокислотну послідовність: хЕО ІЮО МО: 30 із заміною треоніну (Т) у положенні 90 серином (5).
4. Димер за будь-яким із пп. 1-3, який відрізняється тим, що щонайменше один із зазначених двох поліпептидів об'єднаний з гетерологічним поліпептидом, необов'язково - цей гетерологічний поліпептид може бути сироватковим альбуміном, білком, що зв'язує мальтозу, або імуноглобуліновим Ес-поліпептидом, при цьому цей гетерологічний поліпептид кон'югований з М-кінцем або С-кінцем згаданого щонайменше одного із зазначених поліпептидів.
5. Димер за п. 4, який відрізняється тим, що згаданий гетерологічний поліпептид є сироватковим альбуміном, і зазначений сироватковий альбумін є людським сироватковим альбуміном, сироватковим альбуміном яванської макаки або бичачим сироватковим альбуміном.
б. Димер за п. 4, який відрізняється тим, що гетерологічний поліпептид є людським імуноглобуліновим Ес-поліпептидом.
7. Димер за будь-яким із пп. 1-6, причому зазначений димер є М-глікозильованим.
8. Димер за п. 7, причому цей димер є гомодимером, в якому два зазначені поліпептиди містять однакову амінокислотну послідовність.
9. М-глікозильований димер, який містить два поліпептиди, ковалентно приєднані один до одного, причому кожний із зазначених двох поліпептидів містить амінокислотну послідовність Коо) ЗЕО І МО: 30.
10. М-глікозильований димер за п. 9, де кожний із зазначених двох поліпептидів складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 30.
11. Фармацевтична композиція, яка містить димер за будь-яким із пп. 1-8 і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або допоміжну речовину.
12. Фармацевтична композиція, яка містить: М-глікозильований димер, який містить два поліпептиди, ковалентно приєднані один до одного, причому кожний із зазначених двох поліпептидів включає в себе амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 30; і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або допоміжну речовину.
13. Фармацевтична композиція, яка містить: М-глікозильований димер, який містить два поліпептиди, ковалентно приєднані один до одного, причому кожний із зазначених двох поліпептидів складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 30; і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або допоміжну речовину.
14. Молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує щонайменше один із зазначених поліпептидів димера за будь-яким із пп. 1-10.
15. Вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 14.
16. Клітина-хазяїн, яка експресує димер за будь-яким із пп. 1-10.
17. Клітина-хазяїн, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 14.
18. Спосіб одержання димера за п. 1, який включає: культивування клітини-хазяїна, що експресує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність: її ЗЕО ІЮО МО: 30; або ії) ЗЕО ІО МО: 30 із заміною треоніну (Т) у положенні 90 серином (5); і очищення експресованого димеру.
19. Спосіб лікування ожиріння у суб'єкта-ссавця, який включає введення цьому суб'єкту димеру за будь-яким із пп. 1-10, причому зазначений димер вводять в кількості, ефективній для лікування ожиріння у цього суб'єкта.
20. Спосіб лікування гіперглікемії у суб'єкта-ссавця, причому зазначений спосіб включає введення цьому суб'єкту димеру за будь-яким із пп. 1-10, причому зазначений димер вводять в кількості, ефективній для лікування гіперглікемії у цього суб'єкта.
21. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що лікування приводить до зниження споживання їжі суб'єктом.
22. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що зазначений суб'єкт є людиною, і лікування приводить до зниження маси тіла у цього суб'єкта.
23. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що лікування приводить до зниження маси тіла у згаданого суб'єкта.
24. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що лікування приводить до зниження споживання їжі згаданим суб'єктом.
25. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що зазначений суб'єкт є людиною, і лікування приводить до зниження рівня глюкози в крові у цього суб'єкта.
26. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що зазначений суб'єкт страждає на цукровий діабет.
27. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що згаданий суб'єкт є людиною.
28. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що згаданий суб'єкт є людиною.
29. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що згаданий суб'єкт страждає на ожиріння.
30. Спосіб за будь-яким із пп. 19-29, який відрізняється тим, що введення здійснюють за допомогою парентеральної ін'єкції.
31. Спосіб за п. 30, який відрізняється тим, що парентеральна ін'єкція є підшкірною.
Мутенти за сдікознлюваинмям (номени 1-17; БОЮ МО: 2 18), вирівняні з ОЮКІХ дикого тилу БОЮ МО 1 12 23 Яй 35 56 Н і А Е | І ДІ зянопнесесовоВоскоиТУКавьЕрЬОКАПИМЬОРЕВУСУХМСТОАСРООВ КАМНІ) 5 і ЕМО свОоВОосКеиТУМАЗЕВЬОКАЮНУБЕРКЕУВУТМСІСАСРЕОККААММНАЮ З ЗиМсОНСвООвОоВсоМЬІТУНАВЬЕВЕСКАПТОБОРНЕУСУТМСІСАСРЛОГНАВМВНАО БО 3 АВКБОНСЕООРОВССВЬнТУКАНИВТПСОКАПЯСЬШРАЕУСУТМСТОАСВЛОКАВАММИАО 50 З ЗВО НСВОЛеОВССКЬНТУКАУКЕТЬОМКАОМУ С ЕРЕКУСУТМСТСАСВДОККААММИВО БІ 5 ЕКОН ОВОВССКЬИиТУКАЗЬВОБОКАВКУ В ОРКЕУОУТМСТОАСРМОТАЗАМНМНАО БО 5 МЕМООНСВІОВОВССКЬН ТУКА ЕПЬСКАПИУ РИНКУ СТМСТОАСРОМЕТаААМЕНІО БО З Мамо ОВОВССКІНТУ АВІА РК У ТМ ОВС АМВНАЮ Я АВМОрВНСВБОРОВССОКЕВТУКАЗВОБОКАрКУ РЕБУС ХМСІСАСРООЕНАЇМУНАО БО
Кк. ЗаМОБиСЕСОвОВсСКОЬВТУКАЗЬЕПЬОКАОМНУБОРЕЕУССТМСІОАСРІОВИВАМБНАО БО 18 ЕМО аРОВССВЬНТУаЗ ер сяариУ МКУ МСС ОКВААМИНАО 11 АНМОрВНСРОЗРОКОСВЬНУВАВЬВОБОКАНУ ЗКУ ТМСі САС ОКВААММНАЙ БО 12 АНОНС ОВССВЬНТУВАСКВОБОКАННУ ЕВ СУТМСТОАСРІОККААМНИНАО БО 13 АВМОВИСТЬОВСКССКЕНТУ КАВУ КАЮКУ ЯВКУ ТМС АСВ ОКВААМНИНАЗ ВО АяМарВиСРЬОовоКСсКентуУКАВерЬьСиариУ зе ТМСТОАСВ ОК ВААММИНАОЇ БО 15 АеМСОНСРОвРОВССВеНЕУАВОВОСЬСМАНКУЗеКЕУВУ ТМ ОАСВБОКАААНМНАЮ БО 16 мЕБИБИСРОЗРОВССВОНТУКаВЬВО СМАКУ ЗиВЕУОУТМСІСАСЕБОКВААММНАО БО Еш АМС ВоКССВСиТУаОВБОП яру МЕККА ТМ ОАСРЕОККААММНА ОЇ БО то БІВ За М 119 Н Е І | Н І ву ікру ВАРССУвАЗУМЕМУБ ІКТ УВВОТУБІ САКЕ БК ТО МО:3) У зікторнекеохРАВССУРАВУМРИиХІЗКЕТрІсУК ТОВ КСВ ОКО 0 МО Кі ТЕТ ЕВОТУРАВСССРВАЗУМРМБІСКТИсУВТОТХВСЬЬКОСНКІ ОКО б ОМО:3 і іКтТБЕНВЕКВОТеРАРССУРАЗУМРИСБІСКТИІВУОТУТОМОАКІСНИЇ БЕБ ОЇ МО: 3 ІБЕТЗБиВІКВОТУВАРССУВАВІНВМСВІДКТИТОУ УМО АКОСВКІ БО ЗВ МО: У ІЖЕТОБВВОКиОТУВАКССКАВУВРИСКІВКТсУБКОХХОВОАКОСВСІ БЕ Ір ОМО:5 г іКТЗКНВЕКВОТУРАВСССВАВУМРМСЬІКТОЗУ ОТО МАКОСНУІ ЗО 10 МО: З іІКБІОБНКЕбЕУВАКСВАВІНУМУ ІКТ ОКХ ВьМАКМСВСІ 15КО 10 ВО: й ІЖТУ Віки УвАВССУРВАШТВНВМУКІ КТС У ІТ ВОВИАВИСНС СБЕЛУ ТБОНО:З 5 ІКНІ КВОТУРАРСССВАЗУМРВМУСІОКТОІСсУІОТХИОЬЬМКОСНСТ ІБКО Їб МО: 40 16 ІКІЗВБЖХБКРЕОТУРАКССУРАВХНРМУ ІОВ ОТХОвВЬ КИСНІ ЗВО І МО: 11 іхтЗИивВИКиОТУВАЕССУРвАМУТВМРКІОКТОІсУВЬОТХОВЬМАКІСВКІ (ОКО ІВ МО: 2) 17 ІКтбЕБНВЕКВОТУ"АРССУРАЗУМРМУ МІСТУ ЖИСЬАКІСНОТ (ОКО Іа МО: 13 ІКТ ВИКРОТУВАКССУРАБХНЕМУСІОКІМУТУ ОТО ОСВС (ОБО ТО МО:15 14 іктНАКВОТУРАКССУРАВЗУКВРМО БІСКВІТА СВКІ (БЕ Їй МО:15) 18 ІЕЕ КипПУеАКСТУвАВУМВМУ ІСТОТНОЇ ЗКО ТВ ОМО:15, 15 ІКТ КТУРАВСОСУВАВХВЕМуІДКТОУУВЕКТеОЬ АКВСВСІ ОКО ТО С: 17 ІКТ5АВІЖВЕОТУВАКОССВАвУВВМІОКТОТа Томи ОКО І МОгІі
Фіг. 1
Меетанти ДМ затлікознаюванням іномери 15-34; БО ПО МКК 19-38), вирівняні з СБК 15 дикого типу ЕМО і 15 Кк 3 32 за ! | : ; І ! ДІ АВМБИНСВМОКОВ Ан ТУМАВЕПБОКАПМУВРЕЕКОУТМСТОСАСВОКдАВУМНАЙй Б 18 БЕІНСЕОВОВОСВИТУМАВЕТЬОКАЮМУ ОРЕ ОУТМСІОАСВЗОККААНМНАВ БИ 38 ВИНОС КОВССМОТТУКАСВСЕ ОКА МІРКЕХОВ ТВ САСВБОКВААМНАВ 5 МОНСАНТО ОКАЛМУ СЕКСУ МС ОАСРООК ВАМИ БО і Все ОВсВСсКЬНеУАОКЕТВОКАОМУ ВНТ ОАСВІОКВАЛВМНАСВ З Кр СОНСРООВОКССКМЕТУКАВСЕОССКАСНУ ОРАТИ ТМСІОАСВМОТААВНМНАВ БО 23 хиВевБОоКсосвЕНнУнаАвоКОоОоАНУ ВЕК ТМСІОАСРОМКТААЧМНАЙ БУ 33 ВОНСрБОгОоВІСММнтТКАВСКООКМ У Миру МС САСРОМАХАНМНАЮ БУ 25 СИНСРЕОСНОСсКБиТУКАВІВІ ОМАНУ ОвВВУОУ ТМ ОА СВО МАТНМИНАО ВО Її ЗОНСРООВЕСВКСВЬАУ НАВІС КАВМУІРКЕУЮУТМСІСБАСРЕОККААММИНАВ 5 ї7 ЗОНСРБОКОВССКСНТУНАЗСЕОБОКАНУ РЕБУС ІБАСРЕСОКВААМКНАЙ З ЇВ пОНСРООВОВССНЬНТУМВАВЬЕОБОКАСНУ ІБК УСУ МС ОАСВОЦКАААМНМИВО БО 28 СОНСРЕОВСВССЕОНТУКАІ КОМА ВЕЖУ МСТОАСРАОККААММНМО БО ПОНСРЕОВСВССВЕНТУВАВІЖОСМАЛИУСЕВКБУСУТМСТОВСВЕСЕКВАМНКНАО БО Зі ЗОНСРБОВОСКОСВЬОНТУКАВСКОБОКАПИМаБНЕОУ МОТОРС вААМНАС БО 32 ПиНСВООРКВССВЬНТУВАВВОБОКАВКУ ЕСЕ БУЮУТМСІСАСРІОЖКААМНМНАХ Б 33 ЗОВсКЬОВОВоСсВьНІАЗМВОБОКАОКУ МВТ ТМСОАСРІСК ВАННА БО 35 МИиНеРООВСВОСВОНТУУВАВІКПУОХАПВНУ ІБК ТМ ОАСВЕСКЯВАНКНЯО БУ ві 70 но за 1 118 Н І І Н Н Н ДЕ ІКТДЬНКЬКРОоТУРАВССУВАПУцЕМУ ІКОНА НОСЇ (УБО ІВ ЩО у хКІшЬВнВІКврТМрарссУапеМму КПТ ОО ЬАКЕСНСІ БО Тв МО 15 ї8 ІКтпЕнНВОКРОХУрРАрССУВАВУМиМУ ІИКТОТСВКОТОрЬЬАКОСНСТ БЕ ІВ МОВІ В ЇКІЛЬНКОКРОТУРАВССЕАдУМЕМУ ТОКІО ЬАВНИСНСІ КОКО ХВ ОМОЯ і ті Іжа ВПУ рАВТСУВА У МИМО У У ІМ АВС СУКО ІВ МКВУ їх ІКІлЬниОБКеотУрАРССУВАПІМЕМУІИКІрТОСОТУврЬьАКИеВсІ (За ХО МО:53, У ЇІКІЛеНВСКВоуУРАРССУЮАЛУМНЕиМУКІИКІрІ В ИрОЬЬАКрСВСЕ (КО 105 МО: 25 ЕК НеІеотеУРарспуваучими ОКО аа У ОІВ МО 25 ІХхІвЕнЕсКРрТУрРАРСссУВАУМЕМу ІКТ М УвОЬАКИСВсІ КВ їв МОБ ІБ ІКІВЕІВОКРрТУРАРССУВАЗМРМУ ІСІ Урок 45БО ХОМ ЯТІ Її ТЖТІМНТЕВОоТУРАВССУВАУВИМУ МИТО ТОМОТУВОБЬАКИСНСТ 5КО ІБ МО:28 їх ІКТ ЕСРАВССУРАМНУТЕМУ ІКОН ЬАКІСНСІ БЕ І МО: а ІЖТОЬНЕЬКРОТУРАВССУРАЛІМАМУ МІСНІ ТІСУВЬОУУВОЬАКрОВСІ БО ІОМО о ЗИ ІКОН оКРОоТУвАВССУВАВУМиМУ ІСІ ОТУСЬЬАКОСВСІ ЯКО Зб ОМ: зі АКІЗЕНВІЖРОТУВАРССУРКАІМЕМУ ІКТ ЬАКОСВСЇ (ББО ТБ ОВК: 12 Зх ІКТ НВБЕРБТУВАВССУВАУМЕМУ ІКТ ОТОНО ОСЬ ЬАКІСВОЇ СКОБ ОВК Зі Зх ТЕТ РИТУВАВССУВАЦІМИМУИ ТОКІО ЬАКИСНИТ (БКО ЇСб МО: 35 34 ІКІЗЕНВІКРОТУВАРССУРАЖІМНиМУ ІКТ ЧУ НИТОК (БО ТБ ОКО:25)
Фіг. 2
ГПбврняиний білок Мі: Сигнальна посліховність ЗК (нижній регістр), об сдиана з пмінохнолотною послідовністю ЛОВ, об еднвна з лінкерсм Оу -бестіз (пізкдеслений зврифеі на М-юний зрілого С0ОКІ1Х поднни інацізжиарний врифот (ЗО ЦІ МО зіаветваціхціїфімісзаксюАНКЕВУАНАРКОВЬОБИМЕКАКТВІАКАОЗУ МСЕ КСНУКІНЕУТЕВАКТСУХ ПЕЗАЕМНСВИДУНІСВСОКЬСТУАТАКАТУСЕНАВСОСАКОКЕВЕКНКСЕМОВКОРОНЕМВЕРЕБУВРЕУ УМ ТАКНОМЕЕ ТЕАККУБЕУКІАВКНЕТЕХАРЕСЬКЕАКАУКААКТЕССОВАПВКААСЬСКЕКОКІНОЖОКАВВАКОВІКСАВЬОКУСЕВ АУКАЖАУАНЬОДЕЕРКАЕКАВУОКОУТВЬТКУВТЕССНОВЬСВСАВОВАВЬАКУІСЕНОЮБІШОКУКЕССЕКВЬОЕК ЗНСІАЕУКМОКНЕВАМ ВО СААСКУЕОКОКСКВУАВАКОУЕ МУКУ АВВНРО ВУХ ММА ЬАКТУЕТТЕКОСАХ АКеНЕСІВКУВОРВЕКВОСВЕРОМОІКОКВСОКОЕБОСОБУККОМАМОУвУТККУВОУЗІВІ БО ЗКУСІКИСКЕ РЕАКАМНРОСАКВТОВУТИВИСТЬНЕКТИУЗВОАУТКССТЕЗУВАВРСЕВАМЕУОЕТХУККИЕМАКТЕТУНВОЇ СТО ЕКЕРОЇККОТАБУКСУКВКРКАТКЕОСКАУМОПЕАЖУВКОСКАВОКЕТСЕАВКОККОСТАЛОСАВТОВОВОЦООВИОВОЮ МОБОСБОАЯМООНСе Ре ВЬн ВАВ НОЬОМАВИЧ КВУ ЮК ІЗАСРОКВААНМНАОІККВЬИВОЬКРО ТУВАРОСТРАЧНЕМ ХК ОКТО ВУ ВОВСОАКОСВСЯ Тібрнаннй лов МІ: Сиснедьна посліповність ЦЕ (мий регістр). об синеана з вмінокисвотною песніовністю ДСА, об 'єднани з лінкером ПОВЗ-Зе) спізкреєненнії журн на Міна зраного СЮК15 вюднни напівжирний шрнфу), що містить лелецне З вмінокиєт СЗАВМНВКО ЦО МОМ 76 вішусрецііа1іі1інієзакспАнкЕЕУАНВККОЬСЕЕВМЕККАТВІАКАЦУМКСРЕБОВУВЬУНЕСТЕКАКТСХА ПЕСЗЕМСРИЗЬНІБУСОКЬСТАТЬКЕТУСЕНАЮССАКОКРЕАМЕСЕ МОВКООМЕМРКОУВЕВУВУМСТАКНОНКЕ ТКІККУМУБІАВНВНЕЯКХАРЕЬККЕАКВУКААКТЕССВАВОКАВСЬКЕКІОВЬКОВОКАВОАКОВІМОВеЬОККОКВ АЕКАМАУАКЬОКЕВКАБЕАЕСОКЬУХВЬТКУНТВССНОСЬКЕСАИОИАВААКХІСЕПОВІЕОКЬКВОСЕКРБАЮК ЗНСТАБУЄМОВМЕВОСЕВМААОКУКВКрУЄКвУ ЕКО Е МУКУ АКВКРвІУВУЄЬМОКЬАКТУКІТБЕКОССАА АДОБНЕСТАКУРОКЕКРИВЕРОМЬІКОМСКТЕКВОЇСВУКРОНАСЬУКУТЕКУРОСВТЕТЬВУВАНІОКУОЗКССКИ РЕХЖВМЕСАЖОХЬОУЄЬВОССУЬНЕКТРУЗННУТКССТКОБУНАКРСКИАЬЕУПІЕТХУРКЕЕЧАЕТЕТЕНАСЕИКЬО ЕРЖРСІККОТАВУВМІКНЕВКАТКВЦЬКАУМОСОКААКУВКОСКАВОКЕТСЕ ВЕК АМІВАЬСЬООВ ОВО ЗОБОСОВОНОВБОРОВССВЬНТУВАВЬКОООНАСИУЬВУ ВЕУ НО ВАШЕ ОО КААНМНАЦІЕТНОННЬКРИХУВ ЗРОКУВАВВЕМУ ВК ТОТОУ ОТО ОСАКОСНСТ
Фіг. З Кометрукт: МО МИ ПОН с в с ; ВО ОО ! гриля : хі їду ЛА ЩІ вовкіЄ ! ОНИ ! і нюсвсскно оряоінккннннню? : сх ; ; и 000 Б ка бще в вда с ДК у Закда 00000000000100107 бюорочені різновиди " ОК ох Н - МИМО ї ЩЕ бюд. ПВ вща с я ЖКННККМ УМ
Фіг. 4
Геридний білок МИ Сиснальна послідовність МК. (нмжнії регістру), об еєлиана з амінокислотною посліловністю ЛСА, об'єднаною з дінкером НОЯ бе: (пізхреслений шрифт) на М-ківв авіхокислотної послідовності злого СНІК15 вожнни (напійжирний шрифт), то вістить денецію З ввінсюнсвох іпозначену зк ЛАКМ або АМЗНЯКО ШО МО 7 шоашктУреціїзіі1ікікувк ОНЕУ ВНВХ КІ ОВЕМЕКАВУХІАКАСТІ СТ ТЕОНУКИСЧКУТЕНЬКІСКА ВЕОАБМСОКОСВТКЕСОБІЄСТУАТЬАЕТУВЕМАЮССАКОВРЕАНЕСЕТЬОНКОПОМЕМЕБЕВІУВРЕУВУМІТАКВОМЕВ ТРЕЕКХІХКІАКИНЕХЕХАРКЬЬКЕАККХКАВЕТЕССОАВЮКАВСЬКАКООККАСЕОКАНЗАКОКСКСАБІОКЕЗЕА АЕКАКАУАВІЗЦВЕРКАЖКАВУВКІУТОВИІКУНТЕССНОВЬСЕСАООВАОСАКЧ І СЕМООВІБЗКУКВОСЕКРЬЦЕЕ ЗНСІАБУВНОЕМЕАС ВУС ААОКУВЕКІССКИХАВАКОУКІОМКІ ЕТАНОЛУ УВІ МЯВАКТУВЕТЬЕКОССАА ЗЕРВНЕСХАКТЕКЕЕКРЕУВЕРОМЬ ГКОМСЕБЕЕС ОВУ КЕОНАСМОВЕТККУВОВІРІ УВУ НКИ ЕЕЛКАНЕСАБИХІ ЗУ ОЬСУЬНЕКІВУВОВУТКССТКОБУМВАРСЕВАСЕУЮВВТУУККВЕЗАКТУТЕНАЮІСТІЬО ЕКЕВОТЕКОТАБУЕУСЮНКРИВТКВОСКАУМОВЕААКУЮКССКАРОКЕІСЕАБЕСКХКМУЛАВОАНСЬКОМОКОКОЄ ЗОБОПБООВОЗООЦопернсвІагРОаВОсиьн и ВАВ НАЛИВУ ТМ САСРЕОТКААМНЯМОТКУЯ ЗМК КРВКУВАРОСУВАВНР МУ Є ТОВТОВ УОТСОН ГПбрилний лок МА: ЄСпгназьна посліденність ІК. (нижній регістр). об єдиана з змінокислотною песліповністю ДСА, об'єднаною з піннеровм КО ес: (підкреслений юрифі) на М-кінії зманокнолотної поспіовності даного ЗПЕЇХ дено (важ рний мрифе), що містить дедецію о амінокнеВої іпозначену як ЛАКМОЮИ або МО ЇВЕО ПП) МО: 80) кпашсораціічії1і1ієігдвх с ОАНКВЕЗАНКККІНВЕНЕКАСУЬІАКАСУ СЕ КЕОНУКАУНЕУТЕКАКТСУА ПЕБАЖМСЕКНЬНТІКООКІСУУАТЬВЕТУВЕМАВССАКОВРЕВНЕСК МОНЕ ОГМРЕНУВРЕУВУМСТАЕНОМЕЕ ТЕЬККУОХВБІАВАНРХКУАРЕСИЕКАКАУКААКТВССОВАТКААСЬКРКБОВМАОЕОСКАБЕАКОВЬКСАСЬОККОКА АЕКАМНвУВКОСОВКВКАЖЕКАБУОКОУТОЬТКУНТЕССНОВЕОАВОКАНЬАКУІСЕМООВІЗОКЬКВОСЕКВЬСЕК ЗНСІАЕУЕМНОЕМРАЮСРОЬАВОКУКОКЦУСКНУАБАКОУРІЄЮРЬУКУАВКНКОУЗУУСЬЬА АКТУ ВЕТОЕКОГСАХ АПРНБСУВКУЄОКЕКВІЕКРОЗКІКИМСККЕОСОКУККОНАВСУВУТУКУРОМЕТВТ УЮ ВЕНЬ ОКУВОКСОКИ РЕАКЕМРОЗЕНПЧЬЦУСЬКОБСХЬНЕКТРУВОВУТКССТВАІМУМНИАРСЕЗАСЕУОВТУВНЕКМАКТКТКНАВІСТЬО ЕКЕВНФІКБКИКАКУЕДУКИКРЕАХКЕСЬКАУМОВКАЛЖУЕКССКАСЮКЕІСКАБЕСККЦУААВОВА НОВ ВОВОВОВОЄ БОБСОБОШОСВОВОСОСРІСРСНОСВІ НТУ ВАВ ДОМОВ ВЕТО ТМСІСАСР ОК ВААННИЛОТКТНЬНВ. ІРО ТУРАВССУВАЗУНРТНУІОКТЮТВУ ОКО ВКМ
Фіг. 5 ях З нина ооссскжсессєескннюст ж сереловнин-носй ' - | | в | з МІ СЛСА-КОІБИНЮВ 5) 40 кмольх В зе | ' ! «Я. ооо ЗМНСАОВМОМІ НОВІ М имопьзх рон . сур роз МОЛСА-НОЗВУДМІ-ВОВЕІ5) 0 насльл 384 нан і УК Ми НИ Я . 1 КЕКС ВВ 4 Бе: ВВЕ ОКО ДОННА 5: В ШЕ В і ПОС: Во Н ПЕК Ва за ПЕН 5 ШИ 1 сс ДЕННА, ЗЕ НИЙ і 7 Чак ізо
Фіг. 6
У
З. бо» М атллялямн, Е я З за СТ й : зе З | | Шо зокоохк» в Сереловиою-носій ши ши ши ее ак І: хз сх: вва Ох і 00 ем (ЛСАОІВУЮМІ ВОЮ) 40 ноти Е 27 я м Ес ВВ Н ж ДЯ і я 00000000 МСА ЗКВУрКОЛЮЮКІ ХУ до ннольчх ЖК жов я | її. « КНИШ : й ок З з ? й Часів
Фіг. 7
Гліковииьовані мутевси ВОЇК1Х, яні містять сиунальну послідезнність ІВ омижній рейстр), приєаниву де М-юімиз змінеювтвизої песпіловнося зваохо СІК 1Я людини інагвжиринії шриафи М ЗЕ НО НО: 83) парі із ініхчак свати вьеовОоСВОнХнАВІвроСИОчу ЕЕ УТМСТОМ мб (50 Ю МО: 82) пише 13111 з кіхуак овес МО в АВОКО СОСНА ОКУ У МС РООГАААМНАСІКІВЬНВОКРОТУрАРССуУТАНИМУ КТ УВО ВОБЬАКОСНИХ м ЗЕД МО: 83 вошкчрачі ііі сан ов о СВОВЕч АНТОНА У СЕК ВЕЧОУТМСТОВ вауталанмаАСІктльНВ квоту аессувАУМРМУМКОКТОТВУВьОТиВОСЬВКОСНИХ
МЕ. Ї5Ба 0 МО: 84 «еасУваціїіві11ічіхцах само нсемавовОсвинЕУвАБНЕТОСИАОНУЬНЕ ВЕУ МТВ ЕВОКААВОМНАСІКСВЬНВОККОТУРАРССУВАЧЕМИНУ ТОКІО БОКОМ Ма БОЮ Мо я «ккМегУразіізі11 кіхкуаковиневисееевОоВсСвОнуВАВВО ОА ОКУ ОВК МОВ унотТевлАВНННАСІКТВЬНИ КОТУ вАвОСУуВАВИМЕМУ ІТИ СОИХ Міо ГОЮ МО: ВО) «каестваізоі111ї1 хіх оуа" СВИСТ ОРОС УКАВІЖОМОНАВНУЬОК НЕТУ ТМСТАЄ вемттааиниаДсІкеВІни квоту авосУувАвчнриУ ОКУ Ту ььаКОСисх М З 5ЕВЛЮ МО: Я ветгУра іі 11ініх ца овиМаОнеРЬароКесвьнеувАВІЕОЬОНАВНУ ОКУ МОТаАе тесматанинасІкуВЬниБ КО гуКАвОСсТВАНУМОМУ КТ ВИТ ВОБЬВКСНИХ міг (5 МО: ВІ патсУрацііїізі31і1інікзассаиновистьстовоскьнуувАанавьО нариси КУ УТ ОАе гас мАтТиМмиасІжІВЬНАЬКеОТУувАрОосУувАавумеМУ Іти снсї МІ1З (ЗВО 0 МО: 89) вежттраіізі111ініхоах сао НОв ьо сь УВАВІВОЬОСЯАОНУуОР КУТОВЕ ТВО ААВНННАСІКІМОТКОКЕОТУАРСОСУТАСУКРИУЬКОКТО ТО ВЬОСХВВЬЬВКОСИСІ МА (КОЮ ВО: ОЇ завести а ііі зі ічіхаах сВИАМОЮНСТОс Весь тУВАВІКОЬСИОНУСрРАЕНУТМОТОВЕ РІОБЯААМННВОТКТОМиТОКРОТУРАВССУВАВУМРМуЬКО КОСУ ВОК ЕВОСЬВКОСНСХ
Фіг. ЗА мі (58 о МО: 91) таіпеувзаізіїіуніховЕ сАВМОрИсю Овес нта НОСА ВЕУ ТМСсІВАЄ БЕЦКВАВМИНАСІКТВЬНВІКРОТУРАРССУВАМИТУМУСІОКТОТУВСООвБЬОКОСНОХ мів. 50 МО: 95) с«ісУуваа ііі інікзах ВИМОВА ОСВЬН КУА ЯАВНЧУ ВР ЕЧОУТНСТОАЄ ЗО кааиМнаоІКтаМНАрКВОТУувАрССТв АМС ІОНЕ г ОУВІАТХ ОО МОВКОСНОХ мі (5 МО: 93) пажесУураііЧі11іміх ас сАННОВИСКМРСКОСВОВЕВАВІКОБСНАВНУЬЗВЕКУСУ МСА РЕОТАААВМНАВІКТВОВНККОТУРАРОСУРВАВХНЕМУ КОКО Тр СЬВКОИВСХ
МІВ. (БОЮ МО: 54) вит: Урачіза 1 11ізічієзах саме ОнсвОБРаВОСВьНТ УВА ЬСМАВКУ СЕРЕ РЕОБВААМНИНАСІКТВЬНЕБЕРОТУВАРОСУРАВУМР МИСІ ОКОМ ОО ВБОАКОСИСІ МІ 50 Ю МО: 95) ккілеура ці із111ічікзаксвНМорнНовІчеакосВвитУвАВІЬВОВОМаЮИуОВРЕЖУ УМОВИ ТОЖ ВААНиНАСІКТВЬНВЕКРОТУКАРССУРАВУНР МУ ТО ВОАЖОСВСХ Мао (580 1О МО: 36) катера цііЗ111)кігоахсАВМОрНСвьОоРОВССВЬиТуУКАВІВВООМНАВИУБОВВЕУСУТИСТСАС РаОТКААНЧИАОХК ТОНКА КРОТУРАРОСУВАВХМРУМУу ХТО МИТО БЬВКОСНСХ М21- БЕ МО: 97 ххіжкчраціізі1ііівієззсовЕмМеОнсРОовгОовИсвЬн ува оЬОоАВНУ НВ У УТА фЕЦЕВКАВНМНАОТКТИИВЕКРОТУКАРОСУКоНуМеиЧЬІ КТ ВТОМА
Фіг. ЗА (продовження)
Нуклестинні посділовнесу, акі кодують гклікозильоваві музей НЕ 15, ме містяте силпнацьну послідовність ЦК. приєднану ло М-квнуя змізокнсвотної песніновності зрілого ЗОБІ люзнни (як повязано на феурі КАХ Нуклеотинні послівовності. які водукие М зкчувсасзазУуссоспасгссаивосі не сосрапевскспоасстссозаа есеї ЗУМИХКОСААСВЗСАСТИАСТИ ОСС ТЕКС КН ТО СОМОСТОАСАСОСТИАА СОСОТОСТОСААСАССТОВО ТКС ОАТТВОС КОТОВА ОКА АТЕТОСАТСООСССОТОКССВАСОСАБТ ССС СО СААВСАТЕСАСОСОСАВАТОСВАВАСІІА МСТОСАСССССТО А АСОСОАСАСОО ОСТАНКИ ТО ТОСТИ ТАСААТИС САКЕ ОСТСАТУСААААСАССОАСАЮССОСО ОТТО СВО АССТАТОАТОАСТ ТАЄ ВААСАСТОССАСТОСАТАТОА (БО МО: ОВ Нуквеознанмі послівовиості, які хадуніть Мб зіззасзізаасоссозсссаасіссізааасіссі сао зас созаЗЗаесаЗа вс ВАС ООАСС ВИТОКИ НТ КОКОН ГОСТ ОСА АСИСТ ТИ СОСОТОСОСТОЛАВОВИСТОСОСТВОВСССАТТВОСТОСТОТСССАСОСИВСВТОСААСТОВОС УКУС АТОСКВККТУТ ОО ВОАС СВ ААСАТОСАСОСОСАСАТСВКВАСВА ОССТОСАССОССТСААОССТИ ВС ВОБОТОССАС С ТОТОСОТ ССС ОССАССТАЄТУТСС СОТОБТОСТСВТТСсАЛАВОВСССАСАССВОСОСТО ТТ АЛАССТАТОАТЗАСТТСІТАВСС МАВОоВстОоСсАстОосАхАТОВ (БО ЦІ МО ЦЮ Нуквимки вна пезіеості. ява кодують МІ зічзасвізчзавазаксосозстовассстузаЗсЕссссЕ воску чкеосадоаЗуєоВах па АСВОЗАОССАСТЕ ТКС СОСКА КА ЕС ВОВК ТС СОСОААССТОАССа МІСТО АТТООТОСТО СОС АСОКАООТОСААВІСАСС АТСТОСАТССОСОКСОТ ВС ВОСИВОТ ТОСКНСОСВАВКАТОСАОКОКАСАТСАЛСИОМОВ ИСКАТЬ ПАТОСТОСТСАТТСВАВАСАССОАСВССОСОТО М ЗІСТОСАСАССТАТОАТСАСТІЗТ ТАЄ АААОАСТОССАСТОаСАТАТОЯ (БОЇ МО: НО)
Фіг. 855
Нуклеотилні посліновності, нкі кодують МІВ зІізззсвідазЗзЗУквоспУстсаЗсіоссізУча сі сссозскасксточсоосдвочкоосваоа ЖОСОСССВАССОЗСАССАСТТОСОСТССССОСОТТСТОСО СТО САСАСВСТОСО СОСОТСОСААТОАААСССТОСОСТО САТ ТОСТИ САС ТОСААСТОАС АТЕТОСАТСОССОСО ТОК СОАВССАОТТОСОСОСОИССАЛАСАТОСАСОСОСАСАТСВАСАСОХ БеЕСТОСАССОССТВААОСССОВСАСОВ ОСОБ СТАСААКИ САТОСТОСТСАТТСААААСВОССОАСАКССОСОТОТКСОСТОСАСАССТАТОАТОАСТТО КАСИ ААВОСТОССАСТОСАТАТОоХ ЗБОІВ МО Нукоеотндні посліловності, кі кодують МО зезчуасзгузУччкоссозуосвзогскі заз сі ска свс с азсс сс ваза, УБОСОСОСААСОВОСАССАСТВ ОСС ССС КТС ОССЗТСТОКАСАЮВОТОКО сОосвтсСсстоваВостовостаассоА ТТН ОСТ ПСО МОТО САМ ЦНС АТОТОСАТОМКСОСО ТКС ОЗААССАВАССС ОСС СВАВСАТОСАСОСОСАСАТСААВАСЕВ СОС АСНКСТО ВАСКО ПОС ВОН СКС ОСТЕСОСККСАОСТАСААТСС САТОСТОСТСАТТСААААСАСОБАСВССОСОВІН КОТ ВИАССТАТВАТОАСТТВІ ТАК АВАСАСТОССАСТОоСАТАТОМ БОШ МО Нуклестияні послідовності, ямі кодують МІЙ згззасзесзазазкоссссястсачсвсскзазапьсестзосівскосозс сни асова а ЗЕОСОСОСАЛСОВСОСАССАСТО ССО ТИС ОСТ ОС ТОССО ТС ОСАСАСВОТСС СОСОК ОВОСТ КСО АТ ТО ТОСТИ ОКССАСКИВ ОО ГОСТ АСС АТОЕТОЕСАТСОВЕСССТОССОСАССААСТ ТС АС ОСОСАВАСАТОСАСССЧКАЗАТСАВОВОСЯ ОССТЕСАССОСС ТСААВССОВАСАСВО ТОК О СОС ТОСТО С Т О С О С ОЮСАБСТАСАКЕКУ СсАТОСТИСТСАТТСВАВАСАССОАСАССОСОСТИТСОСТССАСАССТАТОАТЗАСТТТТАССС АААСАСТОССАСТОСАТАТОА (ЗБ МОЮ Муклестилні послівовності, які кодують МОЇ зіззасвозвазч сосок овасссо зако асо сс сксз во Во ЗТОСССОСААСОСОВВСКАСОГТССОС ОСС ТОК ТОССО ТС ОСАСАСОСТССО СОССТСОСТОСАВСВССТООССТЮСОБАТ ТС ТОСТОКОССАСОССАОВТОСААВТОВИС АТСТОСАТСОО КТ ОССОВАВССАСААСОС З АСОССААЛАСАТОСВМСОСОСАСАТСАЛОВОСА ОССТОСАССОССТОААОССОСАСАСЮ ОО ОСОСТОСТ ОС СО СО ССАССТАСААТОС САТОСТЕСТСАТТСААААБАССИАСА ССО ОТО ТСТАОАССТАТСАТОАСТТТТ НС ААВОАСТОССАСТОСАТАТОВ БО НО МО: 15)
Фіг. 865 (продовження)
Нукаеозидні послідовності, яні кодують МІ12 зкззасасозоззчксосезсесвзиксогадоЗсКесеосевсссобсоадск сс ссача Є КОСА ВОБАСКАСТО ТОСТИ СОТОК ОСА СОССТОССТОСААВАССТОСТОССОСОАТТОСТОСТО ТКС САС СОЛОСТОСААОТОКСС АТОТОСАТОООСОСИТОСССООССАЗТТСАВСОССАСОВАСАТОСАСОСОСАОАТСААОВСОСА ОССТОСАССОССТОАВОСССОАКАСОСЗТОКИ АСОМ ВАТИ САТООТЕСТСАТТОАВААСАСССАСАССССОВІСТСОСТОВОАССТАТОАТО МТ ТОТТАОСС АВАСАСТОССАСТОеСАТАТСВА (5БО МО: 115) Нукоесетидні посвіповності, які кодують МИ зтаззозсзавчазчосссзссаЗсесічазЗві скоса ссавчеововї ОСС АСОМ АСТ ОТО ТІСТО ТС ОАСАСОСТССО СОС ТССТОААСАССТО СТО СОВ ТТ аТ ТС АСОООА ТО САТ АТОТОСАТСВОСОСО ТИСК СОАСОСАВТ ТС С ОО ААСАТОСАСОСОСАБАТСААСАСОК АССТОСАСОСОССТОАМЕССЗАСВАСОИТ ССС ТОСТИ ОСС АСААТО САТОСОТОСТКАТКСАВАСАССОВИ ВОСКОМ АССТАТОАТИАСТТУ КТ ВОСО АААСАСТОССАСТОСАТАТОВ (ЗВО МО 10) Нуквеотинні послідевнимті вкі колують МІЗ жвмазасзізЗаззазоссезсссвасісссзазасісссасівскскі зас ссзаЗЗкассвЧа гОСсоСаСААСООООАССАСТО ССО ТС ТО ТСТОСАСАСОТССО СОСОТСОСТОВААОАЄСТООВСТОеСИАКОССТОСТВІКОССАСОООАССКСААОТОВСС АТОТОСАТСООСОСОТЕССОСАОССАСТ ССО ССОСАААСАТОСВСОСИСАСАТСААВВСОВ ОСААССАСАСССТОАОСССОВСАКОСТОССОСОСОСТ ТС ТАСААТОС САТОСТЕСТСАТТСААЗАЗАССОВИАССОЗаТИ ТО СТССВОВОСТА ТО ТЧАСТІВІ ТАС АААСАСТОССАСТОСАТа (БО ШІ МО ПЦукаеотняні посліловності, я кодують Мі зіззасвецачззі сновок сов ЗКОСССОСААССОВОАССАСТаТОСОСТОВО ССО ТЕКСТ ОК АСК ТМ СОСОТСОСТОБАВИАКСТоОоСТ СА ТТ ТОСТИ НСС КОСА ТАСЄ АТСТИОСАТСООСОССТОСОСО МОСС АВТ ТОСОЛ СС ВАСАТОСАСССОСАВАТСАНВВМА СКССТЕСАССОССТОААОСССС САС ОСИКИ ТОК ОСС АСТАСАСТКС САТОСТЕСТСАТТСАААЛАВАССОВКАССО ОТ СОСТССАОАССТАТОАВЗАСТІК ТАС АААСАСТОССАСТОСАТАТсА БО ЩІ МОВ
Фіг. 88 (продовження)
Никлеотихві песлівовності, як кодують МІВ зкччасабсзазчксссссесаоссссіоиааооокастассстазчс сс чесдовВЕ СОСеТСЕСтТОВАЛОАССТО СТО ВОСССАТ ТОБТО ТС САСОВСАВИТОСААСТОАСС АТОТОСАТООСОСИТ ОСС АВССАОВТТ СОСОК АААВКАТОСАСОСОСАСАТСААСАСОВ СТО САССОССТОХАВСОССАСАСОО ОКСАНІ ТОСТОСОТОСССОССАССТАСААТИС САТОСТОСТСАТТСАААКСАССАССАССОСОТО ТС СТООАЗАССТАТОАТВУСТІСТТАВОС ААМСАСТОССАСТОСАТАТОСА СББО МО ГРО Нуклестиуні поспіховності. які кодують Мі? зкачасзІчЧачазкссссЯсісазсксссазачиккссвКівосс с ссавЯвіесаче: ЗкоСсоСОоСвАВСКАССАСТО ССО ТОСТИ ОСА СВИСТ СОСОСТОСССТООААСАССТОООСТЕСНКОА ТТ ЗИ СТОПА САС ТОСААНТОМОС АТБТОСАТСВОСОС ТОВСТА ТО САААСАТОСХСОСОСАБАТСАОЛСА СОСТОСАССОССТСАОСССО САС АКОТ ОТО ТОК АВСТАСВАТСС СУТОСТОСТСАТТСАААЛОАССВАСВССАСООТИ ТО СТОСАБАССТАТОСАТОАЄТТОТ ТАС ЗААСАСТОССАСТОСАТАТОМ (БОЮ МО: 120 Нуклеотилні послівовності, які волують МІВ загадзсагзвзадкссспустусвососстузаасвостасівсєстазсіссзазагассвовЕ ЗМК СОСААСОКАКСАСТОТОСОСТОВОСО НС ТОСТОССОТСТОСАСАСОСТНИ сОеаСатостТОвАВаВС ТВО ТОоВОаСКаАТОоСа пТ ОТ ОССАСа В ТООААСТеСК АТБТССАТСЧОСОСОТОСССЯАОССВОТ ГСК СВОСАААСАТИЕСАСОССАСАТСААОАСЮВ ОТО САССОССТОААВСССЯАСАСООТ ССО ТС СОС С АСКСТАСААТИС САТОСТОСТСАТТСАВАВЧАССЯАС ССО АСС ТО СТОСАЗАССТАТОАТОАСТТОТТАВОС ААВМСАСТОССАСТОСАТАТОВ (ВБО Ю МО: 12) Нукоеотилні посліповності, які кодують МІ всчазсатзазуУс сосок ссіЗсузи оса совок ЗЕшСоСОсВАСССОСВОСАС ТО ТИСИ САСАСИСТОСО СОС ТСОСТОСААЛСАССТОВОСТОЗ ССС ТОСТИ АС ОСАООТОСААСТИАСС АТЕТОСАТСООСОССТВСССЗАСОСАВТ ТОЮ СООСАСАТОСВОСОСАЗАТЕАОВОВА ОССТОСАССВССТЗАВОСССОАСАСОВТВССАССССССТО СТО СИТО ОСС ТАСВАТОС САТ ТОСТСАТТСВААМАВАСОСАСАССООСОА СТО АСССВОАССТАТОАТОАСТТСТТАВСС АМАЗАСТОССАСТОСАТАТОВ ЗВО НІ МО 120)
Фіг. 88 (продовження)
Муклгатноні послідовності, нкі колують МІ згчаасакзвзЗзасссососчстсазстоссадачсссствссспосссзазУсосоваах ЗЕОСОПОСАВССОСПАССАСТЕТОСОСТОВОССССОСЗ ТОСТИ ОСАСАСОСТССО СОСОІСОСТОСААВАССТОВОСТОСВССВАТТ ОО ТОСТИ ССС АКОБАССТ ОСА ТОВИЄ АТЕТОСАТООСОСОСОТОСССВАСССТИ ТОСОСОСООСАААСАТОСАСОСОСАСВАТСААВАССТА СТО САССВССТОА АС ВАСАСОТ НАВИ СТО ЗИ АОСТ АСВ АТКС САТОСТОСТСВТТСВАКАСАССОВОВСТКОЗТОААССТЕВСИАССТАТОАТОАСТТУТАЄСС АААСАСТОССАСТОСАТАТОА (ЗО НО МО ІЗ Нуклестидні посліновності, які кодують М зезазсзечачазессоозсвовасісстазацевссезсвассостозсс скачав ЗЕССОСОСААСОСОВАССАСТОТССОКТИСООСССО ОКТАВИ ТОК оСТС СТО АЗСАССТОООСТОСОССИВІ ТТ СОССАСВОПАСОТИ САТ ОАССК ТУТ ЯСАТОВОС ОСОТООССВАОССАВТ ТС ОС САААСАТВСАССВСАСВТСАЛОВОСАОКИТОСАСССССТОААВС ССОАСАСОВТОССВОСОС СТИСК ВАТСССАТ ТИССА ТТСАВААСАСКОВ САССОБОСТОТСасСТоСсАПАССТАТОВТОАСТТОТАЛАСААААССТОССАСТОСАТАТОА (БОЮ МО: 128)
Фіг. 88 (продовження) Авінсквевотна послідовність АМІ-МІЄ (сжнасьни послідовність ж. (вмжній регістр), приєднана да Мввнця зного ОК дози снкепівжнрний вузи екілЕхва 111 нз ков сне Ку ВАВ МОНА ТУР ЕТЦУТМЕТОАСКОУ ТАЛАН НАЦТАТВЬИКІКРОЗУКАРОСУТАВТНРМТЬ ОМ КОУ ВО ТКООБЬАКВИНСК СЕ ОКО МО: 180) Невлеотийна послідовність. зва кодує АМЗ-МІ6 зхзчасагчацучесисичсосвусе сс усе соскеаскаскоказотссзночідоссадчах змо вАССАСТе осот сосат Тест МАСОК ССС ОСААСАСКТОшОСТОООСССАТТООВІСТТСОССАСОООАСЗТОСААСТАССАТОТОСАТС СССОСОТОССССАВСТАТ ТЕО ВА ААСАТИСАСССОСАСАТСАЛСВСОЛОССТОСА СС СССТОААВОСССВАСАСОВТОССАВСКССС ТИС ОСС СОС САССТАСААТСССАТОВТОСТ САТТСАХААСАССАССАОССООСТОКСОСТОСВОАССТАТОАТЗАКТ З АС ААЛОВСТО САСТОСАТАТСА ЗБОЇ МО; 125
Фіг. 8С
Амінемюлетна постіжевність зрілаго СОК15 щоднни ликого типу, приєливме за М-ввцем по си наньної зезсліновності МОЖ. Пед ЯКІ) пківсуУ раці Чі 111 ніхоах АВМ ВССНЬНЕУ ВАВ ВО СОМАЛВИУТОКРЕУЦУТМОХОВО теОКВЛААМИНАСХІКТЬНЕІКООТурАИССУАВУНВИМУЬОКХО УВО СОрВЬСаКОсиСІ (ЗК НУМО: 156 Нукаснова кмслога, яка колує ІВКо-д-СЦКі5 м'зчдвсвічазаатоссссасксазокосізодапі сеанс ссза засос СОСОТСОСсТосАеАСсТО стос АТТ ОТО СС АСООАИТОСААТОВСЄ АТОТОКАТЕСНН КОТ ОССССАВОССАСТТССССССОССАААСАТОІ АКОТ ТАК ОИСТОСАСЧ КОТА АСАСВ ТАС КО ОС САОСТАСАКТСС САТООТОСТСАТТСАВААСВАСТ ВИН ЕК КСО АМССТАТОАТОАСТТОТТАВСЮ АААСАСТОССАСТССАТАТСА (БО І МО: 127
Фіг. 80 Оцінка утворення димерів мутеїнів ФОКІТ5 людини, зайнятості сайту М-гліканом і розчинності ідетйнфікюр 00010007 Ераничнезначення ВООКІ5 ТАК - як і ТАК ТАК чи М? ЛАК 0ОТАК за ШМК ВВ Не внконували Ме 001 0ОТАКО | ТАК 000 Невнковували МІ т н Не викомувапи Ми ОТАК ТАК як МІ; о тТАК ТАК ою МІЗ ОТАК 000 ТАК як Мі і Ні Ні Не виконуванн мів Я НЕ Ні Не виконували мів і ТАК ТАК ЕЕ і Ама-мів | ТАК ТАК вн МІ тк лм лак тк і МІВ і ТАК ТАК Не виконувати маю тА КОТЮК че ши: на
Фіг. 9
UAA201700670A 2014-07-30 2015-07-28 Димер та спосіб його застосування для лікування метаболічних розладів UA123432C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462031063P 2014-07-30 2014-07-30
US201562195908P 2015-07-23 2015-07-23
PCT/US2015/042510 WO2016018931A1 (en) 2014-07-30 2015-07-28 Compositions and methods of use for treating metabolic disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123432C2 true UA123432C2 (uk) 2021-04-07

Family

ID=55179329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201700670A UA123432C2 (uk) 2014-07-30 2015-07-28 Димер та спосіб його застосування для лікування метаболічних розладів

Country Status (29)

Country Link
US (3) US9834586B2 (uk)
EP (1) EP3174894B1 (uk)
JP (1) JP6704358B2 (uk)
KR (1) KR20170065026A (uk)
CN (1) CN106573966B (uk)
AP (1) AP2016009663A0 (uk)
AU (1) AU2015296640B2 (uk)
BR (1) BR112017001789A2 (uk)
CA (1) CA2953827A1 (uk)
CL (1) CL2017000201A1 (uk)
CO (1) CO2017000614A2 (uk)
CR (1) CR20170027A (uk)
DO (1) DOP2017000025A (uk)
EA (1) EA035581B1 (uk)
EC (1) ECSP17005276A (uk)
ES (1) ES2883158T3 (uk)
IL (1) IL249793B (uk)
MD (1) MD20170020A2 (uk)
MX (1) MX370115B (uk)
MY (1) MY192917A (uk)
PE (1) PE20170771A1 (uk)
PH (1) PH12017500153B1 (uk)
SG (2) SG11201700378PA (uk)
SV (1) SV2017005367A (uk)
TN (1) TN2016000578A1 (uk)
TW (1) TWI710570B (uk)
UA (1) UA123432C2 (uk)
WO (1) WO2016018931A1 (uk)
ZA (1) ZA201700311B (uk)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104204218A (zh) 2012-01-26 2014-12-10 安姆根有限公司 生长分化因子15 (gdf-15)多肽
WO2013148117A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
KR101993714B1 (ko) 2013-01-30 2019-06-28 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
EP3099304A4 (en) 2014-01-31 2018-01-10 Mayo Foundation for Medical Education and Research Novel therapeutics for the treatment of glaucoma
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
MD20170020A2 (ro) 2014-07-30 2017-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compoziţii şi metode utilizate pentru tratamentul tulburărilor metabolice
CN115043945A (zh) 2014-10-31 2022-09-13 Ngm生物制药有限公司 用于治疗代谢病症的组合物和方法
US10174119B2 (en) 2016-03-31 2019-01-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
US10336812B2 (en) 2016-05-10 2019-07-02 Janssen Biotech, Inc. GDF15 fusion proteins and uses thereof
JOP20190097A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
US20200131225A1 (en) * 2017-04-20 2020-04-30 Novo Nordisk A/S Methods of purification of albumin fusion proteins
WO2019048660A1 (en) 2017-09-10 2019-03-14 Novo Nordisk A/S MIC-1 AND GLP-1 FOR USE IN THE TREATMENT OF OBESITY
JP2021511785A (ja) 2018-01-19 2021-05-13 ペプジーン インコーポレーテッドＰｅｐｇｅｎｅ Ｉｎｃ． 組換えポリペプチド生産用ｎ末端融合パートナーおよびこれを用いた組換えポリペプチドの生産方法
TWI724392B (zh) 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
PE20201350A1 (es) 2018-04-09 2020-11-30 Amgen Inc Proteinas de fusion del factor de diferenciacion de crecimiento 15
WO2020031149A2 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Novartis Ag Gfral extracellular domains and methods of use
US11524029B2 (en) 2018-08-13 2022-12-13 Viscera Labs, Inc. Therapeutic composition and methods
US11590161B2 (en) 2018-08-13 2023-02-28 Viscera Labs, Inc. Therapeutic composition and methods
MX2022002747A (es) 2019-09-10 2022-04-06 Obsidian Therapeutics Inc Proteinas de fusion de ca2-il15 para regulacion ajustable.
US20230210950A1 (en) 2019-10-04 2023-07-06 Amgen Inc. Use of gdf15 for treating cardiometabolic syndrome and other conditions
BR112022010227A2 (pt) * 2019-11-26 2022-09-13 Yuhan Corp Proteína de fusão gdf15 de ação prolongada e composição farmacêutica compreendendo a mesma
CN114867739A (zh) * 2019-12-11 2022-08-05 株式会社Lg化学 包含gdf15和能够进行o-糖基化的多肽区的融合多肽
AU2020403144A1 (en) * 2019-12-12 2022-07-14 Mayo Foundation For Medical Education And Research Controlled-delivery cromakalim prodrugs
EP4085077A4 (en) 2019-12-31 2024-01-17 Beijing Ql Biopharmaceutical Co Ltd FUSION PROTEINS FROM GLP-1 AND GDF15 AND CONJUGATES THEREOF
WO2023154953A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US6180602B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Sagami Chemical Research Center Human novel cDNA, TGF-beta superfamily protein encoded thereby and the use of immunosuppressive agent
WO1994003599A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Sagami Chemical Research Center HUMAN cDNA AND PROTEIN WHICH SAID cDNA CODES FOR
JPH07250688A (ja) 1994-01-28 1995-10-03 Sagami Chem Res Center ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ
JPH07258293A (ja) 1994-03-23 1995-10-09 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な蛋白質ならびにその製造方法
US6521227B1 (en) 1999-11-18 2003-02-18 Peter L. Hudson Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
US5994102A (en) 1994-12-15 1999-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
WO1996018730A1 (en) 1994-12-15 1996-06-20 Human Genome Sciences, Inc. Prostatic growth factor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
ATE423788T1 (de) 1995-06-22 2009-03-15 St Vincents Hosp Sydney Neues tgf-beta-ahnliches cytokin
US6524802B1 (en) 1996-03-29 2003-02-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-14
JP2001500732A (ja) 1996-09-11 2001-01-23 オーソ―マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 前立腺がんを治療するためのＴＮＦ―β様タンパク質、ならびに関連する核酸分子、医薬組成物および方法
WO1999006445A1 (en) 1997-07-31 1999-02-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-15
WO2000005259A1 (en) 1998-07-23 2000-02-03 Smithkline Beecham Corporation Secreted cysteine rich protein-6 (scrp-6)
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6465181B2 (en) 1999-03-25 2002-10-15 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6974684B2 (en) 2001-08-08 2005-12-13 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
CA2372119A1 (en) 1999-05-17 2000-11-23 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Und Zum Vertrie B Von Pharmaka Mbh Neuroprotective properties of gdf-15, a novel member of the tgf-.beta. superfamily
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
IL151857A0 (en) * 2000-03-22 2003-04-10 Octagene Gmbh Production of recombinant blood clotting factors in human cell lines
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2300325T3 (es) 2000-04-20 2008-06-16 St Vincent's Hospital Sydney Limited Ensayo diagnostico que implica la citoquina 1 inhibitoria de macrofagos (mc1).
AU2001288770A1 (en) 2000-09-08 2002-03-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services A non-steroidal anti-inflammatory drug activated gene with anti-tumorigenic properties
EP1354042A2 (en) 2000-12-29 2003-10-22 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7511121B2 (en) 2001-03-09 2009-03-31 Arnason Barry G W Polymeric immunoglobulin fusion proteins that target low-affinity Fcγreceptors
CN1970077A (zh) 2001-05-11 2007-05-30 安姆根有限公司 与tall－1结合的肽和相关分子
GB0115195D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Bae Systems Plc Split-pin drill jig
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US20030053431A1 (en) 2001-09-10 2003-03-20 Lila Madour Method for performing handoff in a radio telecommunications network
US20060253913A1 (en) 2001-12-21 2006-11-09 Yue-Jin Huang Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
CA2390820A1 (en) 2002-06-17 2003-12-17 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
US7919084B2 (en) 2002-06-17 2011-04-05 St. Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
WO2004043385A2 (en) 2002-11-08 2004-05-27 Barnes-Jewish Hospital Methods and compositions for prostate epithelial cell differentiation
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
SI2441466T1 (sl) 2004-04-13 2015-01-30 St Vincent's Hospital Sydney Limited Centre For Immunology Sredstvo, ki inhibira MIC-1
US20090042780A1 (en) 2004-05-20 2009-02-12 Acceleron Pharma Inc Modified TGF-Beta Superfamily Polypeptides and Related Methods
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
DK1844337T3 (da) 2005-01-24 2013-09-30 Pepscan Systems Bv Bindingsforbindelser, immunogene forbindelser og peptidmimetika
JP2007258293A (ja) 2006-03-22 2007-10-04 Fuji Electric Holdings Co Ltd はんだ濡れ性評価装置およびはんだ濡れ性評価方法
WO2007112005A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Pc5 as a factor ix propeptide processing enzyme
US8974748B2 (en) 2007-04-05 2015-03-10 Corning Incorporated Dual inlet microchannel device and method for using same
EP2377876A1 (en) 2006-06-02 2011-10-19 Wyeth LLC Use of proteins and peptides of the TGF-BETA superfamily for purification and therapeutic methods
US7754689B2 (en) 2006-06-02 2010-07-13 Wyeth Llc Finger-1 peptide analogs of the TGF-β superfamily
WO2008013454A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Pepscan Systems B.V. Immunogenic compounds and protein mimics
KR101245877B1 (ko) 2006-08-04 2013-03-20 메디치니쉐 호흐슐레 하노버 Ｇｄｆ-15 를 바탕으로 한, 심장 중재의 위험도를 평가하는수단 및 방법
SI2144639T1 (sl) 2007-04-25 2013-03-29 Stem Cells Spin S.A. Nova linija izvorne celice in uporaba le-te
US8067548B2 (en) 2007-07-26 2011-11-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
DK2190863T3 (en) 2007-07-31 2015-11-30 Affibody Ab New albumin binding compositions, methods and uses
AU2008286706B2 (en) 2007-08-16 2014-03-06 Garvan Institute Of Medical Research Agents and methods for modulating macrophage inhibitory cytokine (MIC-1) activity
US20100266707A1 (en) 2007-10-09 2010-10-21 Samuel Norbert Breit Method of treating cachexia with the removal or inactivation of macrophage inhibitory cytokine-1
EP2208072B1 (en) 2007-10-22 2015-07-01 St Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of prognosis
CN102066415A (zh) * 2007-10-29 2011-05-18 弗吉尼亚科技知识产权有限公司 猪DC-SIGN、ICAM-3和LSECtin及其用途
PL2235064T3 (pl) 2008-01-07 2016-06-30 Amgen Inc Sposób otrzymywania cząsteczek przeciwciał z heterodimerycznymi fc z zastosowaniem kierujących efektów elektrostatycznych
JP5647899B2 (ja) 2008-01-08 2015-01-07 ラツィオファルム ゲーエムベーハーｒａｔｉｏｐｈａｒｍ ＧｍｂＨ オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化
WO2009087190A1 (en) 2008-01-08 2009-07-16 Roche Diagnostics Gmbh Means and methods for assessing the risk of patients presenting to emergency units based on gdf-15
SG189682A1 (en) * 2008-03-31 2013-05-31 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
WO2009141357A1 (en) 2008-05-20 2009-11-26 Roche Diagnostics Gmbh Gdf-15 as biomarker in type 1 diabetes
EP2318844A1 (en) 2008-07-14 2011-05-11 Roche Diagnostics GmbH Multimarker panel for diagnosing, monitoring and selecting the therapy for patients with heart failure
WO2010019263A2 (en) 2008-08-15 2010-02-18 Genzyme Corporation Soluble flt constructs for treating cancers
CN102203619B (zh) 2008-10-31 2015-12-16 圣文森特医院悉尼有限公司 慢性肾病中的预测方法
JP2012507289A (ja) 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
EP2209003A1 (en) 2009-01-16 2010-07-21 F. Hoffmann-Roche AG Means and methods for differentiating between fibrosis and cirrhosis
EP2211182A1 (en) 2009-01-16 2010-07-28 Roche Diagnostics GmbH Method for the assessment of severity of liver cirrhosis
EP2396025A2 (en) 2009-02-12 2011-12-21 Stryker Corporation Peripheral administration of proteins including tgf-beta superfamily members for systemic treatment of disorders and disease
GB0902737D0 (en) 2009-02-19 2009-04-01 Univ Gent GDF15 as a differential marker for spondyloarthropathy
JP5841845B2 (ja) 2009-02-24 2016-01-13 ソーク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ＴＧＦ−βスーパーファミリーのデザイナーリガンド
PE20120358A1 (es) 2009-05-05 2012-04-26 Amgen Inc Mutantes fgf21 y usos de los mismos
US9308258B2 (en) 2009-07-08 2016-04-12 Amgen Inc. Stable and aggregation free antibody FC molecules through CH3 domain interface engineering
WO2011008956A2 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Zirus, Inc. Mammalian genes involved in infection
WO2011050407A1 (en) 2009-10-28 2011-05-05 St Vincent's Hospital Sydney Limited Methods of diagnosing and prognosing colonic polyps
BR112012010153B1 (pt) 2009-11-05 2022-05-03 Genentech, Inc Método de produção de um anticorpo
CN102711810B (zh) 2009-11-30 2015-04-22 詹森生物科技公司 效应子功能已消除的抗体Fc区突变体
WO2011064758A2 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Pfizer Limited Fusion protein
US9212221B2 (en) 2010-03-03 2015-12-15 Detroit R & D, Inc. Form-specific antibodies for NAG-1 (MIC-1, GDF-15), H6D and other TGF-β subfamily and heart disease and cancer diagnoses
JP5791335B2 (ja) 2010-04-07 2015-10-07 花王株式会社 オルガノポリシロキサン化合物の製造方法
WO2011127458A2 (en) 2010-04-09 2011-10-13 University Of Southern California Systems and methods of cell activated, controlled release delivery of growth factors for tissue repair and regeneration
EP2383571A1 (en) 2010-05-02 2011-11-02 Prof. Hess Medical Consulting GmbH Growth differntioation factor 15 (GDF 15) for risk prediction of diabetic foot ulcer
ES2627337T3 (es) 2010-08-26 2017-07-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Uso de biomarcadores para controlar una medicación en un sujeto que padece insuficiencia cardíaca
EP2439535A1 (en) 2010-10-07 2012-04-11 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis of diabetes related heart disease and GDF-15 and Troponin as predictors for the development of type 2 diabetes mellitus
CA2826142A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
JP5977814B2 (ja) * 2011-04-08 2016-08-24 アムジエン・インコーポレーテツド 増殖分化因子１５（ｇｄｆ−１５）を使用して代謝障害を治療または改善する方法
ES2876421T3 (es) 2011-04-13 2021-11-12 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de fusión Fc que comprenden enlazadores o disposiciones nuevos
EP4011913A1 (en) 2011-06-30 2022-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
AR086823A1 (es) 2011-06-30 2014-01-22 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpo anti-c-met, metodos
CN104204218A (zh) * 2012-01-26 2014-12-10 安姆根有限公司 生长分化因子15 (gdf-15)多肽
WO2013148117A1 (en) * 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
WO2013192388A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for regulating glucose homeostasis and insulin action
WO2014000042A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Prince Henry's Institute Of Medical Research COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TGF-β FAMILY LIGANDS
EA201500208A1 (ru) 2012-08-08 2015-07-30 Роше Гликарт Аг Слитые белки, содержащие интерлейкин-10, и их применения
AU2013364133B2 (en) 2012-12-21 2018-10-11 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-GDF15 antibodies
KR101993714B1 (ko) 2013-01-30 2019-06-28 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
US9161966B2 (en) 2013-01-30 2015-10-20 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. GDF15 mutein polypeptides
ES2676023T3 (es) 2013-03-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Polipéptidos de IL-22 y proteínas de fusión de IL-22 Fc y métodos de uso
CN203123206U (zh) * 2013-04-01 2013-08-14 宋艳丽 一种简易式一次性防污染无菌注射器
MA38873B1 (fr) 2013-07-31 2018-11-30 Amgen Inc Constructions contenant le facteur 15 de différentiation de croissance (gdf-15)
SG11201600734YA (en) 2013-07-31 2016-02-26 Amgen Inc Stabilization of fc-containing polypeptides
MD20170020A2 (ro) 2014-07-30 2017-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compoziţii şi metode utilizate pentru tratamentul tulburărilor metabolice
CN115043945A (zh) 2014-10-31 2022-09-13 Ngm生物制药有限公司 用于治疗代谢病症的组合物和方法
EP3393494A1 (en) 2015-12-22 2018-10-31 Novartis Ag Methods of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201802098UA (en) 2018-04-27
EA035581B1 (ru) 2020-07-10
JP6704358B2 (ja) 2020-06-03
US20160031960A1 (en) 2016-02-04
AU2015296640A1 (en) 2017-02-02
MX2017000964A (es) 2017-09-07
SG11201700378PA (en) 2017-02-27
MD20170020A2 (ro) 2017-07-31
NZ728101A (en) 2023-09-29
WO2016018931A1 (en) 2016-02-04
CN106573966B (zh) 2022-03-01
SV2017005367A (es) 2017-09-26
CO2017000614A2 (es) 2017-06-30
IL249793A0 (en) 2017-03-30
TWI710570B (zh) 2020-11-21
MX370115B (es) 2019-12-02
DOP2017000025A (es) 2017-05-15
EP3174894A1 (en) 2017-06-07
JP2017529059A (ja) 2017-10-05
AP2016009663A0 (en) 2016-12-31
PH12017500153A1 (en) 2017-05-29
CA2953827A1 (en) 2016-02-04
US11358995B2 (en) 2022-06-14
ES2883158T3 (es) 2021-12-07
EP3174894A4 (en) 2018-01-24
US20200165314A1 (en) 2020-05-28
PE20170771A1 (es) 2017-07-04
IL249793B (en) 2021-08-31
MY192917A (en) 2022-09-15
TN2016000578A1 (en) 2018-04-04
PH12017500153B1 (en) 2017-05-29
EA201692477A1 (ru) 2017-06-30
ECSP17005276A (es) 2017-05-31
CR20170027A (es) 2017-05-09
CN106573966A (zh) 2017-04-19
EP3174894B1 (en) 2021-06-23
TW201617364A (zh) 2016-05-16
KR20170065026A (ko) 2017-06-12
AU2015296640B2 (en) 2020-05-21
US9834586B2 (en) 2017-12-05
US20180134761A1 (en) 2018-05-17
CL2017000201A1 (es) 2017-09-08
ZA201700311B (en) 2019-06-26
BR112017001789A2 (pt) 2018-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123432C2 (uk) Димер та спосіб його застосування для лікування метаболічних розладів
ES2799503T3 (es) Composiciones y procedimientos de uso para el tratamiento de trastornos metabólicos
KR101993714B1 (ko) 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
US10195250B2 (en) Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
CN103957926B (zh) 具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的多肽
CN105601748B (zh) 用于代谢病症和疾病治疗的组合物、应用和方法
JP6453243B2 (ja) ホモシスチン尿症を処置するためのシスタチオニンβ−シンターゼ酵素
CN110386975A (zh) 酰化的glp-1衍生物
KR102672706B1 (ko) 대사 장애를 치료하기 위한 조성물 및 사용 방법
NZ728101B2 (en) Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
BR112017005986B1 (pt) Complexo que compreende um primeiro heterodímero e um segundo heterodímero, composição farmacêutica e uso do complexo