JPH07250688A - ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ - Google Patents
ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡInfo
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- JPH07250688A JPH07250688A JP6123824A JP12382494A JPH07250688A JP H07250688 A JPH07250688 A JP H07250688A JP 6123824 A JP6123824 A JP 6123824A JP 12382494 A JP12382494 A JP 12382494A JP H07250688 A JPH07250688 A JP H07250688A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新しい医薬として期待されるＴＧＦ−βスー
パーファミリーに属する新規蛋白質をコードするヒトｃ
ＤＮＡ、それがコードする蛋白質、およびその発現ベク
ターを提供する。 【構成】 ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する新規
蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、このヒトｃＤＮＡが
コードする蛋白質、およびこのヒトｃＤＮＡを有する発
現ベクターからなる。
パーファミリーに属する新規蛋白質をコードするヒトｃ
ＤＮＡ、それがコードする蛋白質、およびその発現ベク
ターを提供する。 【構成】 ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する新規
蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、このヒトｃＤＮＡが
コードする蛋白質、およびこのヒトｃＤＮＡを有する発
現ベクターからなる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト細胞内で発現して
いるｍＲＮＡに由来する新規ｃＤＮＡ、それがコードす
るトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）ス
ーパーファミリーに属する新規蛋白質、およびこのヒト
ｃＤＮＡを有する発現ベクターに関する。本発明のヒト
ｃＤＮＡは、遺伝子診断用プローブとして用いることが
出来る。また、該ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大
量生産するための遺伝子源として用いることが出来る。
本発明の蛋白質は、創傷治癒薬、骨関連疾患の治療薬、
抗炎症剤などの医薬品として、あるいは該蛋白質に対す
る抗体を作製するための抗原として用いることが出来
る。本発明のｃＤＮＡベクターは、該ｃＤＮＡに基づく
プローブ調製や蛋白質発現を容易にする。
いるｍＲＮＡに由来する新規ｃＤＮＡ、それがコードす
るトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）ス
ーパーファミリーに属する新規蛋白質、およびこのヒト
ｃＤＮＡを有する発現ベクターに関する。本発明のヒト
ｃＤＮＡは、遺伝子診断用プローブとして用いることが
出来る。また、該ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大
量生産するための遺伝子源として用いることが出来る。
本発明の蛋白質は、創傷治癒薬、骨関連疾患の治療薬、
抗炎症剤などの医薬品として、あるいは該蛋白質に対す
る抗体を作製するための抗原として用いることが出来
る。本発明のｃＤＮＡベクターは、該ｃＤＮＡに基づく
プローブ調製や蛋白質発現を容易にする。
【０００２】
【従来技術】ヒト細胞は、細胞の増殖、分化に関わる多
くの蛋白質を分泌生産している。これらの蛋白質は、い
ずれも医薬として有用であり、これまでにインターフェ
ロン、インターロイキン、エリスロポイエチンなどが新
しい医薬として開発されている。このような分泌蛋白質
の一つに、最近注目を集めているＴＧＦ−βスーパーフ
ァミリーと呼ばれる蛋白質群がある（実験医学増刊「Ｔ
ＧＦ−βスーパーファミリー」、１０巻１５号、１９９
２年；J.M.Wozney et al., Science 242:1528-1534,198
8)。ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、骨形成因子
（BMP）などがこのファミリーに属しており、細胞増殖
の促進／阻害、細胞分化の促進／阻害、細胞機能促進／
阻害等、多岐にわたる生理活性を示すことが知られてい
る。そこでこれらを、創傷治癒薬、骨関連疾患の治療
薬、抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤等へ応用する研究が
進められている。
くの蛋白質を分泌生産している。これらの蛋白質は、い
ずれも医薬として有用であり、これまでにインターフェ
ロン、インターロイキン、エリスロポイエチンなどが新
しい医薬として開発されている。このような分泌蛋白質
の一つに、最近注目を集めているＴＧＦ−βスーパーフ
ァミリーと呼ばれる蛋白質群がある（実験医学増刊「Ｔ
ＧＦ−βスーパーファミリー」、１０巻１５号、１９９
２年；J.M.Wozney et al., Science 242:1528-1534,198
8)。ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、骨形成因子
（BMP）などがこのファミリーに属しており、細胞増殖
の促進／阻害、細胞分化の促進／阻害、細胞機能促進／
阻害等、多岐にわたる生理活性を示すことが知られてい
る。そこでこれらを、創傷治癒薬、骨関連疾患の治療
薬、抗炎症剤、自己免疫疾患治療剤等へ応用する研究が
進められている。
【０００３】ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、Ｃ末端
側約１１０〜１４０残基にＣｙｓの位置が保存された特
徴的なアミノ酸配列を有する。これまで知られている蛋
白質以外にも、この保存配列を有し、生体内で重要な役
割を演じている蛋白質が存在すると考えられている。
側約１１０〜１４０残基にＣｙｓの位置が保存された特
徴的なアミノ酸配列を有する。これまで知られている蛋
白質以外にも、この保存配列を有し、生体内で重要な役
割を演じている蛋白質が存在すると考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＴＧ
Ｆ−βスーパーファミリーに属する新規蛋白質をコード
するヒトｃＤＮＡ、このヒトｃＤＮＡがコードする蛋白
質、およびこのヒトｃＤＮＡを有する発現ベクター、並
びに活性型の蛋白質を製造する方法を提供することであ
る。
Ｆ−βスーパーファミリーに属する新規蛋白質をコード
するヒトｃＤＮＡ、このヒトｃＤＮＡがコードする蛋白
質、およびこのヒトｃＤＮＡを有する発現ベクター、並
びに活性型の蛋白質を製造する方法を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する新規蛋白
質をコードするヒトｃＤＮＡをクローン化し、本発明を
完成した。すなわち、本発明はＴＧＦ−βスーパーファ
ミリーに属する新規蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、
このヒトｃＤＮＡがコードする蛋白質、およびこのヒト
ｃＤＮＡを有する発現ベクター、並びに活性型の蛋白質
を製造する方法を提供する。
結果、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する新規蛋白
質をコードするヒトｃＤＮＡをクローン化し、本発明を
完成した。すなわち、本発明はＴＧＦ−βスーパーファ
ミリーに属する新規蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、
このヒトｃＤＮＡがコードする蛋白質、およびこのヒト
ｃＤＮＡを有する発現ベクター、並びに活性型の蛋白質
を製造する方法を提供する。
【０００６】本発明のヒトｃＤＮＡ及びｃＤＮＡベクタ
ーは、多機能クローニングベクターを用いて作製したｃ
ＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来る。
多機能クローニングベクターとしては、一本鎖ファージ
由来のオリジンを有するものであって、かつｃＤＮＡク
ローニング部位の上流にＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ーを有するものであればいかなるものでも利用できる。
実施例では、ｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２号公報
に記載）を用いた。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポ
リ(A)+ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞として
は、人体から手術などによって摘出されたものでも培養
細胞でも良い。実施例ではヒトフィブロサルコーマ細胞
株ＨＴ−１０８０から単離したポリ(A)+ＲＮＡを用い
た。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法（Okayama, H. & Be
rg, P., Mol.Cell.Biol. 2:161-170,l982）、Ｇｕｂｌ
ｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法（Gubler, U. & Hoffman, J.,
Gene 25:263-269, 1983）などいかなる方法を用いて合
成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るために
は、実施例にあげたようなベクタープライマーを用いる
方法が望ましい。ｃＤＮＡの同定は、シーケンシングに
よる全塩基配列の決定、塩基配列から予測されるアミノ
酸配列と類似配列を有する既知蛋白質の検索、インビト
ロ翻訳による蛋白質発現、並びに動物細胞による蛋白質
の分泌発現によって行なう。
ーは、多機能クローニングベクターを用いて作製したｃ
ＤＮＡライブラリーからクローン化することが出来る。
多機能クローニングベクターとしては、一本鎖ファージ
由来のオリジンを有するものであって、かつｃＤＮＡク
ローニング部位の上流にＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ーを有するものであればいかなるものでも利用できる。
実施例では、ｐＫＡ１（特開平４−１１７２９２号公報
に記載）を用いた。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポ
リ(A)+ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞として
は、人体から手術などによって摘出されたものでも培養
細胞でも良い。実施例ではヒトフィブロサルコーマ細胞
株ＨＴ−１０８０から単離したポリ(A)+ＲＮＡを用い
た。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法（Okayama, H. & Be
rg, P., Mol.Cell.Biol. 2:161-170,l982）、Ｇｕｂｌ
ｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法（Gubler, U. & Hoffman, J.,
Gene 25:263-269, 1983）などいかなる方法を用いて合
成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るために
は、実施例にあげたようなベクタープライマーを用いる
方法が望ましい。ｃＤＮＡの同定は、シーケンシングに
よる全塩基配列の決定、塩基配列から予測されるアミノ
酸配列と類似配列を有する既知蛋白質の検索、インビト
ロ翻訳による蛋白質発現、並びに動物細胞による蛋白質
の分泌発現によって行なう。
【０００７】本発明者は以上の方法に基づきＴＧＦ−β
スーパーファミリーに属する新規蛋白質をコードするヒ
トｃＤＮＡを見い出し本発明を完成した。得られたｃＤ
ＮＡは、配列番号２に示す様に、１２０１bpからなる塩
基配列を有し、９２７bpのオープンリーディングフレー
ムを有していた。このオープンリーディングフレーム
は、３０８アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてい
る。この蛋白質は、Ｎ末端側に分泌蛋白質に特徴的なシ
グナル配列を有しており、Ｃ末端側９８アミノ酸残基
は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに保存されている配
列を有している。
スーパーファミリーに属する新規蛋白質をコードするヒ
トｃＤＮＡを見い出し本発明を完成した。得られたｃＤ
ＮＡは、配列番号２に示す様に、１２０１bpからなる塩
基配列を有し、９２７bpのオープンリーディングフレー
ムを有していた。このオープンリーディングフレーム
は、３０８アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしてい
る。この蛋白質は、Ｎ末端側に分泌蛋白質に特徴的なシ
グナル配列を有しており、Ｃ末端側９８アミノ酸残基
は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに保存されている配
列を有している。
【０００８】ＴＧＦ−βスーパーファミリーは分泌され
た後プロセシングを受け、Ｃ末端側約１１０〜１４０ア
ミノ酸残基からなるペプチドを生成し、このペプチドが
活性型として作用することが知られている。本発明の蛋
白質は、第１９２番目から第１９４番目にＡｒｇＡｒｇ
Ａｒｇという配列が見られ、この下流でプロセシングさ
れた後、第１９５番目のＡｌａ、あるいは第１９７番目
のＡｌａ、あるいは第１９９番目のＡｓｎから始まる活
性型ペプチドが得られる。したがって活性型ペプチドは
少なくとも配列番号１記載のアミノ酸残基を含むもので
あれば良い。
た後プロセシングを受け、Ｃ末端側約１１０〜１４０ア
ミノ酸残基からなるペプチドを生成し、このペプチドが
活性型として作用することが知られている。本発明の蛋
白質は、第１９２番目から第１９４番目にＡｒｇＡｒｇ
Ａｒｇという配列が見られ、この下流でプロセシングさ
れた後、第１９５番目のＡｌａ、あるいは第１９７番目
のＡｌａ、あるいは第１９９番目のＡｓｎから始まる活
性型ペプチドが得られる。したがって活性型ペプチドは
少なくとも配列番号１記載のアミノ酸残基を含むもので
あれば良い。
【０００９】本発明のｃＤＮＡは、配列番号１あるいは
配列番号２に記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成
したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、本発明で用
いた細胞株から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングすれば、本発明のｃＤＮＡと同一のクロー
ンを容易に得ることが出来る。
配列番号２に記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成
したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、本発明で用
いた細胞株から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングすれば、本発明のｃＤＮＡと同一のクロー
ンを容易に得ることが出来る。
【００１０】一般に、ヒト遺伝子には、個体差による多
型が頻繁に認められる。従って、配列番号１あるいは配
列番号２において、１又は複数個のヌクレオチドの付
加、欠失及び／又は他のヌクレオチドによる置換がなさ
れているｃＤＮＡも、本発明の範疇に入る。
型が頻繁に認められる。従って、配列番号１あるいは配
列番号２において、１又は複数個のヌクレオチドの付
加、欠失及び／又は他のヌクレオチドによる置換がなさ
れているｃＤＮＡも、本発明の範疇に入る。
【００１１】同様に、これらの変更によって生じる、１
又は複数個のアミノ酸の付加、決失及び／又は他のアミ
ノ酸による置換がなされている蛋白質も、本発明の範疇
に入る。
又は複数個のアミノ酸の付加、決失及び／又は他のアミ
ノ酸による置換がなされている蛋白質も、本発明の範疇
に入る。
【００１２】本発明の蛋白質は、本発明のｃＤＮＡを有
するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製
し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによ
りインビトロで発現出来る。また翻訳領域を適当な発現
ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動
物細胞等で、コードしている蛋白質を大量に発現させる
ことも可能である。あるいは本発明のアミノ酸配列に基
づき、化学合成によってペプチドを調製することも出来
る。
するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製
し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによ
りインビトロで発現出来る。また翻訳領域を適当な発現
ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動
物細胞等で、コードしている蛋白質を大量に発現させる
ことも可能である。あるいは本発明のアミノ酸配列に基
づき、化学合成によってペプチドを調製することも出来
る。
【００１３】本発明のｃＤＮＡベクターは、一本鎖ファ
ージ由来のオリジンを有するものであって、かつｃＤＮ
Ａクローニング部位の上流にＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターを有する多機能クローニングベクターに、本発明
のｃＤＮＡを組換えてやれば構築できる。しかし、実施
例のように多機能クローニングベクターを用いて作製し
たｃＤＮＡライブラリーからクローン化した場合には、
得られたクローンその物がすでに目的とする性質を有し
ている。
ージ由来のオリジンを有するものであって、かつｃＤＮ
Ａクローニング部位の上流にＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターを有する多機能クローニングベクターに、本発明
のｃＤＮＡを組換えてやれば構築できる。しかし、実施
例のように多機能クローニングベクターを用いて作製し
たｃＤＮＡライブラリーからクローン化した場合には、
得られたクローンその物がすでに目的とする性質を有し
ている。
【００１４】本発明のｃＤＮＡベクターは、f1ファージ
のオリジンおよびT7プロモーターを有しているので、ｃ
ＤＮＡを他のベクターに組換えることなしに、ｃＤＮＡ
のアンチセンス鎖に対応する一本鎖ＤＮＡ並びにセンス
鎖ＲＮＡを容易に調製することが出来る。即ち、本発明
のｃＤＮＡベクターを有する大腸菌（F'含有株）の培養
液に、ヘルパーファージを感染させると、培地中にｃＤ
ＮＡのアンチセンス鎖に相当する一本鎖ＤＮＡを含むフ
ァージが放出される。したがって培地からこのファージ
を回収すれば容易にアンチセンス一本鎖ＤＮＡを調製で
きる。実施例ではこれを用いて塩基配列決定を行なって
いる。また本発明のｃＤＮＡベクターを制限酵素で切断
して直鎖状にした後、ＲＮＡポリメラーゼを作用させる
と、センス鎖ＲＮＡが調製できる。この際ラジオアイソ
トープや色素などで標識した基質を混合しておけば、こ
れらの化合物によって標識されたＲＮＡプローブを調製
することが出来る。
のオリジンおよびT7プロモーターを有しているので、ｃ
ＤＮＡを他のベクターに組換えることなしに、ｃＤＮＡ
のアンチセンス鎖に対応する一本鎖ＤＮＡ並びにセンス
鎖ＲＮＡを容易に調製することが出来る。即ち、本発明
のｃＤＮＡベクターを有する大腸菌（F'含有株）の培養
液に、ヘルパーファージを感染させると、培地中にｃＤ
ＮＡのアンチセンス鎖に相当する一本鎖ＤＮＡを含むフ
ァージが放出される。したがって培地からこのファージ
を回収すれば容易にアンチセンス一本鎖ＤＮＡを調製で
きる。実施例ではこれを用いて塩基配列決定を行なって
いる。また本発明のｃＤＮＡベクターを制限酵素で切断
して直鎖状にした後、ＲＮＡポリメラーゼを作用させる
と、センス鎖ＲＮＡが調製できる。この際ラジオアイソ
トープや色素などで標識した基質を混合しておけば、こ
れらの化合物によって標識されたＲＮＡプローブを調製
することが出来る。
【００１５】本発明のｃＤＮＡを動物細胞内で働くプロ
モーターの下流に接続した発現ベクターを作製し、該発
現ベクターを動物細胞にトランスフェクションによって
導入してやれば、該ｃＤＮＡを動物細胞で分泌発現さ
せ、培養上澄に目的とする蛋白質を活性型の形で得るこ
とができる。発現ベクター上のプロモーターとしては、
動物細胞内で働くものであれば、いかなるものでもよ
い。ＳＶ４０の初期プロモーターや後期プロモーター、
アデノウイルスの後期プロモーター、レトロウイルスの
ＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター、サイトメ
ガロウイルスのプロモーター、カイコバキュロウイルス
多核体のプロモーター、チミジンキナーゼのプロモータ
ー、メタロチオネインのプロモーター、β−アクチンの
プロモーター、延長因子−１αのプロモーター、リボソ
ーム蛋白質のプロモーター等が例示できる。なお本発明
のｃＤＮＡベクターは、すでにＳＶ４０のプロモーター
を有しているので、そのままトランスフェクションに用
いることができる。トランスフェクションは公知の方法
によって行なうことができる。動物細胞としては、サル
腎臓細胞株ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞
株ＣＨＯ、カイコ細胞株ＢＭーＮ等が例示できる。発現
産物の活性は、公知の方法を用いて測定することができ
る。実施例では、サル腎臓細胞株ＣＯＳ７にトランスフ
ェクションし、培養上澄に、マウス前骨芽細胞のアルカ
リ性ホスファターゼ活性増加作用、並びにコラーゲン合
成量増加作用があることを示した。
モーターの下流に接続した発現ベクターを作製し、該発
現ベクターを動物細胞にトランスフェクションによって
導入してやれば、該ｃＤＮＡを動物細胞で分泌発現さ
せ、培養上澄に目的とする蛋白質を活性型の形で得るこ
とができる。発現ベクター上のプロモーターとしては、
動物細胞内で働くものであれば、いかなるものでもよ
い。ＳＶ４０の初期プロモーターや後期プロモーター、
アデノウイルスの後期プロモーター、レトロウイルスの
ＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスのプロモーター、サイトメ
ガロウイルスのプロモーター、カイコバキュロウイルス
多核体のプロモーター、チミジンキナーゼのプロモータ
ー、メタロチオネインのプロモーター、β−アクチンの
プロモーター、延長因子−１αのプロモーター、リボソ
ーム蛋白質のプロモーター等が例示できる。なお本発明
のｃＤＮＡベクターは、すでにＳＶ４０のプロモーター
を有しているので、そのままトランスフェクションに用
いることができる。トランスフェクションは公知の方法
によって行なうことができる。動物細胞としては、サル
腎臓細胞株ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞
株ＣＨＯ、カイコ細胞株ＢＭーＮ等が例示できる。発現
産物の活性は、公知の方法を用いて測定することができ
る。実施例では、サル腎臓細胞株ＣＯＳ７にトランスフ
ェクションし、培養上澄に、マウス前骨芽細胞のアルカ
リ性ホスファターゼ活性増加作用、並びにコラーゲン合
成量増加作用があることを示した。
【００１６】
【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献（"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Co
ld Spring Harbor Laboratory, 1989）に従った。制限
酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社
製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反
応条件は付属の説明書に従った。
が、本発明はこれらの例に限定されるものではない。Ｄ
ＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、
文献（"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Co
ld Spring Harbor Laboratory, 1989）に従った。制限
酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社
製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反
応条件は付属の説明書に従った。
【００１７】ｃＤＮＡクローニングと同定 ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−１０８０のｃＤＮ
Ａライブラリー（特開平４−１１７２９２号公報に記
載）から任意に選択したクローンの塩基配列決定を行な
い、得られた塩基配列を３フレームのアミノ酸配列に変
換した後、これらの配列でプロテインデータベースを検
索した。解析ソフトウエアはＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ
（ソフトウエア開発社製）を用いた。その結果、クロー
ンＨＰ００２６９がコードしている蛋白質は、ＴＧＦ−
βスーパーファミリーに保存されている配列を有してい
ることが判明した。このクローンの構造を図１に示す。
ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、３
２bpの５'−非翻訳領域、９２７bpのオープンリーディ
ングフレーム、２４２bpの３'−非翻訳領域、４０bpの
ポリAテールからなる構造を有していた（配列番号
２）。オープンリーディングフレームは３０８アミノ酸
残基からなる蛋白質をコードしており、この配列を用い
てプロテインデータベースを検索したところ、Ｃ末端側
９８アミノ酸残基がＴＧＦ−βスーパーファミリーに保
存された配列と高い類似性を有していた。表１に、本発
明の蛋白質（HP）と他のＴＧＦ−βスーパーファミリー
とのＣ末端アミノ酸配列の比較を示す。-はギャップ
を、.は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、*はすべ
ての蛋白質で保存されている配列をそれぞれ表す。この
表からわかるように、本発明の蛋白質のＣｓｙの配置は
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに保存されている物と完
全に一致した。類似性の程度は、９８アミノ酸残基当た
り、BMP-6(BM)と３５.７％、胚成長因子ＧＤＦ−１(GD)
と３４.７％、インヒビンβB（IN）と２１.４％、ＴＧ
Ｆ−β２（TG）と２５.５％であった。
Ａライブラリー（特開平４−１１７２９２号公報に記
載）から任意に選択したクローンの塩基配列決定を行な
い、得られた塩基配列を３フレームのアミノ酸配列に変
換した後、これらの配列でプロテインデータベースを検
索した。解析ソフトウエアはＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ
（ソフトウエア開発社製）を用いた。その結果、クロー
ンＨＰ００２６９がコードしている蛋白質は、ＴＧＦ−
βスーパーファミリーに保存されている配列を有してい
ることが判明した。このクローンの構造を図１に示す。
ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を決定したところ、３
２bpの５'−非翻訳領域、９２７bpのオープンリーディ
ングフレーム、２４２bpの３'−非翻訳領域、４０bpの
ポリAテールからなる構造を有していた（配列番号
２）。オープンリーディングフレームは３０８アミノ酸
残基からなる蛋白質をコードしており、この配列を用い
てプロテインデータベースを検索したところ、Ｃ末端側
９８アミノ酸残基がＴＧＦ−βスーパーファミリーに保
存された配列と高い類似性を有していた。表１に、本発
明の蛋白質（HP）と他のＴＧＦ−βスーパーファミリー
とのＣ末端アミノ酸配列の比較を示す。-はギャップ
を、.は本発明の蛋白質と同一アミノ酸残基を、*はすべ
ての蛋白質で保存されている配列をそれぞれ表す。この
表からわかるように、本発明の蛋白質のＣｓｙの配置は
ＴＧＦ−βスーパーファミリーに保存されている物と完
全に一致した。類似性の程度は、９８アミノ酸残基当た
り、BMP-6(BM)と３５.７％、胚成長因子ＧＤＦ−１(GD)
と３４.７％、インヒビンβB（IN）と２１.４％、ＴＧ
Ｆ−β２（TG）と２５.５％であった。
【００１８】
【表１】
【００１９】Ｎ末端側のアミノ酸配列と高い類似性を示
す蛋白質は見いだせなかったが、Ｎ末端に分泌蛋白質に
特徴的なシグナル配列が存在していた。ＴＧＦ−βスー
パーファミリーは分泌された後プロセシングを受け、Ｃ
末端側約１１０〜１４０アミノ酸残基からなるペプチド
を生成し、このペプチドが活性型として作用することが
知られている。プロセシングは、ＡｒｇやＬｙｓなどの
塩基性アミノ酸残基が連続している部位の後ろで起こ
る。配列番号２で表される本発明の蛋白質は、第１９２
番目から第１９４番目にＡｒｇＡｒｇＡｒｇという配列
が見られ、この下流でプロセシングを受けると考えられ
る。したがって本発明の蛋白質も、他のＴＧＦ−βスー
パーファミリーと同様、プレプロペプチドの形で合成さ
れた後、細胞外に分泌したプロペプチドがプロテアーゼ
の作用を受けて、少なくともＣ末端９８残基を含む活性
型のペプチドになると考えられる。
す蛋白質は見いだせなかったが、Ｎ末端に分泌蛋白質に
特徴的なシグナル配列が存在していた。ＴＧＦ−βスー
パーファミリーは分泌された後プロセシングを受け、Ｃ
末端側約１１０〜１４０アミノ酸残基からなるペプチド
を生成し、このペプチドが活性型として作用することが
知られている。プロセシングは、ＡｒｇやＬｙｓなどの
塩基性アミノ酸残基が連続している部位の後ろで起こ
る。配列番号２で表される本発明の蛋白質は、第１９２
番目から第１９４番目にＡｒｇＡｒｇＡｒｇという配列
が見られ、この下流でプロセシングを受けると考えられ
る。したがって本発明の蛋白質も、他のＴＧＦ−βスー
パーファミリーと同様、プレプロペプチドの形で合成さ
れた後、細胞外に分泌したプロペプチドがプロテアーゼ
の作用を受けて、少なくともＣ末端９８残基を含む活性
型のペプチドになると考えられる。
【００２０】なお得られたｃＤＮＡの配列を用いて塩基
配列データーベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢ
Ｊを検索した結果、配列番号２で表される本発明のｃＤ
ＮＡの９０２番目から１２００番目までの配列と２９９
bpにわたって９９．３％一致するｃＤＮＡ断片の部分配
列（D11716とD11717）が登録されていることがわかっ
た。ただし、部分配列が一致するからといって、この断
片と本発明の完全長ｃＤＮＡが同じｍＲＮＡに由来する
という保証はない。またこの断片は、３'−非翻訳領域
に由来するのでオープンリーディングフレームを含ま
ず、したがってこの配列からだけでは、コードしている
かもしれない蛋白質の機能はわからない。さらにこの断
片を用いて蛋白質を合成することも出来ない。
配列データーベースＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢ
Ｊを検索した結果、配列番号２で表される本発明のｃＤ
ＮＡの９０２番目から１２００番目までの配列と２９９
bpにわたって９９．３％一致するｃＤＮＡ断片の部分配
列（D11716とD11717）が登録されていることがわかっ
た。ただし、部分配列が一致するからといって、この断
片と本発明の完全長ｃＤＮＡが同じｍＲＮＡに由来する
という保証はない。またこの断片は、３'−非翻訳領域
に由来するのでオープンリーディングフレームを含ま
ず、したがってこの配列からだけでは、コードしている
かもしれない蛋白質の機能はわからない。さらにこの断
片を用いて蛋白質を合成することも出来ない。
【００２１】インビトロ翻訳による蛋白質合成 本発明のｃＤＮＡを有するベクターを用いて、ＴＮＴウ
サギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるイ
ンビトロ翻訳を行なった。この際、[35S]メチオニンを
添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。
いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行
なった。発現産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた後、オートラジオグラフィーを行ない、
翻訳産物の分子量を求めた。その結果、本発明のｃＤＮ
Ａは、分子量約３７kDaの翻訳産物を生成した。この値
は、配列番号２で表される塩基配列から予想される蛋白
質の予想分子量３４１６７と許容実験誤差内で一致し、
このｃＤＮＡが確かに配列番号２で表される蛋白質をコ
ードしていることが示された。
サギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるイ
ンビトロ翻訳を行なった。この際、[35S]メチオニンを
添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。
いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行
なった。発現産物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけた後、オートラジオグラフィーを行ない、
翻訳産物の分子量を求めた。その結果、本発明のｃＤＮ
Ａは、分子量約３７kDaの翻訳産物を生成した。この値
は、配列番号２で表される塩基配列から予想される蛋白
質の予想分子量３４１６７と許容実験誤差内で一致し、
このｃＤＮＡが確かに配列番号２で表される蛋白質をコ
ードしていることが示された。
【００２２】動物細胞による分泌発現 サル腎臓細胞株ＣＯＳ７を、１０％ウシ胎児血清含有Ｄ
ＭＥＭ培地中、５％ＣＯ2気流下３７℃で培養した。図
１に示したプラスミド２μｇを、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥ
ＡＥデキストランを含むトリス緩衝ＤＭＥＭ培地（Ｔー
ＤＭＥＭ、ｐＨ７．５）１．５ｍｌに懸濁し、２ｘ１０
5細胞のＣＯＳ７細胞に添加した。３７℃で４時間培養
した後、培地を除去し、ＴーＤＭＥＭで細胞を洗浄した
後、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を添加し、３
日間５％ＣＯ2気流下３７℃で培養した。得られた培養
上澄を活性測定に用いた。ｃＤＮＡを有していないベク
ターのみを、上記と同じ条件でＣＯＳ７細胞にトランス
フェクションし、その培養上澄を対照として用いた。
ＭＥＭ培地中、５％ＣＯ2気流下３７℃で培養した。図
１に示したプラスミド２μｇを、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥ
ＡＥデキストランを含むトリス緩衝ＤＭＥＭ培地（Ｔー
ＤＭＥＭ、ｐＨ７．５）１．５ｍｌに懸濁し、２ｘ１０
5細胞のＣＯＳ７細胞に添加した。３７℃で４時間培養
した後、培地を除去し、ＴーＤＭＥＭで細胞を洗浄した
後、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を添加し、３
日間５％ＣＯ2気流下３７℃で培養した。得られた培養
上澄を活性測定に用いた。ｃＤＮＡを有していないベク
ターのみを、上記と同じ条件でＣＯＳ７細胞にトランス
フェクションし、その培養上澄を対照として用いた。
【００２３】発現産物の活性測定 ＣＯＳ７細胞で得られた上記発現産物をマウス前骨芽細
胞株ＭＣ３Ｔ３ーＥ１に作用させ、アルカリ性ホスファ
ターゼ活性並びにコラーゲン合成量の変化を測定した。
胞株ＭＣ３Ｔ３ーＥ１に作用させ、アルカリ性ホスファ
ターゼ活性並びにコラーゲン合成量の変化を測定した。
【００２４】発現産物を各種濃度で含んでいる１０％新
生子ウシ血清含有アルファーＭＥＭ培地に、ＭＣ３Ｔ３
ーＥ１細胞を１ｘ１０4細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、２
４穴マルチプレートの各穴に１ｍｌづつ接種した。その
後は３日毎に培地交換を行った。培養終了後、培地を除
去し、１ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄した。これに０．０
５％トリトンーＸ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液を１穴あた
り５００μｌ加え、細胞を遊離させた後ピペッテイング
操作により懸濁させた。１５ｍｌ遠心分離チューブ（住
友ベークライト社製）に細胞懸濁液を移し、３０秒間超
音波装置にかけ、細胞を破砕した。これを１０００ｒ．
ｐ．ｍ．、４分間遠心分離機にかけ、得られた上澄を酵
素活性の測定に使用した。
生子ウシ血清含有アルファーＭＥＭ培地に、ＭＣ３Ｔ３
ーＥ１細胞を１ｘ１０4細胞／ｍｌの濃度で懸濁し、２
４穴マルチプレートの各穴に１ｍｌづつ接種した。その
後は３日毎に培地交換を行った。培養終了後、培地を除
去し、１ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄した。これに０．０
５％トリトンーＸ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2溶液を１穴あた
り５００μｌ加え、細胞を遊離させた後ピペッテイング
操作により懸濁させた。１５ｍｌ遠心分離チューブ（住
友ベークライト社製）に細胞懸濁液を移し、３０秒間超
音波装置にかけ、細胞を破砕した。これを１０００ｒ．
ｐ．ｍ．、４分間遠心分離機にかけ、得られた上澄を酵
素活性の測定に使用した。
【００２５】アルカリ性ホスファターゼ活性測定にはア
ルカリ性ホスファＢテストワコー（和光純薬社製）を用
いてＢｅｓｓｅｙーＬｏｗｒｙ法を基にして行い、遊離
したｐーニトロフェノールの量μｍｏｌ／ｍｉｎ／タン
パク質 （ｍｇ）で酵素活性を表わした。すなわち、基
質緩衝液 （０．１Ｍ炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．８、２ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭｐーニトロフェノール）０．５ｍ
ｌを試験管に入れ、３分間３７℃にて予備加温した。こ
れに上記で調製した上澄０．５ｍｌ を加え、３７℃に
て３０分間加温した。反応系に０．０２Ｎ 水酸化ナト
リウム を２ｍｌ加えて反応を停止させ、この溶液を２
４穴マルチプレートの各穴に１ｍｌ分注し、波長４１５
ｎｍの濁度を測定し，検量線から活性値を求めた。
ルカリ性ホスファＢテストワコー（和光純薬社製）を用
いてＢｅｓｓｅｙーＬｏｗｒｙ法を基にして行い、遊離
したｐーニトロフェノールの量μｍｏｌ／ｍｉｎ／タン
パク質 （ｍｇ）で酵素活性を表わした。すなわち、基
質緩衝液 （０．１Ｍ炭酸塩緩衝液 ｐＨ９．８、２ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭｐーニトロフェノール）０．５ｍ
ｌを試験管に入れ、３分間３７℃にて予備加温した。こ
れに上記で調製した上澄０．５ｍｌ を加え、３７℃に
て３０分間加温した。反応系に０．０２Ｎ 水酸化ナト
リウム を２ｍｌ加えて反応を停止させ、この溶液を２
４穴マルチプレートの各穴に１ｍｌ分注し、波長４１５
ｎｍの濁度を測定し，検量線から活性値を求めた。
【００２６】図２に、３回の測定値の平均値と標準誤差
を示した。アルカリ性ホスファターゼ活性は、発現産物
を添加したときのみ有意の増加が認められ、増加の程度
は、添加した発現産物の量に依存した。以上の結果か
ら、本発明のｃＤＮＡを動物細胞で発現させた場合、そ
の分泌発現産物はマウス前骨芽細胞のアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性を増加させる作用を有することが示され
た。
を示した。アルカリ性ホスファターゼ活性は、発現産物
を添加したときのみ有意の増加が認められ、増加の程度
は、添加した発現産物の量に依存した。以上の結果か
ら、本発明のｃＤＮＡを動物細胞で発現させた場合、そ
の分泌発現産物はマウス前骨芽細胞のアルカリ性ホスフ
ァターゼ活性を増加させる作用を有することが示され
た。
【００２７】次いで、ＳＩＲＣＯＬ社製コラーゲンアッ
セイキットを用い、コラーゲン合成量の測定を行なっ
た。２４穴マルチプレートにて培養したＭＣ３Ｔ３ーＥ
１細胞の培養上清を除去し、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し
た。これに１穴あたり１００μｌの０．５Ｍ酢酸溶液を
加え、細胞内のコラ−ゲンを溶出させた。これにさらに
２５０μｌの発色試薬（５％ピルビン酸，０．１％Ｄｉ
ｒｅｃｔ Ｒｅｄ）を加え、細胞の残骸を取らないよう
にして上清３００μｌを１５ｍｌ遠沈管に取り、３０分
間振とうした。この遠沈管を遠心分離器にかけ（１５５
０ｒ．ｐ．ｍ．、４分間）上清を除去した。遠沈管内に
残った赤い沈殿物にエタノ−ル５００μｌを加え，再度
遠心分離器にかけて上清を除去した。得られた沈殿物に
０．５Ｍ水酸化ナトリウムを１ｍｌ加えた後，各検体を
２００μｌづつ９６穴マルチプレートに分注した。マイ
クロプレ−トリ−ダ−にて波長５５０ｎｍの濁度を測定
し，検量線によりコラ−ゲン量を読み取った。
セイキットを用い、コラーゲン合成量の測定を行なっ
た。２４穴マルチプレートにて培養したＭＣ３Ｔ３ーＥ
１細胞の培養上清を除去し、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し
た。これに１穴あたり１００μｌの０．５Ｍ酢酸溶液を
加え、細胞内のコラ−ゲンを溶出させた。これにさらに
２５０μｌの発色試薬（５％ピルビン酸，０．１％Ｄｉ
ｒｅｃｔ Ｒｅｄ）を加え、細胞の残骸を取らないよう
にして上清３００μｌを１５ｍｌ遠沈管に取り、３０分
間振とうした。この遠沈管を遠心分離器にかけ（１５５
０ｒ．ｐ．ｍ．、４分間）上清を除去した。遠沈管内に
残った赤い沈殿物にエタノ−ル５００μｌを加え，再度
遠心分離器にかけて上清を除去した。得られた沈殿物に
０．５Ｍ水酸化ナトリウムを１ｍｌ加えた後，各検体を
２００μｌづつ９６穴マルチプレートに分注した。マイ
クロプレ−トリ−ダ−にて波長５５０ｎｍの濁度を測定
し，検量線によりコラ−ゲン量を読み取った。
【００２８】図３に、４回の測定値の平均値と標準誤差
を示した。コラーゲン合成量は、発現産物を添加したと
きのみ有意の増加が認められ、増加の程度は、添加した
発現産物の量に依存した。以上の結果から、本発明のｃ
ＤＮＡを動物細胞で発現させた場合、その分泌発現産物
はマウス前骨芽細胞のコラーゲン合成量を増加させる作
用を有することが示された。
を示した。コラーゲン合成量は、発現産物を添加したと
きのみ有意の増加が認められ、増加の程度は、添加した
発現産物の量に依存した。以上の結果から、本発明のｃ
ＤＮＡを動物細胞で発現させた場合、その分泌発現産物
はマウス前骨芽細胞のコラーゲン合成量を増加させる作
用を有することが示された。
【００２９】
【発明の効果】本発明によりＴＧＦ−βスーパーファミ
リーに属する新規蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、こ
のヒトｃＤＮＡがコードする蛋白質、およびこのヒトｃ
ＤＮＡを有する発現ベクター、並びに活性型の蛋白質を
製造する方法が提供された。本発明のｃＤＮＡを用いる
ことにより、該組換え蛋白質を大量に発現することがで
きる。該組換え蛋白質は、例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ活性増加作用、コラーゲン合成量増加作用を示し、
創傷治癒薬、骨関連疾患の治療薬、抗炎症剤などの医薬
品として利用することができる。
リーに属する新規蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、こ
のヒトｃＤＮＡがコードする蛋白質、およびこのヒトｃ
ＤＮＡを有する発現ベクター、並びに活性型の蛋白質を
製造する方法が提供された。本発明のｃＤＮＡを用いる
ことにより、該組換え蛋白質を大量に発現することがで
きる。該組換え蛋白質は、例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ活性増加作用、コラーゲン合成量増加作用を示し、
創傷治癒薬、骨関連疾患の治療薬、抗炎症剤などの医薬
品として利用することができる。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：２９４ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 TGC CGT CTG CAC ACG GTC CGC GCG TCG CTG GAA GAC CTG GGC TGG GCC 48 Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala 5 10 15 GAT TGG GTG CTG TCG CCA CGG GAG GTG CAA GTG ACC ATG TGC ATC GGC 96 Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly 20 25 30 GCG TGC CCG AGC CAG TTC CGG GCG GCA AAC ATG CAC GCG CAG ATC AAG 144 Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys 35 40 45 ACG AGC CTG CAC CGC CTG AAG CCC GAC ACG GTG CCA GCG CCC TGC TGC 192 Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys 50 55 60 GTG CCC GCC AGC TAC AAT CCC ATG GTG CTC ATT CAA AAG ACC GAC ACC 240 Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr 65 70 75 80 GGG GTG TCG CTC CAG ACC TAT GAT GAC TTG TTA GCC AAA GAC TGC CAC 288 Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His 85 90 95 TGC ATA 294 Cys Ile
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：１２０１ 配列の型：核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ホモ＝サピエンス 細胞の種類：フィブロサルコーマ セルライン：ＨＴ−１０８０ クローン名：ＨＰ００２６９ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３３．．９５９ 配列 AGTCCCAGCT CAGAGCCGCA ACCTGCACAG CC ATG CCC GGG CAA GAA CTC AGG 53 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg 5 ACG CTG AAT GGC TCT CAG ATG CTC CTG GTG TTG CTG GTG CTC TCG TGG 101 Thr Leu Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp 10 15 20 CTG CCG CAT GGG GGC GCC CTG TCT CTG GCC GAG GCG AGC CGC GCA AGT 149 Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser 25 30 35 TTC CCG GGA CCC TCA GAG TTG CAC ACC GAA GAC TCC AGA TTC CGA GAG 197 Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Thr Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu 40 45 50 55 TTG CGG AAA CGC TAC GAG GAC CTG CTA ACC AGG CTG CGG GCC AAC CAG 245 Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln 60 65 70 AGC TGG GAA GAT TCG AAC ACC GAC CTC GTC CCG GCC CCT GCA GTC CGG 293 Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg 75 80 85 ATA CTC ACG CCA GAA GTG CGG CTG GGA TCC GGC GGC CAC CTG CAC CTG 341 Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu 90 95 100 CGT ATC TCT CGG GCC GCC CTT CCC GAG GGG CTC CCC GAG GCC TCC CGC 389 Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg 105 110 115 CTT CAC CGG GCT CTG TTC CGG CTG TCC CCG ACG GCG TCA AGG TCG TGG 437 Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp 120 125 130 135 GAC GTG ACA CGA CCT CTG CGG CGT CAG CTC AGC CTT GCA AGA CCC CAG 485 Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln 140 145 150 GCG CCC GCG CTG CAC CTG CGA CTG TCG CCG CCG CCG TCG CAG TCG GAC 533 Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp 155 160 165 CAA CTG CTG GCA GAA TCT TCG TCC GCA CGG CCC CAG CTG GAG TTG CAC 581 Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His 170 175 180 TTG CGG CCG CAA GCC GCC AGG GGG CGC CGC AGA GCG CGT GCG CGC AAC 629 Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn 185 190 195 GGG GAC CAC TGT CCG CTC GGG CCC GGG CGT TGC TGC CGT CTG CAC ACG 677 Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr 200 205 210 215 GTC CGC GCG TCG CTG GAA GAC CTG GGC TGG GCC GAT TGG GTG CTG TCG 725 Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser 220 225 230 CCA CGG GAG GTG CAA GTG ACC ATG TGC ATC GGC GCG TGC CCG AGC CAG 773 Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln 235 240 245 TTC CGG GCG GCA AAC ATG CAC GCG CAG ATC AAG ACG AGC CTG CAC CGC 821 Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg 250 255 260 CTG AAG CCC GAC ACG GTG CCA GCG CCC TGC TGC GTG CCC GCC AGC TAC 869 Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr 265 270 275 AAT CCC ATG GTG CTC ATT CAA AAG ACC GAC ACC GGG GTG TCG CTC CAG 917 Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln 280 285 290 295 ACC TAT GAT GAC TTG TTA GCC AAA GAC TGC CAC TGC ATA TGA G 960 Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile *** 300 305 CAGTCCTGGT CCTTCCACTG TGCACCTGCG CGGGGGAGGC GACCTCAGTT GTCCTGCCCT 1020 GTGGAATGGG CTCAAGGTTC CTGAGACACC CGATTCCTGC CCAAACAGCT GTATTTATAT 1080 AAGTCTGTTA TTTATTATTA ATTTATTGGG GTGACCTTCT TGGGGACTCG GGGGCTGGTC 1140 TGATGGAACT GTGTATTTAT TTAAAACTCT GGTGATAAAA ATAAAGCTGT CTGAACTGTT 1200 C 1201
【図１】 クローンＨＰ００２６９の構造を表す。
【図２】 アルカリ性ホスファターゼ活性測定結果を示
すグラフである。
すグラフである。
【図３】 コラーゲン合成量の測定結果を示すグラフで
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小林 みどり 神奈川県藤沢市長後647 (72)発明者 矢田 美日 神奈川県相模原市鵜野森１−18−10 (72)発明者 辻 智子 神奈川県横浜市金沢区能見台６−12−２
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１で表される塩基配列を含むｃ
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む蛋白質。 - 【請求項３】 配列番号１で表される塩基配列を含む配
列番号２で表されるｃＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
む配列番号２で表される蛋白質。 - 【請求項５】 請求項１あるいは請求項３記載のヒトｃ
ＤＮＡを有する発現ベクター。 - 【請求項６】 請求項５記載の発現ベクターを動物細胞
に導入した後、培養を行なうことからなる、活性型の請
求項２記載の蛋白質を製造する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6123824A JPH07250688A (ja) | 1994-01-28 | 1994-06-06 | ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2488594 | 1994-01-28 | ||
| JP6-24885 | 1994-01-28 | ||
| JP6123824A JPH07250688A (ja) | 1994-01-28 | 1994-06-06 | ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07250688A true JPH07250688A (ja) | 1995-10-03 |
Family
ID=26362461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6123824A Pending JPH07250688A (ja) | 1994-01-28 | 1994-06-06 | ＴＧＦ−βスーパーファミリー蛋白質をコードするヒト新規ｃＤＮＡ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07250688A (ja) |
Cited By (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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