EA008831B1 - Слитые белки аналогов glp-1 - Google Patents
Слитые белки аналогов glp-1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA008831B1 EA008831B1 EA200600015A EA200600015A EA008831B1 EA 008831 B1 EA008831 B1 EA 008831B1 EA 200600015 A EA200600015 A EA 200600015A EA 200600015 A EA200600015 A EA 200600015A EA 008831 B1 EA008831 B1 EA 008831B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- zeg
- rgo
- haa
- luz
- tug
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 114
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 114
- 101100337060 Caenorhabditis elegans glp-1 gene Proteins 0.000 title 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 9
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 claims description 3
- 101100377255 Caenorhabditis elegans zer-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 23
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000012636 effector Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 9
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 abstract description 3
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000030135 gastric motility Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 abstract 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 26
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 17
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 101710152019 Centromere-binding protein 1 Proteins 0.000 description 12
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 11
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 11
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 11
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 101800000594 Capsid protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 101800000838 Neutrophil cationic peptide 1 Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- -1 protoplast fusion Substances 0.000 description 5
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 4
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 4
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010056997 Impaired fasting glucose Diseases 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010080064 CP-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101150117862 CPP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100439262 Caenorhabditis elegans cfp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 1
- 206010012655 Diabetic complications Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 1
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100328463 Mus musculus Cmya5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 101710173825 Short transient receptor potential channel 5 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229940123464 Thiazolidinedione Drugs 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical class N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071870 hydroiodic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001624 sedative effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical compound OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001467 thiazolidinediones Chemical class 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000701 toxic element Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
В настоящем изобретении описаны специфические аналоги GLP-1, слитые со специфическими производными IgG4-Fc. Эти слитые белки обладают повышенным периодом полужизни, пониженной иммуногенностью и пониженной активностью эффектора. Слитые белки могут использоваться при лечении диабета, ожирения, синдрома раздраженной толстой кишки и других состояний, на которые оказывает благотворное воздействие снижение глюкозы в крови, ингибирование двигательной функции желудка или моторики кишечника и ингибирование желудочного и/или кишечного опорожнения либо ингибирование потребления пищи.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к аналогам глюкагонподобного пептида, слитым с белками, которые обладают эффектом продления периода полужизни пептидов ίη νίνο. Эти слитые белки могут быть использованы для лечения диабета, а также целого ряда других состояний или расстройств.
Уровень техники
Аналоги и производные глюкагонподобного пептида-1 (СЬР-1) хорошо показали себя в клинических испытаниях при лечении диабета II типа. СЬР-1 стимулирует многочисленные биологические эффекты, такие как стимулирование секреции инсулина, ингибирование секреции глюкагона, ингибирование опорожнения желудка, ингибирование моторики желудка или моторики кишечника и стимулирование снижения массы тела. Существенной характеристикой СЬР-1 является его способность стимулировать секрецию инсулина в отсутствие связанной с этим опасности гипогликемии, которая наблюдается при проведении инсулинотерапии или некоторых видов лечения полости рта, которые действуют за счет повышения экспрессии инсулина.
Методы лечения с применением пептидов СЬР-1 ограничены тем, что СЬР-1(1-37) проявляет слабую активность, а два встречающихся в природе усеченных пептида, СЬР-1 (7-3 7)ОН и СЬР-1 (7-3 6)ΝΗ2, быстро очищаются ίη νίνο и имеют чрезвычайно короткий период полужизни ίη νίνο. Известно, что полученная эндогенно дипептидил-пептидаза IV (ϋΡΡ-ΐν) инактивирует циркуляцию пептидов СЬР-1 за счет удаления Ν-концевых остатков гистидина и аланина и является основной причиной короткого периода полужизни ίη νίνο.
Предлагались различные методы продления периода полу выведения пептида СЬР-1 из плазмы или выведения пептида из организма при одновременном сохранении биологической активности. Один из таких подходов заключается в слиянии пептида СЬР-1 с частью Рс иммуноглобулина. Как правило, иммуноглобулины обладают длительным периодом полужизни ίη νίνο.
Например, молекулы иммуноглобулина С могут иметь период полужизни в человеческом организме до 23 дней. За эту устойчивость ίη νίνο частично отвечает часть Рс иммуноглобулина. Слитые белки СЬР-1-Рс обладают устойчивостью, которая также обеспечивается частью Рс иммуноглобулина, сохраняя при этом биологическую активность молекулы СЬР-1.
Хотя этот метод осуществим при терапии с применением СЬР-1 (см. публикацию XV О 02/46227), существует проблема, связанная с антигенными свойствами различных слитых белков при многократном введении препаратов в течение продолжительных периодов времени. Эта проблема особенно актуальна при терапии слитыми белками СЬР-1-Рс, поскольку пациент, страдающий диабетом, должен проходить курс лечения на протяжении всей своей жизни после того, как поставлен диагноз болезни. Кроме того, терапия слитыми белками Рс может вызвать нежелательный эффект, если часть Рс сохраняет функции эффектора.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является решение проблем, связанных с потенциальной иммуногенностью и активностью эффектора, которые обусловлены введением вставок СЬР-1-Рс, путем идентификации специфических слитых белков СЬР-1-Рс, у которых снижена способность вызывать иммунный ответ после их многократного и продолжительного введения и которые не обладают функцией эффектора. Эти специфичные слитые белки имеют замены в различных положениях в части СЬР-1, а также части Рс молекулы. Описываемые здесь замены приводят к получению повышенной эффективности, повышенной устойчивостью ίη νίνο, устраняют функцию эффектора и снижают вероятность того, что молекула будет распознаваться адаптивными элементами иммунной системы.
Соединения согласно настоящему изобретению включают в себя гетерологичные слитые белки, содержащие аналог СЬР-1, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из
a) (8ЕЦ Ш N0: 1)
Н18-Хаа0-61и-С1у-ТИг-РЬе-Т11г-5ег-Азр-Уа1-Зег-Йег-Туг-Ьеи01и-С1и-01п-А1а-А1а-Ьуз-е1и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-ЕузС1у-(31у-(31у где Хаа§ выбирают из С1у и Уак
b) (8ЕЦ Ш N0: 2)
Н1з-Хаа8-(31и-С1у-Т11г-Р11е-ТЬг-5ег-Азр-Уа1-Еег-8ег-Туг-Ьеи’ С1и-С1и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьуз-Азп51у-<51у-С1у где Хаа§ выбирают из С1у и Уак
c) (8ЕЦ Ш N0: 3)
Н1з-Хааа-О1и-01у-ТЬг-РЬе-Ткг-5ег-Азр-Уа1-5ег-8ег-Туг-Ьеи01и-С1и-С1п-А1а-А1а-Ъув-С1и-Р1те-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ъуз01у-61у-Рго
- 1 008831 где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;
ά) (8Εζ) ГО N0: 4)
Н1з~Хаа0-С1и-31у-ТЬг-РЬе-Т}1г-Зег-А5р-7а1-Зег-Бег-Туг-Ье1101и-31и-О1п-А1а-А1а-Ьуз-01и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьув-АзпО1у-01у-Рго где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;
е) (8Εζ) ГО N0: 5)
Н1з-Хаа8-С1и-С1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-Зег-Азр-7а1-5ег-8ег-Гуг-ЬеиО1и-С1и-01п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-,7а1-Ьу8<Э1у-01у где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;
ί) (8Εζ) ГО N0: 6)
Н1з-Хаав-01и-(31у-ТЬг-Рке-Ткг-8ег-Азр-Уа1-8ег-8ег-Туг-Ьеи0111-0111-С1п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-РЬе-Не-А1а-Тгр-Ьеи-Ьуз-Анп01у-01у где Хаа§ выбирают из С1у и Уа1;
слитый с частью Ес иммуноглобулина, содержащего последовательность 8Εζ) ГО N0: 7
А1а-С1и-Зег-Ьуз-Туг-С1у-Рго-Рго-Суз-Рго-Рго-Суз-Рго-А1а-РгоХаа16-Хаа17-Хаа1е-О1у-О1у-Рго-Зег-Уа1-Рке-Ьеи-Рке-Рго-Рго-Ьуз-РгоЬуз-Азр-ТЬг-Ьеи-МеЬ-11е-Бег-Агд-ТЬг-Рго-С1и-Уа1-Ткг-Суз-7а1Уа1-7а1-Азр-Уа1-Зег-01п-01и-Азр-Рго-01и-Уа1-01п-Р}1е-Азп-ТгрТуг-Уа1-Азр-С1у-Уа1'С1и-Уа1-Н15-Азп-А1а-:ьуз-Т11г-Ъу5-Рго-АгдС1и-01и-С1п-Р11е-Хааво-Зег-Т11г-Туг-Агд-Уа1-7а1-8ег-Уа1-Ьеи-Т}1гУа1-Ьеи-Н18-01п-Азр-Тгр-Ьеи-Азп-01у-Ъуз-01и-Туг-Ьуз-Суз-ЬуБ7а1-Зег-А8п-Ьуз-01у-Ьеи-Рго-Бег-8ег-11е-С1и-Ьуз-ТЬг-11е-8егЬуз-А1а - Ьуз - С1у-01п~ Рго - Агд - 0111 - Рго - Οίη-νβΐ-Туг-Т11г-Ьеи-РгоРго-Зег-01п-С1и-01и-МеЕ-Т11г-Ьу8-Азп-С1п-7а1-Бег-Ьеи-ТЬг-СузЬеи-\7а1-Ьуз-С1у-Р11е-Туг-Рго-Зег-Азр-11е-А1а-Уа1-О1и-Тгр-О1иЗег-Азп-51у-С1п-Рго-01и-Азп-Азп-Туг-Ьуз-ТЬг-ТЬг-Рго-Рго-Уа1Ьеи-Азр-Зег-Азр-01у-8ег-РЬе-РЬе-Ьеи-Туг-5ег-Агд-Ьеи-тЬг-Уа1А8р-Ьуз-Зег-Агд-Тгр-О1п-С1и-О1у-Азп-Уа1-РЬе-Эег-Суз-Бег-Уа1МеЬ-Н1з-01и-А1а-Ьеи-Н1з-Авп-Н1з-Туг-ТЬг-01п-Ьу8-Зег-Ьеи-ЗегЬеи-Бег-Ьеи-С1у-Хаа23() (8Ξζ) Ιϋ N0:7) где Хаа в положении 16 означает Рго или С1и;
Хаа в положении 17 означает РЬе, Уа1 или А1а;
Хаа в положении 18 означает Ьеи, С1и или А1а;
Хаа в положении 80 означает Акп или А1а и
Хаа в положении 230 означает Ьук либо отсутствует.
С-конец части аналога СЬР-1 и Ν-конец части Ес гетерологичных слитых белков по изобретению предпочтительно подвергают слиянию при помощи 1, 1,5 или 2 повторов С-богатого пептидного линкера, имеющего последовательность С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 8).
В настоящем изобретении также описаны полинуклеотиды, кодирующие гетерологичные слитые белки по изобретению, а также векторы и клетки-хозяева, содержащие такие полинуклеотиды. Методы лечения пациентов, страдающих инсулиннезависимым сахарным диабетом, а также инсулинзависимым сахарным диабетом, ожирением и различными иными нарушениями и состояниями, которые заключаются во введении описываемых здесь гетерологичных слитых белков, также охватываются настоящим изобретением.
Гетерологичные слитые белки по изобретению содержат часть аналога СЬР-1 и часть Ес. Часть аналога СЬР-1 и часть Ес содержат замены по отношению к последовательности нативного СЬР-1 и последовательности человеческого 1§С4 соответственно, которые приводят к получению белка с повышенной активностью и устойчивостью ίη νίνο по сравнению с нативным СЬР-1 или аналогами СЬР-1 аиа1о§к, не
-2008831 слитыми с последовательностью Ес, при этом снижающие возможность стимулировать образование антител после продолжительного и многократного введения в человеческий организм.
Нативный СЬР-1 обрабатывают ίη νινο так, что первые шесть аминокислот отщепляются от молекулы. Таким образом, как хорошо известно из уровня техники, амино концу СЬР-1 присваивается номер 7, а карбоксильному концу - номер 37. Другие аминокислоты в полипептиде нумеруются последовательно, как показано в §Εζ) ГО N0: 9. Например, положение 8 представляет собой аланин, а положение 22 глицин. Обработанный пептид можно подвергнуть дальнейшей модернизации ίη νινο так, что остаток Сконцевого глицина удаляется и замещается амидной группой. Таким образом, ОЬР-1(7-37)ОН и СЬР-1(736)амид представляют собой две нативные формы молекулы. СЬР-1 (7-3 7)ОН имеет аминокислотную последовательность §Εζ) ГО N0: 9:
7Н18-А1а-С1и-10С1у-Т11г-Р11е-Т11г-Зег-15Авр-'Ца1-Зег-5ег-Туг-гоЬеи<31и-С1у-С1п-А1а-г5А1а-Ьу5-С1и-Р11в- 11е-30А1а-Тгр-Ьеи-Ца1-Ьуй 35О1у-Агд-37О1у (3Εζ5 10 N0:9)
Часть аналога СЬР-1 гетерологичного слитого белка включает в себя три первичных замены в положениях 8, 22 и 36 относительно нативного СЬР-1(7-37). Замена в положении 8 понижает скорость, при которой эндогенный фермент дипептидил-пептидаза IV (ΌΡΡ-ΐν) инактивирует аналог. ΌΡΡ-ΙV расщепляет нативный СЬР-1 между 2 и 3 аминокислотами (между положением 8 и 9), и полученная молекула является менее активной. Поэтому гетерологичные слитые белки в соответствии с настоящим изобретением резистентны к ЬРР-ΙV. Замена в положении 22 снижает вероятность того, что молекула образует агрегаты, и повышает активность молекулы. Замена в положении 36 в контексте аналога с изменениями в положении 8 и 22, а также в контексте целого слитого белка снижает опасность того, что слитый белок будет вызывать нейтрализующий иммунный ответ после многократного и продолжительного введения в человеческий организм.
Центральным событием в генерации как гуморальных, так и клеточно-опосредованных иммунных ответов является активация и клональное расширение Т-клеток-хелперов (Тн). Активация клеток Тн начинается посредством взаимодействия комплекса рецептора Т-клеток (ТСЯ)-СОЗ с обработанным антигенным пептидом, связанным с молекулой главной тканевой совместимости (МНС) II класса, в присутствии антиген-презентирующей клетки (АПК). Взаимодействие клетки Тн с антигеном инициирует каскад биохимических событий, которые вызывают состояние покоя клетки Тн для вхождения в клеточный цикл (переход от Со к Οι). Активированная Т-клетка проходит клеточный цикл, размножаясь и дифференцируя в клетки памяти или эффекторные клетки.
Для идентификации потенциальных эпитопов (антигенных детерминант) анализировали следующую последовательность:
Н1з-С1у-С1и-С1у-ТЬг-РЬе-Т11г-Зег-Аер-Уа1-Зег-Зег-Туг-Ьеи-С1иС1и-<31п-А1а-А1а-Ъув-О1и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-7а1-Ьуз-С1у-Агд01у-Ц1у-С1у-а1у-е1у-5ег-а1у-61у-а1у-61у-5ег-а1у-а1у-01у-й1у5ег-С1у-С31у-<31у-С1у-5ег-С1у-С1у-С1у-С1у-5ег-С1у-а1у-(31у-О1у5ег-А1а-С1и-5ег-Ьуз-Туг-С1у-Рго-Рго-Сув-Рго (8Е0 ΙΏ N0:10).
Эта последовательность представляет собой последовательность аналога СЬР-1 с изменениями в положениях 8 и 22 относительно нативной последовательности с последующими 2 копиями С-богатой линкерной последовательности, за которой следуют первые 10 аминокислот области Ес, полученные от человеческого иммуноглобулина С4. Эпитоп, как используется в данном описании, относится к области молекулы белка, с которой может связываться антитело. Иммуногенный эпитоп определяется как часть белка, которая выявляет иммунный ответ, когда целый белок представляет собой иммуноген. Картирование эпитопов заключается в сканировании последовательностей окна сравнения с девятью аминокислотами с использованием методики статистического анализа, позволяющей получать информацию, содержащуюся в этих образцах. Для анализа последовательности и идентификации пептидов, которые, весьма вероятно, провоцируют иммунный ответ в присутствии Т-клеток, используют пакет программ, известный как Ер1Ма1пх™. При анализе на взаимодействие с рецептором МНС II класса используют восемь общих аллелей. Эти аллели включают ϋΚΒ1*0101, ϋΚΒ1*0301, ϋΚΒ1*0401, ϋΚΒ1*0701, ϋΚΒ1*0801, ΟΚΒ1*1101,ΌΚΒ1*1301 ηϋΚΒ1*1501.
Прогнозируют, что сильный эпитоп находится в месте соединения С-конца части аналога СЬР-1 и начала линкера. Последовательность этого эпитопа представляет собой Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу8-С1у-Агд-С1уС1у-С1у (§Εζ) ГО N0: 11), которая взаимодействует с ϋΚΒ1*0801. В настоящем изобретении решается задача обнаружения способности этого эпитопа элиминировать путем изменения С-конца аналога СЬР-1 на одну из следующих последовательностей:
-3 008831
Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу5-01у-01у-51у (5ΞΟ Ιϋ
N0:12); Тгр-Ьеи-Ьуз-Авп-Е1у-а1у-С1у (ΞΕΟ Ιϋ N0:13); Тгр-ЬеиУа1-Ьуз-01у-(31у-Рго (ΞΕζ) Ю N0:14); Тгр-Ьеи-Ьуз-Азп-С1у-С1у-Рго (ЗЕО Ю N0:15); Тгр-Ьеи-Уа1-Ъу5-01у-С1у (ЗЕО 10 N0:16); и ТгрЕеи-Ьуз-Азп-01у-01у (ЗЕО Ю N0:17).
Гетерологичные слитые белки по изобретению содержат часть Ес, взятую из человеческого 1дС4, при этом содержат одно или несколько замещений по сравнению с человеческой последовательностью дикого типа. В соответствии с настоящим описанием часть Ес иммуноглобулина имеет значение, общепринятое в области иммунологии. Конкретно этот термин относится к фрагменту антитела, который не содержит две антигенсвязующие области (фрагмента ЕаЬ) из антитела. Часть Ес состоит из постоянной области антитела, состоящей как из тяжелых цепей, которые ассоциируются через посредство нековалентных взаимодействий, так и дисульфидных связей. Часть Ес может включать шарнирные области и простираться через домены СН2 и СНЗ до С-конца антитела. Часть Ес может также включать один или несколько сайтов гликозилирования.
Существует пять типов человеческих иммуноглобулинов с различными эффекторными функциями и фармакокинетическими свойствами. 1дС является наиболее устойчивым из пяти типов, имеющим период полужизни в сыворотке человека около 23 дней. Существует четыре подкласса 1дС (01, 02, 03 и 04), каждый из которых имеет разные биологические функции, известные как эффекторные функции. Эти эффекторные функции обычно опосредованы взаимодействием с рецептором Ес (ЕсуВ.) или посредством комплемента связи С1с| и фиксации. Связывание с ЕсуЯ может привести к антителозависимому комплементопосредованному цитолизу, тогда как связывание с комплементными факторами может привести к лизису клеток. При конструировании гетерологичных слитых белков Ес, в которых часть Ес используется исключительно благодаря ее способности продлевать период полужизни, важно минимизировать эффекторную функцию. Поэтому гетерологичные слитые белки по изобретению получают из области Ес человеческого 1дС4 благодаря ее слабой способности связываться с ЕсуЯ и комплементными факторами по сравнению с другими подтипами 1§С. Однако 1дС4 продемонстрировал способность элиминировать клетки-мишени у человека Рзвасз с! а1., (1996) С1ш. Ехр. 1ттипо1. 106:427-433]. Поскольку гетерологичные слитые белки по изобретению инициируют бета-клетки в поджелудочной железе на стимулирование экспрессии инсулина, используя 1дС4-производную область в слитом белке Ес, можно инициировать иммунный ответ на панкреатическую бета-клетку посредством взаимодействия слитого белка с рецептором СЬР-1, присутствующим в панкреатических бета-клетках. Таким образом, область Ес 1дС4, представляющая собой часть гетерологичных слитых белков по изобретению, содержит замещения, устраняющие эффекторную функцию. Область Ес 1дС4 гетерологичных слитых белков по изобретению может содержать одно или несколько следующих замещений: замена глутамата на пролин в остатке 233, фенилаланина на аланин или валин в остатке 234 и лейцина на аланин или глутамат в остатке 235 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза; КаЬа1, Е.А. с! а1. (1991) 8сс|испссз оГ Рго1сшз о£ 1тпшпо1ощса1 1п1сгсз1. 5411 Еб. И.8. Оер1. оГ НсаНН апб Ншпап 8сг\1ссз. Всбюзба. МЛ, ΝΙΗ РиЬНсабоп по. 91-3242). Эти остатки соответствуют положениям 16, 17 и 18 в последовательности 8Εζ) ГО N0: 7. Кроме того, удаление Ν-связанного сайта гликозилирования в области Ес иммуноглобулина С4 путем замены Азп на А1а в положении остатка 297 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза), который соответствует положению 80 последовательности 8Εζ) ГО N0: 7, представляет собой другой способ обеспечения того, что остаточная активность эффектора устраняется в контексте гетерологичного слитого белка.
Помимо этого часть Ес 1дС4 гетерологичных слитых белков по изобретению содержит замену, которая стабилизирует образование димера тяжелой цепи и препятствует образованию полу-Ес 1дС4 цепей. Гетерологичные слитые белки по изобретению предпочтительно существуют в виде димеров, соединенных друг с другом дисульфидными связями и различными нековалентными взаимодействиями. 1дС4 дикого типа содержит звено Рго-Рго-Суз-Рго-Зег-Суз (8Εζ) ГО N0: 18), начинающееся у остатка 224 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза). Это звено в простой цепи аналога СгЬР-1 и Ес образует дисульфидные связи с соответствующим звеном в другой цепи аналога СгЬР-1 и Ес. Однако присутствие серина в звене вызывает образование одноцепочечных слитых белков. Настоящее изобретение охватывает гетерологичные слитые белки Ес, в которых последовательность 1дС4 подвергается дальнейшему видоизменению так, что серин в положении 228 (нумерация в соответствии с директивой Европейского союза) заменен на пролин (аминокислотный остаток 11 в последовательности 8Εζ) ГО N0: 7).
С-концевой остаток лизина, присутствующий в нативной молекуле, может быть удален в части производного Ес 1дС4 гетерологичных слитых белков, описанных в настоящем изобретении (положение 230 в последовательности 8Εζ) ГО N0: 7; удаленный лизин упомянут как без-К). Слитые белки, экспрессируемые в некоторых клеточных типах (таких как клетки N80), в которых лизин кодируется Суконцевым кодоном, являются гетерологичными в том смысле, что определенная часть молекулы имеет
-4008831 лизин в виде С-концевой аминокислоты, а в другой части лизин удален. Делеция обусловлена действием протеазы во время экспрессии в некоторых типах клеток млекопитающих. Поэтому во избежание этой гетерогенности предпочтительно, чтобы в конструкциях экспрессии слияния Ес отсутствовал С-концевой кодон для лизина.
Предпочтительно, чтобы С-концевая аминокислота части аналога СЬР-1, обсуждаемого в данном описании, сливалась с Ν-концом части аналога Ес 1дС4 посредством линкера, богатого глицином. Функция и устойчивость ίη νίνο гетерологичных слитых белков по изобретению могут быть оптимизированы путем добавления небольших пептидных линкеров с целью предотвращения потенциально нежелательных взаимодействий доменов. Кроме того, линкер, богатый глицином, предоставляет некоторую структурную гибкость так, что часть аналога СЬР-1 может эффективно взаимодействовать с рецептором СЬР1 в клетках-мишенях, таких как β-клетки поджелудочной железы. Однако эти линкеры могут значительно повышать опасность того, что слитый белок будет иммуногенным ίη νίνο. Поэтому предпочтительно, чтобы его длина не была больше необходимой для предотвращения нежелательных взаимодействий доменов и/или оптимизации биологической активности и/или устойчивости. Предпочтительный линкер, богатый глицином, содержит последовательность С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1уС1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 8). Хотя в гетерологичных слитых белках по изобретению можно использовать больше копий этого линкера, предпочтительно, чтобы использовалась одна копия этого линкера для минимизации опасности иммуногенности, связанной с продолжительным и повторным введением в организм.
Предпочтительные гетерологичные слитые белки СЬР-1-Ес настоящего изобретения включают следующие белки:
С1уа-С1и22С1у36-СЬР-1 (7-37) -1Ь-1дС4 (5228Р) , С1ув-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37) 1Ь-1дС4 (3228Р, Г234А, Ь235А) , С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37) -1Ь1дС4 (5228Р, Ν297Α), С1уе-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α) , С1у8-С1и2г-С1у36-СЬР-1 (7 - 3 7) -1.5Ь-1дС4 (5228Р) , С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37) -1.5Ь-1дС4 (5228Р, Р234А,
Б235А) , С1у8-С1и22-С1узй-СЬР-1 (7-37) -1.5Ь-1дС4 (5228Р, Ν297Α) ,
С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37)-1.5Ь-1дС4 (Й228Р, Е234А, Б235А,
Ν297Α) , С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37) -2Ь-1дС4 (5228Р) , С1уа-С1и22С1узе-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, К234А, Ь235А), С1уа-С1и22С1уэ6-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Ν297Α) и С1ув-С1иг2-С1у36-СЬР1(7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Е234А, Ь235А, Ν297Α), а также Уа18 и формы с1с5-1< всех вышеприведенных белков.
Терминология, используемая в данном описании в отношении конкретных гетерологичных слитых белков, определяется следующим образом. Специфические замены в части СЬР-1 слитого белка указываются с использованием конкретной заменяемой аминокислоты с последующим номером остатка. СЬР1(7-37) указывает, что часть СЬР-1 зрелого слитого белка начинается с Ηίδ в положении 7 и заканчивается С1у в положении 37. Ь относится к линкеру с последовательностью С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1уС1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 8). Число, непосредственно предшествующее Ь, относится к числу линкеров, отделяющих часть СЬР-1 от части Ес. Линкер, указанный как 1.5Ь, относится к последовательности С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег-С1у-С1у-С1у-С1у-8ег (8Εζ) ГО N0: 19). 1дС4 относится к аналогу последовательности Ес человеческого 1дС4, указанной как 8Εζ) ГО N0: 7. Замены в части Ес 1дС4 гетерологичного слитого белка заключены в скобки. Аминокислоту дикого типа определяют с помощью ее общепринятого сокращения с последующим номером положения в контексте всей последовательности 1дС4, используя систему нумерации в соответствии с директивой Европейского союза, за которым следует аминокислота, замещенная в этом положении, которая определяется с помощью ее общепринятого сокращения.
Хотя гетерологичные слитые белки по изобретению могут быть получены с помощью целого ряда различных методов, по причине размера слитого белка предпочтительны рекомбинантные методы. Для целей настоящего изобретения, которое раскрывается и заявляется в данном описании, ниже определены следующие общие термины и сокращения в области молекулярной биологии.
Пара нуклеотидов или и.и., как используется в данном описании, относится к ДНК или РНК. Сокращения А, С, С и Т соответствуют 5'-монофосфатным формам дезоксирибонуклеозидов (дезокси)аденозина, (дезокси)цитидина, (дезокси)гуанозина и тимидина соответственно, когда они встречаются в молекулах ДНК. Сокращения и, С, С и А соответствуют 5'-монофосфатным формам рибонуклеозидов
-5008831 уридина, цитидина, гуанозина и аденозина соответственно, когда они встречаются в молекулах РНК. В двухцепочечной ДНК пара нуклеотидов может относиться к партнерству А с Т или С с С. В ДНК/РНК гетеродуплексная пара нуклеотидов может относиться к партнерству А с и или С с С (см. определение комплементарный, ш1га.).
Расщепление или рестрикция ДНК относится к каталитическому расщеплению ДНК ферментом рестрикции (рестриктазой), который действует только в некоторых последовательностях ДНК (эндонуклеазы, специфические к последовательностям). Различные ферменты рестрикции, используемые в данном описании, доступны для приобретения, и условия их реакции, кофакторы и другие требования были использованы, как если бы были известны среднему специалисту в данной области. Соответствующие буферные растворы и количества субстратов для конкретных ферментов рестрикции определены изготовителем или могут быть без труда найдены в литературе.
Лигирование относится к процессу образования фосфодиэфирных связей между двумя двухцепочечными фрагментами нуклеиновой кислоты. Если не указано иное, лигирование можно осуществлять, используя известные буферные растворы и условия, с ДНК-лигазой, такой как ДНК-лигаза Т4.
Плазмида относится к внехромосомному (обычно), самореплицирующемуся генетическому элементу.
Клонирующий вектор рекомбинантной ДНК, как используется в данном описании, относится к любому автономно реплицирующемуся агенту, включая (но не ограничиваясь) плазмиды и бактериофаги, включающему молекулу ДНК, к которой могут быть или были добавлены один или несколько дополнительных ДНК-сегментов.
Экспрессирующий вектор рекомбинантной ДНК, как используется в данном описании, относится к любому клонирующему вектору рекомбинантной ДНК, в который введен промотор в целях управления транскрипцией вставленной ДНК.
Транскрипция относится к способу, посредством которого информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности ДНК, передается комплементарной последовательности РНК.
Трансфекция относится к поглощению экспрессирующего вектора клеткой-хозяином, независимо от того, экспрессируются или нет в действительности любые кодирующие последовательности. Специалистам в данной области известны многочисленные методы трансфекции, например соосаждение в фосфате кальция, липосомная трансфекция и электропорация (электрошоковое открытие клеточных пор). Успешная трансфекция как правило признается в случае, если любое указание действия этого вектора имеет место в пределах клетки-хозяина.
Трансформация относится к введению ДНК в организм так, что ДНК имеет возможность реплицироваться или как внехромосомный элемент, или под действием интеграции хромосом. В данной области хорошо известны методы трансформации бактериальных и эукариотических хозяев, и многие из этих методов, таких как ядерная инъекция, слияние протопластов или кальциевая обработка с использованием хлористого кальция, суммированы в работе 1. 8ашЬгоок, с( а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, (1989). Как правило, при введении ДНК в дрожжи термин «трансформация» используется как противопоставление термину «трансфекция».
Трансляция, как используется в данном описании, относится к способу, посредством которого генетическая информация матричной (информационной) РНК (мРНК) используется для конкретизации и направления синтеза полипептидной цепи.
Вектор относится к соединению нуклеиновой кислоты, используемому для трансфекции и/или трансформации клеток в манипулировании генами с полинуклеотидными последовательностями, соответствующими подходящим молекулам белка, который при объединении с соответствующими регулярными последовательностями придает специфические свойства трансфицируемой и/или трансформируемой клетке-хозяину. Пригодными векторами являются плазмиды, вирусы и бактериофаг. Искусственные векторы строят путем разрезания и соединения молекул ДНК из различных источников с использованием ферментов рестрикции и лигаз. Термин вектор, как используется в данном описании, включает клонирующие векторы рекомбинантной ДНК и экспрессирующие векторы рекомбинантной ДНК.
Комплементарный или комплементарность, как используется в данном описании, относится к парам оснований (пуринам и пиримидинам), которые образуют ассоциации посредством водородных связей в двухцепочечной нуклеиновой кислоте. Комплементарными являются следующие пары оснований: гуанин и цитозин; аденин и тимин и аденин и урацил.
Праймер относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который функционирует в качестве инициирующего субстрата для ферментативной или синтетической элонгации.
Промотор относится к последовательности ДНК, которая направляет транскрипцию ДНК в РНК.
Зонд относится к соединению нуклеиновой кислоты или его фрагменту, который гидролизуется с другим соединением нуклеиновой кислоты.
Лидерная последовательность относится к последовательности аминокислот, которая может быть ферментативно или химически удалена с получением желательного полипептида.
Сигнальная последовательность секреции относится к последовательности аминокислот, как правило, присутствующей в Ν-конечной области более крупного полипептида, функционирующая в целях
- 6 008831 инициации связывания этого полипептида с отделениями клеточной мембраны наподобие эндоплазматического ретикулума и секреции этого полипептида по мембране плазмы.
Белки человеческого иммуноглобулина С4 дикого типа можно получить из целого ряда источников. Например, эти белки можно получить из библиотеки кДНК, полученной из клеток, которые экспрессируют мРНК на обнаруживаемом уровне. Библиотеки можно скринировать с помощью зондов, построенных с использованием опубликованной последовательности ДНК или белка, для конкретного белка. Например, постоянные области легких или тяжелых цепей иммуноглобулина описаны в работах Абатк. с1 а1. (1980) Вюсйепййгу 19:2711-2719; Οοιίβΐιοί. с1 а1. (1980) Вюсйепйкйу 19:2702-2710; Оо1Ьу, с1 а1. (1980) Ртос. №И. Асаб. 8с1. Ь8А 77:6027-6031; Шее е! а1. (1982) Ртос. N811. Асаб. δει. Ь8А 79:7862-7862; Ра1киет, с1 а1. (1982) Майне 298:286-288 и Моткой, с1 а1. (1984) Аил. Γεν. 1ттшю1. 2:239-256.
Скрининг кДНК или геномной библиотеки с помощью отобранного зонда можно осуществлять с использованием стандартных методик, таких, которые описаны в работе 8ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1ат С1оиίη§: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, Со1б 8рпп§ НатЬот ЬаЬогаЮгу Ртекк, ΝΥ (1989). Альтернативным способом выделения гена, кодирующего иммуноглобулиновый белок, является использование методологии РСК (полимеразно-цепьевая реакция) [8ашЬгоок с1 а1., кирта; ΌίοΓΓοηόηεΙι с1 а1., РСК Рптсг: А ЬаЬогаЮгу Маииа1, Со1б 8рпп§ НатЬот ЬаЬогаЮгу Ртекк, ΝΥ (1995)]. Праймеры РСК можно построить на основании опубликованных последовательностей.
Обычно последовательности дикого типа, имеющие полную длину, которые клонированы из определенной библиотеки, могут служить в качестве матрицы для создания фрагментов аналога Рс 1§С4 согласно изобретению, которые сохраняют способность придавать аналогу СЬР-1 более длительный период полувыведения из плазмы, причем указанный аналог СЬР-1 является частью слитого белка. Фрагменты аналога Рс 1§С4 могут быть получены с использованием методик РСК с помощью праймеров, построенных для гибридизации с последовательностями, соответствующими желательным концам фрагмента. Праймеры РСК также могут быть спроектированы для создания сайтов ферментов рестрикции, способствующих клонированию в экспрессирующие векторы.
ДНК, кодирующую аналоги СЬР-1 по изобретению, можно получить различными способами, включая методы клонирования, наподобие тех, которые описаны выше, а также с помощью химически синтезированной ДНК. Химический синтез может быть привлекательным, учитывая незначительную длину кодируемого пептида. Аминокислотная последовательность СЬР-1 опубликована наряду с последовательностью гена препроглюкагона [Ьорег, с1 а1. (1983) Ртос. ΝηΙΙ. Асаб. δει., Ь8А 80:5485-5489; Ве11, е! а1. (1983) Майне, 302:716-718; Неишсй, 6., е! а1. (1984) Еибоспио1, 115:2176-2181; 6Ы§1юие, М., е! а1. (1984) 01аЬе!о1о§1а 27:599-600]. Поэтому праймеры можно строить на основе нативной последовательности с получением ДНК, кодирующей описываемые здесь аналоги СЬР-1.
Ген, кодирующий слитый белок, можно затем построить путем лигирования ДНК, кодирующей аналог СЬР-1 внутри рамки считывания, с ДНК, кодирующей белок Ес 1§С по изобретению. ДНК, кодирующая СЬР-1 дикого типа, и фрагменты Ес 1§С4 можно мутировать либо перед лигированием, либо в контексте кДНК, кодирующей целый слитый белок. В данной области техники хорошо известны разнообразные методики мутагенеза. Ген, кодирующий аналог СЬР-1, и ген, кодирующий фрагмент аналога Ес 1§С4, можно также соединить в рамке считывания посредством ДНК, кодирующей С-обогащенный линкерный пептид. Предпочтительная последовательность ДНК, кодирующей один из предпочтительных гетерологичных слитых белков по изобретению, С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1(7-37)-1Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А, бек К), представлена в виде 8Εζ) Ш ΝΟ: 20:
САСЙЙСЙАЙЙЙСАССТТСАССТССЙАССТСТССТССТАТСТСОАЙСАОСАЙЙССЙССААЙЙМ
ТТСАТССССТСССТОСТСААбСССОССОССбСТСбТСеТСССТССССАСССаСССССТСТССТ
ОЙСЙЙТСЙСАССССТСАСТССАААТАТСЙТСССССАТССССАСССТССССАЙСАССТСАОЙСС
ССССЙСОСАССАТСАСТСТТССТСТТССССССААААСССААОСАСАСТСТСАТЙАТСТССССС
АССССТЙАЙЙТСАСОТЙСЙТбСтааТЙЙАСЙТЙАЙССАЙЙААСАССССЙАСЙТССАОТТСААС
ТЙЙТАСЙТССАТаССаТСЙАаОтаСАТААТЙССААЙАСАААЙССйСССЙАЙЗАЙСАСТТСААС
АОСАССТАССЙТЙТЙСТСАаСйТССТСАССйТССТЙСАССАЙЙАСТЙЙСТЙААСйЙСААЙЙАа
ТАСААЙТЙСААЙОТСТССААСАААааССТСССЙТССТССАТСйАСААААССАТСТССАААЙСС
АААС(ЗаСАаСССССАСАОССАСА(3(ЗтаТАСАСССТ<ЗСССССАТСССАОаАОаАЙАТСАССААС
ААССАсатсАосстоАсстасстйстсАААоасттстАссссАассАСАТсассатааАотйа
ОАААССААТСОССАСССЙЙАОААСААСТАСААЙАССАССССТСССатаСТСЙАСТССЙАСООС
ТССТТСТТССТСТАСАССАСССТААСССТСЗСАСААСАССАСйТСаСАССАСйайААТСТСТТС
ТСАТЙСТСССТЙАТЗСАТОАаОСТСТССАСААССАСТАСАСАСАОААСАЙССТСТСССТОТСТ
СТСЙЙТ (8Ξ0 ю N0:20)
-7 008831
Клетки-хозяева трансфицируют или трансформируют с помощью описываемых здесь экспрессирующих или клонирующих векторов в целях производства и культивирования гетерологичных слитых белков в традиционных питательных средах, модифицированных надлежащим образом для индуцирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Условия культивирования, такие как среды, температура, рН и подобное, могут быть легко выбраны средним специалистом в данной области техники. Принципы, протоколы и практические методики максимального повышения продуктивности клеточных культур можно найти в работах Маштакам Се11 Вю1ескпо1оду: А Ргас!юа1 Арргоасй, М. Ви!1ег, ей. (1ВЬ Ргекк, 1991) и 8атЬгоок, е! а1., выше. Методы трансфекции известны среднему специалисту, например, СаРО4 и электропорация. Общие аспекты трансформаций системы млекопитающая клетка-хозяин описаны в патенте США № 4399216. Трансформации в дрожжи обычно осуществляют в соответствии с методом уаи 8о1шдеи е! а1., 1 Вас!. 130(2): 946-7 (1977) и Нк1ао е! а1., Ргос. №111. Асай. 8ск И8А 76(8): 3829-33 (1979). Тем не менее, можно использовать другие методы введения ДНК в клетки, такие как ядерная микроинъекция, электропорация, слияние бактериальных протопластов с интактными клетками или поликатионами, например полибреном или полиомитином. В отношении различных методик трансформации клеток млекопитающих см. 1<ео\уп. е! а1., Ме11юйк ίη Еп/уто1оду 185: 527-37 (1990) и Маикоиг, е! а1., ЫаШге 336 (6197): 348-52 (1988).
Клетки-хозяева, пригодные для клонирования или экспрессии нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в векторах, включают дрожжи или высшие эукариотические клетки.
Эукариотические микробы, такие как нитевидные грибки и дрожжи, являются пригодными клонирующими или экспрессирующими хозяевами для векторов слитых белков. 8ассйаготусек сегеу181ае является обычно используемым низшим эукариотическим микроорганизмом-хозяином. Другие включают 8с1ихокасскаготусек ротЬе [Веасй аий Ыигке, Ыа!иге 290: 140-3 (1981); ЕР 139,383, публикация 2 мая 1995 г.]; хозяева Миууеготусек [патент США № 4943529; Е1еег, е! а1., Вю/Тесйио1оду 9(10): 968-75 (1991)], такие как, например, К 1аскк (М^98-8С, СВ8683, СВ84574) [йе Еоиуеисоий е! а1., 1. Вас!егю1. 154(2): 737-42 (1983)]; К. йадШк (АТСС 12,424), К. Ьи1дапсик (АТСС 16,045), К мчскегати (АТСС 24,178), К \νη11ίί (АТСС 56,500), К. йгокорййагит (АТСС 36.906) [Уаи йеи Вегд е! а1., Вю/Тесйио1оду 8(2): 135-9 (1990)]; К. !йегто!о1егаи8 и К. татаиик; уагго\\та (ЕР 402,226); РкЫа рак!ог1к (ЕР 183,070) [8геекпккпа е! а1., 1. Ваыс МюгоЬюк 28(4): 265-78 (1988)]; Саий1й; Тпскойегта гееыа (ЕР 244,234); Ыеигозрога сгакка [Сазе, е! а1., Ргос. №Н1. Асай 8сг И8А 76(10): 5259-63 (1979)]; 8скетаии1отусе8, такие как 8ск\\ш1шотусек осайеЩикк (ЕР 394,538, публикация 31 октября 1990 г.); и нитевидные грибки, такие как, например, Ыеигокрога, РешсШшт, То1урос1айшт (\УО 91/00357, публикация 10 января 1991), и хозяева АкрегдШик, такие как А. шйи1аик [Ва11аисе е! а1., Вюскет. Вюркук. Век. Сотт. 112(1): 284-9 (1983)]; Т11Ьиги, е! а1., Оеие 26(2-3): 205-21 (1983); Уе1!ои, е! а1., Ргос. ЫаИ. Асай. 8с1. И8А 81(5): 1470-4 (1984)] и А. тдег [Ке11у аий Нуиек, ЕМВО 1. 4(2): 475-9 (1985)]. Метилотропные дрожжи выбирают из видов, состоящих из НаикеиШа, Саий1йа, К1оескега, РюЫа, 8ассйаготусек, Тоги1орк1к и Вйойо!огша. Перечень конкретных видов, представляющих этот класс дрожжей, можно найти в работе С. Аи!оиу, Тйе ВюскешМгу ок Ме1ку1о1горкк 269 (1982).
Клетки-хозяева, пригодные для экспрессии слитых белков по изобретению, получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки насекомых, такие как Эгокоркйа 82 и 8ройор!ега 8р, 8ройор!ега Ыдй5, а также клетки растений. Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают клетки миеломы N80, яичника китайского хомячка (СНО), 8Р2 и клетки СО8. Более конкретные примеры включают линию почек обезьяны СУ1, трансформированную с помощью 8У40 (СО8-7, АТСС СВЬ 1651); линию почек человеческого зародыша [клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Сгайат, е! а1., 1. Оеи У1го1., 36(1): 59-74 (1977)]; клетки яичника китайского хомячка/-ЭНЕВ [СНО, иг1аиЬ аий Сйакш, Ргос. №111. Асай. 8сг И8А, 77(7): 4216-20 (1980)]; клетки сертоли мыши [ТМ4, Ма1йег, Вю1. Вергой. 23(1):243-52 (1980)]; клетки человеческого легкого (^138, АТСС ССЬ 75); клетки человеческой печени (Нер 02, НВ 8065) и клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС ССБ51). Предпочтительной линией клеток для продукции слитых белков Ес по изобретению является линия клеток миеломы №О, имеющаяся в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС, каталог #85110503) и описанная в работах Сайге, О. аий Мйк!еш, С. ((1981) Ме!йойк ш Епхуто1оду 73(13): 3-46; и Ргерагайои ой Моиос1оиа1 АийЬой1ек: 8!га!ед1ек аий Ргосейигек, Асайетю Ргекк, Ν.Υ., Ν.Υ.).
Слитые белки по изобретению могут быть получены рекомбинантными методами непосредственно или в виде белка, имеющего сигнальную последовательность или другие дополнительные последовательности, которые создают специфическое место расщепления у Ν-конца зрелого слитого белка. Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или частью ДНК, кодирующей слитый белок, которая вставлена в вектор. Для секреции дрожжей сигнальная последовательность может быть, например, лидером инвертазы дрожжей, лидером альфа-фактора (включая лидеры сс-фактора 8ассйаготусек и К1иууеготусек, причем последние описаны в патенте США № 5010182), или лидером кислотной фосфатазы, лидером глюкоамилазы С. а1Ь1саик (ЕР 362,179), либо сигналом, описанным в \УО 90/13646. При экспрессии клеток млекопитающих сигнальные последовательности млекопитающих могут быть
- 8 008831 использованы для направления секреции белка, например, сигнальные последовательности из секретированных полипептидов того же или родственного вида, а также лидеры вирусной секреции.
Экспрессирующие и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая дает возможность вектору реплицироваться в одном или нескольких выбранных клеткаххозяевах. Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат ген селекции, также называемый селектируемым маркером. Типичные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например неомицину, метотрексату или тетрациклину, (Ь) комплементируют автотрофные недостатки или (с) поставляют жизненно важные питательные вещества, недоступные из сложных сред, например, ген, кодирующий Ό-аланин рацемазу для Вас1Ш.
Примерами селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются гены, которые обеспечивают идентификацию клеток, отвечающих за «принятие» нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, такой как ΌΗΡΒ или тимидин-киназа. Подходящей клеткой-хозяином при использовании ΌΗΡΒ дикого типа является линия клеток СНО с отсутствующей активностью ΌΗΡΒ, полученная и размноженная в соответствии с описанием [иг1аиЬ апб Скайп, Ргос. №11. Лсаб. 8с1. И8Л, 77(7): 4216-20 (1980)]. Пригодным геном селекции для использования в дрожжах является ген !гр1, присутствующий в дрожжевой плазмиде УКр7 [8!шсйсотЬ, е! а1., №1ите 282(5734): 39-43 (1979); Кшдктап, е! а1., Оепе 7(2): 141-52 (1979); Тксйитрет, е! а1., Оепе 10(2): 157-66 (1980)]. Ген !гр1 предоставляет маркер селекции для мутантного штамма дрожжей с отсутствующей способностью расти в триптофане, например АТСС Νο. 44076 или РЕРС1 [1опе§, Оепейск 85: 23-33 (1977)].
Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, для направления синтеза мРНК. Промоторы, распознаваемые разнообразными потенциальными клетками-хозяевами, хорошо известны в данной области техники. Примеры пригодных промотирующих последовательностей для использования в дрожжевых хозяевах включают промоторы для 3-фосфоглицерат-киназы [Нй/етап, е! а1., 1. Βίο1. СНет. 255(24): 12073-80 (1980)] или другие гликолитические ферменты [Не§8 е! а1., 1. Αάν. Епхуше Вед. 7: 149 (1968); Но11апб, ВюсНеппйгу 17(23): 4900-7 (1978)], такие как энолаза, глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируват киназа, триозефосфатизомераза, фосфоглюкозаизомераза и глукокиназа. Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцируемыми промоторами, имеющими дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой условиями роста, включают промоторные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, разлагающихся ферментов, ассоциированных с азотным метаболизмом, металлотионеина, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за использование мальтозы и галактозы. Пригодные векторы и промоторы для использования при экспрессии в дрожжах описаны в ЕР 73,657. Транскрипцией мРНК, кодирующей слитые белки, из векторов в клетки-хозяева млекопитающих можно управлять, например, при помощи промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы домашней птицы, аденовирус (такой как Аденовирус 2), вирус бычьей папилломы, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и вирус обязьян (8У40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например, промотора актина или промотора иммуноглобулина, и из промоторов теплового шока, при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Транскрипцию полинуклеотида, кодирующего слитый белок, посредством высших эукариотов можно повысить путем вставки последовательности энхансера в вектор. Энхансерами являются цисдействующие элементы ДНК, обычно имеющие от 10 до 300 пар нуклеотидов, которые воздействуют на промотор, повышая его транскрипцию. В настоящее время известны многие последовательности энхансера из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, а-кетопротеин и инсулин). Однако обычно используют энхансер от вируса эукариотической клетки. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне начала репликации (100-270 пар нуклеотидов), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на поздней стороне начала репликации и энхансеры аденовируса. Энхансер можно подвергнуть сплайсингу в вектор в положении 5' или 3' к последовательности, кодирующей слитый белок, однако, он предпочтительно расположен на участке 5' от промотора.
Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетки дрожжей, грибков, насекомых, растений, животных, людей или нуклеиновые клетки из других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для завершения транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доставляются из 5' и в ряде случаев 3' нетранслированных областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибированные в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслированной области мРНК, кодирующей слитый белок.
Различные формы слитого белка можно восстановить из культуральной среды или из лизатов клеток-хозяев. Если они связаны посредством мембраны, их можно высвободить из мембраны с использованием пригодного раствора детергента (например, Тритон-Х 100) или посредством ферментативного гидролиза. Клетки, используемые при экспрессии слитого белка, можно разрушить при помощи различ
- 9 008831 ных физических или химических средств, таких как цикл замораживания-оттаивания, воздействие ультразвуком, механическое разрушение или с помощью агентов клеточного лизиса.
После экспрессии гетерологичных слитых белков по изобретению в подходящей клетке-хозяине аналоги можно выделить и очистить. Следующие процедуры являются примерами методик очистки: фракционирование на карбоксиметилцеллюлозе; гель-фильтрация, такая как Сефадекс С-75; анионообменная смола, такая как БЕЛЕ или Мопо-О; катионообменная смола, такая как СМ или Моио-8; металлохелатные колонки для связывания эпитоп-меченых форм полипептида; обращенно-фазовая жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР); хроматофокусирование; силикагель; осаждение этанолом и осаждение сульфатом аммония.
Можно использовать различные методы очистки белков, и такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в работах Беийсйег, МеИобк ίη Еихуто1оду 182: 83-9 (1990) и 8еорс5. Рго1еш РипПсайои: Рппар1е5 аиб Ргасбсе, 8ргшдег-Уег1ад, ΝΥ (1982). Стадия (стадии) очистки зависит от характера производственного процесса и конкретного слитого белка. Например, слитые белки, содержащие фрагмент Ес, могут быть эффективно очищены с использованием аффинной матрицы протеина А или протеина С. Буферные растворы с низким или высоким рН могут быть использованы для элюирования слитого белка из аффинной матрицы. Мягкие условия элюирования содействуют предотвращению необратимой денатурации слитого белка.
Гетерологичные слитые белки по изобретению могут приготовляться с содержанием одного или нескольких наполнителей. Слитые белки по изобретению могут быть объединены с фармацевтически приемлемым буферным раствором, а величина рН отрегулирована для получения допустимой устойчивости и величины, приемлемой для введения, такого как парентеральное введение. По выбору можно добавлять одно или несколько фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными противомикробными средствами являются мета-крезол и фенол. Для регулирования ионной силы или тоничности можно добавлять одну или несколько фармацевтически приемлемых солей. Для регулирования изотоничности состава можно добавлять один или несколько наполнителей. Глицерин является примером наполнителя, регулирующего изотоничность. Фармацевтически приемлемые средства, предназначенные для введения людям и животным, не содержат токсичных элементов или нежелательных загрязнителей и не сказываются на активности активных соединений.
Гетерологичные слитые белки по изобретению можно приготавливать в виде раствора или лиофилизированного порошка, который можно восстанавливать с помощью подходящего растворителя. Лиофилизированная лекарственная форма представляет собой форму, в которой слитый белок устойчив, обладает или не обладает буферной способностью для поддержания рН раствора на протяжении предполагаемого периода полужизни восстановленного продукта. Предпочтительно, чтобы раствор, содержащий описываемые здесь гетерологичные слитые белки, перед лиофилизацией был, по существу, изотоническим, что способствует образованию изотонических растворов после восстановления.
Настоящее изобретение включает форму фармацевтически приемлемой соли гетерологичных слитых белков. Кислоты, обычно используемые для образования кислых аддитивных солей, являются неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, йодисто-водородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и так далее, а также органическими кислотами, такими как р-толуолсульфокислота, метансульфокислота, щавелевая кислота, рбромфенилсульфокислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и так далее. Предпочтительными кислыми аддитивными солями являются такие, которые образуются с минеральными кислотами, такими как хлористо-водородная кислота и бромистоводородная кислота.
Основные аддитивные соли включают такие, которые происходят от неорганических оснований, таких как аммоний или щелочные гидроксиды земельных металлов, углекислые соли, бикарбонаты или двууглекислые соли и тому подобное. Такие основы используются для приготовления солей настоящего изобретения, включая, каустическую соду, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия и тому подобное.
Гетерологичные слитые белки по изобретению проявляют биологическую активность. Биологическая активность относится к способности слитого белка связываться с рецептором СЬР-1, активировать его ίη у|уо и вызывать ответ. Ответы включают (однако, не ограниваются) секрецию инсулина, подавление глюкагона, ингибирование аппетита, потерю веса, индуцирование инсулина, ингибирование апоптоза, индукцию размножения панкреатических β-клеток и дифференциацию панкреатических β-клеток. Показательное число слитых белков СЬР-1 испытывали на активность ίη У11го, а также ίη νί\Ό. В примерах 1 и 2 представлена активность ίη νίΙΐΌ на основе способности слитого белка взаимодействовать с рецептором человеческого СЬР-1 и активировать последний. В обеих сериях экспериментов использовали клетки НЕК293, сверхэкспрессирующие рецептор человеческого СЬР-1. Активация рецептора СЬР-1 в этих клетках вызывает активацию аденилилциклазы, которая в свою очередь индуцирует экспрессию гена-репортера, движимую элементом ответа циклического АМФ (СКЕ). В примере 1 (табл. 1) приведены данные, причем геном-репортером является β-лактамаза, а в примере 2 (табл. 2) приведены данные,
- 10 008831 причем геном-репортером является люцифераза. В примере 3 приводятся данные, полученные после введения крысам одного из гетерологичных слитых белков по изобретению. Вместе эти данные показывают, что слитые белки способны связываться с рецептором СЬР-1 и активировать его, причем они являются более сильными ίη уйго, чем Уа18-СЬР-1 (7-37)ОН. Кроме того, данные, полученные после введения крысам, показывают, что слитые белки активны ίη νίνο и имеют более длительный период полужизни, чем нативный СЬР-1.
Введение гетерологичных слитых белков по изобретению можно осуществлять любым способом, известным врачу, обладающему средними познаниями в данной области. Одним таким способом является периферическое парентеральное введение. В медицинской литературе под парентеральным введением обычно понимается инъекция лекарственной формы с помощью стерильного шприца или какого-то другого механического устройства, например инфузионного насоса. Периферические парентеральные способы могут включать внутривенный, внутримышечный, подкожный и внутрибрюшинный способы введения.
Гетерологичные слитые белки по изобретению могут также подлежать введению пероральным, ректальным, назальным или низшим респираторным способами, которые являются не парентеральными способами введения. Среди этих не парентеральных способов предпочтительны низший респираторный и пероральный способы.
Слитые белки по изобретению могут использоваться при лечении широкого круга заболеваний. Слитые белки по изобретению главным образом проявляют свои биологические эффекты, действуя на рецептор, упоминаемый как «рецептор СЬР-1». Пациенты, на состоянии которых благоприятно отражается стимуляция рецепторов СЬР-1 или введение соединений СЬР-1, могут проходить курс лечения с использованием слитых белков СЬР-1 по изобретению. Можно сказать, что эти пациенты нуждаются в лечении соединениями СЬР-1 или нуждаются в стимулировании рецептором СЬР-1. Среди таких пациентов люди, страдающие инсулиннезависимым сахарным диабетом, инсулинзависимым сахарным диабетом, ожирением (см. публикацию XV О 00/16797), инфарктом миокарда (см. публикацию XVО 98/08531), ожирением (см. публикацию XVО 98/19698), катаболическими изменениями после хирургии (см. патент США № 6006753), функциональной диспепсией и синдромом раздраженной толстой кишки (слизистый колит) (см. публикацию ΧνΟ 99/64060). В такой же степени это относится к пациентам, нуждающимся в профилактическом лечении соединением СЬР-1, например, пациенты группы риска в отношении развития инсулиннезависимого сахарного диабета (см. публикацию νΟ 00/07617). Пациенты с нарушенной толерантностью к глюкозе или нарушенным уровнем глюкозы натощак, пациенты, чей вес превышает на 25% нормальный вес тела по причине роста и телосложения, пациенты с резекцией поджелудочной железы, пациенты, имеющие одного или несколько родителей, страдающих инсулиннезависимым сахарным диабетом, пациенты, которые страдали сахарным диабетом, обусловленным беременностью, и пациенты, которые страдали острым или хроническим панкреатитом, относятся к группе риска в отношении развития инсулиннезависимого сахарного диабета.
Эффективным является количество описываемых здесь слитых белков СЬР-1-Ре, которое приводит к получению желательного терапевтического и/или профилактического эффекта при отсутствии побочных эффектов при введении пациенту, нуждающемуся в стимулировании рецептора СЬР-1. Желательный терапевтический эффект заключается в следующем: 1) менее выраженное проявление симптомов заболевания или состояния; 2) более редкое проявление симптомов заболевания или состояния; 3) возросшая продолжительность жизни при проведении лечения и 4) более высокое качество жизни при проведении лечения. Например, эффективное количество слитого белка СЬР-1-Ре для лечения сахарного диабета представляет собой количество, которое привело бы к повышенному контролю за концентрацией глюкозы в крови, результатом чего является задержка диабетических осложнений, таких как ретинопатия, невропатия или заболевание почек. Эффективное количество слитого белка СЬР-1-Ре для предотвращения сахарного диабета представляет собой количество, которое привело бы к задержке, повышения уровней глюкозы в крови, что требует лечения с помощью таких противогипогликемических препаратов, как сульфонил-мочевины, тиазолидиндионы, инсулин и/или бисгуанидины.
Доза слитого белка, эффективная для нормализации глюкозы в крови пациента, зависит от ряда факторов, среди которых пол, вес и возраст пациента, степень неспособности регулировать уровень глюкозы в крови, способ введения и биологическая доступность, фармакокинетический профиль слитого белка, действенность и рецептура. Диапазон дозы может составлять от 0,01 до 1 мг/кг веса тела, предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/кг веса тела.
Предпочтительно вводить слитые белки по изобретению или один раз каждые две недели, или раз в неделю. В зависимости от заболевания может возникнуть необходимость введения слитого белка чаще, например 2-3 раза в неделю.
Настоящее изобретение поясняется приведенными ниже примерами, которые не ограничивают объем изобретения.
- 11 008831
Примеры
Пример 1. Анализ активации рецептора СЬР-1 ίη νίΐτο.
Используя систему СКЕ-ВЬАМ, клетки НЕК-293, экспрессирующие рецептор человеческого ΠΕΡΙ, высевают с интенсивностью 20000-40000 клеток на лунку в 100 мкл среды ϋΜΕΜ с помощью 10% сыворотки плода коровы (ЕВ 8) в черный планшет из 96 лунок с прозрачным дном и покрытием из полисе лизина. Через день после высевания среду удаляют и добавляют 80 мкл среды ОМ ЕМ. не содержащей плазму. На третий день после высевания в каждую лунку добавляют 20 мкл среды ОМ ЕМ. не содержащей плазму, вместе с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (В 8А), содержащим различные концентрации гетерологичного слитого белка СЬР-1-Ес, в целях получения кривой доза-эффект. Как правило, для получения кривой доза-эффект используют 14 разведений с содержанием 3-30 нмоль гетерологичного слитого белка СЬР-1-Ес, и на основе этой кривой определяют значения ЕС50. Через 5 ч инкубации со слитым белком в среду добавляют 20 мкл субстрата на основе β-лактамазы (ССЕ2/АМ, РапУега ЬЬС) и инкубацию продолжают в течение 1 ч, за это время флуоресценцию определяют на цитофлуорографе. Анализ также описан в работе 21окагшк, с( а1. (1998), 8с1еисе, 278:84-88. Исследуют различные слитые белки СЬР-1-Ес, и значения ЕС50 представлены в табл. 1. Значения соотносятся со значениями, определенными для соединения Уа18-СЬР-1(7-37)ОН, которое используют в качестве внутреннего контроля при проведении каждого эксперимента.
Соединение
Уа1й-<ЗЬР-1·.
С1у8-01и22-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (322ΘΡ, Р234А, Ь235А) :
С1уй-С1и22-СЬ₽-1 (7-37)-1.5Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Ь235А):
О1уе-С1и22-<ЗЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (Ξ228Ρ, Р234А, Ь235А):
С1ув-С1и22-С1у26-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (322ВР, Р234А, Ь235А) :
Таблица 1
Активность Ст. откл.
| 100% | 99 |
| 301% | |
| 45 | |
| 314% | |
| 468% | 120 |
| 441% | 35 |
Пример 2. Анализ активации рецептора СЬР-1 ίη νίΐτο.
Используя систему СКЕ-люцифераза, клетки НЕК-293, устойчиво экспрессирующие рецептор человеческого СЬР-1, высевают в планшет из 96 лунок с интенсивностью 30000 клеток на лунку в 800 мкл среды ЬМЕМ Е12 с низким содержанием сыворотки. Через день после высевания 20 мкл аликвоты исследуемого белка, растворенного в 0,5% В 8А, смешивают и инкубируют с клетками в течение 5 ч. Как правило, для получения кривой доза-эффект используют 12 разведений с содержанием от 3 пмоль до 3 нмоль гетерологичного слитого белка СЬР-1-Ес при концентрации 5Х для каждого исследуемого белка перед его добавлением в клетки и на основе этой кривой определяют значения ЕС50. После инкубации 100 мкл реагента люциферазы добавляют непосредственно в каждый планшет и осторожно перемешивают в течение 2 мин. Планшеты помещают в люминометр Тп-1их и производят расчет мощности света в результате экспрессии люциферазы. Исследуют различные слитые белки СЬР-1-Ес, и значения ЕС50 представлены в табл. 2. Значения соотносятся со значениями, определенными для соединения Уа18-СЬР1(7-37)ОН, которое используют в качестве внутреннего контроля при проведении каждого эксперимента. Поскольку исследуемые слитые белки являются димерами, значения корректируют с учетом 2-кратной разницы в молярности.
Таблица 2
| Соединение | Актив- | Ст. |
| ность | откл . | |
| Уа1е-СЬР-1: | 100% | |
| С1уе-С1и22-СЬР-1(7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Ь235А) : | 535% | 240 |
| О1ув-С1и2г-СЬР-1(7-37)-1.5Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Б235А) : | 595% | 43 |
| С1уй-С1и22-СЬР-1(7-37)-1Ь-1дС4 (522ВР, Е234А, Ь235А): | 1119% | 128 |
| С1ув-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37)-2Ь-1дС4 (5228Р, Г234А, Ъ235А) : | 398% | 62 |
| С1ув-С1и22-С1уЗЕ-СЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (5228Р, Р234А, Б235А): | 417% | 140 |
| Пример 3. Исследование толерантности к внутривенному введению глюкозы крысам. Слитый белок Ес, С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1(7-37)-Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А), оценивают при исследовании толерантности к внутривенному введению глюкозы крысам (ΙΥΟΤΤ). В каждой из трех групп |
исследуются по меньшей мере четыре крысы. Крысы в группе I получают носитель (табл. 3), крысы в группе II получают 1,79 мг/кг С1у8-С1и22-С1у36-СЬР-1 (7-37)-Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А) в форме однократной подкожной инъекции (табл. 4) и крысы в группе III получают 0,179 мг/кг С1у8-С1и22-С1у36СЬР-1(7-37)-Ь-1§С4 (8228Р, Е234А, Ь235А) в форме однократной подкожной инъекции (табл. 5). Подкожную инъекцию крысам осуществляют утром 1 дня. Через 24 ч после первой инъекции проводят ин-12008831 фузию 1 мкл глюкозы (050) на 1 г массы тела в форме шарика. Пробы крови отбирают через 2, 4, 6, 10, 20 и 30 мин после проведения инфузии глюкозы.
Носитель:Крыса 1 Крыса 2 Крыса 3 Крыса 4 Крыса 5
Инсулин АиС (нг*мин/мл)
| 0-2 | 11 | 9,4 |
| 2-4 | 18,1 | 9,7 |
| 4-6 | 13,4 | 7 |
| 6-10 | 7,9 | 3,5 |
| 10-20 | 3,7 | 3 |
| 20-30 | 2 | 0 |
| Итого | 56,1 | 32,6 |
| 7 | 11 | 9,6 | Среднее |
| 5,6 | 10,6 | 8,8 | |
| 3,4 | 9,6 | 5,9 | |
| 2,5 | 6 | 2,9 | |
| 2,4 | 3 | 2,4 | |
| 0 | 0 | 2,4 | |
| 20, 9 | 40,2 | 32 | 36,4 |
Таблица 3
БЕМ*
5, е
СЬР-1-Рс (1,79мг/кг) Крыса 1Крыса 2Крыса
Инсулин Аис (нг*мин/мл)
Таблица 4
Крыса 4 Крыса 5
| 0-2 | 12,3 | 17,4 | 16 |
| 2-4 | 21,9 | 13,3 | 13,2 |
| 4-6 | 16,8 | 6,5 | 9,8 |
| 6-10 | 7,6 | 3,8 | 9,2 |
| 10-20 | 3 | 0 | 0 |
| 20-30 | 0 | 0 | 0 |
| Итого | 61,6 | 41 | 48,2 |
| Среднее БЕМ* | ||
| 14 | 13 | |
| 13,9 | 13,6 | |
| 11,1 | 11,7 | |
| 5,8 | 7,4 | |
| 3,2 | 5,6 | |
| 0 | 0 | |
| 48 | 51,3 | 50 3,4 |
СЬР-1-Гс (0,179мг/
| кг) | Крыса 1 | Крыса 2 | Крыса |
| ИнсулинАЦС (нг*мин/мл) | |||
| 0-2 | 14,4 | 29,2 | 25,4 |
| 2-4 | 13,8 | 26,3 | 21,2 |
| 4-6 | 11,2 | 19,4 | 16,4 |
| 6-10 | 6,4 | 10,6 | 10,5 |
| 10-20 | 3,6 | 5,8 | 5,2 |
| 20-30 | 0 | 0 | 0 |
| Итого | 49,4 | 91,3 | 78,7 |
Таблица 5
Крыса 4
23,2
21,8
15, 7
73,7
БЕМ*
ЗЕМ* = сканирующая электронная микроскопия
Пример 4. Фармакокинетическое исследование после проведения однократной подкожной инъекции обезьянам Супото1§и8.
Исследование проводят с целью получения характеристики фармакокинетики (ФК) слитого белка Ес, 61у8-61и22-61у3б-6ЕР-1(7-37)-Е-1§64 (8228Р, Е234А, Б235А) при введении самцам обезьян суиошо1§и§ в форме подкожной инъекции (ПИ) в количестве 0,1 мг/кг. Антитело радио иммуноанализа (РИА) является специфическим относительно средней части СЬР. Твердофазный иммуноферментный анализ
-13 008831 (ЕЫ8А) основан на использовании иммобилизованного антитела, специфического к Ν-концу, и идентифицирующего антитела, специфического к Ес. Полученные концентрации плазмы в результате проведения и ЕЫ8А, и РИА используют для определения представленных значений фармакокинетических параметров.
Значения полученных ФК параметров сведены в табл. 6. ФК однократной ПИ в результате РИА ассоциируется со средним Стах, равным 446,7 нг/мл, при соответствующем Ттах, равным 17,3 ч. Средний период полувыведения из плазмы составляет примерно 79,3 ч (3,3 дня). ФК в результате ЕЫ8А ассоциируется со средним Стах, равным 292,2 нг/мл, при соответствующем Ттах, равным 16,7 ч. Средний период полувыведения из плазмы составляет примерно 51,6 ч (2,2 дня).
Таблица 6
| РИА | |||||||
| Доза (мг/кг) | Животное № | Г * (нг/мл) | (ч) | Аис0.щ с (нг*ч/мл) | (Ч) | СЬ/Р (мл/ч/кг) | (мл/кг) |
| 0,1 | 96051 | 461,0 | 4,0 | 37770,5 | 81,0 | 2,7 | 309,2 |
| 96071 | 430,0 | 24,0 | 43150,2 | 74,2 | 2,3 | 248,1 | |
| 96091 | 449,0 | 24,0 | 62271,1 | 82,9 | 1,6 | 191,9 | |
| РИА | Среднее | 446,7 | 17,3 | 47730,6 | 79,3 | 2,2 | 249,8 |
| СО | 15,6 | 11,5 | 12876,5 | 4,5 | 0,5 | 58,7 | |
| ЕЫ5А | |||||||
| 96051 | 315,4 | 2,0 | 9062,3 | 55,2 | 11,0 | 979,4 | |
| 96071 | 289,4 | 24,0 | 16653,0 | 50,3 | 6,0 | 436,0 | |
| 96091 | 271, 9 | 24,0 | 19907,4 | 49,3 | 5,0 | 357,0 | |
| ЕЫЗА | Среднее | 292,2 | 16,7 | 15207,6 | 51,6 | 7,3 | 557,5 |
| СО | 21,9 | 12,7 | 5565,2 | 3,2 | 3,2 | 281,6 |
а Максимальная концентрация плазмы.
ь Время максимальной концентрации плазмы.
с Площадь под кривой зависимости концентрации плазмы от времени, измеренная от 0 до бесконечности. а Период полувыведения из плазмы.
е Общее очищение организма в зависимости от биологической доступности.
г Объем распределения в зависимости от биологической доступности.
СО = стандартное отклонение.
Пример 5. Оценка потенциального образования антител после проведения повторных подкожных инъекций.
Определенные пробы сыворотки от обезьян супошо1ди8 исследуют на образование антител против С1у8-С1и22-С1у36-СЕР-1(7-37)-Е-1дС4 (8228Р, Е234А, Ь235А), используя прямой формат ЕЬ18А. Планшеты микротитратора покрывают С1у8-С1и22-С1у36-СЕР-1(7-37)-Е-1дС4 (8228Р, Е234А, Ь235А) при концентрации 0,1 мкг/мл. Пробы сыворотки обезьян разбавляют 50, 500, 1000 и 5000 раз в блокирующем растворе и пробы в количестве 0,05 мл на лунку инкубируют приблизительно один час. Вторичное антитело, козлиную <человеческую ЕаЬ'2>-пероксидазу (имеющая 75% перекрестную реактивность в отношении человека), разбавляют 10000 раз в блокирующем растворе, добавляют в количестве 0,05 мл на лунку и инкубируют приблизительно 1 ч. Проявление цвета при использовании субстрата тетраметилбензидин (ТМБ) считывают при оптической плотности 450-630 нм. Сдвоенные показания усредняют. Антитело СЬР-1 используют в качестве положительного контрольного значения и конъюгат козлиная<кроличья>(Н+Е)-пероксидаза используют для определения в качестве вторичного антитела. Точечные пробы сыворотки собирают перед дозированием, через 24 ч после введения второй дозы и через 168 ч после введения первой и второй подкожных доз для оценки потенциальной иммуногенности. Присутствие титров антитела к С8Е22-СЕХ-Ь-ЫдС4 интерпретируют путем сравнения с пробами сыворотки перед дозированием (ПД) и положительным контрольным значением. Соответствующие результаты приведены в табл. 7.
-14008831
Таблица 7
| Доза 1 Животное № | Полож. Контр, | 107774 | 107777 | 107779 | 107780 | ||||
| Проба Время: | пд | 168 ч | ПД | 168ч | ПД | 168 ч | пд | 168 ч | |
| 50х | 2,854 | 0,268 | 0,268 | 0,160 | 0,128 | 0,144 | 0,152 | 0,264 | 0,224 |
| 500х | 2,270 | 0,117 | 0,133 | 0,052 | 0,069 | 0,065 | 0,061 | 0,067 | 0,061 |
| ЮООх | 1,610 | 0,091 | 0,075 | 0,034 | 0,051 | 0,047 | 0,045 | 0,138 | 0,049 |
| ЗОООх | 0,525 | 0,056 | 0,048 | 0,032 | 0,037 | 0,029 | 0,033 | 0,051 | 0,039 |
| Доза 2 Животное № | Полож. Контр. | Ю7774 | 107777 | 107779 | 107780 | ||||
| Проба Время: | пд | 24 ч | ПД | 24 ч | пд | 24ч | пд | 24 ч | |
| 50х | 3,056 | 0,298 | 0,231 | 0,164 | 0,159 | 0,227 | 0,176 | 0,211 | 0,192 |
| 500х | 2,247 | 0,120 | 0,119 | 0,048 | 0,045 | 0.061 | 0,060 | 0,056 | 0.057 |
| ЮООх | 1,673 | 0,090 | 0,086 | 0,039 | 0,041 | 0,046 | 0,045 | 0,043 | ОЖ |
| 5000х | 0,534 | 0,039 | 0,042 | 0,030 | 0,034 | 0,033 | 0,036 | 0,033 | 0,034 |
| До1а 2 Животное № | Полож. Контр, | 107774 | 107777 | 107779 | 107780 | ||||
| Проба Время: | пд | 168 ч | ПД | 168ч | ПД | 168 ч | ПД | 168 ч | |
| 50х | 3,075 | 0,413 | 0,270 | 0,174 | 0,182 | 0,185 | 0,190 | 0,224 | 0,191 |
| 500х | 2,173 | 0,097 | 0,103 | 0.042 | 0,051 | 0,056 | 0,05? | 0,048 | 0,053 |
| ЮООх | 1,510 | 0,066 | 0,067 | 0,038 | 0,040 | 0,037 | 0,046 | 0,043 | 0,043 |
| 5000х | 0,474 | 0,042 | 0,042 | 0,033 | 0,046 | 0,033 | 0,033 | 0,036 | 0,041 |
Пример 6. Фармакодинамическое исследование после однократной подкожной инъекции обезьянам Суиото1ди8 в состоянии натощак и во время постепенной внутривенной инфузии глюкозы.
В фазе 1 (первый день исследования) осуществляют подкожную инъекцию носителя. Затем сразу после инъекции носителя осуществляют постепенную внутривенную инфузию глюкозы (20% декстроза) со скоростью 5, 10 и 25 мг/кг/мин. В фазе 2 (третий день исследования) осуществляют подкожную инъекцию слитого белка СЬР-1 (0,1 мг/кг). В фазе 3 постепенную внутривенную инфузию глюкозы осуществляют приблизительно через 96 ч после инъекции слитого белка СЬР-1.
Процедуры постепенной внутривенной инфузии глюкозы осуществляют на седативных обезьянах после 16-часового ночного голодания. Для обоих внутривенных инфузии глюкозы каждые 10 мин на 20 мин отбирают базисные пробы для определения исходных данных. Ступенчатую инфузию глюкозы начинают через каждые 20 мин со скоростью 5 мг/кг/мин с последующей инфузией со скоростью 10 и 25 мг/кг/мин. Каждую инфузию осуществляют в течение 20 мин. Пробы крови отбирают с 10-минутными интервалами для измерения глюкозы, инсулина и глюкагона. Приблизительно 1,0 мл крови собирают в промежутках, равных -20, -10, 0 (предглюкозная инфузия) и 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин, после инфузии глюкозы для фаз 1 и 3.
Соответствующие данные приведены в табл. 8.
-15 008831
| Глюкоза | лис | ||||
| Группа | Животное | лис (мин*мг/дл) | Группа | Животное | лис (мин*мг/дл) |
| СЪР-Рс | 9423 | 7447 | носитель | 9423 | 8077 |
| 9424 | 7470 | 9424 | 15006 | ||
| 9510 | 5153 | 9510 | 7116 | ||
| 9513 | 6303 | 9513 | 74 5 9 | ||
| 9516 | 5413 | 9516 | 8728 | ||
| 9530 | 5240 | 9530 | 7863 | ||
| Нет | 6 | ||||
| Среднее | 6171 | Среднее | 9041 | ||
| со | 1078 | со | 2973 | ||
| СО | 440 | СО | 1214 | ||
| инсулин лис | |||||
| лис | лис | ||||
| Группа | Животное | (мин*нг/мл) | Группа | Животное | (мин*нг/мл) |
| <зьр- гс | 9423 | 129 | носитель | 9423 | 38 |
| 9424 | 138 | 9424 | 29 | ||
| 9510 | 357 | 9510 | 69 | ||
| 9513 | 161 | 9513 | 64 | ||
| 9516 | 376 | 9516 | 38 | ||
| 9530 | 215 | 9530 | 68 | ||
| Среднее | 229 | Среднее | 51 | ||
| СО | 111 | СО | 18 | ||
| СО | 45 | СО | 7 |
Таблица 8
Уровни глюкагона не имели статистического различия на примере обезьян, получивших дозу носителя и слитого белка СЬР-1.
Пример 7. Фармакодинамическое исследование после однократной подкожной инъекции трех различных доз крысам в состоянии натощак и во время постепенной внутривенной инфузии глюкозы.
Хронически канюлированных крыс распределяют либо по контрольной группе с носителем (солевой раствор), либо по одной из трех лечебных групп (слитый белок СЬР-1; 0,0179 мг/кг, 0,179 мг/кг или 1,79 мг/кг). Слитый белок СЬР-1 и носитель вводят путем подкожной инъекции. Через 24 ч после лечения крыс, подвергнутых ночному голоданию (16 ч), подвергают исследованию на постепенное внутривенное вливание глюкозы. Исследование на постепенное внутривенное вливание глюкозы заключается в проведении инфузии базового солевого раствора (20 мин) с последующими двумя 30-минутными инфузиями глюкозы со скоростью 5 и 15 мг/кг/мин соответственно. Пробы плазмы собирают в промежутках, равных -20, -10, 0 (предглюкозная инфузия) и 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин.
Соответствующие данные приведены в табл. 9.
Таблица 9
| 5 мг/кг/мин | 15 мг/кг/мин | |
| Носитель | 4,3 + 0,2 (п=1В) | 12,7 ± 0,9 (п=18) |
| 0,0179 мг/кг | 5,6 ± 0,4 (П=4) | 15,9 + 1,8 (п=4) |
| 0,179 мг/кг | 9,0 ± 1,1* (п=6) | 28,0 ± 3,8* (п=6) |
| 1,79 мг/кг | 20,5 ± 3,0 * (п=4) | 52,7 ± 7,2* (п=4) |
*Р < 0,05 в сопоставлении с носителем
Claims (12)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Гетерологичный слитый белок, содержащий аналог ОЬР-1, включающий последовательность, выбранную из группы, состоящей изa) (БЕР ГО N0:1)Н1в-Хаа5-С1ц-С1у-ТЪг-Р11е-Т]1г-5ег-А8р-Уа1-5ег-8ег-Туг-ЬеиС1и-С1и-61п-А1а-А1а-Ьуз-01и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьуз-е1уС1у-С1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;b) (БЕР ГО N0:2)Н1з-Хааа-Е1и-(31у-Т11г-Р11е-Т11г-Еег-Аер’Уа1-Зег-Зег-Туг-ЬеиС1и-а1и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-<31и-Р11е-11.е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьуз-Азп-01уС1у-С1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;c) (БЕР ГО N0:3)Н1з-Хаа0-С31и-О].у-Т11г-₽11е-Т11г-Еег-Азр-Уа1-Зег-Еег-Туг-ЬеиС1и-01и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-(31и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьуз-С1уС1у-Рго где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;ά) (БЕР ГО N0:4)Н18-Хааа-С1и-С1у-ТЬг-Р11е-Т}1г-Зег-Азр-Уа1-Бег-Зег-Туг-ЬеиС1и-С1и-С1п-А1а-А1а-Ьуз-С1и-Р11е-11е“А1а-Тгр-Ьеи-Ьу5-Аз11-61уС1у-Рго где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;е) (БЕР ГО N0:5)Н13-Хаав-С1и-С1у-ТЬг-Р11е-Т11г-8ег-Азр-Уа1-Зег-5ег-Туг-ЬеиС1и-О1и- 01п-А1а-А1а-Ьуз-С11и-РЬе-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Уа1-Ьу8а1у-<з1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;£) (БЕР ГО N0:6)Н1з-Хаав-С1и-С1у-ТЬг-Р11е-ТИг-5ег-Азр-Уа1-Зег-Еег-Туг-Ьеи(31и-01и- С1п-А1а-А1а-Ьуз-01и-Р11е-11е-А1а-Тгр-Ьеи-Ьув-АзпС1у-С1у где Хаа§ выбирают из 61у и Уа1;слитый с частью Ес иммуноглобулина, содержащего последовательность БЕр ГО N0:7А1а-С1и-5ег-Ьуз-Туг-С1у-Рго-Рго-Су8-Рго-Рго-Сув-Рго-А1а-РгоХаа1б-Хаа17-Хаа18-С1у-81у-Рго-Зег-Уа1 -РБе-Ьеи-РБе-Рго-Рго-Ьуз-РгоЬуз-Азр-Т11г-Ьеи-МеЬ-11е-Вег-Агд-Т11г-Рго-С1и-'У,а1-ТЬг-С?уз-Уа1Уа1-Уа1-Азр-Уа1-Зег-С1п~С1и-А8р-Рго-С1и-Уа1-О1п-Р11е-Азп-ТгрТуг-Уа1-Азр-а1у-Уа1-О1и-Уа1-Н1з-Азп-А1а-Ьуз-Т11г-Ьуз-Рго-АгдС1и-<31и-б1п-Рке-Хаайо-8ег-Т’11г-Туг-Агд-Уа1-Уа1-Зег-Уа1-Ьеи-ТЬгУа1-Ьеи-Н18-С1п-Азр-Тгр~Ьеи-А5п-С1у-Ьу8-01и.-Туг-Ьуз-Суз-ЬузУа1-5ег-Азп-Ьу8-С1у-Ьеи-Рго-Зег-Зег-11е-С1и-Ьуз-ТЬг-11е-ЗеГ’Ьу8-А1а-Ьу8-а1у-01п-Рго-Агд-а1и-Рго-С1п-Уа1-Туг-ТЬг-Ьеи-РгоРго-8ег-С1п-(31и-С1и“Ме(:-Тйг-Ьу8-Азп-С1п-Уа1-5ег-Ьеи-ТЬг-Су8Ьеи-Уа1-Ьу8-О1у-Рке-Туг-Рго-Зег-Азр-11е-А1а-7а1-С1и-Тгр-01и5ег-А8п-а1у-С1п-Рго-Е1и-Азп-Азп-Туг-Ьуз-Т}1г-Ткг-Рго-Рго-Уа1Ьеи-Азр-5ег-Азр-<31у-5ег-РЪе-Рке-Ьеи-Туг-Зег-Агд-Ьеи-ТЬг-Уа1Азр-Ьуз-Зег-Агд-Тгр-а1п-01и-С1у-Азп-Уа1-Р11е-5ег-Суэ-Зег-Уа1МеЬ-Н1з-С1и-А1а-Ьеи-Н13-А8П-Н18-Туг-ТЬг-01п-Ьуз-5ег-Ьеи-8егЪои-Зах*-Ъаи-С1_у-Хаа22о (ЗΕ^ Ιϋ Ν0ι7) где Хаа в положении 16 означает Рго или 01и;- 17008831Хаа в положении 17 означает РЬе, Уа1 или А1а;Хаа в положении 18 означает Ьеи, С1и или А1а;Хаа в положении 80 означает Аки или А1а иХаа в положении 230 означает Ьу§ либо отсутствует.
- 2. Гетерологичный слитый белок по п.1, отличающийся тем, что С-концевой остаток глицина аналога СгЬР-1 слит с Ν-концевым остатком аланина части Ес посредством пептидного линкера, содержащего последовательность, выбранную из группы, состоящей из:a) 61у-О1у-С1у-О1у-£ег-О1у-С1у-С1у-С1у-5ег-31у-а1у-С1у-01у-Зег (5ЕС Ιϋ N0:8);b) 61у-Зег-С1у-С1у-С1у-С1у-Зег-С1у-С1у-б1у-С1у-Зег-С1у-Й1уО1у-О1у-Зег-С1у-С1у-О1у-О1у-Зег (ЗЕО 1Б N0:19); иc) С1у-01у-а1у-01у-8ег-01у-С1у-01у-О1у-8ег-С1у-С1у-01у-С1уЗег-С1у-е1у-С1у-С1у-Зег-С1у-61у-С1у-61у-Зег-О1у-С1у-(31у-<Э1у-5е1· (5Е<2 1Б N0:21) .
- 3. Гетерологичный слитый белок по п.2, отличающийся тем, что линкер содержит последовательность §Εζ) Ю N0:8.
- 4. Гетерологичный слитый белок по любому из пи. 1-3, отличающийся тем, что Хаа в положении 8 аналога 6ЬР-1 представляет собой 61у.
- 5. Гетерологичный слитый белок по любому из пи. 1-3, отличающийся тем, что Хаа в положении 8 аналога ОЬР-1 представляет собой Уа1.
- 6. Гетерологичный слитый белок по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что аналог СгЬР-1 содержит последовательность §Εζ) Ю N0:1.
- 7. Гетерологичный слитый белок, выбранный из группы, состоящей из:а) О1уе-01и22-01узв-0ЬР-1 (7-37)-1Ь-1дО4 ( 52 2 8Р) ; Ь)01уа-О1и22-01у36-СЬР-1 (7-37) -1Ь-1д04 (3228Р, Р234А, Ь235А) ; с)С1у8-С1и22-С1у36-СЪР-1 (7-37) -1Ь-1дС4 (3228Р, Ν297Α) ; (1) 01у3-01и22О1у36-ОЬР-1(7-37)-1Ь-1дС4 (3228Р, Г234А, Ь235А, Ν297Α); е) 01у801иг2-С1у36~ОЬР-1 (7-37)-1.5Ь-1дС4 (3228Р); £) С1у8-С1и22-51у3!:-СЬР1(7-37)-1.5Ь-1д<34 (3228Р, Р234А, Ь23 5А) ; д) С1ув-01и22-01у36-ОЬР1(7-37)-1.5Ь-1дО4 (5228Р, Ν297Α); И) 01ув-О1и22-а1у36-0ЬР-1 (7-37)1.5Ъ-1дС4 (3228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α) ; ί) О1у8-О1и22-01у35-СЬР1 (7-37) -2Ь-1дС4 (8228Р) ; ]) С1уа-01и22-С1у36-0ЬР- 1 (7-37) - 2Ь-1дС4 (3228Р, Р234А, Е235А) ; к) С1ув-С1и22-01уза-0ЬР-1 (7-37) -2Ь-1д04 (Е228Р, Ν297Α); 1) 01уа-01и22-а1у36-0ЬР-1 (7-37)-2Ь-1д04 (8228Р,Г234А, Б235А, Ν297Α); и его сЗез-К форм.
- 8. Гетерологичный слитый белок, выбранный из группы, состоящей из:а) Уа1в-С1и22-01у36-СЬР-1 (7-37)-1Б-1д04 (8228Р) ; Ь)Уа1в-О1и22-01у3€-СЬР~1 (7-37)-1Ь-1д04 (8228Р, Р234А, Б2 35А) ; с)Уа18-О1и22-01у3€-0ЬР-1 (7-37)-1Ь-1дС4 (8228Р, Ν297Α) ; ά) Уа1э-С1и2201у36-0ЬР-1(7-37)-1Ь-1дО4 (8228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α); е) Уа1а01и22-01узе-0ЬР-1(7-37) -1.5Ь-1дО4 (8228Р) ; £) Уа1е-01и22-01у36-СЬР1 (7-37)-1.5Ь-1д04 (8228Р, Р234А, Σ235Α) ; д) Уа10-С1и22-О1у36-СЬР1(7-37) -1.5Ь-1дО4 (3228Р, Ν297Α) ; Ь) Уа18-01и22-С1у36-ОЬР-1 (7-37)1.5Ь-1дС4 (Б228Р, Р234А, Ь235А, Ν2 97Α) ; ί) Уа18-С1и22“01у36-0ЬР1 (7-37) -2Ь-1д54 (Б228Р) ; ]) Уа18-С1и22-01у35-СЬР-1 (7-37) -2Ь-1дО4 (8228Р, Р234А, Ь2 35А) ; к) Уа18-С1и22-01у36-СЬР-1 (7-37 ) -2Ь-1дС4 (5228Р, Ν297Α) ; 1) Уа18-01и22-О1у36-0ЬР-1 (7-37)-2Е-1дС4 (3228Р, Р234А, Ь235А, Ν297Α); и его йеа-К форм.
- 9. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пи. 1-8 в качестве лекарственного средства.
- 10. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пи. 1-8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения инсулиннезависимого сахарного диабета.-18008831
- 11. Применение гетерологичного слитого белка по любому из пп.1-8 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения ожирения или стимулирования снижения массы тела у пациента с избытком массы тела.Список последовательностей <110> Е1г 1дИу апб Сотрапу <120> Гибридные белки аналогов (ЗЕР-1 <130> Х-15984 <150> 60/477880 <151> 2003-06-12 <160> 21 <170> Ра1еп11п легзюп 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> Белок <213* Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <220><221> Различающийся признак <222> (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает С1у или \/а1 <400> 1Ηίδ Хаа 61ц СИу ТНг РЬе ТЬг бег Авр \/а1 бег бег Туг Ьеи О1и 61ц 15 10 15ΘΙη А!а А!а Ьуз 6(и РЬе 1!е А1а Тгр Ьеи \/а11_уз С1у С1у С1у20 25 30 <210> 2 <211= 31 <212=· Белок <213=· Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <220><221 > Различающийся признак <222> (2)..(2)-19008831 <223> Хаа в положении 2 означает С1у или \/а1 <400> 2Ηί5 Хаа С1и С!у ТЬг РИе ТНг Зег Азр \/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и О1и 15 10 15С1п А1а А1а Ьуз СЮ РЬе Не А1а Тгр Ьеи Ьуз Азп 6!у С1у С!у20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> Белок <213> Искусственный <220* <223> Синтетическая конструкция <220><221> Различающийся признак <222> (2),.(2) <223> Хаа в положении 2 означает С!у или \/а1 <400> 3ΗΪ3 Хаа С1и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр \/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1и15 10 15С!п А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Х/а! Ьуз С1у С!у Рго 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <220><221> Различающийся признак <222> ¢2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает С1у или Уа1 <400> 4-20008831Нгз Хаа 6)и С1у ТИг РИе ТНг Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Беи С1и С1и 15 10 15С1п А1а А1а Буз С1и РКе Пе А1а Тгр Беи Буз Азп С31у 0)у Рго20 25 30 <210= 5 <211=- 30 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <220><221> Различающийся признак <222> (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает С!у или Х/а1 <400> 5Ηίβ Хаа С1и С1у ТИг РОе ТИг Зег Азр Уа! Зег Зег Туг Беи <31и СИи15 10 15С1п А1а А1а Буз С1и Рпе Не А1а Тгр Беи Уа! Буз С1у 6)у20 25 30 <210=· 6 <211> 30 <212> Белок <213= Искусственный <220= <223= Синтетическая конструкция <220><221 > Различающийся признак <222= (2)..(2) <223> Хаа в положении 2 означает СИу или Уа1 <400= 6Нгз Хаа 5Ю <31у ТИг Рпе Τϊιτ Зег Азр Уа1 Зег Зег Туг Беи 61и 6!и 15 10 15-21 008831ΟΙπ А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Ьуз Азп С1у 61у20 25 30 <210> 7 <211> 230 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <220 <221> Различающийся признак <222> (16)..(16) <223> Хаа в положении 16 означает Рго или С1и <220><221> Различающийся признак <222> (17)..(17) <223> Хаа в положении 17 означает РЬе, \/а1, или А1а <220><221> Различающийся признак <222> (18)..(18) <223> Хаа в положении 18 означает Ьеи, С1и, или А!а <220><221> Различающийся признак <222> (80)..(80) <223> Хаа в положении 80 означает Азп или А1а <220><221> Различающийся признак <222> (230)..(230) <223> Хаа в положении 230 означает Ьуз или отсутствует <400> 7А!а СЮ Зег Ьуз Туг <31у Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго А!а Рго Хаа1 5 1015Хаа Хаа О1у 61у Рго Зег \/а1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуэ Рго Ьуз Азр20 2530ТЬг Ьеи Ме( Не Зег Агд ТЬг Рго С1и \/а1 ТЬг Суз \/а1 \/а1 \/а1 Азр 35 4045-22008831 \/а1 Зег ΟΙη 01 и Авр Рго О1и \/а1 С1п РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у 50 5560 \/а1 С1и Х/а( Ηίδ Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и Б1и С51п РЬе Хаа65 70 7580Зег ТЬг Туг Агд \/а1 Х/а1 Зег \/а1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Ηΐδ О)п Αδρ Тгр85 9095Ьеи Азп О1у Ьуз <31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго 100 105110Зег Зег Не О1и Ьуз ТЬг Не Зег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и 115 120125Рго ΘΙπ \/а1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Зег С1п С1и С1и Ме1 ТЬг Ьуз Азп 130 135140С1п λ/а! Зег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Х/а1 Ьуз О1у РЬе Туг Рго Зег Азр Не145 150 155160А1а \/а1О1и Тгр С!и Зег Азп О!у О)п Рго 61и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг165 170175ТЬг Рго Рго \/а1 Ьеи Азр Зег Азр О1у Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Агд 180 135190Ьеи ТЬг \/а1 Азр Ьуз Зег Агд Тгр О1п 01 и С1у Азп Уа! РЬе Зег Суз 195 200205Зег \/а1 Ме1 Ηίβ О1и А1а Ьеи Ηί3 Азп Ηίδ Туг ТЬг ΟΙη Ьуз Зег Ьеи 210 215220Зег Ьеи Зег Ьеи О!у Хаа225230 <210* 8 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственный-23 008831 <220><223> Синтетическая конструкция <400> 8О1у С1у С1у С1у Зег О1у С1у С1у С1у Зег О1у О1у О1у О1у Зег 1 5 .10 15 <210> 9 <211> 31 <212> Белок <213> Ното зар^епе <400* 9Ηΐδ А1а С!и С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр \/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1у 15 10 15С31п А1а А!а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Уа1 Ьуз <31у Агд С1у20 25 30 <210> 10 <211> 71 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 10Н18 С31у ΘΙυ С1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Азр Х/а1 Зег Зег Туг Ьеи С1и С1и 15 1015С1п А1а А1а Ьуз С1и РЬе Не А1а Тгр Ьеи Х/а! Ьуз С1у Агд С1у О1у 20 2530О1у С1у 6!у Зег О1у С1у <31у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у <31у 35 4045 (31у С1у Зег С1у О1у <31у С1у Зег С1у С1у С(у О1у Зег А1а О1и Зег 50 5560Ьуз Туг С1у Рго Рго Суз Рго-24008831 <210> 11 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 11Тгр Ьеи Уа1 Ьу5 С1у Агд 61у С1у 61у
- 1 5 <210> 12 <211=· 7 <212> Белок <213=· Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 12Тгр Ьеи Уа1 Ьуз О1у О1у С1у1 5 <210> 13 <211> 7 <212> Белок <213= Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 13Тгр Ьеи Ьуз Азп О1у С1у С1у1 5 <210> 14 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственный <220><223= Синтетическая конструкция-25 008831 <400> 14Тгр Ьеи Ч/а! Ьуз С!у С1у Рго1 5 <210> 15 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 15Тгр Ьеи Ьуз Авп С1у С1у Рго1 5 <210> 16 <211*· 6 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 16Тгр Ьеи Уа1 Ьуз С!у С1у1 5 <210> 17 <211> 6 <212> Белок <213> Искусственный <220><223> Синтетическая конструкция <400> 17Тгр Ьеи Ьуз Азп О1у С1у1 5 <210> 18 <211> 6 <212> Белок-26008831 <213= Нотозар:епз <400* 18Рго Рго Суз Рго Зег Суз <210> 19 <211» 22 <212> Белок <213> Искусственный <220><223* Синтетическая конструкция <400> 19С1у Зег (31у С!у С1у С!у Зег С!у СИу СИу С1у Зег С1у С1у СИу С!уЗег С1у 61у С1у <31у Зег <210> 20 <211> 825 <212> ДНК <213=* Нотозар^епз <400> 20 сасддсдадд дсассйсас с1ссдасд(д 1сс1сс1а(с (сдаддадса ддссдссаад 60 даайса(сд сс(ддс1дд1 даадддсддс ддсдд1дд(д д!ддс1ссдд аддсддсддс 120 1с1дд1ддсд д1ддсадсдс (дадГссааа 1а1дд1сссс са(дсссасс сГдсссадса 180 сйдаддссд ссдддддасс а!сад(сйс с(дйссссс саааасссаа ддасас1с1с 240 а(да1йссс ддасссс1да дд1сасд1дс д1дд1дд1дд асд(дадсса ддаадасссс 300 дадд1ссад11саас(дд1а сд1дда1ддс д1ддадд1дс а1аа!дссаа дасааадссд 360 сдддаддадс адйсаасад сасд1ассд( д1дд1садсд 1сс1сассд( сс1дсассад 420 дас1ддс1да асддсаадда д(асаад1дс аадд1с(сса асаааддсй сссд1сс(сс 480 а1сдадаааа сса1с(ссаа адссаааддд садссссдад адссасадд( д(асассйд 540 ссссса1ссс аддаддада! дассаадаас саддЮадсс 1дасс1дсс1 дд(саааддс 600-27008831 ййасссса дсдасаЮдс сд1ддад1дд дааадсаа1д ддсадссдда даасаайас 660 аадассасдс с(сссд(дс( ддас(ссдас ддйссНс! (сс1с(асад саддс1аасс 720 д(ддасаада дсадд1ддса ддаддддаа( д1сйс(са1 дйссд1да1 дса1даддй 780 сЛдсасаасс айасасаса даададсс1с (ссс1д1йс 1ддд1 825 <210 21 <211= 30 <212=· Белок <213=· Искусственный <220= <223= Синтетическая конструкция <400> 21О1у <31у С!у С1у 8ег С1у <31у С1у С1у Зег С1у 61у С1у С1у Зег 61у 15 10 15О1у С1у С1у Зег С1у С1у О1у С1у Зег С1у С1у С1у (Э1у Зег20 25 30
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47788003P | 2003-06-12 | 2003-06-12 | |
| PCT/US2004/015595 WO2005000892A2 (en) | 2003-06-12 | 2004-06-10 | Glp-1 analog fusion plroteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200600015A1 EA200600015A1 (ru) | 2006-06-30 |
| EA008831B1 true EA008831B1 (ru) | 2007-08-31 |
Family
ID=33551775
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200600015A EA008831B1 (ru) | 2003-06-12 | 2004-06-10 | Слитые белки аналогов glp-1 |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7452966B2 (ru) |
| EP (2) | EP2368909A1 (ru) |
| JP (1) | JP4629047B2 (ru) |
| KR (1) | KR100758755B1 (ru) |
| CN (2) | CN1802386B (ru) |
| AR (1) | AR044776A1 (ru) |
| AT (1) | ATE525395T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004251145C1 (ru) |
| BE (1) | BE2015C007I2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0411132B8 (ru) |
| CA (1) | CA2528591C (ru) |
| CY (2) | CY1111991T1 (ru) |
| DK (1) | DK1641823T3 (ru) |
| EA (1) | EA008831B1 (ru) |
| ES (1) | ES2371072T3 (ru) |
| FR (1) | FR15C0010I2 (ru) |
| HK (1) | HK1149566A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20110714T1 (ru) |
| HU (1) | HUS1500024I1 (ru) |
| IL (1) | IL171926A (ru) |
| LT (1) | LTC1641823I2 (ru) |
| MX (1) | MXPA05013565A (ru) |
| NZ (1) | NZ543292A (ru) |
| PL (1) | PL1641823T3 (ru) |
| PT (1) | PT1641823E (ru) |
| SI (1) | SI1641823T1 (ru) |
| TW (1) | TW200507870A (ru) |
| UA (1) | UA87458C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005000892A2 (ru) |
Families Citing this family (166)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7183387B1 (en) | 1999-01-15 | 2007-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| US7459540B1 (en) * | 1999-09-07 | 2008-12-02 | Amgen Inc. | Fibroblast growth factor-like polypeptides |
| AU2002337935B2 (en) * | 2001-10-25 | 2008-05-01 | Genentech, Inc. | Glycoprotein compositions |
| AU2002364587A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| PT1463751E (pt) | 2001-12-21 | 2013-08-26 | Human Genome Sciences Inc | Proteínas de fusão de albumina |
| US20070161087A1 (en) * | 2003-05-29 | 2007-07-12 | Wolfgang Glaesner | Glp-1 fusion proteins |
| AU2004251145C1 (en) * | 2003-06-12 | 2011-04-14 | Eli Lilly And Company | GLP-1 analog fusion proteins |
| PL1729795T3 (pl) | 2004-02-09 | 2016-08-31 | Human Genome Sciences Inc | Białka fuzyjne albuminy |
| DE602005015257D1 (ru) * | 2004-12-22 | 2009-08-13 | Lilly Co Eli | |
| PT1881850E (pt) * | 2005-05-13 | 2010-11-26 | Lilly Co Eli | Compostos peguilados de glp-1 |
| US8658174B2 (en) | 2005-07-27 | 2014-02-25 | Qinghua Wang | GLP/1/exendin 4 IgG Fc fusion constructs for treatment of diabetes |
| CN101277722A (zh) | 2005-08-06 | 2008-10-01 | 王庆华 | 用于预防和治疗ⅰ型糖尿病的组合物及方法 |
| ES2336575T3 (es) * | 2005-09-22 | 2010-04-14 | Biocompatibles Uk Limited | Polipeptidos de fusion glp-1 (peptido-1 similar al glucagon) con resistencia aumentada a la peptidasa. |
| CA2627444A1 (en) * | 2005-10-24 | 2007-06-14 | Centocor, Inc. | Glp-2 mimetibodies, polypeptides, compositions, methods and uses |
| US8202837B2 (en) | 2005-11-04 | 2012-06-19 | Glaxosmithkline Llc | Methods for administering hypoglycemic agents |
| EP1959986B1 (en) | 2005-11-07 | 2014-07-23 | Indiana University Research and Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability |
| US20130172274A1 (en) | 2005-12-20 | 2013-07-04 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
| US8841255B2 (en) | 2005-12-20 | 2014-09-23 | Duke University | Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides |
| EP1816201A1 (en) | 2006-02-06 | 2007-08-08 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factor VIIa with extended half-life |
| US8288339B2 (en) | 2006-04-20 | 2012-10-16 | Amgen Inc. | GLP-1 compounds |
| WO2008028117A2 (en) * | 2006-08-31 | 2008-03-06 | Centocor, Inc. | Glp-2 mimetibodies, polypeptides, compositions, methods and uses |
| AU2007292295B2 (en) * | 2006-09-06 | 2013-06-06 | Immunoforge Co., Ltd. | Fusion peptide therapeutic compositions |
| US8338376B2 (en) * | 2006-10-20 | 2012-12-25 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins |
| AU2007338298B2 (en) | 2006-12-22 | 2013-02-07 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
| JP2008169195A (ja) | 2007-01-05 | 2008-07-24 | Hanmi Pharmaceutical Co Ltd | キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体 |
| US20090098130A1 (en) * | 2007-01-05 | 2009-04-16 | Bradshaw Curt W | Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds |
| AU2011254001B2 (en) * | 2007-01-05 | 2012-08-02 | Covx Technologies Ireland Limited | Glucagon-like protein-1 receptor (GLP-1R) agonist compounds |
| SG177953A1 (en) * | 2007-01-05 | 2012-02-28 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility in physiological ph buffers |
| EP2109457B1 (en) | 2007-02-12 | 2016-01-06 | CSL Behring GmbH | Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors |
| BRPI0807728A2 (pt) | 2007-02-15 | 2012-04-17 | Univ Indiana Res & Tech Corp | co-agonistas de receptor glucagon/glp-1 |
| CA2680792A1 (en) * | 2007-03-15 | 2008-09-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Treatment of autoimmune disorders |
| DK2172479T3 (en) * | 2007-06-19 | 2016-12-19 | Glytech Inc | GLP-1 peptide having the sugar chain attached thereto |
| EP2185178B1 (en) | 2007-08-03 | 2017-08-23 | Eli Lilly And Company | Use of an fgf-21 compound and a glp-1 compound for the treatment of obesity |
| US7960336B2 (en) | 2007-08-03 | 2011-06-14 | Pharmain Corporation | Composition for long-acting peptide analogs |
| US8563527B2 (en) * | 2007-08-20 | 2013-10-22 | Pharmain Corporation | Oligonucleotide core carrier compositions for delivery of nucleic acid-containing therapeutic agents, methods of making and using the same |
| EP2031064A1 (de) * | 2007-08-29 | 2009-03-04 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Verfahren zur Steigerung von Proteintitern |
| ES2558155T3 (es) * | 2007-10-30 | 2016-02-02 | Indiana University Research And Technology Corporation | Compuestos que muestran actividad antagonista de glucacón y agonista de GLP-1 |
| ES2509883T3 (es) | 2007-10-30 | 2014-10-20 | Indiana University Research And Technology Corporation | Antagonistas de glucagón |
| US20100317057A1 (en) * | 2007-12-28 | 2010-12-16 | Novo Nordisk A/S | Semi-recombinant preparation of glp-1 analogues |
| CA2713348C (en) * | 2008-01-30 | 2018-10-09 | Indiana University Research And Technology Corporation | Ester-based peptide prodrugs |
| JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
| JP6108659B2 (ja) * | 2008-06-17 | 2017-04-05 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 代謝疾患および肥満の治療のためのｇｉｐに基づいた混合アゴニスト |
| CN102088989B (zh) * | 2008-06-17 | 2014-11-26 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物 |
| AU2009260302B2 (en) | 2008-06-17 | 2014-10-23 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists |
| PL2291523T3 (pl) | 2008-06-24 | 2015-05-29 | Csl Behring Gmbh | Czynnik VIII, czynnik von Willebranda lub ich kompleksy o wydłużonym okresie półtrwania in vivo |
| EP2307038A4 (en) | 2008-06-27 | 2013-03-27 | Univ Duke | THERAPEUTIC AGENTS COMPRISING ELASTINE-LIKE PEPTIDES |
| EP2358749B1 (en) | 2008-10-10 | 2018-07-18 | Amgen, Inc | Fgf21 mutants and uses thereof |
| PE20120332A1 (es) | 2008-12-19 | 2012-04-14 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida |
| WO2010096394A2 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-26 | Redwood Biosciences, Inc. | Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use |
| AU2010246038A1 (en) | 2009-05-05 | 2011-12-01 | Amgen Inc. | FGF21 mutants and uses thereof |
| DK3248610T3 (da) * | 2009-05-05 | 2024-01-15 | Amgen Inc | Fgf21-mutanter og anvendelser deraf |
| MX2011013625A (es) | 2009-06-16 | 2012-01-20 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Compuestos glucagon activo de receptor de gip. |
| EP2443145A1 (en) * | 2009-06-17 | 2012-04-25 | Amgen, Inc | Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof |
| CN101993485B (zh) | 2009-08-20 | 2013-04-17 | 重庆富进生物医药有限公司 | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 |
| KR101229610B1 (ko) * | 2009-10-09 | 2013-02-05 | 한남대학교 산학협력단 | Ｇｌｐ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물 |
| AU2010326024A1 (en) * | 2009-12-02 | 2012-07-05 | Amgen Inc. | Binding proteins that bind to human FGFR1c, human beta-Klotho and both human FGFR1c and human beta-Klotho |
| UA109888C2 (uk) | 2009-12-07 | 2015-10-26 | ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ | |
| US8703701B2 (en) | 2009-12-18 | 2014-04-22 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists |
| CA2788304A1 (en) | 2010-01-27 | 2011-08-04 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon antagonist - gip agonist conjugates and compositions for the treatment of metabolic disorders and obesity |
| EP2371857A1 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-05 | CSL Behring GmbH | Factor XII inhibitors for treating interstitial lung disease |
| EP2558497A2 (en) | 2010-04-15 | 2013-02-20 | Amgen Inc. | Human fgf receptor and beta-klotho binding proteins |
| US20130123460A1 (en) | 2010-04-30 | 2013-05-16 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Peptide for improving biostability of bioactive substance, and bioactive substance having improved biostability |
| EP2569000B1 (en) | 2010-05-13 | 2017-09-27 | Indiana University Research and Technology Corporation | Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity |
| WO2011143208A1 (en) | 2010-05-13 | 2011-11-17 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon superfamily peptides exhibiting g protein-coupled receptor activity |
| CN101891823B (zh) | 2010-06-11 | 2012-10-03 | 北京东方百泰生物科技有限公司 | 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白 |
| MX2012014576A (es) | 2010-06-24 | 2013-02-21 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida. |
| WO2012010553A1 (en) * | 2010-07-20 | 2012-01-26 | Novo Nordisk A/S | N-terminal modified fgf21 compounds |
| WO2012088116A2 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon analogs exhibiting gip receptor activity |
| RU2606016C2 (ru) | 2011-01-14 | 2017-01-10 | Редвуд Байосайнс, Инк. | Меченые альдегидом полипептиды иммуноглобулина и способы их применения |
| EP2683397B1 (en) | 2011-03-09 | 2017-08-09 | CSL Behring GmbH | Factor xii inhibitors for the administration with medical procedures comprising contact with artificial surfaces |
| EP2497489A1 (en) | 2011-03-09 | 2012-09-12 | CSL Behring GmbH | Factor XII inhibitors for the treatment of silent brain ischemia and ischemia of other organs |
| MX354359B (es) | 2011-03-29 | 2018-02-28 | Roche Glycart Ag | Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos. |
| JP6184404B2 (ja) | 2011-06-22 | 2017-08-23 | インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション | グルカゴン／ｇｌｐ−１レセプターコアゴニスト |
| EP2723367B1 (en) | 2011-06-22 | 2017-05-03 | Indiana University Research and Technology Corporation | Glucagon/glp-1 receptor co-agonists |
| IL230564B2 (en) | 2011-07-22 | 2023-09-01 | Csl Ltd | Anticoagulant monoclonal antibodies anti–factor xii/fxiia, a method for their preparation, a pharmaceutical compound containing them and medical uses. |
| UY34317A (es) | 2011-09-12 | 2013-02-28 | Genzyme Corp | Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß |
| KR20130049671A (ko) | 2011-11-04 | 2013-05-14 | 한미사이언스 주식회사 | 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법 |
| US8859491B2 (en) | 2011-11-17 | 2014-10-14 | Indiana University Research And Technology Corporation | Glucagon superfamily peptides exhibiting glucocorticoid receptor activity |
| EP2623110A1 (en) | 2012-01-31 | 2013-08-07 | CSL Behring GmbH | Factor XII inhibitors for the treatment of neurological inflammatory disorders |
| EP2814502B1 (en) | 2012-02-15 | 2017-09-13 | CSL Behring GmbH | Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity |
| JP6311708B2 (ja) | 2012-06-21 | 2018-04-18 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | Ｇｉｐ受容体活性を示すグルカゴンアナローグ |
| HUE056217T2 (hu) | 2012-07-13 | 2022-02-28 | Roche Glycart Ag | Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében |
| CN104797601B (zh) * | 2012-09-12 | 2019-08-30 | 建新公司 | 具有改变的糖基化和降低的效应物功能的包含fc的多肽 |
| US9790268B2 (en) | 2012-09-12 | 2017-10-17 | Genzyme Corporation | Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function |
| EP2926834A4 (en) | 2012-11-27 | 2016-04-20 | Alteogen Inc | COMPOSITION FOR STABILIZING A FUSION PROTEIN IN WHICH A PROTEIN AND A DOMAIN FC ARE MERGED |
| PL2925776T3 (pl) | 2012-11-27 | 2018-11-30 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Ukierunkowane terapeutyczne fuzyjne białka enzymu lizosomalnego i ich zastosowania |
| KR102403299B1 (ko) | 2013-03-08 | 2022-06-03 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 원격 허혈-재관류 손상의 치료 및 예방 |
| IL275376B2 (en) | 2013-03-11 | 2024-01-01 | Genzyme Corp | Polypeptides with hyperglycosidic bonds |
| CA2904332A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Indiana University Research And Technology Corporation | Insulin-incretin conjugates |
| US9546203B2 (en) * | 2013-03-14 | 2017-01-17 | Amgen Inc. | Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions |
| ES2657291T3 (es) | 2013-04-22 | 2018-03-02 | Csl Ltd. | Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro |
| KR20160026905A (ko) | 2013-06-28 | 2016-03-09 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 인자 ｘｉｉ 억제제 및 ｃ1-억제제를 이용한 병용 치료요법 |
| CN103408669B (zh) | 2013-08-01 | 2016-01-20 | 江苏泰康生物医药有限公司 | Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途 |
| CN104592381A (zh) * | 2013-10-31 | 2015-05-06 | 江苏万邦生化医药股份有限公司 | 一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法 |
| JP6712230B2 (ja) | 2014-03-11 | 2020-06-17 | ノバルティス アーゲー | リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法 |
| US10995148B2 (en) | 2014-03-19 | 2021-05-04 | Genzyme Corporation | Site-specific glycoengineering of targeting moieties |
| KR102385120B1 (ko) * | 2014-03-31 | 2022-04-12 | 한미약품 주식회사 | 면역글로불린 Fc 단편 결합을 이용한 단백질 및 펩타이드의 용해도를 개선시키는 방법 |
| KR102513050B1 (ko) | 2014-06-18 | 2023-03-29 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 신경외상성 장애에서의 인자 xii 억제제를 이용한 치료요법 |
| DK3164150T3 (da) | 2014-07-02 | 2021-02-08 | CSL Behring Lengnau AG | Modificeret von willebrand-faktor |
| IL289475B2 (en) | 2014-07-21 | 2023-10-01 | Delinia Inc | Molecules that activate T cells are selectively regulated for the treatment of autoimmune diseases |
| SI3180020T1 (sl) | 2014-08-11 | 2019-04-30 | Delinia, Inc. | Modificirane variante IL-2, ki selektivno aktivirajo regulatorne celice T, za zdravljenje avtoimunih bolezni |
| EP3206710B1 (en) | 2014-09-24 | 2020-05-06 | Indiana University Research & Technology Corporation | Incretin-insulin conjugates |
| CN104293834B (zh) * | 2014-10-11 | 2018-03-23 | 上海兴迪金生物技术有限公司 | GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白的制备方法 |
| PT3236991T (pt) | 2014-12-23 | 2019-09-06 | Novo Nordisk As | Derivados de fgf21 e usos dos mesmos |
| KR101825048B1 (ko) * | 2014-12-31 | 2018-02-05 | 주식회사 제넥신 | GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도 |
| TN2017000432A1 (en) | 2015-04-10 | 2019-04-12 | Amgen Inc | Interleukin-2 muteins for the expansion of t-regulatory cells |
| AR105616A1 (es) * | 2015-05-07 | 2017-10-25 | Lilly Co Eli | Proteínas de fusión |
| AU2016266627A1 (en) | 2015-05-22 | 2018-01-18 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia |
| KR20180012303A (ko) | 2015-05-22 | 2018-02-05 | 체에스엘 베링 리컴비넌트 퍼실리티 아게 | 변형된 폰 빌레브란트 인자의 제조 방법 |
| TWI622596B (zh) | 2015-10-26 | 2018-05-01 | 美國禮來大藥廠 | 升糖素受體促效劑 |
| KR102670157B1 (ko) | 2015-10-28 | 2024-05-29 | 주식회사유한양행 | 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
| KR102668200B1 (ko) | 2015-10-28 | 2024-05-23 | 주식회사유한양행 | 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 |
| NZ743474A (en) | 2015-12-23 | 2023-03-31 | Amgen Inc | Method of treating or ameliorating metabolic disorders using binding proteins for gastric inhibitory peptide receptor (gipr) in combination with glp-1 agonists |
| EP3184149A1 (en) | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Julius-Maximilians-Universität Würzburg | Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases |
| DK3400002T3 (da) | 2016-01-07 | 2022-04-11 | CSL Behring Lengnau AG | Muteret, trunkeret von willebrand faktor |
| EP3400238B1 (en) | 2016-01-07 | 2021-05-19 | CSL Behring Lengnau AG | Mutated von willebrand factor |
| US20170204154A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-20 | Delinia, Inc. | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases |
| CA3019851A1 (en) | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Csl Limited | Method of treating atherosclerosis |
| CN109071634A (zh) | 2016-04-26 | 2018-12-21 | R.P.谢勒技术有限责任公司 | 抗体偶联物及其制备和使用方法 |
| US10336812B2 (en) | 2016-05-10 | 2019-07-02 | Janssen Biotech, Inc. | GDF15 fusion proteins and uses thereof |
| CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| EP3502143A4 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-15 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN |
| CN106317226B (zh) | 2016-08-19 | 2017-09-05 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 用于构建融合蛋白的连接肽 |
| SG11201903882VA (en) | 2016-11-08 | 2019-05-30 | Delinia Inc | Il-2 variants for the treatment of autoimmune diseases |
| CA3042512A1 (en) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Yuhan Corporation | Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins |
| WO2018087267A1 (en) | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Csl Behring Recombinant Facility Ag | Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia |
| AU2017358865A1 (en) | 2016-11-11 | 2019-05-09 | CSL Behring Lengnau AG | Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder |
| EP3351262A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-25 | Istanbul Universitesi Rektorlugu | Curaglutide for in treatment of prediabetes, diabetes, obesity and metabolic diseases associated thereto |
| JOP20190177A1 (ar) | 2017-01-17 | 2019-07-16 | Amgen Inc | طريقة لعلاج أو تحسين اضطرابات أيضية باستخدام مساعدات مستقبل glp-1 مقترنة بمناهضات لمستقبل ببتيد مثبط معوي (gipr) |
| MX2019012331A (es) | 2017-04-21 | 2020-01-23 | Yuhan Corp | Metodo para producir proteinas de doble funcion y sus derivados. |
| US20200171129A1 (en) | 2017-06-01 | 2020-06-04 | Eli Lilly And Company | Therapeutic uses of dulaglutide |
| EP3641800B1 (en) | 2017-06-22 | 2023-10-04 | CSL Behring Lengnau AG | Modulation of fviii immunogenicity by truncated vwf |
| MX2020002977A (es) | 2017-09-22 | 2020-11-06 | Regeneron Pharma | Agonistas de receptor de peptido similar al glucagon tipo 1 y usos de los mismos. |
| KR20220146656A (ko) | 2017-11-21 | 2022-11-01 | 일라이 릴리 앤드 캄파니 | 둘라글루티드를 함유하는 조성물 및 사용 방법 |
| CN111518770B (zh) | 2017-12-19 | 2023-01-06 | 北京吉源生物科技有限公司 | 一种表达glp1和fgf21的干细胞及其用途 |
| WO2019125003A1 (ko) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | 케이비바이오메드 주식회사 | 경구용 유전자 전달체 및 이의 용도 |
| WO2019140021A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Eli Lilly And Company | Combination therapy |
| CN116098989A (zh) | 2018-02-08 | 2023-05-12 | 广东东阳光药业有限公司 | Fgf21变体、融合蛋白及其应用 |
| JP2021530533A (ja) | 2018-07-19 | 2021-11-11 | ディーアンドディー ファーマテック インコーポレイテッド | ポリペプチドを含む医薬組成物 |
| KR20200135618A (ko) | 2019-05-23 | 2020-12-03 | ㈜ 디앤디파마텍 | 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
| CN110878127B (zh) | 2018-09-06 | 2022-06-28 | 浙江柏拉阿图医药科技有限公司 | 长效重组GLP1-Fc-CD47蛋白及其制备和用途 |
| CN111234000B (zh) * | 2018-11-28 | 2023-05-26 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 艾塞纳肽类似物 |
| CN111269312B (zh) * | 2018-12-04 | 2023-05-09 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种异源融合蛋白质 |
| CN109836486B (zh) * | 2019-01-30 | 2020-09-08 | 北京双因生物科技有限公司 | 成纤维生长因子21变体、其融合蛋白及其用途 |
| CN111662373B (zh) * | 2019-03-05 | 2024-05-14 | 广东东阳光药业股份有限公司 | 一种多肽分子及其应用 |
| EP3934679A1 (en) | 2019-03-08 | 2022-01-12 | Amgen Inc. | Growth differentiation factor 15 combination therapy |
| US20220143187A1 (en) | 2019-03-15 | 2022-05-12 | Eli Lilly And Company | Preserved formulations |
| CA3056663C (en) | 2019-04-05 | 2022-10-18 | Jeffrey S. RIESMEYER | Use of dulaglutide in reducing risk of cardiovascular events in patients with type 2 diabetes mellitus |
| CA3138650A1 (en) | 2019-05-17 | 2020-11-26 | Universitaet Zuerich | Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke |
| KR20220029733A (ko) | 2019-07-04 | 2022-03-08 | 체에스엘 베링 렝나우 아게 | 응고 인자 viii의 시험관내 안정성을 증가시키기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 (vwf) |
| EP4045641A1 (en) | 2019-10-15 | 2022-08-24 | Eli Lilly and Company | Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines |
| EP4058049A1 (en) | 2019-11-11 | 2022-09-21 | CSL Behring Lengnau AG | Polypeptides for inducing tolerance to factor viii |
| CN115322794A (zh) | 2020-01-11 | 2022-11-11 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物 |
| US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
| EP4200429A1 (en) | 2020-08-24 | 2023-06-28 | The Trustees of The University of Pennsylvania | Viral vectors encoding glp-1 receptor agonist fusions and uses thereof in treating metabolic diseases |
| CN114106194B (zh) * | 2020-08-31 | 2024-01-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种用于治疗糖尿病和/或肥胖症的融合蛋白 |
| KR20230110563A (ko) | 2020-11-20 | 2023-07-24 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 항체 매개 거부 반응의 치료 방법 |
| CN114685644A (zh) | 2020-12-29 | 2022-07-01 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
| CN117136068A (zh) | 2021-02-01 | 2023-11-28 | 瑞士杰特贝林生物制品有限公司 | 治疗或预防出血性中风后不良继发性神经学后果的方法 |
| JP2024517857A (ja) | 2021-05-07 | 2024-04-23 | ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト | 組換えハプトグロビン（Ｈｐ）ベータ鎖を作製するための発現系 |
| EP4368636A1 (en) | 2021-07-06 | 2024-05-15 | Suzhou Alphamab Co., Ltd. | Fusion protein and application thereof |
| TW202409070A (zh) | 2022-05-18 | 2024-03-01 | 美商普羅托莫科技公司 | 芳族含硼化合物及相關胰島素類似物 |
| CN114774496B (zh) * | 2022-06-21 | 2022-10-04 | 北京惠之衡生物科技有限公司 | 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法 |
| WO2024047219A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Csl Behring Ag | Haptoglobin for use in treating or preventing exaggerated erectile response or erectile dysfunction |
| US20240199728A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-06-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating obesity, diabetes, and liver dysfunction |
| WO2024068848A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Zealand Pharma A/S | Methods for treating obesity |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996004388A1 (en) * | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| WO2002046227A2 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Eli Lilly And Company | Glp-1 fusion proteins |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
| NZ201705A (en) | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
| US4943529A (en) | 1982-05-19 | 1990-07-24 | Gist-Brocades Nv | Kluyveromyces as a host strain |
| AU3145184A (en) | 1983-08-16 | 1985-02-21 | Zymogenetics Inc. | High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe |
| US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
| EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
| US5010182A (en) | 1987-07-28 | 1991-04-23 | Chiron Corporation | DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides |
| AU4005289A (en) | 1988-08-25 | 1990-03-01 | Smithkline Beecham Corporation | Recombinant saccharomyces |
| FR2646437B1 (fr) | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
| DE68927344T2 (de) | 1989-04-28 | 1997-02-20 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces |
| EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
| FR2649120B1 (fr) | 1989-06-30 | 1994-01-28 | Cayla | Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede |
| PT669929E (pt) | 1992-11-13 | 2007-04-30 | Immunex Corp | Ligando de elk, uma citoquina |
| GB9511935D0 (en) | 1995-06-13 | 1995-08-09 | Smithkline Beecham Plc | Novel compound |
| US5723125A (en) | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| US6750334B1 (en) | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
| US6277819B1 (en) | 1996-08-30 | 2001-08-21 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction |
| US6006753A (en) | 1996-08-30 | 1999-12-28 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs to abolish catabolic changes after surgery |
| UA65549C2 (ru) | 1996-11-05 | 2004-04-15 | Елі Ліллі Енд Компані | Применение аналогов и производных glp-1 для периферического введения для борьбы с ожирением |
| US6190909B1 (en) | 1997-04-17 | 2001-02-20 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | TH2-specific gene |
| SE9802080D0 (sv) | 1998-06-11 | 1998-06-11 | Hellstroem | Pharmaceutical composition for the treatment of functional dyspepsia and/or irritable bowel syndrome and new use of substances therein |
| JP2002523333A (ja) | 1998-07-31 | 2002-07-30 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | Ｉｉ型糖尿病を予防するためのｇｌｐ−１及び類似体の利用 |
| MY155270A (en) | 1998-09-24 | 2015-09-30 | Lilly Co Eli | Use of glp-1 or analogs in treatment of stroke |
| US6376653B1 (en) | 1998-09-28 | 2002-04-23 | Smithkline Beecham Plc | Tie2 antagonist antibodies |
| SI1180121T1 (en) | 1999-05-17 | 2004-04-30 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulinotropic peptides |
| ATE424413T1 (de) | 2000-06-16 | 2009-03-15 | Lilly Co Eli | Analoge des glucagon-ähnlichen peptids-1 |
| WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| US6900292B2 (en) | 2001-08-17 | 2005-05-31 | Lee-Hwei K. Sun | Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities |
| PT1463751E (pt) | 2001-12-21 | 2013-08-26 | Human Genome Sciences Inc | Proteínas de fusão de albumina |
| AU2004251145C1 (en) * | 2003-06-12 | 2011-04-14 | Eli Lilly And Company | GLP-1 analog fusion proteins |
-
2004
- 2004-06-10 AU AU2004251145A patent/AU2004251145C1/en active Active
- 2004-06-10 MX MXPA05013565A patent/MXPA05013565A/es active IP Right Grant
- 2004-06-10 CN CN200480015953XA patent/CN1802386B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-10 CN CN201010508567.1A patent/CN101974090B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-10 JP JP2006533197A patent/JP4629047B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-10 NZ NZ543292A patent/NZ543292A/en unknown
- 2004-06-10 KR KR1020057023668A patent/KR100758755B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2004-06-10 EP EP11166548A patent/EP2368909A1/en not_active Withdrawn
- 2004-06-10 CA CA2528591A patent/CA2528591C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-10 PT PT04752589T patent/PT1641823E/pt unknown
- 2004-06-10 DK DK04752589.4T patent/DK1641823T3/da active
- 2004-06-10 EP EP04752589A patent/EP1641823B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-10 EA EA200600015A patent/EA008831B1/ru active Protection Beyond IP Right Term
- 2004-06-10 AT AT04752589T patent/ATE525395T1/de active
- 2004-06-10 PL PL04752589T patent/PL1641823T3/pl unknown
- 2004-06-10 ES ES04752589T patent/ES2371072T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-06-10 SI SI200431776T patent/SI1641823T1/sl unknown
- 2004-06-10 BR BRPI0411132A patent/BRPI0411132B8/pt active IP Right Grant
- 2004-06-10 US US10/558,627 patent/US7452966B2/en active Active
- 2004-06-10 UA UAA200511830A patent/UA87458C2/ru unknown
- 2004-06-10 WO PCT/US2004/015595 patent/WO2005000892A2/en active Application Filing
- 2004-06-11 AR ARP040102037A patent/AR044776A1/es unknown
- 2004-06-11 TW TW093116970A patent/TW200507870A/zh unknown
-
2005
- 2005-11-14 IL IL171926A patent/IL171926A/en active IP Right Grant
-
2008
- 2008-10-31 US US12/262,832 patent/US8273854B2/en active Active
-
2011
- 2011-04-06 HK HK11103498.8A patent/HK1149566A1/xx unknown
- 2011-10-05 HR HR20110714T patent/HRP20110714T1/hr unknown
- 2011-11-03 CY CY20111101059T patent/CY1111991T1/el unknown
-
2015
- 2015-01-30 FR FR15C0010C patent/FR15C0010I2/fr active Active
- 2015-01-30 CY CY2015002C patent/CY2015002I2/el unknown
- 2015-02-02 BE BE2015C007C patent/BE2015C007I2/fr unknown
- 2015-02-03 LT LTPA2015007C patent/LTC1641823I2/lt unknown
- 2015-04-20 HU HUS1500024C patent/HUS1500024I1/hu unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996004388A1 (en) * | 1994-07-29 | 1996-02-15 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| WO2002046227A2 (en) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Eli Lilly And Company | Glp-1 fusion proteins |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA008831B1 (ru) | Слитые белки аналогов glp-1 | |
| ES2298785T3 (es) | Proteinas de fusion. | |
| US7576190B2 (en) | FGF-21 fusion proteins | |
| JP2019213548A (ja) | 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 | |
| JP2016128449A (ja) | Ｆｇｆ２１突然変異体及びその使用 | |
| KR20040038901A (ko) | Ｇｌｐ-1 융합 단백질 | |
| JPH074249B2 (ja) | インシユリン受容体 | |
| US20210253662A1 (en) | Long-Acting Recombinant GLP1-Fc-CD47 Protein and Preparation and Use Thereof | |
| WO2022117044A1 (en) | Glp-1/gcg dual receptor agonist polypeptide and fusion protein thereof | |
| CN111269312B (zh) | 一种异源融合蛋白质 | |
| KR102676582B1 (ko) | 갑상선 자극 호르몬 수용기(thyrotropin receptor, TSHR) 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 | |
| US20240131114A1 (en) | Nerve growth factor fusion protein, preparation method and use thereof | |
| JPH06228194A (ja) | 可溶性キットリガンド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ND4A | Extension of term of a eurasian patent | ||
| ND4A | Extension of term of a eurasian patent |