PT1641823E - Proteínas de fusão de análogos de glp-1 - Google Patents

Description

ΡΕ1641823 1 DESCRIÇÃO "PROTEÍNAS DE FUSÃO DE ANÁLOGOS DE GLP-1"

CAMPO DO INVENTO O presente invento está relacionado com análogos peptidicos do tipo glucagão fundidos com proteínas que têm o efeito de prolongarem a semi-vida in vivo dos péptidos. Estas proteínas de fusão podem ser usadas para tratar diabetes, assim como uma variedade de outras condições ou distúrbios.

Os análogos peptidicos tipo glucagão-1 (GLP-1) e derivados são promissores em ensaios clínicos para o tratamento de diabetes tipo 2. GLP-1 induz numerosos efeitos biológicos tais como estimulação da secreção de insulina, inibição da secreção de glucagão, inibição do esvaziamento gástrico, inibição da motilidade gástrica ou da motilidade intestinal, e indução da perda de peso. Uma característica importante de GLP-1 é a sua capacidade para estimular a secreção de insulina sem o risco associado de hipoglicémia que se observa quando da utilização da terapia com insulina ou nalguns tipos de terapia oral que actuam através do aumento da expressão de insulina. A utilidade da terapia com os péptidos GLP-1 tem sido limitada pelo facto de GLP-1(1-37) ser fracamente 2 ΡΕ1641823 activo e os dois péptidos naturais truncados, GLP-1(7-37)OH e GLP-1(7-36)NH2, serem rapidamente eliminados in vivo e possuírem semi-vidas in vivo extremamente curtas. Sabe-se que a dipeptidil-peptidase IV produzida endogenamente (DPP-IV) inactiva os péptidos GLP-1 circulantes através da remoção dos resíduos histidina e alanina N-terminais e é uma das principais razões para a curta semi-vida in vivo.

Foram consideradas várias abordagens para prolongar a semi-vida de eliminação de um péptido GLP-1 ou reduzir a eliminação do péptido do corpo mantendo a actividade biológica. Uma abordagem envolve a fusão de um péptido GLP-1 com a porção Fc de uma imunoglobulina. As imunoglobulinas tipicamente possuem in vivo semi-vidas em circulação longas. Por exemplo, as moléculas de IgG podem ter uma semi-vida em humanos até 23 dias. A porção Fc da imunoglobulina é responsável, em parte, por esta estabilidade in vivo. As proteínas de fusão GLP-l-Fc tiram partido da estabilidade proporcionada pela porção Fc de uma imunoglobulina, ao mesmo tempo que preservam a actividade biológica da molécula GLP-1.

Neste contexto, WO 02/46227 descreve fusões de um composto GLP-1 e de uma imunoglobulina, como seja IgGl ou IgG4. WO 96/04388 descreve fusões de um mutante ou variante de IL-4 e pelo menos um domínio constante de imunoglobulina humana ou seu fragmento. 3 ΡΕ1641823

Ainda que esta abordagem seja possível para fármacos GLP-1 (Ver WO 02/46227), existe uma preocupação geral relativamente à antigenicidade de várias proteínas de fusão quando administradas repetidamente ao longo de períodos de tempo prolongados. Esta é especialmente uma preocupação para os fármacos de fusão GLP-l-Fc uma vez que um doente com diabetes deve ser tratado durante toda a sua vida uma vez diagnosticada a doença. Ainda, os fármacos de proteínas de fusão com Fc podem ser uma preocupação se a porção Fc mantiver funções efectoras indesejáveis. 0 presente invento pretende ultrapassar os problemas associados à potencial imunogenicidade e à actividade efectora associadas com a administração de fusões GLP-l-Fc através da identificação de proteínas de fusão específicas GLP-l-Fc que possuam um risco reduzido de indução de uma resposta imune, após administração repetida e prolongada e sem terem função efectora. Estas proteínas de fusão específicas possuem substituições em várias posições na porção GLP-1 assim como na porção Fc da molécula. As substituições aqui descritas proporcionam maior potência, maior estabilidade in vivo, função efectora eliminada e menor probabilidade da molécula ser reconhecida pelos elementos adaptativos do sistema imunitário.

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento são proporcionadas proteínas heterólogas de fusão compreendendo um análogo de GLP-1 compreendendo uma sequência seleccionada entre: 4 ΡΕ1641823 a) (SEQ ID N0:1)

His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-

Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; b) (SEQ ID NO:2)

His-Xaae-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-

Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ue-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; c) (SEQ ID NO:3)

His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-

Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro em que Xaas é seleccionado entre Gly e Vai; d) (SEQ ID NO:4)

His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln- Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; 5 ΡΕ1641823

His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-

Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; f) (SEQID NO:6)

His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lcu-Glu-Ghi-

Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly em que Xaa8 é seleccionado entre Gly e Vai; fundido com a porção Fc de uma imunoglobulina compreendendo a sequência de SEQ ID NO:7

Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-

Pro-Xaai6-Xaai7~Xaai8-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-

Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-

Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-

Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-

Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaa8o-Ser-Thr-Tyr-

Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-

Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-

Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-

Pro-Arg-Glu-Pro-Gln- Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-

Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-

Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-

Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-

Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-

Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser- 6 ΡΕ1641823

Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa23o (SEQ IDN0:7) em que:

Xaa na posição 16 é Pro ou Glu;

Xaa na posição 17 é Phe, Vai ou Ala;

Xaa na posição 18 é Leu, Glu ou Ala;

Xaa na posição 80 é Asn ou Ala; e

Xaa na posição 230 é Lys ou não existe. 0 resíduo de glicina N-terminal do análogo de GLP-1 é preferencialmente fundido com o resíduo alanina N-terminal da porção Fc através de um elemento de ligação peptídico compreendendo uma sequência seleccionada entre: a) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-

Ser (SEQ ID NO:8); b) Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:19); e c) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-

Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:21). O elemento de ligação preferencialmente compreende a sequência de SEQ ID NO:8.

De preferência, Xaa na posição 8 do análogo de GLP-1 do presente invento é Gly ou Vai. 7 ΡΕ1641823

Ainda mais de preferência o análogo GLP-1 do presente invento compreende a sequência de SEQ ID N0:1. A proteína heteróloga de fusão do presente invento é seleccionada de entre: a) Gly8-Glu22-GLy36-GLP-l (7-37)-lL-IgG4 (S228P) ; b) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; c)

Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, N2 97A); d) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 )-1.5L-IgG4 (S228P)/ f) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; g) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 )-1.5L-IgG4 (S228P, N2 97A) ; h) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-

IgG4 (S228P) ; j) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; k) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) -2L-

IgG4 (S228P, N2 97A) ; 1) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) -2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e as suas formas des-K.

Uma proteína heteróloga de fusão preferida é a forma deS-R de Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A)

Mais de preferência a proteína heteróloga de fusão e seleccionada de entre: a) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-lL-IgG4 (s228p) . b) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) -lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; c) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1L- ΡΕ1641823

IqG4(S228P, N297A); d) Val8-GLu22-Gly6-GLP-l (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N2 97A) ; e) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P) / f) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) -1.5L-lgG4 (S228P, F234A, L235A) ; g) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7- 37)-1.5L-IgG4 (S228P, N2 97A) ; h) Val8-Glu22-Gly6-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A,L235A, N297A) ; i) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) -2L-IgG4 (S228P) / j) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) -2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) / k) Val8-Glu22-Gly36- GLP-1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P, N2 97A) ; 1) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-IgG4(S228P, F234A, L235A, N2 97A); e as suas formas des-K.

Uma forma de proteína heteróloga de fusão preferida compreende (a) Uma análogo de GLP-1 compreendendo SEQ ID N0:1

His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly em que Xaa8 é seleccionado de Gly; (b) uma porção Fc de uma imunoglobulina compreendendo SEQ ID NO: 7

Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-

Pro-Xaai6-Xaai7-Xaai8-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-

Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-

Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-

Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-

Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaaso-Ser-Thr-Tyr- 9 ΡΕ1641823

Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-

Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-

Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-

Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-

Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys-

Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-

Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu-

Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-

Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-

Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-

Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa23o em que:

Xaa na posição 16 é Glu;

Xaa na posição 17 é Ala;

Xaa na posição 18 é Ala;

Xaa na posição 80 é Asn; e Xaa na posição 230 não existe; e (c) um elemento de ligação peptidico compreendendo SEQ ID NO:8 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, em que a glicina N-terminal do elemento de ligação peptidico está directamente fundida com o resíduo de glicina C-terminal do análogo de GLP-1 e a serina C-terminal do elemento de ligação peptidico está directamente fundida com a alanina N-terminal da porção Fc.

De preferência, a proteína heteróloga de fusão compreende a sequência de aminoácidos: 10 ΡΕ1641823 HGEOTn^DVSSVLEEQAAÍCEFIAWLVKOOGOOÕaSÍHjOCSÔGCKBAESKYCirr

CEFCPAPIAAGGPSVFLFFPKPKDTLMlSRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQf^WYVO

NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVOKSRWQBGMYFSCSVMHEAyíNHYTQKSLSE SLG, e t-esi a sequência de ácidos sacleicos

SEQ M>z2í

De acordo com um segundo aspecto do presente invento é proporcionada uma proteína heteróloga de fusão para usar como um medicamento.

De acordo com um terceiro aspecto do presente invento é proporcionada uma proteína heteróloga de fusão para usar no tratamento de diabetes mellitus não dependente de insulina.

De acordo com um quarto aspecto do presente invento é proporcionada uma proteína heteróloga de fusão para usar no tratamento de obesidade ou indução da perda de peso num indivíduo com excesso de peso.

De acordo com um quinto aspecto do presente invento é proporcionada a utilização de uma proteína heteróloga de fusão para a produção de um medicamento para o tratamento de diabetes mellitus não dependente de insulina.

De acordo com um sexto aspecto do presente invento é proporcionada a utilização uma proteína 11 ΡΕ1641823 heteróloga de fusão para a produção de um medicamento para o tratamento de obesidade ou indução da perda de peso num indivíduo com excesso de peso.

De acordo com um sétimo aspecto do presente invento é proporcionado um dímero compreendendo duas proteínas heterólogas de fusão do presente invento.

De acordo com um oitavo aspecto do presente invento é proporcionada uma formulação compreendendo uma proteína heteróloga de fusão do presente invento que está preferencialmente na forma de um dímero. 0 presente invento também inclui polinucleótidos codificadores das proteínas heterólogas de fusão do presente invento, assim como vectores e células hospedeiras compreendendo tais polinucleótidos. Métodos de tratamento de doentes que sofrem de diabetes mellitus não dependentes de insulina assim como dependentes de insulina, obesidade e vários outros distúrbios e condições compreendendo a administração das proteínas heterólogas de fusão aqui discutidas estão igualmente incluídos no presente invento.

As proteínas heterólogas de fusão do presente invento compreendem uma porção de análogo de GLP-1 e uma porção Fc. A porção do análogo de GLP-1 e a porção Fc compreendem substituições da sequência GLP-1 nativa e da sequência IgG4 humana respectivamente, que proporcionam à proteína maior potência e estabilidade in vivo, compara- 12 ΡΕ1641823 tivamente com GLP-1 ou análogos de GLP-1 não fundidos com uma sequência Fc, ao mesmo tempo que diminuem o potencial de indução da formação de anticorpos após administração prolongada e repetida em seres humanos. GLP-1 nativa é processada in vivo de forma que os primeiros 6 aminoácidos são clivados da molécula. Assim, habitualmente nesta área, o extremo amina de GLP-1 é atribuído ao número 7 e o extremo carboxilo ao número 37. Os outros aminoácidos no polipéptido são numerados consecutivamente como se mostra em SEQ ID NO:9. Por exemplo, a posição 9 é alanina e a posição 22 é glicina. 0 péptido processado pode ainda ser modificado in vivo de forma que o resíduo de glicina é removido e substituído com um grupo amida. Assim, GLP-1(7-37)OH e GLP-1(7-36)amida representam as duas formas nativas da moléculas. GLP-1(Ιό!) OH tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:9: 7His-Ala-Glu-l0Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-l5Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gtn-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Àrg-37Gly (SEQ ID NO:9) A porção do análogo de GLP-1 da proteína heteróloga de fusão compreende três substituições principais nas posições 8, 22 e 36 relativamente a GLP-1(7-37) nativa. A substituição na posição 8 reduz a velocidade a que a enzima endógena dipeptidilpeptidase IV (DPP-IV) inactiva o análogo. DPP-IV cliva GLP-1 nativa entre o 2o e o 3o aminoácido (entre a posição 8 e 9) e a molécula resultante é menos activa. Assim, as proteínas heterólogas 13 ΡΕ1641823

de fusão do presente invento são resistentes a DPP-IV. A substituição na posição 22 reduz o potencial da molécula

para se agrega e aumentar a potência da molécula. A substituição na posição 36, no contexto do análogo com alterações em 8 e 22 assim como no contexto da proteína de fusão total, reduz o risco de a proteína de fusão induzir uma resposta imune neutralizante após administração repetida e prolongada em seres humanos. 0 evento central na geração das respostas imunes humoral e celular é a activação e expansão clonal de células T auxiliares (TH) . A activação de células TH é iniciada através da interacção do complexo receptor de células T (TCR)-CD3 com um péptido antigénico processado ligado a uma molécula do complexo major de histocompatibilidade (MHC) classe II na presença de uma célula apresentadora de anti-génios (APC) . A interacção de uma célula TH com antigénio inicia uma cascata de acontecimentos bioquímicos que induzem a entrada no ciclo celular das células TH em repouso (transição G0 para Gi). A célula T activada progride através do ciclo celular, proliferando e diferenciando-se em células de memória ou em células efectoras. A sequência que se segue foi analisada para identificar potenciais epitopos:

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Fhe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly~ Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro (SEQ DD NO: 10) 14 ΡΕ1641823

Esta sequência é uma sequência do análogo de GLP-1 com alterações nas posições 8 e 22 relativamente à sequência nativa seguido de 2 cópias de uma sequência elemento de ligação rica em G seguido dos 10 primeiros aminoácidos de uma região Fc derivada de IgG4 humana. Epitopo como aqui usado refere-se a uma região de uma molécula proteica a que se pode ligar um anticorpo. Um epitopo imunogénico é definido como a parte da proteína que induz uma resposta de anticorpo quando a totalidade da proteína é o imunogénio. O mapeamento de epitopos envolve o varrimento das sequências usando uma janela que desliza nove aminoácidos acoplada a técnicas avançadas de análise estatística para extrair a informação contida nestes padrões. Um pacote de programas informáticos conhecido como EpiMatrix™ foi usado para analisar a sequência e identidade dos péptidos que com grande probabilidade induzem uma resposta imune quando apresentados às células T. Oito alelos altamente comuns foram usados na análise da interacção com o receptor MHC Classe II. Estes alelos incluíram DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*1101, DRB1*1301 e DRB1*1501.

Prevê-se que um epitopo forte esteja situado na junção do extremo C da porção do análogo de GLP-1 e do começo do elemento de ligação. A sequência deste epitopo é Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:11) que interage com DRB1*0801. O presente invento inclui a descoberta que este epitopo pode ser eliminado através da 15 ΡΕ1641823 alteração do extremo C do análogo de GLP-1 para as seguintes sequências: Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:12); Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:13); Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:14); Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:15); Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO:16); e Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO:17).

As proteínas heterólogas de fusão do presente invento possuem uma porção Fc que deriva de IgG4 humana, mas compreende uma ou mais substituições comparativamente com a sequência humana selvagem. Como aqui usada, a porção Fc de uma imunoglobulina possui o significado normalmente atribuído ao termo na área da imunologia. Especificamente, este termo refere-se a um fragmento de anticorpo que não contem as duas regiões de ligação a antigénio (os fragmentos Fab) do anticorpo. A porção Fc consiste na região constante de um anticorpo de ambas as cadeias pesadas, as quais se associam através de interacções não covalentes e ligações dissulfureto. A porção Fc pode incluir as regiões de charneira e estende-se através dos domínios CH2 e CH3 até ao extremo C do anticorpo. A porção Fc pode ainda incluir um ou mais locais de glicosilação.

Existem cinco tipos de imunoglobulinas humanas com diferentes funções efectoras e propriedades farmacocinéticas. IgG é o mais estável dos cinco tipos, tendo uma semi-vida sérica em seres humanos de aproxima-damente 23 dias. Existem quatro subclasses de IgG (Gl, G2, G3 e G4) cada uma das quais possui diferentes funções 16 ΡΕ1641823 biológicas conhecidas como funções efectoras. Estas funções efectoras são geralmente mediadas através da interacção com o receptor Fc (FcyR) ou através da ligação de Clq e fixação do complemento. A ligação a FcyR pode conduzir a citólise celular mediada por anticorpos, enquanto a ligação a factores do complemento pode conduzir a lise celular mediada pelo complemento. Ao desenhar-se proteínas heterólogas de fusão com Fc em que a porção Fc está a ser utilizada apenas pela sua capacidade para prolongar a semi-vida, é importante minimizar qualquer função efectora. Assim, as proteínas heterólogas de fusão do presente invento derivam da região Fc de IgG4 humana devido à sua reduzida capacidade para se ligar a FcyR e a factores do complemento comparativamente com outros subtipos de IgG. No entanto, IgG4 causa depleção das células alvo em seres humanos [Issacs et al., (1996) Clin. Exp. Immunol. 106:427-433] . Devido às proteínas heterólogas de fusão do presente invento terem como alvo células beta no pâncreas para induzirem a expressão de insulina, usando uma região derivada de IgG4 numa proteína de fusão de Fc poderá iniciar-se uma resposta imune contra as células beta pancreáticas através da interacção da proteína de fusão com o receptor de GLP-1 presente nas células beta pancreáticas. Assim, a região Fc de IgG4 que é parte das proteínas heterólogas de fusão do presente invento possui substituições que eliminam a função efectora. A porção Fc de IgG4 das proteínas de fusão do presente invento pode conter uma ou mais das seguintes substituições: substituição de prolina por glutamato no resíduo 233, 17 ΡΕ1641823 alanina ou valina por fenilalanina no resíduo 234 e alanina ou glutamato por leucina no resíduo 235 (numeração EU, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD, NIH Publication n° 91-3242). Estes resíduos correspondem às posições 16, 17 e 18 em SEQ ID NO.7. Ainda, a remoção do local de glicosilação ligada em N na região Fc de IgG4 através da substituição de Asn por Ala no resíduo 297 (numeração EU) que corresponde à posição 80 de SEQ ID NO: 7 é uma outra forma de assegurar que a actividade efectora residual é eliminada no contexto de uma proteína heteróloga de fusão.

Ainda, a porção Fc de IgG4 das proteínas heterólogas de fusão do presente invento contém uma substituição que estabiliza a formação de dímeros da cadeia pesada e evita a formação de meias cadeias Fc de IgG4. As proteínas heterólogas de fusão do presente invento, de preferência, existem como dímeros ligados por ligações dissulfureto e várias interacções não covalentes. IgG4 selvagem possui um motivo Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys (SEQ ID NO: 18) que começa no resíduo 224 (numeração EU) . Este motivo num análogo de GLP-l-cadeia Fc forma ligações dissulfureto com o motivo correspondente num outro análogo de GLP-l-cadeia Fc. No entanto, a presença de serina no motivo causa a formação de proteínas de fusão de cadeias simples. O presente invento inclui proteínas de fusão Fc heterólogas em que a sequência IgG4 é ainda modificada de forma que serina na posição 228 (numeração EU) seja 18 ΡΕ1641823 substituída com prolina (resíduo de aminoácido 11 em SEQ ID NO:7). 0 resíduo de lisina C-terminal presente na molécula nativa pode ser deletado na porção Fc derivada de IgG4 das proteínas heterólogas de fusão aqui discutidas (posição 230 de SEQ ID NO:7; lisina deletada referida como des-K). As proteínas de fusão expressas nalguns tipo de células (tais como células NSO) em que a lisina é codificada pelo codão C-terminal são heterogéneas devido a uma fracção das moléculas possuir lisina como o aminoácido C-terminal e uma porção possuir a lisina deletada. A deleção é devida à actuação de proteases durante a expressão nalguns tipos de células de mamífero. Assim, para evitar esta heterogeneidade, prefere-se que as construções de expressão da fusão Fc não possuam um codão C-terminal para lisina.

Prefere-se que o aminoácido C-terminal da porção análogo de GLP-1 aqui discutido seja fundido com o extremo N da porção análogo de Fc IgG4 através de um elemento de ligação rico em glicina. A função e a estabilidade in vivo das proteínas heterólogas de fusão do presente invento podem ser optimizadas através da adição de pequenos elementos de ligação peptídicos para evitar interacções de domínios potencialmente indesejáveis. Ainda, um elemento de ligação rico em glicina proporciona alguma flexibilidade estrutural de forma que a porção análogo de GLP-1 pode interagir produtivamente com o receptor de GLP-1 nas células alvo tais como as células beta do pâncreas. No 19 ΡΕ1641823 entanto, estes elementos de ligação podem aumentar significativamente o risco de a proteína de fusão ser imunogénica in vivo. Assim, prefere-se que o comprimento não seja mais do que o necessário para prevenir interacções de domínios indesejáveis e/ou actividade biológica optimizada e/ou estabilidade. 0 elemento de ligação rico em glicinas preferido compreende a sequência: Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:8). Apesar de puderem ser usadas mais cópias deste elemento de ligação nas proteínas heterólogas de fusão do presente invento, prefere-se que uma cópia simples deste elemento de ligação seja usada para minimizar o risco de imunoge-nicidade associada à administração prolongada e repetida.

Proteínas heterólogas de fusão GLP-l-Fc preferidas do presente invento incluem as seguintes proteínas: Gly -Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P) , Gly8-Glu22-Gly -GLP-1(7-37)-lL_IgG4 (S228P, F234A, L235A), Gly8-Glu22-

Gly -GLP-1 (7-37)-iL_IgG4 (S228P, N297A), Gly8-Glu22-Gly36- GLP-1(7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A,L235A, N297A), Gly8-Glu22-Gly -GLP-l (7-37)-!.5L_IgG4 (S228P) , Gly8-Glu22-Gly36-GLP- 1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) , Gly8-Glu22-Gly36- GLP-l (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P/ N297A) , Gly8-Glu22-Gly36-GLP- 1 (?3637) _1-5L"IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A), Gly8-Glu22- GLP 37)~2L-IgG4 (S228P) , Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7- 37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A), Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-IgG4 (S228P, N297A) , e Gly8-Glu22-Gly6-GLP-1 (7-37) - 2L l9G4 (S228P' F234A, L235A, N297A) e as formas Vai8 e des-K de todas as referidas atrás. 20 ΡΕ1641823 A nomenclatura aqui usada para referir as proteínas heterólogas de fusão específicas é definida como se segue: substituições específicas na porção GLP-1 da proteína de fusão são indicadas usando o aminoácido específico a ser substituído seguido do número do resíduo. GLP-1(7-37) indica que a porção GLP-1 da proteína de fusão madura começa com His na posição 7 e termina com Gly na posição 37. L refere-se a um elemto de ligação com a sequência Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 8) . O número que precede imediatamente o L refere-se ao número de elementos de ligação que separa a porção GLP-1 da porção Fc. Um elemento de ligação especificado como 1.5L refere-se à sequência Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:19).IgG4 refere-se a um análogo da sequência Fc de IgG4 humana especificada como SEQ ID NO: 7. As substituições na porção Fc de IgG4 da proteína heteróloga de fusão estão indicadas entre parêntesis. O aminoácido selvagem é especificado pela sua abreviatura habitual seguido do número da posição no contexto da totalidade da sequência de IgG4, usando o sistema de numeração EU, seguido do aminoácido a ser substituído na posição especificada pela sua abreviatura comum.

Ainda que as proteínas heterólogas de fusão do presente invento possam ser produzidas por uma variedade de métodos diferentes, devido ao tamanho da proteína de fusão, são preferidos os métodos recombinantes. Para fins do 21 ΡΕ1641823 presente invento, como descrito e reivindicado aqui, são definidos abaixo os termos e abreviaturas gerais da biologia molecular. "Par de bases" ou "pb" como aqui usado refere-se a DNA ou a RNA. As abreviaturas A, C, G e T correspondem às formas 5'-monofosfato de desoxirribonucleósidos (desoxi)-adenosina, (deso)citidina, (deso)guanosina e timidina, respectivamente, quando ocorrem nas moléculas de DNA. As abreviaturas U, C, G e A correspondem à formas de 5'-monofosfato dos ribonucleósidos uridina, citidina, guanosina e adenosina, respectivamente, quando ocorrem nas moléculas de RNA. No DNA de cadeia dupla, par de bases pode referir-se a um emparelhamento de A com T ou de C com G. Num heteroduplex DNA/RNA par de bases pode referir-se a um emparelhamento de A com U ou de C com G. (Ver a definição de "complementar", infra.) "Digestão" ou "restrição" de DNA refere-se à clivagem catalítica do DNA com uma enzima de restrição que actua apenas em determinadas sequências no DNA ("endonu-cleases específicas de sequência"). As várias enzimas de restrição usadas aqui estão comercializadas e as suas condições de reacção, cofactores e outros requisitos foram usados como será do conhecimento dos familiarizados com a área. Os tampões adequados e as quantidades de substrato para as enzimas de restrição particulares são especificados pelo fabricante ou podem ser facilmente encontrados na literatura. 22 ΡΕ1641823 "Ligação" refere-se ao processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico de cadeia dupla. A menos que de outra forma seja indicado, a ligação pode ser conseguida, com tampões e condições conhecidos, com uma ligase de DNA, como seja a ligase de DNA de T4. "Plasmídeo" refere-se a um elemento genético extracromossómico (geralmente) auto-replicativo. "Vector de clonagem de DNA recombinante" como aqui usado refere-se a qualquer agente de replicação autónoma, incluindo mas não estando limitado a plasmideos e fagos, compreendendo uma molécula de DNA a que um ou mais segmentos de DNA adicionais podem ou foram adicionados. "Transcrição" refere-se ao processo pelo qual a informação contida numa sequência nucleotidica de DNA é transferida para uma sequência de RNA complementar. "Transfecção" refere-se à internalização de um vector de expressão por uma célula hospedeira quer algumas sequências codificadoras sejam ou não, de facto, expressas. São conhecidos numerosos métodos de transfecção, por exemplo coprecipitação com fosfato de cálcio, transfecção com lipossomas e electroporação. 0 sucesso da transfecção é geralmente reconhecido quando qualquer indicação do funcionamento deste vector ocorre dentro da célula hospedeira. 23 ΡΕ1641823 "Transformação" refere-se à introdução de DNA num organismo de forma que o DNA seja replicável, como elemento extracromossómico ou através da integração no cromossoma. Os métodos de transformação de hospedeiros bacterianos e eucarióticos são conhecidos na área, muitos destes métodos, tais como injecção nuclear, fusão de protoplastos ou tratamento com cálcio usando cloreto de cálcio estão sumarizados em J. Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989). De um modo geral, quando da introdução de DNA em levedura o termo transformação é usado como sinónimo do termo transfecção. "Tradução" como aqui usado refere-se ao processo pelo qual a informação genética de RNA mensageiro (mRNA) é usada para especificar e dirigir a síntese de uma cadeia polipeptídica. "Vector" refere-se a um composto de ácido nucleico usado para a transfecção e/ou transformação de células na manipulação de genes portadores de uma sequência polinucleotídica correspondendo a moléculas de proteína adequadas que, quando combinadas com as sequências de controlo adequadas, confere propriedades específicas à célula hospedeira a ser transfectada e/ou transformada. Plasmídeos, vírus e bacteriófagos são vectores adequados. Os vectores artificiais são construídos cortando e ligando moléculas de DNA de diferentes fontes com enzimas de restrição e ligases. 0 termo "vector" como aqui usado inclui vectores de clonagem de DNA recombinante e vectores de expressão de DNA recombinante. 24 ΡΕ1641823 "Complementar" ou "complementaridade", como aqui usado, refere-se a pares de bases (purinas e pirimidinas) que se associam através de ligações de hidrogénio num ácido nucleico de cadeia dupla. Os pares de bases que se seguem são complementares: guanina e citosina; adenina e timina; e adenina e uracilo. "Sequencia iniciadora refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona como um substrato de iniciação de elongação enzimática ou sintética.

"Promotor" refere· dirige a transcrição de DNA "Sonda" refere-se ou um fragmento do mesmo, composto de ácido nucleico. "Sequência líder" aminoácidos que pode ser quimicamente para produzir interesse. -se a uma sequência de DNA que para RNA. a um composto de ácido nucleico o qual híbrida com um outro refere-se a uma sequência de removida enzimaticamente ou o polipéptido pretendido com "Sequência sinal de secreção" refere-se a uma sequência de aminoácidos geralmente presente na região N-terminal de um polipéptido maior que funciona para iniciar a associação daquele polipéptido aos compartimentos de membranas celulares, como o retículo endoplasmático, e 25 ΡΕ1641823 secreção daquele polipéptido através da membrana plasmática.

As proteínas de IgG4 humana selvagem podem ser obtidas a partir de uma variedade de fontes. Por exemplo, estas proteínas podem ser obtidas a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de células que expressam o mRNA com interesse num nível detectável. As bibliotecas podem ser testadas com sondas desenhadas usando a sequência de DNA ou proteica publicada para a proteína particular com interesse. Por exemplo, as regiões constantes da cadeia leve ou da cadeia pesada de imunoglobulina estão descritas em Adams, et al. (1980)Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:7862-7862; Falkner et al. (1982) Nature 298:286-288; e Morrison et al. (1984) Ann. Ver. Immunol. 2:239-256. O rastreio de uma biblioteca de cDNA ou genómica com a sonda seleccionada pode ser efectuado usando procedimentos convencionais, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). Um meio alternativo de isolar um gene codificador de uma proteína imunoglobulina é usar metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)] As sequências iniciadoras de PCR podem ser projectadas com base em sequências publicadas. 26 ΡΕ1641823

De um modo geral, as sequências selvagens de tamanho completo, clonadas a partir de uma biblioteca particular, podem servir como matriz para criar os fragmentos de análogo Fc de IgG4 do presente invento que mantêm a capacidade de conferir uma semi-vida no plasma mais longa ao análogo de GLP-1 que faz parte da proteína de fusão. Os fragmentos de análogo Fc de IgG4 podem ser gerados usando técnicas de PCR com sequências iniciadoras desenhadas para hibridarem com sequências que correspondem aos extremos pretendidos do fragmento. As sequências iniciadoras de PCR podem também ser desenhadas para criar locais de enzimas de restrição para facilitar a clonagem em vectores de expressão. DNA codificador dos análogos GLP-1 do presente invento pode ser feito através de uma variedade de métodos diferentes incluindo métodos de clonagem como os descritos atrás, assim como o DNA sintetizado quimicamente. A síntese química pode ser atraente considerando o tamanho pequeno do péptido codificado. A sequência de aminoácidos de GLP-1 foi publicada assim como a sequência do gene pré-proglucagão. [Lopez, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei., USA 80:5485-5489/ Bell, et al. (1983) Nature, 302:716-718/ Heinrich, G., et al. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181/ Ghiglione, M., et al., 91984) Diabetologia 27:599-600]. Assim, as sequências iniciadoras podem ser projectadas com base na sequência nativa para gerar DNA codificador dos análogos GLP-1 aqui descritos. 27 ΡΕ1641823 0 gene codificador de uma proteína de fusão pode ser então construído através da ligação de DNA codificador de um análogo de GLP-1 em grelha com o DNA codificador das proteínas Fc de IgG aqui descritas. 0 DNA codificador de dos fragmentos de GLP-1 selvagem e de Fc de IgG4 podem ser mutados antes da ligação ou no contexto de um cDNA codificador dum proteína de fusão completa. Uma variedade de técnicas de mutagénese é conhecida na área. 0 gene codificador do análogo de GLP-1 e o gene codificador da proteína do análogo Fc de IgG4 podem também ser ligados em grelha através de um DNA rico em G codificador de um péptido de ligação. Uma sequência de DNA preferida, codificadora de uma das proteínas heterólogas de fusão preferidas do presente invento, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P,F234A, L235A, des K), é apresentada como SEQ ID NO:20:

CACGGCGAGGGCACCTTCAÒCTCCGACGTGTCCTCCTATCTCGAGGAGCAGG

CCGCCAAGGAATTCATCGCCTGGCTGGTGAAGGGCGGCGGCGGTGGTGGTGG

CTCCGGAGGCGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGCGCTGAGTCCAAATATGGT

CCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTT

CCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG

TCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAA

CTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG

GAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA

GGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTC

CCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGC

CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT

CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT

GGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT

GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGC

AGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT (SEQ ID N0:20) 28 ΡΕ1641823

As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão ou clonagem aqui descritos para a produção de uma proteína heteróloga de fusão e cultivadas em meio nutritivo convencional, modificado conforme apropriado para a indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes codificadores das sequências pretendidas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e similares, podem ser seleccionadas pelos familiarizados com a área sem necessidade de mais experimentação. Em geral, os princípios, protocolos e técnicas práticas para maximização da produtividade das culturas celulares podem ser encontrados em "Mammalian Cell Biotechnology: A Praticai Approach", M. Buttler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook, et al., supra. Os métodos de transfecção são conhecidos dos familiarizados com a área, por exemplo CaP04 e electro-poração. Aspectos gerais de transformações de sistemas de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. N° 4399216. As transformações de leveduras são tipicamente realizadas de acordo com o método de van Solingen et al., J Bact. 130(2):946-7 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76(8):3829-33 (1979). No entanto, outros métodos para a introdução de DNA nas células, como seja por microinjecção no núcleo, electro-poração, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões, e.g., polibreno ou poliomitina, podem ser igualmente usados. Para várias técnicas de transformação de células de mamífero, ver Keown, et al., 29 ΡΕ1641823

Methods in Enzymology 185:527-37 (1990) e Mansour et al., Nature 336(6197):348-52 (1988). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ácido nucleico {e.g., DNA) nos vectores incluem células de levedura ou de eucariotas superiores.

Os micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros adequados para clonagem ou expressão dos vectores das proteínas de fusão. Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo hospedeiro eucariota inferior normalmente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe [Beach e Nurse, Nature 290:140-3 (1981); EP 139383 publicada em 2 de Maio 1995]; hospedeiros Muyveromyces [Patente U.S. N° 4943529; Fleer et al., Bio/Technology 9(10):968-75 (1991)] como seja, e.g., K lactis (MW98 -8C, CBS683, CBS4574) [de Louvencourt et al. , J. Bacteriol. 154(2):737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12,424) , K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178) , K. waltii (ATCC 56, 500), K. drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg et al. , Bio/Technology 8(2) : 135-9 (1990)]; K. thermotoierans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070) [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28(4): 265-78 (1988)]; Candida;

Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa [Case, et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces como seja Schwanniomyces occidentulis (EP 394,538 publicada em 31 de Outubro 1990); e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, 30 ΡΕ1641823

Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de Janeiro, 1991), e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilbum, et al., Gene 26(2-3): 205-21(1983);

Yelton, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81(5): 1470-4 (1984) ] e A. niger [Kelly and Hynes, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985) ]. As leveduras metilotrópicas são seleccionadas dos géneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotoruia. Uma lista de espécies especificas que são exemplos desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982). Células hospedeiras adequadas para a expressão das proteínas de fusão do presente invento derivam de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insecto tais como S2 de Drosophila S2 e Spodoptera Sp, Spodoptera High 5, assim como células vegetais. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de mieloma NSO, células de ovário de hamster chinês (CHO), SP2 e COS. Exemplos mais específicos incluem a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhas de rim embrionário humano [células 293 ou 293 subclonadas para crescerem em suspensão, Graham, et al., J. Gen Virol., 36(1): 59-74 (1977)]; células de ovário de hamster chinês/-DHFR [CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]; células de Sertoli de murganho [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; células 31 ΡΕ1641823 de pulmão humano (W138. ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8 0 65) ; e tumor mamário de murganho (MMT 060562, ATCC CCL51). Uma linha celular preferida para a produção das proteínas de fusão de Fc do presente invento é a linha celular de mieloma NSO disponível na European Collection of Cell Cultures (ECACC, catálogo #85110503) e descrita em Galfre, G. e Milstein, C. ((1981) Methods in Enzymology 73(13) :3-46; e Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N.Y., N.Y.).

As proteínas de fusão do presente invento podem ser produzidas directamente por via recombinante ou como uma proteína tendo uma sequência sinal ou outras sequências adicionais que criam um local de clivagem específico no extremo N da proteína de fusão madura. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vector ou pode ser uma parte do DNA codificador da proteína de fusão que é inserido no vector. Para a secreção em levedura, a sequência sinal pode ser, e.g., a sequência líder da invertase de levedura, a sequência líder do factor alfa (incluindo líderes do factor cc de Saccharomyces e de Kluyveromyces, o último descrito na Patente US N° 5010182) ou o líder da fosfatase ácida, o líder da glucoamilase de C. albicans (EP 362179) ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão em células de mamífero, as sequências sinal de mamífero podem ser usadas para dirigir a secreção da proteína, tais como as sequências sinal de polipéptidos secretados da mesma espécie ou de uma espécie relacionada, assim como líderes secretórios virais. 32 ΡΕ1641823

Tanto os vectores de expressão como de clonagem possuem uma sequência de ácido nucleico que permite ao vector replicar-se numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Os vectores de expressão e clonagem tipicamente possuirão um gene de selecção, também designado uma marca seleccionável. Genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., neomicina, metotrexato ou tetraci-clina, (b) complementam deficiências autotróficas ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos, e.g., o gene codificador da D-alanina racemase para Bacilos.

Um exemplo de tais marcas, seleccionáveis adequadas para células de mamífero, são as que permitem a identificação de células competentes possuidoras do ácido nucleico codificador da proteína de fusão, como seja DHFR ou cinase de timidina. Uma célula hospedeira adequada quando é empregue DHFR selvagem é a linha celular CHO deficiente em actividade DHFR, preparada e propagada como descrito [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad Sei. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. Um gene de selecção adequado para usar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb, et al., Nature 282(5734): 39-43 (1979); Kingsman, et al, Gene 7(2): 141-52 (1979); Tschumper, et al., Gene 10(2): 157-66 (1980)]. O gene trpl proporciona uma marca de selecção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade para crescer em triptofano, 33 ΡΕ1641823 por exemplo, ATCC N° 44076 ou PEPC1 [Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)].

Os vectores de expressão e clonagem geralmente possuem um promotor operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico codificadora da proteína de fusão para dirigir a síntese de mRNA. Os promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são conhecidos. Exemplos de sequências promotoras adequadas para usar com hospedeiros de levedura incluem os promotores da 3-fosfoglicerato cinase [Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255(24): 12073-80 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17(23): 4900-7 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexo-cinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucocinase. Outros promotores de levedura, os quais são promotores induzíveis tendo a vantagem adicional da transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões de promotor da álcool-desidrogenase 2, isoci-tocrómio C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e de galactose. Vectores e promotores adequados pata usar na expressão em levedura estão ainda descritos em EP 73657. A transcrição do mRNA codificador da proteína de fusão a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero pode ser controlada, por exemplo, por 34 ΡΕ1641823 promotores obtidos a partir de genomas de vírus tais como vírus do polioma, poxvírus das galinhas, adenovírus (como seja adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e vírus símio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos, e.g., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina e a partir de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira. A transcrição de um polinucleótido codificador de uma proteína de fusão por eucariotas superiores pode ser aumentada através da inserção de uma sequência estimuladora no vector. Os estimuladores são elementos de actuação em cis do DNA, geralmente entre cerca de 10 e 300 pb, os quais actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. Actualmente, são conhecidas muitas sequências estimuladoras para genes de mamífero (globina, elastases, albumina, a-cetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, utili-zar-se-á um estimulador de um vírus de células eucarió-ticas. Exemplos incluem o estimulador do SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o estimulador do promotor precoce de citomegalovírus, o estimulador de polioma no lado tardio da origem de replicação e os estimuladores de adenovírus. O estimulador pode ser colocado no vector numa posição 5' ou 3' relativamente à sequência codificadora da proteína de fusão mas está, de preferência, localizado numa posição 5' relativamente ao promotor. 35 ΡΕ1641823

Os vectores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, insectos, vegetais, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais sequências estão normalmente disponíveis nas regiões não traduzidas 5' e ocasionalmente nas 3' de DNAs eucarióticos ou virais ou cDNAs. Estas regiões possuem segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA codificador da proteína de fusão. Várias formas de uma proteína de fusão podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou a partir de lisados das células hospedeiras. Se ligada a membranas, pode ser libertada a partir da membrana usando uma solução de detergente adequada (e.g., Triton X-100) ou por clivagem enzimática. As células empregues na expressão de uma proteína de fusão podem ser destruídas por vários métodos físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, sonicação, disrupção mecânica ou agentes de lise celular.

Uma vez as proteínas heterólogas de fusão do presente invento expressas na célula hospedeira adequada, os análogos podem ser isolados e purificados. Os procedimentos que se seguem são exemplos de processos de purificação adequados: fraccionamento em carboximetilcelu-lose; filtração em gel como seja Sephadex G-75; resina de 36 ΡΕ1641823 permuta aniónica como seja DEAE ou Mono-Q; permuta catió-nica como CM ou Mono-S; colunas de quelatação de metais para ligação das formas marcadas com epitopos do do polipéptido; HPLC de fase reversa; cromatofocagem; gel de sílica; precipitação com etanol; e precipitação com sulfato de amónio. Podem ser empregues vários métodos de produção de proteína e tais métodos são conhecidos na área e estão descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) e Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Os passos de purificação seleccionados dependerão da natureza do processo de produção usado e da proteína de fusão particular produzida. Por exemplo, as proteínas de fusão compreendendo um fragmento Fc podem ser eficazmente purificadas usando uma matriz de afinidade de Proteína A ou de Proteína G. Podem ser usados tampões de pH baixo ou alto para eluir a proteína de fusão da matriz de afinidade. As condições de eluição suave ajudarão na prevenção de desnaturação irreversível da proteína de fusão.

As proteínas heterólogas de fusão do presente invento podem ser formuladas com um ou mais excipitentes. As proteínas de fusão do presente invento podem ser combinadas com um tampão farmaceuticamente aceitável e o pH ajustado para proporcionar estabilidade aceitável e um pH aceitável para administração, como seja para administração parentérica. Facultativamente, um ou mais agentes antimi-crobianos farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados. Agentes microbianos farmaceuticamente aceitáveis 37 ΡΕ1641823 preferidos são o meta-cresol e o fenol. Um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser adicionados para ajustar a força iónica ou tonicidade. Um ou mais exci-pientes podem ser adicionados para ajustar a isotonicidade da formulação. A glicerina é um exemplo de um excipiente de ajuste da isotonicidade. Farmaceuticamente aceitável significa adequado para administração a um ser humano ou a outro animal e assim não contem elementos tóxicos ou contaminantes indesejáveis e não interfere com a actividade dos compostos activos aqui descritos.

As proteínas heterólogas de fusão do presente invento podem ser formuladas como uma formulação em solução ou como pó liofilizado que pode ser reconstituído com um diluente adequado. Uma forma de dosagem liofilizada é uma em que a proteína de fusão seja estável, com ou sem capacidade para manter o pH da solução durante o tempo de prateleira pretendido do produto reconstituído. Prefere-se que a solução compreendendo as proteínas heterólogas de fusão aqui discutidas, antes da liofilização, seja substancialmente isotónica para permitir a formação de soluções isotónicas após reconstituição.

Uma forma de sal farmaceuticamente aceitável das proteínas heterólogas de fusão do presente invento está no âmbito do invento. Os ácidos normalmente empregues para formar sais de adição de ácido são os ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido hidroiódico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico e similares e 38 ΡΕ1641823 ácidos orgânicos tais como ácido p-toluenossulfónico, ácido metanossulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succinico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido acético e similares. Os sais de adição de ácido são os formados com ácidos minerais tais como ácido clorídrico e ácido bromídrico.

Os sais de adição de bases incluem os derivados de bases inorgânicas, tais como hidróxidos de metais alcalinos ou de metais alcalinos terrosos, carbonatos, bicarbonatos e similares. Tais bases úteis na preparação de sais deste invento incluem assim hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amónio, carbonato de potássio e similares.

As proteínas heterólogas de fusão do presente invento possuem actividade biológica. A actividade biológica refere-se à capacidade da proteína de fusão se ligar e activar o receptor de GLP-1 in vivo e induzir uma resposta. As respostas incluem, mas não estão limitadas a secreção de insulina, supressão do glucagão, inibição do apetite, perda de peso, indução da saciedade, inibição da apoptose, indução da proliferação de células beta pancreáticas e diferenciação das células beta pancreáticas. Um número representativo de proteínas de fusão GLP-1 foram testadas pela sua actividade in vitro assim como in vivo. Os Exemplos 1 e 2 proporcionam actividade in vitro baseada na capacidade da proteína de fusão para interagir com o receptor de GLP-1 e activá-lo. Em ambas as séries de 39 ΡΕ1641823 experiências, foram usadas as células HEK293 expressando o receptor de GLP-1 humano. A activação do receptor de GLP-1 nestas células causa a activação de adenilil ciclase que, por sua vez, induz a expressão de um gene repórter controlado por um elemento de resposta a AMP cíclico (CRE). 0 Exemplo 1 proporciona dados em que o gene repórter é o da beta lactamase e o exemplo 2 (tabela 2) proporciona dados em que o gene repórter é o da luciferase. 0 Exemplo 3 proporciona dados gerados após administração a ratos de uma das proteínas heterólogas de fusão do presente invento. No seu conjunto, os dados mostram que as proteínas de fusão são capazes de se ligarem ao receptor de GLP-1 e activá-lo e parecem mais potentes in vitro que Val8-GLP-1(7-37)OH. Ainda, os dados gerados em ratos indicam que as proteínas de fusão são activas in vivo e possuem uma semi-vida mais longa do que GLP-1 nativa. A administração de proteínas de fusão heterogéneas pode ser por qualquer via conhecida como sendo eficaz pelo médico. A administração parentérica periférica é um desses métodos. A administração parentérica é normalmente considerada na literatura médica como a injecção de uma forma de dosagem no corpo através de uma seringa estéril ou de outro dispositivo mecânico como seja uma bomba de infusão. As vias parentéricas periféricas podem incluir as vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal.

As proteínas heterólogas de fusão do presente 40 ΡΕ1641823 invento podem também ser adequadas à administração pelas vias oral, rectal, nasal ou respiratória inferior, as quais são vias não parentéricas. Destas vias não parentéricas, a via respiratória inferior e a via oral são as preferidas.

As proteínas de fusão do presente invento podem ser usadas para tratar uma larga variedade de doenças e condições. As proteínas de fusão do presente invento exercem os seus efeitos biológicos principalmente actuando num receptor referido como o "receptor de GLP-1". Indivíduos com doenças e/ou condições que respondem favoravelmente à estimulação do receptor de GLP-1 ou à administração de compostos GLP-1 podem assim ser tratados com as proteínas de fusão GLP-1 do presente invento. Estes indivíduos são referidos como "necessitados de tratamento com compostos de GLP-1" ou "necessitados de estimulação do receptor de GLP-1". Estão incluídos os indivíduos com diabetes não dependentes de insulina, diabetes dependentes de insulina, choque (ver WO 00/16797), enfarte do miocárdio (ver WO 98/08531), obesidade (ver WO 98/19698), alterações catabólicas após cirurgia (ver Patente U.S. N° 6006753), dispepsia funcional e síndrome do intestino irritável (ver WO 99/64060). Estão igualmente incluídos os indivíduos necessitados de tratamento profilático com um composto de GLP-1, e.g., indivíduos em risco de desenvolver diabetes não dependentes de insulina (ver WO 00/07617). Os indivíduos com intolerância à glucose ou que não digerem glucose, os indivíduos cujo peso do corpo é cerca de 25% acima do peso normal para a altura e massa corporal do indivíduo, os indivíduos com uma pancreatectomia parcial, 41 ΡΕ1641823 os indivíduos com um ou mais pais com diabetes não dependentes de insulina, indivíduos que tiveram diabetes gestacional e indivíduos que tiveram pancreatite aguda ou crónica estão em risco de desenvolver diabetes não dependentes de insulina.

Uma quantidade eficaz das proteínas de fusão GLP-1-Fc aqui descritas é a quantidade que resulta num efeito terapêutico e/ou profilático pretendido, sem causar efeitos secundários inaceitáveis quando administrados a um indivíduo necessitado da estimulação do receptor de GLP-1. Um "efeito terapêutico pretendido" inclui um ou mais dos seguintes: 1) uma melhoria dos sintomas associados com a doença ou condição; 2) um atraso no estabelecimento dos sintomas associados à doença ou condição; 3) aumento da longevidade comparativamente com a ausência do tratamento; e 4) maior qualidade de vida comparativamente com a ausência do tratamento. Por exemplo, uma "quantidade eficaz" de uma proteína de fusão GLP-l-Fc para o tratamento de diabetes é a quantidade que resultará num maior controlo da concentração de glucose no sangue do que na ausência de tratamento, resultando assim num atraso no estabelecimento de complicações diabéticas tais como retinopatia, neuropatia ou doença renal. Uma "quantidade eficaz" da proteína de fusão GLP-l-Fc para a prevenção de diabetes é a quantidade que retardará, comparativamente com a ausência de tratamento, o estabelecimento de níveis elevados de glucose no sangue que requerem tratamento com fármacos anti-hipoglicémicos tais como sulfonil-ureias, tiazolidino-dionas, insulina e/ou bisguanidinas. 42 ΡΕ1641823 A dose de proteína de fusão eficaz para normalizar a glucose no sangue de um doente dependerá de uma série de factores, entre os quais estão incluídos, sem limites, o sexo, o peso e a idade de um indivíduo, a gravidade da incapacidade para regular a glucose do sangue, a via de administração e biodisponibilidade, o perfil farmacocinético da proteína de fusão, a potência e a formulação. As doses podem ser na gama de 0,01 a 1 mg/kg de peso do corpo, de preferência na gama de 0,05 a 0,5 mg/kg de peso de corpo.

Prefere-se que as proteínas de fusão do presente invento sejam administradas uma vez cada duas semanas e uma vez por semana. Dependendo da doença a ser tratada, pode ser necessário administrar a proteína de fusão mais frequentemente, como seja duas a três vezes por semana. 0 presente invento será agora descrito, apenas como exemplo não limitante, com referência aos Exemplos que se seguem.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Ensaio in vitro de activação do receptor de GLP-1 Células HEK-293 expressando o receptor de GLP-1 humano, usando um sistema CRE-BLAM, foram semeadas a 20000- 43 ΡΕ1641823 40000 células/alvéolo/100 μΐ de meio DMEM com 10% FBS numa placa negra, de fundo transparente, de 96 alvéolos revestida com poli-d-lisina. No dia após sementeira, o meio foi retirado e adicionados 80 μΐ de meio DMEM sem plasma. No terceiro dia após sementeira, foram adicionados 20 μΐ de meio DMEM sem plasma com 0,5% BSA contendo diferentes concentrações das diferentes proteínas heterólogas de fusão GLP-l-Fc a cada alvéolo para gerar uma curva de dose-resposta. De um modo geral, catorze diluições contendo entre 3 e 30 nanomolar da proteína heteróloga de fusão GLP-l-Fc foram usadas para gerar uma curva de dose-resposta a partir da qual puderam ser determinados os valores de EC50· Após 5 horas de incubação com a proteína de fusão, 20 μΐ do substrato da β-lactamase (CCF2/AM, PanVera LLC) foram adicionados e a incubação continuou durante 1 hora, altura em que a fluorescência foi determinada num citofluorimetro. O ensaio está ainda descrito em Zlokarnik, et al. (1998), Science, 278:84-88. Várias proteínas de fusão GLP-l-Fc foram testadas e os valores de EC50 estão representados na Tabela 1. Os valores são relativos aos valores determinados para Val8-GLP-1(7-37)OH que correu paralelamente como um controlo interno em todas as experiências.

Tabela 1

Composto

Actividade DP 100%

Vai -GLP-1:

Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) : Gly-Glu22-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A): Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) : 301% 99 314% 45 468% 120 35

Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) : 441% 44 ΡΕ1641823

Exemplo 2 - Ensaio in vítro de activação do receptor de GLP-1 Células HEK-293 a expressar estavelmente o receptor de GLP-1 humano, usando um sistema CRE-luciferase, foram semeadas a 30000 células/alvéolo/80 μΐ de meio DMEM F12 com baixo teor de soro em placas de 96 alvéolos. No dia após sementeira, aliquotas de 20 μΐ da proteína a testar dissolvida em 0,5% BSA foram misturadas e incubadas com as células durante 5 horas. De um modo geral, foram preparadas 12 diluições contendo entre 3pM e 3 nM numa concentração de 5X para cada proteína a testar antes da adição às células para gerar uma curva de dose-resposta a partir da qual foram determinados valores de EC50. Após incubação, 100 μΐ do reagente Luciferase foi adicionado directamente a cada placa e misturado suavemente durante 2 minutos. As placas foram colocadas num luminómetro Tri-lux e calculada a luz emitida resultante da expressão de luciferase. Várias proteínas de fusão GLP-l-Fc foram testadas e os valores de EC50 estão apresentados na Tabela 2. Os valores são relativos aos valores determinados para Val8-GLP-1(7-37)OH que correu como um controlo interno em todas as experiências. Devido às proteínas de fusão testadas abaixo serem dímeros, os valores foram corrigidos tendo em consideração uma diferença na molaridade de 2 vezes. ΡΕ1641823 45

Tabela 2

DP 240 43 128 62 140

Composto Actividade

Val8-GLP-1: 100% Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A): 535% Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A): 595% Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) : 1119%

Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A): 398% Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) : 417%

Exemplo 3 Teste de tolerância à glucose intra-venosa em ratos A proteína de fusão Fc, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-L-IgG4 (S228P,F234A,L235A), foi avaliada num teste de tolerância à glucose intravenosa (IVGTT) em ratos. Pelo menos quatro ratos foram incluídos em cada um dos três grupos. O Grupo I recebeu veículo (tabela 3), o Grupo II recebeu 1,79 mg/kg de Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-L-IgG4 (S228P,F234A,L235A) como uma única injecção subcutânea (tabela 4) e o Grupo III recebeu 0,179 mg/kg de Gly8-Gku22-Gly36-GLP-1 (7-37)-L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) como uma única injecção subcutânea (tabela 5). Os ratos foram injectados subcutaneamente na manhã do Dia 1. Vinte e quatro horas após a primeira injecção, 1 μΐ de glucose (D50) por grama de peso de corpo de rato foi infundido como um bólus. Foram 46 ΡΕ1641823 retiradas amostras de sangue aos 2, 4, 6, 10, 20 e 30 minutos após a infusão de glucose como bólus.

Tabela 3

Veiculo: Rato 1 : Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5 Média DP Insulina AUC (ng*min/mL) 0-2 11 9, 4 7 11 9, 6 2-4 18, 1 9,7 5, 6 10, 6 8, 8 4-6 13,4 7 3,4 9, 6 5,9 6-10 7,9 3,5 2,5 6 2,9 10-20 3,7 3 2,4 3 2,4 20-30 2 0 0 0 2,4 soma 56, 1 32, 6 20, 9 40,2 32 36, 4 5,8 Tabela 4 GLP-l-Fc (1,79 mg/kg) Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5 Média DP Insulina AUC (ng"min/mL) 0-2 12,3 17,4 16 14 13 2-4 21,9 13,3 13, 2 13, 9 13, 6 4-6 16,8 6, 5 9,8 11, 1 11,7 6-10 7, 6 3, 8 9,2 5, 8 7,4 10-20 0 0 3, 2 5, 6 20-30 0 0 0 0 0 soma 61, 6 41 48,2 48 51,3 50 3,4 47 ΡΕ1641823

Tabela 5 GLP-l-Fc (0:17 9mg/kg) Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Insulina AUC (ng*min \/mL) Média DP 0-2 14,4 29, 2 25, 4 23,2 2-4 13, 8 26,3 21,2 21,8 4-6 11,2 19, 4 16,4 15, 7 6-10 6, 4 10, 6 10,5 8 10-20 3, 6 5, 8 5, 2 5 20-30 0 0 0 0 soma 49, 4 91,3 78,7 73,7 78,7 8,7

Exemplo 4 Estudo farmacocinético após uma única injecção subcutânea em macacos cinomolqos

Foi realizado um estudo para caracterizar a farmacocinética (PK) da proteína de fusão Fc, Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-L-IgG4 (S228P,F234A,L235A) , quando administrada como uma injecção subcutânea (SC) de 0,1 mg/kg a macacos cinomolgos machos. O anticorpo RIA é específico da porção média de GLP. ELISA usa um anticorpo de captura específico do extremo N e um anticorpo de detecção específico de Fc. As concentrações no plasma resultantes de ELISA e de RIA foram usadas para determinar os valores dos parâmetros farmacocinéticos representados.

Na Tabela 6 está resumida uma representação dos valores do parâmetro PK resultantes. Uma única dose SC de 48 ΡΕ1641823 PK do RIA está associado a um Cmax médio de 446, 7 ng/ml com um correspondente Tmax de 17,3 horas. A semi-vida média de eliminação é de aproximadamente 79,3 horas (3,3 dias). 0 PK do ELISA está associado a um Cmax médio de 292,2 ng/ml com um correspondente Tmax de 16,7 horas. A semi-vida média de eliminação é de aproximadamente 51,6 horas (2,2 dias).

Tabela 6 RIA Dose Animais# C a ^max m b -*-max AUC0- c ti/2d CL/Fe Vss/Ff (mg/kg) (ng/ml) (h) (ng*h/ml) (h) (ml/h/kg) (ml/kg) 0,1 96051 461, 0 4,0 37770,5 81, 0 2,7 309,2 96071 430, 0 24,0 43150,2 74,2 2,3 248,1 96091 449,0 24,0 62271,1 82,9 1,6 191, 9 RIA Média 446,7 17,3 47730,6 79,3 2,2 249, 8 DP 15,6 11,5 12876,5 4,5 0, 5 58,7 ELISA 96051 315,4 2,0 9062,3 55,2 11,0 879,4 96071 289,4 24,0 16653,0 50,3 6, 0 436, 0 96091 271,9 24,0 19907,4 49,3 5,0 357,0 ELISA Média 292,2 16,7 15207,6 51,6 7,3 557,5 DP 21,9 12,7 5565,2 3,2 3,2 281,6 Concentração máxima observada no plasma. b Tempo de concentração máxima observada no plasma. c Área debaixo da curva concentração no plasma- tempo entre 0 e o infinito. d semi-vida de eliminação. e Eliminação total do corpo em função da biodisponibilidade. £ Volume de distribuição em função da biodisponibilidade. DP = desvio padrão. 49 ΡΕ1641823

Exemplo 5 Avaliação da formação potencial de anticorpos após injecções subcutâneas repetidas.

As amostras de soro designadas de macacos cinomolgos foram testadas relativamente à formação de anticorpos contra Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 ) -L-IgG4 (S228P,F234A,L235A) usando um formato de ELISA directo. As placas de microtitulação foram revestidas com Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1(7-37)-L-IgG4 (S228P,F234A,L235A) a uma concentração de 0,1 pg/ml. As amostras de soro de macaco foram diluídas 50, 500, 1000 e 5000 vezes em solução de bloqueio e 0,05 ml de amostra/alvéolo foi incubado aproximadamente uma hora. O anticorpo secundário, cabra <Fab'2 humano>peroxidase (com 75% de reactividade cruzada com humano), foi diluído 10000 vezes em tampão de bloqueio e adicionado a 0,05 ml/alvéolo e incubado aproximadamente uma hora. A revelação de cor usando como substrato tetrame-tilbenzidina (TMB) foi lida a uma densidade óptica de 450 nm-630 nm. Foram feitas médias de duplicados das leituras. Um anticorpo contra GLP-1 foi usado como controlo positivo e o conjugado cabra<coelho>(H+L)-peroxidase é o anticorpo secundário usado na detecção. Amostras de soro foram colhidas antes da dosagem, às 24 horas após a segunda dose e 168 horas após a primeira e segunda doses SC para uma avaliação de potencial imunogenicidade. A presença de títulos de anticorpos contra GBE22-CEX-L-hIgG4 foi interpretada por comparação com as amostras de soro antes da dosagem e do controlo positivo. Na tabela 7 está apresentada uma representação dos resultados. ΡΕ1641823 50

Tabela 7

Dose 1 Animal# Controlo positivo 107774 107777 107779 107780 Amostra Pré- 168h Pré- 168h Pré- 168h Pré- 168h Tempo: dose dose dose dose 50X 2,854 0,268 0,268 0,160 0.128 0,144 0,152 0,264 0,224 500x 2,270 0,117 0,133 0,052 0,069 0,065 0,061 0,067 0,061 lOOOx 1,610 0,091 0,075 0,034 0,051 0,047 0,045 0,138 0,049 5000x 0,525 0,056 0,048 0,032 0,037 0,029 0,033 0,051 0, 039 Dose 2 Controlo 107774 107777 107779 107780 Animal# positivo Amostra Pré- 24h Pré- 24h Pré- 24h Pré- 24h Tempo: dose dose dose dose 50x 3,056 0,298 0,231 0,164 0,159 0,227 0,176 0,211 0,192 500x 2,247 0,120 0,119 0,048 0,045 0,061 0, 060 0, 056 0, 057 lOOOx 1,673 0,090 0,086 0,039 0,041 0,046 0, 045 0, 043 0, 048 5000x 0,534 0,039 0,042 0,030 0,034 0,033 0, 036 0, 033 0, 034 Dose 2 Controlo 107774 107777 107779 107780 Animal# positivo Amostra Pré- 168h Pré- 168h Pré- 168h Pré- 168h Tempo: dose dose dose dose 50x 3,075 0,413 0,270 0,174 0,182 0,185 0,190 0,224 0,191 500x 2,173 0,097 0,103 0,042 0,051 0,056 0, 057 0, 048 0, 053 lOOOx 1,510 0,066 0,067 0,038 0,040 0,037 0, 046 0, 043 0, 043 5000x 0,474 0,042 0,042 0,033 0,046 0,033 0,033 0, 036 0, 041

Exemplo 6 Estudo farmacodinâmico após uma única injecção subcutânea a macacos cinomolgos em jejum e durante infusão intravenosa progressiva ΡΕ1641823 51

Infusão

Na Fase 1 (Dia 1 do Estudo) foi administrada uma injecção subcutânea de veiculo. Uma infusão de glucose intravenosa progressiva (20% dextrose) de 5, 10 e 25 mg/kg/min foi então administrada imediatamente após a injecção do veiculo. Na Fase 2 (Dia 3 do Estudo), foi administrada uma injecção subcutânea de uma proteína de fusão de GLP-1 (0,1 mg/kg) . Na Fase 3, foi feita uma infusão progressiva intravenosa de glucose aproximadamente 96 horas após a injecção da fusão de GLP-1.

Foram efectuados procedimentos de infusão progressiva de glucose intravenosa em macacos sedados após um jejum de 16 hr nocturno. Para as infusões de glucose intravenosas, foram colhidas amostras na linha de base cada 10 min durante 20 min para definir a linha de base. Uma infusão de glucose gradual crescente foi iniciada aos +20 min, a uma velocidade de 5 mg/kg/min, seguido de infusões de 10 mg/kg/min e 25 mg/kg/min. Cada velocidade de infusão foi administrada durante um período de 20 minutos. Foram colhidas amostras de sangue com intervalos de 10 min para medição de glucose, insulina e glucagão. Aproximadamente 1,0 ml de sangue foi colhido antes das infusões de glucose aos -20, -10 e 0 min e aos 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos após infusão de glucose para as Fases 1 e 3.

Uma representação dos dados está apresentada na tabela 8. 52 ΡΕ1641823

Tabela 8

Glucose AUC AUC AUC Grupo Animal (min*mg/dL) Grupo Animal (min *mg/dL) GLP-Fc 9423 7447 veículo 9423 8077 9424 7470 9424 15006 9510 5153 9510 7116 9513 6303 9513 7459 9516 5413 9516 8728 9530 5240 9530 7863 N 6 Média 6171 Média 9041 DP 1078 DP 2973 Insulina AUC AUC AUC Grupo Animal (min*mg/ml) Grupo Animal (min *ng/ml) GLP-Fc 9423 129 veículo 9423 38 9424 138 9424 29 9510 357 9510 69 9513 161 9513 64 9516 376 9516 38 9530 215 9530 68 Média 229 Média 51 DP 111 DP 18 EP 45 EP 7

Os níveis do glucagão não foram estatisticamente diferentes entre o veículo e a proteína de fusão de GLP-1 doseada em macacos. 53 ΡΕ1641823

Exemplo 7 Estudo farmacodinâmico após injecções subcutâneas únicas de três doses diferentes a ratos no estado de jejum e durante uma infusão gradual de glucose intravenosa.

Ratos cronicamente canulados foram distribuídos pelos grupos de veículo controlo (soro fisiológico) ou um de três grupos de tratamento (proteína de fusão de GLP-1; 0,0179 mg/kg, 0,179 mg/kg ou 1,79 mg/kg). A proteína de fusão de GLP-1 e o veículo foram administrados via injecção subcutânea. Vinte e quatro horas após tratamento, os ratos que jejuaram durante a noite (16 h) foram sujeitos a um teste de infusão gradual de glucose intravenosa. O teste de infusão gradual de glucose intravenosa consiste num período de infusão de linha de base de soro fisiológico (20 min) , seguido de duas fases de infusão de glucose de 30 min a 5 e 15 mg/kg/min, respectivamente. As amostras de plasma foram colhidas aos -20, -10 min, 0 pré-infusão de glucose (linha de base) e aos 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos.

Uma representação dos dados está apresentada na tabela 9.

Tabela 9 5 mg/kg/min 15 mg/kg/min

Veículo 4,3 ±0,2 (n=l8) 12,7± 0,9 (n=18) 0,0179 mg/kg 5, 6 ±0,4 (n=4) 15,9 ±1,8 (n=4) 0,179 mg/kg 9 9, 0 ±1,1 * (n=6) 28,0± 3,8* (n=6) 1,79 mg/kg 20, 5 ±3,0* (n=4) 52,7 ±7,2* (n=4) *P < 0,05 versus veículo 54 ΡΕ1641823 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Eli Lilly and company <120> Proteínas de fusão de análogos de GLP-1 <130> X-15984 <150> 60/477880 <151> 2003-06-12 <160> 21 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> construção sintética <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> xaa na posição 2 is Gly ou Vai <400> 1 6lll

His xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu 1 5 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu vai Lys Gly Gly Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Gly or Vai <400> 2

His xaa Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp vai ser ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10

Gin Ala Ala Lys Glu Phe He Ala Trp Leu Lys Asn Gly fly Gly 20 25 30 <210> 3 55 ΡΕ1641823 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0>

<221> MISC-FEATURE <222> (2)..C2) <223> Xaa na posição 2 is Gly ou Vai <400> 3

His xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai ser Ser Tyr* Leu Glu Glu 15 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu Vai Lys Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> xaa na posição 2 é Gly ou vai <400> 4

His xaa Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp vai ser ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 AS

Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly f V Pro 20 25 3 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa na posição 2 é Gly ou Vai <400> 5

His xaa Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp vai ser Ser Tyr Leu g u <slu 15 10ΡΕ1641823 56

Gin Ala Ala Lys Glu Phe ile Ala Trp Leu Vai 20 25 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <22 0> <221> MI SC FEATURE <222> (2) . . (2) <223> Xaa na posição 2 é Gly ou Vai <400> 6 H1S Xaa Glu Gly Thr Phe Thr ser Asp Vai Ser 1 5 10 Gin Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Lys 20 25 <210> 7 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <220> <221> MIST-FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa na posição 16 é Pro ou Glu <22 0> <221> MISC FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa na posição 17 é Phe, Vai, ou Ala <220> <221> MIS FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa na posição 18 é Leu, Glu, ou Ala <22 0> <221> MIST FEATURE <222> (80)..(80) <223> Xaa na posição 80 é Asn ou Ala <220> <221> MISRE-FEATURE <222> (230)..(230) <223> Xaa na posição 230 é Lys ou não existi

Leu Glu 15

Giy 30

Gly 30 57 ΡΕ1641823 < 4 Ο Ο > 7

Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro cys pro pro cys Pro Ala pro xaa 1 5 10 15 xaa xaa Gly Gly Pro ser vai Phe Leu Phe pro pro cys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met lie ser Arg Thr pro Glu val Thr cys val val val Asp 35 40 45 val ser Gin Glu Asp pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr val ASp Gly 50 55 60 vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe xaa 65 70 75 80 ser Thr Tyr Arg vai 85 vai Ser val Leu Thr 90 val Leu His Gin Asp 95 Trp Leu Asn Gly Lys GlU Tyr Lys Cys Lys Val ser Asn Lys Gly Leu Pro 100 105 110 ser Ser ile Glu Lys Thr lie ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gin vai Tyr Thr Leu pro pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser ASp ile 145 150 155 160 Ala vai Glu Trp Glu 165 Ser Asn Gly Gin Pro 170 Glu Asn Asn Tyr Lys 175 Thr Thr pro Pro vai 180 Leu Asp Ser Asp Gly 185 ser Phe Phe Leu Tyr 190 Ser Arg Leu Thr Vai 195 Asp Lys ser Arg Trp 200 Gin Glu Gly Asn Val 205 Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Gly xaa 225 230 <210> 8 58 ΡΕ1641823 <211> 15

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética < 4 0 0 > 8

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

<210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp vai Ser ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15

Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu vai Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 10 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção sintética <400> 10 HIS 1 Gly Glu Gly Thr 5 Phe Thr ser Gin Ala Ala Lys 20 Glu Phe Ile Ala Gly Gly Gly 35 ser Gly Gly Gly Gly 40 Gly Gly 50 ser Gly Gly Gly Gly 55 Ser Lys 65 Tyr Gly pro pro cys 70 pro <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial

Asp val ser ser Tyr Leu Glu Glu 10 15

Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly ser Glv Glv Glv Gly ser Gly Gly ' ' ' 45

Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu ser 60 <220> 59 ΡΕ1641823 <223> Construção sintética <400> 11

Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly Gly 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção <400> 12

Trp Leu val Lys Gly Gly Gly 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 13 Trp Leu Lys Asn Gly Gly Gly 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 14 Trp Leu val 1 Lys Gly Gly Pro <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 15

Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro 1 5 60 ΡΕ1641823 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 16 Trp Leu vai Lys Gly Gly 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 17 Trp Leu Lys Asn Gly Gly <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 pro pro cys Pro ser Cys 5 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 19

Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly 15 10 15 ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 20 <211> 825

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 cacggcgagg gcaccttcac ctccgacgtg tcctcctatc tcgaggagca ggccgccaag 61 ΡΕ1641823 gaattcatcg tctggtggcg cctgaggccg atgatctccc gaggtccagt cgggaggagc gactgçctga atcgagaaaa cccccatccc ttctacccca aagaccacgc gtggacaaga ctgcacaacc

<210> 21 <211> 30 <212> PRT cctggctggt gtggcagcgc ccgggggacc ggacccçtga tcaactggta agttcaacag acggcaagga ccatctccaa aggaggagat gcgacatcgc ctcccgtgct gcaggtggca actacacaca gaagggcggc tgagtccaaa atcagtcttc ggtcacgtgc cgtggatggc cacgtaccgt gtacaagtgc agccaaaggg gaccaagaac cgtggagtgg ggactccgac ggaggggaat gaagagcctc ggcggtggtg tatggtcccc ctgttccccc gtggtggtgg gtggaggtgc gtggtcagcg aaggtctcca cagccccgag caggtcagcc gaaagcaatg ggctccttct gtcttctcat tccctgtctc gtggctccgg aggcggcggc 120 catgcccacc ctgcccagca 180 caaaacccaa ggacactctc 240 acgtgagcca ggaagacccc 300 ataatgccaa gacaaagccg 360 tcctcaccgt cctgcaccag 420 araaannrrt cccgtcctcc 480 agccacaggt gtacaccctg 540 tgacctgcct ggtcaaaggc 600 ggcagccgga gaacaactac 660 tcctctacag caggctaacc 720 gctccgtgat gcatgaggct 780 tgggt 825 <213> Artificial <22 0> <223> Construção sintética <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5

Gly Gly ser

Gly Gly Gly Gly ffr

Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly 20 25 ser 30

Lisboa, 25 de Outubro de 2011

Claims (18)

1. ΡΕ1641823 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína heteróloga de fusão compreendendo uma análogo de GLP-1 compreendendo uma sequência seleccionada entre: a) (SEQ ID NO:l) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu- Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Gly em que Xaae é seleccionado entre Gly e Vai; b) (SEQ ID NO:2) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu- Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ue-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Gly em que Xaae é seleccionado entre Gly e Vai; c) (SEQ Π) NO:3) His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu- Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-Pro em que Xaas é seleccionado entre Gly e Vai; d) 2 ΡΕ1641823 (SEQ ID N0:4) His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gin- Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro em que Xaas é seleccionado entre Gly e Vai; e) His-Xaag-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-G ln-Ala-Ala-Lys-G l u-Phe-1 le-Ala-T rp-Leu-V al-Lys-G ly-G ly em que Xaas é seleccionado entre Gly e Vai; f) (SEQ 1D NO:6) His-Xaas-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Lcu-Glu-Glu- Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly em que Xaas é seleccionado entre Gly e Vai; fundido com a porção Fc de uma imunoglobulina compreendendo a sequência de SEQ ID NO:7 Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala- Pro-Xaai6-Xaai7-Xaai8-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro- Pro-Lys-Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu- Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu- Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn- Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe-Xaaso-Ser-Thr-Tyr- Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu-Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu- 3 ΡΕ1641823 Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu- Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln- P ro-Arg-Glu-Pro-Gln- Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu- Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Leu-Val-Lys- Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn- Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val-Leu- Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val- Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser- Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser- Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa23o (SEQ IDN0:7) em que: Xaa na posição 16 é Pro ou Glu; Xaa na posição 17 é Phe, Vai ou Ala; Xaa na posição 18 é Leu, Glu ou Ala; Xaa na posição 80 é Asn ou Ala; e Xaa na posição 230 é Lys ou não existe.
2. 2. A proteína heteróloga de fusão da reivindicação 1, em que o resíduo de glicina C-terminal do análogo de GLP-1 está fundido com o resíduo de alanina N-terminal da porção Fc através de um elemento de ligação peptídico compreendendo uma sequência seleccionada entre: a) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly- Ser (SEQ ID NO:8); b) Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly—Gly—Gly—Ser—Gly—Gly—Gly—Gly—Ser (SEQ ID NO:19); e c) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly- 4 ΡΕ1641823 Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO:21).
3. 3. A proteína heteróloga de fusão da reivindicação 2, em que o elemento de ligação compreende a sequência de SEQ ID NO:8.
4. 4. A proteína heteróloga de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Xaa na posição 8 do análogo de GLP-1 é Gly.
5. 5. A proteína heteróloga de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Xaa na posição 8 de GLP-1 é Vai.
6. 6. A proteína heteróloga de fusão de qualquer uma das reivindicação 1 a 3, em que o análogo de GLP-1 compreende a sequência de SEQ ID N0:1.
7. 7. A proteína heteróloga de fusão da reivin dicação 1, em que a proteína heteróloga de fusão é seleccionada entre: a) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P); b) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; c) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, N297A) ; d) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N2 97A) ; e) Gly-Glu22-Gly36-GLP-1 (7- 37)-1.5L-IgQ4 (S228P) ; f) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; g) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, N2 97A) ; h) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 ( 7-37 ) - 5 ΡΕ1641823 5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N2 97A) / i) Gly8-Glu22-Gly36- ( 37)-2L-IgG4 (S228P); j) Gly-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37) - 2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; k) Gly8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7- 37)-2L-IgG4 (S228P, N297A) ; 1) Gly8-Glu22-Gly36-Gly36-1 (7- -2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e as suas formas des-K. A proteína heteróloga de fusão da reivin dicação 7, em que a proteína de fusão é a forma des-K de Gly -Glu 2-Gly36-GLP-l (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) .
8. 9. A proteína heteróloga de fusão da reivin dicação 1, em que a proteína heteróloga de fusão é seleccionada entre: a) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P); b) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; c) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-lL-IgG4 (S228P, N297A) ; d) Val8-GLu22-GLy36-GLP-l (7-37)-IL-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A) ; e) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 )-1.5L- IgG4 (S228P) ; f) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37)-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A) ; g) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 )-1.5L-IgG4 (S228P, N2 97A) ; h) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 )-1.5L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); i) Vai8 -Glu22-Gly36-GLP- 1 (7-37)-2L-IgG4 (S228P) ; j) Val8-Glu22-Gly36-GLP-1 (7-37 ) -2L-I<1G4 (S228P, F234A, L235A) ; k) Val8-GLu22-GLy36-GLP-l (7~37)-2L-IgG4 (S228P, N2 97A) ; 1) VaL8-Glu22-Gly36-GLP-l (7- ^^)~2L-IgG4 (S228P, F234A, L235A, N297A); e as suas formas ^es-K.
9. 10. A proteína heteróloga de fusão de acordo com a Reivindicação 1, compreendendo: 6 ΡΕ1641823 a) um análogo de GLP-1 compreendendo SEQ ID N0:1 His-Xaae-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-GLy em que Xaa8 é seleccionado de Gly; (b) uma porção Fc de uma imunoglobulina compreendendo SEQ ID NO:7 Ala-Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro- Xaai6-Xaai7>Xaai8-Gly-Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro- Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr-Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val- Val-Val-Asp-Val-Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp- Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn-Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg- Glu-Glu-Gin-Phe-Xaa8o-Ser-Thr-Tyr-Arg-Vai-Vai-Ser-Val-Leu-Thr- Val-Leu-His-Gln-Asp-T rp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-T yr-Lys-Cys-Lys- Val-Ser-Asn-Lys-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-lle-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser- Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-GIn-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro- Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr-Cys- Leu-V al-Lys-G ly-Phe-T yr-Pro-Ser-Asp-I le-Ala-Val-Glu-T rp-Glu- Ser-Asn-Gly-Gln-Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro-Val- Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu-Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val- Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val- Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser- Leu-Ser-Leu-Gly-Xaa23o em que: Xaa na posição 16 é Glu; Xaa na posição 17 é Ala; Xaa na posição 18 é Ala; 7 ΡΕ1641823 Xaa na posição 80 é Asn; e Xaa na posição 230 não existe; e (c) um elemento de ligação peptidico compreendendo SEQ ID NO: 8 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, em que a glicina N-terminal do elemento de ligação peptidico está fundida directamente com o resíduo de glicina C-terminal do análogo de GLP-1 e a serina C-terminal do elemento de ligação peptidico está directamente fundida com a alanina N-terminal da porção Fc.
10. 11. A proteína heteróloga de fusão de acordo com a reivindicação 10, compreendendo a sequência de aminoácidos: HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPP CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLG.
11. 12. Uma sequência de ácido nucleico codificadora da proteína heteróloga de fusão da reivindicação 11.
12. 13. A sequência de ácido nucleico da reivindicação 12, em que a referida sequência compreende SEQ ID NO:2 0. ΡΕ1641823
13. 14. A proteína heteróloga de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para usar como medicamento.
14. 15. A proteína heteróloga de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para usar no tratamento de diabetes melittus não dependente de insulina.
15. 16. A proteína heteróloga de fusão de qualquer uma das reivindicações 1 a 11 para usar no tratamento de obesidade ou indução de perda de peso num indivíduo com excesso de peso.
16. 17. Um dímero compreendendo duas proteínas heterólogas de fusão de acordo com a reivindicação 11.
17. 18. Uma formulação compreendendo qualquer uma das proteínas heterólogas de fusão de acordo com as reivindicações 1 a 11.
18. 19. Uma formulação compreendendo o dímero de acordo com a reivindicação 17. Lisboa, 25 de Outubro de 2011