CN116333148A - 靶向模块的位点特异性糖工程化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向模块的位点特异性糖工程化。本发明提供结合多肽(例如抗体)及其靶向模块缀合物，其包含在所述结合多肽的天然或工程化聚糖内的位点特异性工程化的聚糖连接。本发明还提供编码抗原结合多肽的核酸、重组表达载体和用于制备此类抗原结合多肽的宿主细胞。还提供了使用本文公开的抗原结合多肽治疗疾病的方法。

Description

靶向模块的位点特异性糖工程化
本申请是申请日为2015年03月18日、中国申请号为201580026094.2、发明名称为“靶向模块的位点特异性糖工程化”的发明申请的分案申请。
序列表
本申请包含序列表，其以ASCII形式电子提交并在此通过提述以其整体并入。所述ASCII副本创建于2015年3月5日，标题为566622SA9-148PC_SL.txt且大小为115,860字节。
发明背景
特异性抗体用于治疗人和其他动物的用途是一种强大的工具，其对于治疗许多病况和病症的非常有效。然而，依然极为需要更有效的靶治疗，尤其是具有更高效力和更大治疗窗口的靶特异性治疗。这些靶特异性治疗采用抗体-效应模块缀合物，其中靶向模块将特异性抗体引向所需的治疗部位。这些分子显示了改进的治疗指标——在临床环境中比非靶标的抗体更高的效力和/或更低的毒性概貌。然而，此类治疗的开发可能是具有挑战性的，因为许多因素，包括所述抗体自身的物理和/或结构特性以及连接稳定性可能对疾病靶标(例如肿瘤)具有显著影响，由此降低效力。抗体-效应模块缀合物在循环中具有高度非特异性结合和低稳定性，其在达到靶标部位前通常会通过正常组织清除。此外，具有高药物载荷的显著亚群的抗体-效应模块缀合物可生成聚集体，其会被巨噬细胞消除，导致较短的半衰期。因此，对关键流程的控制和改进以及预防并发症(如抗体聚集和非特异性抗体介导的毒性)存在增加的需求。
虽然根据现有方法产生的抗体-效应模块缀合物可能是有效的，但由于使用的缀合化学通常导致异质混合物，因此这种疗法的开发具有挑战性。例如，由于可用于缀合的抗体中存在许多赖氨酸残基(～30)这一事实，因此将效应模块缀合至抗体赖氨酸残基变得复杂。由于效应模块缀合于抗体比率(DAR)的最佳数目对于最小化抗体的功能丧失低得多(例如约4:1)，赖氨酸缀合通常生成非常异质性的概貌。此外，许多赖氨酸位于CDR区的关键抗原结合位点且药物缀合可导致抗体亲和力的降低。巯基介导的缀合主要靶向参与铰链二硫键的八个半胱氨酸。然而，预测和鉴别八个半胱氨酸中的哪四个在不同的制备物中始终缀合仍是困难的。最近，游离半胱氨酸残基的遗传工程已能够实现使用基于巯基的化学进行的位点特异性缀合，但这种连接经常表现出高度变化的稳定性，其接头经历了与白蛋白和其他含巯基的血清分子的交换反应。因此，生成具有限定的缀合位点和稳定连接的抗体缀合物的位点特异性缀合策略在使得效应模块缀合同时将对抗体结构或功能的不良影响最小化方面是有用的。
发明概述
本发明提供结合多肽(例如抗体)及其靶向模块缀合物。在一些实施方案中，所述缀合物包含在所述结合多肽的天然或修饰聚糖内的位点特异性工程化的靶向-模块聚糖连接。本发明还提供编码抗原结合多肽的核酸序列、重组表达载体和用于制备此类抗原结合多肽的宿主细胞。还提供了使用本文公开的抗原结合多肽治疗疾病的方法。
因此，在一个方面，本发明提供包含至少一个修饰聚糖的结合多肽，所述修饰聚糖包含式(IV)的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000021
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；
C)X是靶向模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，
其中Sia存在或不存在，且其中所述靶向模块结合至细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞选自免疫细胞、肝细胞、肿瘤细胞、血管细胞、上皮细胞、或间充质细胞。在又一些实施方案中，所述细胞选自B细胞、T细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肝细胞、肝窦内皮细胞、或肝癌细胞。
在一个实施方案中，所述结合多肽是由细胞内化的。在另一个实施方案中，所述由细胞内化的结合多肽的量大于缺乏被细胞内化的靶向模块的参考结合多肽的量。
在一个实施方案中，所述靶向模块结合至细胞上的甘露糖-6-磷酸受体。在另一个实施方案中，所述靶向模块包含甘露糖-6-磷酸(Man 6-P)模块。
在一个实施方案中，所述靶向模块结合至细胞上的Siglec。在进一步的实施方案中，所述Siglec是唾液酸粘附素(Siglec-1)、CD22(Siglec-2)、CD33(Siglec-3)、MAG(Siglec-4)、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14、或Siglec-15。在另一个实施方案中，所述靶向模块包含α2,3-、α2,6-、或α2,8-连接的唾液酸残基。在进一步的实施方案中，所述靶向模块包含α2,3-唾液酸乳糖模块和α2,6-唾液酸乳糖模块。
在一个实施方案中，所述靶向模块结合至C型凝集素受体、半乳凝素、L型凝集素受体或其他糖类受体。在进一步的实施方案中，所述靶向模块结合至DEC-205(CD205；淋巴细胞抗原75)、巨噬细胞甘露糖受体(MMR；CD206)、Dectin-1、Dectin-2、可由巨噬细胞诱导的C型凝集素(Mincle)、树突细胞特异性ICAM3-抓取非整合素(DC-SIGN、CD209)、DC NK凝集素基团受体-1(DNGR-1)、朗格汉斯蛋白(Langerin)(CD207)、凝集素蛋白聚糖(lectican)、去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、C-凝集素受体树突细胞免疫受体(CLEC4A；CLECSF6；DCIR)、巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL)、DC受体、胶原凝集素、选择素、NK细胞受体、多C型凝集素域(CTLD)内吞性受体、Reg基团(VII型)凝集素、软骨凝集素、四连接素、多囊蛋白、吸引素(attractin)(ATRN)、嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白(EMBP)、DiGeorge综合征临界区基因2(DGCR2)、血栓调节蛋白、Bimlec、基团XVI凝集素(SEEC)、或基团XVII凝集素(CBCP/Frem1/QBRICK)。
在一个实施方案中，Q是O。
在一个实施方案中，所述聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000031
在一个实施方案中，所述靶向模块是三价GalNAc聚糖模块。
在一个实施方案中，所述靶向模块是糖肽。在进一步的实施方案中，所述靶向模块三-半乳糖基化糖肽，例如乳糖3-Cys3Gly4。
在一个实施方案中，存在Sia且所述乳糖3-Cys3Gly4模块由式V表示：
Figure BDA0003868969060000041
在一个实施方案中，所述聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000042
在一个实施方案中，所述聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000051
在一个实施方案中，所述靶向模块是三价GalNAc聚糖模块。
在一个实施方案中，存在Sia且所述三价GalNAc聚糖模块由式VIII表示：
Figure BDA0003868969060000052
Figure BDA0003868969060000053
其中q是1至29的整数，含本数。
在另一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个具有如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000054
其中q是1至29的整数，含本数。
在另一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个具有如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000061
其中q是1至29的整数，含本数。
在一个实施方案中，所述三价GalNAc聚糖模块由式VII、式XIII、或式XIV表示：
Figure BDA0003868969060000062
Figure BDA0003868969060000071
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000072
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000081
在一个实施方案中，所述结合多肽包含Fc域。在进一步的实施方案中，所述修饰聚糖经所述Fc域的氨基酸位置297处的天冬酰胺残基而N-连接至该结合多肽，所述氨基酸位置依据EU编号。在另一个实施方案中，所述修饰聚糖经所述Fc域的氨基酸位置298处的天冬酰胺残基而N-连接至该结合多肽，所述氨基酸位置依据EU编号。
在一个实施方案中，所述Fc域是人的。在另一个实施方案中，所述结合多肽包含CH1域。在进一步的实施方案中，所述修饰聚糖经所述CH1域的氨基酸位置114处的天冬酰胺残基而N-连接至该结合多肽，所述氨基酸位置依据Kabat编号。
在一个实施方案中，所述连接体模块包括pH敏感性接头、二硫化物接头、酶敏感性接头或其他可切割接头模块。在一个实施方案中，所述连接体模块包含选自下组的接头模块：表2或14所示的接头模块。
在一个实施方案中，所述结合多肽是抗体或免疫粘附素。
在一个方面，本发明提供一种制造前述权利要求任一项的结合多肽的方法，该方法包括将式(I)的效应模块与包含氧化聚糖的前体结合多肽反应，所述式(I)为：
NH2-Q-CON-X
式(I)，
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是靶向模块。
在一个实施方案中，起始结合多肽包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000091
在一个实施方案中，所述起始结合多肽包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000092
在一个实施方案中，所述前体结合多肽包含氧化聚糖，其包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000093
在一个实施方案中，所述前体结合多肽包含氧化聚糖，其包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000094
在一个实施方案中，所述包含氧化聚糖的前体结合多肽通过将包含聚糖的初始结合多肽与温和氧化剂反应而生成。在进一步的实施方案中，所述温和氧化剂是高碘酸钠。在另一个实施方案中，采用不多于1mM的高碘酸钠。在另一个实施方案中，所述温和氧化剂是半乳糖氧化酶。
在一个实施方案中，所述制造结合蛋白的方法包括将如下结构式的效应模块与包含氧化聚糖的前体结合多肽反应：
NH2-O-CON-X
其中所述氧化聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000101
以形成如下结构式的结合多肽：
Figure BDA0003868969060000102
在一个实施方案中，所述靶向模块是三价GalNAc聚糖模块。在一个实施方案中，所述反应步骤在包含金属离子的盐的存在下进行。在进一步的实施方案中，所述金属离子是铜离子。在一个实施方案中，所述盐是乙酸铜。在另一个实施方案中，所述包含金属离子的盐以至少0.1mM的浓度存在。
在另一个实施方案中，所述包含聚糖的结合多肽包含一个或两个末端唾液酸残基。在进一步的实施方案中，所述末端唾液酸残基通过用唾液酸转移酶或唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合来处理所述结合多肽而引入。在一个实施方案中，使初始结合多肽接触温和氧化剂从而产生前体结合多肽或前体结合蛋白。在一个实施方案中，所述前体结合多肽或前体结合蛋白包含氧化的唾液酸模块，其包含末端醛。
在一个方面，本发明提供包含至少一个修饰聚糖的结合多肽，所述修饰聚糖包含式(IV)的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000103
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是乳糖3-Cys3Gly4模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，且
其中Sia存在且所述乳糖3-Cys3Gly4模块由式V表示：
Figure BDA0003868969060000111
在另一个实施方案中，本发明提供组合物，其包含上文所述的结合多肽及药学上可接受的载剂或赋形剂。在一个实施方案中，靶向模块比结合多肽的比率等于或大于约4。在另一个实施方案中，靶向模块比结合多肽的比率是至少约2。在进一步的实施方案中，本发明提供用于治疗对其有需求的患者的方法，包括施用有效量的所述组合物。
在一个方面，本发明提供包含至少一个修饰聚糖的结合多肽，所述修饰聚糖包含式(IV)的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000112
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是包含PEG的模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，
其中Sia存在或不存在。
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个由式IX或式XI表示的模块：
Figure BDA0003868969060000121
Figure BDA0003868969060000122
其中p具有1至32的值；或
Figure BDA0003868969060000123
Figure BDA0003868969060000124
其中p具有1至32的值。
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000125
其中p具有1至32的值；或
Figure BDA0003868969060000131
其中p具有1至32的值。
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000132
其中p具有1至32的值；或
Figure BDA0003868969060000133
其中p具有1至32的值。
在一个实施方案中，所述靶向模块包含PEG且由式X或式XII表示：
Figure BDA0003868969060000134
Figure BDA0003868969060000141
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000142
在一个实施方案中，所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000151
在一个实施方案中，所述PEG模块包含单-PEG、双-PEG、或三-PEG。在另一个实施方案中，所述PEG模块包括3至3.5PEG。在另一个实施方案中，所述结合多肽是抗体或免疫粘附素。
在另一个方面，本发明提供一种制造包含至少一个氧化聚糖的聚乙二醇化结合多肽的方法，其中该方法包括：(a)将包含至少一个聚糖的结合多肽与温和氧化剂在包含金属离子的盐存在下反应，以及(b)将氧化的结合多肽与至少一个包含PEG的模块缀合。
在一个实施方案中，所述金属离子是铜离子。在另一个实施方案中，所述盐是乙酸铜。在另一个实施方案中，所述包含金属离子的盐以至少0.1mM的浓度存在。在另一个实施方案中，所述温和氧化剂是高碘酸盐或半乳糖氧化酶。在另一个实施方案中，所述至少一个聚糖是修饰聚糖。
在一个实施方案中，制造结合多肽的方法包括：(a)将包含至少一个修饰聚糖的结合多肽与温和氧化剂在包含金属离子的盐的存在下反应；以及(b)将氧化的结合多肽与包含PEG的模块缀合。在进一步的实施方案中，所述PEG模块包括单-PEG、双-PEG、或三-PEG。
在另一个方面，本发明提供包含至少一个修饰聚糖的结合多肽，所述修饰聚糖包含式(IV)的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000161
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是三价GalNAc聚糖；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件；
其中Sia存在或不存在且所述三价GalNAc聚糖模块由式VI表示。
在一个实施方案中，所述结合蛋白包含选自下组的N-聚糖糖型：G0糖型、G1糖型、和G2糖型。在进一步的实施方案中，所述N-聚糖糖型选自下组：G1S1糖型、G2S1糖型、G2S2糖型、G1F糖型、G2F糖型、G1S1F糖型、G2S1F糖型、和G2S2F糖型。
本发明涉及下述实施方案。
1.一种结合多肽，其包含至少一个修饰聚糖，其中所述聚糖含有至少一个式(IV)的模块：
Figure BDA0003868969060000162
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；
C)X是靶向模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，其中Sia存在或不存在，且其中所述靶向模块结合至细胞。
2.实施方案1的结合多肽，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
3.实施方案2的结合多肽，其中所述哺乳动物细胞选自免疫细胞、肝细胞、肿瘤细胞、血管细胞、上皮细胞、或间充质细胞。
4.实施方案2的结合多肽，其中所述哺乳动物细胞选自B细胞、T细胞、树突细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肝细胞、肝窦内皮细胞、或肝癌细胞。
5.实施方案1的结合多肽，其中所述结合多肽是由细胞内化的。
6.实施方案5的结合多肽，其中所述由细胞内化的结合多肽的量大于缺乏被细胞内化的靶向模块的参考结合多肽的量。
7.实施方案1的结合多肽，其中所述靶向模块结合至细胞上的甘露糖-6-磷酸受体。
8.实施方案7的结合多肽，其中所述靶向模块包含甘露糖-6-磷酸模块。
9.实施方案1的结合多肽，其中所述靶向模块结合至细胞上的唾液酸结合性免疫球蛋白型凝集素(Siglec)。
10.实施方案9的结合多肽，其中所述Siglec是唾液酸粘附素(Siglec-1)、CD22(Siglec-2)、CD33(Siglec-3)、髓磷脂相关的糖蛋白(MAG(Siglec-4))、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14、或Siglec-15。
11.实施方案9的结合多肽，其中所述靶向模块包含α2,3-、α2,6-、或α2,8-连接的唾液酸残基。
12.实施方案11的结合多肽，其中所述靶向模块包含α2,3-唾液酸乳糖模块和α2,6-唾液酸乳糖模块。
13.实施方案1的结合多肽，其中所述靶向模块结合至C型凝集素受体、半乳凝素、或L型凝集素受体。
14.实施方案13的结合多肽，其中所述靶向模块结合至DEC-205(CD205；淋巴细胞抗原75)、巨噬细胞甘露糖受体(MMR；CD206)、Dectin-1、Dectin-2、可由巨噬细胞诱导的C型凝集素(Mincle)、树突细胞特异性ICAM3-抓取非整合素(DC-SIGN、CD209)、DC NK凝集素基团受体-1(DNGR-1)、朗格汉斯蛋白(Langerin)(CD207)、凝集素蛋白聚糖(lectican)、去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、C-凝集素受体树突细胞免疫受体(CLEC4A；CLECSF6；DCIR)、巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL)、DC受体、胶原凝集素、选择素、NK细胞受体、多C型凝集素域(CTLD)内吞性受体、Reg基团(VII型)凝集素、软骨凝集素、四连接素、多囊蛋白(polycystin)、吸引素(attractin)(ATRN)、嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白(EMBP)、DiGeorge综合征临界区基因2(DGCR2)、血栓调节蛋白、Bimlec、基团XVI凝集素(SEEC)、或基团XVII凝集素(CBCP/Frem1/QBRICK)。
15.实施方案1的结合多肽，其中Q是O。
16.实施方案1的结合多肽，其中所述聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000181
17.实施方案16的结合多肽，其中所述靶向模块是三价GalNAc聚糖模块。
18.实施方案1的结合多肽，其中所述靶向模块是能够结合细胞上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的糖肽。
19.实施方案17的结合多肽，其中所述靶向模块是三-半乳糖基化糖肽或乳糖3-Cys3Gly4。
20.实施方案19的结合多肽，其中存在Sia且所述乳糖3-Cys3Gly4模块由式V表示：
Figure BDA0003868969060000182
21.实施方案20的结合多肽，其中所述聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000191
22.实施方案20的结合多肽，其中所述聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000192
23.实施方案18的结合多肽，其中所述靶向模块是三价GalNAc聚糖模块。
24.实施方案23的结合多肽，其中存在Sia且所述三价GalNAc聚糖模块由式VIII表示：
Figure BDA0003868969060000201
Figure BDA0003868969060000202
其中q是1至29的整数，含本数。
25.实施方案23的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个具有如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000203
其中q是1至29的整数，含本数。
26.实施方案23的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个具有如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000204
其中q是1至29的整数，含本数。
27.实施方案23的结合多肽，其中所述三价GalNAc聚糖模块由式VII、式XIII、或式XIV表示：
Figure BDA0003868969060000211
28.实施方案23的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000221
29.实施方案23的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000231
30.前述实施方案任一项的结合多肽，其中所述结合多肽包含Fc域。
31.实施方案30的结合多肽，其中所述修饰聚糖经所述Fc域的氨基酸位置297处的天冬酰胺残基而N-连接至该结合多肽，所述氨基酸位置依据EU编号。
32.实施方案30的结合多肽，其中所述修饰聚糖经所述Fc域的氨基酸位置298处的天冬酰胺残基而N-连接至该结合多肽，所述氨基酸位置依据EU编号。
33.前述实施方案任一项的结合多肽，其中所述Fc域是人的。
34.前述实施方案任一项的结合多肽，其中所述结合多肽包含CH1域。
35.实施方案34的结合多肽，其中所述修饰聚糖经所述CH1域的氨基酸位置114处的天冬酰胺残基而N-连接至该结合多肽，所述氨基酸位置依据Kabat编号。
36.前述实施方案任一项的结合多肽，其中所述连接体模块包括pH敏感性接头、二硫化物接头、酶敏感性接头或其他可切割接头模块。
37.前述实施方案任一项的结合多肽，其中所述连接体模块包含选自下组的接头模块：表2和表14所示的接头模块。
38.前述实施方案任一项的结合多肽，其是抗体或免疫粘附素。
39.一种制造前述实施方案任一项的结合多肽的方法，该方法包括将式(I)的效应模块与包含氧化聚糖的前体结合多肽反应，所述式(I)为：
NH2-Q-CON-X
式(I)，
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是靶向模块。
40.实施方案39的方法，其中起始结合多肽包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000241
41.实施方案39的方法，其中起始结合多肽包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000242
42.实施方案39的方法，其中所述前体结合多肽包含氧化聚糖，其包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000243
43.实施方案39的方法，其中所述前体结合多肽包含氧化聚糖，其包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000251
44.实施方案39的方法，其中所述包含氧化聚糖的前体结合多肽通过将包含聚糖的初始结合多肽与温和氧化剂反应而生成。
45.实施方案44的方法，其中所述温和氧化剂是高碘酸钠。
46.实施方案45的方法，其中采用少于1mM的高碘酸钠。
47.实施方案44的方法，其中所述温和氧化剂是高碘酸盐或半乳糖氧化酶。
48.实施方案39的方法，其包括将如下结构式的效应模块与包含氧化聚糖的前体结合多肽反应：
NH2-O-CON-X
其中所述氧化聚糖包含如下结构式的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000252
以形成如下结构式的结合多肽：
Figure BDA0003868969060000253
49.实施方案48的方法，其中所述靶向模块是三价GalNAc聚糖模块。
50.实施方案44的方法，其中所述反应步骤在包含金属离子的盐的存在下进行。
51.实施方案50的方法，其中所述金属离子是铜离子。
52.实施方案50或51的方法，其中所述盐是乙酸铜。
53.实施方案50-52任一项的方法，其中所述包含金属离子的盐以至少0.1mM的浓度存在。
54.前述实施方案任一项的方法，其中所述包含聚糖的结合多肽包含一个或两个末端唾液酸残基。
55.实施方案54的方法，其中所述末端唾液酸残基通过用唾液酸转移酶或唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合来处理所述结合多肽而引入。
56.包含前述实施方案任一项的结合多肽及药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物。
57.实施方案56的组合物，其中靶向模块比结合多肽的比率等于或大于约4。
58.实施方案57的组合物，其中靶向模块比结合多肽的比率是至少约2。
59.一种治疗对其有需求的患者的方法，包括施用有效量的实施方案56-58的组合物。
60.包含至少一个修饰聚糖的结合多肽，所述修饰聚糖包含式(IV)的至少一个模块：
Figure BDA0003868969060000261
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；
C)X是包含PEG的模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，
其中Sia存在或不存在。
61.实施方案60的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个由式IX或式XI表示的模块：
Figure BDA0003868969060000262
Figure BDA0003868969060000263
其中p具有1至32的值；或
Figure BDA0003868969060000271
Figure BDA0003868969060000272
其中p具有1至32的值。
62.实施方案60的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000273
其中p具有1至32的值；或
Figure BDA0003868969060000274
其中p具有1至32的值。
63.实施方案60的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000281
其中p具有1至32的值；或
Figure BDA0003868969060000282
其中p具有1至32的值。
64.实施方案60的结合多肽，其中所述靶向模块包含PEG且由式X或式XII表示：
Figure BDA0003868969060000283
Figure BDA0003868969060000291
65.实施方案60的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000292
66.实施方案60的结合多肽，其中所述聚糖包含至少一个选自如下结构式的模块：
Figure BDA0003868969060000301
67.实施方案60的结合多肽，其中所述PEG包括单-PEG、双-PEG、或三-PEG。
68.实施方案60或67的结合多肽，其中所述PEG包括3至3.5PEG。
69.实施方案60、67或68的结合多肽，其中所述结合多肽是抗体或免疫粘附素。
70.一种制造聚乙二醇化结合多肽的方法，其中该方法包括：
(a)将包含至少一个聚糖的结合多肽与温和氧化剂在存在包含金属离子的盐的条件下反应，以生成包含至少一个氧化聚糖的氧化的结合多肽，及
(b)将所述氧化的结合多肽与至少一个包含PEG的模块缀合，由此生成聚乙二醇化的结合多肽。
71.实施方案70的方法，其中所述金属离子是铜离子。
72.实施方案70或71的方法，其中所述盐是乙酸铜。
73.实施方案70-72的方法，其中所述包含金属离子的盐以至少0.1mM的浓度存在。
74.实施方案70-73的方法，其中所述温和氧化剂是高碘酸盐氧化酶或半乳糖氧化酶。
75.实施方案70-74的方法，其中所述至少一个聚糖是修饰聚糖。
76.实施方案1的结合多肽，其中所述结合蛋白包含选自下组的N-聚糖糖型：G0糖型、G1糖型、和G2糖型。
77.实施方案76的结合多肽，其中所述N-聚糖糖型选自下组：G1S1糖型、G2S1糖型、和G2S2糖型。
78.实施方案76的结合多肽，其中所述N-聚糖糖型选自下组：G1F糖型、G2F糖型、G1S1F糖型、G2S1F糖型、和G2S2F糖型。
附图简述
本发明的前述内容及其他特征和优点通过如下阐释性的实施方案连同附图的详细描述而更完全地得以理解。
图1(小图A-C)是抗体药物缀合物合成的示意图，其中用肟连接将毒素模块连接至抗体聚糖的氧化唾液酸残基。图1小图A描绘了在位置Asn297处具有野生型(现存的)糖类和在位置114(依据Kabat编号)及298(依据EU编号)处具有工程化的糖基化位点的抗体。图1小图B描绘了规范聚糖结构G1F(左侧，见于图1小图A中所示抗体上的位置Asn297处)和G2S1F结构(右侧，见于图1小图A中所示抗体上的位置Ala114和Asn298处)。图1小图B中所示的聚糖结构具有一些不同的亚基：白色正方形代表GlcNAc，颠倒的白色三角形代表岩藻糖，白色圆圈代表甘露糖，带阴影的圆圈代表半乳糖，而带阴影的正立三角形代表唾液酸。图1小图C描绘了本发明的缀合物的制备。在左侧是具有Gal和Sia模块的初始结合蛋白。然后用NaIO4氧化，将唾液酸模块氧化以形成前体结合蛋白，然后将其与含毒素的模块反应以形成包含式IV的至少一个模块的结合肽。
图2是考马斯蓝染色的凝胶，其显示糖基化突变体的表达和纯化。
图3描绘了表面等离子体共振实验的结果，其用于评估αβTCR HEBE1IgG抗体突变体对重组人FcγRIIIa(V158&F158)的结合。
图4描绘了表面等离子体共振实验的结果，其用于评估αβTCR HEBE1IgG抗体突变体对重组人FcγRI的结合。
图5描绘了来自PBMC的细胞因子释放概貌，所述释放是对于TNFa、GM-CSF、IFNy和IL10在突变体抗αβTCR抗体的存在下发生的(第2天)。
图6描绘了来自PBMC的细胞因子释放概貌，所述释放是对于IL6、IL4和IL2在突变体抗αβTCR抗体的存在下发生的(第2天)。
图7描绘了来自PBMC的细胞因子释放概貌，所述释放是对于TNFa、GM-CSF、IFNy和IL10在突变体抗αβTCR抗体的存在下发生的(第4天)。
图8描绘了来自PBMC的细胞因子释放概貌，所述释放是对于IL6、IL4和IL2在突变体抗αβTCR抗体的存在下发生的(第4天)。
图9(小图A-B)描绘了实验结果，所述实验通过Western印迹(图9小图A)和表面等离子体共振(图9小图B)研究了2C3突变体的表达水平。
图10描绘了实验结果，所述实验研究了PNGase F治疗之前和之后2C3突变体的糖基化。
图11描绘了SDS-PAGE实验的结果，所述实验研究了分离自细胞培养的2C3突变体上的糖基化位点。
图12(小图A-C)描绘了表面等离子体共振实验的结果，其用于评估修饰的抗CD52对重组人FcγRIIIa(V158)的结合。包含Fc域中的S298N/Y300S突变的抗CD52用于评估修饰分子对CD52肽的结合(图12小图A)、对FcγRIIIa的结合(V158，图12小图B)、以及对小鼠FcRn的对照结合(图12小图C)的效应功能。
图13描绘了表面等离子体共振实验的结果，其研究了2C3突变体的Fc结合特性。
图14(小图A-B)描绘了表面等离子体共振实验的结果，所述实验研究了修饰的抗CD52对FcγRIIIa(Val158)(如上文所述)和FcγRIIIa(Phe158)二者的结合。在Fc域中包含S298N/Y300S突变的抗CD52抗体用于评估修饰分子对FcγRIIIa(Val158，图14小图A)和FcγRIIIa(Phe58，图14小图B)的结合的效应功能。
图15(小图A-B)描绘了S298N/Y300S突变体和WT 2C3对照中C1q结合的分析(图15小图A)以及确认孔的等同涂覆的Eliza分析(图15小图B)。
图16描绘了等离子体共振实验的结果，所述实验测量了2C3突变体对CD-52肽741的结合动力学。
图17描绘了等离子体共振实验的结果，所述实验比较了WT抗CD-522C3和A114N高糖基化突变体的抗原结合亲和力。
图18(小图A-D)描绘了等电聚焦及质谱分析电荷表征实验的结果，以确定2C3突变体的聚糖含量。
图19(小图A-B)描绘了浓度(Octet)和等离子体共振实验的结果，所述实验比较了WT抗CD52 2C3和突变体的抗原结合亲和力。
图20描绘了SDS-PAGE实验的结果，以证明抗TEM1 A114N突变体的额外糖基化。
图21描绘了A114N抗Her2突变体的SDS-PAGE和疏水相互作用色谱分析的结果。
图22描绘了SDS-PAGE实验的结果，以证明PEG经氨基氧基连接缀合于2C3 A114N突变体。
图23描绘了LC-MS实验的结果，以确定抗TEM1 A114N高糖基化突变体的聚糖含量。
图24描绘了LC-MS实验的结果，以确定野生型HER2抗体和A114N抗Her2高糖基化突变体的聚糖含量。
图25(小图A-C)描绘了用于进行抗体的位点特异性缀合的示例性方法。
图26描绘了示例性效应模块的合成：氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-MMAE和氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10。
图27(小图A-C)描绘了唾液酸化HER2抗体的表征信息。
图28(小图A-D)描绘了氧化唾液酸化抗HER2抗体的表征信息。
图29描绘了糖缀合物的疏水相互作用色谱，所述糖缀合物用三个不同的唾液酸化抗体及两个不同的氨基氧基基团来制备。
图30显示了与用GAM(+)化学方法制备的AO-MMAE缀合的抗Her2A114糖基化突变体的HIC色谱。
图31(小图A-D)描绘了抗HER2糖缀合物与硫醇缀合物的体外效力的比较。
图32描绘了抗FAP B11糖缀合物和硫醇缀合物的体外效力的比较。
图33(小图A-D)描绘了抗HER2糖缀合物和硫醇缀合物在Her2+肿瘤细胞异种移植模型中的体内功效的比较。
图34描绘了LC-MS实验的结果，以确定含有S298N/Y300S突变的突变体抗αβTCR抗体的聚糖含量。
图35描绘了圆二色性实验的结果，以确定野生型抗αβTCR抗体的和含有S298N/Y300S突变的突变体抗αβTCR抗体的相对热稳定性。
图36描绘了ADC的细胞增殖测定法的结果，所述ADC用带有A114N高糖基化突变的抗HER抗体和AO-MMAE制备。
图37是抗体药物缀合物合成的示意图，其中用肟连接将靶向模块连接至抗体聚糖的氧化唾液酸残基。
图38是示意图，其描绘了根据所描述的方法通过肟连接将抗体位点特异性缀合至糖肽的示例性方法。
图39是示意图，其描绘了通过天然Fc聚糖中的唾液酸将新聚糖(neoglycan)位点特异性缀合至抗体。
图40是一系列示例性聚糖，其可用于包括乳糖氨基氧基和双Man-6-P(bis Man-6-P)(或双M6P)六甘露糖氨基氧基(对于氨基氧基缀合)的缀合。
图41是描绘Man-6-P六甘露糖马来酰亚胺的制备的示意图。
图42描绘了用兔多克隆抗体进行的对Man-6-P六甘露糖氨基氧基缀合物的SDS-PAGE和MALDI-TOF表征。
图43描绘了表面等离子体共振实验的结果，所述实验用于评估对照和Man-6-P六甘露糖缀合的兔IgG抗体对Man-6-P受体的结合。
图44描绘了Man-6-P缀合的兔IgG抗体在HepG2和RAW细胞中的摄取。
图45描绘了对照、Man-6-P缀合的、和乳糖缀合的抗体通过SDS-PAGE和凝集素印迹的表征。
图46描绘了对对照、Man-6-P缀合的、和乳糖缀合的抗体的MALDI-TOF完整蛋白分析的结果。
图47描绘了与Man-6-P六甘露糖马来酰亚胺缀合(在铰链半胱氨酸处的硫醇缀合)的多克隆抗体的表征，其通过SDS-PAGE(非还原的和还原的)、凝集素印迹(还原的)、和Man-6-P定量来进行。
图48描绘了与乳糖马来酰亚胺缀合(在铰链半胱氨酸处的硫醇缀合)的多克隆抗体的表征，其通过SDS-PAGE和半乳糖定量来进行。
图49描绘了与Man-6-P六甘露糖马来酰亚胺缀合(在铰链半胱氨酸处的硫醇缀合)的单克隆抗体的表征，其通过SDS-PAGE(非还原的和还原的)、和聚糖(双Man-6-P)定量来进行。
图50描绘了铰链半胱氨酸多克隆抗体缀合物的大小排阻色谱分析(SEC)的结果。
图51描绘了铰链半胱氨酸单克隆抗体缀合物的大小排阻色谱分析(SEC)的结果。
图52描绘了唾液酸酶滴定和唾液酸定量的结果，以确定自NNAS的唾液酸释放、唾液酸化的NNAS、和去唾液酸化的及半乳糖基化的NNAS抗体的量。
图53描绘了MALDI-TOF MS分析的结果，以确定小鼠NNAS抗体和去唾液酸化的和半乳糖基化的NNAS抗体的聚糖结构。
图54描绘了MALDI-TOF MS分析的结果，以确定小鼠NNAS抗体和唾液酸化的NNAS抗体的聚糖结构。
图55描绘了结合至双Man-6-P聚糖缀合的(经天然Fc聚糖或铰链二硫化物)多克隆和单克隆抗体的Man-6-P受体(CI-MPR)的表征，其用天然PAGE进行。
图56描绘了酶修饰的和糖肽缀合的NNAS抗体的表征，其通过SDS-PAGE(4-12％NuPAGE；还原的和非还原的)和ECL凝集素印迹(还原的)进行。
图57描绘了NNAS抗体、去唾液酸化的/半乳糖基化的NNAS抗体、和缀合的NNAS抗体中的末端半乳糖定量的结果，其以mol半乳糖或mol糖肽/mol抗体表示。
图58描绘了乳糖马来酰亚胺的检查，所述乳糖马来酰亚胺用α-2,3-唾液酸转移酶修饰并用20mM NaCl从QAE纯化柱洗脱。用MALDI-TOF MS和Dionex HPLC对所得的洗出液进行表征。
图59(小图A-B)描绘了缀合有唾液酸乳糖马来酰亚胺(硫醇反应)的兔多克隆抗体的表征，其用SDS-PAGE和Dionex HPLC(唾液酸定量)进行。
图60(小图A-D)描绘了用α-2,6-唾液酸转移酶唾液酸化并用QAE-琼脂糖柱纯化的乳糖马来酰亚胺的表征。用Dionex HPLC的分析显示(图60小图A)乳糖基准(图60小图B)α-2,6-唾液酸乳糖基准；(图60小图C)乳糖马来酰亚胺基准；以及(图60小图D)洗脱自QAE-琼脂糖柱的α-2,6-唾液酸乳糖马来酰亚胺的级分。
图61描绘了洗脱自QAE-琼脂糖柱的α-2,6-唾液酸乳糖马来酰亚胺的级分的表征，其用MALDI-TOF MS进行。
图62(小图A-B)描绘了对照抗体、α-2,3-唾液酸乳糖聚糖缀合的多克隆抗体、及α-2,6-唾液酸乳糖聚糖缀合的多克隆抗体的表征，其通过SDS-PAGE和Dionex HPLC进行(显示唾液酸分析的图)。
图63描绘了对照和酶修饰的(去唾液酸化的/半乳糖基化的)NNAS突变抗体的表征，其用SDS-PAGE和凝集素印迹进行。
图64描绘了用多种量的半乳糖氧化酶对聚乙二醇化的对照抗体和Gal NNAS通过还原的和非还原的SDS-PAGE的表征。
图65描绘了抗体重链的估计的聚乙二醇化的结果，其来自先前的用ProteinSimple进行的半乳糖氧化酶滴定。
图66描绘了用相对抗体多种摩尔过量(molar excess)的PEG对聚乙二醇化的对照抗体及Gal NNAS通过还原的和非还原的SDS-PAGE的表征。
图67描绘了抗体重链的估计的聚乙二醇化的结果，其来自先前的用ProteinSimple进行的PEG滴定。
图68是氨基氧基糖肽，乳糖3-Cys3Gly4的结构图。
图69(小图A-B)描绘了用半乳糖氧化酶在不存在乙酸铜的情况下(图69小图A)和存在变化量的乙酸铜的条件下(图69小图A和图69小图B)对聚乙二醇化的对照抗体和GalNNAS通过还原性SDS-PAGE的表征。
图70描绘了酶修饰的野生型、A114N、NNAS和A114N/NNAS赫赛汀的表征，其通过SDS-PAGE(4-12％NuPAGE；还原的和非还原的)和ECL凝集素印迹(还原的)进行，连同末端半乳糖定量的结果，其以mol半乳糖/mol抗体表示。
图71是表格，其描绘了如用Dionex HPLC测得的野生型和突变抗体的唾液酸含量(以mol/mol表示)。
图72描绘了野生型和突变抗体的聚乙二醇化通过还原的和非还原的SDS-PAGE的表征。
图73是表格，其描绘了用ProteinSimple估计的野生型和突变抗体的聚乙二醇化(以mol/mol表示)。
图74是一系列照片，其描绘了HepG2细胞对对照抗体、酶修饰的(用半乳糖基转移酶)抗体、或缀合的(用乳糖氨基氧基或乳糖马来酰亚胺)抗体的摄取的免疫荧光染色。
图75是示例性的三价GalNAc聚糖的图示。
图76描绘了表面等离子体共振实验的结果，其用于评估三价GalNAc聚糖缀合的抗体对ASGPR亚基H1的结合。
图77是用于缀合的含有三价GalNAc的聚糖和含有三价半乳糖的糖肽的图示。
图78描绘了表面等离子体共振实验的结果，其用于评估三价GalNAc聚糖缀合的、和含有三价半乳糖的糖肽缀合的重组溶酶体酶类对ASGPR亚基H1的结合。
图79(小图A-D)是其他三价GalNAc聚糖的图示。
图80是高碘酸盐氧化的重组溶酶体酶rhGAA与过量的三价GalNAc聚糖C12(以相对rhGAA 20、40、80、和200倍摩尔过量的聚糖)的缀合结果的图示。描绘了所得的每rhGAA缀合的聚糖。
图81描绘了与三价GalNAc聚糖C12缀合的重组溶酶体酶类的ASGPR结合，其在Biacore上进行。与20(缀合物1)、40、80、和200倍(缀合物4)过量的聚糖缀合的酶都显示出对ASGPR亚基1的强结合。这些缀合物(缀合物1至4)之间的结合没有显著差异。
发明详述
本发明提供结合多肽(例如抗体)及其效应模块缀合物(例如靶向模块缀合物)。在一些实施方案中，所述缀合物包含位点特异性工程化的药物-聚糖连接，所述连接位于抗原结合多肽(如IgG分子)的天然或修饰聚糖内。本发明还提供编码抗原结合多肽的核酸、重组表达载体及用于制备抗原结合多肽的宿主细胞。还提供了使用本文公开的抗原结合多肽来治疗疾病的方法。
I.定义
除本文另有定义外，本文所用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。在存在任何歧义情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。除上下文另行需要外，单数术语应当包括复数，且复数术语应当包含单数。除有另行说明外，使用的“或”意为“和/或”。使用的术语“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”，是非限制性的。
通常，本文所述使用的关于细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学及杂交的术语表是本领域所熟知且普遍使用的那些。本文提供的方法和技术通常根据本领域所熟知的常规方法以及如本说明书全文所引用和讨论的各种一般和更具体的文献所述来进行，另有说明的除外。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明来进行，如本领域通常完成的或如本文所述的那样。本文所述的与分析化学、合成有机化学、和药物及制药化学相关的术语表以及其实验室方法和技术是本领域所熟知且普遍使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送，及患者的治疗。
为使本发明更易于理解，选择的术语定义如下。
术语“多肽”意指任何聚合的氨基酸链且涵盖天然或人工的蛋白、多肽类似物或蛋白序列变体或其片段，与本文上下文相冲突的除外。多肽可以是单体的或多聚的。对于抗原多肽，多肽片段任选地含有至少一个连续的或非线性的多肽表位。所述至少一个表位片段的准确边界可以用本领域普通技术来确证。多肽片段包含例如至少约5个连续氨基酸、至少约10个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸、或至少约20个连续氨基酸。
术语“分离蛋白”或“分离多肽”意指是指由于其来源或衍生来源与在其天然状态下伴随它的天然相关组分不相关的蛋白或多肽；基本上不含来自相同物种的其它蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或不在自然界中形成。因此，在与其天然起源的细胞不同的细胞系统中化学合成或合成的蛋白或多肽是从其天然相关组分“分离”的。蛋白或多肽也可以通过使用本领域熟知的蛋白质纯化技术分离从而基本上不含天然相关组分。
如本文所用的，术语“结合蛋白”或“结合多肽”应指含有至少一个结合位点的蛋白或多肽(例如抗体或其片段)，所述结合位点负责选择性结合至目的靶抗原(例如人抗原)。示例性结合位点包括抗体可变域、受体的配体结合位点、或配体的受体结合位点。在一些方面，结合蛋白或结合多肽包含多个(例如两个，三个，四个或更多个)结合位点。在一些方面，所述结合蛋白或结合多肽不是治疗性的酶。
如本文所用的，术语“天然残基”应指在结合多肽(例如抗体或其片段)的具体氨基酸位置处天然存在且未经人工修饰、引入或改变的氨基酸残基。如本文所用的，术语“改变的结合蛋白”，“改变的结合多肽”，“修饰的结合蛋白”或“修饰的结合多肽”应指这样的结合多肽和/或结合蛋白(例如抗体或其片段)，其相对于天然(即野生型)氨基酸序列包含至少一个氨基酸的取代、缺失和/或添加，和/或相对于天然(即野生型)氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置处包含导致改变的糖基化(例如高糖基化、低糖基化和/或非糖基化)的突变。
如本文所用的，术语“初始结合多肽”或“初始结合蛋白”应指与温和氧化剂接触以分别产生“前体结合多肽”或“前体结合蛋白”(参见图1小图A-C)的结合多肽或结合蛋白。如本文所用的，术语“前体结合多肽”或“前体结合蛋白”应指可与本文所述的一个或多个效应模块反应的轻度氧化多肽或蛋白。在一些实施方案中，初始结合多肽、初始结合蛋白、前体结合多肽和/或前体结合蛋白(例如抗体或其片段)含有至少一个负责选择性结合至目的靶抗原(例如人抗原)的结合位点。示例性结合位点包括抗体可变域、受体的配体结合位点、或配体的受体结合位点。在一些方面，初始结合多肽、初始结合蛋白、前体结合多肽、和/或前体结合蛋白包含多个(例如两个，三个，四个或更多个)结合位点。在一些方面，初始结合多肽，初始结合蛋白，前体结合多肽、和/或前体结合蛋白不是治疗性的酶。初始结合多肽、初始结合蛋白、前体结合多肽、和/或前体结合蛋白可以具有野生型序列，或者其可相对于天然(即野生型)氨基酸序列包含至少一个氨基酸取代，缺失和/或添加，和/或相对于天然(即野生型)氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置处包含导致改变的糖基化(例如，高糖基化、低糖基化和/或非糖基化)的突变。
术语“配体”是指能够结合另一种物质或被另一种物质结合的任何物质。类似地，术语“抗原”是指针对其可以产生抗体的任何物质。尽管“抗原”通常用于指抗体结合底物，而当提及受体结合底物时通常使用“配体”，但是这些术语彼此不区分，并且涵盖宽范围的重叠化学实体。为了免生疑问，抗原和配体在本文全文中可互换地使用。抗原/配体可以是肽、多肽、蛋白质、适配体、多糖、糖分子、糖类、脂质、寡核苷酸、多核苷酸、合成分子、无机分子、有机分子，及其任何组合。
如本文所用的，术语“特异性结合”意指抗体或其抗原结合片段以至多约1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M、1x10-12M或更低的解离常数(Kd)结合至抗原的能力，和/或以作为其对非特异性抗原的亲和力的至少两倍高的亲和力结合至抗原的能力。
如本文所用的，术语“抗体”是指对目的抗原(例如肿瘤相关抗原)具有显著的已知特异性免疫反应活性的物质集合(assemblies)(例如完整抗体分子、抗体片段、或其变体)。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，在它们之间具有或不具有链间共价键。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对较为了解的。
如下文将更详细讨论的，通用术语“抗体”包括可以生物化学鉴定的五种不同类别的抗体。尽管所有五类抗体都清楚地在本公开的范围内，但是以下讨论通常针对IgG类的免疫球蛋白分子。对于IgG，免疫球蛋白包含两条相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链，以及两条相同的分子量53,000-70,000的重链。四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链从“Y”的开口处开始将重链括在内并经可变域延续。
免疫球蛋白的轻链分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。一般来说，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞、或遗传工程化的宿主细胞生成时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价键相互键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉形末端处的N末端延伸到每条链底部的C末端。本领域技术人员会理解的是，重链分类为γ、μ、α、δ、或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如γl-γ4)。这种链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG，IgM，IgA，IgG或IgE。免疫球蛋白同种型亚类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等)已得到充分表征并且已知赋予功能特异性化。考虑到本发明的内容，这些类别和同种型的每一个的修饰版本对于本领域技术人员是容易识别的，因此其在本发明的范围内。
将轻链和重链二者均划分为结构和功能同源性区。术语“区”意指免疫球蛋白或抗体链的部件或部分，且包括恒定区或可变区，以及所述区域的更多的不连续的部件或部分。例如，轻链可变区包括“互补决定区”或“CDR”，其散布于“框架区”或“FR”之中，如本文所定义的。
免疫球蛋白重链或轻链的区域可以定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区，其在“恒定区”的情况下是基于各种类型成员的区域内相对缺乏序列变异性，而在“可变区”的情况下则是基于各种类成员的区域内的显著变化。术语“恒定区”和“可变区”也可以在功能上使用。就这一点而言，应当理解免疫球蛋白或抗体的可变区决定抗原识别和特异性。相反，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要的效应功能，如分泌、经胎盘运动性、Fc受体结合、补体结合等。各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是已知的。
免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区折叠成结构域。术语“结构域”是指包含通过例如β-折叠片层和/或链内二硫键而稳定化的肽环(例如包含3至4个肽环)的重链或轻链的球状区域。免疫球蛋白轻链上的恒定区结构域可互换地称为“轻链恒定区结构域”，“CL区”或“CL域”。重链上的恒定域(例如铰链，CH1，CH2或CH3域)可互换地称为“重链恒定区结构域”，“CH”区结构域或“CH域”。轻链上的可变域可互换地称为“轻链可变区结构域”，“VL区结构域”或“VL域”。重链上的可变域可互换地称为“重链可变区结果域”、“VH区结构域”或“VH域”。
按照惯例，可变恒定区结构域的编号随着它们愈加远离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。每个重和轻免疫球蛋白链的N末端是可变区，并且在C末端是恒定区；CH3和CL域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。因此，轻链免疫球蛋白的域以VL-CL方向排列，而重链的域以VH-CH1-铰链-CH2-CH3方向排列。
重链恒定区中的氨基酸位置(包括CH1，铰链，CH2，CH3和CL域中的氨基酸位置)可根据Kabat索引编号系统进行编号(参见Kabat等，"Sequences of Proteins ofImmunological Interest",U.S.Dept.Health and Human Services,第五版,1991)。或者，可根据EU索引编号系统对抗体氨基酸位置进行编号(参见Kabat等，同上)。
如本文所用的，术语“VH域”包含免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“VL域”包含免疫球蛋白轻链的氨基末端可变结构域。
如本文所用的，术语“CH1域”包含免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域，其例如从Kabat编号系统中的约位置114-223(EU位置118-215)延伸。CH1域与免疫球蛋白重链分子的VH域且氨基末端与铰链区相邻，并且不形成免疫球蛋白重链的Fc区的一部分。
如本文所用的，术语“铰链区”包含将CH1域连接至CH2域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立移动。铰链区可以细分为三个不同的域：上、中、和下铰链域(Roux等，J.Immunol.1998,161:4083)。
如本文所用的，术语“CH2结构域”包含例如从Kabat编号系统中的约位置244-360(EU位置231-340)延伸的重链免疫球蛋白分子的部分。CH2域是独特的，因为它不与另一个域紧密配对。相反，两条N-连接的支链糖链插入完整天然IgG分子的两个CH2域之间。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH2域。
如本文所用的，术语“CH3域”包含重链免疫球蛋白分子的部分，其从CH2结构域的N末端延伸约110个残基，例如从Kabat编号系统的约位置361-476(EU位置341-445)。CH3域通常形成抗体的C末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的域可以自CH3域延伸以形成分子的C-末端部分(例如IgM的μ链和IgE的e链中的CH4域)。在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含来源于IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH3域。
如本文所用的，术语“CL域”包含例如从约Kabat位置107A-216延伸的免疫球蛋白轻链的恒定区结构域。CL域与VL域相邻。在一个实施方案中，本公开的结合多肽包含来源于κ轻链(例如人κ轻链)的CL域。
如本文所用的，术语“Fc区”定义为开始于紧接在木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区中且结束于抗体的C末端的重链恒定区的部分(即IgG中的残基216，取重链恒定区的第一残基为114)。因此，完整Fc区至少包含铰链域、CH2域和CH3域。
如本文所用的术语“天然Fc”是指包含由抗体消化产生或通过其它方式产生的非抗原结合片段的序列的分子，无论其是单体形式还是多聚体形式，并且可以含有铰链区。天然Fc的最初免疫球蛋白来源通常是人来源的，并且可以是任何免疫球蛋白，例如IgG1和IgG2。天然Fc分子由单体多肽组成，所述单体多肽可通过共价(即二硫键)和非共价连结而连接成二聚体或多聚体形式。根据其类别(例如IgG、IgA和IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)，天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目范围为1至4。天然Fc的一个实例是由木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键结合的二聚体。本文所用的术语“天然Fc”通用于单体、二聚体和多聚体形式。
如本文所用的术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰但仍包含挽救(salvage)受体FcRn(新生Fc受体)的结合位点的分子或序列。示例性的Fc变体及其与补救受体的相互作用是本领域已知的。因此，术语“Fc变体”可以包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被去除的区域，因为它们提供了本发明中特征的抗体样结合多肽所不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包含分子或序列，其缺少一个或多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基经修饰从而影响或涉及如下：(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达时的N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，(6)结合至除挽救受体之外的Fc受体，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
本文所用的术语“Fc结构域”涵盖上文定义的天然Fc和Fc变体和序列。与Fc变体和天然Fc分子一样，术语“Fc域”包括单体或多聚体形式的分子，无论其是从完整抗体消化产生还是通过其它方式产生。
如上所指示的，抗体的可变区允许其选择性识别和特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL域和VH域组合以形成限定三维抗原结合位点的可变区(Fv)。这种四级抗体结构形成存在于Y的每个臂的末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由每个重链和轻链可变区上的三个互补决定区(CDR)所定义。如本文所用的，术语“抗原结合位点”包括特异性结合(与之发生免疫反应)抗原(例如细胞表面或可溶性抗原)的位点。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，由这些可变区形成的结合位点决定了抗体的特异性。抗原结合位点由可变区形成，所述可变区在不同抗体中各不相同。本发明的改变的抗体包含至少一个抗原结合位点。
在一些实施方案中，本发明的结合多肽包含提供结合多肽与所选抗原的结合的至少两个抗原结合域。抗原结合域不需要来源于相同的免疫球蛋白分子。在这方面，可变区可以或来源于可被诱导发生体液应答并产生针对所需抗原的免疫球蛋白的任何类型的动物。如此，结合多肽的可变区可以是例如哺乳动物来源的，例如可以是人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、非人灵长类(例如食蟹猴、猕猴等)、狼、或骆驼科动物(例如来自骆驼，美洲驼和相关物种)。
在天然存在的抗体中，存在于每个单体抗体上的六个CDR是短的、非连续的氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，其被特异性定位以形成抗原结合位点。重和轻可变域的剩余部分在氨基酸序列中显示出较小的分子间变异性，并被称为框架区。框架区主要采取β-折叠构象，并且CDR形成环，其连接β-折叠结构，并在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，这些框架区起作用以形成支架，所述支架通过链间非共价相互作用使六个CDR以正确的方向定位。由定位的CDR形成的抗原结合域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。
示例性结合多肽包括抗体变体。如本文所用的，术语“抗体变体”包括合成和工程化形式的抗体，其经改变从而使其不是天然存在的，例如包含至少两个重链部分而不是两个完整重链的抗体(例如缺失型抗体或微型抗体)；经改变以结合至两种或更多种不同抗原或结合至单一抗原上的不同表位的多特异性形式(例如双特异性，三特异性等)的抗体；连接至scFv分子的重链分子等。此外，术语“抗体变体”包括结合至相同抗原的三个，四个或更多个拷贝的多价形式的抗体(例如三价，四价等抗体)。
如本文所用的，术语“价”是指多肽中潜在的靶结合位点的数量。每个靶结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的一个特异性位点。当多肽包含多于一个靶结合位点时，每个靶结合位点可特异性结合相同或不同的分子(例如可结合至不同配体或不同抗原，或相同抗原上的不同表位)。所述结合多肽通常具有至少一个特异性针对人抗原分子的结合位点。
术语“特异性”是指特异性结合(例如与之发生免疫反应)给定靶抗原(例如人靶抗原)的能力。结合多肽可以是单特异性的并且含有特异性结合靶标的一个或多个结合位点，或者多肽可以是多特异性的并且含有特异性结合相同或不同靶标的两个或更多个结合位点。在一些实施方案中，结合多肽特异性针对相同靶标的两个不同(例如非重叠的)部分。在一些实施方案中，结合多肽特异性针对多于一个的靶标。包含结合至肿瘤细胞上表达的抗原的抗原结合位点的示例性结合多肽(例如抗体)是本领域已知的，并且来自此类抗体的一个或多个CDR可以包含在本发明表征的抗体中。
术语“连接模块”包括能够将效应模块连接至本文公开的结合多肽的模块。可以对连接模块加以选择使得其是可切割的(例如可酶促切割或pH敏感性的)或不可切割的。示例性的连接模块示于本文表2中。
如本文所用的，术语“效应模块”包括具有生物或其他功能活性的试剂(例如蛋白质、核酸、脂质、糖类、糖肽，及其片段)。例如，包含与结合多肽缀合的效应模块的修饰结合多肽与未缀合的抗体相比具有至少一种额外的功能或特性。例如，细胞毒性药物(例如效应模块)与结合多肽的缀合导致具有药物细胞毒性的结合多肽的形成，作为第二功能(即除了抗原结合之外)。在另一个实例中，第二结合多肽与结合多肽的缀合可以赋予额外的结合特性。在一些实施方案中，当效应模块是遗传编码的治疗或诊断蛋白或核酸时，可以通过本领域熟知的肽合成或重组DNA方法来合成或表达所述效应模块。在另一个方面，当效应模块是非遗传编码的肽或药物模块时，所述效应模块可以从天然来源纯化或人工合成而得。如本文所用的，术语“药物模块”包括抗炎，抗癌，抗感染(例如抗真菌，抗细菌，抗寄生虫，抗病毒等)和麻醉治疗剂。在进一步的实施方案中，所述药物模块是抗癌剂或细胞毒性剂。可相容的药物模块还可以包括前药。示例性的效应模块示于本文表1中。
如本文所用的，术语“温和氧化”是指接受来自另一物质的电子(从而自身被还原)但不非常强烈地吸引那些电子的试剂。温和氧化剂的实例包括但不限于高碘酸盐氧化酶和半乳糖氧化酶。
在一些实施方案中，“效应模块”包含“靶向模块”。如本文所用的，术语“靶向模块”是指结合至靶分子的效应模块。靶向模块可以包括但不限于蛋白质，核酸，脂质，糖类(例如聚糖)，及其组合(例如糖蛋白，糖肽和糖脂)。
如本文所用的，术语“前药”是指药物活性剂的前体或衍生物形式，其与母体药物相比具有较低的活性、反应性或易于产生副作用，并且能够被酶促活化或以其它方式转变为在体内更具活性的形式。与本发明的组合物相容的前药包括但不限于含磷酸酯的前药，含氨基酸的前药，含硫代磷酸酯的前药，含硫酸酯的前药，含肽的前药，含β-内酰胺的前药，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前药或任选取代的含苯乙酰胺的前药，5-氟胞嘧啶和可以转变为更具活性的无细胞毒性药物的其它5-氟尿苷前药。本领域技术人员可以对所需的药物模块或其前药进行化学修饰，以使该化合物的反应更便于制备本发膜的修饰结合多肽的目的。药物模块还包括本文所述药物模块的衍生物、药学上可接受的盐、酯、酰胺和醚。衍生物包括对本文鉴定的药物的修饰，其可改进或不显著降低具体药物的所需治疗活性。
如本文所用的，术语“抗癌剂”包括对赘生细胞或肿瘤细胞的生长和/或增殖有害并可用于减少、抑制或破坏恶性肿瘤的试剂。此类试剂的实例包括但不限于细胞抑制剂(cytostatic agent)，烷化剂，抗生素，细胞毒性核苷，微管蛋白结合剂，激素，激素拮抗剂，细胞毒性剂等。细胞毒剂包括托马霉素(tomaymycin)衍生物，美登素(maytansine)衍生物，隐球菌素(cryptophycine)衍生物，蒽环霉素衍生物，二磷酸盐衍生物，细霉素衍生物，链黑菌素(streptonigrin)衍生物，澳瑞他汀(auristatine)衍生物和多卡霉素(duocarmycin)衍生物。作用于延缓或减慢免疫反应性细胞或恶性细胞生长的任何药剂均在本发明的范围内。
本文所用的术语“抗原”或“靶抗原”是指能够被结合多肽的结合位点结合的分子或分子的一部分。靶抗原可以具有一个或多个表位。
术语“盐”包括金属离子。例如，金属离子包括但不限于通常价态的碱金属(Ia族)例如锂、钠和钾，碱土金属(IIa族)例如镁和钙、过渡金属例如铜、锌、镍、铁和锰。金属的示例性的通常价态包括例如钠(I)，钙(II)，镁(II)，锌(II)，铜(I)和铜(II)。包含金属离子的示例性盐包括但不限于乙酸铜(II)(Cu2(OAc)4)，乙酸锌(II)(Zn2(OAc)4)，氯化铁(Fe3Cl3)和氯化钙(CaCl2)。
II.结合多肽
在一个方面，本发明提供包含糖基化域(例如糖基化恒定域)的结合多肽(例如抗体，抗体片段，抗体变体和融合蛋白)。本文公开的结合多肽涵盖任何包含具有N-连接的糖基化位点的结构域的结合多肽。在一些实施方案中，结合多肽是抗体或其片段或衍生物。来自任何来源或物种的任何抗体均可用于本文公开的结合多肽。合适的抗体包括但不限于人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在一些实施方案中，糖基化域是Fc域。在一些实施方案中，根据EU编号，糖基化域是N297处的天然糖基化域。
在其他实施方案中，糖基化域是工程化的糖基化域。Fc域中示例性的工程化糖基化域包含根据EU编号氨基酸位置298处的天冬酰胺残基，和/或根据EU编号氨基酸位置300处的丝氨酸或苏氨酸残基。
来自任何免疫球蛋白类别(例如IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和物种的Fc域均可用于本文公开的结合多肽中。还可以使用包含来自不同物种或Ig类别的Fc域的嵌合Fc域。在一些实施方案中，Fc域是人IgG1 Fc域。在人IgG1 Fc域的情况下，Kabat位置298处的野生型氨基酸突变为天冬酰胺，以及Kabat位置300处突变为丝氨酸或苏氨酸，导致形成N-连接的糖基化共有位点(即N-X-T/S序列段，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。然而，在其他物种和/或Ig类别或同种型的Fc域的情况下，技术人员会理解如果存在脯氨酸残基，则可为必需的是突变Fc结构域的Kabat位置299以再生成N-X-T/S序列段。
在其他实施方案中，本发明提供了包含至少一个具有N-连接的糖基化位点的CH1域的结合多肽(例如抗体，抗体片段，抗体变体和融合蛋白)。根据Kabat编号，这种示例性的结合多肽可以包含例如位置114处的工程化的糖基化位点。
来自任何免疫球蛋白类别(例如IgM，IgG，IgD，IgA和IgE)和物种的CH1域均可以用于本文公开的结合多肽。还可以使用包含来自不同物种或Ig类别的CH1域的部分的嵌合CH1域。在一些实施方案中，CH1域是人IgG1 CH1域。在人IgG1域的情况下，位置114处的野生型氨基酸突变为天冬酰胺导致形成N-连接的糖基化共有位点(即N-X-T/S序列段，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)。然而，在其他物种和/或Ig类别或同种型的其他CH1域情况下，本领域技术人员会理解，可为必需的是突变CH1域的位置115和/或116以生成N-X-T/S序列段。
在一些实施方案中，本发明的结合多肽可以包含抗体的抗原结合片段。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，所述多肽片段结合抗原或与完整抗体(即与其来源的完整抗体)竞争抗原结合(即特异性结合)。抗原结合片段可以通过本领域熟知的重组或生物化学方法产生。示例性的抗原结合片段包括Fv、Fab、Fab'和(Fab')2。在示例性实施方案中，本发明的抗原结合片段是包含至少一个工程化的糖基化位点的改变的抗原结合片段。在一个示例性实施方案中，本发明的改变的抗原结合片段包含上文所述的改变的VH域。在另一个示例性实施方案中，本发明的改变的抗原结合片段包含所述的改变的CH1域。
在示例性实施方案中，结合多肽包含单链可变区序列(ScFv)。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点的单一多肽，例如通过柔性接头与VH域连接的VL域。ScFv分子可以采取VH-接头-VL方向或VL-接头-VH方向来构建。连接组成抗原结合位点的VL和VH域的柔性铰链包含约10至约50个氨基酸残基。连接肽是本领域已知的。结合多肽可以包含至少一个scFv和/或至少一个恒定区。在一个实施方案中，本发明的结合多肽可以包含至少一个连接至或融合至抗体或片段的scFv，所述抗体或片段包含CH1域(例如在Kabat位置114/EU位置118处包含天冬酰胺残基的CH1域)和/或CH2域(例如在EU位置298处包含天冬酰胺残基，和在EU位置300处包含丝氨酸或苏氨酸残基的CH2域)。
在一些示例性实施方案中，本发明的结合多肽是通过将编码抗体的DNA序列与ScFv分子(例如改变的ScFv分子)融合而产生的多价(例如四价)抗体。例如，在一个实施方案中，将这些序列进行组合，从而使得ScFv分子(例如改变的ScFv分子)在其N末端或C末端经柔性接头(例如gly/ser接头)连接至抗体的Fc片段。在另一个实施方案中，本公开的四价抗体可以通过如下方式制得：将ScFv分子融合至与CH1(例如在Kabat位置114/EU位置118处包含天冬酰胺残基的CH1域)域融合的连接肽以构建ScFv-Fab四价分子。
在另一个实施方案中，本发明的结合多肽是改变的微型抗体。本发明的改变的微型抗体是由两条多肽链组成的二聚体分子，每条多肽链包含ScFv分子(例如包含上述改变的VH域的改变的ScFv分子)，其通过连接肽与CH3域或其部分融合。可以通过使用本领域中描述的方法来构建ScFv组分和连接肽-CH3组分来制备微抗体(参见例如美国专利5,837,821或WO 94/09817Al。在另一个实施方案中，可以构建四价微型抗体。四价微型抗体可以与微型抗体相同的方式构建，除了两个ScFv分子使用柔性接头连接以外。然后将连接的scFv-scFv构建体连接至CH3域。
在另一个实施方案中，本公开的结合多肽包含双抗体。双抗体是二聚体四价分子，每个所述分子具有类似于scFv分子的多肽，但通常具有连接两个可变域的短(少于10个，例如1-5个)氨基酸残基接头，从而使得相同的多肽链上的VL和VH域不能相互作用。相反，一条多肽链的VL和VH域(分别)与第二条多肽链上的VH和VL域相互作用(参见例如WO 02/02781)。本公开的双抗体包含与CH3域融合的scFv分子。
在其他实施方案中，结合多肽包含多特异性或多价抗体，其包含相同多肽链上串联的一个或多个可变结构域，例如串联的可变域(TVD)多肽。示例性的TVD多肽包括美国专利号5,989,830中描述的“双头”或“双-Fv”构型。在双-Fv构型中，两个不同抗体的可变域以串联方向在两条分离的链(一条重链和一条轻链)上表达，其中一条多肽链具有由肽接头分隔的两个串联的VH域(VH1-接头-VH2)，而另一条多肽链由通过肽接头串联连接的互补VL域组成(VL1-接头-VL2)。在十字架型双头构型中，两个不同抗体的可变域以串联方向在两条分离的多肽链(一条重链和一条轻链)上表达，其中一条多肽链具有由肽接头分隔的两个串联的VH域(VH1-接头-VH2)，而另一条多肽链由通过肽接头以相反方向串联连接的互补VL域组成(VL2-接头-VL1)。基于“双-Fv”形式的其他抗体变体包括双-可变-域IgG(DVD-IgG)双特异性抗体(参见美国专利号7,612,181和TBTI格式(参见US 2010/0226923 A1)。将恒定域添加至双-Fv的各条链(CH1-Fc添加至重链而κ或λ恒定域添加至轻链)产生了功能性的双特异性抗体，而不需要额外的修饰(即明显添加恒定域以增强稳定性)。
在另一个示例性实施方案中，结合多肽包含基于“双头”构型的交叉型双重可变域IgG(CODV-IgG)双特异性抗体(参见US20120251541A1，其通过提述以其整体并入本文)。CODV-IgG抗体变体具有一个多肽链(其具有与CL域串联连接的VL域(VL1-L1-VL2-L2-CL))和第二多肽链(具有以与CH1域相反方向串联连接的互补VH域(VH2-L3-VH1-L4-CH1))，其中所述多肽链形成交叉型轻链-重链对。在一些实施方案中，所述第二多肽可进一步连接至Fc域(VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc)。在一些实施方案中，接头L3的长度至少是接头L1的两倍和/或接头L4的长度至少是接头L2的两倍。例如，L1和L2的长度可以是1-3个氨基酸残基，L3的长度可以是2-6个氨基酸残基，而L4的长度可以是4-7个氨基酸残基。合适的接头的例子包括单甘氨酸(Gly)残基；双甘氨酸(Gly-Gly)；三甘氨酸(Gly-Gly-Gly)；具有4个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:40)；具有5个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:41)；具有6个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:42)；具有7个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:43)；具有8个甘氨酸残基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:44)。还可以使用氨基酸残基的其他组合，如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:45)和肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:46)。
在一些实施方案中，结合多肽包含免疫粘附素分子，其包含与抗体恒定区融合的非抗体结合区(例如受体、配体、或细胞粘附分子)(参见例如Ashkenazi等,Methods,1995 8(2),104-115，其通过提述以其整体并入本文)。
在一些实施方案中，结合多肽包含免疫球蛋白样域。合适的免疫球蛋白样域包括但不限于纤连蛋白域(参见例如Koide等(2007),Methods Mol.Biol.352:95-109，其通过提述以其整体并入本文)、DARPin(参见例如Stumpp等(2008)Drug Discov.Today 13(15-16):695-701，其通过提述以其整体并入本文)、蛋白A的Z域(参见，Nygren等(2008)FEBS J.275(11):2668-76，其通过提述以其整体并入本文)、脂钙蛋白(Lipocalins)(参见，例如Skerra等(2008)FEBS J.275(11):2677-83，其通过提述以其整体并入本文)、Affilins(参见例如Ebersbach等(2007)J.Mol.Biol.372(1):172-85，其通过提述以其整体并入本文)、Affitins(参见例如Krehenbrink等(2008).J.Mol.Biol.383(5):1058-68，其通过提述以其整体并入本文)、Avimers(参见例如Silverman等(2005)Nat.Biotechnol.23(12):1556-61，其通过提述以其整体并入本文)、Fynomers(参见，例如Grabulovski等(2007)J Biol Chem282(5):3196-3204，其通过提述以其整体并入本文)、及Kunitz域肽(参见例如Nixon等(2006)Curr Opin Drug Discov Devel 9(2):261-8，其通过提述以其整体并入本文)。
III.N-连接的聚糖
在一些实施方案中，本发明表征的结合多肽采用这样的聚糖，所述聚糖经天冬酰胺残基“N-连接”至结合多肽的多肽骨架中的糖基化位点。所述糖基化位点可以是天然的或工程化的糖基化位点。另外或作为选择地，所述聚糖可以是含有一个或多个非天然键(linkage)的天然聚糖或工程化聚糖(例如修饰聚糖)。“N-聚糖”或“N-连接的聚糖”经N-乙酰葡糖胺残基附接于蛋白中的天冬酰胺或精氨酸残基的酰胺氮处。这些“N-连接的糖基化位点”存在于含有例如氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸的肽一级结构中，其中X是除脯氨酸和天冬氨酸之外的任意氨基酸残基。此类N-聚糖充分描述于例如Drickamer K,Taylor ME(2006).Introduction to Glycobiology,第二版中，其通过提述以其整体并入本文。
在一些实施方案中，提供了糖工程化的结合蛋白和/或结合多肽及制备糖工程化的结合蛋白和/或结合多肽的方法。如本文所用的，术语“糖工程化”是指任何本领域公认的用于改变结合蛋白组合物的糖型概貌以生成“修饰聚糖”的方法。
如本文所用的术语“G0糖型”，“G1糖型”和“G2糖型”是指分别具有零个，一个或两个末端半乳糖残基的N-聚糖糖型。这些术语包括岩藻糖基化的或包含二等分的N-乙酰葡糖胺残基的G0、G1和G2糖型。
在一些实施方案中，G1和G2糖型还包含连接至末端半乳糖残基的一个或两个的唾液酸残基，以形成G1S1、G2S1和G2S2糖型。如本文所用的术语“G1S1糖型”、“G2S1糖型”和“G2S2糖型”是指这样的N-聚糖糖型，其具有连接至G1糖型中唯一末端半乳糖残基的唾液酸残基，所述末端半乳糖残基的其中一个在G2糖型中，或者两个末端半乳糖残基分别都在G2糖型中。这些术语包括岩藻糖基化的或包含二等分N-乙酰葡糖胺残基的G1S1、G2S1和G2S2糖型。在一些实施方案中，G1S1、G2S1和G2S2糖型的唾液酸残基通过α-2,6-唾液酸键连接至每个糖型的末端半乳糖残基，以增强结合分子的抗炎活性(参见例如Anthony等,PNAS 105:19571-19578,2008)。
如本文所用的术语“G1F糖型”，“G2F糖型”，“G1S1F糖型”，“G2S1F糖型”和“G2S2F糖型”是指分别经岩藻糖基化的“G1糖型”、“G2糖型”、“G1S1糖型”、“G2S1糖型”和“G2S2糖型”。
在一些示例性实施方案中，结合多肽包含抗体Fc域的天然糖基化位点。根据EU编号，该天然糖基化位点包含Fc域的位置297处的野生型天冬酰胺残基(N297)。位于该位置的天然N-连接的聚糖通常通过β-糖基酰胺键连接至N297侧链的氮基团。然而，也可以使用其它合适的本领域公认的连接/键(linkage)。N297 N-连接的聚糖可以含有末端甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖或唾液酸。
在其他示例性实施方案中，结合多肽包含一个或多个工程化的糖基化位点。此类工程化的糖基化位点包含用天冬酰胺残基对结合多肽的多肽骨架中的一个或多个野生型氨基酸进行的取代，所述天冬酰胺残基能够被细胞的糖基化酶N-糖基化。示例性的工程化的糖基化位点包括引入根据EU编号Fc域的氨基酸位置298处的天冬酰胺(298N)，或根据Kabat编号CH1域的氨基酸位置114处(根据EU编号CH1域的位置118处)的天冬酰胺(114N)。
任何类型的天然存在的或合成的(即非天然的或修饰的)N-连接的聚糖都可以连接至本发明所表征的结合多肽的糖基化位点。在一些实施方案中，聚糖包含可以被氧化(例如通过高碘酸盐处理或半乳糖氧化酶来氧化)的糖(例如位于寡糖末端的糖残基)，以产生适合于与效应模块(例如反应性醛基)缀合的基团。合适的可氧化糖包括但不限于半乳糖和唾液酸(例如N-乙酰神经氨酸)。在一些实施方案中，聚糖是双分枝的(biantennary)聚糖。在一些实施方案中，聚糖是天然存在的哺乳动物糖型。
糖基化可以通过本领域已知的任何方式实现。在一些实施方案中，通过在能够进行N-连接的糖基化的细胞中表达结合多肽来实现糖基化。可以采用任何天然或工程化细胞(例如原核或真核细胞(例如CHO或NS0细胞))。一般而言，采用哺乳动物细胞来产生糖基化。在哺乳动物细胞中产生的N-聚糖通常称为复合的高甘露糖的杂合型N-聚糖(参见例如Drickamer(2006))。这些复合的N-聚糖具有这样的结构，所述结构通常具有2至6个外分支，其中唾液酸乳糖胺序列连接至内核结构Man3GlcNAc2。复合的N-聚糖具有至少一个分支，和/或至少两个分支的交替的GlcNAc和半乳糖(Gal)残基，其终止于寡糖，例如：NeuNAc-；NeuAcα2,6GalNAcα1-；NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAcα1-；和NeuAcα2,3/6Galβ1,4GlcNAcβ1。此外，硫酸酯可以存在于半乳糖、GalNAc和GlcNAc残基上。NeuAc可以经O-乙酰化或经NeuG1(N-羟乙酰神经氨酸)置换。复合的N-聚糖还可具有二等分GlcNAc和核心岩藻糖(Fuc)的链内取代。
另外或作为选择地，糖基化可以通过酶方法在体外实现或修饰。例如，可以采用一种或多种糖基转移酶将特定的糖残基添加至结合多肽的天然或工程化N-聚糖，并且可以采用一种或多种糖苷酶从N-连接的聚糖中除去不需要的糖。这种酶方法是本领域公知的(参见例如WO2007/005786,其通过提述以其整体并入本文)。
IV.免疫学效应功能和Fc修饰
在一些实施方案中，结合多肽可以包含介导一种或多种效应功能的抗体恒定区(例如IgG恒定区，例如人IgG恒定区，例如人IgG1或IgG4恒定区)。例如，C1复合物对抗体恒定区的结合可激活补体系统。补体系统的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体系统的激活也刺激炎症响应，并且还可能参与自身免疫性超敏反应。此外，抗体通过Fc区结合至多种细胞上的受体(抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合至细胞上的Fc受体(FcR))。存在许多特异性针对不同类别抗体的Fc受体，所述不同类别的抗体包括IgG(γ受体)，IgE(ε受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体对细胞表面上Fc受体的结合引发许多重要且多样的生物反应，包括抗体包被的颗粒的吞噬和破坏，免疫复合体的清除，杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转运，和免疫球蛋白生产的控制。在一些实施方案中，结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)结合至Fc-γ受体。在可选择的实施方案中，结合多肽可以包含缺乏一种或多种效应功能(例如ADCC活性)的和/或不能结合Fcγ受体的恒定区。
一些实施方案包括这样的抗体，所述抗体中一个或多个恒定区结构域中的至少一个氨基酸已缺失或经其他方式的改变，以提供所需的生物化学特征，如与大致相同免疫原性的完整无改变的抗体相比，降低的或增强的效应功能，非共价二聚化的能力，增加的定位于肿瘤位点的能力，降低的血清半衰期、或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法的一些抗体是域缺失型抗体，其包含与免疫球蛋白重链相似但缺少一个或多个重链域的至少一部分的多肽链。例如，在一些抗体中，修饰抗体的恒定区的一个完整域是缺失的，例如CH2域的全部或部分是缺失的。
在一些其他实施方案中，结合多肽包含来源于不同抗体同种型的恒定区(例如来自人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的两种或更多种的恒定区)。在其他实施方案中，结合多肽包含嵌合铰链(即包含铰链部分的铰链，所述铰链部分来源于不同抗体同种型的铰链域，例如IgG4分子的上铰链域和IgG1中间铰链域)。在一个实施方案中，结合多肽包含来自人IgG4分子的Fc区或其部分和所述分子的核心铰链区中的Ser228Pro突变(EU编号)。
在一些实施方案中，可使用本领域已知的技术来突变Fc部分以增加或降低效应功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他方式)可以降低循环修饰抗体的Fc受体结合，由此提高肿瘤定位。在其它情况下，可能符合本发明的恒定区修饰缓和补体结合，并因此降低血清半衰期和缀合的细胞毒素的非特异性结合。但是恒定区的其它修饰可用于修饰二硫键或寡糖模块，其允许由于增加的抗原特异性或柔性而增强定位。可以容易地使用众所周知的免疫学技术测量和量化所得修饰的生理学概貌，生物利用度和其他生物化学效果，例如肿瘤定位，生物分布和血清半衰期，而无需过度实验。
在一些实施方案中，抗体中采用的Fc域是Fc变体。如本文所用的，术语“Fc变体”是指相对于所述Fc域所来源的野生型Fc域具有至少一个氨基酸取代的Fc结构域。例如，其中Fc域来源于人IgG1抗体，所述人IgG1 Fc域的Fc变体相对于所述Fc域包含至少一个氨基酸取代。
Fc变体的氨基酸取代可位于Fc域内的任何位置(即任何EU惯用氨基酸位置)。在一个实施方案中，Fc变体包含在位于铰链域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含位于CH2域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含位于CH3域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含位于CH4域或其部分中的氨基酸位置处的取代。
结合多肽可以采用已知赋予效应功能和/或FcR结合的改进(例如减少或增强)的任何本领域公认的Fc变体。所述Fc变体可以包括例如如下国际PCT公布文件中公开的任一种氨基酸取代：WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、和WO06/085967A2或美国专利号5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784，其各自通过提述以其整体并入本文。在一个示例性实施方案中，结合多肽可以包含在EU位置268(例如H268D或H268E)处包含氨基酸取代的Fc变体。在另一个示例性实施方案中，结合多肽可以包含EU位置239(例如S239D或S239E)和/或EU位置332(例如I332D或I332Q)处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，结合多肽可以包含Fc变体，其包含改变抗体的抗原非依赖性效应功能，特别是结合多肽的循环半衰期的氨基酸取代。当与缺少这些取代的结合多肽相比时，此类结合多肽显示出对FcRn的结合增加或减少，因此其分别在血清中具有增加或减少的半衰期。预期具有针对FcRn改善的亲和力的Fc变体具有较长的血清半衰期，并且此类分子在治疗其中需要所施用的抗体有长半衰期的哺乳动物的方法中有用，例如用于治疗慢性疾病或病症。相反，具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体预期具有较短的半衰期，并且此类分子也可用于例如施用于这样的哺乳动物，所述哺乳动物中缩短的循环时间可能是有利的，例如用于体内诊断成像或用于起始抗体长时间存在于循环中时具有毒性副作用的情况中。具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体也较不可能穿过胎盘，因此也可用于治疗孕妇的疾病或病症。此外，可能需要降低的FcRn结合亲和力的其他应用包括定位于脑，肾，和/或肝的应用。在一个示例性实施方案中，改变的结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)表现出穿过来自脉管系统的肾小球上皮的转运降低。在另一个实施方案中，改变的结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)表现出降低的从脑穿过血脑屏障(BBB)到血管空间中的转运。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的抗体包含Fc域，其在Fc域的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代。FcRn结合环由氨基酸残基280-299(根据EU编号)组成。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代在国际PCT公开号WO05/047327中公开，其通过提述以其整体并入本文。在一些示例性实施方案中，结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)包含具有一个或多个以下取代的Fc域：V284E，H285E，N286D，K290E和S304D(EU编号)。在其他示例性实施方案中，结合分子包含具有双突变H433K/N434F的人Fc域(参见例如美国专利号8,163,881)。
在其他实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法的结合多肽具有恒定区，例如IgG1或IgG4重链恒定区，其经改变以减少或消除糖基化。例如，结合多肽(例如抗体或其抗原结合片段)还可以包含Fc变体，所述Fc变体包含改变抗体Fc的糖基化的氨基酸取代。例如，所述Fc变体可以具有降低的糖基化(例如N-或O-连接的糖基化)。在示例性实施方案中，Fc变体包含通常存在于氨基酸位置297(EU编号)处的N-连接的聚糖的降低的糖基化。在另一个实施方案中，所述抗体在糖基化基序附近或内部具有氨基酸取代，例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序。在一个具体实施方案中，所述抗体包含在氨基酸位置228或299(EU编号)处具有氨基酸取代的Fc变体。在更具体的实施方案中，所述抗体包含IgG1或IgG4恒定区，所述IgG1或IgG4恒定区包含S228P和T299A突变(EU编号)。
赋予减少或改变的糖基化的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布No.WO05/018572中，其通过提及其整体并入本文。在一些实施方案中，结合多肽经修饰以消除糖基化。此类结合多肽可以称为“非糖基化的(agly)”结合多肽(例如“非糖基化的(agly)”抗体)。不受理论的束缚，据信“非糖基化的”结合多肽可能在体内具有改进的安全性和稳定性概貌。非糖基化的结合多肽可以是其任何同种型或亚类，例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在一些实施方案中，非糖基化的结合多肽包含缺乏Fc效应功能的IgG4抗体的非糖基化的Fc区，由此消除了对表达IL-6的正常重要器官的Fc介导的毒性潜在可能性。在其他实施方案中，结合多肽包含改变的聚糖。例如，抗体可以在Fc区的Asn297处的N-聚糖上具有减少数目的岩藻糖残基，即是去岩藻糖基化的(afucosylated)。无岩藻糖基化的增加NK细胞上的FcγRII结合并强力地增加ADCC。已经显示包含抗IL-6scFv和抗CD3 scFv的双抗体诱导通过ADCC对表达IL-6的细胞的杀伤。因此，在一个实施方案中，无岩藻糖基化的抗IL-6抗体用于靶向和杀伤表达IL-6的细胞。在另一个实施方案中，结合多肽可以在Fc区的Asn297的N-聚糖上具有改变的数目的唾液酸残基。许多本领域公认的方法可用于制备“非糖基化”抗体或具有改变的聚糖的抗体。例如，具有修饰的糖基化途径(例如糖基转移酶缺失)的遗传工程化的宿主细胞(例如修饰的酵母，例如毕赤酵母(Picchia)，或CHO细胞)可以用于产生这样的抗体。
V.效应模块
在一些实施方案中，本发明的结合多肽包含效应模块(例如靶向模块)。通常，这些效应模块缀合(直接或通过接头模块)至结合多肽上的N-连接的聚糖，(例如连接至CH2域的N298(EU编号)和/或CH1域的N114(Kabat编号)的N-连接的聚糖)。在一些实施方案中，结合多肽是包含在Kabat位置114(EU位置118)处具有聚糖的两个CH1域的全长抗体，其中两个聚糖都缀合至一个或多个效应模块。
可以将任何效应模块添加至本文公开的结合多肽。效应模块可将非天然功能添加至改变的抗体或其片段，而不显著改变结合多肽的固有活性。在一些示例性实施方案中，效应模块是靶向模块(例如糖肽或新聚糖)。本公开的修饰结合多肽(例如抗体)可以包含一个或多个效应模块，其可以是相同或不同的。
在一个实施方案中，效应模块可以是式(I)：
H2N-Q-CON-X
式(I)
其中：
A)Q是NH或O；且
B)CON是连接体模块；且
C)X是效应模块(例如本文定义的靶向模块)。
所述连接体模块将治疗剂连接至H2N-Q-。连接体模块可以包括本领域技术人员所知的合适组分的至少一个，其包括例如亚烷基组分，聚乙二醇组分，聚(甘氨酸)组分，聚(噁唑啉)组分，羰基组分，衍生自半胱氨酰胺的组分，衍生自与瓜氨酸缀合的缬氨酸的组分，和衍生自4-氨基苄基氨基甲酸酯的组分，或其任何组合。
在另一个实施方案中，式(I)的效应模块可以是式(Ia)：
H2N-Q-CH2-C(O)-Z-X
式(Ia)，
其中：
A)Q是NH或O；且
B)Z是-Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f，
其中
i.Cys是半胱氨酰氨衍生的组分；
ii.MC是衍生自马来酰亚胺的组分；
iii.VC是衍生自与瓜氨酸偶联的缬氨酸的组分；
iv.PABC是衍生自4-氨基苄基氨基甲酸酯的组分；
v.X是效应模块(例如本文定义的靶向模块)；
vi.a是0或1；
vii.b是0或1；
viii.c是0或1；且
ix.f是0或1。
“衍生自半胱氨酰氨的组分”是与H2N-Q-CH2-C(O)-附接的点。在一个实施方案中，“衍生自半胱氨酰氨的组分”可以指具有如下结构的效应模块的一个或多个部分：
Figure BDA0003868969060000571
在一个实施方案中，效应模块的“Cys”组分可以包括一个此种部分。例如，如下结构显示了具有一个此种部分的效应模块(其中“Cys”组分用虚线框标示)。
Figure BDA0003868969060000572
在另一个实施方案中，效应模块的“Cys”组分可以包括一个或多个此种部分。例如，如下模块含有两个此种部分：
Figure BDA0003868969060000573
从该结构可以看出，每个“Cys”组分带有一个-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X基团。
在一个实施方案中，短语“衍生自马来酰亚胺的组分”可以指具有如下结构的效应模块的任何部分：
Figure BDA0003868969060000574
其中d是2-5的整数。效应模块中的任何Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X基团中包含的MC组分的数目用下标“a”表示且可以是0或1。在一个实施方案中，a是1。在另一个实施方案中，a或b是0。
在一个实施方案中，可以将“Cys”组分经“Cys”组分中的硫原子连接至“MC”组分，如以下结构中虚线框所标示：
Figure BDA0003868969060000581
在一个实施方案中，短语“衍生自与瓜氨酸偶联的缬氨酸的组分”可以指具有如下结构的效应模块的任何部分：
Figure BDA0003868969060000582
效应模块中任何Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X基团中包含的VC组分的数目用下标“b”表示且可以是0或1。在一个实施方案中，b是1。在另一个实施方案中，b是0。
在一个实施方案中，短语“衍生自4-氨基苄基氨基甲酸酯的组分”可以指具有如下结构的效应模块的任何部分：
Figure BDA0003868969060000583
效应模块中任何Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X基团中包含的PABC组分的数目用下标“c”表示且可以是0或1。在一个实施方案中，c是1。在另一个实施方案中，c是0。
在一个实施方案中，“C16H32O8C2H4”是指如下结构：
Figure BDA0003868969060000584
效应模块中任何Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X基团中包含的C16H32O8单元的数目用下标“f”表示，在一个实施方案中，f是1。在另一个实施方案中，f是0。
在一个实施方案中，a是1，b是1，c是1，且f是0。
a)治疗性效应模块
在一些实施方案中，本发明的结合多肽可以缀合至包含治疗剂的效应模块，例如药物模块(或其前药)或放射性标记的化合物。在一个实施方案中，所述治疗剂是细胞毒素。示例性的细胞毒性治疗剂示于本文表1中。
表1.示例性的细胞毒性治疗剂
Figure BDA0003868969060000591
其它示例性药物模块包括抗炎，抗癌，抗感染(例如抗真菌，抗细菌，抗寄生虫，抗病毒等)和麻醉治疗剂。在进一步的实施方案中，药物模块是抗癌剂。示例性的抗癌剂包括但不限于细胞抑制剂，酶抑制剂，基因调节剂，细胞毒性核苷，微管蛋白结合剂或微管蛋白抑制剂，蛋白酶体抑制剂，激素和激素拮抗剂，抗血管生成剂等。示例性的细胞抑制性抗癌剂包括烷化剂，例如蒽环类药物(例如阿霉素，卡利霉素，环孢菌素A，氯喹，甲基叶酸(methopterin)，光辉霉素(mithramycin)，泊非霉素(porfiromycin)，链黑菌素，泊非霉素，蒽二酮类(anthracenediones)，和氮丙啶类)。其它细胞静止性抗癌剂包括DNA合成抑制剂(例如甲氨蝶呤和二氯甲氨蝶呤，3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物，氨基喋呤，胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷，5-氟-5'-脱氧尿苷，5-氟尿嘧啶，更昔洛韦，羟基脲，放线菌素-D和丝裂霉素C)，DNA嵌入剂或交联剂(例如博来霉素(bleomycin)，卡铂，卡莫司汀(carmustine,)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，环磷酰胺，顺-二氯二氨基铂(II)(顺铂)，美法仑，米托蒽醌，和奥沙利铂)，和DNA-RNA转录调节剂(例如放线菌素D，柔红霉素(daunorubicin,)，多柔比星，高三尖杉酯碱和伊达比星)。与本发明相容的其它示例性细胞抑制剂包括安莎霉素苯醌类，醌型衍生物(例如喹诺酮，染料木素，细菌素(bactacyclin))，白消安，异环磷酰胺，氮芥，三亚胺醌类(triaziquone)，地吖醌(diaziquone)，卡波醌(carbazilquinone)，吲哚醌EO9(indoloquinone EO9)，二氮杂环丙烯基-苯醌甲基DZQ，三乙烯基磷酰胺，和亚硝基脲化合物(例如卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀)。
示例性的细胞毒性核苷抗癌剂包括但不限于：腺苷阿拉伯糖苷，阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氟尿嘧啶，氟达拉滨，氟尿苷，替加氟(ftorafur)和6-巯基嘌呤。示例性抗癌微管蛋白结合剂包括但不限于：紫杉烷类(例如帕利他赛，多西他赛，紫杉烷(taxane))，诺考达唑，根霉素，多拉司他汀类(dolastatins)(例如多拉司他汀-10，-11或-15)，秋水仙素和类秋水仙素(例如ZD6126)，考布他汀(combretastatins)(例如考布他汀A-4，AVE-6032)和长春花生物碱类(例如长春花碱，长春新碱，长春地辛和长春瑞滨(navelbine))。示例性的抗癌激素和激素拮抗剂包括但不限于：皮质类固醇(例如泼尼松)，孕激素(例如羟孕酮或甲羟孕酮(medroprogesterone))，雌激素(例如二乙基己烯雌酚)，抗雌激素(例如他莫昔芬)，雄激素(例如睾酮)，芳香化酶抑制剂(例如氨鲁米特(aminogluthetimide))，17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素，4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺，芹菜素，布雷菲德菌素A，西咪替丁，二氯亚甲基-二膦酸，亮丙瑞林(leuprorelin)，促黄体生成激素释放激素，皮斐松-a(pifithrin-a)，雷帕霉素，性激素结合球蛋白，和毒胡萝卜素。示例性的抗癌、抗血管生成化合物包括但不限于：血管他汀K1-3，DL-a-二氟甲基-鸟氨酸，内皮抑制素，烟曲霉素，染料木黄酮，米诺环素，十字孢碱和(±)-沙利度胺。
示例性的抗癌酶抑制剂包括但不限于：S(+)-喜树碱，姜黄素，(-)-鱼藤素，5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷(5,6-diCH1orobenz-imidazole 1-β-D-ribofuranoside)，依托泊苷，福美坦，福司曲星，牛奶树碱(hispidin)，2-亚氨基-1-咪唑啉乙酸(2-imino-l-imidazolidineacetic acid)(环肌氨酸)，美维诺林(mevinolin)，曲古抑菌素A(trichostatin A)，酪氨酸磷酸化抑制剂AG 34，和酪氨酸磷酸化抑制剂AG 879。
示例性的抗癌基因调节剂包括但不限于：5-氮杂-2'-脱氧胞苷，5-氮杂胞苷，胆钙化醇(维生素D3)，4-羟基他莫昔芬，褪黑激素，米非司酮，雷洛昔芬，反式视黄醛(维生素A醛)，视黄酸，维生素A酸，9-顺-视黄酸，13-顺-视黄酸，视黄醇(维生素A)，他莫昔芬，和曲格列酮。
其它类别的抗癌剂包括但不限于：蝶啶族药物，二炔类(diynenes)和鬼臼毒素类。这些类别的特别有用的成员包括例如甲基叶酸，鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷或磷酸依托泊苷，异长春碱(leurosidine)，长春地辛，环长春碱等。
与本文教导相容的其它抗癌剂包括澳瑞他汀类(auristatins)(例如澳瑞他汀E和单甲基澳瑞他汀E)，格尔德霉素，卡奇霉素，短杆菌肽D，类美登素类(maytansanoids)(例如美登素)，新制癌菌素，拓扑替康(topotecan)，紫杉烷，细胞松弛素B，溴化乙锭，依米丁，替尼泊苷(tenoposide)，秋水仙素，二羟基蒽二酮，米托蒽醌，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素及其类似物或同系物。
与本文教导相容的其它抗癌剂包括托马霉素衍生物，美登素衍生物，隐球菌素衍生物，蒽环霉素衍生物，二磷酸盐衍生物，细霉素衍生物，链黑菌素衍生物，澳瑞他汀衍生物和多卡霉素衍生物。
可以用作药物模块的另一类相容的抗癌剂是可以有效地针对肿瘤或免疫反应性细胞的放射增敏药物。这种药物模块增强对电离辐射的敏感性，由此增加放射治疗的功效。不受理论的束缚，用放射增敏药物模块修饰并被肿瘤细胞内化的抗体将放射增敏剂递送至更靠近放射增敏作用最大的核。失去放射增敏剂模块的抗体会从血液中快速清除，将剩余的放射增敏剂定位在靶肿瘤中，并在正常组织中提供最小的摄取。在从血液中清除后，可以通过特异性地指向肿瘤的外部束辐射、直接植入肿瘤中的放射性、或使用相同修饰抗体的全身放射免疫疗法来施用辅助放射治疗。
在一个实施方案中，治疗剂包括具有能够在核DNA中引起多链断裂的导致细胞死亡的高能电离辐射的放射性核素或放射性标记。示例性的高能放射性核素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。这些同位素通常产生具有短路径长度的高能α-或β-粒子。此类放射性核素杀死与它们非常接近的细胞，例如缀合物已经附着或已经进入的肿瘤细胞。它们对非定位的细胞几乎没有或没有影响，并且基本上是非免疫原性的。或者，高能同位素可以通过其它稳定同位素的热辐射产生，例如在硼中子俘获疗法中那样(Guan等,PNAS,95:13206-10,1998)。
在一个实施方案中，治疗剂选自MMAE、MMAF、和PEG8-Do110。
示例性的治疗性效应模块包括如下结构：
Figure BDA0003868969060000621
Figure BDA0003868969060000631
在一个实施方案中，效应模块选自：
Figure BDA0003868969060000632
Figure BDA0003868969060000641
在一些实施方案中，效应模块含有多于一个治疗剂。这些多个治疗剂可以是相同的或不同的。
b)诊断性效应模块
在一些实施方案中，本发明的结合多肽缀合至包含诊断剂的效应模块。在一个实施方案中，诊断剂是可检测的小分子标记，例如生物素，荧光团，发色团，自旋共振探针或放射性标记。示例性荧光团包括荧光染料(例如荧光素，罗丹明等)和其它发光分子(例如鲁米那(luminal))。荧光团可以是对环境敏感的，使得其在位置接近于修饰的结合多肽中的一个或多个残基时其荧光变化，所述结合多肽在结合底物(例如丹磺酰基探针)时经历结构变化。示例性的放射性标记物包括含有具有一个或多个低敏性核的原子(13C、15N、2H、125I、124I、123I、99Tc、43K、52Fe、64Cu、68Ga、111In等)的小分子。放射性核素可以是例如γ，光子或正电子发射放射性核素，其半衰期适于在施用和定位于成像部位之间运行的时间之后允许活性或检测。
在一个实施方案中，诊断剂是多肽。示例性诊断多肽包括具有荧光或显色活性的酶，所述活性例如切割形成作为产物的荧光团或发色团的底物(即报告蛋白，如荧光素酶)的能力。其他诊断蛋白可以具有内在的荧光或显色活性(例如来自生物发光海洋生物的绿色，红色和黄色荧光生物发光水母发光蛋白)，或者它们可以包含含有一个或多个低能放射性核(13C、15N、2H、125I、124I、123I、99Tc、43K、52Fe、64Cu、68Ga、111In等)的蛋白。
关于与本发明相连的放射性标记的缀合物的使用，本发明的结合多肽可以是直接标记的(例如通过碘化标记)或可以通过使用螯合剂间接标记。如本文所用的，短语“间接标记”和“间接标记方法”都是指螯合剂共价连接至结合多肽，并且至少一个放射性核素与螯合剂结合。此类螯合剂通常称为双功能螯合剂，因为它们结合多肽和放射性同位素二者。示例性螯合剂包括1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二亚乙基三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于间接标记的示例性放射性核素包括111In和90Y。大多数成像研究使用5mCi 111In标记的抗体，因为该剂量与较低剂量相比既安全并且具有增加的成像效率，其中最佳成像发生在抗体施用后3至6天。参见例如Murray,(1985),J.Nuc.Med.26:3328和Carraguillo等(1985),J.Nuc.Med.26:67。用于直接标记的示例性放射性核素是131I。本领域技术人员会理解，根据所选择的要缀合的试剂，也可以组装非放射性缀合物。
在一些实施方案中，诊断性效应模块是FRET(荧光共振能量转移)探针。FRET已经用于多种诊断应用，包括癌症诊断。FRET探针可以包含连接FRET探针的供体和受体模块的可切割接头(酶敏感性或pH接头)，其中切割导致增强的荧光(包括近红外光)(参见例如A.Cobos-Correa等Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity inpulmonary inflammation,Nature Chemical Biology(2009),5(9),628-63；S.Gehrig等Spatially Resolved Monitoring of Neutrophil Elastase Activity withRatiometric Fluorescent Reporters(2012)Angew.Chem.Int.Ed.,51,6258-6261)。
在一个实施方案中，效应模块选自：
Figure BDA0003868969060000651
c)官能化的效应模块
在一些实施方案中，可以将效应模块官能化，以含有除效应模块本身之外的一个或多个额外的基团。例如，效应模块可以含有在特定条件下从结合多肽释放效应模块的可切割接头。在示例性实施方案中，效应模块可以包含可被细胞酶切割和/或pH敏感性接头。另外地或作为选择地，效应模块可以含有当被吸收到细胞中时被细胞内谷胱甘肽切割的二硫键。示例性的二硫化物和pH敏感性接头提供如下：
Figure BDA0003868969060000661
在其他实施例中，效应模块可以包含亲水性和生物相容性模块，例如聚(甘氨酸)，聚(噁唑啉)，和/或PEG模块。示例性结构(“Y”)提供如下：
Figure BDA0003868969060000662
在一些实施方案中，效应模块含有氨基氧基，其促进经稳定肟连接与结合多肽的缀合。含有氨基氧基基团的示例性效应模块示于本文表2中。
表2.示例性的氨基氧基效应模块(其中X可以是任何接头，Y是任何间隔基，并且其中X和/或Y是任选的)
Figure BDA0003868969060000671
Figure BDA0003868969060000681
在其他实施方案中，效应模块含有酰肼和/或N-烷基化的肼基团以促进经稳定腙连接对结合多肽的缀合。含有氨基氧基基团的示例性效应模块示于本文表14中。
表14.示例性的腙和/或酰肼效应模块
Figure BDA0003868969060000682
Figure BDA0003868969060000691
d)靶向模块
在一些实施方案中，效应模块包含特异性结合至一个或多个靶分子的靶向模块。可以使用任何类型的靶向模块，包括但不限于蛋白质，核酸，脂质，糖类(例如聚糖)，及其组合(例如糖蛋白，糖肽和糖脂)。在一些实施方案中，靶向模块是糖类或糖肽。在一些实施方案中，靶向模块是聚糖。靶向模块可以是天然或非天然存在的分子。适于缀合的靶向模块可以包括含有氨基氧基接头的那些(参见例如图40和41)。
本发明中描述的靶向模块可以在体外或体内结合至任何类型的细胞，包括但不限于动物(例如哺乳动物)，植物或昆虫细胞。细胞可以是内胚层，中胚层或外胚层起源的，并且可以包括任何细胞类型。在一些实施方案中，靶向模块结合至细胞，例如哺乳动物细胞，促进结合多肽向靶细胞的递送，例如提高细胞靶向和/或摄取。示例性靶细胞包括但不限于免疫细胞(例如淋巴细胞如B细胞，T细胞，天然杀伤(NK)细胞，嗜碱性粒细胞，巨噬细胞或树突细胞)，肝脏细胞(例如肝细胞或非实质细胞如肝窦内皮细胞，Kupffer细胞或肝星状细胞)，肿瘤细胞(例如任何恶性或良性细胞，包括肝癌细胞，肺癌细胞，肉瘤细胞，白血病细胞，或淋巴瘤细胞)，血管细胞(例如主动脉内皮细胞或肺动脉内皮细胞)，上皮细胞(例如简单鳞状上皮细胞，简单柱状上皮细胞，假复层柱状上皮细胞，或分层鳞状上皮细胞)，或间充质细胞(例如淋巴和循环系统的细胞、骨和软骨细胞)。
在一个实施方案中，包含一个或多个靶向模块的结合多肽是由细胞内化的。在另一个实施方案中，包含一个或多个由细胞内化的靶向模块的结合多肽的量大于缺乏由细胞内化的靶向模块的参考结合多肽的量。
在一个实施方案中，靶向模块结合至靶细胞上的受体。例如，靶向模块可以包含结合至细胞上的甘露糖-6-磷酸受体的甘露糖-6-磷酸模块。在其他示例性实施方案中，靶向模块结合靶细胞上的Siglec。示例性Siglec包括唾液酸粘附素(Siglec-1)、CD22(Siglec-2)、CD33(Siglec-3)、MAG(Siglec-4)、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14、或Siglec-15。在其他实施方案中，靶向模块包含α2,3-，α2,6-或α2,8-连接的唾液酸残基。在进一步的实施方案中，所述靶向模块包含α2,3-唾液酸乳糖模块或α2,6-唾液酸乳糖模块。其它示例性受体包括凝集素受体，其包括但不限于C型凝集素受体，半乳凝素，和L型凝集素受体。示例性的凝集素受体包括：DEC-205(CD205；淋巴细胞抗原75)、巨噬细胞甘露糖受体(MMR；CD206)、Dectin-1、Dectin-2、巨噬细胞可诱导的C型凝集素(Mincle)、树突细胞特异性ICAM3-抓取非整合素(DC-SIGN、CD209)、DC NK凝集素基团受体-1(DNGR-1)、朗格汉斯蛋白(Langerin)(CD207)、凝集素蛋白聚糖(lectican)、去唾液酸糖蛋白受体、C-凝集素受体树突细胞免疫受体(CLEC4A；CLECSF6；DCIR)、巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL)、DC受体、胶原凝集素、选择素、NK细胞受体、多C型凝集素域(CTLD)内吞性受体、Reg基团(VII型)凝集素、软骨凝集素、四连接素、多囊蛋白、吸引素(ATRN)、嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白(EMBP)、DiGeorge综合征临界区基因2(DGCR2)、血栓调节蛋白、Bimlec、基团XVI凝集素(SEEC)、和基团XVII凝集素(CBCP/Frem1/QBRICK)。
本发明的结合多肽可用于通过靶向糖类受体(例如甘露糖6-磷酸受体，甘露糖受体和去唾液酸糖蛋白受体)从多种疾病中的肝脏中除去有毒化合物和有害物质。请参见：Ganesan,L.P.等:Rapid and Efficient Clearance of Blood-borne Virus by LiverSinusoidal Endothelium.PLoS Pathogens 2011,9:1；和Monnier,V.M.等:Glucosepane:apoorly understood advanced glycation end product of growing importance fordiabetes and its complications.Clin Chem Lab Med 2014；52:21。
本发明的结合多肽还可以用于通过靶向一种或多种不同的细胞受体而靶向肿瘤细胞，所述细胞受体包括但不限于：糖受体，去唾液酸糖蛋白受体和/或Siglecs。请参见Chen,W.C.等:In vivo targeting of B-cell lymphoma with glycan ligands ofCD22.Blood 2010,115:4778；Chen,W.C.等:Targeting B lymphoma with nanoparticlesbearing glycan ligands of CD22.Leuk Lymphoma 2012,53:208；Hatakeyama,S.等:Targeted drug delivery to tumor vasculature by a carbohydrate mimeticpeptide.PNAS,2011,108:19587；Hong,F.等:β-Glucan Functions as an Adjuvant forMonoclonal Antibody Immunotherapy by Recruiting Tumoricidal Granulocytes asKiller Cells.Cancer Res.2003,23:9023；Kawasakia,N.等:Targeted delivery oflipid antigen to macrophages via the CD169/sialoadhesin endocytic pathwayinduces robust invariant natural killer T cell activation.PNAS 2013,110:7826；和Medina,S.H.等:N-acetylgalactosamine-functionalized dendrimers as hepaticcancer cell-targeted carriers.Biomaterials 2011,32:4118。
本发明的结合肽还可以用于通过多种受体来用于调节免疫响应，所述受体包括但不限于糖受体，DC-SIGN，和/或Siglec。请参见：Anthony,R.M.等:Recapitulation of IVIGAnti-Inflammatory Activity with a Recombinant IgG Fc.Science 2008,320:373；Anthony,R.M.等:Identification of a receptor required for the anti-inflammatory activity of IVIG.PNAS 2008,105:19571；Kaneko,Y.等:Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from FcSialylation.Science 2006,313:670；和Mattner,J.等:Exogenous and endogenousglycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections.Nature2005,434:525。
在一个实施方案中，靶向模块是糖肽。在进一步的实施方案中，靶向模块是三半乳糖基化的糖肽。例如乳糖3-Cys3Gly4(示于如下式V中)：
Figure BDA0003868969060000711
在一些实施方案中，靶向模块可以由式VII表示：
Figure BDA0003868969060000721
在一些实施方案中，式(I)的效应模块的连接体模块包含间隔基，其包括但不限于C2-30烷基或1至32的PEG。在一些实施方案中，基于近似长度来选择效应模块的连接体模块(图79)。适当的间隔基长度包括但不限于
Figure BDA0003868969060000722
Figure BDA0003868969060000723
和
Figure BDA0003868969060000724
在一些实施方案中，式(I)的效应模块可以由式VIII表示：
Figure BDA0003868969060000725
其中q是1至29的整数(含本数)。例如q可为6、8、10、11、12、16、18、或22。在示例的实施方案中，式VIII的效应模块可以由下式表示：
Figure BDA0003868969060000731
在其他实施方案中，式(I)的效应模块可以由式IX表示：
Figure BDA0003868969060000732
其中p具有1-32的值。例如p可为2、4、6、8、11、12、或24。在示例的实施方案中，式IX的效应模块可以由式X表示：
Figure BDA0003868969060000741
在其他实施方案中，式(I)的效应模块可以由式XI表示：
Figure BDA0003868969060000742
其中p具有1-32的值。例如p可为2、4、6、8、11、12、或24。在示例的实施方案中，式XI的效应模块可以由式XII表示：
Figure BDA0003868969060000743
e)PEG模块
在其他方面，效应模块是包含聚(乙二醇)(PEG、PEO或POE)的模块。PEG是环氧乙烷的低聚物或聚合物，并且具有化学结构H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中括号中的元件重复。聚乙二醇化(或PEG化)是其中PEG聚合物链连接至另一分子(例如结合多肽)的过程，所述另一分子从而被描述为聚乙二醇化的(或PEG化的)。聚乙二醇化可用于降低免疫原性和抗原性以及增加其连接的分子的流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)，降低肾清除率和延长循环时间。聚乙二醇化也可以使分子更易溶于水。在本发明的一个实施方案中，PEG模块可以包含单-PEG，双-PEG或三-PEG。在另一个实施方案中，PEG模块包含3至3.5个PEG。
VI.效应模块与结合多肽的缀合
在一些实施方案中，效应模块缀合(直接或间接地)至改变的结合多肽的氧化聚糖(例如氧化的N-连接的聚糖)，(例如抗体CH1域的N114处的工程化聚糖或抗体F域的N297处的天然聚糖)。术语“氧化聚糖”是指聚糖上的醇取代基已被氧化，提供了羰基取代基。羰基取代基可以与合适的氮亲核试剂反应以形成碳-氮双键。例如，羰基与氨基氧基或肼基的反应会分别形成肟或肼。在一个实施方案中，所述羰基取代基是醛。合适的氧化聚糖包括氧化半乳糖和氧化唾液酸。
在一个实施方案中，式(II)的修饰多肽可以是式(II)：
Ab(Gal-C(O)H)x(Gal-Sia-C(O)H)y
式(II)，
其中
A)Q是抗体或本文定义的其他结合多肽；
B)Gal是衍生自半乳糖的组分；
C)Sia是衍生自唾液酸的组分；
D)x是0-5；且
E)y是0-5，
其中x和y至少一个不为0。
可以使用任何本领域公认的化学方法将效应模块(例如包含接头模块的效应模块)缀合至聚糖(参见例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques.Academic Press(1996)，其以其整体并入本文)。在一些实施方案中，聚糖的糖残基(例如唾液酸或半乳糖残基)首先被氧化(例如用高碘酸钠处理唾液酸或用半乳糖氧化酶处理半乳糖)以生成反应性醛基。该醛基与效应模块氨基氧基或肼基反应，分别形成肟或腙接头。采用该一般反应策略的示例性方法阐述于实施例10至15中。
在一些实施方案中，结合多肽的天然或工程化聚糖首先在体外用糖基转移酶预处理，以提供具有适当反应性的末端糖残基。例如可以首先使用半乳糖基转移酶(Gal T)和唾液酸转移酶(Sial T)的组合来实现唾液酸化。在一些实施方案中，缺少半乳糖(G0F或G0)或仅含有一个半乳糖(G1F或G1)的双分枝聚糖可以转化为适于缀合的高阶半乳糖基化或唾液酸化的结构(G1F、G1、G2F、G2、G1S1F、G1S1、G2S1F、G2S1、G2S2F、或G2S2)。
用于产生唾液酸化的糖缀合物的示例性缀合策略示于图25小图C中。在一个示例性实施方案中，使用半乳糖基转移酶(Gal T)和唾液酸转移酶(Sial T)的组合将唾液酸残基酶促地和位点特异性地引入抗体的聚糖(例如Asn-297处的天然聚糖)。然后将引入的唾液酸残基用低浓度的高碘酸钠氧化，以产生适合与接头反应的反应性唾液酸醛(例如氨基氧基接头)，以生成抗体-效应模块缀合物(例如肟-连接的抗体-效应模块缀合物)。通过用体外重塑来控制聚糖的数量和唾液酸残基的数量，本领域技术人员可以精确控制抗体-效应模块缀合物的药物-抗体比率(DAR)。例如，如果将～1个唾液酸加到每条重链的单个双分枝聚糖(A1F)上，可以均匀地获得DAR为2的抗体或结合多肽。
VII.修饰的结合多肽
在一些实施方案中，本发明提供了作为缀合效应模块的产物的修饰多肽缀合(直接或通过接头模块)至一个或多个氧化聚糖(例如氧化的N-连接聚糖)改变的结合多肽(例如抗体CH1域的N114处的工程化聚糖或抗体F域的N297处的天然聚糖)。
在一个实施方案中，结合多肽可以是式(III)：
Ab(Gal-C(H)＝N-Q-CON-X)x(Gal-Sia-C(H)＝N-Q-CON-X)y
式(III)，
其中：
A)Ab是如本文定义的抗体；
B)Q是NH或O；
C)CON是如本文定义的连接体模块；
D)X是如本文定义的靶向模块；
E)Gal是衍生自半乳糖的组件；
F)Sia是衍生自唾液酸的组件；
G)x是0-5；且
H)y是0-5，
其中x和y至少一个不为0。
在一个实施方案中，结合多肽可以是式(III)可以是式(IIIa)：
Ab(Gal-C(H)＝N-Q-CH2-C(O)-Z-X)x(Gal-Sia-C(H)＝N-Q-CH2-C(O)-Z-X)y
式(IIIa)，
其中：
A)Ab是抗体；
B)Q是NH或O；
C)Z是Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8 C2H4)f-，其中
i.Cys是衍生自半胱氨酰氨的组分；
ii.MC是衍生自马来酰亚胺的组分；
iii.VC是衍生自与瓜氨酸偶联的缬氨酸的组分；
iv.PABC是衍生自4-氨基苄基氨基甲酸酯的组分；
v.X是效应模块(例如如本文所定义的靶向模块)；
vi.a是0或1；
vii.b是0或1；
viii.c是0或1；且
ix.f是0或1；
D)X是如本文定义的治疗剂；
E)Gal是衍生自半乳糖的组件；
F)Sia是衍生自唾液酸的组件；
G)x是0-5；且
H)y是0-5，
其中x和y至少一个不为0。
应当理解，式(III)不意欲暗示抗体、Gal取代基、和Gal-Sia取代基以链样方式连接。相反，当存在这样的取代基时，抗体直接连接至每个取代基。例如，其中x为1且y为2的式(III)的结合多肽可以具有如下所示的排布：
Figure BDA0003868969060000781
式(III)中的CON取代基及其中的组件如式(I)针对效应模块所描述的那样。
在一个实施方案中，Q是NH。在另一个实施方案中，Q是O。
在一个实施方案中，x是0。
式(III)的抗体Ab可以是如本文所述的任何合适的抗体。
在一个实施方案中，提供了制备式(III)的结合多肽的方法，所述方法包括使式(I)的效应模块：
NH2-Q-CON-X
式(I)，
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是效应模块(例如本文所定义的靶向模块)；
与式(II)的修饰抗体进行反应
Ab(OXG)r
式(II)
其中
A)OXG是氧化聚糖；且
B)r选0至4；
在一个实施方案中，提供了制备式(III)的结合多肽的方法，所述方法包括使式(I)的效应模块：
NH2-Q-CON-X
式(I)
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是效应模块(例如本文所定义的靶向模块)；
与式(IIa)的修饰抗体进行反应
Ab(Gal-C(O)H)x(Gal-Sia-C(O)H)y
式(IIa)，
其中
A)Ab是如本文定义的抗体；
B)Gal是衍生自半乳糖的组件；
C)Sia是衍生自唾液酸的组件；
D)x是0-5；且
E)y是0-5，
其中x和y至少一个不为0。
VII.用修饰抗体治疗的方法
在一个方面，本发明提供了治疗或诊断对其有需要的患者的方法，其包括施用有效量的本文公开的结合多肽。在本发明的一些实施方案中，提供了用于在需要这种治疗的哺乳动物受试者中诊断和/或治疗病症(例如肿瘤性病症)的试剂盒和方法。在一些示例性实施方案中，所述受试者是人。
本发明的结合多肽可用于许多不同的应用中。例如，在一个实施方案中，主题结合多肽可用于减少或消除具有由结合多肽的结合域识别的表位的细胞。在另一个实施方案中，主题结合多肽在降低循环中的可溶性抗原的浓度或消除循环中的可溶性抗原方面是有效的。在一个实施方案中，结合多肽可以减小肿瘤尺寸，抑制肿瘤生长和/或延长荷瘤动物的存活时间。因此，本发明还涉及通过向这样的人或动物施用有效的、非毒性量的修饰抗体来治疗人或其他动物中的肿瘤的方法。本领域技术人员能够通过常规实验确定修饰的结合多肽的何种有效无毒量可用于治疗恶性肿瘤的目的。例如修饰抗体或其一个或多个片段的治疗活性量可根据如下因素而变化：例如疾病阶段(例如I期对比IV期)，年龄，性别，医学并发症(例如免疫抑制的病况或疾病)和受试者的体重，以及修饰的抗体在受试者中引发期望的响应的能力。可以调节剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可以每天施用若干分开的剂量，或者可以按照治疗紧急情况所指示按比例减少剂量。
一般而言，本发明中提供的组合物可用于预防性或治疗性地治疗任何包含抗原标记物的肿瘤，所述抗原标记物允许通过修饰的抗体靶向癌细胞。
VIII.施用修饰抗体或其片段的方法
制备本发明的结合多肽和将其施用与受试者的方法是本领域技术人员熟知的或容易确定的。本发明的结合多肽的施用途径可以是口服，肠胃外，吸入或局部施用。本文所用的术语肠胃外包括静脉内，动脉内，腹膜内，肌内，皮下，直肠或阴道给药。虽然所有这些给药形式被清楚地预期在本发明的范围内，但是用于施用的形式会是用于注射的溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，表面活性剂(例如聚山梨酸酯)，任选的稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在可与本文的教导兼容的其他方法中，可将修饰的抗体直接递送到不良细胞群体的部位，由此增加患病组织对于治疗剂的暴露。
在一个实施方案中，施用的结合多肽是式(III)的结合多肽：
Ab(Gal-C(H)＝N-Q-CON-X)x(Gal-Sia-C(H)＝N-Q-CON-X)y
式(III)，
其中：
A)Ab是如本文定义的抗体；
B)Q是NH或O；
C)CON是如本文定义的连接体模块；
D)X是效应模块(例如本文定义的靶向模块)；
E)Gal是衍生自半乳糖的组件；
F)Sia是衍生自唾液酸的组件；
G)x是0-5；且
H)y是0-5，
其中x和y至少一个不为0。
肠胃外施用的制备物包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇，聚乙二醇，植物油(如橄榄油)，和可注射的有机酯类如油酸乙酯。水性载剂包括水，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在本发明的组合物和方法中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M，例如0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常用的胃肠外介质包括磷酸钠溶液，林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)，右旋糖和氯化钠，乳酸林格氏液(lactated Ringer's)或固定油。静脉内介质包括流体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于林格氏右旋糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等。更具体地，适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(其中水可溶)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并且应当具有流动性到易于注射的程度。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且通常在防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用的条件下保存。载体可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣/涂层如卵磷脂，(在分散液的情况下)通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类(parabens)，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞(thimerosal)等实现。在许多情况下，其包括等张剂，例如组合物中的糖，多元醇，如甘露醇，山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的制剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
在任何情况下，可通过将所需量的活性化合物(例如修饰的结合多肽本身或与其它活性剂组合)在适当溶剂中的溶液连同本文列举的成分的一种或组合进行合并来制备无菌注射溶液，如所需要的那样，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌介质中来制备分散液，所述无菌介质含有基础/碱性分散基质和来自上文列举的那些的所需其它成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，示例性的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其从之前无菌过滤的溶液产出活性成分加任何额外的所需成分的粉末。将注射用制备物进行加工，装入容器如安瓿，袋，瓶，注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制备物可以以试剂盒的形式包装和出售，如在共同未决的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中所述的那些，其各自通过提述并入本文。这种制品通常具有标签或包装说明书，表明相关组合物可用于治疗患有或倾向于患有自身免疫病症或肿瘤性病症的受试者。
用于治疗上述病况的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式，靶位点，患者的生理状态，患者是人还是动物，施用的其它药物，以及治疗是预防性还是治疗性的。通常患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量，以优化安全性和效力。
对于用结合多肽进行被动免疫而言，剂量范围可以是例如约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等)的宿主体重。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或是范围为1-10mg/kg，例如至少1mg/kg。介于上述范围之间的剂量也意图在本发明的范围内。受试者可以每天，每隔一天(on alternative days)，每周或根据通过经验分析确定的任何其他时间安排来施用这样的剂量。示例性的治疗需要在延长的时间(例如至少6个月)以多剂施用。另外的示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。示例性剂量方案包括连续天的1-10mg/kg或15mg/kg，每隔一天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每种抗体的剂量落在指示的范围内。
本发明的结合多肽可以在多种情况下施用。单次剂量之间的间隔可以是每周，每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中修饰的结合多肽或抗原的血液水平所指示的那样。在一些方法中，调节剂量以实现1-1000μg/ml的血浆修饰结合多肽浓度，在一些方法中浓度为25-300μg/ml。或者，结合多肽可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。对于抗体而言，剂量和频率根据患者中抗体的半衰期而变化。一般来说，人源化抗体显示出最长的半衰期，然后是嵌合抗体和非人抗体。
施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，将含有本抗体或其混合物的组合物施用于尚未处于疾病状态的患者以增强患者的抵抗性。这样的量被定义为“预防有效剂量”。在该用途中，精确的量还取决于患者的健康状况和一般免疫力，但通常范围为每剂0.1至25mg，特别是每剂0.5至2.5mg。相对低的剂量以相对不频繁的间隔在长时间段内施用。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗应用中，有时需要相对较短的间隔的相对较高的剂量(例如，每剂约1至400mg/kg的抗体，5至25mg的剂量更常用于放射免疫缀合物和更高剂量的细胞毒素-药物修饰的抗体)，直到疾病的进展降低或终止，或者直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防方案。
本发明的结合多肽可以任选地与能有效治疗需要治疗的病症或病症的其它试剂(例如预防性或治疗性的)组合施用。本发明的90Y标记的修饰抗体的有效单一治疗剂量(即治疗有效量)的范围为约5至约75mCi，例如约10至约40mCi。131I修饰的抗体的有效单一治疗非骨髓消融(ablative)剂量范围为约5至约70mCi，或约5至约40mCi。131I标记的抗体的有效单一治疗消融剂量(即可能需要自体骨髓移植)范围为约30至约600mCi，例如约50至小于约500mCi。在与嵌合抗体相的联合中，由于相对于鼠抗体更长的循环半衰期，碘-131标记的嵌合抗体的有效单一治疗非骨髓消融剂量范围为约5至约40mCi，例如小于约30mCi。例如111In标记的成像标准通常小于约5mCi。
虽然结合多肽可以如上文所述施用，但必须强调的是，在其它实施方案中，结合可以作为一线治疗施用于健康患者。在这样的实施方案中，结合多肽可以施用于具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或施用于没有经历过和没有正在经历的患者。如本文所用的，修饰的抗体或其片段与辅助治疗的联合或组合施用是指所述治疗和公开的抗体的序贯的，同时的(simultaneous)，同延的(coextensive)，并行的(concurrent)，相伴的(concomitant)，或同期的(contemporaneous)施用或应用。本领域技术人员会理解，组合治疗方案的各种组分的施用或应用可以进行时间安排以增强治疗的整体有效性。例如，化疗剂可以在标准的众所周知的治疗疗程中施用，随后在几周内进行本发明的放射免疫缀合物治疗。相反地，细胞毒素相关结合多肽可以静脉内施用，然后进行肿瘤局部外部束辐射。在其他实施方案中，修饰的结合多肽可以与一种或多种所选择的化疗剂在单次诊所拜访中同时施用。本领域技术人员(例如经验丰富的肿瘤学家)会容易地能够基于所选择的辅助疗法和本说明书的教导来识别有效的组合治疗方案而无需过度的实验。
在这方面，应当理解，结合多肽和化疗剂的组合可以以对患者提供治疗益处的任何顺序和任何时间范围内施用。也就是说，化疗剂和结合多肽可以以任何顺序或同时施用。在选择的实施方案中，本发明的结合多肽会施用于既往经历过化疗的患者。在其它实施方案中，结合多肽和化疗治疗是基本上同时或并行施用的。例如，可以在经历化疗过程的同时给予患者结合多肽。在一些实施方案中，修饰的抗体在任何化疗剂或治疗的一年内施用。在其它实施方案中，结合多肽在任何化疗剂或治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在其它实施方案中，结合多肽在任何化疗剂或治疗的4、3、2或1周内施用。在其它实施方案中，结合多肽将在所选择的化疗剂或治疗的5、4、3、2或1天内施用。还应理解的是，两种试剂或治疗可在约几小时或几分钟内(即基本上同时)施用于患者。
还应理解的是，本发明的结合多肽可以与消除，降低，抑制或控制赘生性细胞的体内生长的任何化疗剂或制剂联合或组合使用(例如以提供组合的治疗方案)。与本发明相容的示例性化疗剂包括烷化剂，长春花生物碱类(例如长春新碱和长春花碱)，甲基苄肼，甲氨蝶呤和泼尼松。四药组合MOPP(mechlethamine(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲基苄肼和泼尼松)在治疗各种类型的淋巴瘤中非常有效。在MOPP耐药的患者中，可以使用ABVD(例如阿霉素、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪)，ChIVPP(CH1orambucil(苯丁酸氮芥)、长春花碱、甲基苄肼和泼尼松)，CABS(洛莫司汀，多柔比星，博来霉素和链唑霉素)，MOPP加ABVD，MOPP加ABV(多柔比星、博来霉素和长春花碱)或BCVPP(卡莫司汀、环磷酰胺、长春花碱、甲基苄肼和泼尼松)组合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler,Malignant Lymphomas,in HARRISON'SPRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788(Kurt J.Isselbacher等编,第13版.1994)和V.T.DeVita等,(1997)及其中引用的参考文献用于标准给药和时间安排。这些治疗可以不改变地使用，或根据具体患者的需要，与本文所述的本发明的一种或多种结合多肽组合使用。
在本发明的情况中有用的其他方案包括使用单一烷化剂例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥，或组合如CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)，CHOP(CVP和多柔比星)，C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱，泼尼松和甲基苄肼)，CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)，m-BACOD(CHOP加甲氨蝶呤、博来霉素和甲酰四氢叶酸)，ProMACE-MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加标准MOPP)，ProMACE-CytaBOM(泼尼松、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博来霉素、长春新碱、甲氨蝶呤和甲酰四氢叶酸)和MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员将能够容易地确定这些方案中的每一个的标准剂量和时间安排。CHOP还与博来霉素、甲氨蝶呤、甲基苄肼、氮芥、阿糖胞苷和依托泊苷组合。其它相容的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)，2'-脱氧助间型霉素和氟达拉滨。
对于未能实现缓解的或是复发的中级和高级NHL(非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma))患者，使用挽救治疗。挽救治疗采用单独或组合给予的药物，如胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡铂、顺铂、依托泊苷和异环磷酰胺。在复发或侵袭性形式的某些肿瘤病症中，经常使用以下方案：IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)，MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)，DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)，ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、顺铂)，CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、泼尼松和博来霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和泼尼松)，其各自按照众所周知的给药速率和时间表使用。
用于与本发明的修饰抗体组合使用的化疗剂的量可以根据受试者而变化或可根据本领域所知的知识来施用。参见例如Bruce A Chabner等,Antineoplastic Agents,inGOODMAN&GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287((JoelG.Hardman等编,第9版.1996)。
如前所述，本发明的结合多肽，其免疫反应性片段或重组体可以以药学有效量施用，用于哺乳动物病症的体内治疗。在这方面，应当理解，所公开的结合多肽会被配制以便于施用和促进活性剂的稳定性。
根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的非毒性无菌载剂，如生理盐水、无毒缓冲剂、防腐剂等等。出于本申请的目的，缀合或未缀合有治疗剂的修饰的结合多肽、其免疫反应性片段或重组体的药学有效量，应当认为是指足以达到对抗原的有效结合并达到有益效果的量，例如缓解疾病或病症的症状或检测到物质或细胞。对于肿瘤细胞的情况而言，修饰的结合多肽可以与赘生性细胞或免疫反应性细胞上所选择的免疫反应性抗原相互作用，并导致这些细胞的死亡增加。当然，本发明的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用，以提供药学上有效量的修饰的结合多肽。
根据本发明的范围，本发明的结合多肽可以根据上述治疗方法以足以产生治疗或预防效果的量施用于人或其它动物。本发明的结合多肽可以以常规剂型施用于这样的人或其它动物，所述常规剂型根据已知技术通过将本发明的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂组合而制备。本领域技术人员会认识到，药学上可接受的载剂或稀释剂的形式和特性由与其组合的活性成分的量、施用途径和其它公知的变量决定。本领域技术人员还会理解，包含本发明中描述的一种或多种类型的结合多肽的混合物可以被证明是特别有效的。
IX.结合多肽的表达
在一个方面，本发明提供了编码本文公开的结合多肽的多核苷酸。还提供了制备结合多肽的方法，其包括表达这些多核苷酸。
编码本文公开的结合多肽的多核苷酸通常被插入表达载体中用于引入宿主细胞中，所述宿主细胞可用于产生所需量的要求保护的抗体或其片段。因此，在一些方面，本发明提供了包含本文公开的多核苷酸的表达载体和包含这些载体和多核苷酸的宿主细胞。
出于说明书和权利要求的目的，本文所用的术语“载体”或“表达载体”是指这样的载体，其根据本发明用作导入细胞中并表达所需基因的载体。如本领域技术人员已知的，这样的载体可以容易地选自下组：质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体会包含选择标记，促进所需基因的克隆的适当限制性位点和进入真核或原核细胞中和/或在其中复制的能力。
出于本发明的目的，可以采用许多表达载体系统。例如，一类载体利用源自动物病毒如牛乳头瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他的涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，可以通过引入允许选择转染的宿主细胞的一种或多种标记物来选择将DNA整合到其染色体中的细胞。标记物可以提供对营养缺陷型宿主的原养(prototrophy)、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属例如铜的抗性。选择性标记基因可以直接连接至待表达的DNA序列，或通过共转化导入相同的细胞中。还可能需要另外的元件用于mRNA的最佳合成。这些元件可以包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施方案中，将克隆的可变区基因连同如上所述合成的重链和轻链恒定区基因(如人基因)一起插入表达载体中。
在其它实施方案中，本发明中表征的结合多肽可以使用多顺反子构建体表达。在这样的表达系统中，可以从单个多顺反子构建体产生多种感兴趣的基因产物，如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相兼容的IRES序列公开于美国专利号6,193,980，其通过提述并入本文。本领域技术人员会理解，此类表达系统可以用于有效地产生本申请中公开的全部范围的多肽。
更通常地，一旦制备了编码抗体或其片段的载体或DNA序列，就可以将表达载体引入合适的宿主细胞中。也就是说，可以转化宿主细胞。可以通过本领域技术人员熟知的多种技术将质粒导入宿主细胞。这些包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，具有包膜DNA的细胞融合，显微注射和用完整病毒感染。参见Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"Chapter 24.2,pp.470-472Vectors,Rodriguez andDenhardt,Eds.(Butterworths,Boston,Mass.1988)。使转化的细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并测定其重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)，免疫组化等。
如本文所用的，术语“转化”应广义地用于指将DNA引入受体宿主细胞，其改变基因型并因此导致受体细胞的改变。
与之类似地，“宿主细胞”是指已经用载体转化的细胞，所述载体使用重组DNA技术构建并编码至少一个异源基因。除另有说明外，在从重组宿主分离多肽的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体的来源。换言之，从“细胞”回收多肽可以意指从离心沉淀(spun down)的全细胞或从包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。
在一个实施方案中，用于抗体表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的；本领域技术人员可以确定最适合于在其中表达所需基因产物的具体宿主细胞系。示例性的宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR减)，HELA(人子宫颈癌)，CVI(猴肾细胞系)，COS(CVI与SV40T抗原的衍生物)，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)，BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)，HAK(仓鼠肾系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)，293(人肾脏)。在一个实施方案中，细胞系提供由其表达的抗体的改变的糖基化，例如非岩藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Crucell)或敲除FUT8的CHO细胞系(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa,Princeton,N.J.))。在一个实施方案中，可以使用NS0细胞。宿主细胞系通常可从商业服务机构，美国组织培养物保藏中心(American TissueCulture Collection)或从公开的文献获得。
体外生产允许按比例放大以产生大量的所需多肽。组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或是固定或包埋的细胞培养，例如在中空纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷盒上。如有必要和/或需要，多肽溶液可以通过常规色谱方法来纯化，例如凝胶过滤，离子交换色谱，DEAE-纤维素色谱和/或(免疫)亲和色谱。
编码结合多肽的一个或多个基因也可以在非哺乳动物细胞中表达，例如细菌或酵母或植物细胞。在这方面，应当理解，各种单细胞非哺乳动物微生物例如细菌也可以加以转化；即能够在培养或发酵中生长的那些。对转化敏感的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；肺炎球菌属(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应当理解，当在细菌中表达时，多肽可以成为包涵体的一部分。多肽必须加以分离、纯化，然后组装成功能分子。
除原核生物外，也可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是真核微生物中最常用的，尽管许多其它菌株通常是可用的。为了在酵母属中表达，质粒YRp7(例如Stinchcomb等,Nature,282:39(1979)；Kingsman等,Gene,7:141(1979)；Tschemper等,Gene,10:157(1980))是通常使用的。该质粒已经含有TRP1基因，其为缺乏在色氨酸中的生长能力的酵母突变株提供选择标记，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。然后，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在提供了用于检测转化的有效环境，其通过在缺乏色氨酸的条件下的生长来进行。
实施例
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为进一步的限制。在本申请中引用的序列表、附图和所有参考文献，专利和公开的专利申请的内容通过提述明确地并入本文。
实施例1. 2C3抗CD-52高糖基化抗体突变体的设计、制备和表征
在抗CD-52抗体2C3的重链中设计了多个高糖基化突变，目的是将大基团添加至相互作用界面(例如FcRn结合位点以调节抗体药代动力学)，用于通过改变其与FcγR的相互作用来调节抗体的效应功能，或引入用于效应模块缀合的新型交联位点亚序列化学修饰，包括但不限于药物、毒素、细胞毒性剂、放射性核苷酸等。高糖基化2C3突变体列于表3中。
表3.高糖基化的2C3抗CD-52突变体
Figure BDA0003868969060000881
Figure BDA0003868969060000891
1A.2C3抗CD-52抗体高糖基化突变体的生成
通过诱变PCR将基于Kabat编号系统指定的A114N突变(相当于EU位置118)引入2C3的CH1域。为了产生全长抗体，通过连接非依赖性克隆(LIC)将VH域加突变的A114N残基插入编码抗体CH域1-3的pENTR-LIC-IgG1载体中。通过使用QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)的定点诱变，将所有其它突变引入pENTR-LIC-IgG1。通过LIC将WT2C3 VH克隆到突变的载体中。通过Gateway克隆将全长突变体克隆到pCEP4(-E+I)Dest表达载体中。基于EU编号系统来指定Fc突变。通过DNA测序来证实突变。WT 2C3重链和轻链和突变的2C3重链的氨基酸序列示于表4中。突变的氨基酸用阴影表示，并且通过突变生成的共有糖基化靶位点用下划线表示。
表4. 2C3抗CD-52抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003868969060000892
Figure BDA0003868969060000901
Figure BDA0003868969060000911
将突变体和WT对照转染至6孔板形式的HEK293-EBNA细胞中。如图9小图A所示，通过SDS-PAGE和Western印迹分析发现表达水平为～0.1μg/ml。还在Biacore上通过蛋白A捕获测量了条件培养基中突变体的表达。在注入固定化的蛋白A后6分钟使用解离反应来测定浓度。使用在培养基中从90μg/mL至1.5ng/mL连续稀释的CHO产生的WT 2C3作为标准曲线。通过使用4参数拟合的校准曲线将浓度计算降至～0.2μg/mL。如图9小图B所示，相对表达水平低，并且通常与Western印迹结果相一致。
1B.高糖基化的验证
为了确定是否通过突变引入了额外的糖基化位点，用通用的非糖基化酶PNGase F处理2C3突变体和野生型蛋白，并通过SDS-PAGE和Western印迹分析蛋白质样品。如图10所示，只有A114N突变体具有增加的表观分子量，表明存在额外的N-连接的糖类。
产生了小规模抗体制备物以纯化2C3突变体，用于进一步验证糖基化位点引入。如图11所示，通过SDS-PAGE证实，仅有A114N突变体具有引入的额外的糖基化位点。
1C.2C3抗CD-52突变体的结合特性
用Biacore来比较纯化的蛋白质的结合特性。将小鼠和SEC纯化的人FcRn-HPC4通过胺缀合固定在CM5芯片上。将每种抗体稀释至200、50和10nM，并注射在固定化的Fc受体上。纳入Campath，CHO产生的WT 2C3和DEPC处理的Campath作为阳性和阴性对照。如图13所示，Y436S突变体显示出对人FcRn结合的约2倍降低。有趣的是，该突变体对小鼠FcRn的结合不受影响。没有其他2C3突变对人或小鼠FcRn结合有任何重大的影响。
用Biacore来比较纯化蛋白的抗原结合特性，其使用CD-52肽741 Biacore结合测定法来进行。将CD-52肽741和对照肽777固定至CM5芯片。抗体在HBS-EP中从60至0.2nM连续稀释2倍，并一式两份注射3分钟，然后在缓冲液中以50μL/分钟的流速解离5分钟。纳入GLD52批次17200-084作为对照。表面用1个脉冲的40mM HCl再生成。使用1:1结合模型来拟合7.5至0.2nM曲线。如图16所示，在该测定中A114N突变体具有略低的CD-52结合亲和力，而NGT突变体具有略高于其余突变体的亲和力。用从较大规模制备物纯化的蛋白来重复CD-52肽741 Biacore结合测定。如图17所示，A114N突变体表现出与WT2C3相当的CD-52肽结合。
1D.A114N突变体的电荷表征
进行等电聚焦(IEF)以表征2C3突变体的电荷。纯化的蛋白在固定化的pH梯度(pH3-10)丙烯酰胺(IPG)凝胶上运行。如图18小图A所示，发现A114N具有更多的负电荷，可能是由于唾液酸残基所致。完整的MS数据证实了在A114N突变体上的具有唾液酸的复杂结构。相比之下，WT 2C3显示具有G0F和G1F作为主要的糖基化种类(分别为图18小图C和D)。
实施例2.数种抗体骨架中高糖基化突变体的制备
除了2C3抗CD-52抗体之外，在几个其他抗体骨架中进行了A114N突变的工程化改造以证实可以将独特的高糖基化位点引入无关的重链可变区序列中。高糖基化的抗TEM1、抗FAP和抗Her2突变体列于表5中。
表5.一些无关的抗体骨架中设计的A114N和/或S298N突变体
Figure BDA0003868969060000931
2A.抗TEM1和抗FAP抗体高糖基化突变体的生成
通过诱变PCR将基于Kabat编号系统指定的A114N突变引入抗TEM1和抗FAP的CH1域。为了产生全长抗体，通过连接非依赖性克隆(LIC)将突变的VH加上残基114插入编码抗体CH域1-3的pENTR-LIC-IgG1载体中。然后通过Gateway克隆将全长突变体克隆至pCEP4(-E+I)Dest表达载体中。通过DNA测序证实突变。抗TEM1野生型和突变的重链和轻链的氨基酸序列示于表6中。突变的氨基酸用阴影表示，并且通过突变产生的共有糖基化靶位点通过划线表示。
表6.抗TEM1和抗FAP抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003868969060000932
Figure BDA0003868969060000941
将突变体和野生型对照以三烧瓶(triple flask)形式转染至HEK293-EBNA细胞中，并在HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare Biosciences，Pittsburgh，PA，USA)上纯化。如通过A280在NanoDrop分光光度计上分析的，抗FAP A114N和抗FAP A114C的表达分别为约3μg/ml和约1μg/ml。抗TEM1 A114N的表达约为0.04μg/ml。
2B.高糖基化的验证
为了证实额外的糖基化位点被引入了A114N突变体中，在还原性SDS-PAGE上用野生型对照蛋白分析来自A114N突变体的纯化蛋白。一个额外的糖基化位点会增加2000-3000道尔顿的重链分子量。如图20所示，SDS-PAGE表明抗FAP和抗TEM1 A114N突变体重链条带具有增加的表观分子量，这与成功引入至两个抗体的额外糖基化位点一致。
2C.抗Her2抗体高糖基化突变体的生成
通过连接非依赖性克隆生成Her-2 A114N、Her-2 A114N/NNAS和WT Her-2抗体。合成赫赛汀的VH域(WT或带有A114N突变)，并用两个LIC相容的引物组进行PCR扩增。为了获得全长抗体，将扩增的VH插入片段(WT或A114N)克隆至编码CH 1-3域的两个pENTR载体，即pENTR-LIC-IgG1 WT和pENTR-LIC-IgG1 NNAS中，产生三个全长突变体(A114N，NNAS，A114N/NNAS)和WT对照作为pENTR上的进入克隆。通过Gateway克隆将这些突变体克隆至pCEP4(-E+I)Dest表达载体中。通过DNA测序证实突变。抗Her-2野生型和突变的重链和轻链的氨基酸序列示于表7中。突变的氨基酸以阴影表示，并且通过突变产生的共有糖基化靶位点以下划线表示。
表7.抗Her-2抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003868969060000951
Figure BDA0003868969060000961
2D.A114N抗Her2抗体高糖基化突变体的表达
将A114N抗Her2和野生型构建体用Lipofectamine-2000(试剂与DNA的比例为2.5:1)和XtremeGene HP(试剂与DNA的比例为3:1)转染至12个三烧瓶中的HEK293-EBNA细胞中。来自第3天条件培养基(CM)的等分试样的Octet测量显示，Lipofectamine-2000和XtremeGene HP二者在6个烧瓶中的蛋白表达是一致的。如表8所示，XtremeGene HP的总转染效率高出了约30％。对于两种转染条件将第3天收集的条件培养基汇集在一起，并通过蛋白A柱纯化。Octet测量显示，在含血清的模拟培养基中1.8ug/ml抗体，而在无血清模拟培养基中显示为0ug/ml l。
表8.A114N抗Her2高糖基化突变体表达
Figure BDA0003868969060000971
从第6天收集条件培养基，并针对每种转染条件分别进行纯化。两种洗脱物分别缓冲液交换至PBS，pH 7.2中，并使用Amicon-4(50kD截留)柱浓缩～15倍。与第3天CM相比，第6天CM显示更高的表达水平。如表8所示，从第6天条件培养基产生总共3mg赫赛汀A114N15.59mg/ml(来自Lipofectamine转染)和6mg赫赛汀A114N 16.86mg/ml(来自XtremeGeneHP转染)用于其他的下游应用，如抗体-药物缀合。
2E.A114N抗Her2突变体的SDS-PAGE和HIC分析
在缀合之前，通过SDS-PAGE和HIC(疏水相互作用色谱)来表征纯化的A114N赫赛汀。如图21所示，确定纯化的A114N赫赛汀的质量为适于进一步的下游应用。
2F.与工程化的糖基化的缀合
已证明了：a)在抗TEM1上的Kabat位置114(EU位置118)位点处引入了糖基化位点；b)A114N突变体通过还原SDS-PAGE在重链上具有高糖基化；和c)通过完整LC/MS发现A114N高糖基化突变体具有复合糖类结构，包括末端唾液酸和半乳糖，其对于SAM和GAM缀合是理想的。为了证实工程化的糖基化位点适于缀合，通过氨基氧基化学方法将抗TEM1 A114N与5kDa PEG缀合。如图22所示，PEG通过氨基氧基连接成功地缀合至抗TEM1 A114N。还在抗FAP和抗CD-52 2C3骨架上成功制备了该突变体(未示出)。这些数据表明N114处的糖基化位点可用于效应模块的缀合。
实施例3：S298N/Y300S Fc突变体的产生
设计并产生了工程化Fc变体，其中在EU位置Ser 298处引入了新的糖基化位点，其相邻于天然存在的Asn297位点。在Asn297处的糖基化是维持的或是通过突变而消除。突变和所需的糖基化结果列于表9。
表9.多种抗体变体的糖基化状态
Figure BDA0003868969060000981
3A.H66αβ-TCR抗体改变的糖基化变体的生成
使用pENTR_LIC_IgG1模板，通过Quikchange对αβT细胞受体抗体克隆#66的重链进行突变。用LIC引物扩增HEBE1δab IgG1#66的VH域，然后通过LIC将其克隆到突变或野生型pENTR_LIC_IgG1中以产生全长突变体或野生型抗体。用DraIII/XhoI双重消化来验证亚克隆，在成功的克隆中产生大约1250bp大小的插入片段。然后通过Gateway克隆将那些全长突变体克隆至表达载体pCEP4(-E+I)Dest中。通过DNA测序来证实突变。WT H66抗αβTCR重链和轻链和突变的H66重链的氨基酸序列示于表10中。突变的氨基酸以阴影表示，并且通过突变产生的共有糖基化靶位点以下划线表示。
表10.H66抗αβTCR抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003868969060000982
Figure BDA0003868969060000991
Figure BDA0003868969060001001
将突变体、野生型和两个非糖基化的对照(pCEP4中的HEBE1 Agly IgG4和HEBE1δab IgG1)构建体转染至三重烧瓶中的HEK293-EBNA细胞中，用于表达。使用多通道蠕动泵用1ml HiTrap蛋白A柱(GE)从160ml条件培养基(CM)纯化蛋白质。在4-20％Tris-甘氨酸还原的和非还原的SDS-PAGE凝胶上分析5微克的每种所得上清液(参见图2)。非糖基化突变体(N297Q，T299A和非糖基化对照)的重链进一步迁移(箭头)，与这些抗体中聚糖的损失相一致。然而，工程化的糖基化抗体(NSY，STY，SY，δab和wt对照，箭头)的重链与野生型对照相似地迁移。该结果与EU位置298处的工程化糖基化位点的存在相一致。SEC-HPLC分析表明所有突变体表达为单体。
3B.通过LC-MS的糖基化分析
将工程化的H66 IgG1 Fc变体用20mM DTT在37℃部分还原30分钟。然后在与QSTARqq TOF杂交系统(Applied Biosystems)缀合的Agilent 1100毛细管HPLC系统上通过毛细管LC/MS分析样品。在Analyst QS 1.1(Applied Bisoystem)中使用具有基线校正和计算机建模的贝叶斯蛋白重建用于数据分析。在S298N/T299A/Y300S H66抗体突变体中，在氨基酸298处观察到一个糖基化位点，其中双分枝和三分枝复合型聚糖被检测为除G0F、G1F和G2F之外的主要种类(参见图34)。这种改变的糖基化谱是一致的，其将糖基化转移到N298处，而不是在N297处的野生型糖基化位点。
3C.用Biacore得到的αβTCR抗体突变体对人FcγRIIIa和FcγRI的结合特性
用Biacore来评估与重组人FcγRIIIa(V158&F158)和FcγRI的结合。CM5芯片的所有四个流动池通过Biacore提供的标准胺缀合程序用抗HPC4抗体加以固定。将抗HPC4抗体在10mM乙酸钠pH 5.0中稀释至50μg/mL用于偶联反应，并以5μL/分钟注射25分钟。将大约12,000RU的抗体固定至芯片表面。将重组人FcγRIIIa-V158和FcγRIIIa-F158在结合缓冲液(含有1mM CaCl2的HBS-P)中稀释至0.6μg/mL，并以5μL/分钟分别注射至流动池2和4中3分钟以捕获抗HPC4芯片上的300-400RU受体。为了区分低结合剂，在抗HPC4表面上捕获比在该测定中通常使用的多三倍的rhFcγRIIIa。流动池1和3用作参比对照。将每种抗体在结合缓冲液中稀释至200nM，并于所有四个流动池注射4分钟，然后在缓冲液中解离5分钟。用10mM EDTA在HBS-EP缓冲液中以20μL/分钟将表面再生3分钟。这些实验的结果示于图3中。
Biacore也用于比较FcγRI结合。使用Zeba脱盐柱将抗四His抗体进行缓冲液交换至10mM乙酸钠pH 4.0中，并在用于胺缀合的乙酸盐缓冲液中稀释至25μg/mL。在以5μL/分钟注射20分钟后，用～9000RU的抗四-His抗体固定CM5芯片的两个流动池。如在前的实验中一样，将多出10倍的FcγRI捕获至抗四-His表面，以比较具有弱结合的样品。将重组人FcγRI在HBS-EP结合缓冲液中稀释10μg/mL，并以5μL/分钟的速度注射至流动池2中1分钟，以将～1000RU受体捕获至抗四-His芯片。在捕获的受体和对照表面上以30μL/分钟注射单一浓度的100nM抗体3分钟。随后，监测解离三分钟。然后以20μL/分钟的10mM甘氨酸pH 2.5的两次30秒注射来再生表面。这些实验的结果示于图4中。
这些结果证明糖工程化的突变体对FcγRIIIa或FcγRI的结合显著降低。H66S298N/T299A/Y300S尤其几乎完全消除了对两种受体的结合。选择该突变体用于更详细的分析。
3D.使用圆二色性(CD)进行的稳定性表征
通过Far-UV CD热熔解实验来监测S298N/T299A/Y300S抗体突变体的稳定性，其中监测216nm和222nm处的CD信号，其随着温度升高导致抗体解折叠(变性)。
通过热电散热器(peltier)(Jasco型AWC100)控制温度，并且其以1℃/分钟的速率从25增加至89℃。在Jasco 815分光光度计上以约0.5mg/mL的蛋白质浓度在具有10mm路径长度的石英比色皿(Hellma，Inc)中的PBS缓冲液中收集CD光谱。扫描速度为50nm/分钟，且数据间距(data pitch)为0.5nm。使用2.5nm的带宽，及介质的灵敏度设置。从210-260nm收集CD信号和HT电压，数据间隔为0.5nm，温度间隔为1℃，每个样品进行四次重复扫描。结果表明δAB H66和S298N/T299A/Y300S H66突变体都具有相似的热行为并且具有大约相同的降解起始温度(约63℃)(图35)，这进一步表明它们具有相当的稳定性。
实施例4：Fc工程化突变体的功能性分析
通过PBMC增殖测定和细胞因子释放测定来评估Fc-工程化的突变体。在PBMC增殖测定中，将人PBMC与增加的浓度的治疗性抗体一起培养72小时，加入3H-胸苷并在18小时后收获细胞。对于T细胞消耗/细胞因子释放测定，将人PBMC与增加的浓度的治疗性抗体一起培养，并每天分析细胞计数和存活力(Vi-Cell，Beckman Coulter)至第7天。同样收获细胞上清液，储藏于-20℃并在8-丛细胞因子面板(Bio-Rad)上分析。
将正常供体PBMC解冻并在如下条件下处理(均在含有补体的培养基中)：未处理的；BMA031，moIgG2b 10ug/ml；OKT3，moIgG2a 10ug/ml；H66，huIgG1δAB 10ug/ml、1ug/ml和0.1ug/ml；H66，huIgG1 S298N/T299A/Y300S10ug/ml、1ug/ml和0.1ug/ml。
在第2天(D2)和第4天(D4)收集细胞因子用于Bioplex分析(IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、GM-CSF、IFNg、TNFa)。在D4对细胞进行CD4、CD8、CD25和abTCR表达的染色。
如图5-8所示的结果表明，H66 S298N/T299A/Y300S在所进行的所有基于细胞的测定中表现得与H66δAB相似，显示出CD25表达的最小T细胞激活，对abTCR的结合(具有与δAB稍微不同的动力学)，以及在D2和D4时间点的最小细胞因子释放。因此，S298N/T299A/Y300S突变体与δAB突变一样有效地消除效应功能。
实施例5：抗CD52抗体骨架中工程化Fc变体的制备与表征
除了H66抗αβTCR抗体外，还在抗CD52抗体骨架(克隆2C3)中进行了S298N/Y300S突变的工程化。然后检查该突变体以确定在S298N/Y300S H66抗αTCR抗体中观察到的效应功能调节是否与另一抗体骨架中的一致。
5A.2C3抗CD52抗体改变的糖基化变体的生成
首先，使用pENTR_LIC_IgG1通过快速变化诱变制备S298N/Y300S 2C3变体DNA，并通过LIC将WT 2C3 VH克隆至突变载体中。使用Gateway技术将全长突变体克隆至pCEP4(-E+I)Dest表达载体中。随后通过DNA测序证实突变，并且序列示于表11中。突变的氨基酸以阴影表示，并且通过突变产生的共有糖基化靶位点以下划线表示。然后将突变体转染至6孔板形式的HEK293-EBNA细胞中，并从条件培养基纯化蛋白质。抗CD52 2C3野生型抗体作为对照平行产生。使用SD-PAGE和Western印迹分析发现表达水平为0.1μg/mL(图9小图A)。突变体在纯条件培养基中的表达也通过Biacore上的蛋白A捕获来测量。在固定化的蛋白A注射6分钟后使用解离响应来测定浓度。使用在培养基中从90μg/mL至1.5ng/mL连续稀释的CHO产生的WT 2C3作为标准曲线。通过使用4-参数拟合的校准曲线计算约0.2μg/mL内的浓度。相对表达水平低并且通常与Western印迹数据一致(图9小图B)。
表11.抗CD52克隆2C3抗体序列
Figure BDA0003868969060001031
Figure BDA0003868969060001041
5B.用PNGaseF进行的糖基化分析
为了评价通过突变引入的额外的糖基化位点，用PNGase F将富集的S298N/Y300S突变体去糖基化。去糖基化没有表现出分子量的任何明显变化，这指示没有额外的糖类存在(图10)。进行小规模制备以纯化这些突变体用于进一步表征，并且结果再次证实在S298N/Y300S突变体上不存在额外的糖类(图11)。
5C.用Biacore得到的2C3抗CD52抗体突变体对人FcγRIIIa的结合特性
Biacore还用于表征纯化的抗体的抗原结合，FcγRIII，和结合特性(参见图12、13和14)。S298N/Y300S 2C3变体与CD52肽紧密结合，并且结合传感图与野生型对照无法区分，表明该突变不影响其抗原结合(图12小图A)。
为了测定Fc效应功能，在结合研究中使用FcγRIII受体(Val158)。将突变体和野生型对照抗体稀释至200nM，并注射至HPC4标签捕获的FcγRIIIa。对于S298N/Y300S突变体几乎检测不到FcγRIII结合，其指示该变体失去效应功能(图12小图B和图14小图A)。为了进一步测定Fc效应功能，FcγRIII受体(Phe158)也用于结合研究。将突变体和野生型对照抗体稀释至200nM，并注射至HPC4标签捕获的FcγRIIIa。对于S298N/Y300S突变体，几乎检测不到FcγRIII结合，这指示Phe158变体的效应功能丧失(图14小图B)。最后，使用Biacore比较纯化蛋白的FcRn结合性质。将小鼠和SEC纯化的人FcRn-HPC4通过胺偶联固定至CM5芯片。将每种抗体稀释至200、50和10nM，并注射到受体上。纳入Campath，CHO产生的WT 2C3，和DEPC处理的Campath作为阳性和阴性对照。这些数据显示突变体以与野生型抗体对照相同的亲和力结合至人和鼠FcRn受体二者，并且其可能在其循环半衰期或其它药代动力学性质方面没有改变。(参见图12小图C，图13小图A和B)。因此，S298N/Y300S突变通常适用于抗体，以减少或消除不需要的Fc效应功能，例如通过人Fcγ受体的衔接。
实施例6：S298N/Y300S突变体中的循环免疫复合体检测
还使用针对S298N/Y300S突变体和WT对照的C1q结合测定来研究了循环免疫复合体检测。用浓度范围为10-0.001μg/ml的100μl的2倍连续稀释于包被缓冲液(0.1M NaCHO3pH 9.2)中的2C3 Ab将高结合的Costar 96孔板在4℃包被过夜。ELISA分析显示与WT相比，S298N/Y300S突变体的C1q结合降低(图15小图A)。抗Fab Ab与包被的2C3 Ab的结合证实了孔的等同包被(图15小图B)。
实施例7：用等电点聚焦对S298N/Y300S突变体的分离和分析
运行pH 3-10等电聚焦(IEF)凝胶以表征S298N/Y300S突变体。发现S298/Y300S具有更多的负电荷，因此，可能唾液酸分子更多(图18小图A)。完整的MS显示S298N/Y300S突变体和WT 2C3具有G0F和G1F作为主要的糖基化种类(分别为图18小图B和D)。
实施例8：S298N/Y300S的抗原结合亲和力
用Biacore来比较已经从较小(图16)和较大(图17)规模表达制备和纯化的WT抗CD52 2C3 Ab和S298N/Y300S突变体的抗原结合亲和力。获得了固定有CD52肽741和对照肽777的CM5芯片。抗体在HBS-EP中从60至0.2nM连续稀释2倍，然后在芯片表面注射3分钟，随后在缓冲液中以50μl/分钟的流速解离5分钟。然后用40mM HCl的脉冲再生表面。这些分析一式两份进行，并证明S298N/Y300S突变体和WT 2C3抗体显示出相当的CD52肽结合。
设计培养基筛选平台以在纯化之前测试功能性结合性质，以筛选在小规模转染期间产生的抗体。使用Octet(图19小图A)来进行这些测试以确定浓度和使用的蛋白A生物传感器和GLD52标准曲线。将样品在HBS-Ep中稀释至7.5和2nM，用于使用Biacore进行的CD52结合比较(图19小图B)。肽结合测定的结果显示S298N/Y300S突变体和WT 2C3抗体都具有相当的CD52肽结合。此外，这些分析表明Octet和Biacore在预测来自小规模转染的抗体的抗原结合方面运行良好。
实施例9：其他抗体骨架中的S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S和N297Q/S298N/Y300S改变的糖基化突变体的制备
除了抗αβ-TCR抗体和2C3抗CD-52抗体之外，还在其他抗体骨架中工程化了S298/Y300S、S298N/T299A/Y300S、和N297Q/S298N/Y300S突变，以证实可以将其他的串联糖基化位点引入不相关的重链可变域序列。择一地糖基化的抗CD-52 12G6和抗Her2突变体在表12和13中列出。突变的氨基酸以阴影表示，并且通过突变产生的共有糖基化靶位点以下划线表示。
表12：抗CD52克隆12G6抗体序列
Figure BDA0003868969060001061
Figure BDA0003868969060001071
表13：抗Her2抗体序列
Figure BDA0003868969060001072
Figure BDA0003868969060001081
实施例10：含有反应性聚糖模块的改变的抗体的生成
为了生成含有能够与衍生的效应模块反应的含有聚糖模块的抗体，使用糖基转移酶和相关的糖核苷酸供体首先在体外将抗HER抗体糖基化。例如，为了引入唾液酸残基，首先用β-半乳糖基转移酶将供体抗体进行半乳糖基化，然后根据Kaneko等(Kaneko,Y.,Nimmerjahn,F.,and Ravetch,J.V.(2006)anti-inflammatory activity ofimmunoglobulin G resulting from Fc sialylation.Science 313,670-3)的方法用α2,6-唾液酸转移酶将其唾液酸化。使用β-半乳糖基转移酶(50mU/mg，Sigma)和α2,6-唾液酸转移酶(5ug/mg,R&D系统)与供体糖核苷酸底物、UDP-半乳糖(10mM)和CMP-唾液酸(10mM)在含有5mM MnCl2的50mM MES缓冲液(pH 6.5)中于一锅合成步骤中进行反应。将含有5mg/ml抗HER2抗体的反应混合物在37℃温育48小时。使用全甲基化聚糖(其通过PNGase F从抗体释放)的MALDI-TOF MS分析，用Dionex HPLC的唾液酸含量分析，以及用SNA(一种特异性针对α2,6-唾液酸的凝集素)的凝集素印迹，来验证唾液酸化。
通过PNGase F处理唾液酸化的抗HER2抗体而释放的聚糖的MALDI-TOF分析表明，天然聚糖已经主要由单唾液酸化的双分枝结构A1F(图27小图A)以及少量的双唾液酸化的种类完全重塑。用较高量的α2,6-唾液酸转移酶处理抗体产生了更均质的A1F糖型的群体，表明酶活性或聚糖定位可以防止完全唾液酸化。唾液酸含量确定为每mol抗体～2mol，这与作为主要糖型种类的A1F聚糖一致(图27小图B)。用SAN凝集素，特异性针对α2,6-连接的唾液酸的欧洲接骨木(Sambucus nigra)凝集素进行的凝集素印迹证实了唾液酸以α2,6-连接的构型存在(图27小图C)。
总之，虽然天然蛋白聚糖有点异质性，通过半乳糖基和唾液酸转移酶重塑产生具有单唾液酸化但完全半乳糖基化的双分枝聚糖(A1F)的几乎均质的抗体。在每个分枝的聚糖上的两个半乳糖受体上仅引入～1个唾液酸可能是由于来自聚糖的一个半乳糖的有限的可及性(accessibility)，其通常被埋在抗体中，或是由于聚糖与蛋白表面的非共价相互作用。
实施例11：含有反应性聚糖模块的改变的抗体的氧化
一旦唾液酸化得以验证，则研究用不同浓度的高碘酸盐(0.25至2mM)对唾液酸化的抗HER2抗体的过程内的氧化。将唾液酸化的抗体首先缓冲液交换至含有5mM EDTA的25mMTris-HCl(pH7.5)中，然后用PBS缓冲液进行缓冲液交换。然后将缓冲的抗体混合物施加至用PBS缓冲液预平衡过的蛋白A Sepharose柱。在用15个柱体积的PBS、15个柱体积的含有5mM EDTA的PBS、和30个柱体积的PBS洗涤柱之后，然后用25mM柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH2.9)对其进行洗脱。立即用磷酸氢盐缓冲液中和洗脱液，并使用来自Millipore的Amiconultra浓缩抗体。纯化后，然后在冰上在黑暗中用100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.6)中的高碘酸钠(Sigma)将唾液酸化的抗HER2抗体氧化30分钟，并在冰上用3％甘油淬灭反应15分钟。通过超过50kDa Amicons的5轮超滤，将产物脱盐并交换至100mM乙酸钠中(pH 5.6)。图28小图A显示了用不同量的高碘酸盐滴定的唾液酸化抗体的唾液酸含量分析。在高于0.5mM的高碘酸盐浓度处实现了唾液酸残基的完全氧化。事实上，低至0.5mM的高碘酸盐浓度足以完全氧化引入的唾液酸。因此，选择1mM浓度的高碘酸盐用于供药物缀合的唾液酸化抗体的氧化。
氧化可对抗体的完整性具有不利影响。例如，已知包含位于Fc CH3区中靠近FcRn结合位点的甲硫氨酸残基(包括Met-252和Met-428)的氧化影响FcRn结合，这对于延长抗体血清半衰期是至关重要的(Wang,W.,等(2011)Impact of methionine oxidation inhuman IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibody.Mol Immunol 48,860-6)。因此，为了检验高碘酸盐氧化对于对FcRn相互作用关键的甲硫氨酸残基(例如Met-252)的潜在副作用，通过胰蛋白酶肽消化的LC/MS分析确定了唾液酸化抗体的氧化状态。该分析显示在用1mM高碘酸盐处理唾液酸化的曲妥珠单抗后Met-252的～30％氧化和Met-428的<10％氧化。为了确定这种程度的甲硫氨酸氧化对FcRn结合的影响，使用表面等离子共振(BIACORE)评估了每种抗体的FcRn结合动力学。该分析揭示了与FcRn结合的微小损失(对小鼠和人FcRn为12％和26％减少，分别参见图28小图B和C)相关的氧化状态。值得注意的是，据报道，人FcRn的Ka的～25％的减少对人FcRn转基因小鼠的血清半衰期没有影响，因为每个抗体上的单个完整FcRn位点足以提供功能性，和PK优势(Wang等，Id)。
总之，这些数据表明，通过唾液酸转移酶处理引入高碘酸盐敏感的唾液酸残基允许使用浓度低得多的高碘酸盐，导致对抗体-FcRn相互作用和抗体完整性的最小副作用，如通过聚集评估的那样(<1％)。因此，唾液酸化抗体的使用提供了更宽的氧化条件窗口以供使用，允许可再生地生成活性糖缀合物而不影响血清半衰期。
也可以使用半乳糖氧化酶特异性地氧化高糖基化抗体突变体中的半乳糖，以生成用于缀合的醛基。为了证实这种方法，将A114N抗TEM1抗体浓缩至13-20mg/ml，然后用溶于PBS中的20mU/mg唾液酸酶在37℃处理6小时。然后用半乳糖氧化酶(“GAO”)将脱盐产物氧化，首先用5ug GAO/mg蛋白在37℃过夜，然后加入2ug GAO/mg蛋白并再温育5小时。加入乙酸钠以将pH调节至5.6(0.1v/v,pH5.6)，并加入DMSO以达到16％的最终反应浓度，在缀合前加入。类似地用唾液酸酶(20mU/mg)将高糖基化突变体A114N抗HER抗体(15mg/ml)去唾液酸化，并在37℃于单一反应中用5ug GAO/mg蛋白氧化过夜。
实施例12：反应性效应模块的合成
为了促进与醛衍生的抗体糖型的缀合，用氨基氧基-胱胺酰胺来衍生候选药物效应模块(例如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和多拉司他汀10(Dol10))从而含有与具有醛特异反应性的官能团(例如氨基氧基-cys)。
简言之，为了生成氨基氧基-胱胺作为起始原料，将S-三苯甲基-L-半胱氨酰胺(362mg，1mmol)添加至t-BOC-氨基氧基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(289mg，1mmol)的3mL的DMF溶液。3小时后反应完成，如HPLC分析所证实。随后将反应混合物用30ml的二氯甲烷稀释，并用0.1M碳酸氢钠溶液(2×20mL)、水(2×20mL)和盐水(2×20mL)洗涤。将溶液用无水硫酸钠干燥、过滤并浓缩至干燥。向该干燥的残余物添加3mL的TFA，然后添加150μL的三乙基硅烷。将所得溶液从叔丁基甲基醚沉淀，并重复该过程三次。过滤后，将残余物在减压条件下干燥，得到205mg的灰白色(off white)固体(67％产率)。该化合物无需进一步纯化即用于下一步骤。
为了产生氨基氧基衍生的MMAE(氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-MMAE)，将30.1mg的氨基氧基-胱胺(0.098mmol，2当量)与64.6mg的MC-VC-PABC-MMAE(0.049mmol)和100μL的三乙胺组合于3mL的DMF中。根据HPLC分析在反应完成之时将所得的反应混合物在室温搅拌15分钟。通过制备型HPLC纯化化合物，得到45mg(62％)的所需产物，其为灰白色固体。反相HPLC分析表明化合物的纯度>96％。ESI计算值C73H116N14O18S(MH)+1509.8501；实测值，m/z1509.8469。
为了产生氨基氧基衍生的Dol10(氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10)，将7.4mg(0.024mmol，3当量)的氨基氧基-胱胺，12mg(0.008mmol)的MC-VC-PABC-PEG8-Dol10和30μL三乙胺组合于3mL的DMF中。根据HPLC分析，反应在15分钟内完成。制备型HPLC纯化得到6.2mg(46％)的所需产物，其为灰白色固体。反相HPLC分析表明化合物的纯度>96％。ESI计算值C80H124N16O19S2(MH)+1678.0664；实测值，m/z 1678.0613。
实施例13：反应性效应模块的唾液酸介导的(SAM)缀合
脱盐后，将实施例11的药物-接头与实施例10的氧化的唾液酸化抗体用75％DMSO(0.167v/v)以25mM的浓度组合，以获得24:1的药物-接头与抗体的摩尔比和5mg/ml的最终抗体浓度。将混合物在室温温育过夜。使用BioBeads清除未合并的药物-接头和任何游离药物。使用PD-10柱将产物缓冲液交换至组氨酸-吐温缓冲液中并进行无菌过滤。测定内毒素水平，并且在体内研究中达到小于0.1EU/mg ADC。
图29小图A-C显示了糖缀合至AO-MMAE的不同唾液酸化抗体(实施例11的抗FAPB11和G11以及抗HER2抗体)的疏水相互作用色谱(HIC)。唾液酸化的HER2抗体还与药物-接头，AO-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10缀合(图29小图D)。该分析揭示，每个抗体主要存在一个或两个药物缀合物，药物对抗体比率(DAR)为1.3-1.9。与MMAE糖缀合物(图29小图C)相比，Dol10糖缀合物(图29小图D)的增加的保留时间可能是由于Dol10的更大的疏水性。
还使用与两种不同药物-接头(AO-MMAE或AO-PEG8-Dol10)缀合的抗HER抗体以30mg的规模进行了LC-MS分析。该分析显示缀合后的类似的DAR值，其为1.7和1.5，这与HIC分析相当。大小排阻色谱法(SEC)在这些缀合物中显示了非常低水平(1％)的聚集体。
实施例14：反应性效应模块的半乳糖介导的(GAM)缀合
将实施例11中所述的用半乳糖氧化酶在A114N抗TEM1高糖基化突变体抗体上产生的半乳糖醛与24摩尔过量的氨基氧基-MC-VC-PABC-MMAE药物-接头在抗体上通过在25℃温育过夜而缀合，产生DAR为1.72的ADC缀合物。
向如实施例11所述制备的半乳糖氧化酶处理的抗HER抗体添加十分之一反应体积的1M乙酸钠，pH5.6，以将pH调节至5.6，并添加DMSO以使终浓度为14％，然后添加24当量氨基氧基MC-VC-PABC-MMAE药物接头。将反应在室温温育过夜。用Biobeads清除游离药物和药物-接头，并用SEC交换产物缓冲液(65％产率)。通过HIC分析产物缀合物。如图30所示，AO-MMAE缀合至～60％的分子。
实施例15：体外ADC细胞增殖测定
还将抗HER和抗FAP糖缀合物分子的体外活性与含有经硫醇键连接至相同供体抗体的铰链区半胱氨酸的相同药物模块的相应硫醇缀合物进行比较。硫醇缀合物含有的每个抗体(DAR)的药物数量是糖缀合物的约两倍。基于硫醇的缀合如Stefano等(Methods inMolecular Biology 2013，in press)所述进行。然后使用Her2+SK-BR-3和Her2-MDA-MB-231细胞系来评估每个ADC的相对效力。该分析的结果示于下表15中
表15.糖缀合物和硫醇缀合物的EC50比较
Figure BDA0003868969060001121
Figure BDA0003868969060001131
标注:*通过LC-MS确定的DAR；**通过HIC确定的DAR
图31(小图A-D)显示了抗HER糖缀合物与其对应的硫醇缀合物的体外效力的比较。将缀合物暴露于表达Her2抗原的(SK-BR-3)细胞(图31小图A和C)或非表达(MDA-MB-231)细胞(图31小图B和D)72小时后测定细胞活力。ADC含有连接至聚糖(“糖”)或通过常规化学连接至铰链区半胱氨酸(“硫醇”)的MMAE或PEG8-Dol10。如图31小图A和C所示，与糖缀合物相比，观察到硫醇缀合物的EC50降低约2倍，这与前者中比后者的2倍更高的DAR一致。用高达100ug/ml的任何抗体的Her2-细胞系没有观察到毒性。
在用针对肿瘤抗原(FAP)的抗体制备的ADC的细胞增殖中也观察到类似的趋势，所述肿瘤抗原在包括结肠癌、胰腺癌和乳腺癌的上皮癌中由反应性基质成纤维细胞高度表达(Teicher,B.A.(2009)Antibody-drug conjugate targets.Curr Cancer Drug Targets9,982-1004)。通过将氨基氧基MMAE药物-接头或马来酰亚胺MMAE药物-接头与聚糖或硫醇基团缀合，再次制备这些缀合物。这些缀合物的细胞增殖测定显示，与图32中描述的相同的缺乏FAP表达的细胞相比，硫醇缀合物的EC50对于用人FAP转染的CHO细胞具有约100倍高的效力，其显示了抗FAP B11糖缀合物和硫醇缀合物的体外效力的比较。在缀合物暴露于用或不用FAP抗原转染的CHO细胞后测定细胞活力。ADC含有连接至聚糖(“糖”)或通过常规化学连接至铰链区半胱氨酸(“硫醇”)的MMAE。注意，与糖缀合物相比，硫醇的约低2倍的EC50与每个抗体递送的药物的相对量一致，假设表达抗原的CHO细胞中靶结合和内化的效率相似。平行地，测定如之前所述的DAR为1.5的抗FAP(B11)ADC的糖缀合物，并显示出比对比物硫醇缀合物约2倍高的EC50(DAR 3.3)。
如图36所示，当在表达SK-BR-3的细胞或MDA-MB-231细胞上测定时，如实施例14所述，在用具有A114N高糖基化突变的抗HER抗体和AO-MMAE制备的ADC的细胞增殖测定中观察到了类似的趋势。A114N糖缀合物清楚地显示了针对Her2表达细胞系相对于非表达系的增强的细胞毒性。与用相同抗体制备的SialT糖缀合物相比的相对毒性与该制备物的较低载药量是一致的。
还对ADC进行了细胞增殖测定，所述ADC用具有A114N高糖基化突变的抗TEM1抗体和如实施例14中所述制备的AO-MMAE来制备。用TEM1表达细胞系SJSA-1和A673观察到了与非表达的MDA-MB-231系相比更高的毒性。与具有相同抗体的常规硫醇缀合物相比，毒性水平与该制备物的载药量(DAR)保持一致。
Figure BDA0003868969060001141
总之，药物通过聚糖与可切割接头的位点特异性缀合产生具有毒性和体外效力的ADC，其等同于常规的基于硫醇的缀合物，如使用不同的抗体和不同的药物-接头所证明的那样。此外，低于2mM高碘酸盐，药物缀合的水平与唾液酸的减少相关。增加高碘酸盐浓度高于2mM几乎没有益处，如从唾液酸向氧化形式的完全转化所预期的。然而，在所有条件下，每个抗体的药物数量略低于唾液酸含量，指示一些氧化的唾液酸可能类似地不可用于偶联，这是由于被埋入或者以其他方式因药物-接头的体量产生的位阻所致。
实施例16：抗体药物缀合物的体内表征
还在Her2+肿瘤细胞异种移植模型中评估了抗HER糖缀合物的效力，并与具有～2倍更高的DAR的硫醇缀合物比较物进行比较。将SK-OV-3Her2+肿瘤细胞植入Beige/SCID小鼠，在开始治疗之前允许其建立～150mm3的肿瘤。在第38、45、52和59天通过尾部血管注射3或10mg/kg剂量的ADC。每组～10只小鼠。测量不同组中小鼠的肿瘤体积并记录其存活。基于Kaplan-Meier方法绘制存活曲线。
图33(小图A-D)显示了Her2+肿瘤细胞异种移植模型中抗HER糖缀合物和硫醇缀合物的体内效力的比较。用具有～2倍更高的DAR的含有糖缀合物或硫醇缀合物比较物的MMAE(图33小图A和B)和PEG8-Dol10(图33小图C和D)给予植入有SK-OV-3Her2+肿瘤细胞的Beige/SCID小鼠。MMAE缀合物的肿瘤生长动力学显示于图33小图A中。在这种情况下，糖缀合物显示出比裸抗体单独(黑色)显著更高的效力，但其效力小于具有～2倍更高的DAR的硫醇缀合物比较物(绿色)。MMAE糖缀合物显示出显著的肿瘤消退和～20天的肿瘤生长延迟(图33小图A)和从第一剂量开始的存活时间的～2倍的增加(图33小图B)。硫醇MMAE缀合物在相同的ADC剂量(10mg/kg)处显示接近完全肿瘤抑制。
还在相同的Her2+肿瘤细胞异种移植物模型中确定了PEG8-Dol10糖缀合物(“Glyco Dol10”)和具有～2倍更高的DAR(“Thiol Dol10”)的硫醇缀合物比较物的体内效力。两种缀合物均显示出比前文所述的MMAE缀合物更低的效力。然而，10mg/kg的氨基氧基-PEG8-Dol10糖缀合物(“Glyco Dol10”)在第一次施用后显示出15天的肿瘤生长延迟(图33小图C)，以及～20天的存活期增加(1.7倍)(图33小图D)。硫醇缀合物在相同剂量下更有效，显示出存活率的2倍增加。在较低剂量(3mg/kg)处，硫醇缀合物显示比10mg/kg的糖缀合物更低的效力。该剂量对应于80umol PEG8-Dol10药物/kg剂量，相比于对糖缀合物为110umolPEG8-Dol10药物/kg剂量。
这些数据表明药物对抗体聚糖的唾液酸的位点特异性缀合产生作用的分子，所述分子具有与经基于硫醇化学方法产生的ADC相当的效力。某种程度上较低的体内效力可能源于每种抗体通过每种抗体结合的抗原的内化而携带至肿瘤细胞中的较少数量的药物。尽管我们没有将这些糖缀合物与相同DAR的硫醇缀合物进行比较，但在代表相当的施用药物水平的两种ADC的不同剂量处观察到的效力显示，糖缀合物具有与它们的硫醇对应物相当的内在效力，指示在该位点处缀合没有有害影响。此外，仅多引入了28％的药物的10mg/kg剂量的Dol10糖缀合物提供了相比于硫醇缀合物(3mg/kg)2倍的存活率增加，表明这些缀合物甚至可以在相同的DAR处提供优越的效力。鉴于在天然聚糖处的唾液酸掺入的明显限制，可以通过许多不同的策略实现更高的载药量，包括使用分枝的药物接头或引入额外的糖基化位点并使用相同的方法。
实施例17：靶向模块的缀合
图37显示了用于将靶向模块缀合至现有糖类或工程化的糖基化位点的整体方案。这种缀合可以通过将新聚糖、糖肽或其他靶向模块附接至氧化的唾液酸化抗体来进行(图38和39)。适合缀合的模块可以包括含有氨基氧基接头的那些(图40和41)。
实施例18：天然Fc聚糖中经唾液酸的缀合
将Man-6-P六甘露糖氨基氧基缀合至特异性靶向Man-6-P受体的多克隆抗体或单克隆抗体。兔多克隆抗体与Man-6-P六甘露糖氨基氧基的缀合的SDS-PAGE和MALDI-TOF MS分析显示于图42中。图43描绘了用于评估对照和Man-6-P六甘露糖缀合的兔多克隆IgG抗体对阳离子依赖性Man-6-P受体(CI-MPR)的结合的表面等离子体共振实验的结果。这种缀合抗体的体外分析证明了其被HepG2(人肝脏肝细胞癌)和RAW(小鼠鼠白血病)细胞系(图44)二者的摄取增加。培养物用抗兔-Alexa 488抗体染色，用DAPI复染。
通过SDS-PAGE和凝集素印迹进一步测试了与Man-6-P或乳糖氨基氧基模块缀合的抗体，并与未缀合的抗体进行比较(图45)。对照和缀合的抗体的MALDI-TOF完整蛋白分析证明缀合物的每个抗体具有约两个聚糖模块，而对照抗体则没有聚糖模块(图46)。
实施例19：抗体中经唾液酸对铰链半胱氨酸残基的缀合
将Man-6-P六甘露糖马来酰亚胺(图41)缀合至多克隆抗体或单克隆抗体。
通过SDS-PAGE，凝集素印迹和Man-6-P定量检验了多克隆抗体与Man-6-P六甘露糖马来酰亚胺通过铰链半胱氨酸的缀合(以确定每个抗体缀合的聚糖数目)(图47)。还通过使用SDS-PAGE检验了多克隆抗体与乳糖马来酰亚胺的缀合，并且对照抗体、缀合的抗体和滤液的半乳糖定量显示于图48中。在铰链半胱氨酸缀合的多克隆抗体中通过大小排阻色谱(SEC)几乎观察不到增加的聚集(图50)。
还通过SDS-PAGE和聚糖定量检验了单克隆抗体与Man-6-P六甘露糖马来酰亚胺通过铰链半胱氨酸的缀合(以确定每个抗体所缀合的聚糖数目)(图49)。在铰链半胱氨酸缀合的多克隆抗体中通过大小排阻层析(SEC)几乎观察不到增加的聚集(图51)。
Man-6-P受体(CI-MPR)通过天然Fc聚糖或铰链二硫化物对双Man-6-P六甘露糖缀合的多克隆和单克隆抗体的结合也通过在非变性(native)PAGE上的凝胶迁移来证明(图55)。
实施例20：完全半乳糖基化的单克隆抗体的制备和三半乳糖基化的糖肽对唾液酸化抗体的缀合
用唾液酸酶和半乳糖基转移酶修饰具有STY突变(NNAS)的小鼠单克隆抗体突变体，用于制备主要天然的三半乳糖基化聚糖(每个抗体2个聚糖)。也用唾液酸转移酶唾液酸化了相同的突变体，并使用SAM方法将其与含有糖肽的三价半乳糖缀合(图68)。测验了酶修饰抗体的唾液酸含量(图52)。此外，检查了从对照和去唾液酸化/半乳糖基化(图53)NNAS释放的聚糖以及从对照和唾液酸化(图54)NNAS释放的聚糖的MALDI-TOF分析。酶修饰和缀合的NNAS的SDS-PAGE(4-12％NuPAGE)和凝集素印迹示于(图56)。还测量了对照NNAS抗体、去唾液酸化/半乳糖基化NNAS抗体和糖肽缀合的NNAS抗体的末端半乳糖定量(图57)。
实施例21：用化学酶方法制备α2,3唾液酸化的乳糖马来酰亚胺以及随后经铰链二硫化物缀合至非免疫兔IgG
糖类结合蛋白(包括Siglec蛋白)能够更有效地结合至具有较大唾液酸密度的区域。因此，给定抗体上的单唾液酸化聚糖可不提供足够的唾液酸密度以促进对其它Siglec蛋白的结合。因此，研究了用于引入多个拷贝的唾液酸化聚糖的铰链二硫化物缀合方法。为了制备用于缀合的唾液酸化聚糖，将乳糖马来酰亚胺(5mg)在体外用来自美人鱼发光杆菌(Photobacterium damsela)的α2,3唾液酸转移酶在Tris2缓冲液(pH7.5)中于37℃唾液酸化2小时。将对照聚糖在无唾液酸转移酶情况下温育并与原聚糖相比较。MALDI-TOF MS分析显示，在37℃于Tris缓冲液(pH7.5)中将没有酶的乳糖马来酰亚胺温育2小时没有改变分子的预期分子量，这表明所检验的条件不导致马来酰亚胺水解。用α2,3唾液酸转移酶修饰的聚糖的MALDI-TOF和Dionex HPLC分析指示存在唾液酸乳糖，尽管其不是主峰(数据未显示)。因此，使用QAE-琼脂糖柱额外纯化了唾液酸乳糖马来酰亚胺，并随后使用MALDI-TOF和Dionex HPLC分析了每个级分。这些分析指示，唾液酸乳糖马来酰亚胺作为主要种类存在于来自QAE柱的20mM NaCl洗脱液中(图58)。使用样品的唾液酸定量分析评估了纯化的唾液酸化聚糖的量，其指示了～1.8mg唾液酸乳糖马来酰亚胺的回收。
使用硫醇-马来酰亚胺化学方法测试了兔多克隆抗体与该唾液酸乳糖马来酰亚胺的随后的缀合。将兔IgG抗体(1mg)用TCEP以4摩尔过量(相对于抗体)在37℃还原2小时，然后在室温与24摩尔过量的唾液酸乳糖缀合1小时。然后将缀合物缓冲液交换至PBS中，用于在SDS-PAGE上分析(图59小图A)。还使用Dionex HPLC进行了唾液酸定量(图59小图B)。将等分试样的对照和硫醇缀合物在37℃用或不用唾液酸酶(1U/mg)处理过夜，然后通过过滤(10kDa MWCO)回收上清液。测量了上清液的唾液酸含量，并与未用唾液酸酶处理的样品进行比较。每个抗体约缀合有4个α2,3唾液酸乳糖模块。
实施例22：通过将乳糖马来酰亚胺唾液酸化制备α2,6唾液酸乳糖马来酰亚胺和通过产生高唾液酸化的α2,3-或α2,6-连接将其缀合至兔多克隆抗体的铰链二硫化物
还研究了多个拷贝的α2,6-唾液酸化的聚糖与兔多克隆抗体的铰链二硫化物的缀合。由于α2,3唾液酸乳糖马来酰亚胺是使用化学酶方法(参见上文，实施例21)成功产生的，所以使用类似的方法来产生α2,6唾液酸乳糖马来酰亚胺(包括使用不同的唾液酸转移酶的实验方案小改动)。为了制备用于缀合的α2,6唾液酸化聚糖，将乳糖马来酰亚胺(～5mg)用0.5U来自美人鱼发光杆菌的细菌α2,6唾液酸转移酶在Tris缓冲液(pH 8)中于37℃体外唾液酸化1小时。酶促反应后，将产物应用于QAE-琼脂糖柱。用10份1ml 2mM Tris(pH8)，5份1ml的含20mM NaCl的Tris缓冲液，和5份1ml含70mM NaCl的Tris缓冲液洗涤柱。使用DionexHPLC以及乳糖和α2,6唾液酸乳糖标准品对来自每一份的等分试样进行分析。标准品和一个洗脱级分的寡糖概貌如图60(小图A-D)所示。还通过MALDI-TOF进行分析和确认了含有α2,6唾液酸乳糖马来酰亚胺的级分。其中一个级分中的聚糖示于图61中。
然后使用唾液酸定量分析来评估了纯化的α2,6唾液酸乳糖马来酰亚胺的量，其指示～1.5mg的唾液酸乳糖马来酰亚胺的回收。一旦制备了聚糖，使用硫醇化学方法测试抗体与α2,6唾液酸乳糖马来酰亚胺或α2,3唾液酸乳糖马来酰亚胺的缀合。将兔多克隆IgG抗体(1mg)进行缓冲液交换并用TCEP以4摩尔过量(相对于抗体)在37℃还原2小时。然后将还原的抗体分成两半：一部分缀合至24摩尔过量的α2,6唾液酸乳糖马来酰亚胺，另一部分缀合至α2,3唾液酸乳糖马来酰亚胺，在室温下缀合1小时。将两种缀合物缓冲液交换至PBS中然后进行SDS-PAGE分析(图62小图A)和使用Dionex HPLC进行唾液酸定量(图62小图B)。用唾液酸定量来估计缀合的聚糖数目。将对照抗体和硫醇缀合的抗体的等分试样在37℃用或不用唾液酸酶(1U/mg)处理过夜，然后通过过滤(10kDa MWCO)回收上清液。测量上清液的唾液酸含量，并与不用唾液酸酶处理的样品(对照)进行比较。分析表明，通过这种方法约有7个聚糖(α2,3-或α2,6-唾液酸乳糖聚糖)缀合至多克隆抗体。
实施例23：用GAM化学方法进行的NNAS的聚乙二醇化
将小鼠NNAS(S298N/T299A/Y300S)突变体单克隆抗体半乳糖基化和去唾液酸化，生成Gal NNAS单克隆抗体且没有任何蛋白酶降解。用半乳糖氧化酶(GAO)修饰该抗体以产生半乳糖醛。然后将半乳糖醛与2或5kDa的氨基氧基聚乙二醇(PEG)缀合。图63描述了使用SDS-PAGE和凝集素印迹的对对照和酶修饰的(脱盐/半乳糖基化)NNAS突变体抗体的表征。图64描述了通过还原性SDS-PAGE用不同量的半乳糖氧化酶对对照抗体和Gal NNAS的聚乙二醇化的表征。这些结果表明，Gal NNAS可以用显著量的单、双和三PEG缀合的每个重链来有效地聚乙二醇化。图66描述了通过还原性SDS-PAGE对对照抗体和具有相对于抗体各种摩尔过量的PEG的Gal NNAS的聚乙二醇化的表征。表征抗体的聚乙二醇化的蛋白简单扫描(Protein Simple scan)证明，每个重链缀合约1.5-1.7个PEG模块(或每个抗体约3-3.4个PEG)(图65和67)。
实施例24：使用GAM化学方法进行的NNAS的聚乙二醇化
用50mU/mg半乳糖基转移酶将NNAS抗体半乳糖基化，随后在50mM MES缓冲液(pH6.5)中用1U/mg唾液酸酶去唾液酸化。然后在存在或不存在0.5mM乙酸铜的情况下用半乳糖氧化酶(57mU/mg)/过氧化氢酶处理去唾液酸化的胎球蛋白和NNAS以及半乳糖基化的NNAS，然后与25摩尔过量的5kDa氨基氧基PEG缀合(图69小图A)。在另一个实验中，在0、0.02、0.1和0.5mM乙酸铜的存在下，用半乳糖氧化酶(57mU/mg)/过氧化氢酶处理半乳糖基化的NNAS，然后与25摩尔过量的5kDa氨基氧基PEG缀合(图69小图B)。在乙酸铜存在下用半乳糖氧化酶氧化的抗体显示出比在没有乙酸铜的情况下与半乳糖氧化酶反应的相同抗体更高程度的聚乙二醇化。当在含有高于0.1mM的浓度的硫酸铜的反应中进行缀合时，观察到了显著更高水平的聚乙二醇化。
实施例25：用唾液酸酶/半乳糖基转移酶对野生型和突变体赫赛汀的修饰
野生型和突变体(A114N、NNAS和A114N/NNAS)赫赛汀抗体用50mU/mg半乳糖基转移酶进行酶促修饰，随后在50mM MES缓冲液(pH 6.5)中用1U/mg唾液酸酶将其去唾液酸化。使用SDS-PAGE(还原的和非还原的)、用ECL(对于末端半乳糖特异的植物凝集素)的凝集素印迹、和使用通过半乳糖苷酶释放的半乳糖的Dionex HPLC分析的末端半乳糖定量来分析修饰的抗体(图70)。使用NNAS和NNAS/A114N双突变体获得了含有大约三至九个末端半乳糖的酶修饰抗体，显示出比野生型和A114N突变体更高的末端半乳糖水平。
实施例26：使用SAM缀合方法对野生型和突变体抗体的聚乙二醇化
野生型和(A114N、NNAS和A114N/NNAS)赫赛汀抗体用唾液酸介导(SAM)的缀合来聚乙二醇化。抗体随后用2mM高碘酸盐氧化。缓冲液交换后，用25摩尔过量的5kDa氨基氧基PEG将氧化抗体聚乙二醇化。使用Dionex HPLC(图71)测量了野生型和突变体抗体的唾液酸含量。然后使用还原的和非还原的SDS-PAGE分析了聚乙二醇化的抗体(图72)。此外，通过使用ProteinSimple分析扫描的凝胶估计了聚乙二醇化(PAR，每个抗体的PEG数目)(图73)。NNAS、A114N和A114N/NNAS突变体都显示出比野生型赫赛汀抗体(1.4)更高的PAR(2.7-4.6)。
实施例27：用含半乳糖的聚糖配体对糖工程化的抗体的摄入的研究
多克隆抗体用半乳糖基转移酶(Gal转移酶)酶促修饰，缀合至乳糖氨基氧基(Gal-Glc至297：缀合至来自唾液酸化抗体的Asn-297的聚糖中的唾液酸)，或缀合至乳糖马来酰亚胺(Gal-Glc至铰链：缀合至铰链二硫化物中的半胱氨酸)。然后将对照、修饰的或缀合的抗体与HepG2细胞(表达ASGPR的肝细胞系)在37℃温育1-2小时，然后使用免疫荧光染色测量了摄取的抗体(图74)。结果显示酶修饰或乳糖缀合的抗体的HepG2细胞摄取增加。
实施例28：三价GalNAc聚糖对赫赛汀的缀合
将赫赛汀(抗Her2)唾液酸化并使用SAM缀合方法将其缀合至三价GalNAc聚糖(图75)以靶向ASGPR。随后使用表面等离子体共振实验(Biacore)来评估这些三价GalNAc聚糖缀合抗体对ASGPR亚基H1的结合(图76)。
实施例29：三价GalNAc聚糖与含有糖肽的三价半乳糖对重组溶酶体酶的缀合
使用SAM缀合方法将重组溶酶体酶与三价GalNAc聚糖或含有糖肽的三价半乳糖(图77)缀合以靶向ASGPR。随后使用表面等离子体共振实验(Biacore)评估了这些三价GalNAc聚糖缀合的酶和含有糖肽的三价半乳糖缀合的酶对ASGPR亚基H1的结合(图78)。结果出显示三价GalNAc聚糖缀合的重组溶酶体酶的强ASGPR结合。图79(小图A-D)显示出许多示例性的三价GalNAc模块。显示了没有间隔基、
Figure BDA0003868969060001211
间隔基、1kDa(约
Figure BDA0003868969060001212
)间隔基，以及
Figure BDA0003868969060001213
间隔基和1kDa(约
Figure BDA0003868969060001214
)间隔基两者的实施例。还将第二重组溶酶体酶(rhGAA)与三价GalNAc聚糖C12缀合。图80显示了描述高碘酸氧化的重组溶酶体酶rhGAA与过量三价GalNAc聚糖C12的缀合结果的图。所得的每个GAA缀合的聚糖以相对rhGAA 20、40、80和200倍摩尔过量的聚糖来描述。图81描绘了在Biacore上与三价GalNAc聚糖C12缀合的重组溶酶体酶的ASGPR结合。与20(缀合物1)、40、80和200倍(缀合物4)过量的聚糖缀合的酶都显示出对ASGPR亚基1的强结合。缀合物(缀合物1至4)之间在结合上没有显著差异。

Claims (6)

1.一种结合多肽，其包含至少一个修饰聚糖，其中所述聚糖含有至少一个式(IV)的模块：
Figure FDA0003868969050000011
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；
C)X是靶向模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，其中Sia存在或不存在，且其中所述靶向模块结合至细胞。
2.一种制造权利要求1的结合多肽的方法，该方法包括将式(I)的效应模块与包含氧化聚糖的前体结合多肽反应，所述式(I)为：
NH2-Q-CON-X
式(I)，
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；且
C)X是靶向模块。
3.包含权利要求1的结合多肽及药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物。
4.一种治疗对其有需求的患者的方法，包括施用有效量的权利要求3的组合物。
5.包含至少一个修饰聚糖的结合多肽，所述修饰聚糖包含式(IV)的至少一个模块：
Figure FDA0003868969050000012
其中：
A)Q是NH或O；
B)CON是连接体模块；
C)X是包含PEG的模块；
D)Gal是衍生自半乳糖的组件；且
E)Sia是衍生自唾液酸的组件，
其中Sia存在或不存在。
6.一种制造聚乙二醇化结合多肽的方法，其中该方法包括：
(a)将包含至少一个聚糖的结合多肽与温和氧化剂在存在包含金属离子的盐的条件下反应，以生成包含至少一个氧化聚糖的氧化的结合多肽，及
(b)将所述氧化的结合多肽与至少一个包含PEG的模块缀合，由此生成聚乙二醇化的结合多肽。
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