CN114656523B - 靶向siglec-10蛋白的多肽及免疫调控应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶向siglec‑10蛋白的多肽及免疫调控应用。本发明通过噬菌体展示技术获得的特异性靶向Siglec‑10的5条噬菌体多肽，氨基酸序列如SEQ ID No.1‑SEQ ID No.5所示。所述噬菌体多肽与Siglec10具有较高的亲和性和特异性。并且，5条多肽为小分子多肽、易被合成，高效、低毒，对巨噬细胞、T淋巴细胞具有较好的免疫调控功能，可促进巨噬细胞对卵巢癌和乳腺癌细胞的吞噬和杀伤。

Description

靶向siglec-10蛋白的多肽及免疫调控应用

技术领域

本发明属于免疫治疗领域(包含激活免疫抗肿瘤)，涉及靶向siglec-10蛋白的多肽及免疫调控应用。

背景技术

免疫系统是人体抵抗外来细菌、病毒等外来病原菌的重要系统，具有免疫监视、防御、调控的作用。免疫细胞(树突状细胞、NK细胞、粒细胞、T细胞和B细胞等)功能的调控对于维持免疫功能具有重要作用。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(sialic acid-bindingimmunoglobulin-like lectin，Siglec)可介导细胞与细胞或病原体间的相互作用，其家族成员参与免疫细胞活化、增殖以及凋亡的调控，参与免疫耐受的调控，在自身免疫病、炎症反应以及肿瘤发生中发挥重要的免疫调控作用。

Siglec-10，人源细胞中的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素10，小鼠同源物为Siglec G，广泛在B细胞、T细胞、树突状细胞和巨噬细胞上表达，在其胞质结构域中带有ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序)结构，是一种免疫抑制性受体，在免疫细胞信号传导中起关键作用。Siglec10与可溶性CD52结合后可以通过削弱主要的组织相容性复合物I类-肽复合物的形成以及与T细胞受体相关的激酶Lck和ZAP-70的磷酸化来抑制T细胞的增殖和活化。2019年Barkal AA等在Nature发表论文报道，卵巢癌和三阴性乳腺癌中高表达的CD24可以结合到巨噬细胞表面Siglec10从而发挥“别吃我”的信号，逃脱机体的免疫监控。肿瘤细胞上的CD24和免疫细胞上的siglecc-10相互作用导致了抑制信号级联。siglec-10的IgV结构域与位于CD24末端的唾液酸结合，导致细胞内ITIM或ITIM样基序诱导Src家族激酶。这些激酶使细胞质中的ITIM酪氨酸磷酸化，然后招募酪氨酸磷酸酶如SHP-1和SHP-2来减少信号转导。

总结以上研究可知，①Siglec10表达在T细胞表面，与可溶性CD52结合，可以抑制T细胞的增殖和活化；②Siglec10表达在巨噬细胞表面，与卵巢癌和三阴性乳腺癌中高表达的CD24可以结合，发挥“别吃我”的信号，介导肿瘤的免疫逃逸。可见，Sigec-10在免疫细胞功能调节中具有关键作用，已成为发展免疫疗法治疗广泛疾病的潜在目标。针对靶点Siglec10开发药物，可能对于治疗巨噬细胞、T细胞功能失调相关疾病具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的是针对现有治疗策略的不足，提供5种靶向siglec-10蛋白的多肽。

本发明的另一目的是提供5条多肽的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

靶向siglec-10的多肽，选自一下所示的任意一条多肽：

多肽pep-MSH：MSHHYPHRGLHK(SEQ ID No.5)。

多肽pep-YLL：YLLAVGRSLKQD(SEQ ID No.1)；

多肽pep-HFV：HFVKTPARWAWG(SEQ ID No.2)；

多肽pep-MGS：MGSHMHRHPKTF(SEQ ID No.3)；

多肽pep-WGY：WGYPHSWLWARS(SEQ ID No.4)。

其中多肽pep-YLL和pep-HFV是针对siglec-10特定序列1AYGYWFKAVTETTKGAPV)筛选到的；多肽pep-MGS、pep-WGY和pep-MSH是针对siglec-10特定序列2(DGRFWIRVQESVMVPEGLC)筛选到的。

所述的靶向siglec-10的多肽在制备封闭巨噬细胞siglec-10功能的药物中的应用。

所述的靶向siglec-10的多肽在制备封闭T淋巴细胞siglec-10功能的药物中的应用。

所述的靶向siglec-10的多肽在制备免疫活化药物中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的靶向siglec-10的多肽在制备促进T淋巴细胞、巨噬细胞免疫活化的药物中的应用。

所述的靶向siglec-10的多肽在制备乳腺癌、卵巢癌免疫治疗药物中的应用。

所述的靶向siglec-10的多肽在制备CD24-siglec-10互作障碍相关疾病药物的应用。

所述多肽的获得可按照氨基酸序列通过固相合成方法获得；或者通过宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码所述多肽之一的核苷酸序列的DNA片段，通过现有的重组DNA技术制备获得。所使用的表达载体和宿主细胞均为重组技术为公众所知的。表达载体例如pET载体、pGEX载体；宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)，放线菌(Actinomycetes)，芽孢杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)。

有益效果：

噬菌体多肽库来源的5条多肽，是针对Siglec10特异性序列筛选获得的，均含有12个氨基酸，目前尚无5条多肽的功能。序列分别为：YLLAVGRSLKQD、HFVKTPARWAWG、MGSHMHRHPKTF、WGYPHSWLWARS、MSHHYPHRGLHK。在5条多肽添加生物素，结合验证试验表明多肽均可以结合siglec10蛋白。在细胞培养过程中，用多肽处理，可以显著促进肿瘤患者巨噬细胞和T淋巴细胞的功能，还可以促进巨噬细胞对卵巢癌细胞以及乳腺癌细胞的吞噬作用。因此，该5条多肽具有免疫调控作用，可以在制备抗自身免疫病和抗肿瘤相关药物中应用。

附图说明：

图1生物素标记的多肽可以与蛋白siglec-10结合

图2流式检测多肽显著促进巨噬细胞对卵巢癌细胞的吞噬作用

图3流式检测多肽显著促进巨噬细胞对乳腺癌细胞的吞噬作用

图4噬菌体多肽促进卵巢癌患者巨噬细胞产生炎症性细胞因子

图5噬菌体多肽促进乳腺癌患者巨噬细胞产生炎症性细胞因子

图6噬菌体多肽促进CD3抗体活化卵巢癌患者T细胞产生TNF-α和IFN-γ

图7噬菌体多肽促进CD3抗体活化乳腺癌患者T细胞产生TNF-α和IFN-γ

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

实施例1与Siglec-10蛋白结合噬菌体多肽的筛选

将体外合成的Siglec-10蛋白包被在ELISA板上，BSA封闭；再加入提前与BSA中和的噬菌体十二肽库孵育，于ER2738菌中扩增并滴定获得噬菌体滴度，经历四轮筛选后，选取一定量噬菌蓝斑进行噬菌体单克隆扩增。通过phage-ELISA验证噬菌体单克隆与Siglec-10的结合能力(同时设置BSA对照组)，共118个噬菌体单克隆：选取结合能力更强的42个噬菌体单克隆，提取噬菌体DNA，测序，获得亲和肽序列(表1、表2)；根据选择疏水结构域，利于与细胞膜结合的原则，委托上海科肽生物科技有限公司用过固相法合成如SEQ ID No.1-SEQID No.5所示的5条多肽，进行后续的功能验证实验。

表1 噬菌体多肽筛选

表2 噬菌体多肽筛选

实施例2生物素标记的多肽可以与蛋白siglec-10结合

合成生物素标记的上述5条多肽，与siglec-10，将以上合成的多肽分别用超纯水(ultra pure water)溶解为100μM，-80度储存备用。

将2ug生物素标记的多肽，分别与链霉亲和素磁珠(25ul，sigma)4℃孵育过夜后，清洗后再和THP-1和Jurkat细胞的蛋白裂解液室温孵育2h，加入适量1xSDS loadingbuffer经过95℃煮沸，洗脱掉珠子，收集蛋白混合液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，最后利用Western Blot实验验证多肽可以和蛋白siglec-10结合。结果如图1所示生物素标记的多肽可以和蛋白siglec-10结合。

实施例3多肽显著促进巨噬细胞对卵巢癌细胞的吞噬作用

将单核细胞THP-1按照标准条件(1640培养基，37℃，5％CO2)，卵巢癌细胞8910按照标准条件(DMEM培养基，37℃，5％CO2)培养。第一天，将THP-1细胞接种在六孔板中，加入PMA(100ng/ml)24h，诱导成M0型巨噬细胞；第二天，卵巢癌细胞8910加入细胞膜远红外荧光染色试剂盒(DiD-APC)进行染色，37℃，避光20min，再用PBS清洗两遍，最后将染色后的8910细胞与巨噬细胞按照1:5的比例，接种到六孔板中，同时分别加入多肽，与巨噬细胞共培养72h。第五天，胰酶消化收集共培养的细胞，PBS 4℃，500g离心5min清洗两遍，利用FITC-CD14染色后，进行流式细胞仪分析。结果如图2所示，由图可见与不加多肽的对照相比，本发明多肽能够促进巨噬细胞对卵巢癌细胞的吞噬作用。

实施例4多肽显著促进巨噬细胞的对乳腺癌细胞的吞噬作用

将单核细胞THP-1，乳腺癌细胞MCF-7按照标准条件(1640培养基，37℃，5％CO2)培养。第一天，将THP-1细胞接种在六孔板中，加入PMA(100ng/ml)24h，诱导成M0型巨噬细胞；第二天，乳腺癌细胞MCF-7加入细胞膜远红外荧光染色试剂盒(DiD-APC)进行染色，37℃，避光20min，再用PBS清洗两遍，最后将染色后的MCF-7与巨噬细胞按照1:5的比例，接种到六孔板中，同时分别加入多肽，与巨噬细胞共培养72h。第五天，胰酶消化收集共培养的细胞，PBS4℃，500g离心5min清洗两遍，利用FITC-CD14染色后，进行流式细胞仪分析。结果如图3所示，由图可见与不加多肽的对照相比，本发明多肽能够促进巨噬细胞对乳腺癌细胞的吞噬作用。

实施例5噬菌体多肽促进人巨噬细胞产生炎症性细胞因子

为了确定噬菌体多肽是否调控人巨噬产生炎性细胞因子，取卵巢癌、乳腺癌患者的新鲜血液，用Ficoll/Hypaque离心法分离得到外周血单个核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cell，PBMC)。用不含FBS的RPMI1640培养基，在37℃、5％的CO₂条件下培养3小时，弃掉未粘附的细胞。将所得细胞，更换为含10％FBS和50ng/ml人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的新鲜RPMI1640培养基继续培养，每3天更换一次培养液，在第7天，即为巨噬细胞。诱导完成后，再用多肽处理48小时后，分别收集培养上清液和细胞。通过实时定量聚合酶链反应(Real-Time Quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)方法检测TNFα和IL-6mRNA的表达情况。结果如图4和图5所示，由图可见与未处理组相比，多肽处理后，可以显著促进TNFα和IL-6的表达水平。这些数据表明噬菌体筛选获得的多肽在促进炎性细胞因子产生中起重要作用。

实施例6噬菌体多肽促进CD3抗体活化T细胞产生TNF-α和IFN-γ

为了确定噬菌体多肽是否调控人T细胞的功能，取卵巢癌、乳腺癌患者的新鲜血液，利用Ficoll/Hypaque离心法，从外周血中分离外周血单个核细胞PBMC，将PBMC与抗CD3抗体(OKT3)和不同浓度的多肽共培养。四天后，分别收集培养上清液和细胞。通过ELISA方法检测IFN-γ和TNF-α分泌情况。结果如图6和图7所示，由图可见与CD3对照相比，5条多肽处理组，均可以显著促进活化的PBMC产生IFN-γ和TNF-α。因此，筛选获得的5条噬菌体可以体外促进PBMC的活化(抗CD3抗体诱导条件下)。

序列表

<110> 南京市第一医院

<120> 靶向siglec-10蛋白的多肽及免疫调控应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Leu Leu Ala Val Gly Arg Ser Leu Lys Gln Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Phe Val Lys Thr Pro Ala Arg Trp Ala Trp Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ser His Met His Arg His Pro Lys Thr Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Trp Gly Tyr Pro His Ser Trp Leu Trp Ala Arg Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ser His His Tyr Pro His Arg Gly Leu His Lys

1 5 10

Claims (5)

1.靶向siglec-10的多肽，选自以下任意一条多肽：

多肽pep-MSH： SEQ ID No.5；

多肽pep-YLL： SEQ ID No.1；

多肽pep-MGS： SEQ ID No.3；

多肽pep-WGY： SEQ ID No.4。

2.权利要求1所述的靶向siglec-10的多肽在制备封闭巨噬细胞siglec-10功能的药物中的应用。

3.权利要求1所述的靶向siglec-10的多肽在制备封闭T淋巴细胞siglec-10功能的药物中的应用。

4.权利要求1所述的靶向siglec-10的多肽在制备人巨噬细胞免疫活化药物中的应用。

5.权利要求1所述的靶向siglec-10的多肽在制备乳腺癌、卵巢癌免疫治疗药物中的应用。

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