KR20230079259A - Kras 돌연변이 특이적 t세포 수용체의 스크리닝 및 항종양 용도 - Google Patents

Kras 돌연변이 특이적 t세포 수용체의 스크리닝 및 항종양 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 KRAS 유전자의 G12V 또는 G12C 돌연변이의 에피토프를 표적하는 두 가지 특이적 T세포 수용체 및 항종양 용도를 제공하고, 이 두 가지 T세포 수용체는 각각 α、β 두 개의 펩타이드 사슬로 구성되어 있다. 본원은 또한 T세포 수용체의 항원 결합 단편, T세포 수용체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 그리고 KRAS의 G12V 돌연변이 특이적 T세포 수용체 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 이 특이적 T세포 수용체 및 그의 항원 결합 단편은 면역 효과 활성제로 사용되어 유기체의 면역 반응을 자극해 항종양 등 질병의 작용 효과를 생성할 수 있다.

Description

KRAS 돌연변이 특이적 T세포 수용체의 스크리닝 및 항종양 용도
본원은 의약분야에 속하고, 구체적으로 종양 KRAS 유전자인 G12V와 G12C 돌연변이의 항원 폴리펩타이드를 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
2011년, 암은 심장병을 제치고 전 세계의 주요 사망원인이 되었다. WHO는 2013년 12월에, 전 세계적으로 매년 신규 암 환자수가 1400만명을 넘어섰다고 발표하였는데, 이는 2008년의 1270만명에 비해 크게 증가한 수치이다. 2020년 현재, 암은 매년 960만명의 사망자를 내고 있으며, 전 세계적으로 매년 약 1조 달러가 암 진단과 치료에 투입되고 있다.
1980년대 초, Allison과 다른 연구자들은 T세포 표면에서 항원 인식을 담당하는 αβ T세포 수용체(TCR)의 유전자 구조를 확정하였다. 1980년대 후반에, Boone, Rosenberg, Old 등은 다양한 종양 환자에서 종양 특이적 항원이 존재한다는 것을 발견하였는데, 이는 T세포에 의해 인식되고 특이적으로 종양 세포를 살상할 수 있다는 것을 발견하여, 종양 면역 치료의 희망을 다시 불러일으켰다. 많은 연구들이 종양 치료용 백신의 연구와 개발에 주력하고 있다. 2013년에, 면역항암요법은 Science 잡지에서 선정된 올해의 10대 과학기술 혁신으로 선정되었다.
최근 몇 년 동안, 줄기세포 생물학, 면역학, 분자 기술, 조직공학 기술 등의 급속한 발전에 따라서, 세포 면역 치료는 안전하고 효과적인 치료 수단으로서, 종양 등의 치료에서의 역할이 점점 더 두드러지고 있다. 현재 새로운 세포치료 기술의 연구와 개발은 종양과 다른 관련 질병을 해결하는 중요한 연구 분야가 되었다.
입양T세포요법(Adoptive cell therapy·ACT)은 고도의 맞춤형 암 치료법으로서, 암 환자의 결여되어있거나 약한 면역체계를 재건하여, 항종양 효과를 나타낸다. ACT 요법은 종양 환자의 체내에서 면역활성세포를 분리해, 체외에서 증폭과 기능 확인을 거친 후, 환자에게 재주입하여, 종양을 직접 사멸시키거나 체내의 면역반응을 자극해 종양세포를 사멸하는 목적을 달성하는 것을 가리킨다. ACT 요법의 제한 요소는 암 조직에서만 발현되고 정상적인 필수 조직에서는 발현되지 않는 항원을 찾는 것이다.
현재 ACT 요법에는 T세포 수용체 공정화 세포(TCR-T) 치료 기술과 키메라(chimeric) 항원 수용체 공정화 T세포(CAR-T) 치료 기술이 포함될 수 있다. 이러한 방법을 통하여, ACT는 흑색종, 자궁경부암, 림프종, 백혈병, 담관암, 신경모세포종 등 다양한 암에 대해 효과적인 것으로 나타났다.
현재 CAR-T는 급성/만성 과립구성 백혈병, 림프종 및 기타 질병의 치료에서도 중대한 돌파구를 찾아내 환자의 생존율 및 삶의 질을 크게 향상시켰다. 하지만, 고형종양 치료 연구에 있어서, 제한된 특이적 표적으로 인해 CAR-T세포의 치료 전망은 아직 불투명하다.
CAR-T세포가 세포외 항원을 표적으로 하기 위해 항체를 이용하는 것과 달리 TCR은 모든 T세포 표면의 특징적인 표지로 CD3과 비공유결합으로 결합해 TCR-CD3 복합체를 형성한다. α、β 두개의 펩타이드 사슬로 구성된 TCR은 면역글로불린 슈퍼 패밀리에 속하며, 항원 특이성은 V영역 (CDR1, CDR2, CDR3)에 존재하고, CDR3은 TCR의 항원 결합 특이성을 직접 결정한다. 말초혈액 내 T세포의 90~95%가 TCR을 발현한다. 유전자 변형을 거친 TCR을 가지는 T세포는 종양세포 표면의 항원 분자를 특이적으로 인식하여 종양세포에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다.
TCR-T세포 면역 치료는 최근 몇 년 동안에 발전한 세포 치료 신기술로 전형적인 “정밀 의료” 치료기술이다. 현재 이 기술은 골수종, 흑색종, 식도암, 간암 등의 치료에서 긍정적인 치료 전망을 보이고 있다. TCR-T세포 면역 치료는 20세기 말에 HIV 치료에 처음 적용되었다. 최근에는, 연구를 통하여 MART-1, MAGE-A4, NY-ESO-1, WT-1 등 종양 항원 특이적 TCR을 기반으로 공정화된 자가면역 세포가 흑색종, 식도암, 다발성 골수종, 활막세포 육종 등의 치료에서 양호한 개발 전망을 보이고 있다는 것을 발견하였다.
특히 2015년 보도에 의하면, 다발성 골수종 임상I/II기 환자 20명이 NY-ESO-1 특이적 TCR 공정화 세포의 면역치료를 받았고, 이 중 80%가 TCR-T 치료 후 긍정적인 임상 치료 효과를 보였다. 현재 TCR-T세포 면역치료 기술은 국제 종양 및 전염병에 대한 국제적인 치료 연구에서 핫스팟 분야가 되었으며, 일부 기술과 제품은 이미 임상 전 또는 임상 연구 단계에 진입하였다.
KRAS 유전자(Kirsten 래트 육종 바이러스 암 유전자 동족체, Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog)가 코딩한 단백질은 RAS 슈퍼 단백질 패밀리에 속하고 세포 내 신호 전달에 관여하는 작은 GTP 가수분해효소(small GTPase)이다. KRAS 단백질은 188개 아미노산을 가지고 있고, 분자량은 21.6 KD이며, GTPase 활성을 가진 구아닌뉴클레오티드 결합 단백질이다. 세포 내에서 KRAS 단백질은 비활성화와 활성화 상태 사이에서 전환되는데, KRAS가 구아닌뉴클레오티드 이인산 (GDP) 과 결합할 시 비활성화 상태에 처하고, 구아닌뉴클레오티드 삼인산 (GTP) 과 결합할 시 활성화 상태에 처하며 MAPK 신호 통로, PI3K 신호 통로, Ral-GEFs 신호 통로를 포함한 하류 신호 통로를 활성화 시킬 수 있다. 이러한 신호 통로는 세포의 생존, 증식 및 세포 인자 방출을 촉진하는데 있어서 중요한 역할을 한다.
인류 암에서, KRAS는 종양학 분야에서 가장 유명한 발암 유전자 중 하나로 “약물로 치료할 수 없는” 표적으로 여겨졌다. KRAS 유전자 돌연변이는 췌장암의 90% 가까이, 결장암의 30~40%, 자궁내막암의 17%, 폐암(소엽성 폐암을 포함)의 15~20% 및 담관암, 자궁경부암, 방광암 등에서 발생한다. KRAS의 유전자 돌연변이는 전체 RAS 유전자 돌연변이의 86%를 차지한다. KRAS의 유전자 돌연변이 중 97%는 제12번 또는 제13번 아미노산 잔기에서 돌연변이가 발생하였다. 그중 가장 주요한 것은 제12번 아미노산이 아스파르트산(G12D), 제12번 아미노산이 발린(G12V), 제12번 아미노산이 시스테인(G12C), 제13번 아미노산이 아스파르트산(G13D)으로 변하는 이 몇 가지 돌연변이이다.
구조 연구에 따르면, 이러한 유전자 돌연변이는 대부분 KRAS가 GTP를 가수분해하는 능력을 방해한다. KRAS의 G12D, G12V, G13D 돌연변이는 GAP 활성을 파괴하고 KRAS를 GTP와 계속 결합시켜 KRAS가 타이로신 키나제에 의해 활성화 상태에 고정되도록 하고 하류 신호 통로(예를 들어 PI3K, RAF-MEK-ERK (MAPK), RAL-GEF 등)를 지속적으로 활성화시킨다. 이러한 하류의 신호통로가 열리면, 세포의 증식, 이동을 자극하여 최종적으로 종양의 발생을 촉진하게 된다.
최근에, KRAS 돌연변이체에 대한 공유결합 억제제가 연구 개발되었는데, 이는 알로스테릭 사이트를 통해 KRAS 돌연변이체를 표적함으로써 KRAS 돌연변이체와 GTP의 친화력을 낮추어 그 활성을 “로킹(locking)”하는 목적을 달성하였다. Amgen의 KRAS-G12C 억제제인 AMG510를 그 예로 들 수 있다. MiratiTherapeutics의 KRAS-G12C 억제제 MRTX1257은 여전히 전임상 개발 단계에 있다. 현재 다른 KRAS 돌연변이에 대한 관련 치료제는 아직 없으며, 체내의 면역 메커니즘을 이용한 종양 검출 및 치료를 위한 약제도 부족하다.
인류 암중에서, KRAS 유전자 돌연변이는 췌장암의 90% 가까이, 결장암의 30~40%, 자궁내막암의 17%, 폐암의 15~20%에서 발생한다. KRAS의 유전자 돌연변이 중 97%는 제12번 또는 제13번 아미노산 잔기에서 돌연변이가 발생하였다. 그중 가장 주요한 것은 G12D, G12V, G12C, G13D 이 몇 가지 돌연변이이다. KRAS 돌연변이는 세포의 MHC 분자에 의해 세포 표면으로 제시(presenting)되고 T세포에 의해 인식되어 T세포의 면역 반응을 자극하고, 나아가 KRAS 돌연변이를 가진 종양세포를 제거할 수 있다.
구체적으로 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드는 항원으로 사용될 시, 신체에서 CD8+ CTL(cytotoxic lymphocyte, 세포독성 T 림프구) 반응을 일으킬 수 있다. KRAS 폴리펩타이드중의 일부 아미노산 잔기에서 발생하는 돌연변이는 HLA 분자에 의해 제시되고 T 세포에 의해 인식될 수 있다.
본원의 일 실시양태는 특이적 T세포 수용체(TCR) 단세포 스크리닝 기술을 통하여, 종양 KRAS 유전자의 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 돌연변이(이하, G12V, G12V 돌연변이, 또는 KRAS 유전자의 G12V 돌연변이로 약칭함), KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이(이하, G12C，G12C 돌연변이, 또는 KRAS 유전자의 G12C 돌연변이로 약칭함)를 특이적으로 표적하는 두 가지 TCR을 스크리닝하는 것을 포함한다.
본원의 일 실시양태는 KRAS 유전자의 G12V 또는 G12C 돌연변이의 에피토프를 표적하는 특이적 T세포 수용체와 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것을 포함한다. 본원의 또 다른 실시방식은 KRAS 유전자의 G12V와 G12C 돌연변이를 가진 종양 치료용 약제에 있어서의 상기 T세포 수용체와 그의 항원 결합 단편의 용도를 포함한다.
본원은 상기 원리에 근거하여 이루어진 것으로, 본원에서 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 KRAS의 G12V 돌연변이 폴리펩타이드(VVGAVGVGK) 및 HLA-A11의 복합체 분자 및/또는 KRAS의 G12C 돌연변이 폴리펩타이드(VVGACGVGK) 및 HLA-A11의 복합체 분자, 또는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 에피토프 및 HLA-A03 복합체 분자에 특이적으로 결합하여, T 세포 활성화를 자극하고, T세포가 IFN-γ등 사이토카인을 분비하도록 유도하고, 그 다음 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드를 발현하는 종양세포(특히 KRAS 유전자의 G12V 및/또는 G12C 돌연변이 양성의 종양세포)를 사멸시킨다.
본원에서, “KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 TCR” 또는 “쥐 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 TCR”이라는 용어는 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 중 HLA-A11 제한적 CTL 에피토프 폴리펩타이드(그 서열은 VVGAVGVGK 및/또는 VVGACGVGK)를 표적으로 하는 쥐 TCR이며, 본원의 구체적인 실시방식에서, 1-2C TCR 또는 1-2C, 3-2E TCR 또는 3-2E로 칭한다.
본 출원은 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드의 제12번 아미노산 돌연변이에서 유래된 VVGAVGVGK 및/또는 VVGACGVGK 폴리펩타이드와 HLA-A11의 복합체 분자와 특이적으로 결합된 TCR 또는 유도체를 포함하고, 기존 TCR과 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 항원 특이적 TCR 단편도 포함한다. “TCR의 단편” 또는 “항원 결합 단편”은 TCR의 항원 결합 단편과 TCR 유사체를 가리키며, 일반적으로　모체 TCR의 항원 결합 영역 또는 가변 영역의 최소 일부분, 예를 들면 하나 이상의 CDR을 포함한다. TCR의 단편은 모체 TCR의 최소한의 일부 결합 특이성을 유지한다.
리간드/수용체, 항체/항원 또는 기타 결합 쌍을 언급할 시, “특이적” 결합은 단백질 및/또는 기타 생물학적 작용제의 이질그룹에서 상기 단백질(예를 들면, VVGAVGVGK 및/또는 VVGACGVGK 폴리펩타이드)과 HLA-A11 복합체 분자의 결합 반응 존재 여부를 확인하는 것을 가리킨다. 따라서, 지정된 조건하에서 특정의 리간드/항원은 특정의 수용체/항체와 결합하고, 샘플중에 존재하는 다른 단백질과 현저한 양으로 결합하지 않는다.
본원은 본원의 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 TCR 중의 한 가지 또는 두 가지, 또는 그의 항원 결합 단편을 함유하는 약학적 조성물도 제공한다. 약학적 조성물을 제조하기 위해서는 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합하여 각종 필요한 제형으로 제조할 수 있다. 본원의 약학적 조성물의 제형의 종류로서, 예를 들면 경구용 제제로 사용할 수 있는 정제, 분말제, 알약, 가루약, 과립제, 세립제, 연질/경질 캡슐제, 박막코팅제, 펠렛, 설하정, 고약 등, 비경구용 제제로 사용할 수 있는 주사제, 좌약, 경피제, 연고제, 경고제, 외용액 등을 열거할 수 있다. 당업자는 약물투여 경로와 약물투여 대상 등에 따라 적절한 제형을 선택할 수 있다.
본원의 약학적 조성물의 유효성분의 투여량은 약물투여 대상, 대상 장기, 증상, 약물투여 방법 등에 따라 차이가 존재하고, 제형의 종류, 약물투여 방법, 환자의 나이와 체중, 환자의 증상 등을 고려하여 의사의 판단에 따라 확정할 수 있다.
본원의 약학적 조성물은 또한 세포독성제, 세포성장 억제제, 항혈관형성 약물 또는 항대사 약물, 종양표적 약물, 면역자극제 또는 면역조절제, 또는 세포독성제, 세포성장 억제제 또는 기타 독성약물과 결합한 TCR을 포함하되 이에 국한되지 않는 기타 약제를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본원은 다음과 같은 실시양태을 제공한다.
1. KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 에피토프 및 HLA-A11의 복합체, 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 에피토프 및 HLA-A11의 복합체, 또는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 에피토프 및 HLA-A03의 복합체와 결합할 수 있고,
α사슬 가변 영역 및 β사슬 가변 영역을 포함하는 T세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
상기 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 아래의 α사슬 상보성 결정 영역(CDR) 및 β사슬 상보성 결정 영역(CDR):
서열번호 3으로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR1;
서열번호 4로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR2;
서열번호 5로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR3;
서열번호 8로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR1;
서열번호 9로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR2; 및
서열번호 10으로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR3;
또는
서열번호 13으로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR1;
서열번호 14로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR2;
서열번호 15로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR3;
서열번호 18로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR1;
서열번호 19로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR2;및
서열번호 20으로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR3;
을 포함하는, T세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 1번 항목에 있어서,
서열번호 2로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및
서열번호 7로 표시되는 β사슬 가변 영역;
또는
서열번호 12로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및
서열번호 17로 표시되는 β사슬 가변 영역;
을 포함하는, T세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 1번 또는 2번 항목에 있어서,
상기 TCR은 쥐 TCR, 인간-쥐 키메라 TCR 또는 인간화 TCR인, TCR 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목의 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하고, 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 11, 및 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열인, 폴리뉴클레오티드.
5. 4번 항목의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인, 발현 벡터.
6. 5번 항목의 발현 벡터를 포함하는, 숙주세포.
7. 1) 6번 항목의 숙주세포를 배양하는 단계;
2) 상기 숙주세포 또는 그의 배양배지로부터 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목의 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계;
를 포함하는, 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목의 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
8. 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
9. T세포에 의해 분비되는 IFN-γ 사이토카인 수준을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도로서,
상기 약제는, 예를 들면 단백질 약제, ADC약제 또는 TCR 및 항원의 조합을 포함하는 약제인, TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
10. KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이를 발현하는 종양 세포의 검출용 시약의 제조에 있어서의, 또는 종양의 검출 또는 진단용 시약의 제조에 있어서의, 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도로서,
바람직하게는, 상기 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11과 특이적으로 결합하거나, 또는
상기 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 HLA-A11 또는 HLA-A03과 유사한 항원 결합 특성을 갖는 HLA 분자에 특이적으로 결합하거나, 또는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하고,
상기 HLA 분자는 바람직하게는 HLA-A31, HLA-A33, HLA-A68, HLA-A30인, TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
11. KRAS 유전자에 G12V 및 G12C 돌연변이를 갖는 종양 환자를 치료하기 위한 항종양 약제의 제조에 있어서의, 1번 내지 3번 항목 중 어느 한 항목에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도로서,
상기 종양은 예를 들면 췌장암, 대장암, 또는 폐암이고,
예를 들면 비소세포폐암이며,
바람직하게는, 상기 KRAS 유전자의 G12V 또는 G12C 돌연변이는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 돌연변이 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이인 용도.
본원의 KRAS 유전자의 G12V 또는 G12C 돌연변이 특이적 TCR을 이용하여 상기 TCR을 발현하는 T림프구(TCR-T)를 제조함으로써, KRAS 유전자의 G12V 또는 G12C 돌연변이의 양성종양세포를 효과적으로 인식하고 사멸시킬 수 있으며, 나아가 종양 특히 고형종양의 성장을 더욱 억제하여 종양치료의 효과를 기대할 수 있다.
본원의 KRAS 유전자의 G12V 또는 G12C 돌연변이의 에피토프를 표적하는 두 가지 특이적 T세포 수용체 및 이를 발현하는 T세포는 감염 효율이 높고 결합 특성이 높은 특성을 가지고 있기에, 이를 이용하여 약물 전단계 연구를 진행할 수 있고, 시험모델 등에서 종양의 성장 및 진행과 관련된 돌연변이를 표적하는 약물을 개발할 수 있다. 따라서, KRAS 유전자 돌연변이를 발현하는 각종 종양을 다양한 시기에 진단, 치료하는 약제의 제조, 특히 돌연변이 빈도가 비교적 높은 고형종양을 치료하는 약제의 제조에 사용할 수 있다.
도1. KRAS의 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드와 HLA-A11 복합체 단백질의 분자체 크로마토그래피 및 비오틴화수준 검출 결과.
도2. KRAS-G12V/HLA-A11 4중합체 특이적 T세포 단세포 분리(sorting). 도A는 KRAS-G12V 폴리펩타이드로 면역된 마우스의 비장세포 중 특이적 T세포의 ELISPOT 검출도를 나타낸다. 여기서, mock는 자극물을 넣지 않은 음성 대조이고, KRAS-G12V8-16은 폴리펩타이드 자극 검출 웰이고, 포르볼에스테르(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)는 양성 대조이며, T1-T6, TF1-TF6는 마우스 번호이다. 도B는 폴리펩타이드로 면역된 마우스의 비장 세포 중 에피토프 특이적 T 세포를 분리한 것을 나타내며, WT는 비면역 마우스의 음성 대조이고, 가로 좌표는 KRAS-G12V8-16 /HLA-A11 4중합체 염색을 나타내고, 세로 좌표는 CD8 양성 염색을 나타내며, KRAS-G12V8-16 /HLA-A11 4중합체 양성 세포는 도에서 네모난 부분으로 둘러싸인 부분이다.
도3. 3-2E 및 1-2C TCR의 KRAS-G12V8-16/HLA-A11과의 특이적 결합의 검증. A는 3-2E 또는 1-2C TCR를 293T세포에 일시적으로 형질주입시킨 후, KRAS-G12V8-16/HLA-A11 4중합체와 특이적으로 결합한 것에 대한 유세포분석(flow cytometry) 결과를 나타낸다. B는 1-2C 또는 3-2E TCR를 293T세포에 일시적으로 형질주입시킨 후, KRAS-G12V7-16/HLA-A11 4중합체와 특이적으로 결합한 것에 대한 유세포분석(flow cytometry) 결과를 나타낸다.
도4. 1-2C 및 3-2E TCR과 KRAS-G12V8-16/HLA-A3의 교차 인식. 도A는 KRAS-G12V8-16/HLA-A11과 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포 4중합체의 염색 분석의 유세포분석(flow cytometry) 결과를 나타낸다. 도B는 KRAS-G12V8-16/HLA-A03과 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포 4중합체의 염색 분석의 유세포분석(flow cytometry) 결과를 나타낸다.
도5. 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포의 감염 효율 검출. 제1행 (가로) 은 TCR 렌티바이러스에 감염되지 않은 D1과 D2 두 명의 지원자 PBMC의 4중합체 검출을 나타내고, 음성 대조로 사용되며; 제2행(가로)과 제3행(가로)은 각각 D1(제2행(가로)) 또는 D2(3행(가로)) 지원자의 PBMC 또는 CD8 T세포로 제조된 TCR-T세포이고, 유세포분석(flow cytometry) 염색은 KRAS-G12V8-16/HLA-A11 4중합체를 이용하여 수행되었고, 사분면의 수치는 TCR의 발현 양성률을 나타낸다.
도6. 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포와 KRAS의 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드의 반응. 도A와 도B는 PBMC 세포를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T 세포의 KRAS-G12 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 반응의 ELISPOT 이미지와 히스토그램을 나타내며, D1 또는 D2는 지원자의 번호이다. 도C는 KRAS-G12 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드로 배양한 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포가 생성한 IFN-γ 수준의 ELISA 차트를 나타낸다. 배지에서 인큐베이션한 TCR-T세포는 음성대조(mock)이고, PMA 자극은 양성대조이다. 도D, E 및 F는 각각 1-2C 또는 3-2E　TCR-T세포의 KRAS-G12 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 ELISPOT 이미지, 도D에서는 결과의 히스토그램, 그리고 이들 세포의 IFN-γ 수준에 대한 ELISA 프로파일을 나타낸다.
도7. 1-2C 및 3-2E 두 가지 TCR 단백질의 체외 복원(renaturation) 및 정제 결과. 도A와 도B는 각각 1-2C TCR 분자가 이온 칼럼과 분자체 크로마토그래피를 거친 후의 정제 결과를 나타낸다. 도C와 도D는 각각 3-2E TCR 분자가 이온 칼럼과 분자체 크로마토그래피를 거친 후의 정제 결과를 나타낸다. 작은 이미지는 별표로 표시된 피크 단백질의 SDS-PAGE 결과이다.
도8. 1-2C 또는 3-2E TCR이 KRAS-G12의 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드 및 HLA-A11복합체 단백질에 결합하는 특성. 도A-D는 1-2C TCR의 KRAS-G12 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드와 HLA-A11 복합체 단백질에 대한 친화력 검출을 나타낸다. 도E-H는 3-2E TCR의 KRAS-G12 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드와 HLA-A11 복합체 단백질에 대한 친화력 검출을 나타낸다.
도9. NCG 면역결핍 마우스 종양 모델에서 1-2C TCR-T세포의 종양 억제 효과 평가. 도A는 마우스의 종양 억제 실험의 흐름도를 나타낸다. PANC-1 종양세포를 0일(D0)째에 접종하고, 7일째 TCR-T세포를 종양내에 투여한 후, 3~4일마다 측정 관찰하였다. 도B는 실험이 끝날 때 분리된 종양의 중량을 서로 다른 치료 그룹간에 비교한 것을 나타낸다. 도C는 서로 다른 치료 그룹의간의 종양 부피를 비교한 것을 나타내며, 각 점은 해당 시점의 각 그룹의 마우스 종양 부피의 평균치 ± 표준 편차를 나타낸다. 도D-G는 각 그룹 내 단일 마우스의 종양 부피를 나타낸다. 그룹 간 통계적 차이는 T-검정에 의해 계산되며, 여기서 **:p < 0.01, ***:p < 0.001; ns, p > 0.05이다.
본원은 구체적인 실시방식과 도면을 통해 본원의 기술방안을 설명하지만, 당업자라면 이하 구체적인 실시방식과 실시예는 본원을 설명하기 위한 것이지 어떠한 방식으로도 본원을 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다는 것을 이해할 수 있다. 당업자는 본원의 취지에서 벗어나지 않고 본원에 대해 많은 보정을 할 수 있으며, 이러한 보정도 본원의 범위에 속한다.
아래의 실험방법은 별도의 설명이 없는 한 본 분야의 일반적인 실험방법이다. 사용된 실험 재료는 별도의 설명이 없는 한 모두 상업 회사에서 쉽게 얻을 수 있는 실험 재료에 속한다.
실시예1.KRAS-G12 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 T세포 분리와 TCR 유전자 클로닝
본 실시예는 우선 KRAS-G12 돌연변이를 가지고 있다고 예측한 HLA-A11 제한적 에피토프 폴리펩타이드를 합성하고, 이러한 폴리펩타이드를 이용해 마우스를 면역시킨 후, ELISPOT 실험을 통해 T세포 반응 스크리닝을 진행하여 면역원성을 가진 돌연변이 폴리펩타이드를 선별하였다. 동시에, 이러한 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드와 HLA-A11의 4중합체를 제조하였다. CD3, CD8 항체를 함께 염색하여, 면역 후 마우스의 비장세포에서 CD3+CD8+T 세포를 선별한 후 분리하여, 그중의 KRAS-G12 돌연변이 폴리펩타이드 특이적 T 세포를 얻었다.
1. KRAS-G12 돌연변이 폴리펩타이드의 HLA 제한적 에피토프 예측
NetMHC-4.0 온라인 예측 시스템을 통하여 KRAS-G12 돌연변이가 발생한 폴리펩타이드에 대하여 HLA-A11 제한적 T세포 에피토프 폴리펩타이드 예측을 진행하였다. 그 결과 KRAS-G12V 에피토프는 HLA-A11과 강한 친화력을 가진 것으로 나타났다.
Sclight Biotechnology LLC에서 KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드8-16(서열번호 34로 표시되는 서열), G12V8-16(서열번호 35로 표시되는 서열), G12D8-16(서열번호 36으로 표시되는 서열), G12C8-16(서열번호 37로 표시되는 서열) 돌연변이 폴리펩타이드, KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드7-16(서열번호 38로 표시되는 서열), G12V7-16(서열번호 39로 표시되는 서열)、G12D7-16(서열번호 40으로 표시되는 서열)、G12C7-16(서열번호 41로 표시되는 서열)을 합성하였다.
2. KRAS-G12V/HLA-A11 4중합체의 제조
이러한 폴리펩타이드와 HLA-A11의 결합 특성 및 특이적 T세포 반응, 그리고 특이적 TCR에 대하여 평가 및 선별을 진행하였다.
통상적인 방법에 따라 β2m(β2-마이크로 글로불린, HLA-A11의 경쇄 유전자) (Uniprot: P61769) 및 HLA-A11 중쇄 유전자 (IMGT/HLA Acc No: HLA00043)에 대하여 원핵 코돈 최적화를 진행하였다. 그 결과 얻은 β2m 핵산 서열은 서열번호 48로 표시되고, 그가 코딩한 아미노산 서열은 서열번호 47로 표시되며, HLA-A11 중쇄 유전자는 서열번호 44로 표시되고, 그가 코딩한 아미노산 서열은 서열번호 43으로 표시된다. HLA-A11 중쇄 유전자의 경우, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 유전자의 C-말단에 비오틴 특이적 결합 폴리펩타이드를 발현하는 서열(Biotin-tag, 아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시됨)이 추가되었다.
상기 DNA 서열들은 Nanjing GenScript에서 합성되었고, 그 안에 제한효소 인식부위 Nde I와 Xho I가 각각 도입되었는데, 여기서 Nde I 제한효소 인식부위는 서열의 5’ 말단에 위치하고, 제한효소 인식부위 Xho I는 서열의 3’ 말단에 위치한다. 제한효소 인식부위 Nde I와 Xho I를 이용하여, 합성한 β2m와 HLA-A11 중쇄 유전자의 DNA 서열을 각각 발현 벡터 pET-21a(Invitrogen)에 클로닝하여 β2m 및 HLA-A11 중쇄 단백질의 원핵 재조합 발현 플라스미드 β2m-pET 21a 및 HLA-A11-pET 21a를 만들었다.
두 가지 발현 플라스미드를 열자극을 통하여 각각 E. coli. BL21(DE3) 컴피턴트 세포(TIANDZ Biotech로 부터 구입함)에 형질전환시키고, IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 대장균을 파쇄하고 균질화해서 내포체를 추출하여 내포체 상태의 β2m 및 HLA-A11 중쇄의 내포체 단백질을 얻었다.
1ml의 β2m 내포체(30mg/ml를 6M Gua-HCl, 50mM Tris pH8.0, 100mM NaCl, 10mM EDTA 및 10mM DTT에 용해)를 상기 제조된 KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드8-16, G12V8-16, G12D8-16, G12C8-16 돌연변이 폴리펩타이드, KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드7-16, G12V7-16, G12D7-16, G12C7-16 폴리펩타이드(Sclight Biotechnology LLC에서 합성)를 5mg씩 함유한 1L 복원액 (20mM Tris-HCL, 400mM L-아르기닌, EDTA 2mM, GSH/GSSG 5mM/1mM)에 천천히 넣고 1시간 후, β2m:HLA-A11 중쇄= 1:1의 몰비로 HLA-A11의 중쇄 내포체를 상기 복원액에 천천히 적가하여 8시간 이상 복원시킨다.
초미세여과기를 사용하여 복원된 샘플을 10kDa 여과막을 통해 농축했고, 농축을 통해 용액을 20mM Tris-Cl, 50mM NaCl, pH8.0의 완충액으로 교환하였다. 용액 교환은 두 번 실시하였다: 1) 샘플을 약 20ml로 농축한 후, 20mM Tris-Cl, 50mM NaCl을 함유한 pH8.0인 완충액 200ml에 첨가하였다. 2) 이후 샘플을 약 20ml로 농축한 후, 다시 20mM Tris-Cl, 50mM NaCl, pH8.0의 완충액에 100ml이 될때까지 첨가하고, 최종적으로 약 10-20ml 부피로 농축하였다. 샘플을 꺼낸 후, 4℃에서 12000rpm로 10min 동안 원심분리하고, 상청액을 초미세여과 튜브에 옮겨 약 0.5-1ml로 농축하고, superdex200 분자체(GE Healthcare에서 구입함)를 거쳐 KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 복합체를 정제하였다. 280nm의 흡광도에서 KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드//HLA-A11 복합체 단백질 피크(피크 값은 약 15.8mL임)를 수집하였다.
분자체를 거쳐 정제된 KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드//HLA-A11 복합체 단백질 샘플을 초미세여과 농축튜브에 수집하여 약 500μL로 농축한 후, 4℃에서 원심분리하여 침전물을 제거하고 KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질 샘플을 얻었다.
(2) 비오틴화 반응
단계 (1)에서 얻은 KRAS-G12V/HLA-A11 복합체 단백질 샘플을 사용하여, 아래와 같은 비오틴화 반응 시스템(500μl)을 제조하였다.
바이오티닐레이션 반응 시스템(AVIDITY에서 구입함): 총 500μl
KRAS-G12 야생형 및 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질 샘플 1mg/ml 200μl,
버퍼 A(N-비스(히드록시에틸) 글리신 버퍼) 50μl,
버퍼 B (ATP, 비오틴) 50μl,
200μM 비오틴, Bir-A 효소(3mg/ml) 20μl,
20mM Tris-Cl, 50mM NaCl, pH 8.0 (500μl될 때까지 첨가함).
상술한 용액을 균일하게 혼합하여 얼음 위에 놓고 4°C의 냉동고에서 밤새 인큐베이션시켰다.
상기 바이오티닐레이션 반응 시스템 샘플을 Superdex200 분자체를 거쳐 비오틴화된 복합체를 정제하고 여분의 비오틴을 제거하였다. 상기와 동일한 작업을 수행하여 약 0.1-0.2mg의 비오틴화된 KRAS-G12 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질을 얻었고, KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드//HLA-A11 복합체 단백질 피크의 피크 값은 약 15.8mL (도1 참조)였다.
비오틴화 효율 검출:
상기 비오틴화된 KRAS-G12/HLA-A11 복합체를 약 500μl로 농축하고, SDS-PAGE shift 시험을 통해 바이오티닐레이션 효과를 검증하였다.
하나의 샘플과 두 개의 대조군을 설정하였다.
A． 비오틴화된된 KRAS-G12/HLA-A11 복합체 샘플 8μl+분자체 완충액 2μl;
B. 비오틴화된된 KRAS-G12/HLA-A11 복합체 샘플 8μl+스트렙타아비딘 2μl(20mg/ml);
C. 스트렙타아비딘 2μl+분자체 완충액 8μl.
상기 세 샘플을 30min 동안 얼음에서 인큐베이션한 후, SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 결과는 도1에 나타난 바와 같다.
결과는 비오틴화된 KRAS-G12/HLA-A11 복합체는 스트렙타아비딘과 결합하여 대분자를 형성할 수 있어 SDS-PAGE에서의 밴드가 뒤처진 것으로 나타났다. 각 그룹의 폴리펩타이드 바이오티닐레이션 전후 SDS-PAGE 밴드 그레이 스케일 비율(KRAS-G12/HLA-A11 복합체에 스트렙타아비딘을 첨가한 후의 밴드 그레이 스케일 / KRAS-G12/HLA-A11 복합체 원시 단백질 밴드 그레이 스케일)을 비교하여, 이러한 KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드가 효과적으로 바이오티닐레이션될 수 있음을 판단할 수 있었다(도1 참조).
(3) KRAS-G12 야생형 및 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11-PE 4중합체의 제조
비오틴화된 KRAS-G12 야생형 및 돌연변이 펩타이드/HLA-A11 복합체 분자를 초미세여과로 농축시키고, 스트렙타아비딘 PE:KRAS-G12 야생형 및 돌연변이 펩타이드/HLA-A11 복합체=1:5의 몰비로, 비오틴화된 KRAS-G12 야생형 또는 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 복합체 분자에 스트렙타아비딘 PE를 첨가하여 4중합체화(tetramerization)시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켜, 사용할 KRAS-G12 야생형8-16(VVGAGGVGK) 폴리펩타이드, G12V8-16(VVGAVGVGK), G12D8-16(VVGADGVGK), G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이 폴리펩타이드, KRAS-G12 야생형7-16(VVVGAGGVGK) 폴리펩타이드, G12V7-16(VVVGAVGVGK), G12D7-16(VVVGADGVGK), G12C7-16(VVVGACGVGK/HLA-A11-PE 4중합체를 얻었다.
3. KRAS-G12V 폴리펩타이드로 면역된 HLA-A11 트랜스제닉 마우스
본 단계에서는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 돌연변이 폴리펩타이드로 HLA-A11 트랜스제닉 마우스(Beijing Biocytogen에서 제조됨)를 면역화하여 마우스 체내에 KRAS-G12V8-16 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 특이적 T세포가 생성되도록 유도함으로써 KRAS-G12V8-16 돌연변이 펩타이드에 대한 특이적 TCR을 추가로 얻는다.
구체적으로, 화학적으로 합성된 KRAS-G12V8-16 돌연변이 폴리펩타이드(Sclight Biotechnology LLC) 100μg를 100μL PBS에 용해시키고, 동일한 부피의 프로인드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 혼합하여 유화시켰다. 유화된 폴리펩타이드와 프로인드 완전 보조제의 혼합액을 등쪽의 여러 군데에 피하주사하여 HLA-A11 트랜스제닉 마우스를 면역시켰다.
1차 면역으로 부터 1주일 후, 같은 방법으로 KRAS-G12V8-16 돌연변이 폴리펩타이드 100μg을 100μL PBS에 용해시키고, 동일한 부피의 프로인드 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant)와 혼합하여 유화시키고, 같은 방법으로 주사하여 면역 강화를 진행하였다. 1주일 후, 마우스를 처형하고 비장을 꺼내 갈아서 마우스의 비장세포를 얻었다.
4. KRAS-G12V 8-16 (VVGA V GVGK)/HLA-A11-PE 4중합체 특이적 T세포의 분리 및 단세포 TCR 유전자의 증폭 및 시퀀싱
PBS 세척을 거쳐 재현탁시키고, 1단계에서 KRAS-G12V8-16 돌연변이 폴리펩타이드 면역화로 얻은 마우스의 약 1×107개의 비장세포를 200~250g으로 10min 동안 원심분리하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 세 번 세척하고, 200~250g으로 10min 동안 원심분리하였다. KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE 4중합체(상기 단계 (3)의 4중합체 제조에서 획득함), PerCP-Cy5-CD8(BD에서 구입함), FITC-CD3 형광항체(BD에서 구입함)를 1:1:1의 몰비로 마우스 비장세포와 함께 25℃ 조건하에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 세포를 세번 세척하고, 200~250g으로 10min 동안 원심분리했으며, 0.5% BSA가 함유된 PBS를 사용하여 다시 재현탁시켰다.
그후, 상기 세포에 대하여 유세포분석기술(flow cytometry) 단세포 분리를 진행하였다. 림프구 아형 CD3+ CD8+ T세포를 선별하고, 분리하여 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE 4중합체 양성 CD8+ T세포를 얻었다(도2 참조, 네모난 부분에 4중합체 양성 세포와 그 비율을 나타 냄).
단일 양성세포를 세포분해액(Tiangen Bio에서 구입함)과 RNA효소 억제제(CW Bio에서 구입함)가 포함된 96-웰 플레이트에 분리하였다. 그후, 각 웰내의 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE 4중합체 양성 T세포에서 총 RNA를 추출하여 아래와 같이 5’ RACE TCR 유전자 증폭을 진행하였다.
5’ RACE는 세 단계로 수행되었다: 역전사(RT-PCR), 제1차 PCR 증폭, 제2차 PCR 증폭. Takara의 D315 -FullRACE Kit를 설명서에 따라 아래와 같이 사용하였다.
(1) RT-PCR: 사용된 하류(downstream) 프라이머는 TCR 유전자 불변 영역 특이적 프라이머 GSP1 (Takara에서 구입함)이고, 상류(upstream) 프라이머는 3’말단에 올리고구아닌 디옥시리보핵산 (Oligo-dG)을 가진 표적 스위칭 프라이머(Takara) 이다.
(2) 제1차 PCR: 상기 (1)에서 획득한 TCR의 cDNA를 템플릿으로 하고, 상류 프라이머는 외층 링커 프라이머1(5’ RACE outer Primer, Takara)이고, 하류 프라이머는 불변 영역 상류에 있는 TCR 불변 영역 부분에 대한 특이적 프라이머 GSP1(Takara에서 구입함)이며, TCR α사슬 또는 β사슬의 제1차 PCR산물을 얻었다.
(3) 제2차 PCR: 상기 (2)에서 얻은 TCR α사슬 또는 β사슬의 제1차 PCR산물을 템플릿으로 하고, 상류 프라이머는 내층 링커 프라이머2 (5’ RACE inner Primer, Takara)이고, 하류 프라이머는 불변 영역 상류에 있는 TCR 불변 영역 부분에 대한 특이적 프라이머 GSP2(Takara에서 구입함, D315-FullRACE Kit)이며, 각각 TCR α사슬 또는 β사슬의 제2차 PCR산물을 얻는다.
증폭 이후, TCR α사슬 및 β사슬 가변 영역 유전자를 포함하는 제2차 PCR 산물에 대하여 아가로스겔 전기영동을 수행하여, 500bp 위치에서 TCR α사슬 또는 β사슬 가변 영역에 대한 목적 유전자를 획득하였다. 목적 밴드를 회수하고, T4 리가제로 목적 유전자 단편을 T 벡터(pMD18T, Takara)에 연결하였다. 이후, 연결 산물로 DH5 α세포(Tiangen Biotechnology에서 구입함)를 형질전환시키고, 모노클론 유전자 시퀸싱(Ruiboxingke에 위탁)을 진행하였다.
상기 과정을 거쳐 획득한 KRAS-G12V8-16 특이적 T세포에 대해 단세포 TCR 유전자 증폭 시퀸싱을 진행하였다. 그 결과를 분석한 후, 그 중에서 고빈도로 나타난 α사슬 및 β사슬 조합을 새로운 TCR로 선별하였고, 1-2C 및 3-2E TCR이라고 명명하였으며, 이에 대해 결합 및 기능적 효과에 대해 검증을 진행하였다.
여기서, 1-2C TCR은 서열번호 2로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및 서열번호 7로 표시되는 β사슬 가변 영역을 가진다. 3-2E TCR은 서열번호 12로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및 서열번호 17로 표시되는 β사슬 가변 영역을 가진다.
실시예2. KRAS-G12V 8-16 (VVGAVGVGK)/HLA-A11 4중합체와 1-2C 및 3-2E TCR을 발현하는 세포의 결합 실험
본 실시예에서, 발명자는 선별된 1-2C 및 3-2E TCR이 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11를 특별히 인식하고 있다는 것을 추가로 확인하였다. 이외에도, 본 실시예에서, 1-2C 및 3-2E는 HLA-A11가 제시한 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)과 결합할 수 있는 것 외에, HLA-A03이 제시한 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)과도 결합할수 있다는 것을 발견하였다.
1. 1-2C 및 3-2E TCR 결합 특이성의 검증
우선, 1-2C 및 3-2E TCR의 α사슬 및 β사슬 가변 영역 (V영역) (1-2C의 핵산 서열은 서열번호 1로 표시되고, 아미노산 서열은 서열번호 6으로 표시됨; 3-2E의 핵산 서열은 서열번호 7로 표시되고, 아미노산 서열은 서열번호 11로 표시됨) 유전자를 인간 TCR의 α사슬 및 β사슬 불변 영역 (C영역) 유전자(Hongxun Biotechnology Co., Ltd.에서 합성)와 연결하여, 1-2C 및 3-2E 키메라 TCR α사슬 및 β사슬 서열을 얻었다. 키메라 서열의 구체적인 서열은 아래 표1에 표시된 바와 같다.
표1. 1-2C 및 3-2E 키메라 TCR α사슬 및 β사슬 서열
Figure pct00001
1-2C 및 3-2E TCR의 α사슬 및 β사슬을 T2A 서열(T2A 서열의 아미노산 서열은 서열번호 42로 표시됨)로 연결하고, 렌티바이러스 발현 플라스미드 pCDH(Invitrogen에서 구입함)를 출발 플라스미드로 사용하여, 각각 1-2C 및 3-2E TCR 렌티바이러스 발현 벡터, 즉, 렌티바이러스 발현 벡터 1-2C-pCDH 및 렌티바이러스 발현 벡터 3-2E-pCDH를 구축하였다.
1-2C 및 3-2E-pCDH 렌티바이러스 발현 벡터와 CD3 및 CD8을 발현하는 CD3-CD8-pCDH 플라스미드(Nanjing GenScript에서 구입함)를 1:1의 비율로 HEK-293T세포(ATCC에서 구입함)에 공동-형질주입시켰다. 24시간 공동-형질주입시킨 후, 세포를 200-250g으로 10min 동안 원심분리하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 세번 세척하고, 200-250g으로 10min 동안 원심분리하여, 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 HEK-293T세포를 얻는다.
그후, 본원자는 1-2C 또는 3-2E TCR과 KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드 및 기타 돌연변이 폴리펩타이드의 결합을 추가로 검증하기 위해, 상기 제조한 KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드8-16(VVGAGGVGK), G12V8-16(VVGAVGVGK), G12D8-16(VVGADGVGK), G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 4중합체와 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포에 대하여 염색분석을 진행하여, 그 결합 특이성을 평가하였다.
구체적으로, 상기 공동-형질주입을 통해 얻은 HEK-293T세포와 상기 제조한 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE 4중합체 및 PerCP-Cy5-CD8과 FITC-CD3 항체(BD)를 1:1:1의 몰비로 30min 동안 인큐베이션시킨다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 세번 세척하고, 200-250g으로 10min 동안 원심분리하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 세포를 재현탁시켜, KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11 양성의 T세포 빈도 검출용으로 사용하였다. 분석은 유세포분석(flow cytometry)을 사용해 수행되었다(도3A 참조).
도3A중의 제1, 2행(가로)는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE 4중합체를 통해 공동-형질주입된 HEK-293T세포에 대하여 염색 분석을 진행한 유세포분석도이다. 결과는 1-2C 또는 3-2E TCR를 형질주입시킨 293T세포 중에서, KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE 4중합체와 결합할 수 있는 세포가 CD8 양성세포에서 차지하는 비율이 약 25.9%인 것으로 나타났다.
KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드 및 기타 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11 4중합체의 결합 특이성에 대한 검출을 통하여, 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포는 KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드(VVGAGGVGK) 또는 G12D8-16(VVGADGVGK) 및 HLA-A11로 형성된 4중합체와 결합할 수 없지만, G12C8-16(VVGACGVGK) 및 HLA-A11로 형성된 4중합체와 결합할 수 있다는 것을 확인하였다(도3A).
세포 수준에서의 결합 실험은, 1-2C 또는 3-2E TCR이 G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11과 특이적으로 결합할 수 있는 것 외에, G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11 복합체와도 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 보여주었다.
2. 1-2C 및 3-2E TCR와 KRAS-G12 10펩타이드의 결합 특이성 검출
CD8 T세포 에피토프 폴리펩타이드의 길이가 일반적으로 9-10개의 아미노산이고, 상기 검출한 폴리펩타이드가 모두 9개 아미노산의 폴리펩타이드(9-펩타이드)인 것을 감안하면, 1-2C 및 3-2E TCR이 10개 아미노산의 폴리펩타이드(10-펩타이드)와 결합할 가능성을 배제할 수 없었다.
HLA-A11 결합 폴리펩타이드의 모티프(motif)에 의하면, N단에서 하나의 아미노산을 앞으로 이동하여도 여전히 T세포 에피토프, 즉, KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드7-16(서열번호 38로 표시됨), G12V7-16(서열번호 39로 표시됨), G12D7-16(서열번호 40으로 표시됨), G12C7-16(서열번호 41로 표시됨)로 될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 실시예에서, 실시예1과 동일한 조건과 조작을 사용하여 상기 길이가 10개 아미노산인 폴리펩타이드를 4중합체로 추가로 제조하고, 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포와 세포결합 실험분석을 진행하였으며, 각 조작 및 조건은 상기 G12D8-16 폴리펩타이드와 같고 유세포분석의 결과는 도 3B에 나타난 바와 같다.
그 결과, 흐름도의 오른쪽 위 사분면에 따르면, 10펩타이드 KRAS 야생형 및 돌연변이체 폴리펩타이드로 제조된 4중합체는 모두 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포와 결합할 수 없다는 것으로 나타났다. 따라서, 본원의 1-2C 또는 3-2E TCR은 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 및 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 폴리펩타이드 에피토프를 고도의 특이성으로 인식한다는 것이 추가로 증명되었다.
3. 1-2C 및 3-2E TCR과 HLA-A03이 제시한 KRAS-G12V 8-16 (VVGAVGVGK)의 교차 인식 검출.
HLA-A11은 HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자의 구성원으로 알려져 있으며, HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자의 구성원에는 HLA-A03, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A68 등도 포함되어 있고, HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자는 유사한 항원제시 특성을 가지고 있다. HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자의 항원제시 특징은 제시된 폴리펩타이드 C-말단이 일반적으로 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이며, 폴리펩타이드 시작 N-말단의 두개 아미노산과 C-말단의 아미노산이 HLA 분자의 폴리펩타이드 결합 홈(binding groove) 내에 삽입되고, 폴리펩타이드 중간 부분의 아미노산이 노출되어 TCR에 의해 인식된다는 것이다. 두 번째로는, TCR과 상호 작용할 수 있는 HLA-A03, HLA-A31, HLA-A33 및 HLA-A68와 같은 HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자의 α1 및 α2 나선이 70%를 넘게 보존되어 있다는 것이다.
따라서, 실시예1에서 선별된 TCR도 HLA-A03, HLA-A31, HLA-A33 및 HLA-A68와 같은 HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자와 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 또는 기타 돌연변이 폴리펩타이드로 형성된 복합체를 인식하는 능력을 가질 수 있다. 본 실시예에서는 HLA-A03과 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)을 사용하여 4중합체를 제조하고, 유세포분석으로 이와 상기 선별된 1-2C 및 3-2E TCR의 결합 능력을 검출하여, 다른 HLA-A3 슈퍼 패밀리 분자가 제시한 KRAS-G12 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 그 특이적 결합 능력을 확인하였다.
따라서, 본 실시예는 1-2C 및 3-2E TCR과 HLA-A03이 제시한 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)의 교차 인식 능력을 검출하였다.
여기에 사용된 HLA-A03 중쇄 유전자는 서열번호 46으로 표시되고, 이것이 코딩한 아미노산 서열은 서열번호 45로 표시된다. 나머지 사용된 재료 및 작업은 HLA-A11에 사용된 것과 동일하다.
본 실시예에서는 상기 실시예1과 같은 방법으로 HLA-A03 (IMGT/HLA Acc No:HLA00037)과 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 폴리펩타이드의 4중합체 단백질을 제조하고, 제조된 4중합체 단백질과 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11 4중합체를 사용해 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포를 염색 분석하였다(도4).
그 결과, KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A03 4중합체는 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 293T세포와 현저하게 결합할 수 있다(도4B, 오른쪽 위 사분면).
따라서, 1-2C 또는 3-2E TCR은 HLA-A11이 제시한 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 것 외에, HLA-A03이 제시한 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 폴리펩타이드와도 결합할 수 있어, 더 광범위한 사람들 사이에서 광범위한 응용 가치를 가질 수 있음을 제시한다.
실시예3. 1-2C 및 3-2E TCR-T세포의 제조 및 KRAS의 다양한 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 반응
본 실시예에서는 HLA-A11 유전적 배경을 가지고 있는 건강한 지원자로부터 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 분리된 CD8 T세포에 1-2C 또는 3-2E TCR 유전자를 도입하여 TCR-T 효과 세포(effector cell)로 사용하였다. KRAS-G12 야생형 폴리펩타이드8-16(VVGAGGVGK), G12V8-16(VVGAVGVGK), G12D8-16(VVGADGVGK), 및 G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이 폴리펩타이드를 각각 상기 TCR-T 효과 세포 시스템에 첨가하여 공동배양하고, KRAS 야생형 및 돌연변이 폴리펩타이드를 제시하는 표적세포와 상호작용한 후 효과 세포에서 분비되는 IFN-γ 수준을 검출하고, 1-2C 또는 3-2E TCR과 KRAS 야생형 및 돌연변이 폴리펩타이드/HLA-A11을 발현하는 표적세포의 상호작용을 평가하였다. 구체적인 실시단계는 다음과 같다.
1. 1-2C 및 3-2E TCR을 발현하는 렌티바이러스의 제조
실시예2중의 1-2C 및 3-2E TCR 렌티바이러스 발현 플라스미드(1-2C-pCDH 및 3-2E-pCDH) 및 렌티바이러스 패킹 플라스미드 PLP1, PLP2 및 VSVG(Addgene에서 구입함)를 PLP1:PLP2:VSVG:TCR-pCDH=20:13:5:20의 비율을 혼합하고, 20ul을 취하여 DMEM 배지(1.25ml)에 희석해서 DNA 용액으로 사용하였다. 폴리에테르 이미드(PEI, 1μg/μl) 20μl를 DMEM(1.25ml)에 첨가하고, 상기 PEI/DMEM 용액 전부를 제조된 DNA 용액에 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 15cm 플레이트에서 배양된 293T세포(Cell Bank, Shanghai)에 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 6시간 후, 배양액을 조심스럽게 흡입하고, 새로운 배양액 25ml를 첨가하여 계속 배양하였다. 72 시간 후, 바이러스가 함유된 상청액, 즉 1-2C 또는 3-2E TCR을 발현하는 렌티바이러스의 상청액을 수집하였다.
2. 1-2C 및 3-2E TCR-T세포의 제조 및 TCR 발현 효율 검출
두 명의 건강한 지원자(D1과 D2)의 말초혈액 림프구를 채집하여 PBMC를 얻고, 마그네틱 비즈(Biolegend)로 일부 PBMC를 음성선별하여 그 안에 있는 CD8 T세포를 분리하였다. 항-CD3/항-CD28이 코팅된 마이크로스피어(ThermoFisher)를 1:1의 비율로 PBMC 또는 CD8 T세포에 첨가하여 활성화시키고, 밤새 배양하였다. 그후, 1-2C 또는 3-2E TCR 렌티바이러스를 1:1 부피비로 PBMC 또는 CD8 T세포에 첨가하고, 균일하게 혼합하였으며, 바이러스 감염이 없는 웰을 대조로 설정하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 24시간 후, 완전 배지로 바꿔 10일째까지 계속 배양하였다.
항-CD3/항-CD28의 마이크로스피어를 자기장 조건하에서 제거하고, 세포배양에서 사용된 것과 같은 배지로 두번 세척하여 본 실시예의 1-2C 또는 3-2E TCR-T 효과세포를 얻었다.
상기 PBMC 또는 CD8 T세포를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T 세포(10일째까지 배양)를 배양하고, KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11 4중합체 염색을 이용하여 실시예2와 동일하게 유세포분석 검출을 진행하여, 1-2C 또는 3-2E TCR의 발현(도5, 오른쪽 위 사분면)을 확인하였다.
그 결과, PBMC 또는 CD8+ T세포를 이용하여 제조된 지원자 D1 및 D2 유래의 1-2C, 3-2E TCR-T세포에서는, 0.26%-2.38%의 서로 다른 양성율을 보이는 4중합체 양성 T세포를 검출할 수 있었는데, PBMC에서의 양성률은, 1-2C의 경우 0.26%, 0.77%, 3-2E의 경우 1.03%, 0.55%, CD8+ T세포에서의 양성률은, 1-2C의 경우 0.68%, 0.91%, 3-2E의 경우 2.38%, 2.37%이었다.
이와 같이, 본원의 TCR-T 효과 세포는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11과 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 알 수 있다.
3. 1-2C 및 3-2E TCR-T 세포의 KRAS 야생형 및 돌연변이체 폴리펩타이드에 대한 면역 반응 검출
이후, 각각 서로 다른 T세포 검출 방법(IFN-γ-ELISPOT 및 IFN-γ-ELISA)을 이용하여, 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포와 KRAS 야생형 및 돌연변이체 폴리펩타이드를 제시하는 표적세포가 작용한 후 분비되는 IFN-γ의 수준을 검출하였다.
D1과 D2 두 명의 지원자의 PBMC 또는 CD8 T세포를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포를 각각의 유래에 대응하여 D1과 D2 두 명의 지원자의 PBMC와 1:1 비율로 혼합하여 항원제시 세포로 사용하고, 100μl 부피 1×105세포수/웰로 사전에 항-IFN-γ항체가 코팅된 ELISPOT판에 첨가하고, 동시에 KRAS 야생형 및 돌연변이체 폴리펩타이드(100μl 부피, 10μg/ml)을 첨가하여, 37℃, 100% 습도, 5% CO2 세포 배양 인큐베이터에서 18시간 동안 계속 배양하였다. PMA/이오노마이신(ION) (100μl 부피, 1μg/ml)으로 자극을 가한 샘플 또는 100μl 배지만 함유한 샘플을 각각 양성과 음성대조로 사용하였다. IFN-γ를 생성하는 특이적 T세포에 대하여, ELISPOT 반점 분석을 진행하여, 그 결과를 도6A-B, D-E에 나타낸다.
더 나아가 D1과 D2 두 명의 지원자의 PBMC 또는 CD8 T세포를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포를 D1과 D2 두 명의 지원자의 PBMC와 1:1 비율로 혼합하여 항원제시 세포로 사용하였다. 준비된 세포현탁액을 각 웰 당 100μl 세포현탁액(2×105개 세포)로 96웰 플레이트내에 넣고, 각 웰 당 세번 반복하였다. 그 중 PMA/이오노마이신(ION) 그룹은 매 250μl 세포배지에 1μl PMA/이오노마이신 혼합액(250×)을 첨가하여 사전에 희석하여 작업액으로 하였다. 이를 양성 자극 대조군으로 사용하였다. 1-2C 또는 3-2E TCR 렌티바이러스에 감염되지 않은 T세포(D1 mock 및 D2 mock)를 평행으로 첨가하여 음성대조로 사용하였다. 37℃에서 20h 배양한 후, 96웰 플레이트 배양 웰의 상청액을 취하고, 500g 회전속도로 5min 동안 원심분리하여 잔류세포를 제거하였다. 상청액을 항IFN-γ항체(BD)가 코팅된 ELISA 검출 플레이트(BD)에 첨가하여, 상청액중의 IFN-γ 수준을 검출하고, 그 결과를 도6C와 F에 나타낸다.
ELISPOT 실험결과에 의하면, D1과 D2 지원자의 PBMC를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포는 모두 KRAS-G12V 돌연변이 폴리펩타이드에 대하여 강한 T세포 면역반응을 일으킬 수 있으며, KRAS-G12C 돌연변이 폴리펩타이드에 대하여서도 일정 수준의 교차반응을 가지고 있다. 한편, KRAS 야생형 및 KRAS-G12D 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 T세포 반응은 검출되지 않았다(도6A-B). D1과 D2 지원자의 CD8 T세포를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T세포에서는 PBMC에 의해 제조된 TCR-T세포와 유사한 T세포 면역반응을 검출할 수 있다(도6D-E).
IFN-γ 수준의 ELISA 실험 결과에 의하면, D1과 D2 지원자의 PBMC 또는 CD8 T세포를 이용하여 제조된 1-2C 또는 3-2E TCR-T 세포는 모두 KRAS-G12V 돌연변이 폴리펩타이드에 대하여 강한 T세포 면역반응을 일으킬 수 있고, IFN-γ 수준이 높아졌으며, KRAS 야생형 및 KRAS-G12D 돌연변이 폴리펩타이드에 대한 T세포 반응은 검출되지 않았다(도6C와 F).
따라서 1-2C 및 3-2E TCR-T세포는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11을 제시하는 표적세포를 특이적으로 인식할 수 있고, KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)을 제시하는 표적세포에 대하여 일정한 교차반응을 가지고 있으며, 사이토카인 IFN-γ를 특이적으로 분비할 수 있다는 것을 알 수 있다。 CD8+ T세포의 표적세포에 대한 잠재적 세포독성 작용을 감안하여, 본원의 1-2C 및 3-2E TCR-T세포는 잠재적 표적세포 사멸 활성 및 종양 치료용으로서의 가치를 가지고 있다는 것을 제시한다.
실시예4. 1-2C 및 3-2E TCR의 KRAS 돌연변이 폴리펩타이드 에피토프에 대한 결합특성 분석
1-2C 및 3-2E TCR과 KRAS의 서로 다른 돌연변이체 폴리펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질의 결합 특성과 친화력을 정확하게 측정하기 위하여, 본원자는 표면 플라즈마 공명 실험(SPR)을 이용하여 단백질 수준의 친화력을 진일보 검출하였다. 1-2C 또는 3-2E TCR의 기능 영역은 세포외 영역이고, 관통막 영역이 없는 세포외 영역은 가용성 단백질이기 때문에, 1-2C 또는 3-2E TCR의 세포외 영역을 합성하였다. 구체적인 조작은 다음과 같다.
1. TCR 단백질 발현과 정제
1-2C 또는 3-2E TCR α사슬 및 β사슬의 세포외 영역 유전자를 원핵 코돈에 따라 최적화하여, 각각 1-2C 및 3-2E TCR 키메라 α사슬 및 β사슬의 세포외 영역의 DNA 서열(1-2C의 α사슬은 서열번호 29로 표시되고; β사슬은 서열번호 30으로 표시되고; 3-2E의 α사슬은 서열번호 31로 표시되고; β사슬은 서열번호 32로 표시됨)을 합성하였다. 그 중에서, 1-2C TCR은 서열번호 2로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및 서열번호 7로 표시되는 β사슬 가변 영역을 포함한다. 3-2E TCR은 서열번호 12로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및 서열번호 17로 표시되는 β사슬 가변 영역을 포함한다. 각각 제한효소 인식부위 Nde I와 Xho I를 도입하였는데, 그중 Nde I 제한효소 인식부위는 서열의 5’ 말단에 있고, 제한효소 인식부위 Xho I는 서열의 3’ 말단에 있다. 제한효소 인식부위 Nde I와 Xho I를 이용하여, 합성된 1-2C 또는 3-2E TCR α사슬 및 β사슬의 세포외 영역의 DNA 서열을 각각 발현 벡터 pET21a(Invitrogen)에 클로닝하여, 1-2C 또는 3-2E TCR α사슬 및 β사슬의 세포외 영역 단백질에 대한 원핵 재조합 발현 플라스미드를 구축하였다.
열쇼크법을 사용하여 발현 플라스미드를 E. coli.BL21(DE3) 컴피턴트 세포에 형질주입시키고, IPTG를 첨가하여 발현을 유도하여, 내포체 상태의 1-2C 또는 3-2E TCR α사슬 및 β사슬의 세포외 영역 단백질을 얻는다.
1-2C 또는 3-2E TCR α사슬 및 β사슬의 세포외 영역의 내포체(각 내포체는 모두 30mg/ml로 6M Gua-HCl, 50mM Tris pH8.0, 100mM NaCl, 10mM EDTA 및 10mM DTT를 함유한 용해액중에 용해됨) 6 ml를 2:1의 질량비에 따라 제조된 복원액(5M 요소, 20mM Tris-HCL, 400mM L-아르기닌, EDTA 2mM, GSH/GSSG 5mM/1mM) 1L중에 적가하는데, 두번으로 나누어 적가하고 매번 3mL씩 적가하고 두번 적가 간격은 최소 8h이다. 그후, 농축컵(Millipore)을 사용하여 농축하였다.
농축 후, 각각 4L 탈이온수와 4L 10mM Tris, pH8.0의 투석액중에 넣고 각각 24h 동안 투석하였다. 이후, Source 15Q 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 초보적인 정제를 진행하고, SDS-PAGE를 통하여 목적 단백질을 확인하였다.
구체적으로, 목적 단백질을 농축컵(Millipore)으로 농축하고, 20mM Tris-HCL, 150mM NaCL, pH8.0의 완충액으로 교환하여, 농축한 후,　Superdex200 pg 분자체(GE Healthcare)로 정제하여, 약 2-3mg의 1-2C 또는 3-2E TCR 단백질을 얻고, 환원성(디티오트레이톨(DTT)을 포함) 및 비환원성(디티오트레이톨(DTT)을 포함하지 않음) SDS-PAGE를 이용해 목적 단백질을 검출하였다(도7).
그 결과, 1-2C TCR은 18.19mS/cm 조건하에서 용출되고, 3-2E TCR은 3-2E 21.19mS/cm 조건하에서 용출되며, 분자체 크로마토그래피에서, 용출부피가 15mL일 시, 단백질 목적 피크가 나타났으며, SDS-PAGE 확인을 통하여 아래와 같은 것을 발견하였다. 즉 1-2C 또는 3-2E는 αβ 헤테로다이머로 나타나 있고, DTT를 첨가하지 않은 비환원 조건의 SDS-PAGE에서 밴드 사이즈가 약 52KD이고, DTT를 첨가한 환원 조건의 SDS-PAGE에서 α사슬 및 β사슬 사이의 이황화 결합이 열려, 각각 24KD와 28KD 정도의 사이즈의 밴드로 나타났다(도7).
2. SPR 검출 분석
실시예1과 동일한 조작으로 체외 복원실험을 진행하여 제조한 1-2C 및 3-2E TCR 단백질, 및 실시예1에서 제조한 바이오티닐레이션된 KRAS 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 9펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질을 SPR 완충액(10mM HEPES-HCl, 150mM Na-Cl, 0.005% Tween-20, pH7.4)중에 옮긴다. KRAS 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 9펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질을 20μg/ml으로 희석하고, SA 칩(GE Health)에 고정한 후, 순차적으로 희석된(0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM) 1-2C 및 3-2E TCR 단백질을 각각 SA 칩의 각 채널을 통과시키고, BIA 평가 소프트웨어를 이용하여 결합 동역학 매개변수를 분석하고 친화력 상수를 계산하였다. 1-2C 및 3-2E TCR과 야생형 및 KRAS 야생형 및 서로 다른 돌연변이체 9펩타이드/HLA-A11 복합체 단백질에 대한 친화력을 검출하였다(도8).
그 결과, 도8중의 곡선으로 부터 알 수 있듯이 1-2C TCR의 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11과의 결합은 빠른 결합과 빠른 해리 모드를 나타내고, 결합 친화력(KD)은 7.21μM이며, KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11과의 결합 친화력(KD)은 46.2μM으로, KRAS-G12V8-16 에피토프보다 현저하게 낮다.
1-2C는 KRAS 야생형 KRAS-G128-16(VVGAGGVGK)/HLA-A11 및 KRAS-G12D8-16(VVGADGVGK)/HLA-A11과 결합할 수 없다. 3-2E TCR의 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11과의 결합 친화력(KD)은 35.9μM이고, 1-2C의 친화력보다 현저하게 낮다. KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11과의 결합 친화력(KD)은 50.5μM이고, KRAS-G12V8-16과 동일한 수준이다.
1-2C와 마찬가지로 3-2E TCR은 KRAS 야생형 KRAS-G128-16(VVGAGGVGK)/HLA-A11 및 KRAS-G12D8-16(VVGADGVGK)/HLA-A11과 결합할 수 없다.
따라서 SPR 결과에서 알 수 있듯이 1-2C TCR 및 3-2E TCR은 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11과 특이적으로 결합할 수 있고, 1-2C TCR과 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11은 일정한 교차 반응이 존재하고, 1-2C TCR의 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11과의 친화력은 KRAS-G12V과 동일한 수준이다. 따라서, 1-2C와 3-2E TCR은 양호한 결합 특성과 친화력을 가지고 있어, 1-2C와 3-2E TCR을 항종양 치료에 사용할 시, 유전자 KRAS의 G12V와 G12C 돌연변이를 가진 종양세포에 대하여 IFN-γ를 생성하여 종양세포를 사멸하고 종양을 치료하는 작용을 한다고 추측할 수 있다.
실시예5. 1-2C TCR-T세포의 종양 마우스 모델에서의 종양 억제 활성
본 실시예는 NCG 면역 결핍 마우스 PANC-1 종양 모델을 응용하여 1-2C TCR-T세포의 종양 억제 효과를 평가하였다.
TCR-T세포의 NCG 마우스 종양 억제 실험 단계는 다음과 같다.
1. NCG 마우스 PANC-1 종양 모델 구축
NCG 마우스는 남경대학-남경생물 의학연구원에서 유래한 것으로, 각 NCG 마우스에 KRAS-G12V 돌연변이 유전자를 가진 PANC-1 종양세포(Beijing Union Cell Resource Center)를 피하 접종하여, NCG 마우스에 인간 면역체계를 구축하였다.
a) PANC-1 세포 접종수량: 4×106개 세포/200μL/마리;
b) 접종부위: 등 피하.
2. 1-2C TCR-T세포 치료
NCG 마우스에 PANC-1 종양세포를 접종한 후 7일째, 종양부피는 약 200mm3로 성장하였다. 실시예3에서 D1과 D2 두 명의 지원자의 PBMC에 의해 제조된 1-2C TCR-T세포를 종양내 멀티포인트 주사를 통해 NCG 마우스의 PANC-1 종양 내부에 주사하였다.
a) 1-2C TCR-T세포 접종수량: 각각 1×107, 1×106, 1×105세포/200μL/마리인 세 가지 용량(dose)에 따름;
b) 접종부위: 종양 내.
3. 그룹핑 및 처리:
종양세포를 주사한 후 약 1주일 후, 종양이 균일한 마우스를 선별하여 그룹핑하였다. 그후, 1-2C TCR-T세포 종양내 주사 치료를 진행하였다. 본 실시예는 TCR을 도입하지 않은 T세포(1×107) 주사그룹을 음성대조로 하고, 각 그룹 당 마우스는 6마리이고, 이 중 D1과 D2로 제조된 TCR-T세포 치료그룹은 각각 3마리이다. 각 그룹 정보 및 처리는 다음 표에 나타난 바와 같다.
표2. 마우스 그룹핑 및 치료 처리
Figure pct00002
종양이 형성된 후 매3~4일에 한 번씩 종양 사이즈를 검출하는데, 마우스의 최대 종양 부피가 4000mm3이 될 때까지 검출하고 실험을 마친다. 마우스를 처형하고 종양을 분리하여 중량을 측정하였다.
4. 치료 효과 관찰:
1) 종양 사이즈 검출:
a) TCR-T세포를 주사한 후, 캘리퍼로 직경을 측량하였다, 단위는 mm이고, 계산 공식은 v=1/2×a×b×b(a는 긴 직경, b는 짧은 직경)이다;
b) 마지막 관찰 후, 실험을 종료시키고, 종양 조직을 분리하여 직접 중량을 측정하였다.
그 결과, 1×107 고용량 및 1×106 중용량 주사그룹의 1-2C TCR-T세포 치료 그룹의 종양 부피는 음성대조 그룹보다 현저하게 작고(T 점검, p<0.01)(도9C), 1×105 저용량 그룹은 음성대조 그룹의 종양 부피와 현저한 차이가 없다(T 점검, p>0.05). 실험 종료 시, 매 그룹의 종양 중량을 분석한 결과, 고용량 그룹의 종양 중량은 음성대조 그룹보다 현저하게 낮다(도9A). 본 실시예의 결과에 의하면, 1-2C TCR-T세포는 종양의 성장을 효과적으로 억제시킬 수 있고, 종양 억제 활성은 현저한 용량의존적 효과를 나타내며, 종양 치료의 잠재력을 가지고 있다(도9 참조).
Sequence listing <110> Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences <120> SCREENING AND ANTITUMOR USE OF KRAS MUTATION SPECIFIC T CELL RECEPTOR <130> IP210439 <160> 48 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 1 gccaacagaa ggtgcagcag agcccagaat ccctcattgt tccagaggga ggcatggcct 60 ctctcaactg cacttccagt gatcgtaatg ttgactactt ctggtggtac agacagcact 120 ctgggaaaag ccccaagatg ctgatgtcta tcttctccaa tggtgaaaag gaagaaggca 180 gattcacagt tcacctcaat aaagccagcc tgcatacttc cctgcacatc agagactccc 240 agcccagtga ctctgctctc tacctctgtg cagcaaggga cagcaactat cagttgatct 300 ggggctctgg gaccaagcta attataaagc cag 333 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 2 Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile Val Pro Glu Gly 1 5 10 15 Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Val Asp Tyr 20 25 30 Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro Lys Met Leu 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ctatagatga ttcagggatg 180 cccaaggaac gattctcagc tcagatgccc aatcagtcgc actcaactct gaagatccag 240 agcacgcaac cccaggactc agcggtgtat ctttgtgcaa gcagcttaga agggacagtg 300 gaagaaacgc tgtattttgg ctcaggaacc agactgactg ttctcg 346 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 17 Asn Ala Gly Val Ile Gln Thr Pro Arg His Lys Val Thr Gly Lys Gly 1 5 10 15 Gln Glu Ala Thr Leu Trp Cys Glu Pro Ile Ser Gly His Ser Ala Val 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Ile Val Gln Gly Leu Glu Phe Leu Thr Tyr 35 40 45 Phe Arg Asn Gln Ala Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Lys Glu Arg 50 55 60 Phe Ser Ala Gln Met Pro Asn Gln Ser His Ser Thr Leu Lys Ile Gln 65 70 75 80 Ser Thr Gln Pro Gln Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Leu 85 90 95 Glu Gly Thr Val Glu Glu Thr Leu Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 18 Ser Gly His Ser Ala 1 5 <210> 19 <211> 6 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gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 600 tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 660 ccagaaagtt cctgtgatgt caagctggtc gagaaaagct ttgaaacaga tacgaaccta 720 aactttcaaa acctgtcagt gattgggttc cgaatcctcc tcctgaaagt ggccgggttt 780 aatctgctca tgacgctgcg gctgtggtcc agc 813 <210> 22 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 22 Met Lys Ser Phe Ser Ile Ser Leu Val Val Leu Trp Leu Gln Leu Asn 1 5 10 15 Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ile 20 25 30 Val Pro Glu Gly Gly Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg 35 40 45 Asn Val Asp Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Met Leu Met Ser Ile Phe Ser Asn Gly Glu Lys Glu Glu Gly Arg 65 70 75 80 Phe Thr Val His Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Thr Ser Leu His Ile 85 90 95 Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ala Arg 100 105 110 Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ser Gly Thr Lys Leu Ile 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ggggcatggg 180 ctgaggctga tccattattc atatggtgct ggcagcactg agaaaggaga tatccctgat 240 ggatacaagg cctccagacc aagccaagag aacttctccc tcattctgga gttggctacc 300 ccctctcaga catcagtgta cttctgtgcc agcggtgata cagggggcta tgaacagtac 360 ttcggtcccg gcaccaggct cacggtttta gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag 420 gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg 480 tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 540 gaggtgcaca gtggggtctg cacagacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 600 gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc 660 cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc tacgggctct cggagaatga cgagtggacc 720 caggataggg ccaaacctgt cacccagatc gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac 780 tgtggcttca cctccgagtc ttaccagcaa ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag 840 atcttgctag ggaaggccac cttgtatgcc gtgctggtca gtgccctcgt gctgatggcc 900 atggtcaaga gaaaggattc cagaggc 927 <210> 24 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 24 Met Gly 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ccagtctgca taccagcctg 240 catatccgcg atagccagcc gagcgatagc gccctgtacc tgtgcgccgc ccgcgatagc 300 aattaccagc tgatctgggg cagcggcacc aaactgatca tcaaaccgga tatccagaat 360 ccggatccgg ccgtttacca gctgcgcgat agcaaaagca gcgataaaag cgtttgcctg 420 ttcaccgatt tcgatagcca gaccaatgtt agccagagca aagatagcga tgtttacatc 480 accgataaat gcgttctgga tatgcgcagc atggatttca aaagcaatag cgccgttgcc 540 tggagcaata aaagcgattt cgcctgcgcc aatgccttca ataatagcat catcccggaa 600 gataccttct tcccgtctcc ggaaagcagc 630 <210> 30 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 30 atgaaacata tggaagccgc cgttacccag agcccgcgca ataaagttgc cgttaccggc 60 ggcaaagtta ccctgagctg caatcagacc aataatcata ataatatgta ctggtaccgc 120 caggataccg gccatggcct gcgcctgatc cattacagct acggcgccgg cagcaccgaa 180 aaaggcgata tcccggatgg ctacaaagcc agccgcccga gccaggaaaa tttcagcctg 240 atcctggaac tggccacccc gagccagacc agcgtttact tctgcgccag cggcgatacc 300 ggcggctacg aacagtactt cggcccgggc acccgcctga ccgttctgga agatctgaaa 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agcagcgata aaagcgtttg cctgttcacc 420 gatttcgata gccagaccaa tgttagccag agcaaagata gcgatgttta catcaccgat 480 aaatgcgttc tggatatgcg cagcatggat ttcaaaagca atagcgccgt tgcctggagc 540 aataaaagcg atttcgcctg cgccaatgcc ttcaataata gcatcatccc ggaagatacc 600 ttcttcccga gcccggaaag cagc 624 <210> 32 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 32 atggaaccga ccaatgccgg cgttatccag accccgcgcc ataaagttac cggcaaaggc 60 caggaagcca ccctgtggtg cgaaccgatc agcggccaca gtgccgtttt ctggtaccgc 120 cagaccatcg ttcagggcct ggaattcctg acctacttcc gcaatcaggc cccgatcgat 180 gatagcggca tgccgaaaga acgcttcagc gcccagatgc cgaatcagag ccatagcacc 240 ctgaaaatcc agagcaccca gccgcaggac agcgccgttt acctgtgcgc cagcagcctg 300 gaaggcaccg ttgaagaaac cctgtacttc ggcagcggca cccgcctgac cgttctggaa 360 gatctgaaaa atgttttccc gccggaagtt gccgttttcg aaccgagcga agccgaaatc 420 agccataccc agaaagccac cctggtttgc ctggccaccg gcttctaccc ggatcatgtt 480 gaactgagct ggtgggttaa tggcaaagaa gttcatagcg gcgtttgcac 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30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr 50 55 60 Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile Gln 85 90 95 Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys 130 135 140 Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Ala Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Arg Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp <210> 44 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 44 atgagccata gcatgcgcta tttttatacc agcgtgagcc gcccgggccg cggcgaaccg 60 cgctttattg cggtgggcta tgtggatgat acccagtttg tgcgctttga tagcgatgcg 120 gcgagccagc gcatggaacc gcgcgcgccg tggattgaac aggaaggccc ggaatattgg 180 gatcaggaaa cccgcaacgt gaaagcgcag agccagaccg atcgcgtgga tctgggcacc 240 ctgcgcggct attataacca gagcgaagat ggcagccata ccattcagat tatgtatggc 300 tgcgatgtgg gcccggatgg ccgctttctg cgcggctatc gccaggatgc gtatgatggc 360 aaagattata ttgcgctgaa cgaagatctg cgcagctgga ccgcggcgga tatggcggcg 420 cagattacca aacgcaaatg ggaagcggcg catgcggcgg aacagcagcg cgcgtatctg 480 gaaggccgct gcgtggaatg gctgcgccgc tatctggaaa acggcaaaga aaccctgcag 540 cgcaccgatc cgccgaaaac ccatatgacc catcatccga ttagcgatca tgaagcgacc 600 ctgcgctgct gggcgctggg cttttatccg gcggaaatta ccctgacctg gcagcgcgat 660 ggcgaagatc agacccagga taccgaactg gtggaaaccc gcccggcggg cgatggcacc 720 tttcagaaat gggcggcggt ggtggtgccg agcggcgaag aacagcgcta tacctgccat 780 gtgcagcatg aaggcctgcc gaaaccgctg accctgcgct gg 822 <210> 45 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 45 Met Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr 50 55 60 Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr 65 70 75 80 Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Ile Gln 85 90 95 Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 115 120 125 Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys 130 135 140 Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Glu Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Asp Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His 180 185 190 Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 210 215 220 Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 230 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp <210> 46 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 46 atgagccata gcatgcgcta tttttttacc agcgtgagcc gcccgggccg cggcgaaccg 60 cgctttattg cggtgggcta tgtggatgat acccagtttg tgcgctttga tagcgatgcg 120 gcgagccagc gcatggaacc gcgcgcgccg tggattgaac aggaaggccc ggaatattgg 180 gatcaggaaa cccgcaacgt gaaagcgcag agccagaccg atcgcgtgga tctgggcacc 240 ctgcgcggct attataacca gagcgaagcg ggcagccata ccattcagat tatgtatggc 300 tgcgatgtgg gcagcgatgg ccgctttctg cgcggctatc gccaggatgc gtatgatggc 360 aaagattata ttgcgctgaa cgaagatctg cgcagctgga ccgcggcgga tatggcggcg 420 cagattacca aacgcaaatg ggaagcggcg catgaagcgg aacagctgcg cgcgtatctg 480 gatggcacct gcgtggaatg gctgcgccgc tatctggaaa acggcaaaga aaccctgcag 540 cgcaccgatc cgccgaaaac ccatatgacc catcatccga ttagcgatca tgaagcgacc 600 ctgcgctgct gggcgctggg cttttatccg gcggaaatta ccctgacctg gcagcgcgat 660 ggcgaagatc agacccagga taccgaactg gtggaaaccc gcccggcggg cgatggcacc 720 tttcagaaat gggcggcggt ggtggtgccg agcggcgaag aacagcgcta tacctgccat 780 gtgcagcatg aaggcctgcc gaaaccgctg accctgcgct gg 822 <210> 47 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 47 Met Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala 1 5 10 15 Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His 20 25 30 Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu 35 40 45 Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 50 55 60 Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp 85 90 95 Asp Arg Asp Met 100 <210> 48 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Artificially synthesized sequence <400> 48 atgattcagc gcaccccgaa aattcaggtg tatagccgcc atccggcgga aaacggcaaa 60 agcaactttc tgaactgcta tgtgagcggc tttcatccga gcgatattga agtggatctg 120 ctgaaaaacg gcgaacgcat tgaaaaagtg gaacatagcg atctgagctt tagcaaagat 180 tggagctttt atctgctgta ttataccgaa tttaccccga ccgaaaaaga tgaatatgcg 240 tgccgcgtga accatgtgac cctgagccag ccgaaaattg tgaaatggga tcgcgatatg 300

Claims (11)

  1. KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 에피토프와 HLA-A11의 복합체, 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 에피토프와 HLA-A11의 복합체, 또는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 에피토프와 HLA-A03의 복합체와 결합할 수 있고,
    α사슬 가변 영역 및 β사슬 가변 영역을 포함하는 T세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    상기 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 아래의 α사슬 상보성 결정 영역(CDR) 및 β사슬 상보성 결정 영역(CDR):
    서열번호 3으로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR1;
    서열번호 4로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR2;
    서열번호 5로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR3;
    서열번호 8로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR1;
    서열번호 9로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR2; 및
    서열번호 10으로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR3;
    또는
    서열번호 13으로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR1;
    서열번호 14로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR2;
    서열번호 15로 표시되는 α사슬 상보성 결정 영역CDR3;
    서열번호 18로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR1;
    서열번호 19로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR2; 및
    서열번호 20으로 표시되는 β사슬 상보성 결정 영역CDR3;
    을 포함하는, T세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및
    서열번호 7로 표시되는 β사슬 가변 영역;
    또는
    서열번호 12로 표시되는 α사슬 가변 영역, 및
    서열번호 17로 표시되는 β사슬 가변 영역;
    을 포함하는, T세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 TCR은 쥐 TCR, 인간-쥐 키메라 TCR 또는 인간화 TCR인, TCR 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하고, 서열번호 1, 서열번호 6, 서열번호 11 및 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열인, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 렌티바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  6. 제5항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주세포.
  7. 1) 제6항의 숙주세포를 배양하는 단계;
    2) 상기 숙주세포 또는 그의 배양배지로부터 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계;
    를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 제조하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  9. T세포에 의해 분비되는 IFN-γ 사이토카인 수준을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도로서,
    상기 약제는 예를 들면 단백질 약제, ADC약제 또는 TCR 및 항원의 조합을 포함하는 약제인,
    TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  10. KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이를 발현하는 종양 세포의 검출용 시약의 제조에 있어서의, 또는 종양의 검출 또는 진단용 시약의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11, 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11, 또는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 에피토프 및 HLA-A03과 특이적으로 결합하거나, 또는
    상기 TCR 또는 그의 항원 결합 단편은 HLA-A11 또는 HLA-A03과 유사한 항원 결합 특성을 갖는 HLA 분자에 특이적으로 결합하거나, 또는 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이 폴리펩타이드와 특이적으로 결합하고,
    상기 HLA 분자는 바람직하게는 HLA-A31, HLA-A33, HLA-A68, HLA-A30인,
    TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
  11. KRAS 유전자에 G12V 및 G12C 돌연변이를 갖는 종양 환자를 치료하기 위한 항종양 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도로서,
    상기 종양은 바람직하게는 췌장암, 대장암, 또는 폐암이고,
    바람직하게는 비소세포폐암이며;
    바람직하게는, 상기 KRAS 유전자의 G12V 및 G12C 돌연변이는 KRAS 유전자의 KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK) 돌연변이 또는 KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK) 돌연변이인, TCR 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
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