CN111094345B - 具有人结构域的抗b细胞成熟抗原嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

提供了对B细胞成熟抗原(BCMA)具有抗原特异性的嵌合抗原受体(CAR)。还提供了与CAR相关的相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和药物组合物。还提供了治疗或预防哺乳动物癌症的方法。

Description

具有人结构域的抗B细胞成熟抗原嵌合抗原受体
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2017年6月30日提交的第62/527,556号美国临时专利申请的权益，其通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在美国国立卫生研究院、美国国家癌症研究所(the NationalInstitutes of Health,National Cancer Institute)的项目号为ZIABC01143905的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
通过引用并入以电子方式递交的材料
通过引用整体并入本文的是与本文同时递交并标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：日期为2018年6月25日的名称为“739534_ST25.TXT”的一个67,061字节的ASCII(文本)文件。
发明背景
癌症是公共健康问题。尽管如化学疗法的治疗取得了进步，但许多癌症的预后可能很差。例如，多发性骨髓瘤(MM)的治疗可能会引起缓解，但许多患者最终复发并死亡。因此，存在对于癌症的其他治疗的未满足的需求。
发明简述
本发明的实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原识别结构域、跨膜(TM)结构域和T细胞激活结构域，其中所述CAR对B细胞成熟抗原(BCMA)具有抗原特异性，其中所述抗原识别结构域包含以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：1-3；(b)SEQ ID NO：4-6；(c)SEQID NO：7-9；或(d)SEQ ID NO：10-12。
本发明的其他实施方案提供了与本发明的所述CAR相关的相关核酸，重组表达载体、宿主细胞、细胞群和药物组合物。
本发明的另外的实施方案提供了治疗或预防哺乳动物癌症的相关方法。
附图中几个视图简要描述
图1A-1D是描绘了CAR的示意图，所述CAR包含与CD8α分子的铰链区和跨膜区、CD28共刺激分子的细胞质部分以及CD3ζT细胞激活结构域的细胞质部分组合的FHVH74(A)、FHVH32(B)、FHVH33(C)或FHVH93(D)的仅全人重链抗原识别结构域。
图1E-1H是描绘了CAR的示意图，所述CAR包含与CD8α分子的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激分子的细胞质部分以及CD3ζT细胞激活结构域的细胞质部分组合的FHVH74(E)、FHVH32(F)、FHVH33(G)或FHVH93(H)的仅全人重链抗原识别结构域。
图1I-1L是描绘了CAR的示意图，所述CAR包含与CD8α分子的铰链区和跨膜区、T细胞可诱导共刺激蛋白(ICOS)的细胞质部分以及CD3ζT细胞激活结构域的细胞质部分组合的FHVH74(I)、FHVH32(J)、FHVH33(K)或FHVH93(L)的仅全人重链抗原识别结构域。
图2是一系列描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了如实施例2中所描述的由原代人T细胞表达的所显示的四种FHVH CAR。未转导的(UT)T细胞被包括作为阴性对照，并且11D5-3-CD828Z被提供作为阳性对照CAR。在培养的第2天转导T细胞，并在培养的第7天用BCMA-Fc蛋白试剂对细胞染色。图是对活淋巴细胞的门控。图中的数字是表达CAR(顶部)或不表达CAR(底部)的CD3+细胞的百分比。
图3是一系列描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了表达FHVH CAR的T细胞的BCMA特异性脱粒。这些图显示了在评估抗原特异性功能的CD107a脱粒测定中用四种FHVHCAR之一转导的原代人T细胞的结果。如实施例3中所描述的，与BCMA阴性靶细胞(NGFR-K562)相比，当与BCMA+靶细胞(BCMA-K562)一起培养时，表达每种CAR的T细胞在更大程度上脱粒。UT细胞被包括作为阴性对照，并且11D5-3-CD828Z被提供作为阳性对照CAR。图是对CD3+淋巴细胞的门控。图中的数字是上调CD107a(顶部)或未上调CD107a(底部)的CD3+细胞的百分比。
图4A是描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了11D5-3-CD828Z CAR以BCMA特异性方式增殖。图是对活的CD3+淋巴细胞的门控。空心直方图(histogram)代表用BCMA-K562(表达BCMA)靶细胞刺激的CAR+T细胞，和黑色直方图代表用NGFR-K562(BCMA阴性)细胞刺激的CAR+T细胞。所有结果都是使用来自同一患者的细胞同时产生的。
图4B-4E是描绘了实验数据的图，如实施例5中所描述的，所述实验数据阐明了FHVH74-CD828Z(B)、FHVH32-CD828Z(C)、FHVH33-CD828Z(D)或FHVH93-CD828Z(E)以BCMA特异性方式增殖。
图4F是描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了当用指示的CAR转导的T细胞与BCMA+靶细胞一起培养时，CAR+T细胞的绝对数量增加。当CAR T细胞与BCMA-K562细胞一起培养时，表达所有CAR的T细胞的CAR+T细胞的数量增加。Y轴代表CAR+T细胞的数量(×106个)。X轴代表T细胞与BCMA+靶细胞一起培养的天数。
图5A是描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了与UT细胞杀死BCMA+靶细胞的能力相比的FHVH33-CD828Z CAR杀死BCMA+靶细胞的能力。将表达FHVH33-CD828Z CAR的T细胞与RPMI8226靶细胞在指示的效应子/靶标比率下体外培养4小时。一式两份测定细胞毒性。结果展示为平均值的+/-标准误差。Y轴代表CAR的％细胞毒性。X轴代表T细胞与靶细胞的比率。
图5B是描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了与UT细胞杀死BCMA+靶细胞的能力相比的FHVH33-CD8BBZ CAR杀死BCMA+靶细胞的能力。在指示的效应子/靶标比率下，将表达FHVH33-CD8BBZ CAR的T细胞与RPMI8226靶细胞在指示的效应子/靶标比例下体外培养4小时。一式两份测定细胞毒性。结果展示为平均值的+/-标准误差。Y轴代表CAR的％细胞毒性。X轴代表T细胞与靶细胞的比率。
图6是一系列描绘了实验数据的图，所述实验数据阐明了具有4-1BB共刺激结构域的CAR在原代人T细胞的表面上表达，其中FHVH33-CD8BBZ显示出最高的表达。该图显示了四种FHVH CAR的BCMA-Fc染色、11D5-3-CD828Z对照CAR的BCMA-Fc染色以及UT细胞的BCMA-Fc染色。图是对活淋巴细胞的门控。图中的数字是染色有(顶部数字)或未染色有(底部数字)BCMA-Fc的细胞百分比。
图7A-7B描绘了与表达FHVH33-CD8BBZ的T细胞(B)相比，该CAR在UT细胞(A)中的表达。图是对活的CD3+淋巴细胞的门控。图中的数字是BCMA-PE+(顶部)和BCMA-PE-(底部)的百分比。
图7C-7F描绘了实验数据，其阐明了如通过CD107a染色所评估的，用FHVH33-CD8BBZ转导的T细胞以BCMA特异性方式脱粒。数据显示，与FHVH33+BCMA-K562细胞(E)和FHVH33+NGFR-K562细胞(F)中CD107a的上调相比，UT+BCMA-K562(C)细胞和UT+NGFR-K562细胞(D)中CD107a的上调。使用与图7A-7B所呈现的相同的T细胞培养物。图是对活的CD3+淋巴细胞的门控。图中的数字是CD107a+(顶部)和CD107a-(底部)的百分比。
图7G描绘了实验数据，其阐明了表达CAR的T细胞以BCMA特异性方式产生IFNγ。当T细胞与BCMA+细胞系BCMA-K562和RPMI8226一起培养时，释放出大量的IFNγ。Y轴代表中IFNγ的量(pg/mL)。X轴代表实验中所使用的靶细胞。
图8是显示与靶原代人骨髓瘤骨髓细胞(黑色条)或对照靶PBMC(灰色条)共培养后，未转导(UT)或用FHVH33-CD828Z或FHVH33-CD8BBZ CAR转导的T细胞分泌的IFNγ的量(pg/ml)的图。
图9A是阐明了小鼠中FHVH33-CD8BBZ T细胞的剂量滴定的示意图。给雌性(F)、7-8周(wk)龄NSG小鼠皮内(i.d.)注射800万(M)RPMI8226细胞，并允许肿瘤生长10天。在第0天，小鼠接受静脉内(IV)输注的各种数量的表达FHVH33-CD8BBZ的T细胞。每三天(d)测量一次肿瘤。
图9B是显示在CAR T细胞输注后的指定天数，在如图9A所示用0.2×106个(实心三角形)、0.7×106个(实心圆)或2.2×106个(空心圆)表达FHVH33-CD8BBZ的T细胞治疗的小鼠中测量的肿瘤体积(mm3)的图在。未治疗的小鼠用空心三角形表示。
图9C是显示在CAR T细胞输注后的指定天数，在用0.2×106个(实心三角形)、0.7×106个(实心圆)或2.2×106个(空心圆)表达FHVH33-CD8BBZ的T细胞治疗后的图9B中所示的小鼠的存活百分比的图。未治疗的小鼠用空心三角形表示。
图10A是显示在CAR T细胞输注后的指定天数，在用表达SP6-CD828Z(三角形)、11D5-3-CD8BBZ(正方形)、FHVH33-CD8BBZ(空心圆)或FHVH33-CD828Z(实心圆)CAR的T细胞治疗的小鼠中测量的肿瘤体积(mm3)的图。未经治疗的小鼠以菱形表示。
图10B是显示在CAR T细胞输注后的指定天数，在用表达SP6-CD828Z(三角形)、11D5-3-CD8BBZ(正方形)、FHVH3用表达SP6-CD828Z(三角形)、11D5-3-CD8BBZ(正方形)、FHVH33-CD8BBZ(空心圆)或FHVH33-CD828Z(实心圆)CAR的T细胞治疗的小鼠的存活百分比的图。未经治疗的小鼠以菱形表示。
发明详述
本发明的实施方案提供了CAR，其包含抗原识别结构域、TM结构域和T细胞激活结构域的，其中所述CAR对BCMA具有抗原特异性。CAR是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导或T细胞激活结构域相连的抗体的抗原识别结构域。利用单克隆抗体的抗原结合特性，CAR具有以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工而识别抗原的能力，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR不会有利地与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚。
本发明的CAR对B细胞成熟抗原(BCMA，也被称为CD269)具有抗原特异性。BCMA是肿瘤坏死因子受体超家族的成员(参见，例如，Thompson等人，J.Exp.Medical，192(1)：129-135(2000)，和Mackay等人，Annu.Rev.Immunol.，21：231-264(2003))。BCMA结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)(参见，例如，Mackay等人，同上，和Kalled等人，Immunological Reviews，204：43-54(2005))。在非恶性细胞中，据报道BCMA主要在浆细胞和成熟B细胞的亚群中表达(参见，例如，Laabi等人，EMBO J.，11(11)：3897-3904(1992)；Laabi等人，Nucleic Acids Res.，22(7)：1147-1154(1994)；Kalled等人，同上；O'Connor等人，J.Exp.Medical，199(1)：91-97(2004)；和Ng等人，J.Immunol.，173(2)：807-817(2004))。BCMA RNA已在多发性骨髓瘤细胞中普遍检测到，并且多位研究者已在来自多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面上检测到BCMA蛋白(参见，例如Novak等人，Blood，103(2)：689-694(2004)；Neri等人，Clinical Cancer Research，13(19)：5903-5909(2007)；Bellucci等人，Blood，105(10)：3945-3950(2005)；和Moreaux等人，Blood，103(8)：3148-3157(2004)。还在霍奇金氏淋巴瘤细胞的表面上检测到BCMA的表达(参见，例如，Chiu等人，Blood，109(2)：729-739(2007))。人BCMA具有SEQ ID NO：42的氨基酸序列。
如本文所用的，短语“具有抗原特异性”和“引起抗原特异性应答”意指CAR可以与抗原特异性结合并且在免疫识别抗原，使得CAR与抗原的结合引起免疫应答。
本发明的CAR可以提供多种优点中的任何一种或多种。例如，本发明的CAR可以提供降低的抗CAR免疫原性。包含非人结构域(例如，小鼠结构域)和人工连接子肽中的一个或两个的CAR可以在施用于患者后引发抗CAR免疫应答。这样的抗CAR免疫应答可减少表达CAR的细胞的持久性，并降低或消除CAR疗法的有效性。不受特定理论或机制的束缚，相信本发明CAR的以下特征中的任何一个或多个可以减少或消除抗CAR免疫原性的潜在来源：(i)CAR的所有结构域都是人的；(ii)CAR不包含人工连接子肽，例如长度为约10至约25个氨基酸残基并且由甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的任何一种或多种组成的连接子肽；(iii)CAR不包含抗体轻链可变区；并且(iv)抗原识别结构域包含不多于一个抗体重链可变区。据信减少或消除抗CAR免疫原性的潜在来源改善表达CAR的细胞的持久性和CAR疗法的有效性。此外，前述特征(ii)-(iv)中的任何一个或多个可以促进制备靶向除BCMA之外的一种或多种不同抗原(BCMA以外的抗原)的CAR。
与传统CAR相比，本发明的CAR可以具有较小的抗CAR免疫原性。传统CAR可能具有以下特征中的任何一个或多个：(i)并非传统CAR的所有结构域都是人的；(ii)传统CAR包含人工连接子肽，例如具有长度为约10至约25个氨基酸残基并且由甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的任何一种或多种组成的连接子肽；(iii)传统CAR包含抗体轻链可变区(以下称为“传统CAR”)。
如果与对传统CAR的免疫应答相比，对本发明CAR的免疫应答在数量或质量上有所降低，则根据本发明，抗CAR免疫原性降低。抗CAR免疫原性的定量降低包括抗CAR免疫应答的量级或程度的降低。抗CAR免疫原性的量级或程度可以基于许多已知参数来测量，例如细胞因子(例如，CAR特异性细胞因子)产生水平(细胞因子浓度)的降低、激活(例如，淋巴细胞(例如，CAR特异性淋巴细胞)的增殖)或募集的淋巴细胞的数量的减少、和/或抗体(CAR特异性抗体)的产生(抗体浓度)的降低、宿主(受体)T细胞杀死表达CAR的T细胞的能力降低等。抗CAR免疫原性的定性降低包括抗CAR免疫应答的性质的任何变化，这使得抗CAR免疫应答在介导CAR的细胞毒性活性降低方面效率较低。测量抗CAR免疫原性的方法是本领域已知的。例如，测量产生的细胞因子的类型和水平可以测量抗CAR免疫原性。抗CAR免疫原性降低的特征可能在于与传统的CAR获得特征相比，细胞因子(例如IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B中的任何一种或多种)的产生减少，和/或细胞介导的抗CAR免疫应答的刺激降低(如特异性针对本发明的CAR的T细胞和/或巨噬细胞的增殖和激活减少)。抗CAR免疫原性降低的特征在于抗CAR T细胞刺激降低、抗CAR T细胞增殖减少、抗CAR T细胞IFNγ和/或颗粒酶B分泌减少以及宿主T细胞杀死表达CAR的T细胞的能力降低中的任何一个或多个。抗CAR免疫原性的定性和定量降低可以同时发生，并且不会相互排斥。如本文中所使用的，短语“抗CAR免疫原性”是指针对CAR本身的免疫应答，而不是针对CAR可以提供的针对靶抗原BCMA的免疫应答的任何方面。
CAR包含抗原识别结构域。抗原识别域识别并结合BCMA。在本发明的实施方案中，抗原识别结构域包含人抗BCMA抗体的重链可变区。完整抗体通常由四个多肽组成：重链(H)多肽的两个相同拷贝和轻链(L)多肽的两个相同拷贝。每条重链含有一个N末端可变(VH)区和三个C末端恒定(CH1、CH2和CH3)区，并且每条轻链含有一个N末端可变(VL)区和一个C末端恒定区(CL)地区。VH和VL区具有相同的总体结构，其中每个区包含序列相对保守的四个框架区。框架区通过三个互补决定区(CDR)(即CDR1、CDR2和CDR3)连接。但是，如上所解释的，在本发明的实施方案中，CAR不包含抗体轻链可变区。因此，在本发明的实施方案中，抗原识别结构域包含不超过一个抗体重链可变区。
在实施方案中，抗原识别结构域包含人抗BCMA抗体的重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区。就这一点而言，在本发明的实施方案中，抗原识别结构域可以包含：
(a)包含SEQ ID NO：1的重链CDR1区、包含SEQ ID NO：2的重链CDR2区和包含SEQID NO：3的重链CDR3区(FHVH74重链可变区的CDR区)中的一个或多个；
(b)包含SEQ ID NO：4的重链CDR1区、包含SEQ ID NO：5的重链CDR2区和包含SEQID NO：6的重链CDR3区(FHVH32重链可变区的CDR区)中的一个或多个；
(c)包含SEQ ID NO：7的重链CDR1区、包含SEQ ID NO：8的重链CDR2区和包含SEQID NO：9的重链CDR3区(FHVH33重链可变区的CDR区)中的一个或多个；或
(d)包含SEQ ID NO：10的重链CDR1区、包含SEQ ID NO：11的重链CDR2区和包含SEQID NO：12的重链CDR3区(FHVH93重链可变区的CDR区)中的一个或多个。
优选地，抗原识别结构域包含(a)全部SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列；(b)全部SEQID NO：4-6的氨基酸序列；(c)全部SEQ ID NO：7-9的氨基酸序列；或(d)全部SEQ ID NO：10-12的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，抗原识别结构域包含人抗BCMA抗体的重链可变区。就这一点而言，抗原识别结构域可以包含以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：13(FHVH74重链可变区)、(b)SEQ ID NO：14(FHVH32重链可变区)、(c)SEQ ID NO：15(FHVH33重链可变区)、或(d)SEQ ID NO：16(FHVH93重链可变区)。
在本发明的实施方案中，抗原识别结构域不包含连接子肽。传统CAR的抗原识别结构域可能由单链可变片段(scFv)组成。scFv是包括通过人工连接子肽连接的Fv片段的两个结构域(即VL和VH)的单价分子，所述人工连接子肽使两个结构域能够合成为单多肽链。本发明的CAR的以下特征中的任何一个或多个可以有利地减少或消除连接CAR的不同成分的潜在免疫原性连接(例如，传统CAR中利用的将连接子肽与scFv的VL和VH连接的两个潜在免疫原性连接)：(i)缺少连接子肽，例如传统CAR中利用的scFv中常见的连接子肽，(ii)缺乏抗体轻链可变区(传统CAR中也利用)以及(iii)存在不多于一个抗体重链可变区。连接和连接子肽可以是免疫原性的，因为它们是人体内通常不存在的人工序列。可替代地或另外地，前述特征(i)-(iii)中的任何一个或多个可以消除肽类似物和抗体轻链可变区中一个或两个中的任何潜在的免疫原性区。连接子肽的目的通常是在两个其他肽或蛋白质之间(例如，在抗体重链和抗体轻链之间)形成柔性连接。连接子肽可以是任何长度，并且许多包含任何氨基酸序列。在本发明的实施方案中，连接子肽的长度可以为约5至约100个氨基酸残基、约8至约75个氨基酸残基，约8至约50个氨基酸残基、约10至约25个氨基酸残基、约8至约30个氨基酸残基、约8至约40个氨基酸残基、或约8至约50个氨基酸残基。在本发明的实施方案中，抗原识别结构域不包含长度为约8至约40个氨基酸残基的连接子肽。例如，连接子肽可包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸中的任何一种或多种，或由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸中的任何一种或多种组成，具有或不具有其他氨基酸残基。在本发明的实施方案中，抗原识别结构域不包含长度为约8至约40个氨基酸残基并且由甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的任何一个或多个组成的连接子肽。
在另一个实施方案中，本发明的CAR包含前导结构域。前导结构域可以位于抗原识别结构域(例如，抗BCMA抗体的重链可变区)的氨基末端。前导结构域可以包含任何合适的前导序列。优选地，前导结构域是人的前导结构域。在一个实施方案中，前导结构域是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体序列或人CD8α前导序列。
在另一个实施方案中，CAR包含铰链结构域。本领域普通技术人员将理解，铰链结构域是有利于抗体灵活性的氨基酸的短序列(参见，例如，Woof等人，Nat.Rev.Immunol.，4(2)：89-99(2004))。铰链结构域可以位于抗原识别结构域和T细胞激活结构域之间。铰链结构域可包含来源于或获自任何合适的分子的任何合适的序列。优选地，铰链结构域包含人序列。在一个实施方案中，例如，铰链结构域是人CD8α分子或人CD28分子的一部分。
CAR可以包含TM结构域。TM结构域可以是来源于或获自本领域已知的任何分子的任何TM结构域。优选地，TM结构域是人TM结构域。例如，TM结构域可以包含人CD8α分子或人CD28分子的TM结构域。CD8是TM糖蛋白，其可作为T细胞受体(TCR)的共受体并且主要在细胞毒性T细胞的表面上表达。CD8最常见的形式是由CD8α链和CD8β链组成的二聚体。CD28在T细胞上表达，并提供T细胞激活所需的共刺激信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的受体。
CAR可以包含T细胞激活结构域。T细胞激活结构域可以包含细胞内(即细胞质的)T细胞信号传导结构域。细胞内T细胞信号传导结构域可获自或来源于CD28分子、CD3ζ分子、Fc受体γ(FcRγ)链、CD27分子、OX40分子、4-1BB分子、T细胞可诱导共刺激蛋白(ICOS)、或本领域已知的其他细胞内信号传导分子、或前述任何一种的修饰形式。如上所讨论的，CD28是在T细胞共刺激中重要的T细胞标志物。CD3ζ与TCR相关联以产生信号，并含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。4-1BB(也被称为CD137)将有效的共刺激信号传递给T细胞，促进T淋巴细胞的分化并增强T淋巴细胞的长期存活。ICOS是在激活的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子。在优选的实施方案中，CD28、CD3ζ、FcRγ、ICOS、4-1BB、OX40和CD27是人的。
本发明的CAR可以以任何组合包含前述TM结构域中的任何一个以及前述细胞内T细胞信号传导域中的任何一个或多个。例如，本发明的CAR可以包含CD28和CD3ζ的CD8αTM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。可替代地，例如，本发明的CAR可包含CD3ζ和4-1BB的CD8αTM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明的CAR可以包含ICOS和CD3ζ的CD8αTM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含从氨基末端到羧基末端的人CD8α前导结构域、人抗BCMA抗体重链可变区、人CD8β分子的铰链和跨膜区、人CD28分子的细胞质T细胞信号传导结构域、以及人CD3ζ分子的细胞质T细胞信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明的CAR从氨基末端到羧基末端包括人CD8α前导结构域、人抗BCMA抗体重链可变区、人CD8α分子的铰链和跨膜区、人4-1BB分子的细胞质T细胞信号传导结构域、以及人CD3ζ分子的细胞质T细胞信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明的CAR从氨基末端到羧基末端包含人CD8α前导结构域、人抗BCMA抗体重链可变区、人CD8α分子的铰链和跨膜区、人ICOS分子的细胞质T细胞信号传导结构域、以及人CD3ζ分子的细胞质T细胞信号传导结构域。本发明的另外的实施方案提供了包含SEQ ID NO：17-28中任一个的氨基酸序列的CAR，由SEQID NO：17-28中任一个的氨基酸序列组成的CAR或基本上由SEQ ID NO：17-28中任一个的氨基酸序列组成的CAR。SEQ ID NO：17-28的CAR的组分在下表A中列出。
表A
在本发明的实施方案中，CAR的所有结构域都是人的。就这一点而言，所有前导结构域、铰链结构域、抗原识别结构域、TM结构域和T细胞激活结构域都是人的。因此，与包括非人前导结构域、非人铰链结构域、非人抗原识别结构域、非人TM结构域和非人T细胞激活结构域中的任何一个或多个的CAR相比，本发明的CAR可以有利地具有如本文关于本发明的其他方面所述的降低的抗CAR免疫原性。
包括在本发明的范围内的是本文所描述的发明的CAR的功能部分。当关于CAR使用时，术语“功能部分”是指本发明CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留了其一部分(亲本CAR)的CAR的生物学活性。功能部分包括例如CAR的那些部分，其保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞、或检测、治疗或预防疾病的能力。关于亲本CAR，功能部分可以包含例如亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能部分可在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中未被发现。期望地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更期望地，与亲本CAR的生物学活性相比，另外的氨基酸增强生物学活性。
包括在本发明范围内的是本文所描述的本发明CAR的功能变体。如本文所用，术语“功能性变体”是指具有与亲本CAR基本或显著的序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，该功能性变体保留了其为变体的CAR的生物学活性。功能性变体包括例本文所述的CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度地识别靶细胞的能力。关于亲本CAR，功能变体可以例如与亲本CAR的氨基酸序列至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约98％或更多相同。
功能性变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。可替代地或另外地，功能性变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，非保守氨基酸取代优选不干扰或抑制功能变体的生物学活性。非保守氨基酸取代可增强功能变体的生物学活性，使得与亲本CAR相比，功能变体的生物学活性增加。
本发明CAR的氨基酸取代优选是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代在本领域中是已知的，并且包括其中将具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸交换为具有相同或相似的化学或物理性质的另一个氨基酸的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸被另一个酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)取代，具有非极性侧链的氨基酸被另一个氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)取代，碱性/带正电的极性氨基酸被另一个碱性/带正电的极性氨基酸(例如Lys、His、Arg等)取代，具有极性侧链的不带电荷的氨基酸被另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)取代，具有β分支侧链的氨基酸被另一个具有β分支侧链的氨基酸(例如Ile、Thr和Val)，具有芳香族侧链的氨基酸被另一个具有芳香族侧链氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)取代等。
CAR可以基本上由本文所述的特定氨基酸序列组成，使得其他组分(例如其他氨基酸)不会实质性地改变功能性变体的生物学活性。
本发明的实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以具有任何长度，即可以包含任何数目的氨基酸，条件是CAR(或其功能部分或功能变体)保持它们的生物学活性，例如与抗原特异性结合、检测哺乳动物中患病细胞、或治疗或预防哺乳动物疾病的能力等。例如，CAR的长度为约50至1000个氨基酸，诸如长度为50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。
本发明的实施方案的CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可以包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式3-和反式4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基赖氨酸、N'，N'-二苄基赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫键环化或转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚化或缀合。
本发明实施方案的CAR(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。可以通过任何合适的制备多肽或蛋白质的方法来制备CAR。例如，可以使用标准重组方法使用本文所述的核酸重组产生CAR。参见，例如，Green和Sambrook，分子克隆：实验室手册，第四版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，2012(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,4th ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2012)。可替代地，本文所述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可以是由公司商业合成的，诸如Synpep(都柏林，CA)、Peptide Technologies Corp.(盖瑟斯堡，MD)和Multiple Peptide Systems(圣地亚哥，CA)。在这方面，本发明的CAR可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
本发明的实施方案还提供了一种核酸，其包含编码本文所述的任何CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列。本发明的核酸可以包含编码本文所述的任何前导结构域、铰链结构域、抗原识别结构域、TM结构域和T细胞激活结构域的核苷酸序列。在本发明的实施方案中，核酸可以包含以下中任一个的核苷酸序列、由以下中任一个的核苷酸序列组成、或基本上由以下中任一个的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：29(FHVH74-CD828Z)、SEQ IDNO：30(FHVH32-CD828Z)、SEQ ID NO：31(FHVH33-CD828Z)、SEQ ID NO：32(FHVH93-CD828Z)、SEQ ID NO：33(FHVH74-CD8BBZ)、SEQ ID NO：34(FHVH32-CD8BBZ)、SEQ ID NO：35(FHVH33-CD8BBZ)、SEQ ID NO：36(FHVH93-CD8BBZ)、SEQ ID NO：37(FHVH74-CD8ICOSZ)、SEQ ID NO：38(FHVH32-CD8ICOSZ)、SEQ ID NO：39(FHVH33-CD8ICOSZ)和SEQ ID NO：40(FHVH93-CD8ICOSZ)。
如本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链、合成或获自(例如，分离和/或纯化)天然来源的，其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸间键(如在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键而不是磷酸二酯)。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，如本文所讨论的，在某些情况下，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或取代可能是合适的。
本发明的实施方案的核酸可以是重组的。如本文中所用的，术语“重组”是指：(i)通过将天然的或合成的核酸部分与可以在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)从上述(i)中所述的那些复制而产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
重组核酸可以是具有非天然存在的序列，或者具有通过序列的两个其他的单独的部分人工组合制成的序列的核酸。该人工组合通常通过化学合成或更普遍地通过核酸的分离的部分的人工操纵，例如通过遗传工程技术(如Green和Sambroo，同上)中描述的那些来实现。可以使用本领结构域已知的方案，基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见例如，Green和Sambroo，同上。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或用于增加在杂交后形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成核酸。可用于产生核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶，5-(羧羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(β-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可替代地，可以从诸如Macromolecular Resources(柯林斯堡,CO)和Synthegen(休斯顿,TX)的公司购买本发明的核酸中的一种或多种。
核酸可以包含任何分离的或纯化的核苷酸序列，其编码任何CAR构建体或其功能部分或功能变体。可替代地，核苷酸序列可以包含简并为任何序列或简并序列的组合的核苷酸序列。
本发明的实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，其包含与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者在严格条件下与本文中所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。“高严格条件”意指核苷酸序列以可检测地比非特异性的杂交更强的量特异性地与靶序列(本文中所述的核酸中的任一种的核苷酸序列)杂交。高严格条件包括将区分具有精确互补的序列的多核苷酸或仅含有来自恰巧具有匹配核苷酸序列的少量较小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列的少量分散的错配的多核苷酸。此类互补的小区域比14-17个或更多个碱基的全长互补序列更易于熔化，并且高严格杂交使得它们易于区分。相对高的严格条件将包括例如，低盐和/或高温条件，如在约50-70℃的温度下提供的约0.02-0.1M NaCl或等价物。此类高严格条件容许很少的核苷酸序列与模板或靶标链之间的错配(如果有的话)，且特别适合检测任何本发明的CAR的表达。通常应理解，通过添加增加量的甲酰胺可以使条件更加严格。
本发明还提供了核酸，其包含与本文中所述的任何核酸至少约70％或更多，例如，约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的核苷酸序列。
在实施方案中，可以将本发明的核酸掺入至重组表达载体内。就这一点而言，本发明的实施方案提供了包含任何本发明的核酸的重组表达受体。为了本文中的目的，术语“重组表达载体”意指遗传改良的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下使载体与细胞接触时，所述构建体允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本发明的载体总体上并非是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达受体可以包含任何类型的核苷酸，所述核苷酸包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键，或两种类型的键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间键不阻碍载体的转录或复制。
在实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括被设计用于增殖和扩增，或用于表达或二者的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自：pUC系列(Fermentas LifeSciences,格伦伯尼,MD)、pBluescript系列(Stratagene,拉由拉市,CA)、pET系列(Novagen,麦迪逊,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,乌普萨拉,瑞典)和pEX系列(Clontech,帕洛阿尔托,CA)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达受体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达受体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如，逆转录病毒载体(例如γ逆转录病毒载体)或慢病毒载体。
在实施方案中，可以使用例如，Sambrook和Green(同上)中所描述的标准的重组DNA技术制备本发明的重组表达受体。环状的或线性的表达受体的构建体可被制备为含有原核或真核宿主细胞中的复制系统功能。复制系统可以来源于例如，ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
视情况而定，并且考虑载体是否为基于DNA或基于RNA的，重组表达载体可以包含特异性针对载体所引入的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)类型的调控序列，如转录和翻译的起始和终止密码子。重组表达载体还可以包含限制位点以促进克隆。除了编码CAR的本发明核酸序列外，提供了用于核酸序列在宿主细胞中的表达的重组表达载体优选包含表达控制序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。
重组表达载体可以包括一个或多个标志基因，其允许选择转化的或转染的宿主细胞。标志基因包括杀生物剂抗性(例如，对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷性宿主中的互补性，以提供原养型等。本发明的表达载体的合适的标志基因包括例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包含天然的或非天然的启动子，其与编码CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列可操作地连接，或者与编码CAR的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。选择例如强的、弱的、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的启动子，在技术人员的普通技能范围之内。类似地，将核苷酸序列与启动子组合也在技术人员的技能范围之内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子，或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
本发明的重组表达受体可被设计用于瞬时表达、稳定表达或二者。同样，重组表达受体可被制备为用于组成型表达或用于可诱导型表达。
此外，重组表达受体可被制备为包括自杀基因。如本文中所用的，术语“自杀基因”是指造成表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是赋予其中基因被表达的细胞对试剂(例如药物)的敏感性并当细胞与试剂接触或暴露至试剂时造成细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的，并且包括例如单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(daminase)、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
本发明的实施方案还提供了包含本文中所述的任何重组表达载体的宿主细胞。如本文中所用的，术语“宿主细胞”是指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如，植物、动物、真菌或藻类)或者可以是原核细胞(例如，细菌或原生动物)。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞(即直接从例如人的生物体分离的)。宿主细胞可以是粘附细胞或悬浮细胞(即悬浮生长的细胞)。合适的宿主细胞是本领域已知的，并且包括例如，DH5α大肠杆菌(E.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞可以是原核细胞，例如，DH5α细胞。为了产生重组CAR构建体的目的，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。宿主细胞可以为任何细胞类型、可以源于任何类型的组织，并且可以为任何发育阶段。宿主细胞可以为外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。
在本发明的实施方案中，宿主细胞是T细胞。为了本文中的目的，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如，Jurkat、SupT1等，或者获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，则T细胞可以获自众多来源，包括但不限于：血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他的组织或流体。还可以富集或纯化T细胞。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是从人分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以为任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞等。T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
在本发明的实施方案中，宿主细胞是自然杀伤(NK)细胞。NK细胞是一种在先天免疫系统中起作用的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞被定义为大粒状淋巴细胞，并构成与普通淋巴细胞祖细胞分化的第三种细胞，后者也产生B淋巴细胞和T淋巴细胞(参见，例如Immunobiology，第9版，Janeway等人编辑，Garland Publishing,New York,NY(2016))。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化并成熟。成熟后，NK细胞作为具有独特细胞毒性颗粒的大淋巴细胞进入循环系统。NK细胞能够识别并杀死某些异常细胞(诸如例如某些肿瘤细胞和病毒感染的细胞)，并且被认为在针对细胞内病原体的先天免疫防御中很重要。如上文关于T细胞所述，NK细胞可以是任何NK细胞，例如培养的NK细胞，例如原代NK细胞，或来自培养的NK细胞系的NK细胞，或获自哺乳动物的NK细胞。如果从哺乳动物获得，则NK细胞可以从许多来源获得，包括但不限于：血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他的组织或流体。还可以富集或纯化NK细胞。NK细胞优选是人NK细胞(例如，从人分离的)。NK细胞系可从美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC，马纳萨斯，VA)获得，并且包括例如NK-92细胞(ATCC CRL-2407)、NK92MI细胞(ATCC CRL-2408)及它们的衍生物。
本发明的实施方案还提供了包含本文中所述的至少一种宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异源群体，其除了包含至少一种其他的细胞(例如，不包含任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞))，或者除T细胞外的细胞(例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等)，还包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞。可替代地，细胞群可以是基本上同源的群体，其中所述群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。所述群体也可以是克隆细胞群，其中所述群体中的所有细胞均是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得所述群体中的所有细胞均包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含含有如本文中所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
可以通过“转染”、“转化”或“转导”将编码CAR的本发明的重组表达载体引入细胞。本文所用的“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞。许多转染技术是本领域已知的并且包括，例如，磷酸钙DNA共沉淀；和DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击；与磷酸锶DNA共沉淀。在感染性颗粒在合适的包装细胞中生长后，可以将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞，其中许多是可商购的。
本发明的范围包括缀合物(例如生物缀合物)，其包含任何本发明的CAR(包括其任何功能部分或变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞或宿主细胞群。缀合物以及通常合成缀合物的方法是本领域已知的。
可以分离和/或纯化本发明的CAR(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体和宿主细胞(包括其群体)(其所有在下文中统称为“本发明的CAR物质”)。如本文中所用的，术语“分离的”意指已经从其天然环境中移出。术语“纯化的”或“分离的”不需要绝对的纯化或分离；相反，其旨在作为相对的术语。因此，例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制备物是其中宿主细胞比体内它们天然环境中的细胞更纯的制备物。可以例如通过标准纯化技术产生此类宿主细胞。在一些实施方案中，纯化了宿主细胞的制备物，使得宿主细胞代表制备物的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以为至少约50％，可以大于约60％、约70％或约80％，或者可以为约100％。
可以将本发明的CAR物质配制成组合物(如药物组合物)。就这一点而言，本发明的实施方案提供了药物组合物，其包含任何的CAR、功能部分、功能变体、核酸、表达载体或宿主细胞(包括其群体)以及药学上可接受的载体。本发明的含有任何本发明的CAR物质的药物组合物可以包含多于一种本发明的CAR物质，例如，CAR和核酸，或两种或更多种不同的CAR。可替代地，药物组合物可以包含本发明的CAR物质与其他的药学活性试剂或药物的组合，所述其他的药学活性试剂或药物如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。在优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。
优选地，载体是药学上可接受的载体。关于药物组合物，考虑的用于特定的本发明CAR物质的载体可以是任何常规使用的那些。此类药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的，并且容易为公众获取。优选地，药学上可接受的载体是在使用条件下不具有有害副作用或毒性的药学上可接受的载体。
载体的选择将部分由特定的本发明的CAR物质以及用于施用本发明的CAR物质的特定方法决定。在优选的实施方案中，CAR由宿主细胞表达(其优选为T细胞或NK细胞)，并且将表达CAR的宿主细胞施用于患者。这些细胞相对于细胞受体可以是自体的或同种异体的。可以通过多种遗传修饰方法中的任一种将编码CAR的核酸引入细胞，所述方法包括但不限于用γ-逆转录病毒，慢病毒或转座子系统进行转导。本发明的药物组合物有多种合适的制剂。合适的制剂可以包括用于肠胃外、皮下、静脉内、肌内、肿瘤内、动脉内、鞘内或腹膜内施用的那些中的任一种。可以使用多于一种的途径来施用本发明的CAR材料，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的应答。
优选地，通过注射(例如，静脉内)施用本发明的CAR构建体物质。优选地，静脉内施用本发明的CAR物质。当本发明的CAR材料是表达本发明的CAR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射细胞的合适的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如例如，生理盐水(约0.90％w/v的NaCl的水溶液、约300mOsm/L NaCl的水溶液，或每升水约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,芝加哥,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,迪尔菲尔德,IL)、约5％葡萄糖的水溶液，或林格氏乳酸盐。在实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清白蛋白。
组合物可以采用随时间释放的、延迟释放和持续释放的递送系统，使得本发明的组合物的递送发生在待治疗的部位致敏之前，并且有足够的时间引起待治疗的部位致敏。许多类型的释放递送系统是可用的，并且是本领域普通技术人员已知的。这样的系统可以避免重复施用组合物，从而增加了对象和医师的便利性，并且可以特别适合于本发明的某些组合物实施方案。
不受特定理论或机制的束缚，据信通过引发针对BCMA的抗原特异性应答，本发明的CAR提供了以下中一种或多种：靶向并破坏表达BCMA的癌细胞、减少或消除癌细胞、促进免疫细胞向肿瘤部位的浸润、以及增强/扩展抗癌应答。
预期本发明的CAR材料可被用于治疗或预防哺乳动物疾病(例如癌症)的方法中。不受特定理论或机制的束缚，本发明的CAR具有生物学活性(例如识别抗原例如BCMA的能力)，使得当CAR被细胞表达时能够介导针对表达抗原(CAR特异性针对的BCMA)的细胞的免疫应答。就这一点而言，本发明的实施方案提供了治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效治疗或预防哺乳动物癌症的量的本发明的任何CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和/或药物组合物。在优选的实施方案中，该方法包括向哺乳动物输注用本发明的CAR转导的宿主细胞。
可将一种或多种表达本文所述的本发明的BCMA CAR的分离的宿主细胞与离体、体内或体外表达BCMA的癌细胞群接触。“离体”是指在生物体外部的人工环境中在细胞或组织内或细胞或组织上进行的方法，其自然条件的改变最小。相反，术语“体内”是指在处于它们的正常、完整状态的活生物体中进行的方法，而“体外”方法是使用已从其常规生物学环境中分离出的生物体组分进行的。本发明的方法优选地涉及离体和体内组分。就这一点而言，例如，上述分离的宿主细胞可以在表达本发明的抗BCMA CAR的条件下离体培养，然后直接转移到受BCMA阳性癌症(例如多发性骨髓瘤)影响的哺乳动物(优选人)中。此类细胞转移方法在本领域中被称为“过继性细胞转移(ACT)”，其中免疫来源的细胞被转移到受体中以将免疫来源的细胞的功能转移到宿主。免疫来源的细胞可能起源于受体或另一个体。过继性细胞转移方法可用于治疗各种类型的癌症，包括血液癌症(例如骨髓瘤)。
一旦将包含表达本发明的编码CAR的核酸序列的宿主细胞的组合物或包含本发明的编码CAR的核酸序列的载体施用于哺乳动物(例如人)，CAR的生物学活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量。根据本发明的方法，CAR与癌症上的BCMA结合，并且癌细胞被破坏。可以使用本领域已知的任何合适的方法来测定CAR与癌细胞表面上的BCMA的结合，包括例如ELISA(酶联免疫吸附测定)和流式细胞术。可以使用本领域已知的任何合适方法来测量CAR破坏细胞的能力，诸如在例如Kochenderfer等人，J.Immunotherapy，32(7)：689-702(2009)以及Herman等人，J.Immunological Methods，285(1)：25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法。CAR的生物学活性也可以通过测定某些细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达来测量。
本发明的实施方案进一步包括在施用本发明的CAR材料之前对哺乳动物进行淋巴细胞耗尽(lymphodepleting)。淋巴细胞耗尽的实例包括但可能不限于：非清髓性淋巴细胞耗尽性化学疗法(nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy)、清髓性淋巴细胞耗尽性学疗法、全身辐照等。
为了本发明方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群，所述细胞可以是对哺乳动物是同种异体或自体的细胞。优选地，细胞对于哺乳动物是自体的。
“有效量”或“有效治疗的量”是指足以预防或治疗个体的癌症的剂量。对于治疗或预防用途有效的量将取决于例如，患者的正在治疗的疾病或病症的阶段和严重程度、年龄、体重和总体健康状况，以及处方医生的判断。剂量的大小还将取决于所选的特定CAR物质、施用的方法、施用的时间和频率、可能伴随特特定CAR物质施用的任何不良副作用的存在、性质和程度，以及期望的生理效应。本领域技术人员将理解，不同的疾病或病症(例如癌症)可能需要涉及多次施用的延长的治疗，可能在每轮或不同轮的施用中使用本发明的CAR物质。通过实例的方式并且不旨在限制本发明，本发明的CAR物质的性剂量可以是约0.001至约1000mg/kg正治疗的对象的体重/天、约0.01至约10mg/kg体重/天、约0.01mg至约1mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，所述剂量可以是约1×104至约1×1010个表达本发明的CAR的细胞/kg体重。当本发明的CAR材料是宿主细胞时，宿主细胞的示例性剂量可以是最少一百万个细胞(1mg细胞/剂量)，例如1×109个细胞/kg体重。当本发明的CAR物质是包装在病毒中的核酸时，病毒的示例性剂量可以是1ng/剂量。
为了本发明的目的，施用的本发明的CAR物质的量或剂量应当足以经合理的时间范围影响对象或动物的治疗或预防应答。例如，本发明的CAR物质的剂量应足以在从施用时间起约2小时或更长的时期(例如，约12至约24小时或更多小时)内与抗原结合或检测、治疗或预防疾病(例如癌症)。在某些实施方案中，时间段可能甚至更长。剂量将由特定的本发明的CAR物质的功效和动物(例如，人)的状况，以及待治疗的动物(例如，人)的体重来决定。
为了本发明的目的，可以使用测定来确定待施用给哺乳动物的起始剂量，所述测定包括例如，比较在向每个施用了不同的剂量的T细胞的一系列哺乳动物中的哺乳动物施用给定剂量的此类T细胞后，靶细胞裂解和/或表达所释放的本发明的CAR的T细胞分泌IFN-γ的程度。可以通过本领域已知的方法来测定在施用某一剂量后靶细胞溶解和/或分泌IFN-γ的程度。
当将本发明的CAR物质与一种或多种另外的治疗剂一起施用时，可以向哺乳动物施用一种或多种另外的治疗剂。“共施用”意指在时间上足够接近地施用一种或多种另外的治疗剂和本发明的CAR物质，使得本发明的CAR物质可以增强一种或多种另外的治疗剂的效应，或者反之亦然。就这一点而言，可以首先施用本发明的CAR物质，其次施用一种或多种另外的治疗剂，或者反之亦然。可替代地，可以同时施用本发明的CAR物质和一种或多种另外的治疗剂。可以与CAR物质共施用的示例性的治疗剂是IL-2。据信，IL-2增强了本发明的CAR物质的治疗效应。不受特定理论或机制的束缚，据信IL-2通过增强表达本发明CAR的细胞的体内扩增数量来增强治疗。
本文中所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文中所用的，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(Rodentia)的哺乳动物(如小鼠和仓鼠)以及兔形目(Logomorpha)的哺乳动物(如兔)。哺乳动物可以来自食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目(Artiodactyla)(包括牛科动物(奶牛)和猪(Swines)(猪))，或者奇蹄目(Perssodactyla)(包括马(Equines)(马))。哺乳动物可以是灵长目(Primates)、卷尾猴科(Ceboids)或猴科(Simoids)(猴)，或者类人猿目(Anthropoids)(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症。在本发明的实施方案中，所述癌症是表达BCMA的癌症。在本发明的实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤。
如本文中所讨论，多发性骨髓瘤(也被称为浆细胞骨髓瘤或卡勒氏病)是浆细胞的癌症，浆细胞是通常负责产生抗体的白细胞的一种类型(Raab等人，Lancet，374：324-329(2009)。多发性骨髓瘤会影响1-4人/100,000人/年。该病在男性中更为常见，并且由于未知的原因，其在非裔美国人中的发病率是高加索美国人的两倍。多发性骨髓瘤是最不常见的血液恶性肿瘤(14％)，占所有癌症的1％(Raab等人，同上)。多发性骨髓瘤的治疗通常包括大剂量化血疗法，然后是造血干细胞移植(同种异体或自体)；但是，在接受过此类治疗的多发性骨髓瘤患者中，复发率很高。如上所讨论的，BCMA在多种骨髓瘤细胞中高度表达(参见，例如，Novak等人，同上；Neri等人，同上；Bellucci等人，同上；以及Moreaux等人，同上)。
霍奇金氏淋巴瘤(以前被称为霍奇金氏病)是免疫系统的癌症，其特征在于存在被称为里德-斯德伯格细胞的多核细胞类型。霍奇金氏淋巴瘤的两种主要类型包括经典霍奇金氏淋巴瘤和以结节性淋巴细胞为主的霍奇金氏淋巴瘤。霍奇金氏淋巴瘤目前用放射疗法、化学疗法或造血干细胞移植治疗，治疗的选择取决于患者的年龄和性别以及疾病的阶段、大块和组织学亚型。已经在霍奇金氏淋巴瘤细胞的表面上检测到BCMA表达(参见，例如，Chiu等人，Blood，109(2)：729-739(2007))。
如本文中所用的，术语“治疗”和“预防”以及由其衍生的词不一定意味着100％的或完全的治疗或预防。而是，存在本领域普通技术人员将其识别为具有潜在的益处或治疗效应的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明的方法可以提供任何量的任何水平的哺乳动物的癌症的治疗或预防。此外，由本发明的方法提供的治疗或预防可以包括对被治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种病况或症状的治疗或预防。同样，为了本文中的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病(例如癌症)或其症状或病况的发作。
本发明的另一个实施方案提供了关于本发明其他方面的本文所描述的任何CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体和/或药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物的癌症的方法中用途。本发明的另一个实施方案提供了关于本发明其他方面的本文所描述的任何CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体和/或药物组合物在制备用于用于治疗或预防哺乳动物的癌症的药物中的用途。癌症可以是本文所述的任何癌症。
例子以下实施例进一步阐示了本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
下文提供了实施例1-10中利用的材料和方法。
细胞系和原代细胞
多发性骨髓瘤BCMA+细胞系H929、U266和RPMI8226获自ATCC。BCMA阴性肺癌细胞系A549获自ATCC。BCMA阴性肉瘤细胞系获自ATCC。
在进行以下实验之前，在实验室中用全长BCMA的基因转导来自ATCC的BCMA-K562细胞和K562细胞。在进行以下实验之前，先在实验室中用低亲和力神经生长因子基因转导NGFR-K562细胞和K562细胞。使用相同的γ逆转录病毒载体和方法转导BCMA-K562和NGFR-K562细胞。
来自六名患有多发性骨髓瘤患者的组织样品或外周血单个核细胞(PMBC)被指定为骨髓瘤患者1-6。从3名患有黑色素瘤对象中使用PBMC，并将供体标记为供体A、供体B和供体C。还获得了来自三名健康供体的原代CD34+造血细胞。使用的所有人类样品均获自美国国家癌症研究所在机构审查委员会批准的临床试验中招募的患者。
构建仅全人类重链(FHVH)的CAR
制备了一系列包含仅全人重链抗原识别(FHVH)结构域的CAR。每种CAR的序列都从5'端到3'端遵循此模式：CD8α前导序列、4种单重链可变区结构域中的一种、人CD8α分子的以及铰链区和跨膜区。然后，加入CD28、4-1BB或T可诱导细胞共刺激(ICOS)分子的细胞质部分，然后加入CD3ζ分子的细胞质部分。这些CARS的完整氨基酸序列在SEQ ID No：17-28中提供。
如图1A-1L中所示，将四种仅全人重链CAR抗原识别结构域指定为FHVH 74、32、33和93。CAR名称还包括CD8α铰链结构域和跨膜结构域、包括的共刺激结构域和CD3ζ结构域。例如，FHVH74-CD828Z具有FHVH74抗原识别结构域、来自CD8α的铰链结构域和跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζT细胞激活结构域。将11D5-3-CD828Z抗BCMA CAR用作阳性对照。
通过标准方法，构建了这些CAR，并将CAR核苷酸序列连接到MSGVγ-反转录病毒载体主链中。CAR的完整核苷酸序列在SEQ ID No：29-40中提供。BCMA特异性可变重链序列被合成为GBLOCK片段(Integrated DNA Technologies(IDT)，斯科基，IL)。每个合成的片段均包含GTC三核苷酸、Ncol位点、CD8α前导序列、FHVH序列，CD8α铰链结构域和跨膜结构域的一部分、Blp1位点和TATCGT六核苷酸(提供为SEQ ID No.41)。加入GTC和TATCGT(SEQ ID NO：41)核苷酸，以确保用NcoI和BlpI的完全末端切割。将片段用BlpI和NCOI-HF(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，伊普斯威奇，MA)在37℃消化2小时。然后使用QIAQUICKPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化消化的片段。将片段连接到经Blpl/Ncol-HF消化和凝胶纯化的MSGV载体骨架中，该骨架也包括GBLOCK片段(Integrated DNA Technologies(IDT)，斯科基，IL)中未包含的CAR的其他成分。
包含在MSGV载体骨架中的CAR成分是：未包含在GBLOCK片段(Integrated DNATechnologies(IDT)，斯科基，IL)中的CD8α结构域的剩余部分、编码共刺激结构域(即CD28或4-1BB或ICOS)的序列，以及CD3ζ结构域。每个GBLOCK(Integrated DNA Technologies(IDT)，斯科基，IL)CAR片段和MSGV载体骨架片段的连接均使用快速DNA连接试剂盒(RocheApplied Sciences)进行。
T细胞的CAR检测
洗涤用一种CAR载体转导的T细胞和未转导的T细胞，并用藻红蛋白标记的BCMA-Fc蛋白染色，以检测细胞表面CAR分子。将五十万个T细胞悬浮在50mL染色缓冲液中，然后加入滴定量的BCMA-Fc-PE试剂。还使用标准方法对CD3、CD4和CD8进行染色。通过使用7-AAD(7-氨基-阿克拉霉素(7-amino-acinomycin)染料，(BD Biosciences))排除死细胞。
T细胞培养
将PBMC解冻并在含有AIM V培养基(Invitrogen，沃尔瑟姆，MA)加5％AB血清(Valley Biomedical，温彻斯特，VA)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的T细胞培养基中洗涤。转导之前，将PBMC以1×106个细胞/mL的浓度悬浮于加入50ng/mL的抗CD3单克隆抗体OKT3(Ortho，布里奇沃特，NJ)和300IU/mL的IL-2T的T细胞培养基中。转导后，将T细胞维持在加IL-2的T细胞培养基中。
γ逆转录病毒转导
为了产生不能复制的γ逆转录病毒，用编码CAR的质粒和编码RD114包膜蛋白的质粒转染包装细胞。在T细胞培养开始后2天进行T细胞的γ-逆转录病毒转导。
干扰素γ和肿瘤坏死因子αELISA
将十万个BCMA+或BCMA阴性的靶细胞与100,000个CAR转导的T细胞在200μL的AIM-V培养基+5％人血清中的96孔圆底板的双孔中混合。将板在37℃下孵育18-20小时。孵育后，使用标准方法(Pierce)进行干扰素γ(INFγ)的ELISA。使用标准方法(R&D)进行肿瘤坏死因子α(TNF)ELISA。
CD107a分析
对于所测试的每种T细胞培养物，制备两个试管。一个管包含BCMA-K562细胞，另一管包含NGFR-K562细胞。两个试管均包含CAR转导的T细胞、1ml AIM-V培养基+5％人AB血清、滴定浓度的抗CD107a抗体(eBioscience，克隆eBioH4A3)和1μL的GOLGI STOP(巴西金叶树苷，BD Biosciences，圣何塞,CA)。将所有试管在37℃下孵育4小时，然后对CD3、CD4和CD8染色。
流式细胞仪
对于抗BCMA染色，将细胞用多克隆生物素标记的山羊抗人BCMA抗体(R&DSystems，目录号BAF 193)染色，然后用链霉亲和素(BD)进行染色。骨髓细胞也用抗CD38(eBioscience)染色。骨髓细胞也用抗CD38(eBioscience)和抗CD56(BD)染色。使用FLOWJO软件(Tree Star,Inc.俄勒冈州,US)进行所有实验的流式细胞仪分析。
增殖测定
在24孔板中建立共培养物。共培养物中包括的靶细胞是0.5×106个辐照的BCMA-K562细胞或0.5×106个辐照的NGFR-K562细胞。共培养物还包括来自已用抗bcma2或SP6转导的培养物的×106个T细胞。如先前所述，用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记T细胞。共培养中使用的培养基是AIM V+5％人AB血清。没有将IL-2添加到培养基中。开始后四天，将每种共培养物中的活细胞用台盼蓝计数以排除死细胞，并进行流式细胞术
细胞毒性测定
通过比较相对于阴性对照CCRF-CEM细胞的存活率的BCMA+靶细胞的存活率的来测量细胞毒性。将这两种细胞类型与用CAR转导的T细胞合并在同一管中。用荧光染料5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基)四甲基罗丹明(CMTMR)(Invitrogen)标记CCRF-CEM阴性对照细胞，并用CFSE标记BCMA+靶细胞。在多个T细胞与靶细胞的比率下，一式两份在无菌5mL试管(BD)中建立共培养物。管中包含的靶细胞是50,000个BCMA+靶细胞以及50,000个CCRF-CEM阴性对照细胞。将培养物在37℃下孵育4小时。孵育后立即添加7AAD(7-氨基放线菌素D)(BD)，并进行流式细胞仪采集。对于每个T细胞加靶细胞培养物，通过将活的BCMA+细胞百分比除以活的CCRF-CEM阴性对照细胞百分比来确定BCMA+靶细胞的存活百分比。通过将每个T细胞加靶细胞培养物中BCMA+靶细胞的存活百分比除以仅含有BCMA+靶细胞与CCRF-CEM而无效应T细胞的管中BCMA+靶细胞的存活百分比与阴性对照细胞的存活百分比的比率来计算的校正BCMA+靶细胞的存活百分比。这种校正对于考虑起始细胞数量的变化和自发靶细胞死亡是必要的。细胞毒性计算如下：BCMA+靶细胞的细胞毒性百分比＝100-BCMA+靶细胞的校正的存活百分比。
体内鼠模型治疗实验
使用了来自杰克逊实验室的NSG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ)。小鼠接受皮内注射的RPMI8226细胞。允许肿瘤生长10天。然后，小鼠接受实施例9(图9B-9C)或实施例10中所述的剂量的用实施例9(图9B-9C)、实施例10中所指示的CAR转导的人T细胞、或未转导人T细胞的静脉内输注。每三天用卡尺测量一次肿瘤。将最长长度和垂直于最长长度的长度相乘以获得以mm2为单位的肿瘤大小(面积)。当最长长度达到15mm时，处死小鼠。动物研究得到了美国国家癌症研究所动物护理和使用委员会(the National CancerInstitute Animal Care and Use Committee)的批准。
实施例1
该实施例证明了具有仅重链抗原识别结构域的CAR的设计。
如图1A-1L所示设计了具有仅人重链抗原识别结构域的十二个CAR。这些CAR从N末端到C末端的一般设计包含：CD8a前导序列、全人重链可变区、CD8a铰链结构域和跨膜结构域、3个共刺激结构域中的一种的细胞质部分、CD3ζ激活结构域的细胞质部分。测试的3个共刺激结构域是CD28、4-1BB和T细胞可诱导共刺激蛋白(ICOS)。该实施例证明了报道具有仅重链抗原识别结构域的第一个的CAR。
实施例2
该实施例证明了R在T细胞的表面上表达的仅重链的CA。
为了进行实验，用图2所示的仅重链的CAR转导来自多发性骨髓瘤(MM)患者的原代人T细胞。通过用BCMA-Fc试剂对细胞进行染色随后通过流式细胞术来评估CAR的表面表达(图2)。如图2所示，所有四个FHVH CAR始终在T细胞表面表达。对于包含轻链可变区又包含重链可变区的11D5-3-CD828Z对照CAR，染色的中值荧光强度稍高，原因不明。
实施例3
该实施例证明了仅重链的CAR以BCMA特异性方式脱粒。
测量了表达图3中所示的四个FHVH CAR和11D5-3-CD828Z CAR中的每一个的T细胞的BCMA特异性脱粒。如图3所示，用每种FHVH CAR转导的T细胞上调CD107a，特异性地应答表达BCMA的靶细胞而不是BCMA阴性靶细胞的刺激(图3)。表达11D5-3的T细胞也上调CD107a(图3)。CD107a的上调证明T细胞的BCMA特异性脱粒，这是穿孔素介导的细胞毒性过程的一部分。
实施例4
该实施例证明了表达仅重链CAR的T细胞以BCMA特异性方式释放细胞因子。
评价了来自MM患者的原代人T细胞在体外与多种靶细胞系培养时释放干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNF)的能力。发现表1-3中所示的所有FHVH CAR分别以高度BCMA特异性的方式释放这些细胞因子，分别如表1-3所示。
表1.干扰素-γELISA
BCMA-K562 RPMI-8226 NGFR-K562 CCRF-CEM 293GP 仅T细胞 ％CAR+
未转导的 39.1 44.4 37.7 17.0 17.0 16.0 0.6
11D5-3-CD828Z 36260.4 1598.7 57.1 28.6 20.0 21.8 68.4
FHVH74-CD828Z 35717.6 2683.3 52.3 21.0 17.8 15.5 61.3
FHVH32-CD828Z 37876.2 3060.9 66.9 29.4 17.3 16.4 55.7
FHVH33-CD828Z 31323.4 4059.5 78.3 17.5 18.5 15.4 60.5
FHVH93-CD828Z 31288.2 3786.0 48.9 20.6 14.7 15.9 52.2
参考表1，用指示的CAR转导培养的T细胞，并与指示的靶细胞(上排)一起培养过夜。过夜孵育后，对培养物上清液进行标准ELISA测定。BCMA-K562和RPMI8226是BCMA+的。NGFR-K562、CCRF-CEM和293GP为BCMA阴性。通过用BCMA-Fc-PE试剂染色，然后通过流式细胞术确定表达所指示的CAR的T细胞的百分比。％CAR+等于用BCMA-Fc-PE试剂染色的每个CAR转导的CD3+细胞的百分比减去用BCMA-Fc-PE试剂染色的未转导的CD3+淋巴细胞的百分比。除％CAR+柱外，所有数字均为pg/mL的干扰素γ。
表2.肿瘤坏死因子αELISA
BCMA-K562 RPMI-8226 NGFR-K562 CCRF-CEM 293GP 仅T细胞 ％CAR+
未转导的 8.8 6.1 8.2 5.7 8.1 6.1 0.6
11D5-3-CD828Z 2219.2 67.6 10.2 7.7 7.1 6.4 68.4
FHVH74-CD828Z 2344.1 107.8 9.3 6.6 9.1 6.1 61.3
FHVH32-CD828Z 2261.6 113.8 9.9 7.0 9.5 6.8 55.7
FHVH33-CD828Z 2161.9 209.9 10.4 6.4 10.2 5.7 60.5
FHVH93-CD828Z 1868.2 200.9 10.0 7.1 8.4 6.2 52.2
参考表2，用所指示的CAR转导培养的T细胞，并与所指示的靶细胞(上排)一起培养过夜。过夜孵育后，对培养物上清液进行标准ELISA测定。BCMA-K562是BCMA+的。所有其他目标均为BCMA阴性。通过用BCMA-Fc-PE试剂染色，然后通过流式细胞术确定表达所指示的CAR的T细胞的百分比。％CAR+等于用BCMA-Fc-PE试剂染色的每个CAR转导的CD3+细胞的百分比减去用BCMA-Fc-PE试剂染色的未转导的CD3+淋巴细胞的百分比。除％CAR+柱外，所有数字均为pg/mL的干扰素γ。
表1和2的结果表明，所指示的CAR特异性识别BCMA+靶细胞。
表3.BCMA+靶细胞的识别
参考表3，用所指示的CAR转导培养的T细胞，并与所指示的靶细胞(上排)一起培养过夜。过夜孵育后，对培养物上清液进行标准ELISA测定。BCMA-K562是BCMA+的。所有其他靶标均为BCMA阴性。通过用BCMA-Fc-PE试剂染色，然后通过流式细胞术确定表达所指示的CAR的T细胞的百分比。％CAR+等于用BCMA-Fc-PE试剂染色的每个CAR转导的CD3+细胞的百分比减去用BCMA-Fc-PE试剂染色的未转导的CD3+淋巴细胞的百分比。除％CAR+柱外，所有数字均为pg/mL的干扰素γ。
表3中的结果表明表达FHVH-CD828Z或FHVH-CD828Z的T细胞特异性识别BCMA+靶细胞。
实施例5
该实施例证明了表达仅重链CAR的T细胞在体外以BCMA特异性方式增殖。
将来自MM患者的CFSE标记的表达CAR的原代T细胞与经辐照的BCMA+靶细胞或BCMA阴性靶细胞一起培养。如图4B-4E所示的，图4B-4E中所示的所有四个FHVH CAR均以BCMA特异性方式增殖。表达11D5-3-CD828Z CAR的T细胞也以BCMA特异性的方式增殖(图4A)。除了通过稀释CFSE记录BCMA特异性增殖外，还可以通过与BCMA+靶细胞一起培养的表达CAR的T细胞绝对数量的增加来证明BCMA特异性增殖。如图4F所示，当T细胞与BCMA+靶细胞一起培养时，CAR+T细胞的绝对数量增加。
实施例6
该实施例证明表达仅重链CAR的T细胞杀死BCMA+靶细胞。
评估了FHVH CAR T细胞杀死BCMA+靶细胞的能力。如图5A和5B中所示，与UT细胞相比，显示出FHVH33-CD828Z和FHVH33-CD8BBZ具有杀死BCMA+RPMI226细胞的能力。
实施例7
该实例证明了具有4-1BB共刺激结构域的仅重链CAR被表达并起作用。
构建并评估了图6所示的具有4-1BB共刺激结构域的四个仅全人重链CAR。所有这四个CAR均在原代人T细胞的表面表达，但FHVH33-CD8BBZ始终具有最高的表达(图6)，因此被选作进一步研究。FHVH33-CD8BBZ功能评估的结果如图7A-7F中所示。这些表达CAR的T细胞产生IFNγ，并以BCMA特异性的方式脱粒。
实施例8
该实施例证实了抗BCMA CAR转导的T细胞识别原发性多发性骨髓瘤细胞。
将未转导的或表达FHVH33-CD828Z或FHVH33-CD8BBZ CAR的T细胞与自体骨髓骨髓瘤细胞(纯度90％)孵育4小时。测量CD107a的上调作为T细胞脱粒的标志，并且还测量CD8或CD4的共表达。具有所指示表型的细胞的百分比示于表4中。如表4所示，用FHVH33-CD828Z或FHVH33-CD8BBZ CAR转导的T细胞在与靶骨髓骨髓瘤细胞共培养后上调了CD107a的表达。
表4
未转导的 FHVH33-CD828Z FHVH33-CD8BBZ
CD107a+/CD4+ 2.3 13.0 50.7
CD107a-/CD4- 0.0 0.0 0.0
CD107a+/CD4- 0.0 0.0 0.0
CD107a-/CD4+ 97.7 87.0 49.3
CD107a+/CD8+ 4.8 27.6 40.0
CD107a-/CD8- 0.0 0.0 0.0
CD107a+/CD8- 0.0 0.0 0.0
CD107a-/CD8+ 95.2 72.4 60.0
将未转导的(UT)或表达FHVH33-CD828Z或FHVH33-CD8BBZ CAR的T细胞与自体骨髓骨髓瘤细胞(纯度90％)或对照PBMC一起孵育过夜。用标准ELISA测定法测量干扰素γ的释放。结果如图8中所示。如图8中所示，在与靶骨髓性骨髓瘤细胞共培养后，用FHVH33-CD828Z或FHVH33-CD8BBZ CAR转导的细胞分泌IFN-γ。
实施例9
该实施例证明了在小鼠中表达FHVH33-CD8BBZ的T细胞的剂量滴定。
如图9A中所示，向NSG小鼠皮内注射RPMI8226细胞。允许肿瘤生长10天。在第0天，小鼠接受所指定数目的表达FHVH33-CD8BBZ的T细胞的静脉内输注。小鼠接受了三种不同剂量的FHVH33-CD8BBZ CAR T细胞之一，而另一组小鼠则未经治疗。小鼠在T细胞输注时均已建立了肿瘤。
如图9B中所示，2.2×106个FHVH33-CD8BBZ T细胞能够根除所有小鼠的肿瘤，并且FHVH33-CD8BBZ CAR T细胞的有效性以剂量依赖性方式降低。所有未经治疗的小鼠的肿瘤进行性扩大。(n＝5只小鼠/组)。
小鼠的存活示于图9C中。在实验期间，接受2.2×106个表达FHVH33-CD8BBZ T细胞的所有小鼠均存活且健康。
实施例10
该实施例证实了NSG小鼠中BCMA+肿瘤的根除。
给小鼠皮内注射RPMI8226细胞。允许肿瘤生长10天。在第0天，小鼠接受静脉内输注1×106个表达SP6-CD828Z、11D5-3-CD8BBZ、FHVH33-CD8BBZ或FHVH33-CD828Z CAR的T细胞，或使小鼠未经治疗。
如图10A中所示，接受输注表达阴性对照SP6-CD828Z CAR的T细胞的小鼠和未治疗的小鼠具有进行性肿瘤生长。接受表达11D5-3-CD8BBZ、FHVH33-CD8BBZ或FHVH33-CD828ZCAR的T细胞的小鼠可根除肿瘤。
小鼠的存活示于图10B中。接受表达11D5-3-CD8BBZ、FHVH33-CD8BBZ或FHVH33-CD828Z CAR的T细胞的小鼠存活。
实施例11
该实施例证命了表达仅重链CAR的T细胞以BCMA特异性方式释放IFNγ。
效应T细胞与表5中所示的靶细胞一起培养过夜。效应T细胞是未转导的T细胞、用编码为FHVH33-CD828Z的核苷酸序列转导的T细胞或用编码为FHVH33-CD8BBZ的核苷酸序列转导的T细胞。T细胞全部来自同一个人供体。FHVH33-CD828Z转导的T细胞提供71％的CAR表达。FHVH33-CD8BBZ转导的T细胞提供80％的CAR表达。
BCMA+靶细胞是BCMA-K562和RPMI8226。BCMA阴性靶细胞是Panc10.05、U251、293GP、原代正常人支气管上皮细胞(NHBE)、原代人微血管内皮细胞(HMVEC)、原代人肠上皮细胞(InEpC)。
进行了干扰素(IFN)γELISA。结果显示在表5中。单独通过效应T细胞产生的干扰素γ也显示在表5中。表5中的所有值均为pg/mL的IFN-γ。
表5
如表5所示，在BCMA+靶标的存在下，CAR T细胞产生更多的干扰素γ。
本文中引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)均通过引用并入本文中，其程度如同每篇参考文献被单独和明确地指示通过引用并入本文中以及在本文中被完整陈述。
除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a/an)”及“所述(the)”和“至少一个(at least one)”以及类似的指示词应解释为包括单数和复数。除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则使用术语“至少一个”接着是一系列的一个或多个项目(例如，“A和B中的至少一个”)应解释为意指从所列的项目(A或B)中选定的一个项目或者所列项目(A和B)中的两个或更多个的任意组合。除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应被解释为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另有说明，否则在本文中叙述的数值范围仅旨在用作单独提及落入范围内的每个单独的值的简写方法，并且每个单独的值均被并入本说明书中，就像其在本文中被单独引用一样。除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾，否则可以以任何适当的顺序进行本文中所述的所有方法。除非另有声明，否则在本文中提供的任何和所有实例或示例性的语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言均不得解释为表明任何非要求保护的要素对实施本发明至关重要。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述描述之后，那些优选实施方案的变型对本领域技术人员来说可能变得显而易见。发明人期望技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以除本文中明确描述的之外的其他的方式实施本发明。因此，本发明包括适用法律允许的本文所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在所有其可能变型中的任何组合。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部(THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BYTHE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES)
特尼奥生物股份有限公司（TENEOBIO, INC.）
<120> 具有人结构域的抗B细胞成熟抗原嵌合抗原受体
<130> 739534
<150> US 62/527,556
<151> 2017-06-30
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<210> 17
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 17
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<400> 23
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370
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
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Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
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195 200 205
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
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260 265 270
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
275 280 285
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
290 295 300
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
325 330 335
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
340 345 350
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
355 360 365
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 28
<211> 373
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Ser His Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Tyr Thr His
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Glu Asp Gly Gly Ser Leu Leu Gly
115 120 125
His Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val
130 135 140
Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
145 150 155 160
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
165 170 175
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
180 185 190
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
195 200 205
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Cys
210 215 220
Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly
225 230 235 240
Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu
245 250 255
Thr Asp Val Thr Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
260 265 270
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
275 280 285
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
290 295 300
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
305 310 315 320
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
325 330 335
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
340 345 350
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
355 360 365
Ala Leu Pro Pro Arg
370
<210> 29
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 29
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt accaaccatg ccatgagttg ggtccgccag 180
gctccaggga aggggctgga gttggtctca agtattagtg gtaatggtcg taccacatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acatttccaa gaacacgctg 300
gatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagat 360
gggggcgaaa ctctagttga ctccagaggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcattc 420
gtgcccgtgt tcctgcctgc caagcctaca acaacccctg ctcctagacc tcctacacca 480
gctcctacaa tcgccagcca gcctctgtct ctgaggcctg aagcttgtag acctgctgct 540
ggcggagccg tgcataccag aggactggat ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct 600
ctggctggaa catgtggcgt tttgctgctg agcctcgtga tcaccctgta ctgcaaccac 660
cggaacagaa gcaagcggag ccggctgctg cacagcgact acatgaacat gacccccaga 720
cggcctggcc ccaccagaaa gcactaccag ccttacgccc ctcccagaga cttcgccgcc 780
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aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgatgt gctggacaaa 900
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 960
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1020
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1080
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1128
<210> 30
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 30
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagccatg ccatgacctg ggtccgccag 180
gctccgggga aggggctgga gtgggtcgca gctattagtg gcagtggtga tttcacacac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacggtg 300
tctctgcaaa tgaacaacct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagat 360
gaggatggtg ggagcttgct tggctacaga ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 420
ttcgtgcccg tgttcctgcc tgccaagcct acaacaaccc ctgctcctag acctcctaca 480
ccagctccta caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc ctgaagcttg tagacctgct 540
gctggcggag ccgtgcatac cagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 600
cctctggctg gaacatgtgg cgttttgctg ctgagcctcg tgatcaccct gtactgcaac 660
caccggaaca gaagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc 720
agacggcctg gccccaccag aaagcactac cagccttacg cccctcccag agacttcgcc 780
gcctaccggt ccagagtgaa gttcagcaga agcgccgacg cccctgccta tcagcagggc 840
cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggcagacggg aagagtacga tgtgctggac 900
aaaagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 960
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1020
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1080
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 1131
<210> 31
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 31
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctgaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag 180
gctccaggga aggggctgga gtgggtctca tctattagtg gtagtggtga ttacatatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acatatccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagaa 360
ggtacgggtg ccaacagcag cttggcagac tacagaggcc agggcaccct ggtcaccgtc 420
tcctcattcg tgcccgtgtt cctgcctgcc aagcctacaa caacccctgc tcctagacct 480
cctacaccag ctcctacaat cgccagccag cctctgtctc tgaggcctga agcttgtaga 540
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<210> 32
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 32
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctgaggtgc agctgttgga gtctgggggg ggcttgatac agcctggggg gtccctgaga 120
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caccggaaca gaagcaagcg gagccggctg ctgcacagcg actacatgaa catgaccccc 720
agacggcctg gccccaccag aaagcactac cagccttacg cccctcccag agacttcgcc 780
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<210> 33
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 33
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
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<210> 34
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 34
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
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cctctggctg gaacatgtgg cgttttgctg ctgagcctcg tgatcaccct gtactgcaac 660
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<210> 35
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 35
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctgaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
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cctgctgctg gcggagccgt gcataccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 600
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<210> 36
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 36
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctgaggtgc agctgttgga gtctgggggg ggcttgatac agcctggggg gtccctgaga 120
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<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 37
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cggaactgct ggctgaccaa gaagaagtac agcagcagcg tgcacgaccc caacggcgag 720
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agagtgaagt tcagcagatc cgccgatgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 840
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<210> 38
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 38
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctcaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagccatg ccatgacctg ggtccgccag 180
gctccgggga aggggctgga gtgggtcgca gctattagtg gcagtggtga tttcacacac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacggtg 300
tctctgcaaa tgaacaacct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagat 360
gaggatggtg ggagcttgct tggctacaga ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 420
ttcgtgcccg tgttcctgcc tgccaagcct acaacaaccc ctgctcctag acctcctaca 480
ccagctccta caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc ctgaagcttg tagacctgct 540
gctggcggag ccgtgcatac cagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 600
cctctggctg gaacatgtgg cgttttgctg ctgagcctcg tgatcaccct gtactgcaac 660
caccggaact gctggctgac caagaagaag tacagcagca gcgtgcacga ccccaacggc 720
gagtacatgt tcatgagggc cgtgaacacc gccaagaaga gcaggctgac cgacgtgacc 780
ctgagagtga agttcagcag atccgccgat gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag 840
ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg gaagagtacg atgtgctgga caaaagacgt 900
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 960
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1020
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1080
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1122
<210> 39
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 39
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctgaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag 180
gctccaggga aggggctgga gtgggtctca tctattagtg gtagtggtga ttacatatac 240
tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag acatatccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaagaa 360
ggtacgggtg ccaacagcag cttggcagac tacagaggcc agggcaccct ggtcaccgtc 420
tcctcattcg tgcccgtgtt cctgcctgcc aagcctacaa caacccctgc tcctagacct 480
cctacaccag ctcctacaat cgccagccag cctctgtctc tgaggcctga agcttgtaga 540
cctgctgctg gcggagccgt gcataccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 600
tgggcccctc tggctggaac atgtggcgtt ttgctgctga gcctcgtgat caccctgtac 660
tgcaaccacc ggaactgctg gctgaccaag aagaagtaca gcagcagcgt gcacgacccc 720
aacggcgagt acatgttcat gagggccgtg aacaccgcca agaagagcag gctgaccgac 780
gtgaccctga gagtgaagtt cagcagatcc gccgatgccc ctgcctacca gcagggccag 840
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc agacgggaag agtacgatgt gctggacaaa 900
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 960
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1020
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1080
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgctaa 1128
<210> 40
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 40
atggccctgc ctgttacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60
cctgaggtgc agctgttgga gtctgggggg ggcttgatac agcctggggg gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagccatg ccatgacctg ggtccgccag 180
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tatctccaaa tgaacagtct gagagccgag gactcggccg tatattactg tgcgaaagat 360
gaggatggtg ggagcctcct ggggcacaga ggccagggca ccctggtcac cgtctcctca 420
ttcgtgcccg tgttcctgcc tgccaagcct acaacaaccc ctgctcctag acctcctaca 480
ccagctccta caatcgccag ccagcctctg tctctgaggc ctgaagcttg tagacctgct 540
gctggcggag ccgtgcatac cagaggactg gatttcgcct gcgacatcta catctgggcc 600
cctctggctg gaacatgtgg cgttttgctg ctgagcctcg tgatcaccct gtactgcaac 660
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ctgagagtga agttcagcag atccgccgat gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag 840
ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg gaagagtacg atgtgctgga caaaagacgt 900
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 960
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cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1080
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1122
<210> 41
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的
<400> 41
tatcgt 6
<210> 42
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180

Claims (17)

1.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原识别结构域、跨膜(TM)结构域和T细胞激活结构域，其中所述CAR对B细胞成熟抗原(BCMA)具有抗原特异性，其中所述抗原识别结构域包含：
(a)SEQ ID NO：1所示的重链CDR1区、SEQ ID NO：2所示的重链CDR2区和SEQ ID NO：3所示的重链CDR3区；
(b)SEQ ID NO：4所示的重链CDR1区、SEQ ID NO：5所示的重链CDR2区和SEQ ID NO：6所示的重链CDR3区；
(c)SEQ ID NO：7所示的重链CDR1区、SEQ ID NO：8所示的重链CDR2区和SEQ ID NO：9所示的重链CDR3区；或
(d)SEQ ID NO：10所示的重链CDR1区、SEQ ID NO：11所示的重链CDR2区和SEQ ID NO：12所示的重链CDR3区。
2.如权利要求1所述的CAR，其中所述CAR的所有结构域都是人的。
3.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原识别结构域不包含长度为8至40个氨基酸残基的连接子肽。
4.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述CAR不包含抗体轻链可变区。
5.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原识别结构域包含以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：13；
(b)SEQ ID NO：14；
(c)SEQ ID NO：15；或
(d)SEQ ID NO：16。
6.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述T细胞激活结构域包含以下蛋白中的任一种的T细胞信号传导结构域：人CD28蛋白、人CD3ζ蛋白、人FcRγ蛋白、CD27蛋白、OX40蛋白、人4-1BB蛋白、人T细胞可诱导共刺激蛋白(ICOS)、或前述的任意组合。
7.如权利要求1或2所述的CAR，其包含SEQ ID NO：17-28中任一项的氨基酸序列。
8.核酸，其包含编码权利要求1-7中任一项所述的CAR的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的核酸，其包含SEQ ID NO：29-40中任一项的核苷酸序列。
10.载体，其包含权利要求8或9所述的核酸。
11.分离的宿主细胞，其包含权利要求10所述的载体。
12.如权利要求11所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是T细胞。
13.如权利要求11所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是自然杀伤(NK)细胞。
14.细胞群，其包含至少一种权利要求11-13中任一项所述的宿主细胞。
15.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的CAR、权利要求8或9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11-13中任一项所述的宿主细胞、或权利要求14所述的细胞群以及药学上可接受的载体。
16.权利要求1-7中任一项所述的CAR、权利要求8或9所述的核酸、权利要求10所述的载体、权利要求11-13中任一项所述的宿主细胞、或权利要求14所述的细胞群、或权利要求15所述的药物组合物在制备用于治疗或预防哺乳动物癌症的药物中的用途，其中所述癌症是表达BCMA的癌症。
17.如权利要求16所述用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤或霍奇金氏淋巴瘤。
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