CN106459203A - 抗糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(gitr)的抗体及其用途 - Google Patents

抗糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(gitr)的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)的抗体或其抗原结合部分。亦提供这些蛋白质在治疗应用，例如在癌症治疗中的用途。进一步提供产生这些抗体的细胞、编码这些抗体的重链及/或轻链可变区的多核苷酸及包含编码这些抗体的重链及/或轻链可变区的多核苷酸的载体。

Description

抗糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)的抗体及其用途
相关申请案的交叉参考
本申请主张分别于2014年6月6日及2014年11月21日递交的标题为“AntibodiesAgainst Glucocorticoid-Induced Tumor Necrosis Factor Receptor(GITR)and UsesThereof”的美国临时申请第62/008,945号及第62/082,980号的优先权，其内容以提述方式并入本文中。
现有技术
糖皮质激素诱导之TNFR相关蛋白(GITR)(一种共刺激分子，亦称作TNFRSF18、AITR、CD357及GITR-D)是最初在经地塞米松(dexamethasone)处理的鼠类T细胞系中鉴别出的TNF受体家族的成员(Nocentini等人，PNAS1997；94:6216-21)。TNF受体家族的其他相关成员包括CD40、CD27、4-1BB及OX40。尽管GITR表达在原初CD4+及CD8+细胞中较低，但其在调控性T细胞中组成型表达(Tone等人，PNAS 2003；100:15059-64)。然而，一旦在效应物T细胞上诱导其表达，则GITR接合促进其活化、增殖及细胞因子产生(Watts,Annual Reviews inImmunology 2005；23:23-68)。关于CD4+CD25+调控性T细胞(Treg)，Shimizu使用混合培养物阻抑分析报导GITR接合阻抑其功能(Shimizu等人，Nature Immunology 2002；3:135-42)。然而，Stephans等人(JI 2004 15；173(8):5008-20)的后续工作确定T效应物(Teff)细胞上的GITR接合使得其对Treg阻抑较不敏感，从而解释Treg-Teff细胞共培养物中观察到的降低阻抑。在多种肿瘤模型中，DTA-1(大鼠抗小鼠GITR)抗体介导的GITR刺激促进抗肿瘤免疫。
GITR-L(即GITR的配体)在抗原呈递细胞(例如，B细胞、树突细胞)中表达程度较低，但在由(例如)病毒感染活化后在这些细胞中瞬时上调(Suvas等人，J Virol.2005；79:11935-42)。
鉴于对用于靶向疾病(例如癌症)的改良策略、来自增强的免疫反应(具体而言T细胞应答)的益处的持续需要，调节GITR活性的新颖药剂及方法是高度期望的。
发明内容
本文提供特异性结合GITR且具有期望的功能性质的分离的抗体，例如单克隆抗体、具体而言人单克隆抗体。这些性质包括结合人GITR、结合猴GITR(例如，食蟹猴GITR)的高亲和力，及刺激抗原特异性T细胞应答的能力。本文所述抗体可用于刺激例如带有肿瘤或带有病毒(病毒感染)受试者中的抗原特异性T细胞应答及检测样品中的GITR蛋白。
在一个方面中，本文提供分离的抗体或其抗原结合部分，其结合GITR且展现以下性质中的至少一者：
(a)结合可溶性人GITR；
(b)结合膜结合的人GITR；
(c)结合膜结合的食蟹猴GITR；
(d)诱导或增强T细胞活化，例如抗原特异性T细胞活化；
(e)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合；
(f)至多部分地抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(g)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位；
(h)结合O-连接与N-糖基化的及未糖基化的人GITR；
(i)在没有与Fc受体结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；及
(j)在任一方向或两个方向上与抗体28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10中的一或多者竞争结合人GITR。
在某些实施方案中，本文所述抗GITR抗体或其抗原结合部分刺激抗肿瘤免疫反应，例如抗原特异性T细胞应答。在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分可增加表达GITR的T细胞中的细胞因子(例如，IL-2及/或IFN-γ)产生及/或增加T细胞增殖。
在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分不结合Fc受体。在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分结合一个或多个FcγR，例如活化或抑制性FcγR。
在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分以如通过Biacore测量的10nM或更小的KD结合可溶性人GITR，以如通过Scatchard测量的1nM或更小的KD结合膜结合人GITR，以如通过FACS测量的1nM或更小的EC50结合膜结合人GITR，以如通过FACS测量的10nM或更小的EC50结合膜结合食蟹猴GITR，诱导或增强T细胞(例如Teff细胞)活化而无需多价交联，以如通过FACS测量的1μg/mL或更小的EC50抑制GITR配体与GITR结合，及/或在成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的区域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内结合。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合GITR且包含呈选自以下的可变重链及可变轻链对的三个可变重链CDR及三个可变轻链CDR：
(a)SEQ ID NO:13及14；
(b)SEQ ID NO:26及27；
(c)SEQ ID NO:39及40；
(d)SEQ ID NO:52及53；
(e)SEQ ID NO:52及54；
(f)SEQ ID NO:71及72；
(g)SEQ ID NO:84及85；
(h)SEQ ID NO:97及98；
(i)SEQ ID NO:97及99；
(j)SEQ ID NO:115及116；
(k)SEQ ID NO:128及129；
(l)SEQ ID NO:128及130；及
(m)SEQ ID NO:335及336。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合GITR且包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:20、21及22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:23、24及25的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:33、34及35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:36、37及38的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(c)分别包含SEQ ID NO:46、47及48的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:49、50及51的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:62、63及64的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:65、66及67的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:62、63及64的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:68、69及70的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:78、79及80的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:81、82及83的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:91、92及93的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:94、95及96的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:106、107及108的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:109、110及111的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:106、107及108的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:112、113及114的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:122、123及124的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:125、126及127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:138、139及140的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:141、142及143的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:138、139及140的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:144、145及146的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:342、343及344的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:345、346及347的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
本文提供结合GITR且包含重链及轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
本文提供结合GITR且包含重链及轻链可变区的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合GITR且包含与选自下组的氨基酸序列至少85％相同(例如90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的重链及轻链可变区序列：
(a)分别为SEQ ID NO:13及14；
(b)分别为SEQ ID NO:26及27；
(c)分别为SEQ ID NO:39及40；
(d)分别为SEQ ID NO:52及53；
(e)分别为SEQ ID NO:52及54；
(f)分别为SEQ ID NO:71及72；
(g)分别为SEQ ID NO:84及85；
(h)分别为SEQ ID NO:97及98；
(i)分别为SEQ ID NO:97及99；
(j)分别为SEQ ID NO:115及116；
(k)分别为SEQ ID NO:128及129；
(l)分别为SEQ ID NO:128及130；及
(m)分别为SEQ ID NO:335及336。
本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合GITR且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％99％或100％相同的重链及轻链序列：
(a)分别为SEQ ID NO:15及16；
(b)分别为SEQ ID NO:17及19；
(c)分别为SEQ ID NO:18及19；
(d)分别为SEQ ID NO:28及29；
(e)分别为SEQ ID NO:30及32；
(f)分别为SEQ ID NO:31及32；
(g)分别为SEQ ID NO:41及42；
(h)分别为SEQ ID NO:43及45；
(i)分别为SEQ ID NO:44及45；
(j)分别为SEQ ID NO:55及56；
(k)分别为SEQ ID NO:55及57；
(l)分别为SEQ ID NO:58及60；
(m)分别为SEQ ID NO:59及60；
(n)分别为SEQ ID NO:58及61；
(o)分别为SEQ ID NO:59及61；
(p)分别为SEQ ID NO:73及74；
(q)分别为SEQ ID NO:75及77；
(r)分别为SEQ ID NO:76及77；
(s)分别为SEQ ID NO:86及87；
(t)分别为SEQ ID NO:88及90；
(u)分别为SEQ ID NO:89及90；
(v)分别为SEQ ID NO:102及104；
(w)分别为SEQ ID NO:103及104；
(x)分别为SEQ ID NO:100及101；
(y)分别为SEQ ID NO:100及371；
(z)分别为SEQ ID NO:102及105；
(za)分别为SEQ ID NO:103及105；
(zb)分别为SEQ ID NO:117及118；
(zc)分别为SEQ ID NO:119及121；
(zd)分别为SEQ ID NO:120及121；
(ze)分别为SEQ ID NO:131及132；
(zf)分别为SEQ ID NO:134及136；
(zg)分别为SEQ ID NO:135及136；
(zh)分别为SEQ ID NO:131及133；
(zi)分别为SEQ ID NO:134及137；
(zj)分别为SEQ ID NO:135及137
(zk)分别为SEQ ID NO:337及338；
(zl)分别为SEQ ID NO:339及341；及
(zm)分别为SEQ ID NO:340及341。
在某些实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分(a)与28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及/或6G10结合GITR上的相同表位，及(b)将28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、及/或6G10与活化T细胞上的GITR的结合抑制至少50％、60％、70％、80％或90％，如通过(例如)FACS所测量。
在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分在成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的区域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内结合。在一些实施方案中，本文所述抗GITR抗体或其抗原结合部分结合人GITR及食蟹猴GITR二者。
在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体或其变体。在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分包含无效应物(effectorless)IgG1 Fc，例如具有以下突变的无效应物IgG1 Fc：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分包含这样的Fc：其结合活化性FcγR，或具有增强的(例如相对于野生型IgG1 Fc)与活化性FcγR的结合。在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分的CDR区中的甲硫氨酸残基取代不经历氧化的氨基酸残基。在某些实施方案中，抗GITR抗体或其抗原结合部分是人抗体或人源化抗体。
本文提供结合GITR的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，该GITR包括经修饰重链恒定区，所述经修饰重链恒定区包含IgG2铰链及不属于IgG2同型的CH1、CH2及CH3中的至少一者，其中该抗GITR抗体相对于相同但具有非IgG2铰链的抗GITR抗体具有增强的激动剂活性。
在某些实施方案中，经修饰的重链恒定区包括：包含选自由SEQ ID NO:223至226及283至290组成的群的氨基酸序列的重链恒定区，或与SEQ ID NO:223至226及283至290的氨基酸序列有至多5个氨基酸不同或至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链恒定区。
在某些实施方案中，重链包含选自由SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362组成的群的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362的氨基酸序列至多10个氨基酸不同或至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链。
在某些实施方案中，轻链包含选自由SEQ ID NO:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371组成的群的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371的氨基酸序列至多10个氨基酸不同或至少95％、96％、97％、98％或99％相同的轻链。
本文提供双特异性分子，其包含连接至具有第二结合特异性的分子的抗GITR抗体。
本文提供编码抗GITR抗体或其抗原结合部分的重链及/或轻链可变区的核酸、包含核酸分子的表达载体及经表达载体转化的细胞。
本文提供包含连接至药剂的本文所述抗GITR抗体的免疫偶联物。
本文提供包含抗GITR抗体或其抗原结合部分及载体的组合物。本文亦提供包含抗GITR抗体或其抗原结合部分及使用说明书的试剂盒。
本文提供制备抗GITR抗体的方法，其包含使抗GITR抗体在细胞中表达并自细胞分离该抗体。
本文提供刺激抗原特异性T细胞应答的方法，其包含使T细胞与抗GITR抗体或其抗原结合部分接触，使得抗原特异性T细胞应答被刺激。
本文提供活化或共刺激T细胞(例如效应物T细胞)的方法，其包含使细胞(例如效应物T细胞)与抗GITR抗体或其抗原结合部分及CD3接触，其中活化或共刺激效应物T细胞。
本文提供增加T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生及/或T细胞增殖的方法，其包含使T细胞与有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分接触。
本文提供增加受试者中T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包括施用有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、包含抗GITR抗体的双特异性分子或偶联物、或包含抗GITR抗体的组合物，以增加自T细胞的IL-2及/或IFN-γ产生。
本文提供减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中T调控性细胞的数目的方法，其包括施用有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或偶联物，以减少肿瘤中T调控性细胞的数目，其中抗体或其抗原结合部分具有效应物功能或增强的效应物功能。
本文提供刺激受试者中免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或偶联物，使得受试者中的免疫应答被刺激。在某些实施方案中，受试者具有肿瘤且抵抗肿瘤的免疫应答被刺激。
本文提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或偶联物，使得受试者中肿瘤的生长被抑制。
本文提供治疗癌症，例如通过免疫疗法治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗GITR抗体或其抗原结合部分、包含抗GITR抗体的双特异性分子或偶联物、或包含抗GITR抗体的组合物，以治疗癌症。在某些实施方案中，癌症是膀胱癌、乳癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。在某些实施方案中，癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
在某些实施方案中，本文所述方法进一步包括与抗GITR抗体(例如抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体及/或PD-L1抗体)一起施用一或多种额外治疗剂。
本文提供检测样品中GITR的存在的方法，其包含在容许在抗体或其抗原结合部分与GITR之间形成复合物的条件下使样品与抗GITR抗体或其抗原结合部分接触，并检测复合物的形成。
本文提供本文所述抗GITR抗体用于治疗癌症、刺激受试者中的免疫应答、刺激抗原特异性T细胞应答、活化或共刺激T细胞、增加T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生及/或T细胞的增殖、减少或耗竭肿瘤中T调控性细胞的数目及/或抑制肿瘤细胞生长的用途。本文亦提供本文所述抗GITR抗体用于制备用于刺激受试者中的免疫应答、刺激抗原特异性T细胞应答、活化或共刺激T细胞、增加T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生及/或T细胞的增殖、减少或耗竭肿瘤中T调控性细胞的数目及/或抑制肿瘤细胞生长的药物的用途。
鉴于以下详细说明及实施例(其不应理解为具有限制性)将明了本发明的其他特征及优点。
附图简要说明
图1显示单克隆抗体28F3(分别为SEQ ID NO:13及14)、18E10(分别为SEQ ID NO:39及40)及19D3(分别为SEQ ID NO:26及27)的重链及轻链可变区的氨基酸序列。28F3的VH及VL CDR加下划线。
图2A显示28F3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:147)及氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:20)、CDR2(SEQ ID NO:21)及CDR3(SEQ IDNO:22)区且指示了V、D及J种系来源。
图2B显示28F3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:148)及氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。描绘CDR1(SEQ ID NO:23)、CDR2(SEQ ID NO:24)及CDR3(SEQ IDNO:25)区且指示V及J种系来源。
图3A显示18E10人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:158)及氨基酸序列(SEQ ID NO:39)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:46)、CDR2(SEQ ID NO:47)及CDR3(SEQID NO:48)区且指示了V、D及J种系来源。
图3B显示18E10人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:159)及氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:49)、CDR2(SEQ ID NO:50)及CDR3(SEQID NO:51)区且指示了V及J种系来源。
图4A显示19D3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:154)及氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:33)、CDR2(SEQ ID NO:34)及CDR3(SEQ IDNO:35)区且指示V、D及J种系来源。
图4B显示19D3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:155)及氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:36)、CDR2(SEQ ID NO:37)及CDR3(SEQID NO:38)区且指示V及J种系来源。
图5A显示3C3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:162)及氨基酸序列(SEQ ID NO:52)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:62)、CDR2(SEQ ID NO:63)及CDR3(SEQ IDNO:64)区且指示V、D及J种系来源。
图5B显示3C3人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK1)的核苷酸序列(SEQ ID NO:163)及氨基酸序列(SEQ ID NO:53)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:65)、CDR2(SEQ ID NO:66)及CDR3(SEQ ID NO:67)区且指示V及J种系来源。
图5C显示3C3人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK2)的核苷酸序列(SEQ ID NO:164)及氨基酸序列(SEQ ID NO:54)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:68)、CDR2(SEQ ID NO:69)及CDR3(SEQ ID NO:70)区且指示了V及J种系来源。
图6A显示2G6人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:168)及氨基酸序列(SEQ ID NO:71)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:78)、CDR2(SEQ ID NO:79)及CDR3(SEQ IDNO:80)区且指示V、D及J种系来源。
图6B显示2G6人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:169)及氨基酸序列(SEQ ID NO:72)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:81)、CDR2(SEQ ID NO:82)及CDR3(SEQ IDNO:83)区且指示了V及J种系来源。
图7A显示8A6人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:172)及氨基酸序列(SEQ ID NO:84)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:91)、CDR2(SEQ ID NO:92)及CDR3(SEQ IDNO:93)区且指示了V、D及J种系来源。
图7B显示8A6人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:173)及氨基酸序列(SEQ ID NO:85)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:94)、CDR2(SEQ ID NO:95)及CDR3(SEQ IDNO:96)区且指示了V及J种系来源。
图8A显示9G7人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:176)及氨基酸序列(SEQ ID NO:97)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:106)、CDR2(SEQ ID NO:107)及CDR3(SEQID NO:108)区且指示了V、D及J种系来源。
图8B显示9G7人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK1)的核苷酸序列(SEQ ID NO:177)及氨基酸序列(SEQ ID NO:98)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:109)、CDR2(SEQ ID NO:110)及CDR3(SEQ ID NO:111)区且指示了V及J种系来源。
图8C显示9G7人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK2)的核苷酸序列(SEQ ID NO:178)及氨基酸序列(SEQ ID NO:99)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:112)、CDR2(SEQ ID NO:113)及CDR3(SEQ ID NO:114)区且指示了V及J种系来源。
图9A显示14E3人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:182)及氨基酸序列(SEQ ID NO:115)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:122)、CDR2(SEQ ID NO:123)及CDR3(SEQID NO:124)区且指示了V、D及J种系来源。
图9B显示14E3人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:183)及氨基酸序列(SEQ ID NO:116)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:125)、CDR2(SEQ ID NO:126)及CDR3(SEQ ID NO:127)区且指示了V及J种系来源。
图10A显示19H8人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:186)及氨基酸序列(SEQ ID NO:128)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:138)、CDR2(SEQ ID NO:139)及CDR3(SEQ ID NO:140)区且指示了V、D及J种系来源。
图10B显示19H8人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK1)的核苷酸序列(SEQID NO:187)及氨基酸序列(SEQ ID NO:129)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:141)、CDR2(SEQ ID NO:142)及CDR3(SEQ ID NO:143)区且指示了V及J种系来源。
图10C显示19H8人单克隆抗体的κ轻链可变区(VK2)的核苷酸序列(SEQ ID NO:188)及氨基酸序列(SEQ ID NO:130)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:144)、CDR2(SEQ ID NO:145)及CDR3(SEQ ID NO:146)区且指示了V及J种系来源。
图11A显示6G10人单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:353)及氨基酸序列(SEQ ID NO:335)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:342)、CDR2(SEQ ID NO:343)及CDR3(SEQ ID NO:344)区且指示了V、D及J种系来源。
图11B显示6G10人单克隆抗体的κ轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO:354)及氨基酸序列(SEQ ID NO:336)。描绘了CDR1(SEQ ID NO:345)、CDR2(SEQ ID NO:346)及CDR3(SEQ ID NO:347)区且指示了V及J种系来源。
图12显示28F3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)与人种系VH 3-33、3-10及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192、193及196)的比对。
图13显示28F3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)与人种系Vk L18及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:204及205)的比对。
图14显示18E10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)与人种系VH 3-33、6-19及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192、199及197)的比对。
图15显示18E10的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)与人种系Vk L15及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:207及205)的比对。
图16显示19D3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)与人种系VH 3-33、3-16及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192、200及198)的比对。
图17显示19D3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)与人种系Vk L15及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:207及205)的比对。
图18显示3C3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:52)与人种系VH 4-34及JH3氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:201及202)的比对。
图19A显示3C3的轻链可变区(VK1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:53)与人种系Vk L15及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:207及205)的比对。
图19B显示3C3的轻链可变区(VK2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)与人种系Vk L20及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:208及206)的比对。
图20显示2G6的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:71)与人种系VH 3-33及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192及197)的比对。
图21显示2G6的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:72)与人种系Vk L15及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:207及205)的比对。
图22显示8A6的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:84)与人种系VH 3-33、3-10及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192、193及197)的比对。
图23显示8A6的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:85)与人种系Vk L18及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:204及205)的比对。
图24显示9G7的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:97)与人种系VH 3-15、3-10及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:203、194及198)的比对。
图25A显示9G7的轻链可变区(VK1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:98)与人种系Vk A27及JK1氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:209及210)的比对。
图25B显示9G7的轻链可变区(VK2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:99)与人种系Vk A27及JK5氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:209及212)的比对。
图26显示14E3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:115)与人种系VH 4-34及JH3氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:201及202)的比对。
图27显示14E3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:116)与人种系Vk L15及JK1氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:207及211)的比对。
图28显示19H8的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:128)与人种系VH 3-33、3-10及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192、195及196)的比对。
图29A显示19H8的轻链可变区(VK1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:129)与人种系VkL18及JK1氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:204及211)的比对。
图29B显示19H8的轻链可变区(VK2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:130)与人种系VkL6及JK4氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:213及214)的比对。
图30显示6G10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO:335)与人种系VH 3-33、3-10及JH6氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:192、195及196)的比对。
图31显示6G10的轻链可变区(VK1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:336)与人种系VkL18及JK2氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:204及205)的比对。
图32显示各种抗GITR抗体对于活化人T细胞的结合亲和力(以nM表示)，其中无抗体、IgG1及hIgG2抗体作为对照，通过FACS评价。
图33显示各种抗GITR抗体对于活化食蟹猴T细胞的结合亲和力(以nM表示)，其中无抗体及hIgG1及hIgG2抗体作为对照，通过FACS评价。
图34A及34B显示各种抗GITR抗体抑制GITR配体(GITR-L)与GITR 3A9细胞的结合的能力，其中hIgG1、hIgG2、无抗体及仅细胞作为对照。
图34C显示重组GITR-L与活化人CD4及CD8 T细胞的结合。
图34D显示GITR-L部分阻断28F3-hIgG1与活化人CD4+T细胞的结合。0.5μg/mL的固定浓度的28F3-hIgG1与活化T细胞的结合以0.0024μg/mL的IC50由预结合GITR-L部分阻断。
图34E显示28F3-hIgG1不阻断0.6μg/ml GITR-L与活化人T细胞的结合。在以0.6mg/mL、约90％饱和度向CD4+T细胞中添加GITR-L时，在100mg/mL至0.00056mg/mL范围内的预结合28F3-hIgG1不能阻断GITR-L。
图34F显示28F3-hIgG1部分阻断0.02μg/ml GITR-L与活化人T细胞的结合。20ng/mL的固定浓度的GITR-L与活化T细胞的结合以0.075μg/mL的IC50被预结合的28F3-hIgG1部分阻断。
图35A显示Western印迹，其展示抗GITR抗体28F3结合天然人GITR但并不结合变性的人GITR，且该结合并不受N-连接糖基化的存在或不存在影响。“+”符号指示经PNGase F处理以去除N-连接糖基化的样品。
图35B为考马斯蓝(Coomassie blue)染色的凝胶，其显示在转移至硝基纤维素上用于Western印迹分析之前所有形式的人GITR的存在。
图36A-36B显示28F3及3C3抗体与通过用内切蛋白酶Arg-C(1)、内切蛋白酶Lys-C(2)、胰蛋白酶(3)、内切蛋白酶Glu-C(4)或内切蛋白酶Asp-N(5)消化生成的天然GITR片段的结合。
图37显示结合利用内切蛋白酶Glu-C及胰蛋白酶(“Glu-C及胰蛋白酶”)、内切蛋白酶Arg-C(“Arg-C”)、内切蛋白酶Lys-C及胰蛋白酶(“Lys-C及胰蛋白酶”)、胰蛋白酶、或内切蛋白酶Asp-N及内切蛋白酶Glu-C(“AspN及GluC”)消化天然人GITR蛋白生成的人GITR肽片段的抗GITR抗体28F3的热图视图，从而鉴别与28F3抗体结合的表位的位置(加框区)。人GITR的成熟细胞外结构域的氨基酸序列以深灰色显示，连接于其C-端的小鼠Fc的序列以浅灰色显示。
图38A显示包被28F3的珠子与来自天然人GITR的胰蛋白酶消化产生的肽温育后，穿透级分中的肽。
图38B显示两种主要的28F3结合肽(由星号指示)。
图38C显示通过LC-MS将图34B中的两个峰的第一个鉴定为对应于具有所示序列且无O-连接糖基化的N-末端肽。
图38D显示通过LC-MS将图34B中的两个峰的第二个鉴定为对应于具有所示序列且在T20上具有O-连接糖基化的N-末端肽。
图38E显示与28F3一起温育过的较长肽在用内切蛋白酶Asp-N原位消化后剩余的GITR肽。
图39A显示重组人GITR/Fc以及重组人GITR/Fc与28F3 IgG1的蛋白复合物的胃蛋白酶消化肽的列表，对GITR的N-末端区的序列覆盖率达到86％。
图39B显示在28F3 IgG1 mAb(“GITR.6”)不存在/存在下通过HDX质谱(MS)的氘摄取水平。
图39C绘示成熟人GITR中被28F3结合的两个区，如通过HDX MS所测定。
图40显示在板结合的抗CD3抗体存在下各种激动性抗GITR抗体对3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的效应。
图41A显示激动性抗GITR抗体18E10、13H2(与28F3相同)及28F3对由特异性抗原活化的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的效应。
图41B显示激动性抗GITR抗体3C3(显示为“GITR.3”)、28F3、19D3及18E10对由特异性抗原活化的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的效应。
图42A显示各种激动性抗GITR HuMab抗体对由经CHO-OKT3细胞(即，表达OKT3scfv的CHO细胞)刺激的T细胞的干扰素γ(IFN-γ)分泌的效应。
图42B显示激动性抗GITR抗体28F3对由经表达OKT3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IL-2分泌的效应，其中T细胞来自第一供体。
图42C显示抗GITR抗体28F3对由经表达OKT3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IFN-γ分泌的效应，其中T细胞来自第一供体。
图42D显示抗GITR抗体28F3对由经表达OKT3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IL-2分泌的效应，其中T细胞来自第二供体。
图42E显示抗GITR抗体28F3对由经表达OKT3的CHO细胞刺激的CD4+T细胞的IFN-γ分泌的效应，其中T细胞来自第二供体。
图43显示在HEL48-63肽存在下抗GITR抗体28F3(IgG2)、28F3-F(ab’)2片段及28F3-Fab对由经LK35.2细胞刺激的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的效应。
图44显示使用单克隆抗体28F3-FITC的人扁桃体样品的免疫组织化学。
图45A-45D显示MC38结肠腺癌模型中大鼠抗小鼠GITR抗体DTA-1的不同同型对抗肿瘤活性的效应，该抗肿瘤活性通过经这些同型处理的小鼠个体的肿瘤体积变化来测量：(图45A)对照小鼠IgG1抗体(10mg/kg)；(图45B)DTA-1大鼠IgG2b(10mg/kg)；(图45C)DTA-1小鼠IgG1(10mg/kg)；(图45D)DTA-1小鼠IgG2a(10mg/kg)。针对每一10只小鼠的组显示每组的无肿瘤(TF)小鼠的数目。
图46A及46B显示经不同同型的DTA-1抗体(10mg/kg)处理的小鼠组中的MC38肿瘤的平均肿瘤体积(图46A)及中值肿瘤体积(图46B)变化。
图47A-47F显示经不同抗GITR(DTA-1)及抗CTLA-4(9D9)同型及所指示对照抗体处理的带有MC38肿瘤的小鼠的脾(图47A-47C)及肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)(图47D-47F)的流式细胞分析。(图47A)脾中的CD8+T细胞的百分比；(图47B)脾中的CD4+细胞的百分比；(图47C)脾中亦为Foxp3+的CD4+细胞的百分比；(图47D)TIL中CD8+T细胞的百分比；(图47E)TIL中CD4+细胞的百分比；(图47F)TIL中亦为Foxp3+的CD4+细胞的百分比。
图48A-48F显示MC38模型中经重新改造以最小化聚集的大鼠抗小鼠GITR抗体DTA-1(称作“mGITR.7”)的不同同型对抗肿瘤活性的效应，该抗肿瘤活性通过经这些同型处理的小鼠个体的肿瘤体积变化来量度：(图48A)对照小鼠IgG1抗体；(图48B)mGITR.7mIgG1；(图48C)mGITR.7mIgG1-D265A；(图48D)mGITR.7mIgG2a；(图48E)mGITR.7mIgG2b；(图48F)mGITR.7大鼠IgG2b。针对每个9只小鼠的组显示每组的TF小鼠的数目。
图49A及49B显示经不同同型的经重新改造的DTA-1抗体处理的小鼠组中MC38肿瘤的平均(图49A)及中值肿瘤体积(图49B)变化。
图50A及50B显示不同DTA-1(经重新改造的“mGITR”DTA-1或最初改造的“DTA-1”抗体)及抗CTLA-4(9D9)同型对带有MC38肿瘤的小鼠的脾(图50A)及TIL(图50B)中Foxp3+/CD4+Treg的效应的流式细胞分析。
图51A-51E显示Sa1N纤维肉瘤小鼠模型中不同小鼠DTA-1同型的抗肿瘤活性，如通过经这些同型处理的小鼠个体的肿瘤体积变化所量度的：(图51A)对照小鼠IgG1抗体；(图51B)DTA-1小鼠IgG2a；(图51C)DTA-1大鼠IgG2b；(图51D)DTA-1小鼠IgG1；(图51E)DTA-1小鼠IgG1-D265A。针对每一个至多10只小鼠的组显示每组的TF小鼠的数目。
图52A及52B显示经不同同型的DTA-1抗体处理的小鼠组中Sa1N肿瘤的平均肿瘤体积(图52A)及中值肿瘤体积(图52B)。
图53A及53B显示不同DTA-1及抗CTLA-4(9D9)同型对带有Sa1N肿瘤的小鼠的脾(图53A)及TIL(图53B)中Foxp3+/CD4+Treg的效应。
图54A-54D显示使用分级MC38结肠腺癌模型的大鼠抗GITR抗体DTA-1对肿瘤体积的效应。在第7、10及14天用(图54A)对照mIgG1、(图54B)mIgG+DTA-1、(图54C)mIgG+PD-1及(图54D)PD-1+DTA-1处理小鼠。针对每一个10只小鼠的组显示每组的无肿瘤(TF)小鼠的数目。
图55A及55B显示抗GITR抗体28F3中VH CDR3的突变的各种组合对与3A9-hGITR细胞的结合的效应。
图56A-56F显示在板结合的抗CD3存在下抗GITR抗体28F3中VH CDR3的突变的各种组合对自3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的量的效应。
图57显示所指示的抗GITR抗体对于活化T细胞的结合亲和力。所测试抗体包含以下重链恒定区中的一者：IgG1恒定区(“抗GITR.g1f”)、无效应物IgG1恒定区(“抗GITR.g1.1f”)、IgG2恒定区(“抗GITR-G2”)、IgG2铰链及IgG1 Fc结构域(“抗GITR.G2.G1f”)及IgG2铰链及无效应物IgG1 Fc结构域(“抗GITR.G2.G1.1f”)。
图58A-58C显示具有不同重链恒定区的可溶性抗人GITR抗体刺激的供体CD4 T细胞的IFN-γ及IL-2的分泌。图58A显示用表达OKT3的CHO细胞及不同浓度的具有IgG2-IgG1恒定区的抗人GITR抗体刺激的供体CD4 T细胞的IFN-γ分泌。图58B显示用表达OKT3的CHO细胞及不同浓度的IgG1重链恒定结构域或IgG2-IgG1杂合重链恒定结构域刺激的供体CD4T细胞的IL-2分泌。图58C显示经表达OKT3的CHO细胞及不同浓度的图55A及B中抗体的无效应物型式(IgG1.1)刺激的供体CD4 T细胞的IL-2分泌。
图59显示在板结合的抗CD3存在下指示的抗GITR抗体对3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的比较。
图60A-60D显示28F3.IgG1及28F3.IgG1.1对Treg及Teff细胞的增殖的效应。
图61A-61F显示28F3.IgG1(“GITR.6IgG1”)及28F3.IgG1.1(“GITR.6IgG1.1”)对来自两种不同供体的活化CD4+细胞、CD8+细胞及富含Treg的细胞的NK细胞诱导的溶解的效应。
图62A-62C显示对照hIgG1抗体、28F3.IgG1(“抗GITR IgG1”)及28F3.IgG1.1(“抗GITR IgG1.1”)对MC38肿瘤生长的效应。
图63A及63B分别显示经对照hIgG1抗体、28F3.IgG1(“抗GITR IgG1”)及28F3.IgG1.1(“抗GITR IgG1.1”)处理的小鼠中MC38肿瘤的平均体积及中值体积。
图64A及64B分别显示经对照hIgG1抗体、28F3.IgG1(“抗GITR IgG1”)及28F3.IgG1.1(“抗GITR IgG1.1”)处理的具有MC38肿瘤的小鼠的体重变化均值％及体重变化中值％。
图65显示MC38肿瘤模型中28F3.IgG1(“GITR IgG1”)相对于同型对照对Treg细胞的耗竭的效应。
图66显示MC38肿瘤模型中28F3.IgG1(“GITR IgG1”)相对于同型对照对CD8+T细胞的百分比的效应。
图67显示可溶性且交联的28F3.IgG1(“GITR.6IgG1”)及28F3.IgG1.1(“GITR.6IgG1.1”)对在与CHO-OKT3及CHO-OKT3-CD32a细胞共培养时自T细胞的IFN-γ分泌的效应。
图68显示可溶性且交联的28F3.IgG1(“GITR.6IgG1”)及28F3.IgG1.1(“GITR.6IgG1.1”)对在与CHO-OKT3及CHO-OKT3-CD32a细胞共培养时T细胞增殖的效应。
详细说明
本文阐述特异性结合GITR且藉此活化下游GITR信号传导的分离的抗体(“激动性抗GITR抗体”)，具体而言单克隆抗体，例如人单克隆抗体。在某些实施方案中，本文所述抗体源自特定重链及轻链种系序列及/或包括包含特定氨基酸序列的特定结构特征，例如CDR区。本文提供分离的抗体、制备这些抗体的方法、包含这些抗体的免疫偶联物及双特异性分子及经调配以含有这些抗体的药物组合物。本文亦提供单独或与其他免疫刺激剂(例如，抗体)及/或癌症疗法组合使用这些抗体用于免疫应答增强的方法。因此，本文所述抗GITR抗体可用于多种治疗应用中的治疗，包括(例如)抑制肿瘤生长及治疗病毒感染。
定义
为了更容易了解本说明，首先定义某些术语。其他定义在整个详细说明中进行阐释。
如本文所用术语“糖皮质激素可诱导的TNF受体”或“GITR”是指一种结合GITR配体(GITR-L)的受体，其为TNF-受体超家族成员。GITR亦称作肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)、AITR及CD357。术语“GITR”包括由细胞天然表达的GITR的任何变体或同种型。因此，本文所述抗体可与来自除人外的物种的GITR(例如，食蟹猴GITR)交叉反应。或者，抗体可对人GITR具有特异性、且可不与其他物种展现任何交叉反应性。GITR或其任何变体及同种型可自天然表达它们的细胞或组织分离，或使用本领域熟知的技术及/或本文所述的技术以重组方式产生。
已鉴别人GITR的三种同种型，三者都共有相同的细胞外结构域，但C-末端部分除外。变体1(登录号NP_004186；SEQ ID NO:1)由241个氨基酸组成，代表最长的转录物。与变体2相比，其含有一个导致移框的额外编码区段。与同种型2相比，所得的蛋白质(同种型1)含有一个不同的较短的C-末端。变体2(登录号NP_683699；SEQ ID NO:2)编码蛋白质的最长(同种型2)，由255个氨基酸组成，且是可溶的。与变体2相比，变体3(登录号NP_683700；SEQID NO:3)含有一个导致移框的额外编码区段。与同种型2相比，所得的蛋白质(同种型3)含有一个不同的较短的C-末端，且由234个氨基酸组成。
以下是三种已知人GITR同种型、食蟹猴GITR及GITR-L的氨基酸序列。
人GITR同种型1(登录号NP_004186；SEQ ID NO:1；由登录号NM_004195.2的核苷酸序列编码)：
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
人GITR同种型2(登录号NP_683699.1；SEQ ID NO:2；由登录号NM_148901.1的核苷酸序列编码)：
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCCWRCRRRPKTPEAASSPRKSGASDRQRRRGGWETCGCEPGRPPGPPTAASPSPGAPQAAGALRSALGRALLPWQQKWVQEGGSDQRPGPCSSAAAAGPCRRERETQSWPPSSLAGPDGVGS
人GITR同种型3(登录号NP_683700.1；SEQ ID NO:3；由登录号NM_148902.1的核苷酸序列编码)：
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
同种型1-3的信号序列对应于氨基酸1-25。因此，成熟同种型1、2及3分别由氨基酸26至241、255或234组成。成熟GITR的细胞外结构域由氨基酸26-162组成且具有以下氨基酸序列：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEP(SEQ ID NO:4)
食蟹猴GITR蛋白序列(SEQ ID NO:5)：
MCASGTLCCLALLCAASLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQGEECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSRGHDGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPPGWLTIILLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLWV
人GITR-L蛋白序列(登录号NP_005083.2；SEQ ID NO:6)：
MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLCSFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS
如本文所用术语“抗体”包括全抗体及其任一抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”指包含由二硫键互连的至少两条重(H)链及两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每一重链包括重链可变区(在本文中缩写为VH)及重链恒定区。在某些天然抗体中，重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2及CH3。在某些天然抗体中，每一轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL)。可将VH及VL区进一步细分成超变区(称为互补决定区(CDR))及更保守的区(称为框架区(FR))，二者间杂排列。每一VH及VL由三个CDR及四个FR构成，其自氨基末端至羧基末端按下列顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)及经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
抗体通常以高亲和力(由10-5M至10-11M或更小的解离常数(KD)反映)特异性结合其关联抗原。通常将大于约10-4M的任何KD视为指示非特异性结合。如本文所用的，“特异性结合”至抗原的抗体指以高亲和力(此意味着KD为10-7M或更小、优选10-8M或更小、更优选5×10-9M或更小、最优选介于10-8M与10-10M之间或更小)结合抗原及实质上相同抗原、但不以高亲和力结合无关抗原的抗体。若抗原展现与给定抗原的高度的序列同一性，例如，若其展现与给定抗原的序列至少80％、至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、或甚至更优选至少99％序列同一性，则该抗原与给定抗原“实质上相同”。举例而言，特异性结合人GITR的抗体亦可与来自某些灵长类动物物种的GITR抗原(例如，食蟹猴GITR)交叉反应，但可不与来自其他物种的GITR抗原或除GITR外的抗原交叉反应。
免疫球蛋白可来自普遍已知的同型中的任一者，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG及IgM。IgG同型在某些物种中分成亚类：在人类中为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，在小鼠中为IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。在某些实施方案中，本文所述抗GITR抗体属IgG1或IgG2亚型。免疫球蛋白(例如IgG1)存在若干异型，这些异型在至多少数个氨基酸中彼此不同。“抗体”举例而言包括天然及非天然抗体；单克隆及多克隆抗体；嵌合及人源化抗体；人及非人抗体；全合成抗体；及单链抗体。
如本文所用术语抗体的“抗原结合部分”指抗体的保持特异性结合抗原(例如，人GITR)的能力的一个或多个片段。这些“片段”的长度为，例如，介于约8个与约1500个氨基酸之间，适宜地介于约8个与约745个氨基酸之间，适宜地约8个至约300个、例如约8个至约200个氨基酸、或约10个至约50个或100个氨基酸。已显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来执行。抗体(例如本文所述抗GITR抗体)的“抗原结合部分”这一术语内涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种二价片段，包含两个在铰链区由二硫桥键连接的Fab片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；及(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)两个或更多个可视情况由合成接头接合的分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL及VH)是由各别的基因编码的，但其可使用重组方法通过合成接头接合在一起，该合成接头使其能够成为单一蛋白链(称作单链Fv(scFv))，其中VL及VH区配对形成单价分子；例如，参见Bird等人，(1988)Science 242:423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体亦意欲涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段系使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式筛选片段是否有效用。抗原结合部分可通过重组DNA技术、或通过酶或化学裂解完整免疫球蛋白来产生。
“双特异性”或“双功能性抗体”系具有两个不同重链/轻链对及两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过多种方法(包括杂交瘤融合或连接Fab'片段)产生。参见(例如)Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”指对抗体的特定表位或组合物展示单一结合特异性及亲和力的抗体，其中所有抗体皆对特定表位展示单一结合特异性及亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”指展示单一结合特异性且具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区(及任选地恒定区)的抗体或抗体组合物。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括自转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其基因组包含与永生化细胞融合的人重链转基因及人轻链转基因。
如本文所用术语“重组人抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如(a)自对人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或自其制备的杂交瘤分离的抗体；(b)自经转化以表达抗体的宿主细胞、例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组的组合人抗体文库分离的抗体；及(d)通过任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体包含可变区及恒定区，其利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括在(例如)抗体成熟期间发生的后续重排及突变。如本领域已知的(例如参见Lonberg(2005)NatureBiotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，抗原结合结构域由多种基因编码，这些基因为形成对外来抗原具有特异性的抗体而重排。除重排外，可变区可通过多个单一氨基酸变化(称作体细胞突变或超突变)进一步修饰，以增加抗体对外来抗原的亲和力。恒定区将进一步因应于抗原发生变化(即，同型切换)。因此，应答于抗原而经过重排且体细胞突变的编码轻链及重链免疫球蛋白多肽的核酸分子可不与初始核酸分子具有序列同一性，而是将实质上相同或类似(即，具有至少80％同一性)。
“人”抗体(HuMAb)指具有可变区的抗体，其中框架及CDR区二者皆源自人种系免疫球蛋白序列。此外，若抗体含有恒定区，则恒定区亦源自人种系免疫球蛋白序列。本文所述抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过活体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用术语“人抗体”并不意欲包括源自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已移植至人框架序列上的抗体。术语“人”抗体及“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体指非人抗体的CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸经源自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换的抗体。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大部分或所有氨基酸经人免疫球蛋白的氨基酸置换，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸未改变。可允许存在氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修饰，只要其不消除抗体结合给定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留类似于初始抗体的抗原特异性的抗原特异性。
“嵌合抗体”指可变区源自一个物种且恒定区源自另一物种的抗体，例如可变区源自小鼠抗体且恒定区源自人抗体的抗体。
如本文所用的“同型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE抗体)。
“异型”指特定同型组内的天然变体，这些变体有少数个氨基酸不同(例如，参见Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。本文所述抗体可属于任何异型。如本文所用的，称作“IgG1f”或“IgG1.1f”同型的抗体分别是异型“f”的IgG1抗体及无效应物IgG1.1抗体，即根据如Kabat中的EU索引(例如SEQ ID NO:7中所示)具有214R、356E及358M(参见表11的SEQID NO:7中的加下划线的残基)。
短语“识别抗原的抗体”及“对抗原特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
如本文所用的“分离的抗体”欲指实质上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合GITR的分离的抗体实质上不含特异性结合除GITR以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合GITR的表位的分离的抗体可与来自不同物种的其他GITR蛋白具有交叉反应性。
如本文所用，“抑制GITR-L与GITR结合”的抗体欲指在本领域公认的方法(例如本文所述基于FACS的结合分析)中，例如在使用3A9-hGITR细胞的结合分析中，以如下EC50抑制GITR-L与GITR结合的抗体：约1μg/mL或更小，例如约0.9μg/mL或更小、约0.85μg/mL或更小、约0.8μg/mL或更小、约0.75μg/mL或更小、约0.7μg/mL或更小、约0.65μg/mL或更小、约0.6μg/mL或更小、约0.55μg/mL或更小、约0.5μg/mL或更小、约0.45μg/mL或更小、约0.4μg/mL或更小、约0.35μg/mL或更小、约0.3μg/mL或更小、约0.25μg/mL或更小、约0.2μg/mL或更小、约0.15μg/mL或更小、或约0.1μg/mL或更小。
“效应物功能”指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或因其发生的生物化学事件。示例性“效应物功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应物功能(例如ADCC及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP))及细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。这些效应物功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白的Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体及可变剪接形式。FcγR家族由三种活化性受体(小鼠中为FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人类中为FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一种抑制性受体(FcγRIIB)组成。人FcγR的各种性质概述于表1中。大多数先天效应细胞类型共表达一或多种活化性FcγR及抑制性FcγRIIB，而小鼠及人类中的天然杀伤(NK)细胞选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠中为FcγRIII，人类中为FcγRIIIA)而不表达抑制性FcγRIIB。人IgG1结合大部分人Fc受体，且就其结合的活化Fc受体的类型而言被认为等效于鼠类IgG2a。
表1.人FcγR的性质
“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”指抗体重链介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合(包括结合位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体或经典补体系统的第一组分(C1q))的C-末端区。因此，Fc区包含抗体的恒定区，但排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)。在IgG、IgA及IgD抗体同型中，Fc区包含两个相同的蛋白质片段，源自抗体的两条重链的第二(CH2)及第三(CH3)恒定结构域；IgM及IgE Fc区在每一多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG而言，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2及Cγ3及介于Cγ1与Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变，但通常将人IgG重链Fc区定义为自位置C226或P230处的氨基酸残基(或该两个氨基酸之间的氨基酸)延伸至重链的羧基-末端，其中编号系根据如Kabat中的EU索引。人IgG Fc区的CH2结构域自约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中的CH2结构域的C-末端侧上，即，其自IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447。如本文所用，Fc区可为天然序列Fc(包括任何异型变体)或变体Fc(例如，非天然Fc)。Fc亦可指分离状态下的此区域，或者指包含Fc的蛋白多肽的背景中的该区域，包含Fc的蛋白多肽例如“包含Fc区的结合蛋白”(亦称作“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素))。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；及天然序列人IgG4 Fc区以及其天然变体。天然序列Fc包括Fc的各种异型(例如，参见Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。
“铰链”、“铰链结构域”或“铰链区”或“抗体铰链区”指重链恒定区中将CH1结构域接合至CH2结构域的结构域，其包括铰链的上部、中间及下部部分(Roux等人J.Immunol.1998 161:4083)。铰链在抗体的结合区与效应物区之间提供不同程度的柔性，且亦提供用于两个重链恒定区之间的分子间二硫键合的位点。如本文所用，对于所有IgG同型而言，铰链始于Glu216且终于Gly237(Roux等人，1998J Immunol 161:4083)。野生型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4铰链的序列示于表2及9中。
表2.
铰链区氨基酸
*CH1结构域的C-末端氨基酸序列。
术语“铰链”包括野生型铰链(例如表11中所述者)以及其变体(例如，非天然铰链或经修饰铰链)。举例而言，术语“IgG2铰链”包括如表11中所示的野生型IgG2铰链及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性IgG2铰链变体包括1、2、3或全部4个半胱氨酸(C219、C220、C226及C229)变为另一氨基酸的IgG2铰链。在具体实施方案中，IgG2包含C219S取代。在某些实施方案中，铰链包含来自至少两个同型的序列的杂合铰链。举例而言，铰链可包含来自一个同型的上部、中间或下部铰链且铰链的其余部分来自一个或多个其他同型。举例而言，铰链可为IgG2/IgG1铰链，且可包含，例如，IgG2的上部及中间铰链及IgG1的下部铰链。铰链可具有效应物功能或丧失效应物功能。举例而言，野生型IgG1的下部铰链提供效应物功能。
术语“CH1结构域”指重链恒定结构域中将可变结构域连接至铰链的重链恒定区域。如本文所用，CH1结构域始于A118且终于V215。术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域(例如：对于IgG1，具有SEQ ID NO:278；对于IgG2，具有SEQ ID NO:279；表11)以及其变体(例如，非天然CH1结构域或经修饰的CH1结构域)。举例而言，术语“CH1结构域”包括野生型CH1结构域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性CH1结构域包括具有改变抗体的生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH1结构域。本文提供影响抗体的生物活性的CH1结构域的修饰形式。
术语“CH2结构域”指重链恒定结构域中将铰链连接至CH3结构域的重链恒定区域。如本文所用的，CH2结构域始于P238且终于K340。术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域(例如对于IgG1，具有SEQ ID NO:280；对于IgG2，具有SEQ ID NO:297；表11)以及其变体(例如，非天然CH2结构域或经修饰的CH2结构域)。举例而言，术语“CH2结构域”包括野生型CH2结构域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性CH2结构域包括具有改变抗体的生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH2结构域。在某些实施方案中，CH2结构域包含降低效应物功能的取代A330S/P331S。本文提供影响抗体的生物活性的CH2结构域的其他修饰。
术语“CH3结构域”指重链恒定结构域中位于CH2结构域的C端侧的重链恒定区域。如本文所用，CH3结构域始于G341且终于K447。术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域(例如对于IgG1，具有SEQ ID NO:282；对于IgG2，具有SEQ ID NO:298；表11)以及其变体(例如，非天然CH3结构域或经修饰的CH3结构域)。举例而言，术语“CH3结构域”包括野生型CH3结构域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5个及/或至多5、4、3、2或1个突变(例如取代、缺失或添加)的变体。示例性CH3结构域包括具有改变抗体的生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)的突变的CH3结构域。本文提供影响抗体的生物活性的CH3结构域的修饰形式。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；及天然序列人IgG4 Fc区以及其天然变体。天然序列Fc包括Fc的各种异型(例如，参见Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。
术语“表位”或“抗原决定簇”指免疫球蛋白或抗体特异性结合抗原(例如，GITR)上的位点。表位可由蛋白质的邻接氨基酸形成(通常是线性表位)，或者由通过三级折叠而并置的非邻接氨基酸形成(通常是构象表位)。由邻接氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂通常会但不总是保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会丧失。表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定被给定抗体所结合的表位的方法(即表位定位)已为本领域熟知，且包括(例如)免疫印迹及免疫沉淀分析，其中测试来自(例如来自GITR)的重叠或邻接肽与给定抗体(例如抗GITR抗体)的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域的技术及本文所述的技术，例如，x射线结晶学及2维核磁共振及HDX-MS(例如，参见Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，第66卷，G.E.Morris编辑，(1996))。
术语“表位定位”指用于鉴别抗体-抗原识别的分子决定簇的方法。
术语“结合相同表位”在指两种或更多种抗体时，意指通过给定方法测定，各抗体结合相同的氨基酸残基区段。确定抗体与本文所述抗体是否结合“GITR上的相同表位”的技术包括，例如，表位定位方法，例如抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子解析及氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰所致的结合损失经常被视为可指示表位组分。另外，亦可使用表位定位的计算组合方法。这些方法取决于目标抗体自组合噬菌体展示肽文库亲和分离特异性短肽的能力。预计具有相同VH及VL或相同CDR1、2及3序列的抗体结合相同表位。
“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体指抑制(部分或完全)另一抗体与靶标结合的抗体。可使用已知的竞争实验确定两个抗体是否彼此竞争结合靶标，即一个抗体是否抑制另一抗体与靶标的结合及其抑制程度。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争结合靶标且将该结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的程度可因哪个抗体是“阻断抗体”(即，先与靶标一起温育的冷抗体)而不同。竞争测定可如以下中所述执行：例如，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277，或“Using Antibodies”的第11章，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。竞争的抗体结合相同表位、重叠表位或毗邻表位(例如，如由空间位阻所证明)。
其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心式竞争测定(参见Stahli等人，Methods in Enzymology 9:242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986))；固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心式测定(参见Harlow及Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125标记的固相之间标记RIA(参见Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176:546(1990))；及直接标记的RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(1990))。
如本文所用术语“特异性结合”(“specific binding”)、“选择性结合”(“selective binding”)、“选择性地结合”(“selectively binds”)及“特异性地结合”(“specifically binds”)指抗体结合预定抗原上的表位。通常，抗体(i)在通过(例如)在BIACORE 2000仪器中使用预定抗原(例如重组人GITR)作为分析物及抗体作为配体的表面等离子体共振(SPR)技术、或抗体与抗原阳性细胞的结合的Scatchard分析测定时，以约小于10-7M、例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合，及(ii)结合预定抗原的亲和力较其与预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍。因此，“特异性地结合人GITR”的抗体指以10-7M或更小、例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD结合可溶性或细胞结合的人GITR的抗体。“与食蟹猴GITR交叉反应”的抗体指以10-7M或更小、例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD结合食蟹猴GITR的抗体。在某些实施方案中，在标准结合测定中，不与非人物种的GITR交叉反应的这些抗体展现针对这些蛋白质基本上不可检测的结合。
如本文所用术语“K缔合”或“Ka”欲指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用术语“K解离”或“Kd”欲指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文所用术语“KD”欲指解离常数，其自Kd对Ka的比率(亦即Kd/Ka)求得且以摩尔浓度(M)表示。可使用本领域充分确立的方法测定抗体的KD值。测定抗体的KD的一种优选方法是通过使用表面等离子体共振、优选使用生物感测器系统(例如系统)或流式细胞术及Scatchard分析。
如本文所用的，术语IgG抗体的“高亲和力”指抗体对于靶抗原具有10-8M或更小、更优选10-9M或更小且甚至更优选10-10M或更小的KD。然而，对于其他抗体同型，“高亲和力”结合可以不同。举例而言，对于IgM同型而言“高亲和力”结合指抗体具有10-7M或更小、更优选10-8M或更小的KD。
术语“EC50”，在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内分析的上下文中，指诱导的应答是最大应答的50％，即介于最大反应与基线之间的一半时，抗体或其抗原结合部分的浓度。
术语“结合固定GITR”指本文所述的抗体结合(例如)细胞表面上表达或附接至固体载体的GITR的能力。
如本文所用，术语“交叉反应”指本文所述的抗体结合来自另一不同物种的GITR的能力。举例而言，结合人GITR的本文所述抗体亦可结合另一物种的GITR(例如，食蟹猴GITR)。如本文所用的，交叉反应性可通过下述方式测量：在结合测定(例如，SPR、ELISA)中检测与纯化抗原的特定反应性；或结合与生理上表达GITR的细胞或以其他方式与之功能互作。用于测定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如，使用BiacoreTM2000 SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
如本文所用术语“天然的”，适用于某物时，指自然界中可发现之物。举例而言，存在于可从自然界中的来源分离、且尚未在实验室中人为有意修饰的生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然的。
“多肽”指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，其中链的长度无上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有例如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键形成等修饰。“蛋白质”可包含一或多种多肽。
如本文所用术语“核酸分子”意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，且可为cDNA。
亦提供本文中(例如)表11中(例如)SEQ ID NO:13-191中所述的序列的“保守序列修饰”，即，不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸及氨基酸序列修饰。这些保守序列修饰包括保守核苷酸及氨基酸取代、以及核苷酸及氨基酸添加及缺失。举例而言，可通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变及PCR介导的诱变)向表11中的序列(例如SEQ ID NO:13-191)中引入修饰。保守氨基酸取代包括氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换者。本领域已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，举例而言，抗GITR抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基置换。鉴别不会消除抗原结合的核苷酸及氨基酸保守取代的方法为本领域所熟知(例如，参见Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997))。或者，在另一实施方案中，可沿抗GITR抗体编码序列的全部或一部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，且可针对所得的修饰的抗GITR抗体筛选结合活性。
对于核酸而言，术语“实质同源性”指示，两个核酸或它们的指定序列在最佳比对及比较(其中适当插入或缺失核苷酸)时有至少约80％的核苷酸、通常至少约90％至95％且更优选至少约98％至99.5％的核苷酸相同。或者，当各区段在选择性杂交条件下将会与链的互补物杂交时，存在实质同源性。
对于多肽而言，术语“实质同源性”指示，两个多肽或它们指定序列在最佳比对及比较(其中适当插入或缺失氨基酸)时有至少约80％的氨基酸、通常至少约90％至95％且更优选至少约98％至99.5％的氨基酸相同。
两个序列之间的同一性百分比随这些序列共有的相同位置数而变化(即同源性％＝相同位置数/总位置数乘以100)，考虑为达成两个序列最佳比对而需要引入的空位数及各空位长度。两个序列之间的序列比较及同一性百分比测定可使用数学算法来完成，如下文非限制性实例中所述。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包(可于http://www.gcg.com获得)中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵及40、50、60、70或80的空位权重及1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))使用PAM120权重残基表来确定，该算法已纳入ALIGN程序(2.0版)中，空位长度罚分为12且空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵测试，该算法已纳入GCG软件包(可于http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4且长度权重为1、2、3、4、5或6。
本文所述核酸及蛋白序列可进一步用作“查询序列”以针对数据库实施搜索以(例如)鉴别相关序列。这些搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(2.0版)实施。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程序实施(评分＝100，字长＝12)以获得与本文所述核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可利用XBLAST程序实施(评分＝50，字长＝3)以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较目的，为获得加空位比对，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述来利用加空位BLAST。在利用BLAST及加空位BLAST程序时，可使用各程序(例如，XBLAST及NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
这些核酸可存在于全细胞中，存在于细胞溶解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如染色体的其他部分)或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“使得实质上纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishingand Wiley Interscience,New York(1987)。
可根据标准技术使核酸(例如cDNA)突变以提供基因序列。对于编码序列而言，若期望，这些突变可影响氨基酸序列。具体而言，涵盖与本文所述天然V、D、J、恒定、转换及其他这些序列的实质上同源或源自其的DNA序列(其中“源自”指示序列与另一序列相同或另一序列修饰而来)。
如本文所用术语“载体”指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其指额外DNA区段可连接至其中的环形双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中额外DNA区段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入宿主细胞后可在宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及附加体型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加体型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合至该宿主细胞的基因组中，并藉此随宿主基因组一同复制。此外，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。这些载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体经常呈质体形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，这是因为质粒是载体的最常用形式。然而，亦包括可起等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺伴随病毒)。
如本文所用术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)欲指这样的细胞，该细胞包含并不天然存在于该细胞中的核酸，且可为其中已导入有重组表达载体的细胞。应了解，这些术语不仅欲指特定对象细胞，而且亦指此细胞的子代。由于突变或环境影响可使后续各代发生某些改变，因此，此子代实际上可能与母细胞不同但却仍包括于本文所用术语“宿主细胞”的范畴内。
如本文所用的，术语“抗原”指任何天然或合成免疫原性物质，例如蛋白质、肽或半抗原。抗原可为GITR或其片段。抗原亦可为期望针对其的保护或治疗性免疫应答的肿瘤抗原，例如由肿瘤细胞(例如，与抗GITR抗体组合的疫苗中)表达的抗原。抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关的抗原。肿瘤相关的抗原的实例包括(但不限于)包含以下的序列的全部或一部分的序列：βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、黑色素-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2及MUC-1抗原及生殖细胞衍生的肿瘤抗原。肿瘤相关的抗原亦包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，构建体中可包括一种以上抗原。举例而言，可将MAGE抗原与其他抗原(例如黑色素A、酪氨酸酶及gp100)以及佐剂(例如GM-CSF或IL-12)组合，并连接至抗APC抗体。
上述抗原的序列为本领域熟知。举例而言，MAGE-3cDNA序列的实例提供于US 6,235,525(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-ESO-1核酸及蛋白序列的实例提供于US 5,804,381及US 6,069,233(Ludwig Institute for Cancer Research)中；黑色素-A核酸及蛋白序列的实例提供于US 5,620,886及US 5,854,203(Ludwig Institute forCancer Research)中；NY-BR-1核酸及蛋白序列的实例提供于US 6,774,226及US 6,911,529(Ludwig Institute for Cancer Research)中且NY-CO-58核酸及蛋白序列的实例提供于WO 02090986(Ludwig Institute for Cancer Research)中；HER-2/neu蛋白的氨基酸序列的实例可以登录号AAA58637获得；且人癌胚抗原-样1(CEA-1)的核苷酸序列(mRNA)可以登录号NM020219获得。
“免疫应答”指脊椎动物内针对外来介质的生物应答，该应答保护生物体抵抗这些介质及由其引起的疾病。免疫应答由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)及由这些细胞中的任一者或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子及补体)的作用介导，其导致脊椎动物身体中选择性靶向、结合、损害、破坏及/或消除侵入的病原体、经病原体感染的细胞或组织、癌性或其他异常细胞或在自体免疫或病理炎症的情形下正常人细胞或组织。免疫应答包括(例如)T细胞(例如效应物T细胞)或Th细胞(例如CD4+或CD8+T细胞)的活化或抑制或Treg细胞的抑制。
“免疫调节剂”或“免疫调控剂”指可参与调节、调控或改变免疫应答的作用剂，例如信号传导路径的组分。“调节”、“调控”或“修饰”免疫应答指免疫系统的细胞或这些细胞(例如，效应物T细胞)的活性的任何改变。这样的调节包括免疫系统的刺激或阻抑，其可表现为各种细胞类型的数目的增加或减少、这些细胞的活性的增加或减少、或可在免疫系统内发生的任何其他变化。已鉴别抑制性及刺激性免疫调节剂，其中的一些在肿瘤微环境中可具有增强的功能。在优选实施方案中，免疫调节剂位于T细胞表面上。“免疫调节性靶标”或“免疫调控性靶标”是被某种物质、试剂、部分、化合物或分子靶向结合，且被该物质、试剂、部分、化合物或分子的结合改变活性的免疫调节剂。免疫调节性靶标包括(例如)细胞表面上的受体(“免疫调节性受体”)及受体配体(“免疫调节性配体”)。
“免疫疗法”指通过包含诱导、增强、阻抑或以其他方式修饰免疫应答的方法治疗罹患疾病、或有感染疾病的风险、或疾病复发的受试者。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”指引起增加(诱导或增强)受试者中的免疫应答用于(例如)治疗癌症的疗法。
“增强内源免疫应答”意指增加受试者中的现存免疫应答的有效性或功效。有效性及功效的此增加可通过(例如)克服阻抑内源宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源宿主免疫应答的机制来达成。
“T效应物”(“Teff”)细胞指具有细胞溶解活性的T细胞(例如，CD4+及CD8+T细胞)以及T辅助(Th)细胞，其分泌细胞因子且活化并引导其他免疫细胞，但不包括调控性T细胞(Treg细胞)。本文所述抗GITR抗体活化Teff细胞，例如CD4+及CD8+Teff细胞。
增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可自T细胞共刺激受体的增强的激动剂活性及/或抑制受体的增强的拮抗剂活性产生。增加的刺激免疫应答或免疫系统的能力可在测量免疫应答的测定、例如测量细胞因子或趋化因子释放、细胞溶解活性(在靶细胞上直接测定或经由检测CD107a或颗粒酶间接测定)及增殖变化的测定中由EC50或最大活性值的倍数增加反映。刺激免疫应答或免疫系统活性的能力可增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。
在某些实施方案中，包含经修饰的重链恒定区的抗体相对于不包含经修饰的重链恒定区的相同抗体具有更有效力的激动剂活性。抗体的增强的激动剂活性可如(例如)实例中所示通过(例如)测量与抗体接触的T细胞的IFN-γ或IL-2分泌量来测定。激动剂活性可增强至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多，如通过以下所定义：效应物T细胞中增加的细胞因子释放或增加的增殖；降低的T调控性细胞活性(若Treg上的接合降低Treg功能)；或增加的Treg耗竭。举例而言，T细胞用包含经修饰的重链恒定区的抗体刺激后分泌的IFN-γ或IL-2的量，与用不包含修饰的重链恒定区的相同抗体刺激过的T细胞相比，可以高至少10％、30％、50％、75％、2倍、3倍、5倍或更多。
如本文所用的，术语“连接”指两个或更多个分子的缔合。连接可为共价或非共价连接。连接亦可为遗传性的(即，重组融合)。这些连接可使用多种本领域公认的技术(例如化学偶联及重组蛋白产生)来达成。
如本文所用，“施用”指使用本领域技术人员已知的各种方法及递送系统向受试者导入包含治疗剂的组合物。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径(例如通过注射或输注)。如本文所用片语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用方式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注、以及体内电穿孔。或者，本文所述抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经引道、经直肠、经舌下或经局部。施用亦可(例如)实施一次、多次及/或在一个或多个延长时段内实施。
如本文所用术语“T细胞介导的反应”指由T细胞(包括效应物T细胞(例如，CD8+细胞)及辅助T细胞(例如，CD4+细胞))介导的反应。T细胞介导的反应包括(例如)T细胞细胞毒性及增殖。
如本文所用术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应”指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL反应主要由CD8+T细胞介导。
如本文所用术语“抑制”或“阻断”(例如，在提及抑制/阻断细胞上的GITR-L与GITR的结合时)可互换使用，且涵盖部分及完全抑制/阻断。在一些实施方案中，抗GITR抗体将GITR-L与GITR的结合抑制至少约50％、例如约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，如(例如)按照本文中进一步所述的那样测定的。在一些实施方案中，抗GITR抗体将GITR-L与GITR的结合抑制不超过50％、例如约40％、30％、20％、10％、5％或1％，如(例如)按照本文中进一步所述的那样测定的。
如本文所用术语“抑制肿瘤的生长”包括肿瘤生长的任何可测量的减少，例如肿瘤生长抑制至少约10％、例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％或100％。
如本文所用“癌症”指特征在于体内异常细胞不受控生长的一大类疾病。失调的细胞分裂可导致形成恶性肿瘤或细胞，侵袭相邻组织且可经由淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。
如本文所用术语“治疗”(“treat”、“treating”及“treatment”)指对受试者实施的任何类型的介入或方法或向其施用活性剂，目的是逆转、缓和、改善、抑制或缓解或预防症状、并发症、病况或与疾病相关的生物化学标记的进展、发展、严重程度或复发。治疗可针对患有疾病的受试者或无疾病的受试者(例如用于预防)。
“血液恶性病”包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性病以及脾及淋巴结的癌症。示例性淋巴瘤包括B细胞淋巴瘤(B细胞血液癌)及T细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)及大部分非霍奇金氏淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的非限制性实例包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜下相关的淋巴组织淋巴瘤、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤(与慢性淋巴细胞性白血病重叠)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症( macroglobulinemia)、结节边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病。T细胞淋巴瘤的非限制性实例包括结节外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、退行性大细胞淋巴瘤及血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤。血液恶性病亦包括白血病，例如但不限于继发性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病及急性淋巴母细胞性白血病。血液恶性病进一步包括骨髓瘤，例如但不限于多发性骨髓瘤及焖燃型多发性骨髓瘤。术语血液恶性病涵盖其他血液及/或B细胞-或T细胞-相关的癌症。
术语“有效剂量”(“effective dose”或“effective dosage”)定义为足以达成或至少部分达成期望效应的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物在单独使用或与另一治疗剂组合使用时促进疾病消退的的任何量，该疾病消退的证据是疾病症状的严重程度降低、无疾病症状的时段的频率及持续时间增加、或防止因患病所致的损害或失能。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，即在向有发生疾病或复发疾病的风险的受试者单独施用或与另一治疗剂组合施用时抑制疾病发展或复发的药物的任何量。可使用多种本领域技术人员已知的方法、例如在临床试验期间在人受试者中、在预测人体内效能的动物模型系统中、或通过在体外测定中测定试剂的活性评估治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发展或复发的能力。
举例而言，抗癌剂是促进受试者中癌症消退的药物。在优选实施方案中，药物的治疗有效量促进癌症消退至消除癌症的程度。“促进癌症消退”意指单独或与抗新生物剂组合施用有效量的药物可减少肿瘤生长或大小、使肿瘤坏死、减少至少一种疾病症状的严重程度、增加无疾病症状的时段的频率及持续时间、防止因患病所致的损害或失能、或以其他方式改善患者的疾病症状。另外，关于治疗的术语“有效”及“有效性”包括药理学有效性及生理安全性。药理学有效性指药物促进患者中癌症消退的能力。生理安全性指因药物施用引起的细胞、器官及/或生物体水平(不利效应)的毒性或其他不利生理效应的程度。
举例而言，对于肿瘤的治疗，药物的治疗有效量或剂量优选相对于未治疗的受试者将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％，更优选至少约80％。在最佳实施方案中，药物的治疗有效量或剂量完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即优选将细胞生长或肿瘤生长抑制100％。可使用下文所述的测定来评估化合物抑制肿瘤生长的能力。或者，组合物的此性质可通过检验化合物抑制细胞生长的能力来评估，该抑制可通过熟练从业人员已知的测定在体外测量。在本文所述的其他优选实施方案中，可观察到肿瘤消退且其持续至少约20天、更优选至少约40天或甚至更优选至少约60天的时段。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人及其他哺乳动物受试者。
如本文所用术语“受试者”包括任何人或非人动物。举例而言，本文所述方法及组合物可用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行类等。
如本文所用术语“ug”及“uM”可与“μg”及“μM”互换使用。
在以下子部分中进一步详细阐述本文所述各个方面。
I.抗GITR抗体
本文阐述特征在于特定功能特征或性质的抗体，例如完全人抗体。举例而言，抗体特异性结合人GITR。另外，抗体可与来自一或多种非人灵长类动物的GITR(例如食蟹猴GITR)交叉反应。
除特异性结合可溶性及/或膜结合的人GITR以外，本文所述抗体展现以下功能性质中的一或多者：
(a)结合食蟹猴GITR；
(b)刺激或增强免疫应答；
(c)活化T细胞(如通过(例如)增强的细胞因子分泌及/或增殖所证明)；
(d)抑制GITRL与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合；
(e)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(f)结合人GITR的N-末端部分中的构象表位；
(g)结合糖基化及未糖基化人GITR；及
(h)在没有与Fc受体结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性。
优选地，抗GITR抗体以高亲和力、例如以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M或10- 9M至10-7M的KD结合GITR。在某些实施方案中，抗GITR抗体如(例如)通过Biacore所测定以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD结合可溶性人GITR。在某些实施方案中，抗GITR抗体如(例如)通过流式细胞术及Scatchard曲线所测定以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10- 11M至10-9M或10-10M至10-9M的KD结合(例如)活化人T细胞上的结合的(例如，细胞膜结合的)人GITR。在某些实施方案中，抗GITR抗体如(例如)通过FACS所测定以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M的EC50结合(例如)活化人T细胞上的结合的(例如，细胞膜结合的)人GITR。在某些实施方案中，抗GITR抗体以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M的KD结合可溶性人GITR，且以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M的KD或EC50结合细胞膜结合的人GITR。
抗GITR抗体可如(例如)通过FACS测量(例如，如实施例中所述)以(例如)100nM或更小、10nM或更小、100nM至0.01nM、100nM至0.1nM、100nM至1nM、或10nM至1nM的EC50结合食蟹猴GITR，例如结合膜结合的食蟹猴GITR。
抗GITR抗体可通过(例如)活化Teff细胞、限制Treg细胞对T效应细胞的阻抑、耗竭及/或抑制肿瘤Treg细胞及/或活化(例如)肿瘤中的NK细胞刺激或增强免疫应答。举例而言，抗GITR抗体可活化或共刺激Teff细胞，如通过(例如)增强的细胞因子(例如，IL-2及IFN-γ)分泌及/或增强的增殖所证明。在某些实施方案中，亦提供CD3刺激。在某些实施方案中，GITR抗体将IL-2分泌增加50％、100％(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大的因数，视情况最大值为至多10倍、30倍、100倍，如(例如)在原代人T细胞或表达人GITR的T细胞上所测量的(例如，如实施例中进一步阐述)。在某些实施方案中，GITR抗体将IFN-γ分泌增加50％、100％(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大的因数，视情况最大值为至多10倍、30倍、100倍，如(例如)在原代人T细胞或表达人GITR的T细胞上所测量的(例如，如实施例中进一步阐述)。
抗GITR抗体可(例如)以10μg/ml或更小、1μg/ml或更小、0.01μg/ml至10μg/ml、0.1μg/ml至10μg/ml或0.1μg/ml至1μg/ml的EC50抑制人GITRL与细胞(例如表达人GITR的3A9细胞)上的人GITR的结合(参见实施例5)。
在某些实施方案中，抗GITR抗体至多仅部分抑制人GITRL与细胞(例如活化T细胞)上的人GITR的结合(参见实施例5)。
抗GITR抗体可结合表位，例如人GITR的N-末端部分中的构象表位，例如位于成熟人GITR的氨基酸1至39内的表位(参见实施例9)，如(例如)通过抗体与人GITR的片段(例如人GITR的天然(即，非变性)片段)的结合所确定的。抗GITR抗体可结合成熟人GITR的氨基酸1至20或位于这些氨基酸内的表位，如(例如)通过抗体与人GITR的片段[例如人GITR的天然(即，非变性)片段]结合，而后酶裂解或HDX所确定的(分别参见实施例11及12)。抗GITR抗体可结合成熟人GITR的氨基酸3至20(PTGGPGCGPGRLLLGTGT，SEQ ID NO:217)或这些氨基酸内的表位。抗GITR抗体可结合成熟人GITR的氨基酸3至20及氨基酸33至40(即氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218))或这些氨基酸内的表位。在某些实施方案中，抗GITR抗体结合糖基化及未糖基化人GITR。在某些实施方案中，抗GITR抗体结合氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)，如(例如)使用实施例中所述的方案通过HDX所确定的。
抗GITR抗体可与包含本文所述CDR或可变区的抗GITR抗体(例如28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10)竞争结合GITR(或抑制所述抗体的结合)。在某些实施方案中，抗GITR抗体将28F3、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8、19D3、18E10及/或6G10与人GITR的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10将抗GITR抗体与人GITR的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，抗GITR抗体将28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10与人GITR的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，且28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10将抗GITR抗体与人GITR的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(例如，在两个方向上竞争)。
在某些实施方案中，抗GITR抗体诱导或增强T细胞活化而无需多价交联，如(例如)无需FcR结合所确定的。在某些实施方案中，抗GITR抗体是多价的，例如二价。在某些实施方案中，抗GITR抗体并非单价。本文中已显示F’(ab)2片段较Fab片段更有效地活化T细胞(参见实施例)。
在某些实施方案中，抗GITR抗体的激动剂活性无需经由Fc受体交联，然而，与Fc受体的交联相对于未结合Fc受体的相同抗体增强其激动剂活性。
在某些实施方案中，抗GITR抗体具有以下特征中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12者：
(1)结合可溶性人GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD，如(例如)通过Biacore测量的；
(2)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的KD，如(例如)通过Scatchard测量的；
(3)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50，如(例如)通过FACS测量的；
(4)结合食蟹猴GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50，例如结合膜结合的食蟹猴GITR，如(例如)通过FACS测量的；
(5)诱导或增强T细胞活化，例如在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3浓度存在下)，如通过(i)表达GITR的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖所证明的；
(6)诱导或增强T细胞活化而无需多价交联；
(7)在没有与Fc受体结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；
(8)抑制GITR配体与GITR的结合，例如以1μg/mL或更小的EC50，如通过FACS测量的，例如在利用3A9-hGITR细胞的测定中；
(9)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(10)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位，例如氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的不连续表位；
(11)结合O-连接及N-连接的糖基化及未糖基化人GITR；及
(12)在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10竞争结合人GITR。
抗GITR抗体亦可诱导GITR在活化T细胞(例如CD4+及CD8+T细胞)中内化，例如在10分钟、30分钟或60分钟内内化，以及后续的信号转导，例如p65NF-kB及p38MAP激酶的活化(即，磷酸化)。
因此，应理解，如根据本领域已知的方法测定并在本文中阐述的展现这些功能性质中的一或多者(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物活性或诸如此类)的抗体与具体活性相对于在抗体不存在时(或在存在不相关特异性的对照抗体时)观察到的活性统计学上显著的差异有关。优选地，抗GITR抗体诱导的所测量参数(例如，T细胞增殖、细胞因子产生)的增加实现所测量参数在统计学上显著增加至少10％、更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍，且在某些优选实施方案中，本文所述抗体可将所测量参数增加大于92％、94％、95％、97％、98％、99％、100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍。相反，抗GITR抗体诱导的所测量参数(例如，肿瘤体积、结合GITR的GITR-L、肿瘤中调节性T细胞的量)的减少实现所测量参数在统计学上显著减少至少10％、更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，且在某些优选实施方案中，本文所述抗体可将所测量参数减少大于92％、94％、95％、97％、98％或99％。
本领域已知用于评估抗体对不同物种的GITR的结合亲和力的标准测定，包括例如ELISA、Western印迹及RIA。适宜的测定详细阐述于实施例中。亦可通过本领域已知的标准测定(例如通过Biacore分析)评价抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。用于评估抗体对GITR的功能性质(例如，配体结合、T细胞增殖、细胞因子产生)的效应的测定更详细阐述于下文及实施例中。
在某些实施方案中，抗GITR抗体并非天然抗体或是非天然存在的抗体。举例而言，抗GITR抗体具有不同于天然抗体的翻译后修饰，例如具有更多的、更少的或不同类型的翻译后修饰。
II.示例性抗GITR抗体
本文所述特定抗体是具有如实施例1中所述分离并在结构上表征的抗体28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10的CDR及/或可变区序列的抗体(例如单克隆抗体)，以及与其可变区或CDR序列具有至少80％同一性(例如，至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性)的抗体。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10的VH氨基酸序列分别描述于SEQ IDNO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的VL氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336中。
因此，本文提供包含重链及轻链可变区的分离的抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
亦提供包含重链及轻链可变区的分离的抗体或其抗原结合部分，其中轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
本文提供包含以下的分离的抗体或其抗原结合部分：
(a)分别包含SEQ ID NO:13及14的重链及轻链可变区序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:26及27的重链及轻链可变区序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:39及40的重链及轻链可变区序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:52及53的重链及轻链可变区序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:52及54的重链及轻链可变区序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:71及72的重链及轻链可变区序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:84及85的重链及轻链可变区序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:97及98的重链及轻链可变区序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:97及99的重链及轻链可变区序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:115及116的重链及轻链可变区序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:128及129的重链及轻链可变区序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:128及130的重链及轻链可变区序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:335及336的重链及轻链可变区序列。
抗GITR抗体可包含28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10或其组合的重链及轻链CDR1、CDR2及CDR3。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10的VHCDR1的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138及342中。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10的VH CDR2的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:21、34、47、63、79、92、107、123、139及343中。28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10的VH CDR3的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:22、35、48、64、80、93、108、124、140及344中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的VL CDR1的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的VL CDR2的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346中。28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的VL CDR3的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347中。CDR区是使用Kabat系统(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)界定的。
鉴于这些抗体中的每一者皆结合GITR，且抗原结合特异性主要是由CDR1、2及3区提供的，可“混合并匹配”VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列(即可混合并匹配来自不同抗体的CDR，但每一抗体必须含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3)以产生本文所述其他抗GITR结合分子。可使用上文及实施例中所描述的结合测定(例如ELISA)来测试这些“混合并匹配”抗体的GITR结合。优选地，在混合并匹配VH CDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2及/或CDR3序列用结构上类似的CDR序列置换。同样，在混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2及/或CDR3序列用结构上类似的CDR序列置换。本领域技术人员将容易明了，可将一个或多个VH及/或VL CDR区序列替换为来自本文公开的单克隆抗体28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10CDR序列的结构类似的序列，以产生新的VH及VL序列。
本文提供包含以下的分离的抗体或其抗原结合部分：
(a)包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区CDR1：SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138及342；
(b)包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区CDR2：SEQ ID NO:21、34、47、63、79、92、107、123、139及343；
(c)包含选自下组的氨基酸序列的重链可变区CDR3：SEQ ID NO:22、35、48、64、80、93、108、124、140及344；
(d)包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区CDR1：SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345；
(e)包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区CDR2：SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346；及
(f)包含选自下组的氨基酸序列的轻链可变区CDR3：SEQ ID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347；
其中抗体特异性结合人GITR。
在一个实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中重链可变区CDR1、CDR2及CDR3区包含：
(a)SEQ ID NO:20-22；
(b)SEQ ID NO:33-35；
(c)SEQ ID NO:46-48；
(d)SEQ ID NO:62-64；
(e)SEQ ID NO:78-80；
(f)SEQ ID NO:91-93；
(g)SEQ ID NO:106-108；
(h)SEQ ID NO:122-124；
(i)SEQ ID NO:138-140；或
(j)SEQ ID NO:342-344；
其中抗体特异性结合人GITR。
在另一实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3区包含：
(a)SEQ ID NO:23-25；
(b)SEQ ID NO:36-38；
(c)SEQ ID NO:49-51；
(d)SEQ ID NO:65-67；
(e)SEQ ID NO:68-70；
(f)SEQ ID NO:81-83；
(f)SEQ ID NO:94-96；
(g)SEQ ID NO:109-111；
(h)SEQ ID NO:112-114；
(i)SEQ ID NO:125-127；
(j)SEQ ID NO:141-143；
(k)SEQ ID NO:144-146；或
(l)SEQ ID NO:345-347；
其中抗体特异性结合人GITR。
在具体实施方案中，抗体包含重链及轻链可变区，其中:
(a)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:20-22，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:23-25；
(b)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:33-35，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:36-38；
(c)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:46-48，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:49-51；
(d)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:62-64，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:65-67；
(e)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:62-64，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:68-70；
(f)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:78-80，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:81-83；
(g)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:91-93，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:94-96；
(h)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:106-108，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:109-111；
(i)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:106-108，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:112-114；
(j)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:122-124，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:125-127；
(k)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:138-140，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:141-143；
(l)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:138-140，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:144-146；或
(m)重链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:342-344，且轻链可变区CDR1、CDR2及CDR3分别包含SEQ ID NO:345-347；
其中抗体特异性结合人GITR。
本文所述的VH结构域或其一个或多个CDR可连接至恒定结构域用于形成重链，例如全长重链。类似地，本文所述的VL结构域或其一个或多个CDR可连接至恒定结构域用于形成轻链，例如全长轻链。全长重链(C-末端赖氨酸(K)除外或C-末端甘氨酸及赖氨酸(GK)除外，它们可以不存在)及全长轻链组合以形成全长抗体。
本文所述VH结构域可融合至人IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，其是天然存在的或经修饰的)的恒定结构域，例如，如本文进一步描述的。举例而言，VH结构域可包含与以下人IgG1氨基酸序列融合的本文所述的任一VH结构域的氨基酸序列：
人IgG1恒定结构域亦可为异型变体的恒定结构域。举例而言，IgG1的异型变体包含R107K、E189D及M191L(在上文中加下划线且编号系根据SEQ ID NO:7中的编号)。在全长重链区内，这些氨基酸取代编号为R214K、E356D及M358L。
本文所述VL结构域可融合至人κ或λ轻链的恒定结构域。举例而言，VL结构域可包含与以下人IgG1κ轻链氨基酸序列融合的本文所述任一VL结构域的氨基酸序列：
在某些实施方案中，重链恒定区在C-末端处包含赖氨酸或另一氨基酸，例如，其包含以下最后氨基酸：对于重链为LSPGK(SEQ ID NO:220)。在某些实施方案中，重链恒定区在C-末端处缺少一个或多个氨基酸，例如C-末端序列为LSPG(SEQ ID NO:276)或LSP。
示例性重链及轻链的氨基酸序列描述于表11中，重链对应于SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，且轻链对应于SEQ ID NO:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371。
包含与表11中描述的重链或轻链中的任意者(或其可变区)至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或70％相同的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:13-19、26-32、40-45、52-61、71-77、84-90、97-105、116-121、128-137、227-275、337-341、348-352、361、362及371)的重链及轻链可用于形成具有期望的特征(例如本文进一步描述者)的抗人GITR抗体。示例性变体是包含(例如)恒定结构域的异型变化及/或可变区或恒定区的突变(例如本文公开的突变)者。包含与表11中描述的重链或轻链中的任一者(或其可变区)至多1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2或1个氨基酸不同(通过取代、添加或缺失)的氨基酸序列的重链及轻链可用于形成具有期望特征的抗人GITR抗体，例如本文进一步描述者。
在各个实施方案中，上述抗体展现以下功能性质中的一或多者、两者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或更多者、十者或更多者、十一者或全部：
(1)结合可溶性人GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD，例如通过Biacore测量的；
(2)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的KD，例如通过Scatchard测量的；
(3)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(4)结合膜结合的食蟹猴GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(5)诱导或增强T细胞活化，例如在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3浓度存在下)，如通过(i)表达GITR的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖所证明的；
(6)诱导或增强T细胞活化而无需多价交联；
(7)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合，例如以1μg/mL或更小的EC50，例如通过FACS测量的；
(8)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(9)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位，例如氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的不连续表位；
(10)结合O-连接及N-连接的糖基化及未糖基化人GITR；
(11)在没有与Fc受体的结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；及
(12)在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10竞争结合人GITR。
这样的抗体包括(例如)人抗体、人源化抗体、嵌合抗体。
在一个实施方案中，本文所述抗GITR抗体结合糖基化(例如，N-连接或O-连接糖基化)及未糖基化人GITR。
在一个实施方案中，本文所述抗GITR抗体结合构象表位。
在一个实施方案中，本文所述抗GITR抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的以下区域内的氨基酸残基：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO:215)，
对应于成熟人GITR同种型1、2或3(SEQ ID NO:4)的氨基酸残基1-39。
在一个实施方案中，本文所述抗GITR抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的以下区域内的氨基酸残基：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:216)，
对应于成熟人GITR同种型1、2或3(SEQ ID NO:4)的氨基酸残基1-20。
在一个实施方案中，本文所述抗GITR抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的以下区域内的氨基酸残基：
PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)。
修饰的重链恒定结构域
如本文进一步论述，本文所述抗GITR抗体的重链恒定区可属于任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4或其组合及/或其修饰形式。抗GITR抗体可具有效应物功能、或可具有降低的效应物功能、或无效应物功能。在某些实施方案中，抗GITR抗体包含为抗体提供增强的性质的修饰的重链恒定区。如实施例中所示，具有包含IgG2铰链的修饰的重链恒定区的抗GITR抗体相对于具有相同可变区但具有非IgG2铰链的抗体是更有效力的激动剂。举例而言，包含IgG2铰链、IgG1同型的CH2及CH3结构域且具有或无效应物功能的抗体具有增强的激动剂活性，如通过与抗体一起温育的T细胞的增强的IFN-γ及IL-2分泌所测量。不希望限于具体作用机制，猜想具有IgG2铰链的抗GITR抗体形成较大的抗体/抗原复合物且更有效地经内化，藉此产生增加的激动剂活性。认为大复合物的形成是由于IgG2铰链相对于其他同型(例如，IgG1、IgG3及IgG4)的铰链的劲度较高所致。如实施例中进一步描述的，增强的激动剂活性似乎与抗体的较高或较低亲和力无关。因此，本文提供具有修饰的重链恒定区的抗GITR抗体，其中抗GITR抗体具有增强的激动剂活性，且其中，具有修饰的重链恒定区的抗体结合GITR的亲和力与具有相同可变区但具有不同重链恒定区的抗体类似。
因此，本文亦提供增强抗GITR抗体的激动剂活性的方法，其包括提供具有非IgG2铰链的抗GITR抗体、及用IgG2铰链置换非IgG2铰链。可受益于该修饰的抗体包括任何抗GITR抗体，例如本领域已知的那些，例如抗体6C8或具有6C8的CDR的人源化抗体，如(例如)WO2006/105021中所述；WO2011/028683、JP2008278814、KR20080105674、US20040072566、US2001472565、US20140065152或WO2015/031667中所述的抗体。
在某些实施方案中，修饰的重链恒定区包含IgG2同型的铰链(“IgG2铰链”)及CH1、CH2及CH3结构域。在某些实施方案中，修饰的重链恒定区包含IgG2铰链及CH1、CH2及CH3结构域，其中CH1、CH2及CH3结构域中的至少一者不属于IgG2同型。IgG2铰链可为野生型IgG2铰链，例如野生型人IgG2铰链(例如，ERKCCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO:291)或其变体，前提是IgG2铰链保留赋予抗体相对于包含非IgG2铰链的相同抗体增强的活性的能力。在某些实施方案中，IgG2铰链变体保留与野生型IgG2铰链类似的刚性或劲度。铰链的刚性可通过(例如)计算机建模、电子显微镜、光谱(例如核磁共振(NMR))、X射线结晶照相术(B-因子)或沉降速度分析超离心(AUC)测定以测量或比较包含铰链的抗体的回转半径。若包含某铰链的抗体在前一句中所述的一种测试中获得的值与具有不同铰链(例如IgG1铰链)的相同抗体的值相差小于5％、10％、25％、50％、75％或100％，则该铰链相对于另一铰链可具有类似的或较高的刚性。从这些测试出发，本领域技术人员通过阐释这些测试的结果应能够确定铰链是否具有与另一铰链至少类似的刚性。一种示例性人IgG2铰链变体是包含对四个半胱氨酸残基(即，C219、C220、C226及C229)中的一或多者的取代的IgG2铰链。半胱氨酸可被丝氨酸取代。一种示例性IgG2铰链是包含C219S突变(例如，ERKSCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO:292)的人IgG2铰链。其他可使用的IgG2铰链变体包括包含C220、C226及/或C229取代(例如C220S、C226S或C229S突变(其可与C219S突变组合))的人IgG2铰链。IgG2铰链亦可为这样的IgG2铰链，其中铰链的一部分是另一同型的铰链(即，嵌合铰链)，前提是嵌合铰链的刚性至少类似于野生型IgG2铰链的刚性。举例而言，IgG2铰链可为这样的IgG2铰链，其中下部铰链(如表2中所定义)属IgG1同型，而且是，例如，野生型IgG1下部铰链。可用于IgG2铰链中的其他IgG2铰链突变包括SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SEFF及GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)突变。
若“杂合”或“嵌合”铰链的一半以上的连续氨基酸来自某种特定同型，则称铰链属于该同型。举例而言，某铰链具有IgG2的上部铰链及中部铰链、及IgG1的下部铰链，这样的铰链视为IgG2铰链。
在某些实施方案中，经修饰重链恒定区包含CH1结构域，其是IgG1或IgG2同型的野生型CH1结构域(分别为“IgG1 CH1结构域”或“IgG2 CH1结构域”)。亦可使用IgG3及IgG4同型的CH1结构域(分别为“IgG3 CH1结构域”及“IgG2 CH1结构域”)。CH1结构域亦可为野生型CH1结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH1结构域的变体。CH1结构域的示例性变体包括A114C及T173C。
在某些实施方案中，修饰的重链恒定区包含CH2结构域，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型的野生型CH2结构域(分别为“IgG1 CH2结构域”、“IgG2 CH2结构域”、“IgG3 CH2结构域”或“IgG4 CH2结构域”)。CH2结构域亦可为野生型CH2结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2结构域的变体。CH2结构域的示例性变体包括调节抗体的Fc区的生物活性(例如ADCC或CDC)或调节抗体的半衰期或其稳定性的变体。在一个实施方案中，CH2结构域是具有A330S及P331S突变的人IgG1 CH2结构域，其中CH2结构域相对于无突变的相同CH2突变具有降低的效应物功能。其他突变进一步描述于本文中别处。
在某些实施方案中，修饰的重链恒定区包含CH3结构域，其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型的野生型CH3结构域(分别“IgG1 CH3结构域”、“IgG2 CH3结构域”、“IgG3 CH3结构域”或“IgG4 CH3结构域”)。CH3结构域亦可为野生型CH3结构域的变体，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域的变体。CH3结构域的示例性变体包括调节抗体的Fc区的生物活性(例如ADCC或CDC)或调节抗体的半衰期或其稳定性的变体。
通常，CH1、铰链、CH2或CH3结构域的变体可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变、及/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个突变、或1-10或1-5个突变，或包含与相应野生型结构域(分别CH1、铰链、CH2或CH3结构域)的氨基酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，前提是包含特定变体的重链恒定区保留必需生物活性。
表3描述包含人CH1、铰链、CH2及/或CH3结构域的示例性人重链恒定区，其中每一结构域皆是为重链恒定区提供期望生物活性的野生型结构域或其变体。表3中的未填充单元格指示结构域存在或不存在，且若存在则可属任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。举例而言，包含表3中的重链恒定区1的抗体是包含至少包含IgG2铰链的重链恒定区的抗体，且其亦可包含CH1、CH2及/或CH3结构域，且若该CH1、CH2及/或CH3结构域存在，则属IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。作为用于理解表3的另一示例，包含重链恒定区8的抗体是包括包含IgG1 CH1结构域、及IgG2铰链、IgG1 CH2结构域的重链恒定区的抗体，其亦可包含或不包含CH3结构域，若CH3结构域存在则可属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
表3.人重链恒定区的示例性构形
*经修饰的重链恒定区
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含表3中所示的重链恒定区且相对于包含不包含该特定重链恒定区的重链恒定区的相同抗体具有增强的激动剂活性。在某些实施方案中，包含表3中所示的重链恒定区的抗体相对于包含不包含IgG2铰链或相同IgG2铰链的重链恒定区的相同抗体具有增强的激动剂活性。在某些实施方案中，包含表3中所示的重链恒定区的抗体相对于包括包含非IgG2铰链且包含(例如)IgG1、IgG3或IgG4铰链的重链恒定区的相同抗体具有增强的激动剂活性。在某些实施方案中，包含表3中所示的重链恒定区的抗体相对于包含不包含相同CH1、铰链、CH2或CH3结构域中的一或多者的重链恒定区的相同抗体具有增强的激动剂活性。举例而言，在某些实施方案中，包含表3中所示的重链恒定区的抗体相对于包含不包含IgG2铰链及特定同型的CH1、CH2及/或CH3结构域的重链恒定区的相同抗体具有增强的激动剂活性。举例而言，包含表3中所示的重链恒定区22的抗体相对于以下抗体可具有增强的激动剂活性：(i)包含不包含IgG2铰链且包含(例如)非IgG2铰链(例如，IgG1、IgG3或IgG4铰链)的重链恒定区的相同抗体；(ii)包含不包含IgG2铰链及IgG1CH1且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1的重链恒定区的相同抗体；(iii)包含不包含IgG2铰链及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG2 CH2的重链恒定区的相同抗体；(iv)包含不包含IgG2铰链及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体；(v)包含不包含IgG2铰链、IgG1 CH1及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2的重链恒定区的相同抗体；(vi)包含不包含IgG2铰链、IgG1 CH1及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体；(vii)包含不包含IgG2铰链、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG2 CH及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体；(viii)或包含不包含IgG2铰链、IgG1 CH1、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2铰链及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2及/或非IgG1 CH3的重链恒定区的相同抗体。
可连接至抗GITR可变区的示例性经修饰重链恒定区(例如本文中所述的彼等)提供于表4中，其描述结构域中的每一者的身份。
表4：示例性经修饰重链恒定区
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含经修饰重链恒定区，其包括包含SEQ ID NO:291、292、293或294的IgG2铰链或其变体，例如包含如下氨基酸序列的IgG2铰链：(i)与SEQID NO:291、292、293或294有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(ii)与SEQ IDNO:291、292、293或294有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(iii)与SEQID NO:291、292、293或294有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:291、292、293或294至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区为抗GITR抗体提供增强的激动剂活性。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含经修饰重链恒定区，其包括包含SEQ ID NO:278的IgG1 CH1结构域或包含SEQ ID NO:279的IgG2 CH1结构域，或者SEQ ID NO:278或279的变体，该变体(i)与SEQ ID NO:278或279有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(ii)与SEQ ID NO:278或279有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(iii)与SEQ ID NO:278或279有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:278或279至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中包含经修饰重链恒定区的抗GITR抗体相对于具有另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)的抗GITR抗体或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区具有增强的激动剂活性。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含经修饰重链恒定区，其包括包含SEQ ID NO:280或281或者SEQ ID NO:280或281的变体的IgG1 CH2结构域，该变体(i)与SEQ ID NO:280或281有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(ii)与SEQ ID NO:280或281有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(iii)与SEQ ID NO:280或281有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:280或281至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区为抗GITR抗体提供增强的激动剂活性。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含经修饰重链恒定区，其包括包含SEQ ID NO:282或SEQ ID NO:282的变体的IgG1 CH3结构域，该变体(i)与SEQ ID NO:282有1、2、3、4或5个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(ii)与SEQ ID NO:282有至多5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(iii)与SEQ ID NO:282有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5个氨基酸取代、添加或缺失的不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:282至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的经修饰重链恒定区提供增强的激动剂活性。
经修饰重链恒定区亦可包含上述CH1、铰链、CH2及CH3结构域的组合。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含经修饰重链恒定区，其包含SEQ ID NO:223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290或SEQ ID NO:223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290的变体，该变体(i)与SEQ ID NO:223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(ii)与SEQ ID NO:223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加或缺失的不同；(iii)与SEQ ID NO:223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10个氨基酸取代、添加或缺失的不同及/或(iv)包含与SEQ ID NO:223、224、225、226、283、284、285、286、287、288、289或290至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中在(i)-(iv)中的任一者中，氨基酸取代可为保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代；且其中经修饰重链恒定区相对于另一重链恒定区(例如包含非IgG2铰链的重链恒定区)或相对于包含非IgG2铰链的相同经修饰重链恒定区提供增强的激动剂活性。
经修饰重链恒定区可具有(i)相对于野生型重链恒定区类似、降低或增加的效应物功能(例如，结合FcγR)及或(ii)相对于野生型重链恒定区类似、降低或增加的半衰期(或结合FcRn受体)。
III.具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区及/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。
如本文所展示的，制备对GITR具有特异性的人抗体，其包含作为人种系VH 3-33基因、VH 3-10基因、VH 3-15基因、VH 3-16、VH JH6b基因、VH 6-19基因、VH 4-34基因及/或VHJH3b基因的产物或源自上述基因的重链可变区。因此，本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含作为选自下组的人VH种系基因的产物或源自这些基因的重链可变区：VH 3-33、VH 3-10、VH 3-15、VH 3-16、VH JH6b、VH 6-19、VH 4-34及/或VH JH3b。
制备对GITR具有特异性的人抗体，其包含作为人种系VK L6基因、VK L18基因、VKL15基因、VK L20基因、VK A27基因、VK JK5基因、VK JK4基因、VK JK2基因及VK JK1基因的产物或源自这些基因的轻链可变区。因此，本文提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含作为选自下组的人VK种系基因的产物或源自这些基因的轻链可变区：VK L6、VKL18、VK L15、VK L20、VK A27、VK JK5、VK JK4、VK JK2及VK JK1。
本文所述的优选抗体包括这样的抗体，其包含：作为上文所列举的人种系VH基因中之一的产物或源自上文所列举的人种系VH基因中之一的重链可变区，且包含作为上文所列举的人种系VK基因中之一的产物或源自上文所列举的人种系VK基因中之一的轻链可变区，如图2-11中所示。
如本文所用，若抗体的可变区是自某种使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的，则人抗体包含作为该特定种系序列的“产物”或“源自”该特定种系序列的重链或轻链可变区。这些系统包括利用所关注抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠实施免疫或利用所关注抗原筛选展示于噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可通过以下方式来鉴别：比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并选择序列最接近人抗体序列(即最大同一性％)的人种系免疫球蛋白序列。作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异，其原因是，例如，天然体细胞突变或有意引入定点突变。然而，所选人抗体的氨基酸序列通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)相比时将人抗体标识为人的氨基酸残基。在某些情形下，人抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，源自特定人种系序列的人抗体与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列将展示不超过10个氨基酸的差异。在某些情形下，人抗体与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可展示不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸的差异。
IV.同源抗体
本文涵盖具有重链及轻链可变区的抗体，这些重链及轻链可变区包含与本文所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，且其中抗体保留本文所述抗GITR抗体的期望功能性质。
举例而言，分离的抗GITR抗体或其抗原结合部分可包含重链可变区及轻链可变区，其中：
(a)重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335；
(b)轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336；
(c)抗体特异性结合GITR，且
(d)抗体展现以下功能性质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部：
(1)以如(例如)通过Biacore测量的(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD结合可溶性人GITR；
(2)以如(例如)通过Scatchard测量的(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的KD结合膜结合的人GITR；
(3)以如(例如)通过FACS测量的(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50结合膜结合的人GITR；
(4)以如(例如)通过FACS测量的(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50结合食蟹猴GITR，例如结合膜结合的食蟹猴GITR；
(5)(例如)在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3浓度存在下)诱导或增强T细胞活化，如通过(i)表达GITR的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖所证明；
(6)诱导或增强T细胞活化而无需多价交联；
(7)以如通过FACS测量的(例如)1μg/mL或更小的EC50抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合；
(8)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(9)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位，例如氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的不连续表位；
(10)结合O-连接及N-连接糖基化及未糖基化人GITR；
(11)在不与Fc受体结合下具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；
(12)在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10竞争结合人GITR。
在各个实施方案中，抗体可展现如上文(1)至(12)所列举的功能性质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种、十种、十一种或全部。该抗体可为，例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
分离的抗GITR抗体或其抗原结合部分可包含重链及轻链，其中：
(a)重链包含与选自下组的氨基酸序列的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，前提是在某些实施方案中，若序列是无效应物重链的序列，则导致重链无效应物的特定突变不被修饰(即，不对A234、E235、A237、S330及S331进行修饰)；
(b)轻链包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371，或相对于选自下组的氨基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO:16、19、29、32、42、45、56、57、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137、338、341及371；
(c)抗体特异性结合GITR，且
(d)抗体展现以下功能性质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部：
(1)结合可溶性人GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD，例如通过Biacore测量的；
(2)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的KD，例如通过Scatchard测量的；
(3)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(4)结合膜结合的食蟹猴GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(5)诱导或增强T细胞活化，例如在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3浓度存在下)，如通过(i)表达GITR的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖所证明的；
(6)诱导或增强T细胞活化而无需多价交联；
(7)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合，例如以1μg/mL或更小的EC50，例如通过FACS测量的；
(8)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(9)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位，例如氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的不连续表位；
(10)结合O-连接及N-连接糖基化及未糖基化人GITR；
(11)在没有与Fc受体的结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；及
(12)在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10竞争结合人GITR。
亦提供包含如下VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及/或VLCDR3的抗GITR抗体：其与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10的相应CDR有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸变化(即，氨基酸取代、添加或缺失)的不同。在某些实施方案中，抗GITR抗体在1、2、3、4、5或6个CDR中的每一者中相对于28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10中的相应序列包含1-5个氨基酸变化。在某些实施方案中，抗GITR抗体在所有CDR中相对于28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及/或6G10中的CDR包含总共1-5个氨基酸变化。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含由28F3的VH及VL CDR组成的VH及VL CDR，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸是本文公开的其他抗GITR抗体的一个或多个氨基酸。
举例而言，在某些实施方案中，抗GITR抗体包含相对于SYGMH(SEQ ID NO:20)包含一个或多个氨基酸修饰的VHCDR1，且可包含，例如，以下简并序列之一：
SYGXH(SEQ ID NO:372)，其中X是任何氨基酸，例如M或F；
X1YGX2H，其中X1是任何氨基酸，例如S、N或D；且X2是任何氨基酸，例如M或F；及
X1YGX2X3，其中X1是任何氨基酸，例如S、N或D；X2是任何氨基酸，例如M或F，且X3是任何氨基酸，例如H或Q。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含相对于VIWYEGSNKYYADSVKG(SEQ ID NO:21)包含一个或多个氨基酸修饰的VHCDR2，且可包含以下简并序列中之一：
VIWYX1GSNKX2YADSVKG(SEQ ID NO:373)，其中X1是任何氨基酸，例如E或A；且X2是任何氨基酸，例如Y或F；及
VIWYX1GSNKX2YX3DSVKG(SEQ ID NO:374)，其中X1是任何氨基酸，例如E、A、G或D；X2是任何氨基酸，例如Y或F；且X3是任何氨基酸，例如A或V。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含相对于GGSMVRGDYYYGMDV(SEQ ID NO:22)包含一个或多个氨基酸修饰的VHCDR3，且可包含，例如，以下简并序列中之一：
GGSX1VRGDYYYGMDV(SEQ ID NO:375)，其中X1是任何氨基酸，例如M或V、L、I或A。
GGSX1VRGX2YYYGMDV(SEQ ID NO:376)，其中X1是任何氨基酸，例如M或V、L、I或A；且X2是任何氨基酸，例如D或E。X1与X2的特定组合描述于实施例中。
GG(6-7aa)MDVWYYX1MDVW(SEQ ID NO:377)，其中X1是任何氨基酸，例如G、S或V。在某些实施方案中，该6-7个氨基酸对应于本文公开的抗GITR抗体的VHCDR3序列中该位置处的氨基酸。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含相对于RASQGISSALA(SEQ ID NO:23)包含一个或多个氨基酸修饰的VLCDR1，且可包含，例如，以下简并序列中之一：
RASQGISSXLA(SEQ ID NO:378)，其中X是任何氨基酸，例如A或W(或A、W或Y)；及
RASQG(2-3aa)SX1LA(SEQ ID NO:379)，其中X1是任何氨基酸，例如W、Y或A且所述2-3个氨基酸为任何氨基酸，例如GI、SVS或SVT。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含相对于DASSLES(SEQ ID NO:24)包含一个或多个氨基酸修饰的VLCDR2，且可包含，例如，以下简并序列中之一：
DASSLXS(SEQ ID NO:380)，其中X是任何氨基酸，例如E或Q；及
X1ASSX2X3X4，其中X1是任何氨基酸，例如A、D或G；X4是任何氨基酸，例如L或R；X3是任何氨基酸，例如Q、E或A；且X4是任何氨基酸，例如S或T。
在某些实施方案中，抗GITR抗体包含相对于QQFNSYPYT(SEQ ID NO:25)包含一个或多个氨基酸修饰的VLCDR3，且可包含，例如，以下简并序列中之一：
QQXNSYPYT(SEQ ID NO:381)，其中X是任何氨基酸，例如F或Y；且
QQX1X2SX3PX4T(SEQ ID NO:382)，其中X1是任何氨基酸，例如F或Y；X2是任何氨基酸，例如N或G；X3是任何氨基酸，例如Y或S；且X4是任何氨基酸，例如Y、W、I、P或Q。
具有与28F3、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8、19D3、18E10及/或6G10的那些序列同源的序列(例如分别为SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335、及SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336的VH及VL区、或分别为SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135及337、及SEQ ID NO:16、19、29、32、42、45、56、60、61、74、87、90、101、104、105、118、121、132、133、136、137及338的重链及轻链或CDR)的抗体可通过以下方式获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO:147、154、158、162、168、172、176、182、186、353及/或SEQ ID NO:148、155、159、163、164、169、173、177、178、183、187、188、354或SEQ ID NO:149、151、152、156、160、165、170、174、179、184、189、355及/或SEQ ID NO:150、153、157、161、166、171、175、180、185、190、191、356的核酸分子，然后使用本文所述的功能测定，测试被编码的改变抗体是否保留功能(即，上文(1)至(12)中描述的功能)。
V.具有保守修饰的抗体
抗GITR抗体可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一或多者包含基于本文所述的优选抗体(例如，28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10)的指定氨基酸序列或其保守修饰形式，且其中抗体保留本文所述的抗GITR抗体的期望功能性质。因此，分离的抗GITR抗体或其抗原结合部分可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区及包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，其中：
(a)重链可变区CDR3序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:22、35、48、64、80、93、108、124、140及344的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；
(b)轻链可变区CDR3序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；
(c)抗体特异性结合GITR，且
(d)抗体展现以下功能性质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11者或全部：
(1)结合可溶性人GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD，例如通过Biacore测量的；
(2)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的KD，例如通过Scatchard测量的；
(3)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(4)结合膜结合的食蟹猴GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(5)诱导或增强T细胞活化，例如在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3浓度存在下)，如通过(i)表达GITR的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖所证明的；
(6)诱导或增强T细胞活化而无需多价交联；
(7)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合，例如以1μg/mL或更小的EC50，例如通过FACS测量的；
(8)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(9)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位，例如氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的不连续表位；
(10)结合O-连接及N-连接糖基化及未糖基化人GITR；
(11)在没有与Fc受体的结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；及
(12)在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10竞争结合人GITR。
在优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:21、34、47、63、79、92、107、123、139及343的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；且轻链可变区CDR2序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138及342的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代；且轻链可变区CDR1序列包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345的氨基酸序列及其保守修饰形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个保守氨基酸取代。
在各个实施方案中，抗体可展现如上文(1)至(12)所列举的功能性质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或全部。这些抗体可为(例如)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
亦可在除CDR外或以及CDR的抗体部分中进行保守氨基酸取代。举例而言，可在框架区或Fc区中进行保守氨基酸修饰。相对于本文提供的抗GITR抗体序列，可变区或重链或轻链可包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50个保守氨基酸取代。在某些实施方案中，抗GITR抗体包含保守及非保守氨基酸修饰的组合。
VI.与本文所述抗体结合GITR上的相同表位或与本文所述抗体竞争结合GITR的抗体
亦提供与本文所述的特定抗GITR抗体(例如，抗体28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10)竞争结合GITR的抗体。这些竞争抗体可在标准GITR结合测定中基于其竞争性抑制结合单克隆抗体28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10中的一或多者的GITR的能力来鉴定。举例而言，可使用标准ELISA测定或竞争性ELISA测定，其中将重组人GITR蛋白固定于板上，添加不同浓度的未标记的第一抗体，洗涤板，添加经标记的第二抗体，且测量标记的量。若递增浓度的未经标记(第一)抗体(亦称作“封阻抗体”)抑制经标记(第二)抗体的结合，则称第一抗体抑制第二抗体与板上的靶标的结合，或称竞争第二抗体的结合。另外/或者，可使用BIAcore分析以评价抗体竞争的能力。测试抗体抑制本文所述抗GITR抗体与GITR的结合的能力展示测试抗体可与抗体竞争结合GITR。
因此，本文提供如下抗GITR抗体：将本文所述抗GITR抗体与细胞(例如活化T细胞)上的GITR的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％，及/或其与细胞(例如活化T细胞)上的GITR的结合被抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，例如通过ELISA或FACS测量，例如通过使用以下段落中所述的测定。
可如下执行用以确定(例如)第一抗体是否阻断第二抗体的结合(即，“与其竞争”)的示例性竞争实验：如下制备活化人T细胞：使用Ficoll梯度自人全血分离外周血单个核细胞(PBMC)并用10μg/mL植物凝血素(PHA-L)(USBiol编号P3370-30)及200IU/mL重组IL-2(Peprotech编号200-02)活化3天。将活化T细胞重新悬浮于FACS缓冲液(具有5％胎牛血清的PBS)中并以105个细胞/样品孔接种在96孔板中。将板设定于冰上，而后以介于0μg/mL至50μg/mL范围内的浓度(自50μg/mL的最高浓度开始三倍滴定)添加未偶联的第一抗体。可使用无关IgG作为第一抗体的同型对照且其以相同浓度(自50μg/mL的最高浓度开始三倍滴定)添加。可将一份样品与50μg/mL未经标记的第二抗体一起预温育，作为竞争阻断(100％抑制)的阳性对照，并可使用一份在初始温育中无抗体的样品作为阴性对照(无竞争；0％抑制)。温育30分钟后，以2μg/mL/孔的浓度添加经标记(例如生物素化)第二抗体而不洗涤。将样品在冰上再温育30分钟。通过用FACS缓冲液洗涤细胞去除未结合的抗体。利用可检出标记物的试剂(例如用于检出生物素的PE偶联的链霉抗生物素蛋白(Invitrogen，目录编号S21388))检测结合于细胞的经标记的第二抗体。在FACS Calibur流式细胞仪(BD,SanJose)上获取样品并利用Flowjo软件(Tree Star公司，Ashland,OR)进行分析。结果可表示为抑制％(即，用100％减去每一浓度下标记物的量除以在无封阻抗体情况下获得的标记物的量)。通常，随后逆向进行相同实验，即以第一抗体作为第二抗体且以第二抗体作为第一抗体。在某些实施方案中，抗体至少部分(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或完全(100％)阻断另一抗体与靶标(例如人GITR或其部分)的结合，且与抑制是在一种抗体或是另一种抗体作为第一抗体时发生无关。在第一抗体及第二抗体彼此双向(即在首先添加第一抗体的竞争实验中及在首先添加第二抗体的竞争实验中)竞争时，第一及第二抗体“交叉阻断”彼此与靶标的结合。在某些实施方案中，抗GITR抗体与本文所述的抗GITR抗体(例如，抗体28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10)结合相同表位，例如通过指定表位定位技术所测定的。如本文中进一步论述的，28F3抗体在QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO:215)内人GITR中的区内结合。因此，在某些实施方案中，抗GITR抗体结合区域QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO:215)内的氨基酸残基，对应于成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的氨基酸残基1-39。在一个实施方案中，抗GITR抗体结合成熟人GITR的区域QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:216)内的氨基酸残基。在一个实施方案中，本文所述抗GITR抗体结合成熟人GITR的区域PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的氨基酸残基。在某些实施方案中，抗GITR抗体结合氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)，例如使用实施例中所述的方案通过HDX所测定。
用于测定与本文所述抗体结合“GITR上的相同表位”的抗体的技术包括，例如，表位定位方法，例如抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子解析度。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致结合损失经常被视为可指示表位组分。另外，亦可使用表位定位的计算组合方法。这些方法亦可依赖于所关注的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离出特定短肽(呈天然三维形式或呈变性形式)的能力。随后可将这些肽视为线索来界定用于筛选肽文库的相应抗体的表位。亦已开发出用于表位定位的计算机算法，一已证明这些算法可定位构象上不连续的表位。
可通过使用本领域已知的方法鉴定与本文所述抗GITR抗体竞争结合或与其结合相同表位的抗体。举例而言，可利用如本文所述的人GITR免疫小鼠，产生杂交瘤，且筛选所得的单克隆抗体是否具有与本文所述抗体竞争结合GITR的能力。亦可利用含有抗体结合的表位的GITR的较小片段免疫小鼠。例如，可通过筛选与跨越GITR的一系列重叠肽的结合来定位表位或包含表位的区域。或者，可使用Jespers等人，Biotechnology 12:899,1994的方法指导与本文所述抗GITR抗体具有相同表位且因此具有类似性质的抗体的选择。使用噬菌体展示，首先使抗GITR抗体的重链与轻链库(优选人类的)配对以选择GITR结合抗体，且随后使新轻链与重链谱(优选人类的)配对以选择具有与本文所述抗GITR抗体相同的表位或表位区的GITR结合抗体(优选人类的)。或者，可通过诱变编码抗体的重链及轻链的cDNA获得本文所述抗体的变体。
亦可通过由Cunningham及Wells(1989)Science 244:1081-1085所述的丙氨酸扫描诱变，或GITR中氨基酸残基的一些其他形式的定点诱变，测定抗GITR抗体的功能表位。然而，诱变研究亦可能揭示对GITR的总体三维结构至关重要但并不直接参与抗体-抗原接触的氨基酸残基，且因此可能需要其他方法以确认使用此方法测定的功能表位。
由特异性抗体结合的表位或表位区域(“表位区域”是包含表位、或与表位重叠的区域)亦可通过评价抗体与包含GITR的片段(例如非变性或变性片段)的肽的结合来加以测定。可合成一系列涵盖GITR(例如，人GITR)的序列的重叠肽，并筛选结合，例如通过直接ELISA、竞争性ELISA(其中评价肽防止抗体与微量滴定板的孔中结合的GITR结合的能力)、或在芯片上筛选结合。这些肽筛选方法可能无法检测一些不连续功能表位，即涉及在GITR多肽链的一级序列上并不邻接的氨基酸残基的功能表位。
亦可通过基于MS的蛋白质足迹法(例如氢/氘交换质谱(HDX-MS)及蛋白质的快速光化学氧化(FPOP))鉴别表位。HDX-MS可如实施例及例如Wei等人(2014)Drug DiscoveryToday 19:95(其方法以引用方式明确并入本文中)中进一步描述的那样来执行。FPOP可如，例如，Hambley and Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057中所述的来执行，其方法以引用方式明确并入本文中。
亦可通过结构方法(例如X射线晶体结构测定(例如，WO2005/044853))、分子建模及核磁共振(NMR)谱(包括NMR测定GITR中的不稳定酰胺氢在游离时和与所关注抗体的复合物中结合时的H-D交换速率)测定由抗GITR抗体结合的表位(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31,11335-11347；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32,6884-6891)。
关于X射线结晶照相术，结晶可使用任何本领域已知方法来完成(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50:339-350；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1-23)，这些方法包括微配液(microbatch)(例如Chayen(1997)Structure 5:1269-1274)、悬滴气相扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300-6303)、接种及透析。推荐使用具有至少约1mg/mL、且优选约10mg/mL至约20mg/mL的浓度的蛋白质制备物。在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量介于约1000Da至约20,000Da的范围内，优选约5000Da至约7000Da，更优选约6000Da)的沉淀溶液中可能实现最好的结晶，其中浓度介于约10％至约30％(w/v)的范围内。亦推荐包括蛋白稳定剂，例如甘油，其中浓度介于约0.5％至约20％范围内。在沉淀溶液中亦可推荐适宜的盐(例如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠)，浓度优选介于约1mM至约1000mM范围内。沉淀优选缓冲至约3.0至约5.0、优选约4.0的pH。可用于沉淀溶液中的具体缓冲液可能变化且为本领域所熟知(Scopes,Protein Purification:Principles andPractice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。有用的缓冲液的实施例包括但不限于HEPES、Tris、MES及乙酸盐。晶体可在宽范围的温度(包括2℃、4℃、8℃及26℃)下生长。
可使用熟知X射线绕射技术研究抗体:抗原晶体且可使用电脑软件(例如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations公司分发；例如参见Blundell&Johnson(1985)Meth.Enzymol.114&115,H.W.Wyckoff等人编辑，Academic Press；美国专利申请公开第2004/0014194号)及BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49:37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A:361-423,Carter及Sweet编辑；Roversi等人(2000)ActaCryst.D56:1313-1323)对其进行精制，这些参考文献的公开内容的全文以引用方式并入本中。
抗GITR抗体可与任何具有本文所述氨基酸序列的抗GITR抗体结合相同表位，如通过表位定位技术(例如本文所述技术)所测定的。
VII.经改造及修饰的抗体
VH及VL区
亦提供经工程化及修饰的抗体，其可通过使用具有本文公开的VH及/或VL序列中的一者或多者的抗体作为起始材料以工程化修饰抗体而制备，该修饰抗体可具有相对于起始抗体改变的性质。抗体可通过修饰一或两个可变区(即VH及/或VL)内、例如一个或多个CDR区内及/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来工程化。另外/或者，抗体可通过修饰恒定区内的残基来工程化，例如为了改变抗体的效应物功能。
可实施的一种可变区改造类型是CDR移植。抗体主要是通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用的。出于此原因，CDR内的氨基酸序列较CDR外的序列在个别抗体之间多样性更大。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，故可通过构建如下所述的表达载体来表达模拟特异性天然抗体的性质的重组抗体：该表达载体包括来自特定天然抗体的CDR序列，所述CDR序列嫁接到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列中(例如参见Riechmann,L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033；颁予Winter的美国专利第5,225,539号、及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)。
因此，本文所述的另一实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：包含CDR1、CDR2及CDR3序列的重链可变区，所述CDR1、CDR2及CDR3序列包含分别选自下述各组的氨基酸序列：SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138和342；SEQ ID NO:21、34、47、63、79、92、107、123、139和343；及SEQ ID NO:22、35、48、64、80、93、108、124、140和344；和包含CDR1、CDR2及CDR3序列的轻链可变区，所述CDR1、CDR2及CDR3序列包含分别选自下述各组的氨基酸序列：SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144和345；SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145和346；及SEQ ID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146和347。因此，这些抗体含有单克隆抗体28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的VH及VL CDR序列，但可含有与这些抗体不同的框架序列。
这些框架序列可自包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献来获得。举例而言，人重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可参见“VBase”人种系序列数据库(可在万维网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH公开案第91-3242号；Tomlinson,I.M.等人(1992)“TheRepertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VHSegments with Different Hypervariable Loops”J.Mol.Biol.227:776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)“A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a StrongBias in their Usage”Eur.J.Immunol.24:827-836；每一者的内容系全文以引用方式明确并入本文中。
用于本文所述抗体中的优选框架序列是在结构上类似于本文所述抗体所使用的框架序列的那些。可将VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列移植至具有与框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中所见的序列相同的序列的框架区上，或可将CDR序列移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。举例而言，已发现，在某些情况下，突变框架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(例如，参见颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)。
本文所述的工程化抗体包括已对VH及/或VL内的框架残基进行修饰以(例如)改良抗体的性质的那些。通常，进行这些框架修饰以降低抗体的免疫原性。举例而言，一种方式是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。更具体而言，已经过体细胞突变的抗体可含有该抗体所来源的种系序列不同的框架残基。这些残基可通过比较抗体框架序列与该抗体所来源的种系序列来鉴定。为使框架区序列返回至其种系构形，可通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。亦意欲涵盖这些“回复突变”抗体。另一类型的框架修饰涉及突变框架区或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，藉此降低抗体的潜在免疫原性。此方法亦称作“去免疫化”且进一步详细描述于Carr等人的美国专利公开案第20030153043号中。
另一类型的可变区修饰是突变VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3区内的氨基酸残基，藉此改良所关注抗体的一或多种结合性质(例如亲和力)。可实施定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，且可在如本文所描述且于实施例中提供的体外或活体内测定中评估对抗体结合的效应或所关注的其他功能性质。优选引入保守修饰(如上文所论述)。突变可为氨基酸取代、添加或缺失，但优选为取代。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，亦提供分离的抗GITR单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，所述重链可变区包含：(a)VH CDR1区，其包含选自由SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138及342组成的群的氨基酸序列或与SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138及342相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2区，其包含选自由SEQ ID NO:21、34、47、63、79、92、107、123、139及343组成的群的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21、34、47、63、79、92、107、123、139及343相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，其包含选自由SEQ IDNO:22、35、48、64、80、93、108、124、140及344组成的群的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22、35、48、64、80、93、108、124、140及344相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，其包含选自由SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345组成的群的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，其包含选自由SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346组成的群的氨基酸序列或与SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；及(f)VL CDR3区，其包含选自由SEQ ID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347组成的群的氨基酸序列或与SEQ ID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
抗体的CDR中的甲硫氨酸残基会被氧化，引起抗体的潜在化学降解及因此降低功效。因此，亦提供一种抗GITR抗体，其重链及/或轻链CDR中一个或多个甲硫氨酸残基被不会经受氧化降解的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，抗体28F3、18E10、19D3及6G10的CDR中的甲硫氨酸残基被不会经受氧化降解的氨基酸残基置换。
类似地，可自抗GITR抗体、具体而言于CDR中去除脱酰胺化位点。
Fc及修饰的Fc
本文所述抗GITR可变区可连接(例如，共价连接或融合)于Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可属任何异型或同种异型，例如对于IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2：G2m、G2m23(n)；对于IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)；且对于K：Km、Km1、Km2、Km3(例如，参见Jefferies等人(2009)mAbs 1:1)。
在某些实施方案中，本文所述抗GITR可变区连接至结合一或多种活化Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)的Fc，且藉此刺激ADCC且可引起T细胞耗竭。在某些实施方案中，本文所述抗GITR可变区连接至可引起耗竭的Fc。如实施例(实施例16及17)中进一步描述的，在若干小鼠肿瘤模型中，小鼠IgG2a及大鼠IgG2b同型(在与小鼠活化FcR的结合方面等效于小鼠IgG2a)诱导肿瘤生长的最大抑制。抗GITR mG2a、mG2b及rG2b同型对外周中Treg群体的效应极小或诱导外周中Treg群体小的增加，但诱导肿瘤环境中的显著Treg耗竭(其与肿瘤生长抑制相关)。相反，mIgG2a同型引起肿瘤部位处CD8+细胞的百分比增加，而mIgG1及大鼠IgG2b不引起CD8+细胞的百分比增加或仅引起很少增加。因此，在某些实施方案中，本文所述抗GITR可变区连接至人IgG1或IgG3 Fc，即抗体属IgG1或IgG3同型。在某些实施方案中，抗GITR抗体系耗竭性抗体，具体而言，其耗竭处于肿瘤微环境中的Treg细胞(且藉此增强抗肿瘤活性)，但不显著耗竭处于肿瘤微环境中的Teff细胞且介导抗肿瘤效应，及/或不显著耗竭在肿瘤外(例如在外周中)的Treg及Teff细胞。在某些实施方案中，抗GITR抗体属于这样的同型(天然或非天然(例如，包括突变)同型)，该同型刺激肿瘤部位处Treg细胞耗竭或消除及Teff细胞的伴随活化。在某些实施方案中，抗GITR抗体在肿瘤部位处产生升高的Teff对Treg比率，这指示有效力的抗肿瘤活性，且优选不显著耗竭在肿瘤外(例如在外周中)的Treg及Teff细胞。在某些实施方案中，抗GITR抗体阻断Treg的免疫阻抑性活性。在某些实施方案中，抗GITR抗体具有无FcR结合或具有降低的FcR结合(例如降低的与活化FcR的结合)的Fc受体。在某些实施方案中，抗GITR抗体具有结合FcRIIb或具有增强的与FcRIIb的结合的Fc，此可提供增强的激动作用。
在某些实施方案中，通过包含选择、设计或修饰抗体的Fc区以便增强该Fc区与活化Fc受体的结合的方法增强、优化或最大化抗GITR抗体增强内源免疫应答的功效。在一个实施方案中，抗GITR抗体是TRX-518。
在某些实施方案中，本文所述抗GITR可变区连接至无效应物或大部分无效应物Fc，例如IgG2或IgG4。
本文所述抗GITR可变区可连接至非天然Fc区(例如无效应物Fc或具有增强的与一或多种活化Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)的结合的Fc)，例如以增强肿瘤环境中Treg耗竭。
通常，本文所述可变区可连接至包含一个或多个修饰通常以改变抗体的一或多种功能性质(例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合及/或抗原依赖性细胞细胞毒性)的Fc。此外，本文所述抗体可经化学修饰(例如可将一个或多个化学部分附接至该抗体)或经修饰以改变其糖基化，以改变抗体的一或多种功能性质。这些实施方案分别进一步详细描述于下文中。Fc区中残基的编号系Kabat的EU索引的编号。
Fc区涵盖源自免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)的恒定区(包括恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物)的结构域。适宜免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其他类别，例如IgA、IgD、IgE及IgM。免疫球蛋白的恒定区定义为与免疫球蛋白C-末端区同源的天然或合成产生的多肽，且可包括单独的CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域或CH4结构域，或其组合。
免疫球蛋白的恒定区负责许多重要抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合及补体结合。存在五种主要类别的重链恒定区，分类为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每一类具有特征性效应物功能(由同型指定)。举例而言，将IgG分成四个子类，称作IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
Ig分子与多个类别的细胞受体相互作用。举例而言，IgG分子与三类Fcγ受体(FcγR)(即FcγRI、FcγRII及FcγRIII)相互作用，这些Fcγ受体对抗体的IgG类别是特异性的。已报导对于IgG与FcγR受体的结合重要的序列位于CH2及CH3结构域中。抗体的血清半衰期受抗体结合Fc受体(FcR)的能力的影响。
在某些实施方案中，Fc区是变体Fc区，例如相对于亲本Fc序列(例如，随后经修饰以生成变体的未经修饰的Fc多肽)经修饰(例如，通过氨基酸取代、缺失及/或插入)的Fc序列，以提供期望的结构特征及/或生物活性。
举例而言，可在Fc区中进行修饰以生成如下Fc变体：(a)具有增加或降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低补体介导的细胞毒性(CDC)，(c)具有增加或降低的对C1q的亲和力及/或(d)相对于亲本Fc具有增加或降低的对Fc受体的亲和力。这些Fc区变体通常将包含Fc区中的至少一个氨基酸修饰。任何氨基酸修饰的组合尤其是期望的。举例而言，变体Fc区中可包括两个、三个、四个、五个等取代，例如本文中鉴别的具体Fc区位置的取代。
变体Fc区亦可包含序列改变，其中去除参与二硫键形成的氨基酸或其经其他氨基酸置换。这样的去除可避免与用于产生本文所述抗体的宿主细胞中存在的其他含有半胱氨酸的蛋白质反应。即使在去除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍可形成非共价保持在一起的二聚体Fc结构域。在其他实施方案中，Fc区可经修饰以使得其与所选宿主细胞更相容。举例而言，可去除典型天然Fc区的N-末端附近的PA序列，该序列可被大肠杆菌(E.coli)中的消化酶(例如脯氨酸亚胺基肽酶)识别。在其他实施方案中，可去除Fc结构域内的一个或多个糖基化位点。通常被糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可赋予细胞溶解反应。这些残基可缺失或经非糖基化残基(例如，丙氨酸)取代。在其他实施方案中，可自Fc区去除参与与补体相互作用的位点(例如C1q结合位点)。举例而言，可缺失或取代人IgG1的EKK序列。在某些实施方案中，可去除影响与Fc受体的结合的位点，优选补救受体结合位点之外的位点。在其他实施方案中，Fc区可经修饰以去除ADCC位点。ADCC位点为本领域已知；关于IgG1中的ADCC位点，参见(例如)Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)。变体Fc结构域的具体实施例公开于例如WO 97/34631及WO 96/32478中。
在一个实施方案中，Fc的铰链区经修饰以改变(例如增加或减少)铰链区中的半胱氨酸残基数。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。改变Fc的铰链区中的半胱氨酸残基数以(例如)有利于轻链及重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。在一个实施方案中，抗体的Fc铰链区经突变以缩短抗体的生物半衰期。更特定而言，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，以使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合相对于具有天然Fc-铰链结构域的抗体与SpA的结合削弱。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利第6,165,745号中。
在再一些实施方案中，通过用不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应物功能。举例而言，一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的氨基酸可经不同氨基酸残基置换，使得抗体具有改变的对效应物配体的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应物配体可为(例如)Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细描述于Winter等人的美国专利第5,624,821号及第5,648,260号中。
在另一实例中，一个或多个选自氨基酸残基329、331及322的氨基酸可被不同氨基酸残基置换，以使抗体具有经改变的C1q结合及/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中。
在另一实例中，改变氨基酸位置231及239内的一个或多个氨基酸残基以藉此改变抗体结合补体的能力。此方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公开案WO 94/29351中。
在再一实例中，可通过在以下位置处修饰一个或多个氨基酸修饰Fc区以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)及/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。示例性变体包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T。用于增强FcyR及补体相互作用的其他修饰包括(但不限于)取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I及396L。这些及其他修饰参阅Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685-691。
增加与Fcγ受体的结合的Fc修饰包括Fc区的以下氨基酸位置中的任一或多者处的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中的残基的编号为如Kabat(WO00/42072)中的EU索引的编号。
可对Fc进行的其他Fc修饰是用于降低或除去与FcγR及/或补体蛋白的结合，藉此降低或除去Fc介导的效应物功能(例如ADCC、ADCP及CDC)的修饰。示例性修饰包括(但不限于)位置234、235、236、237、267、269、325及328处的取代、插入及缺失，其中编号是根据EU索引。示例性取代包括(但不限于)234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R，其中编号是根据EU索引。Fc变体可包含236R/328R。用于降低FcyR及补体相互作用的其他修饰包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V、以及通过突变或酶方式或通过在不糖基化蛋白的生物体(例如细菌)中产生去除位置297处的糖基化。这些及其他修饰参阅Strohl,2009,Current Opinion inBiotechnology 20:685-691。
任选地，Fc区可在本领域技术人员已知的额外及/或替代位置处包含非天然氨基酸残基(例如，参见美国专利第5,624,821号、第6,277,375号、第6,737,056号、第6,194,551号、第7,317,091号、第8,101,720号；PCT专利公开案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114)。
亦可使用增强对抑制性受体FcyRllb的亲和力的Fc变体。这些变体可提供具有与FcyRllb+细胞(包括例如B细胞及单核细胞)相关的免疫调节活性的Fc融合蛋白。在一个实施方案中，Fc变体相对于一或多种活化受体提供选择性增强的对FcyRllb的亲和力。用于改变与FcyRllb的结合的修饰包括根据EU索引选自下组的位置处的一个或多个修饰：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用于增强FcyRllb亲和力的示例性取代包括(但不限于)234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用于增强与FcyRllb的结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。
Fc区对其配体的亲和力及结合性质可通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，这些方法包括(但不限于)平衡方法(例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如，BIACORE分析)及其他方法，例如间接结合测定、竞争抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳及层析(例如，凝胶过滤)。这些及其他方法可在一个或多个被检查组分的上利用标记物，及/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力及动力学的详细说明可参见Paul,W.E.编辑，Fundamental Immunology,第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其关注抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方案中，抗体经修饰以延长其生物半衰期。多种方式是可行的。举例而言，这可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来进行。举例而言，可使以下残基中的一或多者突变：252、254、256、433、435、436，如美国专利第6,277,375号中所述。具体示例性取代包括以下中的一或多者：T252L、T254S及/或T256F。或者，为延长生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内经改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号及第6,121,022号中所述。增加与FcRn的结合及/或改良药物动力学性质的其他示例性变体包括位置259、308、428及434处的取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加与FcRn的Fc结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人2006Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、31 1A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of BiologicalChemistry,2001,276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、31 1S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人，2010,J Immunol,182:7663-7671中。在某些实施方案中，可使用具有特定生物特征的杂合IgG同型。举例而言，IgG1/IgG3杂合变体可以这样构建：将IgG1的CH2及/或CH3区中的位置替换为IgG3中在这两种同型之间存在差异的位置上的氨基酸。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、4221、435R及436F。在本文所述其他实施方案中，可将IgG2的CH2及/或CH3区中的位置替换为IgG1中在这两种同型之间存在差异的位置上的氨基酸，来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可构建杂合变体IgG抗体，其包含一个或多个取代，例如以下氨基酸取代中的一或多者：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处插入甘氨酸)及327A。
此外，已定位人IgG1上对FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点，且已描述具有改良结合的变体(参加Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示位置256、290、298、333、334及339处的特异性突变以改良与FcγRIII的结合。另外，显示以下组合突变体以改良FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A，已显示其展现增强的FcγRIIIa结合及ADCC活性(Shields等人，2001)。已鉴别具有强烈增强的与FcγRIIIa的结合的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E及S239D/I332E/A330L突变的变体，其在食蟹猴中显示对FcγRIIIa的亲和力最大增加、FcγRIIb结合减少及强的细胞毒性活性(Lazar等人，2006)。向抗体(例如阿伦单抗(alemtuzumab)(CD52特异性)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(rituximab)(CD20特异性)及西妥昔单抗(cetuximab)(EGFR特异性))中引入三重突变翻译成大大增强的体外ADCC活性，且S239D/I332E变体显示在猴中增强的缺失B细胞的能力(Lazar等人，2006)。另外，已鉴别含有L235V、F243L、R292P、Y300L及P396L突变的IgG1突变体，其在B细胞恶性病及乳癌的模型中在表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中展现增强的与FcγRIIIa的结合及同时增强的ADCC活性(Stavenhagen等人，2007；Nordstrom等人，2011)。可使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L及M428L/N434S。
在某些实施方案中，选择具有降低的与FcγR的结合的Fc。具有降低的FcγR结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下三个氨基酸取代：L234A、L235E及G237A。
在某些实施方案中，选择具有降低的补体结合的Fc。具有降低的补体结合的示例性Fc(例如IgG1 Fc)具有以下两个氨基酸取代：A330S及P331S。
在某些实施方案中，选择基本上无效应物功能，即，具有降低的与FcγR的结合及降低的补体结合，的Fc。无效应物的示例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五个突变：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。包含这些突变的示例性重链描述于表11中。
在使用IgG4恒定结构域时，其通常优选包括取代S228P，该取代模拟IgG1中的铰链序列且藉此稳定IgG4分子。
在另一实施方案中，抗体的糖基化是经修饰的。举例而言，可制备无糖基化抗体(即抗体缺少糖基化)。可改变糖基化以(例如)增加抗体对抗原的亲和力。这些糖修饰可通过(例如)改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。举例而言，可制备一个或多个氨基酸取代以消除一个或多个可变区框架糖基化位点，以藉此消除该位点处的糖基化。该无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此方法进一步详细描述于Co等人的美国专利第5,714,350号及第6,350,861号中。
可通过将N297残基突变成另一残基(例如N297A)及/或通过突变毗邻氨基酸(例如298)以藉此降低上N297的糖基化，来防止恒定区N297上的糖基化。
另外/或者，可制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有降低量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已展示，这些改变的糖基化模式可增加抗体的ADCC能力。这些糖修饰可通过(例如)在具有经改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体来完成。具有经改变糖基化机构的细胞已于本领域有所描述，且可用作其中表达本文所述重组抗体的宿主细胞，以藉此产生具有改变的糖基化的抗体。举例而言，Hanai等人的EP 1,176,195描述具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述功能被破坏的FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得该细胞系中表达的抗体展现低岩藻糖基化。Presta的PCT公开案WO 03/035835描述变体CHO细胞系Lec13细胞，该细胞将岩藻糖附接至Asn(297)连接的糖的能力降低，亦导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(亦参见Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开案WO99/54342描述一种细胞系，该细胞系经过工程化而表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在经改造细胞系中表达的抗体展现增加的二等分GlcNac结构，从而增强抗体的ADCC活性(亦参见Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。
本文所述抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可经聚乙二醇化以(例如)延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为聚乙二醇化抗体，通常在一个或多个PEG基团附接至抗体或抗体片段的条件下使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，聚乙二醇化是通过与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来实施。如本文所用术语“聚乙二醇”意欲涵盖PEG的已用于衍生其他蛋白质的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，欲聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法为本领域已知且可适用于本文所述抗体。参见(例如)Nishimura等人的EP 0 154 316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。
VIII.抗体物理性质
本文所述抗体可在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点由于改变的抗原结合可增加抗体的免疫原性或改变抗体的pK(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala及Morrison(2004)J.Immunol 172:5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。在一些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗GITR抗体。此可通过选择可变区中不含糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变来完成。
在某些实施方案中，本文所述抗体不含天冬酰胺异构现象位点。天冬酰胺的脱酰胺可在N-G或D-G序列上发生，导致生成异天冬氨酸残基，该残基向多肽链中引入扭结，降低其稳定性(异天冬氨酸效应)。
每一抗体将具有独特等电点(pI)，其通常在介于6与9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常通常在7-9.5的pH范围内且IgG4抗体的pI通常在6-8的pH范围内。有推测认为，pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一定的去折叠及不稳定性。因此，优选具有含有在正常范围内的pI值的抗GITR抗体。此可通过选择pI在正常范围内的抗体或使带电表面残基突变来达成。
每一抗体将具有特征性熔融温度，其中熔融温度越高指示体内的总体稳定性越大(Krishnamurthy R及Manning M C(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。通常，优选地，TM1(初始去折叠的温度)大于60℃、优选大于65℃、甚至更优选大于70℃。抗体的熔点可使用差示扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68:47-52)或圆二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)来测量。
在优选实施方案中，选择不快速降解的抗体。抗体的降解可使用毛细管电泳(CE)及MALDI-MS(Alexander A J及Hughes D E(1995)Anal Chem 67:3626-32)来测量。
在另一优选实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体，聚集效应可导致触发不期望免疫应答及/或改变的或不利的药物动力学性质。通常，聚集度为25％或更小、优选20％或更小、甚至更优选15％或更小、甚至更优选10％或更小且甚至更优选5％或更小的的抗体是可接受的。聚集度可通过若干技术(包括尺寸排除柱(SEC)、高效液相层析(HPLC)及光散射)来测量。
IX.工程化抗体的方法
如上文所论述，可使用具有本文公开的VH及VL序列的抗GITR抗体通过修饰VH及/或VL序列或附接至其的恒定区以产生新抗GITR抗体。因此，在本文所述另一方面中，使用本文所述抗GITR抗体(例如28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10)的结构特征以产生结构上有关的抗GITR抗体，其保留本文所述抗体的至少一种功能性质，例如与人GITR及食蟹猴GITR的结合。举例而言，可将28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10或其突变的一个或多个CDR区与已知框架区及/或其他CDR以重组方式组合以产生额外经重组工程化的本文所述抗GITR抗体，如上文所论述的。其他类型的修饰包括先前部分中所描述的那些。用于改造方法的起始材料是一种或多种本文所提供的VH及/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为产生工程化抗体，无需实际制备(即表达为蛋白质)具有一种或多种本文所提供的VH及/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。而是，使用序列中所含有的资讯作为起始材料以产生源自初始序列的“第二代”序列，且然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
因此，本文提供用于制备抗GITR抗体的方法，其包括：
(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自由SEQ ID NO:20、33、46、62、78、91、106、122、138及342组成的群的CDR1序列、选自由SEQ ID NO:21、34、47、63、79、92、107、123、139及343组成的群的CDR2序列及/或选自由SEQ ID NO:22、35、48、64、80、93、108、124、140及344组成的群的CDR3序列；及(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自由SEQ ID NO:23、36、49、65、68、81、94、109、112、125、141、144及345组成的群的CDR1序列、选自由SEQ ID NO:24、37、50、66、69、82、95、110、113、126、142、145及346组成的群的CDR2序列及/或选自由SEQID NO:25、38、51、67、70、83、96、111、114、127、143、146及347组成的群的CDR3序列；
(b)改变重链可变区抗体序列及/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；及
(c)使改变的抗体序列表达为蛋白质。
可使用标准分子生物学技术来制备并表达经改变抗体序列。
优选地，由改变的抗体序列编码的抗体系保留本文所述抗GITR抗体的功能性质中的一者、一些或全部者，这些功能性质包括：
(1)结合可溶性人GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的KD，例如通过Biacore测量的；
(2)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的KD，例如通过Scatchard测量的；
(3)结合膜结合的人GITR，例如以1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(4)结合膜结合的食蟹猴GITR，例如以10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)的EC50，例如通过FACS测量的；
(5)诱导或增强T细胞活化，例如在CD3接合存在下(例如，在次最佳抗CD3浓度存在下)，如通过(i)表达GITR的T细胞中增加的IL-2及/或IFN-γ产生及/或(ii)增强的T细胞增殖所证明的；
(6)诱导或增强T细胞活化而无需多价交联；
(7)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合，例如以1μg/mL或更小的EC50，例如通过FACS测量的；
(8)至多部分抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(9)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位，例如氨基酸序列PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)内的不连续表位；
(10)结合O-连接及N-连接糖基化及未糖基化人GITR；
(11)在没有与Fc受体的结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强激动剂活性；及
(12)在任一方向或两个方向上与28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10竞争结合人GITR。
经改变抗体可展现如上文(1)至(12)所述的功能性质中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或全部。经改变抗体的功能特性可使用本领域可获得及/或本文所描述的标准测定(例如实施例中所阐释的那些(例如ELISA、FACS))来评价。
在工程化本文所述抗体的方法的某些实施方案中，可沿抗GITR抗体编码序列的全部或部分随机或选择性引入突变，且可筛选所得的修饰抗GITR抗体是否具有如本文所述的结合活性及/或其他功能性质。突变方法已于本领域有所描述。举例而言，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成性接合装配或其组合产生及筛选抗体突变的方法。或者，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选方法以优化抗体的生理化学性质的方法。
X.核酸分子
本文所述另一方面涉及编码本文所述抗体的核酸分子。这些核酸可存在于全细胞中，存在于细胞溶解物中，或以部分纯化或实质上纯的形式存在。当通过标准技术实施纯化以清除了其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸(例如其他染色体DNA，例如连接至自然界中分离的DNA的染色体DNA)或蛋白质)时，核酸是“分离的”或“使得实质上纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳及本领域熟知的其他方法。参见F.Ausubel等人编辑，(1987)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述核酸可为(例如)DNA或RNA且可含有或不含有内含子序列。在某些实施方案中，核酸为cDNA分子。
本文所述核酸可使用标准分子生物学技术来获得。对于由杂交瘤(例如自携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步描述)表达的抗体，编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链及重链的cDNA可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得。对于自免疫球蛋白基因文库获得(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可自文库回收编码抗体的核酸。
本文所述的优选核酸分子是编码28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10单克隆抗体的VH及VL序列的那些。编码28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10的VH序列的示例性DNA序列分别描述于SEQ IDNO:147、154、158、162、168、172、176、182、186及353中。编码28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的VL序列的示例性DNA序列分别描述于SEQ ID NO:148、155、163、164、169、173、177、178、183、187、188及354中。编码28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10的重链序列的示例性DNA序列分别描述于SEQ ID NO:149、156、160、165、170、174、179、184、189及355中。编码28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10的轻链序列的示例性DNA序列分别描述于SEQ ID NO:150、157、161、166、167、171、175、181、180、185、190、191及356中。
编码28F3.IgG1及28F3.IgG1.1(相同可变区)抗体的成熟VH及VL结构域的示例性核酸分别描述为SEQ ID NO:147及148。编码28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗体的成熟重链的示例性核酸分别描述为SEQ ID NO:151及152，且编码28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗体的成熟轻链的示例性核酸描述为SEQ ID NO:153。
具有信号肽的28F3.IgG1及28F3.IgG1.1(相同可变区)抗体的示例性VH及VL结构域分别描述为SEQ ID NO:357及358，且编码这些结构域的核苷酸序列分别描述为SEQ IDNO:359及360。
具有信号肽的28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗体的示例性重链分别描述为SEQ IDNO:361及362，且编码这些重链的示例性核苷酸序列分别描述为SEQ ID NO:363及364。具有信号肽的28F3.IgG1及28F3.IgG1.1抗体的示例性轻链描述为SEQ ID NO:365，且编码其的示例性核苷酸序列描述为SEQ ID NO:366。
用于制备28F3.IgG1的方法可包括使重链及轻链在包含编码具有信号肽的重链及轻链核苷酸序列(例如分别为SEQ ID NO:363及365)的细胞系中表达。用于制备28F3.IgG1.1的方法可包括使重链及轻链在包含编码具有信号肽的重链及轻链的核苷酸序列(例如分别为SEQ ID NO:364及366)的细胞系中表达。本文中涵盖包含这些核苷酸序列的宿主细胞。
一旦获得编码VH及VL区段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操纵这些DNA片段，以(例如)将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操纵中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白质的另一DNA片段(例如抗体恒定区或柔性接头)。如本上下文中使用的术语“可操作地连接”欲指两个DNA片段接合，使得由该两个DNA片段编码的氨基酸序列保持合框。
可通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2及/或CH3)的另一DNA分子，将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列为本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)，且涵盖这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。重链恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
可通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列为本领域已知的(例如，参见Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开案第91-3242号)且涵盖这些区的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。轻链恒定区可为κ或λ恒定区。
为产生scFv基因，将编码VH及VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得VH及VL序列可表达为邻接单链蛋白，其中VL及VH区通过柔性接头接合(例如，参见Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348:552-554)。
本文亦提供编码与28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10单克隆抗体的那些序列同源的VH及VL序列的核酸分子。示例性核酸分子编码与编码28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10单克隆抗体的VH及VL序列的核酸分子至少70％相同(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同)的VH及VL序列。本文亦提供具有保守取代(即，在核酸分子翻译时不改变所得氨基酸序列的取代)的核酸分子，例如用于密码子优化。
XI.抗体产生
本文所述单克隆抗体可使用多种已知技术(例如由Kohler及Milstein,Nature256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术)来产生。尽管体细胞杂交程序是优选的，但原则上亦可采用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。小鼠中的杂交瘤产生是已充分建立的程序。本领域已知分离融合用免疫脾细胞的免疫方案及技术。亦已知融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)及融合程序。
本文所述的嵌合或人源化抗体可基于如上文所述制备的鼠类单克隆抗体的序列而制备。可自所关注鼠类杂交瘤获得编码重链及轻链免疫球蛋白的DNA，并使用标准分子生物学技术工程化，以使之含有非鼠类(例如，人)免疫球蛋白序列。举例而言，为产生嵌合抗体，可使用本领域已知方法(例如，参见颁予Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)将鼠类可变区连接至人恒定区。为产生人源化抗体，可使用本领域已知方法(例如，参见颁予Winter的美国专利第5,225,539号及颁予Queen等人的美国专利第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,762号及第6,180,370号)将鼠类CDR区插入人框架中。
在一个实施方案中，本文所述抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对GITR的这些人单克隆抗体。这些转基因及转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠及KM小鼠的小鼠，且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex公司)含有编码非重排人重链(μ及γ)及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ及κ链基因座不活化的靶突变的人免疫球蛋白基因迷你基因座(例如，参见Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展现降低的小鼠IgM或κ表达，且响应于免疫，所引入的人重链及轻链转基因经历类别切换及体细胞突变而生成高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人(1994),上文文献；参阅Lonberg,N.(1994)Handbookof Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMab小鼠的制备及使用及由这些小鼠携带的基因体修饰进一步描述于以下中：Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，所有参考文献的内容系全文以引用方式明确并入本文中。进一步参见颁予Lonberg及Kay的美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,789,650号、第5,877,397号、第5,661,016号、第5,814,318号、第5,874,299号及第5,770,429号；颁予Surani等人的美国专利第5,545,807号；所有皆颁予Lonberg及Kay的PCT公开案第WO 92/03918号、第WO 93/12227号、第WO 94/25585号、第WO97/13852号、第WO 98/24884号及第WO 99/45962号；及颁予Korman等人的PCT公开案第WO01/14424号。
在某些实施方案中，本文所述抗体是使用在转基因及转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因及人轻链转染色体的小鼠)产生的。这些小鼠(在本文中称作“KM小鼠”)详细描述于颁予Ishida等人的PCT公开案WO 02/43478中。
此外，本领域可获得其他表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统，且可使用其来产生本文所述抗GITR抗体。举例而言，可使用称作Xenomouse(Abgenix公司)的替代性转基因系统；这些小鼠描述于(例如)颁予Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号、第6,075,181号、第6,114,598号、第6,150,584号及第6,162,963号中。
此外，本领域可获得表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统且可使用其来产生本文所述抗GITR抗体。举例而言，可使用携带人重链转染色体及人轻链转染色体的小鼠，称作“TC小鼠”；这些小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中。此外，携带人重链及轻链转染色体的牛已在本领域有描述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)且可使用其来产生本文所述抗GITR抗体。
本领域描述的用于产生人抗体(例如人抗GITR抗体)的其他小鼠系统包括(i)小鼠(Regeneron Pharmaceuticals公司)，其中内源性小鼠重链及轻链可变区已经由同源重组经人重链及轻链可变区置换，可操作地连接至内源小鼠恒定区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，且随后使用标准重组DNA技术转化成完全人抗体；及(ii)小鼠(Merus Biopharmaceuticals公司)，其中小鼠含有非重排人重链可变区而非单一重排人常见轻链可变区。这些小鼠及其产生抗体的用途描述于(例如)WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。
本文所述人单克隆抗体亦可使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的这些噬菌体展示方法已于本领域确立。参见(例如)：颁予Ladner等人的美国专利第5,223,409号、第5,403,484号及第5,571,698号；颁予Dower等人的美国专利第5,427,908号及第5,580,717号；颁予McCafferty等人的美国专利第5,969,108号及第6,172,197号；及颁予Griffiths等人的美国专利第5,885,793号、第6,521,404号、第6,544,731号、第6,555,313号、第6,582,915号及第6,593,081号。
本文所述人单克隆抗体亦可使用SCID小鼠来制备，其中已经重建了人免疫细胞，使得一旦免疫后能产生人抗体反应。此类小鼠描述于(例如)颁予Wilson等人的美国专利第5,476,996号及第5,698,767号中。
免疫
为生成GITR的完全人抗体，可利用GITR抗原及/或表达GITR或其片段的细胞的纯化或富集制剂免疫含有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)，如针对其他抗原由(例如)Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851及WO 98/24884所述。或者，可利用编码人GITR或其片段的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠在首次输注时为6-16周龄。举例而言，可使用重组GITR抗原的纯化或富集制剂(5-50μg)对HuMAb小鼠实施腹膜内免疫。倘若使用GITR抗原的纯化或富集制剂的免疫不产生抗体，亦可利用表达GITR的细胞(例如细胞系)对小鼠实施免疫以促进免疫应答。示例性细胞系包括过表达GITR的稳定CHO及Raji细胞系。
利用各种抗原的累积经验已显示，在最初用Ribi的佐剂中的抗原经腹膜内(IP)或皮下(SC)实施免疫、而后用Ribi的佐剂中的抗原每隔一周IP/SC免疫(直至总共10次)时，HuMAb转基因小鼠反应最佳。可在免疫方案过程中利用血浆样品监测免疫应答，这些血浆样品系通过眶后取血获得。通过ELISA及FACS(如下文所述)筛选血浆，且可使用具有抗GITR人免疫球蛋白的足够效价的小鼠进行融合。可在处死及去除脾及淋巴结之前3天将小鼠用抗原静脉内加强免疫。预计对于每次免疫可需要实施2-3次融合。通常对于每一抗原对介于6只与24只之间的小鼠实施免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM菌株。另外，可将HCo7及HCo12转基因一起配种成具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。
产生GITR的单克隆抗体的杂交瘤的生成
为生成产生本文所述人单克隆抗体的杂交瘤，可自免疫小鼠分离脾细胞及/或淋巴结细胞并融合至适当永生细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞系。对所得的杂交瘤可筛选是否产生抗原特异性抗体。举例而言，使用50％PEG将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)。将细胞以约2×105平铺于平底微量滴定板中，而后在含有10％胎牛克隆血清、18％“653”条件化培养基、5％奥瑞金(origen，IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素(penicillin)、50mg/ml链霉素(streptomycin)、50mg/ml庆大霉素(gentamycin)及1×HAT(Sigma)的选择性培养基中温育两周。约两周后，可在HAT更换为HT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA针对人单克隆IgM及IgG抗体筛选个别孔。一旦出现杂交瘤广泛生长，通常即可在10-14天后观察培养基。可将分泌抗体的杂交瘤再平铺，再次筛选，且若对人IgG仍呈阳性，则可通过限制性稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可使所选杂交瘤在两升旋转烧瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，然后使用蛋白质A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和层析。可通过凝胶电泳及高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃下。
产生GITR的单克隆抗体的转染瘤的生成
抗体可在宿主细胞转染瘤中使用(例如)如本领域所熟知的重组DNA技术及基因转染方法的组合产生(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
举例而言，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达所关注抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链及重链的DNA，且可将DNA插入表达载体中，使得这些基因可操作地连接至转录及翻译控制序列。在此背景下，术语“可操作地连接”欲指使抗体基因接合至载体中，使得该载体内的转录及翻译控制序列发挥其调控抗体基因的转录及翻译的预期功能。表达载体及表达控制序列经选择与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因及抗体重链基因插入单独载体中，或将两种基因插入同一表达载体中。通过标准方法(例如将抗体基因片段上的互补限制位点与载体接合，或若不存在限制位点，则利用平端接合)将抗体基因插入表达载体中。可使用本文所述抗体的轻链及重链可变区通过将其插入已编码期望同型的重链恒定区及轻链恒定区的表达载体中来产生任何抗体同型的全长抗体基因，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段，且使VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。
另外/或者，重组表达载体可编码有利于自宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中，使得信号肽在框架内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
在示例性实施方案中，可使用来自人抗体重链及轻链的以下信号肽：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)；
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:321)；
MEFGLNWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:327)；
MEFGLSWIFLAAILKGVQC(SEQ ID NO:329)；
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:333)；
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:323)；
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:325)；
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:317)；
MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:319)；及
METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:331)。
抗GITR抗体的重链及轻链表达时，可分别带有在这些抗体的克隆来源的杂交瘤中与各个链分别连接的信号序列。下文是如克隆抗GITR抗体的杂交瘤中存在的各种抗GITR抗体的信号序列，这些信号序列可用于表达同一抗体或另一抗体：
28F3 VH信号序列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:316)
28F3 VL信号序列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGAT(SEQID NO:318)
18E10 VH信号序列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:316)
18H10 VL信号序列：
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:317)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGAT(SEQID NO:318)
19D3 VH信号序列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:316)
19D3 VL信号序列：
MRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:319)
ATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ IDNO:320)
3C3 VH信号序列：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:321)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(SEQ ID NO:322)
3C3 VL1信号序列：
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:324)
3C3 VL2信号序列：
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:325)
ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ IDNO:326)
8A6 VH信号序列：
MEFGLNWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:327)
ATGGAGTTTGGGCTGAACTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:328)
8A6 VL信号序列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:318)
9G7 VH信号序列：
MEFGLSWIFLAAILKGVQC(SEQ ID NO:329)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATTTTCCTTGCTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:330)
9G7 VL1及VL2信号序列：
METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:331)
ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ IDNO:332)
14E3 VH信号序列：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:333)
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC(SEQ ID NO:334)
14E3 VL信号序列：
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC(SEQ ID NO:323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:324)
19H8VH信号序列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:316)
19H8 VL1信号序列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:318)
19H8 VL2信号序列：
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:325)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGA(SEQ IDNO:326)
6G10 VH信号序列：
MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT(SEQ ID NO:316)
6G10 VL信号序列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT(SEQ ID NO:318)
信号序列MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO:367)可用于表达重链及轻链。
重链及轻链或其部分(例如那些提供于表11中的)可连接至本文提供的信号序列。举例而言，包含(例如)SEQ ID NO:13、15、17或18的28F3重链或其可变区可连接或融合至包含MEFGLSWVFLVALLRGVQC(SEQ ID NO:315)或MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO:367)或由其组成的信号肽。(例如)包含SEQ ID NO:14、16或19的28F3轻链或其可变区可连接或融合至包含MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:317)或MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO:367)或由其组成的信号肽。
除抗体链基因外，重组表达载体可携带控制抗体链基因在宿主细胞中的表达的调控序列。术语“调控序列”意欲包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子及其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于(例如)Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。本领域技术人员应了解，表达载体的设计(包括调控序列的选择)可依赖于诸如欲转化的宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达程度等因素而定。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中引导较高蛋白质表达程度的病毒元件，例如源自以下各项的启动子及/或增强子：巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒。或者，可使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-球蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源(例如SRα启动子系统)的序列构成，该SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列及人T细胞1型白血病病毒的长末端重复(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除抗体链基因及调控序列外，重组表达载体亦可携带额外序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)及选择标记物基因。选择标记物基因有利于选择其中已引入载体的宿主细胞(例如，参见所有皆由Axel等人的美国专利第4,399,216号、第4,634,665号及第5,179,017号)。举例而言，通常选择标记物基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤)的抗性。优选选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(针对dhfr-宿主细胞用于甲氨蝶呤选择/扩增)及neo基因(针对G418选择)。
对于轻链及重链的表达，通过标准技术将编码重链及轻链的表达载体转染至宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意欲涵盖常用于将外源性DNA引入原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染，等等。尽管理论上可在原核或真核宿主细胞中表达本文所述抗体，但在真核细胞(且优选哺乳动物宿主细胞)中表达抗体是优选的，这是因为真核细胞，具体而言，哺乳动物细胞，较原核细胞更有可能装配并分泌经适当折叠且具有免疫活性的抗体。已报导抗体基因的原核表达对高产率从的活性抗体的产生无效(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。
用于表达本文所述重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中，与DHFR选择标记物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。具体而言，对于与NSO骨髓瘤细胞的使用，另一优选表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中公开的GS基因表达系统。在将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，将宿主细胞培养足够的时间，足以容许抗体在宿主细胞中表达(或更优选地，使抗体分泌至生长宿主细胞的培养基)，来产生抗体。可使用标准蛋白质纯化方法自培养基回收抗体。
XII.测定
可通过(例如)标准ELISA测试本文所述抗体的与GITR的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中的1-2μg/ml的纯化GITR包被，且随后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体的稀释物(例如，来自GITR免疫的小鼠的血浆的稀释物)添加至每一孔中并于37℃下温育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤且随后于37℃下与偶联至辣根过氧化酶(HRP)的二级试剂(例如，对于人抗体，山羊-抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起温育1小时。在洗涤后，将板用ABTS受质(Moss公司，产品：ABTS-1000)显影并通过分光光度计于OD 415-495下进行分析。随后通过流式细胞术针对与表达人GITR的细胞系、而非不表达GITR的对照细胞系的结合进一步筛选来自经免疫小鼠的血清。简言之，通过将表达GITR的CHO细胞与抗GITR抗体以1:20稀释一起温育来评价抗GITR抗体的结合。洗涤细胞并利用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson,San Jose,CA)实施流式细胞分析。优选地，产生最高效价的小鼠将用于融合。
如上文所述ELISA分析可用于筛选显示与GITR免疫原的阳性反应性的抗体，且由此筛选产生这样的抗体的杂交瘤。对于产生结合GITR、优选以高亲和力结合GITR的抗体的杂交瘤，随后可亚克隆并进一步表征。随后可选择来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留亲本细胞的反应性(通过ELISA))用于制备细胞库并用于抗体纯化。
为纯化抗GITR抗体，可使所选杂交瘤在2升旋转烧瓶中生长用于单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，而后使用蛋白质A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)进行亲和层析。可通过凝胶电泳及高效液相层析检查所洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液更换为PBS，且可使用1.43消光系数通过OD280来测定浓度。可将单克隆抗体等分并储存于-80℃下。
为确定所选抗GITR单克隆抗体是否结合独特表位，可使用市售试剂(Pierce,Rockford,IL)生物素化每一抗体。可利用链霉抗生物素蛋白标记的探针检测生物素化MAb结合。可使用如上文所述GITR包被的ELISA板实施使用未经标记的单克隆抗体及生物素化单克隆抗体的竞争研究。
为测定纯化抗体的同型，可使用对特定同型的抗体具有特异性的试剂实施同型ELISA。举例而言，为测定人单克隆抗体的同型，可于4℃下将微量滴定板的孔用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被过夜。在用1％BSA封闭后，于环境温度下使板与1μg/ml或更少测试单克隆抗体或纯化同型对照反应1至2小时。随后可使孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上文所述使板显色并加以分析。
为测试单克隆抗体与表达GITR的活细胞的结合，可使用流式细胞术，如实施例中所述。简言之，将表达膜结合的GITR的细胞系(在标准生长条件下生长)与含有0.1％BSA的PBS中的不同浓度的单克隆抗体于4℃下混合1小时。在洗涤后，在与一级抗体染色相同的条件下使细胞与荧光黄标记的抗IgG抗体反应。可通过FACScan仪器使用光侧向散射性质分析样品以对单细胞设门控，并确定经标记抗体的结合。可使用使用荧光显微镜的替代测定(作为流式细胞术测定的追加或代替)。可完全如上文所述染色细胞，并通过荧光显微镜检查。此方法容许可视化个别细胞，但依赖于抗原的密度，可能具有减低的灵敏性。
可通过Western印迹法针对与GITR抗原的反应性进一步测试抗GITR抗体。简言之，可自表达GITR的细胞制备细胞提取物，对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳后，将分离抗原转移至硝酸纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用欲测试的单克隆抗体探测。可使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.公司St.Louis,MO)对其显色。
用于分析各种抗GITR抗体的结合亲和力、交叉反应性及结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如使用BiacoreTM 2000 SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析。
在一个实施方案中，抗体特异性结合人GITR的细胞外区。抗体可特异性结合GITR的细胞外结构域内的特定结构域(例如，功能结构域)。在具体实施方案中，抗体特异性结合GITR-L结合的GITR上的位点。在某些实施方案中，抗体特异性结合人GITR的细胞外区及食蟹猴GITR的细胞外区。优选地，抗体以高亲和力结合人GITR。
XIII.免疫偶联物、抗体衍生物及诊断
本文所述抗体可用于诊断目的，包括样品测试及体内成像，且为此目的，抗体(或其结合片段)可偶联至适当可检测的试剂，以形成免疫偶联物。为诊断目的，适当试剂是可检测的标记，其包括用于全身成像的放射性同位素、及用于样品测试的放射性同位素、酶、荧光标记及其他适宜抗体标记。
可检测标记可为体外诊断领域中当前所用的各种类型中的任一者，包括包括金属溶胶(例如胶状金)的颗粒标记、提供有(例如)N2S2、N3S或N4类型的肽螯合剂的同位素(例如I125或Tc99)、发色团(包括荧光标记物、发光标记物、磷光标记物、诸如此类)、以及将给定底物转化成可检测标记物的酶标记及在通过(例如)聚合酶链式反应扩增后显示的多核苷酸标记。适宜酶标记包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、诸如此类。举例而言，标记可为酶碱性磷酸酶，其系在1,2二氧杂环丁烷底物(例如金刚烷基甲氧基磷酰基氧基苯基二氧杂环丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环{3.3.1.1 3,7}癸}-4-基)苯基磷酸二钠(CSPD)、以及CDP及或本领域技术人员熟知的其他发光底物(例如适宜镧系元素(例如铽(III)及铕(III))的螯合物)转化后通过测量化学发光的存在或形成来检测。通过所选标记测定检测方式。在标记为颗粒且以适当程度累积的情况下，标记或其反应产物可使用裸眼看到，或使用仪器(例如分光光度计、发光仪、荧光计，等等)显现，均根据标准实践来进行。
优选地，偶联方法产生实质上(或几乎)非免疫原性的联接，例如肽-(即酰胺-)、硫化-(立体阻碍)、二硫化物-、腙-及醚联接。这些联接几乎是非免疫原性的，且在血清内显示合理的稳定性(例如，参见Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO2009/059278；WO 95/17886)。
可利用不同偶联策略，视部分及抗体的生物化学性质而定。在所述部分是50至500个天然或重组氨基酸的情况下，在描述蛋白偶联物之合成的化学法的教科书中有标准程序，本领域技术人员容易地遵循这些标准程序(例如，参见Hackenberger,C.P.R.及Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一个实施方案中，使用抗体或部分内的马来酰亚胺基部分与半胱氨酸残基的反应。在使用抗体的Fab或Fab'-片段的情况下，这是非常适宜的一种偶联化学。或者，在一个实施方案中，偶联至抗体或部分的C-末端。蛋白质(例如Fab-片段)的C-末端修饰可如(例如)所述实施(Sunbul,M.及Yin,J.,Org.Biomol.Chem.7(2009)3361-3371)。
一般而言，位点特异性反应及共价偶联是基于将天然氨基酸转变成具有与存在的其他官能基的反应性正交的反应性的氨基酸。举例而言，处于稀有序列背景中的特定半胱氨酸可经酶转化成醛(参见Frese,M.A.及Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。亦可通过利用某些酶与给定序列背景中的天然氨基酸特异性酶反应性来获得期望氨基酸修饰(例如，参见Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136；及Protease-catalyzed formation of C--N bonds isused by Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403)。
亦可通过末端氨基酸与适当修饰试剂的选择性反应实现位点特异性反应及共价偶联。
N-末端半胱氨酸与苄腈的反应性(参见Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用于实现位点特异性共价偶联。
天然化学接合亦可依赖于C-末端半胱氨酸残基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids and Molecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。
EP 1 074 563描述偶联方法，其是基于一段带负电荷氨基酸内的半胱氨酸与位于一段带正电氨基酸中的半胱氨酸的较快反应。
所述部分亦可为合成肽或肽模拟物。在多肽为化学合成的情况下，合成期间可纳入具有正交化学反应性的氨基酸(例如，参见de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由于有许多正交官能基可用且可引入合成肽中，故该肽与接头的偶联是一种标准化学。
为获得单标记的多肽，可通过层析分离具有1:1化学计量的偶联物与其他偶联副产物。可通过使用染料标记的结合对成员及带电荷的接头易化此程序。通过使用此类经标记且带高负电荷的结合对成员，容易将单偶联的多肽与未经标记的多肽及携带一个以上接头的多肽分离开来，这是因为电荷及分子量的差异可以被用于进行分离。荧光染料可用于纯化复合物与未结合的组分，如经标记的单价结合物。
在一个实施方案中，附接至抗GITR抗体的部分选自下组：结合部分、标记部分及生物活性部分。
本文所述抗体亦可偶联至治疗剂以形成免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。适宜治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组织蛋白去乙酰酶抑制剂、出核转运抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素及抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体及治疗剂优选经由可裂解接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)偶联。更优选地，接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:219)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可如下文中所述：美国专利第7,087,600号、第6,989,452号及第7,129,261号；PCT公开案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312及WO 08/103693；美国专利公开案20060024317、20060004081及20060247295；其公开内容以引用方式并入本文中。
抗GITR抗体(例如那些本文所述者)亦可用于检测GITR，例如人GITR，例如组织或组织样品中的人GITR。这些抗体可用于(例如)ELISA测定或流式细胞术中。在某些实施方案中，使抗GITR抗体与细胞(例如组织中的细胞)接触对于发生特异性结合适宜的一段时间，且随后添加试剂(例如检测抗GITR抗体的抗体)。示例性的测定提供于实施例中。抗GITR抗体可为完全人抗体，或其可为嵌合抗体，例如具有人可变区及鼠类恒定区或其部分的抗体。用于检测样品(细胞或组织样品)中的GITR(例如人GITR)的示例性方法包含(i)使样品与抗GITR抗体接触足以容许抗GITR抗体与样品中的GITR特异性结合的一段时间，及(2)使样品与特异性结合抗GITR抗体(例如结合抗GITR抗体的Fc区)的检测试剂(例如抗体)接触，藉此检测由抗GITR抗体结合的GITR。在与抗体及/或检测试剂一起温育后，可包括洗涤步骤。用于这些方法中的抗GITR抗体不必连接至标记或检测试剂，因为可以使用单独的检测试剂。
抗GITR抗体作为(例如)单一疗法或组合疗法的其他用途提供于本文中的别处，例如涉及组合治疗的部分中。
XIV.双特异性分子
本文所述抗体可用于形成双特异性分子。抗GITR抗体或其抗原结合部分可衍生或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如受体的另一抗体或配体)，以生成结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。举例而言，抗GITR抗体可连接至特异性结合可用作组合治疗的潜在靶标的任何蛋白质(例如本文所述蛋白质)的抗体或scFv(例如，抗体与PD-1、PD-L1或LAG-3)。本文所述抗体事实上可衍生或连接至一个以上的其他功能分子，以生成结合两个以上不同结合位点及/或靶分子的多特异性分子；这些多特异性分子亦欲涵盖于如本文所用的术语“双特异性分子”中。为产生本文所述双特异性分子，本文所述抗体可以有功能地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，例如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，使得产生双特异性分子。
因此，本文提供包含至少一种对GITR的第一结合特异性及对第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在一个本文所述的实施方案中，双特异性分子是多特异性的，分子可进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本文所述双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv))作为结合特异性。抗体亦可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段，例如Fv或单链构建物，如Ladner等人，美国专利第4,946,778号中所述，其内容以引用方式明确并入。
尽管人单克隆抗体是优选的，但本文所述双特异性分子中可采用的其他抗体为鼠类的、嵌合的、及人源化的单克隆抗体。
本文所述的双特异性分子可使用本领域已知的方法通过偶联各组成部分的结合特异性来制备。举例而言，双特异性分子的每一结合特异性可单独生成，随后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的实施例包括蛋白质A、碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻伸苯基二马来酰亚胺(oPDM)、丙酸N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯(磺基-SMCC)(例如，参见Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括那些描述于以下中者：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.编号78，118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)，及Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375)。优选偶联剂是SATA及磺基-SMCC，其皆可自PierceChemical公司(Rockford,IL)购得。
当结合特异性是抗体时，其可经由两条重链的C-末端铰链区的巯基键结来偶联。在特别优选的实施方案中，铰链区经修饰在偶联之前含有奇数个(优选一个)巯基残基。
或者，两种结合特异性可在同一载体中编码且在同一宿主细胞中表达并装配。此方法在双特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、mAb×(scFv)2、Fab×F(ab')2或配体×Fab融合蛋白时尤其有用。双特异性抗体可包含在每一重链的C-末端处包含scFv的抗体。本文所述双特异性分子可为包含一种单链抗体及结合决定簇的单链分子、或包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两种单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于(例如)美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；及美国专利第5,482,858号中。
双特异性分子与其特异性靶的结合可使用本领域公认的方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或Western印迹测定)来确认。这些分析测定通常都采用对受特别关注的蛋白质-抗体复合物特异性的标记试剂(例如抗体)来检测该受关注的复合物的存在。
XV.组合物
进一步提供组合物，例如药物组合物，其含有一种本文所述的抗GITR抗体或本文所述的抗GITR抗体的组合，或本文所述的抗GITR抗体与针对其他靶标的抗体的组合，或本文所述的抗GITR抗体的抗原结合部分，与医药上可接受的载体配制在一起。这些组合物可包括本文所述抗体或免疫偶联物或双特异性分子中的一种或组合(例如两种或更多种不同者)。举例而言，本文所述的药物组合物可包含抗体(或免疫偶联物或双特异性物)的组合，其中各抗体结合靶抗原上的不同表位或具有互补的活性。
在某些实施方案中，组合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml或100-300mg/ml的浓度的抗GITR抗体。
本文所述药物组合物亦可以组合疗法、即与其他药剂组合施用。举例而言，组合疗法可包括与至少一种其他抗癌剂及/或T细胞刺激(例如，活化)剂组合的本文所述抗GITR抗体。可用于组合疗法中的治疗剂的实施例更详细描述于下文关于本文所述抗体的用途的部分中。
在一些实施方案中，本文公开的治疗组合物可包括用于治疗癌症的其他化合物、药物及/或药剂。这些化合物、药物及/或药剂可包括(例如)刺激针对给定癌症的免疫应答的化学疗法药物、小分子药物或抗体。在一些情况下，治疗组合物可包括(例如)以下中的一或多者：抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PDL-1抗体、抗OX40(亦称作CD134、TNFRSF4、ACT35及/或TXGP1L)抗体、抗CD137抗体或抗LAG-3抗体。
如本文所使用，“医药上可接受的载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及生理上相容的类似试剂。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、非经肠、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。依赖于施用途径而定，可于材料中对活性化合物(即抗体、免疫偶联物或双特异性分子)进行包衣以保护化合物免受酸及其他可使化合物失活的天然条件的作用。
本文所述医药化合物可包括一或多种医药上可接受的盐。“医药上可接受的盐”指保留亲本化合物的期望生物活性且不赋予任何不期望毒理学效应的盐(例如，参见Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实施例包括酸加成盐及碱加成盐。酸加成盐包括那些源自无毒无机酸(例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸，等等)以及源自无毒有机酸(例如脂肪族单及二羧酸、经苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸，等等)者。碱加成盐包括那些源自碱土金属(例如钠、钾、镁、钙，等等)以及源自无毒有机胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)，等等)者。
本文所述药物组合物亦可包括医药上可接受的抗氧化剂。医药上可接受的抗氧化剂的实施例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、氢氯酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠，等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚，等等；及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。
可用于本文所述药物组合物中的适宜水性及非水性载体的实施例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)及其适宜混合物、植物油(例如橄榄油)及可注射有机酯(例如油酸乙酯)。可(例如)通过使用诸如卵磷脂等包衣材料、通过维持所需粒径(在分散剂的情形下)及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
这些组合物亦可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过上述灭菌程序并通过纳入各种抗细菌剂及抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸，等等)二者可确保阻止微生物的存在。这些组合物中亦可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠，等等。另外，可通过引入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝及明胶)来实现可注射医药形式的长效吸收。
医药上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。本领域已知用于医药活性物质的这些介质及药剂的使用。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则亦涵盖常规介质或药剂在所述药物组合物中的使用。药物组合物可包含防腐剂或可不含防腐剂。这些组合物中亦可纳入附加活性化合物。
通常，治疗组合物必须无菌且在制造及储存条件下稳定。可将组合物调配成溶液、微乳液、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液体聚乙二醇，等等)及其适宜混合物。可(例如)通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(在分散液情形下)且通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情形下，优选可将等渗剂(例如糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化钠)纳入组合物中。可通过向组合物中纳入延迟吸收剂(例如，单硬脂酸盐及明胶)实现可注射组合物的长效吸收。
无菌可注射溶液可通过以下方式来制备：将所需量的活性化合物纳入具有上文所列举成分中的一者或组合(视需要)的适宜溶剂中，而后进行无菌微滤。通常，可通过将活性化合物纳入含有基本分散介质及来自那些上文所列举者的所需其他成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形下，优选制备方法是真空干燥及冷冻-干燥(冻干)，其可自其预先经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任一所期望额外成分的粉末。
可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将依赖于所治疗受试者及特定施用方式而变化。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常可为产生治疗效应的组合物的量。通常，在100％中，此量将在与医药上可接受的载体组合的约0.01％至约99％的活性成分、优选约0.1％至约70％、最佳约1％至约30％活性成分范围内。
可对剂量方案进行调节以提供最佳期望反应(例如治疗反应)。举例而言，可施用单次推注，可随时间施用若干个分次剂量或可根据治疗状况紧急程度所指示按比例减少或增加剂量。尤其有利地将非经肠组合物调配成剂量单位形式以便于剂量的施用及均匀性。如本文所使用的剂量单元形式指适于作为单位剂量供欲治疗受试者使用的物理离散单元；各单元含有预定量的活性化合物，此预定量经计算与所需医药载体一起产生期望治疗效应。本文所述剂量单位形式的规格取决于且直接依赖于下列因素：(a)活性化合物的独特特性及欲实现的特定治疗效应，及(b)复合此活性化合物以治疗受试者敏感性的技术中的固有限制条件。
对于抗体的施用，剂量将在约0.0001mg/kg至100mg/kg且更通常0.01mg/kg至5mg/kg或10mg/kg宿主体重的范围内。举例而言，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1mg/kg至10mg/kg范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。本文所述抗GITR抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中抗体是使用以下给药日程表中的一者给予的：(i)每四周共六个剂量，随后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，而后每三周1mg/kg体重。
抗GITR抗体可以固定剂量(固定剂量方案)施用。
在一些方法中，同时施用两种或更多种经由不同结合特异性的单克隆抗体，在该情形下，所施用的每一抗体的剂量均在所指示的范围内。抗体通常在多个时机施用。单一剂量之间的间隔可为(例如)每周、每月、每三个月或每年。间隔亦可如通过测量患者的针对靶抗原的抗体血液含量所指示而不规则。在一些方法中，对剂量进行调节以实现约1-1000μg/ml且在一些方法中约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
抗GITR抗体可以另一抗体的剂量方案与另一抗体一起施用。举例而言，抗GITR抗体可每两周在60分钟内以静脉内输注形式与抗PD-1抗体(例如尼沃鲁单抗(nivolumab)(OPDIVO))一起施用直至疾病进展或不可接受的毒性发生为止。抗GITR抗体可每3周在30分钟内以静脉内输注形式与派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)一起施用直至疾病进展或不可接受的毒性发生为止。
抗体可以持续释放配制剂的形式施用，在该情形下需要频率较低的施用。剂量及频率依赖于抗体在患者中的半衰期而变化。通常，人抗体显示最长的半衰期，其后为人源化抗体、嵌合抗体及非人抗体。施用剂量及频率可依赖于治疗为预防性抑或或治疗性而变化。在预防性应用中，以相对较不频繁之间隔经较长时间段施用相对较低的剂量。一些患者在其余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要相对较短间隔的相对较高的剂量直至减轻或终止疾病进展且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用预防性方案。
本文所述药物组合物中活性成分的实际剂量可有所变化，以便获得对于特定患者、组合物及施用方式有效达到期望治疗反应而对患者不具毒性的活性成分量。所选剂量量将依赖于多种药物代谢动力学因素而定，这些因素包括所用本文所述特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物及/或物质、所治疗患者的年龄、性别、体重、身体状况、一般健康情况及先前病史及已为医学技术中所熟知的类似因素。
本文所述抗GITR抗体的“治疗有效量”优选可降低疾病症状的严重程度，增加无疾病症状时段的频率及持续时间或预防因感病性所致的损害或失能。在癌症的上下文中，治疗有效剂量优选可增加存活、及/或预防与癌症相关的身体症状的进一步劣化。癌症的症状是本领域所熟知的，且包括(例如)不常见的痣特征(unusual mole feature)、痣外观(包括不对称、边界、颜色及/或直径)变化、新近着色皮肤区域、异常痣、指甲下变深区域、乳房肿块、乳头变化、乳腺囊肿、乳房疼痛、死亡、体重减轻、虚弱、过度疲劳、进食困难、丧失食欲、慢性咳嗽、恶化的气短、咳血、尿液带血、粪便带血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹痛下堕、气胀病、腹腔中流体、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、吐血、严重出汗、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、发冷、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移及胰脏转移、吞咽困难，等等。
治疗有效剂量可防止或延迟癌症发作，这在有疾病的早期或初步体征时可能是期望的。用于诊断癌症的实验室测试包括化学(包括GITR含量的测量)、血液学、血清学及放射学。因此，监测上述中的任一者的任何临床或生物化学测定均可用于确定特定治疗是否是用于治疗癌症的治疗有效剂量。本领域技术人员应能够基于诸如受试者的体格、受试者症状的严重程度及特定组合物或所选施用途径等因素来测定这些量。
本文所述组合物可使用本领域中已知的多种方法中的一种或多种、经由一个或多个施用途径施用。如本领域技术人员应了解，施用途径及/或方式应视所期望结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜腔内、皮下、脊柱或其他非经肠施用途径，例如通过注射或输注。本文所用短语“非经肠施用”意指除经肠及局部施用以外的施用方式，通常通过注射，且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼窝内、心内、皮内、腹膜腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、经囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
或者，本文所述抗体可经由非经肠途径施用，例如局部、表皮或粘膜施用途径，例如经鼻内、经口、经阴道、经直肠、经舌下或经局部。
活性化合物可利用保护化合物免于快速释放的载体来制备，例如控制释放配制剂，包括植入体、经皮贴剂及微囊封递送系统。可使用生物可降解的生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。用于制备此等配制剂的许多方法已获得专利权或通常已为本领域技术人员所知。参见(例如)Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker公司，New York,1978。
治疗组合物可利用本领域已知的医学器件施用。举例而言，在优选实施方案中，本文所述治疗组合物可利用无针皮下注射(例如器件公开于美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号或第4,596,556号中的器件)来施用。与本文所述抗GITR抗体一起使用的熟知植入体及模组的实施例包括：美国专利第4,487,603号，其公开用于以控制速率分配用药的可植入微输注泵；美国专利第4,486,194号，其公开用于经由皮肤施用药物的治疗器件；美国专利第4,447,233号，其公开用于以精确输注速率递送用药的用药输注泵；美国专利第4,447,224号，其公开用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，其公开经由多室隔间的渗透药物递送系统；及美国专利第4,475,196号，其公开渗透药物递送系统。此等专利皆以引用方式并入本文中。许多其他植入体、递送系统及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本文所述抗GITR抗体可经配制以确保体内的适当分布。举例而言，血脑障壁(BBB)可排除许多高度亲水性化合物。为确保本文所述治疗化合物跨越BBB(视期望，例如，针对脑癌)，则其可以例如配制在脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见(例如)美国专利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂质体可包含一个或多个选择性运输至特定细胞或器官中、由此增强靶向药物递送的部分(例如，参见V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(例如，参见颁予Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；亦参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
XVI.应用及方法
本文所述抗体、抗体组合物及方法具有多种体外及活体内应用，其涉及(例如)通过活化GITR信号传导增强免疫应答或检测GITR。在优选实施方案中，本文所述抗体是人抗体。举例而言，本文所述抗GITR抗体可在体外或离体施用培养物中的细胞或(例如)在活体内施用人受试者以增强多种疾病中的免疫性。因此，本文提供改良受试者中的免疫应答的方法，其包含向受试者施用本文所述抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答被修饰。优选地，增强、刺激或上调反应。
优选受试者包括期望免疫应答增强的人患者。这些方法尤其适于治疗患有可通过加强免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答，例如抗原特异性T细胞应答)治疗的病症的人患者。在具体实施方案中，这些方法尤其适于治疗活体内癌症。为实现免疫性的抗原特异性增强，本文所述抗GITR抗体可与所关注抗原一起施用或抗原可已经存于欲治疗的受试者(例如，带有肿瘤或带有病毒的受试者)中。在针对GITR的抗体与另一药剂一起施用时，两者可单独或同时施用。
亦涵盖用于检测样品中人GITR抗原的存在或测量人GITR抗原的量的方法，其包含在容许在抗体或其部分与人GITR之间形成复合物的条件下使样品及对照样品与单克隆抗体(例如，特异性结合人GITR的人单克隆抗体或其抗原结合部分)接触。随后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比之间的复合物形成差异指示样品中人GITR抗原的存在。此外，本文所述抗GITR抗体可用于经由免疫亲和力纯化来纯化人GITR。
鉴于本文所述的抗GITR抗体刺激或共刺激T细胞应答(例如抗原特异性T细胞应答)的能力，本文提供了使用本文所述的抗体来刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答(例如抗肿瘤T细胞应答)的体外及体内方法。在某些实施方案中，亦提供CD3刺激(例如，通过与表达膜CD3的细胞共温育)，该刺激可与用抗GITR抗体刺激同时、之前或之后提供。举例而言，本文提供刺激抗原特异性T细胞应答的方法，其包含使该T细胞与本文所述抗GITR抗体及视情况与抗CD3抗体接触，使得刺激抗原特异性T细胞应答。可使用抗原特异性T细胞应答的任何适宜指示因子以测量抗原特异性T细胞应答。这些适宜指示因子的非限制性实施例包括在抗体存在下增加的T细胞增殖及/或在抗体存在下增加细胞因子产生。在优选实施方案中，刺激由抗原特异性T细胞的白介素-2及/或干扰素-γ产生。
可利用抗GITR抗体增强或共刺激的T细胞包括CD4+T细胞及CD8+T细胞。T细胞可为Teff细胞，例如CD4+Teff细胞、CD8+Teff细胞、T辅助(Th)细胞及T细胞毒性(Tc)细胞。
进一步涵盖刺激受试者中免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)的方法，其包含向受试者施用本文所述抗GITR抗体，使得刺激受试者中的免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。在优选实施方案中，受试者是带有肿瘤的受试者且刺激针对肿瘤的免疫应答。肿瘤可为实体肿瘤或液体肿瘤(例如血液恶性病)。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤系非免疫原性。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阴性。受试者亦可为带有病毒的受试者且刺激针对病毒的免疫应答。
进一步提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包含向受试者施用本文所述抗GITR抗体，使得抑制受试者中的肿瘤生长。亦提供治疗受试者中病毒感染的方法，其包含向受试者施用本文所述抗GITR抗体，使得治疗受试者中的病毒感染。
本文亦涵盖自患有肿瘤(例如癌性肿瘤)的受试者的肿瘤微环境耗竭Treg细胞的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述抗GITR抗体，该抗GITR抗体包含刺激肿瘤微环境中Treg细胞的耗竭的Fc。Fc可为，例如，具有效应物功能或增强的效应物功能(例如结合一或多种活化Fc受体或具有增强的与一或多种活化Fc受体的结合)的Fc。在优选实施方案中，Treg耗竭发生而不显著耗竭或抑制肿瘤微环境中的Teff，且不显著耗竭或抑制肿瘤微环境外、例如外周中的Teff细胞及Treg细胞。在某些实施方案中，受试者在Treg细胞上较在Teff细胞上、例如在肿瘤微环境中具有较高含量的GITR。
在某些实施方案中，用具有增强激动作用(例如结合抑制性FcRIIb或具有增强的与抑制性FcRIIb的结合)的Fc的抗GITR抗体治疗受试者。利用具有不结合一种或多种活化FcR或具有降低的与一种或多种活化FcR的结合的Fc的抗GITR抗体执行某些治疗。抗GITR抗体可耗竭肿瘤中的Treg及/或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中的Treg。
在某些实施方案中，给予受试者抗GITR抗体作为附加疗法。利用抗GITR抗体治疗患有癌症的受试者可引起延长存活，例如相对于当前护理标准长期耐久反应；至少3个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或更多年的长期存活，或至少3个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年的无复发存活。在某些实施方案中，用抗GITR抗体治疗患有癌症的受试者可防止癌症复发或延迟癌症复发(例如)3个月、6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年。抗GITR治疗可用作一线、二线或三线治疗。
在优选实施方案中，本文所述抗GITR抗体无显著毒性。举例而言，GITR抗体对人器官(例如肝、肾、脑、肺及心脏中的一种或多种)并无显著毒性，如(例如临床试验)中所测定。在某些实施方案中，GITR抗体并不显著触发不期望的免疫应答，例如自体免疫性或炎症。
在某些实施方案中，用抗GITR激动剂(例如，抗GITR抗体)治疗受试者不会引起免疫系统过刺激至受试者的免疫系统随后攻击受试者自身的程度(例如，自体免疫应答)或引起(例如)过敏反应。因此，抗GITR抗体优选不引起过敏反应。
在某些实施方案中，用本文所述抗GITR抗体(例如包含28F3的CDR或可变区的抗体)治疗受试者不会引起显著发炎反应，例如免疫介导的肺炎、免疫介导的结肠炎、免疫介导的肝炎、免疫介导的肾炎或肾功能障碍、免疫介导的垂体炎、免疫介导的甲状腺功能减退及甲状腺功能亢进或其他免疫介导的不良反应。在某些实施方案中，包含28F3的CDR或可变区的抗GITR抗体较其他抗GITR抗体引起较少炎症反应，例如免疫介导的肺炎、免疫介导的结肠炎、免疫介导的肝炎、免疫介导的肾炎或肾功能障碍、免疫介导的垂体炎、免疫介导的甲状腺功能减退及甲状腺功能亢进、过敏反应或其他免疫介导的不良反应。其他免疫介导的不良反应包括：心脏病症，例如心室心律不齐；眼病症，例如虹膜睫状体炎；输注相关的反应；增加的淀粉酶、增加的脂肪酶；神经系统病症，例如头晕、外周及感觉神经病变；皮肤及皮下组织病症，例如疹、瘙痒、表皮脱落性皮肤炎、多形性红斑、白斑病或银屑病；呼吸、胸腔及纵膈病症，例如咳嗽；疲劳；恶心；食欲下降；便秘；关节痛；及腹泻。
在某些实施方案中，GITR抗体与另一癌症疗法(例如刺激免疫系统的化合物(例如，免疫-肿瘤药剂)，例如本文所述化合物或调节本文所述靶标的化合物)组合提供协同抗肿瘤效应。
下文进一步详细论述本文所述这些及其他方法。
癌症
由抗GITR抗体活化GITR可增强对患者中癌细胞的免疫应答。本文提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向受试者施用本文所述抗GITR抗体，使得受试者得到治疗，例如使得癌性肿瘤的生长被抑制或减少，及/或肿瘤退化及/或实现延长存活。抗GITR抗体可单独使用以抑制癌症肿瘤的生长。或者，抗GITR抗体可与另一药剂(例如另一免疫原性药剂、标准癌症治疗或另一抗体)组合使用，如下文所述。
因此，本文提供(例如)通过抑制受试者中肿瘤细胞生长来治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述抗GITR抗体(例如28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或其抗原结合部分。该抗体可为人抗GITR抗体(例如本文所述人抗人GITR抗体中的任一者)。另外/或者，该抗体可为嵌合或人源化抗GITR抗体，例如包含28F3或本文所述其他抗GITR抗体的序列的嵌合或人源化抗GITR抗体。
可使用本发明抗体抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症及那些通常对免疫疗法无反应者。癌症可为具有实体肿瘤或血液恶性病(液体肿瘤)的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实施例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经胚细胞瘤、胰腺癌、神经胶母细胞瘤(多形性神经胶母细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌及头颈癌(或癌瘤)、胃癌、生殖细胞肿瘤、儿科肉瘤、鼻窦天然杀伤、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，例如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统的新生物(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括那些由石棉诱导者)、病毒相关癌症或病毒起源的癌症(例如，人乳头瘤病毒(HPV相关或起源的肿瘤))、及源自两种主要血细胞谱系(即骨髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血栓细胞、巨噬细胞及肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK及浆细胞))中的任一者的血液学恶性病，例如所有类型的白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞性及/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化的AML(M0)、骨髓母细胞性白血病(M1)、骨髓母细胞性白血病(M2；细胞成熟)、前髓球性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞性白血病(具有嗜酸性粒细胞增多症的M4或M4变体[M4E])、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、分离的粒细胞性肉瘤及绿色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金氏氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B细胞血液学恶性病(例如B细胞淋巴瘤)、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织(MALT)淋巴瘤、退行性(例如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵膈B细胞淋巴瘤、前体T-淋巴母细胞性淋巴瘤、T-淋巴母细胞性；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增殖病症、真实组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系的造血性肿瘤、急性淋巴母细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B-淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(亦称作蕈样真菌病或塞扎里综合征(Sezary syndrome))及具有瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、焖燃型骨髓瘤(亦称作无痛骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤及多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；类骨髓谱系的造血性肿瘤、间质起源的肿瘤(包括纤维肉瘤及横纹肌肉瘤)；精细胞瘤、畸形癌、中枢及周围神经肿瘤，包括星细胞瘤、神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤；及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角质棘皮瘤、精细胞瘤、甲状腺滤泡性癌及畸形癌、淋巴谱系的造血性肿瘤，例如T细胞及B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症，例如T前淋巴细胞性白血病(T-PLL)，包括小细胞及脑回状细胞类型；优选T细胞类型的大的颗粒性淋巴细胞白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多型及免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性类骨髓性淋巴瘤以及这些癌症的任何组合。本文所述方法亦可用于治疗转移性癌症、不可切除及/或难治性癌症(例如，利用例如阻断CTLA-4或PD-1抗体的先前免疫疗法难治的癌症)及复发性癌症。
在某些实施方案中，向患有对先前治疗(例如利用免疫-肿瘤药物的先前治疗)的响应不足的癌症的患者、或患有难治或抗性、固有难治或抗性(例如，利用PD-1路径拮抗剂难治)癌症的患者、或其中抗性或难治性状态是获得性的癌症的患者施用抗GITR Ab。举例而言，可通过单独施用抗GITR抗体或与另一疗法(例如，抗PD-1疗法)的组合治疗对第一疗法无反应或反应不足或在治疗(例如抗PD-1治疗)后观察到疾病进展的受试者。
在某些实施方案中，向先前未接受(即，未经治疗)免疫-肿瘤药剂(例如PD-1路径拮抗剂)的患者施用抗GITR抗体。
可利用护理治疗的标准施用抗GITR抗体。抗GITR抗体可作为维持疗法(例如意欲防止肿瘤发生或复发的疗法)施用。
抗GITR抗体可与另一治疗(例如辐射、手术或化学疗法)一起施用。举例而言，当有已存在微转移的可能性时，及/或为了降低复发的风险，可施用抗GITR抗体附加疗法。
抗GITR抗体可作为单一疗法、或作为唯一免疫刺激疗法施用。针对GITR的抗体(例如本文所述抗GITR抗体)亦可免疫原试剂(例如癌细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽及糖分子)、细胞及经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞)组合(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实施例包括黑色素瘤抗原的肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪氨酸酶的肽)、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。
在人中，已显示一些肿瘤具有免疫原性，例如黑色素瘤。通过降低经由GITR活化的T细胞活化的阈值，可活化宿主中的肿瘤反应，从而容许治疗非免疫原性肿瘤或那些具有限制免疫原性者。
抗GITR抗体(例如本文所述抗GITR抗体)可与疫苗接种方案组合。已设计出针对肿瘤的疫苗接种的许多实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of CancerVaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCOEducational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；亦参见Restifo,N.及Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61，第3023-3043页，DeVita等人(编辑),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology，第五版)。在这些策略中的一种中，使用自体或同种肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞被转导表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的强力的抗原呈递活化剂(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90:3539-43)。
各种肿瘤中基因表达及大规模基因表达模式的研究导致了所谓肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg,S A(1999)Immunity 10:281-7)。在许多情形下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤及肿瘤产生的细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。GITR活化可与在肿瘤中表达的若干重组蛋白及/或肽结合使用以生成对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白通常由免疫系统视为自身抗原且因此对其具有耐受性。肿瘤抗原可包括蛋白端粒酶，这种酶是染色体的端粒的合成所需的，且在85％以上人癌症及仅少数的体细胞组织中表达(Kim等人(1994)Science 266:2011-2013)。肿瘤抗原亦可为由于体细胞突变，改变蛋白序列或在两个无关序列(即，费城染色体(Philadelphia chromosome)中的bcr-abl)之间产生融合蛋白，从而在癌细胞中表达的“新-抗原”，或来自B细胞肿瘤的独特型(idiotype)。
其他肿瘤疫苗可包括来自参与人癌症的病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV))的病毒的蛋白质。可与GITR活化结合使用的另一形式的肿瘤特异性抗原是自肿瘤组织自身分离的纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白的片段，且这些HSP高度有效地递送至抗原呈递细胞用于引发肿瘤免疫性(Suot及Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278:117-120)。
树突细胞(DC)是可用于引发抗原特异性反应的强力的抗原呈递细胞。DC可离体产生且装载有各种蛋白质及肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle等人(1998)NatureMedicine 4:328-332)。亦可通过遗传手段转导DC使之表达这些肿瘤抗原。为免疫目的，DC亦已直接融合至肿瘤细胞(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫可有效地与GITR活化组合以活化更强力的抗肿瘤反应。
GITR活化亦可与标准癌症治疗(例如，手术、辐射及化学疗法)组合。GITR活化可有效地与化学治疗方案组合。在这些情况下，可减少所施用化学治疗试剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。该组合的一个实例是抗GITR抗体与氨烯咪胺(decarbazine)的组合用于治疗黑色素瘤。该组合的另一实例是抗GITR抗体与白介素-2(IL-2)的组合用于治疗黑色素瘤。支持GITR活化及化学疗法的组合使用的科学理论基础是：细胞死亡(这是大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果)应该会在抗原呈递路径中产生增加的肿瘤抗原含量。其他可经由细胞死亡与GITR活化产生协同作用的组合疗法有辐射、手术及激素剥夺。这些方案均在宿主中创造出肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂亦可与GITR活化组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可能会向宿主抗原呈递路径中引入肿瘤抗原。
本文所述抗GITR抗体亦可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应物细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(例如，参见美国专利第5,922,845号及第5,837,243号)。双特异性抗体可用于靶向两种单独抗原。举例而言，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性抗体已用于将巨噬细胞靶向肿瘤的位点。此靶向可更有效地活化肿瘤特异性反应。可通过GITR的活化加强这些反应的T细胞臂。或者，可通过使用结合肿瘤抗原及树突细胞特异性细胞表面标记物的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监督。许多这些机制可通过令肿瘤表达的免疫阻抑性蛋白质失活来克服。这些机制包括例如TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)及Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274:1363-1365)。针对这些实体中的每一者的抗体可与抗GITR抗体组合使用以消除免疫阻抑剂的效应并帮助宿主的肿瘤免疫应答。
其他活化宿主免疫应答的抗体可与抗GITR抗体组合使用。这些抗体包括树突细胞表面上活化DC功能及抗原呈递的分子。抗CD40抗体能够有效地替代T细胞辅助活性(Ridge等人(1998)Nature 393:474-478)，可与抗GITR抗体结合使用。活化针对T细胞共刺激分子(例如CTLA-4(例如，美国专利第5,811,097号)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397:262-266))的抗体亦可为增加T细胞活化水平创造条件。PD1或PD-L1的抑制剂亦可与抗GITR抗体结合使用。
目前使用骨髓移植以治疗多种造血性起源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病系由此治疗所致，但可自移植物抗肿瘤反应获得治疗益处。GITR活化可用于增加移入肿瘤特异性T细胞中的供体的有效性。
亦存在若干实验治疗方案，其涉及抗原特异性T细胞的离体活化与扩增，并将这些细胞继受性转移至接受者中以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg及Riddell(1999)Science 285:546-51)。这些方法亦可用于活化T细胞对感染介质(例如CMV)的反应。在抗GITR抗体存在下的离体活化可增加继受性转移的T细胞的频率及活性。
感染性疾病
本文所述方法亦可用于治疗已暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本文所述另一方面提供治疗受试者的感染性疾病的方法，其包含向受试者施用抗GITR抗体或其抗原结合部分，使得受试者的感染性疾病得到治疗。另外/或者，抗体可为嵌合或人源化抗体。
类似于如上文所论述的抗体介导的GITR活化对于肿瘤的应用，抗体介导的GITR活化可单独使用或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素及自身抗原的免疫应答。此治疗方法可尤其有用的病原体的实施例包括目前无有效疫苗的病原体或常规疫苗并非完全有效的病原体。这些病原体包括(但不限于)HIV、肝炎(甲型、乙型和丙型)、流行性感冒、疱疹、贾第虫(Giardia)、疟疾、利什曼虫(Leishmania)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。GITR活化可针对由在感染全过程中均呈现改变抗原的试剂(例如HIV)的确立感染有用。在抗人GITR抗体施用时，这些新颖表位被识别为外来物，由此引起强的T细胞应答。
引起可由本文所述方法治疗的感染的病原体病毒的一些实施例包括HIV、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流行性感冒病毒、虫媒病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、小病毒、痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰白质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及虫媒病毒脑炎病毒。
引起可由本文所述方法治疗的感染的病原体细菌的一些实施例包括衣原体(chlamydia)、立克次氏体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙雷菌属(serratia)、假单胞菌属(pseudomonas)、军团菌属(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门杆菌属(salmonella)、芽孢杆菌、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒中毒、炭疽(anthrax)、鼠疫、钩端螺旋体病(leptospirosis)及莱姆病细菌(Lymesdisease bacteria)。
引起可由本文所述方法治疗的感染的病原体真菌的一些实施例包括念珠菌属(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌属(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属(Genus Mucorales)(毛霉(mucor)、犁头霉(absidia)、根霉菌(rhizopus))、申克孢子丝菌(Sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及荚膜组织浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可由本文所述方法治疗的感染的病原体寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleriafowleri)、棘状变形虫属(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、肺泡囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、焦虫(Babesia microti)、布鲁氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克鲁氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、黑热病利什曼原虫(Leishmania donovani)、弓虫(Toxoplasma gondii)、巴西鼠钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，GITR活化可与其他形式的免疫疗法(例如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法(其提供增强的肿瘤抗原呈递(例如，参见Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure2:1121-1123)))组合。
自体免疫反应
抗GITR抗体可引起并扩增自体免疫反应。实际上，使用肿瘤细胞及肽疫苗诱导抗肿瘤反应揭示，许多抗肿瘤反应涉及抗自身反应性(van Elsas等人(2001)J.Exp.Med.194:481-489；Overwijk等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987；Hurwitz,(2000)，上文文献；Rosenberg及White(1996)J.Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1):81-4)。因此，可考虑使用抗GITR抗体结合各种自身蛋白设计疫苗接种方案，以高效地生成针对这些自身蛋白的免疫应答用于疾病治疗。举例而言，阿尔兹海默氏病(Alzheimer's disease)涉及Aβ肽在脑中类淀粉沉积物中的错误累积；针对类淀粉的抗体反应能够清除这些类淀粉沉积物(Schenk等人，(1999)Nature 400:173-177)。
其他自身蛋白亦可用作靶标，例如用于治疗变态反应及哮喘的IgE、及用于类风湿性关节炎的TNFc。最后，可通过使用抗GITR抗体诱导对于各种激素的抗体应答。对生殖激素的中和性抗体应答可用于避孕。对激素及特定肿瘤的生长所需的其他可溶性因子的中和性抗体应答亦可考虑为可能的疫苗接种靶标。
如上文针对抗GITR抗体的使用所述的类似方法可用于诱导治疗性自体免疫应答，以治疗具有其他自身抗原(例如类淀粉沉积物，包括阿尔兹海默氏病中的Aβ)、细胞因子(例如TNFα)及IgE的错误累积的患者。
疫苗
本文所述抗GITR抗体可通过共施用抗GITR抗体与所关注抗原(例如，疫苗)用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，本文提供增强对受试者中的抗原的免疫应答的方法，其包含向受试者施用：(i)抗原；及(ii)抗GITR抗体或其抗原结合部分，使得增强对受试者中的抗原的免疫应答。抗体可为人抗人GITR抗体(例如本文所述人抗GITR抗体中的任一者)。另外/或者，抗体可为嵌合或人源化抗体。抗原可为，例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这些抗原的非限制性实例包括上文部分中论述的那些，例如上文论述的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
在某些实施方案中，使用包含抗GITR抗体结合的表位的肽或融合蛋白作为疫苗，作为抗GITR抗体的替代或者补充。
在体内及体外施用本文所述抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性及双特异性分子及免疫偶联物)的适宜途径是本领域所熟知的且可由本领域技术人员选择。举例而言，抗体组合物可通过注射(例如，静脉内或皮下)施用。所用分子的适宜剂量将依赖于受试者的年龄及体重及抗体组合物的浓度及/或配制剂而定。
如前文所述，本文所述抗GITR抗体可与一种或多种其他治疗剂(例如细胞毒性剂、放射性毒性剂或免疫阻抑剂)共施用。抗体可连接至试剂(呈免疫-复合物形式)或可与试剂分开施用。在后一情形(单独施用)中，抗体可在试剂之前、之后或同时施用或可与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如辐射)共施用。这些治疗剂包括，例如，自身仅在对患者具有毒性或亚毒性的量下有效的抗新生物剂，例如多柔比星(doxorubicin)(阿德力霉素(adriamycin))、顺铂、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、达卡巴嗪(dacarbazine)及环磷酰胺羟基脲。顺铂以100mg/ml剂量每四周一次静脉内施用，阿德力霉素以60-75mg/ml剂量每21天一次静脉内施用。本文所述抗GITR抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共施用提供两种经由不同机制起作用、从而对人肿瘤细胞产生细胞毒性效应的抗癌剂。该共施用可解决由于发生对药物的抗性或可使得肿瘤细胞与抗体不反应的肿瘤细胞的抗原性变化所引起的问题。
包含本文所述抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)及使用说明书的试剂盒亦在本文所述范畴内。该试剂盒可进一步含有至少一种额外试剂或一种或多种额外本文所述人抗体(例如，具有互补活性且结合不同于第一人抗体的GITR抗原中的表位的人抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒的内容物的预期用途的标签。术语“标签”包括试剂盒上供应或与试剂盒一起供应或以其他方式伴随试剂盒的任何书面或记录材料。
组合疗法
除上文提供的组合疗法外，抗GITR抗体(例如那些本文所述者)亦可用于组合疗法(例如)用于治疗癌症，如下文所述。
本文提供组合疗法的方法，其中抗GITR抗体与一种或多种额外试剂(例如，可有效刺激免疫应答以藉此进一步增强、刺激或上调受试者的免疫应答的小分子药物、抗体或其抗原结合部分)共施用。如实施例中所示，向小鼠施用激动性抗GITR抗体及拮抗性抗PD-1抗体在抑制肿瘤生长中具有协同效应。
通常，例如本文所述抗GITR抗体可与以下物质组合：(i)刺激性(例如，共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂及/或(ii)免疫细胞(例如T细胞)上的抑制性信号或分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，二者皆可增大免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)。在某些方面中，免疫-肿瘤药剂为(i)刺激性(包括共刺激)分子(例如，受体或配体)的激动剂或(ii)涉及天然免疫的细胞(例如NK细胞)上的抑制性(包括共抑制性)分子(例如，受体或配体)的拮抗剂，且其中免疫-肿瘤药剂增强天然免疫。这些免疫-肿瘤药剂通常称作免疫检查点调节剂，例如免疫检查点抑制剂或免疫检查点刺激剂。
在某些实施方案中，抗GITR抗体与靶向作为免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员的刺激性或抑制性分子的试剂一起施用。举例而言，抗GITR抗体，例如本文所述的抗GITR抗体，可与靶向IgSF家族的成员的试剂一起施用受试者以增加免疫应答。举例而言，抗GITR抗体可与靶向(或特异性结合)膜结合的配体的B7家族的成员(该家族包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6)或特异性结合B7家族成员的共刺激性或共抑制性受体的试剂一起施用。
抗GITR抗体亦可与靶向分子(配体或受体)的TNF及TNFR家族的成员的试剂一起施用，这些试剂例如CD40及CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY及NGFR(例如，参见Tansey(2009)Drug Discovery Today 00:1)。
可由本文所述抗GITR抗体(例如28F3.IgG1及28F3.IgG1.1)与以下试剂中的一种或多种的组合刺激T细胞应答：
(1)抑制T细胞活化的蛋白质的拮抗剂(抑制剂或阻断剂)(例如，免疫检查点抑制剂)，例如如上文所述CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2及LAG-3及以下蛋白质中的任一者：TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1及TIM-4；及/或
(2)刺激T细胞活化的蛋白质的激动剂，例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3及CD28H。
调节上述蛋白质中之一、且可与激动性抗GITR抗体(例如那些本文所述者)组合用于治疗癌症的示例性药剂包括：YervoyTM(伊匹单抗(ipilimumab))或曲美目单抗(Tremelimumab)(针对CTLA-4)、加利昔单抗(galiximab)(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7DC)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3)、IMP321(针对LAG-3)、BMS-663513(针对CD137)、PF-05082566(针对CD137)、CDX-1127(针对CD27)、抗OX40(Providence Health Services)、huMAbOX40L(针对OX40L)、阿塞西普(Atacicept)(针对TACI)、CP-870893(针对CD40)、鲁卡木单抗(Lucatumumab)(针对CD40)、达西珠单抗(Dacetuzumab)(针对CD40)、莫罗单抗-CD3(Muromonab-CD3)(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。
抗GITR抗体亦可与匹利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)一起施用，尽管其对PD-1结合的特异性已受到质疑。
可与激动性抗GITR抗体组合用于治疗癌症的其他分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的活化受体的激动剂。举例而言，抗GITR激动性抗体可与KIR的拮抗剂(例如，利利单抗(lirilumab))组合。
T细胞活化亦由可溶性细胞因子调控，且抗GITR抗体可与抑制T细胞活化的细胞因子的拮抗剂或刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂一起施用(例如)患有癌症的受试者。
在某些实施方案中，抗GITR抗体可与以下物质组合使用：(i)抑制T细胞活化的IgSF家族或B7家族或TNF家族的蛋白质的拮抗剂(或抑制剂或阻断剂)或抑制T细胞活化的细胞因子的拮抗剂(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF；“免疫阻抑性细胞因子”)及/或(ii)刺激T细胞活化的IgSF家族、B7家族或TNF家族的刺激性受体或细胞因子的激动剂，其用于刺激免疫应答、例如用于治疗增殖疾病(例如癌症)。
用于组合疗法的其他一些药剂包括抑制或耗竭巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括(但不限于)CSF-1R拮抗剂，例如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、WO13/87699、WO13/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；WO13169264；WO14/036357)。
抗GITR抗体亦可与抑制TGF-β信号传导的药剂一起施用。
可与抗GITR抗体组合的其他药剂包括增强肿瘤抗原呈递的药剂，例如树突细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸及咪喹莫特(imiquimod)，或增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如，蒽环)。
可与抗GITR抗体组合的另外一些疗法包括耗竭或阻断Treg细胞的疗法，例如特异性结合CD25的药剂。
可与抗GITR抗体组合的另一疗法是抑制代谢酶(例如吲哚胺加双氧酶(IDO)、加双氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法。
可与抗GITR抗体一起使用的另一类药剂包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受体的药剂。
可与抗GITR抗体组合用于治疗癌症的其他疗法包括逆转/防止T细胞无反应或耗竭的疗法及在肿瘤部位处触发先天免疫活化及/或炎症的疗法。
抗GITR抗体可与一种以上免疫-肿瘤药剂组合，且可(例如)与靶向免疫路径的多个要素的组合方法组合，例如以下中的一种或多种：增强肿瘤抗原呈递的疗法(例如，树突细胞疫苗、GM-CSF分泌细胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；通过(例如)抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路径及/或耗竭或阻断Treg或其他免疫阻抑细胞抑制负免疫调控的疗法；利用(例如)刺激CD-137、OX-40及/或GITR路径及/或刺激T细胞效应物功能的激动剂刺激正免疫调控的疗法；全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的疗法；使用(例如)CD25的拮抗剂(例如，达利珠单抗(daclizumab))或通过离体抗CD25珠子耗竭来耗竭或抑制Treg(例如肿瘤中的Treg)的疗法；影响肿瘤中的阻抑剂骨髓细胞的功能的疗法；增强肿瘤细胞的免疫原性的疗法(例如，蒽环)；包括经遗传修饰的细胞(例如由嵌合抗原受体修饰的细胞)的继受性T细胞或NK细胞转移(CAR-T疗法)；抑制代谢酶(例如吲哚胺加双氧酶(IDO)、加双氧酶、精氨酸酶或一氧化氮合成酶)的疗法；逆转/防止T细胞无反应或耗竭的疗法；在肿瘤部位处触发先天免疫活化及/或炎症的疗法；施用免疫刺激性细胞因子；或阻断免疫抑制性细胞因子。
本文所述激动性抗GITR抗体可与以下试剂中的一种或多种一起使用：接合阳性共刺激性受体的激动试剂、减弱经由抑制性受体信号传导的阻断剂、拮抗剂及一种或多种全身性增加抗肿瘤T细胞的频率的药剂、克服肿瘤微环境内的不同免疫阻抑性路径(例如，阻断抑制性受体接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗竭或抑制Treg(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如，达利珠单抗)或通过离体抗CD25珠子耗竭)、抑制代谢酶(例如IDO)或逆转/防止T细胞无反应或耗竭)的药剂及在肿瘤部位处触发先天免疫活化及/或炎症的药剂。
在某些实施方案中，若受试者为BRAF V600突变阳性，则将抗GITR抗体与BRAF抑制剂一起施用受试者。
在某些实施方案中，与另一免疫刺激性抗体一起施用的抗GITR抗体是本文所述的抗体。在某些实施方案中，与另一免疫刺激性抗体一起施用的抗GITR抗体系具有6C8的CDR序列的抗体，例如具有6C8的CDR的人源化抗体，如(例如)WO2006/105021中所述；包含WO2011/028683中所述的抗GITR抗体的CDR的抗体；包含JP2008278814中所述的抗GITR抗体的CDR的抗体、包含WO2015/031667中所述的抗GITR抗体的CDR的抗体或本文中描述或提及的其他抗GITR抗体。
本文提供刺激受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用激动性抗GITR分子，例如抗体及一种或多种其他免疫刺激性抗体，例如抗PD-1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、抗PD-L1拮抗剂(例如拮抗剂抗体)、拮抗性抗CTLA-4拮抗剂(例如拮抗性抗体)及/或抗LAG3拮抗剂(例如拮抗性抗体)，使得在受试者中刺激免疫应答，以(例如)抑制肿瘤生长或刺激抗病毒反应。在一个实施方案中，向受试者施用激动性抗GITR抗体及拮抗性抗PD-1抗体。在一个实施方案中，向受试者施用激动性抗GITR抗体及拮抗性抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，向受试者施用激动性抗GITR抗体及拮抗性抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，抗GITR抗体为人抗体，例如本文所述的抗体。或者，抗GITR抗体可为(例如)嵌合或人源化抗体(例如，自小鼠抗GITR mAb制备)，例如本文中进一步描述的那些。在一个实施方案中，至少一种其他免疫刺激性抗体(例如，拮抗性抗PD-1、拮抗性抗PD-L1、拮抗性抗CTLA-4及/或拮抗性抗LAG3抗体)是人抗体。或者，至少一种其他免疫刺激性抗体可为(例如)嵌合或人源化抗体(例如，自小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4及/或抗LAG3抗体制备)。
本文提供治疗过度增殖疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用激动性抗GITR抗体及拮抗剂PD-1抗体。在某些实施方案中，抗GITR抗体以亚治疗剂量施用，抗PD-1抗体以亚治疗剂量施用，或二者皆以亚治疗剂量施用。本文亦提供改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用抗GITR抗体及亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体且抗GITR抗体是人序列单克隆抗体，例如包含本文所述的28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10(例如，28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或本文所述另一激动性抗GITR抗体的CDR或可变区的抗体。
适用于本文所述方法中的PD-1拮抗剂包括(但不限于)配体、抗体(例如，单克隆抗体及双特异性抗体)及多价试剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
示例性抗PD-1抗体是尼沃鲁单抗(nivolumab)(BMS-936558)或包含WO 2006/121168中所述的抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4及4A11中的一者的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD1抗体是WO2012/145493中所述的MK-3475(兰布鲁珠单抗(Lambrolizumab))；及WO 2012/145493中所述的AMP-514。其他已知PD-1抗体及其他PD-1抑制剂包括于WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利第7,635,757号及第8,217,149号及美国专利公开案第2009/0317368号中描述的那些。亦可使用WO2013/173223中所述的抗PD-1抗体中的任一者。与这些抗体之一竞争结合及/或与这些抗体中之一结合PD-1上的相同表位的抗PD-1抗体亦可用于组合治疗。靶向PD-1受体的另一方法是由融合至IgG1的Fc部分的PD-L2(B7-DC)的细胞外结构域构成的重组蛋白，称作AMP-224。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体以5×10-8M或更小的KD结合人PD-1，以1×10-8M或更小的KD结合人PD-1，以5×10-9M或更小的KD结合人PD-1，或以介于1×10-8M与1×10-10M之间或更小的KD结合人PD-1。
本文提供治疗过度增殖疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用激动性抗GITR抗体及拮抗剂PD-L1抗体。在某些实施方案中，抗GITR抗体系以亚治疗剂量施用，抗PD-L1抗体以亚治疗剂量施用，或二者皆以亚治疗剂量施用。本文提供改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病相关的不良事件的方法，其包含向受试者施用抗GITR抗体及亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体且抗GITR抗体是人序列单克隆抗体，例如包含本文所述的28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2及6G10(例如，28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或本文所述另一激动性抗GITR抗体的CDR或可变区的抗体。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(在WO 2007/005874及美国专利第7,943,743号中称作12A4)、或包含描述于PCT公开案WO 07/005874及美国专利第7,943,743号中的3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4的CDR或可变区的抗体。在某一实施方案中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(亦称作抗B7-H1)、MPDL3280A(亦称作RG7446)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。亦可使用WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美国专利第7,635,757号及第8,217,149号及美国公开案第2009/145493号中公开的抗PD-L1抗体中的任一者。与这些抗体中的任一者竞争及/或结合相同表位的抗PD-L1抗体亦可用于组合治疗。
在某些实施方案中，抗PD-L1抗体以5×10-8M或更小的KD结合人PD-L1，以1×10-8M或更小的KD结合人PD-L1，以5×10-9M或更小的KD结合人PD-L1，或以介于1×10-8M与1×10- 10M之间或更小的KD结合人PD-L1。
本文提供治疗过度增殖疾病(例如，癌症)的方法，其包含向受试者施用本文所述抗GITR抗体及CTLA-4拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗GITR抗体系以亚治疗剂量施用，抗CTLA-4抗体以亚治疗剂量施用，或二者皆以亚治疗剂量施用。本文提供改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病相关的不良事件的方法，其包含向受试者施用抗GITR抗体及亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体是选自下组的抗体：YervoyTM(伊匹单抗或抗体10D1，描述于PCT公开案WO 01/14424中)、曲美目单抗(先前称作替西莫单抗(ticilimumab)，CP-675,206)、描述于以下公开案中的任一者中的单克隆或抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利第6,207,156号；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；及Mokyr等人(1998)CancerRes.58:5301-5304。亦可使用WO2013/173223中公开的抗CTLA-4抗体中的任一者。
在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体以5×10-8M或更小的KD结合人CTLA-4，以1×10- 8M或更小的KD结合人CTLA-4，以5×10-9M或更小的KD结合人CTLA-4，或以介于1×10-8M与1×10-10M之间或更小的KD结合人CTLA-4。
本文提供治疗过度增殖疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用抗GITR抗体及抗LAG-3抗体。在其他实施方案中，抗GITR抗体以亚治疗剂量施用，抗LAG-3抗体以亚治疗剂量施用，或二者皆以亚治疗剂量施用。本文提供改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病相关的不良事件的方法，其包括向受试者施用抗GITR抗体及亚治疗剂量的抗LAG-3抗体。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体且抗GITR抗体是人序列单克隆抗体，例如包含本文所述的28F3、19D3、18E10、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、或6G10(例如，28F3.IgG1或28F3.IgG1.1)或本文所述另一激动性抗GITR抗体的CDR或可变区的抗体。抗LAG3抗体的实例包括包含描述于美国专利公开案第US2011/0150892号、第WO10/19570号及第WO2014/008218号中的抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可使用的其他本领域公认的抗LAG-3抗体包括描述于US 2011/007023、WO08/132601及WO09/44273中的IMP731及IMP-321。与这些抗体中的任一者竞争及/或结合相同表位的抗LAG-3抗体亦可用于组合治疗。
在某些实施方案中，抗LAG-3抗体以5×10-8M或更小的KD结合人LAG-3，以1×10-8M或更小的KD结合人LAG-3，以5×10-9M或更小的KD结合人LAG-3，或以介于1×10-8M与1×10- 10M之间或更小的KD结合人LAG-3。
施用本文所述抗GITR抗体及针对一种或多种第二靶抗原(例如LAG-3及/或CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1)的拮抗剂(例如拮抗性抗体)可增强对患者中癌细胞的免疫应答。可使用本发明抗体抑制生长的癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症及那些通常对免疫疗法无应答者。利用本发明的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括本文所列举的那些癌症。
在某些实施方案中，本文论述的治疗抗体的组合可以以在医药上可接受的载体中的单一组合物形式同时施用，或以每一抗体在医药上可接受的载体中的各别的组合物形式同时施用。在另一实施方案中，治疗抗体的组合可依序施用。举例而言，抗CTLA-4抗体及抗GITR抗体可依序施用，例如首先施用抗CTLA-4抗体且第二施用抗GITR抗体，或首先施用抗GITR抗体且第二施用抗CTLA-4抗体。另外/或者，抗PD-1抗体及抗GITR抗体可依序施用，例如首先施用抗PD-1抗体且第二施用抗GITR抗体，或首先施用抗GITR抗体且第二施用抗PD-1抗体。另外/或者，抗PD-L1抗体及抗GITR抗体可依序施用，例如首先施用抗PD-L1抗体且第二施用抗GITR抗体，或首先施用抗GITR抗体且第二施用抗PD-L1抗体。另外/或者，抗LAG-3抗体及抗GITR抗体可依序施用，例如首先施用抗LAG-3抗体且第二施用抗GITR抗体，或首先施用抗GITR抗体且第二施用抗LAG-3抗体。
此外，若依序施用组合疗法的一个以上剂量，则可在施用的每一时间点逆转依序施用的次序或保持相同次序，依序施用可与同时施用组合，或其任一组合。举例而言，抗CTLA-4抗体与抗GITR抗体的组合的首次施用可为同时的，第二次施用可为依序的(其中首先抗CTLA-4抗体且第二抗GITR抗体)，且第三次施用可为依序的(其中首先抗GITR抗体且第二抗CTLA-4抗体)等。另外/或者，抗PD-1抗体与抗GITR抗体的组合的首次施用可为同时的，第二施用可为依序的(其中首先抗PD-1抗体且第二抗GITR抗体)，且第三施用可为依序的(其中首先抗GITR抗体且第二抗PD-1抗体)等。另外/或者，抗PD-L1抗体与抗GITR抗体的组合的首次施用可为同时的，第二施用可为依序的(其中首先抗PD-L1抗体且第二抗GITR抗体)，且第三施用可为依序的(其中首先抗GITR抗体且第二抗PD-L1抗体)等。另外/或者，抗LAG-3抗体与抗GITR抗体的组合的首次施用可为同时的，第二施用可为依序的(其中首先抗LAG-3抗体且第二抗GITR抗体)，且第三施用可为依序的(其中首先抗GITR抗体且第二抗LAG-3抗体)等。另一代表性投药方案可涉及首次依序施用，其中首先抗GITR且第二抗CTLA-4抗体(及/或抗PD-1抗体及/或抗PD-L1抗体及/或抗LAG-3抗体)，且随后的施用可为同时的。
在一个实施方案中，通过施用向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为CD137(4-1BB)激动剂，例如激动性CD137抗体。适宜的CD137抗体包括例如乌瑞鲁单抗(urelumab)或PF-05082566(WO12/32433)。
在一个实施方案中，通过施用向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为OX40激动剂，例如激动性OX40抗体。适宜OX40抗体包括例如MEDI-6383、MEDI-6469或MOXR0916(RG7888；WO06/029879)。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为CD40激动剂，例如激动性CD40抗体。在某些实施方案中，免疫-肿瘤药剂为CD40拮抗剂，例如拮抗性CD40抗体。适宜CD40抗体包括(例如)鲁卡木单抗(HCD122)、达西珠单抗(SGN-40)、CP-870,893或Chi Lob 7/4。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为CD27激动剂，例如激动性CD27抗体。适宜CD27抗体包括(例如)瓦利路单抗(varlilumab)(CDX-1127)。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为MGA271(针对B7H3)(WO11/109400)。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为KIR拮抗剂，例如利利单抗(lirilumab)。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为IDO拮抗剂。适宜的IDO拮抗剂包括(例如)INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚西莫(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO11/56652、WO12/142237)或F001287。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂是Toll样受体激动剂，例如TLR2/4激动剂(例如，卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin))；TLR7激动剂(例如，海特诺(Hiltonol)或咪喹莫特)；TLR7/8激动剂(例如，雷西莫特(Resiquimod))；或TLR9激动剂(例如，CpG7909)。
在一个实施方案中，通过向患有可受益于免疫系统的刺激的疾病(例如癌症或感染性疾病)的受试者施用抗GITR抗体及免疫-肿瘤药剂治疗该受试者，其中免疫-肿瘤药剂为TGF-β抑制剂，例如GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1。
在一个方面中，抗GITR抗体在施用第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)之前依序施用。在一个方面中，抗GITR抗体与第二药剂例如免疫-肿瘤药剂)同时施用。在再一方面中，抗GITR抗体在施用第二药剂后依序施用。两种药剂的施用可以间隔(例如)30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一个或多个周的时间开始，或第二药剂的施用可在施用第一药剂后(例如)30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、3小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、3天、5天、7天或一个或多个周开始。
在某些方面中，抗GITR抗体及第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)同时施用，例如在(例如)30分钟或60分钟的时段内向患者同时输注。抗GITR抗体可与第二药剂(例如免疫-肿瘤药剂)共配制。
任选地，作为单独免疫治疗剂的抗GITR或抗GITR抗体与一种或多种额外免疫治疗抗体(例如，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3阻断)的组合可进一步与免疫原试剂(例如癌细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽及糖分子)、细胞及经编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞)组合(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪氨酸酶的肽)、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步论述)。组合的GITR活化及一种或多种额外抗体(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断)亦可进一步与标准癌症治疗组合。举例而言，组合的GITR活化及一种或多种额外抗体(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断)可与化学治疗方案有效地组合。在这些情况下，可减少与本发明的组合一起施用的化学治疗试剂的剂量(Mokyr等人(1998)CancerResearch 58:5301-5304)。该组合的实例为具有或无额外抗体(例如抗CTLA-4抗体及/或抗PD-1抗体及/或抗PD-L1抗体及/或抗LAG-3抗体)的抗GITR激动性抗体的组合，其进一步与氨烯咪胺组合用于治疗黑色素瘤。另一实例是具有或无抗CTLA-4抗体及/或抗PD-1抗体及/或抗PD-L1抗体及/或LAG-3抗体的抗GITR抗体的组合，其进一步与白介素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。GITR活化及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断与化学疗法的组合使用的科学理论依据是，细胞死亡——这是大部分化学治疗化合物的细胞毒性作用的结果——应会在抗原呈递路径中产生增加的肿瘤抗原含量。其他可经由细胞死亡与具有或无CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断的组合GITR活化产生协同作用的组合疗法包括辐射、手术或激素剥夺。这些方案中都在宿主中创造出肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂亦可与组合的GITR活化及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断组合。血管生成的抑制导致肿瘤细胞死亡，这可能是补充到宿主抗原呈递路径中的肿瘤抗原的来源。
作为单独免疫治疗剂的抗GITR激动性抗体或GITR激动性及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3封闭抗体的组合亦可与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(例如，参见美国专利第5,922,845号及第5,837,243号)。双特异性抗体可用于靶向两种单独抗原。可通过使用组合的GITR活化及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断加强这些反应的T细胞臂。
在另一实例中，作为单独免疫治疗剂的抗GITR激动性抗体或抗GITR抗体与其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4抗体及/或抗PD-1抗体及/或抗PD-L1抗体及/或LAG-3试剂，例如抗体)的组合可结合抗新生物抗体(例如(利妥昔单抗)、(曲妥珠单抗)、(托西莫单抗(tositumomab))、(替伊莫单抗(ibritumomab))、(阿伦单抗)、(依帕珠单抗(eprtuzumab))、(贝伐珠单抗(bevacizumab))及(厄洛替尼(erlotinib))，等等)使用。举例而言且不希望受限于理论，用抗癌抗体或偶联至毒素的抗癌抗体的治疗可导致癌细胞死亡(例如，肿瘤细胞)，其可增强由免疫刺激剂(例如GITR、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3试剂，例如抗体)介导的免疫应答。在示例性实施方案中，过度增殖疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌剂(例如抗体)与抗GITR及视情况额外免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂，例如抗体)的组合，其同时或依序或其任一组合，其可增强由宿主的抗肿瘤免疫应答。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监督。许多这些机制可通过令由肿瘤表达的免疫阻抑性的蛋白质失活来克服。这些机制包括例如TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)及Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274:1363-1365)。针对这些实体中的每一者的抗体可进一步与抗GITR抗体，以及任选的其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂，例如抗体)组合，以消除免疫阻抑剂的效应并帮助由宿主的抗肿瘤免疫应答。
可用于活化宿主免疫应答的其他试剂(例如抗体)可进一步与具有或无额外免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体)的抗GITR抗体组合使用。这些抗体包括树突细胞表面上的分子，其活化DC功能及抗原呈递。抗CD40抗体(Ridge等人，上文文献)可结合抗GITR抗体及任选的其他免疫刺激剂(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂，例如抗体)使用。针对T细胞共刺激性分子的其他活化抗体(Weinberg等人，上文文献；Melero等人，上文文献；Hutloff等人，上文文献)亦可提供增加的T细胞活化程度。
如上文所论述，目前正使用骨髓移植以治疗多种造血性起源的肿瘤。单独或与CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断组合的抗GITR免疫疗法可用于增加移入肿瘤特异性T细胞中的供体的有效性。
若干实验治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化及扩增，及这些细胞继受性转移(adoptive transfer)至接受者中，以刺激对抗肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg及Riddell，上文文献)。这些方法亦可用于活化T细胞对感染物(例如CMV)的反应。可预期在采用或不采用额外免疫刺激疗法(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体)下，在抗GITR存在下的离体活化可增加继受性转移的T细胞的频率及活性。
本文提供改变与使用免疫刺激剂治疗过度增殖疾病(例如癌症)相关的不良事件的方法，包含向受试者施用抗GITR抗体加或不加抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3试剂(例如抗体)。举例而言，本文所述的方法提供通过向患者施用非吸收性类固醇来降低免疫刺激性治疗性抗体所诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。如本文所用的，“非吸收性类固醇”是这样的糖皮质激素，其展现高度首过效应，使得其在肝中代谢后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本文所述的一个实施方案中，非吸收性类固醇系布地奈德(budesonide)。布地奈德是一种局部作用的糖皮质类固醇，在经口施用后被大幅代谢，主要是被肝大幅代谢。ENTOCORT(Astra-Zeneca)是布地奈德的pH-及时间依赖性口服配制剂，是为了优化药物递送至回肠及整个结肠而开发的。ENTOCORT在美国经批准用于治疗涉及回肠及/或升结肠的轻度至中度克罗恩氏病(Crohn's disease)。用于治疗克罗恩氏病的ENTOCORT的常见经口剂量为6mg/天至9mg/天。ENTOCORT在肠中释放，之后吸收并保留于肠粘膜中。一旦其穿过肠粘膜靶组织，ENTOCORT即被肝中细胞色素P450系统高度代谢成几乎没有糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用度低(约10％)。与具有较低首过效应的其他糖皮质激素相比，布地奈德的低生物利用度产生改良的治疗比率。相较于全身作用性皮质类固醇，布地奈德产生较少的不良作用，包括较少的下丘脑-垂体阻抑性。然而，长期施用ENTOCORT可引起全身性糖皮质激素效应，例如肾上腺功能亢进及肾上腺阻抑。参见PDR，第58版，2004；608-610。
在再进一步的一些实施方案中，GITR活化[加或不加CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻断(即，免疫刺激性治疗抗体抗GITR及任选的抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体)]与非吸收性类固醇的联合可进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA试剂，例如；磺胺塞拉金(sulfasalazine)(Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉嗪(olsalazine)(Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(Salix Pharmaceuticals公司)；及美沙拉嗪(mesalamine)(Procter&Gamble Pharmaceuticals；Shire US；Axcan Scandipharm公司；Solvay)。
根据本文所述方法，出于降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率的目的，与抗GITR[加或不加抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或LAG-3抗体]及非吸收性类固醇组合施用的水杨酸盐可包括水杨酸盐及非吸收性类固醇的任何重叠或依序施用。因此，例如，用于降低由本文所述免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率的方法涵盖同时或依序施用水杨酸盐及非吸收性类固醇(例如，在非吸收性类固醇6小时后施用水杨酸盐)或其任一组合。此外，水杨酸盐及非吸收性类固醇可通过相同途径施用(例如，二者皆经口施用)或通过不同途径施用(例如，水杨酸盐经口施用且非吸收性类固醇经直肠施用)，其可不同于用于施用抗GITR及抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗体的途径。
本文所述的抗GITR抗体及组合抗体疗法亦可结合其他熟知疗法使用，这些熟知疗法针对其针对所治疗适应症(例如癌症)的特定有用性进行选择。本文所述抗GITR抗体的组合可与已知医药上可接受的药剂依序使用。
举例而言，本文所述抗GITR抗体及组合抗体疗法可与其他治疗(例如辐照、化学疗法(例如，使用喜树碱(camptothecin)(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、顺铂、多柔比星、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂、太平洋紫杉醇、卡铂-太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多柔比星、5-fu或喜树碱+apo2l/TRAIL(6X combo))、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib)或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如，BH3I-2’(bcl-xl抑制剂)、吲哚胺加双氧酶-1抑制剂(例如，INCB24360、吲哚西莫、NLG-919或F001287)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉(obatoclax))或MCL-1(类骨髓性白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(细胞雕亡蛋白的抑制剂)拮抗剂(例如，smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见Fulda等人，Nat Med 2002；8:808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组织蛋白去乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如，贝伐珠单抗)、靶向VEGF及VEGFR的抗血管生成剂(例如，癌思停(Avastin))、合成三萜系化合物(参见Hyer等人，Cancer Research 2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE-抑制性蛋白)调节剂(例如，PPARγ(过氧化体增殖子-活化受体γ)的天然及合成配体、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如，索拉菲尼(Sorafenib))、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、替西罗莫司(Temsirolimus)、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素(rapamycin)及替西罗莫司、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂及/或遗传毒性药物组合使用(例如同时或分开))。
本文所述抗GITR抗体及组合抗体疗法可进一步与一种或多种抗增殖细胞毒性剂组合使用。可用作抗增殖细胞毒性剂的化合物的类别包括(但不限于)以下：
烷基化剂(包括但不限于氮芥(nitrogen mustards)、次乙亚胺衍生物、磺酸烷基酯、亚硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥、甲川氯(Chlormethine)、环磷酰胺(CYTOXANTM)爱斯达(fosfamide)、美法仑(Melphalan)、氮芥苯丁酸(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、(Triethylenemelamine)、三乙烯硫代磷酰胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、链脲菌素(Streptozocin)、达卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物及腺苷去胺酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨(Fludarabine phosphate)、喷司他汀(Pentostatine)及吉西他滨。
除本领域已知的其他微管蛋白稳定剂外，适于与激动性抗GITR抗体组合的抗增殖剂包括但不限于紫杉烷、太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇系以TAXOLTM购得)、多西他赛(docetaxel)、盘皮海绵内酯(discodermolide)(DDM)、地特斯他汀(dictyostatin)(DCT)、培洛赛德A(Peloruside A)、埃博霉素、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、呋喃埃博霉素D(furanoepothilone D)、去氧埃博霉素Bl、[17]-脱氢去氧埃博霉素B、[18]脱氢去氧埃博霉素B、C12,13-环丙基-埃博霉素A、C6-C8桥接埃博霉素A、反式-9,10-脱氢埃博霉素D、顺式-9,10-脱氢埃博霉素D、16-去甲基埃博霉素B、埃博霉素B10、盘皮海绵内酯、帕土匹龙(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(盘皮海绵内酯)、TZT-1027(索博列多汀(soblidotin))、ILX-651(盐酸泰丝多汀(tasidotin hydrochloride))、软海绵素B(Halichondrin B)、甲磺酸埃雷布林(Eribulin mesylate)(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、念珠藻素(Cyrptophycin)、LY-355703、类美登素(Maytansinoid)免疫偶联物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊匹尼塞(ispinesib))、SB-743921、MK-0731、STA-5312、软珊瑚醇(eleutherobin)、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-侧氧基-B-均-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、环链霉菌素(cyclostreptin)、异劳力马来(isolaulimalide)、劳力马来(laulimalide)、4-表-7-去羟基-14,16-二去甲基-(+)-盘皮海绵内酯及隐塞龙1(cryptothilone 1)。
在期望结合本文所述抗GITR抗体或在用本文所述抗GITR抗体治疗之前使得异常增殖细胞休眠的情形下，亦可向患者施用激素及类固醇(包括合成类似物)、例如17a-乙炔基雌二醇、已烯雌酚(Diethylstilbestrol)、睾固酮、泼尼松(Prednisone)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、丙酸甲雄烷酮(Dromostanolone propionate)、睾内酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲基泼尼松龙(Methylprednisolone)、甲基-睾固酮、泼尼松龙(Prednisolone)、曲安西龙(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羟基助孕酮(Hydroxyprogesterone)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、乙酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、柳培林(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、ZOLADEXTM。在采用本文所述方法或组合物时，若期望，亦可施用在临床情境中用于调节肿瘤生长或转移的其他药剂，例如抗模拟物。
安全有效施用化学治疗剂的方法已为本领域技术人员所知。另外，其施用描述于标准文献中。举例而言，许多化学治疗剂的施用描述于Physicians'Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics公司，Montvale,N.J.07645-1742,USA)中；其公开内容以引用方式并入本文中。
化学治疗剂及/或辐射疗法可根据本领域熟知的治疗方案施用。本领域技术人员应明了，化学治疗剂及/或辐射疗法的施用可依赖于所治疗疾病及化学治疗剂及/或辐射疗法对该疾病的已知效应而变。同样，根据熟练临床医师的知识，治疗方案(例如，施用的剂量及时间)可鉴于所施用治疗剂对患者的观察效应并鉴于疾病对所施用治疗剂的观察反应而变化。
示例性实施方案
1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合人糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且展现以下性质：
(a)结合可溶性人GITR；
(b)结合膜结合的人GITR；
(c)结合膜结合的食蟹猴GITR；
(d)诱导或增强T细胞活化；
(e)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合；
(f)至多部分地抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(g)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位；
(h)结合O-连接及N-糖基化及未糖基化人GITR；
(i)在没有与Fc受体的结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强该激动剂活性；及
(i)在任一方向或两个方向上与抗体28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10中的一种或多种竞争结合人GITR。
2.如实施方案1的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体刺激抗肿瘤免疫应答。
3.如实施方案1或2的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体刺激抗原特异性T细胞应答。
4.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体增加表达GITR的T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生。
5.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体增加T细胞增殖。
6.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体不结合Fc受体。
7.如实施方案1至5中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合一种或多种活化性FcγR。
8.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体以如通过Biacore测量的10nM或更小的KD结合可溶性人GITR。
9.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体以如通过Scatchard测量的1nM或更小的KD结合膜结合的人GITR。
10.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体以如通过FACS测量的1nM或更小的EC50结合膜结合的人GITR。
11.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体以如通过FACS测量的10nM或更小的EC50结合膜结合的食蟹猴GITR。
12.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体诱导或增强T细胞活化而无需多价交联。
13.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体以如通过FACS测量的1μg/mL或更小的EC50抑制GITR配体与GITR的结合。
14.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)。
15.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含选自下组的可变重链与可变轻链对中的三个可变重链CDR及三个可变轻链CDR：
(a)SEQ ID NO:13及14；
(b)SEQ ID NO:26及27；
(c)SEQ ID NO:39及40；
(d)SEQ ID NO:52及53；
(e)SEQ ID NO:52及54；
(f)SEQ ID NO:71及72；
(g)SEQ ID NO:84及85；
(h)SEQ ID NO:97及98；
(i)SEQ ID NO:97及99；
(j)SEQ ID NO:115及116；
(k)SEQ ID NO:128及129；
(l)SEQ ID NO:128及130；及
(m)SEQ ID NO:335及336。
16.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)，且包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:20、21及22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:23、24及25的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:33、34及35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:36、37及38的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:46、47及48的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:49、50及51的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:62、63及64的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:65、66及67的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:62、63及64的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:68、69及70的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:78、79及80的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:81、82及83的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:91、92及93的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:94、95及96的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:106、107及108的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:109、110及111的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:106、107及108的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:112、113及114的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:122、123及124的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:125、126及127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:138、139及140的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:141、142及143的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:138、139及140的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:144、145及146的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:342、343及344的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:345、346及347的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
17.如实施方案16的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含分别包含SEQ IDNO:20、21及22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:23、24及25的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
18.如实施方案16的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含分别包含SEQ IDNO:33、34及35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:36、37及38的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
19.如实施方案16的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含分别包含SEQ IDNO:46、47及48的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:49、50及51的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含重链及轻链可变区，其中该重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
21.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含重链及轻链可变区，其中该轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
22.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含与选自下组的氨基酸序列至少85％相同的重链及轻链可变区序列：
(a)分别为SEQ ID NO:13及14；
(b)分别为SEQ ID NO:26及27；
(c)分别为SEQ ID NO:39及40；
(d)分别为SEQ ID NO:52及53；
(e)分别为SEQ ID NO:52及54；
(f)分别为SEQ ID NO:71及72；
(g)分别为SEQ ID NO:84及85；
(h)分别为SEQ ID NO:97及98；
(i)分别为SEQ ID NO:97及99；
(j)分别为SEQ ID NO:115及116；
(k)分别为SEQ ID NO:128及129；
(l)分别为SEQ ID NO:128及130；及
(m)分别为SEQ ID NO:335及336。
23.如实施方案22的抗体或其抗原结合部分，其中这些重链及轻链可变区包含与选自(a)至(m)的重链及轻链可变区至少90％相同的氨基酸序列。
24.如实施方案23的抗体或其抗原结合部分，其中该重链及轻链可变区包含与选自(a)至(m)的重链及轻链可变区至少95％相同的氨基酸序列。
25.如实施方案24的抗体或其抗原结合部分，其中该重链及轻链可变区包含选自(a)至(m)的重链及轻链可变区。
26.如实施方案25的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含描述于SEQ IDNO:13中的氨基酸序列的重链可变区、及包含描述于SEQ ID NO:14中的氨基酸序列的轻链可变区。
27.如实施方案25的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含描述于SEQ IDNO:26中的氨基酸序列的重链可变区、及包含描述于SEQ ID NO:27中的氨基酸序列的轻链可变区。
28.如实施方案25的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含描述于SEQ IDNO:39中的氨基酸序列的重链可变区、及/或包含描述于SEQ ID NO:40中的氨基酸序列的轻链可变区。
29.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链及轻链序列：
(a)分别为SEQ ID NO:15及16；
(b)分别为SEQ ID NO:17及19；
(c)分别为SEQ ID NO:18及19；
(d)分别为SEQ ID NO:28及29；
(e)分别为SEQ ID NO:30及32；
(f)分别为SEQ ID NO:31及32；
(g)分别为SEQ ID NO:41及42；
(h)分别为SEQ ID NO:43及45；
(i)分别为SEQ ID NO:44及45；
(j)分别为SEQ ID NO:55及56；
(k)分别为SEQ ID NO:55及57；
(l)分别为SEQ ID NO:58及60；
(m)分别为SEQ ID NO:59及60；
(n)分别为SEQ ID NO:58及61；
(o)分别为SEQ ID NO:59及61；
(p)分别为SEQ ID NO:73及74；
(q)分别为SEQ ID NO:75及77；
(r)分别为SEQ ID NO:76及77；
(s)分别为SEQ ID NO:86及87；
(t)分别为SEQ ID NO:88及90；
(u)分别为SEQ ID NO:89及90；
(v)分别为SEQ ID NO:102及104；
(w)分别为SEQ ID NO:103及104；
(x)分别为SEQ ID NO:100及101；
(y)分别为SEQ ID NO:100及371；
(z)分别为SEQ ID NO:102及105；
(za)分别为SEQ ID NO:103及105；
(zb)分别为SEQ ID NO:117及118；
(zc)分别为SEQ ID NO:119及121；
(zd)分别为SEQ ID NO:120及121；
(ze)分别为SEQ ID NO:131及132；
(zf)分别为SEQ ID NO:134及136；
(zg)分别为SEQ ID NO:135及136；
(zh)分别为SEQ ID NO:131及133；
(zi)分别为SEQ ID NO:134及137；
(zj)分别为SEQ ID NO:135及137；
(zk)分别为SEQ ID NO:337及338；
(zl)分别为SEQ ID NO:339及341；及
(zm)分别为SEQ ID NO:340及341。
30.如实施方案29的抗体或其抗原结合部分，其中这些重链及轻链包含选自(a)至(zm)的重链及轻链。
31.如实施方案30的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含描述于SEQ IDNO:17中的氨基酸序列的重链、及包含描述于SEQ ID NO:19中的氨基酸序列的轻链。
32.如实施方案30的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含描述于SEQ IDNO:18中的氨基酸序列的重链、及包含描述于SEQ ID NO:19中的氨基酸序列的轻链。
33.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与实施方案25的抗体结合GITR上的相同表位，及(b)将实施方案25的抗体与活化T细胞上的GITR的结合抑制至少90％，如通过FACS测量的。
34.如实施方案15至33中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ IDNO:218)。
35.如实施方案15至34中任一实施方案的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人及食蟹猴GITR二者。
36.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
37.如实施方案36的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体为IgG1抗体。
38.如实施方案36的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含无效应物IgG1 Fc。
39.如实施方案38的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分包括包含以下突变的无效应物IgG1 Fc：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
40.如实施方案36的抗体，其中该抗体或其抗原结合部分包含具有增强的与活化性FcγR的结合的Fc。
41.如前述实施方案中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中这些CDR区中的甲硫氨酸残基被不会经受氧化的氨基酸残基取代。
42.如实施方案15至41中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分是人抗体或人源化抗体。
43.一种双特异性分子，其包含连接至具有第二结合特异性的分子的如前述实施方案中任一项的抗体。
44.一种核酸，其编码如实施方案1至42中任一项的抗体或其抗原结合部分的重链及/或轻链可变区。
45.一种表达载体，其包含实施方案44的核酸分子。
46.一种经实施方案45的表达载体转化的细胞。
47.一种免疫偶联物，其包含连接至药剂的实施方案1至42中任一项的抗体。
48.一种组合物，其包含实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，以及载体。
49.一种试剂盒，其包含如实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子、或免疫偶联物，以及使用说明书。
50.一种制备抗GITR抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：使该抗体或其抗原结合部分在实施方案46的细胞中表达，并自该细胞分离该抗体或其抗原结合部分。
51.一种刺激抗原特异性T细胞应答的方法，其包括使该T细胞与实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物接触，使得抗原特异性T细胞应答被刺激。
52.一种活化或共刺激效应物T细胞的方法，其包括使效应物T细胞与实施方案1至43及47中任一项的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物与CD3接触，其中该效应物T细胞被活化或共刺激。
53.一种增加T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包括使该T细胞与有效量的实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物接触。
54.一种增加T细胞增殖的方法，其包括使该细胞与有效量的如实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物接触。
55.一种增加受试者的T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包括施用有效量的实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物，以增加自这些T细胞的IL-2及/或IFN-γ产生。
56.一种减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中T调控性细胞的数目的方法，其包括施用有效量的实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物，其中该抗体或其抗原结合部分具有效应物功能或增强的效应物功能，以减少该肿瘤中T调控性细胞的数目。
57.一种刺激受试者的免疫应答的方法，其包功能向该受试者施用实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物，使得该受试者的免疫应答被刺激。
58.如实施方案57的方法，其中该受试者患有肿瘤，且针对该肿瘤的免疫应答被刺激。
59.一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向该受试者施用如实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物，使得该受试者中该肿瘤的生长被抑制。
60.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如实施方案1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物，以治疗该癌症。
61.如实施方案60的方法，其中该癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。
62.如实施方案60或61的方法，其中该癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
63.如实施方案56至62中任一项的方法，其进一步包括施用一种或多种其他治疗剂。
64.如实施方案63的方法，其中该其他疗法是抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体或PD-L1抗体。
65.一种检测样品中糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)的存在的方法，其包含使该样品与实施方案1至42中任一项的抗体或其抗原结合部分在容许在该抗体或其抗原结合部分与GITR之间形成复合物的条件下接触，并检测复合物的形成。
66.一种分离的抗GITR抗体，其包括修饰的重链恒定区，所述修饰的重链恒定区包含IgG2铰链及不属IgG2同型的CH1、CH2及CH3中的至少一者，其中该抗GITR抗体相对于具有非IgG2铰链的相同抗GITR抗体具有增强的激动剂活性。
67.如实施方案66的分离的抗GITR抗体，其中该修饰的重链恒定区包括包含选自SEQ ID NO:223至226及283至290的氨基酸序列的重链恒定区、或与之有至多5个氨基酸不同、或与选自SEQ ID NO:223至226及283至290的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链恒定区。
68.如实施方案67的分离的抗GITR抗体，其中该重链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，或与之有至多10个氨基酸不同或与SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链。
通过以下实施例进一步阐释本发明，但其不应视为进一步限制本发明。贯穿本申请案引用的所有图及所有参考文献、基因库序列、专利及已公开专利申请案的内容皆系以引用方式明确并入本文中。具体而言，PCT公开案WO 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546、WO 09/054863及PCT/US2013/072918及美国专利公开案第2011/0150892号的公开内容以引用方式明确并入本文中。
实施例
实施例1：不同抗GITR抗体的生成
在转基因小鼠(“HuMAb”系Medarex公司的商标，Princeton,NewJersey)的Hco7、Hco27、Hco20、Hco12、Hco17及Hc2品系中、及KM小鼠(KM品系含有如PCT公开案WO 02/43478中所述的SC20转染色体)中生成人抗GITR单克隆抗体。如美国专利第5,770,429号及第5,545,806号中所述生成HC2/KCo27 HuMAb小鼠及KM小鼠，这些文献的公开内容以引用方式并入本文中。
用不同免疫策略(不同抗原、不同剂量、持续时间、施用途径(足垫(fp)、腹膜内(ip)及皮下(sc))，及佐剂(CFA/IFA、Ribi及抗体)，等等)对总共94只小鼠(其包括转基因小鼠的7种基因型(KM、Hco7、Hco27、Hco20、Hco12、Hco17及Hc2))进行免疫。实施来自54只小鼠的36次融合并筛选。自该36次融合鉴定出157种抗体，经过进一步表征，分离出特别关注的抗体，包括命名为28F3、19D3、18E10、3C3、2G6、8A6、9G7、14E3、19H8及6G10的抗体。
cDNA测序鉴定了抗体28F3、19D3、18D10、2G6、8A6、14E3及6G10中的每一者的一条重链及一条轻链，及抗体3C3、9G7及19H8中的每一者的一条重链及两条轻链(轻链1或“L1”及轻链2或“L2”)。通过蛋白质分析，鉴定了抗体3C3及9G7的单一轻链，且N-末端测序及分子量测定指示其为3C3的轻链L1及9G7的轻链L2。关于抗体19H8，93％的由杂交瘤表达的抗体含有轻链L1，且3％含有轻链L2。抗体3C3-1及3C3-2分别对应于具有轻链L1及L2的抗体3C3。抗体9G7-1及9G7-2分别对应于具有轻链L1及L2的抗体9G73。抗体19H8-1及19H8-2分别对应于具有轻链L1及L2的抗体19H8。3种抗体的轻链中的每一者的氨基酸及核苷酸序列提供于表11中。
抗体28F3、19D3、18E10、3C3(3C3-1及3C3-2)、2G6、8A6、9G7(9G7-1及9G7-2)、14E3、19H8(19H8-1及19H8-2)及6G10的可变区氨基酸序列及同型描述于图2至31中。每一抗体的轻链及重链的氨基酸及核苷酸序列提供于表11中。28F3的重链及轻链由氨基酸序列SEQ IDNO:15及16组成。19D3的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:28及29组成。18E10的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:41及42组成。3C3的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:55及56组成。2G6的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:73及74组成。8A6的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:86及87组成。9G7的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:100及101组成。14E3的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:117及118组成。19H8-1的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:131及132组成。19H8-2的重链及轻链由氨基酸序列SEQ ID NO:131及133组成。6G10的重链及轻链由氨基酸序列337及338组成。编码这些蛋白质的核苷酸序列提供于表11中。
实施例2：抗GITR抗体与活化的人T细胞及食蟹猴T细胞的结合
测试实施例1中生成的人单克隆抗GITR抗体与活化的人T细胞及食蟹猴T细胞(这些细胞的表面上表达GITR)的结合。
利用包被在板上的抗CD3抗体(克隆：用于人T细胞活化的为UCHT1；克隆：用于食蟹猴T细胞活化的为SP34；二者皆来自BD Biosciences)及可溶性抗CD28抗体(克隆：用于人及食蟹猴二者的CD28.2，BD Biosciences)将自人或食蟹猴分离的外周血单个核细胞(PBMC)活化4天(人)/或5天(食蟹猴)。在基于荧光活化的细胞分选(FACS)的分析中使用藻红素(PE)偶联的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)测试细胞的GITR mAb结合。利用BDFACS Canto流式细胞仪分析样品。
抗GITR抗体3C3、19D3、18E10及28F3结合活化的人及食蟹猴T细胞二者。如图32中所示，抗体3C3、19D3、18E10及28F3强烈结合活化人T细胞，如0.04916nM、0.3633nM、0.1461nM及0.1916nM的EC50值所分别反映的。类似地，抗体18E10及28F3结合活化食蟹猴T细胞，其中18E10及28F3的EC50值分别为0.9134nM及1.044nM(图33)。3C3不显著结合食蟹猴T细胞。
实施例3：抗GITR抗体与可溶性GITR的结合
通过Biacore测定抗GITR抗体与可溶性GITR的结合。将抗GITR抗体捕获于人κ包被的芯片(约5KRU；Southernbiotech目录号2060-01)上，且使重组人GITR(rHGITR/Fc：R&Dsystems，目录号689-GR)以500nM、250nM、125nM、62nM及31nM的浓度流过芯片。mAb/体积的捕获浓度为2-40μg/mL(于10μL/min下5μL)。于15μL/min下抗原缔合时间为5分钟，抗原解离时间为6分钟，且利用50mM HCl/50mM NaOH(于100μL/min下各自12μL)实施再生。利用28F3及若干其他抗GITR抗体获得的结果示于表5中。
表5：抗GITR抗体的Kon(ka)、Koff(kd)及KD
结果指示，抗GITR抗体以介于1.2×10-8M至3.5×10-8M范围内的KD结合可溶性GITR。提供3C3的2种亚克隆的数据，其中KD介于1.33×10-8M至1.44×10-8M的范围内。
在另一Biacore实验中，测定了具有28F3的可变区、且具有三种不同恒定区的抗体的结合特征。第一种28F3抗体具有野生型IgG1恒定区(“g1f”，亦称作“g1”或“IgG1”或“IgG1f”；重链具有SEQ ID NO:17，轻链具有SEQ ID NO:19)。后缀“f”指示异型。第二种抗体具有在Fc区中具有三个突变的无效应物IgG1恒定区(“g1.1f”，亦称作“g1.1”、“IgG1.1”及“IgG1.1f”，具有L234A、L235E、G237A；重链具有SEQ ID NO:18，轻链具有SEQ ID NO:19)；第三种28F3抗体具有含N297A突变的IgG1恒定区。
如上文所述执行Biacore实验，只是芯片用抗CH1(Invitrogen索引号054500)包被。表6中所示的结果指示，所有三种抗体具有类似结合特征，其中KD介于3.93×10-8M至4.39×10-8M范围内。
表6：具有不同Fc的28F3的动力学特征
样品 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) 功能浓度
28F3-g1f 8.85E+4 3.88E-3 4.39E-8 100％
28F3-IgG1.1 9.09E+4 3.58E-3 3.93E-8 100％
28F3-N297A 7.88E+4 3.36E-3 4.26E-8 100％
实施例4：抗GITR抗体与活化人T细胞及3A9-huGITR细胞的结合亲和力
通过Scatchard分析测定抗GITR抗体与活化的人T细胞及异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系(3A9-hGITR)上的GITR的结合。此测定利用28F3.IgG1.1(对于重链为SEQ ID NO:18，对于轻链为SEQ ID NO:19)以4.59mg/mL执行。
如下执行关于活化人T细胞的Scatchard分析。将自人供体获得的T细胞用培养基(RPMI，含10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、2-巯基乙醇)洗涤一次并以106个细胞/mL再悬浮于补充有1μg/mL抗CD28(CD28.2，BD编号555725)及100U/mL IL-2(Peprotech编号200-02)的相同培养基中。将5×106个细胞各自铺于6孔板的三个孔中，该板已用20ug抗CD3包被(5mL，4μg/mL，于4℃下过夜；UCHT-1，BD编号555329)。将细胞于37℃下温育3天，将且这些细胞的一半用于Scatchard分析(“第3天”分析)。将另一半细胞的用过的培养基更换为5mL新鲜培养基并将细胞再温育一天，且随后与这些细胞一起用于Scatchard分析(“第4天”分析)。
对于Scatchard分析，将28F3.IgG1.1用125I-Na(Perkin Elmer编号NEZ033H001MC(1mCi)，使用固相碘化试剂(1,3,4,6-四氯-3a-6a-二苯基甘脲；Pierce编号28601)放射性碘化。使用脱盐柱(Pierce编号43243)去除过量的碘化物。收集经标记抗体的级分，并利用Wizard 1470γ计数器(Perkin-Elmer)分析其放射性。利用来自Invitrogen的QubitTM荧光计计算每一级分中的125I-28F3.IgG1.1浓度。通过对峰蛋白及放射性级分的薄层层析(Pinestar Technology编号151-005)证实放射性纯度。
通过将活化人T细胞与一定效价的125I-28F3.IgG1.1一起温育来展示放射性碘化28F3.IgG1.1与活化人T细胞的结合。通过在100倍摩尔浓度过量的效价的未标记抗体存在下进行结合来确定非特异性结合，且自总CPM减去该结合以计算特异性结合。使用125I-28F3.IgG1.1浓度对CPM的线性标准曲线来外推最大nM结合的125I-28F3.IgG1.1，并藉此计算每细胞的受体数目。每个经刺激人CD4+T细胞的人GITR分子的数目在第3天为约8,400个，且在第4天为约13,200个。Scatchard分析的结果指示，28F3.IgG1.1以0.7nM的KD特异性结合第3天刺激的人CD4+T细胞，且以0.87nM的KD结合第4天刺激的人CD4+T细胞。
通过将3A9-huGITR细胞与一定效价的125I-28F3.IgG1.1一起温育来展示放射性碘化28F3.IgG1.1与3A9-huGITR细胞的结合。通过在100倍摩尔浓度过量效价的未标记的抗体存在下进行结合来确定非特异性结合，并自总CPM减去该结合以计算特异性结合。使用125I-28F3.IgG1.1浓度对CPM的线性标准曲线外推最大nM结合的125I-28F3.IgG1.1，并藉此计算每个细胞的受体数目。每个3A9-huGITR细胞的人GITR分子的数目为约180,000。Scatchard分析的结果指示，28F3.IgG1.1以0.5nM的KD特异性结合3A9-huGITR细胞。
在另一实验中，测定28F3.IgG1及28F3.IgG1.1与来自人及食蟹猴供体的活化CD4+及CD8+T细胞的结合。自人及食蟹猴供体分离人及食蟹猴CD4+及CD8+T细胞，并用抗CD3及抗CD28抗体处理以活化。结果指示，28F3.IgG1及28.IgG1.1分别以0.55nM及0.67nM的EC50类似地结合活化人CD4+细胞，且分别以0.56nM及0.65nM的EC50类似地结合活化人CD8+细胞。28F3.IgG1及28.IgG1.1分别以1nM及0.86nM的EC50结合活化食蟹猴CD4+细胞，且分别以1.26nM及0.74nM的EC50类似地结合活化食蟹猴CD8+细胞。
实施例5：人单克隆抗GITR抗体抑制GITR-L与GITR的结合
为确定HuMab抗GITR抗体是否抑制GITR配体与GITR的结合，将异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系(GITR-3A9细胞)与GITR mAb以介于10-4μg/mL至100μg/mL范围内的浓度预温育，之后以10ng/mL的浓度温育GITR配体(R&D Systems编号6987-GL)。在基于FACS的测定中使用PE偶联的抗血细胞凝集素(HA)标签抗体测定细胞上GITR配体的结合，且利用BD FACS Canto流式细胞仪分析样品。如图34A及34B中所示，在这些条件下，抗体19D3、28F3及GITR.3(3C3)皆阻断了GITR-L与GITR-3A9细胞的结合，其中EC50值分别为0.7546、0.2783及0.06934。利用抗体19H8获得了类似结果。
在不同条件下执行了另一组实验以进一步评估抗GITR抗体阻断GITR-L与GITR结合的程度。在这些实验中，将浓度为1.06×10-9mg/ml至100mg/ml的可溶性重组hGITR-L三聚物添加至活化人T细胞中并以0.016ug/ml的EC50值以剂量依赖性方式结合CD4+及CD8+T细胞(图34C)。如下执行实验：将浓度为1.06e-9μg/mL至100μg/mL的重组hGITR-L三聚物(R&DSystems目录号6987-GL)添加至PHA-活化的T细胞。30分钟初步温育后，使用PE偶联的抗HA标签抗体(Miltenyi目录号120-002-687)检测细胞结合的GITR-L。在FACS Canto流式细胞仪(BD,San Jose)上获取样品并利用FlowJo软件(Tree Star公司，Ashland,OR)进行分析。
浓度为1.06×10-9ug/ml至100ug/ml的rhGITR-L预先结合到活化T细胞上后，以0.0024ug/ml的IC50阻断了后续的0.5ug/ml 28F3-hIgG1(约90％的饱和度)的结合。由于在100ug/ml下MFI未达到基线(IgG对照)，故抑制是部分性的(图34D)。如下执行实验：首先将PHA活化的T细胞用24点3倍滴定(自100μg/mL开始)的重组GITR-L三聚物(R&D Systems6987-GL)处理30分钟。随后向细胞混合物中以0.5μg/mL的固定浓度添加28F3-hIgG1，使其再经受30分钟温育。使用针对人IgG Fc的PE偶联的第二抗体检测细胞结合的28F3-hIgG1(Jackson ImmunoResearch目录号109-116-098)。使用无关hIgG1Ab作为28F3-hIgG1的同型对照，同时包括了一个未预温育GITR-L的样品，用以显示在不存在阻断时28F3-hIgG1的结合。在FACS Canto流式细胞仪(BD,San Jose)上获取样品并利用FlowJo软件(Tree Star公司，Ashland,OR)进行分析。
在将活化T细胞与浓度介于1.06×10-9ug/ml至100ug/ml范围内的28F3-hIgG1一起预温育时，0.6ug/ml(约90％饱和度)的GITR-L的结合未受影响(图34E)。然而，在添加较低的20ng/ml浓度(接近其EC50)的GITR-L时，其结合由预结合的28F3-hIgG1部分阻断，IC50为0.076mg/ml(图34F)。如下执行实验：将PHA-活化T细胞与浓度介于0.00056μg/mL至100μg/mL范围内的28F3-hIgG1一起预温育，之后添加0.6ug/ml或20ng/mL GITR-L。利用PE偶联抗HA标签抗体检测细胞结合的GITR-L。包括无关hIgG1作为28F3-hIgG1的同型对照，且使用无第一抗体的样品来显示在无阻断情况下GITR-L的结合。在FACS Canto流式细胞仪(BD,SanJose)上获取样品并利用FlowJo软件(Tree Star公司，Ashland,OR)进行分析。
这些数据显示28F3-hIgG1是部分性的配体阻断剂，其可容许一定的GITR被GITR-L的体内接合。
实施例6：所有抗GITR抗体皆分拣至一个组中
利用以下抗人GITR抗体执行抗体分拣实验：28F3、18E10、19D3、14E3、8A6、9G7、3C3及6G10。
将抗GITR抗体固定至传感器芯片CM5芯片(Series S,GE Healthcare目录号BR-1005-30)表面、流动池2、流动池3及流动池4(5000RU)上，且使用流动池1作为阴性对照。将抗体稀释至120μg/mL(2×)的起始浓度。通过用缓冲液稀释1:3浓度的抗体制备8个不同浓度(120μg/ml-0.0μg/ml，2×)的一系列稀释物，以获得滴定曲线。将每一抗体浓度系列分成两半。在第一半浓度系列中，添加40nM(2×)GITR抗原(rHGITR/Fc目录号689-GR)以在每一孔中制作最终浓度系列(60μg/ml-0.0μg/ml)及20nM的最终抗原浓度。在第二半浓度系列中，添加缓冲液代替抗原，以将抗体稀释至相同浓度，将此一半作为空白处理。将复合物温育2小时。将40μL复合物以30μL/min流速注射至抗体包被的表面上。使用Biacore T200仪器且运行缓冲液为HBE-EP，GE Healthcare目录号BR-1001-88，经过滤脱气，0.01M HEPESpH7.4，0.15 NaCl，3Mm EDTA，0.005％表面活性剂P20。将表面用25mM NaOH(订购代码：BR-1003-58,GE Healthcare)以100μL/min再生5秒。使用Microsoft Excel分析数据，其中将抗体的浓度系列对相应的响应单位作图，以获得滴定曲线。
结果指示，所有测试抗体皆分拣至一个组中，从而指示它们都结合人GITR的细胞外区域的某个类似区域。
实施例7：抗GITR抗体结合构象表位
此实施例显示，抗GITR抗体28F3及3C3结合非变性人GITR，但不结合变性人GITR，且结合并不受N-或O-连接糖基化影响。
如下测定抗GITR抗体与具有或无N-连接糖基化的天然或变性GITR的结合。于37℃下在PBS中将天然(即，非变性)及变性人GITR的样品与或不与酶N-聚糖酶PNGase F温育过夜以去除N-糖基化。GITR的变性通过如下方式完成：于37℃在50mM二硫苏糖醇及4M盐酸胍中还原45分钟，且随后于室温下在100mM碘乙酰胺中烷基化20分钟。对有或无N-连接糖基化的天然人GITR的样品进行SDS凝胶电泳，且对有或无N-连接糖基化的变性GITR的样品进行变性SDS凝胶电泳。将蛋白质转移至硝基纤维素膜上用于Western印迹分析。将膜与28F3抗体一起温育。通过与偶联辣根过氧化酶(HRP标记)的、对抗人IgG重链及轻链具有特异性的第二抗体一起温育来检测结合(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，随后检测捕获于膜上的发光。图35中所示的结果指示，抗GITR Ab 28F3仅结合天然GITR，且不结合变性形式，且糖基化的存在或不存在不影响结合。利用抗GITR抗体3C3获得了类似结果。
因此，抗GITR抗体28F3及3C3结合构象性的、且与N-连接及O-连接糖基化无关的表位。
实施例8：28F3及3C3与天然人GITR肽的结合模式
通过SDS-PAGE及Western印迹分析测试28F3及3C3抗体与自天然人GITR生成的肽的结合，来研究这些抗体与人GITR的结合模式。如下执行实验。首先对天然人GITR进行蛋白水解：在不存在变性试剂的条件下，将其在37℃下PBS中与内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Lys-C、胰蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C或内切蛋白酶Asp-N以2％w/w的比率一起温育5小时。随后对整个反应混合物，来自每个消化的2μg，进行非变性SDS-PAGE电泳，并转移至硝基纤维素上用于Western印迹分析。随后将Western印迹与28F3或3C3抗体一起温育，并通过偶联有辣根过氧化酶(HRP标记)的对抗人IgG重链及轻链具有特异性的第二抗体一起温育来检测结合(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)，随后检测捕获于膜上的发光。图36中所示的结果指示，28F3及3C3的结合模式不同，从而表明这些抗体并不是结合人GITR的完全相同的区域。
实施例9：抗GITR抗体28F3结合人GITR的细胞外结构域的N-末端
通过在溶液中测试28F3抗体与人GITR的各种非变性片段的结合来确定该抗体所结合的人GITR上的区域的位置。如下执行实验：将使人GITR在不存在变性试剂的条件下于37℃下在PBS中与内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Lys-C、胰蛋白酶、内切蛋白酶Glu-C或内切蛋白酶Asp-N以2％w/w比率一起温育5小时，来生成人GITR肽片段。随后于室温下将该肽混合物与抗GITR Ab珠子在PBS中一起温育2小时。对一些样品进行原位二次裂解，方法是与不同的酶在PBS中一起温育一小时。通过用PBS洗涤抗GITR Ab珠子两次去除未结合肽。将结合抗GITR Ab 28F3上的肽用2％甲酸稀释，随后通过LC-MS进行序列鉴别。结果在图37中显示为热图，其表明28F3结合以下N-末端氨基酸段内的构象表位：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO:215)，其对应于成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的氨基酸残基1至39，或结合更短的片段QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR(SEQ ID NO:370)内的构象表位。
实施例10：人GITR上的O-连接糖基化不干扰28F3的结合
人GITR的细胞外结构域上无已知或有记载的O-连接糖基化。然而，SEQ ID NO:215的残基T18及T20含有O-糖基化共有序列。这些残基在表位序列中加下划线：
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE(SEQ ID NO:215)。因此，确定O-连接糖基化是否影响28F3与人GITR的结合。
如下执行28F3与由SEQ ID NO:215组成的糖基化或未糖基化肽的结合：通过对连接与小鼠Fc的完整天然人GITR细胞外结构域进行蛋白分解来生成人GITR的部分糖基化及未糖基化N-末端肽。亦通过有机合成生成由SEQ ID NO:215的氨基酸残基1至39组成的未糖基化GITR肽。28F3与肽的结合的程序描述于前述部分中(使用28F3包被的珠子)。如图38B中所示，发现两种肽结合28F3包被的珠子，且这些肽通过LC-MS鉴定为无O-连接糖基化的N-末端肽(图38A)，且另一者是在SEQ ID NO:215的T18及/或T20上具有O-连接糖基化的相同N-末端肽(图38D)。
由此可见，28F3结合人GITR的N-末端区，这与其在氨基酸T18及/或T20上是否具有O-连接的糖无关。
实施例11：抗GITR抗体28F3与20聚体的结合
作为前述实施例中所述实验的一部分，首先将一种具有SEQ ID NO:215、且不具有任何O-连接糖基化的合成肽结合28F3包被的珠子上，且随后通过利用内切蛋白酶Asp-N原位消化来进一步裂解。残余的肽由氨基酸序列QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:216)组成，且含有氨基酸残基T18及T20而无O-连接糖基化，该肽结合28F3(图38E)。由此可见，28F3结合由SEQ ID NO:216组成的20聚体。
实施例12：通过HDX-MS的表位定位
氢/氘交换质谱(HDX-MS)方法通过监测主链酰胺氢原子的氘交换的速率及程度来探测溶液中的蛋白质构象及构象动力学。HDX的程度取决于主链酰胺氢原子及蛋白质氢键的溶剂可及性。通过MS可以精确地测量HDX时蛋白质的质量增加。在此技术与酶消化配对时，可解析肽水平上的结构特征，从而使为区分表面暴露的肽与内部折叠的肽创造条件。通常，实施氘标记及随后的猝灭实验，之后在线胃蛋白酶消化、肽分离及MS分析。
在通过HDX-MS定位28F3.IgG1 mAb(具有分别由SEQ ID No:17及19组成的重链及轻链)在GITR中的表位之前，实施非氘化实验，为重组人GITR/Fc(R&D systems，10μM，其含有氨基酸取代T20A)及重组人GITR/Fc与28F3.IgG1 mAb的蛋白复合物(1:2摩尔比，10μM和20μM)生成一组共同的胃蛋白酶肽，对于GITR N-末端区达到86％的序列覆盖率(图39A)。在此实验中，在标记步骤过程中使用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，之后添加猝灭缓冲液(200mM磷酸盐缓冲液，具有4M GdnCl及0.5M TCEP，pH 2.5，1:1,v/v)。对于表位定位实验，于室温下将5μL的每一样品(GITR/Fc或具有28F3.IgG1 mAb的GITR/Fc(1:2摩尔比))稀释至55μL D2O缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，D2O，pD 7.0)中以开始标记反应。将反应进行不同的时间：20sec、1min、10min、60min及240min。到每一标记反应时段结束时，通过添加猝灭缓冲液(1:1v/v)猝灭反应，并将50μL猝灭样品注射至Waters HDX-MS系统中用于分析。监测所观察的共同胃蛋白酶肽在28F3.IgG1 mAb不存在/存在下的氘摄取量。
测量GITR中的28F3.IgG1 mAb的HDX-MS获得的实验数据如图39B及39C中所示，该数据指示，28F3.IgG1 mAb具有一个不连续表位，该表位由GITR N-末端区中的两个肽区组成(或在其内)。
肽区1：PTGGPGCGPGRLLLGTGA(SEQ ID NO:217)
肽区2：CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)
基于相对氘摄取量的变化，可将两个肽区排序为1>2，其中区1具有最显著的氘摄取变化，且区2是统计学上显著的。
实施例13：抗GITR抗体诱导自T细胞的IL-2及IFN-γ分泌
通过测量由与抗体一起温育的T细胞分泌的IL-2及IFN-γ，测试抗GITR抗体增强体外T细胞活性的能力。
在递增量的19D3、18E10及28F3抗体存在下，在抗CD3单克隆抗体包被的板上培养异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系(3A9-hGITR)。在经1μg/ml抗CD3抗体(克隆145-2C11；BD Biosciences)包被的板上培养5×104个3A9-hGITR细胞，并用指示浓度的抗体处理24小时。如图40中所示，抗体3C3(GITR.3)、28F3、19D3及18E10皆以剂量依赖性方式增强来自T细胞的IL-2分泌。如所预计的，对照hIgG1及hIgG2抗体未增加来自3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。
鉴于在刺激性CD3信号存在下抗GITR抗体增强了来自3A9-hGITR细胞的IL-2分泌，测试了各抗体增强来自用一种特定抗原活化的3A9-hGITR细胞的IL-2分泌的能力。在0.4μMHEL48-63肽及标明的抗体存在下将5×104个3A9-hGITR细胞与2.5×104个LK35.2抗原呈递细胞共培养24小时。如图41A及41B中所示，抗体18E10、13H2(与28F3相同的抗体)、28F3、3C3及19D3以剂量依赖性方式增强了来自3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。
在其他实验中，在经表达抗CD3scFv(OKT3)的CHO细胞刺激的人供体T细胞上测试了28F3对由T细胞的IL-2及IFN-γ分泌的效应。所述CHO细胞表达低水平的OKT3以促进次最佳刺激，以便能够观察由抗GITR抗体的激动作用。在一组实验中，用表达OKT3的CHO细胞及抗GITR抗体刺激来自一个供体的CD3+T细胞，且测量IFN-γ分泌，在第二组实验中，用表达OKT3的CHO细胞及抗GITR抗体刺激2个供体(不同于CD3+T细胞的供体)的CD4+T细胞，且测量IL-2及IFN-γ分泌。如下执行实验。从自Ficoll梯度(Amersham Bioscience 17-1440-03)分离的人PBMC利用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi编号130-091-156)根据制造商的方案获得全T细胞。对于利用CD4+T细胞的实验，CD4+T细胞自人PBMC(供体1及2)利用RosetteSep人CD4+T细胞富集合剂(StemCell Technology编号15062)根据制造商的方案获得。将表达抗CD3scFv(OKT3)的CHO细胞(CHO-OKT3)用RPMI培养基洗涤两次并使其经受50K Rad的剂量的辐照。收获细胞并将其以2.5×105/mL再悬浮于培养基(RPMI-1640，补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、55nMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠及100U/mL青霉素/链霉素)中。在96孔TC级平底板(Costar)中每孔接种2.5×104个CHO-OKT3细胞及1×105个T细胞。将细胞与以20μg/mL开始的8点3倍滴定的GITR抗体一起温育。添加20μg/mL的无关hIgG1作为同型对照。包括一个仅具有细胞的样品，用来显示无任何处理的基线活性。在第2天收获每一样品的上清液用于IL-2测量(仅对利用CD4+T细胞的测定)(BD opt EIA Human IL-2ELISA试剂盒；BDBioscience编号555190)且在第3天收获每一样品的上清液用于IFN-γ测量(BD optEIAhuman IFN-g ELISA试剂盒；BD Bioscience编号555142)。
图42B-E中所示的结果指示，来自两个供体的CD4+T细胞的IL-2及IFN-γ分泌均依赖于28F3剂量增加。
亦展示了来自于经其他抗GITR抗体刺激的供体T细胞的IFN-γ分泌。如上文所述执行测定。如图42A中所示，抗体28F3、3C3、19D3及18E10皆以剂量依赖性方式增强来自CD3+T细胞的IFN-γ分泌，其中抗体28F3及3C3显示的效应是测试抗体中最大的。
在另一实验中，在混合淋巴细胞反应(MLR)中观察在抗GITR抗体(具体而言28F3)存在下的T细胞增殖。
这些数据共同表明，抗体18E10、19D3及28F3可发挥激动性抗GITR抗体的功能，增强来自T细胞的细胞因子分泌。
实施例14：抗GITR抗体独立于体外FcR相互作用活化T细胞应答
已报导激动性抗TNFR抗体的体内活性需要FcγRIIB共接合(Li等人，Cell Cycle2012；11:3343-3344)。为确定此需要是否亦适用于抗GITR抗体，如实施例13中所述将3A9-hGITR细胞与LK35.2细胞及HEL48-63肽共培养，用全长抗GITR抗体28F3(hIgG2)、28F3的F(ab')2片段或28F3的Fab片段处理，并评价mIL-2产生。图43中所述的结果显示，全长28F3及28F3的F(ab')2片段增强mIL-2产生，但28F3的Fab片段的效应较弱，从而表明二价，而非单价接合对抗GITR抗体28F3的效应起贡献。这些结果共同提示，尽管体外激动性抗GITR抗体的T细胞增强效应无需FcγRIIB共接合，但接合FcγRIIB受体可增强激动剂活性。可将抗GITR抗体工程化以增加与FcγRIIB受体的结合，以增加其激动作用。
实施例15：抗GITR抗体28F3标记人扁桃体中的淋巴细胞
为确定何种组织表达GITR，使用抗GITR抗体28F3进行各种组织中的GITR的免疫组织化学检测。非淋巴组织中未发现特异性染色(包括心脏、肝、肺、肾、皮肤、周围神经、甲状腺、睾丸、前列腺)。仅在淋巴样组织(包括扁桃体、脾及胸腺)及富含淋巴的组织(结肠、胃、子宫的粘膜固有层)中的淋巴细胞及/或单核细胞的离散亚群中观察到阳性染色。扁桃体中的染色示于图44中。在滤泡间/滤泡旁区及生发中心中的离散淋巴细胞中观察到阳性染色。离散的成簇单核细胞(在上皮下方)及上皮浸润性淋巴细胞亦呈阳性染色。
实施例16：MC38肿瘤模型中的变体抗GITR同型的抗肿瘤活性
DTA-1是一种激动性大鼠抗小鼠GITR抗体(Shimizu等人，2002；eBioscience,SanDiego,CA)。这种IgG2b抗体已被显示在B16黑色素瘤处理期间可调节Treg及Teff。另外，DTA-1的完全效应需要Teff及Treg二者的GITR表达。Cohen等人(2010)表明，尽管由DTA-1接合GITR并不全局消除Treg阻抑活性，但其可阻碍Treg肿瘤浸润，并导致肿瘤内Treg内的Foxp3表达损失，这意味着阻抑的局部消除。净结果是增大的肿瘤内Teff:Treg比率及肿瘤内更高的Teff活化及功能。DTA-1阻断GITR与GITR配体(GITRL)之间的相互作用，而且这种可溶性抗体可有效促进体外细胞应答。其亦在各种肿瘤模型中有效抑制肿瘤生长(例如，参见Turk等人，2004；Cohen等人，2010)。
a)实验MC38第1号
在分阶段MC38结肠腺癌肿瘤模型中评价不同抗GITR(DTA-1)同型的抗肿瘤活性。向C57BL/6小鼠各自皮下注射2×106个MC38肿瘤细胞。7天后，将小鼠随机分入5个治疗组，且在第7、10及14天如下所述IP施用200μg/剂量、200μl体积的测试抗体：组1：小鼠IgG1对照(IgG)；组2：抗GITR大鼠IgG2b Ab(DTA-rG2b)；组3：抗GITR小鼠IgG1 Ab(DTA-mG1)；及组4：抗GITR小鼠IgG 2a Ab(DTA-mG2a)。在第15天收获肿瘤及脾。
图45C显示，IgG1抗GITR处理的肿瘤以与经小鼠IgG1对照处理的肿瘤(图45A)相当的速率生长，直至监测小鼠结束，10只小鼠无一是无肿瘤的(TF)。然而，DTA-rG2b(图45B)及DTA-mG2a(图45D)显著降低肿瘤生长的速率，其中10只小鼠中分别3只及2只是TF的。
经不同抗GITR同型处理的小鼠组的平均肿瘤体积及中值肿瘤体积的变化绘制于图46A及46B中。这些曲线确认图45中所示的小鼠个体数据：抗GITR抗体的IgG2b同型对MC38肿瘤生长展现的抑制效应最强，IgG2a同型的强度仅仅稍逊。IgG1同型显示的肿瘤生长抑制极少，其中平均及中值肿瘤体积类似于经小鼠IgG对照处理的小鼠。
亦确定了抗GITR同型对TIL及脾中MC38 T细胞亚组的效应。比较了经不同抗GITR同型处理的小鼠的MC38 TIL及脾中的T细胞亚组的群体。在脾中，DTA-m2a及DTA-r2b引起CD8+细胞的含量稍微减少，而9D9-m2a(抗CTLA-4抗体)及DTA-m1不改变CD8+T细胞水平(图47A)。所测试同型变体对脾中CD4+或CD4+Foxp3+细胞的百分比皆未有显著影响(图47B及47C)。
在TIL中，9D9-m2a导致与小鼠IgG1对照相比CD8+细胞的百分比增加至少2倍(图47D)。DTA-m2a的效应相比较不明显，将CD8+细胞的百分比增加约50％，而DTA-m1及DTA-r2b与小鼠IgG1同型对照相比未导致CD8+细胞百分比增加，或仅导致CD8+细胞百分比很小增加(图47D)。与小鼠IgG1同型对照相比，9D9-m2a引起CD4+细胞百分比小的增加，而DTA-m1未引起CD4+变化(图47E)。相比之下，与小鼠IgG1同型相比，DTA-m2a及DTA-r2b二者将CD4+百分比降低40％至50％(图47E)。
观察到最显著效应的是TIL中的CD4+Foxp3+Treg水平。尽管DTA-m1对此T细胞群体无效应，但与IgG1同型及DTA-m1相比，9D9-m2a及DTA-m2a诱导CD4+Foxp3+Treg含量减少至约1/6(图47F)。这些数据证明，抗GITR的IgG2a变体可特异性降低的肿瘤环境中的Treg水平。由此可见，IgG2a抗GITR同型可诱导肿瘤部位的CD8+Teff增加及Treg减少，导致升高的Teff对Treg比率，该比率可指示强健的抗肿瘤活性。与IgG1对照相比，DTA-r2b亦诱导CD4+Foxp3+Treg水平显著降低，但不如由9D9-m2a及DTA-m2a诱导的降低那样明显，这与大鼠IgG2b Fc区与鼠类活化性FcγR的结合较低是一致的。这些数据展示，激动性抗GITR抗体的耗竭活性需要活化性FcγR的接合。
对MC38 TIL及脾中T细胞的不同亚组的GITR表达水平的流式细胞测量显示，GITR在肿瘤部位处的Treg上表达最高，表达水平高于外周中的Treg或肿瘤部位处的CD8+Teff上的表达水平，后者展现的表达又较外周中CD8+或CD4+Teff高。GITR表达的最低相对水平在肿瘤部位处的CD4+Teff上观察到。这些数据提示了一种机制，通过该机制，若Fc融合蛋白的靶标在肿瘤部位处的Treg上相对于靶标在肿瘤部位处的Teff上的表达是高表达的，且Fc融合蛋白结合介导靶细胞的耗竭的活化FcR，则T细胞耗竭活性有助于刺激T细胞应答，且藉此增强Fc融合蛋白的抗肿瘤效能。
b)实验MC38第2号
由于DTA-1变体(商业获得的初始形式的DTA-r2b除外)遇到的聚集，重新工程化了新一组同型变体经以获得不聚集的DTA-1抗体。所观察到的聚集被追溯至工程化同型变体的轻链中无意引入的一个多余氨基酸，且此问题通过去除此外来氨基酸得以缓解。在此实验编号2中使用经重新工程化的抗体。使用分阶段MC38模型评价经重新工程化的抗GITR(DTA-1；GITR.7系列)同型的抗肿瘤活性。向C57BL/6小鼠各自皮下植入2×106个MC38细胞。7天后，将小鼠随机分入7个治疗组以便具有相当的约148mm3/2的平均肿瘤体积，且在第7、10及14天如下以200μg/剂量(但mIgG对照系以200μg的剂量施用)IP施用测试抗体：组1：小鼠IgG1对照(mIgG或“同型”)；组2：抗GITR小鼠IgG1Ab(mGITR.7.mg1)；组3：抗GITR小鼠IgG1D265A同型(mGITR.7.mg1-D265A)；组4：抗GITR小鼠IgG2a Ab(mGITR.7.mg2a)；组5：抗GITR小鼠IgG2b Ab(mGITR.7.mg2b)；及组6：抗GITR大鼠IgG2b Ab(mGITR.7.r2b或DTA-1-rG2b)。在第15天收获肿瘤及脾。
图48B及48C显示，IgG1及IgG1-D265A抗GITR处理的肿瘤以与经小鼠IgG1对照处理的肿瘤(图48A)相当的速率生长。在每种情形下，直至植入后35天监测小鼠结束为止，9只小鼠无一为TF。然而，类似于实验MC38编号1中的结果，mGITR.7.mg2a(图48D)诱导了最大的肿瘤生长抑制，其中9只小鼠中的2只为TF。小鼠及大鼠抗GITR-2b抗体亦将肿瘤生长速率显著降低类似的程度(图48E及48F)，不过在植入后35天时，大鼠2b抗体产生了1只TF小鼠，而小鼠2b抗体未产生任何TF小鼠。
平均肿瘤体积及中值肿瘤体积变化显示于图49A及49B中。趋势类似于MC38实验1中所观察到的，不同之处在于IgG2a抗GITR同型抑制MC38肿瘤生长最强效，而IgG2b同型展现显著的、但相比较低的抑制肿瘤生长的功效。与小鼠IgG对照相比，IgG1及IgG1-D265A同型显示较低水平的肿瘤生长抑制。
不同抗GITR同型对经处理小鼠的TIL及脾中Treg的群体的效应显示于图50中。如实验编号1中所观察到的，所测试的同型变体对脾中CD4+Foxp3+Treg的百分比均无巨大效应：最强的效应是用大鼠抗GITR IgG2b同型处理诱导的小于40％增加，而小鼠抗GITR IgG2b同型稍微降低CD4+Foxp3+Treg的百分比。所测试的其他抗GITR同型及抗CTLA-4 IgG2a(9D9-mG2a)抗体稍微增加Treg的百分比(图50A)。
相比之下，在TIL中，除IgG1同型(其与同型对照相比未引起变化)外，所测试的所有抗体皆诱导Treg的百分比显著降低。与IgG1同型相比，抗CTLA-4抗体9D9-mG2a导致CD4+Foxp3+Treg的含量减少至约1/4；抗GITR小鼠2a及2b同型及大鼠2b同型皆将Treg的含量降低至约1/2，且IgG1-D265A突变体引起稍微较低的减少(图50B)。这些数据确认实验第1号中观察到的效应，展示抗GITR mG2a、mG2b及rG2b同型在肿瘤环境中诱导显著的Treg耗竭，该耗竭与肿瘤生长抑制相关。
实验MC38第2号中获得的数据与实验第1号中所获得的数据大体一致，这提示，抗体的聚集未过度地干扰抗体的活性。有可能的是，聚集的抗体在小鼠中被快速清除，因此抗体聚集在本发明的体内分析中可能不是显著问题。
实施例17：分阶段Sa1N肿瘤模型中变体抗GITR同型的抗肿瘤活性
亦在A/J小鼠中的Sa1N肉瘤模型中评价了抗GITR的抗肿瘤活性。向小鼠皮下注射2×106个Sa1N细胞/植入。7天后，测定肿瘤体积并将小鼠随机分入治疗组以便具有相当的平均肿瘤体积(约75mm3/2)。在第7、10及12天以200μg/剂量IP施用如实施例10的实验MC38第1号中所述的经工程化以具有不同同型的抗GITR(DTA-1)抗体。
对肿瘤生长的效应示于图51中。用IgG2a抗GITR抗体的处理完全抑制了肿瘤生长，且到植入后约第20天为止所有10只小鼠皆为TF(图51B)，且大鼠IgG2b同型具有类似效应，其中到约第20天为止10只小鼠中的9只为TF(图51C)。与IgG1同型对照处理的肿瘤的未抑制生长(图51A)相比，IgG1(图51D)及IgG1D265A(图51E)同型将肿瘤抑制至一定程度，但远小于利用mIgG2a及rIgG2b同型所观察到的抑制。图52A及52B中所示的平均肿瘤体积及中值肿瘤体积变化确认mIgG2a及rIgG2b抗体对肿瘤生长的实质上完全抑制的效应，与之相比，由mIgG1及mIgG1-D265A同型展现的肿瘤生长抑制远远较低。
合起来，图51及52中的数据确认，利用MC38肿瘤模型(实施例10)获得的数据显示，与展现远较低抗肿瘤活性的mIgG1(及mIgG1-D265A)同型相比，抗GITR mIgG2a及rIgG2b同型展现强力的抗肿瘤活性。mIgG1及D265A变体抗体的Sa1N模型中的抗肿瘤活性与无Treg耗竭的GITR的激动作用的效应是一致的。
不同抗GITR同型对经处理小鼠的Sa1N TIL及脾中Treg的群体的效应显示于图53中。所测试的所有抗GITR同型变体皆诱导了脾中CD4+Foxp3+Treg的水平的约20-40％的相对较小增加。最高的增加是通过用小鼠抗GITR IgG2a同型的处理诱导的，其导致的增加与用抗CTLA-4 IgG2b(9D9-G2b)及IgG1-D265A(9D9-G1-D265A)抗体的处理相同(图53A)。在此GITR研究中使用后一抗CTLA-4同型作为阳性对照，因为先前已利用IgG2b同型观察了Treg耗竭。
与外周中Treg的效应相比，抗GITR m2a及r2b同型，以及抗CTLA-4 2b同型，均将肿瘤部位处Treg水平至少降低至1/3.5(图53B)。抗GITR IgG1同型及IgG1-D265A突变体二者皆诱导Treg百分比的约35％的较小减少，而抗CTLA-4 IgG1-D265A突变体未引起TIL中Treg百分比变化(图53B)。因此，如MC38肿瘤模型中所观察到的一样，抗GITR mG2a及rG2b同型在肿瘤环境中诱导显著Treg耗竭，远大于IgG1及IgG1-D265A抗体所诱导的，此耗竭与肿瘤生长抑制相关。
实施例18：抗GITR抗体及抗PD1拮抗性抗体的组合的协同活性
为确认是否可通过组合DTA-1抗体与拮抗PD-1的抗体(一种提供抗肿瘤机制的抑制信号的分子)来获得协同抗肿瘤效应，使用分阶段MC38结肠腺癌模型评价抗体的组合对肿瘤体积的效应。在第7、10及14天将小鼠用(A)对照mIgG1、(B)mIgG+DTA-1、(C)mIgG+PD-1(克隆4H2,BMS)及(D)PD-1+DTA-1处理。
对肿瘤生长的效应显示于图54中。用DTA-1抗体或抗PD-1抗体的处理个别地抑制肿瘤生长至特定程度，其中10只小鼠中的2只为TF。相比之下，到第30天为止，DTA-1抗体及抗PD-1抗体的组合实质上增加TF小鼠的数目，其中10只小鼠中的7只为TF。如所预计的那样，在施用对照mIgG的小鼠中无TF小鼠。
这些结果表明，激动性抗GITR抗体及拮抗性抗PD-1抗体的组合协同地起作用抑制肿瘤生长。
实施例19：CDR氨基酸突变对结合亲和力的效应
此实施例显示，28F3的VH CDR3中的某些氨基酸残基可突变成另一氨基酸而不显著影响其结合亲和力。
通过使VH CDR3中的以下氨基酸中的一种或多种突变生成了28F3的48种突变体：M102、D106及M111(根据SEQ ID NO:13编号)，并测试了以下活性：与3A9-hGITR细胞的结合、及在板结合的抗CD3存在下3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。如上文所述执行实验。
结果示于图55A及55B(与3A9-hGITR细胞的结合)、图56A-F(IL-2分泌)及表7中。
表7：CDR氨基酸突变对结合亲和力的效应
结果指示，若干突变体具有与28F3相当的结合及活性，而其他突变降低了结合和/或IL-2分泌。以下突变体具有相当的结合及活性数据：M98V；M98V/D106E；M98L/D106E；M98I/D160E；及M98A/D106E。
实施例20：恒定区修饰对GITR抗体激动剂活性的影响
此实施例展示，包含IgG2铰链的GITR抗体相对于具有IgG1铰链的相同抗体具有增加的诱导来自T细胞的IL-2及IFN-γ分泌的能力。
已在上述CHO-OKT3及3A9测定中观察到，具有IgG2恒定区的杂交瘤衍生的抗体，相比于重链恒定区切换成IgG1或无效应物IgG1(IgG1.1)的重链恒定区的相同抗体，更强力地刺激细胞因子分泌。因此，在这些测定中进一步测试了IgG2恒定区或铰链对抗GITR抗体的影响。
将抗人GITR抗体的重链可变区连接至以下重链恒定区：
表8：例示的抗GITR抗体的恒定区构形
首先，比较这些GITR抗体的结合亲和力与具有IgG1铰链的GITR抗体的结合亲和力。如实施例2中所示测定结合亲和力。如图57中所示，所有三种具有IgG2铰链的GITR抗体对活化T细胞的亲和力均与具有IgG1铰链的两种GITR抗体类似。
其次，测试具有IgG1恒定区或IgG2铰链/IgG1 Fc结构域的GITR抗体诱导来自经表达OKT3的CHO细胞刺激的T细胞的IL-2及IFN-γ分泌的能力，如实施例13中所示。如图58A及58B中所示，具有IgG2铰链/IgG1 Fc结构域的抗体(“抗GITR.G2.g1f”)较具有IgG1恒定区的抗体(“抗GITR.g1f”)诱导来自T细胞的IFN-γ及IL-2分泌的程度更高。利用这些恒定结构域的无效应物型式获得了类似结果(图58C)。
为进一步确认用包含IgG2铰链的抗GITR抗体实现的T细胞的增加活化，在另一种不同的实验格式中测试了IL-2分泌。在此实验中，测试了GITR抗体诱导来自3A9-hGITR细胞(异位表达人GITR的小鼠T细胞杂交瘤3A9细胞系)的IL-2分泌的能力，如实施例13中所述。如图59中所示，所有具有IgG2铰链的抗体(抗GITR.g2、抗GITR.g2.g1f及抗GITR.g2.g1.1f)相比其含有IgG1恒定区的对应者(“抗GITR.g1f及抗GITR.g1.1f”)均以更高的程度诱导了来自3A9-hGITR细胞的IL-2分泌。
这些结果共同表明，具有IgG2铰链及g1或g1.1恒定区的抗GITR抗体较具有IgG1铰链的相同抗体更强效。解释含有IgG2铰链的GITR抗体的更好效果的一种可能机制是，相对于包含IgG1铰链的相同抗体，这些抗体在细胞表面处的内化增加及/或复合物形成增加。
实施例21：抗GITR抗体诱导的增殖是Teff细胞固有的
GITR在小鼠及人调节性T(Treg)细胞上表达。文献中的数据已显示，在Treg细胞存在下激动性抗GITR抗体驱动小鼠CD4+Foxp3-T效应物(Teff)细胞的增殖。另外，已有人提出，此效应主要是经由抗GITR抗体与Teff细胞的结合，而非对Treg细胞阻抑剂功能的直接影响来驱动。其他出版物显示，抗GITR抗体驱动Treg细胞增殖，且可诱导以Foxp3损失为特征的Treg细胞谱系不稳定性。
为检查抗GITR抗体对Treg细胞功能的效应，执行小鼠Treg细胞阻抑测定，其中在APC及滴定数目的Treg细胞存在下用抗CD3及抗小鼠GITR mAb DTA-1的各种同型刺激Teff细胞。结果显示，与同型对照相比，DTA-1抗体处理增加增殖。此外，IgG1、2a、2b及惰性IgG1D265A同型皆有效增加Teff细胞增殖，藉此展示此系统中的抗GITR抗体功能无需FcR结合。
自前述实验并不清楚增加的Teff增殖是否是由于抗GITR抗体作用于Treg及/或Teff细胞。为解决此问题，使用人GITR“敲入”(huGITR KI)小鼠。在这些小鼠中，用人TNFRSF18基因置换编码小鼠GITR的基因Tnfrsf18，且以类似于野生型小鼠中的muGITR的方式表达人GITR；人GITR在Teff及Treg细胞上表达，其中后者水平较高。发现抗人GITR mAb28F3能够驱动huGITR KI小鼠的Teff细胞的增殖。由于28F3结合人GITR而非小鼠GITR，故有可能设定一种Treg阻抑测定系统，其中可差别地靶向Teff与Treg细胞上的GITR。此系统亦为检查28F3与人IgG1或惰性IgG1.1 Fc区之间的功能差异创造了条件。
基于CD4及CD25表达，自huGITR KI及WT小鼠分选Treg及Teff细胞。将WT及huGITRTreg及Teff细胞混合成容许用28F3单区室靶向(unicompartmental targeting)Treg或Teff细胞(huGITR KI Teff细胞与野生型Treg细胞等)的组合。作为对照，包括28F3可结合Treg及Teff细胞二者、或不结合任一者的情况。在APC及28F3 IgG1、28F3 IgG1.1或同型对照存在下用抗CD3刺激含有Teff及Treg细胞的培养物。
结果提供于图60中。如所预计的，当28F3可结合Treg及Teff两种细胞时，观察到Teff细胞增殖增加，且在28F3仅可结合Teff细胞的条件下维持此效应。相比之下，当28F3仅能够结合Treg细胞时，Teff增殖相对于同型对照无增加。关于同型，在28F3显示效应的条件中，IgG1与IgG1.1 Fc之间无差异。此与上述显示抗GITR激动作用无需Fc交联的数据是一致的。总的来看，在此系统中，抗GITR抗体主要经由其调节Teff细胞功能的能力起作用，而非经由抑制Treg细胞阻抑剂能力起作用。然而，此并不排除GITR信号传导对活体内Treg细胞的作用，因为抗GITR抗体可能驱动Treg细胞增殖或为ADCC或ADCP提供Treg特异性靶标。
实施例22：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
使用NK92/CD16细胞或原代NK细胞作为效应物评价28F3.IgG1f及28F3.IgG1.1f的体外ADCC活性，且使用已知表达GITR的多种细胞作为靶标。
在测定之前三天，通过负选择分离靶CD4+及CD8+T细胞亚组，且通过CD25正选择自CD4+T细胞进一步分离Treg。将T细胞亚组中的每一者用CD2/CD3/CD28珠子(MiltenyiBiotec)刺激三天以诱导GITR的上调。在测定之前一天，通过负选择(StemCellTechnologies公司)自新鲜PBMC分离原代NK细胞，并在补充有500IU/mL重组IL-2(R&DSystems)及1uM氢化可体松(hydrocortisone)(StemCell)的MyeloCult H5100培养基(StemCell)中温育过夜。在测定当天，将效应细胞(原代NK细胞或NK92/CD16)与钙黄绿素AM标记的活化T细胞以指定的效应物对靶标比率在1ug/mL 28F3.IgG1f及28F3.IgG1.1f存在下温育。
使用原代NK细胞或NK92/CD16细胞作为效应物，28F3.IgG1诱导了活化CD4+T效应物及Treg细胞溶解，而观察到较少的活化CD8+T细胞溶解(图61)。如所预计的，使用NK92或原代NK细胞作为效应物，28F3.IgG1.1未介导任何靶细胞的ADCC。因此，28F3.IgG1诱导活化CD4+T效应物及Treg细胞溶解，且诱导活化CD8+T细胞溶解(程度较前者为低)，且由28F3.IgG1诱导的溶解水平似乎与靶细胞上的GITR表达水平成正比。
实施例23：人GITR敲入小鼠中28F3.IgG1抗体的活性
此实施例显示，28F3.IgG1及28F3IgG1.1在具有人免疫系统及人GITR蛋白的C57BL/6小鼠中的MC38肿瘤中具有抗肿瘤活性，且28F3.IgG1的抗肿瘤活性较强。
人GITR敲入小鼠的生成：对C57BL/6小鼠进行遗传工程化以表达人GITR细胞外结构域(ECD)代替小鼠GITR ECD，从而保持小鼠跨膜及细胞质序列完整。通过对具有抗人GITR抗体的抗CD3/CD28活化的脾细胞进行染色确认人/小鼠嵌合GITR的表达。
在具有10％热灭活胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L(45％)葡萄糖(10mL/L)及1mM丙酮酸钠(10mL/L)的DMEM培养基中培养MC38细胞。细胞每2天以1:10分盘。使用两个群组的小鼠，且对于两个群组而言，均使用1-cm3注射器及25号半英寸针向每一小鼠的右侧腹皮下植入0.2mL PBS中的75万个MC38细胞。对于群组1，在植入后第7天，根据肿瘤体积(L×W×H/2)将40只小鼠随机分成3组，每组12至13只小鼠。所有组皆具有约174mm3/2的平均肿瘤体积。在第7、10及14天，以10mg/kg施用媒剂对照或mAb。对于队列2而言，在植入后第7天，根据肿瘤体积(L×W×H/2)将10只小鼠随机分成2组，每组5只小鼠。所有组皆具有约69mm3/2的平均肿瘤体积。在第7、10及14天，以10mg/kg施用媒剂对照或28F3.IgG1 mAb。
以表9中概述的浓度及日期向小鼠腹膜内(IP)投药。
表9.
每周测量两次肿瘤及体重直至研究终止。利用Fowler电子数字测径器(62379-531型；Fred V.Fowler公司，Newton,MA)以3维测量肿瘤，且使用来自Studylog Systems公司(South San Francisco,CA)的StudyDirector软件电子记录数据。
在此肿瘤研究中，在植入后第52天终止群组1。使用Microsoft Excel计算肿瘤体积及体重的平均值、标准偏差(SD)及中值。平均值及中值分别在100％及至少60％的研究动物保留于每一治疗组中时计算。在第15天收获群组2中的小鼠的肿瘤。
结果指示，在肿瘤植入后第22天，即在研究中的所有小鼠均存活时的最后一天，与同型对照抗体相比，10mg/kg剂量的28F3.IgG1显示对MC38异种移植物的67％平均肿瘤生长抑制(TGI)。肿瘤TGI分治疗组总结于表10中。肿瘤生长曲线分治疗组示于图62A至62C中。平均及中值肿瘤生长曲线分治疗组提供于图63A-63B中。在任何治疗组中毒性皆不明显，因为平均及中值体重变化小于20％。小鼠体重及随时间的百分比变化示于图64A-64B中。
表10.
结果显示，在植入后第22天，28F3.IgG1具有67％TGI，而28F3.IgG1.1f具有22％TGI，这指示在MC38肿瘤模型中两种抗体皆减少肿瘤生长。另外，结果提示，在MC38肿瘤模型中，28F3.IgG1的Fc结合可增强抗肿瘤功效。
为研究28F3.IgG1对T细胞群体所具有的效应，在植入后第15天自每一治疗组中的5只小鼠收获组织。利用gentleMACS Octo DissociatorTM(Miltenyi,San Diego,CA)处理脾及肿瘤。使用流式细胞术(FACS)对单细胞悬浮液进行T细胞标记物染色。通过流式细胞术利用Fortessa(BD Biosciences,San Jose,CA)检测抗体荧光且利用计算机程序Flowjo(Flowjo,LLC,Ashland,OR)分析结果。
图65及66中所示的结果显示相对于同型对照降低的Treg细胞百分比，这与经28F3.IgG1处理的小鼠中的耗竭一致(图65)。相反，28F3.IgG1组中的CD8+T细胞百分比增加(图66)。
因此，与同型对照相比，经28F3.IgG1处理的小鼠中的免疫监测提示，TGI可通过Treg耗竭介导且CD8+T细胞增加。
实施例24：交联28F3.IgG1增加其功效
此实施例显示，交联28F3.IgG1可增加其增强T细胞的IFN-γ分泌及促进T细胞增殖的功效。
在各种浓度的抗GITR抗体或对照试剂存在下将T细胞与CHO-OKT3细胞或CHO-OKT3-CD32a高共培养，并测量干扰素-γ(IFN-γ)分泌及细胞增殖。CHO-OKT3-CD32高细胞系具有极高水平的Fc受体CD32a，及较其亲本CHO-OKT3克隆稍微较高的OKT3表达。
如下执行分析。从Ficoll梯度(Amersham Bioscience 17-1440-03)分离的人PBMC利用CD4 T细胞分离试剂盒(Life technologies，目录号113.31D)及CD25微珠(Miltenyi，目录号130-092-983)根据制造商的方案获得应答T细胞。将表达抗CD3scFv(OKT3)的CHO细胞(CHO-OKT3)或表达抗CD3scFv及CD32a的CHO细胞用RPMI培养基洗涤两次，施加50K Rad的剂量的辐照。收获细胞并将其以2.5×105/mL重悬浮于培养基(RPMI-1640，补充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、55nMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠及100U/mL青霉素/链霉素)中。在96孔TC级平底板(Costar)中每孔接种2.5×104个CHO细胞及1×105个T细胞。将细胞与以20μg/mL开始的8点4倍滴定的GITR抗体一起温育。添加20μg/mL的无关hIgG1作为同型对照。包括一个仅具有细胞的样品以显示无任何处理的基线活性。在第3天收获每一样品的上清液用于IFN-γ测量(BD optEIA human IFN-g ELISA试剂盒；BD Bioscience编号555142)。通过3H-胸苷纳入评价最后8小时温育的细胞增殖。图67及68中所示的结果指示，在28F3.IgG1存在下，相对于那些与CHO-OKT3细胞共培养的细胞，与CHO-OKT3-CD32a高共培养的T细胞分泌更多IFN-γ(图67)。如所预计的，利用无效应物28F3.IgG1.1f抗体(其不结合CD32a)未观察到显著差异。另外，在28F3.IgG1存在下，相对于那些与CHO-OKT3细胞共培养的细胞，在与CHO-OKT3-CD32a高共培养的T细胞中观察到更多T细胞增殖；利用无效应物28F3.IgG1.1f抗体并未观察到此效应(图68)。由此可见，交联28F3.IgG1增加了28F3.IgG1增强T细胞的IFN-γ分泌及促进T细胞增殖的功效。利用表达较低水平的CD32a的CHO-OKT3细胞亦观察到此种对T细胞增殖的增强效应。与在可溶时相比，在交联时，GITR.6g1.1f显示更高水平的IFN-γ。此可能是OKT3在CHO-OKT3-CD32a高细胞上表达的水平相对于CHO-OKT3细胞稍微较高的反映。用交联GITR.6g1f观察到的此增加大于利用惰性同型所观察到的，提示交联的正收益。G1f型式即使于低剂量下亦促进高水平的IFN-γ，其中可溶性抗体展示极小的相对于背景的激动作用，再次提示交联的正作用。
由此可见，28F3.IgG1及无效应物28F3.IgG1抗体均刺激IFN-γ产生并刺激T细胞增殖，然而，交联28F3.IgG1进一步增加其增强T细胞的IFN-γ分泌及促进T细胞增殖的功效。
表11：序列表的概述
表11提供成熟可变区及重链及轻链的序列及(若指示)具有信号肽的序列。
等同方案：
本领域技术人员仅使用常规实验即可认识或能够确定本文所公开具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案皆意欲涵盖在下文权利要求内。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
<120> 抗糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)的抗体及其用途F
<130> MXI-535PC
<140> 新申请
<141> 与本案同时
<150> US 62/008,945
<151> 2014-06-06
<150> US 62/082,980
<151> 2014-11-21
<160> 382
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
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Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
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Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
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65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
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Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
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Val
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
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<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
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<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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<213> Homo sapiens
<400> 8
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 10
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
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Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
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Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
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115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
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450
<210> 18
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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130 135 140
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145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
210 215 220
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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210
<210> 30
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly
450
<210> 31
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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115 120 125
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
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Leu Ser Pro Gly
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<220>
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
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Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
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305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 43
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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165 170 175
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340 345 350
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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450
<210> 44
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Leu Ser Pro Gly
450
<210> 45
<211> 214
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Ser Tyr Gly Met His
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Val Ile Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Gly Gly Arg Ile Ala Val Ala Phe Tyr Tyr Ser Met Asp Val
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
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210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Thr
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100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 58
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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385 390 395 400
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
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405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 61
<211> 213
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 62
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Gly Tyr Tyr Trp Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile
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<220>
<223> 合成的
<400> 65
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Thr
1 5
<210> 71
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105
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<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
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210
<210> 75
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
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370 375 380
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450
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<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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275 280 285
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Gly
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
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<223> 合成的
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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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65 70 75 80
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115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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260 265 270
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290 295 300
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305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 87
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 88
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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<210> 89
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 89
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420 425 430
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435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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85 90 95
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 91
Ser Tyr Gly Met Gln
1 5
<210> 92
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 92
Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 93
Gly Gly Leu Met Val Arg Gly Leu Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 96
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Val
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu His Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Leu Ile Pro Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
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115 120 125
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
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85 90 95
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 99
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
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100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Val
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu His Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Leu Ile Pro Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
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145 150 155 160
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Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
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Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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450
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<211> 215
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 101
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Val
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
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Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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450
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Val
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
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Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
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Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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<223> 合成的
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<223> 合成的
<400> 108
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<223> 合成的
<400> 109
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<211> 7
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<220>
<223> 合成的
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<220>
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<400> 112
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 113
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
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<220>
<223> 合成的
<400> 114
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1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 117
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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210
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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385 390 395 400
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435 440 445
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<211> 446
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<400> 124
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1 5
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<223> 合成的
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<223> 合成的
<400> 128
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 130
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 131
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245 250 255
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Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 132
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 132
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 133
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 133
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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195 200 205
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210
<210> 134
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 134
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
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340 345 350
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 135
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 135
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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275 280 285
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355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 136
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 136
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 137
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 138
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Asn Tyr Gly Met His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 139
Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 140
Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 141
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 142
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln Thr
1 5
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
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<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
agtatggttc ggggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 148
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 149
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatattat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
agtatggttc ggggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
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cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 150
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
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aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
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cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
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ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
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<210> 151
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 151
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
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gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600
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agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720
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aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200
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aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggtt ga 1362
<210> 152
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
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<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
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<210> 154
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccaac ctgggaggtc cctgagactc 60
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ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctggaagtaa taaattctat 180
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<210> 155
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 155
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aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
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<210> 156
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 156
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccaac ctgggaggtc cctgagactc 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<220>
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cgtatagcag tggccttcta ctacagtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 159
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg ctggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
cgtatagcag tggccttcta ctacagtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360
gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 420
acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc acaccttccc agctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag caacttcggc 600
acccagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 660
gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 900
acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 161
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 161
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 162
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 162
caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggacctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattgggaaa atcaatcata gtggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actgggggcc 300
tttgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 351
<210> 163
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 163
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 164
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 164
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gggtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggcc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcacacttt tggccagggg 300
accaagctgg agatcaaa 318
<210> 165
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 165
caggtgcaac tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggacctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattgggaaa atcaatcata gtggaaacac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag actgggggcc 300
tttgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 166
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 166
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 167
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 167
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gggtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggcc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcacacttt tggccagggg 300
accaagctgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639
<210> 168
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 168
caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt catcttgagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgacagtt atctggtatg atggaagtaa taaattctat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cgtctagcaa caggtcactt ctactacgtt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 169
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 169
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 170
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic
<400> 170
caggttcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt catcttgagt gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gactggagtg ggtgacagtt atctggtatg atggaagtaa taaattctat 180
gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggga 300
cgtctagcaa caggtcactt ctactacgtt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 171
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 171
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 172
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 172
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcagtgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaaa attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggcggt 300
cttatggttc ggggtctctt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 173
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 173
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 174
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 174
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcagtgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg aaggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaaa attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggcggt 300
cttatggttc ggggtctctt ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 175
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 175
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 176
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 176
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt accgtctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcacacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300
gggcagctga tcccttactc ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacctcg 360
gtcaccgtct cctca 375
<210> 177
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 177
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
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cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 178
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 178
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gagaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 179
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 179
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt accgtctgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180
gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgcacacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300
gggcagctga tcccttactc ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggacctcg 360
gtcaccgtct cctcagcttc caccaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 420
aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480
ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600
ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagagagttg agtccaaata tggtccccca tgcccatcat gcccagcacc tgagttcctg 720
gggggaccat cagtcttcct gttcccccca aaacccaagg acactctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc 840
aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaa 1356
<210> 180
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 180
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttacc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gagaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgat caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 181
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 182
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 182
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggagaa atcaatcata gtggaaacac ctactacaac 180
ccgtccctca agagtcgcgt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttatccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag atttgggagt 300
aatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 351
<210> 183
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 183
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 184
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 184
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggagaa atcaatcata gtggaaacac ctactacaac 180
ccgtccctca agagtcgcgt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttatccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag atttgggagt 300
aatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc agcctccacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 185
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 185
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctccgac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 186
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 186
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg gtggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa ctcgctgtct 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
gctatggttc ggggagtcta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 187
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 187
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcagac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 188
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 188
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 189
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 189
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg gtggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa ctcgctgtct 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagggggg 300
gctatggttc ggggagtcta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 420
agcacctccg agagcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 540
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcaacttc 600
ggcacccaga cctacacctg caacgtagat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660
acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 900
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaaaccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 190
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 190
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagttcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcagac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 191
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 191
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 192
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 192
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 193
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 193
Met Val Arg Gly
1
<210> 194
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 194
Tyr Tyr Tyr Gly
1
<210> 195
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 195
Tyr Tyr Tyr
1
<210> 196
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 196
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 197
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 197
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 198
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 198
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser
20
<210> 199
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 199
Ile Ala Val Ala
1
<210> 200
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 200
Asp Tyr
1
<210> 201
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 201
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 202
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 202
Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 203
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 203
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 204
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 204
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Asn Tyr
85 90
<210> 205
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 205
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 206
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 206
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 207
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 207
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr
85 90
<210> 208
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 208
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
85 90
<210> 209
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 209
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
85 90 95
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 211
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
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<211> 12
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 213
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp
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<220>
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<223> 合成的
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1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys
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<220>
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Pro Val Gly Val Val
1 5
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<220>
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Leu Ser Pro Gly Lys
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 222
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 223
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<211> 325
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 224
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Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 225
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 225
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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115 120 125
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130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 226
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 226
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 227
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> Synthetic
<400> 228
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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385 390 395 400
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420 425 430
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Pro Gly
450
<210> 229
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 229
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
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Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
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Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
180 185 190
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 247
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 247
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Lys Ile Asn His Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Ala Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
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210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
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260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
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370 375 380
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 248
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 248
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Gly
<210> 249
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 249
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成的
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Pro Gly
450
<210> 253
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 253
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
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260 265 270
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 254
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 254
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Met Val Arg Gly Leu Phe Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
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115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
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245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<211> 450
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<220>
<223> 合成的
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Gly
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<223> 合成的
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Gly
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<223> 合成的
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 262
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
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<223> 合成的
<400> 263
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Val
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu His Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Leu Ile Pro Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
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Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
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Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
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Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 272
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 272
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
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210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 273
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 273
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
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Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 274
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 274
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 275
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 275
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Gly Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ala Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 276
Leu Ser Pro Gly
1
<210> 277
<400> 277
000
<210> 278
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 278
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Lys Val
<210> 279
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 279
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
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<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 280
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 281
<211> 103
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 281
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100
<210> 282
<211> 106
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 282
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 283
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 283
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
195 200 205
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 284
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 284
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 285
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 285
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Arg Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 286
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 286
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 287
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 287
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 288
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 288
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
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210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 289
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 289
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 290
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 290
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
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Thr Val Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 291
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 291
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 292
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 292
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
<210> 293
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 293
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 294
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 294
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1 5 10 15
Leu Gly Gly
<210> 295
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 295
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly
20
<210> 296
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 296
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Glu Gly Ala
20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 297
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
20 25 30
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
85 90 95
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
100
<210> 298
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 298
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 299
Val Asp Lys Arg Val
1 5
<210> 300
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 300
Val Asp Lys Thr Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 301
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 302
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr
1 5 10
<210> 303
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 303
Glu Pro Lys Ser
1
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 304
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1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 305
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 306
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 307
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
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Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
35 40 45
Cys Pro
50
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<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 308
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro
20 25 30
Arg Cys Pro
35
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 309
Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Arg Cys Pro
20
<210> 310
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 310
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys
1 5 10 15
Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp
20 25 30
Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
35 40
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 311
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 312
Cys Pro Ser Cys Pro
1 5
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 313
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
<210> 314
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 314
Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5
<210> 315
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 315
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 316
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 316
atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgt 57
<210> 317
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 317
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 318
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 318
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggcttctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agat 64
<210> 319
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 319
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys
20
<210> 320
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 320
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
<210> 321
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 321
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 322
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 322
atgaaacacc tgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcc 57
<210> 323
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 323
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 324
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 324
atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60
agatgt 66
<210> 325
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 325
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 326
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 326
atggaagccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
<210> 327
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 327
Met Glu Phe Gly Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 328
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 328
atggagtttg ggctgaactg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgt 57
<210> 329
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 329
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Ala Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 330
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 330
atggagtttg ggctgagctg gattttcctt gctgctattt taaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 331
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 331
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 332
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 332
atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
<210> 333
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 333
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 334
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 334
atgaaacacc tgtggttctt cctcctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcc 57
<210> 335
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 335
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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85 90 95
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100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 336
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 337
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 337
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 338
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 338
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 339
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 339
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
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Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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275 280 285
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
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Ser Leu Ser Pro Gly
450
<210> 340
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 340
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
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Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 341
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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210
<210> 342
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 342
Thr Tyr Gly Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 343
Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 344
Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 345
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 345
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 347
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 348
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
<210> 349
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 349
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
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Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly
450
<210> 350
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 350
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
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Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
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Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
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Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
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245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 351
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 351
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
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130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 352
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 352
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Thr Trp Tyr Ala Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Leu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 353
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 353
caggtgcagc tggtggagtc tgggggagac gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt acatggtatg ctggaagtaa taaattttat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggaggt 300
agtatggttc ggggacttta ttattacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 354
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 354
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
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gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 355
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 355
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ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt acatggtatg ctggaagtaa taaattttat 180
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ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggaggt 300
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<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 356
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
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gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 357
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
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Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
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Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
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130 135 140
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 358
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
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Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
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Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 359
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<210> 360
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 360
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc cgccatccag 60
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<210> 361
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 361
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
20 25 30
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
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100 105 110
Cys Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
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Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 362
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
20 25 30
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
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50 55 60
Val Ala Val Ile Trp Tyr Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Gly Gly Ser Met Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met
115 120 125
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 363
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<210> 364
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 364
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccggga gagcgctcgc acaggtgcag 60
ctggtggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact ctcctgtgca 120
gcgtctggat tcaccttcag tagctatggc atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag 180
gggctggagt gggtggcagt tatatggtat gaaggaagta ataaatatta tgcagactcc 240
gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg 300
aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgagaggggg gagtatggtt 360
cggggggact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 420
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
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<210> 365
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 365
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
20 25 30
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser
35 40 45
Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
50 55 60
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
85 90 95
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro
100 105 110
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
145 150 155 160
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
165 170 175
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
195 200 205
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 366
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 366
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc cgccatccag 60
ttgacccagt ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 120
cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcctggtatc agcagaaacc agggaaagct 180
cctaagctcc tgatctatga tgcctccagt ttggaaagtg gggtcccatc aaggttcagc 240
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctgcagcc tgaagatttt 300
gcaacttatt actgtcaaca gtttaatagt tacccgtaca cttttggcca ggggaccaag 360
ctggagatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 420
cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 480
gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 540
acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 600
gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 660
cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgttag 696
<210> 367
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 367
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 368
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 368
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccggga gagcgctcgc a 51
<210> 369
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 369
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc c 51
<210> 370
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 370
Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg
20 25 30
<210> 371
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 371
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 372
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 372
Ser Tyr Gly Xaa His
1 5
<210> 373
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 373
Val Ile Trp Tyr Xaa Gly Ser Asn Lys Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 374
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 374
Val Ile Trp Tyr Xaa Gly Ser Asn Lys Xaa Tyr Xaa Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 375
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 375
Gly Gly Ser Xaa Val Arg Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 376
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 376
Gly Gly Ser Xaa Val Arg Gly Xaa Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 377
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸, and one may be
absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 377
Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met Asp Val Trp Tyr Tyr Xaa
1 5 10 15
Met Asp Val Trp
20
<210> 378
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 378
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Xaa Leu Ala
1 5 10
<210> 379
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸, and one may be
absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 379
Arg Ala Ser Gln Gly Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Leu Ala
1 5 10
<210> 380
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 380
Asp Ala Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 381
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 381
Gln Gln Xaa Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 382
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 382
Gln Gln Xaa Xaa Ser Xaa Pro Xaa Thr
1 5

Claims (68)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其结合人糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)，且展现以下性质：
(a)结合可溶性人GITR；
(b)结合膜结合的人GITR；
(c)结合膜结合的食蟹猴GITR；
(d)诱导或增强T细胞活化；
(e)抑制GITR配体与3A9-hGITR细胞上的GITR的结合；
(f)至多部分地抑制GITR配体与活化T细胞上的GITR的结合；
(g)结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)上的构象表位；
(h)结合O-连接与N-糖基化的及未糖基化的人GITR；
(i)在没有与Fc受体的结合时具有激动剂活性，但其中与Fc受体的结合进一步增强该激动剂活性；及
(j)在任一方向或两个方向上与抗体28F3、3C3-1、3C3-2、2G6、8A6、9G7-1、9G7-2、14E3、19H8-1、19H8-2、19D3、18E10及6G10中的一或多者竞争结合人GITR。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体刺激抗肿瘤免疫反应。
3.权利要求1或2的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体刺激抗原特异性T细胞应答。
4.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体增加表达GITR的T细胞中的IL-2及/或IFN-γ产生。
5.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体增加T细胞增殖。
6.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体不结合Fc受体。
7.权利要求1至5中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合一种或多种活化性FcγR。
8.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中如通过Biacore所测量的，该抗体以10nM或更小的KD结合可溶性人GITR。
9.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中如通过Scatchard所测量的，该抗体以1nM或更小的KD结合膜结合的人GITR。
10.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中如通过FACS所测量的，该抗体以1nM或更小的EC50结合膜结合的人GITR。
11.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中如通过FACS所测量的，该抗体以10nM或更小的EC50结合膜结合的食蟹猴GITR。
12.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体无需多价交联即可诱导或增强T细胞活化。
13.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中如通过FACS所测量的，该抗体以1μg/mL或更小的EC50抑制GITR配体与GITR的结合。
14.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)。
15.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)，且包含选自下组的可变重链与可变轻链对中的三个可变重链CDR及三个可变轻链CDR：
(a)SEQ ID NO:13及14；
(b)SEQ ID NO:26及27；
(c)SEQ ID NO:39及40；
(d)SEQ ID NO:52及53；
(e)SEQ ID NO:52及54；
(f)SEQ ID NO:71及72；
(g)SEQ ID NO:84及85；
(h)SEQ ID NO:97及98；
(i)SEQ ID NO:97及99；
(j)SEQ ID NO:115及116；
(k)SEQ ID NO:128及129；
(l)SEQ ID NO:128及130；及
(m)SEQ ID NO:335及336。
16.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)，且包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:20、21及22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:23、24及25的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:33、34及35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:36、37及38的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:46、47及48的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:49、50及51的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:62、63及64的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:65、66及67的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:62、63及64的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:68、69及70的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:78、79及80的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:81、82及83的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:91、92及93的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:94、95及96的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:106、107及108的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:109、110及111的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(i)分别包含SEQ ID NO:106、107及108的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:112、113及114的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(j)分别包含SEQ ID NO:122、123及124的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:125、126及127的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(k)分别包含SEQ ID NO:138、139及140的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:141、142及143的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；
(l)分别包含SEQ ID NO:138、139及140的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:144、145及146的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列；或
(m)分别包含SEQ ID NO:342至344的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQID NO:345至347的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
17.权利要求16的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含：分别包含SEQ ID NO:20、21及22的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:23、24及25的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
18.权利要求16的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含：分别包含SEQ ID NO:33、34及35的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:36、37及38的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
19.权利要求16的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含：分别包含SEQ ID NO:46、47及48的重链CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分别包含SEQ ID NO:49、50及51的轻链CDR1、CDR2及CDR3序列。
20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含重链及轻链可变区，其中该重链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、26、39、52、71、84、97、115、128及335。
21.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含重链及轻链可变区，其中该轻链可变区包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、27、40、53、54、72、85、98、99、116、129、130及336。
22.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含与选自下组的氨基酸序列至少85％相同的重链及轻链可变区序列：
(a)分别为SEQ ID NO:13及14；
(b)分别为SEQ ID NO:26及27；
(c)分别为SEQ ID NO:39及40；
(d)分别为SEQ ID NO:52及53；
(e)分别为SEQ ID NO:52及54；
(f)分别为SEQ ID NO:71及72；
(g)分别为SEQ ID NO:84及85；
(h)分别为SEQ ID NO:97及98；
(i)分别为SEQ ID NO:97及99；
(j)分别为SEQ ID NO:115及116；
(k)分别为SEQ ID NO:128及129；
(l)分别为SEQ ID NO:128及130；及
(m)分别为SEQ ID NO:335及336。
23.权利要求22的抗体或其抗原结合部分，其中这些重链及轻链可变区包含与选自(a)至(m)的重链及轻链可变区至少90％相同的氨基酸序列。
24.权利要求23的抗体或其抗原结合部分，其中该重链及轻链可变区包含与选自(a)至(m)的重链及轻链可变区至少95％相同的氨基酸序列。
25.权利要求24的抗体或其抗原结合部分，其中该重链及轻链可变区包含选自(a)至(m)的重链及轻链可变区。
26.权利要求25的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含SEQ ID NO:13中所列的氨基酸序列的重链可变区，及包含SEQ ID NO:14中所列的氨基酸序列的轻链可变区。
27.权利要求25的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含SEQ ID NO:26中所列的氨基酸序列的重链可变区、及包含SEQ ID NO:27中所列的氨基酸序列的轻链可变区。
28.权利要求25的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含SEQ ID NO:39中所列的氨基酸序列的重链可变区、及/或包含SEQ ID NO:40中所列的氨基酸序列的轻链可变区。
29.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)且包含与选自下组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的重链与轻链序列：
(a)分别为SEQ ID NO:15及16；
(b)分别为SEQ ID NO:17及19；
(c)分别为SEQ ID NO:18及19；
(d)分别为SEQ ID NO:28及29；
(e)分别为SEQ ID NO:30及32；
(f)分别为SEQ ID NO:31及32；
(g)分别为SEQ ID NO:41及42；
(h)分别为SEQ ID NO:43及45；
(i)分别为SEQ ID NO:44及45；
(j)分别为SEQ ID NO:55及56；
(k)分别为SEQ ID NO:55及57；
(l)分别为SEQ ID NO:58及60；
(m)分别为SEQ ID NO:59及60；
(n)分别为SEQ ID NO:58及61；
(o)分别为SEQ ID NO:59及61；
(p)分别为SEQ ID NO:73及74；
(q)分别为SEQ ID NO:75及77；
(r)分别为SEQ ID NO:76及77；
(s)分别为SEQ ID NO:86及87；
(t)分别为SEQ ID NO:88及90；
(u)分别为SEQ ID NO:89及90；
(v)分别为SEQ ID NO:102及104；
(w)分别为SEQ ID NO:103及104；
(x)分别为SEQ ID NO:100及101；
(y)分别为SEQ ID NO:100及371；
(z)分别为SEQ ID NO:102及105；
(za)分别为SEQ ID NO:103及105；
(zb)分别为SEQ ID NO:117及118；
(zc)分别为SEQ ID NO:119及121；
(zd)分别为SEQ ID NO:120及121；
(ze)分别为SEQ ID NO:131及132；
(zf)分别为SEQ ID NO:134及136；
(zg)分别为SEQ ID NO:135及136；
(zh)分别为SEQ ID NO:131及133；
(zi)分别为SEQ ID NO:134及137；
(zj)分别为SEQ ID NO:135及137；
(zk)分别为SEQ ID NO:337及338；
(zl)分别为SEQ ID NO:339及341；及
(zm)分别为SEQ ID NO:340及341。
30.权利要求29的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链及轻链包含选自(a)至(zm)的重链及轻链。
31.权利要求30的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含SEQ ID NO:17中所述的氨基酸序列的重链、及包含SEQ ID NO:19中所述的氨基酸序列的轻链。
32.权利要求30的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：包含SEQ ID NO:18中所述的氨基酸序列的重链、及包含SEQ ID NO:19中所述的氨基酸序列的轻链。
33.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与权利要求25的抗体结合GITR上的相同表位，且(b)将权利要求25的抗体与活化T细胞上的GITR的结合抑制至少90％，如通过FACS所测量的。
34.权利要求15至33中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合成熟人GITR(SEQ ID NO:4)的PTGGPGCGPGRLLLGTGT(SEQ ID NO:217)及CRDYPGEE(SEQ ID NO:218)。
35.权利要求15至34中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体结合人GITR及食蟹猴GITR二者。
36.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
37.权利要求36的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体为IgG1抗体。
38.权利要求36的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包含无效应物IgG1Fc。
39.权利要求38的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分包含含有以下突变的无效应物IgG1Fc：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。
40.权利要求36的抗体，其中该抗体或其抗原结合部分包含具有增强的与活化性FcγR的结合的Fc。
41.前述权利要求中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述CDR区中的甲硫氨酸残基被不会经受氧化的氨基酸残基取代。
42.权利要求15至41中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分是人抗体或人源化抗体。
43.一种双特异性分子，其包含连接至具有第二结合特异性的分子的前述权利要求中任一项的抗体。
44.一种核酸，其编码权利要求1至42中任一项的抗体或其抗原结合部分的重链及/或轻链可变区。
45.一种表达载体，其包含权利要求44的核酸分子。
46.一种经权利要求45的表达载体转化的细胞。
47.一种免疫偶联物，其包含连接至药剂的权利要求1至42中任一项的抗体。
48.一种组合物，其包含权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、或免疫偶联物，以及载体。
49.一种试剂盒，其包含权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子、或免疫偶联物，以及使用说明书。
50.一种制备抗GITR抗体或其抗原结合部分的方法，其包括在权利要求46的细胞中表达该抗体或其抗原结合部分，并自该细胞分离该抗体或其抗原结合部分。
51.一种刺激抗原特异性T细胞应答的方法，其包括使T细胞与权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物接触，使得抗原特异性T细胞应答被刺激。
52.一种活化或共刺激效应物T细胞的方法，其包括使效应物T细胞与权利要求1至43及47中任一项的抗GITR抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物以及CD3接触，其中该效应物T细胞被活化或共刺激。
53.一种增加T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包括使T细胞与有效量的权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物接触。
54.一种增加T细胞增殖的方法，其包括使该细胞与有效量的权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物接触。
55.一种增加受试者的T细胞中IL-2及/或IFN-γ产生的方法，其包括施用有效量的权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，以增加来自T细胞的IL-2及/或IFN-γ产生。
56.一种减少或耗竭有需要的受试者的肿瘤中的T调控性细胞的数目的方法，包括施用有效量的权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，其中该抗体或其抗原结合部分具有效应物或增强的效应物功能，以减少该肿瘤中T调控性细胞的数目。
57.一种刺激受试者中的免疫应答的方法，其包含向该受试者施用权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，使得该受试者中的免疫应答被刺激。
58.权利要求57的方法，其中该受试者具有肿瘤，且对抗该肿瘤的免疫应答被刺激。
59.一种抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向该受试者施用权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，使得该受试者中该肿瘤的生长被抑制。
60.一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至43及47中任一项的抗体或其抗原结合部分、双特异性分子或免疫偶联物，以治疗该癌症。
61.权利要求60的方法，其中该癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结肠直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统的新生物、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相关癌症。
62.权利要求60或61的方法，其中该癌症为转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
63.权利要求56至62中任一项的方法，其进一步包括使用一种或多种其他治疗剂。
64.权利要求63的方法，其中该其他疗法为抗PD1抗体、LAG-3抗体、CTLA-4抗体或PD-L1抗体。
65.一种检测样品中糖皮质激素可诱导的TNF受体(GITR)的存在的方法，其包括使该样品与权利要求1至42中任一项的抗体或其抗原结合部分在容许该抗体或其抗原结合部分与GITR之间形成复合物的条件下接触，及检测复合物的形成。
66.一种分离的抗GITR抗体，其包含修饰的重链恒定区，所述修饰的重链恒定区包含IgG2铰链以及不属于IgG2同型的CH1、CH2及CH3中的至少一者，其中该抗GITR抗体相对于相同的但具有非IgG2铰链的抗GITR抗体具有增强的激动剂活性。
67.权利要求66的分离的抗GITR抗体，其中该修饰的重链恒定区包括：包含选自SEQ IDNO:223至226及283至290的氨基酸序列的重链恒定区、或与之有至多5个氨基酸不同或与SEQ ID NO:223至226及283至290的氨基序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链恒定区。
68.权利要求67的分离的抗GITR抗体，其中该重链包含选自下组的的氨基酸序列：SEQID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362，或与之有至多10个氨基酸不同或与SEQ ID NO:15、17、18、28、30、31、41、43、44、55、58、59、73、75、76、86、88、89、100、102、103、117、119、120、131、134、135、227-275、337、339、340、348-352、361及362的氨基酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同的重链。
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