ES2901705T3 - Anticuerpos contra el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR) y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR) y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, que se une al receptor de TNF inducible por glucocorticoides humano (GITR), que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en donde cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 13 y cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 14.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR) y usos de los mismos
Antecedentes
La proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR), una molécula coestimuladora también conocida como TNFRSF18, AITR, CD357 y GITR-D, es un miembro de la familia de receptores de TNF identificada originalmente en líneas de células T murinas tratadas con dexametasona (Nocentini et al., PNAS 1997; 94: 6216-21). Otros miembros relacionados de la familia de receptores de TNF incluyen CD40, CD27, 4-1BB y OX40. Aunque la expresión de GITR es baja en células CD4+ y CD8+ vírgenes, se expresa constitutivamente en células T reguladoras (Tone et al., PNAS 2003; 100: 15059-64). Sin embargo, una vez que se induce su expresión en las células T efectoras, la interacción de GITR promueve su activación, proliferación y producción de citocinas (Watts, Annual Reviews in Immunology 2005; 23: 23-68). Con respecto a las células T reguladoras (Treg) CD4+ CD25+, Shimizu notificó que la interacción de GITR suprime su función (Shimizu et al., Nature Immunology 2002; 3: 135-42) usando un ensayo de supresión de cultivo mixto. Sin embargo, el trabajo posterior de Stephans et al (JI 2004 15; 173 (8): 5008-20) determinó que la interacción de GITR en células T efectoras (Tef) las vuelve menos sensibles a la supresión de Treg, explicando la disminución de la supresión observada en cocultivos de células Treg-Tef. La estimulación de GITR mediada por anticuerpos DTA-1 (anticuerpos de rata anti-GITR de ratón) promueve la inmunidad antitumoral en múltiples modelos tumorales.
Los documentos WO 2011/028683 A1 y US 2014/065152 A1 describen agonistas de GITR, tales como el anticuerpo DTA-1, anticuerpos anti-GITR humanizados o humanos que reconocen GITR humano.
GITR-L, el ligando para GITR, se expresa a niveles bajos en células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células B, células dendríticas), pero se regula de forma transitoria en estas células tras la activación, por ejemplo, por infección vírica (Suvas et al., J Virol. 2005; 79: 11935-42).
Dada la necesidad continua de estrategias mejoradas para atacar enfermedades tales como el cáncer, son altamente deseables los beneficios de respuestas inmunitarias mejoradas, en particular, de respuestas de células T, nuevos agentes y métodos que modulen la actividad de GITR.
Sumario
En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, tales como anticuerpos monoclonales, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a GITR y tienen propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen la unión de alta afinidad a GITR humano, la unión a GITR de mono (por ejemplo, GITR cynomolgus) y la capacidad de estimular respuestas de células T específicas de antígeno. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para estimular respuestas de células T específicas de antígeno, tal como en un sujeto portador de tumor o portador de virus (infectado con virus) y para detectar la proteína GITR en una muestra.
La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, que se une al GITR humano y comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en donde cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 13 y cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ iD NO: 14.
En un aspecto, los anticuerpos aislados descritos en el presente documento pueden presentar al menos una de las siguientes propiedades:
(a) unión a GITR humano soluble;
(b) unión a GITR humano unido a la membrana;
(c) unión a GITR cynomolgus unido a la membrana;
(d) inducción o potenciación de activación de células T, por ejemplo, activación de células T específicas de antígeno;
(e) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR en células 3A9-hGITR;
(f) inhibición al menos parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(g) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4);
(h) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado;
(i) actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista; y
(j) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones por la unión al GITR humano con uno o más de los anticuerpos 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y 6G10.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR, descritos en el presente documento estimulan una respuesta inmunitaria antitumoral, por ejemplo, una respuesta de células T específica de antígeno. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR aumentan la producción de citocinas (por ejemplo, IL-2 y/o IFN-y) en células T que expresan GITR y/o aumentan la proliferación de células T.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR no se unen a receptores de Fc. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen a uno o más FcyR, por ejemplo, a FcyR activadores o inhibidores.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR humano soluble con una Kd de 10 nM o menos medida por Biacore, se unen a GITR humano unido a membrana con una Kd de 1 nM o menos medida por Scatchard, se unen a GITR humano unido a membrana con una CE50 de 1 nM o menos medida por FACS, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana con una CE50 de 10 nM o menos medida por FACS, inducen o potencian a la célula T, por ejemplo, célula Tef, activación sin requerir entrecruzamiento multivalente, inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR con una CE50 de 1 pg/ml o menos, medida por FACS, y/o unión dentro de las regiones PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218) de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4).
Los anticuerpos monoclonales aislados de la invención comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera idénticas a las secuencias de aminoácidos expuestas en los SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente.
Los anticuerpos monoclonales aislados de la invención pueden comprender secuencias de cadena pesada y cadena ligera al menos un 80%, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % idénticas a las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:
(a) los SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente;
(b) los SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente; y
(c) los SEQ ID NO: 18 y 19, respectivamente.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales aislados (a) se unen al mismo epítopo en GITR que 28F3, y (b) inhiben la unión de 28F3 a GITR en células T activadas en al menos un 50%, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % medido por, por ejemplo, FACS.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen dentro de las regiones PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218) de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento, se unen a GITR tanto humano como cynomolgus. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR son anticuerpos IgG1, IgG2 o IgG4, o variantes de los mismos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR comprenden una región Fc de IgG1 sin efector, por ejemplo, una región Fc de IgG1 sin efector con las siguientes mutaciones: L234A, L235E, G237A, A330S y P331S. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR comprenden una región Fc que se une a, o que tiene una unión mejorada a, un FcyR de activación, por ejemplo, en relación con una región Fc de IgG1 de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, los restos de metionina en las regiones CDR de los anticuerpos anti-GITR se sustituyen por restos de aminoácidos que no sufren oxidación. En ciertas realizaciones, Los anticuerpos anti-GITR son anticuerpos humanos o humanizados.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados que se unen a GITR, que comprenden una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra de IgG2 y al menos uno de CH1, CH2 y CH3 que no es de un isotipo IgG2, en donde el anticuerpo anti-GITR tiene una actividad agonista mejorada en relación con el mismo anticuerpo anti-GITR pero con una bisagra que no es de IgG2.
En ciertas realizaciones, la región constante de cadena pesada modificada comprende una región constante de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 223-226 y 283-290 o una región constante de cadena pesada que difiere de la misma en un máximo de 5 aminoácidos o es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 223-226 y 283-290.
En ciertas realizaciones, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15, 17, 18, 227-231, 361 y 362, o una cadena pesada que difiere de la misma en un máximo de 10 aminoácidos o es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 15, 17, 18, 227-231, 361 y 362.
En ciertas realizaciones, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 16 y 19, o una cadena ligera que difiere de la misma en un máximo de 10 aminoácidos o es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 16 y 19. Adicionalmente, la invención se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos anti-GITR y un vehículo. Adicionalmente, la invención se refiere al anticuerpo anti-GITR de la invención, para su uso en un método de tratamiento del cáncer, por ejemplo, por inmunoterapia. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de útero/cuello del útero, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer broncopulmonar, cáncer de estómago, cáncer de células germinales, cáncer de hueso, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasia del sistema nervioso central (SNC), linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma y cáncer relacionado con virus. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer metastásico, cáncer refractario o cáncer recurrente.
En ciertas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además administrar uno o más productos terapéuticos adicionales con un anticuerpo anti-GITR, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo de LAG-3, un anticuerpo de CTLA-4 y/o un anticuerpo de PD-L1.
Otras características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 28F3 (SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente), 18E10 (s Eq ID No : 39 y 40, respectivamente) y 19D3 (SEQ ID No : 26 y 27, respectivamente). Las CDR de VH y VL de 28F3 están subrayadas. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 147) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 28F3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 21) y CDR3 (SEQ ID NO: 22) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 148) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 28F3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 24) y CDR3 (SEQ ID NO: 25) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 158) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 39) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 18E10. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 46), CDR2 (SEQ ID NO: 47) y CDR3 (SEQ ID nO: 48) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 159) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 18E10. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 49), CDR2 (SEQ ID NO: 50) y CDR3 (SEQ ID NO: 51) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 154) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 19D3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 33), CDR2 (SEQ ID NO: 34) y CDR3 (SEQ ID NO: 35) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 155) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 19D3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO: 37) y CDR3 (SEQ ID NO: 38) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 162) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3C3. Las regiones CDR1 (SEQ ID nO: 62), CDR2 (SEQ ID NO: 63) y CDR3 (SEQ ID NO: 64) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 163) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) de la región variable de cadena ligera kappa (VK1) del anticuerpo monoclonal humano 3C3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 65), CDR2 (SEQ ID NO: 66) y CDR3 (SEQ ID NO: 67) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 5C muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 164) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) de la región variable de cadena ligera kappa (VK2) del anticuerpo monoclonal humano 3C3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 68), CDR2 (SEQ ID NO: 69) y CDR3 (SEQ ID NO: 70) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 168) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 71) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2G6. Las regiones CDR1 (SEQ ID nO: 78), CDR2 (SEQ ID NO: 79) y CDR3 (SEQ ID NO: 80) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 169) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 72) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 2G6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 81), CDR2 (SEQ ID NO: 82) y CDR3 (SEQ ID NO: 83) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 172) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 84) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 8A6. Las regiones CDR1 (SEQ ID No : 91), Las regiones CDR2 (SEQ ID NO: 92) y Cd R3 (SEQ ID NO: 93) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 173) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 85) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 8A6. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 94), CDR2 (SEQ ID NO: 95) y c DR3 (SEQ ID NO: 96) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 8A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 176) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 97) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 9G7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 106), CDR2 (SEQ ID NO: 107) y CDR3 (SEQ ID n O: 108) están delineadas y se indican las derivaciones V, D y J de la línea germinal.
La Figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 177) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 98) de la región variable de cadena ligera kappa (VK1) del anticuerpo monoclonal humano 9G7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 109), CDR2 (SEQ ID NO: 110) y CDR3 (SEQ ID NO: 111) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 8C muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 178) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 99) de la región variable de cadena ligera kappa (VK2) del anticuerpo monoclonal humano 9G7. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 112), CDR2 (SEQ ID NO: 113) y CDR3 (SEQ ID NO: 114) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 9A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 182) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 115) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 14E3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 122), CDR2 (SEQ ID NO: 123) y CDR3 (SEQ ID NO: 124) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 9B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 183) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 116) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 14E3. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 125), CDR2 (SEQ ID NO: 126) y CDR3 (SEQ ID NO: 127) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 10A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 186) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 128) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 19H8. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 138), CDR2 (SEQ ID NO: 139) y CDR3 (SEQ ID NO: 140) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 10B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 187) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 129) de la región variable de cadena ligera kappa (VK1) del anticuerpo monoclonal humano 19H8. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 141), CDR2 (SEQ ID NO: 142) y CDR3 (SEQ ID NO: 143) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 10c muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 188) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 130) de la región variable de cadena ligera kappa (VK2) del anticuerpo monoclonal humano 19H8. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 144), CDR2 (SEQ ID NO: 145) y CDR3 (SEQ ID NO: 146) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 11A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 353) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 335) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 6G10. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 342), CDR2 (SEQ ID NO: 343) y CDR3 (SEQ ID NO: 344) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 11B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 354) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 336) de la región variable de cadena ligera kappa del anticuerpo monoclonal humano 6G10. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 345), CDR2 (SEQ ID NO: 346) y CDR3 (SEQ ID NO: 347) están delineadas y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.
La Figura 12 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 28F3 (SEQ ID NO: 13) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33, 3-10 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 192, 193 y 196, respectivamente).
La Figura 13 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 28F3 (SEQ ID NO: 14) con las secuencias de aminoácidos de Vk L18 y JK2 de la línea germina humana (SEQ ID NO: 204 y 205, respectivamente).
La Figura 14 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 18E10 (SEQ ID NO: 39) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33, 6-19 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 192, 199 y 197, respectivamente).
La Figura 15 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 18E10 (SEQ ID NO: 40) con las secuencias de aminoácidos de Vk L15 y JK2 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 207 y 205, respectivamente).
La Figura 16 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 19D3 (SEQ ID NO: 26) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33, 3-16 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 192, 200 y 198, respectivamente).
La Figura 17 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 19D3 (SEQ ID NO: 27) con las secuencias de aminoácidos de Vk L15 y JK2 de la línea germina humana (SEQ ID NO: 207 y 205, respectivamente). La Figura 18 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 3C3 (SEQ ID NO: 52) con las secuencias de aminoácidos de Vh 4-34 y JH3 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 201 y 202, respectivamente). La Figura 19A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK1) de 3C3 (SEQ ID NO: 53) con las secuencias de aminoácidos de Vk L15 y JK2 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 207 y 205, respectivamente). La Figura 19B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK2) de 3C3 (SEQ ID NO: 54) con las secuencias de aminoácidos de Vk L20 y JK2 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 208 y 206, respectivamente). La Figura 20 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 2G6 (SEQ ID NO: 71) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 192 y 197, respectivamente). La Figura 21 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2G6 (SEQ ID NO: 72) con las secuencias de aminoácidos de Vk L15 y JK2 de la línea germina humana (SEQ ID NO: 207 y 205, respectivamente). La Figura 22 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 8A6 (SEQ ID NO: 84) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33, 3-10 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 192, 193 y 197, respectivamente).
La Figura 23 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 8A6 (SEQ ID NO: 85) con las secuencias de aminoácidos de Vk L18 y JK2 de la línea germina humana (SEQ ID NO: 204 y 205, respectivamente). La Figura 24 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 9G7 (SEQ ID NO: 97) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-15, 3­ 10 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ iD NO: 203, 194 y 198, respectivamente).
La Figura 25A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK1) de 9G7 (SEQ ID NO: 98) con las secuencias de aminoácidos de Vk A27 y JK1 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 209 y 210, respectivamente). La Figura 25B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK2) de 9G7 (SEQ ID NO: 99) con las secuencias de aminoácidos de Vk A27 y JK5 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 209 y 212, respectivamente). La Figura 26 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 14E3 (SEQ ID NO: 115) con las secuencias de aminoácidos de Vh 4-34 y JH3 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 201 y 202, respectivamente). La Figura 27 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 14E3 (SEQ ID NO: 116) con las secuencias de aminoácidos de Vk L15 y JK1 de la línea germina humana (SEQ ID NO: 207 y 211, respectivamente). La Figura 28 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 19H8 (SEQ ID NO: 128) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33, 3-10 y JH6 de la línea germinal humana (SeQ ID NO: 192, 195 y 196, respectivamente). La Figura 29A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK1) de 19H8 (SEQ ID NO: 129) con las secuencias de aminoácidos de Vk L18 y JK1 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 204 y 211, respectivamente). La Figura 29B muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK2) de 19H8 (SEQ ID NO: 130) con las secuencias de aminoácidos de Vk L6 y JK4 de la línea germinal humana (SeQ ID NO: 213 y 214, respectivamente).
La Figura 30 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 6G10 (SEQ ID NO: 335) con las secuencias de aminoácidos de Vh 3-33, 3-10 y JH6 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 192, 195 y 196, respectivamente).
La Figura 31 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (VK1) de 6G10 (SEQ ID NO: 336) con las secuencias de aminoácidos de Vk L18 y JK2 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 204 y 205, respectivamente).
La Figura 32 muestra la afinidad de unión (en nM) de varios anticuerpos anti-GITR para células T humanas activadas, sin anticuerpos, con anticuerpos IgG1 y hIgG2 como controles, evaluada por FACS.
La Figura 33 muestra la afinidad de unión (en nM) de varios anticuerpos anti-GITR para células T de cynomolgus activadas, sin anticuerpos y con anticuerpos hIgG1 y hIgG2 como controles, evaluada por FACS.
Las Figuras 34A y 34B muestran la capacidad de varios anticuerpos anti-GITR para inhibir la unión del ligando de GITR (GITR-L) a células GITR 3A9, con hIgG1, hIgG2, sin anticuerpos y con células solas como controles.
La Figura 34C muestra la unión de GITR-L recombinante a células T c D4 y CD8 humanas activadas.
La Figura 34D muestra que GITR-L bloquea parcialmente la unión de 28F3-hIgG1 a células T CD4+ humanas activadas. La unión de 28F3-hIgG1 a una concentración fija de 0,5 pg/ml a las células T activadas se bloqueó parcialmente por GITR-L previamente unido con una CI50 de 0,0024 pg/ml.
La Figura 34E muestra que 28F3-hIgG1 no bloquea la unión de 0,6 pg/ml de GITR-L a células T humanas activadas. Cuando se añadió GITR-L a células T CD4+ a 0,6 mg/ml, aproximadamente un 90 % de saturación, 28F3-hIgG1 unido previamente no pudo bloquear GITR-L en un intervalo de 100 mg/ml a 0,00056 mg/ml.
La Figura 34F muestra que 28F3-hIgG1 bloquea parcialmente la unión de 0,02 pg/ml de GITR-L a células T humanas activadas. La unión de GITR-L a una concentración fija de 20 ng/ml a las células T activadas se bloqueó parcialmente por 28F3-hIgG1 unido previamente con una CI50 de 0,075 pg/ml.
La Figura 35A muestra una transferencia Western que demuestra que el anticuerpo anti-GITR 28F3 se une al GITR humano nativo, pero no desnaturalizado, y que la unión no se ve afectada por la presencia o ausencia de N-glucosilación. Un signo "+" indica muestras tratadas con PNGasa F para eliminar la N-glucosilación.
La Figura 35B es un gel teñido con azul de Coomassie que muestra la presencia de todas las formas de GITR humano antes de transferirlo a la nitrocelulosa para el análisis de transferencia Western.
La Figura 36A-36B muestra la unión de los anticuerpos 28F3 y 3C3 a fragmentos de GITR nativo generados por digestión con Endoproteinasa Arg-C (1), Endoproteinasa Lys-C (2), Tripsina (3), Endoproteinasa Glu-C (4) o Endoproteinasa Asp-N (5).
La Figura 37 muestra una vista de mapa de calor del anticuerpo anti-GITR 28F3 que se une a fragmentos peptídicos de GITR humano generados por la digestión de una proteína GITR humana nativa con Endoproteinasa Glu-C y Tripsina ("Glu-C y Tripsina"), Endoproteinasa Arg-C ("Arg-C"), Endoproteinasa Lys-C y Tripsina ("Lys-C y Tripsina"), Tripsina o Endoproteinasa Asp-N y Endoproteinasa Glu-C ("AspN y GluC"), que identifica la ubicación del epítopo al que se une el anticuerpo 28F3 (región encuadrada). La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular maduro del GITR humano se muestra en gris oscuro y la secuencia de Fc de ratón, unido por el extremo C al mismo se muestra en gris claro.
La Figura 38A muestra los péptidos en la fracción que fluye, después de la incubación de perlas recubiertas con 28F3 con péptidos resultantes de una digestión con tripsina de GITR humano nativo.
La Figura 38B muestra dos péptidos unidos a 28F3 principales (indicados por un asterisco).
La Figura 38C muestra la identificación por LC-Ms del primero de los dos picos de la Figura 34B como correspondiente al péptido N-terminal que tiene la secuencia mostrada y que carece de O-glucosilación.
La Figura 38D muestra la identificación por LC-MS del segundo de los dos picos de la Figura 34B como correspondiente al péptido N-terminal que tiene la secuencia mostrada y que tiene una O-glucosilación en T20. La Figura 38E muestra el péptido GITR que queda después de la digestión in situ con endoproteinasa Asp-N de un péptido más largo que se incubó junto con 28F3.
La Figura 39A muestra una lista de péptidos pépticos para GITR/Fc humano recombinante y complejo proteico de GITR/Fc humano recombinante y 28F3 IgG1, logrando una cobertura de secuencia del 86 % para la región N-terminal de GITR.
La Figura 39B muestra los niveles de absorción de deuterio por espectrometría de masas (MS) HDX en ausencia/presencia del mAb 28F3 IgG1 ("GITR.6").
La Figura 39C representa las dos regiones en GITR humano maduro unido por 28F3, determinadas por HDX MS. La Figura 40 muestra los efectos de diversos anticuerpos anti-GITR agonistas sobre la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR en presencia de anticuerpos anti-CD3 unidos a placas.
La Figura 41A muestra los efectos de los anticuerpos anti-GITR agonistas 18E10, 13H2 (igual que 28F3) y 28F3 sobre la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR activadas por un antígeno específico.
La Figura 41B muestra los efectos de los anticuerpos anti-GITR agonistas 3C3 (mostrados como "GITR.3"), 28F3, 19D3 y 18E10 sobre la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR activadas por un antígeno específico.
La Figura 42A muestra los efectos de diversos anticuerpos anti-GITR agonistas HuMab sobre la secreción de interferón gamma (IFN-y) por células T estimuladas con células CHO-OKT3 (es decir, células CHO que expresan OKT3 scfv).
La Figura 42B muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR agonista 28F3 sobre la secreción de IL-2 por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan OKT3, en donde las células T proceden de un primer donante. La Figura 42C muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 sobre la secreción de IFN-y por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan o KT3, en donde las células T proceden del primer donante.
La Figura 42D muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 sobre la secreción de IL-2 por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan OKT3, en donde las células T proceden de un segundo donante. La Figura 42E muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 sobre la secreción de IFN-y por células T CD4+ estimuladas con células CHO que expresan o KT3, en donde las células T proceden del segundo donante.
La Figura 43 muestra los efectos del anticuerpo anti-GITR 28F3 (IgG2), el fragmento 28F3-F(ab')2 y 28F3-Fab sobre la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR estimuladas con células LK35.2 en presencia del péptido HEL48-63.
La Figura 44 muestra la inmunohistoquímica de muestras de amígdalas humanas con el anticuerpo monoclonal 28F3-FITC.
Las Figuras 45A-45D muestran los efectos de diferentes isotipos del anticuerpo GITR anti-ratón de rata, DTA-1, sobre la actividad antitumoral medida por cambios en los volúmenes tumorales en ratones individuales tratados con estos isotipos en un modelo de adenocarcinoma de colon MC38: (Figura 45A) anticuerpo IgG1 de ratón de control (10 mg/kg); (Figura 45B) IgG2b de rata DTA-1 (10 mg/kg); (Figura 45C) IgG1 de ratón DTA-1 (10 mg/kg); (Figura 45D) IgG2a de ratón DTA-1 (10 mg/kg). Se muestra el número de ratones libres de tumor (TF) por grupo para cada grupo de 10 ratones.
Las Figuras 46A y 46B muestran los cambios en la media (Figura 46A) y mediana (Figura 46B) de volúmenes tumorales medios de tumores MC38 en grupos de ratones tratados con anticuerpos DTA-1 (10 mg/kg) de diferentes isotipos.
Las Figuras 47A-47F muestran un análisis de citometría de flujo de bazos (Figuras 47A-47C) y linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) (Figuras 47D-47F) de ratones portadores de tumor MC38 tratados con diferentes isotipos de anti-GITR (DTA-1) y anti-CTLA-4 (9d9) y el anticuerpo de control indicado. (Figura 47A) Porcentaje de células T CD8+ en el bazo; (Figura 47B) Porcentaje de células CD4+ en el bazo; (Figura 47C) Porcentaje de células CD4+ que también son Foxp3+ en el bazo; (Figura 47D) Porcentaje de células T CD8+ en TIL; (Figura 47E) Porcentaje de células CD4+ en TIL; (Figura 47F) Porcentaje de células CD4+ que también son Foxp3+ en TIL.
Las Figuras 48A-48F muestran los efectos de diferentes isotipos del anticuerpo GITr anti-ratón de rata, DTA-1, rediseñado por ingeniería genética para minimizar la agregación (denominado "mGITR.7"), sobre la actividad antitumoral medida por cambios en los volúmenes tumorales en ratones individuales tratados con estos isotipos en un modelo MC38: (Figura 48A) anticuerpo IgG1 de ratón de control; (Figura 48B) mIgG1 mGITR.7; (Figura 48C) mGITR.7 mIgGl-D265A; (Figura 48D) mIgG2a mGITR.7; (Figura 48E) mIgG2b mGITR.7; (Figura 48F) IgG2b de rata mGITR.7. Se muestra el número de ratones TF por grupo para cada grupo de 9 ratones.
Las Figuras 49A y 49B muestran los cambios en la media (Figura 49A) y mediana (Figura 49B) de volúmenes tumorales medios de tumores MC38 en grupos de ratones tratados con anticuerpos DTA-1 rediseñados por ingeniería genética de diferentes isotipos.
Las Figuras 50A y 50B muestran un análisis de citometría de flujo de los efectos de diferentes isotipos de DTA-1 (DTA-1 "mGITR" rediseñado por ingeniería genética o los anticuerpos "DTA-1" diseñados por ingeniería genética originalmente) e isotipos de anti-CTLA-4 (9D9) en Treg Foxp3+/CD4+ en bazos (Figura 50A) y TIL (Figura 50B) de ratones portadores de tumor MC38.
Las Figuras 51A-51E muestran la actividad antitumoral de diferentes isotipos de DTA-1 de ratón en un modelo de ratón de fibrosarcoma Sa1 N medido por los cambios en los volúmenes tumorales de ratones individuales tratados con estos isotipos: (Figura 51A) anticuerpo IgG1 de ratón de control; (Figura 51B) IgG2a de ratón DTA-1; (Figura 51C) IgG2b de rata DTA-1; (Figura 51D) IgG1 de ratón DTA-1; (Figura 51E) IgG1 de ratón DTA-1-D265A. Se muestra el número de ratones TF por grupo para cada grupo de hasta 10 ratones.
Las Figuras 52A y 52B muestran los cambios en la media (Figura 52A) y mediana (Figura 52B) de volúmenes tumorales de tumores Sa1N en grupos de ratones tratados con anticuerpos DTA-1 de diferentes isotipos.
Las Figuras 53A y 53B muestran los efectos de diferentes isotipos de DTA-1 y anti-CTLA-4 (9D9) en Treg Foxp3+/CD4+ en bazos (Figura 53A) y TIL (Figura 53B) de ratones portadores de tumor Sa1 N.
Las Figuras 54A-54D muestran los efectos del anticuerpo anti-GITR de rata, DTA-1, sobre el volumen tumoral usando un modelo de adenocarcinoma de colon MC38 estadificado. Los ratones se trataron con (Figura 54A) mIgG1 de control, (Figura 54B) mIgG DTA-1, (Figura 54C) mIgG PD-1 y (Figura 54D) PD-1 d Ta -1 los días 7, 10 y 14. Se muestra el número de ratones libres de tumor (TF) por grupo para cada grupo de 10 ratones. Las Figuras 55A y 55B muestran el efecto de diversas combinaciones de mutaciones en la CDR3 de VH en el anticuerpo anti-GITR 28F3 sobre la unión a células 3A9-hGITR.
La Figura 56A-56F muestra el efecto de varias combinaciones de mutaciones en la CDR3 de VH en el anticuerpo anti-GITR 28F3 sobre el nivel de secreción de IL-2 de células 3A9-hGITR en presencia anti-CD3 unido a placas. La Figura 57 muestra la afinidad de unión de los anticuerpos anti-GITR indicados para células T activadas. Los anticuerpos probados comprendían una de las siguientes regiones constantes de cadena pesada: una región constante de IgG1 ("anti-GITR.glf'), una región constante de IgG1 sin efector ("anti-GITR.g1.1f'), una región constante de IgG2 ("anti-GITR-G2"), una bisagra de IgG2 y un dominio Fc de IgG1 ("anti-GITR.G2.G1f') y una bisagra de IgG2 y un dominio Fc de IgG1 sin efector ("anti-GITR.G2.G1.1f').
Las Figuras 58A-58C muestran la secreción de IFN-y e IL-2 a partir de células T CD4 donantes estimuladas con anticuerpos anti-GITR humano solubles con diferentes regiones constantes de cadena pesada. La Figura 58A muestra la secreción de IFN-y de células T CD4 donantes estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y diversas concentraciones de anticuerpos anti-GITR humano con una región constante IgG2-IgG1. La Figura 58B muestra la secreción de IL-2 a partir de células T CD4 donantes estimuladas con células CHO que expresan OKT3 y diversas concentraciones de un dominio constante de cadena pesada de IgG1 o un dominio constante de cadena pesada híbrida de IgG2-IgG1. La Figura 58C muestra la secreción de IL-2 de células T CD4 donantes estimuladas con células HO que expresan OKT3 y diversas concentraciones de versiones sin efector (IgG1.1) de los anticuerpos de las Figuras 55A y B.
La Figura 59 muestra una comparación de los anticuerpos anti-GITR indicados sobre la secreción de IL-2 de células 3A9-hGITR en presencia de anti-CD3 unido a placas.
Las Figuras 60A-60D muestran el efecto de 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 sobre la proliferación de células Treg y Teff. Las Figuras 61A-61F muestran el efecto de 28F3.IgG1 ("GITR.6IgG1") y 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1") sobre la lisis inducida por células NK de células CD4+ activadas, células CD8+ y células enriquecidas en Treg de dos donantes diferentes.
Las Figuras 62A-62C muestran el efecto de un anticuerpo de hIgG1 de control, 28F3.IgG1 ("IgG1 anti-GITR") y 28F3.IgG1.1 ("IgG1.1 anti-GITR") sobre el crecimiento de tumores MC38.
Las Figuras 63A y 63B muestran la media del volumen y la mediana del volumen, respectivamente, de tumores MC38 en ratones tratados con anticuerpo hIgG1 de control, 28F3.IgG1 ("IgG1 anti-GITR") y 28F3.IgG1.1 ("IgG1.1 anti-GITR").
Las Figuras 64A y 64B muestran la media en % del cambio de peso corporal y la mediana en % del cambio de peso corporal, respectivamente, de ratones con tumores MC38 tratados con anticuerpo hIgG1 de control, 28F3.IgG1 ("IgG1 anti-GITR") y 28F3.IgG1.1 ("IgG1.1 anti-GITR").
La Figura 65 muestra los efectos de 28F3.IgG1 ("IgG1 GITR"), con respecto al control de isotipo, sobre el agotamiento de células Treg en el modelo de tumor MC38.
La Figura 66 muestra los efectos de 28F3.IgG1 ("IgG1 GITR"), con respecto al control de isotipo, sobre el porcentaje de células T CD8+ en el modelo tumoral MC38.
La Figura 67 muestra el efecto de 28F3.IgG1 soluble y entrecruzado ("GITR.6IgG1") y 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1") sobre la secreción de IFN-y de células T cuando se cultivan conjuntamente con células CHO-OKT3 y CHO-OKT3-CD32a.
La Figura 68 muestra el efecto de 28F3.IgG1 soluble y entrecruzado ("GITR.6IgG1") y 28F3.IgG1.1 ("GITR.6IgG1.1") sobre la proliferación de células T cuando se cultivan conjuntamente con células CHO-OKT3 y CHO-OKT3-CD32a.
Descripción detallada
En el presente documento se describen anticuerpos aislados, en particular anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a GITR y, por lo tanto, activan la señalización de GITR aguas abajo ("anticuerpos agonistas anti-GITR"). Los anticuerpos descritos en el presente documento derivan de secuencias de línea germinal de cadena pesada y ligera particulares y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. en el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, métodos para fabricar tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden dichos anticuerpos, y composiciones farmacéuticas formuladas para contener los anticuerpos. En el presente documento también se proporcionan métodos para usar los anticuerpos para mejorar la respuesta inmunitaria, solos o en combinación con otros agentes inmunoestimuladores (por ejemplo, anticuerpos) y/o terapias para el cáncer. En consecuencia, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden usarse en un tratamiento en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas, que incluyen, por ejemplo, la inhibición del crecimiento tumoral y el tratamiento de infecciones víricas.
La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, que se une al GITR humano y que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en donde cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 13 y cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 14.
Definiciones
Para que la presente descripción pueda entenderse más fácilmente, se definen en primer lugar determinados términos. A lo largo de la descripción detallada se establecen definiciones adicionales.
La expresión "receptor de TNF inducible por glucocorticoides" o "GITR" como se usa en el presente documento se refiere a un receptor que es miembro de la superfamilia de receptores de TNF, que se une al ligando de GITR (GITR-L). GITR también se conoce como superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 18 (TNFRSF18), AITR y CD357. El término "GITR" incluye cualquier variante o isoforma de GITR que las células expresan de forma natural. En consecuencia, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden reaccionar de forma cruzada con GITR de especies distintas a las humanas (por ejemplo, GITR cynomolgus). Como alternativa, los anticuerpos pueden ser específicos para GITR humano y pueden no presentar reactividad cruzada con otras especies. GITR o cualquiera de sus variantes e isoformas, puede aislarse a partir de células o tejidos que los expresan naturalmente o producirse de manera recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo y/o las descritas en el presente documento.
Se han identificado tres isoformas de GITR humano, todas las cuales comparten el mismo dominio extracelular, a excepción de su porción C-terminal. La variante 1 (N.° de registro NP_004186; SEQ ID NO: 1) consiste en 241 aminoácidos y representa el transcrito más largo. Contiene un segmento codificante adicional que conduce a un cambio de marco, en comparación con la variante 2. La proteína resultante (isoforma 1) contiene un extremo C distinto y más corto, en comparación con la isoforma 2. La variante 2 (N.° de registro NP_683699; SEQ ID NO: 2) codifica la proteína más larga (isoforma 2), que consiste en 255 aminoácidos, y es soluble. La variante 3 (N.° de registro NP_683700; SEQ ID NO: 3) contiene un segmento codificante adicional que conduce a un cambio de marco, en comparación con la variante 2. La proteína resultante (isoforma 3) contiene un extremo C distinto y más corto, en comparación con la isoforma 2, y consiste en 234 aminoácidos.
A continuación se muestran las secuencias de aminoácidos de las tres isoformas de GITR humano conocidas, GITR cyno y GITR-L.
Isoforma 1 de GITR humano (N.° de registro NP_004186; SEQ ID NO: 1; codificada por la secuencia de nucleótidos que tiene el N.° de registro NM_004195.2):
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRC
CRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDC
ASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAV
AACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEE
KGRLGDLWV
Isoforma 2 de GITR humano (N.° de registro NP_683699.1; SEQ ID NO: 2; codificada por la secuencia de nucleótidos que tiene el N.° de registro n M_148901.1):
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRC
CRDYPGEECCSEWDCMCYQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDC
ASGTFSGGHEGHCKPWTDCCWRCRRRPKTPEAASSPRKSGASDRQRRRGGWETCGCEP
GRPPGPPTAASPSPGAPQAAGALRSALGRALLPWQQKWVQEGGSDQRPGPCSSAAAAG
PCRRERETQSWPPSSLAGPDGVGS
Isoforma 3 de GITR humano (N.° de registro NP_683700.1; SEQ ID NO: 3; codificada por la secuencia de nucleótidos que tiene el N.° de registro n M_148902.1):
MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRC
CRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDC
ASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAV
AACVLLLTSAQLGLHIWQLRKTQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDL
WV
La secuencia señal de las isoformas 1-3 corresponde a los aminoácidos 1-25. Por lo tanto, las isoformas maduras 1, 2 y 3 consisten en los aminoácidos 26 a 241,255 o 234, respectivamente. El dominio extracelular de GITR maduro consiste en los aminoácidos 26-162 y tiene la secuencia de aminoácidos:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGD
PCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTV
FPGNKTHNAVCVPGSPPAEP (SEQ ID NO: 4)
Secuencia de la proteína GITR cynomolgus (SEQ ID NO: 5):
MCASGTLCCLALLCAASLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGKDARCCRVHPTRCCRDYQGE
ECCSEWDCVCVQPEFHCGNPCCTTCQHHPCPSGQGVQPQGKFSFGFRCVDCALGTFSR
GHDGHCKPWTDCTQFGFLT VFPGNKTHN A VC VPGSPPAEPPGWLTIILLA V AAC VLLLT
SAQLGLHIWQLRSQPTGPRETQLLLEVPPSTEDASSCQFPEEERGERLAEEKGRLGDLWV
Secuencia de la proteína GITR-L humana (N.° de registro NP_005083.2; SEQ ID NO: 6):
MTLHPSPITCEFLFSTALISPKMCLSHLENMPLSHSRTQGAQRSSWKLWLFCSIVMLLFLC
SFSWLIFIFLQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYG
Q V APN AN YND V APFE VRLYKNKDMIQTLTNKS KIQN V GGT YELH V GDTIDLIFNSEHQ V
LKNNTYWGIILLANPQFIS
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porciones de unión a antígeno'') o cadenas sencillas de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere, en una realización, a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una región constante de cadena pesada. En ciertos anticuerpos naturales, la región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. En ciertos anticuerpos naturales, cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, Cl . Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
Los anticuerpos normalmente se unen específicamente a su antígeno homólogo con alta afinidad, reflejado por una constante de disociación (Kd) de 10-5 a 10-11 M o menos. Generalmente se considera que cualquier Kd superior a aproximadamente 10-4 M indica unión inespecífica. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente" a un antígeno se refiere a un anticuerpo que se une al antígeno y a antígenos sustancialmente idénticos con alta afinidad, lo que significa que tiene una Kd de 10-7 M o menos, preferentemente de 10-8 M o menos, incluso más preferentemente de 5 x 10-9 M o menos y, aún más preferentemente, entre 10-8 M y aproximadamente 10­ 10 M o menos, pero no se unen con alta afinidad a antígenos no relacionados. Un antígeno es "sustancialmente idéntico" a un antígeno dado si presenta un alto grado de identidad de secuencia con el antígeno dado, por ejemplo, si presenta al menos el 80 %, al menos el 90 %, preferentemente al menos el 95 %, más preferentemente al menos el 97 % o incluso más preferentemente al menos el 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del antígeno dado. A modo de ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a GITR humano también puede tener reactividad cruzada con antígenos GITR de ciertas especies de primates (por ejemplo, GITR cynomolgus), pero no puede reaccionar de forma cruzada con antígenos GITR de otras especies o con un antígeno que no sea GITr .
Una inmunoglobulina puede proceder de cualquiera de los isotipos conocidos habitualmente, incluyendo, pero sin limitación, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. El isotipo IgG se divide en subclases en ciertas especies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 en ratones. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento son del subtipo IgG1 o IgG2. Las inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG1, existen en varios alotipos, que difieren entre sí, a lo sumo, en algunos aminoácidos. "Anticuerpo" incluye, a modo de ejemplo, anticuerpos tanto naturales como no naturales; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos y no humanos; anticuerpos totalmente sintéticos; y anticuerpos monocatenarios.
La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, GITR humano). Tales "fragmentos" son, por ejemplo, de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 1500 aminoácidos de longitud, convenientemente de entre aproximadamente 8 y aproximadamente 745 aminoácidos de longitud, convenientemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 300, por ejemplo, de aproximadamente 8 a aproximadamente 200 aminoácidos, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 o 100 aminoácidos de longitud. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl , Vh , CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward et al,. (1989) Nature 341, 544-546), que consiste en un dominio Vh ; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que opcionalmente pueden estar unidas mediante un enlazador sintético. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh , están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite que se formen como una sola cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo abarque estos anticuerpos monocatenarios. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se seleccionan en función de su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Un "anticuerpo bifuncional" o "biespecífico" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante varios métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular o una composición de anticuerpos en la que todos los anticuerpos muestran una sola especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular. En consecuencia, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo o composición de anticuerpo que muestra una sola especificidad de unión y que tiene regiones constantes opcionales y variables derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante y combinatoria de anticuerpos humanos y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias particulares de inmunoglobulina de la línea germinal humana que están codificadas por los genes de la línea germinal, pero incluyen reordenamientos posteriores y mutaciones que se producen, por ejemplo, durante la maduración de los anticuerpos. Como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125), la región variable contiene el dominio de unión a antígeno, que está codificado por varios genes que se reordenan para formar un anticuerpo específico para un antígeno extraño. Además del reordenamiento, la región variable puede modificarse aún más mediante múltiples cambios de aminoácidos individuales (denominados mutación somática o hipermutación) para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno extraño. La región constante cambiará en respuesta además a un antígeno (es decir, cambio de isotipo). Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico reordenadas y mutadas somáticamente que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina de cadena ligera y cadena pesada en respuesta a un antígeno pueden no tener identidad de secuencia con las moléculas de ácido nucleico originales, pero en cambio serán sustancialmente idénticas o similares (es decir, tendrán al menos un 80% de identidad).
Un anticuerpo "humano" (HuMAb) se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables en las que las regiones marco y las CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden incluir restos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Las expresiones anticuerpos "humanos" y anticuerpos "completamente humanos" se usan como sinónimos.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que algunos, la mayor parte o la totalidad de los aminoácidos fuera de los dominios de CDR de un anticuerpo no humano se han reemplazado con aminoácidos correspondientes derivados de inmunoglobulinas humanas. En una realización de una forma humanizada de un anticuerpo, algunos, la mayor parte o todos los aminoácidos fuera de los dominios de CDR se han reemplazado con aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, la mayor parte o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR permanecen sin cambios. Se permiten pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre que no anulen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno particular. Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones variables derivan de una especie y las regiones constantes derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las regiones variables derivan de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes derivan de un anticuerpo humano.
Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE) que está codificado por los genes de la región constante de cadena pesada.
"Alotipo" se refiere a variantes naturales dentro de un grupo de isotipos específico, difiriendo dichas variantes en unos pocos aminoácidos (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser de cualquier alotipo. Como se usa en el presente documento, Los anticuerpos denominados isotipo "IgG1f' o "IgG1.1f" son anticuerpos IgG1 e IgG1.1 sin efector, respectivamente, del alotipo "f", es decir, que tienen 214R, 356E y 358M de acuerdo con el índice de EU tal como se indica en Kabat, como se muestra, por ejemplo, en el SEQ ID NO: 7 (véanse los restos subrayados en el SEQ ID NO: 7 de la Tabla 11).
Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une de manera especifica a GITR está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen de manera específica a antígenos que no sean GITR). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de GITR puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otras proteínas GITR de diferentes especies.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "inhibe la unión de GITR-L a GITR" se refiere a un anticuerpo que inhibe la unión de GITR-L a GITR, por ejemplo, en ensayos de unión que usan células 3A9-hGITR, con una CE50 de aproximadamente 1 pg/ml o menos, tal como de aproximadamente 0,9 pg/ml o menos, aproximadamente 0,85 pg/ml o menos, aproximadamente 0,8 pg/ml o menos, aproximadamente 0,75 pg/ml o menos, aproximadamente 0,7 pg/ml o menos, aproximadamente 0,65 pg/ml o menos, aproximadamente 0,6 pg/ml o menos, aproximadamente 0,55 pg/ml o menos, aproximadamente 0,5 pg/ml o menos, aproximadamente 0,45 pg/ml o menos, aproximadamente 0,4 pg/ml o menos, aproximadamente 0,35 pg/ml o menos, aproximadamente 0,3 pg/ml o menos, aproximadamente 0,25 pg/ml o menos, aproximadamente 0,2 pg/ml o menos, aproximadamente 0,15 pg/ml o menos, o aproximadamente 0,1 |jg/ml o menos, en métodos reconocidos en la técnica, por ejemplo, los ensayos de unión basados en FACS descritos en el presente documento.
Una "función efectora" se refiere a la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor o ligando de Fc, o un acontecimiento bioquímico que resulta de la misma. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen unión a Clq, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, funciones efectoras mediadas por FcyR tales como ADCC y fagocitosis mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCP) y regulación negativa de un receptor de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B; BCR). Dichas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo).
Un "receptor de Fc" o "FcR" es un receptor que se une a la región Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen a un anticuerpo IgG comprenden receptores de la familia FcyR, que incluyen variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. La familia FcyR consiste en tres receptores activadores (FcyRI, FcyRIII y FcyRIV en ratones; FcyRIA, FcyRIIA y FcyRIIIA en humanos) y un receptor inhibidor (FcyRIIB). En la tabla 1 se resumen varias propiedades de FcyR humanos. La mayoría de los tipos de células efectoras innatas coexpresan uno o más FcyR activadores y el FcyRIIB inhibidor, mientras que las células citolíticas naturales (NK) expresan selectivamente un receptor de Fc activador (FcyRIII en ratones y FcyRIIIA en humanos) pero no el FcyRIIB inhibidor en ratones y humanos. La IgGI humana se une a la mayoría de los receptores de Fc humanos y se considera equivalente a la lgG2a murina con respecto a los tipos de receptores de Fc activadores a los que se une.
Tabla 1. Pro iedades de los Fc R humanos
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Una "región Fc" (región de fragmento cristalizable) o "dominio Fc" o "Fc" se refiere a la región C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo que media la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo la unión a receptores de Fc localizados en varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) o al primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. Por lo tanto, una región Fc comprende la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante (por ejemplo, CH1 o CL). En los isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc comprende dos fragmentos de proteína idénticos, derivados del segundo (Ch2) y tercer (Ch3) dominios constantes de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; las regiones Fc de IgM e IgE comprenden tres dominios constantes de cadena pesada (dominios Ch 2-4) en cada cadena polipeptídica. En el caso de IgG, la región Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3 y la bisagra entre Cy1 y Cy2. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana generalmente se define como una extensión desde un resto de aminoácido en la posición C226 o P230 (o aminoácido entre estos dos aminoácidos) hasta el extremo carboxilo de la cadena pesada, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de EU tal como se indica en Kabat. El dominio Ch2 de una región Fc de IgG humana se extiende desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente el aminoácido 340, mientras que el dominio Ch3 está situado en el lado C-terminal de un dominio Ch2 en una región Fc, es decir, se extiende desde aproximadamente el aminoácido 341 hasta aproximadamente el aminoácido 447 de una IgG. Como se usa en el presente documento, la región Fc puede ser una Fc de secuencia nativa, incluyendo cualquier variante alotípica, o una Fc variante (por ejemplo, una Fc no natural). Fc también puede referirse a esta región de forma aislada o en el contexto de un polipéptido de proteína que comprende Fc tal como una "proteína de unión que comprende una región Fc", también denominada "proteína de fusión Fc" (por ejemplo, un anticuerpo o inmunoadhesina).
Una "región Fc de secuencia nativa" o "Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de lgG1 humana de secuencia nativa; región Fc de lgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de lgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de lgG4 humana de secuencia nativa, así como sus variantes naturales. La Fc secuencia nativa incluye los diversos alotipos de Fc (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
Una "bisagra", "dominio bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra de anticuerpo" se refiere al dominio de una región constante de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2 e incluye la porción superior, media e inferior de la bisagra (Roux et al. J. Immunol. 1998 161: 4083). La bisagra proporciona niveles variables de flexibilidad entre las regiones de unión y efectora de un anticuerpo y también proporciona sitios para la formación de enlaces disulfuro intermoleculares entre las dos regiones constantes de cadena pesada. Como se usa en el presente documento, una bisagra comienza en Glu216 y termina en Gly237 para todos los isotipos de IgG (Roux et al., 1998 J Immunol 161: 4083). En las Tablas 2 y 9 se muestran las secuencias de bisagras de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de tipo silvestre.
Tabla 2.
Aminoácidos de la región bisagra
Tipo de Ig Ch1 C-terminal* Bisagra superior Bisagra media Bisagra inferior IgGl VDKRV EPKSCDKTHT CPPCP APELLGG
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 301) (SEQ ID NO: 305) (SEQ ID NO: 313) IgG2 VDKTV ERK CCVECPPCP APPVAG
(SEQ ID NO: 300) (SEQ ID NO: 306) (SEQ ID NO: 314) IgG3 VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG
(17-15-15-15) (SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 302) (EPKSCDTPPPCPRCP)a (SEQ ID NO: 313)
(SEQ ID NO: 307)
IgG3 (17-15-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 302) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 (SEQ ID NO: 313) (SEQ ID NO: 308)
IgG3 (17-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG (SEQ ID
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 302) (EPKSCDTPPPCPRCP)1 NO: 313)
SEQ ID NO: 309)
IgG3 (15-15-15) VDKRV EPKS (CDTPPPCPRCP APELLGG (SEQ ID
(SEQ ID NO: 299) (SEQ ID NO: 303) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 NO: 313)
(SEQ ID NO: 310)
IgG3 (15) VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG
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* Secuencias de aminoácidos C-terminales de los dominios CH1.
El término "bisagra" incluye bisagras de tipo silvestre (tales como las expuestas en la Tabla 11), así como variantes de las mismas (por ejemplo, bisagras no naturales o bisagras modificadas). Por ejemplo, la expresión "bisagra de IgG2" incluye la bisagra de IgG2 de tipo silvestre, como se muestra en la Tabla 11, y variantes que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como máximo 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Las variantes de bisagra de IgG2 a modo de ejemplo incluyen bisagras de IgG2 en las que 1, 2, 3 o las 4 cisteínas (C219, C220, C226 y C229) se cambian por otro aminoácido. En una realización específica, una IgG2 comprende una sustitución C219S. En ciertas realizaciones, una bisagra es una bisagra híbrida que comprende secuencias de al menos dos isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede comprender la bisagra superior, media o inferior de un isotipo y el resto de la bisagra de uno o más de otros isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede ser una bisagra de IgG2/IgG1 y puede comprender, por ejemplo, las bisagras superior y media de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1. Una bisagra puede tener función efectora o carecer de función efectora. Por ejemplo, la bisagra inferior de IgG1 de tipo silvestre proporciona función efectora.
La expresión "dominio CH1" se refiere a la región constante de cadena pesada que une el dominio variable a la bisagra en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en el presente documento, un dominio CH1 comienza en A118 y termina en V215. La expresión "dominio CH1" incluye dominios CH1 de tipo silvestre (tales como los que tienen el SeQ ID NO: 278 para IgG1 y el SEQ ID NO: 279 para IgG2; Tabla 11), así como sus variantes (por ejemplo, dominios CH1 no naturales o dominios CH1 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH1" incluye dominios CH1 de tipo silvestre y variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Los dominios CH1 a modo de ejemplo incluyen dominios CH1 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como la ADCc , CDC o semivida. En el presente documento se proporcionan modificaciones en el dominio CH1 que afectan a la actividad biológica de un anticuerpo.
La expresión "dominio CH2" se refiere a la región constante de cadena pesada que une la bisagra al dominio CH3 en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en el presente documento, un dominio CH2 comienza en P238 y termina en K340. La expresión "dominio CH2" incluye dominios CH2 de tipo silvestre (tales como los que tienen el SEQ ID NO: 280 para IgG1 y el SEQ ID NO: 297 para IgG2; Tabla 11), así como sus variantes (por ejemplo, dominios CH2 no naturales o dominios CH2 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH2" incluye dominios CH2 de tipo silvestre y variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Los dominios CH2 a modo de ejemplo incluyen dominios CH2 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como la ADCC, CDC o semivida. En ciertas realizaciones, un dominio CH2 comprende las sustituciones A330S/P331S que reducen la función efectora. En el presente documento se proporcionan otras modificaciones en el dominio CH2 que afectan a la actividad biológica de un anticuerpo.
La expresión "dominio CH3" se refiere a la región constante de cadena pesada que es C-terminal al dominio CH2 en un dominio constante de cadena pesada. Como se usa en el presente documento, un dominio CH3 comienza en G341 y termina en K447. La expresión "dominio CH3" incluye dominios CH3 de tipo silvestre (tales como los que tienen el SEQ ID NO: 282 para IgG1 y el SEQ ID NO: 298 para IgG2; Tabla 11), así como sus variantes (por ejemplo, dominios CH3 no naturales o dominios CH3 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH3" incluye dominios CH3 de tipo silvestre y variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Los dominios CH3 a modo de ejemplo incluyen dominios CH3 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como la ADCc , CDC o semivida. En el presente documento se proporcionan modificaciones en el dominio CH3 que afectan a la actividad biológica de un anticuerpo.
Una "región Fc de secuencia nativa" o "Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, así como sus variantes naturales. La Fc de secuencia nativa incluye los diversos alotipos de Fc (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
La expresión "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno (por ejemplo, GITR) al que se une de manera específica una inmunoglobulina o anticuerpo. Los epítopos se pueden formar tanto a partir de aminoácidos contiguos (generalmente un epítopo lineal) como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína (generalmente un epítopo conformacional). Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente, pero no siempre, se conservan tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar qué epítopos están unidos por un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epítopos) son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en los que se ensaya la reactividad de péptidos solapantes o contiguos (por ejemplo, de GITR) con un anticuerpo dado (por ejemplo, anticuerpo anti-GITR). Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen técnicas en este campo y las descritas en el presente documento, por ejemplo, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional y HDX-MS (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
La expresión "mapeo de epítopos" se refiere al proceso de identificación de los determinantes moleculares para el reconocimiento anticuerpo-antígeno.
La expresión "se une al mismo epítopo" con referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos se unen al mismo segmento de restos de aminoácido, según se determina por un método dado. Las técnicas para determinar si los anticuerpos se unen al "mismo epítopo en GITR" con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como, análisis de rayos X de cristales de complejos antígeno:anticuerpo que proporcionan resolución atómica del epítopo y espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS). Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en las que la pérdida de unión debida a una modificación de un resto de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno se considera a menudo una indicación de un componente de epítopo. Además, también se pueden utilizar métodos combinatorios computacionales para el mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos de bibliotecas combinatorias de péptidos de presentación de fagos. Es de esperar que los anticuerpos que tienen las mismas secuencias VH y VL o las mismas secuencias CDR1, 2 y 3 se unan al mismo epítopo.
Los anticuerpos que "compiten con otro anticuerpo para unirse a una diana" se refieren a anticuerpos que inhiben (parcial o completamente) la unión del otro anticuerpo a la diana. Si dos anticuerpos compiten entre sí por unirse a una diana, es decir, si y en qué medida un anticuerpo inhibe la unión del otro anticuerpo a una diana, puede determinarse usando experimentos de competencia conocidos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo compite con e inhibe la unión de otro anticuerpo a una diana en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. El nivel de inhibición o competencia puede ser diferente dependiendo de qué anticuerpo es el "anticuerpo de bloqueo" (es decir, el anticuerpo frío que se incuba primero con la diana). Los ensayos de competencia se pueden realizar como se describe, por ejemplo, en Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 o en el Capítulo 11 de "Using Antibodies" de Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999. Los anticuerpos competidores se unen al mismo epítopo, un epítopo solapante o a epítopos adyacentes (por ejemplo, como se demuestra por impedimento estérico).
Otros ensayos de unión competitiva incluyen: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA de fase sólida directa de biotina-avidina (véase, Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1988)); RIA de mareaje directo de fase sólida usando un marcador I-125 (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25(1): 7 (1988)); EIA en fase sólida directa de biotina-avidina (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); y RIA de marcaje directo. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77 (1990)).
Como se usa en el presente documento, las expresiones "unión específica", "unión selectiva", "se une selectivamente", y "se une específicamente", se refieren a la unión de anticuerpos a un epítopo en un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo (i) se une con una constante de disociación de equilibrio (Kd ) de aproximadamente menos de 10' 7 M, tal como aproximadamente menos de 10' 8 M, 10' 9 M o 10' 10 M o incluso menor, cuando se determina por, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE 2000 que utiliza el antígeno predeterminado, por ejemplo, GITR humano recombinante, como analito y el anticuerpo como ligando, o el análisis de Scatchard de la unión del anticuerpo a células positivas para el antígeno, y (ii) se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) que no sea el antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. En consecuencia, un anticuerpo que "se une específicamente a GITR humano" se refiere a un anticuerpo que se une a GITR humano soluble o unido a células con una Kd de 10' 7 M o menos, tal como aproximadamente menos de 10' 8 M, 10-9 M o 10' 10 M o incluso menor. Un anticuerpo que "reacciona de forma cruzada con GITR cynomolgus" se refiere a un anticuerpo que se une a GITR cynomolgus con una Kd de 10' 7 M o menos, tal como aproximadamente menos de 10' 8 M, 10' 9 M o 10' 10 M o incluso menor. En ciertas realizaciones, los anticuerpos que no reaccionan de forma cruzada con GITR de una especie no humana presentan una unión esencialmente indetectable contra estas proteínas en ensayos de unión convencionales.
El término "kasoc" o " ka", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la tasa de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término "kdis"o" kd" como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la tasa de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término "Kd ", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de kd a ka (es decir, kd/ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos pueden determinarse usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la Kd de un anticuerpo es mediante el uso de resonancia de plasmón superficial, preferentemente usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore® o citometría de flujo y análisis de Scatchard.
Como se usa en el presente documento, la expresión "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10' 8 M o menos, más preferentemente de 10' 9 M o menos e, incluso más preferentemente, de 10' 10 M o menos para un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10' 7 M o menos, más preferentemente de 10' 8 M o menos.
El término "CE50" en el contexto de un ensayo in vitro o in vivo usando un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, se refiere a la concentración de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que induce una respuesta que es el 50% de la respuesta máxima, es decir, a medio camino entre la respuesta máxima y la de partida.
La expresión "se une a GITR inmovilizado" se refiere a la capacidad de un anticuerpo descrito en el presente documento para unirse a GITR, por ejemplo, expresado en la superficie de una célula o que está unido a un soporte sólido.
la expresión "reacciona de forma cruzada" como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo descrito en el presente documento para unirse a GITR de una especie diferente. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento que se une a GITR humano también puede unirse a otra especie de GITR (por ejemplo, GITR cynomolgus). Como se usa en el presente documento, la reactividad cruzada se puede medir detectando una reactividad específica con antígeno purificado en ensayos de unión (por ejemplo, SPR, ELISA) o la unión a, o la interacción funcional de otra manera con, células que expresan fisiológicamente GITR. Los métodos para determinar la reactividad cruzada incluyen ensayos de unión estándar como se describe en el presente documento, por ejemplo, por análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) de Biacore™ utilizando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia) o técnicas de citometría de flujo.
La expresión "de origen natural" tanto usada en el presente documento como aplicada a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o de polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el ser humano en el laboratorio es de origen natural.
Un "polipéptido" se refiere a una cadena que comprende al menos dos restos de aminoácido unidos consecutivamente, sin límite superior en la longitud de la cadena. Uno o más restos de aminoácidos de la proteína pueden contener una modificación tal como, aunque no de forma limitativa, glucosilación, fosforilación o formación de enlaces disulfuro. Una "proteína" puede comprender uno o más polipéptidos.
La expresión "molécula de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, y puede ser ADNc.
También se proporcionan "modificaciones de secuencia conservativas" de las secuencias establecidas en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 11, tal como en los SEQ ID NO: 13-191, es decir, modificaciones de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no anulan la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, al antígeno. Tales modificaciones de secuencia conservativas incluyen sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos, así como, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones en una secuencia de la Tabla 11, por ejemplo, los SEQ ID NO: 13-191, por técnicas convencionales conocidas en este campo, tales como mutagénesis de sitio dirigido y mutagénesis mediada por la PCR. Las "sustituciones de aminoácidos conservativas" incluyen aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un resto de aminoácido no esencial previsto en un anticuerpo anti-GITR se reemplaza preferentemente con otro resto de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. En la técnica se conocen bien métodos para identificar sustituciones conservativas de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno (véase, por ejemplo,, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)). Como alternativa, en otra realización, las mutaciones se pueden introducir de manera aleatoria a lo largo de toda o de una parte de la secuencia codificante del anticuerpo anti-GITR, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-GITR resultantes modificados se pueden seleccionar en función de la actividad de unión.
Para los ácidos nucleicos, la expresión "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando están óptimamente alineados y comparados, son idénticos, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80 % de los nucleótidos, normalmente en al menos aproximadamente del 90 % al 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente del 98 % al 99,5 % de los nucleótidos. Como alternativa, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibridan en condiciones de hibridación selectiva, al complemento de la cadena.
Para los polipéptidos, la expresión "homología sustancial" indica que dos polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando están óptimamente alineados y comparados, son idénticos, con inserciones o deleciones de aminoácidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80% de los aminoácidos, normalmente en al menos aproximadamente del 90 % al 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente del 98 % al 99,5 % de los aminoácidos.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que deben introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático, como se describe más adelante en los ejemplos no limitantes.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una longitud de espacio de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de ácido nucleico y de proteína de la presente invención pueden usarse además como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína descritas en el presente documento. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, las otras partes del cromosoma) o proteínas, por técnicas estándar, entre las que se incluyen el tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas en CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Los ácidos nucleicos, por ejemplo, ADNc, pueden mutarse, de acuerdo con técnicas estándar para proporcionar secuencias de genes. Para la secuencia codificante, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homólogas o derivadas de secuencias nativas de V, D, J, constantes, cambios y otras secuencias similares descritas en el presente documento (donde "derivado" indica que una secuencia es idéntica o está modificada a partir de otra secuencia).
El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "plásmido" es un tipo de vector, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran normalmente en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse de manera intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, también se incluyen otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, pretende referirse a una célula que comprende un ácido nucleico que no está presente naturalmente en la célula, y puede ser una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que dichos términos pretenden hacer referencia no solo a la célula concreta, sino también a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas mutaciones en generaciones posteriores debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, en realidad, no ser idéntica a la célula parental, pero aun así se incluye dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" tal como se usa en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia inmunogénica natural o sintética, tal como una proteína, péptido o hapteno. Un antígeno puede ser GITR o un fragmento del mismo. Un antígeno también puede ser un antígeno tumoral, contra el cual se desean respuestas inmunitarias protectoras o terapéuticas, por ejemplo, antígenos expresados por una célula tumoral (por ejemplo, en una vacuna en combinación con un anticuerpo anti-GITR). Los antígenos incluyen antígenos asociados a tumores para la prevención o el tratamiento de cánceres. Los ejemplos de antígenos asociados a tumores incluyen, aunque no de forma limitativa, secuencias que comprenden la totalidad o parte de las secuencias de phCG, gp100 o Pmel17, HER2/neu, WT1, mesotelina, CEA, gp100, MARTI, TRP-2, melan-A, NY-ESO-1, NY-BR-1, NY-CO-58, MN (gp250), idiotipo, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-A3, Tirosinasa, Telomerasa, antígenos SSX2 y MUC-1, y antígenos tumorales derivados de células germinales. Los antígenos asociados a tumores también incluyen los antígenos del grupo sanguíneo, por ejemplo, Lea, Leb, LeX, LeY, H-2, B-1, antígenos B-2. Como alternativa, Se puede incluir más de un antígeno en una construcción. Por ejemplo, un antígeno MAGE puede combinarse con otros antígenos tales como la melanina A, tirosinasa y gp100 junto con adyuvantes tales como GM-CSF o IL-12, y unirse a un anticuerpo anti-APC.
Las secuencias de los antígenos anteriores son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, se proporciona un ejemplo de una secuencia de ADNc de MAGE-3 en el documento US 6.235.525 (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer); se proporcionan ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas NY-ESO-1 en los documentos US 5.804.381 y US 6.069.233 (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer); se proporcionan ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de Melan-A en los documentos US 5.620.886 y US 5.854.203 (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer); se proporcionan ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas NY-BR-1 en los documentos US 6.774.226 y US 6.911.529 (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer) y se proporcionan ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas NY-CO-58 en el documento WO 02090986 (Instituto Ludwig para el Cáncer Investigación); un ejemplo de una secuencia de aminoácidos para la proteína HER-2/neu está disponible en GENBANK® N.° de registro AAA58637; y una secuencia de nucleótidos (ARNm) para antígeno carcinoembrionario humano tipo 1 (CEA-1) está disponible en GENBANK® N.° de registro NM020219.
Una "respuesta inmunitaria" se refiere a una respuesta biológica dentro de un vertebrado contra agentes extraños, protegiendo dicha respuesta al organismo contra estos agentes y enfermedades causadas por ellos. Una respuesta inmunitaria está mediada por la acción de una célula del sistema inmunitario (por ejemplo, un linfocito T, linfocito B, células citolíticas naturales (NK), macrófago, eosinófilo, mastocito, célula dendrítica o neutrófilo) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que da como resultado una selectividad en el direccionamiento, unión a, daño a, destrucción de y/o eliminación de patógenos invasores en el cuerpo del vertebrado, células o tejidos infectados por patógenos, células cancerosas u otras células anormales o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Una reacción inmunitaria incluye, por ejemplo, activación o inhibición de una célula T, por ejemplo, una célula T efectora o una célula Th, tal como una célula T CD4+ o CD8+, o la inhibición de una célula Treg.
Un "inmunomodulador" o "inmunorregulador" se refiere a un agente, por ejemplo, un componente de una ruta de señalización, que puede estar involucrado en la modulación, regulación o modificación de una respuesta inmunitaria. "Modulación", "regulación" o "modificación" de una respuesta inmunitaria se refiere a cualquier alteración en una célula del sistema inmunitario o en la actividad de dicha célula (por ejemplo, una célula T efectora). Tal modulación incluye la estimulación o supresión del sistema inmunitario que puede manifestarse por un aumento o disminución en el número de varios tipos de células, un aumento o disminución en la actividad de estas células, o cualquier otro cambio que pueda ocurrir dentro del sistema inmunitario. Se han identificado inmunomoduladores tanto inhibidores como estimuladores, de los que algunos pueden tener una función mejorada en un microambiente tumoral. En realizaciones preferidas, el inmunomodulador se encuentra en la superficie de una célula T. Una "diana inmunomoduladora" o "diana inmunorreguladora" es un inmunomodulador que es la diana de unión de, y cuya actividad se ve alterada por la unión de, una sustancia, agente, fracción, compuesto o molécula. Las dianas inmunomoduladoras incluyen, por ejemplo, receptores en la superficie de una célula ("receptores inmunomoduladores") y ligandos de receptores ("ligandos inmunomoduladores").
"Inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto afectado o en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de una enfermedad por un método que comprende inducir, potenciar, suprimir o modificar de otro modo una respuesta inmunitaria.
"Terapia de inmunoestimulación" o "terapia inmunoestimuladora" se refiere a una terapia que ocasiona el aumento (inducción o potenciación) de una respuesta inmunitaria en un sujeto para, por ejemplo, tratamiento de cánceres.
"Potenciación de una respuesta inmunitaria endógena" significa el aumento de la eficacia o potencia de una respuesta inmunitaria existente en un sujeto. Este aumento en eficacia y potencia puede lograrse, por ejemplo, superando mecanismos que suprimen la respuesta inmunitaria endógena del hospedador o estimulando mecanismos que mejoran la respuesta inmunitaria endógena del hospedador.
Células "T efectoras" ("Tef") se refiere a las células T (por ejemplo, células T CD4+ y CD8+) con actividades citolíticas, así como células T auxiliares (Th), que secretan citocinas y activan y dirigen otras células inmunitarias, pero no incluyen las células T reguladoras (células Treg). Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento activan las células Tef, por ejemplo, células Tef CD4+ y CD8+.
Una mayor capacidad para estimular una respuesta inmunitaria o el sistema inmunitario, puede ser el resultado de una actividad agonista mejorada de los receptores coestimuladores de células T y/o una actividad antagonista mejorada de los receptores inhibidores. Una mayor capacidad para estimular una respuesta inmunitaria o el sistema inmunitario puede reflejarse en un aumento en veces de la CE50 o del nivel máximo de actividad en un ensayo que mide una respuesta inmunitaria, por ejemplo, un ensayo que mide cambios en la liberación de citocinas o quimiocinas, en la actividad citolítica (determinada directamente en células diana o indirectamente a través de la detección de CD107a o granzimas) y la proliferación. La capacidad de estimular una respuesta inmunitaria o la actividad del sistema inmunitario puede mejorarse en al menos un 10%, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad agonista más potente, en relación con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada. Se puede determinar la actividad agonista mejorada de un anticuerpo, por ejemplo, como se muestra en los ejemplos, por ejemplo, midiendo el nivel de secreción de IFN-y o IL-2 de las células T que están en contacto con el anticuerpo. La actividad agonista puede potenciarse al menos en un 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más, como se define por el aumento de la liberación de citocinas o el aumento de la proliferación en las células T efectoras; reducción de la actividad de las células T reguladoras si la interacción en Treg reduce la función de Treg; o el aumento del agotamiento de Treg. Por ejemplo, la cantidad de IFN-y o IL-2 secretada por las células T estimuladas con un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada modificada puede ser al menos un 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más alto que el de las células T estimuladas con el mismo anticuerpo que no comprende una región constante de cadena pesada modificada.
Como se usa en el presente documento, el término "unido" se refiere a la asociación de dos o más moléculas. La unión puede ser covalente o no covalente. La unión también puede ser genética (es decir, fusionado de forma recombinante).
Tales uniones se pueden conseguir usando una amplia variedad de técnicas reconocidas en este campo, tal como la conjugación química y la producción de proteínas recombinantes.
Como se usa en el presente documento, "administración" se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente terapéutico en un sujeto, usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de liberación conocidos por los expertos en la materia. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo por inyección o infusión. La frase "administración parenteral", como se usa en el presente documento, significa modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, infusión e inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, así como electroporación in vivo. Como alternativa, un anticuerpo descrito en el presente documento puede administrarse a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, la vía intranasal, la vía oral, la vía vaginal, la vía rectal, la vía sublingual o tópica. La administración también puede realizarse, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
Como se usa en el presente documento, la expresión "respuesta mediada por células T" se refiere a una respuesta mediada por células T, incluyendo células T efectoras (por ejemplo, células CD8+) y células T auxiliares (por ejemplo, células CD4+). Las respuestas mediadas por células T incluyen, por ejemplo, citotoxicidad y proliferación de células T.
Como se usa en el presente documento, la expresión "respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL)" se refiere a una respuesta inmunitaria inducida por células T citotóxicas. Las respuestas de CTL están mediadas principalmente por células T CD8+.
Como se usa en el presente documento, los términos "inhibe" o "bloquea" (por ejemplo, refiriéndose a la inhibición/bloqueo de la unión de GITR-L a GITR en las células) se usan indistintamente y abarcan la inhibición/bloqueo tanto parcial como completo. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR inhibe la unión de GITR-L a GITR en al menos aproximadamente un 50 %, por ejemplo, aproximadamente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, un 99 % o un 100 %, determinado, por ejemplo, como se describe adicionalmente en el presente documento. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR inhibe la unión de GITR-L a GITR en no más del 50 %, por ejemplo, en aproximadamente un 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 %, determinado, por ejemplo, como se describe adicionalmente en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la expresión "inhibe el crecimiento" de un tumor incluye cualquier disminución medible en el crecimiento de un tumor, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de un tumor en al menos aproximadamente un 10 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 99 % o un 100 %.
Como se usa en el presente documento, Un "cáncer" se refiere a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células anormales en el cuerpo. La división celular no regulada puede dar lugar a la formación de células o tumores malignos que invaden los tejidos vecinos y pueden hacer metástasis a partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo.
Los términos "tratar", "que trata" y "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refieren a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en, o a la administración de un agente activo al sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir o ralentizar o prevenir la progresión, el desarrollo, la gravedad o la reaparición de un síntoma, la complicación, la afección o los indicios bioquímicos asociados con una enfermedad. El tratamiento puede ser de un sujeto que tiene una enfermedad o de un sujeto que no tiene una enfermedad (por ejemplo, para la profilaxis).
Una "neoplasia maligna hematológica" incluye un linfoma, leucemia, mieloma o una neoplasia maligna linfoide, así como un cáncer del bazo y de los ganglios linfáticos. Los linfomas a modo de ejemplo incluyen tanto linfomas de células B (un cáncer hematológico de células B) como linfomas de células T. Los linfomas de células B incluyen tanto los linfomas de Hodgkin como la mayoría de los linfomas no Hodgkin. Los ejemplos no limitantes de linfomas de células B incluyen el linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma de tejido linfático asociado a la mucosa, linfoma linfocítico de células pequeñas (coincide con leucemia linfocítica crónica), linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, linfoma mediastínico de células B grandes, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma nodal de la zona marginal de células B, linfoma esplénico de la zona marginal, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusión primaria, granulomatosis linfomatoide. Los ejemplos no limitantes de linfomas de células T incluyen linfoma extranodal de células T, linfoma cutáneo de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T. Las neoplasias hematológicas también incluyen leucemia, tales como, aunque no de forma limitativa, leucemia secundaria, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica y leucemia linfoblástica aguda. Las neoplasias hematológicas incluyen además mielomas, tales como, aunque no de forma limitativa, mieloma múltiple y mieloma múltiple indolente. la expresión neoplasia maligna hematológica abarca otros cánceres hematológicos y/o asociados a células B o células T.
El término "dosis eficaz" o "dosificación eficaz" se define como una cantidad suficiente para lograr o lograr al menos parcialmente un efecto deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosificación terapéuticamente eficaz" de un fármaco o agente terapéutico es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se usa solo o en combinación con otro agente terapéutico, promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o la discapacidad debidos a la enfermedad. Una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz de un fármaco incluye una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "dosis profilácticamente eficaz", que es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se administra solo o en combinación con otro agente terapéutico a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad o de padecer una reaparición de la enfermedad, inhibe el desarrollo o la reaparición de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad puede evaluarse utilizando varios métodos conocidos por el profesional experto, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas modelo en animales que predicen la eficacia en seres humanos o mediante el ensayo de la actividad del agente en ensayos in vitro.
A modo de ejemplo, un agente anticanceroso es un fármaco que promueve la regresión del cáncer en un sujeto. En realizaciones preferidas, una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco promueve la regresión del cáncer hasta el punto de eliminar el cáncer. "Promover la regresión del cáncer" significa que administrar una cantidad eficaz del fármaco, en solitario o en combinación con un agente antineoplásico, da como resultado una reducción en el crecimiento o tamaño del tumor, necrosis del tumor, una disminución en la gravedad de al menos un síntoma de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, una prevención del deterioro o discapacidad debido a la enfermedad o al alivio de otra manera de los síntomas de la enfermedad en el paciente. Además, los términos "eficaz" y "eficacia" con respecto a un tratamiento incluyen tanto la eficacia farmacológica como la seguridad fisiológica. La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del fármaco para promover la regresión del cáncer en el paciente. La seguridad fisiológica se refiere al nivel de toxicidad u otros efectos fisiológicos adversos a nivel celular, de órganos y/o de organismo (efectos adversos) resultantes de la administración del fármaco.
A modo de ejemplo para el tratamiento de tumores, una cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente el 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente el 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente el 60 % y, aún más preferentemente, en al menos aproximadamente el 80% en relación con los sujetos no tratados. En las realizaciones más preferidas, una cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe completamente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral, es decir, preferentemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en un 100%. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar utilizando los ensayos descritos más adelante. Como alternativa, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibición puede medirse in vitro por ensayos conocidos por el profesional experto. En otras realizaciones preferidas descritas en el presente documento, la regresión tumoral se puede observar y continuar durante un período de al menos aproximadamente 20 días, más preferentemente al menos aproximadamente 40 días o, incluso más preferentemente, al menos aproximadamente 60 días.
El término "paciente" incluye seres humanos y otros sujetos mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene cáncer. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Como se usa en el presente documento, los términos "ug" y "uM" se usan indistintamente con "|jg" y " |jM".
Diversos aspectos descritos en el presente documento se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.
I. Anticuerpos anti-GITR
En el presente documento se describen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos completamente humanos, que se caracterizan por características o propiedades funcionales particulares. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a GITR humano. Adicionalmente, los anticuerpos pueden reaccionar de forma cruzada con GITR procedente de uno o más primates no humanos, tal como GITR cynomolgus.
Además de unirse específicamente a GITR humano soluble y/o unido a la membrana, los anticuerpos descritos en el presente documento presentan una o más de las siguientes propiedades funcionales:
(a) unión a GITR cynomolgus;
(b) estimulación o potenciación de una respuesta inmunitaria;
(c) activación de células T (como se evidencia, por ejemplo, por una mayor secreción de citocinas y/o proliferación); (d) inhibición de la unión de GITRL a GITR en células 3A9-hGITR;
(e) como máximo inhibición parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(f) unión a un epítopo conformacional en la porción N-terminal de GITR humano;
(g) unión a GITR humano tanto glucosilado como no glucosilado; y
(h) actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista.
Preferentemente, los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR con alta afinidad, por ejemplo, con una Kd de 10-7 M o menos,, 10-8 M o menos, 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, 10-11 M o menos, 10-12 M o menos, de 10-12 M a 10-7 M, de 10-11 M a 10-7 M, de 10-10 M a 10-7 M o de 10-9 M a 10-7 M. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se une a GITR humano soluble, por ejemplo, como se determina por Biacore, con una Kd de 10-7 M o menos,, 10-8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10-10 M o menos, de 10-12 M a 10-7 M, de 10-11 M a 10-7M, de 10-10 M a 10-7M, de 10-9 M a 10­ 7 M o de 10-8 M a 10-7 M. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se une al GITR humano unido (por ejemplo, unido a la membrana celular), tal como en células T humanas activadas, por ejemplo, como se determina por citometría de flujo y diagrama de Scatchard, con una Kd de 10-7 M o menos,, 10-8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10' 1 ° M o menos, de 10'12 M a 10'7 M, de 10'11 M a 10'8 M, de 10'10 M a 10'8 M, de 10-9 M a 10'8 M, de 10'11 M a 10-9 M o de 10­ 10 M a 10-9 M. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se une al GITR humano unido (por ejemplo, unido a la membrana celular), tal como en células T humanas activadas, por ejemplo, como se determina por FACS, con una CE50 de 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10"10 M o menos, de 10-12 M a 10-7 M, de 10-11 M a 10-8 M, de 10'10 M a 10-8 M, de 10-9 M a 10-8 M, de 10-11 M a 10-9 M o de 10'10 M a 10-9 M. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se une a GITR humano soluble con una Kd de 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10'10 M o menos, de 10'12 M a 10'7 M, de 10'11 M a 10'7 M, de 10-10M a 10'7 M, de 10'9 M a 10-7 M o de 10'8 M a 10-7 M, y a GITR humano unido a la membrana celular con una Kd o CE50 de 10-7 M o menos, 10-8 M o menos, 10-9 M (1 nM) o menos, 10'10 M o menos, de 10'12 M a 10'7 M, de 10'11 M a 10'8 M, de 10'10 M a 10'8 M, de 10-9 M a 10'8 M, de 10-11 M a 10-9 M o de 10'10 M a 10'9 M.
Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a GITR cynomolgus, por ejemplo, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 100 nM o menos, 10 nM o menos, de 100 nM a 0,01 nM, de 100 nM a 0,1 nM, de 100 nM a1 nM, o de 10 nM a 1 nM, por ejemplo, como se mide por FACS (por ejemplo, como se describe en los Ejemplos).
Los anticuerpos anti-GITR pueden estimular o mejorar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, activando células Tef, limitando la supresión de las células T efectoras por las células Treg, agotando y/o inhibiendo las células Treg tumorales y/o activando las células NK, por ejemplo, en el tumor. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR pueden activar o coestimular a las células Tef como se evidencia, por ejemplo, por la mayor secreción de citocinas (por ejemplo, IL-2 e IFN-y) y/o la mayor proliferación. En ciertas realizaciones, también se proporciona estimulación de CD3. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de GITR aumenta la secreción de IL-2 en un factor del 50 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 4 veces, 5 veces o más, opcionalmente con un máximo de hasta 10 veces, 30 veces, 100 veces, como se mide, por ejemplo, en células T humanas primarias o células T que expresan GITR humano (por ejemplo, como se describe adicionalmente en los Ejemplos). En ciertas realizaciones, un anticuerpo de GITR aumenta la secreción de IFN-y en un factor del 50 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 4 veces, 5 veces o más, opcionalmente con un máximo de hasta 10 veces, 30 veces, 100 veces, como se mide, por ejemplo, en células T humanas primarias o células T que expresan GITR humano (por ejemplo, como se describe adicionalmente en los Ejemplos).
Los anticuerpos anti-GITR pueden inhibir la unión de GITRL humano a GITR humano en las células, por ejemplo, células 3A9 que expresan GITR humano, por ejemplo, con una CE50 de 10 pg/ml o menos, 1 pg/ml o menos, de 0,01 |jg/ml a 10 pg/ml, de 0,1 pg/ml a 10 pg/ml, o de 0,1 pg/ml a 1 pg/ml (véase el Ejemplo 5).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR a lo sumo solo inhiben parcialmente la unión de GITRL humano a GITR humano en las células, por ejemplo, células T activadas (véase el Ejemplo 5).
Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a un epítopo, por ejemplo, un epítopo conformacional en la porción N-terminal de GITR humano, por ejemplo, un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 1 a 39 de GITR humano maduro (véase el Ejemplo 9), según se determina, por ejemplo, mediante la unión de los anticuerpos a fragmentos de GITR humano, por ejemplo, fragmentos nativos (es decir, no desnaturalizados) de GITR humano. Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a, o a un epítopo localizado dentro de, los aminoácidos 1 a 20 de GITR humano maduro, tal como se determina, por ejemplo, mediante la unión de los anticuerpos a fragmentos de GITR humano, por ejemplo, fragmentos nativos (es decir, no desnaturalizados) de GITR humano, seguido de la escisión enzimática o de HDX (véanse los Ejemplos 11 y 12, respectivamente). Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a, o a un epítopo dentro de, los aminoácidos 3 a 20 de GIt R humano maduro (PTGGp Gc GPGRLLLg Tg T, SEQ ID NO: 217). Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse a, o a un epítopo dentro de, los aminoácidos 3 a 20 y aminoácidos 33 a 40 de GITR humano maduro, es decir, las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218). En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR humano tanto glucosilado como no glucosilado. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen a las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218), como se determina por HDX, por ejemplo, utilizando el protocolo establecido en los Ejemplos.
Los anticuerpos anti-GITR pueden competir por la unión a GITR con (o inhibir la unión de) anticuerpos anti-GITR que comprenden CDR o regiones variables descritas en el presente documento, por ejemplo, 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10. Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden inhibir la unión de 28F3, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 19D3, 18E10 y/o 6G10 a GITR humano en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1,9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10 pueden inhibir la unión de anticuerpos anti-GITR a GITR humano en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden inhibir la unión de 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10 a GITR humano en al menos un 10%, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % y 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10 inhiben la unión de los anticuerpos anti-GITR a GITR humano en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % (por ejemplo, compiten en ambas direcciones).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR inducen o mejoran la activación de las células T sin requerir entrecruzamiento multivalente, tal como se determina, por ejemplo, por la falta de necesidad de unión a FcR. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR son multivalentes, por ejemplo, bivalentes. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR no son monovalentes. Se ha demostrado en el presente documento que los fragmentos F'(ab)2 son más eficaces que los fragmentos Fab para activar las células T (véanse los Ejemplos).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR no requieren entrecruzamiento a través de receptores de Fc para su actividad agonista, sin embargo, el entrecruzamiento con receptores de Fc mejora su actividad agonista con respecto al mismo anticuerpo que no está unido a receptores de Fc.
Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las siguientes características:
(1) unión a GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cynomolgus, por ejemplo, unión a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(5) inducción o mejora de la activación de células T, tal como en presencia de interacción de CD3 (por ejemplo, en presencia de concentraciones subóptimas de anti-CD3), como se evidencia por (i) aumento de la producción de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan GITR y/o (ii) aumento de la proliferación de células T;
(6) inducción o mejora de la activación de células T sin requerir entrecruzamiento multivalente;
(7) presencia de actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista;
(8) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR, por ejemplo, con una CE50 de 1 pg/ml o menos, como se mide por FACS, por ejemplo, en un ensayo con células 3A9-hGITR;
(9) inhibición a lo sumo parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(10) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (Se Q ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(11) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado; y
(12) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones por la unión a GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10.
Los anticuerpos anti-GITR también pueden inducir la internalización de GITR en células T activadas, por ejemplo, células T CD4+ y CD8+, por ejemplo, dentro de un periodo de 10, 30 o 60 minutos, y la posterior transducción de señales, por ejemplo, activación (es decir, fosforilación) de NF-kB p65 y MAP quinasa p38.
En consecuencia, un anticuerpo que presenta una o más de estas propiedades funcionales (por ejemplo, bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras actividades biológicas, o similares) determinadas de acuerdo con metodologías conocidas en la técnica y descritas en el presente documento, se entenderá que se relaciona con una diferencia estadísticamente significativa en la actividad particular con respecto a la observada en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando está presente un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Preferentemente, los aumentos inducidos por anticuerpos anti-GITR en un parámetro medido (por ejemplo, la proliferación de células T, la producción de citocinas) produce un aumento estadísticamente significativo en al menos un 10 % del parámetro medido, más preferentemente en al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 5 veces o 10 veces y, en ciertas realizaciones preferidas, un anticuerpo descrito en el presente documento puede aumentar el parámetro medido en más del 92 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99%, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 5 veces o 10 veces. Por el contrario, las disminuciones inducidas por anticuerpos anti-GITR en un parámetro medido (por ejemplo, volumen tumoral, unión de GITR-L a GITR, cantidad de células T reguladoras en tumores) produce una disminución estadísticamente significativa en al menos un 10% del parámetro medido, más preferentemente en al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80% o 90% y, en ciertas realizaciones preferidas, un anticuerpo descrito en el presente documento puede disminuir el parámetro medido en más del 92 %, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 %.
En la técnica se conocen ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos a GITR de varias especies, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias de Western y RIA. En los Ejemplos se describen ensayos adecuados con detalle. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también puede evaluarse por ensayos convencionales conocidos en la técnica, tal como por el análisis de Biacore. Más adelante y en los Ejemplos se describen con más detalle ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de GITR (por ejemplo, la unión del ligando, la proliferación de células T y la producción de citocinas).
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR no son anticuerpos nativos o no son anticuerpos naturales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR tienen modificaciones postraduccionales que son diferentes de las de los anticuerpos naturales, por ejemplo, al tener más, menos o un tipo diferente de modificación postraduccional.
II. Anticuerpos anti-GITR a modo de ejemplo
Los anticuerpos particulares descritos en el presente documento son anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que tiene las secuencias de CDR y/o región variable de los anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8 y 6G10, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en el Ejemplo 1, así como anticuerpos que tienen al menos un 80% de identidad (por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad) con sus secuencias de región variable o CDR. El anticuerpo monoclonal aislado de la invención secuencias de CDR y de región variable del anticuerpo 28F3. Las secuencias de aminoácidos de Vh de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 se exponen en los SEQ ID NO: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128 y 335, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de Vl de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 se muestran en los SEQ ID NO: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130 y 336, respectivamente.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, o una porción de unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13, 26, 39, 52, 71,84, 97, 115, 128 y 335.
También se proporcionan anticuerpos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130 y 336.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, o una porción de unión a antígeno de los mismos, que comprenden:
(a) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 13 y 14 respectivamente;
(b) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 26 y 27 respectivamente;
(c) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 39 y 40 respectivamente;
(d) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 52 y 53 respectivamente;
(e) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 52 y 54 respectivamente;
(f) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 71 y 72 respectivamente;
(g) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 84 y 85 respectivamente;
(h) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 97 y 98 respectivamente;
(i) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 97 y 99 respectivamente;
(j) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 115 y 116, respectivamente;
(k) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 128 y 129, respectivamente;
(l) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 128 y 130, respectivamente; o
(m) secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que comprenden los SEQ ID NO: 335 y 336, respectivamente.
Los anticuerpos monoclonales aislados de la invención comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que consisten en la secuencia de aminoácidos expuestas en los SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente.
Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden comprender las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y ligera de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de Vh de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 se exponen en los SEQ ID n O: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDR2 de Vh de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 se exponen en los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDR3 de Vh de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 se exponen en los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de Vl de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 se exponen en SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de Vl de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1,3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 se exponen en los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de Vl de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 se exponen en los SEQ ID NO: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347, respectivamente. Las regiones CDR se delinean usando el sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de la NIH N.° 91-3242).
Dado que cada uno de estos anticuerpos se une a GITR y que la especificidad de unión al antígeno se proporciona principalmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias de las CDR1, 2 y 3 de Vl se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, 2 y 3 de Vh y una CDR1,2 y 3 de Vl) para crear otras moléculas de unión anti-GITR descritas en el presente documento. La unión a GITR de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede ensayar usando los ensayos de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Preferentemente, cuando se mezclan y emparejan secuencias de CDR de Vh, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vh particular se reemplaza por una o más secuencias de CDR estructuralmente similares. De forma análoga, cuando se mezclan y emparejan secuencias de CDR de Vl, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de Vl particular se reemplaza preferentemente por una o más secuencias de CDR estructuralmente similares. Será evidente para el experto en la materia que se pueden crear nuevas secuencias de Vh y Vl sustituyendo una o más secuencias de región CDR de Vh y/o Vl con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR desveladas en el presente documento para los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, o una porción de unión a antígeno de los mismos, que comprenden:
(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342;
(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343;
(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344;
(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345;
(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346; y
(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
En un aspecto, el anticuerpo descrito en el presente documento comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de región variable de cadena pesada comprenden:
(a) los SEQ ID NO: 20-22;
(b) los SEQ ID NO: 33-35;
(c) los SEQ ID NO: 46-48;
(d) los SEQ ID NO: 62-64;
(e) los SEQ ID NO: 78-80;
(f) los SEQ ID NO: 91-93;
(g) los SEQ ID NO: 106-108;
(h) los SEQ ID NO: 138-140; o
(i) los SEQ ID NO: 342-344;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
El anticuerpo monoclonal aislado de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 20-22.
En otro aspecto, el anticuerpo descrito en el presente documento comprende comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden:
(a) los SEQ ID NO: 23-25;
(b) los SEQ ID NO: 36-38;
(c) los SEQ ID NO: 49-51;
(d) los SEQ ID NO: 65-67;
(e) los SEQ ID NO: 68-70;
(f) los SEQ ID NO: 81-83;
(g) los SEQ ID NO: 109-111;
(h) los SEQ ID NO: 112-114;
(i) los SEQ ID NO: 125-127;
(j) los SEQ ID NO: 141-143;
(k) los SEQ ID NO: 144-146; o
(l) los SEQ ID NO: 345-347;
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
El anticuerpo monoclonal aisldo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 20-22.
En un aspecto particular, el anticuerpo descrito en el presente documento comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde:
(a) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 20-22, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 23-25, respectivamente;
(b) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 33-35, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 36-38, respectivamente;
(c) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 46-48, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 49-51, respectivamente;
(d) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 62-64, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 65-67, respectivamente;
(e) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 62-64, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 68-70, respectivamente;
(f) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 78-80, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 81-83, respectivamente;
(g) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 91-93, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 94-96, respectivamente;
(h) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 106-108, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 109-111, respectivamente;
(i) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 106-108, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 112-114, respectivamente;
(j) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 122-124, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 125-127, respectivamente;
(k) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 138-140, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 141-143, respectivamente; o
(l) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 138-140, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 144-146, respectivamente; o
(m) las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprenden los SEQ ID NO: 342-344, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 345-347, respectivamente
en donde el anticuerpo se une específicamente a GITR humano.
El anticuerpo monoclonal aislado de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera, en donde las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada comprende los SEQ ID NO: 20-22, respectivamente, y las CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera comprenden los SEQ ID NO: 23-25, respectivamente.
Un dominio VH, o una o más CDR del mismo, descrito en el presente documento puede estar unido a un dominio constante para formar una cadena pesada, por ejemplo, una cadena pesada de longitud completa. De manera similar, un dominio VL, o una o más CDR del mismo, descrito en el presente documento puede estar unido a un dominio constante para formar una cadena ligera, por ejemplo, una cadena ligera de longitud completa. Una cadena pesada de longitud completa (con la excepción de la lisina C-terminal (K) o con la excepción de la glicina y la lisina C-terminal (GK), que pueden estar ausentes) y la cadena ligera de longitud completa se combinan para formar un anticuerpo de longitud completa.
Un dominio VH descrito en el presente documento puede fusionarse con el dominio constante de una IgG humana, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que son naturales o modificadas, por ejemplo, como se describe adicionalmente en el presente documento. Por ejemplo, un dominio VH puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquier dominio VH descrito en el presente documento fusionado a la siguiente secuencia de aminoácidos de IgG1 humana:
ASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV
LQSSGLYSLS SW TV PSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE
LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG (SEQ ID NO: 7)
El dominio constante de IgG1 humana también puede ser el de una variante alotípica. Por ejemplo, una variante alotípica de IgG1 comprende una R107K, E189D y M191L (subrayado arriba) y la numeración de acuerdo con la del SEQ ID NO: 7). Dentro de la región pesada de longitud completa, estas sustituciones de aminoácidos están numeradas R214K, E356D y M358L.
Un dominio VL descrito en el presente documento puede fusionarse con el dominio constante de una cadena ligera Kappa o Lambda humana. Por ejemplo, un dominio VL puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquier dominio VL descrito en el presente documento fusionado a la siguiente secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa de IgG1 humana:
RTV A A PSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ
ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC( SEQ ID NO:
12 )
En ciertas realizaciones, la región constante de cadena pesada comprende una lisina u otro aminoácido en el extremo C, por ejemplo, comprende los siguientes últimos aminoácidos: LSPGK (SEQ ID NO: 220) para la cadena pesada. En ciertas realizaciones, la región constante de cadena pesada carece de uno o más aminoácidos en el extremo C, y tiene, por ejemplo, la secuencia C-terminal LSPG (SEQ ID NO: 276) o LSP.
Las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras a modo de ejemplo se exponen en la Tabla 11 y corresponden a los SEQ ID NO: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361 y 362 para las cadenas pesadas y a los SEQ ID NO: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61,74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341 y 371 para las cadenas ligeras.
Las cadenas pesadas y ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % o 70 % idéntica a cualquiera de las cadenas pesadas o ligeras expuestas en la Tabla 11 (o sus regiones variables), por ejemplo, los SEQ ID NO: 13-19, 26-32, 40-45, 52-61, 71-77, 84-90, 97­ 105, 116-121, 128-137, 227-275, 337-341, 348-352, 361, 362 y 371 pueden usarse para formar anticuerpos anti-GITR humano que tienen las características deseadas, por ejemplo, las que se describen adicionalmente en el presente documento. Son variantes a modo de ejemplo las que comprenden una variación alotípica, por ejemplo, en el dominio constante, y/o una mutación en las regiones variables o constantes, tales como las mutaciones desveladas en el presente documento. Las cadenas pesadas y ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere como máximo en 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido (por sustitución, adición o deleción) de cualquiera de las cadenas pesadas o ligeras expuestas en la Tabla 11 (o sus regiones variables) se pueden usar para formar anticuerpos anti-GITR humano que tengan las características deseadas, por ejemplo, las que se describen adicionalmente en el presente documento.
En diversas realizaciones, los anticuerpos descritos anteriormente presentan una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once, o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión a GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cynomolgus, por ejemplo, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(5) inducción o mejora de la activación de células T, tal como en presencia de interacción de CD3 (por ejemplo, en presencia de concentraciones subóptimas de anti-CD3), como se evidencia, por (i) aumento de la producción de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan GITR y/o (ii) mayor proliferación de células T;
(6) inducción o mejora de la activación de células T sin requerir entrecruzamiento multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una CE50 de 1 pg/ml o menos, como se mide por FACS;
(8) inhibición a lo sumo parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGt Gt (Se Q ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado;
(11) presencia de actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista; y
(12) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones por la unión a GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10.
Dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
En una realización, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento se unen a GITR humano tanto glucosilado (por ejemplo, N-glucosilado u O-glicosilado) como no glucosilado.
En una realización, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento se unen a un epítopo conformacional.
En una realización, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento se unen a restos de aminoácidos dentro de la siguiente región de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4):
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215),
que corresponde a los restos de aminoácidos 1-39 de las isoformas 1, 2 o 3 de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4).
En una realización, el anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento se une a restos de aminoácidos dentro de la siguiente región de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4):
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 216),
que corresponde a los restos de aminoácidos 1-20 de las isoformas 1, 2 o 3 de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4).
En una realización, el anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento se une a restos de aminoácidos dentro de las siguientes regiones de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4):
PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) and CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218).
Dominios constantes de cadena pesada modificados
Como se analiza más adelante en el presente documento, la región constante de cadena pesada de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, o combinaciones de los mismos y/o modificaciones de los mismos. Un anticuerpo anti-GITR puede tener función efectora o puede tener una función efectora reducida o nula. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR comprenden una región constante de cadena pesada modificada que proporciona propiedades mejoradas al anticuerpo. Tal como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos anti-GITR que tienen una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra de IgG2 son agonistas más potentes que los anticuerpos que tienen la misma región variable pero con una bisagra que no es de IgG2. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende una bisagra de IgG2, un dominio CH2 y CH3 del isotipo IgG1, y con o sin función efectora, tiene una actividad agonista mejorada medida por la secreción mejorada de IFN-y e IL-2 de las células T incubadas con los anticuerpos. Sin querer limitarse a un mecanismo de acción específico, se presume que los anticuerpos anti-GITR que tienen bisagras de IgG2 forman complejos de anticuerpo/antígeno más grandes y se internalizan de manera más eficaz, dando como resultado un aumento de la actividad agonista. Se cree que la formación de complejos grandes es el resultado de una mayor rigidez de la bisagra de IgG2 con respecto a las bisagras de otros isotipos (por ejemplo, IgG1, IgG3 e IgG4). Como se describe adicionalmente en los Ejemplos, una actividad agonista mejorada no parece estar asociada con una mayor o menor afinidad del anticuerpo. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-GITR que tienen una región constante de cadena pesada modificada, en donde los anticuerpos anti-GITR tienen una actividad agonista mejorada, y en donde, la afinidad del anticuerpo con la región constante de cadena pesada modificada se une a GITR con una afinidad similar a la de las mismas regiones variables, pero con una región constante de cadena pesada diferente.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan también métodos para mejorar la actividad agonista de anticuerpos anti-GITR, que comprenden proporcionar un anticuerpo anti-GITR que tiene una bisagra que no es de IgG2 y reemplazar la bisagra que no es de IgG2 por una bisagra de IgG2. Los anticuerpos que pueden beneficiarse de dicha modificación incluyen cualquier anticuerpo anti-GITR, tal como los conocidos en la técnica, por ejemplo, anticuerpo 6C8 o un anticuerpo humanizado que tiene las CDR de 6C8, como se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/105021; un anticuerpo descrito en el documento WO2011/028683, JP2008278814, KR20080105674, US20040072566, US2001472565, US20140065152 o en el documento WO2015/031667.
En ciertas realizaciones, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra del isotipo IgG2 (una "bisagra de IgG2") y un dominio CH1, CH2 y CH3. En ciertas realizaciones, una región constante de cadena pesada modificada comprende una bisagra de IgG2 y un dominio CH1, CH2 y CH3, en donde al menos uno de los dominios CH1, CH2 y c H3 no son del isotipo IgG2. La bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 de tipo silvestre, por ejemplo, una bisagra de IgG2 humana de tipo silvestre (por ejemplo, ERKCCVECPPCPAPPVAG; Se Q ID NO: 291) o una variante de la misma, siempre que la bisagra de IgG2 conserve la capacidad de conferir al anticuerpo una actividad mejorada con respecto al mismo anticuerpo que comprende una bisagra que no es de IgG2. En ciertas realizaciones, una variante de bisagra de IgG2 conserva una rigidez o inflexibilidad similar a la de una bisagra de IgG2 de tipo silvestre. La rigidez de una bisagra se puede determinar, por ejemplo, mediante modelado computarizado, microscopía electrónica, espectroscopia tal como resonancia magnética nuclear (RMN), cristalografía de rayos X (factores B) o ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación (AUC) para medir o comparar el radio de giro de los anticuerpos que comprenden la bisagra. Una bisagra puede tener una rigidez similar o mayor en relación con otra bisagra si un anticuerpo que comprende la bisagra tiene un valor obtenido de uno de los ensayos descritos en la frase anterior que difiere del valor del mismo anticuerpo con una bisagra diferente, por ejemplo, una bisagra de IgG1, en menos del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %. Un experto en la materia podría determinar a partir de los ensayos si una bisagra tiene al menos una rigidez similar a la de otra bisagra al interpretar los resultados de estos ensayos. Una variante de bisagra de IgG2 humana a modo de ejemplo es una bisagra de IgG2 que comprende una sustitución de uno o más de los cuatro restos de cisteína (es decir, C219, C220, C226 y C229). Una cisteína puede reemplazarse por una serina. Una bisagra de IgG2 a modo de ejemplo es una bisagra de IgG2 humana que comprende una mutación C219S (por ejemplo, ERKSCVECPPCPAPPVAG; s Eq ID NO: 292). Otras variantes de bisagra de IgG2 que pueden usarse incluyen bisagras de IgG2 humanas que comprenden una sustitución de C220, C226 y/o C229, por ejemplo, una mutación C220S, C226S o C229S (que puede combinarse con una mutación C219S). Una bisagra de IgG2 también puede ser una bisagra de IgG2 en la que una porción de la bisagra es de otro isotipo (es decir, es una bisagra quimérica), siempre que la rigidez de la bisagra quimérica sea al menos similar a la de una bisagra de IgG2 de tipo silvestre. Por ejemplo, una bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 en la que la bisagra inferior (como se define en la Tabla 2) es de un isotipo IgG1 y es, por ejemplo, una bisagra inferior de IgG1 de tipo silvestre. Las mutaciones adicionales de la bisagra de IgG2 que pueden usarse en una bisagra de IgG2 incluyen las mutaciones SE (S267E), SELF (S267E/l328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF y GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E).
Se dice que una bisagra "híbrida" o "quimérica" es de isotipo específico si más de la mitad de los aminoácidos consecutivos de la bisagra son de ese isotipo. Por ejemplo, una bisagra que tiene una bisagra superior y media de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1 se considera una bisagra de IgG2.
En ciertas realizaciones, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 que es un dominio CH1 de tipo silvestre del isotipo IgG1 o IgG2 ("dominio CH1 de IgG1" o "dominio CH1 de IgG2", respectivamente). También pueden usarse dominios CH1 de los isotipos IgG3 e IgG4 ("dominio CH1 de IgG3 y "dominio CH1 de IgG2", respectivamente). Un dominio CH1 también puede ser una variante de un dominio CH1 de tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH1 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Las variantes a modo de ejemplo de los dominios CH1 incluyen A114C y T173C.
En ciertas realizaciones, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH2 que es un dominio CH2 de tipo silvestre del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 ("dominio CH2 de IgG1", "dominio CH2 de IgG2", "dominio CH2 de IgG3", o "dominio CH2 de IgG4" respectivamente). Un dominio CH2 también puede ser una variante de un dominio CH2 de tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Las variantes a modo de ejemplo de dominios CH2 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tales como ADCC o CDC o modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad. En una realización, el dominio c H2 es un dominio CH2 de IgG1 humano con una mutación A330S y P331S, en donde el dominio CH2 tiene una función efectora reducida con respecto a la misma mutación CH2 sin las mutaciones. Otras mutaciones se exponen adicionalmente en el presente documento en otro lugar.
En ciertas realizaciones, una región constante de cadena pesada modificada comprende un dominio CH3 que es un dominio CH3 de tipo silvestre del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 ("dominio CH3 de IgG1", "dominio CH3 de IgG2", "dominio CH3 de IgG3", o "dominio CH3 de IgG4" respectivamente). Un dominio CH3 también puede ser una variante de un dominio CH3 de tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 de tipo silvestre. Las variantes a modo de ejemplo de dominios CH3 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tales como ADCC o CDC o modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad.
Generalmente, las variantes de los dominios CH1, bisagra, CH2 o CH3 pueden comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones y/o, como máximo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mutación, o 1-10 o 1-5 mutaciones, o comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la del dominio de tipo silvestre correspondiente (dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3, respectivamente), siempre que la región constante de cadena pesada que comprende la variante específica conserve la actividad biológica necesaria.
La Tabla 3 expone regiones constantes de cadena pesada humana a modo de ejemplo que comprenden dominios CH1, bisagra, CH2 y/o CH3 humanos, en donde cada dominio es un dominio de tipo silvestre o una variante del mismo que proporciona la actividad biológica deseada a la región constante de cadena pesada. Una celda sin llenar en la Tabla 3 indica si el dominio está presente o no y, si está presente, puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región constante de cadena pesada 1 en la Tabla 3 es un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende al menos una bisagra de IgG2, y que también puede comprender un dominio CH1, CH2 y/o CH3 y, si está presente, el dominio CH1, CH2 y/o CH3 es de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Como otro ejemplo para comprender la Tabla 3, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada 8 es un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende un dominio CH1 de IgG1 y una bisagra de IgG2, un dominio CH2 de IgG1 y que puede o no comprender también un dominio CH3 que, si está presente, puede ser de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Tabla 3. C nfi r i n m m l r i n n n ^ n a humana
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continuación
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En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada que se muestra en la Tabla 3 y tiene una actividad agonista mejorada en relación con el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende esa región constante de cadena pesada específica. En ciertas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que se muestra en la Tabla 3 tiene una actividad agonista mejorada con respecto al mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2 o la misma bisagra de IgG2. En ciertas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que se muestra en la Tabla 3 tiene una actividad agonista mejorada en relación con el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2, y comprende, por ejemplo, una bisagra de IgG1, IgG3 o IgG4. En ciertas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que se muestra en la Tabla 3 tiene una actividad agonista mejorada en relación con el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende uno o más del mismo dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que se muestra en la Tabla 3 tiene una actividad agonista mejorada en relación con el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2 y un dominio CH1, CH2 y/o CH3 del isotipo específico. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada 22 mostrada en la Tabla 3, puede tener una actividad agonista mejorada en relación con (i) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 (por ejemplo, una bisagra de IgG1, IgG3 o IgG4); (ii) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2 y un CH1 de IgG1, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un c H1 que no es de IgG1; (iii) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2 y un CH2 de IgG2, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un CH2 que no es de IgG2; (iv) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2 y un CH3 de IgG1, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un CH3 que no es de IgG1; (v) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2, un CH1 de IgG1 y un CH2 de IgG2, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un CH1 que no es de IgG1 y/o un CH2 que no es de IgG2; (vi) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2, un CH1 de IgG1 y un CH3 de IgG1, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un CH1 que no es de IgG1 y/o un CH3 que no es de IgG1; (vii) el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2, un CH2 de IgG2 y un CH3 de IgG1, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un CH que no es de IgG2 y/o un CH3 que no es de IgG1; (viii) o el mismo anticuerpo que comprende una región constante de cadena pesada que no comprende una bisagra de IgG2, un CH1 de IgG1, CH2 de IgG2 y un CH3 de IgG1, y comprende, por ejemplo, una bisagra que no es de IgG2 y/o un CH1 que no es de IgG1 y/o un CH2 que no es de IgG2 y/o un CH3 que no es de IgG1.
Se proporcionan ejemplos de regiones constantes de cadena pesada modificadas que pueden unirse a regiones variables de anti-GITR, por ejemplo, los descritos en el presente documento, en la Tabla 4, que establece la identidad de cada uno de los dominios.
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En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra de IgG2 que comprendel SEQ ID NO: 291, 292, 293 o 294 o una variante de la misma, tal como una bisagra de IgG2 que comprende una secuencia de aminoácidos que (i) difiere del SEQ ID NO: 291, 292, 293 o 294 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 291,292, 293 o 294 en, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 291,292, 293 o 294 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al SEQ ID NO: 291, 292, 293 o 294, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa o una sustitución de aminoácidos no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista mejorada a un anticuerpo anti-GITR con respecto a otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2 o con respecto a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra que no es de IgG2.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH1 de IgG1 que comprendel SEQ ID NO: 278 o un dominio CH1 de IgG2 que comprende SEQ ID NO: 279, o una variante de SEQ ID NO: 278 o 279, variante que (i) difiere del SEQ ID NO: 278 o 279 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 278 o 279 en, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 278 o 279 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al SEQ ID NO: 278 o 279, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa o una sustitución de aminoácidos no conservativa; y en donde el anticuerpo anti-GITR que comprende una región constante de cadena pesada modificada tiene una actividad agonista mejorada con respecto a la del anticuerpo anti-GITR pero con otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2 o con respecto a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra que no es de IgG2.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH2 de IgG1 que comprendel SEQ ID NO: 280 o 281, o una variante del SEQ ID NO: 280 o 281, variante que (i) difiere del SEQ ID NO: 280 o 281 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 280 o 281 en, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 280 o 281 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al SEQ ID NO: 280 o 281, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa o una sustitución de aminoácidos no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista mejorada a un anticuerpo anti-GITR con respecto a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2 o con respecto a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra que no es de IgG2.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprende un dominio CH3 de IgG1 que comprendel SEQ ID NO: 282, o una variante del SEQ ID NO: 282, variante que (i) difiere del SEQ ID NO: 282 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 282 en, como máximo, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 282 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al SEQ ID NO: 282, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa o una sustitución de aminoácidos no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista mejorada con respecto a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2 o con respecto a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra que no es de IgG2.
Las regiones constantes de cadena pesada modificadas también pueden comprender una combinación de dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región constante de cadena pesada modificada que comprendel SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290, o una variante del SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290, variante que (i) difiere del SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290 en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (ii) difiere del SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290 en, como máximo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; (iii) difiere del SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 o 5-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al SEQ ID NO: 223, 224, 225, 226, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 o 290, en donde en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservativa o una sustitución de aminoácidos no conservativa; y en donde la región constante de cadena pesada modificada proporciona una actividad agonista mejorada con respecto a la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende una bisagra que no es de IgG2 o con respecto a la misma región constante de cadena pesada modificada que comprende una bisagra que no es de IgG2.
Las regiones constantes de cadena pesada modificadas pueden tener (i) función efectora (por ejemplo, unión a un FcyR) similar, reducida o aumentada con respecto a una región constante de cadena pesada de tipo silvestre y/o (ii) semivida (o unión al receptor FcRn) similar, reducida o aumentada con respecto a una región constante de cadena pesada de tipo silvestre.
111. Anticuerpos que tienen secuencias de línea germinal particulares
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea germinal particular.
Tal como se demuestra en el presente documento, se han preparado anticuerpos humanos específicos para GITR que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de o procede de un gen de línea germinal humana VH 3-33, gen VH 3-10, gen VH 3-15, VH 3-16, gen VH JH6b, gen VH 6-19, gen VH 4-34 y/o gen VH JH3b. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de o procede de un gen de línea germinal de VH humana seleccionado del grupo que consiste en: VH 3-33, VH 3-10, VH 3-15, VH 3-16, VH JH6b, VH 6-19, VH 4-34 y/o VH JH3b.
Se han preparado anticuerpos humanos específicos para GITR que comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto de o procede de un gen de línea germinal humana VK L6, gen VK L18, gen VK L15, gen VK L20, gen VK A27, gen VK JK5, gen VK JK4, gen VK JK2 y gen VK JK1. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto de o procede de un gen de línea germinal humana VK seleccionado del grupo que consiste en: VK L6, VK L18, VK L15, VK L20, VK A27, VK JK5, VK JK4, VK JK2 y VK JK1.
Los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento son los que comprenden una región variable de cadena pesada que es el producto de o procede de uno de los genes de línea germinal humana VH enumerados anteriormente y que también comprenden una región variable de cadena ligera que es el producto de o procede de uno de los genes de línea germinal humana VK enumerados anteriormente, como se muestra en las Figuras 2-11.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "procede de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o el cribado de una genoteca de inmunoglobulinas humanas presentada en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "procede de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana más próxima en secuencia (es decir, de mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "procede de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o a introducción intencionada del sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado normalmente es al menos un 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y contiene restos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como humano en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal murina). En casos determinados, un anticuerpo humano puede ser al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de línea germinal humana no mostrará más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En casos determinados, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.
IV. Anticuerpos homólogos
En el presente documento se describen anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento.
Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde:
(a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128 y 335, o comprende 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1 -10, 1-15, 1-20, 1-25 o 1-50 cambios de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos) con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 13, 26, 39, 52, 71,84, 97, 115, 128 y 335;
(b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130 y 336, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25 o 1-50 cambios de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos) con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130 y 336;
(c) el anticuerpo se une específicamente a GITR, y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión a GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión a GITr humano unido a membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cynomolgus, por ejemplo, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS; (5) inducción o mejora de la activación de células T, tal como en presencia de interacción de CD3 (por ejemplo, en presencia de concentraciones subóptimas de anti-CD3), como se evidencia, por (i) aumento de la producción de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan GITR y/o (ii) mayor proliferación de células T;
(6) inducción o mejora de la activación de células T sin requerir entrecruzamiento multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una CE50 de 1 |jg/ml o menos, como se mide por FACS;
(8) inhibición a lo sumo parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado;
(11) presencia de actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista;
(12) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones para unirse al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y 6G10.
El anticuerpo puede presentar uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve, diez, once o todas las propiedades funcionales enumeradas como (1) a (12) anteriormente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
Un anticuerpo anti-GITR aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en donde:
(a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41,43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361 y 362, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1­ 15, 1-20, 1-25 o 1-50 cambios de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos) con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135, 227-275, 337, 339, 340, 348-352, 361 y 362, con la condición de que, en determinadas realizaciones, si la secuencia es la de una cadena pesada sin efector, las mutaciones que hacen que la cadena pesada no tenga efector no se modifican (es decir, no se realiza ninguna modificación en A234, E235, A237, S330 y S331);
(b) la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341 y 371 o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25 o 1-50 cambios de aminoácido (es decir, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos) con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 57, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137, 338, 341 y 371;
(c) el anticuerpo se une específicamente a GITR, y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión a GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0. 01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cynomolgus, por ejemplo, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS; (5) inducción o mejora de la activación de células T, tal como en presencia de interacción de CD3 (por ejemplo, en presencia de concentraciones subóptimas de anti-CD3), como se evidencia, por (i) aumento de la producción de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan GITR y/o (ii) mayor proliferación de células T;
(6) inducción o mejora de la activación de células T sin requerir entrecruzamiento multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una CE50 de 1 jg/m l o menos, como se mide por FACS;
(8) inhibición como máximo parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado
(11) presencia de actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista; y
(12) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones para unirse al GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y 6G10.
También se proporcionan anticuerpos anti-GITR que comprenden un VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y/o VLCDR3 que difiere de la CDR correspondiente de 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10, en 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 cambios de aminoácidos (es decir, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos). Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender 1-5 cambios de aminoácidos en cada uno de 1,2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR con respecto a la secuencia correspondiente en 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10. Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un total de 1-5 cambios de aminoácidos en todas las CDR con respecto a las CDR en 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10.
Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender las CDR de VH y VL que consisten en las de 28F3, en donde uno o más de los aminoácidos en una o más CDR son los de uno de los otros anticuerpos anti-GITR desvelados en el presente documento.
Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un VHCDR1 que comprende una o más modificaciones de aminoácidos con respecto a SYGMH (SEQ ID NO: 20), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
SYGXH (SEQ ID NO: 372), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o F;
X1YGX2H, en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, S, N o D; y X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o F; y
X1YGX2X3, en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, S, N o D; X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o F, y X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, H o Q.
Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un VHCDR2 que comprende una o más modificaciones de aminoácidos con respecto a VIWYEGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 21), y puede comprender una de las siguientes secuencias degeneradas:
VIWYX1GSNKX2YADSVKG (SEQ ID NO: 373), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, E o A; y X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y o F; y
VIWYX1GSNKX2YX3DSVKG (SEQ ID NO: 374), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, E, A, G o D; X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y o F; y X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, A o V.
Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un VHCDR3 que comprende una o más modificaciones de aminoácidos con respecto a GGSMVRGDYYYGMDV (SEQ ID NO: 22), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
GGSX1VRGDYYYGMDV (SEQ ID NO: 375), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o V, L, I o A. GGSX1VRGX2YYYGMDV (SEQ ID NO: 376), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, M o V, L, I o A; y X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, D o E. En los Ejemplos se exponen combinaciones particulares de X1 y X2.
GG (6-7aa) MDVWYYX1MDVW (SEQ ID NO: 377), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, G, S o V. En ciertas realizaciones, los 6-7 aminoácidos corresponden a los aminoácidos en esa posición en una secuencia de VHCDR3 de un anticuerpo anti-GITR desvelado en el presente documento.
Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un VLCDR1 que comprende una o más modificaciones de aminoácidos con respecto a RASQGISSALA (SEQ ID NO: 23), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
RASQGISSXLA (SEQ ID NO: 378), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, A o W (o A, W o Y); y RASQG (2-3 aa) SXiLA (SEQ ID NO: 379), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, W, Y o A y los 2-3 aminoácidos son cualquier aminoácido, por ejemplo, GI, SVS o SVT.
Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un VLCDR2 que comprende una o más modificaciones de aminoácidos con respecto a DASSLES (SEQ ID NO: 24), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
DASSLXS (SEQ ID NO: 380), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, E o Q; y
X1ASSX2X3X4, en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, A, D o G; X4 es cualquier aminoácido, por ejemplo, L o R; X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Q, E o A; y X4 es cualquier aminoácido, por ejemplo, S o T.
Un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento puede comprender un VLCDR3 que comprende una o más modificaciones de aminoácidos con respecto a QQFNSYPYT (SEQ ID NO: 25), y puede comprender, por ejemplo, una de las siguientes secuencias degeneradas:
QQXNSYPYT (SEQ ID NO: 381), en donde X es cualquier aminoácido, por ejemplo, F o Y; y QQX1X2SX3PX4T (SEQ ID NO: 382), en donde X1 es cualquier aminoácido, por ejemplo, F o Y; X2 es cualquier aminoácido, por ejemplo, N o G; X3 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y o S; y X4 es cualquier aminoácido, por ejemplo, Y, W, I, P o Q.
Los anticuerpos que tienen secuencias con homología con las de 28F3, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8, 19D3, 18E10 y/o 6G10, por ejemplo, las regiones Vh y Vl de los SEQ ID NO: 13, 26, 39, 52, 71, 84, 97, 115, 128 y 335, y los SEQ ID NO: 14, 27, 40, 53, 54, 72, 85, 98, 99, 116, 129, 130 y 336, respectivamente, o cadenas pesadas y ligeras de los SEQ ID NO: 15, 17, 18, 28, 30, 31, 41, 43, 44, 55, 58, 59, 73, 75, 76, 86, 88, 89, 100, 102, 103, 117, 119, 120, 131, 134, 135 y 337, y de los SEQ ID NO: 16, 19, 29, 32, 42, 45, 56, 60, 61, 74, 87, 90, 101, 104, 105, 118, 121, 132, 133, 136, 137 y 338, respectivamente, o CDR, se pueden obtener por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican los SEQ ID n O: 147, 154, 158, 162, 168, 172, 176, 182, 186, 353 y/o los SEQ ID NO: 148, 155, 159, 163, 164, 169, 173, 177, 178, 183, 187, 188, 354 o los SEQ ID NO: 149, 151, 152, 156, 160, 165, 170, 174, 179, 184, 189, 355 y/o los SEQ ID NO: 150, 153, 157, 161, 166, 171, 175, 180, 185, 190, 191, 356, seguido del ensayo en el anticuerpo alterado codificado de la función conservada (es decir, las funciones establecidas en (1) a (12) anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.
V. Anticuerpos con modificaciones conservativas
Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden comprender una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento (por ejemplo, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8 y 6G10), o modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento. En consecuencia, un anticuerpo anti-GITR aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en donde:
(a) la secuencia de CDR3 de la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344, y modificaciones conservativas de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas;
(b) la secuencia CDR3 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de los SEQ ID NO: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347, y modificaciones conservativas de las mismas, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1­ 3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas;
(c) el anticuerpo se une específicamente a GITR, y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o todas las siguientes propiedades funcionales:
(1) unión a GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión a GITr humano unido a membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0. 01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cynomolgus, por ejemplo, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS; (5) inducción o mejora de la activación de células T, tal como en presencia de interacción de CD3 (por ejemplo, en presencia de concentraciones subóptimas de anti-CD3), como se evidencia, por (i) aumento de la producción de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan GITR y/o (ii) mayor proliferación de células T;
(6) inducción o mejora de la activación de células T sin requerir entrecruzamiento multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una CE50 de 1 |jg/ml o menos, como se mide por FACS;
(8) inhibición a lo sumo parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado;
(11) presencia de actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista; y
(12) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones por la unión a GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10.
En un aspecto descrito en el presente documento, la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343, y modificaciones conservativas de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas; y la secuencia de CDR2 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346, y modificaciones conservativas de las mismas, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas. En otro aspecto descrito en el presente documento, la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de los Se Q ID NO: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342, y modificaciones conservativas de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas; y la secuencia de CDR1 de la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345, y modificaciones conservativas de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservativas.
El anticuerpo puede presentar una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve, o todas las propiedades funcionales enumeradas como (1) a (12) anteriormente. Dichos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
También pueden realizarse sustituciones de aminoácidos conservativas en porciones de los anticuerpos que no sean, o además de, las CDR. Por ejemplo, pueden realizarse modificaciones conservativas de aminoácidos en una región marco o en la región Fc. Una región variable o una cadena pesada o ligera puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1 -25 o 1-50 sustituciones de aminoácidos conservativas con respecto a las secuencias de anticuerpos anti-GITR proporcionadas en el presente documento. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR comprende una combinación de modificación de aminoácidos conservativa y no conservativa.
VI. Anticuerpos que se unen al mismo epítopo en GITR que, o que compiten por unirse a GITR con, los anticuerpos descritos en el presente documento
También se proporcionan anticuerpos que compiten por la unión a GITR con los anticuerpos anti-GITR particulares descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8 y 6G10). Dichos anticuerpos competitivos pueden identificarse en función de su capacidad para inhibir competitivamente la unión a GITR de uno o más de los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 en ensayos de unión a GITR estándar. Por ejemplo, pueden usarse ensayos ELISA estándar o ensayos ELISA competitivos en los que se inmoviliza una proteína GITR humana recombinante en la placa, se agregan varias concentraciones del primer anticuerpo no marcado, se lava la placa, se agrega el segundo anticuerpo marcado y se mide la cantidad de marcador. Si la concentración creciente del (primer) anticuerpo no marcado (también denominado "anticuerpo de bloqueo") inhibe la unión del (segundo) anticuerpo marcado, se dice que el primer anticuerpo inhibe la unión del segundo anticuerpo a la diana en la placa, o se dice que compite con la unión del segundo anticuerpo. Además, o como alternativa, Se puede usar el análisis BIAcore para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión de un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento a GITR demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con el anticuerpo por la unión a GITR.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-GITR que inhiben la unión de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento a GITR en las células, por ejemplo, células T activadas, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % y/o cuya unión a GITR en las células, por ejemplo, células T activadas, se inhibe en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, por ejemplo, según se mide por ELISA o FACS, tal como mediante el uso del ensayo descrito en el siguiente párrafo.
Un experimento de competencia a modo de ejemplo para determinar, por ejemplo, si un primer anticuerpo bloquea la unión de (es decir, "compite con") un segundo anticuerpo, puede realizarse de la siguiente manera: se preparan células T humanas activadas de la siguiente manera: se aíslan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre entera humana usando gradiente de Ficoll y se activan con 10 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA-L) (USBiol#P3370-30) y 200 UI/ml de IL-2 recombinante (Peprotech#200-02) durante 3 días. Las células T activadas se resuspenden en tampón FACS (PBS con suero bovino fetal al 5%) y se siembran a 105 células por pocillo de muestra en una placa de 96 pocillos. La placa se pone en hielo seguido de la adición del primer anticuerpo no conjugado a concentraciones que varían de 0 a 50 pg/ml (titulación triple a partir de una concentración máxima de 50 pg/ml). Se puede utilizar una IgG no relacionada como control de isotipo para el primer anticuerpo y agregarse a las mismas concentraciones (titulación triple a partir de una concentración máxima de 50 pg/ml). Como control positivo puede incluirse una muestra preincubada con 50 pg/ml de segundo anticuerpo no marcado para el bloqueo completo (100% de inhibición) y como control negativo puede usarse una muestra sin anticuerpo en la incubación primaria (sin competencia; 0% de inhibición). Después de 30 minutos de incubación, se agrega el segundo anticuerpo marcado, por ejemplo, biotinilado, a una concentración de 2 pg/ml por pocillo sin lavado. Las muestras se incuban durante otros 30 minutos en hielo. Los anticuerpos no unidos se retiran lavando las células con tampón FACS. El segundo anticuerpo marcado unido a las células se detecta con un agente que detecta el marcador, por ejemplo, estreptavidina conjugada con PE (Invitrogen, n.° de catálogo S21388) para detectar biotina. Las muestras se adquieren en un citómetro de flujo FACS Calibur (BD, San José) y se analizan con el software Flowjo (Tree Star, Inc, Ashland, OR). Los resultados pueden representarse como el % de inhibición (es decir, restando del 100% la cantidad de marcador a cada concentración dividida por la cantidad de marcador obtenida sin anticuerpo de bloqueo). Normalmente, después se realiza el mismo experimento a la inversa, es decir, el primer anticuerpo es el segundo anticuerpo y el segundo anticuerpo es el primer anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo al menos parcialmente (por ejemplo, al menos en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) o completamente (100 %) bloquea la unión del otro anticuerpo a la diana, por ejemplo, GITR humano o una porción del mismo, e independientemente de si la inhibición se produce cuando uno o el otro anticuerpo es el primer anticuerpo. Un primer y un segundo anticuerpo "bloquean de forma cruzada" entre sí la unión a la diana, cuando los anticuerpos compiten entre sí de ambas formas, es decir, en experimentos de competición en los que primero se agrega el primer anticuerpo y en experimentos de competición en los que primero se agrega el segundo anticuerpo. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen al mismo epítopo que el de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1,9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10), por ejemplo, como se determina por una técnica de mapeo de epítopos dada. Como se analiza más adelante en el presente documento, el anticuerpo 28F3 se une dentro de una región en GITR humano dentro de QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215).
En consecuencia, en determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se une a restos de aminoácidos dentro de la región QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215), que corresponde a los restos de aminoácidos 1-39 de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4). En una realización, el anticuerpo anti-GITR se une a restos de aminoácidos dentro de la región QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 216) de GITR humano maduro. En una realización, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento se unen a restos de aminoácidos dentro de la región PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218) de GITR humano maduro. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR se unen a las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218), como se determina por HDX, por ejemplo, utilizando el protocolo establecido en los Ejemplos.
Las técnicas para determinar los anticuerpos que se unen al "mismo epítopo en GITR" con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como, análisis de rayos X de cristales de complejos de antígeno: anticuerpo que proporcionan la resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en las que la pérdida de unión debida a una modificación de un resto de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno se considera a menudo una indicación de un componente de epítopo. Además, también se pueden utilizar métodos combinatorios computacionales para el mapeo de epítopos. Los métodos también se pueden basar en la capacidad de un anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos (ya sea en forma tridimensional nativa o en forma desnaturalizada) a partir de bibliotecas combinatorias de péptidos de presentación en fagos. Por tanto, los péptidos se consideran importantes para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para cribar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que, según se ha demostrado, mapean epítopos conformacionales discontinuos.
Los anticuerpos que compiten por la unión con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden identificarse por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones con GITR humano como se describe en el presente documento, producirse hibridomas y cribarse los anticuerpos monoclonales resultantes con respecto a la capacidad de competir con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a GITR. Los ratones también pueden inmunizarse con un fragmento más pequeño de GITR que contiene el epítopo al que se une el anticuerpo. El epítopo o región que comprende el epítopo puede localizarse por, por ejemplo, cribado con respecto a la unión a una serie de péptidos superpuestos que abarcan GITR. Como alternativa, el método de Jespers et al., Biotechnology 12: 899, 1994 puede usarse para guiar la selección de anticuerpos que tienen el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares al anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento. Utilizando la presentación en fagos, primero, la cadena pesada del anticuerpo anti-GITR se empareja con un repertorio de cadenas ligeras (preferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo de unión a GITR, y luego la nueva cadena ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesadas (preferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo de unión a GITR (preferentemente humano) que tiene el mismo epítopo o región de epítopo que un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento. Como alternativa, las variantes de un anticuerpo descrito en el presente documento pueden obtenerse por mutagénesis de ADNc que codifica las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo.
La mutagénesis por barrido de alanina, como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081-1085, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de restos de aminoácidos en GITR también se puede usar para determinar el epítopo funcional para un anticuerpo anti-GITR. Los estudios de mutagénesis, sin embargo, también puede revelar restos de aminoácidos que son cruciales para la estructura tridimensional general de GITR pero que no están directamente involucrados en los contactos antígeno-anticuerpo y, por lo tanto, pueden ser necesarios otros métodos para confirmar un epítopo funcional determinado usando este método.
El epítopo o región del epítopo (una "región del epítopo" es una región que comprende el epítopo o se superpone con el epítopo) al que se une un anticuerpo específico también puede determinarse evaluando la unión del anticuerpo a péptidos que comprenden fragmentos de GITR, por ejemplo, fragmentos no desnaturalizados o desnaturalizados. Una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia de GITR (por ejemplo, GITR humano) puede sintetizarse y cribarse con respecto a la unión, por ejemplo, en un ELISA directo, un ELISA competitivo (donde se evalúa la capacidad del péptido para evitar la unión de un anticuerpo a GITR unido a un pocillo de una placa de microtitulación), o en un chip. Tales métodos de cribado de péptidos pueden no ser capaces de detectar algunos epítopos funcionales discontinuos, es decir, epítopos funcionales que implican restos de aminoácidos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena polipeptídica de GITR.
Un epítopo también puede identificarse por ensayos para determinar huella de proteínas basados en MS, tales como espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) y la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). La HDX-MS puede llevarse a cabo, por ejemplo, como se describe adicionalmente en los Ejemplos y en Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95. La FPOp puede llevarse a cabo como se describe, por ejemplo, en Hambley y Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057.
El epítopo unido por anticuerpos anti-GITR también puede determinarse por métodos estructurales, tales como la determinación de la estructura cristalina de rayos X (por ejemplo, documento WO2005/044853), modelado molecular y espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), incluyendo la determinación de RMN de las tasas de intercambio H-D de hidrógenos de amida lábiles en GITR cuando está libre y cuando está unido en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
Con respecto a la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189: 1-23), incluyendo microbatch (por ejemplo, Chayen (1997) Estructura 5: 1269-1274), difusión de vapor de gota colgante (por ejemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251: 6300-6303), siembra y diálisis. Es deseable usar una preparación de proteína que tenga una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml y, preferentemente, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se puede lograr mejor en una solución precipitante que contenga polietilenglicol 1000-20.000 (PEG; con un peso molecular promedio que varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), preferentemente de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7000 Da, más preferentemente de aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varían de aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 30 % (p/v). También puede ser deseable incluir un agente estabilizador de proteínas, por ejemplo, glicerol a una concentración que varía de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 20 %. También puede ser deseable en la solución precipitante una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio, preferentemente en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante se tampona preferentemente a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0, preferentemente de aproximadamente 4,0. Los tampones específicos útiles en la solución precipitante pueden variar y son bien conocidos en la técnica (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Tercera ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Los ejemplos de tampones útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales pueden crecer a un amplio intervalo de temperaturas, incluyendo 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.
Anticuerpo: los cristales de antígeno pueden estudiarse utilizando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y pueden refinarse utilizando software informático como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 y 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0014194) y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A: 361-423, Carter y Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56: 1313-1323).
Los anticuerpos anti-GITR pueden unirse al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos anti-GITR que tienen secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, como se determina por una técnica de mapeo de epítopos, tal como una técnica descrita en el presente documento.
VII. Anticuerpos diseñados por ingeniería genética y modificados
Regiones VH y VL
También se proporcionan anticuerpos modificados por ingeniería genética y diseñados que pueden prepararse usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de Vh y/o Vl desveladas en el presente documento como material de partida para diseñar por ingeniería genética un anticuerpo modificado, pudiendo tener dicho anticuerpo modificado propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo descrito en el presente documento se puede diseñar por ingeniería genética modificando uno o más restos en una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco. Además, o como alternativa, se puede diseñar por ingeniería genética un anticuerpo modificando restos en la región o regiones constantes, por ejemplo, para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de diseño por ingeniería genética de la región variable que se puede realizar es el injerto de CDR. Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana de manera predominante a través de restos de aminoácidos que están localizados en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias de las CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural específicos construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico de origen natural injertadas en secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033; Patente de Estados Unidos N.° 5.225.539 de Winter y Patentes de Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al).
En consecuencia, otra realización descrita en el presente documento se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342, los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343, y los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345, los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346, y los SEQ ID NO: 25, 38, 51,67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347, respectivamente. Por lo tanto, tales anticuerpos contienen las secuencias de CDR de Vh y Vl de anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10, aunque pueden contener diferentes secuencias marco de estos anticuerpos.
Dichas secuencias marco se pueden obtener a partir de bases de datos públicas de ADN o de referencias publicadas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, se pueden encontrar secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de cadena pesada y ligera humana en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de la NIH N.° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836.
Son secuencias marco preferidas para su uso en los anticuerpos descritos en el presente documento las que son estructuralmente similares a las secuencias marco utilizadas por los anticuerpos descritos en el presente documento. Las secuencias de CDR1,2 y 3 de Vh, y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vl, pueden injertarse en regiones marco que tienen una secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de línea germinal del que procede la secuencia marco, o las secuencias CDR pueden injertarse en regiones marco que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en determinados casos, es beneficioso mutar restos en las regiones marco para mantener o potenciar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al).
Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética del presente documento incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en restos de la región marco en Vh y/o Vl, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones en la región marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a una mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de línea germinal de la que procede el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de línea germinal de la que procede el anticuerpo. Para restablecer las secuencias de la región marco a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende abarcar dichos anticuerpos "retromutados". Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T para reducir de este modo la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque también se conoce como "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20030153043 de Carr et al.
Otro tipo de modificación de región variable es mutar restos de aminoácidos dentro de la CDR1, CDR2 y/o CDR3 de Vh y/o Vl, para mejorar de ese modo una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Se pueden realizar mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR para introducir la mutación o mutaciones, y el efecto sobre la unión de los anticuerpos y otra propiedad de interés, se pueden evaluar en ensayos in vitro o in vivo como se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos. Preferentemente se introducen modificaciones conservativas (como se ha analizado anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pero preferentemente son sustituciones. Además, normalmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos dentro de una región CDR.
En consecuencia, también se proporcionan anticuerpos monoclonales anti-GITR aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342; (b) una región CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343; (c) una región CDR3 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344; (a) una región CDR1 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345; (e) una región CDR2 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346; y (f) una región CDR3 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 25, 38, 51,67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con los SEQ ID NO: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347.
Los restos de metionina en las CDR de los anticuerpos pueden oxidarse, dando como resultado una posible degradación química y la consiguiente reducción en la potencia del anticuerpo. En consecuencia, también se proporcionan anticuerpos anti-GITR que tienen uno o más restos de metionina en las CDR de cadena pesada y/o ligera reemplazados por restos de aminoácidos que no sufren degradación oxidativa. En una realización, los restos de metionina en las CDR de los anticuerpos 28F3, 18E10, 19D3 y 6G10 se reemplazan por restos de aminoácidos que no sufren degradación oxidativa.
De manera similar, pueden eliminarse sitios de desamidación de los anticuerpos anti-GITR, particularmente en las CDR.
Fc y Fc modificados
Las regiones variables de anti-GITR descritas en el presente documento pueden estar unidas (por ejemplo, unidas covalentemente o fusionadas) a un Fc, por ejemplo, un Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que puede ser de cualquier alotipo o isoalotipo, por ejemplo, para IgG1: G1m, G1m1(a), G1m2(x), G1m3(f), G1m17(z); para IgG2: G2m, G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); y para K: Km, Km1, Km2, Km3 (véase, por ejemplo, Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1).
En ciertas realizaciones, las regiones variables de anti-GITR descritas en el presente documento están unidas a un Fc que se une a uno o más receptores de Fc de activación (FcyI, FcYIIa o FcYIIIa) y, por lo tanto, estimulan la ADCC y pueden causar el agotamiento de células T. En ciertas realizaciones, las regiones variables de anti-GITR descritas en el presente documento están unidas a un Fc que causa el agotamiento. Como se describe adicionalmente en los Ejemplos (Ejemplos 16 y 17), los isotipos IgG2a de ratón e IgG2b de rata (equivalentes a IgG2a de ratón en la unión a FcR de activación de ratón) indujeron la mayor inhibición del crecimiento tumoral en varios modelos de tumor de ratón. los isotipos mG2a, mG2b y rG2b de anti-GITR tuvieron poco efecto o indujeron pequeños aumentos en las poblaciones de Treg en la periferia frente a la inducción de un agotamiento significativo de Treg en el entorno del tumor, que se correlacionó con la inhibición del crecimiento tumoral. Por el contrario, el isotipo mIgG2a causó un aumento en el porcentaje de células CD8+ en el sitio del tumor, mientras que mIgG1 e IgG2b de rata no causaron, o solo causaron un aumento marginal en, el porcentaje de células CD8+. En consecuencia, en determinadas realizaciones, las regiones variables de anti-GITR descritas en el presente documento están unidas a un Fc de IgG1 o IgG3 humana, es decir, los anticuerpos son del isotipo IgG1 o IgG3. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR son anticuerpos de agotamiento, en particular, agotan las células Treg que se encuentran en el microambiente tumoral (y, por lo tanto, mejoran la actividad antitumoral), pero no agotan significativamente las células Tef que se encuentran en el microambiente tumoral y median el efecto antitumoral, y/o no agotan significativamente las células Treg y Tef que están fuera del tumor, por ejemplo, en la periferia. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR son de un isotipo (ya sea natural o no natural (por ejemplo, incluyendo una o más mutaciones) que estimulan el agotamiento o eliminación de células Treg en el sitio del tumor y la activación concomitante de células Tef. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR crean una relación elevada entre Tef y Treg en el sitio del tumor, que es indicativa de una potente actividad antitumoral y, preferentemente, sin agotar significativamente las células Treg y Tef que están fuera del tumor, por ejemplo, en la periferia. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR bloquean la actividad inmunosupresora de las Treg. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR tienen un receptor de Fc sin, o con una unión reducida a FcR, por ejemplo, una unión reducida a FcR de activación. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR tienen un Fc que se une o tiene una unión mejorada a FcRIIb, que puede proporcionar agonismo mejorado.
En ciertas realizaciones, se mejora la potencia de un anticuerpo anti-GITR para potenciar una respuesta inmunitaria endógena, optimizada o maximizada por un método que comprende seleccionar, diseñar o modificar la región Fc del anticuerpo para mejorar la unión de dicha región Fc a un receptor de Fc de activación. En una realización, el anticuerpo anti-GITR es TRX-518.
En ciertas realizaciones, las regiones variables de anti-GITR descritas en el presente documento están unidas a un Fc sin efector o esencialmente sin efecto, por ejemplo, IgG2 o IgG4.
Las regiones variables de anti-GITR descritas en el presente documento pueden estar unidas a una región Fc no natural, por ejemplo, un Fc sin efector o un Fc con unión mejorada a uno o más receptores de Fc de activación (FcyI, FcYIIa o FcYIIIa), tal como para mejorar el agotamiento de Treg en el ambiente tumoral.
Generalmente, las regiones variables descritas en el presente documento pueden estar unidas a un Fc que comprende una o más modificaciones, normalmente, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo descrito en el presente documento se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir uno o más grupos químicos al anticuerpo) o se puede modificar para alterar su glucosilación, para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle más adelante. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice de EU de Kabat.
La región "Fc" abarca dominios que proceden de la región constante de una inmunoglobulina, preferentemente una inmunoglobulina humana, incluyendo un fragmento, un análogo, una variante, un mutante o derivado de la región constante. Las inmunoglobulinas incluyen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y otras clases tales como IgA, IgD, IgE e IgM. La región constante de una inmunoglobulina se define como un polipéptido de origen natural o producido de forma sintética homólogo a la región C-terminal de inmunoglobulina, y puede incluir un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3 o un dominio CH4, por separado o en combinación.
La región constante de una inmunoglobulina es responsable de muchas funciones importantes del anticuerpo, entre las que se incluyen la unión al receptor de Fc (FcR) y la fijación del complemento. Hay cinco clases principales de región constante de cadena pesada, clasificadas como IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, cada una con funciones efectoras características designadas por el isotipo. Por ejemplo, la IgG se separa en cuatro subclases conocidas como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Las moléculas de Ig interaccionan con múltiples clases de receptores celulares. Por ejemplo, las moléculas de IgG interaccionan con tres clases de receptores Fcy (FcyR) específicos para la clase de IgG del anticuerpo, particularmente FcyRI, FcyRII y FcyRIII. Se ha informado que las secuencias importantes para la unión de IgG a los receptores FcyR se encuentran en los dominios CH2 y CH3. La semivida en suero de un anticuerpo está influenciada por la capacidad de ese anticuerpo para unirse a un receptor de Fc (FcR).
En ciertas realizaciones, la región Fc es una región Fc variante, por ejemplo, una secuencia Fc que se ha modificado (por ejemplo, por sustitución, deleción y/o inserción de aminoácidos) con respecto a una secuencia Fc parental (por ejemplo, un polipéptido Fc no modificado que posteriormente se modifica para generar una variante), para proporcionar características estructurales y/o actividad biológica deseables.
Por ejemplo, se pueden realizar modificaciones en la región Fc para generar una variante de Fc que (a) tenga la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) aumentada o disminuida, (b) tenga la citotoxicidad mediada por el complemento (CDC) aumentada o disminuida, (c) tenga la afinidad por C1q aumentada o disminuida y/o (d) tenga la afinidad por un receptor de Fc aumentada o disminuida con respecto al Fc parental. Dichas variantes de la región Fc generalmente comprenderán al menos una modificación de aminoácidos en la región Fc. Se cree que la combinación de modificaciones de aminoácidos es particularmente deseable. Por ejemplo, la región Fc variante puede incluir dos, tres, cuatro, cinco, etc., sustituciones en la misma, por ejemplo, de las posiciones específicas de la región Fc identificadas en el presente documento.
Una región Fc variante también puede comprender una alteración de secuencia en la que los aminoácidos implicados en la formación del enlace disulfuro se eliminan o reemplazan con otros aminoácidos. Dicha eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contienen cisteína presentes en la célula hospedadora utilizada para producir los anticuerpos descritos en el presente documento. Incluso cuando se eliminan los restos de cisteína, los dominios Fc de cadena sencilla siguen pudiendo formar un dominio Fc dimérico que se mantiene unido de manera no covalente, En otras realizaciones, la región Fc puede modificarse para hacerla más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, se puede eliminar la secuencia PA cerca del extremo N de una región Fc nativa típica, que puede ser reconocida por una enzima digestiva en E. coli tal como la prolina iminopeptidasa. En otras realizaciones,
se pueden eliminar uno o más sitios de glucosilación dentro del dominio Fc. Los restos que suelen estar glicosilados
(por ejemplo, asparagina) pueden conferir una respuesta citolítica. Dichos restos pueden delecionarse o sustituirse
con restos no glucosilados (por ejemplo, alanina). En otras realizaciones, pueden eliminarse de la región Fc sitios
implicados en la interacción con el complemento, tales como el sitio de unión a C1q. Por ejemplo, se puede eliminar o
sustituir la secuencia EKK de la IgG1 humana. En ciertas realizaciones, pueden eliminarse sitios que afectan la unión
a los receptores de Fc, preferentemente sitios distintos de los sitios de unión al receptor de rescate. En otras
realizaciones, una región Fc puede modificarse para eliminar un sitio de ADCC. Los sitios de ADCC son conocidos en
la técnica; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) con respecto a los sitios de ADCC en IgG1. Se
desvelan ejemplos específicos de dominios Fc variantes, por ejemplo, en los documentos WO 97/34631 y WO
96/32478.
En una realización, la región bisagra de Fc se modifica de tal manera que se altera el número de restos de cisteína en
la región bisagra, por ejemplo, se aumenta o se disminuye. Este enfoque se describe más detalladamente en la Patente
de Estados Unidos N.° 5.677.425 de Bodmer et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de Fc se altera
para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad
del anticuerpo. En una realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida
biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de
la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-bisagra de manera que el anticuerpo tiene una unión a la proteína
A estafilocócica (SpA) deteriorada con respecto a la unión a SpA del dominio Fc-bisagra nativo. Este enfoque se
describe con más detalle en la Patente de Estados Unidos N.° 6.165.745 de Ward et al.
En otras realizaciones más, se altera la región Fc reemplazando al menos un resto de aminoácido por un resto de
aminoácido diferente para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos
seleccionados de los restos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un
resto de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero
conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector para el que se altera la afinidad
puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más
detalle en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.
En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos 329, 331 y 322 se pueden
sustituir por un resto de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tenga una unión a C1q alterada y/o una
citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Este enfoque se describe con más detalle en
las Patentes de Estados Unidos N.° 6.194.551 de Idusogie et al.
En otro ejemplo, se alteran uno o más restos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 para
alterar así la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe con más detalle en la
Publicación PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.
En otro ejemplo más, la región Fc puede modificarse para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(ADCC) y/o aumentar la afinidad por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones:
234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 268, 269, 270, 272, 276, 278,
Figure imgf000044_0001
280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293,
Figure imgf000044_0002
29 296, 298, 299, 301, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332 333, 33
Figure imgf000044_0003
335, 337, 338, 340, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 o 439. Las sustituciones a modo de ejemplo
incluyen 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D y 332E. Las variantes a modo de ejemplo incluyen
239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T y 267E/268F/324T. Otras
modificaciones para mejorar las interacciones de FcyR y el complemento incluyen, pero sin limitación, las sustituciones
298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D), 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I y 396L. Estas
y otras modificaciones se revisan en Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691.
Las modificaciones de Fc que aumentan la unión a un receptor Fcy incluyen modificaciones de aminoácidos en una
cualquiera o más de las posiciones de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269,
270, 272, 279, 280, 283, 285, 298, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 312, 315, 324, 327,
329, 330, 335, 337, 3338, 340, 360, 373, 376, 379, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439
de la región Fc, en donde la numeración de los restos en la región Fc es la del índice de EU como en Kabat (documento
WO00/42072).
Otras modificaciones de Fc que se pueden hacer en los Fc son las que reducen o eliminan la unión a FcyR y/o
proteínas del complemento, reduciendo o eliminando de esta manera funciones efectoras mediadas por Fc tales como
ADCC, ADCP y CDC. Las modificaciones a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, sustituciones, inserciones
y deleciones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 y 328, en donde la numeración está de acuerdo con
el índice de EU. Las sustituciones a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, 234G, 235G, 236R, 237K, 267R,
269R, 325L y 328R, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de EU. Una variante de Fc puede
comprender 236R/328R. Otras modificaciones para reducir FcyR y las interacciones del complemento incluyen las
sustituciones 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P
y 234V, así como la eliminación de la glucosilación en la posición 297 por medios mutacionales o enzimáticos o por producción en organismos tales como bacterias que no glucosilan proteínas. Estas y otras modificaciones se revisan en Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology 20: 685-691.
Opcionalmente, la región Fc puede comprender un resto de aminoácido no natural en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la materia (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091; 8.101.720; y las Publicaciones de Patente PCT WO 00/42072; WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 y WO 06/020114).
También se pueden usar variantes de Fc que mejoran la afinidad por un receptor inhibidor FcyR11b. Dichas variantes pueden proporcionar una proteína de fusión de Fc con actividades inmunomoduladoras relacionadas con células FcyR11b+, entre las que se incluye, por ejemplo, células B y monocitos. En una realización, las variantes de Fc proporcionan afinidad selectivamente mejorada a FcyR11b con respecto a uno o más receptores de activación. Las modificaciones para alterar la unión a FcyR11b incluyen una o más modificaciones en una posición seleccionada del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332, de acuerdo con el índice de EU. Las sustituciones a modo de ejemplo para mejorar la afinidad de FcyR11b incluyen, pero sin limitación, 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y y 332E. Las sustituciones a modo de ejemplo incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y. Otras variantes de Fc para mejorar la unión a FcyR11b incluyen 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E y 267E/328F.
Las afinidades y propiedades de unión de una región Fc por su ligando pueden determinarse por varios métodos de ensayo in vitro (ensayos basados en bioquímica o inmunología) conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)), o cinética (por ejemplo, análisis BIACORE) y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador en uno o más de los componentes que se están examinando y/o emplear varios métodos de detección que incluyen, pero sin limitación, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos. Puede encontrarse una descripción detallada de las afinidades de unión y la cinética en Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Filadelfia (1999), que se centra en las interacciones anticuerpo-inmunógeno.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, esto puede hacerse aumentando la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. Por ejemplo, pueden mutarse uno o más de los siguientes restos: 252, 254, 256, 433, 435, 436, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 6.277.375. Las sustituciones a modo de ejemplo específicas incluyen una o más de los siguientes: T252L, T254S y/o T256F. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, se puede alterar el anticuerpo dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al. Otras variantes a modo de ejemplo que aumentan la unión a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen sustituciones en las posiciones 259, 308, 428 y 434, incluyendo, por ejemplo, 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y y 434M. Otras variantes que aumentan la unión de Fc a FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al.
2006 Journal of Immunology 176: 346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001,276(9): 6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 4331, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281: 23514-23524). Otras modificaciones para modular la unión de FcRn se describen en Yeung et al., 2010, J Immunol, 182: 7663-7671. En ciertas realizaciones, Se pueden usar isotipos híbridos de IgG con características biológicas particulares. Por ejemplo, se puede construir una variante híbrida IgG1/IgG3 sustituyendo las posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de IgG3 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir una variante híbrida de anticuerpo IgG que comprenda una o más sustituciones, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 4221,435r y 436F. En otras realizaciones descritas en el presente documento, se puede construir una variante híbrida IgG1/IgG2 sustituyendo las posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG1 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir una variante híbrida de anticuerpo IgG que comprenda una o más sustituciones, por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, -236G (que se refiere a una inserción de una glicina en la posición 236), y 327A.
Además, los sitios de unión sobre la IgG1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Se demostró que mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII. Adicionalmente, se demostró que los siguientes mutantes de combinación mejoran la unión de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A, que, según se ha demostrado, presenta una mejor unión de FcYRIIIa y actividad ADCC (Shields et al. 2001). Se han identificado otras variantes de IgG1 con una unión fuertemente mejorada a FcYRIIIa, entre las que se incluyen las variantes con mutaciones S239D/I332E y S239D/I332E/A330L que mostraron el mayor aumento de afinidad por FcYRIIIa, una disminución en la unión de FcYRIIb y una fuerte actividad citotóxica en monos cynomolgus (Lazar et al. 2006). La introducción de las mutaciones triples en anticuerpos como el alemtuzumab (específico de CD52), trastuzumab (específico para HER2/neu), rituximab (específico de CD20) y cetuximab (específico de EGFR) se tradujo en una actividad ADCC muy mejorada in vitro y la variante S239D/I332E mostró una capacidad mejorada para agotar las células B en monos (Lazar et al. 2006). Además, se han identificado mutantes de IgG1 que contienen mutaciones L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L que mostraron una unión mejorada a FcYRIIIa y una actividad ADCC mejorada concomitantemente en ratones transgénicos que expresaban FcYRIIIa humano en modelos de neoplasias de células B y cáncer de mama (Stavenhagen et al. 2007; Nordstrom et al. 2011). Otros mutantes de Fc que pueden usarse incluyen: S298A/E333A/l334A, S239D/I332E, S239D/I332E/A330L, L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L y M428L/N434S.
En ciertas realizaciones, se elige un Fc que tiene una unión reducida a los FcyR. Un Fc a modo de ejemplo, por ejemplo, Fc de IgG1, con unión reducida de FcyR comprende las siguientes tres sustituciones de aminoácidos: L234a , L235E y G237A.
En ciertas realizaciones, Se elige un Fc que tiene una fijación del complemento reducida. Un Fc a modo de ejemplo, por ejemplo, Fc de IgG1, con fijación del complemento reducida tiene las dos siguientes sustituciones de aminoácidos: A330SyP331S.
En ciertas realizaciones, se elige un Fc que esencialmente no tenga función efectora, es decir, tenga una unión reducida a los FcyR y una fijación del complemento reducida. Un Fc a modo de ejemplo, por ejemplo, Fc de IgG1, que no tiene efector comprende las cinco siguientes mutaciones: L234A, L235E, G237A, A330S y P331S. En la Tabla 11 se exponen cadenas pesadas a modo de ejemplo que comprenden estas mutaciones.
Cuando se usa un dominio constante de IgG4, por lo general, es preferible incluir la sustitución S228P, que imita la secuencia de la bisagra de IgG1 y, por lo tanto, estabiliza las moléculas de IgG4.
En otra realización más, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación marco de la región variable para eliminar de ese modo la glucosilación en ese sitio. Tal aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tal enfoque se describe con más detalle en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.
La glucosilación de la región constante en N297 puede evitarse mutando el resto N297 a otro resto, por ejemplo, N297A, y/o mutando un aminoácido adyacente, por ejemplo, 298 para de ese modo reducir la glucosilación en N297.
Además, o como alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de restos de fucosilo o un anticuerpo que tiene aumentadas las estructuras GlcNAc bisectadas. Se ha demostrado que tales patrones de glucosilación alterada aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr mediante, por ejemplo, la expresión del anticuerpo en una célula hospedadora con la maquinaria de glucosilación alterada. En la técnica se han descrito células con la maquinaria de glucosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes descritos en el presente documento para producir de este modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hanai et al. describe una línea celular con un gen FUT8 alterado funcionalmente, que codifica una fucosiltransferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal línea celular presentan hipofucosilación. La Publicación de PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la línea celular CHO, células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a los carbohidratos enlazados a Asn(297), que también da como resultado una hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo, la beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que tales anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas por ingeniería genética presentan un aumento de estructuras GlcNac bisectadas que da como resultado una actividad ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180).
Otra modificación de los anticuerpos descritos en el presente documento es la pegilación. Se puede pegilar un anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en el suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, La pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi- (C1-C10) o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. En la técnica se conocen métodos para pegilar proteínas y se pueden aplicar a los anticuerpos descritos en el presente documento. Véase, por ejemplo, el documento EP 0 154 316 por Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 por Ishikawa et al.
VIII. Propiedades físicas de los anticuerpos
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden contener uno o más sitios de glucosilación en la región variable de cadena ligera o pesada. Dichos sitios de glucosilación pueden dar como resultado un aumento de la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración del pK del anticuerpo debido a la unión al antígeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41: 673-702; Gala y Morrison (2004) J. Immunol 172: 5489-94; Wallick et al. (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316: 452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37: 697-706). Se sabe que la glucosilación se produce en motivos que contienen una secuencia NXS/T. En algunos casos, Se prefiere tener un anticuerpo anti-GITR que no contenga glucosilación de región variable. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glucosilación en la región variable o mutando restos dentro de la región de glucosilación.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento no contienen sitios de isomería de asparagina. La desamidación de la asparagina se puede producir en secuencias N-G o D-G y dar como resultado la creación de un resto de ácido isoaspártico que introduce un pliegue en la cadena del polipéptido y disminuye su estabilidad (efecto del ácido isoaspártico).
Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pi), que generalmente cae en el intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pI para un anticuerpo IgG1 generalmente se encuentra dentro del intervalo de pH de 7-9.5 y el pI para un anticuerpo IgG4 normalmente se encuentra dentro del intervalo de pH de 6-8. Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal pueden tener algún desplegamiento e inestabilidad en condiciones in vivo.. Por lo tanto, se prefiere tener un anticuerpo anti-GITR que contenga un valor de pI que se encuentre en el intervalo normal. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos con un pI en el intervalo normal o mutando restos de superficie cargados.
Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, indicando una temperatura de fusión más alta una mayor estabilidad general in vivo (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3: 361-71). Generalmente, se prefiere que el Tm1 (la temperatura de desplegamiento inicial) sea superior a 60 °C, preferentemente mayor que 65 °C., incluso más preferentemente mayor que 70 °C. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorimetría diferencial de barrido (Chen et al (2003) Pharm Res 20: 1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68: 47-52) o dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40: 343-9). En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67: 3626-32).
En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínimos, que puede conducir a la activación de una respuesta inmunitaria no deseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. Generalmente, son aceptables anticuerpos con una agregación del 25 % o menos, preferentemente del 20 % o menos, incluso más preferentemente del 15 % o menos, incluso más preferentemente del 10 % o menos e, incluso más preferentemente, del 5 % o menos. La agregación se puede medir mediante varias técnicas, entre las que se incluyen la columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y dispersión de luz.
IX. Métodos de diseño de anticuerpos por ingeniería genética
Como se ha analizado anteriormente, pueden usarse anticuerpos anti-GITR que tienen secuencias de Vh y Vl desveladas en el presente documento para crear nuevos anticuerpos anti-GITR modificando las secuencias VH y/o VL, o la región o regiones constantes unidas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto descrito en el presente documento, las características estructurales de un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento, por ejemplo, 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8 y 6G10 se usan para crear anticuerpos anti-GITR estructuralmente relacionados que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos descritos en el presente documento, tales como la unión a GITR humano y GITR cynomolgus. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8 y 6G10, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de forma recombinante con regiones marco conocidas y/u otras CDR para crear más anticuerpos anti-GITR diseñados por ingeniería genética de manera recombinante descritos en el presente documento, como se ha analizado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño por ingeniería genética es una o más de las secuencias de Vh y/o Vl proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de Vh y/o Vl proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Más bien, la información contenida en la secuencia o secuencias se usa como material de partida para crear una o más secuencias de "segunda generación" derivadas de la secuencia o secuencias originales y, después, la secuencia o secuencias de "segunda generación" se prepara y expresa como una proteína.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan métodos para preparar un anticuerpo anti-GITR que comprende:
(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 20, 33, 46, 62, 78, 91, 106, 122, 138 y 342, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 21, 34, 47, 63, 79, 92, 107, 123, 139 y 343 y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 22, 35, 48, 64, 80, 93, 108, 124, 140 y 344; y (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 23, 36, 49, 65, 68, 81, 94, 109, 112, 125, 141, 144 y 345, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 24, 37, 50, 66, 69, 82, 95, 110, 113, 126, 142, 145 y 346, y una secuencia de CDr 3 seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 25, 38, 51, 67, 70, 83, 96, 111, 114, 127, 143, 146 y 347;
(b) alterar al menos un resto de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y
(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.
Se pueden usar técnicas convencionales de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.
Preferentemente, el anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de anticuerpos alteradas es uno que conserva una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento, que incluyen,
(1) unión a GITR humano soluble, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por Biacore;
(2) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una Kd de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por Scatchard;
(3) unión a GITR humano unido a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 1 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(4) unión a GITR cynomolgus, por ejemplo, se unen a GITR cynomolgus unido a la membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, de 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide por FACS;
(5) inducción o mejora de la activación de células T, tal como en presencia de interacción de CD3 (por ejemplo, en presencia de concentraciones subóptimas de anti-CD3), como se evidencia, por (i) aumento de la producción de IL-2 y/o IFN-y en células T que expresan GITR y/o (ii) mayor proliferación de células T;
(6) inducción o mejora de la activación de células T sin requerir entrecruzamiento multivalente;
(7) inhibición de la unión del ligando de GITR a GITR en células 3A9-hGITR, por ejemplo, con una CE50 de 1 pg/ml o menos, como se mide por FACS;
(8) inhibición a lo sumo parcial de la unión del ligando de GITR a GITR en células T activadas;
(9) unión a un epítopo conformacional en GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4), por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de las secuencias de aminoácidos PTGGPGCGPGRLLLGt Gt (Se Q ID NO: 217) y CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218);
(10) unión a GITR humano tanto O-glucosilado y N-glucosilado como no glucosilado;
(11) presencia de actividad agonista en ausencia de unión a un receptor de Fc, pero en donde la unión a un receptor de Fc aumenta aún más la actividad agonista; y
(12) competición en cualquier dirección o en ambas direcciones por la unión a GITR humano con 28F3, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, 19D3, 18E10 y/o 6G10.
El anticuerpo alterado puede presentar una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once, o todas las propiedades funcionales establecidas como (1) a (12) anteriormente. Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse utilizando ensayos estándar disponibles en la técnica y/o descritos en el presente documento, tales como los establecidos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA, FACS).
En ciertas realizaciones de los métodos de diseño por ingeniería genética de anticuerpos descritos en el presente documento, las mutaciones pueden introducirse de forma aleatoria o selectiva a lo largo de toda o de parte de una secuencia codificante de anticuerpos anti-GITR y los anticuerpos anti-GITR modificados resultantes pueden cribarse en función de la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. En la técnica se han descrito métodos de mutación. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y cribar mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamblaje de ligamiento sintético o una combinación de los mismos. Como alternativa, La publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe métodos para usar métodos de cribado computacionales para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.
X. Moléculas de ácido nucleico
Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se vuelve sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, otro ADN cromosómico, por ejemplo, el ADN cromosómico que está unido al ADN aislado en la naturaleza) o proteínas, por técnicas estándar, entre las que se incluyen el tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas en CsCl, cromatografía en columna, enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico descrito en el presente documento puede ser, por ejemplo, a Dn o ARN y pueden contener o no secuencias intrónicas. En ciertas realizaciones, El ácido nucleico es una molécula de ADNc.
Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden obtenerse usando técnicas estándar de biología molecular. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que llevan genes de inmunoglobulina humana como se describe más adelante), pueden obtenerse ADNc que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo producido por el hibridoma mediante técnicas estándar de amplificación por PCR o de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de presentación en fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede recuperarse de la biblioteca.
Son moléculas de ácidos nucleicos preferidas descritas en el presente documento las que codifican las secuencias de VH y VL de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2, y anticuerpos monoclonales 6G10. Se exponen secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de VH de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14E3, 19H8 y 6G10 en los SEQ ID NO: 147, 154, 158, 162, 168, 172, 176, 182, 186 y 353, respectivamente. Se exponen secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de VL de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 en los SEQ ID NO: 148, 155, 163, 164, 169, 173, 177, 178, 183, 187, 188 y 354, respectivamente. Se exponen secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de cadena pesada de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 en los SEQ ID NO: 149, 156, 160, 165, 170, 174, 179, 184, 189 y 355, respectivamente. Se exponen secuencias de ADN a modo de ejemplo que codifican las secuencias de cadena ligera de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 en los SEQ ID NO: 150, 157, 161, 166, 167, 171, 175, 181, 180, 185, 190, 191 y 356, respectivamente.
Se exponen ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican los dominios VH y VL maduros de los anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 (misma región variable) como los SEQ ID NO: 147 y 148, respectivamente. Se exponen ácidos nucleicos a modo de ejemplo que codifican las cadenas pesadas maduras de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 como los SEQ ID NO: 151 y 152, respectivamente, y se expone un ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica la cadena ligera madura de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 como el SEQ ID NO: 153.
Se exponen dominios VH y VL a modo de ejemplo de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 (misma región variable) con un péptido señal como los SEQ ID NO: 357 y 358, respectivamente, y las secuencias de nucleótidos que los codifican se exponen como los SEQ ID NO: 359 y 360, respectivamente.
Se exponen cadenas pesadas a modo de ejemplo de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 con un péptido señal como los s Eq ID NO: 361 y 362, respectivamente, y se exponen secuencias de nucleótidos a modo de ejemplo que las codifican como los s Eq ID NO: 363 y 364, respectivamente. Una cadena ligera a modo de ejemplo de anticuerpos 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 con un péptido señal se establece como el SEQ ID NO: 365, y una secuencia de nucleótidos a modo de ejemplo que la codifica se establece como el SEQ ID NO: 366.
Un método para preparar 28F3.IgG1 puede comprender expresar la cadena pesada y las cadenas ligeras en una línea celular que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera con un péptido señal, por ejemplo, los SEQ ID NO: 363 y 365, respectivamente. Un método para fabricar 28F3.IgG1. 1 puede comprender expresar la cadena pesada y las cadenas ligeras en una línea celular que comprende las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera con un péptido señal, por ejemplo, los SEQ ID NO: 364 y 366, respectivamente. El presente documento abarca las células hospedadoras que comprenden estas secuencias de nucleótidos.
Una vez que se han obtenido los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpos de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión "unido operativamente", tal como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el mismo marco.
El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (bisagra, CH1, CH2 y/o CH3). En la técnica se conocen las secuencias de genes de la región constante de cadena pesada humana (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de la NIH N.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, región constante IgM o IgD, por ejemplo, una región IgG1. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante de cadena pesada CH1.
El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. En la técnica se conocen las secuencias de genes de la región constante de cadena ligera humana (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de la NIH N.° 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.
Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4 - Ser)3, de tal manera que las secuencias de VH y VL pueden expresarse como una proteína contigua de cadena sencilla, con las regiones Vl y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554).
También se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias de VH y VL que son homólogas a las de los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10. Las moléculas de ácido nucleico a modo de ejemplo codifican secuencias de VH y VL que son al menos un 7o % idénticas, por ejemplo, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % idénticas, a moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de VH y VL de los anticuerpos monoclonales 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10. También se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico con sustituciones conservativas (es decir, sustituciones que no alteran la secuencia de aminoácidos resultante tras la traducción de la molécula de ácido nucleico), por ejemplo, para la optimización de codones.
XI. Producción de anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento pueden producirse usando varias técnicas conocidas, tales como la técnica estándar de hibridación de células somáticas descrita por Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, también se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B y la técnica de presentación en fagos utilizando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. En la técnica se conocen protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión. También se conocen compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
Los anticuerpos quiméricos o humanizados descritos en el presente documento pueden prepararse basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma murino de interés y se puede diseñar por ingeniería genética de manera que contenga secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) utilizando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden unir a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas pueden insertarse en un marco humano utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.225.539 de Winter y las Patentes de Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).
En una realización, los anticuerpos descritos en el presente documento son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra GITR pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones mencionados en el presente documento como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en el presente documento "ratones de Ig humana".
El HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y y) y de cadena ligera k no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas p y k (véase, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856­ 859). En consecuencia, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o k de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena ligera y pesada humana introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar monoclonal de IgGK humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - l0 l; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación y uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas que llevan estos ratones, se describe con más detalle en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647­ 656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse además, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la Patente de Estados Unidos N.° 5.545.807 de Surani et al.; Las publicaciones PCT N.° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la Publicación PCT N.° WO 01/14424 de Korman et al.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se generan usando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que lleva un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Tales ratones, denominados en el presente documento "ratones KM", se describen en detalle en la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas alternativos de animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden usar para generar anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); estos ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas alternativos de animales transcromosómicos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para generar anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse ratones que llevan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; estos ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Adicionalmente, en la técnica se han descrito vacas que llevan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanas (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894) y puede usarse para generar anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento.
Otros sistemas de ratón descritos en la técnica para generar anticuerpos humanos, por ejemplo, anticuerpos humanos anti-GITR, incluyen (i) el ratón VelocImmune® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), en el que se han reemplazado las regiones variables de cadena pesada y ligera endógenas de ratón, por recombinación homóloga, con regiones variables de cadena pesada y ligera humanas, unidas operativamente a las regiones constantes endógenas de ratón, de tal forma que se generan anticuerpos quiméricos (V humana/C de ratón) en los ratones y posteriormente se convierten en anticuerpos completamente humanos usando técnicas estándar de ADN recombinante; y (ii) el ratón MeMo® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), en el que el ratón contiene regiones variables de cadena pesada humana no reordenadas pero una sola región variable de cadena ligera común humana reorganizada. Estos ratones, y su uso para generar anticuerpos, se describen en, por ejemplo, los documentos WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 y US 2012/0073004.
Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en el presente documento también se pueden preparar usando métodos de presentación en fagos para cribar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Tales métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: las Patentes de Estados Unidos N.° 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las Patentes de Estados Unidos N.° 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Patentes de Estados Unidos N.° 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes de Estados Unidos N.° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
También pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos descritos en el presente documento usando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunitarias humanas de modo que se pueda generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Estos ratones se describen en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.
Inmunizaciones
Para generar anticuerpos completamente humanos contra GITR, pueden inmunizarse ratones transgénicos o transcromosómicos que contienen genes de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones HCo12, HCo7 o KM) con una preparación purificada o enriquecida del antígeno GITR y/o células que expresan GITR o un fragmento del mismo, como se describe para otros antígenos, por ejemplo, por Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y el documento WO 98/24884. Como alternativa, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica GITR humano o un fragmento del mismo. Preferentemente, los ratones tendrán de 6 a 16 semanas de edad tras la primera infusión. Por ejemplo, se puede usar una preparación purificada o enriquecida (5-50 |jg) del antígeno GITR recombinante para inmunizar los ratones HuMAb por vía intraperitoneal. En el caso de que las inmunizaciones que usan una preparación purificada o enriquecida del antígeno GITR no produzcan anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células que expresan GITR, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias. Las líneas celulares a modo de ejemplo incluyen líneas celulares CHO y Raji estables que sobreexpresan GITR.
La experiencia acumulada con varios antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden mejor cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC) con antígeno en el adyuvante de Ribi, seguido de inmunizaciones IP/SC cada dos semanas (hasta un total de 10) con antígeno en adyuvante de Ribi. La respuesta inmunitaria se puede supervisar durante el transcurso del protocolo de inmunización obteniendo muestras de plasma mediante extracción de sangre retroorbital. El plasma puede cribarse mediante ELISA y FACS (como se describe a continuación), y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-GITR pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse por vía intravenosa con antígeno 3 días antes del sacrificio y la extracción del bazo y los ganglios linfáticos. Es de esperar que pueda ser necesario realizar 2-3 fusiones para cada inmunización. Normalmente, se inmunizan entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Por lo general, se usan cepas HCo7, HCo12 y KM. Además, tanto el transgén HCo7 como el HCo12 se pueden generar juntos en un solo ratón que tiene dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12).
Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para GITR
Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos descritos en el presente documento, pueden aislarse esplenocitos y/o células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden cribarse para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, pueden fusionarse suspensiones de una sola célula de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados con células de mieloma de ratón no secretoras Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50 %. Las células se cultivan a aproximadamente 2 x 105 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene un 10 % de suero Fetal Clone, 18 % de medio acondicionado "653", 5 % de origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e IX HAT (Sigma). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en un medio en el que el HAT se reemplaza con HT. Después, pueden cribarse los pocillos individuales mediante ELISA para detectar anticuerpos monoclonales IgM e IgG humanos. Una vez que se produce un crecimiento considerable de hibridoma, el medio puede observarse generalmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos pueden volverse a cultivar en placas, examinarse de nuevo y, si siguen siendo positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables después pueden cultivarse in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejidos para su caracterización.
Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces giratorios de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida puede verificarse mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución para garantizar su pureza. La solución tampón se puede intercambiar por PBS y la concentración se puede determinar por DO280 usando un coeficiente de extinción de 1,43. Se pueden extraer alícuotas de los anticuerpos monoclonales y almacenarse a -80 °C.
Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales para GITR
Los anticuerpos se pueden producir en un transfectoma de células hospedadoras usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de a Dn recombinante y métodos de transfección génica como es bien conocido en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por ejemplo, para expresar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, pueden obtenerse ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa mediante técnicas estándar de biología molecular (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN pueden insertarse en vectores de expresión de modo que los genes estén unidos operativamente a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, la expresión "unido operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se une a un vector, de tal forma que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector cumplen con su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión empleada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector o vectores de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y el vector o mediante ligamiento de extremos romos en caso de que no haya sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo mediante su inserción en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado de modo que el segmento Vh esté unido operativamente al segmento o segmentos Ch dentro del vector y el segmento Vl esté unido operativamente al segmento Cl dentro del vector.
Además, o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula hospedadora. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector, de tal forma que el péptido señal se une en fase al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es una inmunoglobulina).
En realizaciones ilustrativas, se pueden usar los siguientes péptidos señal de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos: MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315); MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 321); MEFGLNWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 327); MEFGLSWIFLAAILKGVQC (SEQ ID NO: 329); MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 333); MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 323); MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 325); MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317); MRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 319); y METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 331).
Las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-GITR pueden expresarse con la secuencia señal respectiva que estaba unida a cada cadena en el hibridoma a partir del cual se clonaron. A continuación se muestran las secuencias señal de varios anticuerpos anti-GITR presentes en el hibridoma a partir del cual se clonaron, secuencias señal que pueden usarse para expresar el mismo anticuerpo u otro anticuerpo:
secuencia señal de VH de 28F3:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 316)
secuencia señal de VL de 28F3:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT
GCCAGAT (SEQ ID NO: 318)
secuencia señal de VH de 18E10:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 316)
secuencia señal de VL de 18H10:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGT
GCCAGAT (SEQ ID NO: 318)
secuencia señal de VH de 19D3:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTT-
GCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 316)
secuencia señal de VL de 19D3:
MRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 319) ATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGA TGT (SEQ ID NO: 320)
secuencia señal de VH de 3C3:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 321) ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC (SEQ ID NO: 322)
secuencia señal de VL1 de 3C3:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGT GCCAGATGT (SEQ ID NO: 324)
secuencia señal de VL2 de 3C3:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 325)
Figure imgf000054_0001
secuencia señal de VH de 8A6:
MEFGLNWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 327) ATGGAGTTTGGGCTGAACTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 328) secuencia señal de VL de 8A6:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT GCCAGATGT (SEQ ID NO: 318)
secuencia señal de VH de 9G7:
MEFGLSWIFLAAILKGVQC (SEQ ID NO: 329) ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGATTTTCCTTGCTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 330) Secuencia señal de VL1 y VL2 de 9G7:
METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 331)
ATGGA AACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCT ACTCTGGCTCCCAGAT ACC ACC GGA (SEQ ID NO: 332)
secuencia señal de VH de 14E3:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 333) ATGAAAGACCTGTGGTTCTTCCTGCTCGTGGTGGGAGGTCCGAGATGGGTCGTGTCG (SEQ ID NO: 334)
secuencia señal de VL de 14E3:
MDMRVLAQLLGLLLLCFPGARC (SEQ ID NO: 323)
ATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGT GCCAGATGT (SEQ ID NO: 324)
secuencia señal de VH de 19H8:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 316) secuencia señal de VL1 de 19H8:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT GCCAGATGT (SEQ ID NO: 318)
secuencia señal de VL2 de 19H8:
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 325)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACC GGA (SEQ ID NO: 326)
secuencia señal de VH de 6G10:
MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 316) secuencia señal de VL de 6G10:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT
GCCAGATGT (SEQ ID NO: 318)
La secuencia señal MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 367) se puede usar para expresar cadenas pesadas y ligeras.
Las cadenas pesadas y ligeras o partes de las mismas, tales como las proporcionadas en la Tabla 11, pueden unirse a una secuencia señal proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, la cadena pesada de 28F3 o su región variable, por ejemplo, que comprendel SEQ ID NO: 13, 15, 17 o 18, puede unirse o fusionarse a un péptido señal que comprende o consiste en MEFGLSWVFLVALLRGVQC (SEQ ID NO: 315) o MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 367). La cadena ligera de 28F3 o su región variable, por ejemplo, que comprendel SEQ ID NO: 14, 16 o 19, puede unirse o fusionarse a un péptido señal que comprende o que consiste en MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 317) o MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 367).
Además de los genes de cadenas de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadenas de anticuerpos en una célula hospedadora. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadenas de anticuerpos. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca (1990)). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV), Virus del Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, pueden usarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de p-globina. Además, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor de SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de células T humana de tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466-472).
Además de los genes de cadenas de anticuerpo y de las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, a una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras dhfr- con selección con metotrexato/amplificación) y el gen neo (para selección en G418).
Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, se transfectan los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras en una célula hospedadora mediante técnicas estándar. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una gran variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos descritos en el presente documento en células hospedadoras procariotas o eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas y, más preferentemente, en células hospedadoras de mamífero, es la más preferida porque tales células eucariotas y, en particular, las células de mamífero, son más propensas que las células procariotas a ensamblar y secretar un anticuerpo inmunológicamente activo y plegado adecuadamente. Se ha notificado que la expresión procariota de genes de anticuerpos es ineficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpos activos (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).
Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes descritos en el presente documento incluyen el ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas las células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para usar con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión génica GS desvelado en el documento WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.
XII. Ensayos
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ensayarse para determinar la unión a GITR mediante, por ejemplo, ELISA estándar. En resumen, se recubren placas de microtitulación con GITR purificado a 1-2 pg/ml en PBS y después se bloquean con albúmina de suero bovino al 5% en PBS. Se añaden diluciones de anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones inmunizados con GITR) a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween y después se incuban con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico de Fc de IgG de cabra anti-humana) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, las placas se revelan con sustrato ABTS (Moss Inc, producto: ABTS-1000) y se analizan por un espectrofotómetro a Do 415-495. Los sueros de ratones inmunizados posteriormente se criban mediante citometría de flujo para unirse a una línea celular que expresa GITR humano, pero no a una línea celular de control que no expresa GITR. En resumen, la unión de anticuerpos anti-GITR se evalúa incubando células CHO que expresan GITR con el anticuerpo anti-GITR a una dilución 1:20. Las células se lavan y se detecta la unión con un Ac IgG anti-humano marcado con PE. Se realizan análisis de citometría de flujo utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Preferentemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se usarán para fusiones.
Se puede usar un ensayo ELISA como se ha descrito anteriormente para cribar anticuerpos y, por lo tanto, hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con el inmunógeno GITR. Los hibridomas que producen anticuerpos que se unen, preferentemente con alta afinidad, a GITR se pueden subclonar y caracterizar adicionalmente. Posteriormente se puede elegir un clon de cada hibridoma, que conserva la reactividad de las células parentales (por ELISA), para preparar un banco de células y para la purificación de anticuerpos.
Para purificar anticuerpos anti-GITR, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces giratorios de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida puede verificarse mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución para garantizar su pureza. La solución tampón se puede intercambiar por PBS y la concentración se puede determinar por DO280 usando un coeficiente de extinción de 1,43. Se pueden extraer alícuotas de los anticuerpos monoclonales y almacenarse a -80 °C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-GITR seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse utilizando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL). La unión de MAb biotinilado se puede detectar con una sonda marcada con estreptavidina. Los estudios de competencia que usan anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden realizarse usando placas ELISA recubiertas con GITR como se ha descrito anteriormente.
Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISA de isotipo utilizando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, pueden recubrirse pocillos de las placas de microtitulación con 1 pg/ml de anti-inmunoglobulina humana durante una noche a 4 °C. Después de bloquear con BSA al 1 %, las placas se hacen reaccionar con 1 pg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de ensayo o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una o dos horas. Los pocillos pueden hacerse reaccionar con IgG1 humana o sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica de IgM humana. Las placas se revelan y analizan como se ha descrito anteriormente.
Para probar la unión de los anticuerpos monoclonales a las células vivas que expresan GITR, se puede usar citometría de flujo, como se describe en los Ejemplos. En resumen, se mezclan líneas celulares que expresan GITR unido a la membrana (cultivadas en condiciones de crecimiento estándar) con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene BSA al 0,1% a 4 °C durante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo anti-IgG marcado con fluoresceína en las mismas condiciones que en la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse mediante el instrumento FACScan utilizando propiedades de dispersión de luz y lateral para seleccionar células individuales y se determina la unión de los anticuerpos marcados. Se puede usar un ensayo alternativo usando microscopía de fluorescencia (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse exactamente como se describió anteriormente y examinarse mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno.
Pueden ensayarse adicionalmente la reactividad de los anticuerpos anti-GITR con el antígeno GITR mediante transferencia de Western. En resumen, pueden prepararse extractos celulares de las células que expresan GITR y someterte a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. Tras la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, se bloquearán con suero de ratón al 20 % y se sondarán con los anticuerpos monoclonales a ensayar. La unión a IgG se puede detectar usando anti-IgG unido a fosfatasa alcalina y se puede revelar con comprimidos de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Métodos para analizar la afinidad de unión, la reactividad cruzada y la cinética de unión de varios anticuerpos anti-GITR incluyen ensayos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore™ utilizando un instrumento Biacore™ 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia).
En una realización, un anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de GITR humano. Un anticuerpo puede unirse específicamente a un dominio particular (por ejemplo, un dominio funcional) dentro del dominio extracelular de GITR. En una realización particular, el anticuerpo se une específicamente al sitio en GITR al que se une GITR-L. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de GITR humano y la región extracelular de GITR cynomolgus. Preferentemente, un anticuerpo se une a GITR humano con alta afinidad.
XIN. Inmunoconjugados, derivados de anticuerpo y diagnóstico
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para fines de diagnóstico, incluyendo ensayos de muestra y obtención de imágenes in vivo y, para este propósito, el anticuerpo (o fragmento de unión del mismo) puede conjugarse con un agente detectable apropiado, para formar un inmunoconjugado. Para fines diagnósticos, son agentes apropiados etiquetas detectables que incluyen radioisótopos, para imágenes de cuerpo entero, y radioisótopos, enzimas, marcadores fluorescentes y otras etiquetas de anticuerpos adecuadas para el ensayo de muestras.
Los marcadores detectables pueden ser cualquiera de los diversos tipos utilizados actualmente en el campo del diagnóstico in vitro, entre los que se incluyen marcadores en forma de partículas que incluyen soles metálicos tales como el oro coloidal, isótopos tales como I125 o Tc99 presentado, por ejemplo, con un agente quelante peptídico del tipo N2S2, N3S o N4, cromóforos, entre los que se incluyen marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores fosforescentes y similares, así como marcadores enzimáticos que convierten un sustrato dado en un marcador detectable, y etiquetas polinucleotídicas que se revelan después de la amplificación, tal como por reacción en cadena de la polimerasa. Los marcadores enzimáticos adecuados incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares. Por ejemplo, el marcador puede ser la enzima fosfatasa alcalina, detectada midiendo la presencia o la formación de quimioluminiscencia después de la conversión de sustratos de 1,2 dioxetano tales como adamantil metoxi fosforiloxi fenil dioxetano (AMPPD), 3-(4-(metoxiespiro{1,2-dioxetano-3,2'-(5'-cloro)triciclo{3.3.1.1 3,7}decan}-4-il)fenil fosfato disódico (CSPD), así como CDP y CDP-star® u otros sustratos luminiscentes bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, los quelatos de lantánidos adecuados, tales como Terbio (III) y Europio (III). Los medios de detección están determinados por el marcador elegido. El aspecto del marcador o sus productos de reacción se puede conseguir a simple vista, en el caso de que la etiqueta esté en forma de partículas y se acumule a niveles apropiados, o usando instrumentos tales como un espectrofotómetro, un luminómetro, un fluorímetro y similares, todo ello de acuerdo con la práctica estándar.
Preferentemente, los métodos de conjugación dan como resultado enlaces que son sustancialmente (o casi) no inmunogénicos, por ejemplo, enlaces péptido- (es decir, amida-), sulfuro-, (estéricamente impedido), disulfuro-, hidrazona- y éter. Estos enlaces son casi no inmunogénicos y muestran una estabilidad razonable dentro del suero (véase, por ejemplo, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; documento WO 2009/059278; documento WO 95/17886).
Dependiendo de la naturaleza bioquímica de la fracción y el anticuerpo, se pueden emplear diferentes estrategias de conjugación. En caso de que la fracción sea natural o recombinante de entre 50 a 500 aminoácidos, existen procedimientos estándar en los libros de texto que describen la química para la síntesis de conjugados de proteínas, que pueden seguirse fácilmente por el experto en la materia (véase, por ejemplo, Hackenberger, C. P. R. y Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074). En una realización, se usa la reacción de una fracción maleinimido con un resto de cisteína dentro del anticuerpo o la fracción. Esta es una química de acoplamiento especialmente adecuada en caso de que se utilice, por ejemplo, un fragmento Fab o Fab' de un anticuerpo. Como alternativa, en una realización, se realiza el acoplamiento al extremo C-terminal del anticuerpo o fracción. La modificación C-terminal de una proteína, por ejemplo, de un fragmento Fab, por ejemplo, se puede realizar como se describe (Sunbul, M. y Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371).
Por lo general, la reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente se basan en la transformación de un aminoácido natural en un aminoácido con una reactividad que es ortogonal a la reactividad de los otros grupos funcionales presentes. Por ejemplo, una cisteína específica dentro de un contexto de secuencia rara puede convertirse enzimáticamente en un aldehído (véase Frese, M. A. y Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427). También es posible obtener una modificación de aminoácidos deseada utilizando la reactividad enzimática específica de ciertas enzimas con un aminoácido natural en un contexto de secuencia dado (véase, por ejemplo, Taki, M. et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al. Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; y la formación catalizada por proteasas de enlaces C--N se usa por Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403).
La reacción específica del sitio y el acoplamiento covalente también se pueden lograr mediante la reacción selectiva de aminoácidos terminales con reactivos modificadores apropiados.
La reactividad de una cisteína N-terminal con benzonitrilos (véase Ren, H. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662) se puede utilizar para conseguir un acoplamiento covalente específico de sitio.
La unión química nativa también puede depender de restos de cisteína C-terminales (Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96).
El documento EP 1074563 describe un método de conjugación que se basa en la reacción más rápida de una cisteína dentro de un tramo de aminoácidos cargados negativamente con una cisteína ubicada en un tramo de aminoácidos cargados positivamente.
La fracción también puede ser un péptido sintético o un péptido mimético. En caso de que un polipéptido se sintetice químicamente, se pueden incorporar aminoácidos con reactividad química ortogonal durante dicha síntesis (véase, por ejemplo, de Graaf, A. J. et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295). Dado que está en juego una gran variedad de grupos funcionales ortogonales y se pueden introducir en un péptido sintético, la conjugación de dicho péptido con un conector es la química estándar.
Para obtener un polipéptido monomarcado, el conjugado con estequiometría 1:1 puede separarse por cromatografía de otros productos secundarios de la conjugación. Este procedimiento puede facilitarse utilizando un miembro de par de unión marcado con colorante y un enlazador cargado. Al utilizar este tipo de miembro de par de unión marcado y con alta carga negativa, los polipéptidos monoconjugados se separan fácilmente de los polipéptidos no marcados y polipéptidos que llevan más de un enlazador, ya que la diferencia en carga y peso molecular puede usarse para la separación. El colorante fluorescente puede ser útil para purificar el complejo de componentes no unidos, como un aglutinante monovalente marcado.
En una realización, la fracción unida a un anticuerpo anti-GITR se selecciona del grupo que consiste en una fracción de unión, una fracción de marcaje y una fracción biológicamente activa.
Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden conjugarse con un agente terapéutico para formar un inmunoconjugado, tal como un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Los agentes terapéuticos adecuados incluyen antimetabolitos, agentes alquilantes, aglutinantes del surco menor de ADN, intercaladores de ADN, agentes de entrecruzamiento de ADN, inhibidores de la histona deacetilasa, inhibidores de la exportación nuclear, inhibidores de proteasomas, inhibidores de topoisomerasa I o II, inhibidores de la proteína de choque térmico, inhibidores de tirosina quinasa, antibióticos y agentes antimitóticos. En el ADC, el anticuerpo y el agente terapéutico se conjugan preferentemente a través de un enlazador escindible tal como un enlazador de peptidilo, disulfuro o hidrazona. Más preferentemente, el enlazador es un enlazador de peptidilo tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 219), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser o Glu. Los ADC se pueden preparar como se describe en las Patentes de Estados Unidos N.° 7.087.600; 6.989.452; y 7.129.261; Publicaciones PCT WO 02/096910; documento WO 07/038658; documento WO 07/051081; documento WO 07/059404; documento WO 08/083312; y WO 08/103693; Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20060024317; 20060004081; y 20060247295.
Los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, los descritos en el presente documento, también se puede usar para detectar GITR, tal como GITR humano, por ejemplo, GITR humano en tejidos o muestras de tejidos. Los anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, en un ensayo ELISA o en citometría de flujo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se pone en contacto con células, por ejemplo, células en un tejido, durante un tiempo apropiado para que se produzca una unión específica, y después se añade un reactivo, por ejemplo, un anticuerpo que detecta el anticuerpo anti-GITR. En los Ejemplos se proporcionan ensayos a modo de ejemplo. El anticuerpo anti-GITR puede ser un anticuerpo completamente humano, o puede ser un anticuerpo quimérico, tal como un anticuerpo que tiene regiones variables humanas y regiones constantes murinas, o una porción del mismo. Los métodos a modo de ejemplo para detectar GITR, por ejemplo, GITR humano, en una muestra (muestra de células o tejidos) comprende (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo anti-GITR, durante un tiempo suficiente para permitir la unión específica del anticuerpo anti-GITR a GITR en la muestra y (2) poner en contacto la muestra con un reactivo de detección, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente al anticuerpo anti-GITR, tal como a la región Fc del anticuerpo anti-GITR, para detectar de ese modo el GITR unido por el anticuerpo anti-GITR. Las etapas de lavado pueden incluirse después de la incubación con el anticuerpo y/o el reactivo de detección. Los anticuerpos anti-GITR para usar en estos métodos no tienen que unirse a un marcador o a agentes de detección, ya que se puede utilizar un agente de detección por separado.
En otro lugar del presente documento se proporcionan otros usos para los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, como monoterapia o terapia combinada, por ejemplo, en la sección relacionada con los tratamientos combinados.
XIV. Moléculas biespecíficas
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para formar moléculas biespecíficas. Un anticuerpo anti-GITR, o porciones de unión a antígeno del mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR puede unirse a un anticuerpo o scFv que se une específicamente a cualquier proteína que pueda usarse como diana potencial para tratamientos combinados, tales como las proteínas descritas en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos contra PD-1, PD-L1 o LAG-3). De hecho, el anticuerpo descrito en el presente documento puede derivatizarse o unirse a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; también se pretende abarcar tales moléculas multiespecíficas en el término "molécula biespecífica" como se usa en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica descrita en el presente documento, un anticuerpo descrito en el presente documento puede unirse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión diferentes, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de tal forma que se obtenga una molécula biespecífica.
En consecuencia, en el presente documento se proporcionan moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para GITR y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una realización descrita en el presente documento en la que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión.
En una realización, las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o Fv monocatenario (scFv). El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción monocatenaria como se describe en Ladner et al. Patente de Estados Unidos N.° 4.946.778.
Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.
Las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se pueden usar varios agentes de entrecruzamiento para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N.° 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83) y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Son agentes conjugados preferidos SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar a través de enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de restos sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.
Como alternativa, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión Fab. Un anticuerpo biespecífico puede comprender un anticuerpo que comprende un scFv en el extremo C de cada cadena pesada. Una molécula biespecífica descrita en el presente documento puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Se describen métodos para preparar moléculas biespecíficas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Número 5.260.203; Patente de Estados Unidos Número 5.455.030; Patente de Estados Unidos Número 4.881.175; Patente de Estados Unidos Número 5.132.405; Patente de Estados Unidos Número 5.091.513; Patente de Estados Unidos Número 5.476.786; Patente de Estados Unidos Número 5.013.653; Patente de Estados Unidos Número 5.258.498; y Patente de Estados Unidos Número 5.482.858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar utilizando métodos reconocidos en la técnica, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de Transferencia de Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de particular interés al emplear un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.
XV. Composiciones
Además se proporcionan composiciones, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos anti-GITR o combinación con anticuerpos para otras dianas, o una o más partes de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más) anticuerpos diferentes, o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas descritas en el presente documento. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias.
En ciertas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-GITR a una concentración de al menos 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1-300 mg/ml o 100-300 mg/ml.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento combinado con al menos otro agente anticanceroso y/o estimulante de células T (por ejemplo, activador). Más adelante se describen con detalle ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en terapia de combinación en la sección de usos de los anticuerpos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas desveladas en el presente documento pueden incluir otros compuestos, fármacos y/o agentes utilizados para el tratamiento del cáncer. Dichos compuestos, fármacos y/o agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos de quimioterapia, fármacos de molécula pequeña o anticuerpos que estimulan la respuesta inmunitaria a un cáncer dado. En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más de un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-Ox40 (también conocido como CD134, TNFRSF4, ACT35 y/o TXGP1L), un anticuerpo anti-CD 137 o un anticuerpo anti-LAG-3.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, se puede recubrir con un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos descritos en el presente documento pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto parental y que no produce ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácidos incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como el clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono- y di-carboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
Una composición farmacéutica descrita en el presente documento también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito de sodio, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse mediante procedimientos de esterilización, mencionados anteriormente, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol de ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma inyectable del fármaco se puede llevar a cabo mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones estériles inyectables o dispersiones. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Una composición farmacéutica puede comprender un conservante o puede carecer de un conservante. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de la composición inyectable incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales monoestearato y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado en frío (liofilización) que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.
La cantidad de principio activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y del modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de transporte para producir una forma de dosificación individual generalmente será esa cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, de un cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente el 0,01 por ciento a aproximadamente el noventa por ciento de principio activo, preferentemente desde aproximadamente el 0,1 por ciento a aproximadamente el 70 por ciento, y aún más preferentemente de aproximadamente el 1 por ciento a aproximadamente el 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una única dosis en embolada, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosificación unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitaria descritas en el presente documento está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico concreto a conseguir y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Para la administración del anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg y, más habitualmente, de 0,01 a 5 o 10 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal, o estar en el intervalo de 1-10 mg/kg. Una pauta de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-GITR descritos en el presente documento incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, administrándose el anticuerpo usando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, después cada tres meses; (iii) cada tres semanas; (iv) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
Se puede administrar un anticuerpo anti-GITR a una dosis plana (régimen de dosis plana).
En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado está dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo generalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de anticuerpo contra el antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1­ 1000 |jg/ml y, en algunos métodos, de aproximadamente 25-300 jg/ml.
Un anticuerpo anti-GITR se puede administrar con otro anticuerpo en el régimen de dosificación del otro anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR puede administrarse con un anticuerpo anti-PD-1, tal como nivolumab (OPDIVO), cada dos semanas como una infusión intravenosa durante 60 minutos hasta que se produzca la progresión de la enfermedad o una toxicidad inaceptable. Un anticuerpo anti-GITR se puede administrar con pembrolizumab (KEYTRUDA) cada 3 semanas como una infusión iv durante 30 minutos hasta que se produzca la progresión de la enfermedad o una toxicidad inaceptable.
Un anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían según la semivida del anticuerpo en el paciente. Por lo general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguido de anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine y, preferentemente, hasta que el paciente muestre una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.
Los niveles reales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares descritas en el presente documento empleadas, o el éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el momento de la administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento preferentemente da como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad o una prevención del deterioro o la discapacidad debidos a la enfermedad. En el contexto del cáncer, una dosis terapéuticamente eficaz preferentemente da como resultado una mayor supervivencia y/o prevención de un mayor deterioro de los síntomas físicos asociados con el cáncer. Los síntomas del cáncer son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, características moleculares inusuales, un cambio en el aspecto de un lunar, incluyendo asimetría, bordes, color y/o diámetro, un área de piel recién pigmentada, un lunar anormal, área oscura debajo de la uña, bultos en las mamas, cambios en el pezón, quistes mamarios, dolor de mama, muerte, pérdida de peso, debilidad, fatiga excesiva, dificultad para comer, pérdida de apetito, tos crónica, empeoramiento de la disnea, tos con sangre, sangre en la orina, sangre en las heces, náuseas, vómitos, metástasis hepáticas, metástasis pulmonares, metástasis óseas, pesadez abdominal, meteorismo, líquido en la cavidad peritoneal, sangrado vaginal, estreñimiento, distensión abdominal, perforación del colon, peritonitis aguda (infección, fiebre, dolor), dolor, vómitos con sangre, sudoración intensa, fiebre, tensión arterial alta, anemia, diarrea, ictericia, mareo, escalofríos, espasmos musculares, metástasis de colon, metástasis pulmonares, metástasis de vejiga, metástasis hepáticas, metástasis óseas, metástasis renales y metástasis pancreáticas, dificultad para tragar y similares.
Una dosis terapéuticamente eficaz puede prevenir o retrasar la aparición de cáncer, como puede desearse cuando hay signos tempranos o preliminares de la enfermedad. Los ensayos de laboratorio utilizados en el diagnóstico de cáncer incluyen químicos (incluida la medición de los niveles de GITr ), hematológicos, serológicos y radiológicos. En consecuencia, cualquier ensayo clínico o bioquímico que supervise cualquiera de los anteriores puede usarse para determinar si un tratamiento particular es una dosis terapéuticamente eficaz para tratar un cáncer. Un experto en la materia podría determinar tales cantidades en función de factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.
Una composición descrita en el presente documento puede administrarse a través de una o más vías de administración usando uno o más de diversos métodos bien conocidos en la técnica. Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo por inyección o infusión. La frase "administración parenteral", como se usa en el presente documento, significa modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.
Como alternativa, un anticuerpo descrito en el presente documento puede administrarse a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, la vía intranasal, la vía oral, la vía vaginal, la vía rectal, la vía sublingual o tópica.
Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica descrita en el presente documento puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos desvelados en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos conocidos para su uso con anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento incluyen: la Patente de Estados Unidos N.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusión implantable para dispensar la medicación a una tasa controlada; la Patente de Estados Unidos N.° 4.486.194, que desvela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente de Estados Unidos N.° 4.447.233, que desvela una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a una tasa de infusión precisa; la Patente de Estados Unidos N.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la Patente de Estados Unidos N.° 4.439.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco que tiene compartimentos multicámara; y la Patente de Estados Unidos N.° 4.475.196, que desvela un sistema de administración osmótica de fármaco. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos por los expertos en la materia.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden formularse para garantizar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos descritos en el presente documento atraviesen la BHE (si se desea, por ejemplo, para cánceres cerebrales), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que se transportan de manera selectiva en células u órganos específicos, mejorando de este modo la administración dirigida del fármaco (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Los grupos de direccionamiento a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
XVI. Usos y métodos
Los anticuerpos, composiciones de anticuerpos y métodos descritos en el presente documento tienen numerosas utilidades in vitro e in vivoque implican, por ejemplo, la mejora de la respuesta inmunitaria mediante la activación de la señalización de GITR o la detección de GITR. En una realización preferida, los anticuerpos descritos en el presente documento son anticuerpos humanos. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden administrarse a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para mejorar la inmunidad en varias enfermedades. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan un anticuerpo descrito en el presente documento para su uso en métodos para modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto c de modo que se modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferentemente, la respuesta se mejora, estimula o regula positivamente.
Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos en los que sería deseable la mejora de una respuesta inmunitaria. Los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen un trastorno que puede tratarse aumentando la respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria mediada por células T, por ejemplo, una respuesta de células T específica de antígeno). En una realización particular, los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncer in vivo. Para conseguir una mejora de la inmunidad específica de antígeno, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden administrarse junto con un antígeno de interés o el antígeno ya puede estar presente en el sujeto a tratar (por ejemplo, un sujeto portador de tumor o portador de virus). Cuando los anticuerpos contra GITR se administran junto con otro agente, los dos se pueden administrar por separado o simultáneamente.
También se incluyen métodos para detectar la presencia de antígeno GITR humano en una muestra, o para medir la cantidad de antígeno GITR humano, que comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a GITR humano, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y el GITR humano. Entonces se detecta la formación de un complejo, en donde una formación de complejo de diferencia entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno GITR humano en la muestra. Además, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden usarse para purificar GITR humano mediante purificación de inmunoafinidad.
Dada la capacidad de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento para estimular o coestimular las respuestas de las células T, por ejemplo, respuestas de células T específicas de antígeno, en el presente documento se proporcionan métodos de uso in vitro e in vivo de los anticuerpos descritos en el presente documento para estimular, mejorar o regular positivamente las respuestas de células T específicas de antígeno, por ejemplo, respuestas de células T antitumorales. En ciertas realizaciones, también se proporciona estimulación de CD3 (por ejemplo, por coincubación con una célula que expresa CD3 en la membrana), estimulación que se puede proporcionar al mismo tiempo, antes o después de la estimulación con un anticuerpo anti-GITR. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan métodos para estimular una respuesta de células T específica de antígeno que comprende poner en contacto dicha célula T con un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento y, opcionalmente, con un anticuerpo anti-CD3, de tal forma que se estimula una respuesta de células T específica de antígeno. Cualquier indicador adecuado de una respuesta de células T específica de antígeno puede usarse para medir la respuesta de células T específica de antígeno. Los ejemplos no limitantes de tales indicadores adecuados incluyen una mayor proliferación de células T en presencia del anticuerpo y/o un aumento de la producción de citocinas en presencia del anticuerpo. En una realización preferida, se estimula la producción de interleucina-2 y/o interferón-Y por la célula T específica de antígeno.
Las células T que pueden potenciarse o coestimularse con anticuerpos anti-GITR incluyen células T CD4+ y células T CD8+. Las células T pueden ser células Tef, por ejemplo, células Tef CD4+, células Tef CD8+, células T auxiliares (Th) y células T (Tc).
Además, se incluye un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento para su uso en métodos para estimular una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de células T específica de antígeno) en un sujeto de manera que se estimula una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de células T específica de antígeno) en el sujeto. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto portador de un tumor y se estimula una respuesta inmunitaria contra el tumor. El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor líquido, por ejemplo, una neoplasia hematológica. En ciertas realizaciones, el tumor es un tumor inmunogénico. En ciertas realizaciones, el tumor es no inmunogénico. En ciertas realizaciones, el tumor es PD-L1 positivo. En ciertas realizaciones, el tumor es PD-L1 negativo. El sujeto también puede ser un sujeto portador de virus y se estimula una respuesta inmunitaria contra el virus.
Además, se proporciona un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento para su uso en métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto de manera que el crecimiento del tumor se inhiba en el sujeto. También se proporcionan métodos de tratamiento de una infección vírica en un sujeto que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento de tal manera que se trate la infección vírica en el sujeto.
También se incluye en el presente documento un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento que comprende un Fc que estimula el agotamiento de células Treg en el microambiente tumoral para su uso en métodos para agotar las células Treg del microambiente tumoral de un sujeto que tiene un tumor, por ejemplo, un tumor canceroso. Un Fc puede, por ejemplo, ser un Fc con función efectora o función efectora mejorada, tal como uno que se une o que se une de forma mejorada a uno o más receptores de Fc activadores. En una realización preferida, el agotamiento de Treg se produce sin agotamiento o inhibición significativa de Tef en el microambiente tumoral y sin agotamiento o inhibición significativa de células Tef y células Treg fuera del microambiente tumoral, por ejemplo, en la periferia. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles mayores de GITR en células Treg que en células Tef, por ejemplo, en el microambiente tumoral.
En ciertas realizaciones, un sujeto se trata con un anticuerpo anti-GITR que tiene un Fc que aumenta el agonismo, por ejemplo, se une o tiene una unión mejorada al FcRIIb inhibidor. Ciertos tratamientos se realizan con un anticuerpo anti-GITR que tiene un Fc que no se une o tiene una unión reducida a, uno o más FcR de activación. Los anticuerpos anti-GITR pueden agotar Treg en tumores y/o Treg en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
En ciertas realizaciones, se administra un anticuerpo anti-GITR a un sujeto como terapia complementaria. Los tratamientos de sujetos que tienen cáncer con un anticuerpo anti-GITR pueden conducir a una supervivencia prolongada, por ejemplo, una respuesta duradera a largo plazo en relación con el estándar de atención actual; supervivencia a largo plazo de al menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más años, o supervivencia libre de recurrencia de al menos 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5 o 10 o más años. En ciertas realizaciones, El tratamiento de un sujeto que tiene cáncer con un anticuerpo anti-GITR previene la recurrencia del cáncer o retrasa la recurrencia del cáncer, por ejemplo, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1, 2, 3, 4, 5 o 10 o más años. Un tratamiento anti-GITR se puede usar como tratamiento de primera, segunda o tercera línea.
En realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento no es significativamente tóxico. Por ejemplo, un anticuerpo de GITR no es significativamente tóxico para un órgano de un ser humano, por ejemplo, uno o más de los siguientes: hígado, riñón, cerebro, pulmones y corazón, tal como se determina, por ejemplo, en ensayos clínicos. En ciertas realizaciones, un anticuerpo GITR no desencadena significativamente una respuesta inmunitaria indeseable, por ejemplo, autoinmunidad o inflamación.
En ciertas realizaciones, el tratamiento de un sujeto con un agonista anti-GITR (por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR) no tiene como resultado una sobreestimulación del sistema inmunitario en la medida en que el sistema inmunitario del sujeto ataca al propio sujeto (por ejemplo, respuesta autoinmunitaria) o tiene como resultado, por ejemplo, anafilaxia. Por lo tanto, los anticuerpos anti-GITR preferentemente no causan anafilaxia.
En ciertas realizaciones, el tratamiento de un sujeto con un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, no causa reacciones inflamatorias significativas, por ejemplo, neumonitis inmunomediada, colitis inmunomediada, hepatitis inmunomediada, nefritis o disfunción renal inmunomediada, hipofisitis inmunomediada, hipotiroidismo e hipertiroidismo inmunomediados u otras reacciones adversas inmunomediadas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR que comprende las CDR o regiones variables de 28F3 provoca menos reacciones inflamatorias, por ejemplo, neumonitis inmunomediada, colitis inmunomediada, hepatitis inmunomediada, nefritis o disfunción renal inmunomediada, hipofisitis inmunomediada, hipotiroidismo e hipertiroidismo inmunomediados, anafilaxia u otras reacciones adversas inmunomediadas, que otros anticuerpos anti-GITR. Otras reacciones adversas inmunomediadas incluyen: trastornos cardíacos, por ejemplo, arritmias ventriculares; trastornos oculares, por ejemplo, iridociclitis; reacciones relacionadas con la infusión; aumento de amilasa, aumento de lipasa; trastornos del sistema nervioso, por ejemplo, mareo, neuropatía periférica y sensorial; trastornos de la piel y del tejido subcutáneo, por ejemplo, erupción, prurito, dermatitis exfoliativa, eritema multiforme, vitíligo o psoriasis; trastornos respiratorios, torácicos y mediastínicos, por ejemplo, tos; fatiga; náuseas; disminución del apetito; estreñimiento; artralgias; y diarrea.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de GITR proporciona efectos antitumorales sinérgicos en combinación con otra terapia contra el cáncer, tal como un compuesto que estimula el sistema inmunitario (por ejemplo, un agente inmunooncológico), por ejemplo, un compuesto descrito en el presente documento o un compuesto que modula una diana descrita en el presente documento.
Estos y otros métodos descritos en el presente documento se analizan con más detalle a continuación.
Cáncer
La activación de GITR por anticuerpos anti-GITR puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-GITR de la invención para su uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer, de tal forma que se trate al sujeto, por ejemplo, de tal forma que se inhiba o reduzca el crecimiento de los tumores cancerosos y/o se produzca la regresión de los tumores y/o que se consiga una supervivencia prolongada. Un anticuerpo anti-GITR puede usarse solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, un anticuerpo anti-GITR puede usarse junto con otro agente, por ejemplo, otro agente inmunogénico, un tratamiento estándar contra el cáncer u otro anticuerpo, como se describe a continuación.
En consecuencia, en el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento, por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3. IgG1. 1 para su uso en métodos de tratamiento del cáncer, por ejemplo, mediante la inhibición del crecimiento de células tumorales, en un sujeto. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-GITR humano (tal como cualquiera de los anticuerpos humanos anti-GITR humano descritos en el presente documento). Además, o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-GITR quimérico o humanizado, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR quimérico o humanizado que comprende secuencias de 28F3 u otros anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento.
Los cánceres cuyo crecimiento puede inhibirse usando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres que normalmente responden a la inmunoterapia y aquellos que normalmente no responden a la inmunoterapia. Los cánceres pueden ser cánceres con tumores sólidos o neoplasias malignas (tumores líquidos). Los ejemplos no limitantes de cánceres para el tratamiento incluyen carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón no microcítico escamoso (NSCLC), NSCLC no escamoso, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células renales (RCC)), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cáncer de cuello de útero, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon y cáncer (o carcinoma) de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, asesino natural senonasal, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico, tal como el melanoma maligno cutáneo o intraocular), cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer de útero, cáncer de la región anal, cáncer de testículo, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, cáncer de cerebro, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por el amianto, cánceres relacionados con virus o cánceres de origen viral (por ejemplo, virus del papiloma humano (tumores relacionados o que se originan por el VPH)) y neoplasias hematológicas derivadas de cualquiera de los dos principales linajes de células sanguíneas, es decir, la línea celular mieloide (que produce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y mastocitos) o la línea celular linfoide (que produce células B, T, NK y plasmáticas), tales como todos los tipos de leucemias, linfomas y mielomas, por ejemplo, leucemias linfocíticas y/o mielógenas agudas o crónicas, tales como la leucemia aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL) y leucemia mielógena crónica (CML), AML indiferenciada (M0), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; con maduración celular), leucemia promielocítica (variante M3 o M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (variante M4 o M4 con eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico aislado y cloroma; linfomas, tales como el linfoma de Hodgkin (HL), linfoma no Hodgkin (NHL), neoplasia hematológica de células B, por ejemplo, linfomas de células B, linfoma de células T, linfoma linfoplasmocitoide, linfoma monocitoide de células B, linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT), linfoma anaplásico (por ejemplo, Ki 1+) de células grandes, linfoma/leucemia de células T en adultos, linfoma de células del manto, linfoma de linfocitos T angioinmunoblásticos, linfoma angiocéntrico, linfoma intestinal de células T, linfoma primario de células B mediastínicas, linfoma linfoblástico de precursores T, T-linfoblástico; y linfoma/leucemia (T-Lbly/TALL), linfoma periférico de células T, linfoma linfobástico, trastorno linfoproliferativo postrasplante, linfoma histiocítico verdadero, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, linfoma de linfocitos B, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B, linfoma cutáneo de células T (CTLC) (también llamado micosis fungoide o síndrome de Sezary) y linfoma linfoplasmocitoide (LPL) con macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tal como mieloma IgG, mieloma de cadena ligera, mieloma no secretor, mieloma latente (también llamado mieloma indolente), plasmocitoma solitario y mielomas múltiples, leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células pilosas; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide, tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, schwanomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma, tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, por ejemplo, tumores de células T y células B, incluyendo, entre otros, trastornos de células T tales como la leucemia prolinfocítica T (T-PLL), incluyendo del tipo de células pequeñas y células cerebriformes; leucemia de linfocitos granulares grandes (LGL), preferentemente del tipo de linfocitos T; linfoma hepatosplénico a/d T-NHL; linfoma de células T periférico/postímico (subtipos pleomórficos e inmunoblásticos); linfoma angiocéntrico (nasal) de células T; cáncer de cabeza o cuello, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de la glándula tiroides; linfoma mieloide agudo, así como cualquier combinación de dichos cánceres. Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para el tratamiento de cánceres metastásicos, cánceres no resecables y/o refractarios (por ejemplo, cánceres refractarios a inmunoterapia previa, por ejemplo, con un anticuerpo de CTLA-4 o PD-1 de bloqueo) y cánceres recurrentes.
En ciertas realizaciones, se administra un Ab anti-GITR a pacientes que tienen un cáncer que mostró una respuesta inadecuada a un tratamiento previo, por ejemplo, un tratamiento previo con un fármaco inmuno-oncológico, o a pacientes que tienen un cáncer que es refractario o resistente, ya sea intrínsecamente refractario o resistente (por ejemplo, refractario a un antagonista de la ruta de PD-1), o en el que se adquiere la resistencia o el estado refractario. Por ejemplo, los sujetos que no responden o no responden suficientemente a una primera terapia o que ven la progresión de la enfermedad después del tratamiento, por ejemplo, tratamiento anti-PD-1, pueden tratarse mediante la administración de un anticuerpo anti-GITR solo o en combinación con otra terapia (por ejemplo, con una terapia anti-PD-1).
En ciertas realizaciones, se administra un anticuerpo anti-GITR a pacientes que no han recibido previamente (es decir, que se han tratado con) un agente inmuno-oncológico, por ejemplo, un antagonista de la ruta de PD-1.
Se puede administrar un anticuerpo anti-GITR con un tratamiento estándar de atención. Se puede administrar un anticuerpo anti-GITR como terapia de mantenimiento, por ejemplo, una terapia destinada a prevenir la aparición o recurrencia de tumores.
Se puede administrar un anticuerpo anti-GITR con otro tratamiento, por ejemplo, radiación, cirugía o quimioterapia. Por ejemplo, puede administrarse la terapia adyuvante con anticuerpos anti-GITR cuando existe el riesgo de que existan micrometástasis y/o para reducir el riesgo de una recaída.
Un anticuerpo anti-GITR puede administrarse como monoterapia o como la única terapia inmunoestimulante. Los anticuerpos contra GITR, por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento, también se puede combinar con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidrato), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimulantes (He et al (2004) J. Immunol. 173: 4919-28). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MARTI y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (analizado más adelante).
En seres humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos tales como melanomas. Al reducir el umbral de activación de las células T a través de la activación de GITR, pueden activarse las respuestas tumorales en el hospedador, permitiendo el tratamiento de tumores no inmunogénicos o los que tienen inmunogenicidad limitada.
Un anticuerpo anti-GITR, por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento, puede combinarse con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C. , 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cáncer Vaccines, Ch. 61, p. 3023-3043 en DeVita et al. (eds.), 1997, Cáncer: Principles and Practice of Oncology, Quinta Edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que el GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación de tumores (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 90: 3539-43).
El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en diversos tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que se originó el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son las dianas de linfocitos T específicos de tumor encontrados en el hospedador. la activación de GITR puede usarse junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como autoantígenos y, por lo tanto, son tolerantes a ellos. El antígeno tumoral puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y en solo un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). El antígeno tumoral también pueden ser "neo-antígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Filadelfia), o idiotipo de tumores de células B.
Otras vacunas de tumores pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como virus del papiloma humano (VPH), virus de la hepatitis (VHB y VHC) y herpesvirus del sarcoma de Kaposi (HVSK). Otra forma de antígeno específico de tumor que puede usarse junto con la activación de GITR son proteínas de choque térmico (HSP) purificadas aisladas del propio tejido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en la administración a células que presentan antígeno para provocar la inmunidad tumoral (Suot y Srivastava (1995) Science 269: 1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278: 117-120).
Las células dendríticas (CD) son potentes células de presentación de antígeno que pueden usarse para inducir respuestas específicas de antígeno. Las CD pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como con extractos de células tumorales (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD también pueden transducirse por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente a células tumorales con fines de inmunización (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6: 332-336). Como método de vacunación, la inmunización con CD puede combinarse eficazmente con la activación de GITR para activar respuestas antitumorales más potentes.
La activación de GITR también se puede combinar con tratamientos estándar contra el cáncer (por ejemplo, cirugía, radiación y quimioterapia). La activación de GITR puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-GITR en combinación con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de dicha combinación es un anticuerpo anti-GITR en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento de melanoma. La razón científica detrás del uso combinado de activación de GITR y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, daría lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación de antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado sinergia con el bloqueo de GITR a través de la muerte celular son radiación, cirugía y privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. También se pueden combinar inhibidores de la angiogénesis con la activación de GITR. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de células tumorales que pueden suministrar antígeno tumoral en las rutas de presentación del antígeno al hospedador.
Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento también se pueden usar en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen células efectoras que expresan el receptor Fca o Fcy a células tumorales (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar compuestos biespecíficos para establecer como diana dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado anticuerpos biespecíficos anti-receptor de Fc/anti-antígeno tumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas específicas de tumor. El grupo de células T de estas respuestas se aumentaría mediante la activación de GITR. Como alternativa, el antígeno puede administrarse directamente a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de la superficie celular específico de células dendríticas.
Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas que se expresan por los tumores y que son inmunosupresoras. Estos incluyen, entre otros, TGF-p (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard y O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), y el ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365).
Pueden usarse anticuerpos para cada una de estas entidades en combinación con anticuerpos anti-GITR para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales por parte del hospedador.
Se pueden usar otros anticuerpos que activan la respuesta inmunitaria del hospedador en combinación con anticuerpos anti-GITR. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función de la CD y la presentación del antígeno. Los anticuerpos anti-CD40 pueden sustituir eficazmente la actividad auxiliar de las células T (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) y puede usarse junto con anticuerpos anti-GITR. La activación de anticuerpos contra moléculas coestimuladoras de células T tales como CTLA-4 (por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.811.097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997) e ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266) también puede proporcionar mayores niveles de activación de células T. Los inhibidores de PD1 o PD-L1 también pueden usarse junto con un anticuerpo anti-GITR.
El trasplante de médula ósea se utiliza actualmente para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. Aunque la enfermedad del injerto contra hospedador es una consecuencia de este tratamiento, puede obtenerse un beneficio terapéutico a partir de respuestas de injerto frente a tumor. La activación de GITR puede usarse para aumentar la eficacia de las células T específicas de tumor injertadas en donantes.
También hay varios protocolos de tratamiento experimentales que implican la activación y expansión ex vivo de células T específicas de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores para estimular células T específicas de antígeno contra el tumor (Greenberg y Riddell (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también se pueden usar para activar respuestas de células T a agentes infecciosos tales como el CMV. La activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-GlTR puede aumentar la frecuencia y la actividad de las células T transferidas de manera adoptiva.
Enfermedades infecciosas
Los métodos descritos en el presente documento también pueden usarse para tratar a pacientes que se han expuesto a toxinas o patógenos particulares. En consecuencia, otro aspecto descrito en el presente documento proporciona un anticuerpo anti-GITR para usar en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto de modo que el sujeto sea tratado para la enfermedad infecciosa. Además, o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado.
Similar a su aplicación a los tumores como se ha analizado anteriormente, La activación de GITR mediada por anticuerpos se puede usar sola o como adyuvante, en combinación con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y autoantígenos. Los ejemplos de patógenos para los que este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil incluyen patógenos para los que actualmente no existe una vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero sin limitación, VIH, Hepatitis (A, B, y C), gripe, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. la activación de GITR puede ser particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como el VIH que presentan antígenos alterados durante el transcurso de las infecciones. Estos nuevos epítopos se reconocen como extraños en el momento de la administración de anticuerpos anti-GITR humano, provocando así una fuerte respuesta de células T.
Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables mediante métodos descritos en el presente documento incluyen VIH, hepatitis (A, B o C), herpes virus (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y c Mv , virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus de molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.
Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables mediante métodos descritos en el presente documento incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos y gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.
Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables mediante métodos descritos en el presente documento incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Géneros Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.
Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables métodos descritos en el presente documento incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.
En todos los métodos anteriores, la activación de GITR puede combinarse con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento con citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2) o terapia de anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación de antígenos tumorales mejorada (véase, por ejemplo, Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).
Reacciones autoinmunitarias
Los anticuerpos anti-GITR pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunitarias. De hecho, La inducción de respuestas antitumorales usando células tumorales y vacunas peptídicas revela que muchas respuestas antitumorales implican anti-autorreactividades (van Elsas et al. (2001) J. Exp. Med. 194: 481-489; Overwijk et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg y White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4). Por lo tanto, es posible considerar el uso de anticuerpos anti-GITR junto con diversas autoproteínas para diseñar protocolos de vacunación para generar eficazmente respuestas inmunitarias contra estas autoproteínas para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica una acumulación inapropiada de péptido Ap en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra el amiloide son capaces de eliminar estos depósitos amiloides (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177).
También pueden usarse como dianas otras autoproteínas tales como IgE para el tratamiento de alergia y asma y TNFc para la artritis reumatoide. Por último, pueden inducirse respuestas de anticuerpos a varias hormonas mediante el uso de anticuerpos anti-GITR. Para la anticoncepción se pueden utilizar respuestas de anticuerpos neutralizantes contra hormonas reproductivas. La respuesta de anticuerpos neutralizantes contra hormonas y otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también pueden considerarse posibles dianas de vacunación.
Pueden usarse métodos análogos como se ha descrito anteriormente para el uso de anticuerpos anti-GITR para la inducción de respuestas terapéuticas autoinmunitarias para tratar a pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros auto-antígenos, tales como depósitos amiloides, incluyendo Ap en la enfermedad de Alzheimer, citocinas tales como TNFa e IgE.
Vacunas
Los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden usarse para estimular respuestas inmunitarias específicas de antígeno mediante la administración conjunta de un anticuerpo anti-GITR con un antígeno de interés (por ejemplo, una vacuna). En consecuencia, en el presente documento se proporciona (i) un antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-GITR para su uso en métodos para mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto de manera que se potencia una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano anti-GITR humano (tal como cualquiera de los anticuerpos humanos anti-GITR descritos en el presente documento). Además, o como alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitativos de tales antígenos incluyen los analizados en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) analizados anteriormente, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones, un péptido o proteína de fusión que comprende el epítopo al que se une un anticuerpo anti-GITR se usa como vacuna en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-GITR.
Las vías adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas e inmunoconjugados multiespecíficos y biespecíficos) descritos en el presente documento in vivo e in vitro son bien conocidos en la técnica y pueden seleccionarse por los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpos.
Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden administrarse conjuntamente con uno u otros agentes terapéuticos más, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede estar unido al agente (tal como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o simultáneamente con el agente o puede coadministrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancerosa, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo, dacarbazina y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí solos, son solamente eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de un anticuerpo anti-GITR o un fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerosos que actúan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico a las células tumorales humanas. Dicha coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las haría no reactivas con el anticuerpo.
También dentro del alcance descrito en el presente documento hay kits que comprenden las composiciones de anticuerpos descritas en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales descritos en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno GITR distinto del primer anticuerpo humano). Los kits incluyen normalmente un marcador que indica el uso deseado del contenido del kit. El término marcador incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el kit, o que acompaña de otro modo al kit.
Terapias combinadas
Además de las terapias combinadas proporcionadas anteriormente, los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, los descritos en el presente documento, también se puede usar en terapia combinada, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer, como se describe a continuación.
En el presente documento se proporcionan métodos de terapia combinada en los que un anticuerpo anti-GITR se coadministra con uno o más agentes adicionales, por ejemplo, fármacos de molécula pequeña, anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, que son eficaces para estimular respuestas inmunitarias para mejorar aún más, estimular o regular positivamente respuestas inmunitarias en un sujeto. Tal como se muestra en los Ejemplos, La administración de un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo anti-PD-1 antagonista a ratones tuvo un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento tumoral.
Generalmente, un anticuerpo anti-GITR, por ejemplo, descrito en el presente documento, se puede combinar con (i) un agonista de una molécula estimuladora (por ejemplo, coestimuladora) (por ejemplo, receptor o ligando) y/o (ii) un antagonista de una señal o molécula inhibidora (por ejemplo, receptor o ligando) en células inmunitarias, tales como células T, obteniéndose en ambos casos la amplificación de respuestas inmunitarias, tales como respuestas de células T específicas de antígeno. En determinados aspectos, un agente inmuno-oncológico es (i) un agonista de una molécula estimuladora (que incluye un coestimulador) (por ejemplo, receptor o ligando) o (ii) un antagonista de una molécula inhibidora (que incluye un coinhibidor) (por ejemplo, receptor o ligando) en células involucradas en la inmunidad innata, por ejemplo, células NK, y en donde el agente inmuno-oncológico mejora la inmunidad innata. Dichos agentes inmunooncológicos a menudo se denominan reguladores del punto de control inmunitario, por ejemplo, inhibidor del punto de control inmunitario o estimulador del punto de control inmunitario.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-GITR se administra con un agente que se dirige a una molécula estimuladora o inhibidora que es miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (IgSF). Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR, por ejemplo, descritos en el presente documento, pueden administrarse a un sujeto con un agente que se dirige a un miembro de la familia IgSF para aumentar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, un anticuerpo anti-GITR puede administrarse con un agente que se dirige (o se une específicamente a) un miembro de la familia B7 de ligandos unidos a membrana que incluye B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) y B7-H6 o un receptor coestimulador o coinhibidor que se une específicamente a un miembro de la familia B7.
También se puede administrar un anticuerpo anti-GITR con un agente que se dirige a un miembro de la familia de moléculas t Nf y TNFR (ligandos o receptores), tal como CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDA1, EDA2, TNFR1, linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, linfotoxina a ip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY y NGFR (véase, por ejemplo, Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1).
Las respuestas de células T pueden estimularse por una combinación de anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento, por ejemplo, 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1, y uno o más de los siguientes agentes:
(1) Un antagonista (agente inhibidor o bloqueante) de una proteína que inhibe la activación de las células T (por ejemplo, inhibidores del punto de control inmunitario), tal como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 y LAG-3, como se ha descrito anteriormente, y cualquiera de las siguientes proteínas: TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, B7-H3, B7-H4, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 y TIM-4; y/o (2) Un agonista de una proteína que estimula la activación de las células T, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H.
Los agentes a modo de ejemplo que modulan una de las proteínas anteriores y se pueden combinar con anticuerpos anti-GITR agonistas, por ejemplo, los descritos en el presente documento, para el tratamiento del cáncer, incluyen: Yervoy™ (ipilimumab) o Tremelimumab (para CTLA-4), galiximab (para B7.1), BMS-936558 (para PD-1), MK-3475 (para PD-1), AMP224 (para B7DC), BMS-936559 (para B7-H1), MPDL3280A (para B7-H1), MEDI-570 (para ICOS), AMG557 (para B7H2), MGA271 (para B7H3), IMP321 (para LAG-3), BMS-663513 (para CD137), PF-05082566 (para CD137), CDX-1127 (para CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (para OX40L), Atacicept (para TACI), CP-870893 (para c D40), Lucatumumab (para CD40), Dacetuzumab (para CD40), Muromonab-CD3 (para Cd 3), Ipilumumab (para Ct LA-4).
Los anticuerpos anti-GITR también se pueden administrar con pidilizumab (CT-011), aunque se ha cuestionado su especificidad para la unión a PD-1.
Otros agentes que pueden combinarse con anticuerpos anti-GITR agonistas para el tratamiento del cáncer incluyen antagonistas de receptores inhibidores en células NK o agonistas de receptores de activación en células NK. Por ejemplo, pueden combinarse anticuerpos agonistas anti-GITR con antagonistas de KIR (por ejemplo, lirilumab).
La activación de las células T también está regulada por citocinas solubles y pueden administrarse anticuerpos anti-GITR a un sujeto, por ejemplo, que tiene cáncer, con antagonistas de citocinas que inhiben la activación de células T o agonistas de citocinas que estimulan la activación de células T.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-GITR pueden usarse en combinación con (i) antagonistas (o agentes inhibidores o bloqueantes) de proteínas de la familia IgSF o la familia B7 o la familia TNF que inhiben la activación de células T o antagonistas de citocinas que inhiben la activación de células T (por ejemplo IL-6, IL-10, TGF-p, VEGF; "citocinas inmunosupresoras") y/o (ii) agonistas de receptores estimuladores de la familia IgSF, la familia B7 o la familia TNF o de citocinas que estimulan la activación de células T, para estimular una respuesta inmunitaria, por ejemplo, para tratar enfermedades proliferativas, tal como un cáncer.
Otros agentes más para terapias combinadas incluyen agentes que inhiben o agotan los macrófagos o monocitos, incluyendo, pero sin limitación, antagonistas de CSF-1R, tales como anticuerpos antagonistas de CSF-1R incluyendo RG7155 (documentos WO11/70024, WO11/107553, WO11/131407, WO13/87699, WO13/119716, WO13/132044) o FPA-008 (documentos WO11/140249; WO13169264; WO14/036357).
Los anticuerpos anti-GITR también se pueden administrar con agentes que inhiben la señalización de TGF-p.
Otros agentes que se pueden combinar con un anticuerpo anti-GITR incluyen agentes que mejoran la presentación del antígeno tumoral, por ejemplo, vacunas de células dendríticas, vacunas celulares que secretan GM-CSF, oligonucleótidos CpG, e imiquimod, o terapias que mejoran la inmunogenicidad de células tumorales (por ejemplo, antraciclinas).
Sin embargo, otras terapias que pueden combinarse con un anticuerpo anti-GITR incluyen terapias que agotan o bloquean células Treg, por ejemplo, un agente que se une específicamente a CD25.
Otra terapia que se puede combinar con un anticuerpo anti-GITR es una terapia que inhibe una enzima metabólica tal como la indolamina dioxigenasa (IDO), dioxigenasa, arginasa u óxido nítrico sintetasa.
Otra clase de agentes que pueden usarse con un anticuerpo anti-GITR incluye agentes que inhiben la formación de adenosina o inhiben el receptor de adenosina A2A.
Otras terapias que se pueden combinar con un anticuerpo anti-GITR para tratar el cáncer incluyen terapias que revierten/previenen la anergia o el agotamiento de células T y terapias que desencadenan una activación inmunitaria innata y/o inflamación en el sitio del tumor.
Un anticuerpo anti-GITR puede combinarse con más de un agente inmuno-oncológico y puede, por ejemplo, combinarse con un enfoque combinatorio que se dirige a múltiples elementos de la ruta inmunitaria, tal como uno o más de los siguientes: una terapia que mejora la presentación del antígeno tumoral (por ejemplo, vacuna de células dendríticas, vacunas celulares que secretan GM-CSF, oligonucleótidos CpG, imiquimod); una terapia que inhibe la regulación inmunitaria negativa, por ejemplo, inhibiendo la ruta CTLA-4 y/o PD1/PD-L1/PD-L2 y/o agotando o bloqueando Treg u otras células inmunosupresoras; una terapia que estimula la regulación inmunitaria positiva, por ejemplo, con agonistas que estimulan la ruta de CD-137, OX-40 y/o GITR y/o estimulan la función efectora de células T; una terapia que aumenta sistémicamente la frecuencia de células T antitumorales; una terapia que agota o inhibe Treg, tales como Treg en el tumor, por ejemplo, usando un antagonista de CD25 (por ejemplo, daclizumab) o por agotamiento de perlas anti-CD25 ex vivo; una terapia que afecta la función de células mieloides supresoras en el tumor; una terapia que aumenta la inmunogenicidad de las células tumorales (por ejemplo, antraciclinas); transferencia adoptiva de células T o células NK incluyendo células genéticamente modificadas, por ejemplo, células modificadas por receptores de antígeno quiméricos (terapia CAR-T); una terapia que inhibe una enzima metabólica tal como la indolamina dioxigenasa (IDO), dioxigenasa, arginasa u óxido nítrico sintetasa; una terapia que revierte/previene la anergia o el agotamiento de células T; una terapia que desencadena una activación inmunitaria innata y/o inflamación en el sitio del tumor; administración de citocinas inmunoestimuladoras; o bloqueo de citocinas inmunorrepresoras.
Los anticuerpos anti-GITR agonistas descritos en el presente documento pueden usarse junto con uno o más agentes agonistas que se unen a receptores coestimuladores positivos, agentes bloqueantes que atenúan la señalización a través de receptores inhibidores, antagonistas y uno o más agentes que aumentan sistémicamente la frecuencia de células T antitumorales, agentes que superan rutas supresoras inmunitarias definidas en el microambiente tumoral (por ejemplo, bloquean la interacción con receptor inhibidor (por ejemplo, interacciones PD-L1/PD-1), agotan o inhiben las Treg (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab) o mediante agotamiento de perlas anti CD25 ex vivo), inhiben enzimas metabólicas tales como IDO o invierten/previenen la anergia o el agotamiento de linfocitos T) y agentes que desencadenan activación inmunitaria innata y/o inflamación en sitios tumorales.
En ciertas realizaciones, se administra un anticuerpo anti-GITR a un sujeto junto con un inhibidor de BRAF si el sujeto es positivo para la mutación BRAF V600.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR que se administra junto con otro anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR que se administra junto con otro anticuerpo inmunoestimulador es un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de 6C8, por ejemplo, un anticuerpo humanizado que tiene las CDR de 6C8, como se describe, por ejemplo, en el documento WO2006/105021; un anticuerpo que comprende las CDR de un anticuerpo anti-GITR descrito en el documento WO2011/028683; un anticuerpo que comprende las CDR de un anticuerpo anti-GITR descrito en el documento JP2008278814, un anticuerpo que comprende las CDR de un anticuerpo anti-GITR descrito en el documento WO2015 / 031667 u otro anticuerpo anti-GITR descrito o mencionado en el presente documento.
En el presente documento se proporciona una molécula anti-GITR agonista, por ejemplo, un anticuerpo, y uno o más anticuerpos inmunoestimuladores adicionales, tal como un antagonista de anti-PD-1, por ejemplo, anticuerpo antagonista, un antagonista de anti-PD-L1, por ejemplo, anticuerpo antagonista, un antagonista de anti-CTLA-4 antagonista, por ejemplo, anticuerpo antagonista y/o un antagonista de anti-LAG3, por ejemplo, un anticuerpo antagonista, para su uso en métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto de tal forma que se estimula una respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o para estimular una respuesta antiviral. En una realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo anti-PD-1 antagonista. En una realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista. En una realización, al sujeto se le administra un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista. En una realización, el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo descrito en el presente documento. Como alternativa, el anticuerpo anti-GITR puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un mAb anti-GITR de ratón), tal como los descritos adicionalmente en el presente documento. En una realización, dicho al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 antagonista, un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista, un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista y/o un anticuerpo anti-LAG3 antagonista) es un anticuerpo humano. Como alternativa, dicho al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un anticuerpo de ratón anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 y/o anti-LAG3).
En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo de PD-1 antagonista para su uso en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-1 se administra a una dosis subterapéutica o ambos se administran a una dosis subterapéutica. También se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-PD-1 para su uso en métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 descritos en el presente documento (por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1) u otro anticuerpo anti-GITR agonista descrito en el presente documento.
Los antagonistas de PD-1 adecuados para su uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, ligandos, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos biespecíficos) y agentes multivalentes. En una realización, el antagonista de PD-1 es una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión de Fc, tal como AMP-244. En una realización, el antagonista de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-Ll.
Un ejemplo de anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab (BMS-936558) o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de uno de los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 y 4A11 descritos en el documento WO 2006/121168. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-PD1 es MK-3475 (Lambrolizumab) descrito en el documento WO2012/145493; y AMP-514 descrito en el documento WO 2012/145493. Otros anticuerpos de PD-1 conocidos y otros inhibidores de PD-1 incluyen los descritos en los documentos WO 2009/014708, WO 03/099196, w O 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, Patentes de Estados Unidos N.° 7.635.757 y 8.217.149 y Publicación de Patente N.° 2009/0317368. También se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 desvelados en el documento WO2013/173223. Un anticuerpo anti-PD-1 que compite por la unión con y/o se une al mismo epítopo en PD-1 que uno de estos anticuerpos también puede usarse en tratamientos combinados. Otro enfoque para dirigirse al receptor PD-1 es la proteína recombinante compuesta del dominio extracelular de PD-L2 (B7-DC) fusionado con la porción Fc de IgG1, denominada AMP-224.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se une a PD-1 humana con una Kd de 5x10'8 M o menos, se une PD-1 humana con una Kd de 1 x 10-8 M o menos, se une a PD-1 humana con una Kd de 5 x 10-9 M o menos o se une a PD-1 humana con una Kd de entre 1 x 10'8 M y 1 x 10'1° M o menos.
En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR agonista y un anticuerpo de PD-L1 antagonista para su uso en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-Ll se administra a una dosis subterapéutica o ambos se administran a una dosis subterapéutica. en el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-PD-Ll para su uso en métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 y 6G10 descritos en el presente documento (por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1) u otro anticuerpo anti-GITR agonista descrito en el presente documento.
En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 es BMS-936559 (denominado 12A4 en el documento WO 2007/005874 y la patente de Estados Unidos N.° 7.943.743) o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4, que se describen en la publicación PCT WO 07/005874 y en la Patente de Estados Unidos N.° 7.943.743. En cierta realización, un anticuerpo anti-PD-Ll es MEDI4736 (también conocido como Anti-B7-H1), MPDL3280A (también conocido como RG7446), MSB0010718C (documento WO2013/79174) o rHigM12B7. También se puede utilizar cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 desvelados en los documentos WO2013/173223, WO2011/066389, WO2012/145493, Patentes de Estados Unidos N.° 7.635.757 y 8.217.149 y Publicación de Estados Unidos N.° 2009/145493. También pueden usarse en tratamientos combinados anticuerpos anti-PD-Ll que compiten y/o se unen al mismo epítopo que cualquiera de estos anticuerpos.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll se une a PD-L1 humana con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a PD-1 humana con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a PD-L1 humana con una Kd de 5 x 10'9 M o menos o se une a PD-L1 humana con una Kd de entre 1 x 10'8 M y 1 x 10'10 M o menos.
En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR descrito en el presente documento y un anticuerpo antagonista de CTLA-4 para su uso en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-GITR se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra a una dosis subterapéutica o ambos se administran a una dosis subterapéutica. En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 para su uso en métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, El anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo seleccionado del grupo de: Yervoy™ (ipilimumab o anticuerpo 10D1, descrito en la Publicación PCT WO 01/14424), tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675.206), monoclonal o un anticuerpo anti-CTLA-4 descrito en cualquiera de las siguientes publicaciones: documento WO 98/42752; documento WO 00/37504; Patente de Estados Unidos N.° 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract N.°2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58: 5301-5304. También se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 desvelados en el documento WO2013/173223.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une a CTLA-4 humana con una Kd de 5x10'8 M o menos, se une a CTLA-4 humana con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a CTLA-4 humana con una Kd de 5 x 10'9 M o menos o se une a CTLA-4 humana con una Kd de entre 1 x 10'8 M y 1 x 10'10 M o menos.
En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR y un anticuerpo anti-LAG-3 para su uso en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer). En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-GITR se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-LAG-3 se administra a una dosis subterapéutica o ambos se administran a una dosis subterapéutica. En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-GITR y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-LAG-3 para su uso en métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-Ll es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-GITR es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 28F3, 19D3, 18E10, 3C3-1, 3C3-2, 2G6, 8A6, 9G7-1, 9G7-2, 14E3, 19H8-1, 19H8-2 o 6G10 descritos en el presente documento (por ejemplo, 28F3.IgG1 o 28F3.IgG1.1) u otro anticuerpo anti-GITR agonista descrito en el presente documento. Los ejemplos de anticuerpos anti-LAG3 incluyen anticuerpos que comprenden las CDR o regiones variables de anticuerpos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5, que se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° u S2011/0150892, y en los documentos WO10/19570 y WO2014/008218. En una realización, un anticuerpo anti-LAG-3 es BMS-986016. Otros anticuerpos anti-LAG-3 reconocidos en la técnica que pueden usarse incluyen IMP731 e IMP-321, descritos en los documentos US 2011/007023, WO08/132601 y w O09/44273. Los anticuerpos anti-LAG-3 que compiten con y/o se unen al mismo epítopo que cualquiera de estos anticuerpos también pueden usarse en tratamientos combinados.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-LAG-3 se une a LAG-3 humana con una Kd de 5 x 10-8 M o menos, se une LAG-3 humana con una Kd de 1 x 10-8 M o menos, se une a LAG-3 humana con una Kd de 5 x 10-9 M o menos o se une a LAG-3 humana con una Kd de entre 1 x 10-8 M y 1 x 10-10 M o menos.
La administración de anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento y antagonistas, por ejemplo, anticuerpos antagonistas, a uno o más antígenos diana secundarios tales como LAG-3 y/o CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 puede mejorar la respuesta inmunitaria a las células cancerosas en el paciente. Los cánceres cuyo crecimiento puede inhibirse usando los anticuerpos de la presente divulgación incluyen cánceres que normalmente responden a la inmunoterapia y aquellos que normalmente no responden a la inmunoterapia. Los ejemplos representativos de cánceres para el tratamiento con la terapia de combinación de la presente divulgación incluyen los cánceres enumerados en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la combinación de anticuerpos terapéuticos analizados en el presente documento puede administrarse simultáneamente como una sola composición en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o simultáneamente como composiciones separadas con cada anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la combinación de anticuerpos terapéuticos puede administrarse secuencialmente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-GITR pueden administrarse secuencialmente, tal como administrando en primer lugar el anticuerpo anti-CTLA-4 y en segundo lugar el anticuerpo anti-GITR, o administrando en primer lugar el anticuerpo anti-GITR y en segundo lugar el anticuerpo anti-CTLA-4. Además, o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-GITR pueden administrarse secuencialmente, tal como administrando en primer lugar el anticuerpo anti-PD-1 y en segundo lugar el anticuerpo anti-GITR, o administrando en primer lugar el anticuerpo anti-GITR y en segundo lugar el anticuerpo anti-PD-1. Además, o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-Ll y un anticuerpo anti-GITR pueden administrarse secuencialmente, tal como administrando en primer lugar el anticuerpo anti-PD-Ll y en segundo lugar el anticuerpo anti-GITR, o administrando en primer lugar el anticuerpo anti-GITR y en segundo lugar el anticuerpo anti-PD-Ll. Además, o como alternativa, un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-GITR pueden administrarse secuencialmente, tal como administrando en primer lugar el anticuerpo anti-LAG-3 y en segundo lugar el anticuerpo anti-GITR, o administrando en primer lugar el anticuerpo anti-GITR y en segundo lugar el anticuerpo anti-LAG-3.
Adicionalmente, si se administra secuencialmente más de una dosis de la terapia combinada, el orden de la administración secuencial puede invertirse o mantenerse en el mismo orden en cada punto de tiempo de administración, se pueden combinar las administraciones secuenciales con administraciones simultáneas, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-GITR puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-CTLA-4 en primer lugar y el anticuerpo anti-GITR en segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-GITR en primer lugar y el anticuerpo anti-CTLA-4 en segundo lugar, etc. Además, o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-GITR puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-PD-1 en primer lugar y el anticuerpo anti-GITR en segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-GITR en primer lugar y el anticuerpo anti-PD-1 en segundo lugar, etc. Además, o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-Ll y anticuerpo anti-GITR puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-PD-LI en primer lugar y el anticuerpo anti-GITR en segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-GITR en primer lugar y el anticuerpo anti-PD-Ll en segundo lugar, etc. Además, o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-LAG-3 y anticuerpo anti-GITR puede ser simultánea, la segunda administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-LAG-3 en primer lugar y el anticuerpo anti-GITR en segundo lugar, y la tercera administración puede ser secuencial con el anticuerpo anti-GITR en primer lugar y el anticuerpo anti-LAG-3 en segundo lugar, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede implicar una primera administración que es secuencial con el anticuerpo anti-GITR en primer lugar y el anticuerpo anti-CTLA-4 (y/o el anticuerpo anti-PD-1 y/o el anticuerpo anti-PD-Ll y/o el anticuerpo anti-LAG-3) en segundo lugar, y las administraciones posteriores pueden ser simultáneas.
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, en donde el agente inmuno-oncológico es un agonista de CD137 (4-1BB), tal como un anticuerpo de CD137 agonista. Los anticuerpos de CD137 adecuados incluyen, por ejemplo, urelumab o PF-05082566 (documento WO12/32433).
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, en donde el agente inmuno-oncológico es un agonista de OX40, tal como un anticuerpo de OX40 agonista. Los anticuerpos de OX40 adecuados incluyen, por ejemplo, MEDI-6383, MEDI-6469 o MOXR0916 (RG7888; documento WO06/029879).
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, el agente inmuno-oncológico es un agonista de CD40, tal como un anticuerpo de CD40 agonista. En ciertas realizaciones, el agente inmuno-oncológico es un antagonista de CD40, tal como un anticuerpo de CD40 antagonista. Los anticuerpos de CD40 adecuados incluyen, por ejemplo, lucatumumab (HCD122), dacetuzumab (SGN-40), CP-870.893 o Chi Lob 7/4.
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, el agente inmuno-oncológico es un agonista de CD27, tal como un anticuerpo de CD27 agonista. Los anticuerpos de CD27 adecuados incluyen, por ejemplo, varlilumab (CDX-1127).
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, el agente inmuno-oncológico es MGA271 (para B7H3) (documento WO11/109400).
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, en donde el agente inmuno-oncológico es un antagonista de KIR, tal como lirilumab.
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, en donde el agente inmuno-oncológico es un antagonista de IDO. Los antagonistas de IDO adecuados incluyen, por ejemplo, INCB-024360 (documentos WO2006/122150, WO07/75598, WO08/36653, WO08/36642), indoximod, NLG-919 (documentos WO09/73620, WO09/1156652, WO11/56652, WO12/142237) o F001287.
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, en donde el agente inmuno-oncológico es un agonista del receptor de tipo Toll, por ejemplo, un agonista de TLR2/4 (por ejemplo, Bacillus Calmette-Guerin); un agonista de TLR7 (por ejemplo, Hiltonol o Imiquimod); un agonista de TLR7/8 (por ejemplo, Resiquimod); o un agonista de TLR9 (por ejemplo, CpG7909).
En una realización, un sujeto que tiene una enfermedad que puede beneficiarse de la estimulación del sistema inmunitario, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa, se trata mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmuno-oncológico, en donde, el agente inmuno-oncológico es un inhibidor de TGF-P, por ejemplo, GC1008, LY2157299, TEW7197 o IMC-TR1.
En un aspecto, un anticuerpo anti-GITR se administra secuencialmente antes de la administración de un segundo agente, por ejemplo, un agente inmuno-oncológico. En un aspecto, un anticuerpo anti-GITR se administra simultáneamente con el segundo agente, por ejemplo, un agente inmuno-oncológico. En otro aspecto adicional, un anticuerpo anti-GITR se administra secuencialmente después de la administración del segundo agente. La administración de los dos agentes puede comenzar en momentos con, por ejemplo, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 5 días, 7 días, o una o más semanas de diferencia, o la administración del segundo agente puede comenzar, por ejemplo, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 5 días, 7 días, o una o más semanas después de la administración del primer agente.
En determinados aspectos, un anticuerpo anti-GITR y un segundo agente, por ejemplo, un agente inmuno-oncológico, se administran simultáneamente, por ejemplo, se infunden simultáneamente, por ejemplo, durante un periodo de 30 o 60 minutos, a un paciente. Un anticuerpo anti-GITR puede formularse conjuntamente con un segundo agente, por ejemplo, un agente inmuno-oncológico.
Opcionalmente, un anti-GITR como único agente inmunoterapéutico, o la combinación de un anticuerpo anti-GITR y uno o más anticuerpos inmunoterapéuticos adicionales (por ejemplo, bloqueo de anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3) puede combinarse adicionalmente con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidrato), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunoestimuladoras (He et al. (2004) J. Immunol. 173: 4919-28). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que se pueden usar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (analizada con más detalle más adelante). Una activación combinada de GITR y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o de PD-L1 y/o LAG-3) también se puede combinar con tratamientos estándar contra el cáncer. Por ejemplo, una activación combinada de GITR y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o de PD-L1 y/o LAG-3) se puede combinar eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis del otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente divulgación (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es una combinación de anticuerpo agonista anti-GITR con 0 sin un anticuerpo adicional, tal como anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos anti-LAG-3) adicionales en combinación con decarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es una combinación de anticuerpo anti-GITR con o sin anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-Ll y/o anticuerpos lAG-3 adicionales en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico del uso combinado de la activación de GITR y el bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, daría lugar a niveles aumentados de antígeno tumoral en la ruta de presentación de antígeno. Otras terapias combinadas que pueden ocasionar sinergia con una activación combinada de GITR con o sin bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 a través de la muerte celular incluyen radiación, cirugía o privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. También se pueden combinar con una activación combinada de GITR y bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 inhibidores de la angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de las células tumorales, que puede ser una fuente de antígeno tumoral que se suministra a las rutas de presentación del antígeno al hospedador.
Un anticuerpo agonista anti-GITR como único agente inmunoterapéutico, o una combinación de anticuerpos de GITR agonista y de bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 también se puede usar en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fca o Fcy a las células tumorales (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.922.845 y 5.837.243). Se pueden usar compuestos biespecíficos para establecer como diana dos antígenos separados. El grupo de células T de estas respuestas se aumentaría mediante el uso de una activación combinada de GITR y bloqueo CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3.
En otro ejemplo, un anticuerpo agonista anti-GITR como único agente inmunoterapéutico o una combinación de un anticuerpo anti-GITR y un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anticuerpo anti-PD-1 y/o anticuerpo anti-PD-Ll y/o agente de LAG-3, por ejemplo, anticuerpo, pueden usarse junto con un anticuerpo antineoplásico, tal como Rituxan® (rituximab), Herceptin® (trastuzumab), Bexxar® (tositumomab), Zevalin® (ibritumomab), Campath® (alemtuzumab), Lymphocide® (eprtuzumab), Avastin® (bevacizumab) y Tarceva® (erlotinib), y similares. A modo de ejemplo y sin deseo de quedar limitado por la teoría, el tratamiento con un anticuerpo anticanceroso o un anticuerpo anticanceroso conjugado con una toxina puede conducir a la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales), lo que potenciaría una respuesta inmunitaria mediada por el agente inmunoestimulador, por ejemplo, GITR, CTLA-4, PD-1, PD-L1 o agente de LAG-3, por ejemplo, anticuerpo. En una realización a modo de ejemplo, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) puede incluir un agente anticanceroso, por ejemplo, anticuerpo, en combinación con anti-GITR y, opcionalmente, un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3, por ejemplo, anticuerpo, simultáneamente o secuencialmente o cualquier combinación de los mismos, que puede potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral por parte del hospedador.
Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador por una gran diversidad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas, que se expresan por los tumores y que son inmunosupresores. Estas incluyen, entre otras, TGF-p (Kehrl et al. (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard y O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), y el ligando Fas (Hahne et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Además, pueden combinarse anticuerpos para cada una de estas entidades con un anticuerpo anti-GITR con o sin un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, un agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3, tal como un anticuerpo, para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas inmunitarias antitumorales por parte del hospedador.
Otros agentes, por ejemplo, anticuerpos, que pueden usarse para activar la respuesta inmunitaria del hospedador pueden usarse además en combinación con un anticuerpo anti-GITR con o sin un agente inmunoestimulador adicional, tal como anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3. Estos incluyen moléculas en la superficie de las células dendríticas que activan la función de las CD y la presentación del antígeno. Pueden usarse anticuerpos anti-CD40 (Ridge et al., supra) junto con un anticuerpo anti-GITR y, opcionalmente, un agente inmunoestimulador adicional, por ejemplo, un agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3, por ejemplo, anticuerpo. Otros anticuerpos activadores de las moléculas coestimuladoras de células T Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra, también pueden proporcionar niveles aumentados de activación de células T.
Como se ha analizado anteriormente, actualmente se usa el trasplante de médula ósea para tratar diversos tumores de origen hematopoyético. La inmunoterapia anti-GITR sola o combinada con bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 se puede usar para aumentar la eficacia de las células T específicas de tumor injertadas del donante.
Varios protocolos de tratamiento experimental implican la activación y expansión ex vivo de células T específicas de antígeno y la transferencia adoptiva de estas células a receptores para obtener células T específicas de antígeno contra el tumor (Greenberg y Riddell, supra). Estos métodos también se pueden usar para activar respuestas de células T a agentes infecciosos tales como el CMV. La activación ex vivo en presencia de anti-GITR con o sin una terapia inmunoestimuladora adicional, por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3, es de esperar que aumente la frecuencia y la actividad de las células T transferidas adoptivamente.
En el presente documento se proporcionan métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer) con un agente inmunoestimulador, que comprende administrar un anticuerpo anti-GITR con o sin anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o agente anti-LAG-3, por ejemplo, anticuerpo, a un sujeto. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento proporcionan un método para reducir la incidencia de colitis o diarrea inducida por anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Como se usa en el presente documento, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que presenta un amplio metabolismo de primer paso de tal manera que, después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menor de aproximadamente un 20 %. En una realización descrita en el presente documento, el esteroide no absorbible es budesonida. La budesonida es un glucocorticosteroide de acción local, que se metaboliza ampliamente, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesonida dependiente del pH y del tiempo, desarrollada para optimizar la liberación de fármacos en el íleon y a lo largo del colon. ENTOCORT Ec ® está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta el íleon y/o el colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT EC® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT EC® se libera en los intestinos antes de absorberse y retenerse en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa intestinal, ENTOCORT EC® se metaboliza ampliamente por el sistema del citocromo P450 en el hígado a metabolitos con actividad glucocorticoide insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (de aproximadamente un 10 %). La baja biodisponibilidad de budesonida da como resultado una relación terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con un metabolismo de primer paso menos amplio. La budesonida produce menos efectos adversos, incluyendo menos supresión hipotalámica-pituitaria, que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT EC® puede producir efectos sistémicos de glucocorticoides tales como hipercorticismo y supresión suprarrenal. Véase PDR 58a ed. 2004; 608-610.
En otras realizaciones adicionales, la activación de GITR con o sin CTLA-4 y/o PD-1 y/o bloqueo de PD-L1 y/o LAG-3 (es decir, anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores anti-GITR y opcionalmente anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3) junto con un esteroide no absorbible puede combinarse adicionalmente con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).
De acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, un salicilato administrado en combinación con anti-GITR con o sin anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o LAG-3 y un esteroide no absorbible puede incluir cualquier administración coincidente o secuencial del salicilato y el esteroide no absorbible con el fin de disminuir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores. Por lo tanto, por ejemplo, Los métodos para reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores descritos en el presente documento incluyen la administración de un salicilato y un no absorbible de forma simultánea o secuencial (por ejemplo, se administra un salicilato 6 horas después de un esteroide no absorbible), o cualquier combinación de los mismos. Adicionalmente, un salicilato y un esteroide no absorbible pueden administrarse por la misma vía (por ejemplo, ambos se administran por vía oral) o por diferentes vías (por ejemplo, un salicilato se administra por vía oral y un esteroide no absorbible se administra por vía rectal), que pueden diferir de la vía o vías utilizadas para administrar los anticuerpos anti-GITR y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-Ll y/o anti-LAG-3.
Los anticuerpos anti-GITR y las terapias de combinación de anticuerpos descritas en el presente documento también pueden usarse junto con otras terapias bien conocidas que se seleccionan por su utilidad particular contra la indicación que se está tratando (por ejemplo, cáncer). Las combinaciones de los anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento pueden usarse secuencialmente con uno o más agentes farmacéuticamente aceptables conocidos.
Por ejemplo, los anticuerpos anti-GITR y las terapias de combinación de anticuerpos descritas en el presente documento pueden usarse en combinación (por ejemplo, simultáneamente o por separado) con un tratamiento adicional, tal como irradiación, quimioterapia (por ejemplo, usando camptotecina (CPT-11), 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino, doxorrubicina, irinotecán, paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, paclitaxel, carboplatino-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu o camptotecina apo21/TRAIL (un combo 6X)), uno o más inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib o MG132), uno o más inhibidores de Bcl-2 (por ejemplo, BH3I-2' (inhibidor de bcl-xl), inhibidor de la indolamina dioxigenasa-1 (por ejemplo, INCB24360, indoximod, NLG-919 o F001287), AT-101 (derivado de R-(-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequeña), GX-15-070 (obatoclax) o MCL-1 (antagonistas de la proteína 1 de diferenciación de células de leucemia mieloide), antagonistas de iAP (inhibidor de la proteína de apoptosis) (por ejemplo, smac7, smac4, mimético smac de molécula pequeña, péptidos smac sintéticos (véase Fulda et al., Nat Med 2002; 8: 808-15), ISIS23722 (LY2181308) o AEG-35156 (GEM-640)), Inhibidores de HD AC (histona desacetilasa), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, bevacizumab), agentes antiangiogénicos dirigidos a VEGF y VEGFR (por ejemplo, Avastin), triterpenoides sintéticos (véase Hyer et al., Cancer Research 2005; 65: 4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína inhibidora de FLICE celular) (por ejemplo, ligandos naturales y sintéticos de PPARy (receptor activado por proliferador de peroxisomas y), 5809354 o 5569100), inhibidores de quinasas (por ejemplo, Sorafenib), Trastuzumab, Cetuximab, Temsirolimus, inhibidores de mTOR tales como rapamicina y temsirolimus, Bortezomib, inhibidores de JAK2, inhibidores de HSP90, inhibidores de PI3K-AKT, Lenalidomida, inhibidores de GSK3p, inhibidores de IAP y/o fármacos genotóxicos.
Los anticuerpos anti-GITR y las terapias de combinación de anticuerpos descritas en el presente documento pueden usarse además en combinación con uno o más agentes citotóxicos antiproliferativos. Las clases de compuestos que pueden usarse como agentes citotóxicos antiproliferativos incluyen, aunque no de forma limitativa, los siguientes: agentes alquilantes (incluyendo, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureas y triazenos): Mostaza de uracilo, Clormetina, Ciclofosfamida (CYTOXAN™) fosfamida, Melfalán, Clorambucilo, Pipobromano, Trietilenomelamina, Trietilenotiofosforamina, Busulfán, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina y Temozolomida.
Antimetabolitos (que incluyen, sin limitación, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa): metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina y gemcitabina.
Agentes antiproliferativos adecuados para combinar con anticuerpos anti-GITR agonistas, sin limitación, taxanos, paclitaxel (el paclitaxel está disponible comercialmente como TAXOL™), docetaxel, discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT), pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona B1, [17]-deshidrodesoxiepotilona B, [18]-deshidrodesoxiepotilona B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A C6-C8 en puente, trans-9,l0-deshidroepotilona D, cis-9,10-deshidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomolida, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (discodermolida), TZT-1027 (soblidotina), ILX-651 (tasidotina clorhidrato), halicondrina B, mesilato de eribulina (E-7389), hemiasterlina (HTI-286), E-7974, criptoficinas, LY-355703, inmunoconjugados de maitansinoide (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17betaacetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7-deshidroxi-14,16-didemetil-(+)-discodermolidas y criptotilona 1, además de otros agentes estabilizadores de la microtubulina conocidos en la técnica.
En los casos en los que es deseable hacer que las células proliferativas de forma aberrante permanezcan quiescentes junto con o antes del tratamiento con anticuerpos anti-GITR descritos en el presente documento, las hormonas y esteroides (incluyendo análogos sintéticos), tales como 17a-etinilestradiol, Dietilestilbestrol, Testosterona, Prednisona, Fluoximesterona, Propionato de dromostanolona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilprednisolona, metiltestosterona, Prednisolona, Triamcinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, medroxiprogesteronaacetato, leuprolida, flutamida, Toremifeno, ZOLADEX™, también se pueden administrar al paciente. Cuando se emplean los métodos o composiciones descritos en el presente documento, también se pueden administrar otros agentes utilizados en la modulación del crecimiento tumoral o metástasis en un entorno clínico, tales como antimiméticos, según se desee.
Los expertos en la materia conocen métodos para la administración segura y eficaz de agentes quimioterapéuticos. Además, su administración se describe en la bibliografía convencional. Por ejemplo, la administración de muchos de los agentes quimioterapéuticos se describe en "Physicians' Desk Reference" (PDR), por ejemplo, 1996 edición (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA).
El o los agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia se pueden administrar de acuerdo con protocolos terapéuticos bien conocidos en la técnica. Será evidente para los expertos en la materia que la administración del o de los agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia se puede variar en función de la enfermedad que se esté tratando y los efectos conocidos del o de los agentes quimioterapéuticos y/o la radioterapia sobre dicha enfermedad. Además, de acuerdo con los conocimientos del clínico experto, los protocolos terapéuticos (por ejemplo, cantidades de dosificación y tiempos de administración) se pueden modificar a la luz de los efectos observados de los agentes terapéuticos administrados sobre el paciente y a la luz de las respuestas observadas de la enfermedad a los agentes terapéuticos administrados.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de diferentes anticuerpos anti-GITR
Se generaron anticuerpos monoclonales humanos anti-GITR en las estirpes Hco7 Hco27, Hco20, Hco12, Hco17 y Hc2 de ratones transgénicos HuMAb® ("HuMAb" es una marca registrada de Medarex, Inc., Princeton, Nueva Jersey) y ratones KM (la estirpe KM Mouse® contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la Publicación PCT WO 02/43478). Se generaron ratones HC2/KCo27 HuMAb y ratones KM como se describe en las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.770.429 y 5.545.806.
Un total de 94 ratones, incluyendo 7 genotipos de ratones transgénicos (KM, Hco7, Hco27, Hco20, Hco12, Hco17 y Hc2), fueron inmunizados con diferentes estrategias de inmunización (diferente antígeno, diferente dosis, duración, vía de administración (almohadilla plantar (fp), intraperitoneal (ip) y subcutánea (sc) y adyuvante (CFA/IFA, Ribi y anticuerpo), etc.). Se efectuaron y exploraron 36 fusiones a partir de 54 ratones. Se identificaron 157 anticuerpos a partir de estas 36 fusiones y una caracterización adicional condujo al aislamiento de anticuerpos de interés particular, incluyendo los anticuerpos designados como 28F3, 19D3, 18E10, 3C3, 2G6, 8A6, 9G7, 14e 3, 19H8 y 6G10.
La secuenciación de ADNc identificó una cadena pesada y una ligera para cada uno de los anticuerpos 28F3, 19D3, 18D10, 2G6, 8A6, 14E3 y 6G10 y una cadena pesada y dos cadenas ligeras (cadena ligera 1 o "L1" y cadena ligera 2 o "L2") para cada uno de los anticuerpos 3C3, 9G7 y 19H8. Mediante análisis de proteínas, se identificó una sola cadena ligera para los anticuerpos 3C3 y 9G7 y la secuenciación N-terminal y la determinación del peso molecular indicaron que era la cadena ligera L1 para 3C3 y la cadena ligera L2 para 9G7. Con respecto al anticuerpo 19H8, un 93 % de los anticuerpos expresados por el hibridoma contenían la cadena ligera L1 y un 3 % contenía la cadena ligera L2. Los anticuerpos 3C3-1 y 3C3-2 corresponden al anticuerpo 3C3 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Los anticuerpos 9G7-1 y 9G7-2 corresponden al anticuerpo 9G73 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Los anticuerpos 19H8-1 y 19H8-2 corresponden al anticuerpo 19H8 con una cadena ligera L1 y L2, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de cada una de las cadenas ligeras de los 3 anticuerpos se proporcionan en la tabla 11.
Las secuencias de aminoácidos de la región variable y el isotipo de los anticuerpos 28F3, 19D3, 18E10, 3C3 (3C3-1 y 3C3-2), 2G6, 8A6, 9G7 (9G7-1 y 9G7-2), 14E3, 19H8 (19H8-1 y 19H8-2) y 6G10 se exponen en las fig. 2-31. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de cada anticuerpo se proporcionan en la tabla 11. Las cadenas pesadas y ligeras de 28F3 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 15 y 16. Las cadenas pesadas y ligeras de 19D3 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 28 y 29. Las cadenas pesadas y ligeras de 18E10 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 41 y 42. Las cadenas pesadas y ligeras de 3C3 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 55 y 56. Las cadenas pesadas y ligeras de 2G6 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 73 y 74. Las cadenas pesadas y ligeras de 8A6 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 86 y 87. Las cadenas pesadas y ligeras de 9G7 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 100 y 101. Las cadenas pesadas y ligeras de 14E3 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 117 y 118. Las cadenas pesadas y ligeras de 19H8-1 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 131 y 132. Las cadenas pesadas y ligeras de 19H8-2 consisten en las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 131 y 133. Las cadenas pesadas y ligeras de 6G10 consisten en las secuencias de aminoácidos 337 y 338. Las secuencias de nucleótidos que codifican estas proteínas se proporcionan en la tabla 11.
Ejemplo 2: Unión de anticuerpos anti-GITR a linfocitos T activados de ser humano y de cinomolgo
Se evaluó la unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-GITR generados en el ejemplo 1 a linfocitos T activados humanos y de cinomolgo, que expresan GITR en su superficie.
Se activaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de ser humano o de mono cinomolgo con anticuerpo anti-CD3 recubierto en la placa (clon: UCHT1 para la activación de linfocitos T humanos; Clon: SP34 para la activación de linfocitos T de cinomolgo; ambos de BD Biosciences) y anticuerpo anti-CD28 soluble (Clon: CD28.2 tanto para ser humano como para mono cinomolgo, BD Biosciences) durante 4 días (ser humano)/o 5 días (mono cinomolgo). Se evaluó la unión del mAb para GITR a las células en un ensayo basado en clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) usando un anticuerpo anti-IgG humana conjugado a ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch). Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto.
Los anticuerpos anti-GITR 3C3, 19D3, 18E10 y 28F3, se unieron a linfocitos T tanto humanos como de cinomolgo. Como se muestra en la figura 32, los anticuerpos 3C3, 19D3, 18E10 y 28F3 se unieron con fuerza a linfocitos T humanos activados, como se refleja en los valores de CE50 de 0,04916 nM, 0,3633 nM, 0,1461 nM y 0,1916 nM, respectivamente. De manera similar, los anticuerpos 18E10 y 28F3 se unieron a linfocitos T activados de cinomolgo, con valores de CE50 para 18E10 y 28F3 de 0,9134 nM y 1,044 nM, respectivamente (figura 33). 3C3 no se unió significativamente a linfocitos T de cinomolgo.
Ejemplo 3: Unión de anticuerpos anti-GITR a GITR soluble
Se determinó la unión de anticuerpos anti-GITR a GITR soluble. Los anticuerpos anti-GITR se capturaron en microplacas recubiertas de kappa humana (~5KUR; Southernbiotech n.° de cat. 2060-01) y el GITR humano recombinante (rHGITR/Fc: R&D systems, n.° de cat. 689-GR) se hizo fluir por la microplaca a concentraciones de 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62 nM y 31 nM. La concentración de captura del mAb/volumen fue de 2-40 pg/ml (5 pl a 10 pl/min). El tiempo de asociación del antígeno fue de 5 minutos a 15 pl/min, el tiempo de disociación del antígeno fue de 6 minutos y la regeneración se llevó a cabo con HCl 50 mM/NaOH 50 mM (12 pl cada uno a 100 pl/min). Los resultados obtenidos con 28F3 y varios anticuerpos anti-GITR diferentes se muestran en la tabla 5.
Tabla 5: Kon (ka), Koff (kd) y Kd de anticuerpos anti-GITR
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Los resultados indican que los anticuerpos anti-GITR se unen a GITR soluble con una Kd en el intervalo de 1,210-8 a 3,5 10'8M. Se proporcionan datos para 2 subclones de 3C3, con una Kd en el intervalo de 1,33 10-8 a 1,44 10'8M.
En un experimento Biacore independiente, se determinaron las características de unión de anticuerpos que tenían las regiones variables de 28F3 con tres regiones constantes diferentes. El primer anticuerpo 28F3 tiene una región constante de IgG1 de tipo silvestre ("g1f" también citada como "g1" o "IgG1" o "cadena pesada de IgG1f que tiene el SEQ ID NO: 17 y cadena ligera que tiene el SEQ ID NO: 19). El sufijo "f" se refiere al alotipo. El segundo tiene una región constante de IgG1 sin actividad efectora que tiene tres mutaciones en la región Fc ("g1.1f", también citada como "g1.1", "IgG1.1" e "IgG1.1f" que tiene L234A, l235E, G237A; cadena pesada que tiene el SEQ ID NO: 18 y cadena ligera que tiene el SEQ ID NO: 19); y el tercer anticuerpo 28F3 tiene una región constante de IgG1 que tiene una mutación N297A.
El experimento Biacore se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente, excepto por que las microplacas se recubrieron con anti-CHI (Invitrogen, n.° de referencia 054500). Los resultados, que se muestran en la tabla 6, indican que los tres anticuerpos tienen características de unión similares, con una Kd en el intervalo de 3,93 x 10'8 M a 4,39 x 10-8 M.
Tabla 6: Características cinéticas de 28F3 ue tienen diversas Fc
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Ejemplo 4: Afinidad de unión de anticuerpos anti-GITR a linfocitos T activados humanos y a células 3A9-huGITR
Se determinó la unión de anticuerpos anti-GITR a GITR en linfocitos T humanos activados y en la línea celular 3A9 de hibridoma de linfocitos T de ratón, que expresa ectópicamente GITR humano (3A9-hGITR) mediante análisis de Scatchard. Este ensayo se llevó a cabo con 28F3. IgG1.1 (SEQ ID NO: 18 para la cadena pesada y SEQ ID NO: 19 para la cadena ligera) a 4,59 mg/ml.
El análisis de Scatchard en linfocitos T humanos activados se llevó a cabo como se expone a continuación. Se lavaron una vez linfocitos T obtenidos de un donante humano con medio de cultivo (RPMI con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio, 2-mercaptoetanol) y se resuspendieron en el mismo medio de cultivo complementado con 1 pg/ml de anti-CD28 (CD28.2, BD n.° 555725) y 100U/ml de IL-2 (Peprotech n.° 200-02) a 106 células/ml. Se sembraron 5x106 células en cada uno de tres pocillos de una placa de 6 pocillos que se recubrió con 20ug de anti-CD3 (5 ml, 4 pg/ml, durante una noche a 4 °C; UCHT-1, BD n.° 555329). Las células se incubaron durante 3 días a 37 °C y se usó la mitad de estas células para el análisis de Scatchard (análisis del "día 3"). El medio gastado de la otra mitad se repuso con 5 ml de medio fresco y las células se incubaron durante otro día y después se usaron para el análisis de Scatchard (análisis del "día 4") con estas células.
Para el análisis de Scatchard, 28F3. IgG1.1 se radioyodó con 125I-Na (Perkin Elmer n.° NEZ033H001MC (1mCi) usando el reactivo de yodación en fase sólida IODO-GEN® (1,3,4,6-tetracloro-3a-6a-difenilglicourilo; Pierce n.° 28601). El exceso de yodo se retiró usando una columna de desalado (Pierce, n.° 43243). Las fracciones de anticuerpo marcado se recogieron y se analizó su radiactividad en un contador gamma Wizard 1470 (Perkin-Elmer). Se calculó la concentración de 125I-28F3.IgG1.1 en cada fracción con el fluorómetro Qubit™ de Invitrogen. La radiopureza se determinó mediante cromatografía en capa fina del pico de proteína y de las fracciones radiactivas (Pinestar Technology, n.° 151-005).
Se demostró la unión de 28F3.IgG1.1 radioyodado a linfocitos T humanos activados incubando los linfocitos T humanos activados con una titulación de 125I-28F3.IgG1.1. La unión no específica se determinó mediante la unión en presencia de una titulación de un exceso molar de 100 veces de anticuerpo no marcado y se restó de las CPM totales para calcular la unión específica. Se usó una curva patrón lineal de la concentración de 125I-28F3.IgG1.1 frente a las CPM para extrapolar el máximo de nM unidos a 125I-28F3. IgG1.1 y de este modo calcular el número de receptores por célula. El número de moléculas de GITR humano por linfocito T CD4+ humano estimulado en el día 3 fue de aproximadamente 8.400 y en el día 4, aproximadamente 13.200. Los resultados del análisis de Scatchard indican que 28F3.IgG1.1 se une específicamente a los linfocitos T CD4+ T humanos estimulados en el día 3 con una Kd de 0,7 nM y a linfocitos T CD4+ humanos estimulados en el día 4 con una Kd de 0,87 nM.
Se demostró la unión de 28F3.IgG1.1 radioyodado a células 3A9-huGITR incubando células 3A9-huGITR con una titulación de 125I-28F3.IgG1.1. La unión no específica se determinó mediante la unión en presencia de una titulación de un exceso molar de 100 veces de anticuerpo no marcado y se restó de las CPM totales para calcular la unión específica. Se usó una curva patrón lineal de la concentración de 125I-28F3.IgG1.1 frente a las CPM para extrapolar el máximo de nM unidos a 125I-28F3. IgG1.1 y de este modo calcular el número de receptores por célula. El número de moléculas de GITR humano por célula 3A9-huGITR fue de aproximadamente 180.000. Los resultados del análisis de Scatchard indican que 28F3.IgG1.1 se une específicamente a células 3A9-huGITR con una Kd de 0,5 nM.
En otro experimento, se determinó la unión de 28F3.IgG1 y 28F3.IgG1.1 a linfocitos T CD4+ y CD8+ activados de donantes humanos y de cinomolgo. Se aislaron linfocitos T CD4+ y CD8+ humanos y de cinomolgo de donantes humanos y de cinomolgo y se trataron con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 para su activación. Los resultados indican que 28F3.IgG1 y 28.IgG1.1 se unen de manera similar a células CD4+ humanas activadas, con valores de CE50 de 0,55 nM y 0,67 nM, respectivamente y de manera similar a células CD8+ humanas activadas, con valores de CE50 de 0,56 nM y 0,65 nM, respectivamente. 28F3.IgG1 y 28.IgG1.1 se unen a células CD4+ de cinomolgo activadas, con valores de CE50 de 1 nM y 0,86 nM, respectivamente y de manera similar a células CD8+ de cinomolgo activadas, con valores de CE50 de 1,26 nM y 0,74 nM, respectivamente.
Ejemplo 5: Los anticuerpos monoclonales anti-GITR humanos inhiben la unión de GITR-L a GITR
Para determinar si los anticuerpos HuMab anti-GITR inhiben la unión del ligando de GITR a GITR, se preincubó la línea celular 3A9 de hibridoma de linfocitos T de ratón, que expresa GITR humano (células GITR-3A9) con mAb para GITR a concentraciones en el intervalo de 10'4 jg /m l a 100 jg/ml, seguido de incubación del ligando de GITR (R&D Systems, n.° 6987-GL) a una concentración de 10 ng/ml. La unión del ligando de GITR a las células se determinó en un ensayo basado en FACS usando un anticuerpo anti-marcador de hemaglutinina (HA) conjugado a PE y las muestras se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto. Como se muestra en las figuras 34A y 34B, en estas condiciones, los anticuerpos 19D3, 28f 3 y GITR.3 (3C3) bloquearon la unión de GITR-L a células GITR-3A9, con valores de CE50 de 0,7546, 0,2783 y 0,06934, respectivamente. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo 19H8.
Se llevó a cabo otro conjunto de experimentos en diferentes condiciones para evaluar adicionalmente el alcance del bloqueo de la unión de GITR-L a GITR mediante anticuerpos anti-GITR. En estos experimentos, se añadió un trímero soluble de hGITR-L recombinante a concentraciones de 1,06 x 10'9 a 100 mg/ml a linfocitos T humanos activados y se unión de una manera dependiente de la dosis a linfocitos T CD4+ y CD8+ T con valores de CE50 de 0,016 ug/ml (figura 34C). El experimento se llevó a cabo como se expone a continuación: Se añadió trímero de hGITR-L recombinante (R&D Systems, n.° de cat. 6987-GL) a una concentración de 1,06e-9 a 100 jg/m l a linfocitos T activados con PHA. Después de una incubación primaria de 30 minutos, se detectó GITR-L unido a células usando anti-marcador de HA conjugado a PE (Miltenyi, cat. 120-002-687). Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACS Canto (BD, San Jose) y se analizaron con el programa informático FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
La unión previa de rhGITR-L a concentraciones de 1,06 x 10'9 a 100 ug/ml a linfocitos T activados bloqueó la unión posterior de 0,5 ug/ml de 28F3-hIgG1 (saturación de aproximadamente el 90 %) con una CI50 de 0,0024 ug/ml. Ya que a 100 ug/ml la IMF no llegó al valor basal (el control de IgG), la inhibición fue parcial (figura 34D). El experimento se llevó a cabo como se expone a continuación: En primer lugar, se trataron linfocitos T activados con PHA con una titulación de 24 puntos de factor 3 de trímero de GITR-L recombinante (R&D Systems, 6987-GL), comenzando a 100 jg/ml, durante 30 minutos. Posteriormente se añadió a la mezcla de células 28F3-hIgG1 a una concentración fija de 0,5 jg/ml, que se sometió a otros 30 minutos de incubación. 28F3- hIgG1 unido a células se detectó usando anticuerpo secundario conjugado a PE contra Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch Cat. 109-116-098). Se usó un Ab hIgG1 no relacionado como control de isotipo para 28F3-hIgG1, mientras que se incluyó una muestra sin preincubación de GITR-L para mostrar la unión de 28F3-hIgG1 en ausencia de bloqueo. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACS Canto (BD, San Jose) y se analizaron con el programa informático FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
Cuando se preincubaron linfocitos T activados con 28F3-hIgG1 a concentraciones en el intervalo de 1,06 x 10'9 a 100 ug/ml, la unión de GITR-L a 0,6 ug/ml (saturación de aproximadamente el 90 %) no se vio afectada (figura 34E). Sin embargo, cuando se añadió GITR-L a una concentración menor de 20 ng/ml, próxima a su CE50, su unión se bloqueó parcialmente mediante 28F3-hIgG1 unido previamente con una CI50 de 0,076 mg/ml (figura 34F). Los experimentos se llevaron a cabo como se expone a continuación: Se preincubaron linfocitos T activados con PHA con 28F3-hIgG1 a concentraciones en el intervalo de 0,00056 a 100 |jg/ml, seguido de la adición de 0,6 ug/ml o 20 ng/ml de GITR-L. GITR-L unido a células se detectó con anti-marcador HA conjugado a PE. Se incluyó una hIgG1 no relacionada como control de isotipo para 28F3-hIgG1 y se usó una muestra sin anticuerpo primario para demostrar la unión de GITR-L sin bloqueo. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACS Canto (BD, San Jose) y se analizaron con el programa informático FlowJo (Tree Star, Inc, Ashland, OR).
Estos datos demuestran que 28F3-hIgG1 es un bloqueador de ligando parcial que puede permitir cierto acoplamiento in vivo de GITR mediante GITR-L.
Ejemplo 6: Todos los anticuerpos anti-GITR se agrupan en un grupo
Se llevaron a cabo experimentos de agrupamiento de anticuerpos con los siguientes anticuerpos anti-GITR humano: 28F3, 18E10, 19D3, 14E3, 8A6, 9G7, 3C3 y 6G10.
Los anticuerpos anti-GITR se inmovilizaron sobre las superficies de una microplaca sensora CM5 (Serie S, GE Healthcare, n.° de cat BR-1005-30), celda de flujo 2, celda de flujo 3 y celda de flujo 4 (5000 UR) y la celda de flujo 1 se usó como control negativo. Los anticuerpos se unieron a 120 jg/m l (2X) a la concentración de partida. Se efectuó una serie de diluciones diluyendo la concentración del anticuerpo 1:3 con tampón para ocho concentraciones diferentes (120 jg/ml-0,0 jg/ml, 2X) para obtener una curva de titulación. Cada serie de concentración de anticuerpo se dividió en dos mitades. En la primera mitad de la serie de concentración, se añadieron 40 nM (2X) de antígeno GITR (rHGITR/Fc n.° de cat. 689-GR) para producir la serie de concentraciones final (60 jg/ml-0,0 jg/m l) y 20 nM de concentración final de antígeno en cada pocillo. En la segunda mitad de la serie de concentración, en lugar de antígeno, se añadió tampón para tener el anticuerpo diluido a la misma concentración y esta mitad se trató como el blanco. Los complejos se incubaron durante 2 horas. Se inyectaron 40 j l de complejos en la superficie recubierta con anticuerpo a un caudal de 30 jl/min. Se usó un instrumento Biacore t 200 y el tampón de ejecución fue HBE-EP, GE Healthcare n.° de cat. BR-1001-88, filtrado desgasificado, HEPES 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %. La superficie se regeneró con NaOH 25 mM (código de pedido: BR-1003-58, GE Healthcare) a 100 jl/m in durante 5 segundos. Los datos se analizaron usando Microsoft Excel, donde la serie de concentraciones de anticuerpos se representó frente a las unidades de respuesta correspondientes para obtener curvas de titulación.
Los resultados indican que todos los anticuerpos evaluados se agrupan en un grupo, lo que indica que todos se unen a una región similar de la región extracelular de GITR humano.
Ejemplo 7: Los anticuerpos anti-GITR se unen a un epítopo conformacional
Este ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-GITR 28F3 y 3C3 se unen a GITR humano no desnaturalizado, pero no a GITR humano desnaturalizado y que la unión no se ve afectada por la glucosilación unida a N u O.
La unión de anticuerpos anti-GITR a GITR nativo o desnaturalizado que tiene o no glucosilación unida a N se determinó como se expone a continuación. Se incubaron muestras de GITR humano nativo (es decir, no desnaturalizado) y desnaturalizado con o sin la enzima N-glicanasa PNGasa F a 37 °C en PBS durante una noche para eliminar la N-glucosilación. La desnaturalización de GITR se llevó a cabo mediante reducción a 37 C en ditiotreitol 50 mM y clorhidrato de guanidina 4 M durante 45 minutos y después fue seguida de alquilación en yodoacetamida 100 mM durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las muestras de GITR humano nativo con o sin glucosilación unida a N se sometieron a electroforesis en gel de SDS y las muestras de GITR desnaturalizado con o sin glucosilación unida a N se sometieron a electroforesis en gel de SDS desnaturalizante. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa para el análisis de transferencia de Western. La membrana se incubó con el anticuerpo 28F3. La unión se detectó mediante incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (marcado con HRP) específico para las cadenas pesadas y ligeras de IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) y fue seguida de detección de luminiscencia capturada sobre película. Los resultados, que se muestran en la figura 35, indican que el Ab anti-GITR 28F3 se une únicamente a GITR nativo y no a la forma desnaturalizada y que la presencia o ausencia de glucosilación no afecta a la unión. Se obtuvieron resultados similares con el anticuerpo anti-GITR 3C3.
Por tanto, los anticuerpos anti-GITR 28F3 y 3C3 se unen a un epítopo que es conformacional e independiente de la glucosilación unida a N y unida a O.
Ejemplo 8: Patrones de unión de 28F3 y 3C3 a péptidos de GITR humano nativo
Se investigó el patrón de unión de 28F3 y 3C3 a GITR humano evaluando la unión de estos anticuerpos a péptidos generados a partir de GITR humano nativo mediante análisis de SDS-PAGE y de transferencia de Western. El experimento se llevó a cabo como se expone a continuación. En primer lugar, se sometió GITR humano nativo a proteólisis mediante incubación con endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Lys-C, tripsina, endoproteinasa Glu-C o endoproteinasa Asp-N a una relación del 2 % en peso a 37 °C en PBS durante 5 horas sin la presencia de reactivos desnaturalizantes. Posteriormente, se sometió a la mezcla de reacción completa, 2 jg de cada digestión, a electroforesis de SDS-PAGE no desnaturalizante y se transfirió sobre nitrocelulosa para el análisis por transferencia de Western. Las transferencias de Western se incubaron posteriormente con anticuerpo 28F3 o 3C3 y la unión se detectó mediante incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (marcado con HRP) específico para las cadenas pesadas y ligeras de IgG anti-humano (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) y fue seguida de detección de luminiscencia capturada sobre película. Los resultados, que se muestran en la figura 36, indican que el patrón de unión de 28F3 y 3C3 es diferente, lo que sugiere que estos anticuerpos no se unen exactamente a la misma región de GITR humano.
Ejemplo 9: El anticuerpo anti-GITR 28F3 se une al extremo N-terminal del dominio extracelular de GITR humano
Se determinó la ubicación de GITR humano a la que se une 28F3 ensayando la unión en solución del anticuerpo a diversos fragmentos no desnaturalizados de GITR humano. El experimento se llevó a cabo como se expone a continuación: Se generaron fragmentos peptídicos de GITR humano mediante incubación de GITR humano con endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Lys-C, tripsina, endoproteinasa Glu-C o endoproteinasa Asp-N a una relación del 2 % en peso a 37 °C en PBS durante cinco horas sin la presencia de reactivos desnaturalizantes. Después, se incubó la mezcla de péptido con perlas de Ab anti-GITR en p Bs a temperatura ambiente durante dos horas. Algunas muestras se sometieron a escisión secundaria in situ mediante incubación con una enzima diferente en PBS durante una hora. Los péptidos no unidos se retiraron mediante lacado de las perlas de Ab anti-GITR dos veces con PBS. Los péptidos que se unieron al Ab anti-GITR 28F3 se eluyeron con ácido fórmico al 2 % y después se sometieron a identificación de secuencia mediante CL-EM. Los resultados, que se muestran en el mapa de calor en la figura 37, indican que 28F3 se une a un epítopo conformacional en la siguiente serie de aminoácidos N-terminal:
QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215),
que corresponde a los aminoácidos 1 a 39 de GITR humano maduro (SEQ ID NO: 4) o en el fragmento más corto, QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTR (SEQ ID NO: 370).
Ejemplo 10: La glucosilación unida a O en GITR humano no interfiere con la unión de 28F3
No hay glucosilación unida a O conocida o documentada en el dominio extracelular de GITR humano. Sin embargo, los restos T18 y T20 del SEQ ID NO: 215 contienen una secuencia consenso de O-glucosilación. Estos restos se encuentran subrayados en la secuencia de epítopo: QRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGE (SEQ ID NO: 215). Por lo tanto, se determinó si la glucosilación unida a O afecta a la unión de 28F3 a GITR humano.
La unión de 28F3 a un péptido glucosilado o no glucosilado que consiste en el SEQ ID NO: 215 se llevó a cabo como se expone a continuación: Se generaron péptidos N-terminales glucosilados o no glucosilados de GITR humano mediante proteólisis del dominio extracelular intacto nativo de GITR humano unido a Fc de ratón. También se generó un péptido de GITR no glucosilado que consistía en los restos de aminoácido 1 a 39 del SEQ ID NO: 215 mediante síntesis orgánica. Los procedimientos para la unión de 28F3 a los péptidos se han descrito en la sección anterior (usando perlas recubiertas con 28F3). Como se muestra en la figura 38B, se observó que dos péptidos se unen a las perlas recubiertas con 28F3 y estos se identificaron mediante CL-EM como el péptido N-terminal sin glucosilación unida a O (figura 38A) y el otro es el mismo péptido N-terminal con glucosilación unida a O en T18 y/o T20 del SEQ ID NO: 215 (figura 38D).
Por tanto, 28F3 se une a la región N-terminal de GITR humano, independientemente de si tiene un azúcar unida a O en el aminoácido T18 y/o T20.
Ejemplo 11: Unión del anticuerpo anti-GITR 28F3 a un 20-mero
Como parte del experimento descrito en el ejemplo anterior, se unió en primer lugar un péptido sintético que tenía el SEQ ID NO: 215 que no tiene una glucosilación unida a O sobre las perlas recubiertas de 28F3 y después se escindieron adicionalmente mediante digestión in situ con endoproteinasa Asp-N. El resto del péptido, que consiste en la secuencia de aminoácidos QRPTGGPGCGPGRLLLGTGT (SEQ ID NO: 216) y que contiene los restos de aminoácido T18 y T20 sin la glucosilación unida a O, se unió a 28F3 (figura 38E). Por tanto, 28F3 se une a un 20-mero que consiste en el SEQ ID NO: 216.
Ejemplo 12: Mapeo de epítopos mediante HDX-EM
El método de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-EM) demuestra la conformación de proteínas y la dinámica conformacional en solución monitorizando la tasa y el alcance del intercambio por deuterio de los átomos de hidrógeno de la cadena principal de amida. El nivel de HDX depende de la accesibilidad del disolvente a los átomos de hidrógeno de la cadena principal de amida y de los enlaces de hidrógeno de la proteína. El aumento de masa de la proteína tras la HDX puede medirse con precisión mediante EM. Cuando se empareja esta técnica con digestión enzimática, pueden resolverse las características estructurales a nivel de péptido, lo que permite la diferenciación de péptidos expuestos en la superficie de aquellos plegados en el interior. Normalmente, el marcaje con deuterio y los posteriores experimentos de inactivación se llevan a cabo, seguidos de digestión con pepsina en línea, separación de péptidos y análisis de EM.
Antes del mapeo de epítopos del mAb 28F3.IgG1 (que tiene una cadena pesada y una ligera que consisten en los SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente) en GITR mediante HDX-EM, se llevaron a cabo experimentos no deuterados para generar una lista de péptidos pépticos comunes para GITR humano recombinante/Fc (R&D Systems, 10 j M, que contiene la sustitución de aminoácidos T20A) y el complejo de proteína de GITR humano recombinante/Fc y el mAb 28F3.IgG1 (relación molar 1:2, 10 j M y 20 j M), logrando una cobertura de secuencia del 86% para la región N-terminal de GITR (figura 39A). En este experimento, se usó tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) durante la etapa de marcaje, seguido de la adición de tampón de inactivación (tampón fosfato 200 mM con GdnCl 4M y TCEP 0,5 M, pH 2,5, 1:1, v/v). Para los experimentos de mapeo de epítopos, se diluyeron 5 j l de cada muestra (GITR/Fc o GITR/Fc con mAb 28F3.IgG1 (relación molar 1:2)) en 55 j l de tampón de D2O (tampón fosfato 10 mM, D2O, pD 7,0) para iniciar las reacciones de marcaje a temperatura ambiente. Las reacciones se llevaron a cabo durante diferentes periodos de tiempo: 20 s, 1 min, 10 min, 60 min y 240 min. Al final de cada periodo de reacción de marcaje, la reacción se inactivó añadiendo tampón de inactivación (1:1 v/v) y se inyectaron 50 j l de muestra inactivada en el sistema HDX-EM de Waters para su análisis. Los péptidos pépticos comunes observados se monitorizaron respecto de sus niveles de captación de deuterio en ausencia/presencia de mAb 28F3.IgG1.
Los datos experimentales mostrados en las figuras 39B y 39C obtenidos de las mediciones de HDX-EM en el mAb 28F3.IgG1 en GITR indican que el mAb 28F3.IgG1 tiene un epítopo discontinuo formado por (o entre) dos regiones peptídicas en la región N-terminal de GITR:
Región peptídica 1: PTGGPGCGPGRLLLGTGA (SEQ ID NO: 217)
Región peptídica 2: CRDYPGEE (SEQ ID NO: 218)
Basándose en los cambios de los niveles relativos de captación de deuterio, las dos regiones peptídicas pueden clasificarse como región 1 > 2, teniendo la región 1 los cambios más significativos en la captación de deuterio y siendo la región 2 estadísticamente significativa.
Ejemplo 13: Los anticuerpos anti-GITR inducen secreción de IL-2 e IFN-y por linfocitos T
Se ensayó la capacidad de los anticuerpos anti-GITR de potenciar la actividad de linfocitos T in vitro midiendo la cantidad de IL-2 e IFN-y secretados por linfocitos T incubados con los anticuerpos.
Se cultivó la línea celular 3A9 de hibridoma de linfocitos T de ratón que expresa ectópicamente GITR humano (3A9-hGITR) sobre placas recubiertas de anticuerpo monoclonal anti-CD3 en presencia de cantidades crecientes de los anticuerpos 19D3, 18E10 y 28F3. Se cultivaron 5 x 104 células 3A9-hGITR en placas recubiertas con 1 jg/m l de anticuerpo anti-CD3 (clon 145-2C11; BD Biosciences), y se trataron con las concentraciones indicadas de anticuerpos durante 24 horas. Como se muestra en la figura 40, los anticuerpos 3C3 (GITR.3), 28F3, 19D3 y 18E10 potenciaron la secreción de IL-2 por linfocitos T de una manera dependiente de la dosis. Como cabía esperar, los anticuerpos hIgG1 y hIgG2 de control no aumentaron la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR.
Dado que los anticuerpos anti-GITR potenciaron la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR en presencia de señal de CD3 estimuladora, se evaluó la capacidad de los anticuerpos de potenciar la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR activadas por un antígeno específico. Se cocultivaron 5 x 104 células 3A9-hGITR con 2,5 x 104 células presentadoras de antígeno LK35.2 en presencia de péptido HEL48-63 0,4 j M y las cantidades de anticuerpo indicadas durante 24 horas. Como se muestra en las figuras 41A y 41B, los anticuerpos 18E10, 13H2 (el mismo anticuerpo que 28F3), 28F3, 3C3 y 19D3 potenciaron la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR de una manera dependiente de la dosis.
En experimentos adicionales, el efecto de 28F3 en la secreción por linfocitos T de IL-2 e IFN-y se evaluó en linfocitos T de donante humano que se habían estimulado con células CHO que expresan anti-CD3scFv (OKT3). Las células CHO expresaron bajos niveles de OKT3 para promover una estimulación subóptima para ser capaz de observar agonismo por anticuerpos anti-GITR. En un conjunto de experimentos, se estimularon linfocitos T CD3+ de un donante con células CHO que expresan OKT3 y un anticuerpo anti-GITR y se midió la secreción de IFN-y. En un segundo conjunto de experimentos, se estimularon linfocitos T CD4+ de 2 donantes (diferente del donante de los linfocitos T CD3+) con células CHO que expresan OKT3 y un anticuerpo anti-GITR y se midió la secreción de IL-2 e IFN-y. Los experimentos se llevaron a cabo como se expone a continuación. Se obtuvieron pan linfocitos T de PBMC humanas aisladas de un gradiente de Ficoll (Amersham Bioscience 17-1440-03) con el kit de aislamiento de pan linfocitos T (Miltenyi, n.° 130-091-156) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para los experimentos con linfocitos T CD4+, se obtuvieron linfocitos T CD4+ de PBMC humanas (donantes 1 y 2) con cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos RosetteSep (StemCell Technology, n.° 15062) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se lavaron células CHO que expresan anti-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3) dos veces con medio RPMI y se sometieron a irradiación con una dosis de 50K Rad. Se recogieron las células y se resuspendieron en medio de cultivo (RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino al 10 %, L-glutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 55 nM, piruvato de sodio 1 mM y 100U/ml de penicilina/estreptomicina) a 2,5x105/ml. Se sembraron 2,5x104 células CHO-OKT3 y 1x105 linfocitos T por pocillo en una placa de fondo plano de grado TC de 96 pocillos (Costar). Las células se incubaron con una titulación de 8 puntos de factor 3 de anticuerpo para GITR comenzando a 20 jg/ml. Se añadió una hIgG1 no relacionada a 20 jg/m l como control de isotipo. Se incluyó una muestra con solo células para mostrar la actividad basal sin tratamiento alguno. Se recogió sobrenadante de cada muestra en el día 2 para la medición de IL-2 (solo para los ensayos con linfocitos T CD4+) (kit ELISA para IL-2 humana BD opt EIA; b D Biosciences, n.° 555190) y en el día 3 para la medición de IFN-y (kit de ELISA para IFN-g humano BD optEIA; BD Biosciences, n.° 555142).
Los resultados, que se muestran en la figura 42B-E, indican un aumento dependiente de la dosis de 28F3 de la secreción de IL-2 e IFN-y por linfocitos T CD4+ de ambos donantes.
También se demostró la secreción de IFN-y por linfocitos T donantes estimulados con otros anticuerpos anti-GITR. El ensayo se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la figura 42A, los anticuerpos 28F3, 3C3, 19D3 y 18E10 potenciaron la secreción de IFN-y por linfocitos T CD3+ de una manera dependiente de la dosis, mostrando los anticuerpos 28F3 y 3C3 el mayor efecto de los anticuerpos ensayados.
En otro experimento, se observó la proliferación de linfocitos T en presencia de anticuerpos anti-GITR, en particular, 28F3, en reacciones mixtas de linfocitos (MLR).
En conjunto, estos datos indican que los anticuerpos 18E10, 19D3 y 28F3 funcionan como anticuerpos anti-GITR agonistas que potencian la secreción de citocinas por linfocitos T.
Ejemplo 14: Los anticuerpos anti-GITR activan las respuestas de linfocitos T independientemente de la interacción con FcR in vitro
Se ha comunicado que los anticuerpos agonistas anti-TNFR requieren del coacoplamiento de FcyRIIB para su actividad in vivo (Li et al., Cell Cycle 2012;11:3343-3344). Para determinar si este requisito también se extiende a anticuerpos anti-GITR, se cocultivaron células 3A9-hGITR con células LK35.2 y el péptido HEL48-63 como se ha descrito en el ejemplo 13, tratadas con el anticuerpo anti-GITR de longitud completa, 28F3 (hIgG2), el fragmento F(ab')2 de 28F3 o el fragmento Fab de 28F3 y se evaluó su producción de mIL-2. Los resultados, que se exponen en la figura 43, demuestran que tanto 28F3 de longitud completa y el fragmento F(ab')2 de 28F3 potenciaron la producción de mIL-2, aunque el fragmento Fab de 28F3 tuvo un efecto más débil, lo que sugiere que el acoplamiento bivalente pero no el monovalente contribuye al efecto del anticuerpo anti-GITR 28F3. Estos resultados sugieren colectivamente que aunque no es necesario el coacoplamiento de FcyRIIB para potenciar los efectos en linfocitos T de anticuerpos agonistas anti-GITR in vitro, el acoplamiento del receptor FcyRIIB puede potenciar la actividad agonista. Pueden diseñarse anticuerpos anti-GITR para aumentar la unión al receptor FcyRIIB para aumentar su agonismo.
Ejemplo 15: El anticuerpo anti-GITR 28F3 marca a linfocitos en la amígdala humana
Para determinar qué tejidos expresan GITR, se usó el anticuerpo anti-GITR 28F3 para la detección inmunohistoquímica de GITr en diversos tejidos. No se observó tinción específica en tejidos no linfoides (incluyendo el corazón, hígado, pulmón, riñón, piel, nervio periférico, tiroides, testículo, próstata). Solo se observó tinción positiva en subconjuntos dispersos de linfocitos y/o células mononucleares en tejidos linfoides (incluyendo amígdala, bazo y timo) y ricos en tejidos linfoides (lámina propria del colon, estómago, útero). La tinción en la amígdala se muestra en la figura 44. Se observó tinción positiva en linfocitos dispersos en la región inter/parafolicular en el centro germinal. También tuvieron una tinción positiva grupos dispersos de células mononucleares (más allá del epitelio) y de linfocitos infiltrantes en epitelio.
Ejemplo 16: Actividad antitumoral de isotipos variantes anti-GITR en el modelo de tumor de MC38
DTA-1 es un anticuerpo agonista de rata anti-GITR de ratón (Shumizu et al., 2002; eBioscience, San Diego, CA). Se ha demostrado que este anticuerpo IgG2b modula tanto a los Treg como a los T f durante el tratamiento del melanoma de B16. Además, se necesitó la expresión de GITR tanto por T f como por Treg para obtener los efectos completos de DTA-1. Cohen et al. (2010) sugirieron que aunque el ligamiento de GITR a DTA-1 no suprime globalmente la actividad supresora de Treg, impide la infiltración en tumores de Treg y da lugar a la pérdida de expresión de Foxp3 en Treg intratumorales, lo que implica una eliminación o supresión localizada. El resultado neto es una relación intratumoral aumentada de Teff:Treg y una mayor activación y función de T f en el tumor. DTA-1 bloquea la interacción entre GITR y el ligando de GITR (GITRL) y el anticuerpo soluble es eficaz para promover una respuesta celular in vitro. También es eficaz en varios modelos de tumor para inhibir el crecimiento tumoral (véase, por ejemplo, Turk et al., 2004; Cohen et al., 2010).
a) Experimento de MC38 n ° 1
Se evaluó la actividad antitumoral de los diferentes isotipos de anti-GITR (DTA-1) en un modelo de tumor de adenocarcinoma de colon de MC38 estadificado. Se inyectó a ratones C57BL/6 por vía subcutánea 2 x 106 células tumorales MC38. Después de 7 días, los ratones fueron asignados aleatoriamente a 5 grupos de tratamiento y se administraron los anticuerpos de ensayo por vía IP en los días 7, 10 y 14 a 200 |jg por dosis en un volumen de 200 j l como se expone a continuación: Grupo 1: IgG1 de control de ratón (IgG); Grupo 2: Ab IgG2b de rata anti-GITR (DTA-rG2b); Grupo 3: Ab IgG1 de ratón anti-GITR (DTA-mG1); y grupo 4: Ab IgG 2a de ratón anti-GITR (DTA-mG2a). Los tumores y bazos se recogieron en el día 15.
La figura 45C muestra que los tumores tratados con IgG1 anti-GITR crecieron a una velocidad comparable a la de los tumores tratados con el control de IgG1 de ratón (figura 45A), no encontrándose ninguno de los 10 ratones libres de tumores (TF) al final de la monitorización de los ratones. Sin embargo, DTA-rG2b (figura 45B) y DTA-mG2a (figura 45D) redujeron significativamente la velocidad de crecimiento de tumores, encontrándose 3 y 2 de los 10 ratones TF, respectivamente.
Los cambios en los volúmenes tumorales medios y la mediana de volúmenes tumorales en los ratones de los grupos tratados con los diferentes isotipos de anti-GITR se representan en las figuras 46A y 46B. Estas gráficas confirman los datos de ratones individuales mostrados en la figura 45 de que el isotipo IgG2b del anticuerpo anti-GITR muestra el efecto inhibidor más potentes en el crecimiento de tumores de MC38, siendo el isotipo IgG2a tan solo ligeramente menos potente. El isotipo IgG1 muestra poca inhibición del crecimiento tumoral, siendo los volúmenes tumorales medios y medianos similares a aquellos en ratones tratados con el control de IgG de ratón.
También se determinaron los efectos de isotipos anti-GITR en subconjuntos de linfocitos T MC38 en TIL y bazo. Se compararon las poblaciones de subconjuntos de linfocitos T en TIL de MC38 y los bazos de ratones tratados con los diferentes isotipos anti-GITR. En el bazo, DTA-m2a y DTA-r2b provocaron una ligera reducción en el nivel de células CD8+, mientras que 9D9-m2a (un anticuerpo anti-CTLA-4) y DTA-ml no alteraron los niveles de linfocitos T CD8+ (figura 47A). Ninguna de las variantes de isotipo ensayadas tuvo un efecto significativo en el porcentaje de células CD4+ o CD4+Foxp3+ en el bazo (figuras 47B y 47C).
En TIL, 9D9-m2a provocó un aumento de al menos 2 veces en el porcentaje de células CD8+ en comparación con ambos controles de IgG1 de ratón (figura 47D). DTA-m2a tuvo un efecto menos pronunciado, aumentando el porcentaje de células CD8+ en aproximadamente un 50 %, mientras que DTA-ml y DTA-r2b provocaron un aumento nulo o tan solo marginal en, el porcentaje de células CD8+ en comparación con el control de isotipo de IgG1 (figura 47D). 9D9-m2a provocó un pequeño aumento en el porcentaje de células CD4+ en comparación con el control de isotipo de IgG1 de ratón, mientras que DTA-ml no provocó cambios en CD4+ (figura 47E). Por el contrario, tanto DTA-m2a como DTA-r2b redujeron los porcentajes de CD4+ en un 40-50 % en comparación con ambos isotipos IgG1 de ratón (figura 47E).
Se observaron los efectos más dramáticos con los niveles de Treg CD4+Foxp3+ entre las TIL. Aunque DTA-ml no tuvo efecto en esta población de linfocitos T, 9D9-m2a y DTA-m2a indujeron una reducción de aproximadamente 6 veces en el nivel de Treg CD4+Foxp3+ en comparación con el isotipo IgG1 y DTA-ml (figura 47F). Estos datos demuestran que la variante de IgG2a de anti-GlTR reduce el nivel de Treg específicamente en el ambiente tumoral. Por tanto, el isotipo IgG2a anti-GITR induce un aumento en los T f CD8+ y una reducción en los Treg en el sitio tumoral, lo que se traduce en una relación de T f a Treg elevada, que indica una robusta actividad antitumoral. DTA-r2b también indujo una reducción significativa en el nivel de Treg CD4+Foxp3+ en comparación con el control de IgG1, aunque no tan pronunciada como la reducción inducida por 9D9-m2a y DTA-m2a, lo que es coherente con la menor unión de la región Fc de IgG2b de rata a los FcyR activantes murinos. Estos datos demuestran que el anticuerpo agonista anti-GITR requiere del acoplamiento de FcyR activantes para su actividad eliminadora.
La medición por citometría de flujo del nivel de expresión de GITR en diferentes subconjuntos de linfocitos T en TIL de MC38 y bazo mostraron que GITR se expresaba en mayor cantidad en Treg en el sitio tumoral, siendo este nivel de expresión mayor que en Treg in en la periferia o en T f c D8+ en el sitio tumoral, que a su vez mostraron una mayor expresión que los T f CD8+ o CD4+ en la periferia. El nivel relativo más bajo de expresión de GITR se observó en T f c D4+ en el sitio tumoral. Estos datos sugirieron un mecanismo mediante el cual la eliminación de linfocitos T ayuda a estimular una respuesta de linfocitos T y de este modo potencia la eficacia antitumoral de una proteína de fusión de Fc si la diana de la proteína de fusión de Fc está altamente expresada en Treg en el sitio tumoral, en relación con la expresión de la diana en T f en el sitio tumoral y la proteína de fusión de Fc se une a un FcR activador que media la eliminación de la célula diana.
b) Experimento de MC38 n ° 2
Debido a la agregación encontrada con las variantes de DTA-1 (excepto la forma original de DTA-r2b obtenida comercialmente), se rediseñó un nuevo conjunto de variantes isotípicas para obtener anticuerpos DTA-1 que no se agregan. La agregación observada se rastreó hasta un aminoácido adicional que se había incorporado de manera inadvertida en la cadena ligera que las variantes isotípicas diseñadas y se solventó el problema mediante la eliminación de este aminoácido extraño. Los anticuerpos rediseñados se usaron en este experimento n.° 2. Se evaluó la actividad antitumoral de los isotipos rediseñados anti-GITR (DTA-1; serie GITR.7) usando un modelo de MC38 estadificado. Se implantó a ratones C57BL/6 por vía subcutánea 2 x 106 células MC38. Después de 7 días, los ratones fueron asignados aleatoriamente a 7 grupos de tratamiento para tener volúmenes tumorales medios comparables de aproximadamente 148 mm3/2) y los anticuerpos de ensayo se administraron por vía IP en los días 7, 10 y 14 a 200 |jg por dosis (excepto para el control de mIgG que se administró a una dosis de 200 jg ) como se expone a continuación: Grupo 1: control de IgG1 de ratón (mIgG o "isotipo"); Grupo 2: IgGIAb de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg1); Grupo 3: Isotipo de IgG1D265A de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg1-D265A); Grupo 4: Ab IgG2a de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg2a); Grupo 5: Ab IgG2b de ratón anti-GITR (mGITR.7.mg2b); y grupo 6: Ab IgG2b de rata anti-GITR (mGITR.7.r2b o DTA-1-rG2b). Los tumores y bazos se recogieron en el día 15.
Las figuras 48B y 48C muestran que los tumores tratados con anti-GITR IgG1 e IgG1-D265A crecieron a una velocidad comparable con la de tumores tratados con el control de IgG1 de ratón (figura 48A). En cada caso, ninguno de los 9 ratones se encontraron TF al final de la monitorización de los ratones 35 días después del implante. Sin embargo, de manera similar a los resultados en el experimento de MC38 n.° 1, mGITR.7.mg2a (figura 48D) indujo la mayor inhibición del crecimiento tumoral, encontrándose 2 de los 9 ratones TF. Los anticuerpos anti-GITR-2b de ratón y rata también redujeron significativamente la velocidad de crecimiento tumoral en un grado similar (figuras 48E y 48f ), aunque el anticuerpo 2b de rata produjo 1 ratón TF, mientras que el anticuerpo 2b de ratón no produjo ningún ratón TF 35 días después del implante.
Los cambios en los volúmenes tumorales medios y la mediana de volúmenes tumorales se muestran en las figuras 49A y 49B. Las tendencias son similares a las observadas en el experimento de MC38 1, excepto que el isotipo anti-GITR IgG2a fue el más potente inhibidor del crecimiento tumoral de MC38, mientras que el isotipo IgG2b muestra una potencia significativa, aunque menor, en la inhibición del crecimiento tumoral. Los isotipos IgG1 e IgG1-D265A mostraron una inhibición de bajo nivel del crecimiento tumoral en comparación con el control de IgG de ratón.
Los efectos de los diferentes isotipos anti-GITR en las poblaciones de Treg en las TIL y bazos de los ratones tratados se muestran en la figura 50. Como se observa en el experimento n.° 1, ninguna de las variantes de isotipo evaluadas tuvo un gran efecto en el porcentaje de Treg CD4+Foxp3+ en el bazo: el efecto más fuerte fue un aumento menor del 40 % inducido por el tratamiento con el isotipo IgG2b de rata anti-GITR, mientras que el isotipo IgG2b de ratón anti-GITR redujo marginalmente el porcentaje de Treg CD4+Foxp3+. Los otros isotipos de anti-GITR ensayados y el anticuerpo IgG2a anti-CTLA-4 (9D9-mG2a) aumentaron marginalmente el porcentaje de Treg (figura 50A).
Por el contrario, en las TIL, a excepción del isotipo de IgG1, que no provocó cambio alguno en comparación con el control de isotipo, todos los anticuerpos ensayados indujeron reducciones significativas en el porcentaje de Treg. El anticuerpo anti-CTLA-49D9-mG2a provoca una reducción de aproximadamente 4 veces en el nivel de Treg CD4+Foxp3+ en comparación con el isotipo IgG1; los isotipos 2a y 2b de ratón anti-GITR y el isotipo 2b de rata redujeron el nivel de Treg aproximadamente 2 veces y el mutante IgG1-D265A provocó una reducción ligeramente menor (figura 50B). Estos datos confirman los efectos observados en el experimento n.° 1, demostrando que los isotipos mG2a, mG2b y rG2b de anti-GITR inducen una eliminación significativa de Treg en el ambiente tumoral, que se correlaciona con la inhibición del crecimiento tumoral.
Los datos obtenidos en el experimento de MC38 n.° 2 son en gran medida coherentes con los obtenidos en el experimento n.° 1, lo que sugiere que la agregación de los anticuerpos no interfirió indebidamente con la actividad de los anticuerpos. Posiblemente, los anticuerpos agregados se eliminan rápidamente en los ratones y, por tanto, la agregación de anticuerpos puede no ser un problema significativo en los presentes ensayos in vivo.
Ejemplo 17: Actividad antitumoral de isotipos variantes de anti-GITR en un modelo de tumor de Sa1N estadificado
También se evaluó la actividad antitumoral de anti-GITR en un modelo de sarcoma Sa1N en ratones A/J. Se inyectaron por vía subcutánea 2 x 106 células Sa1N por implante a los ratones. Después de 7 días, se determinaron los volúmenes tumorales y los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento para tener volúmenes tumorales medios comparables (aproximadamente 75 mm3/2). Se administraron anticuerpos anti-GITR (DTA-1) diseñados para tener diferentes isotipos, como se describen en el ejemplo 10, experimento de MC38 n.° 1, por vía IP en los días 7, 10 y 12 a 200 |jg por dosis.
Los efectos en el crecimiento tumoral se muestran en la figura 51. El tratamiento con el anticuerpo IgG2a anti-GITR inhibió completamente el crecimiento tumoral y los 10 ratones se encontraron TF aproximadamente en el día 20 después del implante (figura 51B) y el isotipo IgG2b de rata tuvo un efecto similar, encontrándose 9 de 10 ratones TF aproximadamente en el día 20 (figura 51C). Los isotipos IgG1 (figura 51D) e IgG1D265A (figura 51E) inhibieron en cierta medida a los tumores, en comparación con el crecimiento no inhibido de los tumores tratados con control de isotipo de IgG1 (figura 51A), pero esta fue mucho menor que la inhibición observada con los isotipos mIgG2a y rIgG2b. Los cambios en los volúmenes tumorales medios y la mediana de volúmenes tumorales, mostrados en las figuras 52A y 52B, confirman el efecto inhibidor prácticamente completo de los anticuerpos mIgG2a y rIgG2b del crecimiento tumoral, en comparación con la mucho menor inhibición del crecimiento tumoral mostrada por los isotipos mIgG1 y mIgG1-D265A.
En conjunto, los datos en las figuras 51 y 52 confirman los datos obtenidos con el modelo de tumor MC38 (ejemplo 10) que muestra que los isotipos mIgG2a y rIgG2b anti-GITR muestran una potente actividad antitumoral, a diferencia de los isotipos mIgG1 (y mIgG1-D265A), que muestran una actividad antitumoral mucho menor. La actividad antitumoral en el modelo de Sa1N de los anticuerpos mIgG1 y el variante D265A es coherente con los efectos del agonismo de GITR sin eliminación de Treg.
Los efectos de los diferentes isotipos anti-GITR en las poblaciones de Treg en las TIL de Sa1N y bazos de los ratones tratados se muestran en la figura 53. Todas las variantes de isotipo de anti-GITR ensayadas indujeron un aumento relativamente pequeño de aproximadamente el 20-40 % en el nivel de Treg CD4+Foxp3+ en el bazo. El mayor aumento se indujo mediante tratamiento con el isotipo IgG2a de anti-GITR de ratón, que provocó el mismo aumento que el tratamiento con los anticuerpos IgG2b (9D9-G2b) e IgG1-D265A (9D9-G1-D265A) anti-CTLA-4 (figura 53A). Estos últimos isotipos de anti-CTLA-4 se usaron como controles positivos en este estudio de GITR ya que se había observado previamente eliminación de Treg con el isotipo IgG2b.
A diferencia del efecto de los Treg en la periferia, los isotipos m2a y r2b anti-GITR, así como los isotipos 2b anti-CTLA-4, redujeron el nivel de los Treg en el sitio tumoral al menos 3,5 veces (figura 53B). El isotipo IgG1 anti-GITR y el mutante IgG1-D265A indujeron menores reducciones de aproximadamente el 35 % en el porcentaje de Treg, mientras que el mutante IgG1-D265A anti-CTLA-4 no provocó cambios en el porcentaje de Treg en los TIL (figura 53B). Por tanto, como se observa en el modelo tumoral de MC38, los isotipos mG2a y rG2b anti-GITR inducen una eliminación de Treg significativa en el ambiente tumoral, mucho mayor que los anticuerpos IgG1 e IgG1-D265A, que se correlaciona con la inhibición del crecimiento tumoral.
Ejemplo 18: Actividad sinérgica con la combinación de anticuerpo anti-GITR y anticuerpo antagonista anti-PD1
Para determinar si se podía obtener un efecto antitumoral sinérgico combinando el anticuerpo DTA-1 con un anticuerpo que antagoniza a PD-1, una molécula que proporciona una señal inhibidora para los mecanismos antitumorales, se evaluó el efecto de la combinación de anticuerpos en el volumen tumoral usando un modelo de adenocarcinoma de colon MC38 estadificado. Se trató a los ratones con (A) mIgG1 de control, (B) mIgG DTA-1, (C) mIgG PD-1 (clon 4H2, BMS) y (D) PD-1 DTA-1 en los días 7, 10 y 14.
Los efectos en el crecimiento tumoral se muestran en la figura 54. El tratamiento con el anticuerpo DTA-1 o el anticuerpo anti-PD-1 inhibió hasta cierto punto el crecimiento tumoral de manera individual, encontrándose 2 de los 10 ratones TF. Por el contrario, la combinación del anticuerpo DTA-1 y el anticuerpo anti-PD-1 aumento significativamente el número de ratones TF en el día 30, encontrándose 7 de los 10 ratones TF. Como cabía esperar, no hubo ratones TF en los ratones a los que se administró mIgG de control.
Estos resultados sugieren que la combinación de anticuerpo agonistas anti-GITR y los anticuerpos antagonistas anti-PD-1 actúa de manera sinérgica para inhibir el crecimiento tumoral.
Ejemplo 19: Efecto de las mutaciones de aminoácidos de CDR en la afinidad de unión
Este ejemplo demuestra que ciertos restos de aminoácidos en la CDR3 de VH de 28F3 pueden mutarse a otro aminoácido sin afectar significativamente a su afinidad de unión.
Se crearon 48 mutantes de 28F3 mutando uno o más de los siguientes aminoácidos en la CDR3 de VH: M102, D106 y M111 (numeración de acuerdo con el SEQ ID NO: 13) y se evaluaron las siguientes actividades: la unión a células 3A9-hGITR y la secreción de IL-2 de células 3A9-hGITR en presencia de anti-CD3 unido a la placa. Los experimentos se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente.
Los resultados, se muestran en las figuras 55A y 55B (unión a células 3A9-hGITR), figuras 56A-F (secreción de IL-2) y la tabla 7.
Tabla 7: Efectos de las mutaciones de aminoácidos de CDR en la afinidad de unión
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continuación
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Los resultados indican que varios mutantes tienen una unión y actividad comparable a las de 28F3, mientras que otras mutaciones reducen una o ambas de la unión y la secreción de IL-2. Los siguientes mutantes tienen datos de unión y actividad comparables: M98V; M98V/D106E; M98L/D106E; M98I/D160E; y M98A/D106E.
Ejemplo 20: Efectos de modificaciones en la región constante en la actividad agonista del anticuerpo para GITR
Este ejemplo demuestra que los anticuerpos para GITR que comprenden una bisagra de IgG2 tienen una capacidad aumentada para inducir secreción de IL-2 e IFN-y por linfocitos T en relación con los mismos anticuerpos que tienen una bisagra de IgG1.
Se ha observado en los ensayos de CHO-OKT3 y 3A9 descritos anteriormente que los anticuerpos procedentes de hibridoma, que tienen una región constante de IgG2, son más potentes en la estimulación de la secreción de citocinas que los mismos anticuerpos en los que se cambió la región constante de cadena pesada a la de IgG1o una IgG1 sin actividad efectora (IgG1.1). Por lo tanto, se evaluó adicionalmente en estos ensayos el efecto de una región constante o bisagra de IgG2 en anticuerpos anti-GITR.
Se ligó la región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-GITR humano a las siguientes regiones constantes de cadena pesada:
Tabla 8: Configuraciones de regiones constantes de los anticuerpos anti-GITR ejemplificados
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En primer lugar, se compararon las afinidades de unión de estos anticuerpos para GITR con las de anticuerpos para GITR que tienen una bisagra de IgG1. Se determinaron las afinidades de unión como se describe en el ejemplo 2. Como se muestra en la figura 57, los tres anticuerpos para GITR que tienen una bisagra de IgG2 tuvieron afinidades similares para linfocitos T activados que los dos anticuerpos para GITR que tienen una bisagra de IgG1.
A continuación, se evaluó la capacidad de los anticuerpos para GITR que tienen una región constante de IgG1 o una bisagra de IgG2/dominio Fc de IgG1 para inducir secreción de IL-2 e IFN-y por linfocitos T estimulados con células CHO que expresan OKT3, como se describe en el ejemplo 13. Como se muestra en las figuras 58A y 58B, el anticuerpo con la bisagra de IgG2/dominio Fc de IgG1 ("anti-GlTR.G2.g1f') indujo secreción tanto de IFN-y como de IL-2 por linfocitos T en mayor medida que el anticuerpo con la región constante de IgG1 ("anti-GITR.glf'). Se obtuvieron resultados similares con las versiones sin actividad efectora de estos dominios constantes (figura 58C).
Para confirmar adicionalmente la activación aumentada de linfocitos T con los anticuerpos anti-GITR que comprenden una bisagra de IgG2, se evaluó la secreción de IL-2 en un formato experimental diferente. En este experimento, se evaluó la capacidad de los anticuerpos de GITR para inducir la secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR (línea celular 3A9 de hibridoma de linfocitos T que expresa GITr humano de manera ectópica), como se describe en el ejemplo 13. Como se muestra en la figura 59, todos los anticuerpos que tienen la bisagra de IgG2 (GITR.g2, anti-GITR.g2.g1f y anti-GITR.g2.g1.1f) indujeron secreción de IL-2 por células 3A9-hGITR en mayor medida que sus homólogos que contienen la región constante de IgG1 (anti-GITR.glf y anti-GITR.g1.1f').
Estos resultados sugieren de manera colectiva que los anticuerpos anti-GITR que tienen una bisagra de IgG2 y regiones constantes de g1 o g1.1 son más potentes que los mismos anticuerpos que tienen una bisagra de IgG1. Un potencial mecanismo para explicar los efectos mejorados de los anticuerpos de GITR que contienen la bisagra de IgG2 es la internalización aumentada y/o la formación de complejos aumentada de estos anticuerpos en la superficie celular, en comparación con los mismos anticuerpos que comprenden una bisagra de IgG1.
Ejemplo 21: La proliferación inducida por anticuerpo anti-GITR es intrínseca de células Teff
GITR se expresa en linfocitos T reguladores (Treg) tanto de ratón como de ser humano. Los datos en las referencias han demostrado que los anticuerpos agonistas anti-GITR impulsan la proliferación de linfocitos T efectores (Teff) CD4+Foxp3- de ratón en presencia de células Treg. Adicionalmente, se ha sugerido que este efecto está impulsado principalmente por la unión del anticuerpo anti-GITR a células Teff, en lugar de efectos directos en la función supresora de células Treg. Otras publicaciones demuestran que los anticuerpos anti-GITR impulsan la proliferación de células Treg y pueden inducir la inestabilidad de linaje de células Treg caracterizada por la pérdida de Foxp3.
Para examinar los efectos de los anticuerpos anti-GITR en la función de células Treg, se llevó a cabo un ensayo de supresión de células Treg de ratón en el que se estimuló a células Teff con anti-CD3 y varios isotipos del mAb anti-GITR de ratón, DTA-1, en presencia de APC y números de titulación de células Treg. Los resultados demostraron que el tratamiento con anticuerpo DTA-1 aumentó la proliferación, en comparación con un control de isotipo. Además, los isotipos IgG1, 2a, 2b e IgG1 D265A inerte fueron eficaces a la hora de aumentar la proliferación de células Teff, demostrando de este modo que no es necesaria la unión a FcR para la función del anticuerpo anti-GITR en este sistema.
En el experimento anterior no quedó claro si la proliferación aumentada de Teff se debía a que los anticuerpos anti-GITR actúan en células Treg y/o Teff. Para abordar esta cuestión, se usaron ratones con "inserción génica" de GITR humano (huGITR KI). En estos ratones, el gen que codifica GITR de ratón, Tnfrsf18, se reemplazó por el gen TNFRSF18 humano y GITR humano se expresa de manera similar a muGITR en los ratones de tipo silvestre; GITR humano se expresa en células tanto Teff como Treg, con mayores niveles en estas últimas. Se descubrió que el mAb anti-GITR humano 28F3 era capaz de impulsar la proliferación de células Teff en ratones huGITR KI. Ya que 28F3 se une a GITR humano pero no a GITR de ratón, fue posible establecer un sistema de ensayo de supresión de Treg en el que podía actuarse diferencialmente sobre GITR en células Teff y Treg. Este sistema también permitió examinar las diferencias funcionales entre 28F3 con una región Fc de IgG1 humana o de IgG1.1 inerte.
Las células Treg y Teff se clasificaron basándose en la expresión de CD4 y CD25 de ratones huGITR KI y TS. Las células Treg y Teff de TS y huGITR se mezclaron en combinaciones que permitieron el direccionamiento unicompartimental de células Treg o Teff con 28F3 (células Teff de huGITR KI con células Treg de tipo silvestre, etc.). Como controles, se incluyeron condiciones en las que 28F3 no podía unirse a células Treg y Teff o a ninguna. Los cultivos que contenían células Teff y Treg se estimularon con anti-CD3 en presencia de APC y 28F3 IgG1,28F3 IgG1.1 o un control de isotipo.
Los resultados se proporcionan en la figura 60. Como cabía esperar, se observó un aumento en la proliferación de células Teff cuando 28F3 pudo unirse tanto a células Treg como Teff y este efecto se mantuvo en las condiciones en las que 28F3 solo pudo unirse a células Teff. Por el contrario, cuando 28F3 solo fue capaz de unirse a células Treg, no hubo aumento en la proliferación de Teff frente al control de isotipo. Con respecto al isotipo, no hubo diferencia entre Fc de IgG1 e IgG1.1 en las condiciones donde 28F3 mostró un efecto. Esto es coherente con los datos descritos anteriormente, que demuestran que la reticulación de Fc no es necesaria para el agonismo anti-GITR. Tomados en conjunto, en este sistema, los anticuerpos anti-GITR actúan principalmente mediante su capacidad para modular la función de células Teff y no mediante la inhibición de la capacidad supresora de células Treg. Sin embargo, esto no excluye un papel para la señalización de GITR en células Treg in vivo, ya que los anticuerpos anti-GITR pueden impulsar la proliferación de células Treg o proporcionar una diana específica de Treg para la ADCC o la ADCP.
Ejemplo 22: Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC)
La actividad de ADCC in vitro de 28F3.IgG1f y 28F3.IgG1.1f se evaluó usando células NK92/CD16 o células NK primarias como efectores y se usó como diana varias células que se sabe que expresan GITR.
Tres días antes del ensayo, se aislaron subconjuntos de linfocitos T CD4+ y CD8+ diana mediante selección negativa y los Treg se aislaron adicionalmente de los linfocitos T CD4+ mediante selección positiva para CD25. Se estimuló cada uno de los linfocitos T durante tres días con perlas de CD2/CD3/CD28 (Miltenyi Biotec) para inducir la regulación positiva de GITR. Un día antes del ensayo, se aislaron células NK primarias de PBMC frescas mediante selección negativa (StemCell Technologies, Inc.) y se incubaron durante una noche en medio MyeloCult H5100 (StemCell) complementado con 500UI/ml de IL-2 recombinante (R&D Systems) e hidrocortisona 1uM (StemCell). En el día del ensayo, se incubaron células efectoras (células NK primarias o NK92/CD16) con linfocitos T activados marcados con Calcein AM a relaciones específicas de efector a diana en presencia de 1 ug/ml de 28F3.IgG1f y 28F3.IgG1.1f.
Usando células NK primarias o células NK92/CD16 como efectores, 28F3.IgG1 indujo la lisis de linfocitos T efectores CD4+ y Treg, mientras que se observó menos lisis de linfocitos T CD8+ (figura 61). Como cabía esperar, 28F3.IgG1.1 no medió la ADCC de cualquier célula diana usando células NK92 o NK primarias como efectores. Por tanto, 28F3.IgG1 indujo la lisis de linfocitos T efectores CD4+ y Treg y en menor medida, linfocitos T CD8+ activados y el nivel de lisis inducido por 28F3.IgG1 parece ser proporcional al nivel de expresión de GITR en las células diana.
Ejemplo 23: Actividad del anticuerpo 28F3.IgG1 en ratones con inserción génica de GITR humano
Este ejemplo demuestra que 28F3.IgG1 y 28F3IgG1.1 tienen actividad antitumoral en tumores de MC38 en ratones C57BL/6 que tienen un sistema inmunitario humano y proteína GITR humano y que la actividad antitumoral es menor con 28F3.IgG1.
Generación de ratones con inserción génica de GITR humano: Se modificaron por ingeniería genética ratones C57BL/6 para expresar el dominio extracelular (ECD) de GITR humano en lugar del ECD de GITR de ratón, manteniendo intactas las secuencias transmembrana y citoplasmáticas de ratón. La expresión de GITR quimérico de humano/ratón se confirmó mediante tinción de células de bazo activadas con anti-CD3/CD28 con un anticuerpo anti-GITR humano.
Se cultivaron células MC38 en medio DMEM con suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) al 10 %, L-glutamina 2 mM, 4.5 g/l (45 %) de glucosa (10 ml/l) y piruvato de sodio 1 mM (10 ml/l). Las células se separaron a 1:10 cada 2 días. Se usaron dos cohortes de ratones y para ambas cohortes, se implantaron en el flanco derecho de cada ratón por vía subcutánea 0,75 millones de células MC38 en 0,2 ml de PBS, usando una jeringuilla de 1-cm3 y una aguja del calibre 25 de media pulgada (12,7 mm). Para la cohorte 1, en el día 7 después del implante, se asignaron aleatoriamente 40 ratones a 3 grupos de 12-13 ratones cada uno dependiendo del volumen tumoral (LxWxH/2). Todos los grupos tuvieron volúmenes tumorales de aproximadamente 174 mm3/2. En los días 7, 10 y 14, se administró control de vehículo o mAb a 10 mg/kg. Para la cohorte 2, en el día 7 después del implante, se asignaron aleatoriamente 10 ratones a 2 grupos de 5 ratones cada uno dependiendo del volumen tumoral (LxWxH/2). Todos los grupos tuvieron volúmenes tumorales de aproximadamente 69 mm3/2. En los días 7, 10 y 14, se administró control de vehículo o mAb 28F3.IgG1 a 10 mg/kg.
Se administraron a los ratones las dosis por vía intraperitoneal (IP) a las concentraciones y en las fechas resumidas en la tabla 9.
Tabla 9.
Grupos Días después del
implante
Isotipo de IgG1,
10 m /k 7, 10 y 14
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Los tumores y los pesos corporales se midieron dos veces a la semana hasta la terminación del estudio. Los tumores se midieron en 3 dimensiones con un calibre digital electrónico Fowler (Modelo 62379-531; Fred V. Fowler Co., Newton, MA), y los datos se registraron electrónicamente usando el programa informático StudyDirector de Studylog Systems, Inc. (South San Francisco, CA).
En este estudio de tumores, la cohorte 1 se terminó en el día 52 después del implante. Se usó Microsoft Excel para calcular la media, la desviación típica (DT) y los valores de la mediana de los volúmenes tumorales y los pesos corporales. Se calcularon la media y la mediana de los valores cuando un 100 % y al menos un 60 % de los animales del estudio permanecieron en cada grupo de tratamiento, respectivamente. Los tumores de los ratones en la cohorte 2 se recogieron en el día 15.
Los resultados indican que, en el día 22 después de la implantación de tumores, el último día en el estudio en el que todos los ratones estaban vivos, la dosis de 10 mg/kg de 28F3.IgG1 mostró una inhibición media de tumores del 67 % (TGI) en los xenoinjertos de MC38, en comparación con el anticuerpo de control de isotipo. La TGI de tumores se resume por grupo de tratamiento en la tabla 10. Las curvas de crecimiento tumoral por grupo de tratamiento se muestran en las figuras 62A-62C. Las curvas de la media y la mediana de crecimiento tumoral por grupo de tratamiento se presentan en las figuras 63A-63B. No se evidenció toxicidad en cualquier grupo de tratamiento, ya que los cambios en la media y la mediana de los pesos corporales fue menor del 20 %. Los pesos corporales de ratones y los porcentajes de cambio con el paso del tiempo se muestran en las figuras 64A-64B.
Tabla 10.
Día 22 Día 25
Volumen tumoral medio
po de trat ento TGI (%) Mediana del volumen tumoral Gru ami TGI(%)(mm3) (mm3)
Isotipo de IgG1,
10 mg/kg 1342 N/A 1790 N/A 28F3.IgG1, 10 mg/kg 447 67 380 79 28F3.IgG1.1f, 10 mg/kg 1049 22 1064 41
Los resultados muestran que 28F3.IgG1 tuvo un 67 % de TGI, mientras que 28F3.IgG1.1f tuvo un 22 % de TGI en el día 22 después del implante, lo que indica que ambos anticuerpos redujeron el crecimiento tumoral en el modelo de tumor MC38. Además, los resultados sugieren que la unión de Fc por 28F3.IgG1 mejora la potencia antitumoral en el modelo de tumor MC38.
Para investigar el efecto que tiene 28F3.IgG1 en poblaciones de linfocitos T, se recogieron tejidos de 5 ratones en cada grupo de tratamiento en el día 15 después del implante. Los bazos y tumores se procesaron en un dispositivo gentleMACS Octo Dissociator™ (Miltenyi, San Diego, CA). Se tiñeron suspensiones de células individuales para marcadores de linfocitos T usando citometría de flujo (FACS). La fluorescencia de anticuerpos se detectó mediante citometría de flujo en el dispositivo Fortessa (BD Biosciences, San Jose, CA) y los resultados se analizaron con el programa informático, Flowjo (Flowjo, LLC, Ashland, OR).
Los resultados, que se muestran en las figuras 65 y 66, muestran un porcentaje reducido de células Treg, que es coherente con la eliminación en los ratones tratados con 28F3.IgG1 en relación con el control de isotipo (figura 65). Por el contrario, hubo un aumento en el porcentaje de linfocitos T CD8+ en el grupo de 28F3.IgG1 (figura 66).
Por tanto, la inmunomonitorización en ratones tratados con 28F3.IgG1 en comparación con el control de isotipo sugiere que la TGI puede estar mediada por la eliminación de Treg y un aumento en los linfocitos T CD8+.
Ejemplo 24: La reticulación de 28F3.IgG1 aumenta su potencia
Este ejemplo demuestra que la reticulación de 28F3.IgG1 aumenta su potencia para mejorar la secreción de IFN-y de linfocitos T y promover la proliferación de linfocitos T.
Se cocultivaron linfocitos T con células CHO-OKT3 o CHO-OKT3-CD32ahigh en presencia de diversas concentraciones de anticuerpos anti-GITR o reactivos de control y se midieron los niveles de secreción de interferón-Y (IFN-y) y de proliferación celular. La línea celular CHO-OKT3-CD32high tiene un nivel muy elevado de receptor de Fc CD32a y una expresión ligeramente mayor de OKT3 que su clon CHO-OKT3 precursor.
El ensayo se llevó a cabo como se expone a continuación. Se obtuvieron linfocitos T respondedores de PBMC humanas aisladas de un gradiente de Ficoll (Amersham Bioscience 17-1440-03) con un kit para aislamiento de linfocitos T CD4 (Life technologies, Cat. 113.31D) y microperlas de CD25 (Miltenyi, Cat. 130-092-983) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sometió a células c Ho que expresan anti-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3) o células CHO que expresan anti-CD3scFv y CD32a lavadas dos veces con medio RPMI a irradiación con una dosis de 50K Rad. Se recogieron las células y se resuspendieron en medio de cultivo (RPMI-1640 complementado con suero fetal bovino al 10 %, L-glutamina 2 mM, p-mercaptoetanol 55 nM, piruvato de sodio 1 mM y 100u/ml de penicilina/estreptomicina) a 2,5x105/ml. Se sembraron 2,5x104 células CHO y 1x105 linfocitos T por pocillo en una placa de fondo plano de grado TC de 96 pocillos (Costar). Las células se incubaron con una titulación de 8 puntos de factor 4 de anticuerpo GITR comenzando a 20 |jg/ml. Se añadió una hIgG1 no relacionada a 20 |jg/ml como el control de isotipo. Se incluyó una muestra con solo células para mostrar la actividad basal sin tratamiento alguno. Se recogió sobrenadante de cada muestra en el día 3 para la medición de IFN-y (Kit de ELISA para IFN-g humano BD optEIA; BD Biosciences, n.° 555142). La proliferación celular se evaluó mediante la incorporación de 3H-timidina durante las últimas 8 horas de incubación. Los resultados, que se muestran en las figuras 67 y 68, indican que, en presencia de 28F3.IgG1, se secreta más IFN-y de los linfocitos T que se cocultivaron con CHO-OKT3-CD32a high en relación con aquellos que se cocultivaron con células CHO-OKT3 (figura 67). Como cabía esperar, no se observó una diferencia significativa con el 28F3 sin función efectora. El anticuerpo IgG1.1f, que no se une a CD32a. Además, en presencia de 28F3.IgG1, se observó más proliferación de linfocitos T en los linfocitos T que se cocultivaron con CHO-OKT3-CD32a high en relación con aquellos que se cocultivaron con células CHO-OKT3; este efecto no se observó con el anticuerpo 28F3.IgG1.1f sin función efectora (figura 68). Por tanto, la reticulación de 28F3.IgG1 aumenta su potencia para mejorar la secreción de IFN-y de linfocitos T y promover la proliferación de linfocitos T. Este efecto potenciador también se observó en la proliferación de linfocitos T con células CHO-OKT3 que expresan menores niveles de CD32a. GITR.6 g1.1f muestra mayores niveles de IFN-y cuando está reticulado en comparación con cuando es soluble. Esto probablemente refleja un nivel ligeramente mayor de OKT3 expresado en células CHO-OKT3-CD32a high en relación con células CHO-OKT3. Este aumento observado con GITR.6 glf reticulado es mayor que el observado con el isotipo inerte, lo que sugiere un beneficio positivo para la reticulación. La versión G1f promueve altos niveles de IFN-y incluso a dosis bajas, demostrando los anticuerpos solubles poco agonismo frente al fondo, sugiriendo nuevamente un papel positivo para la reticulación.
Por tanto, los anticuerpos tanto 28F3.IgG1 como 28F3.IgG1 sin función efectora estimulan la producción de IFN-y y estimulan la proliferación de linfocitos T, sin embargo, la reticulación de 28F3.IgG1 aumenta adicionalmente su potencia para mejorar la secreción de IFN-y de linfocitos T y promover la proliferación de linfocitos T.
TABLA 11: SUMARIO DEL LISTADO DE SECUENCIAS
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La tabla 11 proporciona las secuencias de las regiones variables maduras y las cadenas pesadas y ligeras y en los casos donde se indican, las secuencias con péptidos de señal.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal aislado, que se une al receptor de TNF inducible por glucocorticoides humano (GITR), que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en donde cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 13 y cada una de las cadenas ligeras comprende una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 14.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde cada una de las cadenas pesadas consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el SEQ ID NO: 15 y cada una de las cadenas ligeras consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en el Se Q ID NO: 16.
3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende enlaces disulfuro intermoleculares entre las dos regiones constantes de cadena pesada.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde cada una de las cadenas pesadas y cadenas ligeras consiste en las secuencias de aminoácidos expuestas en los SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente.
5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo comprende enlaces disulfuro intermoleculares entre las dos regiones constantes de cadena pesada.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde cada una de las cadenas pesadas y cadenas ligeras consiste en las secuencias de aminoácidos expuestas en los SEQ ID NO: 18 y 19, respectivamente.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende enlaces disulfuro intermoleculares entre las dos regiones constantes de cadena pesada.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2 o IgG4.
9. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y un vehículo.
10. La composición de la reivindicación 9, que además comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales.
11. La composición de la reivindicación 10, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-LAG-3, un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-L1 y combinaciones de los mismos.
12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para su uso en un método para tratar el cáncer.
13. El anticuerpo para su uso en el método de la reivindicación 12, que además comprende administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales.
14. El anticuerpo para su uso en el método de la reivindicación 13, en donde el agente terapéutico adicional es un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-LAG-3, un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-PD-L1.
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