ES2807182T3 - Anticuerpos frente a CD73 y sus usos - Google Patents

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ES2807182T3 ES15816276T ES15816276T ES2807182T3 ES 2807182 T3 ES2807182 T3 ES 2807182T3 ES 15816276 T ES15816276 T ES 15816276T ES 15816276 T ES15816276 T ES 15816276T ES 2807182 T3 ES2807182 T3 ES 2807182T3
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Alan J Korman
Bryan C Barnhart
Aaron P Yamniuk
Mohan Srinivasan
Karla A Henning
Ming Lei
Emanuela Sega
Angela Goodenough
Maria N Jure-Kunkel
Guodong Chen
John Sack
Richard Huang
Martin J Corbett
Joseph E Myers
Liang Schweizer
Sandra V Hatcher
Haichun Huang
Pingping Zhang
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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a Grupo de Diferenciación 73 (CD73) humano y que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que comprenden las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, en donde el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos frente a CD73 y sus usos
Antecedentes
El grupo de Diferenciación 73 (CD73), también denominado ecto-5'-nucleotidasa (ecto-5'NT, EC 3.1.3.5), es una enzima de superficie ligada a glicosilfosfatidilinositol (GPI) encontrada en la mayoría de los tejidos, pero particularmente expresada en células endoteliales y subconjuntos de células hematopoyéticas (Resta et al., Immunol. Rev. 1998;161:95-109 y Colgan et al., Prinergic Signal 2006;2:351-60). Se sabe que CD73 cataliza la desfosforilación de nucleósido monofosfatos extracelulares en nucleósidos, tales como la adenosina. La adenosina es una molécula de señalización muy estudiada que media sus efectos biológicos a través de varios receptores, incluyendo A1, A2A, A2B y A3. Se ha demostrado que la adenosina regula la proliferación y la migración de muchos cánceres y que tiene un efecto inmunosupresor a través de la regulación de linfocitos T antitumorales (Zhang et al., Cáncer Res 2010;70:6.407-11).
Se ha publicado que CD73 se expresa sobre muchos cánceres diferentes, incluyendo cánceres de colon, pulmón, páncreas, ovario, vejiga, leucemia, glioma, glioblastoma, melanoma, tiroides, esofágico, de próstata y mama (Jin et al., Cáncer Res 2010;70:2.245-55 y Stagg et al., PNAS 2010;107:1.547-52). Además, la expresión de CD73 en cáncer se ha ligado a la proliferación incrementada, la migración, la neovascularización, invasividad, metástasis y menor supervivencia del paciente. También se ha propuesto la actividad de CD73 como un marcador de pronóstico en carcinomas tiroideos papilar. Aunque que se ha demostrado que CD73 regula las interacciones célula-célula y célula-matriz sobre las células tumorales, la expresión y la actividad de CD73 también se han ligado a respuestas de linfocito T reducidas y se han implicado en la resistencia a fármaco (Spychala et al., Pharmacol Ther. 3000;87:161-73). Por tanto, CD73 puede regular la progresión del cáncer tanto directamente como indirectamente, lo cual resalta su potencial como diana nueva diana terapéutica. Se describe un anticuerpo monoclonal anti-CD73 humana para inhibir la formación de metástasis en cáncer de mama humano induciendo el agrupamiento y la internalización de CD73 expresada sobre la superficie de células cancerosas (Terp et al., J. Immunol 2013;191(8):4.165-4.173). Se describe otro anticuerpo humano anti CD73 humana obtenido de una genoteca de expresión en fago scFv para unirse e internalizarse en células de cáncer de mama, para inhibir la actividad enzimática de CD73, y para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto (Rus et al., Mol Cáncer, Biomed Central 2013; 12(1): 11).
Dada la necesidad en curso de estrategias mejoradas para dirigir enfermedades tales como el cáncer, son altamente deseables métodos de regulación de la progresión tumoral a través de mecanismos múltiples, así como métodos para la regulación de la actividad de CD73 y agentes terapéuticos relacionados.
Sumario
En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, tales como anticuerpos monoclonales (porciones de unión a antígeno de los mismos), en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a CD73 y que tienen propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen unión de alta afinidad a CD73 humana, unión a c D73 de mono (por ejemplo, CD73 de cynomolgus), y la capacidad para inhibir la actividad enzimática de CD73. Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para inhibir el crecimiento tumoral, reducir la producción de adenosina, estimular una respuesta inmunitaria, y detectar la proteína CD73 en una muestra.
Los anticuerpos anti-CD73 de la invención están definidos en las reivindicaciones 1-11.
La presente invención se refiere a anticuerpos aislados que se unen al Grupo de Diferenciación 73 humano (CD73) y comprenden las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que comprenden las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, en los que el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención se unen dentro de las regiones FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) y/o LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97) de CD73 humana, por ejemplo, en los que los tramos de epítopo o superposiciones con FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) y/o LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97) de CD73 humana.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención se unen a un epítopo sobre CD73 humana (SEQ ID NO: 1) que incluye todos o una parte de los restos de aminoácidos FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) y/o LYlPy KVLpVg DEVVG (SeQ ID NO: 97). En determinadas realizaciones, el epítopo unido por los anticuerpos anti-CD73 de la invención se determina mediante, por ejemplo, HDX-MS y/o cristalografía.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención comprenden las tres CDR de la cadena pesada variables y las tres CDR de la cadena ligera variables que están en los pares de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable de los anticuerpos anti-CD73 representados por las SEQ ID NO: 4 y 12; o las SEQ ID NO: 135 y 12.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la divulgación comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos un 80 % idénticas, por ejemplo, al menos un 85 % idénticas, al menos un 90 % idénticas, al menos un 95 % idénticas, al menos un 96 % idénticas, al menos un 97 % idénticas, al menos un 98 % idénticas, o al menos un 99 % idénticas o más a las secuencias de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento, por ejemplo, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 4, 135, 171 y una región variable de la cadena ligera de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento, por ejemplo, que comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la divulgación comprenden las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que son al menos un 80 % idénticas, por ejemplo, al menos un 85 % idénticas, al menos un 90 % idénticas, al menos un 95 % idénticas, al menos un 96 % idénticas, al menos un 97 % idénticas, al menos un 98 % idénticas, o al menos 99 % idénticas o más (por ejemplo, 100 %), a las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 135 y 12; SEQ ID NO: 4 y 12; o las SEQ ID NO: 171 y 12.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención comprenden las regiones variables de la cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 135 y 12; SEQ ID NO: 4 y 12; o las SEQ ID NO: 171 y 12.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 135 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la divulgación tienen secuencias de longitud completa de la cadena pesada y la cadena ligera al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de cualquier anticuerpo anti-CD73 descritos en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 100 y 102; SEQ ID NO: 133 o 189 (sin lisina C-terminal) y 102; SEQ ID NO: 189 y 102; o una cualquiera de las SEQ ID No : 188 y 102.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo de la invención comprende una región de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 133 o 189 y una región de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 102.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la divulgación son los anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o variantes de los mismos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la divulgación se unen al mismo epítopo sobre CD73 que los anticuerpos que tienen las anteriores secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y ligera (por ejemplo, anticuerpos CD73.4-2 y/o 11F11-2).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la divulgación comprenden una región constante de la cadena pesada que incluye, por ejemplo, un dominio CH1 humano, un dominio bisagra humano, un dominio CH2 humano, y un dominio CH3 humano en orden desde el extremo N al C, en los que al menos 2 dominios son de un isotipo diferente (por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una región constante modificada comprende una bisagra de IgG2 humana y al menos uno de los dominios CH2 y CH3 no es de un isotipo IgG2. En determinadas realizaciones, CH1 es un dominio CH1 de IgG2 humana, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 124). La región constante modificada puede incluir un dominio bisagra de IgG2 humana, por ejemplo, un dominio bisagra de IgG2 humana que reduce la heterogeneidad en la unión a cisteína, por ejemplo, un dominio bisagra de IgG2 humana que tiene una sustitución de aminoácidos en C219, por ejemplo, C219S, relativa a un domino bisagra de IgG2 humana tipo silvestre (SEQ NO 136), por ejemplo, un dominio bisagra de IgG2 humana que tiene la secuencias de aminoácidos ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 123). La región constante modificada puede incluir un dominio CH2 de IgG1 humana que reduce o elimina las funciones efectoras, por ejemplo, un dominio CH2 de IgG1 humana que tiene las sustituciones de aminoácidos A330S y P331S, relativas a un dominio CH2 de IgG1 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 137), por ejemplo, un dominio CH2 de IgG1 humana comprende la secuencia de aminoácidos
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK (SEQ ID NO: 125).
La región constante modificada puede incluir un dominio CH3 de IgG1 humana tipo silvestre, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:
128).
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 de la invención comprende una región de la cadena pesada modificada que comprende una bisagra de IgG2 y el dominio CH1 de IgG2, con la condición de que el anticuerpo no sea un anticuerpo IgG2, por ejemplo, el anticuerpo no comprende una región constante de la cadena pesada de IgG2 tipo silvestre.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención comprenden una cualquiera de las regiones constantes que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 130, 164, 165, 168 y 169, 268, 273, 315, 329, y 332-338.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 de la invención comprende los dominios VH y VL de 11F11 o CD73.4, y una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2. La región constante de la cadena pesada puede ser IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO: 169) o IgG2CS-IgGlf (SEQ ID NO: 165), en la que "CS" se refiere a "C219S".
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención presentan al menos una de las siguientes propiedades:
(a) inhibición de la actividad enzimática de CD73;
(b) unión a CD73 de cynomolgus;
(c) internalización de CD73 mediada por anticuerpo dentro de las células, por ejemplo, células tumorales; y (d) unión a un epítopo conformacional que comprende los aminoácidos 65-83 y 157-172 de CD73 humana. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 de la invención se unen a CD73 humana (CD73 monomérica y/o dimérica) con un Kd de aproximadamente 10 nM a 0,1 nM o menos como se mide, por ejemplo, mediante análisis SPR BIACORE®, y se internaliza dentro de las células tumorales con un T1/2 de no más de 10 min medido, por ejemplo, por caza de pulso y como se describe en los Ejemplos.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD73 de la invención es un anticuerpo humano y presenta una o más de las siguientes propiedades:
(a) se une a CD73 humano con una Kd de 10 nM o menos determinada por Resonancia de Plasmón Superficial (SPR);
(b) inhibe la actividad enzimática de CD73;
(c) internaliza CD73 por internalización de CD73 mediada por anticuerpo dentro de células, por ejemplo, células tumorales; y
(d) se une a CD73 humana con una CE50 de 0,1 a 10 nM o menos como se mide por FACS.
En el presente documento se proporcionan moléculas bioespecíficas que comprenden los anticuerpos anti-CD73 de la invención unidos a una molécula que tiene una segunda especificidad de unión, así como inmunoconjugados que comprenden los anticuerpos anti-CD73 de la invención unidos a un agente.
También se proporcionan las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-CD73 de la invención, así como los vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos, y las células transformadas con los vectores de expresión.
También se proporcionan las composiciones y los kits que comprenden los anticuerpos anti-CD73 de la invención. Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales. En una realización, el agente terapéutico adicional es un anticuerpo antagonista de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), un anticuerpo antagonista del ligando 1 de muerte programada (PD-L1), un anticuerpo antagonista de la proteína 4 asociada a linfocito T citotóxica (CTLA-4), o un anticuerpo antagonista del gen-3 de activación de linfocito (LAG-3).
En el presente documento se proporciona un método de preparación de los anticuerpos anti-CD73 de la invención, que comprende expresar un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento en una célula y aislar el anticuerpo de la célula.
En el presente documento también se proporcionan métodos de uso de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento, por ejemplo, métodos de descenso de los niveles de adenosina, por ejemplo, en o por un tumor, por ejemplo, una célula tumoral, que expresa CD73, métodos de estimulación de una respuesta de linfocito T específica a antígeno, métodos de estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, métodos de inhibición del crecimiento de las células tumorales en un sujeto, métodos de tratamiento del cáncer, por ejemplo, por inmunoterapia. En determinadas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino/cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de célula germinal, cáncer de huesos, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasias del sistema nervioso central, linfoma, leucemia, mieloma, sarcoma o cáncer relacionado con virus. El cáncer puede ser un cáncer metastásico, cáncer refractario, o cáncer recurrente.
En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden además administrar una o más sustancias terapéuticas, por ejemplo, una sustancia terapéutica que estimula el sistema inmune, por ejemplo, un antagonista de PD-1, un antagonista de CTLA-4, un antagonista de LAG-3, un antagonista de GITR, y/o un anticuerpo anti-CD39, un anticuerpo anti-A2AR, o un inhibidor químico de A2AR.
Otras características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de los ejemplos, que no se deberían considerar limitantes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 237) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 135) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano CD73.4-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (Se Q ID NO: 6) y CDR3 (SEQ ID NO: 7) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 140) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de la cadena ligera (VK1) del anticuerpo monoclonal humano CD73.4-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) y CDR3 (SEQ ID NO: 11) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 237) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 135) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano CD73.4-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (Se Q ID NO: 6) y CDR3 (SEQ ID NO: 7) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 141) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano CD73.4-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 14) y c Dr 3 (SEQ ID NO: 15) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 139) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11F11-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) y CDR3 (SEQ ID NO: 7) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 140) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 11F11-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 9), CDR2 (SEQ ID NO: 10) y CDR3 (SEQ ID NO: 11) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 139) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11F11-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQ ID NO: 6) y CDR3 (SEQ ID NO: 7) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 141) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 11F11-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 14) y CDR3 (SEQ ID NO: 15) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 142) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4C3-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (Se Q ID NO: 18) y CDR3 (SEQ ID NO: 19) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 143) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4C3-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 22) y CDR3 (SEQ ID NO: 23) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 142) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4C3-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (Se Q ID NO: 18) y CDR3 (SEQ ID NO: 19) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 144) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4C3-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 26) y CDR3 (SEQ ID NO: 27) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 142) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4C3-3. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SeQ ID NO: 18) y CDR3 (SEQ ID NO: 19) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 145) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4C3-3. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO: 30) y CDR3 (SEQ ID NO: 31) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 8A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 146) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4D4-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 33), CDR2 (SEQ ID NO: 34) y CDR3 (SEQ ID NO: 35) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 147) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 36) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4D4-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 38) y CDR3 (SEQ ID NO: 39) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 9A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 148) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 10D2-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 42) y CDR3 (SEQ ID NO: 43) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 9B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 149) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 44) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 10D2-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 45), CDR2 (SEQ ID NO: 46) y Cd R3 (SEQ ID NO: 47) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 10A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 148) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 40) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 10D2-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 42) y CDR3 (SEQ ID NO: 43) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 10B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 150) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 10D2-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 49), CDR2 (SEQ ID NO: 50) y Cd R3 (SEQ ID NO: 51) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 11A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 151) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 11A6-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 53), CDR2 (SEQ ID NO: 54) y CDR3 (SEQ ID NO: 55) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 11B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 152) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 56) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 11A6-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 57), CDR2 (SEQ ID NO: 58) y Cd R3 (SEQ ID NO: 59) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 12A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 153) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 60) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 24H2-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 61), CDR2 (SEQ ID NO: 62) y CDR3 (SEQ ID NO: 63) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 12B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 154) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 64) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 24H2-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 65), CDR2 (SEQ ID NO: 66) y Cd R3 (SEQ ID NO: 67) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 13A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 155) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 68) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5F8-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SeQ ID NO: 70) y CDR3 (SEQ ID NO: 71) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 13B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 156) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 72) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5F8-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 73), CDR2 (SEQ ID NO: 74) y CDR3 (SEQ ID NO: 75) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 14A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 155) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 68) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5F8-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SeQ ID NO: 70) y CDR3 (SEQ ID NO: 71) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 14B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 157) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 76) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5F8-2. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 77), CDR2 (SEQ ID NO: 78) y CDR3 (SEQ ID NO: 79) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 15A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 155) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 68) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5F8-3. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 69), CDR2 (SEQ ID NO: 70) y CDR3 (SEQ ID NO: 71) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 15B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 242) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 238) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5F8-3. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 239), CDR2 (SEQ ID NO: 240) y CDR3 (SEQ ID NO: 241) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 16A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 158) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 80) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 6E11-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 81), CDR2 (SEQ ID NO: 82) y CDR3 (SEQ ID NO: 83) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 16B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 159) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 84) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 6E11-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 85), CDR2 (SEQ ID NO: 86) y Cd R3 (SEQ ID NO: 87) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 17A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 160) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 88) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7A11-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 89), CDR2 (SEQ ID NO: 90) y CDR3 (SEQ ID NO: 91) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 17B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 161) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 92) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7A11-1. Se definen las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 93), CDR2 (SEQ ID NO: 94) y Cd R3 (SEQ ID NO: 95) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J.
La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 189) de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD73 CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, y su región variable, CDR 1, 2 y 3, dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3.
La Figura 19 muestra los datos del sensorgrama SPR para la unión de humana-CD73-his 600, 200, 66,7, 22,2, 7,4, y 2,5 nM (líneas anchas) o cyno-CD73-his (líneas finas) a CD73.4-IgG2-C219S-IgG1.1f capturado sobre una superficie de proteína A inmovilizada a 25 °C.
Las Figuras 20A1 y 20A2 muestran la unión de los anticuerpos 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas a células Calu6 CD73 positivas humanas (línea celular del adenocarcinoma pulmonar humano).f
Las Figuras 20B1 y 20B2 muestran la unión de los anticuerpos 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas a células DMS114 CD73 negativas humanas (línea celular del carcinoma de pulmón de célula pequeña).
Las Figuras 20C1 y 20C2 muestran la unión de los anticuerpos 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas a células CHO CD73 cyno positivas.
Las Figuras 20D1 y 20D2 muestran la unión de los anticuerpos 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas a células CHO-K1 CD73 positivas cyno.
La Figura 20E muestra la unión de los anticuerpos indicados a los linfocitos T de los donantes D1 y D2.
La Figura 20F muestra la unión de los anticuerpos indicados a los linfocitos T de los donantes D1 y D2.
Las Figuras 21A1 y 21A2.muestran la inhibición de la actividad enzimática de CD73 humana unida a perla por los anticuerpos anti-CD73 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas. Todos los anticuerpos inhibieron la actividad enzimática de CD73 humana.
Las Figuras 21B1 y 21B2.muestran la inhibición de la actividad enzimática de CD73 cyno unida a perla por los anticuerpos anti-CD73
11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas. Todos los anticuerpos inhibieron la actividad enzimática de CD73 cyno.
Las Figuras 22A1 y 22A2 muestran la inhibición enzimática de CD73 en células Calu6 CD73 positivas por los anticuerpos 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas. Todos los anticuerpos inhibieron la actividad enzimática de CD73 en estas células.
Las Figuras 22B1 y 22B2 muestran la inhibición enzimática de CD73 en células DMS-114 CD73 negativo por los anticuerpos 11F11, CD73.4 y CD73.10 con las regiones constantes de la cadena pesada indicadas.
La Figura 22C muestra los valores CE50 e Ymáx de la inhibición de la actividad de CD73 endógena por los fragmentos F(ab')2 de 11F11 y 11F11, como se determina en el ensayo de cAMP usando células Calu-6 y HEK/A2R. La Figura 22C también muestra los valores de CE50 e Ymáx de 11F11 y fragmentos F(ab')2 de 11F11 en un ensayo de internalización de Calu-6. La Figura muestra que un fragmento Fab de 11F11 está inactivo en estos dos ensayos.
La Figura 22D muestra el trascurso temporal de la producción de adenosina a partir de células Calu6 con el anticuerpo 11F11 o 4C3, como se mide mediante LC/MS/MS, indicando que la inhibición enzimática de CD73 por el anticuerpo 11F11 ocurre más rápidamente que por el anticuerpo 4C3.
La Figura 23A muestra las cinéticas de la internalización de CD73 mediada por anticuerpo por los siguientes anticuerpos: anticuerpos 11F11, 4C3, 6D11, CD73.3-IgGl.lf con la cadena ligera 4c3vkl ("3-Vh-hHC-IgG1.1f/4C3Vk1"), CD73.4-IgG2CS con la cadena ligera Vk2 de 11F11 ("4-Vh-hHC-IgG2-C219S/11F11-Vk2"), CD73.10-IgG2CS ("CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S"), CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f ("CD73.10-Vh-hHC-IgG2-C219S-IgG1.1f"), y CD73.10-IgG1.1f ("CD73.10-Vh-hHC-IgG1.1f') en células H2228. Los anticuerpos 11F11 (el cual es de un isotipo IgG2), CD73.4-IgG2CS, CD73.10-IgG2CS y CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f se internalizan más rápidamente y a un mayor grado que los otros anticuerpos ensayados, los cuales son de un isotipo IgG1.
La Figura 23B muestra las cinéticas de la intemalización de CD73 mediada por anticuerpo de los mismos anticuerpos que los mostrados en la Figura 23A en células HCC15 (línea celular del carcinoma de células no pequeñas de pulmón), mostrando resultados similares a los obtenidos en las células H2228 (línea celular del carcinoma de células no pequeñas de pulmón).
La Figura 23C muestra las cinéticas de la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los mismos anticuerpos que los mostrados en las Figuras 23A y 23B, así como CD73.11-IgG2CS ("11-Vh-hVC-IgG2-C219S"), en células Calu6, mostrando resultados similares a los obtenidos en las células H2228 y HCC15.
La Figura 23D muestra las cinéticas de la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los mismos anticuerpos que los mostrados en la Figura 23C en células NCI-2030 (línea celular del carcinoma de células no pequeñas de pulmón), mostrando resultados similares a los obtenidos en células H2228, HCC15 y Calu6.
La Figura 23E muestra las cinéticas de la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células Calu6, como se mide mediante citometría de flujo.
La Figura 23F muestra las cinéticas de la internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células NCI-H292 (línea celular del carcinoma pulmonar mucoepidermoide), como se mide mediante citometría de flujo, pero en la que los anticuerpos no se lavaron después de la primera incubación de las células con los anticuerpos.
La Figura 23G muestra el porcentaje de CD73 internalizada en células Calu6 tratadas con los anticuerpos indicados, mostrando internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células Calu6 con el paso del tiempo.
La Figura 23H muestra el porcentaje de CD73 internalizada en células NCI-H292 tratadas con los anticuerpos indicados con el paso del tiempo, mostrando internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células NCI-H292 con el paso del tiempo.
La Figura 23I muestra el porcentaje de CD73 internalizada en células SNU-C1 (línea celular del carcinoma de colón) tratadas con los anticuerpos indicados con el paso del tiempo, mostrando internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células SNU-C1 con el paso del tiempo.
La Figura 23J muestra el porcentaje de CD73 internalizada en células NCI-H1437 (línea celular del carcinoma de pulmón) de células no pequeñas tratadas con los anticuerpos indicados con el paso del tiempo, mostrando internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células NCI-H1437 con el paso del tiempo.
La Figura 23K muestra el porcentaje de CD73 internalizada en células Calu6 tratadas con los anticuerpos indicados con el paso del tiempo, mostrando internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células Calu6 con el paso del tiempo.
La Figura 23L muestra el porcentaje de CD73 internalizada en células NCI-H292 tratadas con los anticuerpos indicados con el paso del tiempo, mostrando internalización de CD73 mediada por anticuerpo de los anticuerpos indicados en células Calu6 con el paso del tiempo.
La Figura 23M muestra el nivel de CD73 sobre la superficie de células Calu6 tratadas con 5 pg/ml de los anticuerpos indicados durante 0, 5, 15 o 30 minutos.
La Figura 24A muestra secciones de tumor de xenoinjerto de animales recogidas 4 días después del tratamiento de los animales con un anticuerpo control y teñidas para la actividad enzimática de CD73. Las secciones muestran un color marrón denso, indicando actividad enzimática de CD73.
La Figura 24B muestra secciones de tumor de xenoinjerto de animales recogidas 1 día después del tratamiento de los animales con el anticuerpo 11F11 y teñidas para la actividad enzimática de CD73. Las secciones muestran significativamente menos color marrón en relación con las secciones de tumor control mostradas en la Figura 24A, indicando inhibición in vivo de la actividad enzimática de CD73 por CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f tan pronto como 1 día después del comienzo del tratamiento.
La Figura 24C muestra secciones de tumor de xenoinjerto de animales recogidas 2 días después del tratamiento de los animales con CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f y teñidas para la actividad enzimática de CD73. Las secciones muestran significativamente menos color marrón en relación con las secciones de tumor control mostradas en la Figura 24A y en relación con las secciones de tumor después de 1 día de tratamiento de los animales con CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f, indicando inhibición in vivo de la actividad enzimática de CD73 por CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f al menos 2 días después del comienzo del tratamiento.
La Figura 24D muestra secciones de tumor de xenoinjerto de animales recogidas 3 días después del tratamiento de los animales con CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f y teñidas para la actividad enzimática de CD73. Las secciones muestran significativamente menos color marrón en relación con las secciones de tumor control mostradas en la Figura 24A, indicando inhibición in vivo de la actividad enzimática de CD73 por CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f al menos 3 días después del comienzo del tratamiento.
La Figura 24E muestra secciones de tumor de xenoinjerto de animales recogidas 7 días después del tratamiento de los animales con CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f y teñidas para la actividad enzimática de CD73. Las secciones muestran significativamente menos color marrón en relación con las secciones de tumor control mostradas en la Figura 24A, indicando inhibición in vivo de la actividad enzimática de CD73 por CD73.10-IgG2CS-IgG1.1f al menos 7 días después del comienzo del tratamiento.
La Figura 24F muestra un trascurso temporal de la actividad enzimática de CD73 humana en tumores SNUC1 en ratones xenoinjerto tratados con un anticuerpo control (no CD73) o con 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, mostrando que el anticuerpo anti-CD73 reduce eficazmente la actividad enzimática de CD73 en los tumores del ratón xenoinjerto.
La Figura 25A muestra niveles de la actividad enzimática de CD73 de ratón en las secciones de tumor control de ratones Balb/c portadores de tumores 4T1 singeneicos y mIgG control.
La Figura 25B muestra secciones tumor (4T1 días 1-7) de ratones Balb/c portadores de tumores 4T1 singenéicos subcutáneamente tratados con anticuerpo anti-CD73 de ratón TY23, mostrando que TY23 inhibe la inhibición enzimática de CD73 in vivo.
La Figura 26A muestra el nivel de bloqueo cruzado de 4C3 por los anticuerpos anti-CD734C3, 7A11, 6E11, 5F8, 4C3, 11F11 y 11A6 determinado mediante citometría de flujo.
La Figura 26B muestra el nivel de bloqueo cruzado de 11F11 por los anticuerpos anti-CD734C3, 7A11, 6E11, 5F8, 4C3, 11F11 y 11A6 determinado mediante citometría de flujo.
La Figura 27A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 283) de CD73 humana y las regiones de interacción con CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f, las cuales están representadas en un gris más oscuro. A mayor interacción, más oscuro es el gris.
La Figura 27B muestra un modelo de la interacción entre una proteína CD73 humana dimérica y CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f.
La Figura 28A muestra un modelo cristalográfico de la interacción entre CD73 humana y el fragmento 11F11Fab'. La Figura 28B muestra un modelo de una estructura compuesta de dos complejos de CD73 humana con 11F11. La Figura 28C muestra un modelo de la interacción entre CD73 humana y el fragmento 11F11.
La Figura 28D muestra un modelo de la interacción entre 11F11 y CD73 humana.
La Figura 29A muestra los datos de SEC-MALS para complejos humanos de CD73 y anticuerpo. "CD73.4-hybrid" se refiere a CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f.
La Figura 29B muestra los datos de DLS para complejos humanos de CD73 y anticuerpo.
La Figura 30A muestra los datos del cromatograma SEC para los complejos de hCD73-his con el anticuerpo CD73.4 que contiene diferentes regiones constantes, mostrando el efecto de una bisagra de IgG2 y el dominio CH1 en el tamaño de los complejos anticuerpo/antígeno.
La Figura 30B muestra los datos de DLS para los complejos de hCD73-his con el anticuerpo CD73.4 que contiene diferentes regiones constantes, mostrando el efecto de una bisagra de IgG2 y el dominio CH1 en el tamaño de los complejos anticuerpo/antígeno.
La Figura 30C muestra los datos de MALS para los complejos de hCD73-his con el anticuerpo CD73.4 que contiene diferentes regiones constantes, mostrando el efecto de una bisagra de IgG2 y el dominio CH1 en el tamaño de los complejos anticuerpo/antígeno.
La Figura 30D muestra un modelo esquemático de los complejos hCD73-his/mAb derivados de las masas determinadas por MALS en la Figura 30C.
La Figura 30E muestra que complejos de mayor orden están afectados por la región CH1. Los histogramas muestran el % área bajo los picos 1 y 2, mostrados en la gráfica, para cada construcción.
La Figura 31 muestra el porcentaje de internalización de CD73 mediada por anticuerpo a 1, 4 o 21 horas después de la adición de cada uno de los anticuerpos mostrados. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden de 21 horas (a la izquierda), 4 horas (en el medio) y 1 hora (derecha).
La Figura 32A muestra una superposición de los datos del cromatograma SEC para los complejos 1:1 molar de hCD73-his con 16 anticuerpos CD73.4 diferentes que contienen diferentes secuencias de región constante.
La Figura 32B muestra una expansión de los datos del cromatograma desde 11 -19,5 min del cromatograma de la Figura 32A, con 4 especies de dilución distintas indicadas.
La Figura 32C muestra el porcentaje del área de la señal del cromatograma por UV para el pico 2 de la Figura 32B, trazado para los 16 complejos anticuerpo/CD73-his diferentes. Los datos están ordenados desde la izquierda a la derecha en orden de incremento del área del pico.
La Figura 33 muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcYR-his capturadas por anti-his Fab. Las respuestas de la unión están trazadas en la gráfica como un porcentaje de la Rmáx teórica asumiendo una estequiometría de unión mAb:FcYR 1:1. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en la parte de abajo de la diapositiva.
La Figura 34 muestra la unión del anticuerpo a proteínas FcgR-his capturadas por anti-his Fab. Las respuestas de la unión están trazadas en la gráfica como un porcentaje de la Rmáx teórica asumiendo una estequiometría de unión mAb:FcYR 1:1. Las barras para cada anticuerpo se muestran en el orden proporcionado por las leyendas de color en la parte de abajo de la diapositiva.
La Figura 35 muestra un alineamiento de las secuencias VH y VL de diversos anticuerpos anti-CD73. Las secuencias de VH y VL CDR1, CDR2 y CDR3 están en negrita.
Descripción detallada
En el presente documento se describen anticuerpos aislados, particularmente anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, los cuales se unen específicamente a CD73 de ese modo reducen la actividad de CD73 ("anticuerpos anti-CD73 antagonistas"). En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se derivan de secuencias particulares de la línea germinal de la cadena pesada y ligera y/o comprenden características estructurales particulares tales como regiones CDR que comprenden secuencias particulares de aminoácidos. En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, métodos de producción de tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos, y composiciones farmacéuticas formuladas para contener los anticuerpos. En el presente documento también se proporcionan métodos de uso de los anticuerpos para reducir el crecimiento del tumor, solos o en combinación con otros agentes terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos) y/o terapias de cáncer. Por consiguiente, los anticuerpos antiCD73 descritos en el presente documento se pueden usar en un tratamiento en una amplia diversidad de aplicaciones terapéuticas, incluyendo, por ejemplo, inhibición del crecimiento tumoral, inhibición de la metástasis, y aumento de una respuesta inmunitaria frente a un tumor.
Definiciones
Con el fin de que se pueda entender más fácilmente la presente divulgación, se definen previamente determinadas expresiones. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
La expresión "Grupo de Diferenciación 73" o "CD73" como se usa en el presente documento se refiere a una enzima (nucleotidasa) capaz de convertir los nucléosido 5' monofosfatos extracelulares a nucleósidos, concretamente adenosín monofosfato (AMP) a adenosina. CD73 normalmente se encuentra como un dímero anclado a la membrana celular a través de un enlace de glicosilfosfatidilinositol (GPI), tiene actividad ecto-enzimática y juega un papel en la transducción de la señal. La función principal de CD73 es su conversión de nucleótidos extracelulares (por ejemplo, 5'-AMP) a adenosina, una molécula altamente imunosupresora. Por tanto, ecto-5'-nucleotidasa cataliza la desfosforilación de los ribo- y desoxirribonucleotidasa monofosfatos de purina y pirimidina al correspondiente nucleósido. Aunque CD73 tiene amplia especificidad de sustrato, prefiere ribonucleósidos de purina.
CD73 también es referido como ecto-5'-nucleasa (ecto-5'NT, EC 3.1.3.5). El término "CD73" incluye cualquier variante o isoforma de CD73 que se expresa de forma natural por las células. Por consiguiente, los anticuerpos descritos en el presente documento reaccionan con CD73 de especies distintas a la humana (por ejemplo CD73 cynomolgus). Como alternativa, los anticuerpos pueden ser específicos a CD73 humana y pueden presentar cualquier reactividad cruzada con otras especies. CD73 o cualquiera de sus variantes e isoformas, se pueden aislar de células o tejidos que las expresan de forma natural o se producen de manera recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica y/o las descritas en el presente documento.
Se han identificado dos isoformas de CD73 humana, las cuales comparten las mismas porciones N-terminal y C terminal. La isoforma 1 (N.° de acceso NP_002517.1; SEQ ID NO: 1) representa la proteína más larga, que consiste en 574 aminoácidos y 9 exones. La isoforma 2 (N.° de acceso Np_001191742.1; SEQ ID NO: 2) codifica una proteína más corta, que consiste en 524 aminoácidos, que carece de los aminoácidos 404-453. La Isoforma 2 carece de una alterno en el exón del marco de lectura dando como resultado una transcripción con solamente 8 exones, pero con las mismas secuencias N-terminal y C-terminal.
La secuencia de la proteína CD73 de cynomolgus (cyno) está proporcionada como SEQ ID NO: 3. Los términos cynomolgus y cyno ambos se refieren a la especies Macaca fascicularis y se usan de manera intercambiable por toda la memoria.
El término "anticuerpo" como se usa en el presente documento puede incluir anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, la "porción de unión a antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere, en una realización, a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligera (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de la cadena pesada (abreviado en el presente documento como Vh) y una región constante de la cadena pesada. En ciertos anticuerpos IgG, IgD e IgA de origen natural, la región constante de la cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. En determinados anticuerpos de origen natural, cada cadena ligera está comprendida por una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
La cadena pesada de un anticuerpo puede o no puede contener una lisina (k) terminal o una glicina y lisina (GK) terminal. Por tanto, cualquier secuencia de la cadena pesada y secuencia de la región constante de la cadena pesada proporcionadas en el presente documento pueden terminar en GK o G, o carecer K o GK, a pesar de lo cual están provistas del último aminoácido de la secuencia. Esto es debido a que la lisina terminal y algunas glicina y lisina se escinden durante la expresión del anticuerpo.
Los anticuerpos generalmente se unen específicamente a su antígeno afín con alta afinidad, reflejado por una constante de disociación (Kd) de 10'7 a 10'11 M o menos. Cualquier Kd mayor que aproximadamente 10'6 M generalmente se considera que indica unión no específica. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente" a un antígeno se refiere a un anticuerpo que se une al antígeno y a antígenos sustancialmente idénticos con alta afinidad, lo que significa que tiene una Kd de 10-7 M o menos, preferentemente 10-8 M o menos, incluso más preferentemente 5 x 10-9 M, y lo más preferentemente entre 10-8 M y 10-10 M o menos, pero no se une con alta afinidad a antígenos no relacionados. Un antígeno es "sustancialmente idéntico" a un antígeno dado si presenta un alto grado de identidad de secuencia al antígeno dado, por ejemplo, si presenta al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % o más de identidad de secuencia a la secuencia del antígeno dado. A modo de ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a CD73 humana también puede reaccionar de manera cruzada con CD73 de ciertas especies de primate no humano (por ejemplo, mono cynomolgus), pero no puede reaccionar de manera cruzada con CD73 de otras especies, o con un antígeno distinto a CD73.
Una inmunoglobulina puede ser de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, incluyendo, pero sin limitación, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. El isotipo IgG se divide en subclases en ciertas especies: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b y IgG3 en ratones. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento son del subtipo IgG1 o IgG2. Las inmunoglobulinas, por ejemplo, IgG1 humana, existen en diversos alotipos, los cuales difieren unos de otros en como mucho unos pocos aminoácidos. "Anticuerpo" puede incluir, a modo de ejemplo, tanto anticuerpos de origen natural como de no origen natural; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos y no humanos; anticuerpos completamente sintéticos; y anticuerpos de cadena única.
La expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD73 humana). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento, incluyen (i) un fragmentos Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que opcionalmente pueden estar unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína en la que las regiones Vl y Vh se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.Uu . 85:5.879-5.883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena sencillas estén abarcados por la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estas y otras construcciones potenciales se describen en Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se seleccionan en función de su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.
Un "anticuerpo biespecífico" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena ligera/pesada diferentes, dando lugar a dos sitios de unión a antígeno con especificidad para antígenos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante varios métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de los fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1.547-1.553 (1992).
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, ser refiere a un anticuerpo que muestra una especificidad de unión única y afinidad para un epítopo particular o una composición de anticuerpos en los que todos los anticuerpos muestran una especificidad de unión única y afinidad para un epítopo particular. Generalmente, tales anticuerpos monoclonales se derivarán de una célula única o ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y se propagará sin introducir de manera intencionada cualquier alteración de la secuencia. Por consiguiente, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene regiones variables y opcionales constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma, por ejemplo, obtenido fusionando un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico o transcromosómico (por ejemplo, un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera), a una célula inmortalizada.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos (descrito más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de un recombinante, genoteca de anticuerpo humano combinatoria, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular y son codificadas por los genes de la línea germinal, pero incluyen reordenamientos y mutaciones posteriores que ocurren, por ejemplo, durante la maduración del anticuerpo. Como es conoce en la técnica (véase, por ejemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1.117-1.125), la región variable contiene el dominio de unión a antígeno, el cual es codificado por diversos genes que se disponen para formar un anticuerpo específico a un antígeno extraño. Además del reordenamiento, la región variable además se puede modificar por múltiples cambios de aminoácido único (referidos como mutación somática o hipermutación) para incrementar la afinidad del anticuerpo al antígeno extraño. La región constante cambiará en respuesta adicional a un antígeno (es decir, cambio de isotipo). Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos reorganizadas y somáticamente mutadas que codifican los polipéptidos de la inmunoglobulina de la cadena ligera y la cadena pesada en respuesta a un antígeno pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal original, pero en lugar de ello serán sustancialmente idénticas o similares (es decir, tienen al menos un 80 % de identidad).
Un anticuerpo "humano" (HuMAb) se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables en el que tanto el marco como las regiones CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos descritos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específicas a sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Las expresiones anticuerpos "humanos" y anticuerpos "completamente humanos" se usan como sinónimos.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR de un anticuerpo no humano se reemplazan por los aminoácidos correspondientes derivados de las inmunoglobulinas humanas. En una realización de una forma humanizada de un anticuerpo, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR se han reemplazado por aminoácidos de las inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR no cambian. Pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos son permisibles siempre que no anulen la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno particular. Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que las regiones variables se derivan de una especie y las regiones constantes se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las regiones variables se derivan de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes derivan de un anticuerpo humano.
Una "región constante de la cadena pesada modificada" se refiere a una región constante de la cadena pesada que comprende los dominios constantes CH1, bisagra, CH2 y CH3, en los que uno o más de los dominios constantes son de un isotipo diferente (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). En determinadas realizaciones, la región constante modifica incluye un dominio CH1 de IgG2 humana y una bisagra de IgG2 humana fusionado con un dominio CH2 de IgG1 humana y un dominio CH3 de IgG1 humana. En determinadas realizaciones, tales regiones constantes modificadas también incluyen modificaciones de aminoácidos dentro de uno o más de los dominios en relación con la secuencia de aminoácidos tipo silvestre.
Cuando se hace referencia en el presente documento a un anticuerpo como "CD73.3" o "CD73.4" sin indicar la identidad de la región constante, a menos que se indique lo contrario, se refiere a anticuerpos que tiene las regiones variables de CD73.3 o CD73.4, respectivamente, con cualquier región constante descrita en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE) que se codifica por los genes de la región constante de la cadena pesada.
"Alotipo" se refiere a variantes de origen natural dentro de un grupo de isotipo específico, cuyas variantes difieren en unos pocos aminoácidos (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser de cualquier alotipo.
A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, todos los números de aminoácidos son según el índice de la UE del sistema Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH N.° 91-3242).
Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en el presente documento con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD73 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CD73). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de c D73 puede, sin embargo, tener reacción cruzada con otras proteínas c D73 de diferentes especies.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "inhibe CD73" se refiere a un anticuerpo que presenta una función biológica y/o enzimática de CD73. Estas funciones incluyen, por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la actividad enzimática de CD73, por ejemplo, la producción regulada por CD73 de adenosina o la reducción de la producción de cAMP.
Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "internaliza" se refiere a un anticuerpo que cruza la membrana celular tras la unión a un antígeno de superficie celular. La internalización incluye anticuerpo mediado por receptor, por ejemplo, CD73, internalización. En algunas realizaciones, el anticuerpo "se internaliza" dentro de las células que expresa CD73 a una tasa de T1/2 igual a aproximadamente 10 min o inferior.
Una "función efectora" se refiere a la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor o ligando de Fc, o un evento bioquímico que resulta de la misma. "Funciones efectoras" ilustrativas incluyen la unión de Clq, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión a receptor de Fc, funciones efectoras mediadas por FcyR tales como ADCC y fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCP) y regulación por disminución de un receptor superficial celular (por ejemplo, el receptor de linfocito B; BCR). Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo).
Un "receptor de Fc" o "FcR" es un receptor que se une a la región Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen a anticuerpo IgG comprenden receptores de la familia FcyR, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. La familia FcyR consiste en tres receptores activadores (FcyRI, FcyRIII, y FcyRIV en ratones; FcyRIA, FcyRIIA, y FcyRIIIA en seres humanos) y uno inhibidor (FcyRIIB). Diversas propiedades de los FcyR humanos se resumen en la Tabla 1. La mayoría de los tipos de célula efectora innata expresan conjuntamente uno o más FcyR activadores y el FcyRIIB inhibidor, mientras que los linfocitos citolíticos naturales (NK) expresan selectivamente un receptor de Fc activadores (FcyRIII en ratones y FcyRIIIA en seres humanos) pero no el FcyRIIB inhibidor en ratones y seres humanos. La IgG1 humana se une a la mayoría de los receptores de Fc humanos y se considera equivalente a IgG2a murina con respecto a los tipos de receptores de Fc activadores a los que se unen.
T l 1. Pr i l F R h m n
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Una "bisagra", "dominio bisagra" o "región bisagra" o región bisagra de anticuerpo" se refiere al dominio de una región constante de la cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2 e incluye las porciones superiores, medias, e inferiores de la bisagra (Roux et al. J. Immunol. 1998161:4083). La bisagra proporciona niveles variantes de flexibilidad entre las regiones de unión y efectoras de un anticuerpo y también proporciona sitios para el enlace disulfuro intermolecular entre las dos regiones constantes de región pesada. Como se usa en el presente documento, una bisagra comienza en Glu216 y termina en Gly237 para los isotipos IgG (Roux et al., 1998 J. Immunol. 161:4.083). Las secuencias de bisagras de IgG1 tipo silvestre, IgG2, IgG3 y IgG4 se muestran en las Tablas 2 y 31.
Tabla 2.
Aminoácidos de la región bisagra
Tipo Ig Ch1* C-terminal Bisagra Superior Bisagra Media (SEQ ID NO) Bisagra Inferior (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) IgG1 VDKRV (284) EPKSCDKTHT CPPCP (290) APELLGG (298)
(286)
(continuación)
Tipo Ig CH1* C-terminal Bisagra Superior Bisagra Media (SEQ ID NO) Bisagra Inferior (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) IgG2 VDKTV (285) ERK CCVECPPCP (291) APPVAG (299) IgG3 VDKRV (284) ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG (17-15-15-15) (287) (EPKSCDTPPPCPRCP)a (292) (298)
IgG3 VDKRV (284) ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG
(17-15-15) (287) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 (293) (298)
IgG3 (17-15) VDKRV (284) ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG (298)
(287) (EPKSCDTPPPCPRCP)1 (294)
IgG3 VDKRV (284) EPKS (288) CDTPPPCPRCP APELLGG (298) (15-15-15) (EPKSCDTPPPCPRCP)2 (295)
IgG3 (15) VDKRV (284) EPKS (288) CDTPPPCPRCP (296) APELLGG (298) IgG4 VDKRV (284) ESKYGPP (289) CPSCP (297) APEFLGG (298) * secuencias de aminoácidos C-terminales de los dominios
CH1.
El término "bisagra" incluye bisagras tipo silvestre (tales como las expuestas en las Tablas 2 y 31), así como variantes de las mismas (por ejemplo bisagras de no origen natural o bisagras modificadas). Por ejemplo, la expresión "bisagra de IgG2" incluye bisagra de IgG2 tipo silvestre, como se muestra en la Tabla 2, y las variantes que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como mucho 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Variantes de bisagra de IgG2 ilustrativas incluyen bisagras de IgG2 en las que 1, 2, 3 o todas las 4 cisteínas (C219, C220, C226 y C229) se cambian a otro aminoácido. En una realización específica, Una bisagra de IgG2 comprende una sustitución C219S. Una bisagra de IgG2 también puede comprender una sustitución en C220 o sustituciones en tanto C219 como una C220. Una bisagra de IgG2 puede comprender una sustitución, la cual sola, o junto con una o más sustituciones en otras regiones de la cadena pesada o ligera causará que el anticuerpo tome la forma A o B (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3.755). En determinados aspectos descritos en el presente documento, una bisagra es una bisagra híbrida que comprende las secuencias de al menos dos isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede comprender la bisagra superior, media o inferior de un isotipo y el resto de la bisagra de uno u otro más isotipos. Por ejemplo, una bisagra puede ser una bisagra IgG2/IgG1, y puede comprender, por ejemplo, las bisagras superior y media de IgG2 y la bisagra inferior IgG1. Una bisagra puede tener función efectora o puede estar desprovista de función efectora. Por ejemplo, una bisagra inferior de IgG1 tipo silvestre proporciona función efectora.
La expresión "dominio CH1" se refiere a la región constante de la cadena pesada que une el dominio variable a la bisagra en un dominio constante de la cadena pesada. Como se usa en el presente documento, el dominio CH1 comienza en A118 y termina en V215. La expresión "dominio CH1" incluye dominios CH1 tipo silvestre (tales como los que tienen SEQ ID NO: 98 para IgG1 y SEQ ID NO: 124 para IgG2), así como variantes de los mismos (por ejemplo, dominios CH1 de origen natural o dominios CH1 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH1" incluye dominios CH1 tipo silvestre y variantes de los mismos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como mucho 5, 4, 3, 2, o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Dominios CH1 ilustrativos incluyen dominios CH1 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. En el presente documento se proporcionan modificaciones al dominio CH1 que afectan una actividad biológica de un anticuerpo. Un dominio CH1 puede comprender la sustitución C131S, dicha sustitución puede causar que un anticuerpo IgG2 o un anticuerpo que comprende al menos una porción de un anticuerpo IgG2, tal como la bisagra y/o la bisagra y CH1, adopte la forma B, en lugar a la forma A del anticuerpo.
La expresión "dominio CH2" se refiere a la región constante de la cadena pesada que liga la bisagra al dominio CH3 en un dominio constante de la cadena pesada. Como se usa en el presente documento, el dominio CH2 comienza en P238 y termina en K340. La expresión "dominio CH2" incluye dominios CH2 tipo silvestre (tales como los que tienen SEQ ID NO: 137 para IgG1; Tabla 35), así como las variantes de los mismos (por ejemplo, dominios CH2 de origen no natural o dominios CH2 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH2" incluye dominios CH2 tipo silvestre y variantes de los mismos que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como mucho 5, 4, 3, 2, o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Dominios CH2 ilustrativos incluyen dominios CH2 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. En determinadas realizaciones, un dominio CH2 comprende las sustituciones A330S/P331S que reducen la función efectora. En el presente documento se proporcionan otras modificaciones al dominio c H2 que afectan a una actividad biológica de un anticuerpo.
La expresión "dominio CH3" se refiere a la región constante de la cadena pesada que es C-terminal al dominio CH2 en un dominio constante de la cadena pesada. Como se usa en el presente documento, el dominio CH3 comienza en G341 y termina en K447. La expresión "dominio CH3" incluye dominios CH3 tipo silvestre (tales como los que tienen SEQ ID NO: 138 para IgG1; Tabla 35), así como las variantes de los mismos (por ejemplo, dominios CH3 de origen no natural o dominios CH3 modificados). Por ejemplo, la expresión "dominio CH3" incluye dominios CH3 tipo silvestre y variantes de los mismos que tienen 1,2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 y/o como mucho 5, 4, 3, 2, o 1 mutaciones, por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones. Dominios CH3 ilustrativos incluyen dominios CH3 con mutaciones que modifican una actividad biológica de un anticuerpo, tal como ADCC, CDC o semivida. En el presente documento se proporcionan modificaciones al dominio CH3 que afectan una actividad biológica de un anticuerpo. Un "dominio CL" se refiere al dominio constante de una cadena ligera. La expresión "dominio CL" incluye dominios CL tipo silvestre y variantes de los mismos, por ejemplo, variantes que comprenden C214S.
Una "región Fc de secuencia nativa" o "Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa así como variantes de las mismas de origen natural. Fc de secuencia nativa incluye diversos alotipos de Fc (véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1).
El término "epítopo"o "determinante antigénico" se refiere a un lugar sobre un antígeno (por ejemplo, CD73) al que se une específicamente una inmunoglobulina o anticuerpo. Epítopos dentro de los antígenos proteicos se pueden formar tanto a partir de aminoácidos contiguos (normalmente un epítopo lineal) o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de la proteína (normalmente un epítopos conformacional). Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos generalmente, pero no siempre, se conservan en la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario generalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo generalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para la determinación de qué epítopos se unen por un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epítopos) son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en los que los péptidos que se solapan o contiguos (por ejemplo, de CD73) se ensayan para reactividad con un anticuerpo dado (por ejemplo anticuerpo anti-CD73). Los métodos para determinar la conformación espacial de un epítopo incluyen las técnicas en la materia y las descritas en el presente documento, por ejemplo, cristalografía por rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional y HDX-MS (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
La expresión "mapeo de epítopo" se refiere al proceso de identificación de los determinantes moleculares sobre el antígeno implicado en el reconocimiento anticuerpo-antígeno.
La expresión "se une al mismo epítopo" en referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos se unen al mismo segmento de los restos de aminoácidos, como se determina por un método dado. Las técnicas para determinar si los anticuerpos se unen al "mismo epítopo sobre CD73" con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como, análisis por rayos x de cristales de complejos de antígeno:anticuerpo, lo cual proporciona resolución atómica del epítopo, y espectrometría de masas por intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS). Otros métodos que hacen un seguimiento de la unión del anticuerpo a los fragmentos de antígeno (por ejemplo, fragmentos proteolíticos) o a variaciones mutadas del antígeno donde la pérdida de unión debido a una modificación de un resto de aminoácidos dentro de la secuencia de antígeno con frecuencia se considera un indicio de un componente de epítopo (por ejemplo, mutagénesis de barrido de alanina - Cunningham & Wells (1985) Science 244:1.081). Además, también se pueden usar métodos combinatorios computacionales para el mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos de genotecas combinatorias de genotecas de presentación de fagos.
Anticuerpos que "compiten con otro anticuerpo para la unión a una diana" se refiere a anticuerpos que inhiben (parcialmente o completamente) la unión del otro anticuerpo a la diana. Si dos anticuerpos compiten o no uno con otro para la unión a diana, es decir, si y hasta que punto un anticuerpo inhibe la unión del otro anticuerpo a una diana, se puede determinar usando experimentos de competición conocidos, por ejemplo, tales como los descritos en los Ejemplos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo compite con, e inhibe la unión de otro anticuerpo a una diana en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. El nivel de inhibición o competición puede ser diferente dependiendo de qué anticuerpo es el "anticuerpo bloqueante" (es decir, el anticuerpo frío que se incuba primero con la diana). Los ensayos de competición se pueden conducir como se describe, por ejemplo, en Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 o en el Capítulo 11 of "Using Antibodies" de Ed Harlow and David Lane, "Cold Spring Harbor Laboratory Press", Cold Spring Harbor, NY, EE.UU. 1999. Los anticuerpos que compiten se unen al mismo epítopo, un epítopo solapante o a epítopos adyacentes (por ejemplo, como se evidencia por impedimento estérico).
Otros ensayos de unión competitiva incluyen: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich (véase Stahli et al., (1983) Methods in Enzimology 9:242); EIA en fase sólida directa de biotina-avidina (véase, Kirkland et al., J. Immuno. 137:3.614 (1986)); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, 1988)); RIA de marcaje directo en fase sólida usando 1-125 marcador (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); EIA e n fa s e s ó lid a d ire c ta d e b io t in a -a v id in a (C h e u n g e t a l., Virology 176 :546 (1990 )) ; y R IA d e m a re a je d ire c to . (M o ld e n -h a u e r e t a l., Scand. J. Immunol. 32 :77 (1990 )).
C o m o se u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , la s e x p re s io n e s "u n ió n e s p e c íf ic a " , "u n ió n s e le c t iv a " , "s e u n e s e le c t iv a m e n te " , y "s e u n e e s p e c íf ic a m e n te " se re f ie re n a la u n ió n d e l a n t ic u e rp o q u e se u n e a un e p íto p o o un a n tíg e n o p re d e te rm in a d o p e ro n o a o tro s a n tíg e n o s . N o rm a lm e n te , e l a n t ic u e rp o ( i) se u n e c o n u n a c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n en e q u il ib r io (Kd) d e a p ro x im a d a m e n te m e n o s d e 10 '7 M , ta l c o m o a p ro x im a d a m e n te m e n o s d e 10 '8 M, 10 '9 M o 10 '1° M o in c lu s o in fe r io r c u a n d o se d e te rm in a p o r, p o r e je m p lo , te c n o lo g ía d e re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l (S P R ) en un in s tru m e n to d e re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l B IA C O R E ® 200 ° q u e u s a e l a n tíg e n o p re d e te rm in a d o , p o r e je m p lo , C D 73 h u m a n a re c o m b in a n te , c o m o e l a n a lito y e l a n t ic u e rp o c o m o e l l ig a n d o , o a n á lis is S c a tc h a rd d e u n ió n d e l a n t ic u e rp o a c é lu la s a n tíg e n o p o s it iv a s , y ( ii) s e u n e a l a n tíg e n o p re d e te rm in a d o co n u n a a f in id a d q u e e s a l m e n o s d o s v e c e s m a y o r q u e su a f in id a d d e u n ió n a un a n tíg e n o no e s p e c íf ic o (p o r e je m p lo , B S A , c a s e ín a ) d is t in to d e l a n tíg e n o p re d e te rm in a d o o un a n tíg e n o e s tre c h a m e n te re la c io n a d o . P o r c o n s ig u ie n te , a m e n o s q u e se in d iq u e lo c o n tra r io , un a n t ic u e rp o q u e "s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a C D 73 h u m a n a " se re f ie re a un a n t ic u e rp o q u e se u n e a C D 73 h u m a n a s o lu b le o u n id a a c é lu la c o n u n a Kd d e 10 '7 M o in c lu s o in fe r io r , ta l c o m o a p ro x im a d a m e n te m e n o s d e 10 '8 M , 10 '9 M o 10 '10 M o in c lu s o in fe r io r . U n a n t ic u e rp o q u e " re a c c io n a d e m a n e ra c ru z a d a c o n C D 73 d e c y n o m o lg u s " s e re f ie re a un a n t ic u e rp o q u e s e u n e a C D 73 d e c y n o m o lg u s c o n u n a Kd o f 10 '7 M o in fe r io r , ta l c o m o m e n o s d e 10 '8 M, 10 '9 M o 10 '10 M o in c lu s o in fe r io r . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , los a n t ic u e rp o s q u e n o re a c c io n a n d e m a n e ra c ru z a d a co n C D 73 d e u n a e s p e c ie n o h u m a n a p re s e n ta n b á s ic a m e n te u n ió n n o d e te c ta b le f re n te a e s ta s p ro te ín a s e n e n s a y o s d e u n ió n c o n v e n c io n a le s .
E l té rm in o "K asoc" o " K a", c o m o se u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , p re te n d e re fe r irs e a la c o n s ta n te d e la ta s a a s o c ia c ió n d e u n a in te ra c c ió n p a r t ic u la r a n t ic u e rp o -a n t íg e n o p a rt ic u la r , m ie n tra s q u e e l té rm in o " k dis" o " k d", c o m o se u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p re te n d e re fe r ir s e a la c o n s ta n te d e la ta s a d is o c ia c ió n d e u n a in te ra c c ió n p a r t ic u la r d e a n t ic u e rp o -a n t íg e n o . E l té rm in o "Kd", c o m o se u sa e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p re te n d e re fe r irs e a la c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n en e q u ilib r io , la c u a l se o b t ie n e d e la re la c ió n d e kd y ka (e s d e c ir , kd/ k a) y se e x p re s a c o m o u n a c o n c e n tra c ió n m o la r (M ). L o s v a lo re s d e Kd p a ra a n t ic u e rp o s se p u e d e n d e te rm in a r u s a n d o m é to d o s b ie n e s ta b le c id o s en la té c n ic a . U n m é to d o p re fe r id o p a ra d e te rm in a r la Kd d e un a n t ic u e rp o e s u s a n d o re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e rf ic ia l, p re fe r ib le m e n te u s a n d o un s is te m a b io s e n s o r ta l c o m o e l s is te m a d e re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l B ia c o re ® o c ito m e tr ía d e f lu jo y a n á lis is d e S c a tc h a rd .
E l té rm in o "C E 50 " en e l c o n te x to d e un e n s a y o in vitro o in vivo q u e u s a un a n t ic u e rp o o f ra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o , s e re f ie re a la c o n c e n tra c ió n d e un a n t ic u e rp o o u n a p o rc ió n d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o q u e in d u c e u n a re s p u e s ta q u e e s 50 % d e la re s p u e s ta m á x im a , e s d e c ir, a m e d io c a m in o e n tre la re s p u e s ta m á x im a y la d e p a rtid a .
U n a " ta s a d e in te rn a liz a c ió n " d e un a n t ic u e rp o o d e un re c e p to r , p o r e je m p lo , C D 73 , m e d ia d o p o r un a n t ic u e rp o , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , s e p u e d e re p re s e n ta r , p o r e je m p lo , p o r T 1/2 d e in te rn a liz a c ió n , p o r e je m p lo , c o m o se m u e s tra en lo s E je m p lo s . U n a ta s a d e in te rn a liz a c ió n d e un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e a u m e n ta r o in c re m e n ta r e n a l m e n o s u n 10 % , 30 % , 50 % , 75 % , 2 v e c e s , 3 v e c e s , 5 v e c e s o m á s , d a n d o c o m o re s u lta d o u n a re d u c c ió n d e l T 1/2 en a l m e n o s un 10 % , 30 % , 50 % , 75 % , 2 v e c e s , 3 v e c e s , 5 v e c e s o m á s c a m b ia n d o la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a d e l a n t ic u e rp o a u n a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a m o d if ic a d a , p o r e je m p lo , u n a q u e c o n t ie n e u n a b is a g ra d e Ig G 2 y d o m in io C H 1 d e Ig G 2. P o r e je m p lo , e n v e z d e te n e r un T 1/2 d e 10 m in u to s , u n a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a m o d if ic a p u e d e in c re m e n ta r la ta s a d e in te rn a liz a c ió n y d e e s e m o d o re d u c ir e l T 1/2 a 5 m in u to s (e s d e c ir , un in c re m e n to d e d o s v e c e s en la ta s a d e in te rn a liz a c ió n o un d e s c e n s o d e d o s v e c e s en T 1/2). " T 1/2" se d e fin e c o m o e l t ie m p o a l q u e se a lc a n z a la m ita d d e la in te rn a liz a c ió n m á x im a , m e d id o a p a r t ir d e l m o m e n to en e l q u e se a ñ a d e e l a n t ic u e rp o a la s c é lu la s . E l n iv e l m á x im o d e in te rn a liz a c ió n p u e d e s e r el n iv e l d e in te rn a liz a c ió n en la m e s e ta d e u n a g rá f ic a q u e re p re s e n ta la in te rn a liz a c ió n t ra z a d a en la g rá f ic a fre n te a la s c o n c e n tra c io n e s d e a n t ic u e rp o . U n a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a m o d if ic a d a p u e d e in c re m e n ta r e l n iv e l d e in te rn a liz a c ió n d e un a n t ic u e rp o e n a l m e n o s un 10 % , 30 % , 50 % , 75 % , 2 v e c e s , 3 v e c e s , 5 v e c e s o m á s . O tro m o d o d e c o m p a ra r la s e f ic ie n c ia s d e in te rn a liz a c ió n d e d ife re n te s a n t ic u e rp o s , ta le s c o m o un a n t ic u e rp o co n , y e l m is m o a n t ic u e rp o s in , u n a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a , e s c o m p a ra n d o su n iv e l d e in te rn a liz a c ió n a u n a c o n c e n tra c ió n d e a n t ic u e rp o d a d a (p o r e je m p lo , 100 n M ) o a un t ie m p o d a d o (p o r e je m p lo , 2 m in u to s , 5 m in u to s , 10 m in u to s o 30 m in u to s ) . La c o m p a ra c ió n d e lo s n iv e le s d e in te rn a liz a c ió n ta m b ié n s e p u e d e re a liz a r c o m p a ra n d o los n iv e le s d e C E 50 d e in te rn a liz a c ió n . E l n iv e l d e in te rn a liz a c ió n d e un a n t ic u e rp o s e p u e d e d e f in ir e n re la c ió n c o n la d e un a n t ic u e rp o d a d o ( re fe re n c ia ) , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , 11 F 11 o C D 73.4 - Ig G 2 C S - Ig G 1 o C D 73.4 - Ig G 2 C S - Ig G 1.1 f , y, se p u e d e id e n t if ic a r c o m o un p o rc e n ta je d e l v a lo r o b te n id o co n e l a n t ic u e rp o d a d o ( re fe re n c ia ) . E l a lc a n c e d e in te rn a liz a c ió n s e p u e d e a u m e n ta r e n a l m e n o s un 10 % , 30 % , 50 % , 75 % , 2 v e c e s , 3 v e c e s , 5 v e c e s o m á s , en c o m p a ra c ió n c o n u n o c u a lq u ie ra d e e s to s m é to d o s .
L a e x p re s ió n "d e o r ig e n n a tu ra l" c o m o se u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to c o m o a p lic a d a a un o b je to se re f ie re a l h e c h o d e q u e un o b je to se p u e d e h a lla r en la n a tu ra le z a . P o r e je m p lo , u n a s e c u e n c ia d e p o lip é p tid o o de p o lin u c le ó t id o q u e e s tá p re s e n te en un o rg a n is m o ( in c lu y e n d o a lo s v iru s ) q u e s e p u e d e a is la r d e u n a fu e n te en la n a tu ra le z a y q u e n o s e h a m o d if ic a d o in te n c io n a d a m e n te p o r e l s e r h u m a n o e n e l la b o ra to r io e s d e o r ig e n n a tu ra l.
U n "p o l ip é p t id o " se re f ie re a u n a c a d e n a q u e c o m p re n d e a l m e n o s d o s re s to s d e a m in o á c id o s c o n s e c u t iv a m e n te unidos, con un límite no superior sobre la longitud de la cadena. Uno o más restos de aminoácidos en la proteína pueden contener una modificación tal como, pero sin limitación, glicosilación, fosforilación o un enlace disulfuro. Una "proteína" puede comprender uno o más polipéptidos.
La expresión "molécula de ácido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, y puede ser ADNc.
También se proporcionan "modificaciones de secuencia conservadoras" de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO descritas en el presente documento, es decir, las modificaciones de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no anulan la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contienen la secuencia de aminoácidos, al antígeno. Tales modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones de nucleótido y aminoácido, así como, adiciones y deleciones de nucleótido y aminoácido. Por ejemplo, las modificaciones se pueden introducir en las SEQ ID NO descritas en el presente documento por técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por la PCR. Las modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos conservadoras, en las que un resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un resto de aminoácido no esencial previsto en un anticuerpo anti-CD73 está reemplazado preferentemente por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígeno son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32:1.180-1.187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng.
12(10):879-884 (1999); y Burks et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
Como alternativa, en otra realización, las mutaciones se pueden introducir de manera aleatoria a lo largo de toda o una porción de la secuencia codificante del anticuerpo anti-CD73, tal como por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-CD73 modificados resultantes se pueden seleccionar en función de su actividad de unión mejorada.
Para los ácidos nucleicos, la expresión "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de las mismas, cuando se alinean óptimamente y se comparan, son idénticas, con apropiadas inserciones o deleciones de nucleótidos, en al menos aproximadamente un 80 % de los nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente un 90 % a 95 % y más preferentemente al menos aproximadamente un 98 % a 99,5 % de los nucleótidos. Como alternativa, la homología sustancial existe cuando los segmentos se hibridarán bajo las condiciones de hibridación selectivas, con el complemento de la hebra.
Para polipéptidos, la expresión "homología sustancial" indica que dos polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean óptimamente y se comparan, son idénticas, con inserciones o deleciones de aminoácidos apropiadas, en al menos aproximadamente un 80 % de los aminoácidos, normalmente al menos aproximadamente un 90 % a 95 % y más preferentemente al menos aproximadamente un 98 % a 99,5 % de los aminoácidos.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias cuando las secuencias se alinean óptimamente (es decir, % homología=n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), con alineamiento óptimo determinado tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden conseguirse usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes de más adelante.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de programa informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también se pueden determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de resto peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programa informático GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Las secuencias de ácidos nucleicos y proteína descritas en el presente documento además se pueden usar además c o m o u n a " s e c u e n c ia p ro b le m a " p a ra re a liz a r u n a b ú s q u e d a fre n te a b a s e s d e d a to s p ú b lic a s p a ra , p o r e je m p lo , id e n t if ic a r s e c u e n c ia s re la c io n a d a s . T a le s b ú s q u e d a s s e p u e d e n re a liz a r u s a n d o lo s p ro g ra m a s N B L A S T y X B L A S T (v e rs ió n 2 ,0 ) d e A lts c h u l, e t a l. (1990 ) J. Mol. Biol. 215 :403 -10 . P u e d e n re a liz a rs e b ú s q u e d a s d e n u c le ó tid o s p o r B L A S T c o n e l p ro g ra m a N B L A S T , p u n tu a c ió n = 100 , lo n g itu d d e p a la b ra = 12 p a ra o b te n e r s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s h o m ó lo g a s a la s m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s d e s c r ita s e n e l p re s e n te d o c u m e n to . L a s b ú s q u e d a s d e p ro te ín a s p o r B L A S T p u e d e n re a liz a rs e c o n e l p ro g ra m a X B L A S T , p u n tu a c ió n = 50 , lo n g itu d d e p a la b ra = 3 p a ra o b te n e r s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s h o m ó lo g a s a la s m o lé c u la s p ro te ic a s d e s c r ita s e n e l p re s e n te d o c u m e n to . P a ra o b te n e r a l in e a c io n e s c o n h u e c o s c o n f in e s d e c o m p a ra c ió n , se p u e d e u s a r G a p p e d B L A S T c o m o se d e s c r ib e en A lts c h u l e t a l, (1997 ) Nucleic Acids Res. 25 (17 ) :3389 -3402 . C u a n d o se u t iliz a n lo s p ro g ra m a s B L A S T y G a p p e d B L A S T , s e p u e d e n u s a r lo s p a rá m e tro s p o r d e fe c to d e lo s p ro g ra m a s re s p e c t iv o s (p o r e je m p lo , X B L A S T y N B L A S T ). V é a s e w w w .n c b i.n lm .n ih .g o v .
L o s á c id o s n u c le ic o s p u e d e n e s ta r p re s e n te s en c é lu la s c o m p le ta s , en lis a d o c e lu la r , o en u n a fo rm a p a rc ia lm e n te p u r if ic a d a o s u s ta n c ia lm e n te p u ra . U n á c id o n u c le ic o se "a ís la " o "s e v u e lv e s u s ta n c ia lm e n te p u ro " c u a n d o se p u r if ic a d e o tro s c o m p o n e n te s c e lu la re s u o tro s c o n ta m in a n te s , p o r e je m p lo , o tro s á c id o s n u c le ic o s c e lu la re s (p o r e je m p lo , la s o tra s p a rte s d e l c ro m o s o m a ) o p ro te ín a s , m e d ia n te té c n ic a s c o n v e n c io n a le s , in c lu y e n d o t ra ta m ie n to a lc a lin o /S D S , b a n d e o d e C s C l, c ro m a to g ra f ía en c o lu m n a , e le c t ro fo re s is en g e l d e a g a ro s a y o tro s b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a . V é a s e , F. A u s u b e l, e t a l., ed . "C u r re n t P ro to c o ls in M o le c u la r B io lo g y " , G re e n e P u b lis h in g a n d W ile y In te rs c ie n c e , N u e v a Y o rk (1987 ).
L o s á c id o s n u c le ic o s , p o r e je m p lo , A D N c , se p u e d e n m u ta r , d e a c u e rd o co n té c n ic a s c o n v e n c io n a le s p a ra p ro p o rc io n a r s e c u e n c ia s g é n ic a s . P a ra s e c u e n c ia s c o d if ic a n te s , e s ta s m u ta c io n e s p u e d e n a fe c ta r a la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s c o m o se d e s e a . E n p a rt ic u la r , se c o n te m p la n s e c u e n c ia s d e A D N s u s ta n c ia lm e n te h o m ó lo g a s a o d e r iv a d a s d e V n a tiv a , D, J, c o n s ta n te , c a m b io s y o tra s ta le s s e c u e n c ia s e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
E l té rm in o "v e c to r " , c o m o se u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , p re te n d e re fe r irs e a u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o c a p a z d e t r a n s p o r ta r o tro á c id o n u c le ic o a l q u e s e h a u n id o . U n t ip o d e v e c to r e s un " p lá s m id o " e l c u a l se re f ie re a un b u c le d e A D N b ic a te n a r io e n e l q u e p u e d e n lig a rs e s e g m e n to s d e A D N a d ic io n a le s . O tro t ip o d e v e c to r e s un v e c to r v ira l, e n e l q u e p u e d e n lig a rs e s e g m e n to s d e A D N a d ic io n a le s a l g e n o m a v ira l. D e te rm in a d o s v e c to re s s o n c a p a c e s d e re p lic a c ió n a u tó n o m a e n u n a c é lu la h o s p e d a d o ra e n la q u e s e in tro d u c e n (p o r e je m p lo , v e c to re s b a c te r ia n o s q u e t ie n e n un o r ig e n d e re p lic a c ió n b a c te r ia n o y v e c to re s e p is ó m ic o s d e m a m ífe ro ) . O tro s v e c to re s (p o r e je m p lo , v e c to re s no e p is ó m ic o s d e m a m ífe ro ) se p u e d e n in te g ra r en e l g e n o m a d e u n a c é lu la h o s p e d a d o ra tra s su in tro d u c c ió n en la c é lu la h o s p e d a d o ra y d e e s te m o d o se re p lic a n ju n to c o n e l g e n o m a d e l h o s p e d a d o r . A d e m á s , d e te rm in a d o s v e c to re s so n c a p a c e s d e d ir ig ir la e x p re s ió n d e g e n e s a lo s q u e e s tá n u n id o s o p e ra t iv a m e n te . T a le s v e c to re s se re f ie re n en e l p re s e n te d o c u m e n to c o m o "v e c to re s d e e x p re s ió n re c o m b in a n te s " (o s im p le m e n te , "v e c to re s d e e x p re s ió n " . E n g e n e ra l, lo s v e c to re s d e e x p re s ió n ú tile s en la s té c n ic a s d e A D N re c o m b in a n te e s tá n c o n fre c u e n c ia en fo rm a d e p lá s m id o s . E n la p re s e n te m e m o r ia d e s c r ip t iv a , lo s té rm in o s " p lá s m id o " y "v e c to r " se p u e d e n u s a r d e m a n e ra in te rc a m b ia b le , y a q u e e l p lá s m id o e s la fo rm a d e v e c to r m á s c o m ú n m e n te u s a d a . S in e m b a rg o , ta m b ié n se in c lu y e n o tra s fo rm a s d e v e c to re s d e e x p re s ió n , ta le s c o m o v e c to re s v í r ic o s (p o r e je m p lo , re tro v iru s d e fe c tu o s o s p a ra la re p lic a c ió n , a d e n o v iru s y v iru s a d e n o a s o c ia d o s ) , q u e t ie n e n fu n c io n e s e q u iv a le n te s .
L a e x p re s ió n " c é lu la h o s p e d a d o ra re c o m b in a n te " (o s im p le m e n te " c é lu la h o s p e d a d o ra " ) , c o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p re te n d e re fe r irs e a u n a c é lu la q u e c o m p re n d e un á c id o n u c le ic o q u e n o e s d e o r ig e n n a tu ra l p re s e n te en la c é lu la , y q u iz á s u n a c é lu la d e n tro d e la c u a l se h a in t ro d u c id o u n a e x p re s ió n re c o m b in a n te . D e b e e n te n d e rs e q u e ta le s té rm in o s p re te n d e n re fe r ir s e n o s o lo a la c é lu la c o n c re ta , s in o ta m b ié n a la d e s c e n d e n c ia d e d ic h a c é lu la . D e b id o a q u e p u e d e n o c u r r ir d e te rm in a d a s m u ta c io n e s en g e n e ra c io n e s p o s te r io re s d e b id o a u n a m u ta c ió n o a in f lu e n c ia s a m b ie n ta le s , d ic h a p ro g e n ie p u e d e , d e h e c h o , n o s e r id é n t ic a a la c é lu la p a re n ta l, p e ro a u n a s í se in c lu y e n d e n tro d e l a lc a n c e d e la e x p re s ió n "c é lu la h o s p e d a d o ra " , c o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
C o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e l té rm in o " a n t íg e n o " s e re f ie re a c u a lq u ie r s u s ta n c ia in m u n o ló g ic a n a tu ra l o s in té t ic a , ta l c o m o u n a p ro te ín a , p é p tid o , o h a p te n o . U n a n tíg e n o p u e d e s e r C D 73 o un f ra g m e n to d e la m is m a .
U n a " re s p u e s ta in m u n ita r ia " se re f ie re u n a re s p u e s ta b io ló g ic a d e n tro d e un v e r te b ra d o fre n te a a g e n te s e x tra ñ o s , d ic h a re s p u e s ta p ro te g e e l o rg a n is m o f re n te a e s to s a g e n te s y e n fe rm e d a d e s c a u s a d a s p o r lo s m is m o . U n a re s p u e s ta in m u n ita r ia e s tá m e d ia d a p o r la a c c ió n d e u n a c é lu la d e l s is te m a in m u n ita r io (p o r e je m p lo , un lin fo c ito T, lin fo c ito B, l in fo c ito s c ito lí t ic o s n a tu ra le s (N K ), m a c ró fa g o , e o s in ó fi lo , m a s to c ito , c é lu la d e n d r í t ic a o n e u tró f i lo s ) y m a c ro m o lé c u la s s o lu b le s p ro d u c id a s p o r c u a lq u ie ra d e e s ta s c é lu la s o e l h íg a d o (q u e in c lu y e a n tic u e rp o s , c ito q u in a s , y c o m p le m e n to ) q u e d a c o m o re s u lta d o e l d ire c c io n a m ie n to s e le c t iv o , u n ió n a, d a ñ o d e , d e s tru c c ió n de , y /o e lim in a c ió n d e l c u e rp o d e l v e r te b ra d o d e lo s p a tó g e n o s in v a s o re s , c é lu la s o te j id o s in fe c ta d o s p o r p a tó g e n o s , c é lu la s c a n c e ro s a s u o tra s a n o rm a le s , o, en lo s c a s o s d e a u to in m u n id a d o in f la m a c ió n p a to ló g ic a , c é lu la s o te jid o s h u m a n o s n o rm a le s . U n a re s p u e s ta o re a c c ió n in m u n ita r ia in c lu y e , p o r e je m p lo , a c t iv a c ió n o in h ib ic ió n d e un lin fo c ito T , p o r e je m p lo , un lin fo c ito T a fe c to r o u n a c é lu la T h , ta l c o m o un l in fo c ito s T C D 4 o C D 8 , o la in h ib ic ió n d e u n a c é lu la T re g .
U n " in m u n o m o d u la d o r " o " in m u n o re g u la d o r " se re f ie re a un a g e n te , p o r e je m p lo , un c o m p o n e n te d e u n a ru ta d e s e ñ a liz a c ió n , la c u a l p u e d e e s ta r im p lic a d a en la m o d u la c ió n , re g u la c ió n , o m o d if ic a c ió n d e u n a re s p u e s ta inmunitaria. "Modulación", "regulación", o "modificación" de una respuesta inmunitaria se refiere a cualquier alteración en una célula del sistema inmunitario o en la actividad de tal célula (por ejemplo, un linfocito T efector). Tal modulación incluye estimulación o supresión del sistema inmunitario que se puede manifestar por un incremento o disminución en el número de diversos tipos celulares, un incremento o descenso en la actividad de estas células, o cualquier otro cambio que puede ocurrir dentro del sistema inmunitario. Se han identificado tanto los inmunomoduladores inhibidores como los estimuladores, algunos de los cuales pueden aumentar la función en un microambiente tumoral. El inmunomodulador puede estar localizado sobre la superficie de un linfocito T. Una "diana inmunomoduladora" o "diana inmunoreguladora" es un inmunomodulador que está dirigido para la unión por, y cuya actividad se altera por la unión de, una sustancia, agente, resto, compuesto o molécula. Las dianas inmunomoduladoras incluyen, por ejemplo, receptores sobre la superficie de una célula ("receptores inmunomoduladores") y ligandos del receptor ("ligandos inmunomoduladores").
Una capacidad incrementada para estimular una respuesta inmunitaria, o el sistema inmunitario, puede resultar de una actividad agonista aumentada de receptores coestimuladores de linfocito T y/o una actividad antagonista aumentada de receptores inhibidores. Una capacidad incrementada para estimular una respuesta inmunitaria, o el sistema inmunitario puede estar reflejada por un incremento de la CE50 o el nivel máximo de actividad en un ensayo que mide una respuesta inmunitaria, por ejemplo, un ensayo que mide los cambios en la liberación de citoquina o quimiocina, la actividad citolítica (determinada directamente en células diana o indirectamente detectando CD107a o granzimas) y la proliferación. La capacidad para estimular una respuesta inmune o la actividad del sistema inmunitario se puede aumentar en al menos un 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 2 veces, 3 veces, 5 veces o más.
"Inmunoterapia" se refiere al tratamiento de un sujeto afectado por, o está en riesgo de contraer o padecer una recurrencia de, una enfermedad mediante un método que comprende inducir, aumentar, suprimir o modificar de otro modo modificar una respuesta inmunitaria.
"Terapia inmunoestimulante" o "terapia inmunoestimuladora" se refiere a una terapia que da como resultado el incremento (inducción o aumento) de una respuesta inmunitaria en un sujeto para, por ejemplo, tratar el cáncer. "Potenciar una respuesta inmunitaria endógena" quiere decir incrementar la efectividad o la potencia de una respuesta inmunitaria existente en un sujeto. El incremento en la efectividad y la potencia se puede alcanzar, por ejemplo, dominando mecanismos que suprimen la respuesta inmunitaria hospedadora endógena o estimulando los mecanismos que aumentan la respuesta inmunitaria hospedadora endógena.
Linfocitos "T efectores" ("Teff") se refiere a linfocitos T (por ejemplo linfocitos T CD4+ y CD8+) con actividades citolíticas así como células auxiliares T (Th), que secretan citoquinas y activan y dirigen otras células inmunitarias, pero no incluyen linfocitos T reguladores (células Treg).
Como se usa en el presente documento, el término "unido" se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace también puede ser genético (es decir, fusionado recombinantemente). Tales enlaces se pueden conseguir usando una amplia diversidad de técnicas reconocidas en la materia, tales como la conjugación química y la producción de proteína recombinante.
Como se usa en el presente documento, "administrar" se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente terapéutico a un sujeto, usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de liberación conocidos por los expertos en la técnica. Vías de administración preferidas para los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión, así como electroporación in vivo. Como alternativa, un anticuerpo descrito en el presente documento se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, por vía oral, por vía vaginal, rectal, sublingualmente o tópicamente. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
Como se usa en el presente documento, el término "respuesta linfocito T mediada " se refiere a una respuesta mediada por linfocitos T, incluyendo los linfocitos T efectores (por ejemplo, CD8+) y linfocitos T auxiliares (por ejemplo, CD4+). Las respuestas mediadas por linfocito T incluyen, por ejemplo, citotoxicidad y proliferación de linfocito T.
Como se usa en el presente documento, el término "respuestas de linfocito T citotóxico (CTL)" se refiere a una respuesta inmunitaria inducida por linfocitos T citotóxicos. Las respuestas CTL están mediadas por linfocitos T CD8+.
C o m o se u sa en e l p re s e n te d o c u m e n to , lo s té rm in o s " in h ib e " o "b lo q u e a " (p o r e je m p lo , en re fe re n c ia a la in h ib ic ió n /b lo q u e o d e la u n ió n o a c t iv id a d d e C D 73 ) se u s a d e m a n e ra in te rc a m b ia b le y a b a rc a ta n to in h ib ic ió n /b lo q u e o p a rc ia l o c o m p le to .
C o m o se u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , "C á n c e r " se re f ie re a un a m p lio g ru p o d e d iv e rs a s e n fe rm e d a d e s c a ra c te r iz a d a s p o r e l c re c im ie n to in c o n tro la d o d e c é lu la s a n o rm a le s e n e l c u e rp o . L a d iv is ió n c e lu la r n o re g u la d a d a n c o m o re s u lta d o la fo rm a c ió n d e tu m o re s o c é lu la s m a lig n a s q u e in v a d e n lo s te j id o s v e c in o s y ta m b ié n p u e d e n h a c e r m e tá s ta s is a p a r te s d is ta n te s d e l c u e rp o a t ra v é s d e l s is te m a lin fá t ic o o d e l to r re n te s a n g u ín e o .
L o s té rm in o s " t ra ta r" , " q u e t ra ta " y " t ra ta m ie n to " , c o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , s e re f ie re n a c u a lq u ie r t ip o d e in te rv e n c ió n o p ro c e s o re a liz a d o en , o a d m in is tra c ió n d e un a g e n te a c t iv o a, e l s u je to c o n e l o b je t iv o d e in v e rtir , a liv ia r , m e jo ra r , in h ib ir o f r e n a r o p re v e r la p ro g re s ió n , d e s a rro llo , g ra v e d a d o re c u r re n c ia d e un s ín to m a , c o m p lic a c ió n , a fe c c ió n o in d ic io s b io q u ím ic o s a s o c ia d o s c o n u n a e n fe rm e d a d . L a p ro f ila x is se re f ie re a la a d m in is t ra c ió n a un s u je to q u e n o t ie n e u n a e n fe rm e d a d , p a ra p re v e n ir q u e o c u rra la e n fe rm e d a d o m in im iz a r su s e fe c to s si lo s h ay .
U n a " m a lig n id a d h e m a to ló g ic a " in c lu y e un lin fo m a , le u c e m ia , m ie lo m a o u n a m a lig n id a d lin fo id e , a s í c o m o un c á n c e r d e l b a z o y lo s n ó d u lo s lin fá t ic o s . L in fo m a s i lu s tra t iv o s in c lu y e n ta n to lin fo m a s d e l in fo c ito s B c o m o lin fo m a s d e lin fo c ito T . L o s lin fo m a s d e lin fo c ito B in c lu y e n ta n to lin fo m a s d e H o d g k in c o m o la m a y o r ía d e lo s lin fo m a s d e no H o d g k in . E je m p lo s n o lim ita n te s d e lo s lin fo m a s d e l in fo c ito B in c lu y e n lin fo m a d e lin fo c ito B g ra n d e d ifu s o , lin fo m a fo lic u la r , lin fo m a d e te j id o lin fá t ic o a s o c ia d o a m u c o s a , l in fo m a l in fo c í t ic o d e c é lu la p e q u e ñ a (s u p e rp o s ic io n e s c o n la le u c e m ia lin fo c í t ic a c ró n ic a ) , lin fo m a d e c é lu la s d e l m a n to (M C L ) , l in fo m a d e B u rk it t , lin fo m a m e d ia s t ín ic o d e l in fo c ito s B g ra n d e s , m a c ro g lo b u lin e m ia d e W a ld e n s tro m , lin fo m a d e l in fo c ito s B d e z o n a m a rg in a l n o d a l, l in fo m a e s p lé n ic o d e la z o n a m a rg in a l, lin fo m a in t ra v a s c u la r d e lin fo c ito B g ra n d e , lin fo m a d e d e rra m e p r im a r io , g ra n u lo m a to s is lin fo m a to id e . E je m p lo s n o l im ita n te s d e l in fo m a s d e lin fo c ito T in c lu y e n lin fo m a e x tra n o d a l d e lin fo c ito T , lin fo m a c u tá n e o d e lin fo c ito T , lin fo m a a n a p lá s ic o d e c é lu la s g ra n d e s , y lin fo m a a n g io in m u n o b lá s ic o d e lin fo c ito T. L a m a lig n id a d e s h e m a to ló g ic a s ta m b ié n in c lu y e n le u c e m ia , ta le s c o m o , p e ro s in l im ita c ió n , le u c e m ia s e c u n d a r ia , le u c e m ia lin fo c í t ic a c ró n ic a , le u c e m ia m ie ló g e n a a g u d a , le u c e m ia m ie ló g e n a c ró n ic a , y le u c e m ia l in fo b lá s ic a a g u d a . L a s m a lig n id a d e s h e m a to ló g ic a s in c lu y e n a d e m á s m ie lo m a s , ta le s c o m o , p e ro s in l im ita c ió n , m ie lo m a m ú lt ip le y m ie lo m a m ú lt ip le la te n te . O tro s c á n c e re s h e m a to ló g ic o s o a s o c ia d o s a lin fo c ito B o lin fo c ito T e s tá n a b a rc a d o s p o r e l té rm in o m a lig n id a d h e m a to ló g ic a .
L a e x p re s ió n "d o s is e f ic a z " o "d o s if ic a c ió n e f ic a z " s e d e f in e c o m o u n a c a n t id a d s u f ic ie n te p a ra c o n s e g u ir o c o n s e g u ir a l m e n o s p a rc ia lm e n te un e fe c to d e s e a d o . U n a "c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z " o "d o s if ic a c ió n te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z " d e un fá rm a c o o a g e n te te ra p é u t ic o e s c u a lq u ie r c a n t id a d d e l fá rm a c o q u e , c u a n d o se u sa s o lo o en c o m b in a c ió n c o n o tro a g e n te te ra p é u t ic o , p ro m u e v e la re g re s ió n d e la e n fe rm e d a d e v id e n c ia d a p o r un d e s c e n s o en la g ra v e d a d d e lo s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d , un a u m e n to en la f re c u e n c ia y d u ra c ió n d e lo s p e r ío d o s lib re s d e s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d , o u n a p re v e n c ió n d e l e m p e o ra m ie n to o d is c a p a c id a d d e b id o a la e n fe rm e d a d . U n a "c a n t id a d p ro f ilá c t ic a m e n te e f ic a z " o u n a "d o s if ic a c ió n p ro f ilá c t ic a m e n te e f ic a z " d e un fá rm a c o e s u n a c a n t id a d d e l fá rm a c o q u e , c u a n d o se a d m in is tra s o lo o en c o m b in a c ió n c o n o tro a g e n te te ra p é u t ic o a un s u je to en r ie s g o d e d e s a r ro l la r u n a e n fe rm e d a d o d e p a d e c e r u n a re c u r re n c ia d e la e n fe rm e d a d , in h ib e e l d e s a r ro l lo o la re c u r re n c ia d e la e n fe rm e d a d . L a c a p a c id a d d e u n a g e n te te ra p é u t ic o o p ro f i lá c t ic o p a ra p ro m o v e r la re g re s ió n d e la e n fe rm e d a d o in h ib ir e l d e s a rro llo o re c u r re n c ia d e la e n fe rm e d a d se p u e d e e v a lu a r u s a n d o d iv e rs o s m é to d o s c o n o c id o s p o r los p ro fe s io n a le s , ta l c o m o en s u je to s h u m a n o s d u ra n te e n s a y o s c lín ic o s , en s is te m a s d e m o d e lo s a n im a le s q u e p re d ic e n la e f ic a c ia e n s e re s h u m a n o s , o a n a liz a n d o la a c t iv id a d d e l a g e n te e n e n s a y o s in vitro.
A m o d o d e e je m p lo , un a g e n te a n t i-c á n c e r e s un fá rm a c o q u e fre n a la p ro g re s ió n d e l c á n c e r o p ro m u e v e la re g re s ió n d e l c á n c e r e n u n s u je to . E n re a liz a c io n e s p re fe r id a s , u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z d e l fá rm a c o p ro m u e v e la re g re s ió n d e l c á n c e r h a s ta e l p u n to d e e lim in a r e l c á n c e r. " P ro m o v e r la re g re s ió n d e l c á n c e r" s ig n if ic a q u e la a d m in is tra c ió n d e u n a c a n tid a d e f ic a z d e l fá rm a c o , s o lo o en c o m b in a c ió n c o n un a g e n te a n t i-n e o p lá s ic o ,, d a c o m o re s u lta d o u n a re d u c c ió n e n e l c re c im ie n to d e l tu m o r o e l ta m a ñ o , n e c ro s is d e l tu m o r , un d e s c e n s o e n la g ra v e d a d d e a l m e n o s un s ín to m a d e la e n fe rm e d a d , un in c re m e n to e n la f r e c u e n c ia y la d u ra c ió n d e lo s p e r io d o s s in s ín to m a d e e n fe rm e d a d , u n a p re v e n c ió n d e d e f ic ie n c ia o d is c a p a c id a d d e b id o a la e n fe rm e d a d , o d e o tra m a n e ra m e jo ra d e lo s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d en e l p a c ie n te . L a e f ic a c ia fa rm a c o ló g ic a se re f ie re a la c a p a c id a d d e l fá rm a c o d e p ro m o v e r la re g re s ió n d e l c á n c e r en e l p a c ie n te . L a s e g u r id a d f is io ló g ic a se re f ie re a un n iv e l a c e p ta b le m e n te b a jo d e la to x ic id a d , u o tro s e fe c to s f is io ló g ic o s a d v e rs o s a l n iv e l c e lu la r , d e ó rg a n o y /u o rg a n is m o (e fe c to s a d v e rs o s ) re s u lta n te s d e la a d m in is tra c ió n d e l fá rm a c o .
A m o d o d e e je m p lo p a ra e l t ra ta m ie n to d e tu m o re s , u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z o d o s is d e l fá rm a c o p re fe re n te m e n te in h ib e e l c re c im ie n to c e lu la r o e l c re c im ie n to tu m o ra l e n a l m e n o s un 20 % , m á s p re fe re n te m e n te en a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 40 % , in c lu s o m á s p re fe re n te m e n te en a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 60 % , y a ú n m á s p re fe re n te m e n te en a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te un 80 % en re la c ió n c o n s u je to s n o tra ta d o s . E n las re a liz a c io n e s m á s p re fe r id a s , u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z o d o s is d e l fá rm a c o in h ib e c o m p le ta m e n te el c re c im ie n to c e lu la r o e l c re c im ie n to tu m o ra l, e s d e c ir , p re fe re n te m e n te in h ib e e l c re c im ie n to c e lu la r o e l c re c im ie n to a l 100 % . L a c a p a c id a d d e un c o m p u e s to p a ra in h ib ir e l c re c im ie n to tu m o ra l se p u e d e e v a lu a r u s a n d o lo s e n s a y o s d e s c r ito s infra. C o m o a lte rn a t iv a , e s ta p ro p ie d a d d e u n a c o m p o s ic ió n se p u e d e e v a lu a r e x a m in a n d o la c a p a c id a d d e l compuesto para inhibir el crecimiento tumoral, tal inhibición se puede medir in vitro por ensayos conocidos por los profesionales. En otras realizaciones preferidas descritas en el presente documento, se puede observar la regresión tumoral y puede continuar durante un período de al menos aproximadamente 20 días, más preferentemente al menos aproximadamente 40 días, o incluso más preferentemente al menos aproximadamente 60 días.
Los términos "paciente" y "sujeto" se refieren a cualquier animal humano o no humano que recibe tratamiento profiláctico o terapéutico. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para tratar un sujeto que tiene cáncer. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Diversos aspectos descritos en el presente documento se describen en más detalle en las siguientes subsecciones.
I. Anticuerpos anti-CD73
En el presente documento se describen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos completamente humanos, los cuales se caracterizan por características funcionales particulares o propiedades. Por ejemplo, los anticuerpos específicamente se unen a CD73 humana. Además, los anticuerpos pueden reaccionar de manera cruzada con CD73 de uno o más primates no humanos, tales como CD73 de cynomolgus.
Además de unirse específicamente a CD73 humana soluble y/o unida a membrana, los anticuerpos descritos en el presente documento presentan una o más de las siguientes propiedades funcionales:
(a) inhibición de la actividad enzimática de CD73, dando como resultado una reducción de la adenosina producida;
(b) unión a CD73 cyno;
(c) internalización de CD73 mediada por anticuerpo en las células, por ejemplo, células tumorales; y
(d) unión a un epítopo conformacional que comprende los aminoácidos 65-83 y 157-172 de CD73 humana. Preferentemente, los anticuerpos anti-CD73 se unen a CD73 humana (monomérica o dimérica; isoforma 1 o 2) con alta afinidad, por ejemplo, con una Kd de 10'7 M o menos, 10'8 M o menos, 10'9 M o menos, 10'1° M o menos, 10'11 M o menos, 10-12 M o menos, 10-12 M a 10-7 M, 10-11 M a 10-7 M, 10'1° M a 10-7 M, 10-9 M a 10-7 M, o 10'1° M a 10-8 M. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 se une a CD73 humana soluble, por ejemplo, como se determina mediante análisis SPR de BIACORE®, con una Kd de 10'7 M o menos, 10'8 M o menos, 10'9 M (1 nM) o menos, 10'1° M o menos, 10-12 M a 10-7 M, 10-11 M a 10-7 M, 10'1° M a 10-7 M, 10-9 M a 10-7 M, 10-8 M a 10-7 M o 10'1° M a 1°'8 M. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73, se une a CD73 humana unida (por ejemplo, unida a membrana celular, por ejemplo, células Calu6), por ejemplo, determinada como se describe además en el presente documento, con una CE5° de menor que 1 nM. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 se une a CD73 humana unida, por ejemplo, CD73 humana unida a membrana celular, por ejemplo, determinado mediante citometría de flujo y gráfico de Scatchard, con una Kd de 1°'7 M o menos, 1°'8 M o menos, 1°'9 M (1 nM) o menos, 1°-1° M o menos, 1°-12 M a 1°-7 M, 1°-11 M a 1°-8 M, 1°-1° M a 1°-8 M, 1°-9 M a 1°-8 M, 1°-11 M a 1°-9 M, 1°-1° M a 1°'8 M, o 10■10 M a 1°'9 M. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 se une a CD73 humana soluble con una Kd de 1°'7 M o menos, 1°'8 M o menos, 1°'9 M (1 nM) o menos, 10■10 M o menos, 1°'12 M a 1°'7 M, 1°-11 M a 1°-7 M, 1°-1° M a 1°-7 M, 1°-9 M a 1°-7 M, 1°-1° M a 1°-8 M, o 1°-8 M a 1°-7 M, y a CD73 humana unida, por ejemplo, CD73 humana unida a membrana celular, con una Kd o CEsü de 1°'7 M o menos, 1°'8 M o menos, 1°'9 M (1 nM) o menos, 1°-1° M o menos, 1°-12 M a 1°-7 M, 1°-11 M a 1°-8 M, 1°-1° M a 1°-8 M, 1°-9 M a 1°-8 M, 1°-11 M a 1°-9 M, o 1°-1° M a 1°-9 M.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 se une a CD73 cyno con alta afinidad, por ejemplo, se une a una célula CHO que expresa CD73 cyno con una CE5° de °,1 nM to 1° nM, tal como una CE5° de menos de 1 nM, como se determina, por ejemplo, como se describe además en el presente documento.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento también se unen a CD73 de cynomolgus, por ejemplo, se unen a CD73 de cynomolgus unida a membrana, por ejemplo, a una célula CHO que expresa CD73 cyno con una CEsü de 1°° nM o menos, 1° nM o menos, 1 nM o menos, 1°° nM a °,°1 nM, 1°° nM a °,1 nM, 1°° nM a 1 nM, o 1° nM a °,1 nM, como se mide, por ejemplo, en los Ejemplos.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 son al menos 9° %, 95 %, 98 % o 99 % monoméricos, como se determina, por ejemplo, mediante SEC. Los anticuerpos anti-CD73 también pueden tener características biofísicas que son similares a, o están dentro del rango de, aquellas de los anticuerpos descritos en el presente documento.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 inhiben la actividad enzimática de CD73 humana y/o cyno, por ejemplo, como se determina en los ensayos unidos a perla de CD73, o como se determina en células, por ejemplo, Calu6, SKMEL24 o H292, o como se determina en un ensayo in vivo, por ejemplo, un modelo de tumor de xenoinjerto, por ejemplo, como se describe además en los Ejemplos. Los anticuerpos anti-CD73 pueden tener actividades inhibidoras que son al menos similares a, o están dentro del rango de, aquellas de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD73 pueden inhibir la actividad enzimática CD73 humana (por ejemplo, CD73 unida a un sólido) (producción de adenosina) con una CE50 de menos de 10 nM o menos de 5 nM o en el rango de 1 a 10 nM o 5 a 10 nM. Los anticuerpos anti-CD73 pueden inhibir la actividad de CD73 humana en células, por ejemplo, células Calu6 con una CE50 de menos de 10 nM o menos de 1 nM o en el intervalo de 0,1 a 10 nM, 0,1 a 1 nM, o 0,1 a 0,5 nM.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se internalizan (y median la internalización de CD73) por una célula a la cual se une como se determina, por ejemplo, en un ensayo de internalización de alto contenido o mediante FACS o citometría de flujo, como se describe además en los Ejemplos. Los anticuerpos anti-CD73 pueden tener características de internalización (CE50, T1/2 e Ymáx), y el tiempo hasta la meseta que son al menos similares a, o están dentro del rango de, aquellos de los anticuerpos descritos en los Ejemplos. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD73 tiene un T1/2 de internalización que es menor que 1 hora, tal como menor que 30 minutos, menor que 15 minutos, menor que 12 minutos, menor que 10 minutos, menor que 7 minutos o incluso menor que 5 minutos en una o más líneas celulares, por ejemplo, aquellas expuestas en los Ejemplos, como se determina, por ejemplo, en un ensayo de internalización de alto contenido (descrito en el Ejemplo 6A). En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-CD73 alcanza la internalización mediada por anticuerpo anti-CD73 en 10 minutos o menos, 6 horas o menos, 5 horas o menos, 4 horas o menos, 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, por ejemplo, en el intervalo de 10 minutos a 10 horas, 10 minutos a 6 horas, 1 hora a 10 horas o 1 hora a 6 horas, como se determina, por ejemplo, usando un ensayo de internalización de alto contenido, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 6a o usando citometría de flujo, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 6B. El nivel máximo de internalización de CD73 mediada por anticuerpo anti-CD73 puede ser de al menos 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos 90 % o más, dependiendo del tipo de célula. Por ejemplo, la CE50 de la internalización de CD73 mediada por anticuerpo anti-CD73 en células Calu6, como se mide en el ensayo de internalización de alto contenido descrito en los Ejemplos, puede ser menor que 10 nM, por ejemplo, de 0,1 to 10 nM o 1 a 10 nM o 1 a 5 nM y una Ymáx de al menos 90 % o al menos 95 %.
Los anticuerpos anti-CD73, por ejemplo, los anticuerpos que tienen una bisagra de IgG2, dominio CH1 de IgG2, o bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2, puede mediar las siguientes características de internalización de CD73 como se mide en un ensayo de internalización de alto contenido, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 6A: - CE50 de 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos, o 0,1 a 10 nM o 0,1 a 1 nM; una Ymáx (porcentaje máximo de internalización) de al menos 90 %, 95 % o 98 % en células Calu6 y una T1/2 de menos de 30 minutos o menos de 10 minutos en células Calu6;
- Un T1/2 de menos de 30 minutos o menos de 10 minutos en células humanas, por ejemplo, células Calu6, células HCC44, células H2030, células H2228, células HCC15, células SKLU1, células SKMES1 o células SW900.
Los anticuerpos anti-CD73, por ejemplo, los anticuerpos que tienen una bisagra de IgG2, dominio CH1 de IgG2, o bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2, pueden mediar las siguientes características de internalización de CD73 medidas mediante citometría de flujo, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 6B:
- Un T1/2 de 1 hora o menos y una Ymáx de al menos 70 % en células Calu6;
- Un T1/2 de 30 minutos o menos y una Ymáx de al menos 70 % en células NCI-H292;
- Un T1/2 de 2 horas o menos y una Ymáx de al menos 30 % en células SNUC1; y/o
- Un T1/2 de 30 minutos o menos y una Ymáx de al menos 60 % en células NCI-H1437.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 es un anticuerpo bin1, es decir, compite por unirse a CD73 humana con 11F11, pero no con 4C3.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se unen a un epítopo, por ejemplo, un epítopo conformacional en la porción N-terminal de CD73 humana, por ejemplo, un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 65-83 de CD73 humana (SEQ ID NO: 96) determinado, por ejemplo, mediante HDX-MS, como se describe además en los Ejemplos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se unen a los aminoácidos 157-172 de CD73 humana (SEQ ID NO: 97), o a un epítopo localizado dentro de los aminoácidos 157­ 172, de CD73 humana (SEQ ID NO: 97), determinado, por ejemplo, mediante HDX-MS. Como alternativa, los anticuerpos anti-CD73 se unen a un epítopo, por ejemplo, un epítopo discontinuo en la porción N-terminal de CD73 humana, como se determina, por ejemplo, mediante h DX-MS.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se unen a los aminoácidos 65 a 83 y los aminoácidos 157­ 172 de CD73 humana, o a un epítopo dentro de los aminoácidos 65 a 83 y los aminoácidos 157-172, de isoforma 1 o 2 de CD73 humana, es decir, las secuencias de aminoácidos FTKv Qq IRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) y LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97), como se determina mediante, por ejemplo, HDX-MS. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se unen a todos o una parte de los aminoácidos 65 a 83 y los aminoácidos 157-172 de CD73 humana, como se determina mediante, por ejemplo, HDX-MS. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se unen a tanto CD73 humana glicosilada como no glicosilada. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 se unen únicamente a CD73 glicosilada y no a CD73 no glicosilada.
Los anticuerpos anti-CD73 pueden competir por la unión a CD73 con (o inhibir la unión de) anticuerpos anti-CD73 que comprenden CDR o regiones variables descritas en el presente documento, por ejemplo, aquellas de CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 inhiben la unión de CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 y/o 7A11 CD73 humanos en al menos un 10%, 20%, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. En determinadas realizaciones, CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11 inhiben la unión de anticuerpos anti-CD73 a CD73 humana en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 inhiben la unión de CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11 a CD73 humana en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 % o 100 % y CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11 inhiben la unión de anticuerpos anti-CD73 a CD73 humana en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90% o 100 % (por ejemplo, compiten en ambas direcciones). Los experimentos de competición se pueden realizar, por ejemplo, como se describe además en el presente documento, por ejemplo, en los Ejemplos.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 inhiben la actividad enzimática de CD73 y/o se internalizan en células sin requerir entrecruzamiento multivalente, como se determina, por ejemplo, por la carencia de requerimiento de unión a FcR.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, u 11 de las características enumeradas en la Tabla 3.
Tabla 3: Características potenciales de los anticuerpos anti-CD73
(1) unión a CD73 humana, por ejemplo, isoforma 1 y 2 de CD73 humana monomérica y dimérica humana unida a perla, por ejemplo, con una Kd de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM a 10 nM), por ejemplo, como se mide mediante análisis SPR de BIACORE®;
(2) unión a CD73 humana unida a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 1 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM a 1 nM);
(3) unión a CD73 de cynomolgus, por ejemplo, unión a CD73 de cynomolgus unida a membrana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos (por ejemplo, 0,01 nM a 10 nM);
(4) inhibición de la actividad enzimática de CD73 humana, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos;
(5) inhibición de la actividad enzimática de CD73 cyno, por ejemplo, con una CE50 de 10 nM o menos;
(6) inhibición de la actividad enzimática de CD73 humana endógena (celular) en células Calu6 con una CE50 de 10 nM o menos;
(7) inhibición de la actividad enzimática de CD73 humana in vivo;
(8) internalización, por ejemplo, internalización de CD73 mediada (o dependiente) por anticuerpo, en células, por ejemplo, con un T1/2 de menos de 1 hora, 30 minutos o 10 minutos y/o una Ymáx de al menos 70 %, 80 % o 90 %;
(9) unión a un epítopo conformacional en CD73 humana, por ejemplo, un epítopo discontinuo dentro de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que incluye todos o una parte de los restos de aminoácidos FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) y/o LYLPYKVLPVGDEVVG (SEQ ID NO: 97);
(10) competición en una dirección o ambas direcciones para la unión a CD73 humana con CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11; y
(11) interacción con CD73 humana en un patrón similar a CD73.4, como se determina mediante cristalografía por rayos X.
Una actividad de anticuerpo que presenta una o más de estas propiedades funcionales (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras biológicas, o similares) como se determinan según las metodologías conocidas en la técnica y se describen en el presente documento, se entenderá que se refiere a una diferencia estadísticamente significativa en la actividad particular en relación a la vista en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando un anticuerpo control de especificidad irrelevante está presente). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento desciende un parámetro medido (por ejemplo, volumen tumoral, metástasis tumoral, niveles de adenosina, niveles de cAMP) en al menos un 10 % del parámetro medido, más preferentemente al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % y en ciertas realizaciones preferidas, en más de un 92%, 94 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 %. Por el contrario, un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento incrementa un parámetro medido en al menos un 10 %, tal como al menos un 20%, o, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % (es decir, 2 veces), 3 veces, 5 veces o 10 veces.
Los ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia CD73 de diversas especies son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, y RIA. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. Las cinéticas de unión (por ejemplo, la afinidad de unión) de los anticuerpos también se pueden evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como análisis SPR BIACORE®. Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de CD73 (por ejemplo, la producción de adenosina, el crecimiento tumoral y la metástasis, la inhibición de los linfocitos T) se describen a más detalle infra y en los Ejemplos.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 no son anticuerpos nativos o no son anticuerpos de origen natural. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD73 tienen modificaciones postraduccionales que son diferentes de las de los anticuerpos que son de origen natural, tal como teniendo más, menos o un tipo diferente de modificación postraducción.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 estimulan la función de Teff (T efector) y/o reduce la función de Treg, por ejemplo, eliminando CD73 de la superficie del linfocito T y/o inhibiendo su actividad enzimática.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 comprenden al menos una bisagra de IgG2, y opcionalmente también un dominio CH1 de IgG2 o fragmento o derivado de la bisagra y/o dominio CH1 y la forma A del anticuerpo (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3.755). En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 comprenden al menos una bisagra de IgG2, y opcionalmente también un dominio CH1 de IgG2 o fragmento o derivado de la bisagra y/o dominio CH1 y el anticuerpo ha adoptado la forma B (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3.755). En determinadas realizaciones una composición comprende una mezcla de anticuerpos anti-CD73 con forma A y anticuerpos anti-CD73 con forma B.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-CD73 humana que (i) comprenden una región variable que se une a una región en la CD73 humana que es similar a la unida a 11F11, pero no se une a una región que es similar a la unida por 4C3 (es decir, es un anticuerpo bin1); (ii) se unen a CD73 humana monomérica y dimérica con una Kd de 10 nM o menos; (iii) inhiben la actividad enzimática (conversión de AMP a adenosina) de CD73 humana, por ejemplo, en células, por ejemplo, células Calu6, con una CE50 de menos de 10 nM; y (iv) median la internalización de CD73 dependiente de anticuerpo en células, por ejemplo, con un T1/2 de 1 hora o menos (o 30 minutos o menos, o 10 minutos o menos), una Ymáx de 50 % o más (o 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más o 90 % o más) en células humanas, por ejemplo, células Calu6, células H2228, células HCC15 células H2030, células SNUC1. En determinadas realizaciones, los anticuerpos comprende una bisagra de IgG2 o una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2. En el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-CD73 humana que (i) comprenden una región variable que se une a una región en la CD73 humana que es similar a la unida a 11F11, pero no se une a una región que es similar a la unida por 4C3 (es decir, es un anticuerpo bin1); (ii) se unen a CD73 humana monomérica y dimérica con una Kd de 10 nM o menos, como se determina mediante SPR (Biacore); (iii) inhiben la actividad enzimática (conversión de AMP a adenosina) de CD73 humana, por ejemplo, en células, por ejemplo, células Calu6, con una CE50 de menos de 10 nM; y (iv) median la internalización de c D73 dependiente de anticuerpo en células, por ejemplo, con un T1/2 de 30 minutos o menos, un Ymáx de 80 % o más en células Calu6, H2228, HCC15 o H2030 humanas, determinado usando el ensayo de internalización de alto contenido descrito en el Ejemplo 6A.
En realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento no es significativamente tóxico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD73 no es significativamente tóxico a un órgano de un ser humano, por ejemplo, uno o más del hígado, riñón, cerebro, pulmones y corazón, como se determina, por ejemplo, en ensayos clínicos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 no desencadena significativamente una respuesta inmune no deseable, por ejemplo, autoinmunidad o inflamación.
II. Anticuerpos anti-CD73 ilustrativos
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD73 aislados que comprenden secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y los que comprenden una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2. Además de los anticuerpos anti-CD73 de la invención, la divulgación también proporciona otros anticuerpos anti-CD73 ilustrativos.
Regiones variables de los anticuerpos anti-CD73
Los anticuerpos particulares descritos en el presente documento son los anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que tienen las secuencias de CDR y/o región variable de los anticuerpos 11F11-1, 11F11 -2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11, 7A11, CD73.3-1, -2 o -3, CD73.4-1 y -2, CD73.4-2, CD73.5-1 y -2, CD73.6-1 y -2, CD73.7-1 y -2, CD73.8-1 y -2, CD73.9-1 y -2, CD73.10-1 y -2 y CD73.11, así como los anticuerpos que tienen al menos un 80 % de identidad (por ejemplo, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 % de identidad) con las secuencias de su región variable o CDR. Los anticuerpos de la invención son anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, que tienen las secuencias de CDR y/o región variable de los anticuerpos 11F11-2, c D73.4-2 y c D73.5-2. La Tabla 4 expone las SEQ ID NO de las CDR de las regiones VH y VL de cada anticuerpo, así como la de las regiones VH y VL. Como se describe además en los Ejemplos, determinadas cadenas pesadas pueden existir con más de una cadena ligera, y las SEQ ID NO de las cadenas ligeras alternas también se proporcionan en la Tabla de a continuación.
Tabla 4:
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En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera, en los que la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, y 170-177.
También se proporcionan anticuerpos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera, en los que la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92 y 238. En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, o una porción de unión a antígeno de los mismos, que comprenden:
(a) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 135 y 8, respectivamente;
(b) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 135 y 12, respectivamente;
(c) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 4 y 8, respectivamente;
(d) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 4 y 12, respectivamente;
(e) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 16 y 20, respectivamente;
(f) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 16 y 24, respectivamente;
(g) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 16 y 28, respectivamente;
(h) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 32 y 36, respectivamente;
(i) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 40 y 44, respectivamente;
(j) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 40 y 48, respectivamente;
(k) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 52 y 56, respectivamente;
(l) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 60 y 64, respectivamente;
(m) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 68 y 72, respectivamente;
(n) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 68 y 76, respectivamente;
(o) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 68 y 238, respectivamente;
(p) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 80 y 84, respectivamente;
(q) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 88 y 92, respectivamente;
(r) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 170 y 20, respectivamente;
(s) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 170 y 24, respectivamente;
(t) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 170 y 28, respectivamente;
(u) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 171 y 8, respectivamente;
(v) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 171 y 12, respectivamente;
(w) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 172 y 8, respectivamente;
(x) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 172 y 12, respectivamente;
(y) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 173 y 8, respectivamente;
(z) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 173 y 12, respectivamente;
(a2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 174 y 8, respectivamente;
(b2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 174 y 12, respectivamente;
(c2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 175 y 8, respectivamente;
(d2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 175 y 12, respectivamente;
(e2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 176 y 8, respectivamente;
(f2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 176 y 12, respectivamente; o
(g2) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 177 y 36, respectivamente.
En una realización de la invención, los anticuerpos aislados comprenden
(a) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 135 y 12, respectivamente;
(b) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 4 y 12, respectivamente; o
(c) las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que comprenden las SEQ ID NO: 171 y 12, respectivamente.
Los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento pueden comprender las CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento, por ejemplo, CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 11F11, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6,24H2, 5F8-1, 5F8-2, 5F8-3, 6E11 y 7A11, o combinaciones de los mismos. Los anticuerpos anti-CD73 de la invención comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y ligera del anti-CD73 CD73.4-2 u 11F11-2.
Dado que cada uno de estos anticuerpos se une a CD73 y que la especificidad de unión a antígeno se proporciona principalmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vh y las secuencias de Cd R1, 2 y 3 de Vl se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, 2 y 3 de Vh y una CDR1, 2 y 3 de Vl) para crear otras moléculas de unión a anti-CD73 descritas en el presente documento. La unión de CD73 de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" se pueden ensayar usando los ensayos de unión anteriormente descritos en los Ejemplos (por ejemplo ELISA). Preferentemente, cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH particular se reemplaza por una(s) secuencia(s) de CDR estructuralmente similares. Asimismo, cuando las secuencias de CDR de VL se mezclan y emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VL particular se reemplaza por una(s) secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Será fácilmente evidente a los expertos en la técnica que las novedosas secuencias Vh y Vl se pueden crear sustituyendo una o más secuencias de la región de c Dr de Vh y Vl con secuencias estructuralmente similares a las secuencias de CDR descritas en el presente documento para los anticuerpos monoclonales CD73.4-1, CD73.4-2, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11. Los anticuerpos "mezclados y emparejados" que tienen la afinidad de unión, la bioactividad y/o otras propiedades equivalentes o superiores a los anticuerpos específicos descritos en el presente documento se pueden seleccionar para su uso en los métodos descritos en el presente documento.
En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados, o una porción de unión a antígeno de los mismos, que comprenden:
(a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89;
(b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90;
(c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91;
(d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, y 93; (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, y 94; y (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, y 95; en el que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 5-7; 17­ 19; 33-35; 41-43; 53-55; 61-63; 69-71; 81-83; o 89-91;
en el que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana. Los anticuerpos de la invención comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera, en los que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 5-7.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden:
(a) las SEQ ID NO: 9-11; 13-15; 21-23; 25-27; 29-31; 37-39; 45-47; 49-51; 57-59; 65-67; 73-75; 77-79; 85-87; o 93-95;
en el que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana. Los anticuerpos de la invención comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que las regiones CDR1, c DR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 13-15.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que: (a) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 5-7, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 9-11, respectivamente;
(b) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 5-7, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 13-15, respectivamente;
(c) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 17-19, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 21-23, respectivamente;
(d) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 17-19, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 25-27, respectivamente;
(e) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 17-19, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 29-31, respectivamente;
(f) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 33-35, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 37-39, respectivamente;
(g) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 41-43, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 45-47, respectivamente;
(h) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 41-43, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 49-51, respectivamente;
(i) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 53-55, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 57-59, respectivamente;
(j) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 61-63, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 65-67, respectivamente;
(k) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 69-71, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 73-75, respectivamente;
(l) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 69-71, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 77-79, respectivamente;
(m) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 81-83, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 85-87, respectivamente; o
(n) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprenden las SEQ ID NO: 89-91, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 93-95, respectivamente;
en las que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana.y opcionalmente tiene una o más de las características enumeradas en la Tabla 3, por ejemplo, la capacidad para inhibir la desfosforilación de AMP y para mediar la internalización de CD73 dependiente de receptor.
En determinadas realizaciones de la invención, el anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 5-7, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprenden las SEQ ID NO: 13-15, respectivamente;
en las que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana.y opcionalmente tiene una o más de las características enumeradas en la Tabla 3, por ejemplo, la capacidad para inhibir la desfosforilación de AMP y para mediar la internalización de CD73 dependiente de receptor.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que:
(a) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las
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EQ ID NO: 5-7, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 9-11, respectivamente;
(b) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las
Figure imgf000028_0002
EQ ID NO: 5-7, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 13-15, respectivamente;
(c) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 17-19, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 21-23, respectivamente;
(d) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 17-19, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 25-27, respectivamente;
(e) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 17-19, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 29-31, respectivamente;
(f) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 33-35, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 37-39, respectivamente;
(g) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 41-43, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 45-47, respectivamente;
(h) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 41-43, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 49-51, respectivamente;
(i) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 53-55, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 57-59, respectivamente;
(j) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 61-63, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 65-67, respectivamente;
(k) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 69-71, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 73-75, respectivamente;
(l) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 69-71, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 77-79, respectivamente;
(m) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 81-83, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 85-87, respectivamente; o
(n) CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 89-91, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 93-95, respectivamente;
en las que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana.y opcionalmente tiene una o más de las características enumeradas en la Tabla 3, por ejemplo, la capacidad para inhibir la desfosforilación de AMP y para mediar la internalización de CD73 dependiente de receptor.
En determinadas realizaciones de la invención, el anticuerpo comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera, en el que las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada consisten en las SEQ ID NO: 5-7, respectivamente, y CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena ligera consisten en las SEQ ID NO: 13-15, respectivamente;
en las que el anticuerpo se une específicamente a CD73 humana.y opcionalmente tiene una o más de las características enumeradas en la Tabla 3, por ejemplo, la capacidad para inhibir la desfosforilación de AMP y para mediar la internalización de CD73 dependiente de receptor.
Dominios constantes de la cadena pesada de los anticuerpos anti-CD73
la región constante de la cadena pesada de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 o combinaciones de los mismos y/o modificaciones de los mismos. Un anticuerpo anti-CD73 puede tener función efectora o puede no tener función efectora o reducida. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento comprenden una región constante de la cadena pesada modificada que proporciona propiedades aumentadas al anticuerpo. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos anti-CD73 que tienen una bisagra de IgG2 y opcionalmente un dominio CH1 de IgG2, tales como los que tienen las regiones variables del anticuerpo 11F11, se internalizan mejor y más rápido en relación a los anticuerpos que tienen la misma región variable pero con una bisagra o CH1 de no IgG2, por ejemplo, en relación a los anticuerpos que tienen una bisagra de IgG1 o una bisagra de IgG1 y CH1 de IgG1. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende las regiones variables del anticuerpo 11F11 y que comprende una bisagra de IgG2 y opcionalmente un CH1 de IgG2 y un CH2 de IgG1 y dominios CH3 de IgG1, y si con o sin función efectora, se internaliza más eficazmente en las células tras la unión a CD73 en la membrana celular en relación al mismo anticuerpo, pero con una bisagra de IgG1 o un dominio bisagra de IgG1 y CH1 de IgG1. Como además se muestra en el presente documento, un anticuerpo de CD73 que tiene una bisagra de IgG2 y el resto del anticuerpo de un isotipo IgG1 se internaliza más eficazmente que el mismo anticuerpo en el que la bisagra es de un isotipo IgG1. Un anticuerpo que tiene, además de una bisagra de IgG2, un dominio CH1 de IgG2 internaliza incluso más eficazmente que el mismo anticuerpo en el que el dominio CH1 es un dominio CH1 de IgG1. Como además se muestra en el presente documento, los anticuerpos anti-CD73 con una bisagra de IgG2 y opcionalmente CH1 de IgG2 también forman complejos anticuerpo/antígeno mayores que los anticuerpos que tienen una bisagra de IgG1 o bisagra de IgG1 y CH1 de IgG1. La internalización incrementada parece correlacionarse con el tamaño incrementado del complejo anticuerpo/antígeno. Como se describe además en los Ejemplos, la internalización aumentada no parece estar asociada con una afinidad mayor o menor del anticuerpo. Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-CD73 que tienen una región constante de la cadena pesada modificada que media la internalización de CD73 mediada por anticuerpo, y en los que el anticuerpo con la región constante de la cadena pesada modificada se une a CD73 con una afinidad similar a la del mismo anticuerpo, pero con una región constante de la cadena pesada diferente.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo CD73 comprende una región constante de la cadena pesada modificada que comprende una bisagra del isotipo IgG2 (una "bisagra de IgG2") y un dominio CH1, CH2 y CH3. En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada comprende una bisagra de IgG2 y un dominio CH1, CH2 y CH3, en la que al menos uno del dominios CH1, CH2 y CH3 no es del isotipo IgG2. Los anticuerpos de la invención comprenden una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2. En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada modificada comprende una bisagra del isotipo IgG2, un CH1 del isotipo IgG2, en la que al menos uno de los dominios CH2 y CH3 no es del isotipo IgG2. La bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 tipo silvestre, por ejemplo, una bisagra de IgG2 humana tipo silvestre (por ejemplo, que tiene la SEQ ID NO: 136) o una variante de la misma, siempre que la bisagra de IgG2 conserve la capacidad para conferir al anticuerpo una actividad aumentada (por ejemplo, internalización incrementada por una célula; inhibición aumentada de la actividad enzimática; actividad antagonista o bloqueante mejorada; la capacidad para formar complejos grandes entrecruzados de anticuerpo/antígeno; capacidad incrementada para estimular o aumentar una respuesta; y/o efecto antiproliferativo o antitumoral incrementado) en relación al mismo anticuerpo que comprende una bisagra de no IgG2 y opcionalmente un dominio CH1 de no IgG2. En determinadas realizaciones, una variante de bisagra de IgG2 conserva rigidez o dureza similar a la de la bisagra de IgG2 tipo silvestre. La rigidez de una bisagra o un anticuerpo se puede determinar, por ejemplo, mediante modelado computarizado, microscopía electrónica, espectroscopia tal como Resonancia magnética nuclear (NMR), cristalografía por rayos X, (factores B), o ultracentrifugación analítica de la velocidad de sedimentación (AUC) para medir o comparar los radios de giro de los anticuerpos que comprende la bisagra. Una bisagra o anticuerpo puede tener rigidez similar o superior en relación con otra bisagra si un anticuerpo que comprende la bisagra tiene un valor obtenido de uno de los ensayos descritos en la frase anterior que difiere del valor del mismo anticuerpo con una bisagra diferente, por ejemplo, una bisagra de IgG1, en menos del 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 %. Un experto en la técnica será capaz de determinar a partir de los ensayos si una bisagra o un anticuerpo tiene al menos rigidez similar a la de otra bisagra o anticuerpo, respectivamente, interpretando los resultados de estos ensayos. Una variante de bisagra de IgG2 humana ilustrativa es una bisagra de IgG2 que comprende una sustitución de uno o más de los cuatro restos de cisteína (es decir, C219, C220, C226 y C229) con otro aminoácido. Una cisteína puede estar reemplazada por una serina. Una bisagra de IgG2 ilustrativa es una bisagra de IgG2 humana que comprende una mutación C219X o una mutación C220X, en la que X es cualquier aminoácido excepto serina. En una determinada realización, una bisagra de IgG2 no comprende tanto una sustitución C219X como una C220X. En determinadas realizaciones, una bisagra de IgG2 comprende C219S o C220S, pero no tanto C219S como C220S. Otras variantes de bisagra de IgG2 que se pueden usar incluyen bisagras de IgG2 humana que comprende la sustitución C220, C226 y/o C229, por ejemplo, una mutación C220S, C226S o C229S (la cual se puede combinar con una mutación C219S). Una bisagra de IgG2 también puede ser una bisagra de IgG2 en la cual una porción de la bisagra es la de otro isotipo (es decir, es una bisagra quimérica o híbrida), siempre que la rigidez de la bisagra quimérica es al menos similar a la de una bisagra de IgG2 tipo silvestre. Por ejemplo, una bisagra de IgG2 puede ser una bisagra de IgG2 en la que la bisagra inferior (como se define en la Tabla 2) es de un isotipo IgG1, y es, por ejemplo, una bisagra inferior de IgG1 tipo silvestre.
Una bisagra "híbrida" o "quimérica" se refiere que es un isotipo específico si más de la mitad de los aminoácidos consecutivos de la bisagra son de ese isotipo. Por ejemplo, una bisagra que tiene una bisagra superior y media de IgG2 y la bisagra inferior de IgG1 se considera que es una bisagra híbrida de IgG2.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo de CD73 comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de IgG2 que comprende las siguientes bisagras:
ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 348);
ERKSCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 349);
ERKCSVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 350);
ERKXCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 351);
ERKCXVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 352);
ERKCCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 353);
ERKSCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 354);
ERKCSVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 355);
ERKXCVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 356);
ERKCXVECPPCPAPPVAGX (SEQ ID NO: 357);
ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 358);
ERKSCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 359);
ERKCCSVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 360);
ERKXCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 361);
ERKCXVECPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 362);
ERKCCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 363);
ERKSCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 364);
ERKCCSVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 365);
ERKXCVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 366);
ERKCXVECPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 367);
ERKCCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 368);
ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 369);
ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID NO: 370);
ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID NO: 371); o
ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID NO: 372),
en las que X es cualquier aminoácido, excepto una cisteína,
o cualquiera de las anteriores secuencias, en las que 1-5, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido se inserta entre los restos de aminoácidos CVE y CPP. En determinadas realizaciones, se inserta THT o GGG.
En determinadas realizaciones, la bisagra comprende las SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, o 352, en las que 1,2, 3 o todos los 4 aminoácidos P233, V234, A235 y G237 (correspondientes a los 4 aminoácidos C-terminales "PVAG" (SEQ ID NO: 373) están delecionados o sustituidos por otro aminoácido, por ejemplo, los aminoácidos del extremo C de la bisagra de IgG1 (ELLG (SEQ ID NO: 374) o ELLGG (SEQ ID NO: 375). En determinadas realizaciones, la bisagra comprende las Se Q ID NO: 348, 349, 350, 351, o 352, en las que V234, A235 y G237 están delecionados o sustituidos por otro aminoácido. En determinadas realizaciones, la bisagra comprende las SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, o 352, en las que A235 y G237 están delecionados o sustituidos por otro aminoácido. En determinadas realizaciones, la bisagra comprende las SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, o 352, en las que G237 está delecionado o sustituido por otro aminoácido. En determinadas realizaciones, la bisagra comprende las SEQ ID NO: 348, 349, 350, 351, o 352, en las que V234 y A235 están delecionados o sustituidos por otro aminoácido. La sustitución de PVAG (SEQ ID NO: 373) en una IgG2 con los correspondientes aminoácidos de una bisagra de IgG1, es decir, (ELLG (SEQ ID NO: 374) o ELLGG (SEQ ID NO: 375)) para obtener una bisagra híbrida, por ejemplo, mostrado anteriormente, proporciona una bisagra que tiene las ventajas de una bisagra de IgG2 y la función efectora de las bisagras de IgG1.
En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada modificada comprende una bisagra que consiste esencialmente en una de las secuencias anteriormente mostradas, por ejemplo, una cualquiera de las s Eq ID NO: 348-372 y por ejemplo, no comprende restos de aminoácidos de bisagra adicional.
En determinadas realizaciones, 1 o 1-2 o 1-3 aminoácidos están insertados entre la bisagra y el dominio CH2, por ejemplo, se puede añadir una glicina adicional.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una IgG1 (no comprendida en los anticuerpos de la invención) o la región constante de IgG2, en el que la bisagra comprende una deleción de 1-10 aminoácidos. Como se muestra en los Ejemplos, un anticuerpo IgG1 que carece de los restos de aminoácidos SCDKTHT (S219, C220, D221, K222, T223, H224 y T225; SEQ ID NO: 376) confirió internalización de CD73 mediada por anticuerpo más eficazmente que el mismo anticuerpo que tiene una región constante de IgG1 tipo silvestre. Igualmente, en el contexto de un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG2 que carece de los restos de aminoácidos CCVE (C219, C220, V222 y E224; SEQ ID NO: 377) confirió internalización de CD73 mediada por anticuerpo más eficazmente que el mismo anticuerpo que tiene una región constante de IgG1 tipo silvestre. Por consiguiente, en el presente documento se proporciona la región constante de la cadena pesada en la que la bisagra comprende una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 restos de aminoácidos, seleccionados de los restos S219, C220, D221, K222, T223, H224 y T225 para un anticuerpo IgG1, y restos C219, C220, V222 y E224 para un anticuerpo IgG2.
En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada modificada comprende un dominio CH1 que es un domino CH1 tipo silvestre del isotipo IgG1 (no comprendido en los anticuerpos de la invención) o igG2 ("dominio CH1 de IgG1" o "dominio CH1 de IgG2", respectivamente). También se pueden usar los dominios CH1 de los isotipos IgG3 y IgG4 ("dominio CH1 de IgG3 y "dominio CH1 de IgG4", respectivamente) (no comprendido en los anticuerpos de la invención). Un dominio CH1 también puede ser una variante de un dominio CH1 tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH1 de IgG1 tipo silvestre, IgG2, IgG3 o IgG4. Variantes ilustrativas de los dominios CH1 incluyen A114C, T173C y/o C131, por ejemplo, C131S.
Un dominio CH1, por ejemplo, un dominio CH1 de IgG2, puede comprender la sustitución C131S, dicha sustitución confiere sobre un anticuerpo IgG2 o anticuerpo que tiene un CH1 de IgG2 y bisagra de la forma B (o conformación). La región constante de la cadena pesada modificada según la invención comprende un dominio CH1 que es del isotipo IgG2. En determinadas realizaciones, el dominio CH1 es dominio CH1 de IgG2 tipo silvestre, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSWFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV (SEQ ID NO: 378). En determinadas realizaciones, el dominio CH1 es una variante de SEQ ID NO: 378 y comprende 1-10, 1-5, 1-2 o 1 sustituciones o deleciones de aminoácido en relación a la SEQ ID NO: 378. Como se describe además en los Ejemplos, se ha demostrado en el presente documento que un dominio CH1 de IgG2 o variantes del mismo confiere propiedades de internalización aumentadas o alteradas a anticuerpos anti-CD73 en relación a anticuerpos IgG1 e incluso internalización más aumentada o alterada cuando los anticuerpos también comprenden una bisagra de IgG2. En determinadas realizaciones, las variantes de CH1 de IgG2 no comprenden sustitución o deleción de aminoácidos en uno o más de los siguientes restos de aminoácidos: C131, R133, E137 y S138, dichos restos de aminoácidos se muestran en negrita y subrayados en la SEQ ID NO: 378 anteriormente mostrada. Por ejemplo, una región constante de la cadena pesada modificada puede comprender un dominio CH1 de IgG2 en el que ninguno de R133, E137 y S138 están sustituidos con otro aminoácido o se somete a deleción o en el que ninguno de C131, R133, E137 y S138 están sustituidos con otro aminoácido o se someten a deleción. En determinadas realizaciones, C131 está sustituido con otro aminoácido, por ejemplo, C131S, dicha sustitución desencadena que el anticuerpo adopte la conformación B. Tanto los anticuerpos de conformación A como de conformación B que tienen regiones contantes de la cadena pesada modificadas han mostrado en el presente documento que tienen actividades aumentadas en relación con el mismo anticuerpo con una región constante de IgG1.
En determinadas realizaciones, N192 y/o F193 (mostrados como restos en cursiva y subrayados en la SEQ ID NO: 378 anteriormente mostrada) están sustituidos con otro aminoácido, por ejemplo, con los correspondientes aminoácidos en IgG1, es decir, N192S y/o F193L.
En determinadas realizaciones, uno o más restos de aminoácidos de un dominio CH1 de IgG2 están sustituidos con los correspondientes restos de aminoácidos en IgG4. Por ejemplo, N192 puede ser N192S; F193 puede ser F193L; C131 puede ser C131K; y/o T214 puede ser T214R.
Un anticuerpo puede comprender una región constante de la cadena pesada modificada que comprende un dominio CH1 de IgG2 o variante del mismo y bisagra de IgG2 o variante de la misma. La bisagra y el dominio CH1 puede ser una combinación de cualquier bisagra de IgG2 y el dominio CH1 de IgG2 descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, el CH1 de IgG2 y la bisagra comprenden la siguiente secuencia de aminoácidos ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFG TQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 379) o una secuencia de aminoácidos que difiere de la misma en como mucho 1-10 aminoácidos. Las variantes de aminoácidos son como se describen para la bisagra y los dominios CH1 anteriormente.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos comprenden al menos una bisagra de IgG2, y opcionalmente también un dominio CH1 de IgG2 o fragmento o derivado de la bisagra y/o dominio CH1 y el anticuerpo ha adoptado la forma (de conformación) A (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3.755). En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden al menos una bisagra de IgG2, y opcionalmente también un dominio CH1 de IgG2 o fragmento o derivado de la bisagra y/o dominio CH1 y el anticuerpo ha adoptado la forma B (véase, por ejemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3.755).
En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada modificada comprende un dominio CH2 que es un dominio CH2 tipo silvestre del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 ("domino CH2 de IgG1", "dominio CH2 de IgG2", "dominio CH2 de IgG3", o "dominio CH2 de IgG4", respectivamente). Un dominio CH2 también puede ser una variante de un dominio CH2 tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH2 de IgG1 tipo silvestre, IgG2, IgG3 o IgG4. Variantes ilustrativas de dominios c H2 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC o modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad. En una realización, el dominio CH2 es un dominio CH2 de IgG1 con una mutación A330S y P331S, en la que el dominio CH2 tiene función efectora reducida en relación con el mismo dominio CH2 sin las mutaciones. Un dominio CH2 puede tener función efectora aumentada. Los dominios CH2 pueden comprender una o más de las siguientes mutaciones: SE (S267E), SELF (S267E/l328F), SDIE (S239D/I332E), SEFF y GASDALIE (G236A/S239D/A330L/I332E) y/o una o más de las mutaciones en los siguientes aminoácidos: E233, G237, P238, H268, P271, L328 y A330. Otras mutaciones se exponen además en el presente documento en otra parte.
En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada modificada comprende un dominio CH3 que es un dominio CH3 tipo silvestre del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 ("domino CH3 de IgG1", "dominio CH3 de IgG2", "dominio CH3 de IgG3", o "dominio CH3 de IgG4", respectivamente. Un dominio CH3 también puede ser una variante de un dominio CH3 tipo silvestre, por ejemplo, una variante de un dominio CH1 de IgG1 tipo silvestre, IgG2, IgG3 o IgG4. Variantes ilustrativas de dominios c H3 incluyen variantes que modulan una actividad biológica de la región Fc de un anticuerpo, tal como ADCC o CDC o modulan la semivida del anticuerpo o su estabilidad.
La región constante de la cadena pesada según la invención comprende una bisagra del isotipo IgG2 y una región CH1 del isotipo IgG2. La bisagra y CH1 de IgG2 pueden ser bisagra de IgG2 y CH1 tipo silvestre o variantes de los mismos, siempre que tengan la actividad biológica deseada. En determinadas realizaciones, una región constante de la cadena pesada modificada comprende una bisagra de IgG2 que comprende la mutación C219S, y un CH1 de IgG2, que puede ser de tipo silvestre o comprender como mucho 1-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 sustitución, deleción o adición de aminoácidos. La región constante de la cadena pesada modificada puede además comprender dominios CH2 y CH3 tipo silvestre o mutados. Por ejemplo, un anticuerpo de CD73 puede comprender un dominio constante de la cadena pesada que comprende un dominio CH1 de IgG2, una bisagra de IgG2, que pueden comprender C219S y un dominio CH2 y CH3 de IgG1, en el que los dominios CH2 y CH3 pueden ser no efectores, tal como comprendiendo mutaciones A330S y P331S.
Generalmente, las variantes de dominios CH1, bisagra, CH2 o CH3 puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, y/o como mucho 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 mutación, o 1-10 o 1-5 mutaciones, o comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la del correspondiente dominio tipo silvestre (dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3, respectivamente), siempre que la región constante de la cadena pesada que comprende la variante específica conserve la actividad biológica necesaria.
La Tabla 5 expone las regiones constantes de la cadena pesada humana ilustrativa que comprenden un domino CH1, bisagra, CH2 y/o CH3, en las que cada dominio es un dominio tipo silvestre o una variante del mismo que proporciona la actividad biológica deseada a la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos de la invención comprenden una bisagra de IgG2 y dominio CH1 de IgG2. Una celda no rellenada en la Tabla 5 indica que el dominio está presente o no, y si está presente puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende la región constante de la cadena pesada 1 en la Tabla 5 es un anticuerpo que comprende una región constante de la cadena pesada que comprende al menos una bisagra de IgG2, y que también puede comprender un dominio CH1, CH2 y/o CH3, y si está presente, dicho dominio CH1, CH2 y/o c H3 es de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Como otro ejemplo para entender la Tabla 5, un anticuerpo que comprende una región constante de la cadena pesada 8 es un anticuerpo que comprende una región constante de la cadena pesada que comprende un dominio de CH1 de IgG1, y bisagra de IgG2, un dominio CH2 de IgG1, y que puede o no puede comprender también un dominio CH3, el cual está presente, puede ser un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Tabla 5:
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En determinadas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región constante de la cadena pesada mostrada en la Tabla 5 tiene una actividad biológica aumentada en relación con el mismo anticuerpo que comprende una región constante de la cadena pesada que no comprende esa región constante de la cadena pesada específica o en relación con el mismo anticuerpo que comprende una región constante de IgG1.
En determinadas realizaciones, un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo anti-CD73 que comprende una bisagra de no IgG2 y/o dominio CH1 de no IgG2 comprende proporcionar un anticuerpo anti-CD73 que comprende una bisagra de no IgG2 y/o un dominio CH1 de no IgG2, y reemplazar la bisagra de no IgG2 y el dominio CH1 de no IgG2 por una bisagra de IgG2 y un dominio CH1 de IgG2, respectivamente. Un método para mejorar la actividad biológica de un anticuerpo de CD73 que no comprende una región constante de la cadena En determinadas realizaciones, un anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada modificada que comprende el dominio CH1 de IgG1 que comprende la SEQ ID NO: 98 (no comprendido en los anticuerpos de la invención) o un dominio CH1 de IgG2 que comprende la SEQ ID NO: 124, o una variante de la SEQ ID NO: 98 o 124, dicha variante (i) difiere de la SEQ ID NO: 98 o 124 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: 98, o 124 en como mucho 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: 98, o 124 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica con la SEQ ID NO: 98 o 124, en la que en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en la que la región constante de la cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada en relación con la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de no IgG2 o bisagra de no IgG2y dominio CH1 o en relación con la misma región constante de la cadena pesada que comprende un bisagra de no IgG2 o bisagra de no IgG2 y dominio CH1. Un dominio CH1 de IgG2 puede comprender C131S u otras mutaciones que causan que una bisagra de IgG2 y CH1 que contienen anticuerpo adopten o bien una forma A o una B.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende una región constante de la cadena pesada que comprende un dominio CH2 de IgG1 que comprende la SEQ ID NO: 137 o 125, o una variante de SEQ ID NO: 137 o 125, dicha variante (i) difiere de la SEQ ID NO: 137 o 125 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: 137, o 125 en como mucho 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: 137, o 125 en 1-5, 1-3, 1­ 2, 2-5 o 3-5 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica con la SEQ ID NO: 137 o 125, en la que en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en la que la región constante de la cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada en relación con la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de no IgG2 o en relación con la misma región constante de la cadena pesada modificada que comprende una bisagra de no IgG2.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo descrito en el presente documento comprende una región constante de la cadena pesada que comprende un dominio CH3 de IgG1 que comprende la SEQ ID NO: 138, o una variante de SEQ ID n O: 138, dicha variante (i) difiere de la SEQ ID NO: 138 en 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: o 138 en como mucho 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: o 138 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 o 3-5 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID No : 138, en la que en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en la que la región constante de la cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada en relación con la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de no IgG2 o en relación con la misma región constante de la cadena pesada modificada que comprende una bisagra de no IgG2.
Las regiones constantes de la cadena pesada modificadas también pueden comprender una combinación de los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 anteriormente descritos.
En determinadas realizaciones, un anticuerpo de CD73 comprende una región constante de la cadena pesada modificada que comprende una cualquiera de las SEQ ID NO: 162-169, 180-183, 267-282, y 300-347, o una variante de una cualquiera de las SEQ ID NO: 162-169, 180-183, 267-282, y 300-347, dicha variante (i) difiere de las SEQ ID NO: 162-169, 180-183, 267-282, y 300-347 en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones; (ii) difiere de las SEQ ID NO: 162-169, 180-183, 267-282, y 300-347 en como mucho 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones; (iii) difiere de las SEQ ID NO: 162-169, 180-183, 267-282, y 300-347 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 o 5-10 sustituciones de aminoácido, adiciones o deleciones y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 162-169, 180-183, 267-282, y 300­ 347, en la que en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácido puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora; y en la que la región constante de la cadena pesada modificada tiene una actividad biológica aumentada en relación con la de otra región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante de la cadena pesada que comprende una bisagra de no IgG2 y dominio CH1 de no IgG2 o relativa a la misma región constante de la cadena pesada que comprende un bisagra de no IgG2 y/o un dominio CH1 de no IgG2.
Las regiones constantes de la cadena pesada modificada pueden tener (i) función efectora similar, reducida o incrementada (por ejemplo, unión a FcyR, por ejemplo, FcyRIIB) en relación con una región constante de la cadena pesada tipo silvestre y/o (ii) semivida similar, reducida o incrementada (o unión al receptor FcRn) en relación con la región constante de la cadena pesada.
El dominio VH de un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento se puede unir a una región constante de la cadena pesada descrita en el presente documento. Por ejemplo, La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos del anticuerpo CD73.4 unida a la región constante de la cadena pesada IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 o 169). El presente documento también abarca anticuerpos que comprenden una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de CD73.4-IgG2CS-IgGl.lf (SEQ ID NO:133 o 189) en como mucho 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácidos (por sustitución, adición o deleción) y/o que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 o 189). Por ejemplo, el presente documento abarca anticuerpos que comprenden la cadena pesada de CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID n O: 133 o 189), y en la que K o GK o PGK C-terminales están delecionados o están presentes. Otras variantes de CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 o 189) incluyen aquellas que tienen una cadena pesada que es de un alotipo diferente, y en las que, por ejemplo, los aminoácidos 356 y 358 son D y L, respectivamente. Las variantes incluyen aquellas que incluyen una cisteína adicional mutada en la bisagra de IgG2, por ejemplo, C220 (o tienen C220S en lugar de C219S), y aquellas que no tienen las mutaciones A330S y/o P331S. Las variantes de CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO:133 o 189) preferentemente tienen al menos propiedades bioquímicas similares y/o actividades biológicas, por ejemplo, eficacia de internalización, inhibición de la actividad enzimática de CD73, afinidad a CD73 humana y unión al mismo epítopo o similar, en relación con CD73.4-IgG2CS-IgG1.1f (SEQ ID NO: 133 o 189).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73, o porciones de unión a antígeno de los mismos, comprenden una cualquiera de las regiones constantes descritas en el presente documento, por ejemplo, regiones constantes que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 126, 127, 129, 130, 162­ 169, 180-183, 267-282, y 300-347.
Una cadena ligera de un anti-CD73 descrito en el presente documento puede comprender una región constan de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 131, o una variante de SEQ ID NO: 131, dicha variante (i) difiere de la SEQ ID NO: 131 en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: o 131 en como mucho 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2, o 1 sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones; (ii) difiere de la SEQ ID NO: o 131 en 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10, o 5-10 sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones y/o (iv) comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 9 6 %, 97%, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ iD NO: 131, en la que en cualquiera de (i)-(iv), una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora. Una mutación CL ilustrativa incluye C124S.
Las cadenas pesadas y ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 % o 70 % idéntica a cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras expuestas en la Tabla 35, como se detalla en el presente documento (o su regiones variables), se pueden usar para formar anticuerpos anti-CD73 humana que tienen las características deseadas, por ejemplo, aquellas descritas además en el presente documento. Variantes ilustrativas son aquellas que comprenden una variación alotípica, por ejemplo, en el dominio constante. Las cadenas pesadas y ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 o 1 aminoácido (por sustitución, adición o deleción) de cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras expuestas en la Tabla 35, como se describe en el presente documento (o su regiones variables), se pueden usar para formar anticuerpos anti-CD73 humana que tienen las características deseadas, por ejemplo, aquellas descritas además en el presente documento.
En diversas realizaciones, los anticuerpos anteriormente descritos presentan una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez, o todas las propiedades funcionales enumeradas en la Tabla 3.
Tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. En una realización, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento se unen a CD73 humana tanto glicosilada (por ejemplo, glicosilación ligada a N o ligada O) como no glicosilada. Determinados anticuerpos anti-CD73 pueden unirse a CD73 glicosilada, pero no a no glicosilada o a CD73 no glicosilada pero no a glicosiladas. En una realización, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento se unen a un epítopo conformacional.
En una realización, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento se unen a restos de aminoácidos dentro de la siguiente región de CD73 humana:
FTKVQQIRRAEPNVLLLDA (SEQ ID NO: 96) y
correspondiente a restos de aminoácidos 65-83 de CD73 humana (SEQ ID NO: 1 o 2), como se determina mediante, por ejemplo, HDX-MS.
En una realización, los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento se unen a todos o una parte de lo s s ig u ie n te s re s to s e n C D 73 h u m a n a : F T K V Q Q IR R A E P N V L L L D A (S E Q ID N O : 96 ), q u e c o r re s p o n d e a lo s re s to s d e a m in o á c id o s 65 -83 d e C D 73 h u m a n a (S E Q ID N O : 1 o 2 ), c o m o s e d e te rm in a m e d ia n te , p o r e je m p lo , H D X -M S .
E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to se u n e a re s to s d e a m in o á c id o s d e n tro d e la s ig u ie n te re g ió n d e C D 73 h u m a n a :
L Y L P Y K V L P V G D E V V G (S E Q ID N O : 97 ),
c o r re s p o n d ie n te a re s to s d e a m in o á c id o s 157 -172 d e C D 73 h u m a n a (S E Q ID N O : 1 o 2 ), c o m o se d e te rm in a m e d ia n te , p o r e je m p lo , H D X -M S .
E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to se u n e a to d o s o u n a p a rte d e lo s s ig u ie n te s re s to s en C D 73 h u m a n a : L Y L P Y K V L P V G D E V V G (S E Q ID N O : 97 ), q u e c o r re s p o n d e a lo s re s to s de a m in o á c id o s 157 -172 d e C D 73 h u m a n a (S E Q ID N O : 1 o 2 ), c o m o s e d e te rm in a m e d ia n te , p o r e je m p lo , H D X -M S .
E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to se u n e a re s to s d e a m in o á c id o s d is c o n t in u o s d e n tro d e la s s ig u ie n te s re g io n e s d e C D 73 h u m a n a (S E Q ID N O : 1 o 2):
F T K V Q Q IR R A E P N V L L L D A (S E Q ID N O : 96 ) y L Y L P Y K V L P V G D E V V G (S E Q ID N O : 97 ).
E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to se u n e a lo s re s to s d e a m in o á c id o s d is c o n t in u o s d e n tro d e la s s ig u ie n te s re g io n e s d e C D 73 h u m a n a (S E Q ID N O : 1 o 2 ): F T K V Q Q IR R A E P N V L L L D A (S E Q ID N O : 96 ) y L Y L P Y K V L P V G D E V V G (S E Q ID N O : 97 ), q u e c o r re s p o n d e a lo s re s to s d e a m in o á c id o s 65 -83 y 157 -172 d e C D 73 h u m a n a S E Q ID N O : 1 o 2 ), c o m o s e d e te rm in a m e d ia n te , p o r e je m p lo , H D X -M S .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 t ie n e n in te ra c c io n e s co n C D 73 h u m a n a q u e c o r re s p o n d e n a la s m o s tra d a s en la T a b la 30 , c o m o se d e te rm in a m e d ia n te c r is ta lo g ra f ía p o r ra y o s X . U n a n t ic u e rp o p u e d e c o m p a r t ir a l m e n o s 50 % , 60 % , 70 % , 80 % , 90 % , 95 % o 99 % d e la s in te ra c c io n e s c o n C D 73 h u m a n a q u e se m u e s tra n e n la T a b la 30.
111. Anticuerpos que tiene secuencias de la línea germinal particulares
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 c o m p re n d e u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a d e un g e n d e in m u n o g lo b u lin a d e c a d e n a p e s a d a d e lín e a g e rm in a l p a r t ic u la r y /o u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a lig e ra d e un g e n d e in m u n o g lo b u lin a s d e lín e a g e rm in a l p a rt ic u la r .
C o m o se d e m u e s tra en e l p re s e n te d o c u m e n to , lo s a n t ic u e rp o s h u m a n o s e s p e c íf ic o s p a ra C D 73 se h a n p re p a ra d o d e m a n e ra q u e c o m p re n d e n u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a q u e e s e l p ro d u c to d e o se d e r iv a d e un g e n V H 3 -33 d e lín e a g e rm in a l h u m a n a , g e n V H 3 -10 , g e n V H 3 -15 , V H 3 -16 , g e n J H 6 b , g e n V H 6 -19 , g e n V H 4 -34 y /o g e n J H 3 B . P o r c o n s ig u ie n te , en e l p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a is la d o s e s p e c íf ic o s p a ra C D 73 h u m a n a o p o rc io n e s d e u n ió n a a n tíg e n o d e lo s m is m o s , q u e c o m p re n d e n u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a q u e e s e l p ro d u c to d e o se d e r iv a d e un g e n d e lín e a g e rm in a l d e V H h u m a n a s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n : V H 3 -33 , V H 3 -10 , V H 3 -15 , V H 3 -16 , V H 6 -19 y V H 4 -34.
L o s a n t ic u e rp o s h u m a n o s e s p e c íf ic o s p a ra C D 73 s e h a n p re p a ra d o d e m a n e ra q u e c o m p re n d e n u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a l ig e ra q u e e s e l p ro d u c to d e o s e d e r iv a d e un g e n V K L 6 d e lín e a g e rm in a l h u m a n a , g e n V K L 18 , g e n V K L 15 , g e n V K L 20 , g e n V K A 27 , g e n J K 5 , g e n J K 4 , g e n J K 2 , y g e n J K 1. P o r c o n s ig u ie n te , en e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a is la d o s e s p e c íf ic o s p a ra C D 73 h u m a n a o p o rc io n e s de u n ió n a a n tíg e n o d e lo s m is m o s , q u e c o m p re n d e n u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a lig e ra q u e e s e l p ro d u c to d e o se d e r iv a d e un g e n d e lín e a g e rm in a l V K h u m a n a s e le c c io n a d o d e l g ru p o q u e c o n s is te e n : V K L6 , V K L 18 , V K L 15 , V K L 20 , y V K A 27.
L o s a n t ic u e rp o s p re fe r id o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to s o n a q u e llo s q u e c o m p re n d e n u n a c a d e n a v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a q u e e s e l p ro d u c to d e o se d e r iv a d e lo s g e n e s V H d e lín e a g e rm in a l h u m a a n te r io rm e n te e n u m e ra d o s y ta m b ié n q u e c o m p re n d e n u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a lig e ra q u e e s e l p ro d u c to d e o s e d e r iv a d e u n o d e lo s g e n e s V K d e lín e a g e rm in a l h u m a n a a n te r io rm e n te e n u m e ra d o s .
C o m o s e u s a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , U n a n t ic u e rp o h u m a n o c o m p re n d e re g io n e s v a r ia b le s d e la c a d e n a p e s a d a o lig e ra q u e s o n "e l p ro d u c to d e " o "s e d e r iv a d e " u n a s e c u e n c ia d e lín e a g e rm in a l p a r t ic u la r s i la s re g io n e s v a r ia b le s d e l a n t ic u e rp o se o b tie n e n d e un s is te m a q u e u s a g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a d e lín e a g e rm in a l h u m a n a . T a le s s is te m a s in c lu y e n in m u n iz a c ió n d e un ra tó n t r a n s g é n ic o p o r ta d o r d e g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a c o n el a n tíg e n o d e in te ré s o c r ib a d o d e u n a g e n o te c a d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a e x p re s a d a en fa g o c o n e l a n tíg e n o d e in te ré s . U n a n t ic u e rp o h u m a n o q u e e s "e l p ro d u c to d e " o " s e d e r iv a d e " u n a s e c u e n c ia d e in m u n o g lo b u lin a d e lín e a g e rm in a l h u m a n a se p u e d e id e n t if ic a r ta l c o m o c o m p a ra n d o la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l a n t ic u e rp o h u m a n o c o n la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e la s in m u n o g lo b u lin a s d e lín e a g e rm in a l h u m a n a y s e le c c io n a n d o la s e c u e n c ia d e in m u n o g lo b u lin a d e lín e a g e rm in a l h u m a n a q u e e s m á s c e rc a n a e n s e c u e n c ia (e s d e c ir , e l m a y o r % d e id e n t id a d ) a la s e c u e n c ia d e l a n t ic u e rp o h u m a n o . U n a n t ic u e rp o h u m a n o q u e e s "e l p ro d u c to d e " o "s e d e r iv a d e " u n a s e c u e n c ia d e in m u n o g lo b u lin a d e lín e a g e rm in a l h u m a n a p a r t ic u la r p u e d e c o n te n e r d ife re n c ia s d e a m in o á c id o en c o m p a ra c ió n co n la s e c u e n c ia d e lín e a g e rm in a l, d e b id o a, p o r e je m p lo , m u ta c io n e s s o m á tic a s d e o r ig e n n a tu ra l o introducción intencional de mutación dirigida a sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado generalmente es al menos 90 % idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencias de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal y contiene restos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se comparada con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de línea germinal murina). En determinados casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95 % o incluso al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana particular mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinados casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5 o incluso no más 4, 3, 2 o 1 aminoácido de diferencia de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.
IV. Anticuerpos homólogos
En el presente documento se abarcan anticuerpos que tienen regiones variables de la cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento (los anticuerpos y secuencias de aminoácidos abarcados por la invención se definen en las reivindicaciones), y en los que los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CD73, descritos en el presente documento.
Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD73 aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que:
(a) la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, y 170-177, o comprende 1,2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácido (i.e., sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones) en relación a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 16, 32, 40, 52, 60, 68, 80, 88, 135, y 170-177, respectivamente;
(b) la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92, y 138, o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácido (i.e., sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones) en relación a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 12, 20, 24, 28, 36, 44, 48, 56, 64, 72, 76, 84, 92, y 238, respectivamente;
(c) el anticuerpos especialmente se une a CD73 y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las propiedades funcionales enumeradas en la Tabla 3.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera con el porcentaje de identidades y/o cambios de aminoácidos y funciones discutidos anteriormente (es decir, (a)-(d)), en los que la región variable CDR3 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61,69, 81, y 89, y opcionalmente la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera con el porcentaje de identidades y/o cambios de aminoácidos y funciones discutidos anteriormente (es decir, (a)-(d)), en los que la región variable de la cadena ligera CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, y 241, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, y 239, y opcionalmente la c DR2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, y 240.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden regiones variables de la cadena pesada y ligera con el porcentaje de identidades y/o cambios de aminoácidos y funciones discutidos anteriormente (es decir, (a)-(d)), en los que la región variable CDR3 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61,69, 81, y 89, y opcionalmente la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90, y en los que la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, y 241, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, y 239, y opcionalmente la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, y 240.
En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
Un anticuerpo anti-CD73 aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en el que:
(a) la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 100, 103, 107, 109, 112, 114, 116, 119, 121, 133, 184-210 o comprende 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1­ 4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácidos (i.e., sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones) en relación a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 100, 103, 107, 109, 112, 114, 116, 119, 121, 133, y 184-210, respectivamente;
(b) la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122 o comprende 1,2, 3, 4, 5, 1­ 2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 cambios de aminoácidos (i.e., sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones) en relación a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122, respectivamente;
(c) el anticuerpos especialmente se une a CD73 y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las propiedades funcionales enumeradas en la Tabla 3.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden las cadenas pesadas y ligeras con el porcentaje de identidades y/o los cambios de aminoácidos y funciones discutidos anteriormente (es decir, (a)-(d)), en los que la región variable CDR3 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89, y opcionalmente la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden las cadenas pesadas y ligeras con el porcentaje de identidades y/o los cambios de aminoácidos y funciones discutidos anteriormente (es decir, (a)-(d)), en los que la región variable de la cadena ligera CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, y 241, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, y 239, y opcionalmente la Cd R2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, y 240.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-CD73 comprenden las cadenas pesadas y ligeras con el porcentaje de identidades y/o los cambios de aminoácidos y funciones discutidos anteriormente (es decir, (a)-(d)), en los que la región variable CDR3 de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91, y opcionalmente la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61,69, 81, y 89, y opcionalmente la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90, y en los que la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, 95, y 241, y opcionalmente la c DR1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21,25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, 93, y 239, y opcionalmente la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, 94, y 240.
También se proporcionan anticuerpos anti-CD73 que comprenden una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y/o VLCDR3 que difiere del correspondiente CDR de CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11, en 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, o 1-5 cambios de aminoácidos (es decir, sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones). En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 comprende 1-5 cambios de aminoácidos en cada una de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de la s C D R en re la c ió n c o n la s c o r re s p o n d ie n te s s e c u e n c ia s en C D 73.4 -1 , C D 73.4 -2 , C D 73.3 , 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 11 F 11 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2 , 6 E 11 y /o 7 A 11. E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 c o m p re n d e en to ta l d e 1 -5 c a m b io s d e a m in o á c id o s a t ra v é s d e to d a s las C D R en re la c ió n c o n la s C D R en C D 73.4 -1 , C D 73.4 -2 , C D 73.3 , 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2 , 6 E 11 y /o 7 A 11.
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 c o m p re n d e la s C D R d e V H y V L q u e c o n s is te n e n a q u e lla s d e C D 73.4 -1 o C D 73.4 -2 , en e l q u e u n o o m á s d e lo s a m in o á c id o s en u n a o m á s C D R s o n a q u e l la s d e u n o d e lo s o tro s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to .
M u ta c io n e s (p o r e je m p lo , s u s t itu c io n e s , a d ic io n e s , d e le c io n e s ) q u e s e p u e d e n re a liz a r e n la s s e c u e n c ia s d e re g ió n v a r ia b le d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 se p u e d e n d e te rm in a r b a s á n d o s e en lo s ig u ie n te : ( i) la s m u ta c io n e s q u e s e in tro d u c e n e n lo s a n t ic u e rp o s , c o m o s e d e s c r ib e e n lo s E je m p lo s ; e ( ii) la c o m p a ra c ió n d e lo s re s to s d e a m in o á c id o s e n c a d a p o s ic ió n e n lo s d o m in io s v a r ia b le s d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to (v é a s e T a b la 35 y F ig u ra 35 ): un a m in o á c id o d ife re n te en u n a d e te rm in a d a p o s ic ió n e n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 p u e d e in d ic a r q u e e l re s to d e a m in o á c id o en e s ta p o s ic ió n se p u e d e c a m b ia r a o tro re s to d e a m in o á c id o s in a fe c ta r s ig n if ic a t iv a m e n te a la s a c t iv id a d e s d e l a n t ic u e rp o ; m ie n tra s q u e s i e l m is m o re s to d e a m in o á c id o s e e n c u e n tra e n la m is m a p o s ic ió n en v a r io s o to d o s lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 , e s to p u e d e in d ic a r q u e e s te a m in o á c id o p a r t ic u la r se d e b e r ía c o n s e rv a r y n o c a m b ia r a o tro re s to . A c o n tin u a c ió n , s e p ro p o rc io n a n re a liz a c io n e s ilu s tra t iv a s .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , u n a s u s t itu c ió n en la re g ió n m a rc o se p u e d e in t ro d u c ir en la p o s ic ió n 25 ( ...R L S C A T S G F T F ... en 11 F 11 ) d e la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a (p o r e je m p lo , u n a s u s t itu c ió n c o n s e rv a d o ra , p o r e je m p lo , a S o A ) d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , s i e l a m in o á c id o e n e s ta p o s ic ió n e s T , s e p u e d e in t ro d u c ir u n a s u s t itu c ió n a A o S ; s i e l a m in o á c id o e n e s ta p o s ic ió n e s A , s e p u e d e in t ro d u c ir u n a s u s t itu c ió n a S o T ; y s i e l a m in o á c id o e n e s ta p o s ic ió n e s S, s e p u e d e in t ro d u c ir u n a s u s t itu c ió n a T o A . L o s a n t ic u e rp o s 24 H 2 , 4 D 4 , 10 D 2 , 6 E 11 , 7 A 11 , 11 A 6 , y 4 C 3 t ie n e n u n a A en e s ta p o s ic ió n , 11 F 11 t ie n e u n a T e n e s ta p o s ic ió n , y 73.5 , 73.7 , y 73.9 t ie n e n u n a S e n e s ta p o s ic ió n .
Ig u a lm e n te , en d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , u n a s u s t itu c ió n d e re g ió n m a rc o se p u e d e in t ro d u c ir en la p o s ic ió n d e a m in o á c id o s 94 ( ...A E D T A V Y Y C A R ... e n 11 F 11 ) d e la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a (p o r e je m p lo , V a L o L a V ). P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s 11 F 11 , 73.3 -73.10 , 24 H 2 , 4 D 4 , 5 F 8 , y 10 D 2 t ie n e n u n a V e n e s ta p o s ic ió n , y 6 E 11 , 7 A 11 , 11 A 6 , y 4 C 3.
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s se p u e d e n re a liz a r a la C D R 2 d e la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s en la p o s ic ió n 52 ( ...W V A V I L Y D G S N ... en 11 F 11 ) p u e d e e s ta r s u s t itu id a c o n W o s i e l a m in o á c id o en e s ta p o s ic ió n e s W , e n to n c e s e l a m in o á c id o s p u e d e e s ta r s u s t itu id o c o n L ( lo s a n t ic u e rp o s 11 F 11 y 73.4 -73.7 t ie n e n u n a L e n e s ta p o s ic ió n , y lo s a n t ic u e rp o s 73.8 -73.10 , 24 H 2 , y 4 D 4 t ie n e n un W e n e s ta p o s ic ió n ).
Ig u a lm e n te , en d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a m in o á c id o en la p o s ic ió n 54 (... V IL Y D G S N K Y Y ... en 11 F 11 ) p u e d e e s ta r s u s t itu id o co n S o E, o si e l a m in o á c id o en e s ta p o s ic ió n e s S, e n to n c e s e l a m in o á c id o p u e d e e s ta r s u s t itu id o c o n E. L o s a n t ic u e rp o s 11 F 11 , 73.4 , 73.5 , 24 H 2 , 10 D 2 , y 5 F 8 t ie n e n u n a G en e s ta p o s ic ió n , lo s a n t ic u e rp o s 73.6 ­ 73.9 , 6 E 11 , 7 A 11 , 4 C 3 , y 73.3 t ie n e n u n a S en e s ta p o s ic ió n , y lo s a n t ic u e rp o s 73.10 y 4 D 4 t ie n e n un E en e s ta p o s ic ió n .
S e p u e d e n d e te rm in a r o tra s s u s t itu c io n e s p e rm is ib le s e n la re g ió n v a r ia b le b a s á n d o s e e n e l a lin e a m ie n to d e la s s e c u e n c ia s d e la re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a y lig e ra en la F ig u ra 35 u s a n d o un fu n d a m e n te s im ila r a l a n te r io rm e n te d e s c r ito .
L o s a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n s e c u e n c ia s c o n h o m o lo g ía a la s d e C D 73.3 , C D 73.4 , C D 73.5 , C D 73.6 , C D 73.7 , C D 73.8 , C D 73.9 , C D 73.10 , C D 73.11 , 11 F 11 , 4 C 3 , 4 D 4 , 10 D 2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 , 6 E 11 y /o 7 A 11 , p o r e je m p lo , la s re g io n e s V H y V L d e la s S E Q ID N O : 4, 16, 32 , 40 , 52 , 60 , 68 , 80 , 88 , 135 , 170 -177 , y la s S E Q ID N O : 8 , 12 , 20 , 24 , 28 , 36 , 44 , 48 , 56 , 64 , 72 , 76 , 84 , 92 , re s p e c t iv a m e n te , o la s c a d e n a s p e s a d a s y l ig e ra s d e la s S E Q ID N O : 100 , 103 , 107 , 109 , 112 , 114 , 116 , 119 , 121 , 133 , y 184 -210 , y la s S E Q ID N O : 101 , 102 , 104 , 105 , 106 , 108 , 110 , 111 , 113 , 115 , 117 , 118 , 120 y 122 , re s p e c t iv a m e n te , o la s C D R se p u e d e n o b te n e r m e d ia n te m u ta g é n e s is (p o r e je m p lo , m u ta g é n e s is d ir ig id a a s it io o m e d ia d a p o r P C R d e m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o , p o r e je m p lo , S E Q ID N O : 139 , 142 , 146 , 148 , 151 , 153 , 155 , 158 , 160 , 237 y /o la s S E Q ID N O : 140 , 141 , 143 , 144 , 145 , 147 , 149 , 150 , 152 , 154 , 156, 157 , 159 , 161 o la s S E Q ID N O : 134 , 243 , 246 , 250 , 252 , 255 , 257 , 259 , 262 , 264 , y /o la s S E Q ID N O : 244 , 245 , 247 , 248 , 249 , 251 , 253 , 254 , 256 , 258 , 260 , 261 , 263 , 265 , 266 s e g u id o p o r e n s a y o d e l a n t ic u e rp o a lte ra d o c o d if ic a d o p a ra c o n s e rv a r la fu n c ió n u s a n d o lo s e n s a y o s fu n c io n a le s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
V. Anticuerpos con modificaciones conservadoras
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 p u e d e n c o m p re n d e r u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e s e c u e n c ia s d e C D R 1 , C D R 2 y C D R 3 y u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a lig e ra q u e c o m p re n d e s e c u e n c ia s d e C D R 1 , C D R 2 y C D R 3 , en lo s q u e u n a o m á s d e e s ta s s e c u e n c ia s d e C D R c o m p re n d e n s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s e s p e c if ic a d a s basadas en los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento, por ejemplo, de CD73.4-1, CD73.4-2, CD73.3, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y/o 7A11, o modificaciones conservadoras de los mismos, y en los que los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento. Los anticuerpos anti-CD73 que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente, y las secuencias CDR1, c DR2 y CDR3 de la cadena ligera que comprenden las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente.
Por consiguiente, un anticuerpo anti-CD73 aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, en el que:
(a) la CDR3 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91 y modificaciones conservadoras de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones conservadoras;
(a) la CDR3 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, y 95 y modificaciones conservadoras de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones conservadoras;
(c) el anticuerpos especialmente se une a CD73 y
(d) el anticuerpo presenta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las propiedades funcionales enumeradas en la Tabla 3.
En una realización preferida, la CDR2 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90 y modificaciones conservadoras de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones conservadoras; y la CDR2 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, y 94 y modificaciones conservadoras de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra realización preferida, la CDR1 de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89 y modificaciones conservadoras de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones conservadoras; y la CDR1 de la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, y 93 y modificaciones conservadoras de las mismas, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4 o 1-5 sustituciones de aminoácidos conservadoras.
En diversas realizaciones, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras también se pueden realizar en porciones de los anticuerpos distintos o además de, las CDR. Por ejemplo, las modificaciones de aminoácidos conservadoras se pueden realizar en una región de marco o en la región constante, por ejemplo, región Fc. Cualquiera de las sustituciones descritas en el presente documento puede ser una sustitución conservadora. Una región variable o una cadena pesada o ligera puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, o 1-50 sustituciones de aminoácidos conservadoras en relación con las secuencias de anticuerpo anti-CD73 proporcionadas en el presente documento. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD73 comprende una combinación de modificación de aminoácido conservadora o no conservadora.
VI. Anticuerpos que se unen al mismo epítopo en CD73 o compiten por la unión a CD73 con los anticuerpos descritos en el presente documento
También se proporcionan anticuerpos que compiten por la unión a CD73 con los particulares anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos CD73.4, CD73.3, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 y 7A11). Tales anticuerpos competidores se pueden identificar basándose en su capacidad para inhibir de manera competitiva la unión a CD73 de uno o más anticuerpos monoclonales 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 7A11 y/o CD73.3 o CD73.4 (con cualquier región constante y cadenas ligeras descritas en el presente documento para estos anticuerpos) en ensayos de unión a CD73 convencionales. Por ejemplo, se pueden usar ensayos ELISA convencionales o ensayos ELISA competitivos en los que una proteína CD73 humana recombinante se inmovilizada sobre la placa, se añaden diversas concentraciones del primer anticuerpo no marcado, la placa se lava, se añade el segundo anticuerpo marcado, se lava, y se mide la cantidad de marcador unido. Si la concentración creciente del anticuerpo (primero) no marcado (también referido como el "anticuerpo bloqueante") inhibe la unión del anticuerpo (segundo) marcado, se dice que el primer anticuerpo inhibe la unión del segundo anticuerpo a la diana en la placa, o se dice que compiten con la unión del segundo anticuerpo. Además, o como alternativa, se puede usar el análisis SPR de BIACORE® para valorar la capacidad de los anticuerpos para competir. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión de un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento a CD73 demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con el anticuerpo para la unión a CD73.
En el presente documento también se proporciona anticuerpos anti-CD73 que inhiben la unión de anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento a CD73 sobre células, por ejemplo, células tumorales, en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % y/o dicha unión a CD73 sobre las células, por ejemplo, células tumorales, se inhibe en al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, por ejemplo, como se mide mediante ELISA o FACS, tal como usando el ensayo descrito en el párrafo anterior.
Los anticuerpos que compiten por la unión con los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento se pueden identificar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con CD73 humana como se describe en el presente documento, hibridomas producidos, y los anticuerpos monoclonales resultantes seleccionados en función de su capacidad para competir con un anticuerpo descrito en el presente documento por la unión a CD73. Los ratones también se pueden inmunizar con un fragmento más pequeño de CD73 que contiene el epítopo al que se une el anticuerpo. El epítopo o región que comprende el epítopo se puede identificar mediante, por ejemplo, cribado en función de su unión a una serie de péptidos de solapamientos que abarcan CD73. Como alternativa, el método de Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994 se puede usar para guiar la selección de anticuerpos que tienen el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares al anti-CD73 descrito en el presente documento. Usando la presentación en fago, primero, la cadena pesada del anticuerpo anti-CD73 se empareja con un repertorio de cadenas ligeras (preferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo de unión a CD73, y a continuación la nueva cadena ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesadas (preferentemente humanas) para seleccionar un anticuerpo de unión a CD73 (preferentemente humano) que tiene el mismo epítopo o región de epítopo que un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento. Se pueden obtener variantes alternativas de un anticuerpo descrito en el presente documento mediante mutagénesis de ADNc que codifica las cadenas pesadas y ligera del anticuerpo.
Las técnicas para determinar los anticuerpos que se unen al "mismo epítopo sobre CD73" con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como análisis por rayos x de cristales de antígeno: complejos de anticuerpo, que proporciona resolución atómica del epítopo. Otros métodos hacen un seguimiento de la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en los que la pérdida de unión debida a una modificación de un resto de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno se considera con frecuencia un indicio de un componente epítopo. Además, también se pueden usar métodos combinatorios computacionales para el mapeo de epítopos. Los métodos también pueden depender de un anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos (o bien en forma tridimensional nativa o en forma desnaturalizada) de las genotecas de péptido de expresión en fago. Por tanto, los péptidos se consideran guías para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para cribado de la genoteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que ha demostrado que mapean epítopos conformacionales discontinuos.
La mutagénesis por barrido de alanina, como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1.081­ 1.085, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de los restos de aminoácidos en CD73 también se pueden usar para determinar el epítopo funcional para un anticuerpo anti-CD73. Los estudios de mutagénesis, sin embargo, también pueden revelar restos de aminoácidos que son cruciales para la estructura tridimensional general de CD73 pero que no están implicados directamente en los contactos de anticuerpo-antígeno y, por tanto, pueden ser necesario otros métodos para confirmar un epítopo funcional determinado usando este método.
El epítopo o región de epítopo (una región de epítopo" es una región que comprende el epítopo o el solapamiento con el epítopo) unido a un anticuerpo específico también se puede determinar valorando la unión del anticuerpo a los péptidos que comprenden fragmentos de CD73, por ejemplo, fragmentos no desnaturalizados o desnaturalizados. Una serie de péptidos de solapamiento que abarcan la secuencia de CD73 (por ejemplo, CD73 humana) se pueden sintetizar y seleccionar en función de su unión, p. ej., en un ELISA directo, un ELISA competitivo (donde se evalúa la capacidad del péptido para evitar la unión de un anticuerpo con CD73 unido a un pocillo de una placa de microtitulación) o en un chip. Tales métodos de cribado de péptidos pueden no tener capacidad para detectar algunos epítopos funcionales discontinuos, es decir, epítopos funcionales que implican restos de aminoácidos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena polipeptídica de CD73.
Un epítopo también se puede identificar mediante huella proteica basada en MS, tal como espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) y oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). HDX-MS se puede conducir, por ejemplo, como se describe además en los Ejemplos y en Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95. FPOp se puede conducir como se describe, por ejemplo, en Hambley and Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2.057.
El epítopo unido por anticuerpos anti-CD73 también se puede determinar mediante métodos estructurales, tales como determinación de la estructura cristalina por rayos X (por ejemplo., documento WO2005/044853), modelado molecular y espectroscopia por resonancia magnética nuclear (NMR), incluyendo determinación por NMR de las tasas de intercambio de H-D de hidrógenos de amida lábiles en CD73 cuando están libres y cuando están unidos en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31: 11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32: 6.884-6.891).
Con respecto a la cristalografía por rayos X, se puede conseguir cristalización usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23), incluyendo microlote (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5:1269-1274), difusión de vapor de gota colgante (p. ej., McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), siembra y diálisis. Es deseable usar una preparación de proteínas que tenga una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml y preferentemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización puede lograrse mejor en una solución precipitante que contiene polietilenglicol 1000-20.000 (PEG; peso molecular medio que varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), preferentemente de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 7.000 Da, más preferentemente aproximadamente 6.000 Da, oscilando las concentraciones de aproximadamente 10% a aproximadamente 30 % (p/v). También puede ser deseable incluir un agente estabilizador de proteínas, por ejemplo, glicerol a una concentración que oscila de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 20 %. Una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio también puede ser deseable en la solución de precipitación, preferentemente en una concentración que oscila de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitado se tampona preferentemente a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0, preferentemente de aproximadamente 4,0. Tampones específicos útiles en la solución de precipitado pueden variar y son bien conocidos en la técnica ("Scopes, Protein Purification: Principles and Practice", tercera ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Ejemplos de tampones útiles incluyen, pero sin limitación, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales pueden crecer a una amplia gama de temperaturas, incluyendo 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.
Anticuerpo: los cristales de antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y pueden refinarse usando programa informático tal como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 y 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2004/0014194) y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A: 361-423, Carter y Sweet, eds.; Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).
Los anticuerpos anti-CD73 pueden unirse al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos anti-CD73 que tienen las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, como se determina mediante una técnica de mapeo de epítopos, tal como una técnica descritas en el presente documento. Los anticuerpos anti-CD73 también pueden tener interacciones similares con CD73 humana, por ejemplo, pueden tener al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de las interacciones mostradas en la Tabla 30, como se determina mediante cristalografía por rayos X.
VII. Anticuerpos diseñados y modificados por ingeniería genética
Regiones VH y VL
También se proporcionan anticuerpos diseñados y modificados por ingeniería genética que se preparan usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias Vh y/o Vl descritas en el presente documento como material de partida para diseñar y modificar por ingeniería genética el anticuerpo, dicho anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar por ingeniería genética modificando uno o más restos en una o ambas regiones variables (es decir, Vh y/o Vl), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones marco. Además, o como alternativa, se puede diseñar por ingeniería genética un anticuerpo modificando los restos en la(s) región(es) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) función(es) efectora(s) del anticuerpo.
Un tipo de ingeniería genética en la región variable que se puede realizar es la inserción de CDR. Los anticuerpos interaccionan con antígenos diana de manera predominante a través de los restos de aminoácidos que están localizados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de los anticuerpos de referencia específicos construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo de referencia específico insertados en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Véase. EE.UU. 86:10029-10033; el documento de patente de los Estados Unidos N.° 5.225.539 de Winter, y el documento de Patente de los Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.)
Por consiguiente, otra realización descrita en el presente documento concierne a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89, SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90 y las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91, respectivamente, y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, y 93, SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, y 94, y las SEQ ID NO:11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, y 95, respectivamente. Por tanto, tales anticuerpos contienen las secuencias de CDR de Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales CD73.4-1, CD73.4-2, 11F11-1, 11F11-2, 4C3-1, 4C3-2, 4C3-3, 4D4, 10D2-1, 10D2-2, 11A6, 24H2, 5F8-1, 5F8-2, 6E11 y 7A11, incluso puede contener diferentes secuencias marco de estos anticuerpos.
Tales secuencias marco se pueden obtener a partir de bases de datos públicas de ADN o de referencias publicadas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH N.° 91-3242); Tomlinson, I. M., et al (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ­ line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836.
Las secuencias marco preferidas para su uso en los anticuerpos descritos en el presente documento son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por los anticuerpos descritos en el presente documento. Las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vh, y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de Vl, se pueden injerta sobre regiones marco que tienen la secuencia idéntica que la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal de la cual deriva la secuencia marco, o las secuencias de CDR se pueden injertar sobre las regiones marco que contienen hasta 20, preferentemente conservadoras, sustituciones de aminoácidos en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que en determinados casos es beneficioso mutar restos en las regiones marco para conservar o aumentar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento de Patente de los Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).
Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética descritos en el presente documento incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones en los restos de la región marco en Vh y/o Vl, por ejemplo para mejorar las propiedades del anticuerpo. Generalmente, tales modificaciones en la región marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a una mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Tales restos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que proviene el anticuerpo. Para restablecer las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR. También se pretende que se abarquen tales anticuerpos "retromutados". Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T para reducir de ese modo la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Esta estrategia también es referida como "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 20030153043 por Carr et al.
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar los restos de aminoácidos en las regiones CDR para mejorar una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida a sitio o la mutagénesis mediada por PCR se pueden realizar para introducir la(s) mutación(es), y el efecto sobre la unión a anticuerpo y otra propiedad de interés, se puede evaluar en ensayos in vitro o in vivo como se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos. Preferentemente se introducen modificaciones conservadoras (como se ha discutido anteriormente). Las mutaciones pueden ser adiciones de aminoácidos, deleciones, o preferentemente adiciones. Además, generalmente se alteran no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos en una región CDR.
Por consiguiente, también se proporcionan anticuerpos monoclonales anti-CD73 aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones en comparación con las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89; (b) una región CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones en comparación con las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90; (c) una región CDR3 de Vh que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones en comparación con las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71, 83, y 91; (d) una región CDR1 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, y 93,o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones en comparación con las SEQ ID NO: 9, 13, 21, 25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, y 93; (e) una región CDR2 de VL que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, y 94,o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones en comparación con las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, y 94; y (f) una región CDR3 de Vl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, y 95,o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones en comparación con las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, y 95.
Los restos de metionina en las CDR de los anticuerpos se pueden oxidar, dando como resultado la degradación química potencial y la reducción consecuente en la potencia del anticuerpo. Por consiguiente, también se proporcionan anticuerpos anti-CD73 que tienen uno o más restos de metionina en las CDR de la cadena pesada y/o ligera reemplazados por restos de aminoácidos que no se someten a la degradación oxidativa.
Igualmente, los sitios de desaminación se pueden eliminar de los anticuerpos anti-CD73, particularmente en las CDR.
Los sitios de glicosilación potencial en el dominio de unión a antígeno se eliminan preferentemente para evitar la glicosilación que puede interferir con la unión de antígeno. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.714.350.
Unión a antígeno dirigido
En diversas realizaciones, el anticuerpo de la presente divulgación se modifica para bloquear selectivamente la unión a antígeno en tejidos y ambientes en donde la unión a antígeno sería perjudicial, pero permiten la unión a antígeno en donde sería beneficiosa. En una realización, una "máscara" de péptido bloqueante se genera que se une específicamente a la superficie de unión a antígeno del anticuerpo e interfiere con la unión a antígeno, dicha máscara se une a cada uno de los brazos del anticuerpo por un enlazador escindible de peptidasa. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N.° 8.518.404 de CytomoX. Tales construcciones son útiles para el tratamiento de los cánceres en los que los niveles de proteasa se incrementan mucho en el ambiente del tumor en comparación con tejidos no tumorales. La escisión selectiva del enlazador escindible en el ambiente de tumor permite la disasociación del péptido de enmascaramiento/bloqueo, permitiendo la unión a antígeno selectivamente en el tumor, en lugar de en los tejidos periféricos en los que la unión a antígeno podría causar efectos secundarios indeseados.
Como alternativa, en una realización relacionada, se desarrolla un compuesto de unión bivalente ("ligando de enmascaramiento") que comprende dos dominios de unión a antígeno que une ambas superficies de unión a antígeno del anticuerpo (bivalente) e interfiere con la unión a antígeno, en el que las máscaras de los dominios de unión se unen una a otra (pero no al anticuerpo) por un enlazador escindible, por ejemplo, escindible por una peptidasa. Véase, por ejemplo, Publicación de solicitud de patente Internacional N.° WO 2010/077643 de Tegopharm Corp. Los ligandos de enmascaramiento pueden comprender, o ser derivados de, el antígeno al cual el anticuerpo se pretende unir, o se puede generar independientemente. Tales ligandos de enmascaramiento son útiles para el tratamiento de los cánceres en los que los niveles de proteasa se incrementan mucho en el ambiente del tumor en comparación con tejidos no tumorales. La escisión selectiva del enlazador escindible en el ambiente del tumor permite la disasociación de los dos dominios de unión uno del otro, reduciendo la capacidad para las superficies de unión a antígeno del anticuerpo. La disociación resultante del ligando de enmascaramiento del anticuerpo posibilita la unión a antígeno selectivamente en el tumor, en lugar de en los tejidos periféricos en los que la unión a antígeno podría causar efectos secundarios indeseados.
Fcs y Fcs modificado
Además de la actividad de una anticuerpo terapéutico que surge de la unión del dominio de unión a antígeno al antígeno (por ejemplo, bloqueo de un ligando afín o proteína receptora en el caso de anticuerpos antagonistas, o señalización inducida en el caso de anticuerpos agonistas), la porción Fc del anticuerpo interacciona con el sistema inmunitario generalmente de manera compleja para suscitar cualquier número de efectos biológicos. Las funciones efectoras, tales como la región Fc de una inmunoglobulina es responsable de muchas importantes funciones del anticuerpo, tales como la citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC), la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y la fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCP), dando como resultado la muerte de células diana, aunque mediante diferentes mecanismos.
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 p u e d e n c o m p re n d e r lo s d o m in io s v a r ia b le s d e lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to c o n lo s d o m in io s c o n s ta n te s q u e c o m p re n d e n la s re g io n e s F c, s e le c c io n a d o s b a s á n d o s e en la s a c t iv id a d e s b io ló g ic a s (s i la s h a y ) d e l a n t ic u e rp o p a ra e l u so p re v is to . S a lfe ld (2007 ) Nat. Biotechnol. 25 :1369 . L a s Ig G h u m a n a s , p o r e je m p lo , s e p u e d e n c la s if ic a r e n c u a tro s u b c la s e s , Ig G 1 , Ig G 2 , Ig G 3 y Ig G 4 y c a d a u n a d e e s ta s c o m p re n d e u n a re g ió n F c q u e t ie n e un p e rf il ú n ic o p a ra la u n ió n a u n o o m á s d e lo s re c e p to re s F cy ( re c e p to re s a c t iv a d o re s F cyRI (C D 64 ), F cyR IIA , F cyR IIC (C D 32 ); F cy R IIIA y F cyR IIIB (C D 16 ) y re c e p to r in h ib id o r F cyR IIB ), y p a ra e l p r im e r c o m p o n e n te d e l c o m p le m e n to (C 1 q ) . IgG 1 y Ig G 3 h u m a n a s se u n e n a to d o s lo s re c e p to re s d e F cy ; Ig G 2 se u n e a F cyR IIA h131, y c o n a f in id a d in fe r io r a F cyR IIA r131 F cyR IIIA v158; Ig G 4 se u n e a F cyR I, F cyR IIA , F cyR IIB , F cyR IIC , y F cyR IIIA v i58; y e l r e c e p to r in h ib id o r F cyR IIB t ie n e u n a a f in id a d in fe r io r p a ra Ig G I , Ig G 2 y Ig G 3 q u e to d o s lo s o tro s re c e p to re s d e F cy . B ru h n s e t a l. (2009 ) Blood 113 :3716. L o s e s tu d io s h a d e m o s tra d o q u e F cyRI n o se u n e a Ig G 2 , y F cy R IIIB n o se u n e a Ig G 2 o Ig G 4. Id. E n g e n e ra l, c o n re s p e c to a la a c t iv id a d A D C C , Ig G I $ $ Ig G 3 > > Ig G 4 $ $ Ig G 2 h u m a n a . E n c o n s e c u e n c ia , p o r e je m p lo , un d o m in io c o n s ta n te d e Ig G I , en lu g a r d e Ig G 2 o Ig G 4 , s e p o d ría e le g ir p a ra su u s o e n un fá rm a c o e n e l q u e s e d e s e a A D C C ; Ig G 3 s e p o d ría e le g ir s i la a c t iv a c ió n d e c é lu la s N K q u e e x p re s a n F cy R IIIA , m o n o c ito s d e m a c ró fa g o s ; e Ig G 4 s e p o d ría n e le g ir s i e l a n t ic u e rp o e s p a ra s e r u s a d o p a ra in s e n s ib i l iz a r p a c ie n te s d e a le rg ia . Ig G 4 ta m b ié n se p o d r ía s e le c c io n a r s i se d e s e a q u e e l a n t ic u e rp o c a re z c a d e to d a la fu n c ió n e fe c to ra .
P o r c o n s ig u ie n te , la s re g io n e s v a r ia b le s d e a n t i-C D 73 d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u n ir (p o r e je m p lo , u n id a s o fu s io n a d a s c o v a le n te m e n te ) a u n Fc, p o r e je m p lo , un F c d e Ig G I , Ig G 2 , Ig G 3 o Ig G 4 , q u e p u e d e s e r d e c u a lq u ie r a lo t ip o o is o a lo t ip o , p o r e je m p lo , p a ra Ig G I : G lm , G lm l ( a ) , G 1 m 2 (x ) , G 1 m 3 (f) , G 1 m 17 (z ) ; p a ra Ig G 2 : G 2 m , G 2 m 23 (n ) ; p a ra Ig G 3 : G 3 m , G 3 m 21 (g 1 ) , G 3 m 28 (g 5 ) , G 3 m 11 (b 0 ) , G 3 m 5 (b 1 ) , G 3 m 13 (b 3 ) , G 3 m 14 (b 4 ) , G 3 m 10 (b 5 ) , G 3 m 15 (s ) , G 3 m 16 ( t) , G 3 m 6 (c 3 ) , G 3 m 24 (c 5 ) , G 3 m 26 (u ) , G 3 m 27 (v ) ; . V é a s e , p o r e je m p lo , J e f fe r is e t al. (2009 ) mAbs 1 :1 ). L a s e le c c ió n d e a lo t ip o p u e d e e s ta r in f lu e n c ia d a p o r lo s a s u n to s d e in m u n o g e n ic id a d p o te n c ia l, p o r e je m p lo , p a ra m in im iz a r la fo rm a c ió n d e a n t ic u e rp o s a n ti- fá rm a c o .
L a s re g io n e s v a r ia b le s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u n ir a un F c q u e c o m p re n d e u n a o m á s m o d if ic a c io n e s , g e n e ra lm e n te , p a ra a lte ra r u n a o m á s p ro p ie d a d e s fu n c io n a le s d e l a n t ic u e rp o , ta l c o m o la s e m iv id a en s u e ro , la f i ja c ió n d e l c o m p le m e n to , la u n ió n a l re c e p to r F c y /o la c ito to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n tíg e n o . A d e m á s , un a n t ic u e rp o d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e m o d if ic a r q u ím ic a m e n te (p o r e je m p lo , se p u e d e n u n ir u n o o m á s g ru p o s q u ím ic o s a l a n t ic u e rp o ) o s e p u e d e m o d if ic a r p a ra a lte ra r su g lic o s ila c ió n , p a ra a lte ra r u n a o m á s p ro p ie d a d e s d e l a n t ic u e rp o . C a d a u n a d e e s ta s re a liz a c io n e s s e d e s c r ib e c o n m á s d e ta l le a c o n t in u a c ió n . L a n u m e ra c ió n d e lo s re s to s en la re g ió n F c e s la d e l ín d ic e d e la U E d e K a b a t. S e p ro p o rc io n a n la s v a r ia n te s d e s e c u e n c ia d e s c r ita s e n e l p re s e n te d o c u m e n to e n re fe re n c ia a l n ú m e ro d e re s to s e g u id o p o r e l a m in o á c id o q u e e s tá s u s t itu id o en lu g a r d e l a m in o á c id o d e o r ig e n n a tu ra l, o p c io n a lm e n te p re c e d id o p o r e l re s to d e o r ig e n n a tu ra l en e sa p o s ic ió n . C u a n d o a m in o á c id o s m ú lt ip le s p u e d e n e s ta r p re s e n te s en u n a p o s ic ió n d a d a , p o r e je m p lo , s i las s e c u e n c ia s d if ie re n e n tre lo s is o t ip o s d e o r ig e n n a tu ra l, o s i la s m u ta c io n e s m ú lt ip le s p u e d e n e s ta r s u s t itu id a s en la p o s ic ió n , s e s e p a ra n p o r b a rra s in c lin a d a s (p o r e je m p lo , "X /Y /Z ") .
P o r e je m p lo , se p u e d e n h a c e r m o d if ic a c io n e s en la re g ió n F c p a ra g e n e ra r u n a v a r ia n te F c c o n (a ) c ito to x ic id a d m e d ia d a p o r c é lu la d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o in c re m e n ta d a o d is m in u id a (A D C C ), (b ) c ito to x ic id a d m e d ia d a p o r c o m p le m e n to in c re m e n ta d a o d is m in u id a (C D C ), (c ) a f in id a d in c re m e n ta d a o d is m in u id a p a ra C lq y /o (d ) a f in id a d in c re m e n ta d a o d is m in u id a p a ra un re c e p to r d e F c en re la c ió n c o n F c p a re n ta l. T a le s v a r ia n te s d e la re g ió n F c g e n e ra lm e n te c o m p re n d e rá n a l m e n o s u n a m o d if ic a c ió n d e a m in o á c id o s en la re g ió n F c. L a c o m b in a c ió n d e la s m o d if ic a c io n e s d e a m in o á c id o s se c re e q u e e s p a r t ic u la rm e n te d e s e a b le . P o r e je m p lo , la re g ió n F c v a r ia n te p u e d e in c lu ir u na , t re s , c u a tro , c in c o , e tc s u s t itu c io n e s en la m is m a , p o r e je m p lo , d e la s p o s ic io n e s d e la re g ió n F c e s p e c íf ic a id e n t if ic a d a s en e l p re s e n te d o c u m e n to . V a r ia n te s d e la s e c u e n c ia d e F c ilu s t ra t iv a s se d e s c r ib e n en el p re s e n te d o c u m e n to , y ta m b ié n se p ro p o rc io n a n en lo s d o c u m e n to s d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.624.821 ; 6.277.375 ; 6.737.056 ; 6.194.551 ; 7.317.091 ; 8.101.720 ; la s p u b lic a c io n e s d e P a te n te P C T W O 00 /42072 ; W O 01 /58957 ; W O 04 /016750 ; W O 04 /029207 ; W O 04 /035752 ; W O 04 /074455 ; W O 04 /099249 ; W O 04 /063351 ; W O 05 /070963 ; W O 05 /040217 , W O 05 /092925 y W O 06 /020114.
Reducción de la función efectora
L a a c t iv id a d d e A D C C s e p u e d e re d u c ir m o d if ic a n d o la re g ió n F c. E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , s e p u e d e n e lim in a r lo s s it io s q u e a fe c ta n la u n ió n a re c e p to re s d e F c, p re fe re n te m e n te lo s s it io s d is t in to s d e lo s s it io s d e u n ió n a re c e p to r s a lv a je . E n o tra s re a liz a c io n e s , se p u e d e m o d if ic a r u n a re g ió n F c p a ra e l im in a r un s it io A D C C . L o s s it io s A D C C s o n c o n o c id o s en la té c n ic a ; v é a s e , p o r e je m p lo , S a rm a y e t a l. (1992 ) Molec. Immunol. 29 (5 ): 633 -9 co n re s p e c to a lo s s it io s A D C C en Ig G I . E n u n a re a liz a c ió n , la v a r ia n te G 236 R y L 328 R d e la Ig G I h u m a n a e lim in a e f ic a z m e n te la u n ió n a F cyR. H o r to n e t a l. (2011 ) J. Immunol. 186 :4223 y C h u e t a l. (2008 ) Mol. Immunol. 45 :3926 . E n o tra s re a liz a c io n e s , la F c q u e t ie n e la u n ió n re d u c id a a F c y R s c o m p re n d ía la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s L 234 A , L 235 E y G 237 A . G ro s s e t a l. (2001 ) Immunity 15 :289. A d e m á s , lo s a n t ic u e rp o s d e n o u n ió n a F cyR se p u e d e n p re p a ra r c o n v ir t ie n d o e l d o m in io d e u n ió n a F cy R d e Ig G I (e n la s p o s ic io n e s 233 , 234 , 235 , 236 , 327 , 330 , y 331 ) e n la s e c u e n c ia d e ig G 2 o Ig G 4. E l d o c u m e n to U S 2013 /0317203.
L a a c t iv id a d d e C D C ta m b ié n se p u e d e re d u c ir m o d if ic a n d o la re g ió n Fc. M u ta c io n e s e n la p o s ic io n e s D 270 d e Ig G I , K 322 , P 329 y P 331 , e s p e c íf ic a m e n te m u ta c io n e s d e a la n in a D 270 A , K 322 A , P 329 A y P 331 A , re d u c e n s ig n if ic a t iv a m e n te la c a p a c id a d d e l c o rre s p o n d ie n te a n t ic u e rp o p a ra u n irs e a C 1 q y p a ra a c t iv a r e l c o m p le m e n to . Id u s o g ie e t a l. (2000 ) J. Immunol. 164 :4178 ; e l d o c u m e n to W O 99 /51642 . S e h a d e m o s tra d o q u e la m u ta c ió n d e la p o s ic ió n 331 d e IgG 1 (p o r e je m p lo , P 331 S ) q u e re d u c e la u n ió n a c o m p le m e n to . T a o e t a l. (1993 ) J. Exp. Med.
178 :661 y C a n f ie ld & M o r r is o n (1991 ) J. Exp. Med. 173 :1483. E n o tro e je m p lo , u n o o m á s re s to s d e a m in o á c id o s en la s p o s ic io n e s d e a m in o á c id o s 231 a 239 s e a lte ra n p a ra re d u c ir d e e s e m o d o la c a p a c id a d d e l a n t ic u e rp o p a ra f i ja r e l c o m p le m e n to . e l d o c u m e n to W O 94 /29351.
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la F c c o n f i ja c ió n d e c o m p le m e n to re d u c id a t ie n e la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s A 330 S y P 331 S . G ro s s e t a l. (2001 ) Immunity 15 :289.
P a ra su u s o s c u a n d o h a y q u e e v ita r la fu n c ió n e fe c to ra p o r c o m p le to , p o r e je m p lo , c u a n d o la u n ió n a a n t íg e n o s o la e s s u f ic ie n te p a ra g e n e ra r e l b e n e f ic io te ra p é u t ic o d e s e a d o , y la fu n c ió n e fe c to ra s o la m e n te c o n d u c e a (o in c re m e n ta e l r ie s g o d e ) e fe c to s s e c u n d a r io s in d e s e a d o s , lo s a n t ic u e rp o s Ig G 4 s e p u e d e n u s a r, o lo s a n t ic u e rp o s o fra g m e n to s q u e c a re c e n d e la re g ió n F c o u n a p o rc ió n s u s ta n c ia l d e lo s m is m o s se p u e d e n c o n c e b ir , o la F c se p u e d e m u ta r p a ra e l im in a r la g lic o s ila c ió n to ta lm e n te (p o r e je m p lo N 297 A ) . C o m o a lte rn a t iv a , se h a g e n e ra d o u n a c o n s tru c c ió n h íb r id a d e Ig G 2 h u m a n a (d o m in io C H 1 y re g ió n b is a g ra ) y Ig G 4 h u m a n a (d o m in io s C H 2 y C H 3 ) q u e e s tá d e s p ro v is ta d e la fu n c ió n e fe c to ra , q u e c a re c e d e la c a p a c id a d d e u n ir lo s F c y R s ( t ip o Ig G 2 ) y e s in c a p a z d e a c t iv a r e l c o m p le m e n to ( t ip o Ig G 4 ). R o th e r e t a l. (2007 ) Nat. Biotechnol. 25 :1256 . V é a s e ta m b ié n M u e lle r e t a l. (1997 ) Mol. Immunol. 34 :441 ; L a b r ijn e t a l. (2008 ) Curr. Op. Immunol. 20 :479 (d is c u t ie n d o la s m o d if ic a c io n e s d e F c p a ra re d u c ir la fu n c ió n e fe c to ra g e n e ra lm e n te ) .
E n o tra s re a liz a c io n e s , se a lte ra la re g ió n F c re e m p la z a n d o a l m e n o s un re s to d e a m in o á c id o p o r un re s to de a m in o á c id o d ife re n te p a ra re d u c ir la s fu n c io n e s e fe c to ra s d e l a n t ic u e rp o . P o r e je m p lo , u n o o m á s a m in o á c id o s s e le c c io n a d o s d e lo s re s to s d e a m in o á c id o s 234 , 235 , 236 , 237 , 297 , 318 , 320 y 322 se p u e d e n re e m p la z a r p o r un re s to d e a m in o á c id o s d ife re n te d e m a n e ra q u e e l a n t ic u e rp o t ie n e a f in id a d d is m in u id a p a ra un lig a n d o e fe c to r p a ra c o n s e rv a r la c a p a c id a d d e u n ió n a a n tíg e n o d e l a n t ic u e rp o p a re n te ra l. E l lig a n d o e fe c to r p a ra e l q u e se a lte ra la a f in id a d p u e d e se r, p o r e je m p lo , un re c e p to r d e F c ( re s to s 234 , 235 , 236 , 237 , 297 ) o e l c o m p o n e n te C1 de l c o m p le m e n to ( re s to s 297 , 318 , 320 , 322 ). L o s d o c u m e n to s d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.624.821 y 5.648.260 , a m b a s p o r W in te r e t al.
e l d o c u m e n to W O 88 /007089 p ro p u s o m o d if ic a c io n e s en la re g ió n F c d e Ig G p a ra d is m in u ir la u n ió n a F c y R I p a ra d is m in u ir A D C C (234 A ; 235 E ; 236 A ; G 237 A ) o b lo q u e a r la u n ió n a l c o m p o n e n te c o m p le m e n to C 1 q p a ra e lim in a r C D C (E 318 A o V /K 320 A y K 322 A /Q ) . V é a s e ta m b ié n D u n c a n & W in te r (1988 ) Nature 332 :563 ; C h a p p e l e t a l. (1991 ) Proc. Nat'l Acad. Sci. ( u S a ) 88 :9036 ; y S o n d e rm a n n e t a l. (2000 ) Nature 406 :267 (d is c u t ie n d o lo s e fe c to s d e e s ta s m u ta c io n e s s o b re la u n ió n d e F c y R III).
L a s m o d if ic a c io n e s d e F c q u e re d u c e n la fu n c ió n e fe c to ra ta m b ié n in c lu y e n s u s t itu c io n e s , in s e rc io n e s , y d e le c io n e s en la s p o s ic io n e s 234 , 235 , 236 , 237 , 267 , 269 , 325 , y 328 , ta l c o m o 234 G , 235 G , 236 R , 237 K , 267 R , 269 R , 325 L y 328 R . U n a v a r ia n te d e F c p u e d e c o m p re n d e r 236 R /328 R . O tra s m o d if ic a c io n e s p a ra re d u c ir F c y R y las in te ra c c io n e s c o m p le m e n to in c lu y e n la s s u s t itu c io n e s 297 A , 234 A , 235 A , 237 A , 318 A , 228 P , 236 E , 268 q , 309 L , 330 S , 331 S , 220 S , 226 S , 229 S , 238 S , 233 P , y 234 V . E s ta s y o tra s m o d if ic a c io n e s se re v is a n en S tro h l (2009 ) Current Opinion in Biotechnology 20 :685 -691 . L a s fu n c io n e s e fe c to ra s ( ta n to A D C C c o m o la a c t iv a c ió n d e c o m p le m e n to ) se p u e d e n re d u c ir , m ie n tra s q u e se m a n t ie n e la u n ió n d e F c R n e o n a ta l (m a n t ie n e la s e m iv id a ) , m u ta n d o lo s re s to s d e Ig G en u n a o m á s p o s ic io n e s 233 - 236 y 327 - 331 , ta l c o m o E 233 P , L 234 V , L 235 A , o p c io n a lm e n te G 236 A , A 327 G , A 330 S y P 331 S en Ig G 1 ; E 233 P , f 234 V , L 235 A , o p c io n a lm e n te G 236 A en Ig G 4 ; y A 330 S y P 331 S en Ig G 2. V é a s e A rm o u r e t a l, (1999 ) Eur. J. Immunol. 29 :2613 ; e l d o c u m e n to W O 99 /58572 . O tra s m u ta c io n e s q u e re d u c e n la fu n c ió n e fe c to ra in c lu y e n L 234 A y L 235 A en IgG 1 (A le g re e t a l., (1994 ) Transplantation 57 :1537 ) ; V 234 A y G 237 A en Ig G 2 (C o le e t a l. (1997 ) J. Immunol. 159 :3613 ; v é a s e ta m b ié n e l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.834.597 ) ; y S 228 P y L 235 E p a ra Ig G 4 (R e d d y e t a l. (2000 ) J. Immunol. 164 :1.925 ). O tra c o m b in a c ió n d e m u ta c io n e s p a ra re d u c ir en u n a IgG 1 h u m a n a in c lu y e L 234 F , L 235 E y P 331 S . O g a n e s y a n e t a l. (2008 ) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64 :700 . V é a s e g e n e ra lm e n te L a b r ijn e t a l. (2008 ) Curr. Op. Immunol.
20 :479. L a s m u ta c io n e s a d ic io n a le s e n c o n tra d a s p a ra d is m in u ir la fu n c ió n e fe c to ra e n e l c o n te x to d e u n a p ro te ín a d e fu s ió n F c ( Ig G 1 ) (a b a ta c e p t) s o n C 226 S , C 229 S y P 238 S (e n u m e ra c ió n d e re s to E U ). D a v is e t a l. (2007 ) J. Immunol.
34 :2204.
O tra s v a r ia n te s d e F c q u e t ie n e n A D C C y /o C D C re d u c id a s s e d e s c r ib e n e n G la e s n e r e t a l. (2010 ) Diabetes Metab. Res. Rev. 26 :287 (F 234 A y L 235 A p a ra d is m in u ir A D C C y A D C P en un Ig G 4 ); H u tc h in s e t a l. (1995 ) Proc. Nat'l Acad. Sci. (U S A ) 92 :11980 (F 234 A , G 237 A y E 318 A en un Ig G 4 ); A n e t a l. (2009 ) MAbs 1 :572 y la P u b lic a c ió n d e s o lic itu d d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s 2007 /0148167 (H 268 Q , V 309 L , A 330 S y P 331 S e n u n a Ig G 2 ); M c E a rc h e rn e t a l. (2007 ) Blood 109 :1 .185 (C 226 S , C 229 S , E 233 P , L 234 V , L 235 A en un Ig G 1 ); V a fa e t a l. (2014 ) Methods 65 :114 (V 234 V , G 237 A , P 238 S , H 268 A , V 309 L , A 330 S , P 331 S e n u n a Ig G 2 ).
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , se e lig e u n a F c q u e t ie n e e s e n c ia lm e n te n o fu n c ió n e fe c to ra , e s d e c ir , t ie n e u n ió n re d u c id a a F c y R s y f i ja c ió n a c o m p le m e n to re d u c id a . U n a F c ilu s tra t iv a , p o r e je m p lo , F c d e Ig G 1 , q u e n o e s e fe c to ra c o m p re n d e la s s ig u ie n te s m u ta c io n e s : L 234 A , L 235 E , G 237 A , A 330 S y P 331 S. G ro s s e t a l. (2001 ) Immunity 15 :289. C a d e n a s p e s a d a s i lu s tra t iv a s q u e c o m p re n d e e s ta s m u ta c io n e s se e x p o n e n en e l L is ta d o d e S e c u e n c ia s , c o m o se detalla en la Tabla 35. Estas cinco sustituciones se pueden combinar con N297A para eliminar también la glicosilación.
Aumentar la función efectora
Como alternativa, la actividad de ADCC se puede incrementar modificando la región Fc. Con respecto a la actividad ADCC, lgG1 a|gG3» lgG4 algG2 huma, por tanto, un dominio constante de lgG1, en lugar de lgG2 o lgG4, se podría elegir para su uso en un fármaco en el que se desea ADCC. Como alternativa, la región Fc se puede modificar para incrementar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad para un receptor de Fcy modificando uno o más aminoácidos de las siguientes posiciones: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241,243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 o 439. Véase el documento WO 2012/142515; véase también el documento WO 00/42072. Sustituciones ilustrativas incluyen 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D y 332E. Variantes ilustrativas incluyen 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T, y 267E/268F/324T. Por ejemplo, se ha demostrado que las IgG1Fc humanas que comprenden la variante G236A, la cual opcionalmente se puede combinar con I332E, incrementa la relación de afinidad de unión a FcyIIA / FcyIIB aproximadamente 15 veces. Richards et al. (2008) Mol. Cáncer Therap. 7:2517; Moore y co. (2010) mAbs 2:181. Otras modificaciones para aumentar las interacciones de FcyR y complemento incluyen poro no se limitan a sustituciones 298A, 333A, 334A, 326A, 247I, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292p , 300L, 396L, 3051, y 396L. Estas y otras modificaciones se revisan en Strohl (2009) Current Opinión in Biotechnology 20:685-691. Específicamente, tanto ADCC como CDC se pueden aumentar por cambios en la posición E333 de IgG1, por ejemplo, E333A. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591. El uso de mutaciones P247I y A339D para aumentar la función efectora en una IgG1 se describe en el documento WO 2006/020114, y D280H, K290S ± S298D/V se describe en el documento WO 2004/074455. Se ha demostrado que las variantes K326A/W y E333A/S incrementan la función efectora en IgG1 humana y E333S en IgG2. Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571.
Específicamente, los sitios de unión en IgG1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han mapeado, y se han descrito variantes con unión mejorada. Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604. Se demostró que las mutaciones específicas 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcyRIII, incluyendo los mutantes de combinación T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A (que tiene unión a FcYRIIIa aumentada y actividad ADCC). Se han identificado otras variantes de IgG1 con unión a FcYRIIIa fuertemente aumentada, incluyendo variantes con mutaciones S239D/I332E y S239D/I332E/A330L que muestran el mayor incremento en afinidad para FcYRIIIa, una disminución en la unión a FcyRIIb, y fuerte actividad citotóxica en monos cynomolgus. Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278. La introducción de las mutaciones triples en anticuerpos tales como alemtuzumab (específico a CD52), trastuzumab (específico a HER2/neu), ituximab (específico a CD20), y cetuximab (específico a EGFr ) se tradujo en actividad ADCC muy aumentada in vitro, y la variante S239D/I332E mostró una capacidad aumentada para eliminar los linfocitos B en monos. Lazar et al.(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005. Además, se han identificado mutantes de IgG1 que contienen mutaciones L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L que presentan unión a FcYRIIIa y actividad ADCC concomitantemente aumentada en ratones transgénicos que expresan FcYRIIIa humana en modelos de malignidades de linfocito B y cáncer de mama. Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882; el documento de patente de Estados Unidos n.° 8.652.466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123.
Isotipos de IgG diferentes también pueden presentar actividad CDC diferencial (IgG3>IgG1>>IgG2“ IgG4). Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989. Para sus usos en los que se desea CDC aumentada, también es posible introducir mutaciones que incrementan la unión a C1q. La capacidad de reclutar complemento (CDC) se puede aumentar mediante mutaciones a K326 y/o E333 en una IgG2, tal como K326W (que reduce la actividad ADCC) y E333S, para incrementar la unión a C1q, el primer componente de la cascada complemento. Idusogie et al. (2001) J. Immunol.
166:2571. La introducción de S267E / H268F / S324T (sola o en cualquier combinación) en IgG1 humana aumenta la unión a C1q. Moore y co. (2010) mAbs 2:181. La región Fc del anticuerpo isotipo híbrido IgG1/IgG3 "113F" de Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863 (figura 1 en el presente documento) también confiere CDC aumentada. Véase también Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553 y Redpath et al. (1998) Immunology 93:595.
Las mutaciones adicionales que pueden incrementar o disminuir la función efectora se describen en Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129. Véase también Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460.
También se pueden usar variantes de Fc que aumentan la afinidad para el receptor inhibidor FcyRIIb, por ejemplo, para aumentar la actividad inductora de apoptosis o adyuvante. Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966; la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2014/0010812. Tales variantes pueden proporcionar un anticuerpo con actividades inmunomoduladoras relacionadas con células FcyRllb+, incluyendo por ejemplo linfocitos B y monocitos. En una realización, las variantes de Fc proporcionan afinidad aumentada a FcyRIlb en relación con uno o más receptores activadores. Las modificaciones para alterar la unión a FcyRllb incluyen una o más modificaciones en una posición seleccionada del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328, y 332, según el índice EU. Las sustituciones ilustrativas para aumentar la afinidad de FcyRllb incluyen pero no se limitan a 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y y 332E, Sustituciones ilustrativas incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, y 328Y, Otras variantes de Fc para aumentar la unión a FcyRllb incluyen 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E, y 267E/328F. Específicamente, las variantes S267E, G236D, S239D, L328F y I332E, incluyendo la variante doble S267E L328F, de IgG1 humana son de particular valor en aumentar específicamente la afinidad para el receptor FcyRllb inhibidor. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926; la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2006/024298; documento WO 2012/087928. La especificidad aumentada para FcYRIIb (como se distingue de FcYRIIaR131) se puede obtener añadiendo la sustitución P238D. Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589; el documento WO 2012/115241.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo se modifica para incrementar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, esto se puede realizar para incrementar la afinidad de unión de la región de Fc para FcRn. En una realización, se altera el anticuerpo en la región CH1 o CL para contener un receptor de rescate de unión al epítopo tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en los documentos de patente de Estados Unidos n.° 5.869.046 y 6.121.022 por Presta et al. Otras variantes de Fc ilustrativas que incrementan la unión a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen las sustituciones en las posiciones 259, 308, y 434, incluyendo por ejemplo 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y y 434M. Otras variantes que incrementan la unión de Fc a FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 311A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524), Véase el documento de Patente de Estados Unidos n.°, 8.367.805,
La modificación de determinados restos conservados en Fc de IgG (I253/H310/Q311/H433/N434), tales como la variante N434A (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663), se ha propuesto como un modo de incrementar la afinidad de FcRn, incrementando así la semivida del anticuerpo en circulación. el documento WO 98/023289. Se ha demostrado que la variante de Fc de combinación que comprende M428L y N434S incrementa la unión a FcRn e incrementa la semivida en suero hasta cinco veces. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157. La variante de Fc de combinación que comprende las modificaciones T307A, E380A y N434A también se prolonga la semivida de los anticuerpos IgG1. Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759. Además, también se ha demostrado que las variantes de Fc de combinación que comprenden las variantes M252Y/M428L, M428L/N434H, M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, M428L/N434M, y M428L/N434S prolongan la semivida. el documento WO 2009/086320.
Además, una variante de Fc de combinación que comprende M252Y, S254T y T256E, incrementa la semivida casi 4 veces. Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514. Se ha usado una modificación de IgG1 relacionada que proporciona afinidad de FcRn incrementada pero dependencia de pH reducida (M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F) para crear una construcción de IgG1 ("MST-HN Abdeg") para usarse como un competidor para evitar la unión de otros anticuerpos a FcRn, dando como resultado aclaramiento incrementado de ese otro anticuerpo, o bien IgG endógena (por ejemplo, en un ajuste autoinmune) u otro anticuerpo exógeno (terapéutico). Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283; el documento WO 2006/130834.
Se describen otras modificaciones para incrementar la unión de FcRn en Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671; 6.277.375; 6.821.505; documento WO 97/34631; documento WO 2002/060919,
En determinadas realizaciones, los isotipos de IgG híbridos se pueden usar para incrementar la unión de FcRn, e incrementar potencialmente la semivida. Por ejemplo, se puede construir una variante híbrida IgG1/IgG3 sustituyendo posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG3 en las posiciones donde los dos isotipos difieren. Por tanto se puede construir un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F. En otras realizaciones descritas en el presente documento, se puede construir una variante híbrida IgG1/IgG2 sustituyendo posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG1 en posiciones donde los dos isotipos difieren. Por tanto se puede construir un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, uno o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 233E, 234l, 235L, -236G (referente a una inserción de una glicina en la posición 236) y 327A. Véase el documento de Patente de Estados Unidos n.° 8.629.113. Se ha generado un híbrido de las secuencias IgG1/IgG2/IgG4 que incrementan supuestamente la semivida en suero y mejora la expresión. El documento de patente de Estados Unidos n.° 7.867.491 (número de secuencia 18 en el presente documento).
La semivida en suero de los anticuerpos de la presente invención también se puede incrementar por pegilación. Se puede someter a pegilación un anticuerpo para, por ejemplo, incrementar la semivida biológica (por ejemplo, en el suero) del anticuerpo. Para someter a pegilación un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, generalmente se hacer reaccionar con un reactivo de polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado de aldehido de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de p Eg reactiva (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi (C1-C10) alcoxi o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicolmaleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a someter a pegilación es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos de pegilación de proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos descritos en el presente documento. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 de Nishimura et al, y el documento EP 0401384 de Ishikawa et al.
Como alternativa, bajo algunas circunstancias puede ser deseable incrementar la semivida de un anticuerpo de la presente invención, en lugar de incrementarlo. Modificaciones tales como I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med.
41:355) y H435A/R I253A o H310A (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819) en Fc de IgG1 humana puede disminuir la unión a FcRn, disminuyendo así la semivida (incrementando el aclaramiento) para su uso en situaciones en las que se prefiere el rápido aclaramiento, tales como un realización de imagen médica. Véase también Kenanova et al. (2005) Cáncer Res. 65:622. Otros medios para aumentar el aclaramiento incluyen el formateo de los dominios de unión a antígeno de la presente invención como fragmentos de anticuerpo que carecen de la capacidad de unión a FcRn, tal como fragmentos Fab. Tal modificación puede reducir la circulación de la semivida de un anticuerpo de un par de semanas a un asunto de horas. A continuación, se puede usar la PEGilación selectiva de los fragmentos de anticuerpo para afinar (incrementar) la semivida de los fragmentos de anticuerpo si es necesario. Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780. Los fragmentos de anticuerpo también se pueden fusionar a albúmina humana de suero, por ejemplo, en una construcción de proteína de fusión, para incrementar la semivida. Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904. Como alternativa, se puede construir un anticuerpo biespecífico con un primer dominio de unión a antígeno de la presente invención y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a albúmina humana de suero (HSA). Véase la Publicación de solicitud de patente Internacional WO 2009/127691 y las referencias de patente citadas en el mismo. Como alternativa, se pueden añadir secuencias polipeptídicas especializadas a fragmentos de anticuerpo para incrementar la semivida, por ejemplo, secuencias polipeptídicas "XTEN". Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186; La publicación de solicitud de patente Internacional WO 2010/091122. Variantes de Fc adicionales
Cuando se usa un dominio constante de IgG4, es preferible normalmente incluir la sustitución S228P, la cual imita la secuencia bisagra en IgG1 y de ese modo estabiliza las moléculas de IgG4, por ejemplo, reduciendo el intercambio Fab-brazo entre el anticuerpo terapéutico e IgG4 endógena en el paciente a tratar. Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925.
Se puede eliminar un sitio de escisión de proteasa potencial en la bisagra de las construcciones de IgG1 por las modificaciones D221G y K222S, incrementando la estabilidad del anticuerpo. el documento WO 2014/043344.
Las afinidades y las propiedades de unión de una variante de Fc para su ligando (receptores de Fc) se pueden determinar mediante diversos métodos de ensayo in vitro (ensayos basados en bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), o raidioinmunoensayo (RIA)), o cinéticas (por ejemplo, análisis SpR BIACORE®),y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis y cromatografía en gel (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden utilizar un marcador o uno o más de los componentes a examinar y/o emplear varios métodos de detección que incluyen, pero sin limitación, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes, o isotópicos. Puede encontrarse una descripción detallada de las afinidades y cinéticas de unión en Paul, W. E., ed., "Fundamental Immunology", 4.a edición, Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se centra en las interacciones de anticuerpo-inmunógeno.
En otras realizaciones más, la glicosilación de un anticuerpo se modifica para incrementar o disminuir la función efectora. Por ejemplo, se puede producir un anticuerpo aglicosilado que carezca de toda la función efectora mutando el resto de asparagina conservado en la posición 297 (por ejemplo, N297A). por tanto, suprimiendo la unión de complemento y FcyRI. Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. Véase también Tao & Morrison (1989) J. Immunol.
143:2595 (usando N297Q en IgG1 para eliminar la glicosilación en la posición 297).
Aunque los anticuerpos aglicosilados generalmente carecen de función efectora, se pueden introducir mutaciones para restaurar esa función. Los anticuerpos aglicosilados, por ejemplo, aquellos resultantes de mutaciones N297A/C/D/or H o producidos en los sistemas (por ejemplo, E. coli) que no glicosilan las proteínas, además se pueden mutar para restaurar la unión de FcyR, por ejemplo, S298G y/o T299A/G/o H (WO 2009/079242), o E382V y M428I (Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604).
Además, se puede producir un anticuerpo con ADCC mejorada alterando la glicosilación. Por ejemplo, se ha demostrado que la eliminación de la fucosa de los oligosacáridos unidos a Asn297 de la cadena pesada aumentada la ADCC, basándose en la unión mejorada a FcyRIIIa. Shields et al. (2002) JBC 277:26.733; Niwa et al. (2005) J.
Immunol. Methods 306: 151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cáncer Res.15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al. (2010) Cáncer Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342). Tales anticuerpos de baja fucosa se pueden producir, por ejemplo, en células de ovario de hámster chino (CHO) nuligénico que carecen de fucosiltransferasa (FUT8) (Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614),o en otras células que generan estos anticuerpos afucosilados. Véase, por ejemplo, Zhang et al. (2011) mAbs 3:289 y Li et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210 (describiendo ambos la producción de anticuerpo en Pichia pastoris glicodiseñada por ingeniería genética); Mossner et al. (2010) Blood 115:4393; Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem.
278:3466; documento EP 1176195B1. ADCC también se puede aumentar como se describe en la publicación PCT WO 03/035835, que describe el uso de una línea celular CHO variante, Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a los carbohidratos unidos a Asn(297), también dando como resultado la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Como alternativa, los análogos de fucosa se pueden añadir a medio de cultivo durante la producción de anticuerpo para inhibir la incorporación de fucosa en el carbohidrato sobre el anticuerpo. el documento WO 2009/135181.
Incrementar las estructuras GlcNac bisectantes en oligosacáridos unidos a anticuerpo también aumenta la ADCC. El documento de publicación PCT WO 99/54342 concedida a Umana et al. describe líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para expresar glucosiltransferasas modificadoras de glucoproteínas (por ejemplo beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de manera que dichos anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas por ingeniería genética presentan estructuras GlcNac bisectadas aumentadas que dan como resultado una actividad de ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Se han desarrollado variantes de glicosilación adicionales que están desprovistas de restos de galactosa, ácido siálico, fucosa y xilosa (denominados glicomformas GNGN), que presentan ADCC y ADCP aumentadas pero CDC disminuida, así como otras que están desprovistas de ácido siálico, fucosa y xilosa (denominadas glicoformas G1/G2), que presentan ADCC, ADCP y CDC aumentadas. la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos 2013/0149300. Los anticuerpos que tienen estos patrones de glicosilación opcionalmente se producen en plantas de N. benthamiana genéticamente modificadas en las que se han desactivado los genes de la xiloxil y fucosil tranfesasa endógenas.
El glicodiseño por ingeniería genética también se puede usar para modificar las propiedades antiinflamatorias de una construcción de IgG cambiando el contenido de a2,6 sialilo de las cadenas de carbohidrato unidas a Asn297 de las regiones Fc, en la que una proporción de formas a2,6 sialidadas da como resultado efectos antiinflamatorios aumentados. Véase Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513. Por el contrario, la reducción en la producción de anticuerpos que tienen carbohidratos a2,6 sialidados puede ser útil en casos en los que no se quieren las propiedades antiinflamatorias. Los métodos de modificación del contenido de a2,6 sialilación de anticuerpos, por ejemplo, mediante purificación selectiva de formas a2,6 sialidadas o mediante modificación enzimática, se proporcionan en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2008/0206246. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región Fc se puede modificar para imitar el efecto de a2,6 sialilación, por ejemplo, mediante inclusión de una modificación F241A. el documento WO 2013/095966.
VIII. Propiedades físicas del anticuerpo
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la región variable de la cadena ligera o la pesada. Tales sitios de glicosilación pueden dar como resultado la inmunogenicidad incrementada del anticuerpo o una alteración de pK del anticuerpo debido a la unión a antígeno alterada Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J. Exp. Med. 168:1.099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al 1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se ha sabido que la glicosilación ocurre en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-CD73 que no contenga glicosilación de la región variable. Esto se puede conseguir o bien seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glicosilación en la región variable o mutando los restos en la región de glicosilación.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento no contienen sitios de isomerismo de asparagina. La desaminación de la asparagina puede ocurrir en secuencias N-G o D-G y pueden dar como resultado la creación de un resto de ácido isoaspártico que puede introducir un pliegue en la cadena polipeptídica y puede disminuir su estabilidad (efecto de ácido isoaspártico). Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos Asp-Gly está presente en las secuencias de CDR de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo, la secuencia se sustituye con una secuencia de aminoácidos que no se somete a isomerización. En una realización descrita en el presente documento, el anticuerpo comprende la secuencia de CDR2 de la región variable de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NO: 6, pero en el que Asp o Gly en la secuencia de Asp-Gly (VILYDGSNKYYPDSVKG; SEQ ID NO: 6 están reemplazados por la secuencia de aminoácidos que no se somete a isomerización, por ejemplo, una secuencia Asp-Ser o una Ser-Gly.
Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pI), que generalmente cae en el intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pI de un anticuerpo IgG1 generalmente cae dentro del intervalo de pH de 7-9,5 y el pI para un anticuerpo IgG4 generalmente cae en el intervalo de pH 6-8. Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal puede tener algún desdoblamiento e inestabilidad bajo condiciones in vivo. Por tanto, se prefiere tener un anticuerpo anti-CD73 que contenga un valor de pI que caiga en el intervalo normal. Esto se puede conseguir o bien seleccionando anticuerpos con un pI en el intervalo normal o mutando restos de superficie cargados.
Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, con una temperatura de fusión mayor indicando mayor estabilidad general in vivo(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Generalmente, se prefiere que la Tmi (la temperatura de desplegamiento inicial) sea mayor que 60 °C, preferentemente mayor que 65 °C, incluso preferentemente mayor que 70 °C. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorimetría de barrido diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) o dicroismo circular (Murray et al (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9). En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degraden rápidamente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS (Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32).
En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínima, lo cual puede conducir al desencadenamiento de una respuesta inmunitaria indeseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos son aceptables con una agregación del 25 % o menos, preferentemente 20 % o menos, incluso más preferentemente 15 % o menos, incluso más preferentemente 10 % o menos e incluso más preferentemente 5 % o menos. La agregación se puede medir mediante varias técnicas, incluyendo la columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y la dispersión de luz.
IX. Métodos de diseño por ingeniería genética de anticuerpos
Como se ha tratado anteriormente, los anticuerpos anti-CD73 que tienen las secuencias Vh y Vl descritas en el presente documento se pueden usar para crear nuevos anticuerpos anti-CD73 modificando las secuencias VH y/o VL, o la(s) región(es) constante(s) unidas a las mismas. Por tanto, en otro aspecto descrito en el presente documento, las características estructurales de un anticuerpo anti-CD73 descrito en el presente documento, por ejemplo, CD73.4, 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 y/o 7A11, se usan para crear anticuerpos anti-CD73 estructuralmente relacionados para conservar al menos una propiedad funcional de los anticuerpos descritos en el presente documento, tal como la unión a CD73 humana y CD73 de cynomolgus. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 11F11, 4C3, 4D4, 10D2, 11A6, 24H2, 5F8, 6E11 y/o 7A11, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar recombinantemente con regiones marco conocidas y/o otras CDR para crear anticuerpos anti-CD73 adicionales, recombinantemente diseñados por ingeniería genética, descritos en el presente documento, tal como se ha tratado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño por ingeniería genética es una o más secuencias de VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado por ingeniería genética, no es necesario realmente preparar (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tiene una o más secuencias de la VH y/o VL proporcionadas en el presente documento, o una o más regiones CDR de las mismas. En cambio, la información contenida en la(s) secuencia(s) se usa como el material de partida para crear una(s) secuencia(s) de "segunda generación" de la(s) secuencia(s) original(es) y, a continuación, se prepara(n) la(s) secuencia(s) de "segunda generación" y se expresa(n) como una proteína.
Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan métodos para preparar anticuerpo anti-CD73 que comprende:
(a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 17, 33, 41, 53, 61, 69, 81, y 89, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 18, 34, 42, 54, 62, 70, 82, y 90, y/o secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 19, 35, 43, 55, 63, 71,83, y 91; y (ii) una secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 13, 21,25, 29, 37, 45, 49, 57, 65, 73, 77, 85, y 93, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 14, 22, 26, 30, 38, 46, 50, 58, 66, 74, 78, 86, y 94, y/o secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 15, 23, 27, 31, 39, 47, 51, 59, 67, 75, 79, 87, y 95;
(b) alterar al menos un resto de aminoácidos en la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de la región variable de la cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y
(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.
Las técnicas de biología molecular convencionales se pueden usar para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.
Preferentemente, el anticuerpo codificado por la(s) secuencia(s) de anticuerpo alterada(s) es una que conserva una, alguna o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-CD73 descritos en el presente documento, que incluye aquellas enumeradas en la Tabla 3.
E l a n t ic u e rp o a lte ra d o p u e d e p re s e n ta r u n a o m á s , d o s o m á s , t r e s o m á s , c u a tro o m á s , c in c o o m á s , s e is o m á s , s ie te o m á s , o c h o o m á s , n u e v e o m á s , d ie z , o to d a s la s p ro p ie d a d e s fu n c io n a le s u s a n d o lo s e n s a y o s fu n c io n a le s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to . L a s p ro p ie d a d e s fu n c io n a le s d e lo s a n t ic u e rp o s a lte ra d o s se p u e d e n v a lo ra r u s a n d o e n s a y o s c o n v e n c io n a le s d is p o n ib le s e n la té c n ic a y /o d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , ta l c o m o a q u e llo s e x p u e s to s e n lo s E je m p lo s (p o r e je m p lo , E L IS A s , F A C S ).
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s d e lo s m é to d o s d e d is e ñ o p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a d e a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en el p re s e n te d o c u m e n to , s e p u e d e n in t ro d u c ir m u ta c io n e s a le a to r ia m e n te o s e le c t iv a m e n te a lo la rg o d e to d a o p a rte d e la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 m o d if ic a d o s re s u lta n te s se p u e d e n s e le c c io n a r e n fu n c ió n d e su a c t iv id a d d e u n ió n y /o o tra s p ro p ie d a d e s fu n c io n a le s c o m o s e d e s c r ib e n e n e l p re s e n te d o c u m e n to . E n la té c n ic a se h a n d e s c r ito m é to d o s m u t ifu n c io n a le s . P o r e je m p lo , e l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n P C T W O 02 /092780 d e S h o r t d e s c r ib e m é to d o s p a ra c re a c ió n y c r ib a d o d e m u ta c io n e s d e a n t ic u e rp o u s a n d o m u ta g é n e s is d e s a tu ra c ió n , e n s a m b la je d e l ig a m ie n to s in té t ic o , o u n a c o m b in a c ió n d e lo s m is m o . C o m o a lte rn a t iv a , e l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n P C T W O 03 /074679 d e L a z a r e t a l. d e s c r ib e m é to d o s d e u so d e m é to d o s d e c r ib a d o p o r o rd e n a d o r p a ra o p t im iz a r p ro p ie d a d e s f is io q u ím ic a s d e a n t ic u e rp o s .
X. Moléculas de ácido nucleico
O tro a s p e c to d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to p e rte n e c e a m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s q u e c o d if ic a n los a n t ic u e rp o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to . L o s á c id o s n u c le ic o s p u e d e n e s ta r p re s e n te s e n c é lu la s c o m p le ta s , en lis a d o c e lu la r , o e n u n a fo rm a p a rc ia lm e n te p u r if ic a d a o s u s ta n c ia lm e n te p u ra . U n á c id o n u c le ic o s e "a ís la " o "s e v u e lv e s u s ta n c ia lm e n te p u ro " c u a n d o se p u r if ic a d e o tro s c o m p o n e n te s c e lu la re s u o tro s c o n ta m in a n te s , p o r e je m p lo , o tro s á c id o s n u c le ic o s c e lu la re s (p o r e je m p lo , o tro A D N c ro m o s ó m ic o , p o r e je m p lo , e l A D N c ro m o s ó m ic o q u e s e u n e a l A D N a is la d o e n la n a tu ra le z a ) o p ro te ín a s , m e d ia n te té c n ic a s c o n v e n c io n a le s , in c lu y e n d o tr a ta m ie n to a lc a lin o /S D S , b a n d e o d e C s C l, c ro m a to g ra f ía e n c o lu m n a , e n z im a s d e re s tr ic c ió n , e le c t ro fo re s is e n g e l d e a g a ro s a y o tro s b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a . V é a s e , F. A u s u b e l, e t a l., e d . (1987 ) "C u r re n t P ro to c o ls in M o le c u la r B io lo g y " , G re e n e P u b lis h in g a n d W ile y In te rs c ie n c e , N u e v a Y o rk . U n á c id o n u c le ic o d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e se r, p o r e je m p lo , A D N o A R N y p u e d e o n o p u e d e c o n te n e r s e c u e n c ia s in tró n ic a s . E n u n a d e te rm in a d a re a liz a c ió n , e l á c id o n u c le ic o e s u n a m o lé c u la d e A D N c .
L o s á c id o s n u c le ic o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n o b te n e r u s a n d o té c n ic a s d e b io lo g ía m o le c u la r c o n v e n c io n a le s . P a ra lo s a n t ic u e rp o s e x p re s a d o s p o r h ib r id o m a s (p o r e je m p lo , h ib r id o m a s p re p a ra d o s a p a r t ir d e ra to n e s tra n s g é n ic o s q u e p o rta n g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a c o m o se d e s c r ib e n a d ic io n a lm e n te m á s a d e la n te ) , L o s A D N c q u e c o d if ic a n la s c a d e n a s lig e ra s y p e s a d a s d e l a n t ic u e rp o p ro d u c id o p o r e l h ib r id o m a se p u e d e n o b te n e r m e d ia n te a m p lif ic a c ió n p o r P C R c o n v e n c io n a l o té c n ic a s d e c lo n a c ió n d e A D N c . P a ra a n t ic u e rp o s o b te n id o s d e u n a g e n o te c a d e in m u n o g lo b u lin a (p o r e je m p lo , u s a n d o té c n ic a s d e e x p re s ió n en fa g o ) , se p u e d e re c u p e ra r e l á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a e l a n t ic u e rp o d e la g e n o te c a .
L a s m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s p re fe r id a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to so n a q u e lla s q u e c o d if ic a n las s e c u e n c ia s d e V H y V L d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s C D 73.4 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2 , 6 E 11 , 7 A 11 , C D 73.3 y /o C D 73.4. L a s s e c u e n c ia s d e A D N q u e c o d if ic a n la s s e c u e n c ia s d e V H d e C D 73.4 (C D 73.4 -1 y C D 73.4 -2 ) 11 F 11 (11 F 11 -1 y 11 F 11 -2 ) , 4 C 3 (4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 y 4 C 3 -3 ) , 4 D 4 , 10 D 2 (10 D 2 -1 y 10 D 2 -2 ) , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 (5 F 8 -1 y 5 F 8 -2 ) , 6 E 11 , 7 A 11 , C D 73.3 y C D 73.4 s e e x p o n e n e n la s S E Q ID N O : 4, 16, 32 , 40 , 52 , 60 , 68 , 80 , 88 , 135 , y 170 , re s p e c t iv a m e n te . L a s s e c u e n c ia s d e A D N q u e c o d if ic a n la s s e c u e n c ia s d e V L d e 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2 , 6 E 11 7 A 11 , C D 73.3 y /o C D 73.4 s e e x p o n e n e n la s S E Q ID N O : 8, 12, 20 , 24 , 28 , 36 , 44 , 48 , 56 , 64 , 72 , 76 , 84 , y 92 , re s p e c t iv a m e n te .
U n a v e z q u e s e o b t ie n e n lo s f ra g m e n to s d e A D N q u e c o d if ic a n lo s s e g m e n to s V H y V L , e s to s f ra g m e n to s d e A D N se p u e d e n m a n ip u la r a d e m á s m e d ia n te té c n ic a s d e A D N re c o m b in a n te c o n v e n c io n a le s , p o r e je m p lo , p a ra c o n v e r t ir g e n e s d e la re g ió n v a r ia b le e n g e n e s d e la c a d e n a d e l a n t ic u e rp o d e lo n g itu d c o m p le ta , e n g e n e s d e l f ra g m e n to F a b o e n un g e n s c F v . E n e s ta s m a n ip u la c io n e s , un f r a g m e n to d e A D N c o d if ic a n te d e V L o V H s e u n e o p e ra t iv a m e n te a o tro f ra g m e n to d e A D N q u e c o d if ic a o tra p ro te ín a , ta l c o m o u n a re g ió n c o n s ta n te d e a n t ic u e rp o o un e n la z a d o r f le x ib le . L a e x p re s ió n "u n id o o p e ra t iv a m e n te " , c o m o se u s a en e s te c o n te x to , p re te n d e s ig n if ic a r q u e lo s d o s fra g m e n to s d e A D N s e ju n ta n d e m a n e ra q u e la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s c o d if ic a d a s p o r lo s d o s fra g m e n to s d e A D N p e rm a n e c e n e n e l m a rc o d e le c tu ra .
E l A D N a is la d o q u e c o d if ic a la re g ió n d e V H s e p u e d e c o n v e r t ir e n un g e n d e la c a d e n a p e s a d a d e lo n g itu d c o m p le ta u n ie n d o o p e ra t iv a m e n te e l A D N c o d if ic a n te d e V H a o tra m o lé c u la d e A D N q u e c o d if ic a la s re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a (b is a g ra , C H 1 , C H 2 y /o C H 3 ). L a s s e c u e n c ia s d e lo s g e n e s d e la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a s o n c o n o c id a s en la té c n ic a (v é a s e , p o r e je m p lo , K a b a t, E. A ., e t a l. (1991 ) S e q u e n c e s o f P ro te in s o f Im m u n o lo g ic a l In te re s t, Q u in ta e d ic ió n , U .S . D e p a r tm e n t o f H e a lth a n d H u m a n S e rv ic e s , E l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n N 1H N .° 91 -3242 ) y lo s f ra g m e n to s d e A D N q u e a b a rc a n e s ta s re g io n e s se p u e d e n o b te n e r m e d ia n te a m p lif ic a c ió n p o r P C R c o n v e n c io n a l. L a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a p u e d e s e r u n a re g ió n c o n s ta n te d e Ig G 1 , Ig G 2 , Ig G 3 , Ig G 4 , Ig A , IgE , Ig M o IgD , p o r e je m p lo , u n a re g ió n d e Ig G 1. P a ra un g e n d e la c a d e n a p e s a d a d e f ra g m e n to F a b , E l A D N c o d if ic a n te d e V H se p u e d e u n ir o p e ra t iv a m e n te a o tra m o lé c u la d e A D N q u e c o d if ic a s o la m e n te la re g ió n c o n s ta n te d e C H 1 d e la c a d e n a p e s a d a .
E l A D N a is la d o q u e c o d if ic a la re g ió n V L s e p u e d e c o n v e r t ir e n un g e n d e la c a d e n a lig e ra d e lo n g itu d c o m p le ta (a s í c o m o un g e n d e la c a d e n a lig e ra d e F a b ) u n ie n d o o p e ra t iv a m e n te e l A D N c o d if ic a n te d e V L a o tra m o lé c u la d e A D N q u e c o d if ic a la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a lig e ra , C L . L a s s e c u e n c ia s d e lo s g e n e s d e la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a lig e ra so n c o n o c id a s en la té c n ic a (v é a s e , p o r e je m p lo , K a b a t, E. A ., e t a l. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Q u in ta e d ic ió n , U .S . D e p a r tm e n t o f H e a lth a n d H u m a n S e rv ic e s , E l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n N 1H N .° 91 -3242 ) y lo s f ra g m e n to s d e A D N q u e a b a rc a n e s ta s re g io n e s se p u e d e n o b te n e r m e d ia n te a m p li f ic a c ió n p o r P C R c o n v e n c io n a l. L a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a lig e ra p u e d e s e r u n a re g ió n c o n s ta n te k a p p a o la m b d a .
P a ra c re a r un g e n s c F v , lo s f ra g m e n to s d e A D N c o d if ic a n te s d e V H y V L se u n e n o p e ra t iv a m e n te a o tro f ra g m e n to q u e c o d if ic a un e n la z a d o r f le x ib le , p o r e je m p lo , q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s (G ly 4-S e r )3, d e m a n e ra q u e la s s e c u e n c ia s V H y V L p u e d a n e x p re s a rs e c o m o u n a p ro te ín a m o n o c a te n a r ia c o n t ig u a , c o n la s re g io n e s V L y V H ju n ta d a s p o r e l e n la z a d o r f le x ib le (v é a s e , p o r e je m p lo , B ird e t a l. (1988 ) Science 242 :423 -426 ; H u s to n e t a l. (1988 ) Proc. Nati. Acad. Sci. E E .U U . 85 :5.879 -5.883 ) ; M c C a ffe r ty e t a l., (1990 ) Nature 348 :552 -554 ) .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se d e s c r ib e m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s q u e c o d if ic a n s e c u e n c ia s V H y V L o la s c a d e n a s p e s a d a s y lig e ra s d e lo n g itu d c o m p le ta q u e s o n h o m ó lo g a s a a q u e lla s d e lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2 , 6 E 11 , 7 A 11 , C D 73.3 y /o C D 73.4. L a s m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s ilu s t ra t iv a s c o d if ic a n la s s e c u e n c ia s V H y V L q u e so n a l m e n o s 70 % , p o r e je m p lo , a l m e n o s un 75 % , a l m e n o s un 80 % , a l m e n o s un 85 % , a l m e n o s un 90 % , a l m e n o s 95 % o a l m e n o s 99 % id é n t ic a s , a la s m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s q u e c o d if ic a n la s s e c u e n c ia s V H y V L o la s c a d e n a s p e s a d a s y l ig e ra s d e lo n g itu d c o m p le ta d e los a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2, 6 E 11 7 A 11 , C D 73.3 y /o C D 73.4 , p o r e je m p lo , la s s e c u e n c ia s e x p u e s ta s en la T a b la 35. P o r e je m p lo , en el p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 q u e c o m p re n d e n u n a c a d e n a V H y u n a c a d e n a V L q u e se c o d if ic a n p o r s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s q u e s o n a l m e n o s 80 % , 85 % , 90 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o 100 % id é n t ic a s a S E Q ID N O : 139 y S E Q ID N O : 140 o 141 ; S E Q ID N O : 237 y S E Q ID N O : 140 o 141 ; S E Q ID N O : 142 y S E Q ID N O : 143 , 144 o 145 ; S E Q ID N O : 146 y S E Q ID N O : 147 ; S E Q ID N O : 148 y S E Q ID N O : 149 o 150 ; S E Q ID N O : 151 y S E Q ID N O : 152 ; S E Q ID N O : 153 y S E Q ID N O : 154 ; S E Q ID N O : 155 y S E Q ID N O : 156 o 157 o 242 ; S E Q ID N O : 158 y S E Q ID N O : 159 ; S E Q ID N O : 160 y S E Q ID N O : 161. E n e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se p ro p o rc io n a n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 q u e c o m p re n d e n u n a c a d e n a p e s a d a y u n a c a d e n a lig e ra q u e s e c o d if ic a n p o r s e c u e n c ia s n u c le ó tid a s q u e s o n a l m e n o s 80 % , 85 % , 90 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o 100 % de id e n t id a d c o n la s S E Q ID N O : 134 , 214 , 215 , 216 , 217 , 218 , 219 , 220 , 221 , 222 , 223 , 224 , 225 , 226 , 227 , 228 , 229 , 230 , 231 , 232 , 233 , 234 , 243 , 266 (c a d e n a p e s a d a ) y S E Q ID N O : 244 o 245 ( c a d e n a lig e ra ) ; S E Q ID N O : 211 , 212 , 213 o 246 y S E Q ID N O : 247 , 248 o 249 ; S E Q ID N O : 235 , 236 o 250 y 251 ; S E Q ID N O : 252 y S E Q ID N O : 253 o 254 ; S E Q ID N O : 255 y S E Q ID N O : 256 ; S E Q ID N O : 257 y S E Q ID N O : 258 ; S E Q ID N O : 259 y S E Q ID N O : 260 o 261 ; S E Q ID N O : 262 y S E Q ID N O : 263 ; S E Q ID N O : 264 y S E Q ID N O : 265. E n e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se p ro p o rc io n a n m o lé c u la s d e á c id o s n u c le ic o s c o n m u ta c io n e s s ile n c io s a s (e s d e c ir , c a m b io s d e b a s e s q u e n o a lte ra n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s re s u lta n te t ra s la t ra d u c c ió n d e la m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o ) , p o r e je m p lo , p a ra o p t im iz a c ió n d e c o d o n e s .
XI. Generación de anticuerpo
S e p u e d e n p ro d u c ir d iv e rs o s a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n u s a n d o d iv e rs a s té c n ic a s c o n o c id a s , ta le s c o m o la té c n ic a d e h ib r id a c ió n d e c é lu la s o m á tic a c o n v e n c io n a l d e s c r ita p o r K o h le r y M ils te in , Nature 256 : 495 (1975 ). A u n q u e s e p re f ie re n p ro c e d im ie n to s d e h ib r id a c ió n d e c é lu la s o m á tic a , en p r in c ip io , ta m b ié n se p u e d e n e m p le a r o tra s té c n ic a s p a ra p ro d u c ir a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s , p o r e je m p lo , t r a n s fo rm a c ió n v ir a l u o n c o g é n ic a d e l in fo c ito s B, té c n ic a d e e x p re s ió n e n fa g o u s a n d o g e n o te c a s d e g e n e s d e a n t ic u e rp o h u m a n o .
E l s is te m a a n im a l p re fe r id o p a ra p re p a ra r lo s h ib r id o m a s e s e l s is te m a m u r in o . L a p ro d u c c ió n d e h ib r id o m a en e l ra tó n e s un p ro c e d im ie n to m u y b ie n e s ta b le c id o . S e c o n o c e n en la té c n ic a p ro to c o lo s d e in m u n iz a c ió n y té c n ic a s p a ra e l a is la m ie n to d e e s p le n o c ito s in m u n iz a d o s p a ra fu s ió n . T a m b ié n se c o n o c e n c o m p a ñ e ro s d e fu s ió n (p o r e je m p lo , c é lu la s d e m ie lo m a m u r in o ) y p ro c e d im ie n to s d e fu s ió n .
L o s a n t ic u e rp o s q u im é r ic o s o h u m a n iz a d o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n p re p a ra r b a s á n d o s e e n la s e c u e n c ia d e un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l m u r in o p re p a ra d o c o m o se h a d e s c r ito a n te r io rm e n te . E l A D N q u e c o d if ic a la s in m u n o g lo b u lin a s d e la c a d e n a p e s a d a y lig e ra se p u e d e o b te n e r d e l h ib r id o m a m u r in o d e in te ré s y se p u e d e d is e ñ a r p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a p a ra c o n te n e r s e c u e n c ia s d e in m u n o g lo b u lin a no m u r in a (p o r e je m p lo , h u m a n a ) u s a n d o té c n ic a s d e b io lo g ía m o le c u la r c o n v e n c io n a le s . P o r e je m p lo , p a ra c re a r un a n t ic u e rp o q u im é r ic o , las re g io n e s v a r ia b le s m u r in a s se p u e d e n u n ir a re g io n e s c o n s ta n te s h u m a n a s u s a n d o m é to d o s c o n o c id o s e n la té c n ic a (v é a s e , p o r e je m p lo , e l d o c u m e n to d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 4.816.567 d e C a b il ly e t a l.) . P a ra c re a r un a n t ic u e rp o h u m a n o , la s re g io n e s C D R m u r in a s se p u e d e n in s e r ta r en u n a re g ió n m a rc o h u m a n a u s a n d o m é to d o s c o n o c id o s e n la té c n ic a (v é a s e , p o r e je m p lo , e l d o c u m e n to d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.225.539 d e W in te r , y e l d o c u m e n to d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.530.101 ; 5.585.089 ; 5.693.762 y 6.180.370 d e Q u e e n e t a l.).
E n u n a re a liz a c ió n , lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to s o n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s h u m a n o s . T a le s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s h u m a n o s d ir ig id o s f re n te a C D 73 s e p u e d e n g e n e ra r u s a n d o ra to n e s t r a n s g é n ic o s o t r a n s c ro m o s ó m ic o s q u e p o rta n p a rte s d e l s is te m a in m u n ita r io h u m a n o en lu g a r d e l s is te m a d e ra tó n . E s to s ra to n e s t r a n s g é n ic o s y t ra n s c ro m o s ó m ic o s in c lu y e n ra to n e s re fe r id o s en e l p re s e n te d o c u m e n to c o m o ra to n e s H u M A b y ra to n e s K M , re s p e c t iv a m e n te , y c o le c t iv a m e n te s e re f ie re n e n e l p re s e n te d o c u m e n to c o m o " ra to n e s Ig h u m a n o s " .
E l H u M A b m o u s e ® (M e d a re x , In c .) c o n t ie n e m in ilo c i d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a q u e c o d if ic a s e c u e n c ia s de in m u n o g lo b u lin a d e la c a d e n a p e s a d a ( | j y y ) y lig e ra k d e s o rg a n iz a d a s , ju n to c o n m u ta c io n e s d ir ig id a s q u e a c t iv a n lo s lo c i d e la c a d e n a j y k e n d ó g e n a (v é a s e , p o r e je m p lo , L o n b e rg , e t a l. (1994 ) Nature 368 (6474 ): 856 -859 ) . P o r c o n s ig u ie n te , lo s ra to n e s p re s e n ta n e x p re s ió n d e ra to n e s Ig M o k, y e n re s p u e s ta a la in m u n iz a c ió n , lo s t r a n s g e n e s d e la c a d e n a p e s a d a y lig e ra h u m a n o s in tro d u c id o s se s o m e te n a in te rc a m b io d e c la s e y m u ta c ió n s o m á tic a p a ra g e n e ra r m o n o c lo n a l h u m a n o d e IgG K d e la ta a f in id a d (L o n b e rg , N. e t a l. (1994 ) , supra; re v is a d o en L o n b e rg , N. (1994 ) Handbook of Experimental Pharmacology 113 :49 -101 ; L o n b e rg , N. a n d H u s z a r, D. (1995 ) In te rn . Rev. Immunol. 13: 65 -93 , y H a rd in g , F. a n d L o n b e rg , N. (1995 ) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764 :536 -546 ) . L a p re p a ra c ió n y e l u s o d e ra to n e s H u M a b , y la s m o d if ic a c io n e s g e n ó m ic a s p o rta d a s p o r ta le s ra to n e s , se d e s c r ib e a d e m á s e n T a y lo r , L. e t a l. (1992 ) Nucleic Acids Research 20 :6287 -6295 ; C h e n , J. e t a l. (1993 ) International Immunology 5: 647 -656 ; T u a illo n e t a l. (1993 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 90 :3720 -3724 ; C h o i e t a l. (1993 ) Nature Genetics 4 :117 -123 ; C h e n , J. e t a l. (1993 ) EMBO J. 12: 821 -830 ; T u a illo n e t a l. (1994 ) J. Immunol. 152 :2912 -2920 ; T a y lo r , J. e t a l. (1994 ) International Immunology 6 : 579 -591 ; y F is h w ild , D. e t a l. (1996 ) Nature Biotechnology 14: 845 -851. V é a s e , a d e m á s , E l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; 5.789.650 ; 5.877.397 ; 5.661.016 ; 5.814.318 ; 5.874.299 ; y 5.770.429 ; to d o s d e L o n b e rg y K a y ; E l d o c u m e n to d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.545.807 d e S u ra n i e t a l.; L o s d o c u m e n to s d e p u b lic a c ió n P C T n .° W O 92 /03918 , W O 93 /12227 , W O 94 /25585 , W O 97 /13852 , W O 98 /24884 y W O 99 /45962 , to d o s d e L o n b e rg y K a y ; y e l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n P C T N .° W O 01 /14424 d e K o rm a n e t al.
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e c u lt iv a n u s a n d o u n ra tó n q u e p o rta s e c u e n c ia s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a s o b re t ra n g e n e s y t r a n s c ro m o s o m a s , ta le s c o m o un ra tó n q u e p o rta un tra n s g e n d e la c a d e n a p e s a d a h u m a n a y un t ra n s c ro m o s o m a d e la c a d e n a lig e ra h u m a n a . T a le s ra to n e s , re fe r id o s en e l p re s e n te d o c u m e n to c o m o " ra to n e s K M ", se d e s c r ib e n en d e ta l le en e l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n P C T W O 02 /43478 d e Is h id a e t al.
M á s a ú n , lo s s is te m a s a n im a le s tra s g é n ic o s a lte rn a t iv o s q u e e x p re s a n g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a e s tá n d is p o n ib le s en la té c n ic a y se p u e d e n u s a r p a ra c u lt iv a r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , se p u e d e u s a r un s is te m a t r a n s g é n ic o a lte rn a t iv o re fe r id o c o m o e l X e n o ra tó n (A b g e n ix In c .); ta le s ra to n e s se d e s c r ib e n en , p o r e je m p lo , e l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.939.598 ; 6.075.181 ; 6.114.598 ; 6.150.584 y 6.162.963 d e K u c h e r la p a t i e t al.
A d e m á s , lo s s is te m a s a n im a le s tra n s c ro m o s ó m ic o s a lte rn a t iv o s q u e e x p re s a n g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a e s tá n d is p o n ib le s en la té c n ic a y se p u e d e n u s a r p a ra c u lt iv a r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , se p u e d e n u s a r ra to n e s q u e p o rta n ta n to un t r a n s c ro m o s o m a d e la c a d e n a p e s a d a h u m a n o y un tra n s c ro m o s o m a d e la c a d e n a lig e ra h u m a n o , re fe r id o c o m o " ra to n e s T C "; ta le s ra to n e s se d e s c r ib e n en T o m iz u k a e t a l. (2000 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 97 :722 -727 . A d e m á s , s e h a n d e s c r ito e n la té c n ic a v a c a s q u e p o rta n t r a n s c ro m o s o m a s d e la c a d e n a p e s a d a y l ig e ra h u m a n o s (K u ro iw a e t a l. (2002 ) Nature Biotechnology 20 :889 -894 ) y se p u e d e n u s a r p a ra c u lt iv a r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to .
L o s s is te m a s d e ra tó n a d ic io n a le s d e s c r ito s en la té c n ic a p a ra c u lt iv a r a n t ic u e rp o s h u m a n o s , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 h u m a n o s , in c lu y e n ( i) e l ra tó n V e lo c Im m u n e ® (R e g e n e ro n P h a rm a c e u t ic a ls , In c .), en e l q u e la s re g io n e s v a r ia b le s e n d ó g e n a s d e la c a d e n a p e s a d a y lig e ra d e ra tó n s e h a n re e m p la z o , m e d ia n te re c o m b in a c ió n h o m ó lo g a , p o r re g io n e s v a r ia b le s h u m a n a s d e la c a d e n a p e s a d a y lig e ra , u n ie n d o o p e ra t iv a m e n te la s re g io n e s e n d ó g e n a s c o n s ta n te s d e ra tó n , d e m a n e ra q u e lo s ra to n e s q u im é r ic o s (V h u m a n o / C d e ra tó n ) se c u lt iv a n en lo s ra to n e s , y a c o n t in u a c ió n s e c o n v ie r te n p o s te r io rm e n te e n a n t ic u e rp o s c o m p le ta m e n te h u m a n o s u s a n d o la s té c n ic a s d e A D N re c o m b in a n te s c o n v e n c io n a le s ; y ( i i i) e l ra tó n M e M o ® (M e ru s B io p h a rm a c e u t ic a ls , In c .), en e l q u e e l ra tó n c o n t ie n e re g io n e s v a r ia b le s d e s o rg a n iz a d a s d e la c a d e n a p e s a d a y l ig e ra p e ro u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a lig e ra c o m ú n h u m a n a re o rg a n iz a d a . T a le s ra to n e s , y su u so p a ra c u lt iv a r lo s a n t ic u e rp o s , se d e s c r ib e n en , p o r e je m p lo , W O 2009 /15777 , U S 2010 /0069614 , W O 2011 /072204 , W O 2011 /097603 , W O 2011 /163311 , W O 2011 /163314 , W O 2012 /148873 , U S 2012 /0070861 y U S 2012 /0073004.
L o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s h u m a n o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n p re p a ra r u s a n d o m é to d o s d e e x p re s ió n en fa g o p a ra e l c r ib a d o d e g e n o te c a s d e g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a . T a le s m é to d o s d e e x p re s ió n en fa g o p a ra a is la r lo s a n t ic u e rp o s h u m a n o s e s tá n e s ta b le c id o s en la té c n ic a . V é a s e , p o r e je m p lo : el d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.223.409 ; 5.403.484 ; y 5.571.698 d e L a d n e r e t a l.; lo s d o c u m e n to s d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.427.908 y 5.580.717 d e D o w e r e t a l.; lo s d o c u m e n to s d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.969.108 y 6.172.197 d e M c C a ffe r ty e t a l.; y lo s d o c u m e n to s d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.885.793 ; 6.521.404 ; 6.544.731 ; 6.555.313 ; 6 ,582 ,915 y 6 ,593 ,081 d e G r if f i th s e t al.
L o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s h u m a n o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se p u e d e n p re p a ra r u s a n d o ra to n e s S C ID en lo s q u e la s c é lu la s in m u n ita r ia s h u m a n a s se h a n re c o n s t itu id o d e m a n e ra q u e se p u e d e g e n e ra r u n a re s p u e s ta d e a n t ic u e rp o h u m a n o t ra s la in m u n iz a c ió n . T a le s ra to n e s se d e s c r ib e n e n , p o r e je m p lo , los d o c u m e n to s d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 5.476.996 y 5.698.767 d e W ils o n e t al.
Inmunizaciones
P a ra g e n e ra r a n t ic u e rp o s a C D 73 h u m a n a s c o m p le ta s , se p u e d e n in m u n iz a r ra to n e s tra n s g é n ic o s o t r a n s c ro m o s ó m ic o s q u e c o n t ie n e n g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a (p o r e je m p lo , H C o l2 , H C o 7 o K M ) s e p u e d e n in m u n iz a r c o n u n a p re p a ra c ió n p u r if ic a d a o e n r iq u e c id a d e l a n tíg e n o C D 73 y /o c é lu la s q u e e x p re s a n C D 73 , c o m o se d e s c r ib e p a ra o tro s a n tíg e n o s , p o r e je m p lo , p o r L o n b e rg , e t al. (1994 ) Nature 368 (6474 ): 856 -859 ; F is h w ild e t al. (1996 ) Nature Biotechnology 14: 845 -851 y e l d o c u m e n to W O 98 /24884. C o m o a lte rn a t iv a , lo s ra to n e s se p u e d e n in m u n iz a r c o n A D N q u e c o d if ic a C D 73 h u m a n a . P re fe re n te m e n te , lo s ra to n e s s e rá n d e 6 -16 s e m a n a s d e v id a t ra s la p r im e r in fu s ió n . P o r e je m p lo , se p u e d e u s a r u n a p re p a ra c ió n p u r if ic a d a o e n r iq u e c id a (5 -50 | jg ) d e l a n tíg e n o C D 73 re c o m b in a n te p a ra in m u n iz a r lo s ra to n e s H u M a b in t ra p e r ito n e a lm e n te . E n e l s u c e s o d e q u e la s in m u n iz a c io n e s q u e u s a n u n a p re p a ra c ió n p u r if ic a d a o e n r iq u e c id a d e l a n tíg e n o C D 73 n o d a c o m o re s u lta d o a n t ic u e rp o s , lo s ra to n e s ta m b ié n se p u e d e n in m u n iz a r c o n c é lu la s q u e e x p re s e n C D 73 , p o r e je m p lo , u n a lín e a c e lu la r , p a ra p ro m o v e r re s p u e s ta s in m u n ita r ia s . L ín e a s c e lu la re s ilu s tra t iv a s in c lu y e n C H O e s ta b le s q u e s o b re e x p re s a n C D 73 y lín e a s c e lu la re s R a ji.
L a s e x p e r ie n c ia a c u m u la t iv a co n d iv e rs o s a n tíg e n o s h a d e m o s tra d o q u e la re s p u e s ta d e lo s ra to n e s t r a n s g é n ic o s H u A m b e s la m e jo r c u a n d o in ic ia lm e n te se in m u n iz a n in t ra p e r ito n e a lm e n te ( IP ) o s u b c u tá n e a m e n te (S C ) co n a n tíg e n o en a d y u v a n te d e R ib i, s e g u id o d e in m u n iz a c io n e s iP /S C c a d a d o s s e m a n a s (h a s ta un to ta l d e 10 ) co n a n tíg e n o en a d y u v a n te R ib i. S e p u e d e h a c e r un s e g u im ie n to d e la re s p u e s ta in m u n ita r ia d u ra n te e l t ra n s c u rs o d e l p ro to c o lo d e in m u n iz a c ió n c o n m u e s tra s d e p la s m a q u e se o b t ie n e n p o r s a n g ra d o s re tro o rb ita le s . E l p la s m a se p u e d e s o m e te r a c r ib a d o p o r E L IS A y F A C S (c o m o s e d e s c r ib e m á s a d e la n te ) , y se p u e d e n u s a r p a ra la s fu s io n e s ra to n e s c o n s u f ic ie n te t itu la c ió n d e in m u n o g lo b u lin a h u m a n a a n t i-C D 73. L o s ra to n e s se p u e d e n e s t im u la r in tra v e n o s a m e n te co n a n tíg e n o 3 d ía s a n te s d e s a c r if ic io y la e x t irp a c ió n d e l b a z o y lo s n ó d u lo s lin fá t ic o s . S e e s p e ra q u e p u e d a s e r n e c e s a r io re a liz a r 2 -3 fu s io n e s p a ra c a d a in m u n iz a c ió n . E n tre 6 y 24 ra to n e s g e n e ra lm e n te se in m u n iz a n p a ra c a d a a n tíg e n o . N o rm a lm e n te , H C o 7 , H C o 12 y K M . A d e m á s , ta n to e l tra n s g e n H C o 7 c o m o H C o 12 se p u e d e n c r ia r ju n to s en un ú n ic o ra tó n te n ie n d o d o s t r a n s g e n e s h u m a n o s d ife re n te s d e c a d e n a p e s a d a (H C o 7 /H C o 12 ) .
Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a CD73
P a ra g e n e ra r lo s h ib r id o m a s q u e p ro d u c e n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s h u m a n o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , se p u e d e n a is la r e s p le n o c ito s y /o c é lu la s d e l n o d o lin fá t ic o d e ra to n e s in m u n iz a d o s y fu s io n a r a u n a lín e a c e lu la r in m o r ta liz a d a a p ro p ia d a , ta l c o m o u n a lín e a c e lu la r d e m ie lo m a d e ra tó n . L o s h ib r id o m a s re s u lta n te s se p u e d e n s e le c c io n a r en fu n c ió n d e la p ro d u c c ió n d e a n t ic u e rp o s e s p e c íf ic o s a a n tíg e n o . P o r e je m p lo , se p u e d e n fu s io n a r s u s p e n s io n e s d e c é lu la ú n ic a d e l in fo c ito s e s p lé n ic o s d e ra to n e s in m u n iz a d o s a c é lu la s d e m ie lo m a d e ra tó n no s e c re ta d o ra s d e S p 2 /0 (A T C C , C R L 1581 ) c o n P E G a l 50 % . L a s c é lu la s s e c o lo c a n a a p ro x im a d a m e n te 2 x 105 en p la c a d e m ic ro t itu la c ió n d e fo n d o p la n o , s e g u id o d e d o s s e m a n a s d e in c u b a c ió n e n m e d io s e le c t iv o q u e c o n t ie n e 10 % d e s u e ro d e c lo n fe ta l, 18 % d e m e d io s c o n d ic io n a d o s "653 " , 5 % d e o r ig e n ( IG E N ), L -g lu ta m in a 4 m M , p iru v a to s ó d ic o 1 m M , H E P E S 5 m M , 2 -m e rc a p to e ta n o l 0 ,055 m M , 50 u n id a d e s /m l d e p e n ic ilin a , 50 m g /m l d e e s tre p to m ic in a , 50 m g /m l d e g e n ta m ic in a y IX H A T (S ig m a ) . D e s p u é s d e a p ro x im a d a m e n te d o s s e m a n a s , la s c é lu la s se p u e d e n c u lt iv a r en m e d io en e l q u e H A T e s tá re e m p la z a d o p o r hT. L o s p o c illo s in d iv id u a le s a c o n t in u a c ió n se p u e d e n s o m e te r a c r ib a d o m e d ia n te E L IS A p a ra a n t ic u e rp o s IgM e Ig G m o n o c lo n a le s h u m a n o s . U n a v e z q u e se d a el c re c im ie n to d e h ib r id o m a e x te n s o , se p u e d e n o b s e rv a r e l m e d io n o rm a lm e n te d e s p u é s d e 10 -14 d ía s . L o s h ib r id o m a s s e c re ta d o re s d e a n t ic u e rp o s e p u e d e n re e m p la z a r , s o m e te r a c r ib a d o d e n u e v o , y s i a ú n e s p o s it iv o p a ra IgG , lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s se p u e d e n s u b c lo n a r a l m e n o s d o s v e c e s m e d ia n te d ilu c ió n lim ita n te . A c o n t in u a c ió n , s e p u e d e n c u lt iv a r lo s s u b c lo n e s e s ta b le s in vitro p a ra g e n e ra r p e q u e ñ a s c a n t id a d e s d e a n t ic u e rp o en m e d io d e c u lt iv o d e te j id o p a ra la c a ra c te r iz a c ió n .
P a ra p u r if ic a r lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s , s e p u e d e n c u lt iv a r h ib r id o m a s s e le c c io n a d o s e n d o s m a tra c e s g ira to r io s d e d o s lit ro s p a ra la p u r if ic a c ió n d e a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l. L o s s o b re n a d a n te s se p u e d e n f i l t r a r y c o n c e n tra r a n te s d e la c ro m a to g ra f ía p o r a f in id a d co n p ro te ín a A -s e fa ro s a (P h a rm a c ia , P is c a ta w a y , N .J .) . E l Ig G e lu id o se p u e d e c o n tro la r m e d ia n te e le c tro fo re s is en g e l y c ro m a to g ra fía líq u id a d e a lta re s o lu c ió n p a ra a s e g u ra r la p u re z a . La s o lu c ió n ta m p ó n s e p u e d e in te rc a m b ia r e n P B S y la c o n c e n tra c ió n s e p u e d e d e te rm in a r p o r D O 280 u s a n d o 1 ,43 d e c o e f ic ie n te d e e x t in c ió n . L o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s se p u e d e n p o n e r e n a líc u o ta s a -80 °C .
XII. Producción de anticuerpo
Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales a CD73
L o s a n t ic u e rp o s d e la p re s e n te in v e n c ió n s e p u e d e n p ro d u c ir e n un tra n s fe c to m a d e c é lu la h o s p e d a d o ra u s a n d o , p o r L a s c é lu la s m a m ífe ra s p re fe r id a s p a ra la e x p re s ió n d e lo s a n t ic u e rp o s re c o m b in a n te s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to in c lu y e n c é lu la s d e o v a r io d e h á m s te r c h in o (C H O ) ( in c lu y e n d o c é lu la s d h fr -C H O , d e s c r ita s en U r la u b y C h a s in , (1980 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 77 :4216 -4220 , u s a d a s c o n un m a rc a d o r d e s e le c c ió n d e D H F R , p o r e je m p lo , c o m o se d e s c r ib e en R. J. K a u fm a n a n d P. A . S h a rp (1982 ) Mol. Biol. 159 :601 -621 ) , c é lu la s d e m ie lo m a N S O , c é lu la s C O S y c é lu la s S P 2. E n p a rt ic u la r , p a ra su u s o c o n c é lu la s d e m ie lo m a N S O , o tro s is te m a d e e x p re s ió n p re fe r id o e s e l s is te m a d e e x p re s ió n d e l g e n G S d e s c r ito en e l d o c u m e n to W O 87 /04462 , W O 89 /01036 y E P 338.841. C u a n d o s e in tro d u c e n v e c to re s d e e x p re s ió n re c o m b in a n te s q u e c o d if ic a n g e n e s d e a n t ic u e rp o en c é lu la s h o s p e d a d o ra s d e m a m ífe ro , lo s a n t ic u e rp o s se p ro d u c e n c u lt iv a n d o la s c é lu la s h o s p e d a d o ra s d u ra n te un p e r io d o d e t ie m p o s u f ic ie n te p a ra p e rm it ir la e x p re s ió n d e l a n t ic u e rp o e n la s c é lu la s h o s p e d a d o ra s o, m á s p re fe re n te m e n te , la s e c re c ió n d e l a n t ic u e rp o en e l m e d io d e c u lt iv o en e l q u e s e c u lt iv a n la s c é lu la s h o s p e d a d o ra s . L o s a n t ic u e rp o s se p u e d e n re c u p e ra r d e l m e d io d e c u lt iv o u t i l iz a n d o m é to d o s d e p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s c o n v e n c io n a le s .
L o s e x tre m o s N y C d e la s c a d e n a s p o lip e tíd ic a s d e a n t ic u e rp o d e la p re s e n te in v e n c ió n p u e d e n d ife r ir d e la s e c u e n c ia e s p e ra d a d e b id o a la s m o d if ic a c io n e s p o s tra d u c c io n a le s o b s e rv a d a s . P o r e je m p lo , lo s re s to s d e lis in a C -te rm in a le s c o n fre c u e n c ia e s tá n a u s e n te s en la s c a d e n a s p e s a d a s d e a n t ic u e rp o . D ic k e t a l. (2008 ) Biotechnol. Bioeng. 100 :1132 . L o s re s to s d e g lu ta m in a N - te rm in a le s , y re s to s d e g lu ta m a to a un a lc a n c e m e n o r , c o n f re c u e n c ia s e c o n v ie r te n en re s to s d e p iro g lu ta m a to e n ta n to la s c a d e n a s p e s a d a s c o m o lig e ra s d e lo s a n t ic u e rp o s te ra p é u t ic o s . D ic k e t a l. (2007 ) Biotechnol. Bioeng. 97 :544 ; L iu e t a l. (2011 ) JBC 28611211 ; L iu e t a l. (2011 ) J. Biol. Chem.
286 :11211.
XIII. Ensayos
L o s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n e n s a y a r p a ra la u n ió n a C D 73 p o r, p o r e je m p lo , E L IS A c o n v e n c io n a l. E n re s u m e n , se re c u b re n p la c a s d e m ic ro t itu la c ió n c o n C D 73 p u r if ic a d a a 1 -2 p g /m l e n P B S y, a c o n t in u a c ió n , s e b lo q u e a n c o n a lb ú m in a d e s u e ro b o v in o a l 5 % e n P B S . S e a ñ a d e n d ilu c io n e s d e l a n t ic u e rp o (p o r e je m p lo , d ilu c io n e s d e p la s m a d e ra to n e s in m u n iz a d o s co n C D 73 ) a c a d a p o c illo y se in c u b a n d u ra n te 1 -2 h o ra s a 37 °C . L a s p la c a s se la v a n c o n P B S /T w e e n y, a c o n t in u a c ió n , se in c u b a n c o n re a c t iv o s e c u n d a r io (p o r e je m p lo , p a ra a n t ic u e rp o s h u m a n o s , un re a c t iv o p o lic lo n a l e s p e c íf ic o a F c a n t i- Ig G h u m a n a d e c a b ra ) c o n ju g a d o c o n p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te (H R P ) d u ra n te 1 h o ra a 37 °C . D e s p u é s d e la v e r, la s p la c a s se c u lt iv a ro n co n s u s tra to A B T S (M o s s Inc , p ro d u c t: A B T S -1000 ) y se a n a liz a ro n m e d ia n te un e s p e c tro fo tó m e tro a D O 415 -495. A c o n t in u a c ió n , a d e m á s se in v e s t ig a n s u e ro s d e ra to n e s in m u n iz a d o s m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo p a ra la u n ió n a u n a lín e a c e lu la r h u m a n q u e e x p re s a C D 73 h u m a n a , p e ro n o a u n a lín e a c e lu la r c o n tro l q u e n o e x p re s a C D 73. E n re s u m e n , la u n ió n d e a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 se v a lo ra m e d ia n te c é lu la s C H O q u e e x p re s a n C D 73 c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a d ilu c ió n 1 :20. L a s c é lu la s se la v a n y se d e te c ta la u n ió n c o n a n t ic u e rp o a n ti Ig G h u m a n a m a rc a d o c o n P E . L o s a n á lis is d e c ito m e tr ía d e f lu jo se re a liz a n u s a n d o c ito m e tr ía d e f lu jo F A C S c a n (B e c to n D ic k in s o n , S a n J o s é , C A ). P re fe re n te m e n te , lo s ra to n e s q u e d e s a rro lla n la s m a y o re s t itu la c io n e s s e u s a rá n p a ra la s fu s io n e s .
S e p u e d e u s a r un e n s a y o E L IS A c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te p a ra c r ib a d o d e lo s a n t ic u e rp o s y, p o r ta n to , los h ib r id o m a s q u e p ro d u c e n a n t ic u e rp o s q u e m u e s tra n re a c t iv id a d p o s it iv a c o n e l in m u n o g e n d e c D 73. lo s h ib r id o m a s q u e p ro d u c e n a n t ic u e rp o s q u e se u n e n , p re fe re n te m e n te co n a lta a f in id a d , a C D 73 p u e d e n e n to n c e s s u b c lo n a rs e y c a ra c te r iz a rs e m á s . U n c lo n d e c a d a h ib r id o m a , e l c u a l c o n s e rv a la re a c t iv id a d d e la s c é lu la s p a re n ta le s (m e d ia n te E L IS A ) , e n to n c e s se p u e d e n e le g ir p a ra p ro d u c ir un b a n c o c e lu la r, y p a ra la p u r if ic a c ió n d e a n tic u e rp o .
P a ra p u r if ic a r a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 , s e p u e d e n c u lt iv a r h ib r id o m a s s e le c c io n a d o s e n d o s m a tra c e s g ira to r io s d e d o s lit ro s p a ra la p u r if ic a c ió n d e a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l. L o s s o b re n a d a n te s se p u e d e n f i l t r a r y c o n c e n tra r a n te s d e la c ro m a to g ra f ía p o r a f in id a d c o n p ro te ín a A -s e fa ro s a (P h a rm a c ia , P is c a ta w a y , N J ). E l Ig G e lu id o se p u e d e c o n tro la r m e d ia n te e le c t ro fo re s is en g e l y c ro m a to g ra f ía líq u id a d e a lta re s o lu c ió n p a ra a s e g u ra r la p u re z a . L a s o lu c ió n ta m p ó n s e p u e d e in te rc a m b ia r e n P B S y la c o n c e n tra c ió n s e p u e d e d e te rm in a r p o r D O 280 u s a n d o 1 ,43 d e c o e f ic ie n te d e e x t in c ió n . L o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s s e p u e d e n p o n e r e n a líc u o ta s a -80 °C .
P a ra d e te rm in a r s i lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a n t i-C D 73 s e le c c io n a d o s se u n e n a e p íto p o s ú n ic o s , c a d a a n t ic u e rp o se p u e d e s o m e te r a b io t in ila c ió n u s a n d o re a c t iv o s c o m e rc ia lm e n te d is p o n ib le s (P ie rc e , R o c k fo rd , IL). El m A b b io t in ila d o s e p u e d e d e te c ta r c o n u n a s o n d a m a rc a d a p o r e s tre p ta v id in a . L o s e s tu d io s d e c o m p e t ic ió n q u e u s a n a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s n o m a rc a d o s y a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s b io t in ila d o s se p u e d e n re a liz a r u s a n d o p la c a s d e E L IS A re c u b ie r ta s c o n C D 73 c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te .
P a ra d e te rm in a r e l is o t ip o d e lo s a n t ic u e rp o s p u r if ic a d o s , se p u e d e n re a liz a r E L IS A d e is o t ip o u s a n d o re a c t iv o s e s p e c íf ic o s p a ra lo s a n t ic u e rp o s d e un is o t ip o p a rt ic u la r . P o r e je m p lo , p a ra d e te rm in a r e l is o t ip o d e un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l h u m a n o , se p u e d e n re c u b r ir p o c il lo s d e p la c a s d e m ic ro t itu la c ió n co n 1 p g /m l d e a n t i- in m u n o g lo b u lin a h u m a n a d u ra n te u n a n o c h e a 4 °C . D e s p u é s d e b lo q u e a r c o n B S A a l 1 % , la s p la c a s se h a c e n re a c c io n a r co n 1 p g /m l o m e n o s d e a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s d e e n s a y o o c o n tro le s d e is o t ip o p u r if ic a d o , a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te u n a o d o s h o ra s . A c o n t in u a c ió n , lo s p o c il lo s se h a c e n re a c c io n a r c o n s o n d a s c o n ju g a d a s a fo s fa ta s a a lc a lin a e s p e c íf ic a s a IgG 1 h u m a n a o IgM h u m a n a . L a s p la c a s se d e s a rro lla n y se a n a liz a n c o m o se h a d e s c r ito a n te r io rm e n te .
P a ra e n s a y a r la u n ió n d e lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a c é lu la s v iv a s q u e e x p re s a n C D 73 , se p u e d e u s a r c ito m e tr ía d e f lu jo , c o m o s e d e s c r ib e e n lo s E je m p lo s . E n re s u m e n , la s lín e a s c e lu la re s q u e e x p re s a n c D73 u n id a a m e m b ra n a (c u lt iv o b a jo c o n d ic io n e s d e c re c im ie n to c o n v e n c io n a le s ) se m e z c la n c o n d iv e rs a s c o n c e n tra c io n e s d e a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s e n P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0,1 % a 4 °C d u ra n te 1 h o ra . D e s p u é s d e l la v a d o , la s c é lu la s se h a c e n re a c c io n a r c o n a n t ic u e rp o a n t i- Ig G m a rc a d o c o n F lu o re s c e in a b a jo la s m is m a s c o n d ic io n e s q u e la t in c ió n d e a n t ic u e rp o p r im a r ia . L a s m u e s tra s se p u e d e n a n a liz a r p o r in s tru m e n to F A C S c a n u s a n d o p ro p ie d a d e s d e d is p e rs ió n d e lu z y la te ra l a p u e rto s o b re c é lu la ú n ic a s y se d e te rm in a la u n ió n d e lo s a n t ic u e rp o s m a rc a d o s . S e p u e d e u s a r un e n s a y o a lte rn a t iv o q u e u s a m ic ro s c o p ia d e f lu o re s c e n c ia (a d e m á s o en lu g a r d e ) e l e n s a y o d e c ito m e tr ía d e f lu jo . L a s c é lu la s se p u e d e n te ñ ir e x a c ta m e n te c o m o s e ha d e s c r ito a n te r io rm e n te y e x a m in a r m e d ia n te m ic ro s c o p ia d e f lu o re s c e n c ia . E l m é to d o p e rm ite la v is u a liz a c ió n d e la s c é lu la s in d iv id u a le s , p e ro p u e d e te n e r s e n s ib il id a d d is m in u id a d e p e n d ie n d o d e la d e n s id a d d e l a n tíg e n o .
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 a d e m á s se p u e d e n e n s a y a r p a ra la re a c t iv id a d co n e l a n tíg e n o C D 73 m e d ia n te t r a n s fe re n c ia W e s te rn . E n re s u m e n , lo s e x tra c to s d e la c é lu la s q u e e x p re s a C D 73 se p u e d e n p re p a ra r y s o m e te r a e le c tro fo re s is e n g e l d e p o lia c r i la m id a co n d o d e c il s u lfa to d e s o d io . T ra s la e le c tro fo re s is , lo s a n tíg e n o s s e p a ra d o s se t ra n s fe r irá n a m e m b ra n a s d e n it ro c e lu lo s a , b lo q u e a d a s c o n s u e ro d e ra tó n a l 20 % , y s o n d a d a s c o n lo s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a e n s a y a r . L a u n ió n a Ig G se p u e d e d e te c ta r u s a n d o la fo s fa ta s a a lc a lin a a n t i- Ig G y d e s a r ro l la r co n ta b le ta s d e s u s tra to B C IP /N B T . C o ., S t. L o u is , M O ).
L o s m é to d o s p a ra a n a liz a r la a f in id a d d e u n ió n , la re a c t iv id a d c ru z a d a , y la s c in é t ic a s d e u n ió n d e d iv e rs o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 in c lu y e n e n s a y o s c o n v e n c io n a le s c o n o c id o s en la té c n ic a , p o r e je m p lo , a n á lis is p o r re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l B IA C O R E ® (S P R ) u s a n d o un in s tru m e n to d e S P R B IA C O R E ® 2000 (B ia c o re Ab , U p s a la , S u e c ia ) .
XIV. Inmunoconjugados y derivados de anticuerpo
L o s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u s a r p a ra f in e s d ia g n ó s t ic o s , in c lu y e n d o e l e n s a y o d e m u e s tra s y la re a liz a c ió n d e im á g e n e s in vivo, y c o n e s to s f in e s e l a n t ic u e rp o (o e l f ra g m e n to d e u n ió n d e l m is m o ) se p u e d e c o n ju g a r a un a g e n te d e te c ta b le a p ro p ia d o , p a ra fo rm a r un in m u n o c o n ju g a d o . P a ra f in e s d ia g n ó s t ic o s , los a g e n te s a p ro p ia d o s s o n m a rc a d o re s d e te c ta b le s q u e in c lu y e n ra d io is ó to p o s , p a ra la im a g e n c o m p le ta , y ra d io is ó to p o s , e n z im a s , m a rc a d o re s f lu o re s c e n te s y o tra s e t iq u e ta s d e a n t ic u e rp o a d e c u a d a s p a ra e l e n s a y o d e m u e s tra .
L o s m a rc a d o re s d e te c ta b le s p u e d e n s e r d e lo s d iv e rs o s t ip o s u s a d o s a c tu a lm e n te en e l c a m p o d e l d ia g n ó s t ic o in vitro, in c lu y e n d o m a rc a d o re s p a r t ic u la d o s q u e in c lu y e n m e ta l ta l c o m o o ro c o lo id a l, is ó to p o s ta le s c o m o I125 o T c 99 p re s e n ta d o s p o r e je m p lo c o n un a g e n te q u e la n te p e p tíd ic o d e l t ip o N 2S 2, N 3S o N 4, c ro m ó fo ro s in c lu y e n d o m a rc a d o re s f lu o re s c e n te s , b io t in a , m a rc a d o re s lu m in is c e n te s , m a rc a d o re s fo s fo re s c e n te s y s im ila re s , a s í c o m o m a rc a d o re s e n z im á t ic o s q u e c o n v ie r te n un s u s tra to d a d o e n u n m a rc a d o r d e te c ta b le , y e t iq u e ta s d e p o lin u c le ó t id o s q u e s e re v e la n d e s p u é s d e la a m p li f ic a c ió n ta l c o m o p o r re a c c ió n en c a d e n a d e la p o lim e ra s a . E n to n c e s , un a n t ic u e rp o b io t in ila d o s e rá d e te c ta b le p o r u n ió n a a v id in a o e s tre p ta v id in a . M a rc a d o re s e n z im á t ic o s a d e c u a d o s in c lu y e n p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te , fo s fa ta s a a lc a lin a y s im ila re s . P o r e je m p lo , e l m a rc a d o r p u e d e s e r la e n z im a fo s fa ta s a a lc a lin a , d e te c ta d a m id ie n d o la p re s e n c ia o la fo rm a c ió n d e q u im io lu m in is c e n c ia d e s p u é s d e la c o n v e rs ió n d e s u s tra to s d e 1 ,2 d io x e ta n o ta l c o m o a d a m a n t i l m e th o x i fo s fo r i lo x i fe n il d io x e ta n o (A M P P D ) , 3 - (4 - (m e to x is p iro {1 ,2 -d io x e ta n o -3 ,2 '- (5 '- c lo ro ) t r ic ic lo {3.3 .1.1 3 ,7 }d e c a n } -4 - i l) fe n il fo s fa to d e d is o d io (C S P D ), a s í c o m o Cd P y C D P -s ta r® u o tro s s u s tra to s lu m in is c e n te s b ie n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a , p o r e je m p lo , lo s q u e la to s d e la n ta n id a s a d e c u a d a s ta le s c o m o T e rb io ( I I I ) y E u ro p io ( I I I ) . E l s ig n if ic a d o d e la d e te c c ió n s e d e te rm in a p o r e l m a rc a d o r e le g id o . L a a p a r ie n c ia d e l m a rc a d o r o s u s p ro d u c to s d e re a c c ió n s e p u e d e n c o n s e g u ir a s im p le v is ta , e n e l c a s o e n e l q u e e l m a rc a d o r e s p a r t ic u la d o y se a c u m u la a n iv e le s a p ro p ia d o s , o u s a n d o in s tru m e n to s ta le s c o m o un e s p e c tro fo tó m e tro , un lu m in ó m e tro , un f lu o r ím e tro , y s im ila re s , to d o d e a c u e rd o c o n la p rá c t ic a c o n v e n c io n a l.
P re fe re n te m e n te , lo s m é to d o s d e c o n ju g a c ió n d a n c o m o re s u lta d o e n la c e s q u e s o n s u s ta n c ia lm e n te (o c a s i) no in m u n o g é n ic o s , p o r e je m p lo , e n la c e s p é p tid o s (e s d e c ir , a m id a ) , d e s u lfu ro , (e s té r ic a m e n te im p e d id o ) , d is u lfu ro s , h id ra z o n a , y é te r. E s to s e n la c e s so n c a s i no in m u n o g é n ic o s y m u e s tra n e s ta b il id a d ra z o n a b le d e n tro d e l s u e ro (v é a s e , S e n te r , P .D ., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009 ) 235 -244 ; d o c u m e n to W O 2009 /059278 ; W O 95 /17886 ) .
D e p e n d ie n d o d e la n a tu ra le z a b io q u ím ic a d e l re s to y e l a n t ic u e rp o , se p u e d e n e m p le a r d ife re n te s e s tra te g ia s de c o n ju g a c ió n . E n e l c a s o en e l q u e e l re s to e s p o lip é p tid o d e o r ig e n n a tu ra l o re c o m b in a n te d e e n tre 50 a 500 a m in o á c id o s , e x is te n p ro c e d im ie n to s c o n v e n c io n a le s e n lo s lib ro s d e te x to q u e d e s c r ib e n la q u ím ic a p a ra la s ín te s is d e lo s c o n ju g a d o s p ro te ic o s , lo s c u a le s p u e d e n s e r fá c i lm e n te s e g u id o s p o r lo s e x p e r to s (v é a s e , p o r e je m p lo , H a c k e n b e rg e r , C . P. R ., a n d S c h w a rz e r, D ., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008 ) 10030 -10074 ) . E n u n a re a liz a c ió n s e u s a la re a c c ió n d e un re s to m a le in im id o c o n un re s to d e c is te ín a d e n tro d e l a n t ic u e rp o o e l re s to . E s to e s u n a q u ím ic a d e a c o p la m ie n to e s p e c ia lm e n te a d e c u a d a e n e l c a s o d e q u e s e u se , p o r e je m p lo , un fra g m e n to F a b o F a b ' d e un a n t ic u e rp o . A lte rn a t iv a m e n te en u n a re a liz a c ió n se re a liz a e l a c o p la m ie n to a l e x tre m o C - te rm in a l d e l a n t ic u e rp o o e l re s to . L a m o d if ic a c ió n C - te rm in a l d e u n a p ro te ín a , p o r e je m p lo , d e un f ra g m e n to s F a b se p u e d e re a liz a r ta l c o m o s e d e s c r ib e (S u n b u l, M . a n d Y in , J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009 ) 3361 -3371 ).
E n g e n e ra l la re a c c ió n e s p e c íf ic a a s it io y e l a c o p la m ie n to c o v a le n te s e b a s a e n la t r a n s fo rm a c ió n d e un a m in o á c id o n a tu ra l en un a m in o á c id o c o n u n a re a c t iv id a d q u e e s o r to g o n a l a la re a c t iv id a d d e lo s o tro s g ru p o s fu n c io n a le s p re s e n te s . P o r e je m p lo , u n a c is te ín a e s p e c íf ic a d e n tro d e un c o n te x to d e s e c u e n c ia ra ro se p u e d e c o n v e r t ir e n z im á t ic a m e n te en un a ld e h íd o (v é a s e F re s e , M . A ., a n d D ie rk s , T ., ChemBioChem. 10 (2009 ) 425 -427 ) . T a m b ié n e s p o s ib le o b te n e r u n a m o d if ic a c ió n d e a m in o á c id o s d e s e a d a u t il iz a n d o la re a c t iv id a d e n z im á t ic a e s p e c íf ic a d e d e te rm in a d a s e n z im a s c o n un a m in o á c id o n a tu ra l e n un c o n te x to d e s e c u e n c ia d a d o (v é a s e , p o r e je m p lo , T a k i, M . e t a l., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004 ) 119 -126 ; G a u tie r , A . e t a l. C h e m . Biol. 15 (2008 ) 128 -136. L a fo rm a c ió n c a ta liz a d a p o r p ro te a s a d e e n la c e s C -N se d e s c r ib e e n B o rd u s a , F ., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004 ) 389 -403.
L a re a c c ió n e s p e c íf ic a a s it io y e l a c o p la m ie n to c o v a le n te ta m b ié n s e p u e d e c o n s e g u ir m e d ia n te la re a c c ió n s e le c t iv a d e lo s a m in o á c id o s te rm in a le s c o n re a c t iv o s m o d if ic a n te s a p ro p ia d o s . L a re a c t iv id a d d e u n a c is te ín a N - te rm in a l co n b e n z o n it r i lo s (v é a s e , R e n , H. e t a l., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009 ) 9658 -9662 ) s e p u e d e u s a r p a ra c o n s e g u ir un a c o p la m ie n to c o v a le n te e s p e c íf ic o a s it io . E l l ig a m ie n to q u ím ic o n a t iv o ta m b ié n p u e d e d e p e n d e r d e lo s re s to s d e c is te ín a C - te rm in a l ( (T a y lo r , E. V o g e l; Im p e r ia li, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009 ) , 22 (P ro te in E n g in e e r in g ) , 65 -96 ) . E l d o c u m e n to E P 1 074 563 d e s c r ib e un m é to d o d e c o n ju g a c ió n q u e se b a s a en la re a c c ió n m á s rá p id a d e u n a c is te ín a d e n tro d e un t ra m o d e a m in o á c id o s n e g a t iv a m e n te c a rg a d o s q u e u n a c is te ín a lo c a liz a d a e n un t ra m o d e a m in o á c id o s p o s it iv a m e n te c a rg a d o s .
E l re s to ta m b ié n p u e d e s e r un p é p tid o s in té t ic o o un m im é t ic o p e p tíd ic o . E n e l c a s o d e q u e un p o lip é p tid o se s in te t ic e q u ím ic a m e n te , se p u e d e n in c o rp o ra r a m in o á c id o s c o n re a c t iv id a d q u ím ic a o r to g o n a l d u ra n te ta l s ín te s is (v é a s e , d e G ra a f, A . J. e t a l., Bioconjug. Chem. 20 (2009 ) 1281 -1295 ). P u e s to q u e se p u e d e in tro d u c ir u n a g ra n d iv e rs id a d d e g ru p o s fu n c io n a le s o r to g o n a le s e n un p é p tid o s in té t ic o , la c o n ju g a c ió n d e ta l p é p tid o a un e n la z a d o r e s q u ím ic a c o n v e n c io n a l.
P a ra o b te n e r un p o lip é p tid o m o n o m a rc a d o e l c o n ju g a d o c o n e s te q u io m e tr ía 1:1 se p u e d e s e p a ra r m e d ia n te c ro m a to g ra f ía d e o tra c o n ju g a c ió n d e p ro d u c to s s e c u n d a r io s . E s te p ro c e d im ie n to se p u e d e fa c i l i ta r u s a n d o un m ie m b ro d e l p a r d e u n ió n m a rc a d o p o r c o lo ra n te y un e n la z a d o r c a rg a d o . U s a n d o e s te t ip o d e m ie m b ro d e l p a r de u n ió n m a rc a d o y a lta m e n te n e g a t iv a m e n te c a rg a d o , lo s p o lip é p tid o s m o n o c o n ju g a d o s se s e p a ra n fá c ilm e n te d e p o lip é p tid o s n o m a rc a d o s y p o lip é p tid o s q u e p o rta n m á s d e un e n la z a d o r , p u e s to q u e la d ife re n c ia en c a rg a y el p e s o m o le c u la r s e p u e d e n u s a r p o r s e p a ra c ió n . E l c o lo ra n te f lu o re s c e n te p u e d e s e r ú til p a ra p u r if ic a r e l c o m p le jo d e c o m p o n e n te s n o u n id o s , c o m o un e n la z a d o r m o n o v a le n te m a rc a d o .
E n u n a re a liz a c ió n e l re to u n id o a un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o s is te e n un re s to d e u n ió n , un re s to d e m a rc a c ió n , y un re s to b io ló g ic a m e n te a c tiv o .
L o s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se p u e d e n c o n ju g a r a un a g e n te te ra p é u t ic o p a ra fo rm a r un in m u n o c o n ju g a d o ta l c o m o un c o n ju g a d o a n t ic u e rp o - fá rm a c o (A D C ). A g e n te s te ra p é u t ic o s a d e c u a d o s in c lu y e n a n t im e ta b o lito s , a g e n te s a lq u ila n te s , a g lu t in a n te s d e la ra n u ra m e n o r d e l A D N , in te rc a la d o re s d e A D N , re t ic u la n te s d e A D N , in h ib id o re s d e la h is to n a d e s a c e t ila s a , in h ib id o re s d e e x p o r ta c ió n n u c le a r , in h ib id o re s d e p ro te o s o m a , in h ib id o re s d e to p o is o m e ra s a I o II, in h ib id o re s d e la p ro te ín a d e c h o q u e té rm ic o , in h ib id o re s d e t iro s in a q u in a s a , a n t ib ió t ic o s , y a g e n te s a n t i-m itó t ic o s . E n A D C , e l a n t ic u e rp o y e l a g e n te te ra p é u t ic o p re fe re n te m e n te se c o n ju g a n p o r un e n la z a d o r e s c in d ib le ta l c o m o un e n la z a d o r d e p e p tid ilo , d is u lfu ro o h id ra z o n a . M á s p re fe re n te m e n te , e l e n la z a d o r e s un e n la z a d o r d e p e p tid i lo ta l c o m o V a l-C it , A la -V a l, V a l-A la -V a l, L y s -L y s , P ro -V a l-G ly -V a l-V a l (S E Q ID N O : 219 ), A la -A s n -V a l, V a l-L e u -L y s , A la -A la -A s n , C it-C it , V a l-L y s , L ys , C it, S e r, o G lu . L o s A D C se p u e d e n p re p a ra r c o m o se d e s c r ib e en e l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s n .° 7.087.600 ; 6.989.452 ; y 7.129.261 ; L o s d o c u m e n to s d e p u b lic a c ió n P C T W O 02 /096910 ; W O 07 /038658 ; W O 07 /051081 ; W O 07 /059404 ; W O 08 /083312 ; y W O 08 /103693 ; L o s d o c u m e n to s d e p u b lic a c ió n d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s 20060024317 ; 20060004081 ; y 20060247295.
O tro s u s o s p a ra lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 , p o r e je m p lo , c o m o m o n o te ra p ia , se p ro p o rc io n a n en o tra p a rte en el p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , e n la s e c c ió n q u e p e r te n e c e a lo s t ra ta m ie n to s d e c o m b in a c ió n .
M á s e s p e c íf ic a m e n te , e n un A D C , e l a n t ic u e rp o se c o n ju g a a un fá rm a c o , fu n c io n a n d o el a n t ic u e rp o c o m o un a g e n te d ir ig id o p a ra d ir ig ir e l A D C a u n a c é lu la d ia n a q u e e x p re s a su a n tíg e n o , ta l c o m o u n a c é lu la c a n c e ro s a . P re fe re n te m e n te , e l a n tíg e n o e s un a n t íg e n o a s o c ia d o a tu m o r , e s d e c ir , u n o q u e ú n ic a m e n te se e x p re s a o s o b re e x p re s a p o r la c é lu la c a n c e ro s a . U n a v e z a llí, e l fá rm a c o se lib e ra , o b ie n d e n tro d e la c é lu la d ia n a o en su v e c in d a d , p a ra a c tu a r c o m o un a g e n te te ra p é u t ic o . P a ra la re v is ió n s o b re e l m e c a n is m o d e a c c ió n y e l u s o d e A D C e n te ra p ia p a ra e l c á n c e r, v é a s e S c h ra m a e t a l., Nature Rev. Drug Disc. 2006 , 5, 147.
P a ra e l t ra ta m ie n to d e l c á n c e r, e l fá rm a c o p re fe re n te m e n te e s un fá rm a c o c ito tó x ic o q u e c a u s a m u e r te d e la c é lu la c a n c e ro s a d ir ig id a . L o s fá rm a c o s c ito tó x ic o s q u e se p u e d e n u s a r en A D C in c lu y e n lo s s ig u ie n te s t ip o s d e c o m p u e s to s y s u s a n á lo g o s y d e r iv a d o s :
(a ) e n e d iin a s ta le s c o m o c a liq u e a m ic in a (v é a s e , p o r e je m p lo , L e e e t a l., J. Am. Chem. Soc. 1987 , 109 , 3464 y 3466 ) y u n c ia lm a c in a (v é a s e , p o r e je m p lo , D a v ie s e t a l, W O 2007 /038868 A 2 (2007 ) y C h o w d a r i e t a l., u S 8.709.431 B 2 (2012 ));
(b ) tu b u l is in a s (v é a s e , p o r e je m p lo , D o m lin g e t a l., U S 7.778.814 B 2 (2010 ) ; C h e n g e t a l., U S 8.394.922 B 2 (2013 ) ; y C o n g e t a l., U S 2014 /0227295 A 1 ;
(c ) C C -1065 y d u o c a rm ic in a (v é a s e , p o r e je m p lo , B o g e r , U S 6.5458.530 B1 (2003 ) ; S u fi e t a l., U S 8.461.117 B 2 (2013 ) ; y Z h a n g e t a l., U S 2012 /0301490 A1 (2012 ));
(d ) e p o ti lo n a s (v é a s e , p o r e je m p lo , V ite e t a l., U S 2007 /0275904 A 1 (2007 ) y U S R E 42930 E (2011 ));
(e ) a u r is ta t in a s (v é a s e , p o r e je m p lo , S e n te r e t a l., U S 6.844.869 B 2 (2005 ) y D o ro n in a e t a l., U S 7.498.298 B 2 (2009 ));
( f) d ím e ro s d e p ir ro lo b e z o d ia z e p in a (P B D ) (v é a s e , p o r e je m p lo , H o w a rd e t a l., U S 2013 /0059800 A 1 (2013 ) ; U S 2013 /0028919 A1 (2013 ); y W O 2013 /041606 A1 (2013 )) ; y
(g ) m a ita n s in o id e s ta le s c o m o D M 1 y D M 4 (v é a s e , p o r e je m p lo , C h a r i e t a l., U S 5.208.020 (1993 ) y A m p h le t t e t a l., U S 7.374.762 B 2 (2008 )).
XV. Moléculas específicas
L o s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e u s a r p a ra fo rm a r m o lé c u la s b ie s p e c íf ic a s . U n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , o p o rc io n e s d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o , se p u e d e d e r iv a t iz a r o u n ir a o tra m o lé c u la fu n c io n a l, p o r e je m p lo , o tro p é p tid o o p ro te ín a (p o r e je m p lo , o tro a n t ic u e rp o o lig a n d o p a ra un re c e p to r ) p a ra g e n e ra r u n a m o lé c u la b ie s p e c íf ic a q u e se u n e a a l m e n o s d o s s it io s d e u n ió n d ife re n te s o m o lé c u la s d ia n a . E l a n t ic u e rp o d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to d e h e c h o s e d e r iv a o e s tá u n id o a m á s d e u n a o tra m o lé c u la fu n c io n a l p a ra g e n e ra r m o lé c u la s m u lt ie s p e c í f ic a s q u e se u n e n a m á s d e d o s s it io s d e u n ió n d ife re n te s y /o m o lé c u la s d ia n a ; ta le s m o lé c u la s m u lt ie s p e c í f ic a s ta m b ié n s e p re te n d e q u e s e a b a rq u e n p o r la e x p re s ió n "m o lé c u la b ie s p e c íf ic a " c o m o se u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to . P a ra c re a r u n a m o lé c u la b ie s p e c íf ic a d e s c r ita en e l p re s e n te d o c u m e n to , un a n t ic u e rp o d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e e s ta r fu n c io n a lm e n te u n id o (p o r e je m p lo , p o r a c o p la m ie n to q u ím ic o , fu s ió n g e n é t ic a , a s o c ia c ió n n o c o v a le n te o d e o tra m a n e ra ) a u n a o m á s m o lé c u la s d e u n ió n d ife re n te s , ta l c o m o o tro a n t ic u e rp o , f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o , p é p tid o o m im é t ic o d e u n ió n , d e m a n e ra q u e re s u lta u n a m o lé c u la b ie s p e c íf ic a .
P o r c o n s ig u ie n te , en e l p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n m o lé c u la s b ie s p e c íf ic a s q u e c o m p re n d e n a l m e n o s u n a p r im e ra e s p e c if ic id a d d e u n ió n p a ra C D 73 y u n a s e g u n d a e s p e c if ic id a d d e u n ió n p a ra un s e g u n d o e p íto p o d ia n a . En u n a re a liz a c ió n d e s c r ita e n e l p re s e n te d o c u m e n to e n la q u e la m o lé c u la b ie s p e c íf ic a e s m u lt ie s p e c íf ic a , la m o lé c u la a d e m á s p u e d e in c lu ir u n a te rc e ra e s p e c if ic id a d d e u n ió n .
E n u n a re a liz a c ió n , la s m o lé c u la s b ie s p e c íf ic a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to c o m p re n d e n c o m o u n a e s p e c if ic id a d d e u n ió n a l m e n o s un a n t ic u e rp o , o un fra g m e n to a n t ic u e rp o d e l m is m o , in c lu y e n d o , p o r e je m p lo , un F a b , F a b ', F (a b ')2, F v, o un F v d e c a d e n a s e n c il la . E l a n t ic u e rp o ta m b ié n p u e d e s e r un d ím e ro d e c a d e n a lig e ra y c a d e n a p e s a d a , o c u a lq u ie r f ra g m e n to m ín im o d e l m is m o ta l c o m o un F v o u n a c o n s tru c c ió n d e c a d e n a s e n c il la c o m o s e d e s c r ib e e n L a d n e r e t a l, d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 4.946.778.
L a u n ió n d e la s m o lé c u la s b ie s p e c íf ic a s a s u s d ia n a s e s p e c íf ic a s s e p u e d e n c o n f irm a r u s a n d o m é to d o s re c o n o c id o s p o r la té c n ic a , ta le s c o m o e n s a y o in m u n o a b s o rb e n te lig a d o a e n z im a (E L IS A ), ra d io in m u n o e n s a y o (R IA ), a n á lis is F A C S , b io e n s a y o (p o r e je m p lo , in h ib ic ió n d e l c re c im ie n to ) , o e n s a y o d e t r a n s fe re n c ia W e s te rn . C a d a u n o d e e s to s e n s a y o s g e n e ra lm e n te d e te c ta n la p re s e n c ia d e c o m p le jo s p ro te ín a -a n t ic u e rp o d e p a r t ic u la r in te ré s e m p le a n d o un re a c t iv o m a rc a d o (p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o ) e s p e c íf ic o p a ra e l c o m p le jo d e in te ré s .
XVI. Composiciones
A d e m á s se p ro p o rc io n a n c o m p o s ic io n e s , p o r e je m p lo , u n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a , q u e c o n t ie n e n u n o o u n a c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 , o p o rc ió n (e s ) d e u n ió n a a n tíg e n o d e lo s m is m o s , c o m o se d e s c r ib e en el p re s e n te d o c u m e n to , fo rm u la d o s ju n to c o n un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le . T a le s c o m p o s ic io n e s p u e d e n in c lu ir u n o o u n a c o m b in a c ió n d e (p o r e je m p lo , d o s o m á s d ife re n te s ) a n t ic u e rp o s o in m u n o c o n ju g a d o s o m o lé c u la s b ie s p e c íf ic a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to . P o r e je m p lo , u n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a d e s c r ita en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e c o m p re n d e r u n a c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s ( in m u n o c o n ju g a d o s o b ie s p e c íf ic o s ) q u e se u n e n a d ife re n te s e p í to p o s e n e l a n t íg e n o d ia n a o q u e t ie n e n a c t iv id a d e s c o m p le m e n ta r ia s . L a s c o m p o s ic io n e s d e la in v e n c ió n c o m p re n d e n e l a n t ic u e rp o d e la in v e n c ió n y un v e h íc u lo a c e p ta b le .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , u n a c o m p o s ic ió n c o m p re n d e un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a u n a c o n c e n tra c ió n d e a l m e n o s 1 m g /m l, 5 m g /m l, 10 m g /m l, 50 m g /m l, 100 m g /m l, 150 m g /m l, 200 m g /m l, 1 -300 m g /m l, o 100 -300 m g /m l.
L a s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n p u e d e n a d m in is t ra rs e e n te ra p ia d e c o m b in a c ió n , e s d e c ir , c o m b in a d a s c o n o tro s a g e n te s . P o r e je m p lo , la te ra p ia d e c o m b in a c ió n p u e d e in c lu ir un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to c o m b in a d o c o n a l m e n o s o tro a g e n te a n t i-c á n c e r y /o e s t im u la n te d e lin fo c ito T (p o r e je m p lo , a c t iv a d o r ) . E je m p lo s d e a g e n te s te ra p é u t ic o s q u e se p u e d e n u s a r en la te ra p ia d e c o m b in a c ió n se d e s c r ib e n en m a y o r d e ta l le a c o n t in u a c ió n en la s e c c ió n s o b re u s o s d e lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s te ra p é u t ic a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e n in c lu ir o tro s c o m p u e s to s , fá rm a c o s , y /o a g e n te s u s a d o s p a ra e l t ra ta m ie n to d e c á n c e r. S e p u e d e n in c lu ir ta le s c o m p u e s to s , fá rm a c o s , y /o a g e n te s , p o r e je m p lo , fá rm a c o s q u im io te ra p é u t ic o s , fá rm a c o s d e m o lé c u la p e q u e ñ a o a n t ic u e rp o s q u e e s t im u la n la re s p u e s ta in m u n e a un c á n c e r d a d o . E n a lg u n o s c a s o s , la s c o m p o s ic io n e s te ra p é u t ic a s p u e d e n in c lu ir , p o r e je m p lo , u n o o m á s d e lo s a g e n te s e n u m e ra d o s e n la s e c c ió n o te ra p ia s d e c o m b in a c ió n .
C o m o se u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , " v e h íc u lo fa rm a c é u tic a m e n te a c e p ta b le " in c lu y e c u a lq u ie ra y to d o s los d is o lv e n te s , m e d io s d e d is p e rs ió n , re c u b r im ie n to s , a g e n te s a n t ib a c te r ia n o s y a n t ifú n g ic o s , a g e n te s is o tó n ic o s y a g e n te s re ta rd a n te s d e la a b s o rc ió n , y s im ila re s , q u e s e a n f is io ló g ic a m e n te c o m p a t ib le s . P re fe re n te m e n te , e l v e h íc u lo e s a d e c u a d o p a ra in tra v e n o s a , in tra m u s c u la r , s u b c u tá n e a , p a re n te ra l, e s p in a l o e p id é rm ic a (p o r e je m p lo , m e d ia n te in y e c c ió n o in fu s ió n ) . D e p e n d ie n d o d e la v ía d e a d m in is tra c ió n , e l c o m p u e s to a c t iv o , e s d e c ir , a n t ic u e rp o , in m u n o c o n ju g a d o o m o lé c u la b ie s p e c íf ic a , se p u e d e re c u b r ir c o n un m a te r ia l p a ra p ro te g e r e l c o m p u e s to d e la a c c ió n d e lo s á c id o s y d e o tra s c o n d ic io n e s n a tu ra le s q u e p u e d e n in a c t iv a r e l c o m p u e s to .
L o s c o m p u e s to s fa rm a c é u t ic o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e n in c lu ir u n a o m á s s a le s fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le s . U n a "s a l fa rm a c é u tic a m e n te a c e p ta b le " se re f ie re a u n a s a l q u e c o n s e rv a la a c t iv id a d b io ló g ic a d e s e a d a d e l c o m p u e s to p a re n ta l y q u e no p ro d u c e n in g ú n e fe c to to x ic o ló g ic o in d e s e a d o (v é a s e , p o r e je m p lo , B e rg e , S .M ., e t a l. (1977 ) J. Pharm. Sci. 66 :1 -19 ) . L o s e je m p lo s d e d ic h a s s a le s in c lu y e n s a le s de a d ic ió n d e á c id o y s a le s d e a d ic ió n d e b a s e s . L a s s a le s d e a d ic ió n d e á c id o s in c lu y e n la s d e r iv a d a s d e á c id o s in o rg á n ic o s n o tó x ic o s , ta le s c o m o á c id o c lo rh íd r ic o , n ítr ic o , fo s fó r ic o , s u lfú r ic o , b ro m h íd r ic o , h y d ro y ó d ic o , fo s fo ro s o y s im ila re s , a s í c o m o d e á c id o s o rg á n ic o s n o tó x ic o s , ta le s c o m o á c id o s a lifá t ic o s m o n o c a rb o x í lic o s y d ic a rb o x í lic o s , á c id o s a lc a n ó ic o s s u s t itu id o s co n fe n ilo , á c id o s h id ro x ia lc a n o ic o s , á c id o s a ro m á tic o s , á c id o s s u lfó n ic o s a l ifá t ic o s y a ro m á tic o s , y s im ila re s . L a s s a le s d e a d ic ió n d e b a s e s in c lu y e n a q u e l la s d e r iv a d a s d e m e ta le s a lc a lin o té r re o s , ta le s c o m o s o d io , p o ta s io , m a g n e s io , c a lc io y s im ila re s , a s í c o m o d e a m in a s o rg á n ic a s n o tó x ic a s , ta le s c o m o N ,N '-d ib e n c ile t i le n d ia m in a , N -m e t ilg lu c a m in a , c lo ro p ro c a ín a , c o lin a , d ie ta n o la m in a , e t i le n d ia m in a , p ro c a ín a y s im ila re s .
U n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a d e s c r ita en e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n p u e d e in c lu ir un a n t io x id a n te fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le . E je m p lo s d e a n t io x id a n te s fa rm a c é u tic a m e n te a c e p ta b le s in c lu y e n : (1 ) a n t io x id a n te s s o lu b le s en a g u a , ta le s c o m o á c id o a s c ó rb ic o , c lo rh id ra to d e c is te ín a , b is u lfa to d e s o d io , m e ta b is u lf ito d e s o d io , s u lf ito d e s o d io y s im ila re s ; (2 ) a n t io x id a n te s s o lu b le s en a c e ite , ta le s c o m o p a lm ita to d e a s c o rb ilo , h id ro x ia n is o l b u t ila d o (B H A ), h id ro x ito lu e n o b u t ila d o (B H T ), le c it in a , g a la to d e p ro p ilo , a lfa - to c o fe ro l y s im ila re s ; y (3 ) a g e n te s q u e la n te s d e m e ta l, ta le s c o m o á c id o c ítr ic o , á c id o e t ile n d ia m in o te t ra a c é t ic o (E D T A ), s o rb ito l, á c id o ta r tá r ic o , á c id o fo s fó r ic o y s im ila re s .
E je m p lo s d e v e h íc u lo s a c u o s o s y n o a c u o s o s a d e c u a d o s q u e p u e d e n e m p le a rs e en la s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s d e s c r ita s e n e l p re s e n te d o c u m e n to in c lu y e n a g u a , e ta n o l, p o lio le s ( ta le s c o m o g lic e ro l, p ro p ile n g lic o l, p o lie t i le n g l ic o l y s im ila re s ) y m e z c la s a d e c u a d a s d e lo s m is m o s , a c e ite s v e g e ta le s , ta le s c o m o a c e ite d e o liv a y é s te re s o rg á n ic o s in y e c ta b le s , ta le s c o m o o le a to d e e tilo . L a f lu id e z a d e c u a d a se p u e d e m a n te n e r, p o r e je m p lo , m e d ia n te e l u s o d e m a te r ia le s d e re c u b r im ie n to , ta l c o m o le c it in a , m e d ia n te e l m a n te n im ie n to d e l ta m a ñ o d e p a rt íc u la n e c e s a r io e n c a s o d e d is p e rs io n e s , y m e d ia n te e l u s o d e te n s io a c t iv o s .
E s ta s c o m p o s ic io n e s ta m b ié n p u e d e n c o n te n e r a d y u v a n te s ta le s c o m o a g e n te s c o n s e rv a n te s , a g e n te s h u m e c ta n te s , a g e n te s e m u ls io n a n te s y a g e n te s d is p e rs a n te s . L a p re v e n c ió n d e la p re s e n c ia d e m ic ro o rg a n is m o s p u e d e g a ra n t iz a rs e m e d ia n te p ro c e d im ie n to s d e e s te r il iz a c ió n , supra, y m e d ia n te la in c lu s ió n d e v a r io s a g e n te s a n t ib a c te r ia n o s y a n t ifú n g ic o s , p o r e je m p lo , p a ra b e n o , c lo ro b u ta n o l, fe n o l d e á c id o s ó rb ic o y s im ila re s . T a m b ié n p u e d e s e r d e s e a b le in c lu ir a g e n te s is o tó n ic o s , ta le s c o m o a z ú c a re s , c lo ru ro s ó d ic o y s im ila re s e n la s c o m p o s ic io n e s . A d e m á s , la a b s o rc ió n p ro lo n g a d a d e la fo rm a fa rm a c é u t ic a in y e c ta b le se p u e d e l le v a r a c a b o m e d ia n te la in c lu s ió n d e a g e n te s q u e re tra s e n la a b s o rc ió n , ta le s c o m o m o n o e s te a ra to d e a lu m in io y g e la t in a .
L o s v e h íc u lo s fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le s in c lu y e n s o lu c io n e s a c u o s a s e s té r ile s o d is p e rs io n e s y p o lv o s e s té r ile s p a ra la p re p a ra c ió n e x te m p o rá n e a d e s o lu c io n e s e s té r ile s in y e c ta b le s o d is p e rs io n e s . E l u so d e d ic h o s m e d io s y a g e n te s p a ra s u s ta n c ia s fa rm a c é u t ic a m e n te a c t iv a s e s c o n o c id o e n la té c n ic a . E x c e p to e n e l c a s o d e q u e c u a lq u ie r a g e n te o m e d io c o n v e n c io n a l s e a in c o m p a t ib le c o n e l c o m p u e s to a c t iv o , s e c o n te m p la su u s o e n la s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to . T a m b ié n p u e d e n in c o rp o ra rs e c o m p u e s to s a c t iv o s c o m p le m e n ta r io s e n la s c o m p o s ic io n e s .
N o rm a lm e n te , la s c o m p o s ic io n e s te ra p é u t ic a s d e b e n s e r e s té r ile s y e s ta b le s e n la s c o n d ic io n e s d e fa b r ic a c ió n y a lm a c e n a m ie n to . L a c o m p o s ic ió n p u e d e fo rm u la rs e c o m o u n a s o lu c ió n , m ic ro e m u ls ió n , lip o s o m a u o tra e s tru c tu ra o rd e n a d a a d e c u a d a p a ra la a lta c o n c e n tra c ió n d e fá rm a c o . E l v e h íc u lo p u e d e s e r un d is o lv e n te o m e d io de d is p e rs ió n q u e c o n tie n e , p o r e je m p lo , a g u a , e ta n o l, p o lio l (p o r e je m p lo , g lic e ro l, p ro p ile n g lic o l y p o lie t i le n g lic o l líq u id o , y s im ila re s ) y m e z c la s a d e c u a d a s d e lo s m is m o s . L a f lu id e z a p ro p ia d a p u e d e m a n te n e rs e , p o r e je m p lo , m e d ia n te e l u s o d e un re c u b r im ie n to ta l c o m o le c it in a , m e d ia n te e l m a n te n im ie n to d e l ta m a ñ o d e p a r t íc u la n e c e s a r io en e l c a s o d e u n a d is p e rs ió n y m e d ia n te e l u s o d e te n s io a c t iv o s . E n m u c h o s c a s o s , s e rá p re fe r ib le in c lu ir a g e n te s is o tó n ic o s , p o r e je m p lo , a z ú c a re s , p o lia lc o h o le s ta le s c o m o m a n ito l, s o rb ito l o c lo ru ro s ó d ic o en la c o m p o s ic ió n . La a b s o rc ió n p ro lo n g a d a d e la s c o m p o s ic io n e s in y e c ta b le s s e p u e d e lo g ra r in c lu y e n d o e n la c o m p o s ic ió n un a g e n te q u e re tra s e la a b s o rc ió n , p o r e je m p lo , s a le s d e m o n o e s te a ra to y g e la t in a .
L a s s o lu c io n e s in y e c ta b le s e s té r i le s s e p u e d e n p re p a ra r in c o rp o ra n d o e l c o m p u e s to a c t iv o e n la c a n t id a d n e c e s a r ia en un d is o lv e n te a d e c u a d o c o n u n o o u n a c o m b in a c ió n d e lo s in g re d ie n te s e n u m e ra d o s a n te r io rm e n te , s e g ú n s e a n e c e s a r io , s e g u id o d e e s te r i l iz a c ió n p o r m ic ro f ilt ra c ió n . G e n e ra lm e n te , la s d is p e rs io n e s s e p re p a ra n in c o rp o ra n d o e l c o m p u e s to a c t iv o en un v e h íc u lo e s té r il q u e c o n t ie n e un m e d io d e d is p e rs ió n b á s ic o y lo s o tro s in g re d ie n te s re q u e r id o s d e lo s e n u m e ra d o s a n te r io rm e n te . E n e l c a s o d e p o lv o s e s té r ile s p a ra la p re p a ra c ió n d e s o lu c io n e s in y e c ta b le s e s té r ile s , lo s m é to d o s d e p re p a ra c ió n p re fe r id o s s o n e l s e c a d o a l v a c ío y e l s e c a d o en f r ío ( l io f i l iz a c ió n ) q u e p ro d u c e n un p o lv o d e l p r in c ip io a c t iv o m á s c u a lq u ie r in g re d ie n te a d ic io n a l d e s e a d o a p a r t ir u n a s o lu c ió n d e l m is m o p re v ia m e n te e s te r il iz a d a p o r f i lt ra c ió n .
L a c a n t id a d d e p r in c ip io a c t iv o q u e se p u e d e c o m b in a r c o n un m a te r ia l v e h íc u lo p a ra p ro d u c ir u n a s o la fo rm a de d o s if ic a c ió n v a r ia rá d e p e n d ie n d o d e l s u je to a t ra ta r , y e l m o d o p a r t ic u la r d e a d m in is t ra c ió n . L a c a n t id a d d e p r in c ip io a c t iv o q u e s e p u e d e c o m b in a r c o n un m a te r ia l p o r ta d o r p a ra p ro d u c ir u n a s o la fo rm a fa rm a c é u t ic a , e n g e n e ra l, s e rá la c a n t id a d d e la c o m p o s ic ió n q u e p ro d u z c a un e fe c to te ra p é u t ic o . G e n e ra lm e n te , d e un c ie n p o r c ie n to , e s ta c a n t id a d o s c ila rá d e s d e a p ro x im a d a m e n te e l 0 ,01 p o r c ie n to a a p ro x im a d a m e n te e l n o v e n ta p o r c ie n to d e l p r in c ip io a c t iv o , p re fe re n te m e n te d e s d e a p ro x im a d a m e n te e l 0 ,1 p o r c ie n to a a p ro x im a d a m e n te e l 70 p o r c ie n to , m á s p re fe re n te m e n te d e s d e a p ro x im a d a m e n te 1 p o r c ie n to a a p ro x im a d a m e n te 30 p o r c ie n to d e p r in c ip io a c t iv o ju n to co n un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le .
L o s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n se a ju s ta n p a ra p ro p o rc io n a r la re s p u e s ta ó p t im a d e s e a d a (p o r e je m p lo , u n a re s p u e s ta te ra p é u t ic a ) . P o r e je m p lo , se p u e d e a d m in is t r a r un ú n ic o b o lo , se p u e d e n a d m in is t r a r v a r ia s d o s is d iv id id a s a lo la rg o d e l t ie m p o o se p u e d e re d u c ir o a u m e n ta r p ro p o rc io n a lm e n te la d o s is s e g ú n se in d iq u e p o r las e x ig e n c ia s d e la s itu a c ió n te ra p é u t ic a . E s e s p e c ia lm e n te v e n ta jo s o fo rm u la r la s c o m p o s ic io n e s p a re n te ra le s en fo rm a d e d o s is u n ita r ia p a ra fa c i l i ta r la a d m in is tra c ió n y la u n ifo rm id a d d e la d o s is . La fo rm a d e d o s if ic a c ió n u n ita r ia u s a d a en e l p re s e n te d o c u m e n to se re f ie re a u n id a d e s f ís ic a m e n te d is c re ta s a d e c u a d a s c o m o d o s if ic a c io n e s u n ita r ia s p a ra lo s s u je to s a tra ta r ; c a d a u n id a d c o n t ie n e u n a c a n t id a d p re d e te rm in a d a d e c o m p u e s to a c t iv o c a lc u la d a p a ra p ro d u c ir e l e fe c to te ra p é u t ic o d e s e a d o en a s o c ia c ió n c o n e l v e h íc u lo fa rm a c é u tic o re q u e r id o . L a m e m o r ia d e s c r ip t iv a p a ra la s fo rm a s d e u n id a d d e d o s if ic a c ió n d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to e s tá d ic ta d a p o r y d e p e n d ie n te d ire c ta m e n te d e (a ) la s c a ra c te r ís t ic a s ú n ic a s d e l c o m p u e s to a c t iv o y e l e fe c to te ra p é u t ic o p a r t ic u la r q u e se v a a lo g ra r , y (b ) la s l im ita c io n e s in h e re n te s en la té c n ic a d e la c o m p o s ic ió n d e ta l c o m p u e s to a c t iv o p a ra e l t ra ta m ie n to d e s e n s ib il id a d e n in d iv id u o s .
P a ra la a d m in is tra c ió n d e l a n t ic u e rp o , la d o s if ic a c ió n o s c ila d e s d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,0001 a 100 m g /k g , y m á s n o rm a lm e n te 0 ,01 a 5 m g /k g , d e l p e s o c o rp o ra l d e l h u é s p e d . P o r e je m p lo la s d o s if ic a c io n e s p u e d e n s e r 0 ,3 m g /k g d e p e s o c o rp o ra l, 1 m g /k g d e p e s o c o rp o ra l, 3 m g /k g d e p e s o c o rp o ra l, 5 m g /k g d e p e s o c o rp o ra l o 10 m g /k g de p e s o c o rp o ra l o e n e l in te rv a lo d e 1 -10 m g /k g . U n ré g im e n d e tra ta m ie n to i lu s tra t iv o im p lic a la a d m in is tra c ió n u n a v e z a l d ía , u n a v e z c a d a d o s s e m a n a s , u n a v e z c a d a t re s s e m a n a s , u n a v e z c a d a c u a tro s e m a n a s , u n a v e z a l m e s , u n a v e z c a d a 3 m e s e s o u n a v e z c a d a tre s a 6 m e s e s .
E n a lg u n o s m é to d o s , d o s o m á s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s c o n d ife re n te s e s p e c if ic id a d e s d e u n ió n se a d m in is tra n s im u ltá n e a m e n te , en e s e c a s o , la d o s is d e c a d a a n t ic u e rp o a d m in is t ra d o c a e d e n tro d e lo s ra n g o s in d ic a d o s . El a n t ic u e rp o n o rm a lm e n te se a d m in is t ra en o c a s io n e s m ú ltip le s . L o s in te rv a lo s e n tre d o s is in d iv id u a le s p u e d e n se r, p o r e je m p lo , s e m a n a lm e n te , m e n s u a lm e n te , c a d a tre s m e s e s o a n u a lm e n te . L o s in te rv a lo s ta m b ié n p u e d e n s e r ir re g u la re s c o m o s e in d ic a m id ie n d o lo s n iv e le s s a n g u ín e o s d e a n t ic u e rp o p a ra e l a n t íg e n o d ia n a e n e l p a c ie n te . E n a lg u n o s m é to d o s , la d o s is se a ju s ta p a ra c o n s e g u ir u n a c o n c e n tra c ió n d e a n t ic u e rp o en p la s m a d e a p ro x im a d a m e n te 1 -1.000 p g /m l y e n a lg u n o s m é to d o s a p ro x im a d a m e n te 25 --300 p g /m l.
U n a n t ic u e rp o se p u e d e a d m in is t ra r c o m o u n a fo rm u la c ió n d e lib e ra c ió n s o s te n id a , en c u y o c a s o se re q u ie re u n a a d m in is t ra c ió n m e n o s f re c u e n te . L a d o s if ic a c ió n y la f re c u e n c ia p u e d e n v a r ia r d e p e n d ie n d o d e la s e m iv id a d e l a n t ic u e rp o e n e l p a c ie n te . E n g e n e ra l, lo s a n t ic u e rp o s h u m a n o s m u e s tra n la m a y o r s e m iv id a , s e g u id o d e a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s , a n t ic u e rp o s q u im é r ic o s , y a n t ic u e rp o s no h u m a n o s . L a d o s if ic a c ió n y la f r e c u e n c ia d e a d m in is tra c ió n p u e d e n v a r ia r d e p e n d ie n d o d e s i e l t ra ta m ie n to e s p ro f ilá c t ic o o te ra p é u t ic o . E n a p lic a c io n e s p ro f ilá c t ic a s , se a d m in is tra u n a d o s if ic a c ió n re la t iv a m e n te b a ja a in te rv a lo s re la t iv a m e n te in fre c u e n te s d u ra n te un p e r io d o d e t ie m p o la rg o . A lg u n o s p a c ie n te s c o n t in ú a n re c ib ie n d o tra ta m ie n to e l re s to d e s u s v id a s . E n a p lic a c io n e s te ra p é u t ic a s , a v e c e s se re q u ie re u n a d o s is re la t iv a m e n te a lta a in te rv a lo s re la t iv a m e n te c o r to s h a s ta q u e la p ro g re s ió n d e la e n fe rm e d a d se re d u z c a o te rm in e , y h a s ta q u e e l p a c ie n te m u e s tre u n a m e jo r ía p a rc ia l o c o m p le ta d e lo s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d . D e s p u é s d e e so , a l p a c ie n te s e le p u e d e a d m in is t ra r un ré g im e n p ro f ilá c t ic o .
L o s n iv e le s re a le s d e d o s if ic a c ió n d e lo s p r in c ip io s a c t iv o s en la s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s d e s c r ita s en el p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n v a r ia r p a ra o b te n e r u n a c a n t id a d d e l p r in c ip io a c t iv o q u e s e a e f ic a z p a ra c o n s e g u ir la re s p u e s ta te ra p é u t ic a d e s e a d a p a ra un p a c ie n te , c o m p o s ic ió n y m o d o d e a d m in is tra c ió n p a rt ic u la r , s in q u e s e a n tó x ic o s p a ra e l p a c ie n te . E l n iv e l d e d o s if ic a c ió n s e le c c io n a d o d e p e n d e rá d e v a r io s fa c to re s fa rm a c o c in é t ic o s q u e fá rm a c o q u e t ie n e c o m p a r t im e n to s m u lt ic á m a ra ; y e l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 4.475.196 , q u e d e s v e la un s is te m a d e a d m in is tra c ió n o s m ó tic a d e fá rm a c o . M u c h o s o tro s d e e s to s im p la n te s , s is te m a s d e a d m in is tra c ió n y m ó d u lo s s o n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s e n la m a te r ia .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n fo rm u la r p a ra a s e g u ra r la d is tr ib u c ió n a p ro p ia d a in vivo. P o r e je m p lo , la b a rre ra h e m a to e n c e fá lic a (B H M ) e x c lu y e m u c h o s c o m p u e s to s a lta m e n te h id ro f í l ic o s . P a ra a s e g u ra r q u e lo s c o m p u e s to s te ra p é u t ic o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to c ru c e n la B B B (s i se d e s e a ) , se p u e d e n fo rm u la r , p o r e je m p lo , en lip o s o m a s . P a ra lo s m é to d o s d e fa b r ic a c ió n d e lip o s o m a s , v é a s e , p o r e je m p lo , lo s d o c u m e n to d e P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s 4.522.811 ; 5.374.548 ; y 5.399.331. L o s lip o s o m a s p u e d e n c o m p re n d e r u n o o m á s g ru p o s q u e se t r a n s p o r ta n d e m a n e ra s e le c t iv a en c é lu la s u ó rg a n o s e s p e c íf ic o s , m e jo ra n d o d e e s te m o d o la a d m in is t ra c ió n d ir ig id a d e fá rm a c o (v é a s e , p o r e je m p lo , V .V . R a n a d e (1989 ) J. Clin. Pharmacol. 29 :685 ) . L o s re s to s d ir ig id o s ilu s t ra t iv o s in c lu y e n fo la to o b io t in a (v é a s e , p o r e je m p lo , e l d o c u m e n to d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s 5.416.016 p a ra L o w e t a l.); m a n ó s id o s (U m e z a w a e t a l., (1988 ) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 :1038 ) ; a n t ic u e rp o s (P .G . B lo e m a n e t a l. (1995 ) FEBS Lett. 357 :140 ; M . O w a is e t a l. (1995 ) Antimicrob. Agents Chemother. 39 :180 ) ; re c e p to r d e p ro te ín a A d e l te n s io a c t iv o (B r is c o e e t a l. (1995 ) Am. J. Physiol. 1233 :134 ) ; p 120 (S c h re ie r e t a l. (1994 ) J. Biol. Chem. 269 :9090 ) ; v é a s e ta m b ié n K. K e in a n e n ; M .L . L a u k k a n e n (1994 ) F E B S L e tt. 346 :123 ; J .J . K il lio n ; I.J. F id le r (1994 ) Im m u n o m e th o d s 4 :273.
XVII. Usos y métodos
L o s a n t ic u e rp o s , la s c o m p o s ic io n e s d e a n t ic u e rp o y lo s m é to d o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to t ie n e n n u m e ro s a s a p lic a c io n e s in vitro e in vivo, p o r e je m p lo , in h ib ic ió n d e l c re c im ie n to tu m o ra l, in h ib ic ió n d e la m e tá s ta s is tu m o ra l, a u m e n to d e la re s p u e s ta in m u n ita r ia p o r, p o r e je m p lo , re d u c c ió n d e la s e ñ a liz a c ió n d e a d e n o s in a , o d e te c c ió n d e C D 73. E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to so n a n t ic u e rp o s h u m a n o s . P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n a d m in is t ra r a c é lu la s en c u lt iv o , in vitro o ex vivo, o a s u je to s h u m a n o s , p o r e je m p lo , in vivo, p a ra in h ib ir la p ro li fe ra c ió n d e c é lu la s tu m o ra le s . P o r c o n s ig u ie n te , en e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n m é to d o s de m o d if ic a c ió n d e l c re c im ie n to tu m o ra l en un s u je to q u e c o m p re n d e la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a n t ic u e rp o , o p o rc ió n d e u n ió n a a n t íg e n o d e l m is m o , d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to d e m a n e ra q u e s e re d u c e e l c re c im ie n to tu m o ra l e n e l s u je to .
E n u n a re a liz a c ió n p a rt ic u la r , lo s m é to d o s so n p a r t ic u la rm e n te a d e c u a d o s p a ra e l t ra ta m ie n to d e l c á n c e r in vivo. P a ra c o n s e g u ir la in h ib ic ió n e s p e c íf ic a a a n tíg e n o d e l c re c im ie n to tu m o ra l, lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n a d m in is t r a r ju n to s c o n u n a n tíg e n o d e in te ré s o e l a n t íg e n o p u e d e e s ta r y a p re s e n te en e l s u je to a t r a ta r (p o r e je m p lo , un s u je to p o r ta d o r d e tu m o r ) . C u a n d o lo s a n t ic u e rp o s p a ra C D 73 se a d m in is tra n ju n to co n o tro a g e n te , lo s d o s s e p u e d e n a d m in is t ra r p o r s e p a ra d o o s im u ltá n e a m e n te .
T a m b ié n s e a b a rc a n lo s m é to d o s p a ra d e te c ta r la p re s e n c ia d e a n t íg e n o C D 73 h u m a n o e n u n a m u e s tra , o m e d ir la c a n t id a d d e a n tíg e n o C D 73 h u m a n o , q u e c o m p re n d e n p o n e r en c o n ta c to la m u e s tra y u n a m u e s tra d e c o n tro l, co n un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l h u m a n o , o u n a p o rc ió n d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o , q u e se u n e e s p e c íf ic a m e n te a C D 73 h u m a n a , b a jo c o n d ic io n e s q u e p e rm ite n la fo rm a c ió n d e un c o m p le jo e n tre e l a n t ic u e rp o o la p o rc ió n de l m is m o y C D 73 h u m a n a . E n to n c e s , se d e te c ta la fo rm a c ió n d e un c o m p le jo , en e l q u e u n a fo rm a c ió n d e c o m p le jo d ife re n te e n tre la m u e s tra en c o m p a ra c ió n c o n la m u e s tra c o n tro l e s in d ic a t iv a d e la p re s e n c ia d e a n tíg e n o C D 73 h u m a n o e n la m u e s tra . A d e m á s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n u s a r p a ra p u r if ic a r C D 73 h u m a n a p o r p u r if ic a c ió n p o r in m u n o a f in id a d .
A d e m á s se a b a rc a n m é to d o s d e e s t im u la c ió n d e re s p u e s ta in m u n ita r ia (p o r e je m p lo , u n a re s p u e s ta a lin fo c ito T e s p e c íf ic a a a n tíg e n o ) en un s u je to q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to a l s u je to d e m a n e ra q u e s e e s t im u la u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia (p o r e je m p lo , u n a re s p u e s ta d e lin fo c ito T e s p e c íf ic a a a n t íg e n o ) en e l s u je to . E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l s u je to e s un s u je to p o r ta d o r d e tu m o r y se e s t im u la u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia c o n tra e l tu m o r . U n tu m o r p u e d e s e r un tu m o r s ó lid o o un tu m o r líq u id o , p o r e je m p lo , u n a m a lig n id a d h e m a to ló g ic a . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , un tu m o r e s un tu m o r in m u n o g é n ic o . En d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , un tu m o r e s n o in m u n o g é n ic o .
E s to s y o tro s m é to d o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e t ra ta n e n m á s d e ta l le m á s a d e la n te .
Cáncer
L a in h ib ic ió n d e C D 73 p o r a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 p u e d e re d u c ir e l c re c im ie n to tu m o ra l y la m e tá s ta s is en un p a c ie n te . L a in h ib ic ió n d e C D 73 p o r a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 p u e d e ta m b ié n a u m e n ta r la re s p u e s ta in m u n e a c é lu la s c a n c e ro s a s en e l p a c ie n te . E n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n m é to d o s d e t ra ta m ie n to d e un s u je to q u e t ie n e un c á n c e r, c o m p re n d ie n d o la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to , d e m a n e ra q u e e l s u je to s e tra ta , p o r e je m p lo , d e m a n e ra q u e e l c re c im ie n to d e lo s tu m o re s c a n c e ro s o s s e in h ib e n o re d u c e n y /o lo s tu m o re s re v ie r te n . U n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e p u e d e u s a r p a ra in h ib ir e l c re c im ie n to d e tu m o re s c a n c e ro s o s . C o m o a lte rn a t iv a , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e u s a r ju n to c o n o tro a g e n te , p o r e je m p lo , o tro s a g e n te s in m u n o g é n ic o s , t ra ta m ie n to s d e l c á n c e r c o n v e n c io n a le s , u o tro s a n tic u e rp o s , c o m o se d e s c r ib e a L o s m é to d o s se p u e d e n u s a r p a ra e l t ra ta m ie n to d e tu m o re s o c á n c e re s q u e s o n C D 73 p o s it iv o s , o q u e e x p re s a n a lto s n iv e le s d e C D 73. U n m é to d o p u e d e c o m p re n d e r d e te rm in a r p r im e ro e l n iv e l d e c D 73 en tu m o re s o c é lu la s tu m o ra le s , y t r a ta r c o n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , p o r e je m p lo , c o m o se d e s c r ib e en e l p re s e n te d o c u m e n to , s i lo s tu m o re s o c é lu la s e x p re s a n C D 73 , p o r e je m p lo , a lto s n iv e le s d e C D 73.
U n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e a d m in is t r a r c o m o m o n o te ra p ia , o c o m o la ú n ic a te ra p ia in m u n o e s t im u la n te . L o s a n t ic u e rp o s p a ra C D 73 , p o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to , ta m b ié n se p u e d e c o m b in a r c o n un a g e n te in m u n o g é n c o , ta l c o m o c é lu la s c a n c e ro s a s , a n tíg e n o s tu m o ra le s p u r if ic a d o s ( in c lu y e n d o p ro te ín a s re c o m b in a n te s , p é p tid o s y m o lé c u la s d e c a rb o h id ra to s ) , c é lu la s y c é lu la s t r a n s fe c ta d a s co n g e n e s q u e c o d if ic a n c ito q u in a s in m u n o e s t im u la n te s (H e e t a l. (2004 ) J. Immunol. 173 :4919 -28 ) . L o s e je m p lo s no lim ita t iv o s d e v a c u n a s tu m o ra le s q u e se p u e d e n u s a r in c lu y e n p é p tid o s d e a n tíg e n o s d e m e la n o m a , ta le s c o m o p é p tid o s d e g p 100 , a n t íg e n o s M A G E , T rp -2 , M A R T 1 y /o t ir o s in a s a , o c é lu la s tu m o ra le s t r a n s fe c ta d a s p a ra e x p re s a r la c ito q u in a G M -C S F (d is c u t id o m á s a c o n tin u a c ió n ) .
E n s e re s h u m a n o s , s e h a d e m o s tra d o q u e a lg u n o s tu m o re s s o n in m u n o g é n ic o s ta le s c o m o m e la n o m a s . A l b a ja r e l u m b ra l d e a c t iv a c ió n d e lo s lin fo c ito s T p o r la in h ib ic ió n d e C D 73 , se p u e d e n a c t iv a r la s re s p u e s ta s tu m o ra le s en e l h o s p e d a d o r , p e rm it ie n d o e l t ra ta m ie n to d e tu m o re s n o in m u n o g é n ic o s o a q u e llo s q u e t ie n e n in m u n o g e n ic id a d lim ita d a .
U n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to , se p u e d e c o m b in a r c o n un p ro to c o lo d e v a c u n a c ió n . S e h a n id e a d o m u c h a s e s tra te g ia s e x p e r im e n ta le s p a ra la v a c u n a c ió n c o n tra tu m o re s (v é a s e R o s e n b e rg , S ., 2000 , "D e v e lo p m e n t o f C a n c e r V a c c in e s " , A S C O E d u c a t io n a l B o o k S p r in g : 60 -62 ; L o g o th e tis , C ., 2000 , A S C O E d u c a t io n a l B o o k S p r in g : 300 -302 ; K h a y a t, D. 2000 , A S C O E d u c a t io n a l B o o k S p r in g : 414 -428 ; F o o n , K. 2000 , A S C O E d u c a t io n a l B o o k S p r in g : 730 -738 ; v é a s e ta m b ié n R e s tifo , N. y S z n o l, M ., "C a n c e r V a c c in e s " , C . 61 , p á g . 3023 -3043 en D e V ita e t a l., 1997 , "C a n c e r : P r in c ip le s a n d P ra c tic e o f O n c o lo g y " , Q u in ta E d ic ió n ) . E n u n a d e e s ta s e s tra te g ia s , se p re p a ra u n a v a c u n a u s a n d o c é lu la s tu m o ra le s a u tó lo g a s o a lo g é n ic a s . S e h a d e m o s tra d o q u e e s ta s v a c u n a s c e lu la re s s o n m á s e f ic a c e s c u a n d o la s c é lu la s tu m o ra le s se s o m e te n a tra n s d u c c ió n p a ra e x p re s a r G M -C S F . S e h a d e m o s tra d o q u e G M -C S F e s un p o te n te a c t iv a d o r d e la p re s e n ta c ió n d e a n tíg e n o p a ra la v a c u n a c ió n d e tu m o re s (D ra n o f f e t a l. (1993 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U .S .A . 90 : 3539 -43 ).
E l e s tu d io d e la e x p re s ió n g é n ic a y lo s p a tro n e s d e e x p re s ió n g é n ic a a g ra n e s c a la en d iv e rs o s tu m o re s ha c o n d u c id o a la d e f in ic ió n d e lo s d e n o m in a d o s a n tíg e n o s e s p e c íf ic o s d e tu m o re s (R o s e n b e rg , S A (1999 ) Immunity 10: 281 -7 ) . E n m u c h o s c a s o s , e s to s a n t íg e n o s e s p e c íf ic o s d e tu m o r s o n a n t íg e n o s d e d ife re n c ia c ió n e x p re s a d o s en lo s tu m o re s y en la c é lu la d e la q u e se o r ig in ó e l tu m o r , p o r e je m p lo , a n tíg e n o s d e m e la n o c ito s g p 100 , a n tíg e n o s M A G E y T rp -2. M á s im p o r ta n te a ú n , s e p u e d e d e m o s tra r q u e m u c h o s d e e s to s a n tíg e n o s so n la s d ia n a s d e lin fo c ito s T e s p e c íf ic o s a tu m o r e n c o n tra d o s e n e l h o s p e d a d o r . L a in h ib ic ió n d e C D 73 s e p u e d e u s a r ju n to c o n u n a c o le c c ió n d e p ro te ín a s re c o m b in a n te s y /o p é p tid o s e x p re s a d o s e n un tu m o r p a ra g e n e ra r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia a e s ta s p ro te ín a s . E s ta s p ro te ín a s s o n n o rm a lm e n te v is ta s p o r e l s is te m a in m u n ita r io c o m o a n t íg e n o s p ro p io s y p o r lo ta n to , s o n to le ra n te s a e llo s . E l a n tíg e n o tu m o ra l p u e d e in c lu ir la p ro te ín a te lo m e ra s a , q u e se re q u ie re p a ra la s ín te s is d e te ló m e ro s d e c ro m o s o m a s y q u e s e e x p re s a e n m á s d e l 85 % d e lo s c á n c e re s h u m a n o s y en s o lo un n ú m e ro lim ita d o d e te j id o s s o m á t ic o s (K im , N e t a l. 1994 ) Science 266 : 2011 -2013 ) . E l a n tíg e n o tu m o ra l ta m b ié n p u e d e s e r " n e o a n t íg e n o " e x p re s a d o en c é lu la s c a n c e ro s a s d e b id o a m u ta c io n e s s o m á tic a s q u e a lte ra n la s e c u e n c ia d e p ro te ín a o c re a n p ro te ín a s d e fu s ió n e n tre d o s s e c u e n c ia s n o re la c io n a d a s (e s d e c ir , b c r-a b l en e l c ro m o s o m a F ila d e lf ia ) , o id io t ip o d e tu m o re s d e lin fo c ito s B.
O tra s v a c u n a s d e tu m o re s p u e d e n in c lu ir la s p ro te ín a s d e v iru s im p lic a d o s en c á n c e re s h u m a n o s ta le s c o m o v iru s d e l p a p ilo m a h u m a n o (H P V ), V iru s d e la h e p a t it is (V H B y V H C ) y V iru s d e l s a rc o m a d e h e rp e s d e K a p o s i (K H S V ). O tra fo rm a d e a n tíg e n o e s p e c íf ic o a tu m o r q u e se p u e d e u s a r ju n to c o n la in h ib ic ió n d e C D 73 e s p ro te ín a s de c h o q u e té rm ic o (H S P ) p u r if ic a d a s a is la d a s d e l te j id o tu m o ra l. E s ta s p ro te ín a s d e c h o q u e té rm ic o c o n t ie n e n f r a g m e n to s d e p ro te ín a s d e la s c é lu la s tu m o ra le s y e s ta s H S P s o n a lta m e n te e f ic ie n te s en la a d m in is t ra c ió n a la s c é lu la s p re s e n ta d o ra s d e a n tíg e n o p a ra p ro v o c a r la in m u n id a d tu m o ra l (S u o t, R y S r iv a s ta v a , (1995 ) Science 269 :1585 -1588 ; T a m u ra e t a l. (1997 ) Science 278 :117 -120 ) .
L a s c é lu la s d e n d r í t ic a s (D C ) s o n p o te n te s c é lu la s p re s e n ta d o ra s d e a n tíg e n o q u e p u e d e n u s a rs e p a ra p re p a ra r re s p u e s ta s e s p e c íf ic a s d e a n tíg e n o . L a s D C p u e d e n p ro d u c irs e e x v iv o y c a rg a rs e c o n d iv e rs o s a n tíg e n o s d e p ro te ín a s y p é p tid o s , a s í c o m o c o n e x tra c to s d e c é lu la s tu m o ra le s (N e s tle , F. e t a l. (1998 ) Nature Medicine 4 : 328 ­ 332 ). L a s D C ta m b ié n p u e d e n s e r s o m e t id a s a t ra n s d u c c ió n p o r m e d io s g e n é t ic o s p a ra e x p re s a r ta m b ié n e s to s a n t íg e n o s tu m o ra le s . L a s D C ta m b ié n s e h a n fu s io n a d o d ire c ta m e n te a c é lu la s tu m o ra le s c o n e l f in d e in m u n iz a c ió n (K u g le r , A . e t al. (2000 ) Nature Medicine 6 :332 -336 ) . C o m o m é to d o d e v a c u n a c ió n , La in m u n iz a c ió n c o n D C p u e d e c o m b in a rs e e f ic a z m e n te c o n la in h ib ic ió n d e C D 73 p a ra a c t iv a r re s p u e s ta s a n t itu m o ra le s m á s p o te n te s .
L a in h ib ic ió n d e C D 73 ta m b ié n se p u e d e c o m b in a r c o n tra ta m ie n to s d e l c á n c e r c o n v e n c io n a le s (p o r e je m p lo , c iru g ía , ra d ia c ió n y q u im io te ra p ia ) . L a in h ib ic ió n d e C D 73 se p u e d e c o m b in a r e f ic a z m e n te c o n re g ím e n e s q u im io te ra p é u t ic o s . E n e s to s c a s o s , p u e d e s e r p o s ib le re d u c ir la d o s is d e re a c tiv o q u im io te ra p é u t ic o a d m in is tra d o (M o k y r , e t a l. (1998 ) Cancer Research 58 : 5301 -5304 ) . U n e je m p lo d e ta l c o m b in a c ió n e s un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 ju n to c o n la d e s c a rb a z in a p a ra e l t r a ta m ie n to d e l m e la n o m a . O tro e je m p lo d e ta l c o m b in a c ió n e s un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 ju n to co n in te r le u q u in a -2 ( IL -2 ) p a ra e l t ra ta m ie n to d e l m e la n o m a . E l fu n d a m e n to c ie n tí f ic o d e trá s d e l u so c o m b in a d o d e in h ib ic ió n d e C D 73 y q u im io te ra p ia e s q u e la m u e r te c e lu la r , q u e e s u n a c o n s e c u e n c ia d e la a c c ió n c ito tó x ic a d e la m a y o r ía d e lo s c o m p u e s to s q u im io te ra p é u t ic o s , d e b e r ía d a r lu g a r a n iv e le s in c re m e n ta d o s d e a n tíg e n o tu m o ra l en la ru ta d e p re s e n ta c ió n d e l a n tíg e n o . O tra s te ra p ia s c o m b in a d a s q u e p u e d e n d a r c o m o re s u lta d o u n a s in e rg ia c o n la in h ib ic ió n d e C D 73 a t ra v é s d e la m u e r te c e lu la r s o n la ra d ia c ió n , c iru g ía y p r iv a c ió n d e h o rm o n a s . C a d a u n o d e e s to s p ro to c o lo s c re a u n a fu e n te d e a n t íg e n o tu m o ra l e n e l h o s p e d a d o r . L o s in h ib id o re s d e a n g io g é n e s is ta m b ié n s e p u e d e n c o m b in a r c o n la in h ib ic ió n d e C D 73. L a in h ib ic ió n d e la a n g io g é n e s is c o n d u c e a la m u e r te d e c é lu la s tu m o ra le s q u e p u e d e n a lim e n ta r e l a n tíg e n o tu m o ra l en la s ru ta s d e p re s e n ta c ió n d e l a n tíg e n o h o s p e d a d o r .
O tro e je m p lo m á s d e ta l c o m b in a c ió n e s un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 ju n to c o n un a n t i-C D 39 , a n t i-A 2 A R o in h ib id o r q u ím ic o , o a n t ic u e rp o a n t iA 2 B R o in h ib id o r q u ím ic o . E l fu n d a m e n to c ie n tí f ic o t ra s e l u s o c o m b in a d o d e la in h ib ic ió n d e C D 73 y la in h ib ic ió n d e C D 39 , A 2 A R o A 2 B R e s q u e e s ta s p ro te ín a s ta m b ié n e s tá n lig a d a s a la fu n c ió n b io ló g ic a d e C D 73 y la s e ñ a liz a c ió n . E s p e c íf ic a m e n te , C D 39 c a ta liz a la c o n v e rs ió n d e A T P o A D P a A M P , p ro p o rc io n a n d o a s í e l s u s tra to (A M P ) p a ra la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 (e s d e c ir , la c o n v e rs ió n d e A M P e n a d e n o s in a ) . A d e m á s , la a d e n o s in a e s un lig a n d o p a ra c u a tro re c e p to re s c o n o c id o s , in c lu y e n d o A IR , A 2 A R , A 2 B R y A 3. S e h a d e m o s tra d o q u e A 2 A R y A 2 B R re g u la n la p ro li fe ra c ió n d e c é lu la tu m o ra l, e l c re c im ie n to , la m ig ra c ió n y la m e tá s ta s is , a s í c o m o la a c t iv a c ió n d e lin fo c ito T e n e l a m b ie n te tu m o ra l a t ra v é s d e s e ñ a liz a c ió n d e c A M P .
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 , d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to p u e d e n u s a rs e ju n to c o n a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s q u e d ir ig e n la s c é lu la s e fe c to ra s q u e e x p re s a n e l re c e p to r F c a o F c y a la s c é lu la s tu m o ra le s (v é a s e , p o r e je m p lo , los d o c u m e n to s d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.922.845 y 5.837.243 ) . S e p u e d e n u s a r a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s p a ra d ir ig ir d o s a n t íg e n o s s e p a ra d o s . P o r e je m p lo , s e h a n u s a d o a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s re c e p to r a n t i-F c /a n tíg e n o a n t i- tu m o ra l (p o r e je m p lo , H e r -2 /n e u ) p a ra d ir ig ir m a c ró fa g o s a s it io s d e tu m o r . E s te d ir e c c io n a m ie n to p u e d e a c t iv a r m á s e f ic a z m e n te la s re s p u e s ta s tu m o ra le s e s p e c íf ic a s . C o m o a lte rn a t iv a , e l a n tíg e n o se p u e d e a d m in is t ra r d ire c ta m e n te a la s D C m e d ia n te e l u s o d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s q u e s e u n e n a l a n t íg e n o tu m o ra l y un m a rc a d o r d e s u p e r f ic ie c e lu la r e s p e c íf ic o a c é lu la s d e n d r ít ic a s .
L o s tu m o re s e v a d e n la v ig i la n c ia in m u n ita r ia d e l h o s p e d a d o r p o r u n a g ra n d iv e rs id a d d e m e c a n is m o s . M u c h o s d e e s to s m e c a n is m o s p u e d e n s e r s u p e ra d o s p o r la in a c t iv a c ió n d e p ro te ín a s q u e s o n e x p re s a d a s p o r lo s tu m o re s y q u e s o n in m u n o s u p re s o ra s . E s to s in c lu y e n e n tre o tro s T G F - p (K e h r l e t a l. (1986 ) J. Exp. Med. 163 : 1037 -1050 ), IL -10 (H o w a rd & O 'G a r ra (1992 ) Immunology T o d a y 13: 198 -200 ), y lig a n d o F a s (H a h n e e t a l. (1996 ) Science 274 : 1363 ­ 1365 ). L o s a n t ic u e rp o s p a ra c a d a u n a d e e s ta s e n t id a d e s se p u e d e n u s a r ju n to c o n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 p a ra c o n tra r re s ta r lo s e fe c to s d e l a g e n te in m u n o s u p re s o r y fa v o re c e r la s re s p u e s ta s in m u n ita r ia s tu m o ra le s p o r p a r te d e l h o s p e d a d o r .
O tro s a n t ic u e rp o s q u e a c t iv a n la c a p a c id a d d e re s p u e s ta in m u n ita r ia d e l h o s p e d a d o r ju n to co n a n t ic u e rp o s a n ti-C D 73. E s to s in c lu y e n m o lé c u la s en la s u p e r f ic ie d e la s c é lu la s d e n d r í t ic a s q u e a c t iv a n la fu n c ió n D C y la p re s e n ta c ió n d e l a n tíg e n o . L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 40 s o n c a p a c e s d e s u s t itu ir e f ic a z m e n te la a c t iv id a d d e l a u x il ia r d e l lin fo c ito T (R id g e e t a l. (1998 ) Nature 393 : 474 -478 ) y se p u e d e n u s a r ju n to co n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 . L o s a n t ic u e rp o s a c t iv a d o re s p a ra m o lé c u la s c o e s t im u la d o ra s d e l l in fo c ito T ta l c o m o O X -40 (W e in b e rg e t a l. (2000 ) Immunol 164 : 2160 -2169 ) , 4 -1 B B (M e le ro , I. e t a l. (1997 ) Nature Medicine 3: 682 -685 (1997 ) e IC O S (H u tlo ff , A . e t a l. (1999 ) Nature 397 : 262 -266 ) ta m b ié n p u e d e n p ro p o rc io n a r n iv e le s in c re m e n ta d o s d e la a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T. L o s in h ib id o re s d e P D 1 , P D -L 1 o C T L A -4 (e .g ., d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s .N 5.811.097 ) , ta m b ié n se p u e d e n u s a r ju n to c o n un a n t ic u e rp o a n ti-C D 73.
O tro s m é to d o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se u s a n p a ra t r a ta r p a c ie n te s q u e h a n e s ta d o e x p u e s to s a to x in a s o p a tó g e n o s p a rt ic u la re s . P o r c o n s ig u ie n te , o tro a s p e c to d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to p ro p o rc io n a un m é to d o d e tra ta m ie n to d e e n fe rm e d a d in fe c c io s a en un s u je to q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r a l s u je to un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , o p o rc ió n d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o , d e m a n e ra q u e e l s u je to s e a tra ta d o p o r la e n fe rm e d a d in fe c c io s a . A d e m á s , o c o m o a lte rn a tiv a , e l a n t ic u e rp o p u e d e s e r un a n t ic u e rp o q u im é r ic o o h u m a n iz a d o .
E n to d o s lo s m é to d o s a n te r io re s , la in h ib ic ió n d e C D 73 p u e d e c o m b in a rs e c o n o tra s fo rm a s d e in m u n o te ra p ia ta le s c o m o tra ta m ie n to co n c ito q u in a (p o r e je m p lo , in te r fe ro n e s , G M -C S F , G -C S F , IL -2 ) o te ra p ia d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s , q u e p ro p o rc io n a u n a p re s e n ta c ió n d e a n tíg e n o s tu m o ra le s a u m e n ta d a (v é a s e , p o r e je m p lo , H o llig e r (1993 ) Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 90 :6444 -6448 ; P o lja k (1994 ) Structure 2 :1121 -1123 ) .
Terapias de combinación
A d e m á s d e la s te ra p ia s d e c o m b in a c ió n a n te r io rm e n te p ro p o rc io n a d a s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u s a r en te ra p ia d e c o m b in a c ió n , p o r e je m p lo , p a ra e l t ra ta m ie n to d e l c á n c e r, c o m o s e d e s c r ib e a c o n tin u a c ió n .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to a d e m á s se p ro p o rc io n a m é to d o s d e te ra p ia d e c o m b in a c ió n e n lo s q u e un a n t ic u e rp o a n ti-C D 73 se a d m in is tra c o n ju n ta m e n te co n un o m á s a g e n te s a d ic io n a le s , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s , q u e s o n e f ic a c e s en re s p u e s ta s in m u n ita r ia e s t im u la n te s p a ra d e e s e m o d o a u m e n ta r m á s , e s t im u la r o r e g u la r a l a lz a la s re s p u e s ta s in m u n ita r ia s en un s u je to .
G e n e ra lm e n te , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e c o m b in a r c o n ( i) un a g o n is ta d e un re c e p to r c o e s t im u la n te y /o ( ii) un a n ta g o n is ta d e u n a s e ñ a l in h ib id o ra en lo s l in fo c ito s T , a m b o s d a n c o m o re s u lta d o a m p lif ia c ió n d e re s p u e s ta s d e l in fo c ito s T e s p e c íf ic o s a a n tíg e n o ( re g u la d o re s d e l c ic lo re g u la r in m u n e ) . La m a y o r ía d e la s m o lé c u la s c o e s t im u la n te s y d e in h ib ic ió n c o n ju n ta s o n m ie m b ro s d e la s u p e r fa m ilia d e la in m u n o g lo b u lin a ( Ig s F ), y a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n a d m in is t r a r c o n un a g e n te q u e d ir ig e un m ie m b ro d e la fa m il ia Ig S F p a ra in c re m e n ta r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia . U n a fa m il ia im p o r ta n te d e l ig a n d o s u n id o s a m e m b ra n a q u e se u n e n a re c e p to re s c o e s t im u la d o re s o c o in h ib id o re s e s la fa m il ia B 7 , q u e in c lu y e B 7 -1 , B 7 -2 , B 7 -H 1 (P D -L 1 ) , B 7 -D C (P D -L 2 ) , B 7 -H 2 ( IC O S -L ) , B 7 -H 3 , B 7 -H 4 , B 7 -H 5 (V IS T A ) y B 7 -H 6. O tra fa m il ia d e lig a n d o s u n id o s a m e m b ra n a q u e s e u n e n a re c e p to re s c o e s t im u la d o re s o c o in h ib id o re s e s la fa m il ia T N F d e m o lé c u la s q u e se u n e n a m ie m b ro s d e la fa m il ia d e re c e p to re s T N F re la c io n a d o s , q u e in c lu y e C D 40 y C D 40 L , O X -40 , O X -40 L , C D 70 , C D 27 L , C D 30 , C D 30 L , 4 -1 B B L , C D 137 , G IT R , T R A IL /A p o 2 -L , T R A IL R 1 /D R 4 , T R A IL R 2 /D R 5 , T R A IL R 3 , T R A IL R 4 , O P G , R A N K , R A N K L , T W E A K R /F n 14 , T W E A K , B A F F R , E D A R , X E D A R , T A C I, A P R IL , B C M A , L T p R , L IG H T , D c R 3 , H V E M , V E G I/T L 1 A , T R A M P /D R 3 , E D A R , E D A 1 , X E D A R , E D A 2 , T N F R 1 , lin fo to x in a a /T N F p , T N F R 2 , T N F a , L T p R , lin fo to x in a a ip 2 , F A S , F A S L , R E L T , D R 6 , T R O Y , N G F R (v é a s e , p o r e je m p lo , T a n s e y (2009 ) Drug Discovery Today 00 :1 ) . La a c t iv a c ió n d e l lin fo c ito T ta m b ié n se re g u la p o r c ito q u in a s s o lu b le s . P o r ta n to , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 se p u e d e n u s a r ju n to co n ( i) a n ta g o n is ta s (o a g e n te s in h ib id o re s o b lo q u e a n te s ) d e p ro te ín a s d e la fa m il ia Ig s F o la fa m il ia B 7 o la fa m il ia d e l T N F q u e in h ib e la a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T o a n ta g o n is ta s d e c ito q u in a s q u e in h ib e n la a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T (p o r e je m p lo , IL -6 , IL -10 , T G F -p , V E G F ; ( " c ito q u in a s in m u n o s u p re s o ra s " ) y /o ( ii) a g o n is ta s d e re c e p to re s e s t im u la d o re s d e la fa m il ia Ig S F , fa m il ia B 7 o la fa m il ia T N F o d e c ito q u in a s q u e e s t im u la n la a c t iv a c ió n d e lo s l in fo c ito s T , p a ra e s t im u la r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia , p o r e je m p lo , p a ra t r a ta r e n fe rm e d a d e s p ro life ra t iv a s , ta l c o m o c á n c e r.
P o r e je m p lo , la s re s p u e s ta s d e lo s l in fo c ito s T se p u e d e n e s t im u la r m e d ia n te u n a c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s a n ti-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to , p o r e je m p lo , C D 73.4 - Ig G 2 C S - Ig G 1.1 f , y u n o o m á s d e lo s s ig u ie n te s a g e n te s :
(1 ) U n a n ta g o n is ta (a g e n te in h ib id o r o b lo q u e a n te ) d e u n a p ro te ín a q u e in h ib e la a c t iv a c ió n d e lin fo c ito s T (p o r e je m p lo , in h ib id o re s d e lo s p u n to s d e re g u la c ió n in m u n e ) , ta l c o m o c T l A -4, P D -1 , P D -L 1 , P D -L 2 y L A G -3 , c o m o se h a d e s c r ito a n te r io rm e n te , y c u a lq u ie ra d e la s s ig u ie n te s p ro te ín a s : T IM -3 , G a le c t in a 9, C E A C A M -1 , B T L A , C D 69 , G a le c t in a -1 , T IG IT , C D 113 , G P R 56 , V IS T A , 2 B 4 , C D 48 , G A R P , C D 73 , P D 1 H , L A IR 1 , T IM -1 , T IM -4 , C D 39.
(2 ) U n a g o n is ta d e u n a p ro te ín a q u e e s t im u la la a c t iv a c ió n d e lo s l in fo c ito s T , ta l c o m o B 7 -1 , B 7 -2 , C D 28 , 4 -1 B B (C D 137 ) , 4 -1 B B L , G IT R , G IT R L , IC O S , IC O S -L , O X 40 , O X 40 L , C D 70 , C D 27 , C D 40 , D R 3 y C D 28 H .
A g e n te s ilu s tra t iv o s q u e m o d u la n u n a d e la s a n te r io re s p ro te ín a s y se p u e d e n c o m b in a r c o n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta s , p o r e je m p lo , a q u e llo s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to , p a ra e l t ra ta m ie n to d e l c á n c e r, in c lu y e n : Y e rv o y ™ ( ip il im u m a b ) o T re m e lim u m a b (p a ra C T L A -4 ) , g a lix im a b (p a ra B 7.1 ) , B M S -936558 (p a ra P D -1 ), C T -011 (p a ra P D -1 ), M K -3475 (p a ra P D -1 ), A M P 224 (p a ra B 7 D C ), B M S -936559 (p a ra B 7 -H 1 ), M P D L 3280 A (p a ra B 7 -H 1 ), M E D I-570 (p a ra IC O S ), A M G 557 (p a ra B 7 H 2 ), M G A 271 (p a ra B 7 H 3 ), IM P 321 (p a ra L A G -3 ), B M S -663513 (p a ra C D 137 ), P F -05082566 (p a ra C D 137 ), C D X -1127 (p a ra C D 27 ) , a n t i-O X 40 (P ro v id e n c e H e a lth S e rv ic e s ) , h u M A b O X 40 L (p a ra O x 40 L ), A ta c ic e p t (p a ra T A C I) , C P -870893 (p a ra C D 40 ) , L u c a tu m u m a b (p a ra C D 40 ), D a c e tu z u m a b (p a ra C D 40 ) , M u ro m o n a b -C D 3 (p a ra C d 3), Ip ilu m u m a b (p a ra C T L A -4 ) .
O tra s m o lé c u la s q u e p u e d e n c o m b in a rs e c o n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta s p a ra e l t ra ta m ie n to d e l c á n c e r in c lu y e n a n ta g o n is ta s d e re c e p to re s in h ib id o re s e n c é lu la s N K o a g o n is ta s d e re c e p to re s a c t iv a d o re s e n c é lu la s N K . P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n ta g o n is ta s a n t i-C D 73 se p u e d e n c o m b in a r c o n a n ta g o n is ta s d e K IR (p o r e je m p lo , lir ilu m a b ) .
L a a c t iv a c ió n d e lo s lin fo c ito s T ta m b ié n se p u e d e re g u la r p o r c ito q u in a s s o lu b le s , y lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 se p u e d e n a d m in is t ra r a un s u je to , p o r e je m p lo , q u e t ie n e un c á n c e r, c o n a n ta g o n is ta s d e c ito q u in a s q u e in h ib e n la a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T o a g o n is ta s d e c ito q u in a s q u e e s t im u la n la a c t iv a c ió n d e lin fo c ito s T .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 se p u e d e n u s a r ju n to c o n ( i) a n ta g o n is ta s (o a g e n te s in h ib id o re s o b lo q u e a n te s ) d e p ro te ín a s d e la fa m il ia Ig s F o la fa m il ia B 7 o la fa m il ia d e l T N F q u e in h ib e la a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T o a n ta g o n is ta s d e c ito q u in a s q u e in h ib e n la a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T (p o r e je m p lo , IL -6 , IL -10 , T G F -p , V E G F ; ( " c ito q u in a s in m u n o s u p re s o ra s " ) y /o ( ii) a g o n is ta s d e re c e p to re s e s t im u la d o re s d e la fa m il ia Ig S F , fa m il ia B 7 o la fa m il ia T N F o d e c ito q u in a s q u e e s t im u la n la a c t iv a c ió n d e lo s l in fo c ito s T , p a ra e s t im u la r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia , p o r e je m p lo , p a ra t r a ta r e n fe rm e d a d e s p ro li fe ra t iv a s , ta l c o m o c á n c e r.
A ú n o tro s a g e n te s p a ra te ra p ia s d e c o m b in a c ió n in c lu y e n a g e n te s q u e in h ib e n o re d u c e n m a c ró fa g o s o m o n o c ito s , in c lu y e n d o , p e ro s in l im ita c ió n , a n ta g o n is ta s d e C S F -1 R ta le s c o m o a n t ic u e rp o s a n ta g o n is ta d e C S F -1 R in c lu y e n d o R G 7155 (W O 11 /70024 , W O 11 /107553 , W O 11 /131407 , W O 13 /87699 , W O 13 /119716 , W O 13 /132044 ) o F P A -008 (W O 11 /140249 ; W O 13169264 ; W O 14 /036357 ) .
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 ta m b ié n s e p u e d e n a d m in is t ra r co n a g e n te s q u e in h ib e n la s e ñ a liz a c ió n d e T G F -p .
A g e n te s a d ic io n a le s q u e se p u e d e n c o m b in a r c o n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 in c lu y e n a g e n te s q u e a u m e n ta n la p re s e n ta c ió n d e a n tíg e n o tu rm o ra l, p o r e je m p lo , v a c u n a s d e c é lu la s d e n d r í t ic a s , v a c u n a s c e lu la re s s e c re to ra s d e G M -C S F , O lig o n u c le ó t id o s C p G , e im iq u im o d , o te ra p ia s q u e a u m e n ta n la in m u n o g e n ic id a d d e la s c é lu la s tu m o ra le s (p o r e je m p lo , a n tra c ic lin a s ) .
O tra s te ra p ia s m á s q u e se p u e d e n c o m b in a r c o n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 in c lu y e n te ra p ia s q u e e lim in a n o b lo q u e a n la c é lu la s T re g , p o r e je m p lo , un a g e n te q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a C D 25.
O tra te ra p ia q u e s e p u e d e c o m b in a r c o n u n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 e s u n a te ra p ia q u e in h ib e u n a e n z im a m e ta b ó lic a ta l c o m o in d o la m in a d io x ig e n a s a ( ID O ), d io x ig e n a s a , a rg in a s a , o s in ta s a d e ó x id o n ítr ic o .
O tra c la s e d e a g e n te s q u e s e p u e d e n u s a r c o n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 in c lu y e a g e n te s q u e in h ib e n la fo rm a c ió n d e a d e n o s in a o in h ib e n e l re c e p to r A 2 A d e a d e n o s in a .
O tra s te ra p ia s q u e se p u e d e n c o m b in a r co n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p a ra t r a ta r e l c á n c e r in c lu y e n te ra p ia s q u e in v ie r te n /p re v ie n e n la a n e rg ia o e l a g o ta m ie n to d e lin fo c ito s T y te ra p ia s q u e d e s e n c a d e n a n u n a a c t iv a c ió n in m u n ita r ia in n a ta y /o in f la m a c ió n e n un s it io tu m o ra l.
U n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e c o m b in a r c o n m á s d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o , y p u e d e s e r, p o r e je m p lo , c o m b in a d o c o n u n a e s tra te g ia c o m b in a to r ia q u e d ir ig e e le m e n to s m ú lt ip le s d e la ru ta in m u n ita r ia , ta l c o m o u n o o m á s d e lo s ig u ie n te : u n a te ra p ia q u e a u m e n ta la p re s e n ta c ió n d e a n t íg e n o s tu rm o ra le s (p o r e je m p lo , v a c u n a d e c é lu la s d e n d r í t ic a s , v a c u n a s c e lu la re s s e c re to ra s d e G M -C S F , O l ig o n u c le ó t id o s C p G , im iq u im o d ) ; u n a te ra p ia q u e in h ib e la re g u la c ió n in m u n ita r ia n e g a tiv a , p o r e je m p lo , in h ib ie n d o la ru ta d e C T L A -4 y /o P D 1 /P D -L 1 /P D -L 2 y /o d is m in u y e n d o o b lo q u e a n d o T re g u o tra s c é lu la s s u p re s o ra s in m u n ita r ia s ; u n a te ra p ia q u e e s t im u la la re g u la c ió n in m u n ita r ia p o s it iv a , p o r e je m p lo , co n a g o n is ta s q u e e s t im u la n la ru ta d e C D -137 , O X -40 y /o G IT R y /o e s t im u la n la fu n c ió n e fe c to ra d e l in fo c ito s T ; u n a te ra p ia q u e in c re m e n ta s is té m ic a m e n te la f re c u e n c ia d e l in fo c ito s T a n t itu m o ra le s ; u n a te ra p ia q u e d is m in u y e o in h ib e T re g , ta le s c o m o T re g en e l tu m o r , p o r e je m p lo , u s a n d o un a n ta g o n is ta d e C D 25 (p o r e je m p lo , d a c liz u m a b ) o p o r a g o ta m ie n to d e p e r la a n t i-C D 25 ; u n a te ra p ia q u e a fe c ta a la fu n c ió n d e la s c é lu la s m ie lo d e s s u p re s o ra s e n e l tu m o r ; u n a te ra p ia q u e a u m e n ta la in m u n o g e n ic id a d d e la s c é lu la s tu m o ra le s (p o r e je m p lo , a n tra c ic lin a s ) ; t r a n s fe re n c ia d e l in fo c ito s T a d o p t iv o s o c é lu la s N K in c lu y e n d o c é lu la s m o d if ic a d a s g e n é t ic a m e n te , p o r e je m p lo , c é lu la s m o d if ic a d a s p o r re c e p to re s d e a n tíg e n o q u im é r ic o s (T e ra p ia d e C A R -T ); u n a te ra p ia q u e in h ib e u n a e n z im a m e ta b ó lic a ta l c o m o in d o le a m in a d io x ig e n a s a ( ID O ), d io x ig e n a s a , a rg in a s a , o s in ta s a d e ó x id o n ítr ic o ; u n a te ra p ia q u e in v ie r te /e v ita la a n e rg ia o a g o ta m ie n to d e lo s lin fo c ito s T ; u n a te ra p ia q u e d e s e n c a d e n a la a c t iv a c ió n in m u n ita r ia in n a ta y /o la in f la m a c ió n en un s it io tu m o ra l; a d m in is tra c ió n d e c ito q u in a s e s t im u la d o ra s in m u n ita r ia s ; o b lo q u e o d e c ito q u in a s in m u n o s u p re s o ra s .
G e n e ra lm e n te , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u s a r ju n to co n u n o o m á s g e n te s a g o n is ta s q u e s e lig a n a re c e p to re s c o e s t im u la n te s p o s it iv o s , a g e n te s d e b lo q u e o q u e a te n ú a n la s e ñ a liz a c ió n a t ra v é s d e re c e p to re s in h ib id o re s , a n ta g o n is ta s , y u n o o m á s a g e n te s q u e in c re m e n ta n d e m a n e ra s is té m ic a la f re c u e n c ia d e c é lu la s T a n t itu m o ra le s , a g e n te s q u e s u p e ra n d is t in ta s ru ta s s u p re s o ra s in m u n ita r ia s d e n tro d e l m ic ro e n to rn o tu m o ra l (p o r e je m p lo , b lo q u e a r la u n ió n d e re c e p to r in h ib id o r (p o r e je m p lo , in te ra c c io n e s P D -L 1 /P D -1 ), d is m in u ir o in h ib ir T re g s (p o r e je m p lo , u s a n d o un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a n t i-C D 25 (p o r e je m p lo , d a c liz u m a b ) o m e d ia n te a g o ta m ie n to d e p e r la s a n t i-C D 25 e x v iv o ) , in h ib ir e n z im a s m e ta b ó lic a s ta le s c o m o ID O , o re v e r t ir /e v ita r la a n e rg ia o e l a g o ta m ie n to d e c é lu la s T ) y a g e n te s q u e d is p a ra n la a c t iv a c ió n in m u n ita r ia in n a ta y /o in f la m a c ió n en s it io s tu m o ra le s . U n a in te rn a liz a c ió n in c re m e n ta d a d e re c e p to re s in h ib id o re s p u e d e t r a d u c ir s e en un n iv e l in fe r io r d e un in h ib id o r p o te n c ia l (a s u m ie n d o q u e n o s e d a s e ñ a liz a c ió n ) .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , s e a d m in is t ra un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a un s u je to ju n to c o n un in h ib id o r d e B R A F si e l s u je to e s p o s it iv o p a ra m u ta c ió n B R A F V 600.
S e p ro p o rc io n a n en e l p re s e n te d o c u m e n to m é to d o s p a ra e s t im u la r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia en un s u je to q u e c o m p re n d e a d m in is t ra r a l s u je to u n a m o lé c u la a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o , y u n o o m á s a n t ic u e rp o s in m u n o e s t im u la d o re s a d ic io n a le s , ta l c o m o un a n ta g o n is ta a n ti-P D -1 , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta , un a n ta g o n is ta a n t i-P D -L l, p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta , un a n ta g o n is ta a n t i-C T L A -4 a n ta g o n is ta , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta y /o un a n ta g o n is ta a n t i-L A G 3 , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta , d e ta l m a n e ra q u e se e s t im u la u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia en e l s u je to , p o r e je m p lo , p a ra in h ib ir e l c re c im ie n to tu m o ra l o p a ra e s t im u la r u n a re s p u e s ta a n t iv ira l. E n u n a re a liz a c ió n , a l s u je to se a d m in is tra un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta y un a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 a n ta g o n is ta . E n u n a re a liz a c ió n , a l s u je to se a d m in is t ra un a n t ic u e rp o a n ti-C D 73 a n ta g o n is ta y un a n t ic u e rp o a n ti-P D -L I a n ta g o n is ta . E n u n a re a liz a c ió n , a l s u je to se a d m in is tra un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta y un a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 a n ta g o n is ta . E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 e s un a n t ic u e rp o h u m a n o , ta l c o m o un a n t ic u e rp o d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to . C o m o a lte rn a t iv a , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p u e d e se r, p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o q u im é r ic o o h u m a n iz a d o (p o r e je m p lo , d e un m A b a n t i-C D 73 d e ra tó n ) , ta l c o m o a q u e llo s a d e m á s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to . E n u n a re a liz a c ió n , e l a l m e n o s un a n t ic u e rp o in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l (p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o un a n ti-P D -1 a n ta g o n is ta , un a n t i-P D -L I a n ta g o n is ta , un a n t i-C T L A -4 a n ta g o n is ta y /o a n t i-L A G 3 a n ta g o n is ta ) e s un a n t ic u e rp o h u m a n o . C o m o a lte rn a t iv a , e l a l m e n o s un a n t ic u e rp o in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l p u e d e se r, p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o q u im é r ic o o h u m a n iz a d o (p o r e je m p lo , p re p a ra d o d e un a n t ic u e rp o d e ra tó n a n ti-P D -1 , a n t i-P D -L I, a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-L A G 3 ) .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra t r a ta r u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a (p o r e je m p lo , c á n c e r) , q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta y un a n t ic u e rp o P D -1 a n ta g o n is ta a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is tra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , e l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 s e a d m in is t ra a u n a d o s is s u b te ra p é u t ic a , o a m b o s s e a d m in is t ra n a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a . E n e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra a lte ra r u n a s u c e s o a d v e rs o a s o c ia d o c o n e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a c o n un a g e n te in m u n o e s t im u la d o r , q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y u n a d o s is s u b te ra p é u tic a d e a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l s u je to e s un s e r h u m a n o . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l d e s e c u e n c ia h u m a n a y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 e s a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l d e s e c u e n c ia h u m a n a , ta l c o m o un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R o re g io n e s v a r ia b le s d e 11 F 11 , 4 C 3 , 4 D 4 , 10 D 2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 , 6 E 11 , 7 A 11 , C D 73.3 , C D 73.4 , C D 73.5 , C D 73.6 , C D 73.7 , C D 73.8 , C D 73.9 , C D 73.10 o C D 73.11 d e s c r ito s en el p re s e n te d o c u m e n to u o tro a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
L o s a n ta g o n is ta s P D -1 a d e c u a d o s p a ra su u so en lo s m é to d o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to , in c lu y e n , s in l im ita c ió n , lig a n d o s , a n t ic u e rp o s (p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s y a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s ) , y a g e n te s m u lt iv a le n te s . E n u n a re a liz a c ió n , e l a n ta g o n is ta d e P D -1 e s u n a p ro te ín a d e fu s ió n , p o r e je m p lo , u n a p ro te ín a d e fu s ió n Fc, ta l c o m o A M P -244. E n u n a re a liz a c ió n , e l a n ta g o n is ta d e P D -1 e n un a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 o a n ti-P D -L I.
U n a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 i lu s tra t iv o e s n iv o lu m a b (B M S -936558 ) o un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R o re g io n e s v a r ia b le s d e u n o d e lo s a n t ic u e rp o s 17 D 8 , 2 D 3 , 4 H 1 , 5 C 4 , 7 D 3 , 5 F 4 y 4 A 11 d e s c r ito s en e l d o c u m e n to W O 2006 /121168. E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , un a n t ic u e rp o a n t i-P D I e s M K -3475 (L a m b ro liz u m a b ) d e s c r ito en e l d o c u m e n to W O 2012 /145493 ; A M P -514 d e s c r ito en e l d o c u m e n to W O 2012 /145493 ; y C T -011 (P id il iz u m a b ; p re v ia m e n te C T -A c T ib o d y o B A T ; v é a s e , p o r e je m p lo , R o s e n b la t t e t a l., (2011 ) J. Immunotherapy 34 :409 ) . A n t ic u e rp o s P D -1 c o n o c id o s a d ic io n a le s y o tro s in h ib id o re s d e P D -1 in c lu y e n a q u e llo s d e s c r ito s en lo s d o c u m e n to s W O 2009 /014708 , W O 03 /099196 , W O 2009 /114335 , W O 2011 /066389 , W O 2011 /161699 , W O 2012 /145493 , El d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 7.635.757 y 8.217.149 y la p u b lic a c ió n d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 2009 /0317368. T a m b ié n se p u e d e n u s a r c u a lq u ie ra d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti-P D -1 d e s c r ito s en e l d o c u m e n to W O 2013 /173223. U n a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 q u e c o m p ite p o r la u n ió n c o n , y /o s e u n e a l m is m o e p í to p o e n P D -1 q u e , u n o d e e s to s a n t ic u e rp o s ta m b ié n se p u e d e u s a r ju n to c o n lo s t ra ta m ie n to s .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 s e u n e a P D -1 h u m a n a c o n u n a K d d e 5 x 10 '8 M o m e n o s , se u n e a P D -1 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M o m e n o s , s e u n e a P D -1 h u m a n a c o n u n a K d d e 5 x 10 '9 M o m e n o s , o s e u n e a P D -1 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M y 1 x 10 '1° M o m e n o s .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra t r a ta r u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a (p o r e je m p lo , c á n c e r) , q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta y un a n t ic u e rp o P D -L 1 a n ta g o n is ta a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is tra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I s e a d m in is t ra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , o a m b o s s e a d m in is tra n a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a . E n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra a lte ra r un s u c e s o a d v e rs o a s o c ia d o c o n e l t r a ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d p ro li fe ra t iv a c o n un a g e n te in m u n o e s t im u la d o r , q u e c o m p re n d e a d m in is t ra r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y u n a d o s is s u b te ra p é u t ic a d e a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l s u je to e s u n s e r h u m a n o . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l d e s e c u e n c ia h u m a n a y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 e s a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l d e s e c u e n c ia h u m a n a , ta l c o m o un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R o re g io n e s v a r ia b le s d e 11 F 11 , 4 C 3 , 4 D 4 , 10 D 2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 , 6 E 11 , 7 A 11 , C D 73.3 , C D 73.4 , C D 73.5 , C D 73.6 , C D 73.7 , C D 73.8 , C D 73.9 , C D 73.10 o C D 73.11 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to u o tro a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
E n u n a re a liz a c ió n , e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I e s B M S -936559 ( re fe r id o c o m o 12 A 4 e n e l d o c u m e n to W O 2007 /005874 y e l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s N o . 7.943.743 ), o un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R o re g io n e s v a r ia b le s d e 3 G 10 , 12 A 4 , 10 A 5 , 5 F 8 , 10 H 10 , 1 B 12 , 7 H 1 , 11 E 6 , 12 B 7 y 13 G 4 , e l c u a l se d e s c r ib e en e l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n P C T W O 07 /005874 y e l d o c u m e n to d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 7.943.743. E n d e te rm in a d a re a liz a c ió n un a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I e s M E D I4736 ( ta m b ié n c o n o c id o c o m o A n t i-B 7 -H 1 ) o M P D L 3280 A ( ta m b ié n c o n o c id o c o m o R G 7446 ) . T a m b ié n se p u e d e u s a r c u a lq u ie ra d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-P D -L I d e s c r ito s en lo s d o c u m e n to s W O 2013 /173223 , W O 2011 /066389 , W O 2012 /145493 , p a te n te s d e E s ta d o s U n id o s n .° 7.635.757 y 8.217.149 , y p u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s n .° 2009 /145493. T a m b ié n se p u e d e n u s a r lo s a n t ic u e rp o s a n ti-P D -L I q u e c o m p ite n c o n y /o s e u n e n a l m is m o e p íto p o q u e e l d e c u a lq u ie ra d e e s to s a n t ic u e rp o s ju n to co n lo s t ra ta m ie n to s .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I se u n e a P D -L 1 h u m a n a c o n u n a K d d e 5 x l0 '8 M o m e n o s , se u n e a P D -L 1 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M o m e n o s , se u n e a P D -L 1 h u m a n a c o n u n a K D d e 5 x 10 '9 M o m e n o s , o se u n e a P D -L 1 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M y 1 x 10 '10 M o m e n o s .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra t r a ta r u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a (p o r e je m p lo , c á n c e r) , q u e c o m p re n d e n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to y un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta d e C T L A -4 a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is t ra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 se a d m in is t ra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , o a m b o s se a d m in is tra n a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a . E n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra a lte ra r un s u c e s o a d v e rs o a s o c ia d o c o n e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d p ro li fe ra t iv a c o n un a g e n te in m u n o e s t im u la d o r , q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y u n a d o s is s u b te ra p é u tic a d e a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l s u je to e s un s e r h u m a n o . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 e s un a n t ic u e rp o s e le c c io n a d o d e l g ru p o d e : Y e rv o y ™ ( ip il im u m a b o a n t ic u e rp o 10 D 1 , d e s c r ito en e l d o c u m e n to d e p u b lic a c ió n P C T W O 01 /14424 ) , e m e lim u m a b (a n te r io rm e n te t ic il im u m a b , C P -675.206 ) , a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 d e s c r ito e n c u a lq u ie ra d e la s s ig u ie n te s p u b lic a c io n e s : W O 98 /42752 ; W O 00 /37504 ; p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° 6 .207.156 ; H u rw itz e t a l. (1998 ) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95 (17 ) :10067 -10071 ; C a m a c h o e t a l. (2004 ) J. Clin. Oncology 22 (145 ) : A b s t ra c t N o. 2505 (a n t ic u e rp o C P -675206 ) ; y M o k y r e t a l. (1998 ) Cáncer Res. 58 :5301 -5304. T a m b ié n s e p u e d e n u s a r c u a lq u ie ra d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A -4 d e s c r ito s e n e l d o c u m e n to W O 2013 /173223.
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 se u n e a C T L A -4 h u m a n a c o n u n a K d d e 5 x 10 '8 M o m e n o s , s e u n e a C T L A -4 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M o m e n o s , s e u n e a C T L A -4 h u m a n a c o n u n a K D d e 5 x 10 '9 M o m e n o s , o s e u n e a C T L A -4 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M y 1 x 10 '1° M o m e n o s .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra t r a ta r u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a (p o r e je m p lo , c á n c e r) , q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y un a n t ic u e rp o L A G -3 a un s u je to . E n re a liz a c io n e s a d ic io n a le s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is t ra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , e l a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 se a d m in is t ra a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a , o a m b o s se a d m in is tra n a u n a d o s is s u b te ra p é u tic a . E n e l p re s e n te d o c u m e n to se p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra a lte ra r u n a s u c e s o a d v e rs o a s o c ia d o co n e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a c o n un a g e n te in m u n o e s t im u la d o r , q u e c o m p re n d e a d m in is t r a r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y u n a d o s is s u b te ra p é u t ic a d e a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 a un s u je to . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l s u je to e s un s e r h u m a n o . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-p D -L I e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l d e s e c u e n c ia h u m a n a y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 e s a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l d e s e c u e n c ia h u m a n a , ta l c o m o un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R o re g io n e s v a r ia b le s d e 11 F 11 , 4 C 3 , 4 D 4 , 10 D 2 , 11 A 6 , 24 H 2 , 5 F 8 , 6 E 11 , 7 A 11 , C D 73.3 , C D 73.4 , C D 73.5 , C D 73.6 , C D 73.7 , C D 73.8 , C D 73.9 , C D 73.10 o C D 73.11 u o tro a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta d e s c r ito en e l p re s e n te d o c u m e n to . E je m p lo s d e a n t ic u e rp o s a n t i-L A G 3 in c lu y e n a n t ic u e rp o s q u e c o m p re n d e n la s C D R o re g io n e s v a r ia b le s d e lo s a n t ic u e rp o s 25 F 7 , 26 H 10 , 25 E 3 , 8 B 7 , 11 F 2 o 17 E 5 , q u e se d e s c r ib e n en la p u b lic a c ió n d e p a te n te d e E s ta d o s U n id o s n .° U S 2011 /0150892 y W O 2014 /008218. E n u n a re a liz a c ió n , un a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 e s B M S -986016. O tro s a n t ic u e rp o s a n t i-L A G -3 re c o n o c id o s e n la té c n ic a q u e s e p u e d e n u s a r in c lu y e n IM P 731 d e s c r ito en e l d o c u m e n to U S 2011 /007023. T a m b ié n se p u e d e u s a r IM P -321. T a m b ié n se p u e d e n u s a r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-L A G -3 q u e c o m p ite n c o n y /o se u n e n a l m is m o e p íto p o q u e e l d e c u a lq u ie ra d e e s to s a n t ic u e rp o s ju n to c o n lo s t ra ta m ie n to s .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 s e u n e a L A G -3 h u m a n a c o n u n a K d d e 5 x 10 '8 M o m e n o s , se u n e a L A G -3 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M o m e n o s , se u n e a L A G -3 h u m a n a c o n u n a K d d e 5 x 10 '9 M o m e n o s , o s e u n e a L A G -3 h u m a n a c o n u n a K d d e 1 x 10 '8 M y 1 x 10 '10 M o m e n o s .
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e a d m in is tra ju n to c o n un a n t ic u e rp o a n t i-a g o n is ta d e G IT R , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o q u e t ie n e la s s e c u e n c ia s d e C D R d e 6 C 8 , p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o h u m a n iz a d o q u e t ie n e la s C D R d e 6 C 8 , c o m o se d e s c r ib e , p o r e je m p lo , en e l d o c u m e n to W O 2006 /105021 ; un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R d e l a n t ic u e rp o a n t i-G lT R d e s c r ito en e l d o c u m e n to W O 2011 /028683 ; un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R d e l a n t ic u e rp o a n t i-G IT R d e s c r ito en e l d o c u m e n to J P 2008278814 ; o un a n t ic u e rp o q u e c o m p re n d e la s C D R d e l a n t ic u e rp o a n t i-G IT R d e s c r ito en e l d o c u m e n to W O 2015187835.
L a a d m in is tra c ió n d e a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to y a n ta g o n is ta s , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s a n ta g o n is ta , a u n o o m á s s e g u n d o s a n t íg e n o s d ia n a ta le s c o m o L A G -3 y /o C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 p u e d e a u m e n ta r la re s p u e s ta in m u n ita r ia a c é lu la s c a n c e ro s a s en e l p a c ie n te . L o s c á n c e re s c u y o c re c im ie n to se p u e d e in h ib ir u s a n d o lo s a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en la p re s e n te d iv u lg a c ió n in c lu y e n c á n c e re s s e n s ib le s a la in m u n o te ra p ia . E je m p lo s re p re s e n ta t iv o s d e c á n c e re s p a ra e l t ra ta m ie n to co n la te ra p ia d e c o m b in a c ió n d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n in c lu y e n a q u e llo s c á n c e re s e s p e c ia lm e n te a n te r io rm e n te e n u m e ra d o s en la d is c u s ió n d e la m o n o te ra p ia c o n lo s a n t ic u e rp o s a n ti-C D 73.
E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , la c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s te ra p é u t ic o s tra ta d o s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e a d m in is t r a r a l m is m o t ie m p o c o m o u n a c o m p o s ic ió n s e n c il la en un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le , o a l m is m o t ie m p o c o m o c o m p o s ic io n e s s e p a ra d a s c o n c a d a a n t ic u e rp o e n un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le . E n o tra re a liz a c ió n , la c o m b in a c ió n d e lo s a n t ic u e rp o s te ra p é u t ic o s se p u e d e a d m in is t r a r s e c u e n c ia lm e n te . P o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e n a d m in is t r a r s e c u e n c ia lm e n te , ta l c o m o a d m in is t ra n d o e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , o a d m in is trá n d o s e el a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 s e g u n d o . A d e m á s , o c o m o a lte rn a t iv a , un a n t ic u e rp o a n t i-P D -1 y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e p u e d e n a d m in is t r a r s e c u e n c ia lm e n te , ta l c o m o a d m in is t r a n d o e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -1 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , o a d m in is t rá n d o s e e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 s e g u n d o . A d e m á s , o c o m o a lte rn a t iv a , un a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e n a d m in is t ra r s e c u e n c ia lm e n te , ta l c o m o a d m in is t ra n d o e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , o a d m in is t rá n d o s e e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t ic u e rp o s a n t i-P D -L I s e g u n d o . A d e m á s , o c o m o a lte rn a t iv a , un a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e n a d m in is t ra r s e c u e n c ia lm e n te , ta l c o m o a d m in is tra n d o e l a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , o a d m in is t rá n d o s e e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 s e g u n d o .
A d e m á s , s i s e a d m in is t ra s e c u e n c ia lm e n te m á s d e u n a d o s is d e la te ra p ia c o m b in a d a , e l o rd e n d e la a d m in is t ra c ió n s e c u e n c ia l se p u e d e re v e r t ir o m a n te n e r en e l m is m o o rd e n en c a d a m o m e n to d e a d m in is tra c ió n , las a d m in is t ra c io n e s s e c u e n c ia le s p u e d e n c o m b in a rs e c o n a d m in is t ra c io n e s c o n c u rre n te s , o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e la s m is m a s . P o r e je m p lo , la p r im e ra a d m in is tra c ió n d e u n a c o m b in a c ió n a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 y a n t ic u e rp o a n ti-C D 73 p u e d e s e r c o n c u rre n te , la s e g u n d a a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , y la te rc e ra a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 s e g u n d o , e tc . A d e m á s , o c o m o a lte rn a t iv a , la p r im e ra a d m in is tra c ió n d e u n a c o m b in a c ió n a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 y a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p u e d e s e r c o n c u rre n te , la s e g u n d a a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l c o n e l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , y la te rc e ra a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 s e g u n d o , e tc . A d e m á s , o c o m o a lte rn a t iv a , la p r im e ra a d m in is tra c ió n d e u n a c o m b in a c ió n a n t ic u e rp o a n ti-P D -L 1 y a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p u e d e s e r c o n c u rre n te , la s e g u n d a a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l co n e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , y la te rc e ra a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I s e g u n d o , e tc . A d e m á s , o c o m o a lte rn a t iv a , la p r im e ra a d m in is tra c ió n d e u n a c o m b in a c ió n a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 y a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p u e d e s e r c o n c u rre n te , la s e g u n d a a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l co n e l a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 s e g u n d o , y la te rc e ra a d m in is tra c ió n p u e d e s e r s e c u e n c ia l c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y e l a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 s e g u n d o , e tc . O tro e s q u e m a d e d o s if ic a c ió n re p re s e n ta t iv o p u e d e im p lic a r u n a p r im e ra a d m in is tra c ió n q u e e s s e c u e n c ia l c o n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 p r im e ro y a n t i-C T L A -4 (y /o a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 y /o a n t ic u e rp o a n t i-P D -L I y /o a n t ic u e rp o a n t i-L A G -3 ) s e g u n d o , y p o s te r io rm e n te la s a d m in is t ra c io n e s p u e d e n s e r c o n c u rre n te s .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , en la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a g o n is ta d e C D 137 (4 -1 B B ), ta l c o m o un a n t ic u e rp o d e C D 137 a g o n is ta . L o s a n t ic u e rp o s d e C D 137 a d e c u a d o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , u re lu m a b o P F -05082566 (W O 12 /32433 ) .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , e n la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a g o n is ta d e O X 40 , ta l c o m o un a n t ic u e rp o d e O X 40 a g o n is ta . L o s a n t ic u e rp o s d e O X 40 a d e c u a d o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , M E D I-6383 , M E D I-6469 o M O X R 0916 (R G 7888 ; W O 06 /029879 ) .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , en la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a g o n is ta d e C D 40 , ta l c o m o un a n t ic u e rp o d e C D 40 a g o n is ta . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a n ta g o n is ta d e C D 40 , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-C D 40 a n ta g o n is ta . L o s a n t ic u e rp o s d e C D 40 a d e c u a d o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , lu c a tu m u m a b (H C D 122 ), d a c e tu z u m a b (S G N -40 ) , C P -870.893 o C h i L o b 7 /4.
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , e n la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a g o n is ta d e C D 27 , ta l c o m o un a n t ic u e rp o d e C D 27 a g o n is ta . L o s a n t ic u e rp o s d e C D 27 a d e c u a d o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , v a r l i lu m a b (C D X -1127 ) .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , en e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s M G A 271 (a B 7 H 3 ) (W O 11 /109400 ) .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , en la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a n ta g o n is ta de K IR , ta le s c o m o lir ilu m a b .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , en la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a n ta g o n is ta de ID O . L o s a n ta g o n is ta s d e ID O a d e c u a d o s in c lu y e n , p o r e je m p lo , IN C B -024360 (W O 2006 /122150 , W O 07 /75598 , W O 08 /36653 , W O 08 /36642 ) , in d o x im o d , N L G -919 (W O 09 /73620 , W O 09 /1156652 , W O 11 /56652 , W O 12 /142237 ) o F 001287.
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , en la q u e e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un a g o n is ta d e l re c e p to r t ip o T o ll, p o r e je m p lo , un a g o n is ta d e T L R 2 /4 (p o r e je m p lo , B a c il lu s C a lm e tte -G u e r in ) ; un a g o n is ta d e T L R 7 (p o r e je m p lo , H ilto n o l o Im iq u im o d ); un a g o n is ta d e T L R 7 /8 (p o r e je m p lo , R e s iq u im o d ) ; o un a g o n is ta d e T L R 9 (p o r e je m p lo , C p G 7909 ) .
E n u n a re a liz a c ió n , un s u je to q u e t ie n e u n a e n fe rm e d a d q u e p u e d e b e n e f ic ia rs e d e la e s t im u la c ió n d e l s is te m a in m u n ita r io , p o r e je m p lo , c á n c e r o u n a e n fe rm e d a d in fe c c io s a , se t ra ta m e d ia n te la a d m in is tra c ió n a l s u je to d e un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o y un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 , e n la q u e , e l a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o e s un in h ib id o r d e T G F -P, p o r e je m p lo , G C 1008 , L Y 2157299 , T E W 7197 , o IM C -T R 1.
E n un a s p e c to , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is t r a r s e c u e n c ia lm e n te a n te s d e la a d m in is t ra c ió n d e un s e g u n d o a g e n te , p o r e je m p lo , un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o . E n u n a s p e c to , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is tra a l m is m o t ie m p o c o n e l s e g u n d o a g e n te , p o r e je m p lo , un a g e n te in m u n o ló g ic o -o n c o ló g ic o . E n un a s p e c to m á s , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se a d m in is t ra r s e c u e n c ia lm e n te d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e l s e g u n d o a g e n te . La a d m in is tra c ió n d e lo s d o s a g e n te s p u e d e c o m e n z a r en m o m e n to s q u e e s tá n , p o r e je m p lo , 30 m in u to s , 60 m in u to s , 90 m in u to s , 120 m in u to s , 3 h o ra s , 6 h o ra s , 12 h o ra s , 24 h o ra s , 36 h o ra s , 48 h o ra s , 3 d ía s , 5 d ía s , 7 d ía s , o u n a o m á s s e m a n a s s e p a ra d o s , o la a d m in is tra c ió n d e l s e g u n d o a g e n te p u e d e c o m e n z a r , p o r e je m p lo , 30 m in u to s , 60 m in u to s , 90 m in u to s , 120 m in u to s , 3 h o ra s , 6 h o ra s , 12 h o ra s , 24 h o ra s , 36 h o ra s , 48 h o ra s , 3 d ía s , 5 d ía s , 7 d ía s , o u n a o m á s s e m a n a s d e s p u é s d e q u e s e h a y a a d m in is tra d o e l p r im e r a g e n te .
E n c ie r to s a s p e c to s , un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y un s e g u n d o a g e n te , p o r e je m p lo , un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o , se a d m in is tra n s im u ltá n e a m e n te , p o r e je m p lo , s e in fu s io n a n s im u ltá n e a m e n te , p o r e je m p lo , d u ra n te un p e r io d o d e 30 o 60 m in u to s , a un p a c ie n te . U n a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se p u e d e fo rm u la r c o n ju n ta m e n te c o n un s e g u n d o a g e n te , p o r e je m p lo , un a g e n te in m u n o o n c o ló g ic o .
O p c io n a lm e n te , un a n t i-C D 73 c o m o a g e n te in m u n o te ra p é u t ic o so lo , o la c o m b in a c ió n d e un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y u n o o m á s a n t ic u e rp o s in m u n o te ra p é u t ic o s a d ic io n a le s (p o r e je m p lo , b lo q u e o d e a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o P D -L1 y /o a n t i-L A G -3 ) se p u e d e c o m b in a r a d e m á s c o n un a g e n te in m u n o g é n ic o , ta l c o m o c é lu la s c a n c e ro s a s , a n tíg e n o s tu m o ra le s p u r if ic a d o s ( in c lu y e n d o p ro te ín a s re c o m b in a n te s , p é p tid o s y m o lé c u la s d e c a rb o h id ra to s ) , c é lu la s y c é lu la s t r a n s fe c ta d a s co n g e n e s q u e c o d if ic a n c ito q u in a s in m u n o e s t im u la n te s (H e e t a l. (2004 ) J. Immunol. 173 :4919 -28 ) . L o s e je m p lo s n o lim ita t iv o s d e v a c u n a s tu m o ra le s q u e s e p u e d e n u s a r in c lu y e n p é p tid o s d e a n tíg e n o s d e m e la n o m a , ta le s c o m o p é p tid o s d e g p 100 , a n tíg e n o s M A G E , T rp -2 , M A R T 1 y /o t iro s in a s a , o c é lu la s tu m o ra le s tra n s fe c ta d a s p a ra e x p re s a r la c ito q u in a G M -C S F (d is c u t id o m á s a c o n t in u a c ió n ) . U n a in h ib ic ió n d e C D 73 c o m b in a d a y u n o o m á s a n t ic u e rp o s a d ic io n a le s (p o r e je m p lo , b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 a y /o L A G -3 ) se p u e d e n c o m b in a r a d e m á s c o n t r a ta m ie n to s d e c á n c e r c o n v e n c io n a le s . P o r e je m p lo , U n a in h ib ic ió n d e C D 73 c o m b in a d a y u n o o m á s a n t ic u e rp o s a d ic io n a le s (p o r e je m p lo , b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 a y /o L A G -3 ) se p u e d e n c o m b in a r e f ic a z m e n te c o n re g ím e n e s q u im io te ra p é u t ic o s . E n e s to s c a s o s , E s p o s ib le re d u c ir la d o s is d e o tro re a c tiv o q u im io te ra p é u t ic o a d m in is t ra d o c o n la c o m b in a c ió n d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n (M o k y r e t a l. (1998 ) Cáncer Research 58 : 5301 -5304 ) . U n e je m p lo d e ta l c o m b in a c ió n e s u n a c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta a n t i-C D 73 c o n o s in un a n t ic u e rp o a d ic io n a l, ta l c o m o a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A -4 y /o a n t ic u e rp o s a n ti-P D -1 y /o a n t ic u e rp o s a n ti-P D -L 1 y /o a n t ic u e rp o s a n t i-L A G -3 ) a d e m á s ju n to c o n d e c a rb a z in a p a ra e l t r a ta m ie n to d e m e la n o m a . O tro e je m p lo e s u n a c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 co n o s in a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A -4 , y /o a n t ic u e rp o s a a n ti-P D -1 y /o a n t ic u e rp o s a n ti-P D -L 1 y /o a n t ic u e rp o s L A G -3 a d e m á s ju n to c o n in te r le u c in a -2 ( IL -2 ) p a ra e l t ra ta m ie n to d e m e la n o m a . El fu n d a m e n to c ie n tí f ic o t ra s e l u so c o m b in a d o d e la in h ib ic ió n d e C D 73 y b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 y /o L A G -3 c o n q u im io te ra p ia e s q u e la m u e r te c e lu la r , q u e e s u n a c o n s e c u e n c ia d e la a c c ió n c ito tó x ic a d e la m a y o r ía d e lo s c o m p u e s to s q u im io te ra p é u t ic o s , d e b e r ía d a r lu g a r a n iv e le s in c re m e n ta d o s d e a n tíg e n o tu m o ra l en la ru ta de p re s e n ta c ió n d e l a n tíg e n o . O tra s te ra p ia s d e c o m b in a c ió n q u e p u e d e n d a r c o m o re s u lta d o s in e rg ia c o n u n a in h ib ic ió n d e C D 73 c o m b in a d a c o n o s in un b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 y /o L A G -3 a t ra v é s d e la m u e r te c e lu la r in c lu y e n la ra d ia c ió n , c iru g ía , o p r iv a c ió n h o rm o n a l. C a d a u n o d e e s to s p ro to c o lo s c re a u n a fu e n te d e a n t íg e n o tu m o ra l e n e l h o s p e d a d o r . L o s in h ib id o re s d e a n g io g é n e s is ta m b ié n s e p u e d e c o m b in a r c o n u n a in h ib ic ió n d e C D 73 c o m b in a d a y b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 y /o L A G -3. L a in h ib ic ió n d e la a n g io g é n e s is c o n d u c e a la m u e r te d e la s c é lu la s tu m o ra le s , q u e p u e d e s e r u n a fu e n te d e a n tíg e n o tu m o ra l a lim e n ta d a en la s ru ta s d e p re s e n ta c ió n d e l a n tíg e n o d e l h o s p e d a d o r .
U n a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta a n t i-C D 73 c o m o a g e n te in m u n o te ra p é u t ic o so lo , o u n a c o m b in a c ió n d e a n ta g o n ís t ic a de C D 73 y a n t ic u e rp o s d e b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 y /o L A G -3 se p u e d e n u s a r ju n to c o n a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s q u e d ir ig e n la s c é lu la s e fe c to ra s q u e e x p re s a n e l re c e p to r F c a o F c y d ia n a a la s c é lu la s tu m o ra le s (v é a s e , p o r e je m p lo , lo s d o c u m e n to s d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.922.845 y 5.837.243 ) . S e p u e d e n u s a r a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s p a ra d ir ig ir d o s a n tíg e n o s s e p a ra d o s . E l b ra z o d e lin fo c ito T d e e s ta s re s p u e s ta s se a u m e n ta r ía p o r e l u s o d e u n a in h ib ic ió n d e C D 73 y b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 y /o L A G -3 c o m b in a d o s .
E n o tro e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta a n t i-C D 73 c o m o a g e n te in m u n o te ra p é u t ic o s o lo o u n a c o m b in a c ió n d e un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y a g e n te in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l, p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 y /o a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 y /o a n t ic u e rp o a n ti-P D -L 1 y /o a g e n te L A G -3 , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o , se p u e d e u s a r ju n to c o n un a n t ic u e rp o a n t in e o p lá s ic o , ta l c o m o R IT U X A N ® ( r itu x im a b ) , H e rc e p t in ® ( t ra s tu z u m a b ) , B e x x a r® ( to s itu m o m a b ) , Z e v a lin ® ( ib r itu m o m a b ) , C a m p a th ® (a le m tu z u m a b ) , L y m p h o c id e ® (e p r tu z u m a b ) , A v a s t in ® (b e v a c iz u m a b ) , y T a rc e v a ® (e r lo t in ib ) , y s im ila re s . A m o d o d e e je m p lo y s in e l d e s e o d e q u e d a r v in c u la d o s a te o r ía a lg u n a , e l t ra ta m ie n to c o n un a n t ic u e rp o a n t ic a n c e r íg e n o o un a n t ic u e rp o a n t ic a n c e r íg e n o c o n ju g a d o co n u n a to x in a p u e d e c o n d u c ir a la m u e r te d e c é lu la s c a n c e ro s a s (p o r e je m p lo , c é lu la s tu m o ra le s ) , lo q u e p o te n c ia r ía u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia m e d ia d a p o r e l a g e n te in m u n o e s t im u la n te , p o r e je m p lo , C D 73 , C T L A -4 , P D -1 , P D -L 1 o L A G -3 , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o . E n u n a re a liz a c ió n a m o d o d e e je m p lo , un tra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a (p o r e je m p lo , un tu m o r c a n c e ro s o ) p u e d e in c lu ir un a g e n te a n t ic á n c e r , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o , ju n to c o n a n t i-C D 73 y o p c io n a lm e n te un a g e n te in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l, p o r e je m p lo , a g e n te a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n ti-P D -L 1 y /o a n t i-L A G -3 , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o , c o n c u rre n te o s e c u e n c ia lm e n te , o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e lo s m is m o s , q u e p u e d e p o te n c ia r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia a n t itu m o ra l p o r e l h o s p e d a d o r .
L o s tu m o re s e v a d e n la v ig i la n c ia in m u n ita r ia d e l h o s p e d a d o r p o r u n a g ra n d iv e rs id a d d e m e c a n is m o s . M u c h o s d e e s to s m e c a n is m o s p u e d e n s e r s u p e ra d o s p o r la in a c t iv a c ió n d e p ro te ín a s , q u e se e x p re s a n p o r lo s tu m o re s y q u e s o n in m u n o s u p re s o ra s . E s ta s in c lu y e n , e n tre o tro s , T G F - p (K e h r l e t a l. (1986 ) J. Exp. Med. 163 : 1037 -1050 ), IL -10 (H o w a rd & O 'G a r ra (1992 ) Immunology T o d a y 13: 198 -200 ), y lig a n d o F a s (H a h n e e t a l. (1996 ) Science 274 : 1363 ­ 1365 ). A d e m á s s e p u e d e n c o m b in a r a n t ic u e rp o s p a ra c a d a u n a d e e s ta s e n t id a d e s c o n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 co n o s in un a g e n te in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l, p o r e je m p lo , un a g e n te a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n ti-P D -L 1 y /o a n t i-L A G -3 , ta l c o m o a n t ic u e rp o , p a ra c o n tra r re s ta r lo s e fe c to s d e lo s a g e n te s in m u n o s u p re s o re s y fa v o re c e r la s re s p u e s ta s in m u n e s a n t itu m o ra le s p o r p a r te d e l h o s p e d a d o r .
O tro s a g e n te s , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s , q u e s e p u e d e n u s a r p a ra a c t iv a r la c a p a c id a d d e re s p u e s ta in m u n ita r ia d e l h o s p e d a d o r a d e m á s se p u e d e u s a r ju n to c o n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 co n o s in un a g e n te in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l, ta l c o m o , a n t ic u e rp o a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n ti-P D -L 1 y /o a n t i-L A G -3. E s to s in c lu y e n m o lé c u la s en la s u p e r f ic ie d e la s c é lu la s d e n d r í t ic a s q u e a c t iv a n la fu n c ió n D C y la p re s e n ta c ió n d e l a n tíg e n o . L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 40 (R id g e e t a l., s u p ra ) se p u e d e n u s a r ju n to c o n un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 y o p c io n a lm e n te un a g e n te in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l, p o r e je m p lo , un a g e n te a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n ti-P D -L 1 y /o a n t i-L A G -3 , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o . O tro s a n t ic u e rp o s a c t iv a d o re s p a ra m o lé c u la s c o e s t im u la d o ra s d e lin fo c ito s T W e in b e rg e t a l., supra, M e le ro e t a l. supra, H u t lo f f e t a l., s u p ra , ta m b ié n p u e d e n p ro p o rc io n a r n iv e le s in c re m e n ta d o s d e a c t iv a c ió n d e l in fo c ito s T.
C o m o s e h a tr a ta d o a n te r io rm e n te , e l t r a s p la n te d e m é d u la ó s e a s e u t il iz a a c tu a lm e n te p a ra t r a ta r d iv e rs o s tu m o re s d e o r ig e n h e m a to p o y é tic o . L a in m u n o te ra p ia a n t i-C D 73 s o la o c o m b in a d a c o n b lo q u e o d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L1 y /o L A G -3 s e p u e d e u s a r p a ra in c re m e n ta r la e f ic a c ia d e lo s l in fo c ito s T e s p e c íf ic o s a tu m o r d o n a n te s .
T a m b ié n v a r io s p ro to c o lo s d e tra ta m ie n to e x p e r im e n ta l im p lic a n la a c t iv a c ió n ex vivo y e x p a n s ió n d e l in fo c ito s T e s p e c íf ic o s a a n tíg e n o y t ra n s fe re n c ia a d o p t iv a d e e s ta s c é lu la s en re c e p to re s p a ra l in fo c ito s T e s p e c íf ic o s a a n tíg e n o c o n tra tu m o r (G re e n b e rg , & R id d e ll, s u p ra ) . E s to s m é to d o s ta m b ié n se p u e d e n u s a r p a ra a c t iv a r las re s p u e s ta s d e lo s l in fo c ito s T a a g e n te s in fe c c io s o s ta le s c o m o C M V . La a c t iv a c ió n ex vivo en la p re s e n c ia d e a n ti-C D 73 c o n o s in u n a te ra p ia in m u n o e s t im u la n te a d ic io n a l, p o r e je m p lo , se p u e d e e s p e ra r q u e lo s a n t ic u e rp o s a n ti-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n ti-P D -L 1 y /o a n t i-L A G -3 in c re m e n te n la f re c u e n c ia y la a c t iv id a d d e lo s l in fo c ito s T tra n s fe r id o s d e m a n e ra a d o p tiv a .
E n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra a lte ra r u n a s u c e s o a d v e rs o a s o c ia d o c o n e l t r a ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d h ip e rp ro life ra t iv a (p o r e je m p lo , c á n c e r) c o n un a g e n te in m u n o e s t im u la d o r , q u e c o m p re n d e a d m in is t ra r un a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 co n o s in y u n a d o s is s u b te ra p é u tic a d e a g e n te a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n ti-P D -L 1 y /o a n t i-L A G -3 , p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o , a un s u je to . P o r e je m p lo , lo s m é to d o s d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to p a ra un m é to d o d e re d u c c ió n d e la in c id e n c ia d e c o lit is in d u c id a p o r a n t ic u e rp o te ra p é u t ic o in m u n o e s t im u la d o r o d ia r re a m e d ia n te la a d m in is t ra c ió n d e un e s te ro id e n o a b s o rb ib le a l p a c ie n te . C o m o s e u s a en e l p re s e n te d o c u m e n to , un "e s te ro id e n o a b s o rb ib le " e s un g lu c o c o r t ic o id e q u e p re s e n ta un e x te n s o m e ta b o lis m o d e p r im e r p a s o d e m a n e ra q u e , d e s p u é s d e l m e ta b o lis m o en e l h íg a d o , la b io d is p o n ib il id a d d e l e s te ro id e e s b a ja , e s d e c ir , m e n o s d e a p ro x im a d a m e n te 20 % . E n u n a re a liz a c ió n d e s c r ita en e l p re s e n te d o c u m e n to , e l e s te ro id e no a b s o rb ib le e s b u d e s o n id a . L a b u d e s o n id a e s un g lu c o c o r t ic o s te ro id e d e a c c ió n lo ca l, q u e se m e ta b o liz a a m p lia m e n te , p r in c ip a lm e n te p o r e l h íg a d o , d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n o ra l. E N T O C O R T E C ® (A s tra -Z e n e c a ) es u n a fo rm u la c ió n o ra l d e b u d e s o n id a d e p e n d ie n te d e l t ie m p o y d e l pH d e s a rro lla d a p a ra o p t im iz a r la a d m in is tra c ió n d e fá rm a c o s a l íle o n y p o r to d o e l c o lo n . E N T O C O R T ® E C e s tá a p ro b a d o e n lo s E s ta d o s U n id o s p a ra t ra ta m ie n to d e la e n fe rm e d a d d e C ro h n le v e a m o d e ra d a q u e a fe c ta a l íle o n y /o a l c o lo n a s c e n d e n te . L a d o s is o ra l h a b itu a l de E N T O C O R T E C ® p a ra e l t ra ta m ie n to d e la e n fe rm e d a d d e C ro h n e s d e 6 a 9 m g /d ía . E N T O C O R T E C ® s e lib e ra en lo s in te s t in o s a n te s d e s e r a b s o rb id o y re te n id o en la m u c o s a in te s t in a l. U n a v e z q u e p a s a a t ra v é s d e l te j id o d ia n a d e la m u c o s a in te s t in a l, E N T O C O R T E C ® se m e ta b o liz a a m p lia m e n te p o r e l s is te m a d e l c ito c ro m o p 450 en el h íg a d o a m e ta b o lito s c o n u n a a c t iv id a d g lu c o c o r t ic o id e in s ig n if ic a n te . P o r lo ta n to , L a b io d is p o n ib il id a d e s b a ja (a lre d e d o r d e l 10 % ). L a b a ja b io d is p o n ib il id a d d e b u d e s o n id a d a c o m o re s u lta d o u n a p ro p o rc ió n te ra p é u t ic a m e jo ra d a en c o m p a ra c ió n co n o tro s g lu c o c o r t ic o id e s co n un m e ta b o lis m o d e p r im e r p a s o m e n o s e x te n s o . B u d e s o n id a d a c o m o re s u lta d o m e n o s e fe c to s a d v e rs o s , in c lu y e n d o m e n o s s u p re s ió n h ip o ta lá m ic a -p itu ita r ia , q u e los c o r t ic o s te ro id e s d e a c c ió n s is té m ic a . S in e m b a rg o , la a d m in is tra c ió n c ró n ic a d e E N T O C O R T E C ® p u e d e p ro d u c ir e fe c to s g lu c o c o r t ic o id e s s is té m ic o s ta le s c o m o h ip e rc o r t ic is m o y s u p re s ió n s u p ra r re n a l. V é a s e P D R 58 a ed . 2004 ; 608 -610.
E n o tra s re a liz a c io n e s a d ic io n a le s , la in h ib ic ió n d e C D 73 c o n o s in b lo q u e d e C T L A -4 y /o P D -1 y /o P D -L 1 y /o L A G -3 (e s d e c ir , a n t ic u e rp o s te ra p é u t ic o s in m u n o e s t im u la d o re s a n t i-C D 73 y o p c io n a lm e n te a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n t i-P D -L I y /o a n t i-L A G -3 ) ju n to c o n un e s te ro id e n o a b s o rb ib le a d e m á s se p u e d e c o m b in a r c o n un s a lic ila to . L o s s a lic ila to s in c lu y e n a g e n te s 5 -A S A ta le s c o m o , p o r e je m p lo : s u lfa s a la z in a (A Z U L F ID IN E ® , P h a rm a c ia & U p jo h n ) ; o ls a la z in a (D IP e N t U M ® , P h a rm a c ia & U p jo h n ) ; b a ls a la z id a (C O L A Z A L ® , S a lix P h a rm a c e u t ic a ls , In c .); y m e s a la m in a (A S A C O L ® , P ro c te r & G a m b le P h a rm a c e u t ic a ls ; P e N t A S A ® , S h ire U S ; C A N A S A ® , A x c a n S c a n d ip h a rm , Inc .; R O W A S A ® , S o lv a y ) .
D e a c u e rd o c o n lo s m é to d o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , u n s a lic ila to a d m in is t ra d o ju n to c o n a n t i-C D 73 co n o s in a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n t i-P D -L I y /o L A G -3 y un e s te ro id e n o a b s o rb ib le p u e d e in c lu ir c u a lq u ie r s o la p a m ie n to o a d m in is tra c ió n s e c u e n c ia l d e l s a lic ila to y e l e s te ro id e n o a b s o rb ib le c o n e l f in d e d is m in u ir la in c id e n c ia d e c o lit is in d u c id a p o r a n t ic u e rp o s in m u n o e s t im u la d o re s . P o r ta n to , p o r e je m p lo , lo s m é to d o s p a ra re d u c ir la in c id e n c ia d e c o lit is in d u c id a p o r lo s a n t ic u e rp o s in m u n o e s t im u la d o re s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to a b a rc a n la a d m in is tra c ió n d e un s a lic ila to y u n o n o a b s o rb ib le a l m is m o t ie m p o o s e c u e n c ia lm e n te (p o r e je m p lo , un s a lic ila to se a d m in is t ra 6 h o ra s d e s p u é s d e un e s te ro id e n o a b s o rb ib le ) , o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e lo m is m o . A d e m á s , un s a lic ila to y un e s te ro id e n o a b s o rb ib le se p u e d e n a d m in is t ra r m e d ia n te la m is m a v ía (p o r e je m p lo , a m b o s s e a d m in is tra n o ra lm e n te ) o m e d ia n te v ía s d ife re n te s (p o r e je m p lo , un s a lic ila to s e a d m in is t ra o ra lm e n te y un e s te ro id e n o a b s o rb ib le se a d m in is t ra p o r e l re c to ) , la s c u a le s p u e d e n d ife r ir d e la (s ) ru ta (s ) u s a d a (s ) p a ra a d m in is t ra r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 y a n t i-C T L A -4 y /o a n ti-P D -1 y /o a n t i-P D -L I y /o a n ti-L A G -3.
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 y la c o m b in a c ió n d e te ra p ia s d e a n t ic u e rp o d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to ta m b ié n se p u e d e n u s a r ju n to c o n o tra s te ra p ia s b ie n c o n o c id a s q u e s e s e le c c io n a n p a ra su p a r t ic u la r u t ilid a d c o n tra la e n fe rm e d a d a t r a ta r (p o r e je m p lo , c á n c e r) . L a s c o m b in a c io n e s d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to s e p u e d e n u s a r s e c u e n c ia lm e n te c o n a g e n te (s ) fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le (s ) c o n o c id o (s ) .
P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 y la s te ra p ia s co n a n t ic u e rp o d e c o m b in a c ió n d e s c r ito s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u s a r ju n to c o n (p o r e je m p lo , s im u ltá n e a m e n te o p o r s e p a ra d o ) un t ra ta m ie n to a d ic io n a l, ta l c o m o ir ra d ia c ió n , q u im io te ra p ia (p o r e je m p lo , u s a n d o c a m p to te c in a (C P T -11 ) , 5 - f lu o ro u ra c ilo (5 -F U ), c is p la t in o , d o x o rru b ic in a , ir in o te c á n , p a c lita x e l, g e m c ita b in a , c is p la t in o , p a c lita x e l, c a rb o p la t in -p a c lita x e l (T a x o l) , d o x o rru b ic in a , 5 -fu o c a m p to te c in a a p o 21 /T R A IL (u n c o m b o 6 X )) , u n o o m á s in h ib id o re s d e p ro te a s o m a (p o r e je m p lo , b o r te z o m ib o M G 132 ) , u n o o m á s in h ib id o re s d e B c l-2 (p o r e je m p lo , B H 3 I-2 ' ( in h ib id o r d e b c l-x 1 ) , in h ib id o r d e in d o le a m in a d io x ig e n a s a -1 ( ID O 1 ) (p o r e je m p lo ., IN C B 24360 ) , A T -101 (d e r iv a d o d e R -( - ) -g o s s ip o l) , A B T -263 (m o lé c u la p e q u e ñ a ) , G X -15 -070 (o b a to c la x ) o M C L -1 (a n ta g o n is ta s d e la p ro te ín a 1 d e d ife re n c ia c ió n c e lu la r d e le u c e m ia m ie lo id e ) , a n ta g o n is ta s d e iA P ( in h ib id o r d e la p ro te ín a d e a p o p to s is ) (p o r e je m p lo , s m a c 7 , s m a c 4 , m im é t ic o s m a c d e m o lé c u la p e q u e ñ a , p é p tid o s s m a c s in té t ic o s (v é a s e F u ld a e t a l., Nat Med 2002 ;8 :808 -15 ) , IS IS 23722 (L Y 2181308 ) o A E G -35156 (g E M -640 )) , H D A C ( in h ib id o re s d e la h is to n a d e s a c e t ila s a ) , a n t ic u e rp o s a n t i-C D 20 (p o r e je m p lo , r itu x im a b ) , in h ib id o re s d e la a n g io g é n e s is (p o r e je m p lo , b e v a c iz u m a b ) , a g e n te s a n t i-a g io g é n ic o s d ir ig id o s a V E G F y V E G F R (p o r e je m p lo , A v a s t in a ) , t r ite rp e n o id e s s in té t ic o s (v é a s e H y e r e t a l., Cáncer Research 2005 ;65 :4799 -808 ) , c -F L IP (p ro te ín a in h ib id o ra d e F L IC E c e lu la r ) m o d u la d o re s (p o r e je m p lo , l ig a n d o s n a tu ra le s y s in té t ic o s d e P P A R y ( re c e p to r Y a c t iv a d o p o r p ro li fe ra d o d e p e ro x is o m a ) , 5809354 o 5569100 ) , in h ib id o re s d e q u in a s a (p o r e je m p lo ., S o ra fe n ib ) , T ra s tu z u m a b , C e tu x im a b , T e m s iro lim u s , in h ib id o re s d e m T O R ta le s c o m o ra p a m ic in a y te m s iro lim u s , B o r te z o m ib , in h ib id o re s d e J A K 2 , in h ib id o re s d e H S P 90 , in h ib id o re s d e P I3 K -A K T , L e n a lid o m id a , in h ib id o re s d e G S K 3 p , in h ib id o re s d e IA P y /o fá rm a c o s g e n o tó x ic o s .
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 y la s te ra p ia s c o n a n t ic u e rp o d e c o m b in a c ió n d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to se p u e d e n u s a r a d e m á s ju n to c o n u n o o m á s a g e n te s c ito tó x ic o s a n t ip ro life ra t iv o s . L a s c la s e s d e c o m p u e s to s q u e p u e d e n u s a rs e c o m o a g e n te s c ito tó x ic o s a n t ip ro life ra t iv o s in c lu y e n , p e ro s in l im ita c ió n , la s s ig u ie n te s :
a g e n te s a lq u ila n te s ( in c lu y e n d o , s in l im ita c ió n , m o s ta z a s n it ro g e n a d a s , d e r iv a d o s d e e t ile n im in a , a lq u il s u lfo n a to s , n it ro s o u re a s y t r ia z e n o s ) : m o s ta z a d e u ra c ilo , c lo rm e t in a , c ic lo fo s fa m id a (C Y T O X A N ™ ) fo s fa m id a , M e lfa lá n , C lo ra m b u c ilo , P ip o b ro m a n o , T r ie t i le n o m e la m in a , T r ie t i le n o t io fo s fo ra m in a , B u s u lfá n , C a rm u s t in a , L o m u s tin a , E s tre p to z o c in a , d a c a rb a z in a y te m o z o lo m id a .
A n t im e ta b o lito s ( in c lu y e n d o , s in l im ita c ió n , a n ta g o n is ta s d e á c id o fó lic o , a n á lo g o s d e p ir im id in a , a n á lo g o s d e p u r in a e in h ib id o re s d e a d e n o s in a d e s a m in a s a ) : M e to tre x a to , 5 - f lu o ro u ra c ilo , F lo x u r id in a , C ita ra b in a , 6 -m e rc a p to p u r in a , 6 -t io g u a n in a , F o s fa to d e f lu d a ra b in a , p e n to s ta t in a y g e m c ita b in a .
A g e n te s a n t ip ro l i fe ra t iv o s a d e c u a d o s p a ra la c o m b in a c ió n c o n a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 a n ta g o n is ta s , s in l im ita c ió n , ta x a n o s , p a c lita x e l (p a c li ta x e l e s c o m e rc ia lm e n te d is p o n ib le c o m o T A X O L ™ ), d o c e ta x e l, d is c o d e rm o lid a (D D M ), d ic t io s ta t in a (D C T ), p e lo ru s id a A , e p o ti lo n a s , e p o ti lo n a A , e p o ti lo n a B, e p o ti lo n a C , e p o ti lo n a D, e p o ti lo n a E, e p o ti lo n a F, fu ra n o e p o t i lo n a D, d e s o x ie p o t ilo n a B 1 , [17 ]-d e s h id ro d e s o x ie p o t i lo n a B, [18 ]-d e s h id ro d e s o x ie p o t i lo n a B, C 12 ,13 -c ic lo p ro p il-e p o t i lo n a A , e p o ti lo n a A p u e n te a d a C 6 -C 8 , t ra n s -9 ,10 -d e s h id ro e p o t i lo n a D, c is -9 ,10 -d e s h id ro e p o t i lo n a D, 16 -d e s m e ti le p o t ilo n a B, e p o ti lo n a B 10 , d is c o d e ro m o lid a , p a tu p ilo n a (E P O -906 ) , K O S -862 , K O S -1584 , Z K -E P O , A B J -789 , X A A 296 A (d is c o d e rm o lid a ) , T Z T -1027 (s o b lid o t in a ) , IL X -651 ( ta s id o t in a c lo rh id ra to ) , h a lic o n d r in a B, m e s ila to d e e r ib u lin a (E -7389 ) , h e m ia s te r lin a (H T I-286 ) , E -7974 , c r ip to f ic in a s , L Y -355703 , in m u n o c o n ju g a d o s d e m a ita n s in o id e (D M -1 ), M k C - 1, A B T -751 , T 1 -38067 , T -900607 , S B -715992 ( is p in e s ib ) , S B -743921 , M K -0731 , S T A -5312 , e le u te ro b in a , 17 b e ta -a c e to x i-2 -e to x i-6 -o x o -B -h o m o -e s tra -1 ,3 ,5 (10 ) - t r ie n -3 -o l, c ic lo s tre p t in a , is o la u lim a lid a , la u lim a lid a , 4 -e p i-7 -d e s h id ro x i-14 ,16 -d id e m e t i l- (+ ) -d is c o d e rm o lid a s y c r ip to t i lo n a 1, a d e m á s d e o tro s a g e n te s e s ta b i l iz a d o re s d e la m ic ro tu b u lin a c o n o c id o s e n la té c n ic a .
E n lo s c a s o s en q u e e s d e s e a b le h a c e r q u e la s c é lu la s p ro li fe ra t iv a s d e fo rm a a b e rra n te p e rm a n e z c a n q u ie s c e n te s ju n to c o n o a n te s d e l t ra ta m ie n to c o n lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to , la s h o rm o n a s y e s te ro id e s ( in c lu y e n d o a n á lo g o s s in té t ic o s ) , ta le s c o m o 17 a -e t in ile s tra d io l, D ie t i le s t i lb e s tro l, T e s to s te ro n a , P re d n is o n a , F lu o x im a s te ro n a , P ro p io n a to d e d ro m o s ta n o lo n a , T e s to la c to n a , M e g e s tro la c e ta to , M e t ilp re d n is o lo n a , m e t il- te s to s te ro n a , P re d n is o lo n a , T r ia m c in o lo n a , C lo ro tr ia n is e n o , H id ro x ip ro g e s te ro n a , A m in o g lu te t im id a , E s tra m u s t in a , m e d ro x ip ro g e s te ro n a a c e ta to , le u p ro lid a , f lu ta m id a , T o re m ife n o , Z O L A D E X ™ , ta m b ié n se p u e d e n a d m in is t ra r a l p a c ie n te . C u a n d o se e m p le a n lo s m é to d o s o c o m p o s ic io n e s d e s c r ita s en e l p re s e n te d o c u m e n to , ta m b ié n se p u e d e n a d m in is t r a r o tro s a g e n te s u s a d o s en la m o d u la c ió n d e l c re c im ie n to o m e tá s ta s is tu m o ra l en un in s ta la c io n e s c lín ic a s , ta le s c o m o a n t im im é t ic o s , c o m o s e d e s e e .
L o s m é to d o s p a ra la a d m in is t ra c ió n s e g u ra y e f ic a z d e la m a y o r ía d e lo s a g e n te s q u im io te ra p é u t ic o s s o n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s e n la té c n ic a . A d e m á s , su a d m in is tra c ió n se d e s c r ib e e n la b ib lio g ra f ía c o n v e n c io n a l. P o r e je m p lo , la a d m in is t ra c ió n d e m u c h o s d e lo s a g e n te s q u im io te ra p é u t ic o s se d e s c r ib e en "P h y s ic ia n s ' D e s k R e fe re n c e " (P D R ), p o r e je m p lo , 1996 e d ic ió n (M e d ic a l E c o n o m ic s C o m p a n y , M o n tv a le , N .J . 07645 -1742 , E E .U U .).
E l o lo s a g e n te (s ) q u im io te ra p é u t ic o (s ) y /o la ra d io te ra p ia se p u e d e (n ) a d m in is t r a r d e a c u e rd o c o n p ro to c o lo s te ra p é u t ic o s b ie n c o n o c id o s e n la té c n ic a . S e rá e v id e n te p a ra lo s e x p e r to s e n la té c n ic a q u e la a d m in is t ra c ió n d e l o lo s a g e n te (s ) q u im io te ra p é u t ic o (s ) y /o la ra d io te ra p ia se p u e d e v a r ia r d e p e n d ie n d o d e la e n fe rm e d a d a t r a ta r y lo s e fe c to s c o n o c id o s d e l o lo s a g e n te (s ) q u im io te ra p é u t ic o (s ) y /o la ra d io te ra p ia s o b re d ic h a e n fe rm e d a d . T a m b ié n , d e a c u e rd o c o n lo s c o n o c im ie n to s d e l e x p e rto , lo s p ro to c o lo s te ra p é u t ic o s (p . e j., c a n t id a d e s d e d o s is y t ie m p o s d e a d m in is t ra c ió n ) se p u e d e n m o d if ic a r a la lu z d e lo s e fe c to s o b s e rv a d o s d e lo s a g e n te s te ra p é u t ic o s a d m in is tra d o s s o b re e l p a c ie n te , y a la lu z d e la s re s p u e s ta s o b s e rv a d a s d e la e n fe rm e d a d a lo s a g e n te s te ra p é u t ic o s a d m in is tra d o s .
L a p re s e n te d iv u lg a c ió n se ilu s tra a d e m á s m e d ia n te lo s s ig u ie n te s e je m p lo s
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos anti-CD73 humanos
S e g e n e ra ro n a n t ic u e rp o s h u m a n o s m o n o c lo n a le s a n t i-C D 73 h u m a n a en c e p a s H c o 7 , H c o 27 , H c o 20 , H c o 12 , H c o 17 , y H c 2 d e ra to n e s tra n s g é n ic o s H u M A b ® ( "H u M A b " e s u n a M a rc a C o m e rc ia l d e M e d a re x , In c ., P r in c e to n , N e w J e rs e y ) y ra to n e s K M ( la c e p a K M M o u s e ® c o n t ie n e e l t ra n s c ro m o s o m a S C 20 c o m o se d e s c r ib e en la p u b lic a c ió n P C t W O 02 /43478 ) . S e g e n e ra ro n ra to n e s H C 2 /K C o 27 H u M A b y ra to n e s K M c o m o se d e s c r ib e en lo s d o c u m e n to s d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N .° 5.770.429 y 5.545.806.
S e in m u n iz a ro n ra to n e s , in c lu y e n d o d iv e rs o s g e n o t ip o s d e ra to n e s tra n s g é n ic o s ( ta le s c o m o , K M , H c o 7 , H c o 27 , H c o 20 , H c o 12 , H c o 17 y H c 2 ) c o n d ife re n te s e s tra te g ia s d e in m u n iz a c ió n (d ife re n te a n tíg e n o , d ife re n te d o s is , d u ra c ió n , v ía s d e a d m in is t ra c ió n (a lm u h a d illa p la n ta r (fp ), in tra p e r ito n e a l ( ip ) y s u b c u tá n e a (s c ) y a d y u v a n te (C F A /IF A , R ib i y a n t ic u e rp o ) , e tc ). S e re a liz a ro n fu s io n e s d e lo s ra to n e s y se in v e s t ig a ro n , y lo s a n t ic u e rp o s se id e n t if ic a ro n a p a r t ir d e e s ta s fu s io n e s . L a c a ra c te r iz a c ió n a d ic io n a l c o n d u jo a l a is la m ie n to d e a n t ic u e rp o s de p a r t ic u la r in te ré s , in c lu y e n d o lo s a n t ic u e rp o s d e n o m in a d o s 11 F 11 -1 , 11 F 11 -2 , 4 C 3 -1 , 4 C 3 -2 , 4 C 3 -3 , 4 D 4 -1 , 10 D 2 -1 , 10 D 2 -2 , 11 A 6 -1 , 24 H 2 -1 , 5 F 8 -1 , 5 F 8 -2 , 6 E 11 -1 , y 7 A 11 -1. L a T a b la 7 (a c o n t in u a c ió n ) p ro p o rc io n a e l is o t ip o y e l a lo t ip o d e Ig G d e la s c a d e n a s p e s a d a s , a s í c o m o e l t ip o d e c a d e n a lig e ra , p a ra c a d a a n t ic u e rp o . L o s a n t ic u e rp o s q u e d if ie re n ú n ic a m e n te en la c a d e n a lig e ra e s tá n re p re s e n ta d o s p o r un d íg ito d ife re n te d e s p u é s d e l g u ió n . P o r e je m p lo , 11 F 11 -1 t ie n e la m is m a c a d e n a p e s a d a q u e 11 F 11 -2 , p e ro 11 F 11 -1 t ie n e la c a d e n a lig e ra V K 1 , m ie n tra s q u e 11 F 11 -2 t ie n e la c a d e n a lig e ra V K 2. A m e n o s q u e se e s p e c if iq u e lo c o n tra r io , lo s a n t ic u e rp o s re c o m b in a n te s b a s a d o s e n re g io n e s V H d e lo s a n t ic u e rp o s e n la ta b la e s tá n re a liz a d o s co n la c a d e n a lig e ra p re d o m in a n te .
Tabla 7:
Figure imgf000077_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000078_0003
L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s y n u c le ó tid o s d e la s e c u e n c ia d e lo n g itu d c o m p le ta d e la s c a d e n a s p e s a d a s y lig e ra s , lo s d o m in io s V H y V L y la s C D R d e c a d a a n t ic u e rp o se p ro p o rc io n a n en e l lis ta d o d e s e c u e n c ia s y en la T a b la 35. L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e V H y V L ta m b ié n se p ro p o rc io n a n en la s F ig u ra s 1 A a 17 B y un a l in e a m ie n to d e la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e V h y V L d e d iv e rs o s a n t ic u e rp o s s e p ro p o rc io n a e n la F ig u ra 35 ( la s s e c u e n c ia s d e C D R e s tá n e n n e g rita ) .
Ejemplo 2: Sustituciones de aminoácidos en regiones variables y variaciones de isotipo
L a re g ió n m a rc o d e la re g ió n V H d e l a n t ic u e rp o 11F 11 se m u tó in tro d u c ie n d o u n o o m á s d e la m u ta c ió n en lo s s ig u ie n te s re s to s d e a m in o á c id o s (s e m u e s tra n lo s a m in o á c id o s c irc u n d a n te s y e l a m in o á c id o m u ta d o e s tá s u b ra y a d o ) : T 25 (m u ta c ió n e n re g ió n m a rc o ; ... R L S C A T S G F T F ... ) , L 52 (m u ta c ió n c D r 2; ...W V A V IL Y D G S N ...) , G 54 (m u ta c ió n C D R 2 ; ...V IL Y D G S N K Y Y ... ) y V 94 (m u ta c ió n d e re g ió n m a rc o ; ...A E D T A V Y Y C A R ... ) . L o s n o m b re s d e la s c o n s tru c c io n e s y la s s u s t itu c io n e s e n c a d a u n o d e e llo s s e e x p o n e n e n la T a b la 8:
Tabla 8.
Figure imgf000078_0001
L a re g ió n c o n s ta n te d e lo s a n t ic u e rp o s 11 F 11 y 4 D 4 ta m b ié n s e m o d if ic a ro n , c a m b iá n d o la a u n a re g ió n c o n s ta n te d e Ig G 2 (C H 1 , b is a g ra , C H 2 y C H 3 ) c o n u n a s u s t itu c ió n C 219 S ( " Ig G 2 C S " ; S E Q ID N O : 267 ) , u n a re g ió n c o n s ta n te d e IgG 1 n o e fe c to ra c o n la s s u s t itu c io n e s L 234 A , L 235 E , G 237 A , A 330 S y P 331 S ( " Ig G 1. 1 f"; S E Q ID N O :268 ) o u n a re g ió n c o n s ta n te h íb r id a Ig G 1 /Ig G 2 n o e fe c to ra C H 1 y b is a g ra d e Ig G 2 (c o n C 219 S ) y C H 2 y C H 3 d e IgG 1 (c o n A 330 S /P 331 S ) ( " Ig G 2 C S - Ig G 1.1 f" o " Ig G 2 C 219 S - Ig G 1.1 f '; S E Q ID N O :169 ) . L a s c o n s tru c c io n e s q u e se p ro d u je ro n s e e n u m e ra n e n la T a b la 9.
Tabla 9.
Figure imgf000078_0002
L a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e C D 73.4 - Ig G 2 C S Ig G 1.1 f s e m u e s tra e n la F ig u ra 18 (S E Q ID N O : 189 ).
L o s a n t ic u e rp o s C D 73.3 -C D 73.11 se p ro d u je ro n c o m o s ig u e . S e u só la c a d e n a lig e ra V K 2 (S E Q ID N O : 102 ) p a ra lo s a n t ic u e rp o s q u e d e r iv a b a n d e 11 F 11 (C D 73.4 , C D 73.6 , C D 73.8 y C D 73.10 ) . L a s c a d e n a s p e s a d a s y l ig e ra s se e x p re s a ro n e n c é lu la s H E K 293 -6 E y lo s m e d id o s d e c u lt iv o se re c o g ie ro n 5 d ía s d e s p u é s d e la t ra n s fe c c ió n .
L a u n ió n d e la s c o n s tru c c io n e s a F c y R h u m a n o s s e m id ió p o r S P R h C D 64 y lo s d a to s d e la u n ió n d e h C D 32 a -H 131 p a ra m o lé c u la s d e Ig G 1.1 y Ig G 2 e ra n c o h e re n te s c o n lo s v a lo re s e s p e ra d o s p a ra la s d ife re n te s F c. Ig G 1.1 f e s la F c m á s in e rte . Ig G 2 y Ig G 2 -C 219 S m o s tró u n ió n t íp ic a a F c R p a ra Ig G 2. C o m o c a b ía e s p e ra r , lo s d a to s p a ra Ig G 2 -C 219 S -G 1.1 f s u g ie re n u n ió n s ig n if ic a t iv a m e n te m á s d é b il q u e IgG 1 o Ig G 2 t ip o s ilv e s tre , p e ro u n ió n in c re m e n ta d a en c o m p a ra c ió n c o n Ig G 1.1 f. Ig G 2 -C 219 S -G 1.1 f te n ía u n ió n d é b il d e h C D 32 a -H 131 (K d d e 2.3 j M ) y la a f in id a d de u n ió n a o tro s re c e p to re s F c y R e ra n m e n o r q u e 5 j M. La a f in id a d d e u n ió n d e Ig G 2 -C 219 S -G 1.1 f a F c y R c y n o e ra m a y o r q u e 5 j M . E L a n á lis is p o r S P R d e la u n ió n d e Ig G 2 -C 219 S -G 1.1 f a F c R n h u m a n o m o s tró u n ió n d e p e n d ie n te d e pH ( fu e r te a pH 6 y u n ió n d é b il c o n d is o c ia c ió n rá p id a a pH 7 ,4 ).
S e e n c o n tró q u e la s p re p a ra c io n e s re c o m b in a n te s c o n fre c u e n c ia c a re c e n d e L y s C - te rm in a l d e la c a d e n a p e s a d a . P o r e je m p lo , e l 97 % d e la s c a d e n a s p e s a d a s d e l a n t ic u e rp o C D 73.4. Ig G 2 - C 2 l9 S - G 1.1 f c a re c ía n d e la l is in a C -te rm in a l. D e te rm in a d a s p re p a ra c io n e s te n ía n p y ro -Q en la Q (g lu ta m in a ) N - te rm in a l d e la c a d e n a p e s a d a . P o r e je m p lo , e l 94 % d e la g lu ta m in a N - te rm in a l d e la c a d e n a p e s a d a d e l a n t ic u e rp o C D 73.4. Ig G 2 - C 2 l9 S - G 1.1 f e ra p y ro -Q .
Ejemplo 3: Características de unión de los anticuerpos anti-CD73
A . R e s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l (S P R )
S e e s tu d ia ro n la s c in é t ic a s d e u n ió n a C D 73 y la a f in id a d m e d ia n te re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l (S P R ) u s a n d o un in s tru m e n to B ia c o re T 100 (G E H e a lth c a re ) a 25 °C .
U n fo rm a to e x p e r im e n ta l e n s a y ó la u n ió n d e l d o m in io N - te rm in a l d e h C D 73 (q u e c o n s is t ía e n lo s re s to s 26 -336 d e la C D 73 h u m a n a ; d e n o m in a d o N -h C D 73 ) a a n t ic u e rp o s q u e se c a p tu ra ro n s o b re s u p e r f ic ie s d e p ro te ín a A in m o v iliz a d a s . P a ra e s to s e x p e r im e n to s , la p ro te ín a A (P ie rc e ) se in m o v iliz ó a u n a d e n s id a d d e 3.000 - 4.000 R U s o b re c é lu la s d e f lu jo 1 -4 d e un c h ip s e n s o r C M 5 (G E H e a lth c a re ) u s a n d o e l c o m p u e s to q u ím ic o c o n v e n c io n a l e t i l( d im e t i la m in o p ro p il) c a rb o d iim id a (E d C ) / N -h d ro x is u c c in im id a (N H S ), c o n b lo q u e o d e e ta n o a m in a , en un ta m p ó n d e e je c u c ió n d e h E p E S 0 ,01 M pH 7 ,4 , N a C l 0 ,15 M , E D T A 3 m M , tw e e n 20 a l 0 ,005 % v /v . L o s e x p e r im e n to s c in é t ic o s s e re a liz a ro n p r im e ro c a p tu ra n d o a n t ic u e rp o s (5 -10 u g /m l) s o b re la s s u p e r f ic ie s d e la p ro te ín a A u s a n d o un t ie m p o d e c o n ta c to d e 30 s a 10 u l/m in , c o n u n ió n d e N -h C D 73 -h is 600 , 200 , 66 ,7 , 22 ,2 , 7 ,4 , y 2 ,5 n M , u s a n d o 180 s d e t ie m p o d e a s o c ia c ió n y 360 s d e t ie m p o d e d is o c ia c ió n a u n a ta s a d e f lu jo d e 30 u l/m in . E l ta m p ó n d e e je c u c ió n p a ra lo s e x p e r im e n to s c in é t ic o s e ra d e fo s fa to d e s o d io 10 m M , c lo ru ro d e s o d io 130 m M , T w e e n 20 a l 0 ,05 % , pH 7 ,1. L a s s u p e r f ic ie s s e re g e n e ra ro n d e s p u é s d e c a d a c ic lo u s a n d o d o s p u ls o s d e 30 s d e g lic in a 10 m M pH 1 ,5 a u n a ta s a d e f lu jo d e 30 j l /m in . L o s d a to s d e l s e n s o g ra m a e ra n d o b le m e n te re fe re n c ia d o s y a c o n t in u a c ió n s e f i ja ro n a un m o d e lo 1:1 L a n g m u ir u s a n d o e l p ro g ra m a in fo rm á t ic o v 2.0.4 d e B ia c o re T 100 , p a ra d e te rm in a r la c o n s ta n te d e la ta s a d e a s o c ia c ió n (k a ), la c o n s ta n te d e la ta s a d e d is o c ia c ió n (k d ), y la c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n e n e q u ilib r io (K D ).
L o s re s u lta d o s se m u e s tra n en la T a b la 10. L a ta b la c o m p ila lo s d a to s d e lo s d ife re n te s e x p e r im e n to s . P a ra los a n t ic u e rp o s p a ra lo s c u a le s se m u e s tra n d o s o m á s c o n ju n to s d e n ú m e ro s , c a d a c o n ju n to c o r re s p o n d e a d a to s o b te n id o s e n un e x p e r im e n to s e p a ra d o .
Tabla 10.
Figure imgf000079_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000080_0001
L a K d en la ta b la e s la K d m o n o v a le n te , e s d e c ir , L a K d d e la u n ió n d e lo s a n t ic u e rp o s a la p o rc ió n N - te rm in a l de C D 73 h u m a n a , la c u a l e s m o n o v a le n te .
L a m u ta c ió n G 54 S se to le ra y p a re c e q u e in c re m e n ta lig e ra m e n te la a f in id a d , c o n la e lim in a c ió n d e l s it io d e is o m e r iz a c ió n D G p re v is to . L a m u ta c ió n L 52 W p a re c e c a u s a r u n a d is m in u c ió n e n la a f in id a d d e a p ro x im a d a m e n te 10 v e c e s . L a s v a r ia n te s 4 D 4 t ie n e n s e c u e n c ia s d e C D R 3 ú n ic a s y d ife re n te s c in é t ic a s (a s o c ia c ió n m á s le n ta en c o m p a ra c ió n c o n m o lé c u la s 11 F 11 ).
L a K d m e d ia d e 10 e x p e r im e n to s p a ra C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f e s 1,1 ± 0 ,4 n M . L a m u ta c ió n T 25 A re la t iv a a 11 F 11 n o a fe c ta la a fin id a d .
L o s re s u lta d o s m u e s tra n q u e to d o s lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 s e u n e n a C D 73 h u m a n a c o n b u e n a a f in id a d y t ie n e n u n a ta s a d e d is o c ia c ió n le n ta .
L o s re s u lta d o s d e lo s e s tu d io s d e u n ió n in d ic a n q u e la a c t iv id a d d e u n ió n s e m a n tu v o d e s p u é s d e la in tro d u c c ió n d e m u ta c io n e s en 11 F 11 , 4 C 3 o 4 D 4 , o c a m b io d e is o t ip o , a u n q u e a lg u n o s a n t ic u e rp o s te n ía n a f in id a d re d u c id a en re la c ió n a l a n t ic u e rp o o r ig in a l (e s d e c ir , 11 F 11 , 4 C 3 o 4 D 4 ). E n p a rt ic u la r , C D 73.10 (T 25 A ,L 52 W ,G 54 E ) t ie n e u n a ta s a d e d is o c ia c ió n m á s rá p id a q u e C D 73.4 (T 25 A ) o C D 73.11 (4 D 4 ) . L a c o m p a ra c ió n c o n to d a s la s m o lé c u la s de Ig G 2 in d ic a q u e 11 F 11 y C D 73.4 (11 F 11 -T 25 A ) t ie n e n la a f in id a d d e C D 73 m o n o v a le n te m á s a lta (K D = 1,1 nM ± 0 ,4 n M ). C D 73.10 (11 F 11 -T 25 A , L 52 W , G 54 E ) t ie n e n a f in id a d d e C D 73 a p ro x im a d a m e n te 10 v e c e s m e n o r q u e 11 F 11 o C D 73.4. E s to s u g ie re q u e la s m u ta c io n e s d e L 52 W o G 54 E o a m b a s re d u c e n la a f in id a d d e C D 73 c u a n d o ju n to c o n o tra s s e c u e n c ia s d e 11 F 11. 4 D 4 y C D 73.11 t ie n e n a f in id a d c o m p a ra b le c o n C D 73.10 (K D a p ro x im a d a m e n te 5 n M ), p e ro d ife re n te s c in é t ic a s . S e c re e q u e e l e p í to p o 4 C 3 in c lu y e re g io n e s d e d o m in io s N y C -te rm in a le s d e C D 73 , p o r lo ta n to , la K D m e d id a p a ra un d o m in io N - te rm in a l a is la d o e s d é b il (K D = 100 -200 nM ).
T a m b ié n se in v e s t ig ó la u n ió n d e C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f a C D 73 c y n o . S e c o m p a ró la e s p e c if ic id a d de C D 73.4 - Ig G 2 - C 219 S - Ig G 1.1 f p a ra la u n ió n a C D 73 d e m o n o c y n o m o lg u s c o n la d e la u n ió n a C D 73 h u m a n a p o r re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l (S P R ) u s a n d o un in s t ru m e n to B ia c o re T 100 (G E H e a lth c a re ) a 25 °C . E l d o m in io e x t ra c e lu la r d e lo n g itu d c o m p le ta d e o b ie n C D 73 h u m a n a (q u e c o n s is t ía en lo s re s to s 27 -547 d e C D 73 h u m a n a u n id o s a u n a e t iq u e ta H is , d e n o m in a d o h C D 73 -h is ) o C D 73 d e c y n o m o lg u s (q u e c o n s is t ía en lo s re s to s 27 -547 de C D 73 d e c y n o m o lg u s u n id o s a e t iq u e ta H is , d e n o m in a d o c y -C D 73 -h is ) s e e n s a y a ro n p a ra la u n ió n a a n t ic u e rp o s q u e se c a p tu ra ro n s o b re s u p e r f ic ie s d e p ro te ín a A in m o v iliz a d a s . P a ra e s to s e x p e r im e n to s , la p ro te ín a A (P ie rc e ) se in m o v iliz ó a u n a d e n s id a d d e 3.000 - 4.000 R U s o b re c é lu la s d e f lu jo 1 -4 d e un c h ip s e n s o r C M 5 (G E H e a lth c a re ) u s a n d o e l c o m p u e s to q u ím ic o c o n v e n c io n a l e t i l( d im e t i la m in o p ro p il) c a rb o d iim id a (E D C ) / N -h d ro x is u c c in im id a (N H S ), c o n b lo q u e o d e e ta n o a m in a , e n un ta m p ó n d e e je c u c ió n d e H E P E S 0 ,01 M pH 7 ,4 , N a C l 0 ,15 M , E D T A 3 m M , tw e e n 20 a l 0 ,005 % v /v . L o s e x p e r im e n to s s e re a liz a ro n p r im e ro c a p tu ra n d o a n t ic u e rp o s (5 -10 u g /m l) s o b re la s s u p e r f ic ie s d e la p ro te ín a A u s a n d o u n t ie m p o d e c o n ta c to d e 30 s a 10 u l/m in , c o n u n ió n a N -h C D 73 -h is 600 , 200 , 66 ,7 , 22 ,2 , 7 ,4 , y 2 ,5 nM o c y n o -C D 73 -h is , u s a n d o 180 s d e t ie m p o d e a s o c ia c ió n y 360 s d e t ie m p o d e d is o c ia c ió n a u n a ta s a d e f lu jo d e 30 u l/m in . E l ta m p ó n d e e je c u c ió n d e e s to s e x p e r im e n to s e ra fo s fa to d e s o d io 10 m M , c lo ru ro d e s o d io 130 m M , T w e e n 20 a l 0 ,05 % , pH 7 ,1. L a s s u p e r f ic ie s s e re g e n e ra ro n d e s p u é s d e c a d a c ic lo u s a n d o d o s p u ls o s d e 30 s d e g lic in a 10 m M pH 1 ,5 a u n a ta s a d e f lu jo d e 30 p l/m in .
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la F ig u ra 19, in d ic a n q u e C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f se u n e co n a f in id a d s im ila r y c in é t ic a s a C D 73 c y n o y h u m a n a . C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f s e u n e a d ím e ro d e C D 73 h u m a n o y c y n o d e lo n g itu d c o m p le ta c o n u n a K D d e m e n o s d e 1 n M . S e o b s e rv ó re a c t iv id a d c ru z a d a n o s ig n if ic a t iv a de C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f a C D 73 d e ra tó n o ra ta .
L a s c in é t ic a s y la a f in id a d d e un f r a g m e n to F a b a is la d o d e l a n t ic u e rp o 11 F 11 ta m b ié n s e e v a lu ó p o r S P R . E n e s to s e x p e r im e n to s , e l d o m in io F a b d e un a n t ic u e rp o a n t i-6 x H is s e in m o v iliz ó s o b re un c h ip s e n s o r C M 5 u s a n d o E D C /N H S a u n a d e n s id a d d e -3.000 R U . S e c a p tu ró h C D 73 d e lo n g itu d c o m p le ta a d e n s id a d d e 10 R U e n F c 2 (1 u g /m l h C D 73 -h is ), la d e n s id a d d e 40 R U en F c 3 (5 u g /m l d e h C D 73 -h is ) y 160 R U d e d e n s id a d en F c 4 (20 u g /m l h C D 73 -h is ) , u s a n d o un t ie m p o d e c o n ta c to d e 30 s a 10 u l/m in . A c o n t in u a c ió n , e l f ra g m e n to F a b d e 11 F 11 (p u r if ic a d o d e l a n t ic u e rp o 11F 11 re d u c id o en L -c is te ín a e s c in d id o c o n p e p s in a ) se e n s a y ó p a ra u n ió n a 400 , 135 , 44.4 , 14.8 , 4 ,9 , 1.7 , 0.55 nM , u s a n d o t ie m p o d e a s o c ia c ió n d e 180 s, t ie m p o d e d is o c ia c ió n d e 600 s a 30 u l/m in , en un ta m p ó n d e e je c u c ió n d e fo s fa to d e s o d io 10 m M , c lo ru ro d e s o d io 130 m M , T w e e n 20 a l 0 ,05 % , pH 7 ,1. L a s s u p e r f ic ie s se re g e n e ra ro n d e s p u é s d e c a d a c ic lo u s a n d o d o s p u ls o s d e 15 s d e g lic in a 10 m M pH 2 ,0 a u n a ta s a d e f lu jo d e 30 p l/m in . L o s d a to s d e l s e n s o g ra m a e ra n d o b le m e n te re fe re n c ia d o s y a c o n t in u a c ió n se a ju s ta ro n a un m o d e lo 1:1 L a n g m u ir u s a n d o el p ro g ra m a in fo rm á t ic o v 2.0.4 d e e v a lu a c ió n B ia c o re T 100 , p a ra d e te rm in a r la c o n s ta n te d e la ta s a d e a s o c ia c ió n (k a ) , la c o n s ta n te d e la ta s a d e d is o c ia c ió n (k d ), y la c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n en e q u ilib r io (K d). L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n e n la T a b la 11 d e a c o n tin u a c ió n .
Tabla 11.
Figure imgf000081_0002
P o r ta n to , lo s re s u lta d o s m u e s tra n q u e e l f ra g m e n to s F a b d e 11 F 11 t ie n e a lta a f in id a d p a ra h C D 73 ( (K d de a p ro x im a d a m e n te 0 ,74 n M ).
B. U n ió n d e a n t ic u e rp o s d e C D 73 a c é lu la s C D 73 p o s it iv a s
L a s c u rv a s d e u n ió n d e t i tu la c ió n se p ro d u je ro n c o n a n t ic u e rp o s d e C D 73 e n C a lu 6 (e x p re s o re s e n d ó g e n o s d e C D 73 ; lín e a c e lu la r d e a d e n o c a rc in o m a p u lm o n a r h u m a n o ) , D M S 114 (C D 73 n e g a tiv a ; lín e a c e lu la r d e c á n c e r d e p u lm ó n d e c é lu la p e q u e ñ a h u m a n a ) , C H O -c y n o C D 73 (c y n o C D 73 - t ra n s fe c ta d a s ) y C H O -K 1 (c y n o C D 73 n e g a tiv a ) , c é lu la s q u e u s a n a n t i- Ig G h u m a n a d e c a b ra A le x a F lu o r® 647 (H L ) c o m o un a n t ic u e rp o s e c u n d a r io , In v it ro g e n C a t N .°A -21445 , u s a n d o e l s ig u ie n te m é to d o : se p u s ie ro n en p la c a 100.000 c é lu la s en 100 u l d e P B S 2 % F B S p o r p o c il lo y se b lo q u e a ro n d u ra n te 20 m in . U s a n d o u n a p la c a d e 96 p o c il l lo s p ro fu n d o s d e fo n d o en U, v o lú m e n e s d e a n t ic u e rp o y P B S 2 % F B S s e c o m b in a ro n c o m o s e d ic ta e n la T a b la 12 d e a c o n t in u a c ió n .
Tabla 12.
Figure imgf000081_0001
S e re a liz ó u n a d ilu c ió n s e r ia l 1 :8 d ilu y e n d o un s e x to d e l v o lu m e n (90 u l) en 450 p l d e P B S 2 % F B S . L a p la c a c e lu la r se c e n tr ifu g ó d u ra n te 5 m in u to s a 1.500 rp m . S e a ñ a d ió 100 u l d e a n t ic u e rp o d ilu id o p o r p o c il lo d e la p la c a . S e a ñ a d ió 100 u l d e P B S 2 % F B S a to d o s lo s o tro s p o c illo s . L a s p la c a s se t iñ e ro n en h ie lo d u ra n te 45 m in , se c e n tr ifu g a ro n a 1.500 rp m d u ra n te 5 m in y se la v a ro n d o s v e c e s en 200 u l d e P B S 2 % F B S p o r p o c illo . L o s p o c il lo s q u e h a n re c ib id o a n t ic u e rp o n o c o n ju g a d o , m á s u n p o c il lo n o te ñ id o p o r lín e a c e lu la r , s e re s u s p e n d ie ro n en 100 u l d e A P C a n t ic u e rp o a n t i-s e c u n d a r io h u m a n o (20 u g /m l) . 100 u l d e p B s 2 % F B S se a ñ a d ie ro n a to d o s los o tro s p o c illo s , y se t iñ e ro n en h ie lo d u ra n te 45 m in . L a s p la c a s se c e n tr ifu g a ro n a 1.500 rp m d u ra n te 5 m in y se la v a ro n en 200 u l d e P B S 2 % F B S p o r p o c illo . L a s p la c a s se la v a ro n d e n u e v o , s e re s u s p e n d ie ro n en 200 u l d e F B S a l 2 % e n P B S p o r p o c illo y la s m u e s tra s s e tra ta ro n .
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s s e m u e s tra n e n la s F ig u ra s 20 A 1 ,20 A 2 , 20 B 1 , 20 B 2 , 20 C 1 , 20 C 2 , 20 D 1 , 20 D 2 , y la T a b la 13, in d ic a n q u e to d o s lo s a n t ic u e rp o s d e C D 73 s e u n e n a c é lu la s q u e s e e x p re s a n d e m a n e ra n a tu ra l C D 73 (c é lu la s c a lu 6 ) y c é lu la s C H O t r a n s fe c ta d a s p a ra e x p re s a r c y n o C D 73 , p e ro q u e lo s a n t ic u e rp o s n o s e u n e n a c é lu la s q u e no e x p re s a n C D 73 (D M S 114 y C H O -K 1 ) . L a C E 50 d e u n ió n o b te n id a p a ra c a d a a n t ic u e rp o se m u e s tra n e n la T a b la 13.
Tabla 13.
Figure imgf000082_0002
L a C E 50 d e u n ió n d e C D 73.4 - Ig G 2 - Ig G 1.1 f a l ín e a s c e lu la re s tu m o ra le s h u m a n a s e ra d e 0 ,5 nM ( in te rv a lo d e 0 ,3 a 0 ,67 n M ). L a C E 50 d e u n ió n C D 73.4 - Ig G 2 - Ig G 1.1 f a c é lu la s C H O t ra n s fe c ta d a s co n C D 73 c y n o e ra d e 0 ,3 nM ( in te rv a lo d e 0,1 a 0 ,5 n M ).
T a m b ié n se d e te rm in ó la u n ió n d e a n t ic u e rp o C D 73.4 a l in fo c ito s B y T h u m a n o s . S e o b tu v o s a n g re d e d o s d o n a n te s , D 316 y D 329 , d e Im m u n s c ie n c e s , B M S . L a s c é lu la s m o n o n u c le a re s d e s a n g re p e r ifé r ic a (P B M C ) se a is la ro n c o n m e d io s d e g ra d ie n te d e s e p a ra c ió n c e lu la r d e lin fo c ito H. S e in c u b a ro n P B M C c o n a n t ic u e rp o s C D 73.4 -Ig G 2 m a rc a d o s c o n F IT C s e r ia lm e n te d ilu id o s , C D 73.4 - Ig G 2 - Ig G 1.1 f, o C D 73.4 - Ig G 1.1 f, y s e id e n t if ic a ro n l in fo c ito s B y lin fo c ito s T c o n a n t ic u e rp o s m a rc a d o s c o n f lu o ro c ro m o p a ra C D 3 y C D 20. L a s c é lu la s d e a m b o s d o n a n te s se a g ru p ó p a ra la s m u e s tra s c o n tro l n o te ñ id a s y F M O (F lu o re s c e n c ia m e n o u n o ). L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n e n la s F ig u ra s 20 E y F y la T a b la 14, in d ic a n q u e lo s a n t ic u e rp o s s e u n e n e s p e c íf ic a m e n te a l in fo c ito s B y T h u m a n o s .
Tabla 14: C I50 d e u n ió n d e a n t ic u e r o s d e C D 73 a lin fo c ito s B T
Figure imgf000082_0001
Ejemplo 4: Características biofísicas de unión de los anticuerpos anti-CD73
A . C ro m a to g ra f ía d e e x c lu s ió n p o r ta m a ñ o a c o p la d a a un d e te c to r d e d is p e rs ió n d e lu z m u lt iá n g u lo en lín e a (S E C -M A L S )
E l e s ta d o o lig o m é r ic o d e m A b d e C D 73 s e e x a m in a ro n p o r c ro m a to g ra f ía d e e x c lu s ió n p o r ta m a ñ o a c o p la d a a un d e te c to r d e d is p e rs ió n d e lu z m u lt iá n g u lo en lín e a (S E C -M A L S ) . S e re a liz a ro n s e p a ra c io n e s is o c rá t ic a s s o b re u n a c o lu m n a S h o d e x P R O T E IN K W -803 c o n e c ta d a a u n a P ro m in e n c e S h im a d z u U F L C e n ta m p ó n q u e c o n t ie n e K 2H P O 4 200 m M , N a C l 150 m M , pH 6 ,8 , q u e c o n t ie n e N a a z id a a l 0 ,02 % (0 ,1 p m f i l t r a d a ) q u e c o rre a 0 ,5 m l/m in . L a s m u e s tra s se in y e c ta ro n en la c o lu m n a u s a n d o un a u to m u e s tre a d o r S IL -20 A C P ro m in e n c e S h im a d z u y lo s d a to s se o b tu v ie ro n d e t re s d e te c to re s en lín e a c o n e c ta d o s en s e r ie : un e s p e c tro fo tó m e tro p o r U V /v is d e m a tr iz d e d io d o s P ro m in e n c e S P D -20 A D s e g u id o p o r un d e te c to r d e d is p e rs ió n d e la lu z m u lt iá n g u lo W y a t t m in iD A W N ™ T R E O S a c o n t in u a c ió n un d e te c to r d e ín d ic e re fra c ta r io W y a t t O p t ila b T -rE X . L o s d a to s (m o s tra d o s en la T a b la 15 d e a c o n t in u a c ió n ) se re c o g ie ro n y se a n a liz a ro n u s a n d o e l p ro g ra m a in fo rm á t ic o d e A s tra (W y a tt) a n d L a b s o lu t io n s (S h im a d z u ) . L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n e n la T a b la 15.
B. C a lo r im e tr ía d ife re n c ia l d e b a rr id o (D S C )
L a e s ta b il id a d té rm ic a d e m A b d e C D 73 se d e te rm in ó u s a n d o un in s tru m e n to d e D S C c a p ila r M ic ro C a l (G E H e a lth c a re ) . L o s a n t ic u e rp o s se a n a liz a ro n a u n a c o n c e n tra c ió n d e 0 ,5 -0 ,75 m g /m l en P B S pH 7 ,1. P a ra e s ta b i l iz a r la s c o n d ic io n e s d e p a r t id a d e l in s tru m e n to d e D S C y o b te n e r un h is to r ia l té rm ic o c o n s is te n te , s e re g is tra ro n m ú ltip le s b a rr id o s d e l ta m p ó n s o lo e n ta n to e n la c é lu la m u e s tra c o m o e n la d e re fe re n c ia a n te s d e l a n á lis is d e la m u e s tra . L o s b a rr id o s d e la m u e s tra c o n te n ía n m A b en la c é lu la m u e s tra y P B S pH 7,1 e n la c é lu la d e re fe re n c ia . T o d o s los b a rr id o s s e lle v a ro n a c a b o d e s d e 10 -110 °C a u n a ta s a d e b a rr id o d e 60 /h u s a n d o un p e r io d o d e te rm o s ta to p re c ic lo d e 5 m in u to s . L o s d a to s (c o m o se m u e s tra n en la T a b la 15 d e a c o n t in u a c ió n ) se a n a liz a ro n u s a n d o el p ro g ra m a in fo rm á t ic o d e a n á lis is D S C M ic ro C a l O r ig in C a p . L o s b a rr id o s e n b la n c o d e ta m p ó n - ta m p ó n a p ro p ia d o s s e re s ta ro n a lo s d a to s m u e s tra - ta m p ó n , y lo s v a lo re s d e la te m p e ra tu ra d e l p u n to m e d io d e la t r a n s ic ió n (T m ) s e d e te rm in a ro n a ju s ta n d o lo s d a to s a un m o d e lo d e n o 2 e s ta d o s . L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n en la T a b la 15. T m 1 , T m 2 y T m 3 so n la s T m p a ra d ife re n te s d o m in io s e n lo s a n t ic u e rp o s .
Figure imgf000084_0001
L o s re s u lta d o s m u e s tra n q u e to d o s lo s a n t ic u e rp o s s o n m a y o rm e n te m o n o m é r ic o s y s o n e s ta b le s .
Ejemplo 5: Inhibición de la actividad enzimática por anticuerpos anti-CD73
A . In h ib ic ió n d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 u n id a a p e r la
P a ra v a lo ra r la in h ib ic ió n d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 u n id a a p e r la p o r a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 , s e u s a ro n los s ig u ie n te s m a te r ia le s y m é to d o s :
M a te r ia le s
ta m p ó n T M : T r is 25 m M , M g C h 5 m M e n a g u a
T a m p ó n fo s fa to d e s o d io 0 ,5 m M , p H 8 ,0
T a m p ó n d e la v a d o (10 m l d e fo s fa to d e s o d io 0 ,5 m M , pH 8 ,0 ; 10 m l d e N a C l 5 M ; 34 m l d e a g u a ; 10 u l d e T w e e n -20 ) s a l d e a d e n o s in a 5 '-m o n o fo s fa to d is o d io , S ig m a C a t N .° 01930 -% G , 300 m M e n ta m p ó n T M
H id ra to d e s a l d e a d e n o s in a 5 '- t r ifo s fa to d is o d io , S ig m a C a t N .° A 6419 -1 G , l 00 m M en ta m p ó n T M rh C D 73 , 0 ,781 m g /m l d e C D 73 c y n o , S in o B io lo g ic a l In c C a t N .° 90192 -C 08 H
p e r la s d e e t iq u e ta h is m a g n é t ic a s , In v itro g e n C a t N .° 10103 D
e n s a y o d e v ia b il id a d c e lu la r p o r lu m in is c e n c ia C e llT ite r -G lo ® , P ro m e g a C a t N .° G 7572 m A b O , un a n t ic u e rp o no re la c io n a d o q u e n o s e u n e a C D 73
M é to d o s
S e c o n d u jo u n a d ilu c ió n s e r ia l 1 :6 d e lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 e n u m e ra d o s e n la T a b la 16 (c o n c e n tra c ió n m á x im a 10 u g /m l) c o m b in a n d o v o lú m e n e s c o m o lo s d ic ta d o s e n la T a b la 16 y d ilu y e n d o 3 v e c e s ( t ra n s f ir ie n d o 225 u l e n 450 u l d e ta m p ó n T M ). T o d o s lo s a n t ic u e rp o s co n b is a g ra d e Ig G 2 c o n te n ía n la m u ta c ió n C 219 S .
Tabla 16.
Figure imgf000085_0001
L a s p e r la s m a g n é t ic a s (2 u l d e p e r la s p o r m u e s tra ) s e la v a ro n e n 1 m l d e ta m p ó n d e fo s fa to d e s o d io e n un tu b o d e m ic ro c e n tr í fu g a . L a s p e r la s se s e d im e n ta ro n c o n e l im á n y s e re s u s p e n d ie ro n en 400 u l d e ta m p ó n T M . P a ra c a d a e s p e c ie d e C D 73 : E n un tu b o s e p a ra d o , se c o m b in ó C D 73 (75 ng p o r m u e s tra ) co n T M p a ra a u m e n ta r e l v o lu m e n h a s ta 400 ul. S e p re p a ró un te rc e r tu p o p a ra p e r la s en b la n c o (n o C D 73 ) . L a s u s p e n s ió n d e p e r la se c o m b in ó co n s o lu c ió n d e rh C D 73 y se m e z c ló s o b re un a g ita d o r d u ra n te 5 m in a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a s p e r la s se s e d im e n ta ro n c o n un im á n y la s p e r la s s e la v a ro n e n 1 m l d e ta m p ó n d e la v a d o . L a s p e r la s s e s e d im e n ta ro n c o n un im á n y s e re s u s p e n d ie ro n en ta m p ó n T M (40 u l p o r m u e s tra ) . L a s p e r la s s e tra n s f ir ie ro n a p la c a s d e 96 p o c il lo s d e P C R (40 u l p o r p o c illo ) . S e a ñ a d ie ro n 200 u l d e H u M a b d e C D 73 s e r ia lm e n te d ilu id o a p la c a s y se m e z c la ro n b ie n . L a s p la c a s se in c u b a ro n d u ra n te 30 m in a te m p e ra tu ra a m b ie n te . S e p re p a ra ro n 700 u l d e c a d a u n o d e A T P 400 uM (8 X ) y A M P 1 ,2 m M (8 X ). 650 u l d e c a d a u n o se c o m b in a ro n p a ra p ro d u c ir u n a m e z c la re s e rv a 4 X A M P /A T P . L a s p e r la s se s e d im e n ta ro n y s e la v a ro n d o s v e c e s c o n 200 u l d e ta m p ó n T M p o r p o c illo . L a s p e r la s se s e d im e n ta ro n d e n u e v o y se re s u s p e n d ie ro n en 30 u l d e ta m p ó n T M . L o s 30 u l d e p e r la s se tra n s f ir ie ro n a p la c a s en b la n c o d e 96 p o c illo s . S e a ñ a d ie ro n 10 u l d e la 4 x s o lu c ió n d e re s e rv a d e A M P /A T P (c o n c e n tra c ió n f in a l a M p 150 u M /A T P 50 u M ) y se m e z c la ro n . S e a ñ a d ie ro n 40 u l e n p o c il lo s c o n tro l (c o n c e n tra c ió n f in a l A M P 150 u M y /o A T P 50 u M . L a s p la c a s se in c u b a ro n d u ra n te 15 m in a 37 °C .
L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n e n la s F ig u ra s 21 A 1 ,21 A 2 , 21 B 1 , y 21 B 2 , y la T a b la 17.
Tabla 17:
Figure imgf000085_0002
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000086_0002
L o s re s u lta d o s d e la in h ib ic ió n e n z im á t ic a d e C D 73 c y n o s e e x p o n e n e n la T a b la 18.
Tabla 18:
Figure imgf000086_0003
L o s re s u lta d o s m u e s tra n q u e lo s a n t ic u e rp o s in h ib e n d e p e n d ie n te m e n te d e la d o s is la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 h u m a n a . C D 73.4. Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f t ie n e u n a C E 50 d e 2 ,97 ( in te rv a lo d e 2 ,9 a 3 ,1 n M ) e n e l e n s a y o d e in h ib ic ió n d e e n z im a C D 73 h u m a n a re c o m b in a n te . C D 73.4. Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f t ie n e u n a C E 50 d e 3 ,7 ( in te rv a lo d e 1 ,6 a 12 ,6 n M ) e n e l e n s a y o d e in h ib ic ió n d e e n z im a C D 73 h u m a n a re c o m b in a n te . P o r ta n to , to d o s lo s a n t ic u e rp o s p a ra C D 73 e n s a y a d o s in h ib e n la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 h u m a n a y c y n o u n id a a p e rla .
B. In h ib ic ió n d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 e n c é lu la s C a lu 6
L a m u e s tra d e s c r ib e la v a lo ra c ió n d e c é lu la s C a lu 6 (C D 73 p o s it iv a s ) y c é lu la s D M S -114 (C D 73 n e g a t iv a s ) p a ra la d e s fo s fo r ila c ió n d e C D 73 d e A M P d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to c o n a n t ic u e rp o s a n ti-C D 73.
Materiales:
a n t ic u e rp o s d e C D 73 ; v é a s e la ta b la d e a c o n t in u a c ió n
A n t ic u e rp o c o n tro l M a b O , 5 ,38 m g /m l
ta m p ó n T M : T r is 25 m M , M g C h 5 m M e n a g u a
s a l d e a d e n o s in a 5 '-m o n o fo s fa to d is o d io , S ig m a C a t N .° 01930 -5 G , 300 m M e n ta m p ó n T M
H id ra to d e s a l d e a d e n o s in a 5 '- t r ifo s fa to d is o d io , S ig m a C a t N .° A 6419 -1 G , 100 m M en ta m p ó n T M rh C D 73 , 0 ,781 m g /m l
e n s a y o d e v ia b il id a d c e lu la r p o r lu m in is c e n c ia C e llT ite r -G lo ® , P ro m e g a C a t N .° G 7572
Métodos:
L o s a n t ic u e rp o s s e d i lu y e ro n s e r ia lm e n te c o m b in a n d o v o lú m e n e s d e a n t ic u e rp o s p u r if ic a d o s y P B S c o m o s e d ic ta en la T a b la 19 d e a c o n t in u a c ió n en u n a p la c a d e 96 p o c il lo s d e fo n d o en U. S e re a liz a ro n d ilu c io n e s s e r ia le s 1 :6 co n lo s a n t ic u e rp o s (c o n c e n tra c ió n m á x im a 25 u g /m l, 300 u l) y d i lu c io n e s 5 v e c e s , t ra n s f ir ie n d o 60 u l e n 240 u l d e P B S , . T o d o s lo s a n t ic u e rp o s c o n b is a g ra d e Ig G 2 c o n te n ía n la m u ta c ió n C 219 S .
Tabla 19.
Figure imgf000086_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000087_0002
L a s c é lu la s se re c o g ie ro n c o n V e rs e n e y se re c o n ta ro n . La p la c a s se s e m b ra ro n , se c e n tr ifu g a ro n a 1.500 rp m d u ra n te 5 m in y se re s u p e n d ie ro n e n 100 u l d e a n t ic u e rp o s e r ia lm e n te d ilu id o . T o d o s lo s o tro s p o c il lo s se re s u s p e n d ie ro n e n 100 u l d e P B S . L a in c u b a c ió n e ra a 37 °C d u ra n te 20 m in . S e p re p a ró 15 m l d e u n a re s e rv a 180 uM d e A M P e n ta m p ó n T M .
L a s p la c a s se c e n tr ifu g a ro n a 1.500 rp m d u ra n te 5 m in y se la v a ro n u n a v e z c o n 200 u l d e P B S /p o c il lo . L a s p la c a s s e c e n tr ifu g a ro n d e n u e v o y s e re s u s p e n d ie ro n e n 100 u l d e A M P . T o d o s lo s o tro s p o c il lo s se re s u s p e n d ie ro n e n 100 u l d e ta m p ó n T M . L a s c é lu la s s e in c u b a ro n c o n A M P d u ra n te 60 m in a 37 °C . S e p re p a ró 7 ,5 m l d e u n a re s e rv a 60 uM d e A T P en ta m p ó n T M . L a s p la c a s se c e n tr ifu g a ro n a 1.500 rp m d u ra n te 5 m in y 50 u l d e l s o b re n a d a n te se tra n s f ir ió a u n a p la c a d e 96 p o c il lo s e n b la n c o . S e a ñ a d ió 50 ul d e a T p . S e a ñ a d ió rh C D 73 a d e te rm in a d o s p o c il lo s a 75 ng p o r p o c illo c o m o un c o n tro l p o s it iv o . L o s p o c il lo s q u e n o re c ib ie ro n rh C D 73 se re l le n a ro n h a s ta 100 u l co n ta m p ó n T M . L a c o n c e n tra c ió n f in a l e ra d e 90 uM d e A M P : 30 uM d e A T P . L a in c u b a c ió n e ra d e 37 °C d u ra n te 15 m in . P a ra e l e n s a y o C e llT ite rG lo (e l c u a l d e te c ta A T P ) , s e a ñ a d ió 100 u l p o r p o c illo y s e h iz o la le c tu ra d e la p la c a .
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la s F ig u ra s 22 A 1 , 22 A 2 , 22 B 1 , 22 B 2 , y la T a b la 20 , in d ic a n q u e los a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 in h ib e n la d e s fo s fo r ila c ió n d e A M P (o re d u c e n e l p ro c e s a m ie n to d e A M P ) e n la s c é lu la s C a lu 6 C D 73 p o s it iv a s h u m a n a s , p e ro n o a fe c ta n a la s c é lu la s D M S 114 C D 73 n e g a t iv a s . L a C E 50 p a ra e l b lo q u e d e C D 73 c e lu la r e n d ó g e n a en la lín e a d e c é lu la tu m o ra l h u m a n a C a lu 6 d e l a n t ic u e rp o C D 73.4 - lg G 2 S - lg G 1.1 f e s d e 0 ,39 nM ( in te rv a lo d e 0 ,31 a 0 ,48 n M ). E s to s e x p e r im e n to s se re p it ie ro n en c é lu la s N C I-H 292 ( lín e a c e lu la r d e c a rc in o m a m u c o e p id e rm o id e ) y S K -M E L -24 ( lín e a c e lu la r d e m e la n o m a h u m a n o ) y lo s re s u lta d o s s o n s im ila re s (T a b la 20 ).
Tabla 20:
Figure imgf000087_0001
C. In h ib ic ió n d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 en un e n s a y o d e c A M P d e lín e a c e lu la r d u a l e n s a y o d e c A M P d e f lu o re s c e n c ia h o m o g é n e a re s u e lta e n t ie m p o (H T R F )
L o s a n t ic u e rp o s d e C D 73 s e d ilu y e ro n e n s e r ie c o n ta m p ó n P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0 ,2 % y s e c o lo c ó e n p la c a 5 p l/p o c il lo en p ro x ip la c a d e fo n d o b la n c o d e 384 p o c ilio s (P e rk in E lm e r , W a lth a m , M A ). L a s c é lu la s C a lu -6 se re c o g ie ro n y re s u s p e n d ie ro n en P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0 ,2 % , a c o n t in u a c ió n , se a ñ a d ie ro n 5 p l d e c é lu la s (300 c é lu la s /p o c i l lo ) a la p la c a . L a s c é lu la s s e in c u b a ro n c o n a n t ic u e rp o s d u ra n te 10 m in a 37 °C C O 2 a l 5 % y h u m e d a d a l 95 % , s e g u id o p o r la a d ic ió n d e 5 p l/p o c il lo d e A M P 80 m M . L a s c é lu la s a d e m á s se in c u b a ro n co n a M p d u ra n te 30 m in u to s a 37 °C . D u ra n te e s te t ie m p o , la s c é lu la s H E K 293 /A 2 A R se re c o g ie ro n y se d ilu y e ro n a 0 ,4 m illo n e s /m l en P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0 ,2 % . S e a ñ a d ie ro n d e n tro d e la p la c a d e e n s a y o a 5 p l/p o c il lo y se c o n t in u a ro n in c u b a n d o a 37 °C d u ra n te 1 h. S e re a liz a ro n e n s a y o s d e H R T F u s a n d o e l k it d e d e te c c ió n d e c A M P H iR a n g e d e f lu o re s c e n c ia h o m o g é n e a re s u e lta en t ie m p o h o m o g é n e a (H T R F ) (C is b io , B e d fo rd , M A ) a ñ a d ie n d o 10 p l/p o c il lo de d 2 c A M P c o n ju g a d o y 10 p l/p o c il lo d e c r ip ta to d e e u ro p io c o n ju g a d o c o n a n t ic u e rp o a n t i-c A M P en ta m p ó n d e lis is s e g ú n co n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . L a s p la c a s s e in c u b a ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 60 m in u to s y las s e ñ a le s d e la t ra n s fe re n c ia d e e n e rg ía p o r re s o n a n c ia d e f lu o re s c e n c ia (F R E T ) (665 y 615 n M ) s e le y e ro n u s a n d o un le c to r d e p la c a E n v is io n (P e rk in E lm e r , W a lth a m , M A ). L a s e ñ a l d e F R E T s e c a lc u ló c o m o la p ro p o rc ió n d e s e ñ a l d e lo s c a n a le s d e 665 n m (a c e p to r ) y 615 n m (d o n a n te ) y se m u lt ip l ic ó p o r 10.000. S e m id ie ro n C I50 e Y m á x . S e d e te rm in ó Y m á x c o m p a ra n d o co n 100 nM d e d o s is d e 11F 11 c o m o m á x im o in te rn o . S e d e te rm in a ro n to d o s lo s c á lc u lo s c o m o un p o rc e n ta je d e in h ib ic ió n e n c o m p a ra c ió n co n e s te c o n tro l, lo s c u a le s h a c ía n e l 100 % .
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la T a b la 21 , in d ic a n q u e lo s m A b a n t i-C D 73 d e m o s tra ro n d ife re n te s e f ic a c ia s y p o te n c ia s en e s te e n s a y o d e c A M P u s a n d o un s is te m a d e c u lt iv o c o n ju n to d e lín e a c e lu la r . T o d o s los a n t ic u e rp o s m o s tra ro n a lg u n a re d u c c ió n e n la p ro d u c c ió n d e a d e n o s in a , y e l a lc a n c e d e la in h ib ic ió n e ra s im ila r p a ra la m a y o r ía d e lo s a n t ic u e rp o s s e le c c io n a d o s . L a m a y o r in h ib ic ió n s e v io p a ra 11 F 11 , 11 A 6 , 4 C 3 y 5 F 8.
Tabla 21:
Figure imgf000088_0002
L o s e n s a y o s d e in h ib ic ió n e n z im á t ic a ta m b ié n s e c o n d u je ro n c o n F a b y F (a b ')2 d e 11 F 11. L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s s e m u e s tra n e n la F ig u ra 22 C , in d ic a ro n q u e la in h ib ic ió n e n z im á t ic a o c u rr ió co n e l f ra g m e n to F (a b ')2, p e ro n o c o n e l f ra g m e n to F a b . P o r ta n to , n o se re q u ie re la re g ió n F c p a ra la in h ib ic ió n e n z im á t ic a d e 11 F 11 , p e ro se re q u ie re b iv a le n c ia .
L a in h ib ic ió n e n z im á t ic a en la s c é lu la s C a lu 6 ta m b ié n se d e te rm in ó p a ra lo s a n t ic u e rp o s C D 73.4 q u e c o m p re n d ía n re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a , lo s c u a le s se m u e s tra n en la T a b la 26 , u s a n d o e l e n s a y o d e c A M P a n te r io rm e n te d e s c r ito . L o s re s u lta d o s , en té rm in o s d e C E 50 y e l n iv e l d e in h ib ic ió n f re n te a lo a n te r io r ( "S :B " ) se p ro p o rc io n a n en la s ú lt im a s c o lu m n a s d e la T a b la 28. L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e to d o s lo s a n t ic u e rp o s C D 73.4 in h ib e n la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 e n la s c é lu la s C a lu 6.
D. T ra s c u rs o d e t ie m p o te m p o ra l la in h ib ic ió n d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73
L a in h ib ic ió n d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a ta m b ié n se e v a lu ó en un t r a s c u rs o te m p o ra l e v a lu a n d o la g e n e ra c ió n d e a d e n o s in a p o r L C /M S /M S . S e in c u b a ro n c é lu la s C a lu 6 co n 11 F 11 o 4 C 3 d u ra n te 30 m in u to s , 2 h o ra s o 4 h o ra s , s e g u id o d e la a d ic ió n d e 50 pM d e A M P y la e v a lu a c ió n d e la p ro d u c c ió n d e a d e n o s in a m e d ia n te L C /M S /M S u s a n d o m é to d o s c o n v e n c io n a le s .
C o n d ic io n e s d e e s p e c tro m e tr ía d e m a s a s (X e v o T Q -S ):
Instrumento: X e v o T Q -S (c o n W a te rs 2777 C )
Figure imgf000088_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000089_0001
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s s e m u e s tra n e n la F ig u ra 22 D , in d ic a n q u e e l t ie m p o d e in c u b a c ió n h a c e u n a d ife re n c ia en e l m o m e n to d e 30 m in y q u e la in h ib ic ió n p o r 11F 11 o c u rre m á s rá p id a m e n te q u e p o r 4 C 3. A u n q u e a m b o s a n t ic u e rp o s a lc a n z a ro n la m is m a in h ib ic ió n e n m o m e n to s m á s ta rd ío s , e l a n t ic u e rp o 11 F 11 in h ib e m á s rá p id a m e n te la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73.
Ejemplo 6: Internalización de CD73 mediada por anticuerpo
L a in te rn a liz a c ió n d e C D 73 m e d ia d a p o r a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 se m id ió d e d o s m a n e ra s d ife re n te s .
A . E n s a y o d e in te rn a liz a c ió n d e a lto c o n te n id o (e n s a y o d e t ie m p o f i ja d o d e 2 h o ra s )
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 s e u s a ro n p a ra e n s a y a r la in te rn a liz a c ió n d e C D 73 d e p e n d ie n te d e a n t i-C D 73 e n c é lu la s C a lu 6 v a lo ra n d o la e x p re s ió n c e lu la r d e s p u é s d e 2 h o ra s d e in c u b a c ió n d e a n t ic u e rp o . S e c o lo c a ro n la s c é lu la s (2.000 c é lu la s /p o c i l lo ) en 20 p l d e m e d io c o m p le to (G ib c o R P M I M e d ia 1640 c o n 10 % d e s u e ro b o v in o fe ta l in a c t iv a d o p o r c a lo r) e n p la c a 384 B D F a lc o n y s e c u lt iv a ro n d u ra n te u n a n o c h e a 37 °C C O 2 a l 5 % y h u m e d a d a l 95 % . L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 s e d ilu y e ro n s e r ia lm e n te c o n ta m p ó n P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0 ,2 % y s e a ñ a d ie ro n a 5 p l/p o c il lo en la p la c a c e lu la r . L a s c é lu la s se in c u b a ro n c o n a n t ic u e rp o s d u ra n te 2 h o ra s a 37 °C C O 2 a l 5 % y h u m e d a d a l 95 % , s e g u id o d e la v a d o u n a v e z c o n ta m p ó n P B S . A c o n t in u a c ió n , s e a ñ a d ió fo rm a ld e h íd o (4 % f in a l en P B S ) e n p la c a c e lu la r a 20 u l/p o c il lo , y la p la c a s e in c u b ó a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in u to s , D e s p u é s , se a s p iró to d o e l líq u id o y la s c é lu la s s e re c o g ie ro n u n a v e z c o n 30 p l d e P B S . E l a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n (2 ,5 p g /p o c il lo d e a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 C D 73.10.Ig G 2 C 219 S ) se a ñ a d ió a 15 p g /p o c il lo en la p la c a c e lu la r f ija d a . L a s c é lu la s se in c u b a ro n a 4 °C d u ra n te u n a n o c h e . A l d ía s ig u ie n te , la p la c a se la v ó d o s v e c e s c o n ta m p ó n P B S , s e g u id o d e la a d ic ió n d e a n t ic u e rp o s e c u n d a r io q u e c o n te n ía a n ti h u m a n o d e c a b ra A le x a -488 y D A P I, se t iñ ó d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . D e s p u é s d e 3 la v a d o s en ta m p ó n P B S , se re a liz ó im a g e n d e la p la c a en A r ra y s e a n V ti (C e llo m ic s , P it ts b u rg h , P A ), S e m id ie ro n C I50 e Y m á x . S e d e te rm in ó Y m á x c o m p a ra n d o co n 100 nM d e d o s is de 11 F 11 c o m o m á x im o in te rn o . S e d e te rm in a ro n to d o s lo s c á lc u lo s c o m o un p o rc e n ta je d e in te rn a liz a c ió n en c o m p a ra c ió n c o n e s te c o n tro l, lo s c u a le s h a c ía n e l 100 % .
L o s re s u lta d o s s e p ro p o rc io n a n e n la ta b la 22.
Tabla 22:
Figure imgf000089_0002
P o r ta n to , lo s re s u lta d o s in d ic a n q u e la C E 50 d e la in te rn a liz a c ió n d e C D 73 m e d ia d a p o r C D 73.4. Ig G 2 -C 219 S -Ig G 1.1 f en la lín e a c e lu la r d e e x p re s ió n d e C D 73 h u m a n a C a lu 6 e ra d e 1 ,2 nM , y q u e e l n iv e l m á x im o d e in te rn a liz a c ió n e n la lín e a c e lu la r e ra d e 97 ,5 % .
L o s e n s a y o s d e in te rn a liz a c ió n ta m b ié n se c o n d u je ro n c o n F a b y F (a b ')2 d e 11 F 11. L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la F ig u ra 22 C , in d ic a ro n q u e la in te rn a liz a c ió n o c u rr ía co n e l f ra g m e n to F (a b ')2 , p e ro n o c o n e l f ra g m e n to F a b . P o r ta n to , n o se re q u ie re la re g ió n F c p a ra la in te rn a liz a c ió n d e 11 F 11.
L o s e s tu d io s d e in te rn a liz a c ió n c in é t ic a s e re a liz a ro n p a ra v a lo ra r la ta s a d e in te rn a liz a c ió n . S e c o lo c a ro n la s c é lu la s (2 .000 c é lu la s /p o c i l lo ) en 20 | j l d e m e d io c o m p le to (G ib c o R P M I M e d ia 1640 c o n 10 % d e s u e ro b o v in o fe ta l in a c t iv a d o p o r c a lo r ) e n p la c a 384 B D F a lc o n y s e c u lt iv a ro n d u ra n te u n a n o c h e a 37 °C C O 2 a l 5 % y h u m e d a d a l 95 % . S e d ilu y e ro n a n t ic u e rp o s d e C D 73 c o n ta m p ó n P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0 ,2 % a 10 jg / m l y se a ñ a d ió 5 j l / p o c i l lo e n la p la c a c e lu la r . L a s c é lu la s se in c u b a ro n c o n a n t ic u e rp o s d u ra n te 0 -2 h o ra s d e t r a s c u rs o te m p o ra l a 37 °C , s e g u id o d e la v a d o u n a v e z c o n ta m p ó n P B S . L a s c é lu la s p o s te r io rm e n te s e f i ja ro n c o n fo rm a ld e h id o (4 % f in a l en P B S ) a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 10 m in u to s , y a c o n t in u a c ió n se la v a ro n u n a v e z c o n 30 u l d e P B S . El a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n (2 ,5 jg / p o c i l lo d e a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 C D 73.10.Ig G 2 C 219 S ) se d ilu y e ro n c o n ta m p ó n P B S q u e c o n te n ía B S A a l 0 ,2 % , y a ñ a d ió 15 j l / p o c i l lo e n la p la c a c e lu la r f i ja d a . L a p la c a se in c u b ó a 4 °C d u ra n te u n a n o c h e . A l d ía s ig u ie n te , d e s p u é s d e 3 la v a d o s e n ta m p ó n P B S , s e a ñ a d ie ro n a n t ic u e rp o s e c u n d a r io a n ti h u m a n o d e c a b ra A le x a 488 c o n D A P I. L a s c é lu la s se t iñ e ro n d u ra n te 60 m in u to s a te m p e ra tu ra a m b ie n te , d e s p u é s d e 3 la v a d o s , s e a d q u ir ie ro n im á g e n e s u s a n d o A r ra y s c a n V ti (C e llo m ic s , P it ts b u rg h , P A ). L o s re s u lta d o s s e p ro p o rc io n a n en la s F ig u ra s 23 A -23 D y la s T a b la s 23 y 24. L o s v a lo re s en la T a b la 24 d e r iv a n d e lo s d a to s m o s tra d o s en la s F ig u ra s 23 A -D .
Tabla 23:
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e lo s a n t ic u e rp o s c la s e 1 (11 F 11 y s u s d e r iv a d o s C D 73.4 y C D 73.10 ) m o s tra ro n u n o s b u e n o s v a lo re s d e in te m a liz a c ió n C E 50 y m á x im o (97 ,5 % ), a u n q u e a lg u n o s a n t ic u e rp o s se in te rn a liz a ro n m á s q u e o tro s . 11 F 11 e ra e l m á s a c t iv o e in te rn a liz a d o e n m in u to s , a lc a n z a n d o u n a m e s e ta e n lo s 30 m in u to s , m ie n tra s q u e 6 E 11 ( ta m b ié n un a n t ic u e rp o c la s e 1, Ig G 1 ) se in te rn a liz ó m á s le n ta m e n te , a lc a n z a n d o u n a m e s e ta a a p ro x im a d a m e n te 1 h (F ig u ra s 23 A -D ). L o s a n t ic u e rp o s c la s e 2 (5 F 8 y 4 C 3 ) n o s e in te rn a liz a ro n s ig n if ic a t iv a m e n te . A d e m á s , la p re s e n c ia d e b is a g ra d e Ig G 2 y e l d o m in io C H 1 a u m e n ta ro n la v e lo c id a d y e l a lc a n c e d e in te rn a liz a c ió n . L a te n d e n c ia s e o b s e rv ó e n d iv e rs a s lín e a s c e lu la re s (F ig u ra s 23 A -D y T a b la 24 ).
B. In te rn a liz a c ió n m e d id a p o r c ito m e tr ía d e f lu jo
L a in te rn a liz a c ió n d e C D 73 m e d ia d a p o r a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 ta m b ié n se e n s a y ó m e d ia n te c ito m e tr ía d e f lu jo . L a s c é lu la s in d ic a d a s se in c u b a ro n co n 10 p g /m l d e l a n t ic u e rp o in d ic a d o d u ra n te 30 m in u to s en h ie lo , se la v a ro n v a r ia s v e c e s , y s e t r a n s f ir ie ro n a 37 °C d u ra n te e l t ie m p o in d ic a d o . L a s c é lu la s se re c o g ie ro n en e l m is m o m o m e n to d e s p u é s d e l t ie m p o d e in c u b a c ió n in d ic a d o . L a s c é lu la s se t iñ e ro n c o n a n t ic u e rp o p r im a r io d e n u e v o (e l m is m o a n t ic u e rp o u s a d o p a ra la in c u b a c ió n in ic ia l) s e g u id o d e a n t ic u e rp o s e c u n d a r io a n ti h u m a n o . A c o n t in u a c ió n , s e v a lo ró la e x p re s ió n d e c D 73 e n la s c é lu la s m e d ia n te c ito m e tr ía d e flu jo .
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la s F ig u ra s 23 E y la T a b la 25 , so n c o h e re n te s c o n lo s o b te n id o s en los e n s a y o s d e in te rn a liz a c ió n a n te r io rm e n te d e s c r ito s , e in d ic a n q u e , to d o s lo s a n t ic u e rp o s c o n b is a g ra d e Ig G 2 y C H 1 in d u je ro n rá p id a y c o m p le ta in te rn a liz a c ió n . L o s n iv e le s d e C D 73 p e rm a n e c ie ro n b a jo s d e s p u é s d e 22 h o ra s d e s p u é s d e l la v a d o , in d ic a n d o q u e la in te rn a liz a c ió n e s d u ra d e ra .
S e o b tu v ie ro n re s u lta d o s s im ila re s , m o s tra d o s e n la F ig u ra 23 F y la T a b la 25 , e n la lín e a c e lu la r N C I-H 292 , e n la q u e e l a n t ic u e rp o se m a n tu v o en c u lt iv o d u ra n te e l t ie m p o d e in c u b a c ió n (n o la v a d o ). D e n u e v o , e s to s d a to s in d ic a n in te rn a liz a c ió n rá p id a y s ig n if ic a t iv a y m a n te n im ie n to d e la re g u la c ió n p o r d is m in u c ió n d e C D 73 e n d ó g e n a .
L o s e n s a y o s d e in te rn a liz a c ió n ta m b ié n se c o n d u je ro n c o n la s c é lu la s h u m a n a s S N U -C 1 ( lín e a c e lu la r d e c á n c e r d e c o lo n ) y N C I-H 1437 ( lín e a c e lu la r d e c a rc in o m a d e p u lm ó n d e c é lu la n o p e q u e ñ a . L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n e n la s F ig u ra s 23 I y J y la T a b la 25 , ta m b ié n in d ic a n rá p id a in te rn a liz a c ió n c o n un n iv e l m á x im o a lc a n z a d o en 5 h o ra s y un n iv e l m á x im o d e in te rn a liz a c ió n d e a p ro x im a d a m e n te e l 50 % p a ra C D 73.4. Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f en S N U -C 1 y e l 60 % p a ra la s c é lu la s N C I-H 1437. L a s F ig u ra s 23 G y H m u e s tra n c in é t ic a s s im ila re s d e in te rn a liz a c ió n d e C D 73.4. Ig G 2 - c 2 l9 S - Ig G 1.1 f e n c é lu la s C a lu 6 y N C I-H 292. P a ra la s g rá f ic a s , la s c u a le s m u e s tra n e l % d e C D 73 in te rn a liz a d a , e s te n ú m e ro s e o b tu v o c o m o s ig u e :
lFMt=x - lFMorlalnal
% CD 73 internalizada = 100 - r , / * ------ , x 100 ) y¡FMt = 0 - lF M ° orlglnal
en la q u e p a ra c a d a a n t ic u e rp o , IFMt=x e s la IF M a un m o m e n to d a d o y IF M t=0 e s la f lu o re s c e n c ia m á x im a a t= 0 y IFMIoriginal e s la IF M d e l a n t ic u e rp o s e c u n d a r io s o la m e n te .
Figure imgf000093_0001
L o s e n s a y o s d e in te m a liz a c ió n s e c o n d u je ro n e n c é lu la s C a lu 6 y H 292 p a ra d is c r im in a r a d e m á s e l p a p e l d e l is o t ip o s o b re la in te m a liz a c ió n . L o s e n s a y o s d e in te m a liz a c ió n s e c o n d u je ro n c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te (p ro to c o lo s in la e ta p a d e la v a d o d e lo s a n t ic u e rp o s ) , y lo s a n t ic u e rp o s d e is o t ip o s h íb r id o s v a r ia n te s m o s tra d o s e n la T a b la 26 se m a n tu v ie ro n en e l c u lt iv o a 10 | jg /m l d u ra n te e l t ie m p o d e in c u b a c ió n . P a ra lo s e x p e r im e n to s d e c ito m e tr ía d e f lu jo , e l m é to d o d e l E je m p lo 6 B s e a d a p tó a a n á lis is d e a lto r e n d im ie n to e n p la c a s d e 96 p o c il lo s (e n lu g a r d e p la c a s d e 48 p o c il lo s ) y co n 50.000 c é lu la s p o r p o c illo .
T l 2 :
Figure imgf000094_0001
L a u n ió n d e F c y R se m u e s tra q u e e s c o m o se e s p e ra p a ra c a d a c o n s tru c c ió n , e s d e c ir , la u n ió n d e F c y R e s tá c o n d u c id a p o r la re g ió n b is a g ra in fe r io r /C H 2.
L o s re s u lta d o s s e m u e s tra n e n la s F ig u ra s 23 K , L, M y e n la T a b la 27 y 28. L o s d a to s m o s tra d o s e n la T a b la 27 s e g e n e ra ro n u s a n d o e l m is m o p ro to c o lo d e s c r ito e n e l E je m p lo 6 B . L o s d a to s m o s tra d o s e n la T a b la 28 s e g e n e ra ro n u s a n d o e l m is m o p ro to c o lo d e s c r ito e n e l E je m p lo 6A .
T l 27:
Figure imgf000094_0002
Tabla 28: In te rn a liz a c ió n y c a ra c te r ís t ic a s d e in h ib ic ió n e n z im á t ic a d e C D 73.4 c o n d iv e rs a s re g io n e s c o n s ta n te s en c é lu la s C a lu 6
Figure imgf000095_0001
L a s F ig u ra s 23 K , L y M y la s T a b la s 27 y 28 in d ic a n q u e lo s a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n u n a b is a g ra y e l d o m in io C H 1 d e l is o t ip o Ig G 2 s o n lo s m á s e f ic a c e s en c o n d u c ir la in te rn a liz a c ió n d e C D 73 , m ie n tra s q u e lo s a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n u n a b is a g ra d e IgG 1 y d o m in o C H 1 c o r re s p o n d e n a la s c u rv a s in fe r io re s e n la f ig u ra , e s d e c ir , a lc a n c e in fe r io r d e la in te rn a liz a c ió n . A d e m á s , lo s a n t ic u e rp o s co n s o la m e n te la b is a g ra d e Ig G 2 t ie n e n u n a in te rn a liz a c ió n in c re m e n ta d a e n c o m p a ra c ió n co n u n a b is a g ra d e IgG 1 h u m a n a . P o r ta n to , lo s a n t ic u e rp o s q u e t ie n e u n a b is a g ra y e l d o m in io C H 1 d e l is o t ip o Ig G 2 t ie n e n c a ra c te r ís t ic a s d e in te rn a liz a c ió n s u p e r io re s en re la c ió n c o n lo s a n t ic u e rp o s c o n un is o t ip o Ig G 1.
P o r ta n to , E l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 m A b -C D 73.4 - Ig G 2 C S - Ig G 1.1 f in d u jo rá p id a in te rn a liz a c ió n d e p e n d ie n te s o b re la c é lu la e n s a y a d a . E l T 1 /2 p a ra la in te rn a liz a c ió n o s c iló d e m in u to s a p o r d e b a jo d e u n a h o ra . L a m a y o r ía d e la s lín e a s c e lu la re s e n s a y a d a s te n ía n un T 1 /2 p o r d e b a jo d e 10 m in u to s . S e in d u jo u n a in te rn a liz a c ió n c a s i c o m p le ta p a ra a lg u n a s lín e a s c e lu la re s y to d a s la s e n s a y a d a s te n ía n a l m e n o s u n a re d u c c ió n d e l 50 % en la e x p re s ió n d e C D 73 s u p e r f ic ia l q u e g e n e ra lm e n te a lc a n z a b a n iv e le s m á x im o s e n 5 h o ra s , m e n o s e n a lg u n o s c a s o s .
L o s d a to s d e S E C -M A L S y D L S d e m o s tra ro n q u e c o m p le jo s m á s g ra n d e s s e fo rm a e n tre h C D 73 -h is y lo s m A b q u e c o n te n ía n u n a b is a g ra d e Ig G 2 y re g ió n C H 1 ( Ig G 2 -C 219 S o Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f) , en c o m p a ra c ió n c o n a q u e llo s q u e c o n te n ía n b is a g ra d e IgG 1 y re g ió n C H 1 ( Ig G 1.1 f) .
Ejemplo: 7: Inhibición enzimática de CD73 en tumores en modelos animales de xenoinjerto
S e tra ta ro n ra to n e s p o r ta d o re s d e tu m o re s d e C a lu 6 h u m a n a s u b c u tá n e o s c o n C D 73.10 - Ig G 1.1 , C D 73.10 - Ig G 2 C S , o C D 73.10 - Ig G 2 C S - Ig G 1.1 d e s p u é s d e 7 d ía s d e c re c im ie n to . L o s a n t ic u e rp o s se d o s if ic a ro n a 10 m g /k g IP . L o s tu m o re s se re c o g ie ro n en lo s d ía s 1, 2, 3 y 7 d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n d e a n t ic u e rp o , in c ru s ta d o s en O C T y c o n g e la d o s rá p id a m e n te en is o p e n ta n o h e la d o . L o s tu m o re s in c ru s ta d o s en O C T se c o r ta ro n en s e c c io n e s d e 5 ­ 6 | jm y se d e ja ro n s e c a r d u ra n te u n a n o c h e a T A . L a s s e c c io n e s tu m o ra le s se f i ja ro n d u ra n te 2 ,5 m in c o n u n a m e z c la 1:1 d e fo rm a lin a ta m p o n a d o c o n fo s fa to a l 10 % fr ía y a c e to n a a c o n t in u a c ió n s e p re in c u b a ro n d u ra n te 1 h a T A en ta m p ó n T r is -m a le a to 50 m M , pH 7 ,4 q u e c o n te n ía C a C l2 2 m M y s a c a ro s a 0 ,25 M . D e s p u é s d e 1 h o ra se s e p a ró e l ta m p ó n d e p re in c u b a c ió n y se re e m p la z ó p o r e l m is m o ta m p ó n s u m p le m e n te a d o c o n M n C h 5 m M , P b (N O 3 )2 2 m M , 2 ,5 % d e D e x tra n o T 200 , le v a m is o l 2 ,5 m M , y A M P 1 m M . L a re a c c ió n e n z im á t ic a s e lle v ó a c a b o d u ra n te 1 h a 37 °C . D e s p u é s d e u n e n ju a g u e c o n a g u a D I, la s s e c c io n e s s e in c u b a ro n d u ra n te e x a c ta m e n te 1 m in c o n 1 % d e ( N H ^ S s e g u id o d e un e n ju a g u e rá p id o e n a g u a D I. L a s s e c c io n e s s e c o n tra t iñ e ro n c o n h e m a to x il in a , se d e s h id ra ta ro n y se m o n ta ro n c o n un m e d io d e m o n ta je b a s a d o en x ila n o . U n c o lo r m a rró n in d ic a la p re s e n c ia de C D 73 a c tiv a , m ie n tra s q u e la c a re n c ia d e c o lo r m a rró n in d ic a q u e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 e s ta b a in h ib id a p o r e l a n t ic u e rp o .
L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e C D 73.10 - Ig G 1.1 , C D 73.10 - Ig G 2 C S , y C D 73.10 - Ig G 2 C S - Ig G 1.1 in h ib e n la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 in vivo. L a s s e c c io n e s te ñ id a s re p re s e n ta t iv a s d e lo s tu m o re s d e ra to n e s tra ta d o s c o n e l a n t ic u e rp o C D 73.10 - Ig G 2 C S - Ig G 1.1 se m u e s tra n en la s F ig u ra s 24 A -E . L a s s e c c io n e s te ñ id a s d e lo s tu m o re s d e ra to n e s t r a ta d o s c o n lo s o tro s d o s a n t ic u e rp o s e ra n s im ila re s . E l a lc a n c e d e la in h ib ic ió n d e C D 73 se c o r re la c io n ó c o n lo s n iv e le s en s u e ro d e l a n t ic u e rp o . E l n iv e l l ig e ra m e n te m a y o r d e la a c t iv id a d d e C D 73 o b s e rv a d a en e l D ía 3 e je m p lo s e c o r re la c io n ó c o n un n iv e l e n s u e ro in fe r io r d e l a n t ic u e rp o q u e e l D ía 7 e je m p lo .
U n e x p e r im e n to s im ila r a l d e s c r ito a n te r io rm e n te se c o n d u jo s o b re ra to n e s p o r ta d o re s d e tu m o re s d e x e n o in je r to d e r iv a d o s d e a d e n o c a rc in o m a d e c o lo n d e S N U C 1 h u m a n o s u b c u tá n e o s y s e t ra ta ro n c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 C D 73.4 Ig G 2 C S -Ig G 1.1 f. L o s ra to n e s c o n tu m o re s S N U C 1 s e t ra ta ro n c o n C D 73.4 Ig G 2 C S - Ig G 1.1 f a 1, 3 y 10 m g /k g IP e l d ía 0. L o s tu m o re s se re c o g ie ro n a 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 168 h d e s p u é s d e la d o s if ic a c ió n . E l e n s a y o d e in h ib ic ió n e n z im á t ic a d e C D 73 se re a liz ó c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te . La c u a n tif ic a c ió n d e t in c ió n en m a rró n s e re a liz ó co n e l p ro g ra m a in fo rm á t ic o m a g e P ro P re m ie M e d ia C y b e rn e t ic s ) .
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s s e p re s e n ta n e n la g rá f ic a e n la F ig u ra 24 F , m u e s tra n q u e la a c t iv id a d d e C D 73 s e re d u c e s ig n if ic a t iv a m e n te e n a n im a le s d o s if ic a d o s c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 c u a n d o s e c o m p a ra c o n ra to n e s tra ta d o s co n a n t ic u e rp o c o n tro l, in d ic a n d o la in h ib ic ió n e n z im á t ic a d e C D 73 fu e r te p o r e l a n t ic u e rp o a la s t re s c o n c e n tra c io n e s . P o r ta n to , e l a n t ic u e rp o a n t i-C D 73 C D 73 .4 C S - Ig G 1 .1 f in h ib e e f ic a z m e n te la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 in vivo. L a s c in é t ic a s d e la in h ib ic ió n d e C D 73 p o r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 ta m b ié n s e d e te rm in a ro n e n e l m o d e lo tu m o ra l s in é rg ic o 4 T 1. S e in y e c ta ro n T Y /23 (a n t ic u e rp o s d e ra ta a n t i-C D 73 d e ra tó n ) o c o n tro l d e Ig G d e ra ta (10 m g /k g ) e l d ía 7 d e s p u é s d e la in y e c c ió n d e c é lu la tu m o ra l 4 T 1. T u m o r, b a zo , s a n g re c o m p le ta y s u e ro s e re c o g ie ro n lo s d ía s 1, 2, 3, 6 y 7 d e s p u é s d e l t r a ta m ie n to c o n a n t ic u e rp o . L a in h ib ic ió n d e la a c t iv id a d d e C D 73 s e m id ió c o m o se ha d e s c r ito a n te r io rm e n te en s e c c io n e s d e l d ía in d ic a d o . L a s s e c c io n e s tu m o ra le s re p re s e n ta t iv a s se m u e s tra n en la s F ig u ra s 25 A y B. L o s d a to s in d ic a n q u e T Y /23 in h ib e la a c t iv id a d d e C D 73 in vivo.
Ejemplo 8: Preclasificación (binning) de epitopo y bloqueo cruzado basado citometría de flujo
L o s e s tu d io s d e p re c la s if ic a c ió n d e e p íto p o s e re a liz a ro n p o r In te r fe ro m e tr ía d e b io c a p a (B L I) u s a n d o un in s tru m e n to O c te t R E D (P a ll F o r te b io ) a 25 °C . P a ra e s to s e s tu d io s , 20 -30 u g /m l d e h C D 73 -h is s e c a p tu ra ro n s o b re lo s s e n s o re s a n t i-p e n ta -h is u s a n d o 90 -180 s d e fa s e d e c a rg a . L a c o m p e t ic ió n d e a n t ic u e rp o se e v a lu ó p e rm it ie n d o q u e un a n t ic u e rp o d a d o (m A b 1 ) se u n a a la s s u p e r f ic ie s h C D 73 -h is d u ra n te 180 s, s e g u id o p o r la e x p o s ic ió n in m e d ia ta a u n a s e g u n d a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o (m A b 2 ) d u ra n te 180 s. L a s e ñ a l d e u n ió n p a ra m A b 2 d e s p u é s d e p re u n ió n d e m A b 1 se c o m p a ró a la d e l m A b 2 en la a u s e n c ia d e c o m p e t ic ió n , p a ra d e te rm in a r s i m A b 1 y m A b 2 c o m p ite n p o r la u n ió n a la s s u p e r f ic ie s d e h C D 73 -h is . E s to s e x p e r im e n to s se re a liz a ro n p a ra n u m e ro s o s p a re s d e m A b en a m b o s ó rd e n e s (m A b 1 lu e g o m A b 2 y m A b 2 lu e g o m A b 1 ) p a ra e s ta b le c e r lo s p e r f i le s d e c o m p e t ic ió n y c la s e s (b in ) d e e p íto p o (c o m o s e re s u m e e n la T a b la 29 d e a c o n tin u a c ió n ) .
C o m o s e m u e s tra e n la T a b la 29 , e l a n á lis is d e p re c la s if ic a c ió n d e e p íto p o re v e ló 2 c la s e s d e e p íto p o .
Tabla 29.
Figure imgf000096_0001
L o s a n t ic u e rp o s ta m b ié n s e s o m e tie ro n a b lo q u e o c ru z a d o b a s a d o p o r c ito m e tr ía d e f lu jo . E l e x p e r im e n to s e c o n d u jo c o m o s ig u e u s a n d o un c o n ju n to d e a n t ic u e rp o f lu o re s c e n te m e n te m a rc a d o y un s e g u n d o c o n ju n to d e a n t ic u e rp o no m a rc a d o : se s e m b ra ro n 100.000 c é lu la s N C I-H 292 p o r p o c illo . L a p la c a s e c e n tr ifu g ó y la s c é lu la s s e re s u s p e n d ie ro n en 100 u l d e F B S a l 2 % en P B S p o r p o c illo . L a s c é lu la s se b lo q u e a ro n en h ie lo d u ra n te 20 m in . E l a n t ic u e rp o no m a rc a d o , c o m o se in d ic a , en F B S a l 2 % en P B S s e a ñ a d ió a c a d a p o c illo . L a p la c a se c e n tr ifu g ó y la s c é lu la s se re s u s p e n d ie ro n en 100 u l p o r p o c illo d e a n t ic u e rp o d ilu id o , m a rc a d o (10 u g /m l) , e s d e c ir , 4 C 3 u 11 F 11 , c o n ju g a d o c o n F IT C . 6 p o c il lo s d e c é lu la s se in c u b a ro n s in a n t ic u e rp o , y se re s u s p e n d ie ro n en 100 u l d e F B S a l 2 % en P B S s o la m e n te (p a ra c o n tro le s ) . A c o n t in u a c ió n , s e in c u b a ro n e n h ie lo d u ra n te 30 m in . L a s c é lu la s s e la v a ro n d o s v e c e s c o n F B S a l 2 % e n P B S y la s m u e s tra s s e re s u s p e n d ie ro n e n 140 u l d e F B S a l 2 % y s e a n a liz a ro n e n un c itó m e tro d e f lu jo F a c s C a lib u r B e c to n D ic k in s o n ) .
L o s re s u lta d o s d e l b lo q u e o c ru z a d o b a s a d o en c ito m e tr ía d e f lu jo , lo s c u a le s se m u e s tra n en la s F ig u ra s 26 A y B, c o n f irm a n lo s d a to s d e p re c la s if ic a c ió n d e e p íto p o p o r S P R e x p u e s to s a n te r io rm e n te . P o r e je m p lo , 7 A 11 c o m p ite co n 11 F 11 , p e ro 4 C 3 no.
Ejemplo 9: Mapeo de epítopo por HDX
E s te e je m p lo d e s c r ib e e l u so d e H D X -M S p a ra la id e n t if ic a c ió n d e l e p íto p o s o b re C D 73 h u m a n a a d ic h o C D 73.4 -Ig G 2 C S - Ig G 1.1 f.
E l m é to d o d e e s p e c tro m e tr ía d e m a s a s p o r in te rc a m b io d e h id ró g e n o /d e u te r io (H D X -M S ) in v e s t ig a la c o n fo rm a c ió n d e la p ro te ín a y la s d in á m ic a s c o n fo rm a c io n a le s en la s o lu c ió n h a c ie n d o un s e g u im ie n to d e la ta s a y e l a lc a n c e d e l in te rc a m b io d e d e u te r io d e lo s á to m o s d e h id ró g e n o s d e a m id a d e la e s tru c tu ra p r in c ip a l d e la p ro te ín a (e x c e p to p ro lin a ) . E l n iv e l d e in te rc a m b io d e H D X d e p e n d e d e la a c c e s ib il id a d d e d is o lv e n te p ro te ic o y lo s e n la c e s de h id ró g e n o , y e l in c re m e n to d e m a s a d e la p ro te ín a t ra s H D X se p u e d e m e d ir c o n p re c is ió n m e d ia n te M S . C u a n d o e s ta té c n ic a se ju n ta c o n la d ig e s t ió n e n z im á t ic a , se p u e d e re s o lv e r la s c a ra c te r ís t ic a s e s tru c tu ra le s a l n iv e l d e p é p tid o , p o s ib il ita n d o la d ife re n c ia c ió n d e s u p e r f ic ie e x p u e s ta d e a q u e lla s p le g a d a s d e n tro . E n e x p e r im e n to s de m a p e o d e e p íto p o s , lo s e x p e r im e n to s d e m a rc a c ió n c o n d e u te r io y p o s te r io r e n fr ia m ie n to se re a liz a ro n en p a ra le lo p a ra e l a n tíg e n o y e l c o m p le jo a n tíg e n o /m A b , s e g u id o d e d ig e s t ió n c o n p e p s in a en lín e a , s e p a ra c ió n d e p é p tid o , y a n á lis is M S .
A n te s d e l m a p e o d e e p íto p o d e C D 73.4 - Ig G 2 -C S - Ig G 1.1 f en C D 73 p o r H D X -M S , se re a liz a ro n e x p e r im e n to s no d e u te r iz a d o s p a ra g e n e ra r un lis ta d o d e p é p tid o s p é p tic o s c o m u n e s p a ra C D 73 d im é r ic a d e E C D d e lo n g itu d c o m p le ta h u m a n a re c o m b in a n te (12 j M ) y c o m p le jo p ro te ic o d e C D 73 h u m a n a re c o m b in a n te y m A b d e C D 73 ( re la c ió n m o la r 1 :1 , 12 j M p a ra m A b d e C D 73 ) , c o n s ig u ie n d o u n a c o b e r tu ra d e s e c u e n c ia d e l 88 % p a ra C D 73 d e E C D d e lo n g itu d c o m p le ta . E n e l e x p e r im e n to d e H D X -M S , 5 j l d e C D 73 (S E Q ID N O : 99 ) o C D 73 c o n m A b C D 73.4 -Ig G 2 -C S - Ig G 1.1 f se d ilu y e ro n en 55 j l d e ta m p ó n d e D 2O ( ta m p ó n d e fo s fa to 10 m M , D 2O , p D 7 ,0 ) p a ra c o m e n z a r la s re a c c io n e s d e m a rc a c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a p ro te ín a C D 73 u s a d a e ra h C D 73 d im é r ic a d e lo n g itu d c o m p le ta g lic o s ila d a q u e te n ía S E Q ID N O : 99 , ta m b ié n m o s tra d a a c o n t in u a c ió n ) . L a s re a c c io n e s se lle v a ro n a c a b o d u ra n te d ife re n te s p e r io d o s d e t ie m p o : 20 s, 1 m in , 10 m in y 240 m in . A l f in a l d e c a d a p e r io d o d e re a c c ió n d e m a rc a c ió n , la re a c c ió n s e e n fr ió a ñ a d ie n d o ta m p ó n d e e n fr ia m ie n to ( ta m p ó n fo s fa to 100 m M c o n G d n C I 4 M y T C E P 0 ,4 M , p H 2 ,5 , 1 :1 , v /v ) y 50 j l d e m u e s tra e n fr ia d a s e in y e c tó e n e l s is te m a d e H D X -M S d e W a te rs p a ra e l a n á lis is . S e h iz o un s e g u im ie n to d e lo s n iv e le s d e a b s o rc ió n d e d e u te r io d e lo s p é p tid o s p é p tic o s c o m u n e s en a u s e n c ia /p re s e n c ia d e m A b d e C D 73.
L a p ro te ín a C D 73 u s a d a te n ía la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e te n ía la S E Q ID N O : 99.
L a s m e d ic io n e s d e H D X -M S s o b re m A b d e C D 73 en C D 73 in d ic a n q u e e l m A b C D 73.4 - Ig G 2 -C S - Ig G 1.1 f re c o n o c e un e p íto p o d is c o n t in u o d e d o s re g io n e s p e p tíd ic a s e n la re g ió n N - te rm in a l d e C D 73 :
re g ió n p e p tíd ic a 1 (65 -83 ): F T K V Q Q IR R A E P N V L L L D A (S E Q ID N O : 96 )
re g ió n p e p tíd ic a 2 (157 -172 ) : L Y L P Y K V L P V G D E V V G (S E Q ID N O : 97 )
U n a v is ta t r id im e n s io n a l d e la in te ra c c ió n (F ig u ra 27 B ) m u e s tra q u e e s ta s d o s re g io n e s s o n g e o m é tr ic a m e n te c e rc a n a s . U n m a p a d e ta l la d o d e la in te ra c c ió n s e m u e s tra e n la F ig u ra 27 A .
Ejemplo 10: Estructura cristalina de 11F11 que se une a CD73
E s te e je m p lo d e s c r ib e la e s tru c tu ra c r is ta l in a d e un F a b ' d e 11 F 11 u n id o a C D 73 (26 -336 )H is .
C D 73 (26 -336 )H is se p u r if ic ó d e c é lu la s H E K -293 E te m p o ra lm e n te t r a n s fe c ta d a s u s a n d o p ro to c o lo s c o n v e n c io n a le s , y s e u s a ro n ta l cu a l, o s e s o m e tie ro n a d e s g lic o s ila c ió n p o r t ra ta m ie n to P N G a s e F, y s e c o n c e n tra ro n a 1 ,2 m g /m l. El F a b ' d e l a n t ic u e rp o 11 F 11 se p re p a ró p o r d ig e s t ió n p o r P e p s in a d e 11 F 11 u s a n d o p ro to c o lo s c o n v e n c io n a le s , y se c o n c e n tró a 1,1 m g /m l.
E l c o m p le jo se fo rm ó in c u b a n d o v o lú m e n e s ig u a le s d e h C D 73 (26 -336 )H is d e s g lic o s ila d a s y e l F a b ' d e 11 F 11 d u ra n te u n a n o c h e a 4 °C , s e p u r if ic ó u s a n d o c o lu m n a G E S u p e rd e x 200 26 /60 , y s e c o n c e n tró a 9 ,5 m g /m l u s a n d o un c o n c e n tra d o r ro ta to r io M W C O 10 K.
L o s c r is ta le s s e c u lt iv a ro n e n g o ta s p o s a d a , lo s e x p e r im e n to s d e d ifu s ió n a l v a p o r y la g o ta e ra d e 0 ,25 u l d e p ro te ín a m e z c la d a c o n 0 ,25 u l d e s o lu c ió n re s e rv o r io . S e e s ta b le c ie ro n p o r e n c im a d e 7.100 e x p e r im e n to s d e c r is ta l iz a c ió n . E l c r is ta l in ic ia l e ra p e q u e ñ o a p ro x im a d a m e n te 10 jm . L o s c r is ta le s o p t im iz a d o s e ra n d e 200 - 300 j m en ta m a ñ o . L a o p t im iz a c ió n d e c r is ta l iz a c ió n in c lu ía c r ib a d o : d e t ip o d e a d it iv o s , d e te rg e n te s , p re c ip ita n te s , pH , te m p e ra tu ra y ta m p ó n . L a s c o n d ic io n e s q u e p e rm it ie ro n la fo rm a c ió n d e c r is ta l e ra c o m o s ig u e : la s o lu c ió n re s e rv o r io c o n s is t ía en p o lip ro p ile n g lic o l P 400 a l 34 % , N a /K P O 4 0,1 M pH 6 ,5 y C Y M A L -7 15 j M; lo s e x p e r im e n to s d e c r is ta l iz a c ió n se e s ta b le c ie ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te y, a c o n t in u a c ió n , s e c o lo c a ro n e n p la c a a 4 °C p a ra in c u b a r; y la in c u b a c ió n a 4 °C d u ra n te 7 d ía s . L a fo rm a c ió n d e c r is ta l s e o b s e rv ó ú n ic a m e n te c o n la p ro te ín a C D 73 g lic o s ila d a .
L o s c r is ta le s s e re c o g ie ro n d ire c ta m e n te d e la g o ta d e c r is ta l iz a c ió n y s e c o lo c a ro n d ire c ta m e n te e n e l líq u id o d e N 2. P o r e n c im a d e 100 c r is ta le s s e s e le c c io n a ro n e n fu n c ió n d e la d if ra c c ió n in te rn a .
L o s d a to s s e re c o g ie ro n u s a n d o un h a z p e q u e ñ o , a te n u a c ió n m u y p e q u e ñ a , y c o le c c ió n d e d a to s h e lic o id a le s s o b re S E R -C A T b e a m lin e 22 ID c o n e l d e te c to r d e C C D d e a lta v e lo c id a d R a y o n ix M X -33 H S . L o s c o n ju n to s d e d a to s se re c o g ie ro n a 4 ,1 A , 3 ,8 A , 3 ,5 A , y f in a lm e n te a 3 ,05 A . L o s d a to s , p ro c e s a d o s y a e s c a la q u e u s a n H K L 2000 h a b itu a l (O tw in o w s k i Z ., M in o r W ., Methods in Enzymology 276 , 307 -326 (1997 )) , e ra n 96 % c o m p le to s a re s o lu c ió n 3 ,04 A .
U n a b ú s q u e d a B L A S T (A lts c h u l e t a l. (1990 ) " B a s ic lo c a l a l ig n m e n t s e a rc h to o l" . J. Mol. Biol. 215 :403 -410 ) se u só p a ra e n c o n tra r e l m o d e lo m á s c e rc a n o p a ra e l d o m in io N - te rm in a l d e C D 73 y lo s d o m in io s F c y F v en e l B a n c o d e D a to s d e P ro te ín a R C S B p a ra u s a rs e en u n a b ú s q u e d a d e re e m p la z o m o le c u la r : e l m o d e lo d e C D 73 e ra d e P D B E n try 4 H 1 S (H e u ts e t a l. Chembiochem. 2012 N o v 5 ;13 (16 ) :2384 -91 ) .
E s to s s e u s a ro n c o m o m o d e lo d e p a rt id a e n la b ú s q u e d a P H A S E R (M c C o y e t a l. J. Appl. Cryst. (2007 ) . 40 , 658 -674 ) d e re e m p la z o m o le c u la r . L a b ú s q u e d a d e C D 73 e n c o n tró 5 m o lé c u la s e n la u n id a d a s im é tr ic a . M a n te n ie n d o la C D 73 f i ja d a , u n a b ú s q u e d a c o n e l m o d e lo d e b ú s q u e d a d e la c a d e n a p e s a d a e n c o n tró 2 m o lé c u la s e n la u n id a d a s im é tr ic a . M a n te n ie n d o la s C D 73 y la s c a d e n a s p e s a d a s f i ja d a s , u n a te rc e ra b ú s q u e d a P H A S E R c o n la c a d e n a lig e ra e n c o n tró 2 m o lé c u la s en la u n id a d a s im é tr ic a . U n m o d e lo c o m p u e s to d e c in c o c o m p le jo s c o m p le to s se re a liz ó a p a r t ir d e s o lu c io n e s p a rc ia le s s u p e rp o n ie n d o la s c in c o C D 73 y e m p a re ja n d o la s c a d e n a s lig e ra s y p e s a d a s . E s to se u s ó c o m o e l m o d e lo d e p a rt id a p a ra un re f in a d o p o r B U S T E R ( (B r ic o g n e e t a l. (2011 ) B U S T E R v e rs ió n 2.11.6. C a m b r id g e , R e in o U n id o : G lo b a l P h a s in g L td ). E l m o d e lo se h a re a ju s ta d o y lo s a m in o á c id o s c a m b ia d o p a ra re f le ja r la s s e c u e n c ia s d e 11 F 11. E l m o d e lo se s o m e tió a c o n s tru c c ió n d e m o d e lo m a n u a l e x h a u s t iv o y re f in a d o . S e re a liz a ro n un to ta l d e c in c o c ic lo s d e re f in a d o p o r B U S T E R p a ra c o m p le ta r e l re f in a d o . E l fa c to r R f in a l e s d e 20 ,59 % (R - lib re = 24 ,58 % ) p a ra lo s 27.484 á to m o s d e p ro te ín a y 24 m o lé c u la s d e d is o lv e n te .
L a s re p re s e n ta c io n e s d e la e s tru c tu ra c r is ta l d e l c o m p le jo s e e x p o n e n e n la s F ig u ra s 28 A -D .
L a s e s tru c tu ra s d e c r is ta l m u e s tra n q u e to d o s m e n o s u n a d e la s in te ra c c io n e s s o n d e re s to s e n la s re g io n e s C D R , y q u e la m a y o r ía d e la s in te ra c c io n e s s o n d e l d o m in io V H c o n d o s in te ra c c io n e s a d ic io n a le s d e l d o m in io V L (F ig u ra 28 A ). L o s re s to s q u e in te ra c c io n a n d e C D 73 y F a b ' d e 11F 11 h u m a n o s s e m u e s tra n e n la T a b la 30.
Tabla 30.
Figure imgf000098_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000099_0001
U n m o d e lo b a s a d o e n la e s t ru c tu ra c o m p u e s ta d e d o s c o m p le jo s C D 73 (N D T ) /11 F 11 s u p e rp u e s to s s o b re d ím e ro d e C D 73 (P D B E n try 4 H 1 S ) s u g ie re q u e 1 lF 11 s e u n e a la s u p e r f ic ie s o b re C D 73 le jo s d e la in te r fa z d e l d ím e ro , s u g ir ie n d o q u e F a b n o in te r fe r irá c o n la fo rm a c ió n d e d ím e ro .
U n a c o m p a ra c ió n d e m a p e o p o r H D X -M S y lo s re s u lta d o s d e ra y o s X s o b re e l c o m p le jo C D 73 /11 F 11 m u e s tra n q u e s o n d e a c u e rd o b á s ic o co n lo q u e m u e s tra un e p ito p o s im ila r s o b re C D 73 (65 -83 y 157 -172 ). S in e m b a rg o , la e s t ru c tu ra p o r ra y o s X m u e s tra in te ra c c io n e s a d ic io n a le s (m e n o s d e 6 Á ) en la re g ió n d e M e t-105 a A s p -111 ( in c lu y e n d o e n la c e s H a A rg -109 y T y r -110 ) , L y s -135 a P ro -139 , y A s p -317 a I le -320 ( in c lu y e n d o e n la c e s H a S e r-319 ).
Ejemplo 11: Impacto de diferentes bisagra/Fc sobre el tamaño de los complejos anticuerpo/CD73
C o m o se m u e s tra en lo s E je m p lo s a n te r io re s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 c o n u n a b is a g ra d e Ig G 2 y C H 1 so n m e jo re s in h ib id o re s d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 s o b re la s c é lu la s y se in te rn a liz a ro n m e jo r q u e lo s m is m o s a n t ic u e rp o s c o n u n a b is a g ra d e Ig G 1. B a s á n d o s e e n e s ta o b s e rv a c io n e s , y e l h e c h o d e q u e la b is a g ra d e Ig G 2 es m á s r íg id a q u e u n a b is a g ra d e Ig G 1 , se tu v o la h ip ó te s is d e q u e se fo rm a n m a y o re s c o m p le jo s e n tre un a n tíg e n o y a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n u n a b is a g ra d e Ig G 2 en re la c ió n a a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n u n a b is a g ra d e Ig G 1. E l s ig u ie n te e x p e r im e n to s e c o n d u jo p a ra a n a liz a r e s ta h ip ó te s is .
L a e s tru c tu ra y e l e s ta d o o lig o m é r ic o d e lo s c o m p le jo s C D 73 /a n tic u e rp o e n s o lu c ió n s e e x a m in a ro n p o r S E C -M A L S y D L S . P a ra e s to s e s tu d io s , lo s a n t ic u e rp o s q u e c o n te n ía n u n a re g ió n c o n s ta n te d e IgG 1 o Ig G 2 , se m e z c la ro n a d ife re n te s re la c io n e s m o la re s c o n p ro te ín a s re c o m b in a n te s q u e c o m p re n d ía n e l d o m in io e x t ra c e lu la r d e lo n g itu d c o m p le ta d e C D 73 h u m a n a q u e c o n te n ía e t iq u e ta d e p o lih is t id in a C - te rm in a l ( re s to s d e a m in o á c id o s 26 -546 d e C D 73 h u m a n a , d e n o m in a d o "h C D 73 -h is " ) o un fra g m e n to q u e c o r re s p o n d ía a l d o m in io N - te rm in a l d e C D 73 h u m a n a ( re s to s d e a m in o á c id o s 26 -336 , d e n o m in a d o "N -h C D 73 -h is " ) .
E l e s ta d o o lig o m é r ic o d e lo s c o m p le jo s C D 73 /a n tic u e rp o se e x a m in ó p o r c ro m a to g ra f ía d e e x c lu s ió n p o r ta m a ñ o a c o p la d a a un d e te c to r d e d is p e rs ió n d e la lu z m u lt iá n g u lo en lín e a (S E C -M A L S ) . S e re a liz a ro n s e p a ra c io n e s is o c rá t ic a s s o b re u n a c o lu m n a S h o d e x P R O T E IN K W -803 c o n e c ta d a a u n a P ro m in e n c e S h im a d z u U F L C e n ta m p ó n q u e c o n t ie n e K 2H P O 4 200 m M , N a C l 150 m M , pH 6 ,8 , q u e c o n t ie n e N a a z id a a l 0 ,02 % (0,1 p m f i l t r a d a ) q u e c o r re a 0 ,5 m l/m in . L a s m u e s tra s s e in y e c ta ro n e n la c o lu m n a u s a n d o un a u to m u e s tre a d o r S IL -20 A C P ro m in e n c e S h im a d z u y lo s d a to s s e o b tu v ie ro n d e t re s d e te c to re s e n lín e a c o n e c ta d o s e n s e r ie : un e s p e c tro fo tó m e tro p o r U V /v is d e m a tr iz d e d io d o s P ro m in e n c e S P D -20 A D s e g u id o p o r un d e te c to r d e d is p e rs ió n d e la lu z m u lt iá n g u lo W y a t t m in iD A W N ™ T R E O S a c o n t in u a c ió n un d e te c to r d e ín d ic e re fra c ta r io W y a t t O p t ila b T -rE X . L o s d a to s se re c o g ie ro n y a n a liz a ro n u s a n d o e l p ro g ra m a in fo rm á t ic o A s tra (W y a tt) y L a b s o lu t io n s (S h im a d z u ) .
S e re a liz a ro n e s tu d io s d e d is p e rs ió n d e la lu z d in á m ic a (D L S ) e n un le c to r d e p la c a W y a t t D y n a P ro e n p la c a s d e 384 p o c il io s a 25 °C . L o s p a rá m e tro s e x p e r im e n ta le s e ra n 20 a d q u is ic io n e s d e 5 s c a d a u n a p a ra m e d ic ió n , y las m e d ic io n e s se re g is tra ro n p o r c u a d ru p lic a d o , c o n la d e s v ia c ió n m e d ia y e s tá n d a r in fo rm a d a . L a s fu n c io n e s d e a u to c o r re la c ió n d e in te n s id a d se a ju s ta ro n u s a n d o e l a lg o r itm o d e "R e g u la r iz a c ió n " en e l p ro g ra m a in fo rm á t ic o D y n a m ic s (W y a t t T e c h n o lo g ie s ) .
U n s u m a r io d e S E C -M A L S y D L S se p ro p o rc io n a en la s F ig u ra 29 A y B. L o s a n á lis is d e lo s a n t ic u e rp o s s o lo s , m u e s tra t ie m p o s d e re te n c ió n (a p ro x im a d a m e n te 16 -17 m in ), m a s a s (140 -150 k D a ) y ra d io s h id ro d in á m ic o s (5 ,0 -5 ,4 n m ) p a ra c a d a a n t ic u e rp o q u e s o n t íp ic o s p a ra e l a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l m o n o m é r ic o . L o s d a to s p a ra la p ro te ín a h C D 73 -h is e s c o h e re n te c o n la p ro te ín a q u e a d o p ta la e s tru c tu ra d im é r ic a e s p e ra d a en s o lu c ió n ; en p a rt ic u la r , la m a s a d e te rm in a d a a p a r t ir d e lo s d a to s S E C -M A L S (120 k D a ) e s c o h e re n te c o n la e s p e ra d a p a ra un d ím e ro C D 73 -h is (117 k D a ) e in c o h e re n te c o n la q u e se e s p e ra r ía p a ra un m o n ó m e ro h C D 73 -h is (58 ,5 kD a ). L o s d a to s p a ra N -h C D 73 s o n c o h e re n te s c o n la p ro te ín a N -d o m in io re c o m b in a n te q u e e s m o n o m é r ic a en s o lu c ió n (m a s a m e d id a p o r S E C -M A L S = 38 kD a , en c o m p a ra c ió n c o n la m a s a m o n o m é r ic a e s p e ra d a = 35 ,0 k D a ), lo c u a l se e s p e ra d e b id o a q u e la re g ió n d e l d o m in io e x t ra c e lu la r d e C D 73 d e lo n g itu d c o m p le ta q u e e s re s p o n s a b le p a ra la d im e r iz a c ió n d e la p ro te ín a e s tá c o n te n id o e n e l d o m in io C - te rm in a l s in c o n tr ib u c ió n d e lo s re s to s N - te rm in a le s .
S e e n c o n tró q u e la s m e z c la s e q u im o la re s d e un a n t ic u e rp o d a d o c o n N -h C D 73 -h is e lu y e n c o m o u n a e s p e c ie s e n c il la en la S E C c o n t ie m p o d e re te n c ió n m á s c o r to q u e e l a n t ic u e rp o o N -h C D 73 -h is so lo , a s í c o m o m a y o re s ra d io s h id ro d in á m ic o s (R h ) p o r D L S , lo c u a l e s c o h e re n te c o n la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s . L o s d a to s d e M A L S in d ic a n m a s a s p a ra e s to s c o m p le jo s d e a p ro x im a d a m e n te 210 kD a . E s to e s c o h e re n te c o n u n a m o lé c u la N -h C D 73 -h is u n id a a c a d a u n o d e lo s d o s d o m in io s F a b d e un a n t ic u e rp o d a d o p a ra fo rm a r un c o m p le jo a n t ic u e rp o :N -h C D 73 -h is 1 :2.
L o s d a to s d e S E C -M A L S p a ra m e z c la s d e a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 c o n d ím e ro h C D 73 -h is m u e s tra q u e la s m e z c la s e lu y e n a n te s q u e e l h C D 73 -h is o e l a n t ic u e rp o s o lo , s u g ir ie n d o q u e s e fo rm a n lo s c o m p le jo s . C o m p a ra n d o lo s d a to s p a ra m A b q u e c o n t ie n e n la m is m a re g ió n v a r ia b le p e ro d ife re n te s d o m in io s c o n s ta n te s , m u e s tra q u e lo s t ie m p o s d e e lu c c ió n p a ra lo s c o m p le jo s d e h C D 73 -h is c o n m A b q u e c o n t ie n e d o m in io s c o n s ta n te s d e Ig G 2 ( Ig G 2 -C 219 S , Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f) s o n m á s te m p ra n o s q u e a q u e l lo s p a ra c o m p le jo s d e h C D 73 -h is c o n m A b q u e c o n t ie n e n un d o m in io c o n s ta n te d e Ig G 1.1 f. A d e m á s , la s m a s a s d e te rm in a d a s p o r M A L S p a ra c o m p le jo s d e h C D 73 -h is c o n m A b q u e c o n t ie n e n un d o m in io c o n s ta n te d e Ig G 2 s o n m a y o re s q u e a q u e l la s p a ra c o m p le jo s d e h C D 73 -h is c o n m A b q u e c o n t ie n e n un d o m in io c o n s ta n te d e Ig G 1. L o s d a to s d e D L S m u e s tra n a d e m á s q u e lo s ra d io s h id ro d in á m ic o s de c o m p le jo s d e h C D 73 -h is c o n m A b q u e c o n t ie n e n un d o m in io c o n s ta n te d e Ig G 2 s o n m a y o re s q u e a q u e l lo s p a ra c o m p le jo s d e h C D 73 -h is c o n m A b q u e c o n t ie n e n un d o m in io c o n s ta n te d e Ig G 1. P o r e je m p lo , lo s d a to s d e S E C -M A L S y D L S p a ra C D 73.4 c o n t r e s re g io n e s c o n s ta n te s d ife re n te s ( Ig G 2 -C 219 S , Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f, o Ig G 1.1 f) se m u e s tra n en la F ig u ra 30. E n e s te c a s o se p u e d e v e r q u e e l c o m p le jo d e h C D 73 -h is co n C D 73.4 q u e c o n t ie n e el d o m in io c o n s ta n te d e Ig G 2 t ie n e t ie m p o s d e re te n c ió n m á s c o r to s (F ig u ra 30 A ), ra d io s h id ro d in á m ic o s m a y o re s (F ig u ra 30 B ) y m a y o re s m a s a s d e te rm in a d a s p o r M A L S (F ig u ra 30 C ), e n c o m p a ra c ió n c o n lo s c o m p le jo s d e h C D 73 -h is co n C D 73.4 - Ig G 1.1 f. B a s á n d o s e en la s m a s a s p o r M A L S , un m o d e lo e s q u e m á t ic o p a ra la e s tru c tu ra y la e s te q u io m e tr ía d e lo s c o m p le jo s e n tre h C D 73 -h is y lo s a n t ic u e rp o s se m u e s tra en la F ig u ra 30 D , en e l q u e lo s c o m p le jo s q u e c o n t ie n e n C D 73.4 - Ig G 1.1 f p re d o m in a n te m e n te fo rm a n c o m p le jo s d e d ím e ro m A b /C D 73 m á s p e q u e ñ o s 2 :2 (p ic o 1 = -550 k D a ) o 4 :4 (p ic o 2 = -1.300 kD a ), m ie n tra s q u e C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S o C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f fo rm a n c o m p le jo s m u c h o s m a y o re s (> 3.000 k D a ) c o n h C D 73 -h is , p o r lo c u a l n o se p u e d e m o d e la r c o n s e g u r id a d e s tru c tu ra y e s te q u io m e tr ía p re c is a s .
L o s a n t ic u e rp o s C D 73.4 q u e t ie n e n la s re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a e x p u e s to s e n la T a b la 26 ta m b ié n se e n s a y a ro n p a ra e l ta m a ñ o d e la fo rm a c ió n d e c o m p le jo . C o m o se m u e s tra en la F ig u ra 30 D , lo s re s u lta d o s in d ic a n q u e se fo rm a n c o m p le jo s d e m a y o r o rd e n c o n a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n un d o m in io C H 1 d e Ig G 2 en re la c ió n c o n a q u e llo s q u e t ie n e n un d o m in io C H 1 d e Ig G 1.
C o le c t iv a m e n te lo s d a to s d e S E C -M A L S y D L S d e m u e s tra n q u e lo s c o m p le jo s m á s g ra n d e s s e fo rm a n e n tre h C D 73 -h is y lo s m A b q u e c o n t ie n e n u n a b is a g ra d e Ig G 2 y re g ió n C H 1 ( Ig G 2 -C 219 S o Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f) , en c o m p a ra c ió n c o n a q u e llo s q u e c o n t ie n e n b is a g ra d e IgG 1 y re g ió n C H 1 ( Ig G 1.1 f) . A d e m á s , lo s a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n un d o m in io c H 1 d e Ig G 2 fo rm a n m a y o re s c o m p le jo s q u e a q u e llo s q u e t ie n e n un d o m in io C H 1 d e Ig G 1.
Ejemplo 12: Relevancia de determinados restos de aminoácidos en CH1 y bisagra de IgG2 en mejora de la intemalización de CD73 mediada por anticuerpos
L o s a n t ic u e rp o s a n t i-C D 73 (C D 73.4 ) c o n la s re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a m o s tra d o s e n la T a b la 31 se p re p a ra ro n y s e e n s a y a ro n c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te en e n s a y o s d e in te rn a liz a c ió n d e C D 73 m e d ia d a p o r a n t ic u e rp o .
T l 1:
Figure imgf000101_0001
L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la F ig u ra 31 , p ro p o rc io n a n la s ig u ie n te in fo rm a c ió n en e l c o n te x to d e in te rn a liz a c ió n d e C D 73 :
• e l d o m in io C H 2 n o p a re c e te n e r un im p a c to c o m o s e m u e s tra p o r
◦ a ) se o b s e rv ó m u y p o c a d ife re n c ia en la c a p a c id a d d e in te rn a liz a c ió n e n tre lo s a n t ic u e rp o s q u e c o m p re n d e n u n a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a m o d if ic a d a c o n fo rm a to "A Y " (q u e t ie n e la b is a g ra d e Ig G 2 E R K C C V E C P P C P A P P V A G (S E Q ID N O : 8 ) en re la c ió n c o n a q u e lla s co n fo rm a to "K H " (E R K C C V E C P P C P A P E L L G G (S E Q ID N O : 22 ) (C o n ju n to 5, 6 y 7);
◦ b ) lo s in te rc a m b io s d e C H 2 s o n c o m p a ra b le s a G1 o G 2 t ip o s i lv e s tre (C o n ju n to s 5 y 6 ); y
◦ c ) e l re s to 237 n o t ie n e im p a c to s o b re la in te rn a liz a c ió n : n i la a d ic ió n d e un re s to "G " a u n a b is a g ra d e Ig G 2 ni la d e le c ió n d e l "G " C - te rm in a l e n u n a b is a g ra d e IgG 1 a fe c tó a la in te rn a liz a c ió n (C o n ju n to 9).
E s to s u g ie re q u e e l d o m in io C H 2 n o a fe c ta la in te m a liz a c ió n (e s d e c ir , e l d o m in io C H 2 p u e d e s e r d e IgG 1 o Ig G 2 );
• In te rc a m b io d e la s re g io n e s C H 1 in d ic a d a s en e l C o n ju n to 3 (K R G E G S S N L F ; K R G E G S ; S N L F ; IT N D R T P R y S N L F P R ) en IgG 1 c o n a q u e lla s d e Ig G 2 p ro p o rc io n a p o c o b e n e f ic io , e s d e c ir , la in te rn a liz a c ió n p e rm a n e c e s im ila r a la d e Ig G 1 ; v é a s e C o n ju n to 3);
• In te rc a m b io d e la s re g io n e s c H 1 in d ic a d a s en e l C o n ju n to 4 (R K E G S G N S F L ; R K E G S G ; N S F L ; T ID N T R R P a n d N S F L R P ) e n Ig G 2 c o n a q u e lla s d e IgG 1 t ie n e im p a c to v a r ia b le : c a m b ia r N S F L n o t ie n e im p a c to , m ie n tra s q u e las 2 re g io n e s (R K E G S G & R P ) e s tá n im p lic a d a s (v é a s e C o n ju n to 4 ). B a s á n d o s e e n lo s re s u lta d o s d e lo s C o n ju n to s 3 y 4, p a re c e q u e e x is te u n a in te ra c c ió n e n tre la re g ió n c H 1 y la b is a g ra , s ie n d o la s re g io n e s R K E G S G y R P m á s im p o r ta n te s q u e la re g ió n N S F L ;
• L a re g ió n b is a g ra a fe c ta a la in te rn a liz a c ió n , e s d e c ir , la b is a g ra d e Ig G 2 p ro p o rc io n a m e jo r in te rn a liz a c ió n en re la c ió n c o n la b is a g ra d e IgG 1 (v é a s e lo s c o n ju n to s 7 y 8). A d e m á s , IgG 1 c o n u n a d e le c ió n (G 1 -d e lta -b is a g ra ) m e jo ra la in te rn a liz a c ió n s o b re Ig G 1.Ig G 2 c o n u n a d e le c ió n (G 2 -d e lta -b is a g ra ) p ro p o rc io n a un n iv e l s im ila r d e in te rn a liz a c ió n en re la c ió n c o n e l d e u n a b is a g ra d e Ig G 2. E s to s u g ie re q u e la re g ió n b is a g ra a fe c ta a la in te rn a liz a c ió n , d ic h o e fe c to e s a u m e n ta d o p o r un C H 1 d e Ig G 2 (G 2 -G 1 -G 2 -G 2 -A Y e s c o m p a ra b le a G 1 -G 2 -G 1 -G 1 -A Y );
• Ig G 2.4 (C 220 S ) t ie n e in te rn a liz a c ió n s im ila r o re d u c id a en c o m p a ra c ió n c o n Ig G 2.3 (C 219 S ). Ig G 2.3 /4 (C 219 S /C 220 S ) t ie n e in te rn a liz a c ió n m u y re d u c id a en c o m p a ra c ió n co n Ig G 2.3 o Ig G 2.4 s o lo (v é a s e C o n ju n to 10 ). E s to s u g ie re q u e la in te rn a liz a c ió n d e un a n t ic u e rp o c o n u n a b is a g ra d e Ig G 2 y C 219 S e s a p ro x im a d a m e n te la m is m a q u e la d e u n a b is a g ra d e Ig G 2 c o n C 220 S , a m b a s s o n m u c h o m e jo re s q u e la d e u n a b is a g ra d e Ig G 2 c o n ta n to C 219 S c o m o C 220 S ;
• Ig G 2.5 (m u ta c ió n C 131 S ) t ie n e in te rn a liz a c ió n re d u c id a e n c o m p a ra c ió n c o n la s c o n s tru c c io n e s c o n C 131 (v é a s e C o n ju n to s 1, 6 y 7).
P o r ta n to , e s to s re s u lta d o s in d ic a n q u e e l d o m in io C H 1 y la b is a g ra s o n a m b a s re le v a n te s en la in te rn a liz a c ió n de C D 73 m e d ia d a p o r a n t ic u e rp o , y q u e un a n t ic u e rp o q u e t ie n e la s s e c u e n c ia s d e Ig G 2 d e e s to s d o m in io s se in te rn a liz a c o n m e jo r e f ic a c ia e n re la c ió n co n un a n t ic u e rp o q u e t ie n e e s ta s re g io n e s d e Ig G 1.
Ejemplo 13: Anticuerpos que tienen una bisagra de IgG2 y/o dominio CH1 forman complejos de alto peso molecular
A n t ic u e rp o s C D 73.4 q u e t ie n e n re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a e x p u e s ta s en la T a b la 26 ta m b ié n se e n s a y a ro n p a ra la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s d e a lto p e s o m o le c u la r p o r e x p e r im e n to s S E C -M A L S y D L S , c o m o s e ha d e s c r ito en e l E je m p lo 11.
T re s d e lo s 16 a n t ic u e rp o s en e s te e s tu d io se e n s a y a ro n p re v ia m e n te : C D 73.4 - Ig G 1.1 f, C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S (d e n o m in a d o ta m b ié n C D 73.4 - Ig G 2.3 ) , y C D 73.4 - Ig G 2 -C 219 S - Ig G 1.1 f ( ta m b ié n d e n o m in a d o C D 73.4 - Ig G 2.3 G 1.1 f-K H ). L o s d a to s d e S E C -M A L S y D L S d e lo s a n t ic u e rp o s s o lo s m o s tra ro n t ie m p o s d e re te n c ió n , m a s a s , y ra d io s h id ro d in á m ic o s p a ra c a d a a n t ic u e rp o q u e s o n t íp ic o s p a ra un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l m o n o m é r ic o . C o m p le jo s e q u im o la re s d e c a d a a n t ic u e rp o (5 ,5 u M ) c o n h C D 73 -h is (5 ,5 u M ) m o s tra ro n t ie m p o s d e re te n c ió n m á s le n to s p a ra to d o s lo s c o m p le jo s en c o m p a ra c ió n co n e l a n t ic u e rp o o h C D 73 -s o lo in d ic a n d o la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s . U n s o la p a m ie n to d e lo s d a to s d e l c ro m a to g ra m a S E C p a ra c a d a u n o d e lo s 16 c o m p le jo s se m u e s tra en la s F ig u ra s 32 A . L o s d a to s d e l c ro m a to g ra m a s e p u e d e n d iv id ir e n 4 p ic o s d is t in to s , lo s c u a le s s e m u e s tra n e n la F ig u ra 32 B . E l p ic o 1 c o n t ie n e la s e s p e c ie s m á s g ra n d e s , co n m a s a s d e te rm in a d a s p o r M A L S q u e s u g ie re n c o m p le jo s c o n m a s a e q u iv a le n te d e m a y o r q u e c o m p le jo s h C D 73 -h is :m A b 4 :4. E l p ic o 2 c o n tie n e e s p e c ie s c o n m a s a s d e te rm in a d a s p o r M A L S q u e s u g ie re n c o m p le jo s d e a p ro x im a d a m e n te c o m p le jo s h C D 73 -h is :m A b 2 :2. E l p ic o 3 e s u n a e s p e c ie m e n o r c o n b a ja s e ñ a l y m a s a s d e te rm in a d a s p o r M A L S q u e s u g ie re n c o m p le jo s h C D 73 -h is :m A b d e a p ro x im a d a m e n te 1 :1. E l p ic o 4 c o r re s p o n d e a la e lu c ió n d e lo s m A b s o lo s co n m a s a s d e te rm in a d a s p o r M A L S c o h e re n te s c o n s in a n t ic u e rp o . P a ra c u a n t i f ic a r la s c a n t id a d e s re la t iv a s d e c a d a e s p e c ie , lo s p ic o s 4 d e c a d a c ro m a to g ra m a se in te g ra ro n c o m o p ic o 1 (12 ,9 m in ) p ic o 2 (12 ,9 m in - 15,1 m in ) p ic o 3 (15 ,1 -16 ,7 m in ) p ic o 4 (16 ,7 - 19 ,3 m in ). La in te g ra c ió n ta m b ié n in c lu ía un in te rv a lo in te g ra d o a d ic io n a l d e n o m in a d o p ic o 5 (> 19 ,3 m in ) p a ra te n e r e n c u e n ta c u a lq u ie r e s p e c ie d e p e s o m o le c u la r , e l c u a l se e n c o n tró in s ig n if ic a n te (< 3 ,5 % p a ra to d o s lo s c o m p le jo s ) . El p o rc e n ta je p a ra c a d a e s p e c ie d e e s ta in te g ra c ió n se re s u m e en la T a b la 32. T o d o s lo s c o m p le jo s c o n te n ía n un p o rc e n ta je p e q u e ñ o s im ila r d e p ic o 3 (a p ro x im a d a m e n te 6 -9 % ), p e ro c a n t id a d e s v a r ia b le s d e lo s o tro s p ic o s . Lo m á s n o ta b le e s q u e to d o s lo s c o m p le jo s e n tre h C D 73 -h is y lo s a n t ic u e rp o s q u e c o n te n ía n e l d o m in io C H 1 d e h Ig G 1 te n ía n un p o rc e n ta je s ig n if ic a t iv a m e n te m a y o r d e c o m p le jo s m e n o re s (p ic o 2 ), m ie n tra s q u e a q u e l lo s q u e c o n te n ía n e l d o m in io C H 1 d e h Ig G 2 te n ía n un p o rc e n ta je m a y o r d e c o m p le jo s m a y o re s (p ic o 1) (T a b la 32 y F ig u ra 32 C ). E s to s u g ie re un im p o r ta n te p a p e l p a ra n o s o la m e n te la re g ió n d e b is a g ra s in o ta m b ié n e l d o m in io c H 1 en fo rm a c ió n de c o m p le jo d e o rd e n m a y o r.
T l 2: s
Figure imgf000103_0001
Ejemplo 14: Unión del receptor de Fc para anticuerpos con dominios constantes diseñados por ingeniería genética
E s te e je m p lo d e m u e s tra q u e lo s a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a m o d if ic a d a s q u e c o m p re n d e n e l C H 1 y b is a g ra d e Ig G 2 s e u n e n a F c y R s c u a n d o c o n t ie n e n lo s d o m in io s C H 2 y C H 3 d e Ig G 1.
A d e m á s d e la u n ió n a a n tíg e n o p o r lo s d o m in io s v a r ia b le s , lo s a n t ic u e rp o s se p u e d e n a c o p la r a re c e p to re s g a m m a d e F c (F c g R s ) a t ra v é s d e la in te ra c c ió n c o n lo s d o m in io s c o n s ta n te s . E s ta s in te ra c c io n e s m e d ia n la s fu n c io n e s e fe c to ra s ta le s c o m o la c ito to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o (A D C C ) y la fa g o c i to s is c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o (A D C P ). L a a c t iv id a d d e la fu n c ió n e fe c to ra e s a lta p a ra e l is o t ip o Ig G 1 , p e ro m u y b a ja o a u s e n te p a ra Ig G 2 y Ig G 4 d e b id o a q u e e s to s is o t ip o s t ie n e n a f in id a d m e n o r p a ra F c g R s . A d e m á s , la fu n c ió n e fe c to ra d e IgG 1 se p u e d e m o d if ic a r a t ra v é s d e m u ta c ió n d e re s to s d e a m in o á c id o s e n la s re g io n e s c o n s ta n te s p a ra a lte ra r la a f in id a d a F c g R y la s e le c t iv id a d .
L a u n ió n d e lo s a n t ic u e rp o s a re c e p to re s g a m m a d e F c (F c y R s o F c g R s ) se e s tu d ió u s a n d o te c n o lo g ía s de b io s e n s o r in c lu y e n d o re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f ic ia l (S P R ) B ia c o re e In te r fe ro m e tr ía d e b io c a p a F o r te b io (B L I) . L o s e s tu d io s d e S P R s e re a liz a ro n e n un in s tru m e n to B ia c o re T 100 (G E H e a lth c a re ) a 25 °C . E l f ra g m e n to F a b d e un a n t ic u e rp o a n t i-6 x H is m u r in o s e in m o v iliz ó s o b re un c h ip s e n s o r C M 5 u s a n d o E D C /N H S a u n a d e n s id a d d e -3.000 R U . S e c a p tu ra ro n d iv e rs o s F c g R s h is -e t iq u e ta d o s (7 u g /m l) p o r la e t iq u e ta h is C - te rm in a l u s a n d o un t ie m p o de c o n ta c to d e 30 s a 10 u l/m in , y la u n ió n d e a n t ic u e rp o 1 ,0 pM s e e v a lu ó en un ta m p ó n d e e je c u c ió n d e N a P O 4 10 m M , N a C l 130 m M , 0 ,05 % d e p 20 (P B S -T ) pH 7 ,1. L o s F c g R s u s a d o s p a ra e s to s e x p e r im e n to s in c lu ía n C D 64 (F c g R I) , C D 32 a H 131 (F c g R IIa -H 131 ) , C D 32 a -R 131 (F c g R IIa -R 131 ) , C D 32 b (F c g R IIb ) , C D 16 a -V 158 (F c g R II Ia -V 158 ) , C D 16 b -N A 1 (F c g R II Ib -N A 1 ) , y C D 16 B -N A 2 (F c g R II Ib -N A 2 ) . S e re a liz a ro n e x p e r im e n to s B L I en un in s tru m e n to d e R E D F o r te b io O c te t (P a ll, F o r te b io ) a 25 °C en N a P O 4 10 m M , N a C l 130 m M , 0 ,05 % d e p 20 (P B S -T ) pH 7 ,1. L o s a n t ic u e rp o s s e c a p tu ra ro n fu e ra d e lo s s o b re n a d a n te s d e e x p re s ió n n o d i lu id o s e n s e n s o re s re c u b ie r to s p o r p ro te ín a A , s e g u id o d e la u n ió n d e 1 p M h C D 32 a -H 131 , h C D 32 a -R 131 , h C D 32 b , h C D 16 a -V 158 , o 0.1 pM a n a lito s h C D 64.
E n p r im e r lu g a r, se p ro d u je ro n a n t ic u e rp o s q u e c o n te n ía n lo s d o m in io s F c d e IgG 1 m o d if ic a d o s q u e in c lu y e n las s u s t itu c io n e s S 267 E (S E ) y S 267 E /l328 F (S E L F ), a s í c o m o d iv e rs a s c o m b in a c io n e s d e la s m u ta c io n e s P 238 D , P 271 G , H 268 D , A 330 R , G 237 D , E 233 D , re fe r id a s c o m o V 4 , V 7 , V 8 , V 9 y V 12. S e e s tu d ió la u n ió n d e e s to s a n t ic u e rp o s p o r B ia c o re S P R c o n c o m p a ra c ió n a a n t ic u e rp o s Ig G 1 f, Ig G 2.3 ( Ig G 2 -C 219 S ) y Ig G 4.1 ( Ig G 4 -S 228 P ) , a s í c o m o un a n t ic u e rp o Ig G 1.1 f q u e s e h a d is e ñ a d o p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a p a ra re d u c ir la u n ió n a to d o s lo s F c g R s . L o s re s u lta d o s , lo s c u a le s se m u e s tra n en la F ig u ra 33 , d e m u e s tra n la s p ro p ie d a d e s u n ió n a F c g R e s p e ra d a s p a ra Ig G 1 f, Ig G 2.3 y Ig G 4.1 y lo s a n t ic u e rp o s IgG 1 m u ta n te s , in c lu y e n d o u n ió n d e C D 32 a -H 131 , C D 32 a -R 131 y C D 32 b in c re m e n ta d a p a ra S E y S E L F , a s í c o m o s e le c t iv id a d in c re m e n ta d a d e lo s m u ta n te s V 4 , V 7 , V 8 , V 9 y V 12 p a ra C D 32 b s o b re C D 32 a -H 131 y C D 32 a -R 131 , F ig u ra 33.
E l p ró x im o c o n ju n to d e c o n s tru c c io n e s se u s ó p a ra d is e ñ a r p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a la fu n c ió n e fe c to ra en e l is o t ip o Ig G 2 fu n c ió n e fe c to ra n e g a tiv o . P a ra e s te e s tu d io , la s m u ta c io n e s a n te r io rm e n te d e s c r ita s se in tro d u je ro n en el c o n te x to d e u n a re g ió n c o n s ta n te Ig G 2.3 , o un h íb r id o Ig G 2.3 / Ig G 1 f d e n o m in a d o Ig G 2.3 G 1 -A Y (T a b le 33 ). L o s a n t ic u e rp o s se e x p re s a ro n a p e q u e ñ a e s c a la c o m o s o b re n a d a n te s , y se e n s a y a ro n p a ra la u n ió n a F c g R s u s a n d o te c n o lo g ía d e b io s e n s o r d e in te r fe ro m e tr ía d e b io c a p a F o r te b io O c te t. P u e s to q u e lo s a n t ic u e rp o s e s ta b a n p re s e n te s a b a ja c o n c e n tra c ió n en lo s s o b re n a d a n te s , e l e x p e r im e n to se re a liz ó c a p tu ra n d o lo s a n t ic u e rp o s fu e ra d e lo s s o b re n a d a n te s u s a n d o lo s s e n s o re s d e re c u b r im ie n to d e p ro te ín a A , s e g u id o p o r la u n ió n d e a n a lito s F c g R en s o lu c ió n . Ig G 1 f c o n tro l p u r if ic a d o y s o b re n a d a n te q u e in c lu y e a n t ic u e rp o s IgG 1 t ip o s ilv e s tre , S E , P 238 D , V 4 y V 12 ta m b ié n s e in c lu y e ro n p a ra la c o m p a ra c ió n , y c a d a u n o d e e s to s a n t ic u e rp o s c o n tro le s d e m o s tra ro n p ro p ie d a d e s d e u n ió n a F c g R e s p e ra d a s (F ig u ra 34 ). E l a n t ic u e rp o Ig G 2.3 ta m b ié n d e m o s tró e l p e rfil d e u n ió n e s p e ra d o , c o n u n ió n a p re c ia b le a s o la m e n te C D 32 a -H 131. S in e m b a rg o , to d a s la s m u ta c io n e s S 267 E , L 328 F , P 238 D , P 271 G , H 268 D , A 330 R , G 237 D y E 233 D en Ig G 2.3 fa lla ro n p a ra re c a p itu la r la a f in id a d d e F c g R d e lo s c o r re s p o n d ie n te s m A b IgG 1 d is e ñ a d o s p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a (F ig u ra 34 ). P o r e l c o n tra r io , la c o n s tru c c ió n Ig G 2.3 G 1 -A Y e ra c a p a z d e c o n s e rv a r c o m p le ta m e n te la s p ro p ie d a d e s d e u n ió n a F c g R d e IgG 1 t ip o s ilv e s tre , m ie n tra s re t ie n e la re g io n e s C H 1 y b is a g ra s d e Ig G 2.3. A d e m á s , to d o s lo s m u ta n te s Ig G 2.3 G 1 -A Y q u e c o n t ie n e n S 267 E , L 328 F , P 238 D , P 271 G , H 268 D , A 330 R , G 237 D y E 233 D d e m o s tra ro n q u e la s p ro p ie d a d e s d e u n ió n a F c g R c o m p a ra b le s a lo s m A b v e rs ió n IgG 1 q u e c o n t ie n e n la s m is m a s m u ta c io n e s (F ig u ra 34 ). E s to d e m u e s tra e l é x ito d e l d is e ñ o p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a d e lo s a n t ic u e rp o s c o n re g io n e s C H 1 y b is a g ra d e Ig G 2 c o m b in a d a s c o n la fu n c ió n e fe c to ra d e l IgG 1 t ip o s ilv e s tre o m u ta n te .
T l :
Figure imgf000104_0001
A d e m á s s e e x p lo ró la e s tra te g ia d e l d is e ñ o p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a p ro d u c ie n d o o tro s a n t ic u e rp o s fo rm a te a d o s co n Ig G 2.3 G 1 -A Y , Ig G 2.3 G 1 -A Y -S 267 E ( Ig G 2.3 G 1 -A Y -V 27 ) , a s í c o m o v a r ia n te s d e fo rm a B d e Ig G 2 ( Ig G 2.5 G 1 -A Y y Ig G 2.5 G 1 -A Y -V 27 ) , y o tro s a n t ic u e rp o s h íb r id o s q u e c o n t ie n e n c o m b in a c io n e s d ife re n te s d e d o m in io s c o n s ta n te s d e IgG 1 y Ig G 2 , y e n s a y a n d o la u n ió n d e e s to s a n t ic u e rp o s a F c g R s h is -e t iq u e ta d o s c a p tu ra d o s p o r a n t i-h is F a b u s a n d o la te c n o lo g ía d e S P R B ia c o re . D e a c u e rd o c o n lo s d a to s d e s o b re n a d a n te d e O c te t, lo s d a to s d e S P R m o s tra ro n q u e lo s a n t ic u e rp o s Ig G 2.3 G 1 -A Y y Ig G 2.3 G 1 -A Y -V 27 te n ía n p ro p ie d a d e s d e u n ió n a F c g R c o m p a ra b le s a Ig G 1 f y Ig G 1 f-S 267 E , re s p e c t iv a m e n te , a p e s a r d e c o n te n e r la s re g io n e s C H 1 y b is a g ra d e un a n t ic u e rp o Ig G 2 d e fo rm a A ( Ig G 2.3 ) (T a b la 34 ). L o s d a to s ta m b ié n se o b tu v ie ro n u s a n d o a n t ic u e rp o s Ig G 2.5 G 1 -A Y y Ig G 2.5 G 1 -A Y -V 27 , d e m o s tra n d o e l é x ito d e l d is e ñ o p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a d e a n t ic u e rp o s Ig G 2 fo rm a B (q u e c o n t ie n e n la m u ta c ió n C 131 S d e n o m in a d o Ig G 2.5 ) q u e t ie n e n fu n c io n e s e fe c to ra s t ip o Ig G 1 f o Ig G 1 f m o d if ic a d o . L o s d a to s d e o tro s v a r io s a n t ic u e rp o s c o n re g io n e s c o n s ta n te s Ig G 2.3 G 1 -A Y , Ig G 2.3 G 1 -A Y -V 27 , Ig G 2.5 G 1 -A Y , o Ig G 2.5 G 1 -A Y -V 27 p e ro d ife re n te s re g io n e s v a r ia b le s m o s tra ro n q u e la e s t ra te g ia d e d is e ñ o p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a e s m u y a p lic a b le a o tro s a n t ic u e rp o s in d e p e n d ie n te s d e lo s d o m in io s v a r ia b le s (T a b la 34 ). O tra s c o n s tru c c io n e s q u e d e m u e s tra n la s p ro p ie d a d e s d e u n ió n a F c g R t ip o Ig G 1 f in c lu y e n Ig G 1 -G 2.3 G 1 -A Y , y Ig G 1 d e lta T H T , m ie n tra s q u e v a r ia s d e la s c o n s tru c c io n e s d e re g ió n c o n s ta n te m o d if ic a d a e ra n in c a p a c e s d e c o n s e rv a r la s p ro p ie d a d e s d e u n ió n a F c g R t ip o Ig G 1 f, in c lu y e n d o la s c o n s tru c c io n e s Ig G 2.3 G 1 -K H , Ig G 2.5 G 1 -K H , Ig G 2.3 p lu s T H T , Ig G 2.5 p lu s T H T y Ig G 2.3 p lu s G G G (T a b le 34 ).
Ta l 4: a b
Figure imgf000105_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000106_0002
T o m á n d o lo s c o n ju n ta m e n te e s to s d a to s d e m u e s tra n q u e la s e c u e n c ia e n IgG 1 in m e d ia ta m e n te C - te rm in a l a l m o t iv o c o n s e rv a d o C P P C P A P (S E Q ID N O : 380 ) e n la re g ió n b is a g ra c o n f ie re fu n c ió n e fe c to ra m e d ia d a p o r F c g R , m ie n tra s q u e C H 1 y la s p o rc io n e s s u p e r io re s d e la b is a g ra d e l a n t ic u e rp o se p u e d e n re e m p la z a r c o n s e c u e n c ia s d e Ig G 2 o Ig G 2 m o d if ic a d a s , p a ra c o m b in a r p o te n c ia lm e n te la s fu n c io n e s e fe c to ra s d e IgG 1 y IgG 1 m o d if ic a d a c o n las p ro p ie d a d e s s u p e r io re s d e in te rn a liz a c ió n o s e ñ a liz a c ió n d e a n t ic u e rp o s q u e c o n t ie n e n re g io n e s C H 1 y b is a g ra de Ig G 2.
Equivalentes
L o s e x p e r to s en la té c n ic a re c o n o c e rá n , o s e rá n c a p a c e s d e d e te rm in a r , u s a n d o s im p le m e n te e x p e r im e n to s d e ru tin a , m u c h o s e q u iv a le n te s d e la s re a liz a c io n e s e s p e c íf ic a s d e s c r ita s e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
C O M P E N D IO D E L IS T A D O D E S E C U E N C IA S
Tabla 35.
Figure imgf000106_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000107_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000108_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000109_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000110_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000111_0001
( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000112_0001
( c o n t in u a c ió n )
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( c o n t in u a c ió n )
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( c o n t in u a c ió n )
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( c o n t in u a c ió n )
Figure imgf000116_0001
( c o n t in u a c ió n )
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E l lis ta d o d e s e c u e n c ia s p ro p o rc io n a la s s e c u e n c ia s d e la s re g io n e s v a r ia b le s m a d u ra s y la s c a d e n a s p e s a d a s y l ig e ra s (e s d e c ir , la s s e c u e n c ia s n o in c lu y e n p é p tid o s s e ñ a l) .

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. U n a n t ic u e rp o a is la d o q u e s e u n e a G ru p o d e D ife re n c ia c ió n 73 (C D 73 ) h u m a n o y q u e c o m p re n d e la s s e c u e n c ia s C D R 1 , C D R 2 y C D R 3 d e la c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e n la s S E Q ID N O : 5, 6 y 7, re s p e c t iv a m e n te , y las s e c u e n c ia s c D r 1, C D R 2 y C D R 3 d e la c a d e n a lig e ra q u e c o m p re n d e n la s S E Q ID N O : 13, 14 y 15, re s p e c t iv a m e n te , e n d o n d e e l a n t ic u e rp o c o m p re n d e u n a re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e u n a b is a g ra d e Ig G 2 y d o m in io C H 1 d e Ig G 2.
2. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e la re iv in d ic a c ió n 1, en e l q u e e l d o m in io b is a g ra c o m p re n d e s u s t itu c ió n d e a m in o á c id o s C 219 S , s e g ú n e l ín d ic e d e la U E d e l s is te m a d e K a b a t, en re la c ió n a un d o m in io b is a g ra d e Ig G 2 h u m a n a t ip o s ilv e s tre (S E Q ID N O : 136 ).
3. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 o 2, e n e l q u e la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e :
(a ) un d o m in io C H 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 124 ; y
(b ) un d o m in io b is a g ra q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 123.
4. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 3, en d o n d e e l a n t ic u e rp o c o m p re n d e u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta e n la S E Q ID N O : 135 y u n a re g ió n v a r ia b le d e la c a d e n a lig e ra q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta e n la S E Q ID N O : 12.
5. El a n t ic u e rp o a is la d o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 3, en d o n d e el a n t ic u e rp o c o m p re n d e u n a c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta e n la s S E Q ID N O : 133 o 189 y u n a c a d e n a lig e ra q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta e n la S E Q ID N O : 102.
6. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 3, e n e l q u e la s c a d e n a s p e s a d a s y lig e ra s so n c a d e n a s p e s a d a s y lig e ra s d e lo n g itu d c o m p le ta , re s p e c t iv a m e n te .
7. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e la re iv in d ic a c ió n 6, q u e e s un a n t ic u e rp o d e IgG .
8. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 3, en d o n d e el a n t ic u e rp o c o m p re n d e u n a c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en la S E Q ID N O : 133 y u n a c a d e n a lig e ra q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta e n la S E Q ID N O : 102.
9. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 3, en d o n d e el a n t ic u e rp o c o m p re n d e u n a c a d e n a p e s a d a q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en la S E Q ID N O : 189 y u n a c a d e n a lig e ra q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta e n la S E Q ID N O : 102.
10. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -9 q u e e s un a n t ic u e rp o h u m a n o y p re s e n ta u n a o m á s d e la s s ig u ie n te s p ro p ie d a d e s :
(a ) s e u n e a C D 73 h u m a n o c o n u n a K d d e 10 nM o m e n o s d e te rm in a d a p o r R e s o n a n c ia d e P la s m ó n S u p e r f ic ia l (S P R );
(b ) in h ib e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e C D 73 ;
(c ) in te rn a liz a C D 73 p o r in te rn a liz a c ió n d e C D 73 m e d ia d a p o r a n t ic u e rp o d e n tro d e c é lu la s , p o r e je m p lo , c é lu la s tu m o ra le s ; y
(d ) s e u n e a C D 73 h u m a n a co n u n a C E 50 d e 0,1 a 10 nM o m e n o s c o m o se m id e p o r F A C S .
11. E l a n t ic u e rp o a is la d o d e la re iv in d ic a c ió n 7, en e l q u e la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e a d e m á s un d o m in io C H 2 d e IgG 1 h u m a n a q u e c o m p re n d e la s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s A 330 S y P 331 S , s e g ú n e l ín d ic e d e la U E d e l s is te m a d e K a b a t, e n re la c ió n a un d o m in io C H 2 d e IgG 1 h u m a n a t ip o s ilv e s tre (S E Q ID N O : 137 ).
12. U n a c o m p o s ic ió n q u e c o m p re n d e e l a n t ic u e rp o d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -11 y un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le .
13. La c o m p o s ic ió n d e la re iv in d ic a c ió n 12, q u e c o m p re n d e a d e m á s u n o o m á s a g e n te s te ra p é u t ic o s a d ic io n a le s .
14. L a c o m p o s ic ió n d e la re iv in d ic a c ió n 13, e n la q u e e l a g e n te te ra p é u t ic o a d ic io n a l e s un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta d e la p ro te ín a 1 d e m u e r te c e lu la r p ro g ra m a d a (P D -1 ), un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta d e l lig a n d o 1 d e m u e r te p ro g ra m a d a (P D -L 1 ) , un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta d e la p ro te ín a 4 a s o c ia d a a lin fo c ito T c ito tó x ic a (C T L A -4 ) o un a n t ic u e rp o a n ta g o n is ta d e l g e n -3 d e a c t iv a c ió n d e lin fo c ito (L A G -3 ) .
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