CN113039201A - 具有经过工程化的Fc结构域的抗CD137结合分子及其治疗用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了CD137结合分子，所述CD137结合分子包括在铰链结构域中具有突变的经过工程化的人IgG结构域，例如人IgG1、IgG2和IgG4变体，所述经过工程化的人IgG结构域对一种或多种Fcγ受体表现出改变的结合活性。本文还描述了用于使用所述CD137结合分子选择性激活或抑制受试者的免疫应答的方法。

Description

具有经过工程化的Fc结构域的抗CD137结合分子及其治疗 用途

相关申请

本申请要求于2018年9月28日提交的国际专利申请第PCT/CN2018/0108284号的权益，所述国际专利申请通过引用整体并入本文。

背景技术

分化簇137(CD137)，也被称为4-1BB和TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9)，是抗原呈递细胞(APC)激活所需的APC共刺激蛋白。CD137是肿瘤坏死因子(TNF)-受体超家族的成员并且激活各种免疫感受态细胞(immune competent cel)，从而导致激活、细胞因子诱导、预防激活诱导的细胞死亡(AICD)、上调细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性以及增加的存活。CD137以高亲和力与其配体CD137L(4-1BBL)结合，其在抗原呈递细胞(如树突细胞、巨噬细胞和激活的B细胞)上表达。CD137主要发现于各种造血细胞上，如初免T细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、树突细胞和肥大细胞。已经显示，其激活逆转对肿瘤特异性抗原的耐受性，从而导致抗原特异性抗肿瘤免疫。

Fc受体(FcR)是能够与抗体的Fc部分结合的免疫细胞表面蛋白的家族。存在若干种不同类型的Fc受体，包含Fcγ受体、Fcα受体、Fcε受体和新生儿Fc受体(FcRn)，所述受体与IgG、IgA、IgE和IgG抗体分别有不同的结合活性。Fcγ受体亚家族包含FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIB(CD32c)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。FcγRI对IgG1抗体和IgG3抗体具有高结合亲和力，而其它FcγR与IgG抗体具有低结合亲和力。

不同类型的Fc受体在免疫系统中发挥不同的作用。例如，表达在NK细胞和巨噬细胞上的FcγRIII受体与附着于受感染细胞或入侵病原体的抗体结合并且触发免疫细胞的抗体介导的吞噬作用(ADCP)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，从而导致消除受感染细胞或入侵病原体。另一方面，表达在B细胞和树突细胞上的FcγRII受体可以在与IgG抗体结合时下调免疫细胞的活性。

涉及激活的免疫细胞的疗法是用于消除如癌细胞等患病细胞的有前景的方法。然而，这种治疗方法常常会引起安全问题。例如，过度激活的免疫细胞将会导致不期望的细胞毒性，从而造成组织损伤。因此，开发有效且安全的新免疫疗法具有重大意义。

发明内容

本公开至少部分地基于CD137结合分子(例如，CD137激动剂或CD137拮抗剂)的设计，其包括表现出所期望的Fc受体结合活性和/或选择性的经过工程化的(变体)Fc区(例如，IgG1、IgG2或IgG4分子的经过工程化的Fc区)，例如对FcγRIIB具有增强的结合亲和力和/或选择性或对一种或多种FcγR受体具有显著降低的结合亲和力。此类CD137结合分子可以用于调节需要治疗的受试者的免疫应答(例如，选择性增强或选择性抑制免疫应答)。

因此，本公开的一个方面提供了CD137结合分子(例如，CD137激动剂或CD137拮抗剂)，与野生型Fc区对应物相比，所述CD137结合分子包括CD137结合部分；以及抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区包括经过工程化的Fc区，其包括位置220-331中的任何一个位置处，例如位置228-329中的任何一个位置处的至少一个突变。编号系统是根据EU索引。

在一些实施例中，CD137结合部分是CD137L的胞外结构域，其可以包括SEQ ID NO:143的氨基酸序列。包括这种CD137结合部分的CD137结合分子可以是CD137激动剂。

在其它实施例中，CD137结合部分可以是抗CD137抗体片段。在一个实施例中，抗CD137抗体片段包括重链和轻链，所述重链包括与本文所述的任何经过工程化的Fc区连接的重链可变区，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。

在一些情况下，所述变体Fc区相对于野生型对应物可以对FcγRIIB具有增强的结合亲和力和/或选择性。在其它情况下，所述变体Fc区可以对一种或多种FcγR受体具有显著降低的结合亲和力。在一些实例中，所述变体Fc区对所有FcγR受体具有低结合活性或不具有结合活性。

在一些实施例中，CD137结合分子可以包括IgG1分子(例如，人IgG1分子)的变体Fc区，其可以包括包含以下中的一种或多种的突变：(a)位置233-238(例如，234-238)内的氨基酸取代或缺失；(b)位置265处的取代；(c)位置267处的取代；(d)位置297处的取代；(e)位置328处的取代、位置329处的取代；或其组合。可替代地或另外，IgG1分子的Fc变体可以包括位置220、226、229、238、273、327、330和/或331处的一个或多个突变。在一个实例中，突变包括位置233-236中的任何位置处的取代、位置236-238中的一个或多个位置处的缺失或其组合。例如，位置233-235处的取代可以包括E233P、L234V、L234F、L234A、L235A和/或L235E。在一个实例中，突变包括位置236-238中的一个或多个位置处的缺失。在另一个实例中，位置238处的取代可以是P238S，位置265处的取代可以是D265A或其组合。在又另一个实例中，所述取代位于位置267处并且是S267E。在另外的实例中，所述取代位于位置329处并且是P329G。在另外的实例中，所述突变可以包括位置265处的取代、位置297处的取代或其组合。例如，位置265处的所述取代可以是D265A，并且位置297处的所述取代可以是N297A。进一步地，位置220、226、229、327、330和331处的一个或多个取代可以是C220S、C226S、C229S、A327G、A330S和P331S。源自人IgG1的示例性变体Fc区可以是G1m1、G1m2、G1m17、G1m27、G1mAA、G1mAAG、G1N297A、G1m240和G1m40之一。

在其它实施例中，CD137结合分子可以包括IgG2分子(例如，人IgG2分子)的Fc区，其可以包括包含以下中的一种或多种的突变：(a)位置237和238中的一个或多个位置的缺失；(b)位置265处的取代；(b)位置267处的取代；(c)位置297处的取代；(d)位置328处的取代；或其组合。在一些实例中，所述缺失位于位置237处或位于位置237和238两者处。可替代地或另外，IgG2分子的Fc变体可以包括至少一个突变，所述至少一个突变包括位置233-235、237、238、268、273、330和331中的一个或多个位置处的取代。例如，位置233-235、237、238、268、273、330和331中的一个或多个位置处的所述取代可以是P233E、V234A、V234L、A235L、A235S、G237A、P238S、H268A、H268Q、V273E、A330S和P331S。在一个实例中，所述取代位于位置267处并且是S267E。在另一个实例中，所述取代位于位置328处并且是L328F。在另外的实例中，所述突变可以包括位置265处的取代、位置297处的取代或其组合。例如，位置265处的所述取代可以是D265A，并且位置297处的所述取代可以是N297A。在一些特定实例中，源自IgG2的变体Fc区可以是G2m1、G2m17、G2m18、G2m19、G2m20、G2m27、G2m28、G2m29、G2m2040、G2m43、G2G4、G2mAA和G2m40之一。

在又其它实施例中，CD137结合分子可以包括IgG4分子(例如，人IgG4分子)的Fc区，其可以包括(a)位置228处的氨基酸残基取代；(b)任何一个位置235-238处的取代或缺失；(c)位置265处的取代；(d)位置267处的取代；(e)位置297处的取代；(e)位置328处的取代；或其组合。在一个实例中，位置228处的取代是S228P。在另一个实例中，所述缺失位于位置236、237和238中的一个或多个位置处(例如，位于位置236和237两者处)。可替代地或另外，IgG4分子的Fc变体可以包括位置233-235、237和273中的一个或多个位置处的取代。例如，一个或多个位置233-235、237和273处的取代可以是E233P、F234V、F234A、L235S、L235E、L235A、G237A和V273E。在另一个实例中，位置267处的取代是S267E。在另外的实例中，位置328处的取代是L328F。在另外的实例中，所述突变可以包括位置228处的取代、位置265处的取代、位置297处的取代或其组合。例如，位置228处的所述取代可以是S228P，位置265处的所述取代可以是D265A并且位置297处的所述取代可以是N297A。在一些特定实例中，所述变体Fc区是G4m1、G4m2、G4m20、G4m28、G4m30、G4m41、G4m42、G4m46、G4mPE、G4mAA和G4m40之一。

与野生型Fc区相比，本文所述的变体Fc区中的任何变体Fc区可以对FcγRIIB表现出增强的结合活性和/或增强的选择性。可替代地，本文所述的变体Fc区可以对任何FcγR受体具有低结合活性或不具有结合活性。在一些情况下，变体Fc区可以对FcγRIIB表现出降低的结合亲和力。可替代地或另外，变体Fc区与FcRn结合。

本文所述的CD137结合分子中的任何CD137结合分子中的抗CD137抗体片段可以属于人抗体或人源化抗体。在一些实施例中，抗CD137抗体是激动剂抗体。在一些实例中，抗CD137抗体可以包括与SEQ ID NO:128中或与20A12D11、11E10D12、23D2D6、22F2C2、30C11B4和26B3D7中的任何一个中的重链互补决定区(HC CDR)相同的HC CDR和/或与SEQ ID NO:129中或与20A12D11、11E10D12、23D2D6、22F2C2、30C11B4和26B3D7中的任何一个中的轻链互补决定区(LC CDR)相同的LC CDR。在一个实例中，抗体片段可以包括SEQ ID NO:128的重链可变区和/或SEQ ID NO:129的轻链可变区。在其它实例中，抗体片段可以包括与20A12D11、11E10D12、23D2D6、22F2C2、30C11B4和26B3D7之一相同的重链可变区和/或相同的轻链可变区。

另外，本文提供了一种药物组合物，其包括本文所述的CD137结合分子中的任何CD137结合分子和药学上可接受的载体。此类药物组合物可以用于选择性调节(例如，选择性激活或选择性抑制)受试者的免疫应答。

在又另一方面，本公开提供了一种用于选择性调节(例如，选择性激活或选择性抑制)受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所述的CD137结合分子。

在本文所述的任何方法中，所述受试者可以是患有或疑似患有癌症的人类患者，并且所述CD137结合分子可以是CD137激动剂。示例性癌症包含肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肉瘤、骨癌、淋巴瘤和血液癌。

可替代地，所述受试者可以是患有或疑似患有免疫相关病症的人类患者，并且所述CD137结合分子可以是CD137拮抗剂。示例性免疫病症包含自身免疫性疾病、免疫缺陷或过敏症。在一些实施例中，用于治疗的靶疾病是自身免疫性疾病。

在又另一方面，本公开提供了一种分离的抗CD137抗体，其与选自由以下组成的组的参考抗体相同的CD137的表位结合：20A12D11、11E10D12、23D2D6、22F2C2、30C11B4和26B3D7，或者与所述参考抗体竞争与所述表位结合。

在一些实施例中，所述抗体包括重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3共同与所述参考抗体的相应重链CDR至少85％相同；和/或其中所述抗体包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3共同与所述参考抗体的相应轻链CDR至少85％相同。

在另一个实施例中，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3相对于参考抗体的相应重链CDR共同包括10个或更少氨基酸突变；和/或其中轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3相对于参考抗体的相应轻链CDR共同包括10个或更少氨基酸突变。

在一个实施例中，所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区与所述参考抗体的重链可变区至少85％相同；和/或轻链可变区，所述轻链可变区与所述参考抗体的轻链可变区至少85％相同。

在一些实施例中，重链可变区相对于参考抗体的重链可变区包括10个或更少氨基酸残基突变；和/或并且相对于参考抗体的轻链可变区包括10个或更少氨基酸突变的轻链可变区。

在一些实例中，本文公开的抗CD137抗体可以与所述参考抗体包括相同的重链可变区CDR和/或与所述参考抗体包括相同的轻链可变区CDR。

本文所述的任何抗CD137抗体可以是人抗体或人源化抗体。本文还提供了一种药物组合物，其包括本文所述的任何抗CD137抗体和药学上可接受的载体。

进一步地，本公开的特征在于一种分离的核酸或核酸组，其编码或共同编码本文所述的任何CD137结合分子或任何抗CD137抗体。所述核酸或核酸组可以位于一个或两个载体，例如表达载体上。本文还提供了包括一种或多种此类载体的宿主细胞。

本公开的特征还在于包括一种或多种本文所述的CD137结合分子和/或一种或多种本文公开的抗CD137抗体的药物组合物用于治疗本文所述的靶病症，或此类CD137结合分子和/或抗CD137抗体在制造用于治疗靶病症的药物中的用途。

在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点将根据以下附图和对若干个实施例的详细描述并且还根据所附权利要求书变得显而易见。

附图说明

图1A-1W是示出了如所指示的各种IgG变体在如所指示的不同浓度下与CHO-K1细胞上表达的不同类型的Fcγ受体的结合活性的图表。在图1A-1C、1E-1J、1L-1M、1P-1R和1T-1V中，每种IgG变体的浓度从左到右为0μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml和10μg/ml。对于图1D、1K、1O、1S和1W，条从左到右对应于IgG变体的以下浓度：0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml和10μg/ml。图1A-1D：与FcγRI的结合活性。图1E-1G：与FcγRIIA(H131)的结合活性。图1H-1K：与FcγRIIA(R131)的结合活性。图1L-1O：与FcγRIIB的结合活性。图1P-1S：与FcγRIIC的结合活性。图1T-1W：与FcγRIII的结合活性。

图2A-2C是示出了通过IFN-γ分泌指示的，由许多IgG变体在与亲本或FcγR表达性细胞共培养的情况下对人CD8⁺T细胞的刺激的图表。在图2A中，组从左到右对应于：无OKT、0.01μg/ml、0.03μg/ml、0.1μg/ml和0.3μg/ml。在图2B和2C中，组从左到右对应于0.01μg/ml、0.03μg/ml和0.1μg/ml。图2A：G2m2。图2B：如所指示的各种Fc变体。图2C：如所指示的另外的Fc变体。

图3A-3D是示出了如所指示的各种IgG变体在所指示的不同浓度下与CHO-K1细胞上表达的不同类型的Fcγ受体的结合活性的图表。每种IgG变体的浓度从左到右为0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml和30μg/ml。(图3A：与FcγRI的结合活性。图3B：与FcγRIIA的结合活性。图3C：与FcγRIIB的结合活性。图3D：与FcγRIIIA的结合活性。

图4示出了在报告基因测定中，由所指示的IgG变体对人CD137激活的刺激的图表。每种IgG变体的浓度从左到右为0.01μg/ml、0.03μg/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml和10μg/ml。

具体实施方式

本文提供了CD137结合分子(例如，CD137激动剂或CD137拮抗剂)，其包括CD137结合部分(例如，CD137配体的胞外结构域或抗CD137抗体片段)和经过工程化的(变体)Fc区，其可以对一种或多种Fc受体具有改变的结合亲和力和/或特异性，例如对FcγRIIB具有增强的结合亲和力、对FcγRIIB具有增强的结合特异性或对一种或多种FcγR具有显著降低的结合亲和力(例如，对所有FcγR受体具有低结合活性或不具有结合活性)。

预期此类CD137结合分子会表现出出乎意料的优越治疗活性。例如，预期具有对FcγRIIB具有增强的结合亲和力的变体Fc区的CD137结合分子将表现出增强的激动活性，并且预期具有对FcγRIIB具有增强的结合特异性的变体Fc区的CD137结合分子相对于野生型对应物将表现出更高的肿瘤选择性。进一步地，对FcγR受体具有低结合亲和力或不具有结合亲和力的CD137结合分子将有助于激活肿瘤微环境中的CD137阳性免疫细胞和/或阻断免疫病症中的CD137阳性免疫细胞。

因此，本文描述了用于设计CD137结合分子的方法，所述CD137结合分子包括CD137结合部分和经过工程化的Fc区(Fc变体)，所述经过工程化的Fc区可以是IgG分子(例如，IgG1、IgG2和IgG4分子，如人IgG1、人IgG2和人IgG4分子)，以及其用于调节免疫应答的用途。这种Fc变体相对于野生型对应物可以对FcγRIIB(CD32B)具有增强的结合亲和力和/或相对于其它Fc受体，如FcγRIII(CD16)具有增强的结合选择性。可替代地，这种Fc变体相对于野生型对应物可以对一种或多种FcγR受体(例如，对所有FcγR受体)具有显著降低的结合亲和力。“显著降低”意指Fc变体对FcγR受体的结合亲和力比野生型对应物与同一FcγR受体的结合亲和力低至少60％(例如，低70％、低80％、低90％、低95％、低98％或低99％)。在一些实例中，Fc变体可以对所有FcγR受体具有低结合亲和力或不具有结合亲和力，即结合亲和力不能通过常规测定来检测或结合亲和力是显著低的，这样使得将不触发显著的生物活性。

I.CD137结合分子

本文描述了CD137结合分子，其包括与经过工程化的Fc区连接的CD137结合部分，所述经过工程化的Fc区对如本文所述的一种或多种Fc受体具有改变的结合亲和力和/或特异性。此类CD137结合分子可以是CD137激动剂，其能够在与细胞表面CD137结合时触发由CD137/CD137L介导的信号传导。可替代地，本文所述的CD137结合分子是CD137拮抗剂，其能够在与细胞表面CD137结合时抑制由CD137/CD137L介导的信号传导。当向需要治疗的受试者施用时，CD137结合分子可用于调节(选择性调节)免疫应答。

(i)CD137结合部分

本文所述的CD137结合部分可以是与CD137，例如人CD137结合的任何肽或多肽。CD137是本领域熟知的免疫细胞受体。例如，NCBI GenBank登录号NP_001552.2和NP_001070977分别提供了人和小鼠CD137的信息。下面提供了示例性人CD137多肽的氨基酸序列。

人CD137：

MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:142)

来自其它物种的CD137多肽是本领域已知的，并且可以使用人类序列或小鼠序列作为查询从公开可获得的基因数据库，例如GenBank获得。

在一些实施例中，CD137结合部分可以是包括CD137配体(CD137L或4-1BBL)的胞外结构域的多肽。CD137L是一种膜糖蛋白表达的抗原呈递细胞(APC)，即激活的B和T细胞。已经显示，分子通过其与其受体的相互作用在T细胞增殖和细胞因子产生中起作用。另外，CD137L可以驱动单核细胞向树突细胞分化。CD137L的序列和其胞外结构域是本领域熟知的。例如，NCBI GenBank登录号NP_003802.1(胞外结构域，氨基酸50-254)提供了人CD137L的信息。下面提供了示例性人CD137L的胞外结构域的氨基酸序列。

人CD137L(胞外结构域)：

ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO:143)

来自其它物种的CD137L多肽是本领域已知的，并且可以使用人序列作为查询从公开可获得的基因数据库，例如GenBank获得。

在其它实施例中，本文所述的CD137L结合部分可以包括抗CD137L抗体。如本文所使用的，术语“抗CD137抗体”是指能够与CD137多肽结合的任何抗体，其可以具有合适的来源，例如人或非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、灵长类动物，如猴等)。

本文所述的抗CD137抗体包括重链和任选地轻链，所述重链包括与本文所述的任何Fc变体连接的重链可变结构域，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。重链可变区(V_H)和任选地轻链可变区(V_L)通常参与抗原(在这种情况下是CD137)结合。

V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更保守的被称为“框架区”(“FR”)的区。每个V_H和V_L通常由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义来精确地鉴定，所有所述定义均是本领域熟知的。参见例如，Kabat,E.A.等人,(1991)《免疫学上关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242；Chothia等人,(1989)《自然(Nature)》342:877；Chothia,C.等人(1987),《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917；Al-lazikani等人,(1997)《分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)》273:927-948；和Almagro,《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体可以结合并抑制CD137的活性至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更高，包含其中的任何增量)。提供抑制剂效力的量度的表观抑制常数(Kiapp或Ki,app)与降低酶活性所需的抑制剂浓度相关并且不依赖于酶浓度。本文所述的抗CD137抗体的抑制活性可以通过本领域已知的常规方法确定。

抗体的K_i, ^app值可以通过测量不同浓度的抗体对反应程度(例如，酶活性)的抑制作用来确定；将作为抑制剂浓度的函数的伪一阶速率常数(v)的变化拟合到修正的莫里森等式(Morrison equation)(等式1)得到表观Ki值的估计值。对于竞争性抑制剂，可以根据从K_i, ^app与底物浓度的绘图的线性回归分析中提取的y截距获得Ki^app。

其中A等于v_o/E，在抑制剂(I)不存在的情况下酶反应的初始速度(v_o)除以总酶浓度(E)。

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体对于靶抗原或抗原表位的Ki^app值可以为1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5pM或更小。在一些实施例中，任何抗CD137抗体可以进一步亲和力成熟以减少抗体对靶抗原或其抗原表位的Ki^app。

在一些情况下，抗CD137抗体可以将CD137/CD137L相互作用触发的信号传导抑制至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更高，包含其中的任何增量)。这种抑制活性可以通过常规方法或本文所述的测定来确定。

本文所述的抗体可以是鼠、大鼠、人类或任何其它来源(包含嵌合抗体或人源化抗体)。此类抗体是非天然存在的，即在没有人类行为(例如，用所期望的抗原或其片段免疫此类动物或从抗体文库中分离)的情况下将不会在动物中产生。

在一些实施例中，抗CD137抗体是人源化抗体，其可以具有下文或本文其它地方所述的一种或多种要素或特性。人源化抗体是指为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的抗原结合片段的非人(例如，鼠)抗体的形式。通常，人源化抗体是来自接受者的CDR的残基被来自如小鼠、大鼠或兔等具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括既未在接受者抗体中发现也未在导入的CDR或框架序列中发现但被包含在内以进一步精化和优化抗体性能的残基。在一些情况下，人源化抗体可以包括至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。抗体可以具有如WO 99/58572中所描述的修饰的Fc区。其它形式的人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，也称为“源自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗体还可以涉及亲和力成熟。

用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如Queen等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的V_H和V_L可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本V_H和V_L序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人V_H链和人V_L链。然后选择人V_H受体基因和人V_L受体基因。

可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基来取代人受体基因中的对应残基。

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体与对应的靶抗原或其表位，例如CD137抗原或表位特异性结合。与抗原或表位“特异性结合”的抗体是本领域充分理解的术语。如果分子与特定靶抗原比其与替代性靶标更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应，则所述分子被称为表现出“特异性结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶抗原或表位“特异性结合”。例如，与抗原(CD137)或其中的抗原表位特异性(或优先地)结合的抗体是这样的抗体：所述抗体与这种靶抗原比其与其它抗原或同一抗原中的其它表位亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合。利用这个定义还应理解，例如，与第一靶抗原特异性结合的抗体可以或可以不与第二靶抗原特异性结合或优先地结合。如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他结合。在一些实例中，与靶抗原或其表位“特异性结合”的抗体可以不与其它抗原或同一抗原中的其它表位结合(即，在常规方法中仅可以检测基线结合活性)。在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体与CD137特异性结合。可替代地/另外，相对于小鼠对应物，本文所述的抗CD137抗体与人CD137或其片段特异性结合，或反之亦然(例如，如在相同的测定条件下的同一测定中确定的，对一种抗原的结合亲和力比对另一种抗原的结合亲和力高至少10倍)。在其它情况下，本文所述的抗CD137抗体可以与人和非人CD137(例如，小鼠)交叉反应，例如对人和非人CD137的结合亲和力差异小于5倍，例如小于2倍，或基本上类似。

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体对靶抗原(例如，CD137)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所使用的，“结合亲和力”是指表观缔合常数或K_A。K_A是解离常数(K_D)的倒数。本文所述的抗CD137抗体对于靶抗原或抗原表位的结合亲和力(K_D)可以为至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10M或更低。增大的结合亲和力对应于减小的K_D。抗体相对于第二抗原对第一抗原的更高亲和力结合可以通过比用于结合第二抗原的K_A(或数值K_D)更高的用于结合第一抗原的K_A(或更小的数值K_D)来指示。在这种情况下，所述抗体相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同的第一蛋白质；或第二蛋白质)对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白质)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其它比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或10⁵倍。在一些实施例中，任何抗CD137抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。

可以通过各种方法来确定结合亲和力(或结合特异性)，包含平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件为处于HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于根据靶蛋白浓度测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合(Bound)])通常通过以下等式与游离靶蛋白([游离(Free)])的浓度相关：

[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])

然而，并不总是需要对K_A进行精确测定，因为有时例如通过功能性测定，例如体外或体内测定中的活性足以获得对亲和力的定量测量、获得对亲和力的定性测量或者获得对亲和力的推断，所述亲和力例如是使用如ELISA或FACS分析等方法确定的、与K_A成正比并且因此可以用于比较，如确定更高的亲和力是否例如高2倍。

下文提供了示例抗CD137抗体173(V_H和V_L氨基酸序列；CDR以粗体字表示)：V_H：

V_L：

下文提供了另外的示例性抗CD137抗体(CDR以粗体字表示)。

20A12D11

V_H：

V_L：

11E10D12

V_H：

V_L：

23D2D6

V_H：

V_L：

22F2C2

V_H：

V_L：

30C11B4

V_H：

V_L：

26B3D7

V_H：

V_L：

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体和本文所述的任何示例性抗体与同一表位结合，或者和示例性抗体竞争与CD137抗原的结合。

“表位”是指靶抗原上被抗体识别并结合的位点。位点可以完全由氨基酸组分构成、完全由蛋白质的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)构成或由其组合构成。重叠表位包含至少一个共同的氨基酸残基。表位可以是线性的，其长度通常为6-15个氨基酸。可替代地，表位可以是构象的。可以通过常规技术，例如表位作图方法(参见例如以下描述)来确定抗体与其结合的表位。和本文所述的示例性抗体与同一表位结合的抗体可以和示例性抗体与同一表位或基本上重叠的表位(例如，含有少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基或仅1个非重叠氨基酸残基)完全结合。可以通过本领域熟知的竞争测定来确定两种抗体是否彼此竞争与同源抗原结合。

在一些实施例中，本文公开的抗CD137抗体包括与以下序列中的重链和轻链CDR相同的重链和轻链CDR：(a)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129；(b)SEQ ID NO:130和SEQ IDNO:131(20A12D11)；(c)SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133(11E10D12)；(d)SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135(23D2D6)；(e)SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137(22F2C2)；(f)SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139(30C11B4)或者SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141(26B3D7)。在一些实例中，抗CD137抗体包括SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140的重链可变结构域和/或SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139或SEQ IDNO:141的轻链可变结构域。

本文公开的示例性抗CD137抗体中的任何一种的功能变体也在本公开的范围内。此类功能变体在结构和功能两者上基本上类似于示例性抗CD137抗体中的任何一种。功能变体包括与示例性抗CD137抗体中的任何一种基本上相同的V_H和V_L CDR。例如，其可以在抗体的总CDR区(共同地)中仅包括至多10个(例如，10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸残基变异，并且以基本上类似的亲和力与CD137的相同表位(例如，具有相同顺序的K_D值)结合。可替代地或另外，氨基酸残基变异是保守氨基酸残基取代。如本文所使用的，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特性的氨基酸取代。可以根据用于改变本领域的普通技术人员已知的多肽序列的方法来制备变体，所述方法如编制这种方法的参考文献中发现的，所述参考文献例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,J.Sambrook等人编辑,第二版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1989或《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,F.M.Ausubel等人编辑,约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约。氨基酸的保守取代包含在以下组中的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体可以包括重链CDR，其组合(共同地)与以下序列中的重链CDR具有至少80％(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和其中的任何增量百分比)序列同一性：SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140。可替代地或另外，抗CD137抗体可以包括轻链CDR，其共同地与以下序列中的轻链CDR具有至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和其中的任何增量百分比)序列同一性：SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139或SEQ IDNO:141。

在一些实施例中，本文所述的抗CD137抗体可以包括重链可变结构域和/或轻链可变结构域，所述重链可变结构域与SEQ ID NO:128、130、132、134、136、138或140至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和其中的任何增量百分比)相同，所述轻链可变结构域与SEQ ID NO:129、131、133、135、137、139或141至少80％(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和其中的任何增量百分比)相同。

使用Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》,87:2264-68,1990的算法来确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”，所述算法如Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》,90:5873-77,1993中那样进行修改。此类算法并入Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)来执行BLAST蛋白质检索以获得与所关注蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以利用如Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,25(17):3389-3402,1997中描述的带空位BLAST(Gapped BLAST)。当利用BLAST程序和带空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。

(ii)经过工程化的Fc区

本文所述的CD137结合分子包括经修饰的重链恒定区，其中Fc结构域被修饰以调节其对如FcγR等Fc受体的结合亲和力和/或特异性。

在一些实施例中，相对于其野生型对应物，本文所述的CD137结合分子中的Fc变体对FcγRIIB具有增强的选择性。对FcγRIIB具有选择性、与FcγRIIB选择性结合或与FcγRIIB特异性结合的Fc片段是本领域中充分理解的术语。如果分子与特定靶抗原(例如，FcγRIIB受体)比其与替代性靶标(例如，FcγRIII受体)更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应，则称分子表现出“选择性结合”或“特异性结合”。如果Fc片段比其与其它Fc受体亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则Fc片段与Fc受体“特异性结合”。例如，与FcγRIIB特异性(或优先地)结合的Fc片段是这样的Fc片段：所述Fc片段与这种Fc受体比与其它Fc受体亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合。利用这个定义还应理解，例如，与第一Fc受体选择性或特异性结合的Fc片段可以与或可以不与第二Fc受体特异性或优先地结合。如此，“选择性结合”、“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他结合。在一些实例中，与靶Fc受体(例如，FcγRIIB)“选择性结合”或“特异性结合”的Fc片段可能不与其它Fc受体结合(即，无法通过常规方法检测到的结合)。在其它实施例中，变体Fc片段不与任何FcγR结合。

下表1中给出了IgG1、IgG2和IgG4与不同Fc受体的相对结合亲和力。

表1.人和小鼠免疫球蛋白与Fc受体的相对结合亲和力

本文所述的Fc变体相对于其野生型对应物(引入突变以产生Fc变体的野生型亲本Fc区)可以对FcγRIIB具有增强的选择性。这种Fc变体对FcγRIIB相对于其对另一种Fc受体(例如，FcγRIII)的相对结合活性高于野生型对应物对FcγRIIB相对于其对其它Fc受体(例如，FcγRIII)的相对结合活性。Fc变体可以对FcγRIIB具有增强的结合活性和/或与另一种Fc受体(例如，FcγRIII)具有降低的结合活性。在一些实施例中，本文所述的Fc变体可以对FcγRIIB和另一种Fc受体(例如，FcγRIII)两者均具有降低的结合活性；然而，对其它Fc受体(例如，FcγRIII)的降低的结合活性的水平大于对FcγRIIB的降低的结合活性的水平。

在一些实施例中，本文所述的Fc变体对于FcγRIIB具有合适的结合亲和力，例如相比于Fc变体源自的野生型亲本Fc增强的结合亲和力。如本文所使用的，“结合亲和力”是指表观缔合常数或K_A。K_A是解离常数(K_D)的倒数。本文所述的Fc变体对于FcγRIIB的结合亲和力(K_D)可以为至少10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10M或更低。增大的结合亲和力对应于减小的K_D。Fc片段对第一Fc受体的亲和力结合相对于其对第二Fc受体更高可以通过用于结合第一Fc受体的K_A(或数值K_D)比用于结合第二Fc受体的K_A(或数值K_D)更高(或更小)来指示。在这种情况下，Fc变体相对于第二Fc受体对第一Fc受体具有特异性。在一些实施例中，与对FcγRIII(FcγRIIIA或FcγRIIIB)的结合亲和力相比，本文所述的Fc变体对FcγRIIB具有更高的结合亲和力(更高的K_A或更小的K_D)。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其它比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、91倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或10⁵倍。

在一些实施例中，可以根据对应的小鼠IgG，例如小鼠IgG1中的氨基酸残基，通过使野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc片段中的一个或多个氨基酸残基发生突变来设计本文所述的Fc变体。下文提供了人和小鼠IgG(分别为hIgG和mIgG)的序列比较(SEQ ID NO:60-64，从上到下，各自表示对应Fc区的片段211-245、260-278和320-332的组合)：

下文提供了野生型鼠IgG1和IgG2 Fc片段以及具有降低的FcγR结合的示例性Fc变体的氨基酸序列：

野生型小鼠IgG1 Fc片段的氨基酸序列：

VDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:144)

野生型小鼠IgG2a Fc片段的氨基酸序列：

VDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:145)

突变小鼠IgG1mDANA Fc片段的氨基酸序列：

VDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO:146)

突变小鼠IgG2a1mDANA Fc片段的氨基酸序列：

VDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYASTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:147)

在一些实施例中，本文所述的Fc变体是包括Fc片段的铰链结构域中的一个或多个突变(例如，氨基酸取代、缺失或添加)的人IgG1、G2或G4 Fc变体。人IgG在铰链结构域中含有核心基序CPPC或CPSC(根据EU索引，位置226-229)。位置216到225被视为铰链结构域的上部，并且位置230-238被视为铰链结构域的下部。除非明确指示，否则本文所使用的编号系统是根据EU索引。在一些实例中，所述一个或多个突变可以位于铰链结构域的上部。可替代地或另外，所述一个或多个突变可以位于铰链结构域的下部。在一些实施例中，本文公开的任何抗CD137分子的Fc区可以包括位置220-331的任何位置处，优选地在位置228-329的任何位置处的至少一个突变。与其天然对应物相比，此类Fc变体可以对Fc受体(例如，FcγIIB、FcγRI、FcγRIIA或FcγRIIIA)中的一种或多种具有改变的结合亲和力和/或特异性。

可以根据小鼠IgG1的铰链结构域中的对应的氨基酸残基进行人IgG Fc的突变。例如，小鼠IgG1在位置236-238处不含有GGP基序。因此，这个GGP基序中的残基中的一个或多个残基可以从人IgG1、IgG2或IgG4 Fc片段中缺失以产生本文所述的Fc变体。

可替代地或另外，人Fc变体可以在铰链结构域的上部、下部或两者中含有一个或多个氨基酸取代。例如，Fc变体可以包括位置233、234、235和/或236中的一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代。这种氨基酸取代可以与本文所提到的GGP基序(236-238)中的一个或多个GGP基序的缺失组合。可以将这些突变引入到人IgG2或IgG4 Fc片段中以产生本文所述的Fc变体。在一些实例中，本文所述的Fc变体在位置236-238中的一个或多个位置(例如，236、237、238或其任何组合)处含有缺失。

本文所述的铰链结构域中的突变中的任何突变可以与参与与Fc受体相互作用的一个或多个位置处的突变(例如，氨基酸取代)组合。这种位置包含但不限于位置265、267、273、297和327-331或其组合。在那些位置处的示例性氨基酸取代包含D265A、S261E、V271E、N297A、L328F、P329G、A330S和/或P331S。

在一些实施例中，本文公开的Fc变体可以源自IgG1分子(例如，人IgG1)并且在位置220、226、229、234-238、265、267、297和327-331中的一个或多个位置处的位置处含有一个或多个突变。例如，Fc变体可以包括位置234-238内的取代或缺失、位置265处的取代(例如，D265A)、位置267处的取代(例如，S267E)、位置297处的取代(例如，N297A)、位置328处的取代(例如，L328F)、位置329处的取代(例如，P329G)或其组合。可替代地或另外，Fc变体可以包括在位置220(例如，C220S)、226(例如，C226S)、229(例如，C229S)、327(例如，A327G)、330(例如，A330S)和331(例如，P331S)中的一个或多个位置处的取代。在一些情况下，源自IgG1分子的Fc变体可以包括位置236-238中的一个或多个位置处的缺失。

在一些实施例中，本文公开的Fc变体可以源自IgG2分子(例如，人IgG2)并且在位置233-235、237-238、265-268、273、297、328、330和331中的一个或多个位置处含有一个或多个突变。在一些实例中，这种Fc变体可以包括位置237-238内的缺失(例如，位置237处的缺失或位置237和238两者的缺失)、位置265处的取代(例如，D265A)、位置267处的取代(例如，S267E)、位置297处的取代(例如，N297A)、位置328处的取代(例如，L328F)或其组合。可替代地或另外，源自IgG2分子的Fc变体可以包括在位置233-235、237、238、268、273、330和331(例如，P233E、V234A、V234L、A235L、A235S、G237A、P238S、H268A、H268Q、V273E、A330S和P331S)中的一个或多个位置处的取代。

在又其它实施例中，本文公开的Fc变体可以源自IgG4分子(例如，人IgG4)，并且在位置228、233-238、265、267、273、297和328中的一个或多个位置处含有一个或多个突变。在一些实例中，这种Fc变体可以包括位置228处的取代(例如，S228P)、位置235-238中的任何位置处的取代或缺失(例如，位置236-238之一(例如，位置236和位置237)处的缺失)、位置265处的取代(例如，D265A)、位置267处的取代(例如，S267E)、位置273处的取代(例如，V273E)、位置297处的取代(例如，N297A)、位置328处的取代(例如，L328F)或其组合。可替代地或另外，Fc变体可以包括位置233-235和237(例如，E233P、F234V、F234A、L235S、L235E、L235A和G237A)中的一个或多个位置处的取代。

源自在位置265、267、273、297、328和/或329处含有一个或多个突变的IgG2或IgG4分子的Fc变体也在本公开的范围内。此类突变可以包含这些位置，例如D265A、S261E、V271E、N297A、L328F和/或P329G中的一个或多个位置处的氨基酸取代。

在一些情况下，本文公开的任何Fc变体可以进一步包括位置309处的突变，例如取代(例如，V309L)。这种Fc变体可以源自IgG2分子(例如，人IgG2)。在一些实施例中，位置309处的突变可以与位置234、268、330和331中的一个或多个位置处的突变组合。此类Fc变体的实例包含G2m43。

在一些实施例中，本文所述的Fc变体可以包括与其野生型对应物的氨基酸序列至少85％相同(例如，90％、95％、98％、99％或更高)的氨基酸序列(例如，本文所述的野生型人IgG1、IgG2或IgG4的Fc片段)。

在一个实例中，本文所述的Fc变体中的氨基酸残基取代是保守氨基酸残基取代。

下文提供了示出示例性位置的序列比对，在所述示例性位置中，可以将突变引入到hIgG1、hIgG2和IgG4中以产生本公开的各种Fc变体。

人IgG1变体相对于野生型人IgG1的序列比对(SEQ ID No:70-88和161-166，从上到下)：

人IgG2变体相对于野生型人IgG2的序列比对(SEQ ID NO:89-105和167-171，从上到下)：

人IgG4变体相对于野生型人IgG4的序列比对(SEQ ID NO:65、106-127和172-175，从上到下)

下文提供了野生型人IgG1、IgG2和IgG4 Fc片段的氨基酸序列以及许多示例性hIgG1、hIgG2和hIgG4 Fc变体(基于EU编号，位置221及以后的位置)：

野生型人IgG1 Fc片段的氨基酸序列：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)

野生型人IgG2 Fc片段的氨基酸序列：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)

野生型人IgG4 Fc片段的氨基酸序列：

VDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:3)

人IgG4 S228P Fc变体的氨基酸序列：

VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:4)

示例性人IgG1 Fc变体的氨基酸序列：

G1m1：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:5)

G1m2：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:6)

G1m-2：

VDKKVEPKCCVECPPCPAPELLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:7)

G1m-4：

VDKKVEPKYGPPCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:8)

G1m5：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEEKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:9)

G1m7：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:10)

G1m8：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:11)

G1m9：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:12)

G1m15：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEEKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:13)

G1m17：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:14)

G1m18：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:15)

G1m19：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:16)

G1m25：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEEKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)

G1m27：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)

G1m28：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:19)

G1m29：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:20)

G1mAA：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:21)

G1mAG：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:22)

G1m40：

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:148)

G1m45

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPpvaGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:66)

G1m240

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:67)

G1 N297A

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYaSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:68)

G1m47

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPpvaGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKgLPs s IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:69)

G1m48

VDKKVEPKSsDKTHTsPPsPAPELLGGsSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:176)

G1m49

VDKKVEPKSCDKTHTsPPsPAPpvaGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:177)

G1m50

VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEfeGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAsIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:178)

示例性人IgG2 Fc变体的氨基酸序列：

G2m1：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVASVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:23)

G2m-1：

VDKTVERKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)

G2m2：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:25)

G2m-4：

VDKTVERKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:26)

G2m5：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEEQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:27)

G2m7：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:28)

G2m8：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:29)

G2m9：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:30)

G2m10：

VDKTVERKCCVECPPCPAPEVSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:31)

G2m15：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVASVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEEQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:32)

G2m17：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVASVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:33)

G2m18：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVASVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:34)

G2m19：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVASVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:35)

G2m20：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:36)

G2m27：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:37)

G2m28：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:38)

G2m40：

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:149)

G2m43

VDKTVERKCCVECPPCPAPPaaasSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSaEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVlHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPssIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:179)

G2m44

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSqEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVlHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPssIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:180)

G2mAA

VDKTVERKCCVECPPCPAPPaaaPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:181)

G2m2040

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFASTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:182)

G2G4

VDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:183)

示例性人IgG4 Fc变体的氨基酸序列：

G4m1：

VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:39)

G4m-1：

VDKRVESKSCDKTHTPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:40)

G4m2：

VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:41)

G4m-2：

VDKRVESKCCVEPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:42)

G4m3：

VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEEQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:43)

G4m4：

VDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEEQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:44)

G4m5：

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G4mPE：

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G4m40：

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G4m46

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G4mAA

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与野生型对应物相比，本文所述的Fc变体可以对FcγRIIB表现出增强的结合活性。实例包含G2m2、G2m5、G2m7、G2m8、G2m9、G2m19、G2m44、G1m7、G1m9、G1m27、G1m45、G1m47、G1m49、G1m50、G4m7、G4m46和G4mPE。可替代地或另外，Fc变体与其野生型对应物相比可以与FcγRIIB具有增强的选择性，例如G2m1、G2m20、G2m43、G2m44、G2G4、G2mAA、G1m2、G1m15、G1m17、G1m18、G1m19、G1m27、G1m28、G1m29、G4m1、G4m2、G4m7、G4m8、G4m9、G4m20、G4m25、G4m27、G4m28、G4m30、G4m46和G4mPE。此类Fc变体可以保留与FcRn的结合活性。这些Fc变体可以用于构建能够使免疫受体和FcγRIIB受体交联的本文所述的治疗剂。

可替代地，如本文所述的某些Fc变体可以对FcγRIIB具有选择性和/或对任何FcγR具有明显的低结合活性或不具有结合活性。实例包含G1m2、G1m25、G1m40、G1mAAG、G1m240、G2m1、G2m20、G2m40、G2m2040、G4m5、G4m18、G4m19、G4m20、G4m30、G4m40、G4m41和G4m42。此类Fc变体可以保留与FcRn的结合活性。由于亲合力效应，含有此类Fc变体的治疗剂(例如，抗体)可能能够使免疫受体和FcγRIIB受体交联。

下表2-4中提供了示例性Fc变体与其野生型对应物相比的结合亲和力/特异性变化。“N/A”指示无可用数据。当发现Fc变体的结合活性与野生型对应物相比为“无变化”时，这意味着如在相同实验条件下通过同一测定指示的，Fc变体与野生型对应物之间的结合活性不存在显著变异。当Fc变体的结合活性相对于其野生型对应物“增大”或“减小”时，这意味着如在相同实验条件下通过同一测定确定的，Fc变体的结合活性高于或低于野生型对应物的结合活性，并且如本领域的技术人员已知的，变异是显著的(例如，生物学上显著的)。当Fc变体的结合活性相对于其野生型对应物“略微增大”或“略微减小”时，这意味着如在相同实验条件下通过同一测定确定的，Fc变体的结合活性高于或低于野生型对应物的结合活性，并且变异在统计学上是显著的但处于有限水平(例如，高达10％)。

表2.人IgG1突变体相对于野生型人IgG1的FcγR结合活性

进一步地，预期G1m40对FcγRI、FcγRIIA(H131)、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIII具有降低的结合活性或不具有明显的结合活性。

表3.人IgG2突变体相对于野生型人IgG2的FcγR结合活性

进一步地，预期G2m40对FcγRI、FcγRIIA(H131)、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIII具有降低的结合活性或不具有明显的结合活性。

表4.人IgG4突变体相对于野生型人IgG4的FcγR结合活性

进一步地，预期G4m40对FcγRI、FcγRIIA(H131)、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIII具有降低的结合活性或不具有明显的结合活性。

本文所述的Fc变体可以按照本文所提供的指导进行设计并且通过常规重组技术产生。Fc变体对各种Fc受体的结合亲和力和特异性可以通过常规方法来确定。还参见下面的实例。

除了本文所述的FACS结合测定之外，Fc变体对Fcγ受体的活性可以在替代性测定中进行检查。例如，可以使用在与FcγRIIB表达性细胞共培养或不与其共培养的情况下进行的CD137报告基因测定来证明受体交联和激活的效果。由于抗体与两个靶标(例如，CD137和FcγRIIB)同时结合产生的亲合力效应，所以此测定对检测FcγRIIB结合更敏感。可通过FACS检测到的最小或无明显结合可以在报告基因测定中显示阳性结果。

II.包括Fc变体的CD137结合分子的制备

本文所述的CD137结合分子可以通过常规方法，例如重组技术来制备。以下是一些实例。

对于包括CD137L的胞外结构域的CD137结合分子，CD137L胞外结构域的编码序列可以与合适的Fc变体的编码序列框内融合。可以将完整CD137结合分子的编码序列克隆到合适的表达载体中，可以将所述表达载体引入到合适的宿主细胞进行蛋白质表达。

可以通过本领域已知的任何方法制备与CD137结合的抗体。参见例如，Harlow和Lane,(1998),《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),纽约。在一些实施例中，可以通过常规杂交瘤技术制备对CD137或其胞外结构域具有特异性的抗体。可以使用任选地与如KLH等载体蛋白偶联的全长靶受体或片段来使宿主动物免疫，以生成与所述抗原结合的抗体。如本文进一步描述的，宿主动物的免疫途径和方案通常与用于抗体刺激和产生的已建立的和常规的技术保持一致。用于产生小鼠抗体、人源化抗体和人抗体的通用技术是本领域已知的并且在本文中进行描述。设想的是，可以操纵包含人类在内的任何哺乳动物受试者或来自其的产生抗体的细胞以充当用于产生哺乳动物(包含人)杂交瘤细胞系的基础。通常，对宿主动物腹膜内、肌肉内、口服、皮下、足底内和/或皮内接种一定量的免疫原，包含如本文所述的免疫原。

可以使用Kohler,B.和Milstein,C.(1975)《自然》256:495-497或如Buck,D.W.等人,《体外(In Vitro)》,18:377-381(1982)所修改的一般体细胞杂交技术由淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞来制备杂交瘤。可以在杂交中使用可用的骨髓瘤系，所述骨髓瘤系包含但不限于X63-Ag8.653和来自美国加利福尼亚州圣地亚哥索尔克研究所细胞分布中心(SalkInstitute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA)的那些骨髓瘤系。通常，所述技术涉及使用如聚乙二醇等融合剂或通过本领域的技术人员熟知的电气装置来融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合之后，将细胞从融合培养基中分离并且在如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基等选择性生长培养基中生长，以消除未杂交的亲本细胞。可以使用补充有或不含血清的本文所述的任何培养基培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一个替代性方案，可以使用EBV永生化B细胞来产生本文所述的抗免疫细胞受体单克隆抗体。使杂交瘤膨胀并在需要时进行亚克隆，并且通过常规免疫测定程序(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)来测定上清液的抗免疫原活性。

可以用作抗体的来源的杂交瘤涵盖所有衍生物、产生能够调节靶免疫细胞受体的活性的单克隆抗体的亲本杂交瘤的子代细胞。可以使用已知程序在体外或体内生长产生这种抗体的杂交瘤。在需要时，可以通过如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色谱法和超滤等常规免疫球蛋白纯化程序来从培养基或体液中分离单克隆抗体。可以例如通过在由附着于固相的免疫原制成的吸附剂上运行制剂并且从免疫原中洗脱或释放期望抗体来去除不期望的活性(如果存在的话)。用靶抗原或含有靶氨基酸序列的片段使宿主动物免疫可以产生抗体(例如，单克隆抗体)群，所述靶氨基酸序列使用双功能制剂或衍生化制剂(例如，马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基进行缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基进行缀合)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)来与在待免疫物种中产生免疫原性的蛋白质(例如，钥孔虫戚血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合。

如果需要，可以对所关注(例如，通过杂交瘤产生)抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)进行测序，并且然后将多核苷酸序列克隆到载体中，以供本文所述的抗CD137抗体的进一步构建。可以在载体中将对所关注抗体进行编码的序列维持在宿主细胞中并且然后可以使宿主细胞膨胀并冷冻以供将来使用。

在替代性方案中，多核苷酸序列可以用于基因操纵以使抗体“人源化”或改善亲和力(亲和力成熟)或抗体的其它特性。例如，如果将抗体用于人类的临床试验和治疗，则可以将恒定区工程化成更类似于人恒定区以避免免疫应答。可以期望对抗体序列进行基因操纵，以获得与靶抗原更大的亲和力和在抑制或激活免疫细胞受体的活性方面更大的功效。对本领域的技术人员而言将显而易见的是，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸改变，并且所述一种或多种多核苷酸改变仍维持其与靶受体的结合特异性。

在其它实施例中，可以通过使用已经被工程化以表达特异性人免疫球蛋白的可商购获得的小鼠来获得完全人抗体。被设计成产生更期望的(例如，完全人抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可以用于生成人源化抗体或人抗体。这种技术的实例为来自安进公司(Amgen,Inc.)(弗里蒙特，加利福尼亚州)的Xenomouse^RTM以及来自Medarex公司(普林斯顿，新泽西州)的HuMAb-Mouse^RTM和TC MouseTM。在另一个替代性方案中，可以通过噬菌体展示或酵母技术重组地制备抗体。参见例如美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；和第6,265,150号；以及Winter等人,(1994)《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》12:433-455。

可替代地，可以将如噬菌体展示技术(McCafferty等人,(1990)《自然》348:552-553)、酵母展示技术或哺乳动物细胞展示技术等抗体文库技术用于如对靶免疫受体具有特异性的人抗体等分离的抗体。

用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如Queen等人,《美国国家科学院院刊》,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的V_H和V_L可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴定具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH链和人VL链。然后选择人VH受体基因和人VL受体基因。

可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基(参见以上描述)来取代人受体基因中的对应残基。

一旦获得能够与靶免疫细胞受体结合的抗体，其重链的编码序列可以与合适的Fc变体的编码序列框内融合，其可以通过常规重组技术与FcγRIIB选择性结合或不与任何FcγR结合，例如本文所述的任何Fc变体。在一些情况下，首先研究抗体用于激活其所结合的免疫细胞受体的激动作用。可以选择这种激动抗体用于制备本文所述的CD137结合分子以增强激动作用。

在其它情况下，首先研究抗体用于抑制其所结合的免疫细胞受体的拮抗作用。可以选择这种拮抗抗体用于制备本文所述的CD137结合分子以下调免疫应答。可替代地，可以选择对任何Fc受体具有低结合活性或不具有结合活性的Fc变体用于制备CD137拮抗剂。

本文所述的所得抗体分子或CD137结合分子可以通过如下所例示的常规重组技术产生。可以将对本文所述的CD137结合分子的抗体或多肽的重链和轻链进行编码的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与合适的启动子可操作地连接。在一个实例中，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列中的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可替代地，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者均从同一启动子表达。在必要时，可以在对重链和轻链进行编码的序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。

在一些实例中，将对抗体的两条链进行编码的核苷酸序列克隆到两个载体中，所述载体可以被引入到相同或不同的细胞中。当在不同的细胞中表达这两条链时，其中的每条链均可以从表达这种链的宿主细胞中分离，并且分离的重链和轻链可以混合并在允许形成抗体的合适条件下温育。

通常，可以使用本领域已知的方法将对抗体的一条或所有链进行编码的核酸序列克隆到合适的表达载体中、与合适的启动子可操作地连接。例如，可以在合适条件下使核苷酸序列和载体与限制酶相接触，以在每个分子上产生可以彼此配对并且用连接酶连接在一起的互补端。可替代地，可以将合成核酸连接子与基因的末端连接。这些合成连接子含有对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。

可以使用各种启动子来表达本文所述的抗体，所述启动子包含但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR等病毒LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌(E.coli)lac UV5启动子和单纯性疱疹tk病毒启动子。

还可以使用可调节的启动子。这些可调节的启动子包含使用来自大肠杆菌的lac阻遏物作为转录调节剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节的那些启动子[Brown,M.等人,《细胞(Cell)》,49:603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetR)的那些启动子[Gossen,M.和Bujard,H.,《美国国家科学院院刊》89:5547-5551(1992)；Yao,F.等人,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》,9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995)]。其它系统包含FK506二聚体、使用雌二醇(astradiol)的VP16或p65、RU486、二元酚米乐甾酮(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导型系统可从英杰公司(Invitrogen)、克隆技术公司(Clontech)和阿瑞雅德公司(Ariad)获得。

可以使用包含具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施例中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以用作转录调节剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节[M.Brown等人,《细胞》,49:603-612(1987)]；Gossen和Bujard(1992)；[M.Gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)]，所述携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合，以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，携带有tetO的哺乳动物启动子源自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子以用于产生tetR-tet操纵基因系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施例中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵基因适当地定位在CMVIE启动子的TATA元件下游时，四环素阻遏物(tetR)而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以单独用作强效反式调节剂来调节哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人,《人类基因疗法》)。这个四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调节作用，在一些情况下，所述四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白可能对细胞有毒(Gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)；Shockett等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995))。

另外，载体可以含有例如以下中的一些或全部：可选标志基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的游离型复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)、通用多克隆位点；以及用于正义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适的载体和方法是本领域熟知并且可获得的。

可用于实践本文所述的方法的聚腺苷酸化信号的实例包含但不限于人胶原I聚腺苷酸化信号、人胶原II聚腺苷酸化信号和SV40聚腺苷酸化信号。

可以将包括对抗体中的任何抗体进行编码的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)引入到合适的宿主细胞中以用于产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞以用于表达抗体或其任何多肽链。可以通过常规方法，例如亲和力纯化通过培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)来回收这种抗体或其多肽链。如果有必要，可以在合适的条件下在允许产生抗体的合适时间段内温育抗体的多肽链。

在一些实施例中，用于制备本文所述的抗体的方法涉及对如本文所述的抗体的重链和轻链进行编码的重组表达载体。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将重组表达载体引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可以选择并在允许表达形成抗体的这两条多肽链的合适条件下培养阳性转化体宿主细胞，这两条多肽链可以从细胞或从培养基中回收。在必要时，可以在允许形成抗体的合适条件下培育从宿主细胞中回收的这两条链。

在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种重组表达载体对抗免疫细胞受体抗体的重链进行编码并且另一种重组表达载体对同一抗体的轻链进行编码。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将这两种重组表达载体都引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可替代地，可以将表达载体中的每种表达载体均引入到合适的宿主细胞中。可以选择并在允许表达抗体的多肽链的合适条件下培养阳性转化体。在将这两种表达载体引入到相同的宿主细胞中时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如果有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，并且然后在允许形成抗体的合适条件下温育多肽链。当将这两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，所述两种表达载体中的每种表达载体可以从对应的宿主细胞或从对应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下温育这两条多肽链以用于形成抗体。

使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白质A或蛋白质G偶联基质通过亲和色谱法来分离一些抗体。

可以使用本领域已知的或本文所述的测定来验证本文所述的抗体的生物活性。

III.药物组合物

本公开提供了包括本文所述的CD137结合分子或任何抗CD137抗体的药物组合物及其用于调节由CD137/CD137L信号传导触发的免疫应答的用途。如本文所述的这种CD137结合分子或还如本文所述的抗CD137抗体可以用于治疗如癌症或免疫相关病症等疾病。

如本文所述的CD137结合分子或抗CD137抗体可以与药学上可接受的载体(赋形剂)混合，以形成用于治疗靶疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包含缓冲液，所述缓冲液是本领域熟知的。参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins),K.E.Hoover编辑。

用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。(《雷明顿：药学科学与实践》第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司,K.E.Hoover编辑)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

在一些实例中，本文所述的药物组合物包括含有抗体(或编码核酸)的脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的方法制备，如以下文献中所描述的方法：Epstein等人,《美国国家科学院院刊》82:3688(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号。美国专利第5,013,556号中公开了具有增强的循环时间的脂质体。可以用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。

还可以将CD137结合分子、抗CD137抗体或一种或多种编码核酸包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。这些技术都是本领域已知的，参见例如，《雷明顿：药学科学与实践》第20版,马克出版公司(Mack Publishing)(2000)。

在其它实例中，可以以持续释放格式调配本文所述的药物组合物。持续释放制剂的合适的实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如薄膜或微胶囊的形式。缓释型基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物放置在具有无菌进口端的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。

本文所述的药物组合物可以采用单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。

为了制备如片剂等固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体例如常规压片成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和如水等其它药物稀释剂混合，以形成含有本发明的化合物的均相混合物固体预调配组合物或无毒的其药学上可接受的盐。在称这些预调配组合物均相时，这意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预调配组合物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有0.1至约500mg本发明的活性成分。可以包覆或以其它方式配混新组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量组分和外剂量组分，后者在前者之上采用包膜的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且允许内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包含多种聚合酸以及聚合酸与如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等此类材料的混合物。

合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，Tween^TM 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，Span^TM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括介于0.05％与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1％与2.5％之间。应当理解，如果有必要，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。

可以使用如Intralipid^TM、Liposyn^TM、Infonutrol^TM、Lipofundin^TM和Lipiphysan^TM等可商购获得的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常将含有高达20％的油，例如，介于5％与20％之间。脂肪乳剂可以包括介于0.1与1.0μm之间、具体地0.1与0.5μm之间的脂肪滴，并且pH范围为5.5到8.0。

乳剂组合物可以是通过将抗体与Intralipid^TM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些乳剂组合物。

用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物以产生局部或全身作用。

可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。

IV.治疗应用

本文公开的CD137结合分子中的任何CD137结合分子或抗CD137抗体可以用于调节(例如，增强或抑制)针对侵入性病原体和/或患病细胞如癌细胞的免疫应答。

为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所述的药物组合物，所述合适的途径如静脉内施用(例如，如团注或通过一段时间内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。包含喷射雾化器和超声雾化器的用于液体调配物的可商购获得的雾化器可用于施用。液体调配物可以直接雾化并且冻干粉可以在重构之后雾化。可替代地，本文所述的抗体可以使用碳氟化合物调配物和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。

待通过本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包含但不限于家畜、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。

在一些情况下，受试者是患有如癌症等细胞介导的疾病或病症或者处于患有如癌症等细胞介导的疾病或病症的风险中的人类患者，所述癌症包含但不限于肺癌、胃癌(stomach cancer)、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、膀胱癌或结肠直肠癌。另外的示例性癌症包含但不限于乳腺癌；胆管癌；膀胱癌；脑癌，包含成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌(gastric cancer)；血液肿瘤，包含急性淋巴细胞白血病和骨髓性白血病，例如B细胞CLL；T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤；毛细胞白血病；慢性骨髓性白血病，多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤；上皮内肿瘤，包含博文氏病(Bowen's disease)和佩吉特氏病(Paget's disease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包含霍奇金氏病(Hodgkin's disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；成神经细胞瘤；口腔癌，包含鳞状细胞癌；卵巢癌，包含由以下引起的那些:上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包含平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包含黑色素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包含胚组织瘤，如精原细胞瘤、非精原细胞瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包含甲状腺腺癌和髓样癌；和肾癌，包含腺癌和威尔姆氏肿瘤(Wilmstumor)。患有癌症的受试者可以通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波来鉴定。在一些实施例中，通过本文所述的方法待治疗的受试者可以是已经经历或正经受抗癌疗法(例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法或外科手术)的人癌症患者。

在其它情况下，受试者是患有免疫相关病症或处于免疫相关病症风险的人类患者。免疫相关病症是指免疫系统的功能障碍，包含自身免疫性疾病、免疫缺陷和/或过敏症。在一个实施例中，免疫相关病症是自身免疫性疾病。免疫相关病症的实例包含但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)、格雷夫氏病(Graves'Disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格林-巴利综合征(Guillain-BarreSyndrome)、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、糖尿病、I型或II型糖尿病、多发性硬化症、雷诺氏综合征(Reynaud's syndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎症性肠病、脊椎关节病变、实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫性中性粒细胞减少症、青少年型糖尿病、和与常见于结核病、结节病和多肌炎中的由细胞因子、T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答、多动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮、类天疱疮(pemphigold)、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、川崎氏病(Kawasaki's disease)、系统性硬化症、抗磷脂综合征、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、移植物抗宿主(GVH)疾病和免疫性血小板减少症。患有免疫相关病症的受试者可以通过常规医学检查(例如，用实验室测试)来鉴定。在一些实施例中，通过本文所述的方法待治疗的受试者可以是患有免疫相关病症的人类受试者，所述人类受试者已经经历或正经受免疫相关病症治疗，例如免疫抑制介导、激素替代疗法、输血、抗炎药物和/或疼痛药物。

如本文所使用的，“有效量”是指单独地或与一种或多种其它活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施例中，治疗效果是调节(例如，激活)靶免疫受体，从而触发或增强受体介导的免疫应答。确定抗体的量是否达到治疗效果对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别和体重在内的个体患者参数、治疗持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体施用途径和在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知的并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，也就是说，根据合理的医学判断的最高安全剂量。

如半衰期等经验性考虑通常将有助于确定剂量。例如，可以使用如人源化抗体或完全人抗体等与人免疫系统相容的分子来延长抗体的半衰期并且防止抗体受到宿主的免疫系统的攻击。施用频率可以在治疗过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，抗体的持续连续释放调配物可以是适当的。用于实现缓释的各种调配物和装置是本领域已知的。

在一个实例中，本文所述的CD137结合分子或抗CD137抗体的剂量可以在给予一次或多次抗体施用的个体中凭经验确定。给予个体递增剂量的CD137结合分子或抗CD137抗体。为了评估CD137结合分子或抗CD137抗体的功效，可以遵循疾病/病症的指标。

通常，对于施用任何治疗剂，如本文所述的CD137结合分子或抗CD137抗体，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开的目的，典型的日剂量的范围根据上述因素可以为约0.1μg/kg到3μg/kg、到30μg/kg、到300μg/kg、到3mg/kg、到30mg/kg、到100mg/kg或更多中的任何剂量。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状持续治疗，直至出现期望的症状抑制或直至达到足以减轻靶疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，之后施用约1mg/kg抗体的每周维持剂量或者之后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其它剂量方案可能是有用的。例如，设想每周给药一到四次。在一些实施例中，可以使用的剂量范围为约3μg/mg到约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施例中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更久一次。通过常规技术和测定，容易地监测这一疗法的进展。给药方案(包含使用的治疗剂)可以随时间推移而变化。

在一些实施例中，对于正常体重的成年患者，可以施用的剂量范围为约0.3到5.00mg/kg。在一些实例中，如本文所述的抗体等治疗剂的剂量可以为10mg/kg。特定的给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定个体和所述个体的病史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域所熟知的其它考虑)。

出于本公开的目的，本文所述的CD137结合分子或抗CD137抗体的适当剂量将取决于所采用的特异性抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、CD137结合分子或抗CD137抗体是否出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对激动剂的应答以及主治医生的判定。通常，临床医生将施用CD137结合分子或抗CD137抗体，直至达到实现期望结果的剂量。在一些实施例中，期望结果是血栓形成的减少。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。一种或多种CD137结合分子或抗CD137抗体的施用可以是连续或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。CD137结合分子或抗CD137抗体的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展靶疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。

如本文所使用的，术语“治疗”是指向受试者施加或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述受试者患有靶疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。

减轻靶疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度。减轻疾病不一定需要治愈效果。如本文所使用的，“延迟”靶疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或正在治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所使用的，靶疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。

在一些实施例中，在体内以足以激活靶受体的活性至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大)的量向需要治疗的受试者施用本文所述的抗体。

根据待治疗的疾病的类型或疾病的位点，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。

可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物调配物。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂(例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌调配物)可以在如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液等药物赋形剂中溶解和施用。

本文所述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定受试者和所述受试者的病史。

在一些实施例中，可以向需要治疗的受试者施用多于一种抗体或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。CD137结合分子或抗CD137抗体还可以与用于增强和/或补充药剂有效性的其它药剂结合使用。

可以通过本领域熟知的方法对靶疾病/病症的治疗功效进行评估。

本文所述的治疗剂可以与用于如癌症等靶疾病的其它类型的疗法结合使用。另外的抗癌疗法包含化学疗法、外科手术、辐射、基因疗法等。当使用第二治疗剂时，这种药剂可以与本文所述的CD137结合分子或抗CD137抗体同时或依次(以任何顺序)施用。

当与另外的治疗剂共同施用时，可以根据相加作用或协同效应降低每种药剂的合适的治疗有效剂量。

本公开的治疗可以与其它免疫调节治疗组合，所述其它免疫调节治疗如例如治疗性疫苗(包含但不限于GVAX、基于DC的疫苗等)或检查点抑制剂(包含但不限于阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药剂)。可替代地，本公开的治疗可以与以下组合：化学治疗剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包含如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)等天然产物、如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛(docetaxel))、长春新碱、长春碱、诺考达唑(nocodazole)、埃博霉素(epothilone)和诺维本(navelbine)等微管破坏剂、表鬼臼毒素(依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶(amsacrine)、蒽环霉素(anthracycline)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、卡铂、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、六轻甲基蜜胺(hexamethyhnelamine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、二氯甲基二乙胺(merchlorehtamine)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、亚硝基脲、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷(VP16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、伊达比星(idarubicin)、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(系统地代谢L-天冬酰胺并且剥夺不具有合成其自身的天冬酰胺的能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和类似物、链脲霉素(streptozocin))、三氮烯-达卡巴嗪(trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦(mitotane)、氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁米特(nilutamide))和芳香酶抑制剂(来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其它凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林(aspirin)、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(贝莱维定(breveldin))；免疫抑制剂(环孢菌素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、染料木黄酮、贝伐单抗(bevacizumab))和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸(tretinoin))；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、京尼平苷(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))、皮质类固醇(可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基强的松龙(methylpednisolone)、强的松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone))；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；以及染色质破坏剂。

关于另外的有用药剂的实例，还参见：《内科医生案头参考(Physician's DeskReference)》,补充第59版,(2005),Thomson P D R,Montvale N.J.；Gennaro等人编辑,《雷明顿药学科学与实践》,补充第20版,(2000),马里兰州巴尔的摩的利平科特·威廉姆斯&威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins,Baltimore Md.)；Braunwald等人编辑,《哈里森内科医学原理(Harrison's Principles of Internal Medicine)》,补充第15版,(2001),麦格劳·希尔公司(McGraw Hill),纽约；Berkow等人编辑,《默克诊断与疗法手册(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy)》,(1992),默克研究实验室(MerckResearch Laboratories),拉威(Rahway),新泽西州(N.J.)。

V.试剂盒

本公开还提供了用于使用本文所述的任何CD137结合分子或抗CD137抗体增强期望免疫应答的试剂盒。

在一些实施例中，试剂盒可以包括用于根据本文所述的任何方法使用的说明书。包含的说明书可以包括对施用用于治疗、延迟发作或减轻如本文所述的那些靶疾病等靶疾病的治疗剂的描述。试剂盒可以进一步包括对基于鉴定个体是否患有靶疾病来选择适于治疗的所述个体的描述。在仍其它实施例中，说明书包括对向处于靶疾病风险中的个体施用如抗体等治疗剂的描述。

与治疗剂的使用有关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。

标签或包装插页指示组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻如癌症等靶疾病或病症。可以提供说明书以用于实践本文所述的任何方法。

本发明的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的那些治疗剂的治疗剂。

试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本发明提供了包括上文所述的试剂盒的内容物的制品。

一般技术

除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域技术范围内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在如以下文献中有充分解释：《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989),冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》,胡玛纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:ALaboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,1998),学术出版社；《动物细胞培养(AnimalCell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养导论(Introduction toCell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱南出版社(PlenumPress)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8),约翰·威利父子出版公司(J.Wiley and Sons)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:ThePolymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编辑,1994)；《免疫学实验指南(CurrentProtocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practicalapproach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999))；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)。

无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。

实例1.工程化人IgG1、IgG2和IgG4以用于选择性FcγRIIB/CD32B结合

为了验证人IgG1、IgG2和IgG4的铰链结构域中的突变对FcγRIIB/CD32B的结合活性的影响，将本文公开的人Fc变体G1m1、G1m2、G2m1、G2m2、G2m10、G4m1、G4m2、G4m10和G4m20与抗CD137抗体的VH片段和对应的IgG1、G2和G4 CH1片段连接，以产生全长IgG重链。将这些突变体IgG重链克隆、与抗CD137抗体的轻链共表达并且使用标准分子生物学和抗体方案进行纯化。下文提供了VH-CH1片段(斜体的VH结构域)和轻链的氨基酸序列：

VH-CH1(IgG1)：

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK(SEQ ID NO:188)

VH-CH1(IgG2)：

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTK(SEQ ID NO:189)

VH-CH1(IgG4)：

EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTK(SEQ ID NO:190)

轻链：

SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ IDNO:191)

使用Octet Red96系统(ForteBio公司(ForteBio)，型号#Red96)测试这些IgG突变体与一组人Fc受体(FcR)(包含FcRn)的结合。人FcR蛋白是可商购获得的(FcRn，MednaBio，E1032；FcRI，MednaBio，E1031；FcRIIA，MednaBio，E1033；FcRIIB/C，MednaBio，E1034；FcRIIIA-F158，MednaBio，E1036；FcRIIIA-V158，MednaBio，E1035；FcRIIIB，MednaBio，E1037)。所有Fcγ受体测定均在pH 7.2下执行；所有FcRn测定均在pH 6下执行。以20μg/mL的浓度将Fcγ受体加载到抗五-HIS1K(ForteBio公司，目录号18-5122)生物传感器上。然后在具有0.1％BSA、0.02％Tween-20(pH 7.2)的PBS中，以300nM的起始浓度将加载的生物传感器浸入8点1:3稀释系列的测试IgG分子(包含对照物和本文所描述的突变体)中。使用1:1结合模型和全局拟合执行动力学分析。结果显示在下表5和6中。

表5：IgG1和IgG2突变体对各种Fc受体的FcγR结合活性

表6.IgG4突变体的FcγR结合活性

本研究中测试的某些IgG突变体(例如，G4m2)显示出与FcγRIIB(CD32B)的选择性结合活性并且还维持与FcRn的结合活性，这在体内对IgG分子的半衰期很重要。如G1m2、G2m1或G4m20等其它突变体丧失了与所有FcγR的结合。

实例2.另外的IgG1、IgG2和IgG4突变体和与各种Fc受体的结合活性

将本文公开的人Fc变体G1m5、G1m7、G1m8、G1m9、G2m5、G2m7、G2m8、G2m9、G4m5、G4m7、G4m8和G4m9与抗CD137抗体的VH片段和对应的IgG1、G2和G4 CH1片段连接，以产生全长IgG重链。参见上文的实例1。将这些突变体IgG重链克隆、与抗CD137抗体的轻链共表达(参见上文的实例1)并且使用标准分子生物学和抗体方案进行纯化。结果显示在下表7-9中。

实例3.具有用于增强与FcγRIIB(CD32B)的选择性结合的组合突变的示例性IgG突变体

将本文公开的人Fc变体G1m15、G1m17、G1m18、G1m19、G2m25、G2m27、G2m28、G4m15、G4m17、G4m18和G4m19、G4m25、G4m27、G4m28和G4m29与抗CD137抗体的VH片段和对应的IgG1、G2和G4 CH1片段连接，以产生全长IgG重链。参见上文的实例1。这些Fc突变体含有铰链结构域中的一个或多个突变与CH2和/或CH3结构域中的一个或多个突变的组合。将这些突变体IgG重链克隆、与抗CD137抗体的轻链共表达(参见上文的实例1)并且使用标准分子生物学和抗体方案进行纯化。结果显示在下表10-12中。

实例4.确定人IgG突变体与细胞FcγR的结合活性

为了确定人IgG突变体与细胞Fc受体的结合活性，使用本领域已知的慢病毒递送系统将CHO细胞基因工程化，以表达人FcγR(FcγRI、FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIII)。

按照本文的公开内容来设计和构建IgG Fc突变体，包含G1m-2、G1m-4、G1mAA、G1mAG、G2m-1、G2m-4、G2m15、G2m17、G2m17、G2m18、G2m19、G2m20、G2m27、G2m28、G4m-1、G4m-2、G430和G4PE(上文所提供的氨基酸序列)。如所指示的，这些IgG突变体在上铰链结构域或下铰链结构域中含有突变。

关于IgG突变体与不同FcγR的结合的FACS分析，使用胰蛋白酶-EDTA收获FcγR过表达性CHO细胞，并且将其悬浮在冷染色缓冲液(含3％BSA的PBS)中。向细胞中添加在染色缓冲液中稀释的测试IgG突变体。将混合物在4℃下温育2小时，并且然后用冷染色缓冲液洗涤两次并重悬于带PE标记的抗人IgG中，之后在4℃下温育2小时。将混合物用染色缓冲液洗涤两次并重悬于含2％PFA的PBS中以进行FACS。

如图1A-1W所示，许多人IgG1、IgG2和IgG4突变体显示出与细胞表面上表达的FcγR的结合活性。上表2-4中提供了对突变体相对于野生型对应物的Fcγ结合活性的变化的定性概括。

表7.IgG1突变体的FcR结合活性

表8.IgG2突变体的FcR结合活性

表9.IgG4突变体的FcR结合活性

表10.人IgG1突变体的FcR结合活性

表11.人IgG2突变体的FcR结合活性

表12.人IgG4突变体的FcR结合活性

实例5.能够与细胞FcγRIIB结合的人IgG突变体显示出增强的激动剂活性

为了验证与细胞FcγR2B的结合将会增强IgG突变体的激动剂活性，开发了共培养测定，所述共培养测定涉及表达FcγR2B的CHO细胞以及人CD8阳性T细胞。将CHO-FcγRIIB细胞以2×10⁴个/孔铺板在96孔细胞培养板中并且温育过夜。为了分离人CD8阳性T细胞，将来自健康供体的新鲜血液与等体积的DPBS轻轻混合。然后将血液样品置于Ficoll底衬的顶部并且在无制动的情况下在室温下以1000g离心30分钟。将含有PBMC的血沉棕黄层收获到新管中并且用DPBS洗涤。根据试剂盒手册，使用EasySep^TM人CD8+T细胞分离试剂盒(干细胞公司(Stemcell)，#17953)从PBMC中分离CD8阳性T细胞。将悬浮于RPMI培养基中的分离的CD8+T细胞添加到具有CHO-FcγRIIB细胞的板中。添加抗人CD3抗体OKT3到最终浓度为0.1μg/ml，之后添加以期望浓度稀释的测试抗体。将板培养3天，并且然后收获培养物上清液以用于使用人IFN-γELISA Ready-SET-GO试剂盒(EBIOSCIENCE公司，#88-7316-88)通过ELISA来测量IFNg浓度。

如图2A-2C所示，许多所测试的IgG突变体在CHO-FcγRIIB细胞存在的情况下刺激人CD8⁺细胞，如通过IFN-γ的分泌所证明的。

实例6.用突变体Fc工程化抗CD137抗体

合成并且克隆对具有不同重链CH1和Fc区或人κ轻链恒定区的抗CD137抗体可变结构域进行编码的cDNA序列。用含有对应的重链序列和轻链序列的质粒进行CHO瞬时表达。这些抗体通过蛋白质A亲和色谱法进行纯化。下文提供了重链(HC)和轻链(LC)的氨基酸序列：

173-huIg LC

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:151)

173-huIgG1m27

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:152)

173-msIgG LC

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQID NO:153)

173-msIgG1 DANA

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQID NO:154)

173-msIgG1 HC

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQID NO:155)

173-msIgG2a DANA HC

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVAVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYASTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPK(SEQ ID NO:156)

173-msIgG2a HC

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPK(SEQ ID NO:157)

173-huIgG1m40 HC

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVaVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYaSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:158)

173-huIgG2m40 HC

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVaVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFaSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:159)

173-huIgG4m40 HC

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVaVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFaSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:160)

实例7.具有Fc突变体的CD137抗体与细胞FcγR的结合活性的确定

为了确定IgG突变体中的CD137抗体与细胞Fc受体的结合活性，使用本领域已知的慢病毒递送系统将CHO细胞基因工程化，以表达人FcγR(FcγRI、FcγRIIA(H131)、FcγRIIB和FcγRIII)。

按照本文的公开内容来设计和构建IgG Fc突变体，包含173-msIgG1、173-msIgG1DANA、173-msIgG2a、173-msIgG2a DANA、173-huIgG2、173-huIgG2m2、173-huIgG4m2、173-huIgG1m27和173-huIgG4SP(上文所提供的氨基酸序列)。这些IgG突变体在上铰链结构域或下铰链结构域或CH2结构域内含有突变。

关于IgG突变体与不同FcγR的结合的FACS分析，使用胰蛋白酶-EDTA收获FcγR过表达性CHO细胞，并且将其悬浮在冷染色缓冲液(含3％BSA的PBS)中。向细胞中添加在染色缓冲液中稀释的测试IgG突变体。将混合物在4℃下温育2小时，并且然后用冷染色缓冲液洗涤两次并重悬于带PE标记的抗人IgG中，之后在4℃下温育2小时。将混合物用染色缓冲液洗涤两次并重悬于含2％PFA的PBS中以进行FACS。

如图3A-3D所示，许多人IgG1、IgG2和IgG4突变体显示出与细胞表面上表达的FcγR的结合活性，而其它突变体对所检查的FcγR未表现出结合。

实例8.IgG突变体中的CD137抗体显示出差异性CD137激动剂活性

为了确定IgG突变体的激动剂活性，开发了CD137报告基因测定，其涉及Jakat细胞表达性人CD137阳性T细胞。将GS-H2-huCD137报告细胞重悬于测定缓冲液中，并且用台盼蓝确定细胞密度和存活力。用测定缓冲液(含有1％FBS的MEM)将细胞悬浮液稀释到1×10⁴个细胞/mL。以100微升/孔添加细胞，使得在测定板(Nunc，目录号167425)中最终细胞数量为1000个细胞/孔。在测定缓冲液中以2x最终浓度制备测试样品的连续工作稀释液。以100微升/孔测试样品以2x最终浓度向测定板添加样品。将测定板在37℃、5％CO₂温育箱中温育18-20小时。温育18-20小时之后，从测定板的每个孔中收集8μl上清液并且将其添加到HTRF检测测定板(Nunc)中。使用人IL-8测定试剂盒(Cisbio，目录号62IL8PEB)进行人白介素8(CD137激活的报告基因)检测测定。具体地，使用16μl的测定体积。使用Tecan F200pro的时间分辨荧光读取结果，并且记录相对光单位数据。

如图4中所示，所有所测试的CD137抗体IgG突变体刺激人CD137激活，如通过IL8的分泌所证明的。CD137激活的量级受Fc影响。

实例9.IgG突变体中的CD137抗体在体内在动物模型中表现出差异性抗肿瘤活性

在小鼠同源肿瘤模型中体内测试具有各种Fc区的所选CD137抗体(例如，以上实例6中公开的那些)，以确定变体Fc区如何影响这些抗体的功效和毒性。使用具有人CD137胞外结构域敲入的C57BL6小鼠来开发同源小鼠肿瘤模型。将鼠结肠癌MC38细胞皮下植入到纯合子人CD137敲入小鼠中。当肿瘤大小为大约150±50mm³(n＝6)时，将小鼠分组。然后通过腹膜内注射施用CD137抗体，并且在4-6周的抗体处理期间测量肿瘤大小。在对照组和抗体处理组的肿瘤大小之间评估抗肿瘤功效。

实例10.IgG突变体中的另外的CD137抗体的制备和表征

使用标准方案克隆并且表达一组具有野生型或变体Fc区的人CD137抗体或融合蛋白。示例性抗CD137抗体提供于以上实例6中。

如以上实例中所述，在体外测试这些抗体和融合蛋白的CD137结合和激动剂活性，以及在体内测试其抗肿瘤功效和毒性。使用文献中的标准方案进行人T细胞激活测定。

其它实施例

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以通过充当相同、等效或类似目的的替代性特征替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是等效或类似特征的通用系列的实例。

通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求范围内。

等效物

尽管本文已经描述和展示了若干个本发明实施例，但本领域的普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得结果和/或本文所述的优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变异和/或修改中的每一个均被视为在本文所述的本发明实施例的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体本发明实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包含在本公开的发明范围内。

本文中定义和使用的所有定义都应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。

除非清楚地相反地指出，否则如本文中在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应理解为意指“至少一个”。

如本文中在说明书和权利要求中所使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此联合的要素中的“任一个或两个”，即要素在一些情况下结合地存在而在其它情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即如此联合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言，如“包括”结合使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指代A(任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施例中，仅指代B(任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中，指代A和B两者(任选地包含其它要素)；等。

如本文中在说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一个要素、但是还包含多于一个要素，以及任选地另外未列出的项。只有明确地指示相反的术语，如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或者在权利要求中使用时“由……组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。通常，当之前有排他性术语，如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时，如本文中所使用的术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个而非两者”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有如在专利法领域中所使用的普通含义。

如本文中在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不必要包含要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个并且不排除要素列表中的要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指代的要素列表内具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以指代至少一个，任选地包含多于一个A，而不存在B(并且任选地包含除了B之外的要素)；在另一个实施例中指代至少一个、任选地包含多于一个B，而不存在A(并且任选地包含除了A之外的要素)；在又另一个实施例中指代至少一个、任选地包含多于一个A，以及至少一个、任选地包含多于一个B(并且任选地包含其它要素)；等。

还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作的顺序。

Claims (68)

1.一种CD137结合分子，其包括(a)CD137结合部分和(b)经过工程化的Fc区，与野生型Fc区对应物相比，所述经过工程化的Fc区包括位置220-331中的任何位置处，优选地位置228-329中的任何位置处的至少一个突变，其中编号是根据EU索引进行的。

2.根据权利要求1所述的CD137结合分子，其是CD137激动剂或CD137拮抗剂。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的CD137结合分子，其中所述CD137结合部分是CD137配体(CD137L)。

4.根据权利要求3所述的CD137结合分子，其中所述CD137L包括SEQ ID NO:142的氨基酸序列。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的CD137结合分子，其中所述CD137结合部分是抗CD137抗体片段，所述抗CD137抗体片段包括(a)重链，所述重链包括重链可变区；以及(b)轻链，所述轻链包括轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变结构域与所述经过工程化的Fc区连接。

6.根据权利要求1到5中任一项所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区相对于其野生型对应物对FcγRIIB具有增强的结合亲和力或选择性。

7.根据权利要求1到5中任一项所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区相对于其野生型对应物对一种或多种FcγR受体具有降低的结合亲和力。

8.根据权利要求7所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区相对于其野生型对应物对所有FcγR受体具有显著降低的结合亲和力。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的CD137结合分子，其中所述分子是IgG1，并且其中所述至少一个突变包括位置233-238内的取代或缺失、位置265处的取代、位置267处的取代、位置297处的取代、位置328处的取代、位置329处的取代或其组合。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的CD137结合分子，其中所述分子是IgG1，并且其中所述至少一个突变包括位置220、226、229、238、273、327、330和331中的一个或多个位置处的取代。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的CD137结合分子，其中所述至少一个突变包括位置233-236中的任何位置处的取代、位置236-238中的一个或多个位置处的缺失或其组合。

12.根据权利要求11所述的CD137结合分子，其中位置233-235处的所述取代是E233P、L234V、L234F、L235A和/或L235E。

13.根据权利要求9到12中任一项所述的CD137结合分子，其中所述缺失位于位置236处或位于一个或多个位置236-238处。

14.根据权利要求9到13中任一项所述的CD137结合分子，其中位置238处的所述取代是P238S，其中位置273处的所述取代是V273E，和/或其中位置265处的所述取代是D265A。

15.根据权利要求9到14中任一项所述的CD137结合分子，其中位置267处的所述取代是S267E。

16.根据权利要求9到13中任一项所述的CD137结合分子，其中位置329处的所述取代是P329G。

17.根据权利要求9所述的CD137结合分子，其中所述至少一个突变包括位置265处的取代、位置297处的取代或其组合。

18.根据权利要求15所述的CD137结合分子，其中位置265处的所述取代是D265A，并且位置297处的所述取代是N297A。

19.根据权利要求9或权利要求10所述的CD137结合分子，其中位置220、226、229、327、330和331处的所述一个或多个取代是C220S、C226S、C229S、A327G、A330S和P331S。

20.根据权利要求9所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区选自由以下组成的组：G1m2、G1m17、G1m27、G1mAA、G1mAAG、G1N279A、G1m240和G1m40。

21.根据权利要求1到8中任一项所述的CD137结合分子，其中所述分子是IgG2，并且其中所述至少一个突变包括位置237-238内的缺失、位置265处的取代、位置267处的取代、位置297处的取代、位置328处的取代或其组合。

22.根据权利要求1到8和21中任一项所述的CD137结合分子，其中所述分子是IgG2，并且其中所述至少一个突变包括位置233-235、237、238、268、273、330和331中的一个或多个位置处的取代。

23.根据权利要求21或权利要求22所述的CD137结合分子，其中所述缺失位于位置237处或位于位置237和238两者处。

24.根据权利要求21到23中任一项所述的CD137结合分子，其中位置267处的所述取代是S267E。

25.根据权利要求21到24中任一项所述的CD137结合分子，其中位置328处的所述取代是L328F。

26.根据权利要求22到25中任一项所述的CD137结合分子，其中位置233-235、237、238、268、273、330和331中的一个或多个位置处的所述取代是P233E、V234A、V234L、A235L、A235S、G237A、P238S、H268A、H268Q、V273E、A330S和P331S。

27.根据权利要求21到26中任一项所述的CD137结合分子，其中所述至少一个突变包括位置265处的取代、位置297处的取代或其组合。

28.根据权利要求27所述的CD137结合分子，其中位置265处的所述取代是D265A，并且位置297处的所述取代是N297A。

29.根据权利要求21所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区选自由以下组成的组：G2m1、G2m17、G2m18、G2m19、G2m20、G2m27、G2m28、G2m29、G2m2040、G2m43、G2G4、G2mAA和G2m40。

30.根据权利要求1到8中任一项所述的CD137结合分子，其中所述分子是IgG4，并且其中所述至少一个突变包括位置228处的取代、位置235-238中的任何位置处的取代或缺失、位置265处的取代、位置267处的取代、位置297处的取代、位置273处的取代、位置328处的取代或其组合。

31.根据权利要求1到8和30中任一项所述的CD137结合分子，其中所述分子是IgG4，并且其中所述至少一个突变包括位置233-235或237中的一个或多个位置处的取代。

32.根据权利要求30或权利要求31所述的CD137结合分子，其中位置228处的所述取代是S228P。

33.根据权利要求30到32中任一项所述的CD137结合分子，其中所述缺失位于位置236-238中的至少一个位置处。

34.根据权利要求30到33中任一项所述的CD137结合分子，其中一个或多个位置233-235和237处的所述取代包括E233P、F234V、F234A、L235S、L235E、L235A和G237A。

35.根据权利要求30到34中任一项所述的CD137结合分子，其中所述缺失位于位置236和237两者处。

36.根据权利要求30到35中任一项所述的CD137结合分子，其中位置267处的所述取代是S267E，和/或其中位置273处的所述取代是V273E。

37.根据权利要求30到36中任一项所述的CD137结合分子，其中位置238处的所述取代是L238F。

38.根据权利要求30所述的CD137结合分子，其中所述至少一个突变包括位置228处的取代、位置265处的取代、位置297处的取代或其组合。

39.根据权利要求31所述的CD137结合分子，其中位置228处的所述取代是S228P，位置265处的所述取代是D265A并且位置297处的所述取代是N297A。

40.根据权利要求30所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区选自由以下组成的组：G4m2、G4m20、G4m28、G4m30、G4m41、G4m42、G4m46、G4mPE、G4mAA和G4m40。

41.根据权利要求1到40中任一项所述的CD137结合分子，其中与亲本Fc区相比，所述变体Fc区对FcγRIIB表现出增强的结合亲和力。

42.根据权利要求1到41中任一项所述的CD137结合分子，其中与亲本Fc区相比，所述变体Fc区对FcγRIIB表现出降低的结合亲和力和/或增强的选择性。

43.根据权利要求1到42中任一项所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区对任何FcγR表现出低结合活性或不表现出结合活性。

44.根据权利要求1到43中任一项所述的CD137结合分子，其中所述变体Fc区与FcRn结合。

45.根据权利要求5到44中任一项所述的CD137结合分子，其中所述重链可变区包括与以下序列中的重链互补决定区(HC CDR)相同的HC CDR：SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:140，和/或所述轻链可变区包括与以下序列中的轻链互补决定区(LC CDR)相同的LC CDR：SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:141。

46.根据权利要求45所述的CD137结合分子，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:136、SEQ IDNO:138或SEQ ID NO:140，和/或所述轻链可变区包括SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:141。

47.根据权利要求5到46中任一项所述的CD137结合分子，其中所述抗体片段属于人抗体或人源化抗体。

48.一种分离的核酸或核酸组，其编码或共同编码根据权利要求1到47中任一项所述的CD137结合分子。

49.一种载体或载体组，其包括或共同包括根据权利要求48所述的核酸或核酸组。

50.根据权利要求49所述的载体或载体组，其是一种或多种表达载体。

51.一种宿主细胞，其包括根据权利要求49或权利要求50所述的载体或载体组。

52.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到51中任一项所述的CD137结合分子和药学上可接受的载体。

53.一种用于选择性调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1到52中任一项所述的CD137结合分子。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者，并且所述CD137结合分子是CD137激动剂。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、皮肤癌、胰腺癌、脑癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肉瘤、骨癌、淋巴瘤和血液癌。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有免疫相关病症的人类患者，并且其中所述CD137结合分子是CD137拮抗剂。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述免疫相关病症选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力(MG)、格雷夫氏病(Graves'Disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome)、自身免疫性心肌炎、膜性肾小球肾炎、糖尿病、I型或II型糖尿病、多发性硬化症、雷诺氏综合征(Reynaud's syndrome)、自身免疫性甲状腺炎、胃炎、乳糜泻、白癜风、肝炎、原发性胆汁性肝硬化、炎症性肠病、脊椎关节病变、实验性自身免疫性脑脊髓炎、免疫性中性粒细胞减少症、青少年型糖尿病、和与常见于结核病、结节病和多肌炎中的由细胞因子、T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫应答、多动脉炎、皮肤血管炎、天疱疮、类天疱疮(pemphigold)、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、川崎氏病(Kawasaki'sdisease)、系统性硬化症、抗磷脂综合征、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、移植物抗宿主(GVH)疾病和免疫性血小板减少症。

58.一种分离的抗CD137抗体，其和选自由以下组成的组的参考抗体与CD137的同一表位结合：20A12D11、11E10D12、23D2D6、22F2C2、30C11B4、26B3D7，或者与所述参考抗体竞争与所述表位结合。

59.根据权利要求58所述的分离的抗CD137抗体，其中所述抗体包括重链互补决定区1(CDR1)、重链互补决定区2(CDR2)和重链互补决定区3(CDR3)，所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3共同与所述参考抗体的重链CDR至少85％相同；和/或其中所述抗体包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3，所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3共同与所述参考抗体的轻链CDR至少85％相同。

60.根据权利要求58所述的分离的抗CD137抗体，其中相对于所述参考抗体的重链CDR，所述重链CDR1、所述重链CDR2和所述重链CDR3共同包括至多10个氨基酸变异；和/或其中相对于所述参考抗体的轻链CDR，所述轻链CDR1、所述轻链CDR2和所述轻链CDR3共同包括至多10个氨基酸变异。

61.根据权利要求58到60中任一项所述的分离的抗CD137抗体，其中所述抗体包括重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区与所述参考抗体的重链可变区至少85％相同，所述轻链可变区与所述参考抗体的轻链可变区至少85％相同。

62.根据权利要求58所述的分离的抗CD137抗体，其中所述抗体与所述参考抗体包括相同的重链可变区CDR和/或与所述参考抗体包括相同的轻链可变区CDR。

63.根据权利要求58到62中任一项所述的分离的抗CD137抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。

64.一种分离的核酸或核酸组，其编码或共同编码根据权利要求58到63中任一项所述的抗CD137抗体。

65.一种载体或载体组，其包括或共同包括根据权利要求64所述的核酸或核酸组。

66.根据权利要求65所述的载体或载体组，其是一种或多种表达载体。

67.一种宿主细胞，其包括根据权利要求65或权利要求66所述的载体或载体组。

68.一种药物组合物，其包括根据权利要求58到63中任一项所述的抗CD137抗体、根据权利要求64到66中任一项所述的编码核酸或根据权利要求67所述的宿主细胞和药学上可接受的载体。

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