CN112111008A - 抗cd73抗体及其应用 - Google Patents
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-
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- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
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Abstract
本发明属于生物医药领域，提供一种抗CD73抗体或其抗原结合片段的制备和使用，所述抗体包含H CDR1、H CDR2和H CDR3，以及L CDR1、L CDR2和L CDR3；H CDR1的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示，H CDR2的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18所示，H CDR3的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19所示，L CDR1的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21所示，L CDR2的序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22所示，L CDR3的序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23所示。本发明的抗CD73抗体能够特异性结合CD73，抑制CD73的酶活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及抗体的制备和使用。
背景技术
CD73又称胞外-5’-核苷酸酶，是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于质膜的一种糖蛋白，广泛表达于人体内皮细胞、淋巴细胞，有助于将具有免疫激活作用的ATP转化为具有免疫抑制作用的腺苷。腺苷作为信号传导分子可由多种受体(包括A1，A2A，A2B及A3)介导其生物学效应，如腺苷与腺苷受体A2AR(adenosine receptor AR)结合可抑制T细胞的免疫作用，进而帮助癌细胞逃逸T细胞的“追杀”。肿瘤细胞也可以表达CD73并释放腺苷，从而降低抗肿瘤活性，除了抑制免疫细胞功能，越来越多的研究表明CD73也可以直接刺激肿瘤细胞增殖，迁移和侵袭，及肿瘤血管生成。由此可见，CD73和其他调节免疫应答的靶点比较，靶向CD73有着“一箭双雕”的优势。
临床前研究表明，靶向CD73能够产生良好的抗肿瘤作用，可通过增加T淋巴细胞和肿瘤白细胞总数改变肿瘤免疫微环境，还可减少肿瘤骨髓源性抑制细胞(MDSC)，使有应答大鼠的巨噬细胞朝着活化(抗肿瘤)表型转变。且将CD73阻断治疗与其它免疫分子调节剂联合(如PD-(L)1抗体)可以显著增强如CD73单抗的抗肿瘤效果，这对增强本企业的抗肿瘤产品线也是极具吸引力的选择。
对临床肿瘤样本的分析显示，CD73高表达是一种潜在的生物标志物，在多种不同的肿瘤上表达，与多种类型肿瘤的不良预后密切相关，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、头颈癌等。另外，PD-1/CD73单抗、放化疗等治疗方案可能引起肿瘤微环境CD73表达升高，继而通过腺苷信号抑制免疫反应，使治疗大打折扣，也就是我们常说的获得性耐药。因此，靶向CD73的治疗策略有潜力作为单药或联合疗法应用于临床。
鉴于对靶向疾病(如癌症)的治疗仍有较迫切的改进需求，通过多种机制调控肿瘤进展的方法以及调控CD73活性的方法及相关治疗剂是非常令人期望的。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗CD73抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别并结合CD73，并且具有预期功能特性，这些特性包括高亲和力结合至CD73并且抑制CD73酶活性的能力。本文所述的抗体可用于抑制肿瘤生长，减少腺苷产生，刺激免疫反应及检测样品中的CD73蛋白。
在第一个方面，本发明提供抗CD73抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含H CDR1、H CDR2和H CDR3，所述轻链可变区包括L CDR1、L CDR2和L CDR3；
所述H CDR1的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示，或者所述HCDR1的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述H CDR2的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18所示，或者所述H CDR2的序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述H CDR3的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19所示，或者所述H CDR3的序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述L CDR1的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21所示，或者所述L CDR1的序列与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述L CDR2的序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22所示，或者所述L CDR2的序列与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述L CDR3的序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23所示，或者所述L CDR3的序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗体的重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一种实施方案中，所述抗体的重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在一种实施方案中，所述抗体的重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在一种实施方案中，所述抗体的轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一种实施方案中，所述抗体的轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
在一种实施方案中，所述抗体的轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在一种实施方案中，所述抗体为A7，其重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
其轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一种实施方案中，所述抗体为B11，其重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
其轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
在一种实施方案中，所述抗体为B22，其重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
其轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体A7包含重链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体A7包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体B11包含重链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体B11包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体B22包含重链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，或与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体B22包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，或与SEQ ID NO:24具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体包含重链恒定区(CH)，其中所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，或与SEQ ID NO:26具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体包含轻链恒定区(CL)，其中所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，或与SEQ ID NO:25具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体或其抗原结合片段能够特异性识别并结合CD73，其中亲和力为1×10-9M或更低，优选5×10-10M或更低，更优选1×10-10M或更低。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体或其抗原结合片段以如通过fortebio octet分析所测量的约0.1nm至10nm或更小的KD结合人CD73。
在一种实施方案中，所述抗CD73抗体或其抗原结合片段以如通过FACS所测量的0.1nm至10nm或更小的EC50结合人CD73。
在另一方面，提供一种分离的核酸分子，其包括编码权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列区。
在一种实施方案中，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35，或者SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43，或者SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51。
在进一步优选的实施方案中，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36，或者SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44，或者SEQ ID NO:48和52。
在另一方面，本发明还提供一种表达载体，其包含本发明的核酸分子。
在另一方面，本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的核酸分子或本发明的表达载体。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
在一种实施方案中，所述药物组合物中，所述抗体为A7、B11、B22或其组合。
在另一方面，提供制备抗CD73抗体的方法，包括：培养本发明的宿主细胞，及自该宿主细胞分离该抗体。
在另一方面，提供本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物中的应用。
在另一方面，本发明提供一种治疗个体的肿瘤性疾病的方法，其包括向有此需要的个体给药本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及的本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物，其用于治疗肿瘤性疾病。
在一种实施方案中，本文所述的肿瘤性疾病为CD73阳性肿瘤。在另一实施方案中，所述CD73阳性肿瘤为肺癌(如非小细胞肺癌)、卵巢癌、子宫/宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统新生物、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、肉瘤及病毒相关的癌症。
在另一方面，本发明提供一种降低表达CD73的肿瘤细胞中腺苷水平的方法，包括使所述细胞与本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段接触。
在另一方面，本发明提供一种抑制表达CD73的肿瘤细胞生长的方法，包括使所述细胞与本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段接触。
在另一方面，本发明提供一种刺激抗原特异性T细胞反应的方法，包括向需要的个体施用本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供一种刺激个体中的免疫反应的方法，包括向需要的个体施用本发明的抗CD73抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，上述方法或应用还包括给药其它抗肿瘤治疗手段，例如施用化疗剂、靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体或放疗。
在本发明中，所述CD73为人或鼠CD73，其序列均是公知的。例如，人CD73亚型1的序列如SEQ ID NO:27所示，人CD73亚型2的序列如SEQ ID NO:28所示。
本发明的抗CD73抗体能够特异性结合CD73，通过抗体介导的CD73内化将CD73内吞至细胞，例如肿瘤细胞中，从而抑制CD73的酶活性，激活T细胞，进而抑制肿瘤生长。
附图说明
图1显示了A7、B11及B22抗体与人CD73阳性Calu-6细胞(人肺腺癌细胞系)的流式分析(FACS)结合曲线。
图2显示了CD73酶活性抑制曲线图。经A7、B11及B22抗体处理后，Calu-6细胞处理ATP产生的AMP减少，表面CD73酶活性被抑制，其中，A7，B11抗体的抑制效果更优于B22抗体。
图3显示了经A7、B11及B22抗体处理的Calu-6细胞表面CD73的内吞百分比，其显示在Calu-6细胞中标示的抗体随时间推移的抗体介导的CD73内吞化。
图4显示了抗体电荷异构体图谱，其中A为抗体A7，B为抗体B11，C为抗体B22。
图5显示了抗体的SEC图谱，其中A为抗体A7，B为抗体B11，C为抗体B22。
具体实施方式
以下详细描述及实施例阐述了本发明的其他特征及优点，但这些实施例不应理解为具有限制性。本发明的内容由权利要求书的范围所限定。
定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8个(种)或更多个(种)。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体涵盖抗体片段。如本文所用，因此术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。在优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如Methods in Molecular Biology,Vol 207:Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25,Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合抗原的抗体。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标示为L和L’)和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)，CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点”同义地用来指识别并与同种(cognate)抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“HV”、“互补决定区”和“CDR”和“抗体CDR”可以交换地使用，并且指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如，轻链可变区结构域包含3个CDR，命名为L CDR1(或VL CDR1)、L CDR2(或VL CDR2)和L CDR3(或VL CDR3)；重链可变区结构域包含3个CDR，命名为H CDR1(或VH CDR1)、H CDR2(或VH CDR2)和H CDR3(或VH CDR3)。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述，本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如Kabat,E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242,和Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序列方面而言，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域，而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM包含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
“亲和力”或“结合亲和力”KD常通过测量平衡缔合常数(ka)和平衡解离常数(kd)并计算kd除以ka的商来确定(KD＝kd/ka)。如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可以交换地使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于例如肿瘤细胞中。
在本发明的一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以2×10-9M或更低、1×10-9M或更低、9×10-10M或更低、8×10-10M或更低、7×10-10M或更低、6×10-10M或更低、5×10-10M或更低、4×10-10M或更低、3×10-10M或更低、2×10-10M或更低、1×10-10M或更低的亲和力结合靶抗原(例如CD73，如人CD73)。
亲和力可以利用常规技术容易地测定，例如通过平衡透析；通过使用BIAcore2000仪器，利用制造商所列的一般方法；通过利用放射性标记的靶抗原进行放射免疫测定；或者通过技术人员已知的其他方法。
“分离的蛋白”、“分离的多肽”或“分离的抗体”指所述蛋白、多肽或抗体(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然中存在。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分“分离”。还可通过分离以使蛋白实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白纯化技术。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如Watson et al.,Molecular Biology ofthe Gene,4th Edition,1987,The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“一致性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and GenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis ofSequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987；and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的一致性的方法，但是术语“一致性”是技术人员公知的(Carrillo,H.&Lipman,D.,SIAM J AppliedMath 48:1073(1988))。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭)入细胞。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
如本文所用，“治疗”患有疾病或疾病状况的个体表示所述个体的症状部分或全部缓解，或者在治疗后保持不变。因此，治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防指防止潜在疾病和/或防止症状恶化或疾病发展。治疗还包括所提供的任何抗体或其抗原结合片段以及本文所提供的组合物的任何药学用途。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。同样，如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文中所使用的，术语“个体”是指哺乳动物，例如人。
本发明的抗体
本发明提供一种针对CD73的抗体，即抗CD73抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性识别并结合CD73。
在一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性识别并结合CD73，其中亲和力(KD)为1×10-9M或更低，优选5×10-10M或更低，更优选1×10-10M或更低。
在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具有下述特征中的至少一个：
1)抑制CD73酶活性；2)通过抗体介导的CD73内化将CD73内化至细胞，例如肿瘤细胞中；3)激活T细胞；4)抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合CD73(如人CD73)并能抑制CD73酶活性，降低腺苷的产生。
在一些实施方案中，所针对的肿瘤包括但不限于下文关于肿瘤性疾病所描述的那些。在另一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够抑制肿瘤生长至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。
在具体实施方案中，所述抗CD73抗体包括抗CD73抗体A7、抗CD73抗体B11、抗CD73抗体B22或其组合。
抗体A7
在一方面，本发明提供一种针对CD73的抗体A7或其抗原结合片段，
其中所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中
所述重链可变区包含：
H CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，
H CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，和
H CDR3，其包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
L CDR1，其包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，
L CDR2，其包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，和
L CDR3，其包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗CD73抗体A7包含重链可变区(VH)，
其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗CD73抗体A7包含轻链可变区(VL)，
其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在又一实施方案中，抗CD73抗体A7包含重链恒定区(CH)，
其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在又一实施方案中，CD73抗体A7包含轻链恒定区(CL)，
其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
抗体B11
在另一方面，本发明提供一种针对CD73的抗体B11或其抗原结合片段，
其中所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中
所述重链可变区包含：
H CDR1，其包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列，
H CDR2，其包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，和
H CDR3，其包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
L CDR1，其包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，
L CDR2，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列，和
L CDR3，其包含SEQ ID NO:15所示氨基酸序列。
在一实施方案中，抗CD73抗体B11包含重链可变区(VH)，
其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在一实施方案中，抗CD73抗体B11包含轻链可变区(VL)，
所述轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:16具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，抗CD73抗体B11包含重链恒定区(CH)，
其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在又一实施方案中，抗CD73抗体B11包含轻链恒定区(CL)，
其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
抗体B22
在又一方面，本发明提供一种针对CD73的抗体B22或其抗原结合片段，
其中所述抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中
所述重链可变区包含：
H CDR1，其包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列，
H CDR2，其包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列，和
H CDR3，其包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
L CDR1，其包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列，
L CDR2，其包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列，和
L CDR3，其包含SEQ ID NO:23所示氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗CD73抗体B22包含重链可变区，
其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，抗CD73抗体B22包含轻链可变区，
其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:24具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在又一实施方案中，抗CD73抗体B22包含重链恒定区(CH)，
其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:26所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:26具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
在又一实施方案中，CD73抗体B22包含轻链恒定区(CL)，
其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:25所示氨基酸序列或与SEQ ID NO:25具有至少85％、至少90％、至少95％或更高序列一致性的氨基酸序列。
肿瘤性疾病
本发明的抗体对CD73的阻断可以增强患者中对癌细胞的免疫应答。CD73将具有免疫激活作用的ATP转化为具有免疫抑制作用的腺苷。腺苷作为信号传导分子可由多种受体(包括A1，A2A，A2B及A3)介导其生物学效应，如腺苷与腺苷受体A2AR(adenosine receptorAR)结合可抑制T细胞的免疫作用，进而帮助癌细胞逃逸T细胞的“追杀”。肿瘤细胞也可以表达CD73并释放腺苷，从而降低抗肿瘤活性。靶向CD73能够产生良好的抗肿瘤作用，可通过增加T淋巴细胞和肿瘤白细胞总数改变肿瘤免疫微环境，还可减少肿瘤骨髓源性抑制细胞(MDSC)。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗肿瘤性疾病。可以使用本发明的抗体或其抗原结合片段进行预防和/或治疗的优选的肿瘤性疾病(或癌症)包括一般对免疫治疗有应答的癌症。可治疗的癌症的非限制性的实例包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。其他癌症的实例包括但不限于骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明的抗体也可用于治疗转移性癌，特别是表达CD73的转移性癌。在又一实施方案中，所述肿瘤性疾病(或癌症)为肺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌或骨肉瘤，特别是结直肠癌或非小细胞肺癌。在一实施方案中，所述肿瘤性疾病为CD73阳性肿瘤。
核酸、载体和抗体产生方法
在另一方面，本发明提供分离的核酸分子，其包括编码前述本发明的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列区。在一些实施方案中，所述核苷酸序列区的核苷酸序列可以针对用于表达的宿主细胞进行密码子优化。例如，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35，或者SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43，或者SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51；进一步优选地，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:32和SEQID NO:36，或者SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44，或者SEQ ID NO:48和52。
本发明还提供一种表达载体，其包含至少一种前述本发明的核酸分子。
本发明的一方面还提供一种宿主细胞，其由至少一种前述本发明的核酸分子或表达载体转化。
本发明的又一方面还涉及一种生产抗CD73的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：(i)在适合核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和(ii)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
药物组合物
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体。在一实施方案中，上述抗体包括抗CD73抗体A7、抗CD73抗体B11、抗CD73抗体B22或其组合，特别是抗CD73抗体B11。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短后期给药间隔加长。在一实施方案中，所用的剂量可以是每三周给药1200mg。给药方式可以是静脉滴注。
或者，针对肿瘤的抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。
本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的抗体优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。
药物组合物中本发明的抗体或其抗原结合片段还可以与诸如细胞毒素、放射性同位素或生物活性蛋白等治疗性部分缀合。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括但不限于：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。
可用于缀合的治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
能与本发明的抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、和它们的衍生物。
可以利用本领域使用的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体缀合。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的接头。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的接头，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。
本发明的抗体也可以与放射性同位素缀合，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性抗体缀合物。能够与诊断或治疗性使用的抗体缀合的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。制备放射性抗体缀合物的方法在本领域是公知的。
本发明的抗体也可以与具有需要的生物活性的蛋白缀合，可用于修饰特定的生物学反应。这样的生物活性蛋白包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-10(“IL-10”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他免疫因子如IFN等。
联合治疗
本发明的抗体或药物组合物可以与化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体联合施用。本发明的抗体和所述化疗剂或靶向其他肿瘤抗原的抗体可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或以预定的间隔施用。本发明的抗体或本发明的药物组合物还可以与放疗联合，例如包括向患者施用电离辐射，其早于、在其过程中和/或晚于本发明的抗体或药物组合物的施用过程。
试剂盒
本发明的范围内还包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的抗体或其抗原结合片段，以及使用说明。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。
有益效果
本发明的抗体对靶抗原具有非常强的亲和力，抑制靶抗原的酶活性，降低腺苷的产生，具有潜在的活化T细胞及抗肿瘤活性，优异的稳定性、更低的副作用。
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。本文中所用的比例包括百分比，如果没有特别指出，都按重量计。
实施例中所用的试剂和仪器都是可商购的。
实施例1：人抗CD73抗体的产生
收集106名成年健康人外周血，利用淋巴细胞分离液分离PBMC(外周血单核细胞)细胞，共收集2.7×109个细胞。Trizol法提取总RNA，将其反转录为cDNA。参考《重组抗体》(科学出版社，2005年)中的方法，常规PCR方法扩增不同抗体亚型的可变区基因，利用常规分子生物学技术将抗体可变区基因克隆入同样酶切处理的pDF载体中，电转化法转化大肠杆菌XL1-Blue(Agilent Technology)，最终获得1E+10pfu的大容量抗体库。经2YT培养液扩大培养后，加辅助噬菌体VCSM13(BioVector NTCC Inc.)感染，获得初级噬菌体抗体库。
用5％脱脂奶粉封闭重组人CD73(R&D公司产品)包被的免疫试管(Maxisorp免疫试管，Thermo Nunc)后，加入上述噬菌体抗体库，37℃下孵育2h；弃去未结合的噬菌体，PBS-T洗液洗涤5遍，洗去非特异吸附噬菌体；加入1mL洗脱缓冲液(0.1mol/L甘氨酸-HCl，pH 2.2)洗脱噬菌体并以2mol/L Tris溶液中和；加入对数期XL1-Blue菌(Agilent Technology)、2YT培养基及辅助噬菌体VCSM13进行扩增富集；重复该过程3-4轮，将洗脱下来的噬菌体感染新鲜制备的对数期XL1-Blue菌涂培养板，在37℃下过夜培养后，获得单克隆(具体方法和试剂可以参考：《Phage Display》，Humana Press)。
将重组CD73与96孔板在4℃下温育16小时，然后用BSA溶液封闭。从筛选后有明显富集的噬菌体库中挑选大约400个(5个96孔板)单个噬菌体克隆在补充了羧苄青霉素的2YT液体培养基500μL中培养24小时，离心取上清，将上清加入包被了CD73的96孔板并温育1h。PBST清洗后与HRP偶联的抗噬菌体抗体(抗-M13HRP)温育，最终加底物显色以测定结合在96孔板的噬菌体量。利用此实验初步选出8个亲和力相对较高并有特异序列的候选抗体进行进一步检测筛选。
对筛选出的8个候选抗体进行大肠杆菌表达，将保存的单克隆菌液按照1：100的比例转接50ml 2YT-Tet培养基，过夜培养12～16h，收集菌体，离心取沉淀重悬至10ml PBS中，超声破碎菌体，离心取上清，用于fortebio分析CD73Fab抗体的亲和力，从而进行亲和力排序(表1)。
表1.采用fortebio的抗-Fab传感器芯片测出的Fab抗体亲和力
实施例2：抗体表达
选取A7、B11和B22克隆进行测序并优化其编码基因，将A7(SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:36)、B11(SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44)、B22(SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52)克隆可变区的基因与人IgG恒定区的基因(轻链恒定区序列为SEQ ID NO:53；重链恒定区序列为SEQID NO:54)融合后克隆入表达载体pCDNA3.4(Thermo Fisher)。将获得的真核表达载体，用瞬转方式转染Expi-CHO细胞(Thermo Fisher)中。经过12天左右的无血清培养基培养，收获培养上清用proteinA介质进行纯化，获得目标抗体。经测序，所获得的A7、B11和B22与目标序列一致。
实施例3：抗CD73抗体与CD73阳性细胞的结合
使用Calu-6(内源表达CD73，人肺腺癌细胞系，购自中国科学院细胞库)，DMS114(CD73阴性，人小细胞肺癌细胞系，购自广州赛库生物技术有限公司)作为待检测细胞，采用Alexa Fluor 488山羊抗人IgG(H+L)(Thermo Fisher)作为第二抗体，采用以下流式分析技术产生结合曲线
按照每个抗体做6个浓度将一种细胞分成6份，每份有5+10E5个细胞。抗CD73抗体起始浓度为5μg/ml，用1640培养基6倍梯度稀释6个浓度梯度，加入细胞中，300μl/份细胞，37℃孵育1h。清洗后，加入1：1000稀释的二抗染色45min。清洗后，使用流式分析仪(MerkGuava)检测荧光值。
图1所显示的结果指示，所有抗CD73抗体均可结合天然表达CD73的细胞(Calu-6)。三种抗体均不结合不表达CD73的细胞(DMS114)(数据未展示)。对每一种抗体获得的结合的EC50显示于表2。
表2：抗体结合Calu-6细胞的EC50值
| 抗体μg/ml | A7 | B11 | B22 |
| EC<sub>50</sub> | 0.08114 | 0.04424 | 0.1331 |
实施例4：抗体亲和力分析
在本实施例中，用Fortebio测定抗体亲和力。本实验中使用AHC(anti-Fc)传感芯片(Fortebio，18-5060)结合配体，即IgG抗体，之后再结合分析物。用0.02％PBST缓冲液稀释抗CD73抗体，用AHC芯片在相同缓冲液中吸附抗体A7、B11、B22作为配体。将重组带His标签的CD73(近岸蛋白科技有限公司，C446)用PBST稀释至8μg/ml、4μg/ml、1.6μg/ml、0.64μg/ml、0.256μg/ml和0.102μg/ml，作为分析物，进行亲和力分析实验。分析物的每个浓度循环设置捕获时间180s；配体与分析物结合时间180s；解离时间2400s。将原始数据导入分析软件，扣除零浓度对照，并且扣除参比通道以消除容积效应，用Kinetics分析方法中的1:1结合模式拟合图形，根据结合曲线由分析软件回归计算出抗原抗体的亲和力数据。实验结果表明候选抗体A7、B11、B22均可高亲和力识别靶抗原(表3)。
表3：抗体A7、B11、B22的亲和力测定结果
| 抗体克隆 | Ka(1/Ms) | Kd(1/s) | KD(M) |
| A7 | 1.435×10<sup>6</sup> | 1.23×10<sup>-4</sup> | 8.6×10<sup>-11</sup> |
| B11 | 1.361×10<sup>6</sup> | 1.07×10<sup>-4</sup> | 7.89×10<sup>-11</sup> |
| B22 | 1.190×10<sup>6</sup> | 1.063×10<sup>-4</sup> | 8.93×10<sup>-11</sup> |
实施例5 Calu-6细胞表面CD73酶活性的抑制
使用Calu-6(内源表达CD73，人肺腺癌细胞系)作为待检测细胞。将A7、B11、B22、IgG对照(不相关抗体)四个单抗溶液按照起始浓度30μg/ml，5倍浓度梯度稀释至10个浓度梯度，每个浓度有3个复孔。将Calu-6细胞消化后铺板至U形底96孔板，10000个细胞/孔。随后将抗体加入细胞板中，10μl/孔，置于96孔板恒温振荡器上，37℃孵育30min，150rpm/min。AMP(20μM)和ATP(100mM)按照AMP：ATP:1640培养基＝1:1:8的比例稀释配置，加入细胞板中，每孔加10μl，37℃恒温振荡器孵育2h。离心，取30μl细胞培养上清至白底96孔板中，再加入30μl celltiter-Glo 2.0assay(promega/G9241)，混匀后，酶标仪用luminescence读板。
如图2所示，随抗体浓度升高，本发明抗体对细胞表面CD73的酶活性抑制增强。表4计算了抗体对酶活性抑制的IC50。
表4：抗体对细胞表面CD73酶活性抑制的IC50
| 抗体μg/ml | A7 | B11 | B22 |
| IC<sub>50</sub> | 0.0537 | 0.0336 | 0.08017 |
实施例6：CD73内吞活性
使用Calu-6(内源表达CD73，人肺腺癌细胞系)作为待检测细胞，采用Alexa Fluor488山羊抗人IgG(H+L)(Thermo Fisher)作为第二抗体，采用以下流式分析技术检测内吞。
将B11、A7、B22三种单抗分别与三组等量的Calu-6细胞孵育，室温30min，随后将不同单抗细胞组再等分三份，按照1h，2h，4h的时间离心，弃抗体上清，清洗细胞，再加入1：1000稀释的二抗染色30min。清洗后，使用流式分析仪(Merk)检测荧光值。
图3显示三种单抗在Calu-6细胞表面的内吞效果接近，随时间推移，内吞增多，2h与4h内吞接近，4h内吞饱和。
实施例7：抗体分子电荷异构体的检测
毛细管等电聚焦电泳仪(Protein Simple iCE3)，毛细管柱(Protein Simple FC-coated)
样品溶液：取适量系统适用性样品，供试品，加超纯水稀释至1mg/ml，振荡混匀待用。
取适量空白溶液(稀释倍数同供试品)、样品溶液按照表5配制，取150μl加入内插管中，将内插管置于离心管中，12000rpm离心1min，即得空白对照溶液、系统适用性溶液和供试品溶液。
表5进样溶液配制方法
| 试剂 | 体积 | 终体积百分比 |
| 1％甲基纤维素 | 70μl | 35％ |
| 两性电解质3～10 | 7.0μl | 3.5％ |
| 两性电解质8～10.5 | 3.0μl | 1.5％ |
| 标记物：pI＝7.05，pI＝9.50 | 各0.5μl，共1.0μl | 各0.25％ |
| 1mg/ml样品溶液/空白对照 | 50μl | 25％ |
| 40mM精氨酸 | 69μl | 34.5％ |
依次进样空白对照溶液1针，系统适用性溶液3针，待测供试品溶液各1针，最后进针系统适用性溶液，按照表6条件操作实验。以仪器自带操作软件，以两个标记物的pI值和其相对应的像素位置值，进行校正分析，自动计算出样品对应的pI值。
表6：等电聚焦条件
| 方法参数 | 状态 |
| Focus Period 1 Time | 1.00min |
| Focus Period 1 Voltage | 1500V |
| Focus Period 2 Time | 9.00min |
| Focus Period 2 Voltage | 3000V |
表7所示为样品碱性峰、主峰、酸性峰的比例，表明抗体主峰浓度符合典型抗体成药性分析结果。图4所示为样品的等电点及纯度测定图谱，也符合典型抗体成药性分析结果。
表7：样品的酸碱峰和主峰比例
| 名称 | 碱性峰 | 主峰 | 酸性峰 |
| A7 | 11.86 | 80.89 | 7.25 |
| B11 | 1.35 | 86.77 | 11.88 |
| B22 | 50.42 | 43.65 | 5.94 |
实施例8：分子排阻色谱法分析
液相色谱柱：TOSOH TSK-GEL G3000SWXL 7.8*300mm 5μm；
色谱条件：流动相为0.02M磷酸二氢钠-0.2M氯化钠缓冲液，pH7.4；
取样品适量用超纯水稀释至5mg/ml，取20μl上样检测，波长280nm，流速0.5ml/min，室温恒温运行30min。
表8列出了经分子排阻法测出各样品的聚体，单体，碎片比例，符合典型抗体成药性分析结果。图5列出了具体的SEC色谱图，符合典型抗体成药性分析结果。
表8：抗体分子排阻测出的成分比例
| 名称 | 聚体 | 单体 | 碎片 |
| A7 | 0.459 | 99.310 | 0.231 |
| B11 | 0.075 | 99.842 | 0.084 |
| B22 | 0.250 | 99.640 | 0.110 |
实施例9：毛细管凝胶电泳法测定单克隆抗体纯度
仪器：毛细管电泳仪Agilent Technology 7100，毛细管Agilent Technology内径50μm，运行缓冲液贝克曼库尔特有限公司SDS-MW Gel Buffer-proprietary formulation，pH8，0.2％SDS；
溶液配置：样品缓冲液(100mM Tris-HCl,pH9.0,1％SDS)；0.1M盐酸洗液；800mM碘乙酰胺溶液。运行溶液配制(表9)。
表9：运行溶液配制表
注：将序号1-12样品瓶依次放置于毛细管电泳仪样品盘的1-12号位(或者样品盘的15-26号位)
CE-SDS还原电泳样品配制：包括供试品溶液及空白对照溶液。
取样品适量，加入样品缓冲液及巯基乙醇稀释至1.0mg/ml，其中巯基乙醇体积比为5％，混匀后，70℃水浴15min；取出，冷却到室温后6000转/min，离心1min，转移75μl溶液至样品瓶中，确保无气泡产生，即得供试品溶液，用样品缓冲液替代样品即得空白对照溶液。
CE-SDS非还原电泳样品配制，即供试品溶液：取样品加入样品缓冲液及800mM碘乙酰胺溶液稀释至1.0mg/ml，其中800mM碘乙酰胺溶液体积比为5％，混匀后，70℃水浴5min；取出，冷却到室温后6000转/min，离心1min，转移75μl溶液至样品瓶中，确保无气泡产生。用样品缓冲液替代样品即得空白对照溶液。
检测方法如表10所示。
表10：方法参数概述
非还原电泳：按面积归一化法计算，报告免疫球蛋白单体峰的含量，低分子片段峰含量之和，及HHL峰的含量。
还原电泳：按面积归一化法计算报告轻链含量，重链含量以及免疫球蛋白重链和轻链含量之和。
结果如表11所示：非还原CE-SDS中A7中完整抗体的含量有82％，B11中完整抗体的含量有85％，两者接近，片段HHL的含量有14～18％；还原CE-SDS中HC含量有64％。
表11：CE-SDS结果表
序列表
A7
B11
B22
A7
B11
B22
Claims (10)
1.抗CD73抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包含H CDR1、H CDR2和H CDR3，所述轻链可变区包括L CDR1、L CDR2和L CDR3；
所述H CDR1的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17所示，或者所述HCDR1的序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:17有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述H CDR2的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18所示，或者所述HCDR2的序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:18有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述H CDR3的序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19所示，或者所述HCDR3的序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:19有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述L CDR1的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21所示，或者所述LCDR1的序列与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:21有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述L CDR2的序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22所示，或者所述LCDR2的序列与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性；
所述L CDR3的序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23所示，或者所述LCDR3的序列与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23有95％以上，如96％、97％、98％、99％的序列一致性。
2.根据权利要求1所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其中，
所述抗体的重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；或者
所述抗体的重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；或者
所述抗体的重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；以及
所述抗体的轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；或者
所述抗体的轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或者
所述抗体的轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
3.根据权利要求2所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其中，
所述抗体为A7，其重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
其轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；或者
所述抗体为B11，其重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
其轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；或者
所述抗体为B22，其重链可变区包含：
H CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，
H CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，和
H CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；
其轻链可变区包含：
L CDR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，
L CDR2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，和
L CDR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；
优选地，所述抗CD73抗体A7包含重链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或与SEQ ID NO:4具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性；所述抗CD73抗体A7包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或与SEQ ID NO:8具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性；
优选地，所述抗CD73抗体B11包含重链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，或与SEQ ID NO:12具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性；所述抗CD73抗体B11包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:16所示，或与SEQ ID NO:16具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性；
优选地，所述抗CD73抗体B22包含重链可变区，其中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，或与SEQ ID NO:20具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性；所述抗CD73抗体B22包含轻链可变区，其中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:24所示，或与SEQ ID NO:24具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗CD73抗体包含重链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，或与SEQID NO:26具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性；以及，
所述抗CD73抗体包含轻链恒定区，优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO:25所示，或与SEQ ID NO:25具有至少85％、至少90％、至少95％或更高的序列一致性。
5.一种核酸分子，包括编码权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列区；优选地，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31和SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35，或者SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43，或者SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51；进一步优选地，所述核苷酸序列区的核苷酸序列包括SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36，或者SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:44，或者SEQ ID NO:48和52。
6.一种表达载体，包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8.一种药物组合物，包含权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体；优选地，所述抗体为A7、B11、B22或其组合。
9.一种制备权利要求1-4任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段的方法，包括：培养权利要求7所述的宿主细胞，及自所述宿主细胞分离所述抗体。
10.权利要求1-4任一项所述的抗CD73抗体或其抗原结合片段或者权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤性疾病的药物中的应用；优选地，所述的肿瘤性疾病为CD73阳性肿瘤；优选地，所述CD73阳性肿瘤为肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、前列腺癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、皮肤癌、中枢神经系统新生物、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、胃癌、肉瘤及病毒相关的癌症。
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