CN115916349A

CN115916349A - 针对Lewis Y的人源化抗体

Info

Publication number: CN115916349A
Application number: CN202180043633.9A
Authority: CN
Inventors: A·丹尼尔奇克; J·格莱尔特; A·弗勒什奈; P·克莱尔
Original assignee: Glycotope GmbH
Current assignee: Glycotope GmbH
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2023-04-04
Also published as: EP4171749A1; WO2022002887A1; KR20230030626A; US20230235076A1; JP2023530720A; AU2021298824A1

Abstract

本发明涉及人源化抗Lewis Y抗体，其特异性结合Lewis Y且不显示任何交叉反应性。特别是，人源化抗Lewis Y抗体不与Lewis b或任何其他血型碳水化合物抗原结合。特别地，本发明涉及用于治疗癌症的人源化抗Lewis Y抗体。

Description

针对Lewis Y的人源化抗体

发明领域

本发明涉及抗体领域。特别地，提供了一种人源化抗Lewis Y抗体，其对聚糖抗原表现出特殊的靶特异性和亲和力。在特定实施方案中，本发明涉及用于治疗和诊断用途的人源化抗Lewis Y抗体。

发明背景

今天，抗体在医学和研究领域被广泛使用。在医学上，它们在许多不同的领域都有应用。例如，抗体被用作治疗和预防多种疾病的治疗剂，如癌症、心血管疾病、炎症性疾病、黄斑变性、移植排斥、多发性硬化和病毒感染。在这些疗法中，抗体可自身具有治疗活性，例如通过阻断受体或信使分子，从而抑制其与疾病相关的功能，或通过招募和激活患者免疫系统的成分。

特异性抗体是通过向哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊或马)注射抗原而产生的。从这些动物分离的血液含有针对血清中所述抗原的多克隆抗体。为了获得对抗原的单个表位具有特异性的抗体，从动物中分离出分泌抗体的淋巴细胞，并通过将其与癌细胞系融合而永生化，从而产生杂交瘤细胞。然后通过稀释克隆分离单个杂交瘤细胞，以产生均产生相同单克隆抗体的细胞克隆。

然而，在治疗应用中，这些单克隆抗体有一个问题，即它们来源于动物生物，氨基酸序列与人抗体不同。因此，人类免疫系统将这些动物抗体识别为外来抗体，并迅速将其从循环中清除。此外，还可能引起全身炎症反应。这个问题的解决方案是用人抗体的相应部分替换单克隆抗体的某些恒定部分。如果仅替换重链和轻链恒定区，则获得嵌合抗体，而额外替换重链可变区和轻链可变区的框架区则产生所谓的人源化抗体。

在研究中，纯化的抗体用于许多应用。它们最常用于识别和定位生物分子，例如特定的蛋白质。生物分子可以在分离后进行检测，例如确定其存在、浓度、完整性或大小。另一方面，可以在细胞或组织样本中检测它们，例如以确定它们的存在或位置。此外，抗体用于特定生物物质，特别是蛋白质的分离过程，其中抗体特异性地将感兴趣的生物物质与含有它的样品分离。

在所有这些应用中，抗原的紧密结合和特异性识别对于所用抗体至关重要。因此，获得了较高的活性和较少的交叉反应性，特别是在治疗应用中较少的不良副作用。然而，在单克隆抗体的人源化过程中，工程抗体的亲和力和特异性通常会降低。

一组有趣且重要的抗体是针对碳水化合物部分的抗体。特别是组织血型碳水化合物链是抗体的有趣靶点，因为它们通常是肿瘤特异性或肿瘤相关抗原。例如，包括乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和小细胞肺癌在内的几种不同上皮癌细胞表达的碳水化合物结构Lewis Y[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-](也称为LeY)比任何细胞表面蛋白抗原都丰富。在各自的肿瘤中，高百分比的肿瘤细胞是LeY阳性的，甚至包括癌干细胞。因此，这些碳水化合物抗原是肿瘤成像和主动或被动免疫治疗的潜在靶点。

针对这些碳水化合物结构的抗体通常与几个问题相关。特别是，由于正常组织中存在相同或密切相关的碳水化合物结构，如红细胞上的H2型表达，或人类髓细胞(如成熟粒细胞)上的Lewis X，可能会产生不希望的副作用。例如，一些针对LeY的抗体在临床试验中失败，因为它们对LeX具有交叉反应，并显示出不利的疗效和/或安全性。此外，与其他聚糖表位的交叉反应是一个常见问题。例如，大多数识别Lewis Y的现有抗体对其他碳水化合物结构如Lewis b[Fucα1-4(Fucα1-2Galβ1-3)GlcNAcβ-]表现出交叉反应性，这会降低其治疗潜力。此外，碳水化合物抗原通常产生IgM型的免疫应答，这被认为不是适合治疗的抗体形式。使用重组抗体技术，可以进行从IgM到IgG的类别转换。然而，由于碳水化合物结合抗体的低内在亲和力，相当大的功能亲和力丧失。

已知的针对Lewis Y的特异性抗体是单克隆抗体A70-A/A9和A70-C/C8，以及通过链重排获得的组合A/A9-C/C8抗体(该抗体包含A70-A/A9的重链和A70-C/C8的轻链)。然而，这些是具有鼠可变区的嵌合抗体，其可能导致上述非人抗体的问题。因此，这些抗体的人源化将是有益的。不幸的是，人源化抗体对其靶抗原的亲和力和特异性通常低于相应的非人或嵌合抗体。这是因为可变区的整体三维结构，特别是互补决定区(CDR)的构象和取向可以通过框架区的替换而改变。这对于通常具有低抗原亲和力和特异性的针对碳水化合物抗原的抗体来说尤其有问题。例如，抗体A70-A/A9显示出与Lewis b的交叉反应性。

因此，本领域需要提供具有特异性高抗原结合亲和力和抗原特异性的人源化抗Lewis Y抗体。

发明概述

本发明人已经发现人源化抗Lewis Y抗体具有与衍生它们的亲本嵌合抗体相当的抗原结合亲和力。此外，这些人源化抗体表现出增强的抗原特异性，因为在人源化形式中防止了与亲本嵌合抗体的Lewis b的交叉反应性。

因此，在第一方面，本发明涉及一种人源化抗体，其能够与Lewis Y结合并包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ IDNO:10的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。

在第二方面，本发明提供编码根据本发明的抗体的核酸。此外，在第三方面，提供了包含根据本发明的核酸和与所述核酸可操作地连接的启动子的表达盒或载体，以及在第四方面，提供包含本发明的核酸或表达盒或者载体的宿主细胞。

在第五方面，本发明提供一种缀合物，其包含与另一种试剂缀合的本发明抗体。

在第六方面，本发明涉及包含本发明抗体、本发明核酸、本发明表达盒或载体、本发明宿主细胞或本发明缀合物的组合物。

根据第七方面，本发明提供了本发明的抗体、核酸、表达盒或载体、宿主细胞、组合物或缀合物，其用于医学，特别是用于治疗癌症。

本发明的其他目的、特征、优点和方面对于本领域技术人员来说将从以下描述和所附权利要求中变得显而易见。然而，应当理解，以下描述、所附权利要求和具体示例(其指示了本申请的优选实施方案)仅通过说明的方式给出。通过阅读以下内容，本领域技术人员将容易明白在所公开的发明的精神和范围内的各种变化和修改。

定义

如本文所用，以下表达通常优选具有如下所述的含义，除非其使用的上下文另有指示。

此处使用的“包含”一词，除字面含义外，还包括并具体指“基本上由”和“由……组成”的表达。因此，表达“包含”是指其中“包含”具体列出的元素的主题不包含其他元素的实施方案，以及其中“包括”具体列出元素的主题可以和/或确实包含其他元素。同样，表达式“具有”应理解为表达“包括”，也包括并具体指表达“基本上由……组成”和“由……组成”。在可能的情况下，术语“基本上由……组成”特别指的是其中除了主题基本上由其组成的具体列出的元素之外，主题包括20％或更少、特别是15％或更少、10％或更少或特别是5％或更少的其他元素的实施方案。

术语“抗体”特别指包含至少两条重链和两条轻链(由二硫键连接)的蛋白质。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链恒定区包括三个或(在IgM或IgE型抗体的情况下)四个重链恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)，其中第一恒定结构域CH1与可变区相邻并且可以通过铰链区连接到第二恒定结构域CH2。轻链恒定区仅由一个恒定域组成。可变区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)，其中每个可变区包括三个CDR和四个FR。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。重链恒定区可以是任何类型的，如γ-、δ-、α-、μ-或ε-型重链。优选地，抗体的重链是γ链。此外，轻链恒定区也可以是任何类型的，例如κ或λ型轻链。优选地，抗体的轻链是κ链。术语“γ-(δ-、α-、μ-或ε-)型重链”和“κ-(λ-)型轻链”分别指抗体重链或抗体轻链，其具有源自天然存在的重链或轻链恒定区氨基酸序列的恒定区氨基酸，特别是人重链或轻链恒定区的氨基酸序列。特别地，γ型(特别是γ1型)重链的恒定结构域的氨基酸序列与人γ(特别是人γ1的同种异型之一)抗体重链的恒定结构域的序列至少95％，特别是至少98％相同。此外，κ型轻链的恒定结构域的氨基酸序列特别是至少95％，特别是至少98％，与人κ抗体轻链的同种异型之一的恒定结构的氨基酸序列相同。抗体的恒定区域可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。抗体可以是例如人源化、人或嵌合抗体。

抗体的抗原结合部分通常指保留特异性结合抗原的能力的抗体的全长或一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实现。抗体的结合片段的实例包括Fab片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)₂片段，包含两个Fab片段的二价片段，每个Fab片段结合同一抗原，在铰链区通过二硫键连接；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；以及由VH结构域组成的dAb片段。

抗体的“Fab部分”特别是指抗体的一部分，包括重链和轻链可变区(VH和VL)以及重链和重链恒定区的第一结构域(CH1和CL)。在抗体不包含所有这些区域的情况下，术语“Fab部分”仅指抗体中存在的VH、VL、CH1和CL区域。优选地，“Fab部分”是指与通过用木瓜蛋白酶消化天然抗体而获得的片段相对应的抗体部分，该片段含有抗体的抗原结合活性。特别地，抗体的Fab部分包含其抗原结合位点或抗原结合能力。优选地，Fab部分至少包含抗体的V_H区。

抗体的“Fc部分”特别是指包含重链恒定区2、3和-4(CH2、CH3和CH4)的抗体部分。特别地，Fc部分包括这些区域中的两个。在抗体不包含所有这些区域的情况下，术语“Fc部分”仅指抗体中存在的区域CH2、CH3和CH4。优选地，Fc部分至少包含抗体的CH2区。优选地，“Fc部分”是指与通过用木瓜蛋白酶消化天然抗体而获得的片段相对应的抗体部分，其不包含抗体的抗原结合活性。特别地，抗体的Fc部分能够结合Fc受体，因此例如包括Fc受体结合位点或Fc受体的结合能力。

根据本发明，术语“嵌合抗体”特别是指一种抗体，其中恒定区源自人抗体或人抗体共有序列，并且其中至少一个且优选两个可变区源自非人抗体，例如源自啮齿动物抗体，例如小鼠抗体。

根据本发明，术语“人源化抗体”特别是指包含人恒定区和可变区的非人抗体，所述人恒定区或可变区的氨基酸序列被修饰以降低抗体在施用到人体时的免疫原性。构建人源化抗体的示例性方法是CDR移植，其中非人抗体的CDR或特异性决定残基(SDR)与人源性框架区结合。任选地，人框架区的一些残基可以向亲本非人抗体的残基反向突变，例如用于增加或恢复抗原结合亲和力。其他人源化方法包括，例如，重新表面处理、超人源化和人字符串内容优化(human string content optimization)。在重新表面处理方法中，只有位于抗体表面的非人框架区的那些残基被存在于所述位置的相应人抗体序列中的残基取代。超人源化本质上对应于CDR移植。然而，虽然在CDR移植过程中，通常根据其与非人框架区的同源性来选择人框架区，但在超人源化中，选择人框架区域的基础是CDR的相似性。在人字符串内容优化中，对非人抗体序列与人生殖系序列的差异进行评分，然后对抗体进行突变以使所述评分最小化。此外，人源化抗体也可以通过经验方法获得，其中使用人框架区或人抗体的大库来产生多个抗体人源化候选物，然后通过筛选方法确定最有前景的候选物。同样，通过上述合理的方法，可以产生几个人源化抗体候选物，然后进行筛选，例如用于其抗原结合。

如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人源序列。

如本文所使用的术语“抗体”在某些实施方案中指代同种抗体群体。特别地，抗体群体的所有抗体都表现出用于定义抗体的特征。在某些实施方案中，抗体群体中的所有抗体具有相同的氨基酸序列。提及特定种类的抗体，例如抗Lewis Y抗体，特别是指此类抗体的群体。

本文中使用的术语“抗体”还包括所述抗体的片段和衍生物。抗体的“片段或衍生物”特别是一种蛋白质或糖蛋白，其来源于所述抗体，并且能够与相同的抗原结合，特别是与抗体相同的表位结合。因此，本文中抗体的片段或衍生物通常指功能性片段或衍生物。在特别优选的实施方案中，抗体的片段或衍生物包含重链可变区。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体或其衍生物的片段来实现。抗体片段的实例包括(i)Fab片段，由每个重链和轻链的可变区和第一恒定区组成的单价片段；(ii)F(ab)₂片段，包含两个Fab片段的二价片段，所述Fab片段在铰链区通过二硫键连接；(iii)由重链的可变区和第一恒定结构域CH1组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的重链和轻链可变区组成的Fv片段；(v)由单个多肽链组成的Fv片段、scFv片段；(vi)由共价连接在一起的两个Fv片段组成的(Fv)₂片段；(vii)重链可变结构域；和(viii)由共价连接在一起的重链可变区和轻链可变区组成的多体，连接方式使得重链和轻链可变区的结合只能发生在分子间而不能发生在分子内。抗体的衍生物特别包括与亲本抗体结合相同抗原的抗体，但其氨基酸序列与衍生该抗体的亲本抗体不同。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段和衍生物。

如果目标氨基酸序列在其整个长度上与参考氨基酸序列的相应部分具有至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性，则目标氨基酸序列“衍生”自参考氨基酸序列或“对应”于参考氨基酸序列。“对应部分”是指，例如，目标抗体的重链可变区(FRH1)的框架区1对应于参考抗体的重链式可变区的框架区1。在特定实施方案中，从参考氨基酸序列“衍生”或“对应”于参考氨基酸序列的目标氨基酸序列在其全长上与参考氨基酸序列对应部分100％同源，或特别是100％相同。氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”优选根据本发明在参考序列的整个长度上或在参考序列对应于定义同源性或同一性的序列的相应部分的整个长度上来确定。源自由一个或多个氨基酸序列(例如特定CDR序列或特定可变区序列)定义的亲本抗体的抗体，特别是与亲本抗体的相应氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同源或相同(例如CDR序列或可变区序列)，特别是相同的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，源自亲本抗体(即，其衍生物)的抗体包含与亲本抗体相同的CDR序列，但在可变区的剩余序列上不同。

本文所用的术语“抗体”还指多价和多特异性抗体，即具有两个以上结合位点的抗体构建体，每个结合位点与同一表位结合，以及具有一个或多个结合位点与第一表位结合和一个或多个结合位点与第二表位结合的抗体构建，并且任选地甚至进一步结合位点结合到进一步的表位。

特异性结合”优选地是指试剂(如抗体)与特异的靶(如表位)的结合比与另一靶的结合更强。如果试剂以低于第二靶标解离常数(K_d)的解离常数与第一靶标结合，则与第二靶标相比，试剂与第一靶标的结合更强。优选地，所述试剂特异性结合的靶的解离常数比所述试剂不特异性结合靶的解离常量低100倍、200倍、500倍或1000倍以上。此外，术语“特异性结合”特别表示结合伴侣之间的结合亲和力，亲和力常数K_a为至少10⁵M^-1、优选至少10⁶M^-1、更优选至少10⁷M^-1，例如至少10⁸M^-1。对特定抗原特异的抗体特别是指能够以K_a为至少10⁵M^-1、优选至少10⁶M^-1、更优选至少10⁷M^-1的亲和力结合所述抗原的抗体。例如，术语“抗Lewis Y抗体”是指特异性结合Lewis Y的抗体，并且优选能够以K_a为至少10⁵M^-1、优选至少10⁶M^-1、更优选至少10⁷M^-1的亲和力结合Lewis Y。

本文中使用的术语“A70-A/A9”特别是指分别具有SEQ ID NO:30和31的重链和轻链可变区氨基酸序列的人/小鼠嵌合抗体。

根据本发明的术语“Lewis Y”或“LeY”特别是指碳水化合物结构(或寡糖)Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-，其特别可以连接到支持结构或载体分子，例如肽、蛋白质、脂质或碳水化合物结构。在上述结构中，Fuc表示岩藻糖残基，Gal表示半乳糖残基并且GlcNAc表示N-乙酰氨基葡萄糖残基。“α1-2”、“β1-4”和“α1-3”表示两个相邻单糖残基的连接，特别是左侧单糖的碳原子C1和右侧单糖的碳原子C2、C4或C3之间的分别的连接，其中碳原子C1处的连

术语“GlcNAcβ-”表示Lewis Y寡糖还原端的GlcNAc残基以β-构型连接到支撑结构。图1还显示了Lewis Y和相关血型抗原的结构示意图。

Lewis Y是人体血型系统的碳水化合物抗原。它在许多肿瘤上表达，可作为肿瘤相关或肿瘤特异性抗原用于定向癌症治疗。

术语“唾液酸”特别是指神经氨酸的任何N-或O-取代的衍生物。它可以指的是5-N-乙酰神经氨酸和5-N-乙醇基神经氨酸，但优选地仅指的是5-N-乙酰神经氨基酸。

术语“聚糖”、“聚糖结构”、“碳水化合物”、“糖链”和“碳水化合物结构”在本文中通常用作同义词。

在“共轭物”中，两种或多种化合物连接在一起。在某些实施方案中，每个化合物的至少一些性质保留在缀合物中。连接可以通过共价键或非共价键实现。优选地，缀合物的化合物通过共价键连接。共轭物的不同化合物可以通过化合物原子之间的一个或多个共价键直接彼此结合。或者，所述化合物可以通过化学部分例如连接分子彼此结合，其中所述连接分子共价连接到所述化合物的原子上。如果缀合物由两种以上的化合物组成，则这些化合物可以例如以链构象连接，一种化合物连接到下一化合物上，或者几种化合物各自可以连接到一种中心化合物上。

术语“核酸”包括单链和双链核酸和核糖核酸以及脱氧核糖核酸。它可以包括天然存在的和合成的核苷酸，并且可以天然或合成修饰，例如通过甲基化、5’-和/或3’-帽。

术语“表达盒”特别是指能够实现和调节引入其中的编码核酸序列的表达的核酸构建体。表达盒可以包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。表达盒的确切结构可根据物种或细胞类型功能而变化，但通常包括分别参与转录和翻译起始的5’-未转录和5’-和3’-未翻译序列，例如TATA盒、帽序列、CAAT序列等。更具体地，5’-未转录的表达控制序列包含启动子区，该启动子区包含用于操作地连接核酸的转录控制的启动子序列。表达盒还可以包括增强子序列或上游激活子序列。

根据本发明，术语“启动子”是指位于待表达核酸序列上游(5’)的核酸序列，并通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点来控制该序列的表达。“启动子”可包括对参与基因转录调控的其他因子的进一步识别和结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可是“可诱导的”，即响应于诱导剂启动转录，或者如果转录不受诱导剂控制，则启动子可是“组成的”。在诱导型启动子控制下的基因在诱导剂不存在的情况下不表达或仅表达低程度。在诱导剂的存在下，基因被打开或转录水平增加。一般来说，这是由特定转录因子的结合介导的。

术语“载体”在这里以其最一般的含义使用，并且包括用于核酸的任何中间载体，该载体例如能够将所述核酸引入原核和/或真核细胞中，并且在适当的情况下能够整合到基因组中。这类载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌体、噬菌体或病毒基因组。本文中使用的术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常是环状DNA双链体，其可以独立于染色体DNA进行复制。

根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”包括原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞，特别是人或仓鼠细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人类、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可衍生自多种组织类型，并包括原代细胞和细胞系。核酸可以以单个拷贝或两个或更多拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在宿主细胞中表达。

根据本发明，术语“患者”是指人类、非人灵长类动物或另一种动物，特别是哺乳动物，如牛、马、猪、羊、山羊、狗、猫或啮齿动物，如小鼠和大鼠。在特别优选的实施方案中，患者是人。

根据本发明的术语“癌症”特别包括白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠道癌、淋巴结癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移。术语癌症还指和/或包括癌症干细胞，特别是上述特定类型癌症的癌症干细胞。

“肿瘤”是指由细胞增殖失调形成的一组细胞或组织。肿瘤可能表现为部分或完全缺乏结构组织和功能协调(与正常组织)，通常形成一个明显的组织块，可能是良性或恶性的。

“转移”是指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是一个非常复杂的过程，通常涉及癌细胞从原发肿瘤中分离出来，进入身体循环，并在身体其他地方的正常组织中驻留生长。当肿瘤细胞转移时，新肿瘤被称为继发性或转移性肿瘤，其细胞通常与原始肿瘤中的细胞相似。例如，这意味着，如果乳腺癌转移到肺部，则继发肿瘤由异常的乳腺细胞组成，而不是由异常的肺细胞组成。肺部的肿瘤被称为转移性乳腺癌，而不是肺癌。

术语“药物组合物”特别指适用于给人或动物施用的组合物，即含有药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或其盐或前药以及载体、稀释剂或药物赋形剂，例如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂。

发明详述

本发明基于具有类似于相应嵌合抗体的抗原结合亲和力的人源化抗Lewis Y抗体的开发。本发明人可以进一步证明人源化抗体出乎意料地具有改进的抗原特异性。亲本嵌合抗体除了对Lewis Y的主要特异性外，还显示出与Lewis b的显著结合。这种交叉反应性对于与碳水化合物抗原结合的抗体来说是常见的，因为这些抗原相当小并且可能非常相似。例如，Lewis Y和Lewis b的不同之处仅在于岩藻糖臂和岩藻糖-半乳糖臂在GlcNAc中心残基处的连接点被切换(见图1)。然而，本发明提供的人源化抗Lewis Y抗体令人惊讶地不显示与其他碳水化合物抗原的任何交叉反应性，特别是与Lewis b的交叉反应性。

鉴于这些发现，本发明提供了一种人源化抗体，其能够与Lewis Y结合并包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ IDNO:10的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。

此外，人源化抗体可表现出类似于参考抗体的抗原结合性质，所述参考抗体包含具有SEQ ID NO:30氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:31氨基酸序列的轻链可变区。优选地，参考抗体是人/小鼠嵌合抗体A70-A/A9。特定地，根据本发明的人源化抗体可以特异性结合与参考抗体相同的抗原，并且可以优选地以相当的亲和力结合所述抗原。即，人源化抗体优选以解离常数比参考抗体高至多1000倍、更优选高至多200倍、高至多100倍、高至多20倍或高至多10倍的亲和力结合抗原。最优选地，解离常数与参考抗体的解离常数大致相同，特别是不高于2倍。此外，人源化抗体优选显示与参考抗体的交叉特异性，所述参考抗体包含具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区。特别地，如果以足够高的浓度存在，人源化抗体能够阻断参考抗体与Lewis Y的结合。如果当根据本发明的人源化抗体已经与Lewis Y结合时，参考抗体与LewisY的结合受阻是可能的。

在某些实施方案中，人源化抗体特异性结合Lewis Y。特别地，人源化抗体对Lewisb不显示显著的结合亲和力和/或不特异性结合Lewis b。在某些实施方式中，与与Lewis b结合的人源化抗体的解离常数相比，与Lewis Y结合的人源化抗体的解离常数低至少10倍。特别地，与Lewis b的结合相比，与Lewis Y结合的解离常数低至少20倍、至少50倍或至少100倍。

在某些实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少93％相同的氨基酸序列。特别地，重链可变区包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％，特别是至少98％相同的氨基酸序列。

在特定实施方案中，人源化抗体的重链可变区包含具有SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1、具有SEQ ID NO:14或15的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ IDNO:16的氨基酸序列的CDR-H3。特别地，重链可变区包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:12、14和16或SEQ ID NO:13、15和16的氨基酸序列的三个特定CDR。因此，与SEQ ID NO:10的任何序列偏差位于框架区，而不位于CDR中。

在某些实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。特别地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少93％相同的氨基酸序列。特别地，重链可变区包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少95％，特别是至少98％相同的氨基酸序列。在特定实施方案中，重链可变区包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ IDNO:12、14和16的氨基酸序列的三个特定CDR。

具体地，人源化抗体可包含具有根据SEQ ID NO:1至9中任一项的氨基酸序列的重链可变区。特别地，所述重链可变区域具有根据SEQ ID NO:1至6中任一项，特别是SEQ IDNO:1或4，优选SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述重链可变区包含与SEQID NO:1的氨基酸序列至少90％，特别是，至少93％、至少95％相同的氨基酸序列，特别是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，重链可变区优选具有具有SEQ ID NO:12、14和16的氨基酸序列的三个特定CDR。

在某些实施方案中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少93％相同的氨基酸序列。特别地，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有至少95％，特别是至少98％相同的氨基酸序列。

在特定实施方案中，人源化抗体的轻链可变区包含具有SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1、具有SEQ ID NO:26或27的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ IDNO:28或29的氨基酸序列的CDR-L3。特别地，轻链可变区包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:24、26和28或SEQ ID NO:25、27和29的氨基酸序列的三个特定CDR。因此，与SEQ ID NO:22的任何序列偏差位于框架区，而不位于CDR中。

在某些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与SEQ ID NO:23的氨基酸顺序至少90％相同的氨基酸序列。特别地，轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少93％相同的氨基酸序列。特别地，轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少95％，特别是至少98％相同的氨基酸序列。在特定实施方案中，轻链可变区包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:24、26和28的氨基酸序列的三个特定CDR。

具体地，人源化抗体可包含具有根据SEQ ID NO:17至21中任一项的氨基酸序列的轻链可变区。特别地，所述轻链可变区域具有根据SEQ ID NO:17或18，特别是SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少90％相同，特别是至少93％、至少95％相同的氨基酸序列，或特别是与SEQ ID NO：17的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。

在特定实施方案中，人源化抗体具有重链可变区，其包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:12、14和16或SEQ IDNO:13、15和16的氨基酸序列的三个特定CDR；以及轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:24、26和28或SEQ IDNO:25、27和29的氨基酸序列的三个特定CDR。在某些优选实施方案中，人源化抗体包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区。

在特定实施方案中，人源化抗体具有重链可变区，其包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:12、14和16的氨基酸序列的三个特定CDR；和轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且另外具有具有SEQ ID NO:24、26和28的氨基酸序列的三个特定CDR。在某些优选实施方案中，人源化抗体包含包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方案中，人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:1至7和9，特别是1至6的氨基酸序列，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:17或18，特别是17的氨基酸序列。特别地，人源化抗体包含包含SEQ ID NO:1或4的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区。特别地，人源化抗体包含包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的轻链可变区。在其他实施方案中，人源化抗体包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:19的氨基酸顺序的轻链可变区。

在优选实施方案中，人源化抗体包含Fc区。人源化抗体尤其可以是全抗体。人源化抗体可以是任何同种型的，特别是IgG型抗体，特别是IgG1、IgG2或IgG4。在特定实施方案中，人源化的抗体是IgG1型抗体。人源化抗体尤其能够结合一种或多种人Fc受体，特别是人Fcγ受体，如Fcγ受体IIIa。

在进一步的实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体是抗体的片段。特别地，所述片段选自(i)Fab片段；(ii)F(ab)₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)scFv片段；和(vi)(Fv)₂片段。在某些实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体不包含Fc区。

在某些实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体被糖基化，特别是N-糖基化。特别地，人源化抗体在重链的第二恒定结构域(CH2)中具有糖基化位点。抗体通常具有两条具有相同氨基酸序列的重链。因此，人源化抗体优选具有至少两个糖基化位点，其两个CH2结构域中的每一个都有一个。该糖基化位点尤其位于对应于根据Kabat编号的重链的氨基酸位置297的氨基酸位置，并且具有氨基酸序列基序Asn-Xaa-Ser/Thr，其中Xaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。Asn297处的N-连接糖基化在哺乳动物IgG以及其他抗体同种型的同源区中是保守的。由于可变区中可存在的可选的额外氨基酸或其他序列修饰，该保守糖基化位点的实际位置可能在抗体的氨基酸序列中有所不同。

在优选实施方案中，人源化抗-Lewis Y抗体不包含N-乙醇酰基神经氨酸(NeuGc)或可检测量的NeuGc。此外，人源化抗体优选也不包含Galili表位(Galα1,3-Gal结构)或可检测量的Galili表位。特别是，携带NeuGc和/或Galα1,3-Gal结构的聚糖的相对量小于抗体群体中附着于人源化抗体Fc部分的聚糖总量的0.1％或甚至小于0.02％。

在其他实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体在其CH2结构域处未糖基化。在这些实施方案中，抗体的CH2结构域可以突变，例如通过用任何其他氨基酸(例如丙氨酸或谷氨酰胺)取代重链297位(或相应位置)的天冬酰胺残基。在CH2结构域缺乏糖基化的抗体与Fcγ受体的结合降低，因此效应子功能降低。在进一步的实施方案中，人源化抗-Lewis Y抗体可以具有减少Fc受体结合的其他或额外的氨基酸取代，包括例如Leu235Glu(“LE突变”)、Leu234Ala/Leu235Ala(“LALA”突变)、Ser228Pro/Leu235Glu(“SPLE”突变)、Leu234Ala/Leu235Ala/Pro329Gly(“LALA-PG”突变)及其组合。

人源化抗Lewis Y抗体优选在宿主细胞中重组产生。因此，人源化抗体特别是单克隆抗体。用于产生人源化抗体的宿主细胞可以是可用于产生抗体的任何宿主细胞。合适的宿主细胞特别是真核宿主细胞，特别是哺乳动物宿主细胞。示例性宿主细胞包括酵母细胞如毕赤酵母细胞系、昆虫细胞如SF9和SF21细胞系、植物细胞、鸟类细胞如EB66鸭细胞系、啮齿动物细胞如CHO、NS0、SP2/0和YB2/0细胞系以及人类细胞如HEK293、PER.C6、CAP、CAP-T、AGE1.HN、Mutz-3和KG1细胞系。

在某些实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体在人细胞系中，特别是在人髓系白血病细胞系中重组产生。WO 2008/028686 A2中描述了可用于制备抗-Lewis Y抗体的优选人细胞系以及合适的制备方法。在特定实施方案中，人源化抗-LewisY抗体通过在选自NM-H9D8、NM-H9D6-E6和NM-H9D9-E6Q12的人髓系白血病细胞系中表达而获得。根据布达佩斯条约的要求，这些细胞系以保藏号DSM ACC2806(NM-H9D8；2006年9月15日保藏)、DSM ACC2807(NM-H9D8-E6；2006年10月5日保藏)和DSM ACC2856(NM-H9D8-E6Q12；2007年8月8日保藏)保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig(DE)，Glycotope GmbH，Robert-

-Str.10，13125柏林(DE)。NM-H9D8细胞提供具有高度唾液酸化、高度二等分GlycNAc、高度半乳糖基化和高度岩藻糖基化的糖基化模式。NM-H9D8-E6和NM-H9D6-E6Q12细胞提供类似于NM-H9D8细胞的糖基化模式，只是岩藻糖基化程度非常低。其他合适的细胞系包括K562，一种存在于美国典型培养物保藏中心(ATCC CCL-243)中的人髓系白血病细胞系，CHO细胞，以及源自上述的细胞系。在特定实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体在CHO细胞中重组产生，特别是在CHO-dhfr-细胞中。

在特定实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体作为缀合物提供，所述缀合物包含缀合到另一试剂例如可检测标记物或治疗活性物质的抗体。人源化抗体可与一种或多种其它试剂偶联。如果缀合物中存在不止一种其它试剂，则这些其它试剂可以相同或不同，特别是全部相同。另外的试剂与人源化抗体的缀合可以使用本领域已知的任何方法实现。另外的试剂可以共价连接，特别是通过融合或化学偶联，或非共价连接到抗体上。在某些实施方案中，所述另外的试剂特别是通过接头部分共价连接至人源化抗体。接头部分可以是适合于将另外的试剂附着到人源化抗体上的任何化学实体。

另一种试剂优选用于治疗、诊断、预后和/或监测疾病，特别是癌症。例如，所述另一种试剂可以选自放射性核素、化疗剂、抗体、双特异性抗体或抗体片段，特别是与人源化抗Lewis Y抗体、酶、相互作用结构域、可检测标记、毒素、细胞溶解成分、免疫调节剂、免疫效应剂、免疫抑制剂、细胞因子、趋化因子、MHC I类或II类抗原和脂质体是不同种和/或不同特异性。

在某些实施方案中，其他的试剂是多肽或蛋白质。该多肽或蛋白质尤其可以与人源化抗体的多肽链融合。在某些实施方案中，作为多肽或蛋白质的其他试剂与人源化抗体的抗体轻链的C末端融合。在其中人源化抗体包含两条抗体轻链的实施方案中，作为多肽或蛋白质的其他试剂可以与两条抗体重链中的每一条的C末端融合。在进一步的实施方案中，作为多肽或蛋白质的另外的试剂与人源化抗体的抗体重链的C末端融合。在其中人源化抗体包含两条抗体重链的实施方案中，作为多肽或蛋白质的其他试剂可以与两条抗体轻链中的每一条的C末端融合。其他试剂可以相同或不同，特别是具有相同的氨基酸序列。在人源化抗体不包含一条或多条轻链和一条或多条重链的实施方案中，例如在人源性抗体是抗体片段的情况下，作为多肽或蛋白质的其他试剂可以与人源化的抗体的多肽链的C末端或N末端融合。作为多肽或蛋白质的此类其它试剂的合适实例可选自细胞因子、趋化因子、抗体、抗原结合片段、酶和相互作用结构域。

在某些实施方案中，作为多肽或蛋白质的其他试剂是阻断和/或触发激活信号的检查点抗体。各个靶的实例包括作为活化靶的CD40、CD3、CD137(4-1BB)、OX40、GITR、CD27、CD278(ICOS)、CD154(CD40配体)、CD270(HVEM)和CD258(LIGHT)，作为抑制靶的CTLA4、PD1、CD80、CD244、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA和磷脂酰丝氨酸，以及它们各自的配体如PDL1。在进一步的实施方案中，作为多肽或蛋白质的另外的试剂是针对肿瘤相关抗原的抗癌抗体。下文关于联合疗法描述了可用作融合伴侣的示例性合适的肿瘤靶点和抗癌抗体。

在进一步的实施方案中，作为多肽或蛋白质的另外的试剂是免疫调节化合物，例如趋化因子、细胞因子或生长因子。在这方面，合适的细胞因子包括干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ，以及白介素，如IL-15。合适的生长因子包括G-CSF和GM-CSF。

在特定实施方案中，作为多肽或蛋白质的其他试剂是抗原受体，特别是T细胞受体或T细胞共受体，或其部分和/或嵌合体。特别地，人源化抗Lewis Y抗体与跨膜结构域和细胞内T细胞信号结构域融合，形成嵌合抗原受体(CAR)。胞内结构域特别地源自一种或多种T细胞受体或共受体。任选地，CAR还包括人源化抗体和跨膜结构域之间的铰链区。

在这些实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体特别是单链抗体片段，其在一条多肽链中包含重链可变区和轻链可变区，特别是scFv片段。铰链区域可以例如基于免疫球蛋白超家族成员的铰链区域或膜近端区域。示例性铰链区包括源自IgG、CD8和CD28的铰链区。跨膜结构域可以是横跨细胞膜的疏水性α螺旋。例如，它来源于CD28。细胞内T细胞信号结构域尤其包括T细胞受体ζ链的细胞质结构域。此外，细胞内T细胞信号结构域可包括T细胞共刺激蛋白的其他结构域。示例性的其他结构域包括来自CD28、CD27、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)的信号结构域。

示例性CAR可以从N端到C端包括(i)scFv片段形式的人源化抗Lewis Y抗体，(ii)源自CD8的细胞外铰链区，(iii)源自CD28的跨膜结构域，(iv)源自CD28的细胞质信号结构域，和(v)源自T细胞受体ζ链的信号结构域。

或者，人源化抗Lewis Y抗体，特别是单链形式的抗体，例如scFv，可以在N末端与T细胞受体复合物的CD3链，特别是CD3ε链融合，以形成嵌合抗原受体。或者人源化抗Lewis Y抗体，特别是单链形式如scFv，可以融合到能够特异性结合T细胞或NK细胞上天然存在或工程化受体的结合结构域。

在某些实施方案中，其他试剂是细胞毒性或化学治疗剂，特别是细胞毒素。可以作为其他试剂缀合的化疗剂的具体实例包括烷化剂，如顺铂、抗代谢物、植物生物碱和萜类、长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷如紫杉醇、拓扑异构酶抑制剂如伊立替康和拓扑替康，抗肿瘤药物如多柔比星或微管抑制剂如auristatin和美登素/美登木素生物碱。

化疗剂可以特别地选自V-ATP酶抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管失稳剂、奥瑞他汀、多伐他汀、美登素、美登木素生物碱、鹅膏毒素、甲硫氨酸氨基肽酶、，蛋白质CRM1核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酸转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA插入剂、，DNA小沟槽结合剂、DHFR抑制剂、微管形成抑制剂、微管稳定剂、肌动蛋白稳定剂、拓扑异构酶II抑制剂、铂化合物、核糖体抑制剂、RNA聚合酶II抑制剂和细菌毒素。在特定实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂选自奥瑞他汀、美登木素生物碱、拓扑异构酶I抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂和DNA小沟槽结合剂。

在一些实施方案中，化疗剂是美登素或美登木素生物碱。可用于缀合的美登木素生物碱的具体实例包括美登木素生物碱、N^2'-脱乙酰基-N²'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N^2'-脱乙酰基-N^2'-(4-巯基-1-氧基戊基)-美登素(DM3)和N^2'-去乙酰基-N²'-(4-甲基-4-巯基-1-氧基戊基)-美登素(DM4)。特别地，DM1或DM4附着于抗LeY抗体。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是奥瑞他汀，特别是单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)或奥瑞他汀T。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是DNA小凹槽结合剂，特别是吡咯并苯二氮杂平(PBD)、吡咯并苯二氮杂平二聚体(PBD二聚体)、多卡霉素、多卡霉素-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(DUBA)、seco-多卡霉素-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(seco-DUBA)或多柔比星。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化学治疗剂是DNA烷化剂，特别是吲哚并二氮杂平(indolinobenzodiazepine)或恶唑并二氮卓(oxazolidinobenzodiazepine)。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化学治疗剂是DNA损伤剂，特别是卡奇霉素。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是拓扑异构酶I抑制剂，特别是喜树碱及其衍生物，例如7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)、(S)-9-二甲基氨基甲基-10-羟基樟脑碱(拓扑替康)、(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-1,2,3,9,12,15-六氢-9-羟基-4-甲基-10H，13H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚氮杂并[1，2-b]喹啉-10,13-二酮(Exatecan(DX-8951f))和DXd。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是微管形成的抑制剂，特别是微管溶素、安丝霉素、鬼臼毒素或长春碱。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是微管的稳定剂，特别是紫杉醇或埃博霉素。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是肌动蛋白的稳定剂，特别是鬼笔毒素。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是拓扑异构酶II抑制剂，特别是替尼泊苷、XK469、唑烷、氨吖啶、伊达比星或美巴隆(mebarone)。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是铂化合物，特别是顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、triplatin tetranitrate、菲铂、皮铂或萨特铂(sattraplatin)。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是核糖体抑制剂，特别是蓖麻毒素、皂草素、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素或外毒素A。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是RNA聚合酶II抑制剂，特别是鹅膏毒素，例如鹅膏素。在一些实施方案中，附着于抗LeY抗体的化疗剂是细菌毒素，特别是炭疽毒素。合适的抗体药物缀合物也描述在EP 16 151 774.3和LU 92659中，在此明确提及。

下文关于组合疗法描述了可与人源化抗Lewis Y抗体缀合的其他合适的毒素。

在另一方面，本发明提供编码人源化抗Lewis Y抗体的核酸。所述核酸的核酸序列可以具有适合于编码抗体的任何核苷酸序列。然而，优选地，所述核酸序列至少部分地适应待表达核酸的宿主细胞或生物体的特定密码子使用，特别是人类密码子使用。核酸可以是双链或单链DNA或RNA，优选双链DNA如cDNA或单链RNA如mRNA。它可以是一个连续的核酸分子，也可以由几个核酸分子组成，每个核酸分子编码人源化抗体的不同部分。

如果人源化抗体由多于一条不同的氨基酸链(例如轻链和重链)组成，则核酸可以是例如含有多个编码区的单个核酸分子，每个编码区编码抗体的一条氨基酸链，优选由调节元件如IRES元件分离，以产生分离的氨基酸链，或者所述核酸可以由多个核酸分子组成，其中每个核酸分子包括一个或多个编码区，每个编码区编码抗体的一个氨基酸链。或者，所述核酸可以是含有一个编码重链和轻链的编码区的单个核酸分子，所述编码区由自切割肽(例如2A肽)和/或含有蛋白酶识别位点(例如furin识别位点)的连接肽分离。除了编码人源化抗体的编码区之外，核酸还可以包括另外的核酸序列或其他修饰，其例如可以编码其他蛋白质，可以影响编码区的转录和/或翻译，可以影响核酸的稳定性或其他物理或化学性质，或者可能根本没有功能。

在某些实施方案中，核酸是可用于感染人类细胞的病毒载体。例如，这些病毒载体可适用于治疗人类，例如通过将病毒感染和/或复制到疾病细胞如肿瘤细胞，或在人源化抗体呈嵌合抗原受体形式的实施方案中修饰T细胞以获得CAR T细胞。

在另一方面，本发明提供一种表达盒或载体，其包含根据本发明的核酸和与所述核酸可操作连接的启动子。此外，表达盒或载体可以包括其他元件，特别是能够影响和/或调节核酸的转录和/或翻译、表达盒或表达载体的扩增和/或复制、表达盒或者表达载体整合到宿主细胞基因组中的元件，和/或宿主细胞中表达盒或载体的拷贝数。合适的表达盒和包含用于表达抗体的相应表达盒的载体在现有技术中是公知的，因此这里不需要进一步描述。

此外，本发明提供一种宿主细胞，其包含根据本发明的核酸或根据本发明所述的表达盒或载体。宿主细胞可以是任何宿主细胞。它可以是分离的细胞或包含在组织中的细胞。优选地，宿主细胞是培养的细胞，特别是原代细胞或建立的细胞系的细胞，优选肿瘤衍生细胞。优选地，它是细菌细胞，例如大肠杆菌，酵母细胞，例如酿酒酵母细胞，特别是酿酒酵母，昆虫细胞，例如Sf9细胞，或哺乳动物细胞，尤其是人类细胞，例如肿瘤衍生的人类细胞，仓鼠细胞，例如CHO，或灵长类细胞。在本发明的优选实施方案中，宿主细胞来源于人髓系白血病细胞。优选地，其选自以下细胞或细胞系：K562、KG1、MUTZ-3、CHO或衍生自其的细胞或细胞株，或包含至少一种上述细胞的细胞或或细胞株的混合物。所述宿主细胞优选选自NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM H9D8-E6Q12和源自任何所述宿主的细胞或细胞系，或包含至少一种上述细胞的细胞或或细胞系的混合物。这些细胞系及其性质在PCT申请WO 2008/028686 A2中详细描述。在优选实施方案中，宿主细胞被优化以表达具有特定糖基化模式的糖蛋白，特别是抗体。优选地，根据本发明的核酸的编码区和/或启动子中的密码子使用以及表达盒或载体的其他元件与所使用的宿主细胞的类型相容，并且更优选地优化。优选地，人源化抗体由如上所述的宿主细胞或细胞系产生。

在另一方面，本发明提供包含人源化抗体、核酸、表达盒或载体、宿主细胞或缀合物的组合物。所述组合物还可以包含多于一种的这些组分。此外，该组合物可包含一种或多种选自溶剂、稀释剂和赋形剂的其它组分。优选地，该组合物是药物组合物。在该实施方案中，组合物的组分优选全部是药学上可接受的。该组合物可以是固体或液体组合物，特别是优选水溶液、乳液或悬浮液或冻干粉。

人源化抗-Lewis Y抗体或其缀合物尤其可用于医学，特别是用于治疗、诊断、预后和/或监测疾病，特别是本文所述的疾病，例如癌症和感染，优选癌症。因此，在另一方面，本发明提供用于医学的人源化抗体、核酸、表达盒或载体、宿主细胞、缀合物或组合物。优选地，所述药物用途是用于治疗、预后、诊断和/或监测疾病，例如与异常细胞生长相关的疾病，例如癌症或传染病。传染病尤其包括病毒感染和细菌感染，尤其是感染表面带有LewisY的病毒或细菌。示例性感染包括幽门螺杆菌感染。

在优选实施方案中，所述疾病是癌症，特别是上皮癌，特别是晚期上皮癌。优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、白血病如急性髓系白血病、淋巴瘤如多发性骨髓瘤、头颈癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和膀胱癌，特别是非小细胞肺癌、结肠癌，乳腺癌和卵巢癌。

在某些实施方案中，待治疗的疾病是与异常细胞生长相关的疾病，例如癌症。该癌症是Lewis Y阳性的，并且特别包括在其细胞表面携带Lewis Y的癌细胞。在特定实施方案中，人源化抗Lewis Y抗体与另一种抗癌治疗剂组合使用。所述另外的治疗剂可以是任何已知的抗癌药物，特别是可以是针对癌症抗原的抗体。用于与人源化抗Lewis Y抗体组合的合适抗体包括抗EGFR抗体，如西妥昔单抗(Erbitux)、托木妥昔单抗、帕尼单抗(Vectibix)和尼妥珠单抗(Theraloc)，抗HER2抗体，如曲妥珠单抗(Herceptin)、替米妥珠单抗和帕妥珠单抗；抗VEGF抗体如贝伐单抗(Avastin)和伐努珠单抗；抗CD52抗体，如阿伦单抗(Campath)；抗CD30抗体，如维布妥昔单抗(Adcetris)；抗CD33抗体，如吉妥单抗(Mylotarg)；抗CD20抗体，如利妥昔单抗(Rituxan，Mabthera)、托西莫单抗(Bexxar)和替伊莫单抗(Zevalin)；抗CTLA4抗体，如伊匹单抗和替西木单抗，抗PD1/PD-L1抗体，如纳武利尤单抗、阿替利珠单抗和阿维鲁单抗，抗TNF和TNFR超家族成员的抗体，如乌瑞芦单抗、MEDI6469、TRX518和varilumab；CSF1R抗体如依米妥珠单抗；抗B7-H3抗体，如伊诺妥珠单抗；抗LAG3抗体；抗4-1BB抗体；抗ICOS抗体；和抗OX-40抗体。

可与人源化抗Lewis Y抗体和任选一种或多种其它抗体组合的其它抗癌治疗剂可选自紫杉醇，如紫杉醇(紫杉醇)、多西他赛(多西他赛)和SB-T-1214；环磷酰胺；拉帕替尼；埃罗替尼；伊马替尼；帕唑帕尼；卡培他滨；阿糖胞苷；长春瑞滨；吉西他滨；蒽环类药物，如柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、伊达比星、柔比星和米托蒽醌；芳香酶抑制剂，如氨基谷丙酰胺、睾内酯(Teslac)、阿那曲唑(Arimidex)、来曲唑(Femara)、依西美坦(Aromasin)、伏氯唑(Rivizor)、福美司坦(Lentaron)、法曲唑(Afema)、4-羟基雄烯二酮、1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(ATD)和4-雄烯-3,6,17-三酮(6-OXO)；拓扑异构酶抑制剂，如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、片螺素D、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、安吖啶、玫瑰树碱类、金精三羧酸和HU-331；基于铂的化疗剂，如顺式二胺二氯铂(II)(顺铂)、顺式二甲胺(1,1-环丁烷二羧基)铂(Ⅱ)(卡铂)和[(1R，2R)-环己烷-1,2-二胺](乙二氨基-O，O′)铂(II)(奥沙利铂)；抗代谢物，特别是诸如甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞和普拉曲沙的叶酸拮抗剂，诸如氟尿嘧啶、吉西他滨、氟尿苷、5-氟尿嘧啶和喃氟啶-尿嘧啶的嘧啶类似物，以及嘌呤类似物；以及诸如奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕利和塔拉帕利的酶聚ADP核糖聚合酶的抑制剂(PARP抑制剂)。可与人源化抗-Lewis Y抗体结合使用的其他合适的毒素在上文关于可偶联至人源化抗体的试剂中进行了描述。

人源化抗Lewis Y抗体的治疗可进一步与免疫刺激剂、细胞因子、趋化因子、放射治疗、疫苗如蛋白质、肽或RNA疫苗、B-Raf抑制剂如vemurafenib、地塞米松、蛋白酶抑制剂如硼替佐米和来那度胺组合。

为了用于治疗细胞表达Lewis Y的癌症，人源化抗体可以与如上所述的另一种试剂偶联，其中所述另一种药物优选是细胞毒性药物，例如放射性核素或细胞毒素。上文描述了示例性细胞毒性剂。细胞毒性剂还包括前体化合物，其仅在激活时产生细胞毒性活性，例如通过光照射或体内的酶反应。上述一种或多种抗癌治疗剂也可用作与人源化抗Lewis Y抗体偶联的另一种试剂。此外，人源化抗体可被工程化以增强其激活患者免疫应答的能力，特别是激活ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和/或CDC(补体依赖性细胞毒性)的能力。例如，这可以通过优化抗体的氨基酸序列和/或糖基化模式，特别是其恒定区来实现。

为了用作疾病诊断、预后和/或监测中的检测试剂，人源化抗体优选与能够产生可检测信号的标记试剂偶联。特别地，所述标记剂可以是放射性核素、荧光团或酶。

序列表

<110> Glycotope GmbH

<120> 针对Lewis Y的人源化抗体

<130> 63 136 K

<150> EP 20 183 237.5

<151> 2020-06-30

<160> 32

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 8

Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 9

Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 10

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<220>

<221> VARIANT

<222> 1

<223> Xaa 是 Gln 或 Lys

<220>

<221> VARIANT

<222> 9

<223> Xaa 是 Ala 或 Pro

<220>

<221> VARIANT

<222> 12

<223> Xaa 是 Lys 或 Val

<220>

<221> VARIANT

<222> 34

<223> Xaa 是 Ile 或 Met

<220>

<221> VARIANT

<222> 38

<223> Xaa 是 Arg 或 Lys

<220>

<221> VARIANT

<222> 40

<223> Xaa 是 Thr 或 Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> 43

<223> Xaa 是 Lys 或 Gln

<220>

<221> VARIANT

<222> 44

<223> Xaa 是 Gly 或 Ser

<220>

<221> VARIANT

<222> 55

<223> Xaa 是 Gln 或 Asn

<220>

<221> VARIANT

<222> 67

<223> Xaa 是 Lys 或 Arg

<220>

<221> VARIANT

<222> 68

<223> Xaa 是 Ala 或 Val

<220>

<221> VARIANT

<222> 70

<223> Xaa 是 Met 或 Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> 72

<223> Xaa 是 Val 或 Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> 74

<223> Xaa 是 Lys 或 Thr

<400> 10

Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Val Xaa Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Xaa Asp Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Xaa Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Xaa Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 11

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<220>

<221> VARIANT

<222> 9

<223> Xaa 是 Ala 或 Pro

<220>

<221> VARIANT

<222> 12

<223> Xaa 是 Lys 或 Val

<220>

<221> VARIANT

<222> 40

<223> Xaa 是 Thr 或 Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> 43

<223> Xaa 是 Lys 或 Gln

<220>

<221> VARIANT

<222> 67

<223> Xaa 是 Lys 或 Arg

<220>

<221> VARIANT

<222> 68

<223> Xaa 是 Ala 或 Val

<220>

<221> VARIANT

<222> 72

<223> Xaa 是 Val 或 Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> 74

<223> Xaa 是 Lys 或 Thr

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Val Xaa Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Xaa Pro Gly Xaa Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Xaa Xaa Thr Met Thr Xaa Asp Xaa Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H1

<400> 12

Asp Tyr Asn Ile Asp

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H1

<400> 13

Asp Tyr Asn Met Asp

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H2

<400> 14

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Gln Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H2

<400> 15

Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-H3

<400> 16

Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe

1 5

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 17

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Thr Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Asn Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Arg

85 90 95

Thr His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 20

Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Asn Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Arg

85 90 95

Thr His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 21

Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Leu Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Asn Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Arg

85 90 95

Thr His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<220>

<221> VARIANT

<222> 4

<223> Xaa 是 Met 或 Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> 19

<223> Xaa 是 Ala 或 Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> 24

<223> Xaa 是 Lys 或 Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> 30

<223> Xaa 是 Leu 或 Val

<220>

<221> VARIANT

<222> 32

<223> Xaa 是 Gly 或 Ser

<220>

<221> VARIANT

<222> 35

<223> Xaa 是 Lys 或 Asn

<220>

<221> VARIANT

<222> 36

<223> Xaa 是 Thr 或 Ser

<220>

<221> VARIANT

<222> 39

<223> Xaa 是 Asn 或 Asp

<220>

<221> VARIANT

<222> 41

<223> Xaa 是 Leu 或 Tyr

<220>

<221> VARIANT

<222> 49

<223> Xaa 是 Pro 或 Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> 50

<223> Xaa 是 Lys 或 Gln

<220>

<221> VARIANT

<222> 55

<223> Xaa 是 Leu 或 Glu

<220>

<221> VARIANT

<222> 58

<223> Xaa 是 Asn 或 Lys

<220>

<221> VARIANT

<222> 59

<223> Xaa 是 Leu 或 Arg

<220>

<221> VARIANT

<222> 60

<223> Xaa 是 Glu 或 Asn

<220>

<221> VARIANT

<222> 74

<223> Xaa 是 Thr 或 Lys

<220>

<221> VARIANT

<222> 88

<223> Xaa 是 Val 或 Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> 94

<223> Xaa 是 Leu 或 Phe

<220>

<221> VARIANT

<222> 96

<223> Xaa 是 Ala 或 Arg

<220>

<221> VARIANT

<222> 99

<223> Xaa 是 Phe 或 Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> 105

<223> Xaa 是 Gln 或 Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> 107

<223> Xaa 是 Thr 或 Ala

<400> 22

Asp Ile Val Xaa Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Xaa Ser Ile Ser Cys Xaa Ser Ser Gln Ser Leu Xaa His Xaa

20 25 30

Asn Gly Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Trp Xaa Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Xaa Xaa Leu Leu Ile Tyr Xaa Val Ser Xaa Xaa Xaa Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Xaa Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Xaa Gln Xaa

85 90 95

Thr His Xaa Pro Leu Thr Phe Gly Xaa Gly Xaa Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<220>

<221> VARIANT

<222> 19

<223> Xaa 是 Ala 或 Thr

<220>

<221> VARIANT

<222> 88

<223> Xaa 是 Val 或 Leu

<220>

<221> VARIANT

<222> 105

<223> Xaa 是 Gln 或 Ala

<220>

<221> VARIANT

<222> 107

<223> Xaa 是 Thr 或 Ala

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Xaa Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Xaa Gly Xaa Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L1

<400> 24

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L1

<400> 25

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L2

<400> 26

Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 27

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L2

<400> 27

Glu Val Ser Lys Arg Asn Ser

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L3

<400> 28

Leu Gln Ala Thr His Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR-L3

<400> 29

Phe Gln Arg Thr His Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 30

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 30

Lys Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Thr His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Gly Pro Gly Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser

115

<210> 31

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 31

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Thr Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Ala Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 32

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Phe Leu His Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Asp Trp His Leu Gln Lys Ser Asp Gln Ser

35 40 45

Leu Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Asn Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Arg

85 90 95

Thr His Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

附图简述

图1显示了Lewis碳水化合物抗原家族的示意图。Lewis抗原是一组相关的聚糖，其以α1-3(Lewis X，Y)或α1-4(Lewis A，B)携带岩藻糖连接至GlcNAc单糖。

图2显示了抗原ELISA测定的结果。测试了不同的人源化抗Lewis Y抗体变体与Lewis Y、Lewis b和Globo H的结合。高O.D.信号表明抗体与抗原的强结合。A：25ng/mL的抗体变体与Lewis Y(LeY)、Lewis b(Leb)和Globo H的结合。B：25ng/mL和12.5ng/mL的变体与Lewis Y的结合。C：100ng/mL、50ng/mL和25ng/mL抗体变体与Lewis b的结合。D：100ng/mL、50ng/mL和25ng/mL抗体变体与Globo H.对照(ctrl.+)：亲本人/小鼠嵌合抗体AA9的结合。

图3显示了抗原ELISA测定的结果。测定了不同人源化抗Lewis Y抗体变体与LewisY(A)和Lewis b(B)的结合曲线。对照1(ctrl.+AA9)：亲本人/小鼠嵌合抗体AA9。对照2(ctrl.+链重组)：包含人/小鼠嵌合体抗体AA9的重链和人/鼠嵌合体抗体CC8的轻链的链重组抗体。

图4显示了抗原ELISA测定的结果。测定人源化抗Lewis Y抗体AA9-3-10.1与LewisY和Lewis b的结合曲线。对照(ctrl.)：亲本人/小鼠嵌合抗体AA9。

图5显示了抗原ELISA测定的结果。在50ng/mL的抗体浓度下测试人源化抗Lewis Y抗体AA9-3-10.1(人源化AA9)和亲本人/小鼠嵌合抗体AA9(嵌合AA9)与不同碳水化合物抗原的结合。

图6显示了抗原ELISA测定的结果。测试了人源化抗Lewis Y抗体AA9-3-10的不同序列优化版本与Lewis Y和Lewis b的结合。高O.D.信号表明抗体与抗原的强结合。A：50ng/mL的抗体变体与Lewis Y(LeY)和Lewis b(Leb)的结合。B：50ng/mL和25ng/mL抗体变体与Lewis Y的结合。C：100ng/mL和50ng/mL抗体变体与Lewis b.对照(pos.-ctrl.-Set2 128+129)：亲本人/小鼠嵌合抗体AA9的结合。

图7显示了抗原ELISA测定的结果。通过分析其与Lewis Y和其他相关碳水化合物抗原的结合，测试不同的抗Lewis Y抗体的特异性。A：人源化抗Lewis Y抗体AA9-3-10.1；B：抗Lewis Y抗体h3S193；C：抗Lewis Y抗体BR96。

图8显示了抗原ELISA测定的结果。测定了抗Lewis Y抗体AA9-3-10.1、h3S193和BR96与Lewis Y的结合曲线。

图9显示了人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1、BR96和h3S193(作为hIgG1)与肿瘤细胞系Ls-174T、T-47D、H9D8和Colo-205的结合。不相关的hIgG1用作阴性对照。结合以抗体阳性细胞占总活细胞的百分比报告。

图10显示了人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1、BR96和h3S193(作为mIgG1)与从五名健康供体分离的白细胞的结合。不相关的hIgG1用作参考。与粒细胞、淋巴细胞和单核细胞的结合被报告为中值荧光强度(MFI)。

图11显示了毒素偶联的AA9-3-10.1(作为hIgG1)和不同肿瘤细胞系的同种型对照的增殖抑制实验。增殖报告为相对于培养基对照的增殖百分比。

实施例

实施例1：抗LeY抗体的鼠重链和轻链可变区的人源化

编码两种单克隆抗LeY抗体(AA9:SEQ ID NO:30和31；CC8:SEQ ID NO:32)的鼠重链和轻链可变区的核酸序列分别与人恒定γ1区(CH)和人恒定κ区(CL)的基因组序列连接。

在这些嵌合克隆的基础上，构建了人源化抗体。为此，将点突变引入小鼠VH和VL的框架区的核酸序列中，以产生相应的人类框架区。目标人框架区选自人生殖系抗体库。特别是，根据其总体序列相似性和CDR环分类，从库中选择最相关的框架区域。考虑所有获得的数据以设计一组不同的亲本鼠抗体两者的人源化可变轻链和可变重链的可变序列。一些变体在关键位置上含有小鼠序列的反向突变。轻链可变区的人源化变体克隆到κ链载体中，重链可变区人源化变变体克隆到γ1-链载体中。

产生包含所获得的重链和轻链的不同组合的抗体，并筛选其表达和LeY结合谱。选择以下人源化抗体重链和轻链可变区进行进一步分析。

表1

实施例2：人源化抗体变体与不同碳水化合物抗原的结合

在NM-H9D8细胞中表达不同构建体后，测定人源化抗体变体的滴度并调整其浓度。然后，在抗原ELISA中分析人源化抗体与Lewis Y、Lewis b和Globo H的结合。简而言之，将抗原(偶联到聚丙烯酰胺)涂覆到96孔MaxiSorp板(Nunc ThermoScientific)上过夜。阻断非特异性结合，并以不同浓度添加测试样品。然后，加入抗人IgG Fc POD二抗，然后进行TMB底物反应。通过使用EnSpire 2300多标记读取器(PerkinElmer)在450/630nm处或使用Tecan SPARK板读取器在450/620nm处测量来测定结合抗体。

所有变体显示出与亲本嵌合抗体类似的与Lewis Y的显著结合。此外，所有抗体与Globo H的结合均为阴性。然而，令人惊讶的是，所选的人源化抗体变体对Lewis b的交叉反应性显著降低(见图2、3和4)。

人源化抗体变体AA9-3-6(包含VL3和VH6)、AA9-3-9(包含VL 3和VH9)、AA9-3-10(包含VL3和VH10)和CC8-1-11(包含VL1和VH11)使用抗原ELISA进一步分析其与Lewis Y、Galα1，2-Gal和β-N-乙酰基-D-葡糖胺-6-硫酸盐的细微特异性。分析的人源化抗体显示出与Lewis Y的强、高度特异性结合，但与其他碳水化合物抗原没有显著结合。在50ng/mL的抗体浓度下测试与以下碳水化合物抗原的结合(另见图5)：

表2

实施例3：基于抗体AA9-3-10产生进一步的人源化变体

人源化抗体变体AA9-3-10(包括VL3和VH10)被选为进一步优化人源化VH序列的最佳候选。如实施例1所述产生以下人源化抗体：

表3

如实施例2所述分析这些人源化抗体变体与Lewis Y和Lewis b的结合。所有抗体变体均显示与Lewis Y的强、高度特异性结合。未检测到与Lewis b的显著结合(见图6)。

实施例4：人源化变体AA9-3-10.1与已知抗LeY抗体的抗原结合和特异性的比较

将人源化抗体变体AA9-3-10.1对不同的、密切相关的碳水化合物抗原(βD-半乳糖、Lewis b、Lewis X、3'-O-su-Lewis X、乳糖-N-四糖(LNT)、Neu5Acα2-5Galβ和Lewis Y)的结合特异性与对已知抗体h3S193和BR96的结合特异性进行了比较。

简言之，将抗原(偶联至聚丙烯酰胺)涂覆到96孔MaxiSorp板(NuncThermoScientific)上过夜。阻断非特异性结合，并以不同浓度添加测试样品。然后，加入抗人IgG(H+L)POD二抗，然后进行TMB底物反应。通过使用EnSpire 2300多标记读取器(PerkinElmer)在450/630nm处或使用Tecan SPARK板读取器在450/620nm处测量来测定结合抗体。

人源化抗体变体AA9-3-10.1与Lewis Y的结合更强，特异性显著提高。在低抗体浓度下，h3S193与Lewis Y的结合低得多，BR96与βD-半乳糖和Lewis X的结合显著。此外，在较高浓度下，h3S193和BR96均与Neu5Acα2-5Galβ结合(见图7和8)。

确定结合常数和亲和力的一种新方法是使用DRX2仪器(动态生物传感器)芯片上的单链DNA(96mer)和与配体偶联的互补DNA进行荧光邻近传感。在本研究中，链霉亲和素用作配体，以捕获生物素化聚丙烯酰胺偶联的Lewis Y或Lewis b。人源化抗体变体AA9-3-10.1或竞争者的抗Lewis Y抗体与抗原的结合导致荧光变化。可以在缔合和解离过程中计算开和关速率。AA9-3-10.1和竞争者的抗LeY抗体在PE140缓冲液中稀释至300、60和12nM，并应用于芯片结合抗原。对于在Lewis b上使用AA9-3-10.1的实验，使用了3000、600和120nM，因为预期信号非常低。通过单指数全局拟合(仪器软件)评估结合曲线。由于更高的灵敏度，与表面等离子体共振(SPR)相比，可以监测更快的相互作用。这导致了与SPR不同的结合动力学，而更类似于在液体系统中测量的“金标准”方法KinExA。

结合测定显示AA9-3-10.1与Lewis Y的强且高度特异性结合。数据证实了ELISA测定的结果。

表4

n.d.：不可确定

实施例5：人源化变体AA9-3-10.1与已知抗LeY抗体的肿瘤细胞结合的比较

通过流式细胞术分析人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1、BR96和3S193(均为hIgG1)与人癌细胞系Ls-174T、T-47D、H9D8和Colo-205的结合特性。不相关的hIgG1用作阴性对照。简言之，收获肿瘤细胞，并在黑暗中在4℃下与指定的抗体进行连续稀释的孵育。然后，将细胞洗涤，并在黑暗中在4℃下与山羊抗hIgG PE缀合的二抗孵育。在额外的洗涤步骤之后，用DAPI对细胞进行染色，以区分活细胞和死细胞，并通过流式细胞仪进行分析。

人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1显示出与Lewis Y阳性细胞系Ls-174T和T-47D的浓度依赖性结合，而与Lewis Y阴性细胞系H9D8和Colo-205无结合，而竞争者抗LewisY的抗体BR96和3S193显示出比人源化的抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1更强的与所有四种肿瘤细胞系的结合(见图9)。BR96和3S193的更强结合很可能是由于交叉反应性。例如，Colo-205被描述为对Lewis Y呈阴性(Westwood等人，2005)，但对Lewis b呈阳性(Noble等人，2013)。

实施例6：人源化变体AA9-3-10.1与已知抗LeY抗体的血细胞结合的比较

使用流式细胞术测定人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1、BR96和3S193(作为mIgG1)与白细胞的结合。因此，使用了五名健康志愿者的全血。在第一步中，裂解红细胞，并在室温下用指定抗体[10μg/ml]孵育剩余的白细胞。不相关的mIgG1用作阴性对照。然后，洗涤细胞并在室温下与二抗mIgG AF647缀合抗体孵育。洗涤步骤后，在室温下用抗人CD45PacificBlue缀合抗体对细胞进行染色。在额外的洗涤步骤之后，通过流式细胞术分析细胞。免疫细胞亚群，粒细胞，单核细胞和淋巴细胞，通过其CD45表达和粒度来区分。

人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1与白细胞亚群无结合或仅弱结合，而BR96与粒细胞强结合，3S193与粒细胞、淋巴细胞和单核细胞结合(见图10)。这显示了人源化抗Lewis Y抗体变体对肿瘤细胞的优越特异性及其与正常组织细胞的非常低的交叉反应性。

实施例7：使用与毒素偶联的人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1抑制不同肿瘤细胞系的增殖

为了证明人源化抗Lewis Y抗体变体对杀死肿瘤细胞的效力，对不同的肿瘤细胞系进行了增殖抑制试验。作为细胞毒素，MMAE与蛋白G偶联，蛋白G与抗体结合，从而形成抗体-毒素缀合物。

将细胞系Ls-174T、T-47D、MCF-7(富含CSC)、Ovcar-3和HSC-4接种在96孔平板中5000个细胞/孔的培养基中，并在人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1(作为hIgG1)或不相关的同种型对照存在下以指定浓度和ProtG MMAE孵育4天。使用商业CellTiterGlo发光细胞活力测定法测定活细胞的数量。相对于仅培养基对照测定增殖百分比。

毒素偶联的人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1能够抑制各种表达Lewis Y的肿瘤细胞系的增殖，表明抗体的有效内化(见图11)。

实施例8：不同癌症类型的不同肿瘤组织的人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1的免疫组织化学染色

通过免疫组化分析人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1与不同癌症适应症的结合。简而言之，将乳腺癌(BRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌(CRC)、头颈癌(HNC)、小细胞肺癌(SCLC)和卵巢癌(OvCa)的组织芯片载玻片按递减酒精序列进行去石蜡和再水化。抗原回收后，内源性过氧化物酶和非特异性结合被阻断。用二抗Envision Flex抗小鼠Ig-HRP和DAB+染色溶液检测人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1作为mIgG1[6.5μg/ml]的结合。最后，用Mayer’s苏木精复染载玻片，封片并在显微镜下评估。使用免疫反应评分(IRS；范围0-12)报告人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1的结合，免疫反应评分通过染色强度(范围0-3)乘以染色细胞百分比(范围0-4)计算。

人源化抗Lewis Y抗体变体AA9-3-10.1对乳腺癌(BRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌(CRC)、头颈癌(HNC)、小细胞肺癌(SCLC)和卵巢癌(OVCa)的肿瘤组织进行高比例染色。

表5

序列表

保藏生物材料的鉴定

细胞系DSM ACC 2806、DSM ACC 2807和DSM ACC 2856保藏在DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig(DE)，Glycotope GmbH，Robert-

-Str.10，13125柏林(DE)，日期如下表所示。

细胞系名称	保藏号	保藏者	保藏日期
				NM-H9D8	DSM ACC 2806	Glycotope GmbH	2006年9月15日
NM-H9D8-E6	DSM ACC 2807	Glycotope GmbH	2006年10月5日
				NM-H9D8-E6Q12	DSM ACC 2856	Glycotope GmbH	2007年8月8日

Claims

1.一种能够结合Lewis Y的人源化抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:12或13的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1、具有SEQ IDNO:14或15的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR-H3，特别地，具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的互补决定区CDR-H1，具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的互补决定区CDR-H2，具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的互补决定区CDR-H3。

3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列。

4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，特别是选自SEQ ID NO:1至6的氨基酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含具有SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1、具有SEQ ID NO:26或27的氨基酸序列的CDR-L2和具有SEQ ID NO:28或29的氨基酸序列的CDR-L3，特别地，具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的互补决定区CDR-L1，具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的互补决定区CDR-L2，具有SEQID NO:28的氨基酸序列的互补决定区CDR-L3。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:17至21的氨基酸序列。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，特别是选自SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，进一步包含Fc区。

11.根据权利要求10所述的抗体，其为IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型抗体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其能够特异性结合Lewis Y，但不结合Lewis b。

13.编码权利要求1至12中任一项的抗体的核酸。

14.一种表达盒或载体，其包含根据权利要求13所述的核酸和与所述核酸可操作连接的启动子。

15.宿主细胞，其包含根据权利要求13所述的核酸或根据权利要求14所述的表达盒或载体。

16.一种缀合物，其包含与另外的试剂缀合的根据权利要求1至12中任一项所述的抗体。

17.根据权利要求16所述的缀合物，其中所述另外的试剂是细胞毒性试剂、肿瘤特异性抗体或免疫检查点阻断或激活抗体。

18.根据权利要求16所述的缀合物，其为嵌合抗原受体。

19.一种组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的抗体、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14所述的表达盒或载体、根据权利要求15所述的宿主细胞或根据权利要求16至18中任一项所述的缀合物。

20.根据权利要求19所述的组合物，其是优选进一步包含一种或多种选自溶剂、稀释剂和赋形剂的组分的药物组合物。

21.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体、根据权利要求16至18中任一项所述的缀合物或根据权利要求20所述的组合物，其用于医学。

22.根据权利要求21所述的抗体、缀合物或组合物，其用于治疗癌症、感染或免疫缺陷疾病。

23.根据权利要求22所述的抗体、缀合物或组合物，其中所述癌症选自肺癌、结肠癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、头颈癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。