CN113330036B - 结合pd-l1和ox40的双特异性抗体 - Google Patents

Abstract

一种经人工设计的抗体分子，特别是抗PD‑L1/OX40双特异性抗体分子，其能同时结合PD‑L1和OX40。

Description

结合PD-L1和OX40的双特异性抗体

发明领域

本发明总体上涉及免疫学和抗体工程领域。具体而言，本发明涉及新型的经人工设计的双特异性抗体分子，特别是同时结合PD-L1和OX40的双特异性抗体、编码所述抗体分子或其各条链的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、包含所述抗体分子的免疫缀合物和药物组合物、以及所述抗体分子在疾病的免疫治疗、预防和/或诊断上的用途。

发明背景

抗体分子能够与其相应的抗原发生靶向性的特异性结合，正日益成为针对各种疾病(例如，癌症、自身免疫病、炎性疾病、感染性疾病等)的重要的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。但是，仅针对一种靶点的单特异性抗体在临床应用上存在一些局限性。患者在接受单特异性抗体治疗后可能产生耐药性或无应答。随着对癌症和其他多种疾病的研究，认识到了往往有多种信号转导通路参与疾病的发生和发展，单一靶点的免疫疗法在许多疾病中通常并不足以发挥对疾病的治疗作用。

由于多特异性抗体(例如，双特异性抗体)能够特异性结合不同抗原，能够设计为同时作用于两种或多种不同介质的信号转导通路。这些优势特性为多特异性抗体(例如，双特异性抗体)开辟了广阔的应用前景。

已经通过抗体工程开发了大量富于想象力的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)样式并且研究了它们在疾病应用上的适用性(Brinkmann U.和Kontermann R.E.，Themaking of bispecific antibodies，Mabs，2017，9(2)：182-212)。

多特异性抗体(例如，双特异性抗体)根据不同的组成部分以及构建方式，可以分为许多种类。例如，根据多特异性抗体结构的左右基本上对称性，可分为对称结构和不对称结构；根据多特异性抗体有无IgG的Fc区，可分为有Fc区的抗体样式和无Fc区的抗体样式；根据多特异性抗体中抗原结合位点的数量可分为二价、三价、四价或更多价的抗体等。

现有技术中的多特异性抗体样式在制备和应用中各有利弊，例如，虽然Blinatumomab可以通过重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行大规模培养生产，但是容易形成聚集物、在体内半衰期很短，实际使用的时候需要额外配备连续输液装置；Catumaxomab生产工艺复杂且鼠异源抗体比较容易在人体产生免疫原性问题。

因此，本领域仍然需要可供选择的具有改善性能的多特异性抗体，特别是双特异性抗体。本发明提供了一种新的多特异性抗体样式，所述抗体易于在体外的培养细胞中有效表达，不需要复杂的生产工艺。同时，所述的双特异性抗体能够同时结合不同的抗原，特别是OX40和PD-L1，保持各抗原结合位点与相应的不同表位结合的结合活性，以及其他性质。进一步地，本发明的双特异性抗体样式是物理稳定的和生物学稳定的，这允许该抗体具有更好的生产性和可发展性。

发明概述

本文公开了通过抗体工程方法构建的一种新型的双特异性抗体分子。

因此，在一个方面，本发明提供了具有以下一个或多个特性的双特异性抗体分子：

(a)以高亲和力与一种或两种抗原特异性结合；

(b)易于在体外的培养细胞中表达，且抗体分子的各条链之间能够正确偶合或配对；

(c)具有良好的物理稳定性，特别地，具有良好的长期热稳定性；且能长时间保持生物学活性；

(d)在与一种或两种抗原特异性结合后，通过调节(例如，抑制或者激活)各抗原所参与的信号传导通路来发挥生物学功能；

(e)发挥效应子功能；

(f)具有更好的抗肿瘤活性。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含全抗体部分和单结构域抗体部分，后者通过接头连接于全抗体部分的重链恒定区的C端。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含以下部分或由其组成：

式(I)的多肽链(肽链#1)：

VH-CH1-Fc-X-VHH；和

式(II)的多肽链(肽链#2)：

VL-CL；

其中：

VH表示重链可变区；

CH表示重链恒定区结构域；

Fc包含CH2、CH3，以及任选的CH4；

CH1、CH2、CH3和CH4分别表示重链恒定区的结构域1、2、3和4，

X可以不存在，或者在存在时表示接头，例如柔性接头；

VHH表示单结构域抗原结合位点，例如单结构域抗体；

VL表示轻链可变区；

CL表示轻链恒定区；

任选地，CH1和Fc之间还存在铰链区。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含至少一条式(I)的多肽链和一条式(II)的多肽链。优选地，本发明的抗体分子包含两条(例如相同的)式(I)的多肽链和两条(例如相同的)式(II)的多肽链。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子的结构如图1所示。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子或其片段具有2个或4个抗原结合位点，其结合2个、3个或4个不同的抗原，或相同的抗原。在一个实施方案中，式(I)中的VH和式(II)中的VL形成一个抗原结合位点，式(I)的VHH构成一个抗原结合位点(单结构域抗原结合位点)。

在一个实施方案中，不同抗原结合位点结合相同的抗原上的相同表位，或不同表位。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中的式(I)中的接头X是柔性接头，例如具有单独或组合的甘氨酸和/或丝氨酸残基的接头。在一个实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数，例如，n是2，3，4，5，6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4。

在一个实施方案中，由式(I)中的VH和式(II)中的VL形成的抗原结合位点是来自人的或人源化的，或嵌合的。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中的单结构域抗原结合位点(VHH)是天然缺乏轻链的抗体的重链可变结构域(例如，骆驼科(Camelidae)物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域)或鱼类中称为新型抗原受体(new antigen receptor，NAR)的免疫球蛋白(如鲨鱼血清中天然存在的IgNAR)中的VH样单结构域、或衍生自它们的经重组的单结构域抗原结合位点(例如，骆驼化的人VH结构域或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域)。在一个优选的实施方案中，本发明抗体分子中的所述单结构域抗原结合位点选自骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域和人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中式(I)的肽链中的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)中产生的抗体。除骆驼科之外的其他物种也可以产生天然缺乏轻链的重链抗体，这类重链抗体的VHH也处于本发明的范围内。

在一个实施方案中，CH1和Fc来自抗体重链，或其衍生物。

在一个实施方案中，式(I)的“CH1-Fc”为IgG的形式，例如IgG1、IgG2或IgG4的形式。在一个实施方案中，所述重链恒定结构域来自IgG2。将理解，可以对恒定结构域中的Fc进行突变，以实现稳定抗体的作用，或增强效应子功能的作用。例如在一个具体实施方案中，所述效应子功能是抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，所述氨基酸突变存在于CH2结构域，例如，所述抗体分子包含在第234和235位置(EU编号，根据Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的EU索引进行编号)处的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，所述氨基酸置换是L234A和L235A。

在一个实施方案中，在CH1和CL之间存在二硫键。在一个实施方案中，如果包含两条式(I)多肽链，则在两个式(I)多肽链的CH1和CH2之间的铰链区之间存在二硫键，二硫键的数量依据抗体恒定结构域所来源IgG形式不同而可变化，在一些实施方案中，铰链区之间存在2个或4个二硫键。

在一个实施方案中，式(II)的轻链恒定结构域CL来自κ或λ。

在一个实施方案中，由式(I)的VH和式(II)的VL形成的结合位点对第一抗原是特异性的，在一个实施方案中，第一抗原是OX40。

在一个实施方案中，由式(I)的VHH形成的结合位点对第二抗原是特异性的，在一个实施方案中，第二抗原是PD-L1。

不特别地限制本发明的抗体分子特异性结合的抗原类型，抗原可以是例如细胞因子、生长因子、激素、信号传导蛋白、炎性介质、配体、细胞表面受体或其片段。在一个实施方案中，本发明的抗体分子特异性结合的抗原选自肿瘤相关抗原、免疫检查点分子、血管新生诱导因子、肿瘤坏死因子受体超家族成员和免疫系统中的共刺激分子，以及这些分子的配体和/或受体，例如，OX40、CD47、PD1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、4-1BB (CD137)、VEGF和GITR。

在一个实施方案中，式(I)的VH-CH1-Fc构成全抗体部分的重链，式(II)的VL-CL构成全抗体部分的轻链。

在一个实施方案中，式(II)的VHH构成单结构域抗体。

在一个实施方案中，本发明的抗体还涵盖其抗原结合片段，例如Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)₂、单结构域抗体、双抗体(dAb)或线性抗体。

在一个方面，本发明提供了编码本发明抗体分子中的任意一条或者多条多肽链的核酸，包含所述核酸的载体，包含所述核酸或载体的宿主细胞。

在一个方面，本发明提供了包含编码本发明抗体分子中的任意一条或者多条多肽链的多核苷酸的载体，优选地表达载体，例如pXC载体或pTT5载体，例如pXC17.4或pXC18.4。在一个实施方案中，表达载体被构建为双基因表达载体pXC载体。

在一个方面，本发明提供了用于产生本发明抗体分子或其片段的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明抗体的免疫缀合物、药物组合物、试剂盒、组合产品或制品。

在一些实施方案中，本发明的抗体、药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤、T细胞功能障碍性疾病等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌或肺癌。在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者或个体疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何抗体或其片段、药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一个实施方案中，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌或肺癌。在另一方面，本发明还涉及本文所述的任何抗体或其片段或免疫缀合物制备用于在受试者中治疗肿瘤(例如癌症)或感染的药物或药物组合物或试剂盒或组合产品的用途。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一个实施方案中，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌或肺癌。

本发明还涉及在样品中检测抗原的方法。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗体或其片段或免疫缀合物或药物组合物或组合产品或试剂盒、方法和用途。

附图简述

结合以下附图一起阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的优选实施方案。出于说明本发明的目的，图中显示了目前优选的实施方案。

然而，应当理解本发明不限于图中所示实施方案的精确安排和手段。

图1A-1B例示了本发明双特异性抗体的结构。

图2显示了利用大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测的本发明制备的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的纯度。

图3显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体、以及作为对照的抗OX40抗体ADI-20057和IgG2与过量表达人OX40的CHO细胞(CHO-OX40细胞)的结合。图中横轴表示抗体浓度、纵轴表示平均荧光强度(MFI)。

图4显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体、以及作为对照的抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2与过量表达人PD-L1的CHO细胞(CHO-PD-L1细胞)的结合。图中横轴表示抗体浓度、纵轴表示平均荧光强度(MFI)。

图5显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体，以及其他抗体和对照(抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057和IgG2)对过量表达OX40的CHO细胞(CHO-OX40)和过量表达PD-L1的CHO细胞(CHO-PD-L1)的同时结合作用。

图6显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及作为对照的抗OX40抗体ADI-20057和IgG2和人T细胞的结合。

图7显示了差示扫描荧光法(DSF)测定的本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的结果。

图8显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体有效解除PD1/PD-L1相互作用对NFAT信号通路的阻断效应，进而获得了荧光信号。还检测了作为对照的抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2的作用。

图9显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体、以及作为对照的ADI-20057、Pogalizumab和IgG2对人OX40配体与OX40结合的阻断作用，证明本发明的双特异性抗体对该结合没有阻断作用。

图10显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体、以及作为对照的ADI-20057、Pogalizumab和IgG2对人OX40配体与OX40结合的作用，证明本发明的双特异性抗体不阻断人OX40配体与OX40的结合，并且有效增强OX40配体介导的OX40信号通路激活作用。

图11显示了基于荧光素酶报告基因法检测的本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及作为对照的ADI-20057和IgG2对OX40介导的信号通路的激活作用。

图12显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对PD-L1依赖的OX40介导的信号通路的作用。其中使用不表达PD-L1的Raji细胞。还检测了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057、Pogalizumab和IgG2的作用。

图13显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对PD-L1依赖的OX40介导的信号通路的激活作用。其中使用高表达PD-L1的Raji细胞，证明本发明的抗体在PD-L1表达的细胞的存在下，具有更好的OX40介导的信号通路激活作用。还检测了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057、Pogalizumab和IgG2的作用。

图14显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对PD-L1依赖的OX40介导的信号通路的激活作用。其中使用表面表达PD-L1的人肺癌细胞NCI-H292，证明本发明的抗体在天然表达PD-L1的肿瘤细胞的存在下，具有更好的OX40介导的信号通路激活作用。还检测了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057的作用。

图15显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对人T细胞的激活作用。还检测了抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc+ADI-20057和IgG2的作用。

图16显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及其他抗体和对照对LoVo细胞荷瘤的NPG小鼠模型的肿瘤抑制作用。

图17显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及其他抗体和对照对LoVo细胞荷瘤的NPG小鼠模型给药后的体重的影响。

图18显示了低剂量组的本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及其他抗体和对照对NCI-H292细胞荷瘤的NOG小鼠模型的肿瘤抑制作用。

图19显示了中剂量组的本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及其他抗体和对照对NCI-H292细胞荷瘤的NOG小鼠模型的肿瘤抑制作用。

图20显示了高剂量组的本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及其他抗体和对照对NCI-H292细胞荷瘤的NOG小鼠模型的肿瘤抑制作用。

图21显示了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体以及其他抗体和对照对NCI-H292细胞荷瘤的NOG小鼠模型给药后的体重的影响。

发明详述

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。

缩写除非另外说明，否则本说明书中的缩写具有以下含义：

使用以下缩写：

ADCC 抗体依赖性细胞介导的毒性

CDC 补体依赖性细胞毒性

CDR 在免疫球蛋白可变区中的互补决定区

CHO 中国仓鼠卵巢

EC50导致50％效力或结合的浓度

K_D 平衡解离常数

ELISA 酶联免疫吸附测定

FACS 流式细胞术

MOA mechanism of action，作用机制

MLR 淋巴细胞混合反应

FR 抗体构架区

IC50 产生50％抑制的浓度

Ig 免疫球蛋白

Kabat 通过Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immun ologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)设立的免疫球蛋白比对和编号系统

mAb或Mab或MAb 单克隆抗体

PCR 聚合酶链式反应

IFN 干扰素

VL 轻链可变区

VH 重链可变区

LC 轻链

HC 重链

HCDR 重链互补决定区

LCDR 轻链互补决定区

IL2 白介素-2

I.定义

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。

在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。

术语“抗体”在本文中以最广意义使用，指包含抗原结合位点的蛋白质，涵盖各种结构的天然抗体和人工抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、完整抗体和抗体片段。

术语“全抗体”、“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指天然存在的包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体；双价或双特异性抗体或其片段；骆驼科抗体；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。

如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，人OX40或PD-L1)中与抗体分子特异性相互作用的部分。

与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。

与参照抗体竞争结合其抗原的抗体是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。

抑制(例如竞争性抑制)参照抗体与其抗原的结合的抗体是指这样的抗体，其抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合。反言之，参照抗体抑制50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。抗体与其抗原的结合可以亲和力(例如平衡解离常数)衡量。测定亲和力的方法是本领域已知的，例如ForteBio亲和力测定。

与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。

“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia (Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”，Journal ofMolecular Biology，273，927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat (Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services，National Institututes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database (IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagationclustering)的North CDR定义。

例如，根据不同的CDR确定方案，每一个CDR的残基如下所述。

CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。

除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。

除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))的编号位置。

在一个实施方案中，本发明抗体的CDR通过Kabat规则确定边界，或通过AbM规则确定，或通过其组合确定规则。

在本发明的一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的VH和VHH的HCDR1是通过AbM规则确定，HCDR2和HCDR3是通过Kabat规则确定，式(II)中的VL CDR是通过Kabat规则确定。

具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat，Chothia，AbM和Contact方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。例如，在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或Chothia定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。

“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属于的IgG形式。所有同一型的抗体的重链恒定区都是相同的，不同型的抗体之间的重链恒定区不同。例如，IgG4形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG4。

本文所述的术语“单结构域抗体”通常指这样的抗体，其仅由一个重链可变区组成，具有与抗原结合的活性，即从C端到N端仅包含一条链：FR4-VHHCDR3-FR3-VHHCDR2-FR2-VHHCDR1-FR1的抗体，可来自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、鱼类IgNAR的VH样单结构域(v-NAR))，其可以天然产生或由基因工程技术产生。单结构域抗体的实例包括源自骆驼科(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如护士鲨)的单结构域抗体(WO 2005/035572)。

术语“骆驼化的人VH结构域”是指将衍生自骆驼科VHH的关键元件转移到人VH结构域上导致人VH结构域不再需要与VL结构域配对来识别靶抗原，经骆驼化的人VH结构域单独即可赋予抗原结合特异性。

如本文所用的术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗体分子中与抗原实际结合的区域，包括由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的VH/VL对、衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、来自鲨鱼科动物的IgNAR的VH样单结构域(v-NAR)、骆驼化的人VH结构域、人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体分子包含至少四个抗原结合位点，例如，包含两个单结构域抗体抗原结合位点(例如，VHH)和两个VH/VL对形成的抗原结合位点。

术语“单结构域抗原结合位点”表示抗体分子的以单个可变结构域(例如，重链可变结构域(VH))与抗原结合的区域。在本发明的一个实施方案中，本发明的单结构域抗原结合位点可构成单结构域抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体分子包含两个单结构域抗原结合位点，分别结合相同或不同的抗原。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体分子包含两个单结构域抗原结合位点，分别结合相同或不同的抗原表位。

如本文所用，术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体，所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与相同抗原的不同表位或与不同抗原的不同表位结合。本文提供的抗体通常是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，本文提供了这样的双特异性抗体，其具有针对第一抗原和第二抗原的结合特异性。

术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键键合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条免疫球蛋白重链具有一个重链可变区(VH)，也称作重链可变结构域，随后是三个重链恒定区的结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条免疫球蛋白轻链具有一个轻链可变区(VL)，也称作轻链可变结构域，随后是一个轻链恒定结构域(CL)。免疫球蛋白的重链可以归属5个类别之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类别可以进一步划分成亚类，例如γ₁(IgG1)、γ₂(IgG2)、γ₃(IgG₃)、γ₄(IgG₄)、α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。

术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于免疫球蛋白Fc区的那些生物学活性。免疫球蛋白效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。

术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的抗原性。

“人源化”抗体是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性，同时作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并且抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，恒定区以及可变区中不参与结合的部分为人类抗体的相应部分)来实现。参见，例如Padlan，Anatomy ofthe antibodymolecule，Mol.Immun.，1994，31：169-217。人类抗体工程化技术的其他例子包括但不限于US 5,766,886中公开的Xoma技术。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

术语“...价”抗体指抗体分子中存在的抗原结合位点的数目。“二价”、“三价”和“四价”抗体指抗体分子中分别存在2个抗原结合位点、3个抗原结合位点和4个抗原结合位点。在一个实施方案中，本文中报道的双特异性抗体是“四价的”。

术语“柔性接头”或“接头”是指由氨基酸组成的连接肽，例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，以连接抗体中的各个可变结构域。在一个实施方案中，柔性接头是Gly/Ser连接肽，包括氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数，例如2、3或4。在一个实施方案中，所述柔性接头是(Gly₄Ser)₂(SEQ ID NO：5)。还包括在本发明范围内的是WO2012/138475中描述的接头，其通过引用并入本文。

如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法测定。

术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。在本文的一些实施方案中，第一抗原、第二抗原是两种不同的抗原。

术语“肿瘤相关抗原”或“癌症抗原”可互换地指与正常细胞相比，优选在癌细胞表面完全或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且所述分子可用在药剂对癌细胞的优先靶向中。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是与正常细胞相比在肿瘤细胞中过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过量表达、2倍过量表达、3倍过量表达或更多倍过量表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原是在肿瘤细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原仅在肿瘤细胞的细胞表面完整表达或作为片段表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子、白介素(IL)，诸如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-15；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)和γ-干扰素。如本文中使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物，包括通过人工合成产生的小分子实体，及其药剂学可接受的衍生物和盐。

“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。

如本文中使用的，术语“OX40”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人、猴、食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然OX40，除非另有说明。该术语涵盖“全长”，未加工的OX40以及因细胞中的加工所致的任何形式的OX40。该术语还涵盖OX40的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。

“OX40活化”指OX40受体的活化。通常，OX40活化导致信号转导。

本文所用的术语“抗OX40抗体”、“抗OX40”、“OX40抗体”或“结合OX40的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合(人或猴)OX40蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向(人或猴)OX40中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗OX40抗体与非(人或猴)OX40蛋白结合的程度低于所述抗体与(人或食蟹猴)OX40结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或以上，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜干涉测定法或MSD测定法或SPR测定法测量的。

如本文所用的术语“程序性细胞死亡1配体1”、“PD-L1”、“程序性死亡配体1”、“分化簇274”、“CD274”或“B7同系物1”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然PD-L1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类(例如，人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”、未加工的PD-L1以及由细胞中的加工所产生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作为跨膜蛋白或作为可溶性蛋白存在。所述术语还涵盖天然存在的PD-L1的变体，例如剪接变体或等位基因变体。PD-L1的基本结构包括4个结构域：胞外Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域、跨膜结构域以及细胞质结构域。可在NCBI Gene ID No.29126下找到关于人PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的另外信息。可在NCBI Gene ID No.60533下找到关于小鼠PD-L1基因(包括基因组DNA序列)的另外信息。示例性全长人PD-L1蛋白的氨基酸序列可例如在NCBI登录号NP_001254653或UniProt登录号Q9NZQ7下找到，而可例如在NCBI登录号NP_068693或Uniprot登录号Q9EP73下找到示例性全长小鼠PD-L1蛋白序列。

本文所用的术语“抗PD-L1抗体”、“抗PD-L1”、“PD-L1抗体”或“结合PD-L1的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合PD-L1蛋白或其片段。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体与非PD-L1蛋白结合的程度低于所述抗体与PD-L1结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或以上，如例如通过放射性免疫测定(RIA)或生物光干涉测定法或MSD测定法测量的。

术语“抑制剂”或“拮抗剂”包括使所给出分子的某些参数(例如，活性)降低的物质。例如，这个术语包括使得所给出的分子被抑制至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的活性(例如，PD-L1活性)的物质。因此，抑制作用不必是100％。

术语“激活剂”包括使所给出分子的某些参数(例如，活性)增加的物质。例如，这个术语包括使得所给出的分子被增加至少5％、10％、20％、30％、40％或更多的活性(例如，OX40活性)的物质。因此，激活作用不必是100％。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用多种测定法来评估，例如本文所公开的那些。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达Fc使效应器功并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。

术语“有效量”指本发明的抗体或片段或缀合物或组合物的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中激发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤生长率)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％和仍更优选地至少约80％。可以在预示人肿瘤中的功效的动物模型系统中评价化合物抑制可度量参数(例如，癌症)的能力。可选地，可以通过检验化合物抑制的能力评价组合物的这种特性，所述抑制在体外通过熟练技术人员已知的测定法。

“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。

“Fab”片段包括重链可变结构域和轻链可变结构域，并且还包括轻链的恒定结构域以及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1结构域的羧基末端增加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab’-SH是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羰基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^thed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是可以用来产生本发明抗体分子的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。

术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括肺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌，包括那些癌症的转移性形式。

术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接被标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体进行的一级抗体的检测和具有生物素的DNA探针的末端标记，使得其可以用荧光标记的链霉抗生素蛋白来检测。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

如下进行序列之间序列同一性的计算。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。

可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的Blossum 62评分矩阵。

还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和w.Miller算法，((1989)CABIOS，4：11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。

额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。

如本文所用，术语“在低严格性、中等严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件。进行杂交反应的指导可以在通过引用方式并入的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。参考文献中描述了含水方法和非含水方法并且可以使用任一方法。本文中提及的特异性杂交条件如下：1)低严格性杂交条件是在约45℃于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后至少在50℃(对于低严格性条件，可以增加洗涤的温度至55℃)于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中等严格性杂交条件是在约45℃于6X SSC中、随后在60℃在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严格性杂交条件是在约45℃在6X SSC中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；并且优选地4)极高严格性杂交条件是在65℃于0.5M磷酸钠、7％SDS中、随后在65℃于0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件和除非另外说明，否则应当使用的一个条件。

术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、载体、赋形剂或稳定剂等。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体分子用来延缓疾病发展或用来减慢疾病的进展。

用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗疾病，例如肿瘤(例如癌症)和感染中有效的任何物质，包括抗血管发生剂、化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物，包括但不限于抗肿瘤剂，包括烷化剂；抗代谢物；天然产物；抗生素；酶；杂类试剂；激素和拮抗剂；抗雌激素；抗雄激素；以及非类固醇抗雄激素等。

本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。

术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。

术语“抗感染活性剂”包括在施用浓度和给药间隔下特异性抑制或消除微生物生长但对宿主不致命的任何分子，所述微生物诸如病毒、细菌、真菌或原生动物，例如寄生虫。用于本文时，术语抗感染活性剂包括抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。在一个具体方面中，抗感染活性剂在施用浓度和给药间隔对宿主是无毒的。

抗细菌的抗感染活性剂或抗细菌剂可广泛的分类为杀菌的(即，直接杀死)或抑菌的(即，阻止分裂)。抗菌的抗感染活性剂可进一步再分类为窄谱抗菌剂(即，仅影响小类细菌亚型，例如，革兰氏阴性等)或广谱抗菌剂(即，影响广泛种类)。

术语“抗病毒剂”包括抑制或消除病毒生长、致病和/或存活的任何物质。

术语“抗真菌剂”包括抑制或消除真菌生长、致病和/或存活的任何物质。

术语“抗原生动物剂”包括抑制或消除原生动物生物体(例如寄生虫)生长、发病和/或存活的任何物质。

术语“功能障碍”在免疫功能障碍的背景中指降低的对抗原性刺激的免疫响应性的状态。如本文中使用的，术语“功能障碍”还包括对抗原识别的不感受或不响应，特别地，将抗原识别转化成下游T细胞效应器功能，诸如增殖，细胞因子生成(例如γ干扰素)和/或靶细胞杀伤的能力受损。

“激活T细胞”意指诱导，引起或刺激效应或记忆T细胞具有更新，持续或放大的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括：相对于干预前的此类水平，升高的来自CD8⁺效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌，升高的来自CD4⁺记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)分泌，升高的CD4⁺效应和/或记忆T细胞增殖，升高的CD8⁺效应T细胞增殖，升高的抗原响应性(例如清除)。在一个实施方案中，增强的水平是至少50％，或者60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、2倍、3倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍或更高。测量此增强的方式是本领域普通技术人员已知的。

“肿瘤免疫逃逸”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此，作为治疗概念，肿瘤免疫在此类逃避减弱时得到“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤收缩和肿瘤清除。

“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的，并且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答清除肿瘤细胞。

如本文中使用的，“抗体的激动剂活性”指抗体能活化它所结合的抗原的生物学活性。

“抗血管发生剂”指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。

术语“组合产品”是指一种剂量单位形式的固定组合或非固定组合或用于组合施用的部分的试剂盒，其中两种或更多种治疗剂可以独立地在同一时间同时施用或在一定时间间隔内分开施用，尤其是在这些时间间隔允许组合伴侣展示协作，例如，协同效应时。术语“固定组合”是指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂)以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指本发明抗体和组合伴侣(例如其他治疗剂)作为分开的实体同时、并行或依次施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用提供了患者体内两种治疗剂的治疗有效水平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或更多种治疗剂。在一个优选的实施方案中，药物组合是非固定组合。

术语“组合疗法”或“联合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗如本公开所述的癌症或感染。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用或分开施用或依次施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。在一些实施方案中，施用还包括以大致相同的时间，或在不同的时间以顺序的方式，使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其有效相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“受试者/患者样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、细针吸出物、支气管灌洗液、胸膜液(胸水)、痰液、尿液、手术标本、循环中的肿瘤细胞、血清、血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

II.本发明的抗体分子

本发明提供了一种新型的抗体分子，其能够用于多种疾病的免疫治疗、预防和/或诊断。本发明的抗体分子包含至少2个、3个或4个抗原结合位点，其能够作为单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体发挥作用，优选地，其能够作为双特异性抗体发挥作用。

在一个实施方案中，本发明抗体分子中式(I)的单结构域抗原结合位点(VHH)是能够以较高亲和力特异性结合靶抗原表位的单个重链可变结构域，例如，衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、来自鲨鱼科动物的IgNAR的v-NAR、骆驼化的人VH结构域、人源化的骆驼科抗体重链可变结构域、和它们的经重组的单结构域。在一个实施方案中，本发明抗体分子中的单结构域抗原结合位点是衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、骆驼化的人VH结构域和/或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。现有技术中已经对从骆驼科物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)获得的抗体蛋白的大小、结构和针对人类受试者的抗原性进行了表征。在自然界中来自骆驼科哺乳动物家族的某些IgG抗体缺少轻链，并且因此在结构上区别于来自其他动物的具有两条重链和两条轻链的常见四链抗体结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公布的WO 94/04678)。

可以通过基因工程方法获得骆驼科重链抗体的对靶抗原具有高亲和力的重链可变结构域VHH。参见例如1998年6月2日授予的美国专利号5,759,808。与其他非人源抗体片段一样，骆驼科VHH的氨基酸序列可以重组地改变以获得更逼真模仿人序列的序列，即，“人源化”，由此降低骆驼科VHH对人类的抗原性。另外，也可以将衍生自骆驼科VHH的关键元件转移到人VH结构域上，获得骆驼化的人VH结构域。VHH的分子量是人IgG分子的分子量的十分之一，并且具有仅数纳米的物理直径。VHH本身具有极高的热稳定性、对极端pH和蛋白酶解消化稳定和抗原性低，因此，在本发明抗体分子的一个实施方案中，式(I)中的VHH作为构建模块对本发明抗体分子的稳定性、对人受试者的低抗原性做出了贡献。

在一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的VHH特异性结合PD-L1(例如人PD-L1)。

在一个实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的特异性结合PD-L1的VHH包含

(i)SEQ ID NO：6中所含的三个互补决定区域(VHH CDR)，或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在优选的实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的特异性结合PD-L1的VHH包含：

互补决定区域(CDR)VHH CDR1、VHH CDR2和VHH CDR3，其中VHH CDR1包含SEQ IDNO：10的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR1包含与SEQ ID NO：10的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；VHH CDR2包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR2包含与SEQ ID NO：11的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；VHH CDR3包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或者VHH CDR3包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，本发明抗体分子式(I)中的特异性结合PD-L1的VHH包含或由其组成：

(i)SEQ ID NO：6所示的序列，

(ii)与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或

(iii)与SEQ ID NO：6的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一个实施方案中，式(I)的vH和式(II)的VL构成的抗原结合位点特异性结合OX40，例如人OX40。

在一些具体的实施方案中，在本发明抗体分子中，式(I)中的VH包含

(i)如SEQ ID NO：2所示的重链可变区VH的3个互补决定区HCDR，或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，和/或

式(II)中的VL包含

(i)如SEQ ID NO：8所示的轻链可变区VL的3个互补决定区LCDR，或

(ii)相对于(i)的序列，在所述三个CDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。

在一些实施方案中，在本发明的抗体分子中，式(I)中的VH包含

互补决定区域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO：13的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ IDNO：14的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO：14的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQID NO：15的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；

和/或

式(II)中的VL包含

互补决定区域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO：16的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ IDNO：17的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO：17的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQID NO：18的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在本发明的抗体分子中，

(a)式(I)中的VH

(i)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；或者

(ii)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；

和/或

(b)式(II)中的VL

(i)包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：8的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的Fc来自IgG1、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，所述Fc来自IgG2。在一些实施方案中，Fc

(i)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的CHl来自来自IgGl、IgG2或IgG4。在一些实施方案中，CHl来自IgG2。在一些实施方案中，CH1

(i)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的CL

(i)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明抗体分子式(I)的X是柔性接头，例如具有单独或组合的甘氨酸和/或丝氨酸残基的接头。在一个实施方案中，所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数，例如，n是1-7中的正整数，例如，n是2，3，4，5，6。在一个实施方案中，n是1、2、3或4。在一个实施方案中，X具有SEQ ID NO：5所示的序列。

在一些实施方案中，在本发明的抗体分子中，

(a)式(I)中的VH-CH1-Fc

(i)包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：19的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在重链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在重链可变区中；

和/或

(b)式(II)的VL-CL

(i)包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成；

(ii)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列或由其组成；或者

(iii)包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链的CDR区中，更优选地，所述氨基酸改变不发生在轻链可变区中。

在一些实施方案中，本发明抗体分子在式(I)的VH或式(II)的VL的N端还包含信号肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：22)。

在本发明的优选的实施方案中，本发明涉及这样的抗体分子，其中式(I)的多肽链包含SEQ ID NO：1所示的序列，或包含与其具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或其中式(II)的多肽链包含SEQ IDNO：7所示的序列，或包含与其具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含全抗体部分作为其一部分。在一些实施方案中，本发明的全抗体部分包含式(I)链的VH-CH1-Fc，以及式(II)链的VL-CL。其中VH构成全抗体部分的重链可变区，CH1-Fc构成全抗体部分的重链恒定区，二者一起构成全抗体部分的重链；VL构成全抗体部分的轻链可变区，CL构成全抗体部分的轻链恒定区，二者一起构成全抗体部分的轻链。

在一些实施方案中，全抗体部分是人抗体。在一些实施方案中，全抗体部分是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG4形式的抗体。在一些实施方案中，全抗体部分可独立地构成单克隆抗体。在一些实施方案中，全抗体部分是人源化的。在一些实施方案中，全抗体部分是嵌合抗体。在一些实施方案中，至少部分的全抗体部分的框架序列是人共有框架序列。

在一个具体的实施方案中，全抗体部分是的抗OX40抗体。

在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。

在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。

在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表A所示：

表A

原始残基	示例性置换	优选的置换
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp、Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	A1a	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu，Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。

举例而言，可实施一或多种氨基酸置换以消除一或多个可变区构架糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。这类无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。例如参见美国专利第5,714,350号及第6,350,861号。可制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减小量的岩藻糖基残基的低岩藻糖化抗体或具有增加的等分GlcNac结构的抗体。这类改变的糖基化模式已显示可增加抗体的ADCC能力。可通过例如在具有改变的糖基化体系的宿主细胞中表达抗体来实现这类糖类修饰。备选地，可使用岩藻糖苷酶切除抗体的岩藻糖残基；举例而言，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗体去除岩藻糖基残基(Tarentino等人(1975)Biochem.14：5516-23)。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体，以便增强例如抗体治疗癌症或细胞增殖性疾病的有效性。Fc区的修饰包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化、和添加多个Fc。对Fc的修饰还可以改变治疗性抗体中的抗体的半衰期，从而实现更低频率的给药和因而增加的方便和减少的材料使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，734-735页。

在一个实施方案中，可以改变抗体的半胱氨酸残基数目以修饰抗体特性。例如对CH1的铰链区实施修饰，从而改变(例如增加或降低)铰链区中的半胱氨酸残基的数目。此办法进一步阐述于美国专利第5,677,425号中。可以改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如促进轻链及重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。

任选地，本发明的抗体包括对抗体链的翻译后修饰。示例性的翻译后修饰包括二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述抗体或片段用经工程改造的酵母N-连接的聚糖或CHO N-连接的聚糖糖基化。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

本发明所涵盖的另一种对本文所述抗体或其片段的修饰是聚乙二醇化(pegylation)。可对抗体实施聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。如本文中所使用，术语“聚乙二醇”意图涵盖已用于衍生化其他蛋白质的PEG的任一形式，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，要聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。本领域中已知使蛋白质聚乙二醇化的方法且可将其应用于本发明的抗体，例如参见EP 0154316及EP 0401384。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子是人源化的。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13∶1619-1633)。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子是人抗体或人源化抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体或人源化抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体分子是嵌合抗体。

在一些实施方案中，至少部分的本发明的抗体分子的框架序列是人共有框架序列。

在一个实施方案中，本发明的本发明的抗体分子还涵盖其抗体片段，例如以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)或(Fab’)₂、或线性抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体具有如下一种或多种性质：

(1)本发明的双特异性抗体或其片段以高亲和力同时结合两种人抗原，例如，以以下平衡解离常数(K_D)与人OX40结合，所述K_D小于或等于大约150nM、140nM、130nM、120nM、110nM或100nM，在一些实施方案中，所述K_D在大约90nM或95nM以上；且同时，以以下平衡解离常数(K_D)与人PD-L1结合，所述K_D小于或等于大约10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、或4nM，在一些实施方案中，所述K_D在大约1nM、2nM、3nM或3.5nM以上；在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用SPR测定法测定的。

(2)本发明的双特异性抗体或其片段以高亲和力同时结合两种猴抗原，例如，以以下平衡解离常数(K_D)与猴OX40结合，所述K_D小于或等于大约50nM、40nM、30nM、25nM、24nM、23nM或22nM，在一些实施方案中，所述K_D在大约10nM或15nM或20nM以上；且同时，以以下平衡解离常数(K_D)与猴PD-L1结合，所述K_D小于或等于大约50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、14nM或13nM，在一些实施方案中，所述K_D在大约10nM、11nM或12nM以上；在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物膜层干涉技术法测定(例如ForteBio亲和力测定)测定的。

(2)本发明的抗体或其片段结合表达人PD-L1的细胞，例如，以小于或等于大约10nM、9nM、8.9nM或8.8nM的EC50(在一些实施方案中，所述EC50在大约7nM、8nM或8.5nM以上)，且同时，结合表达人OX40的细胞，例如，以小于或等于大约10nM、9nM、8.9nM、8.8nM、8.7nM、8.6nM或8.5nM的EC50(在一些实施方案中，所述EC50在大约7nM或8nM以上)。在一些实施方案中，所述结合用流式细胞术(例如FACS)测定。在一些实施方案中，表达人OX40的细胞为表达人OX40的CHO细胞和/或表达人PD-L1的细胞为表达人PD-L1的CHO细胞。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段诱导表达人OX40的细胞与表达人PD-L1的细胞的交联。

(3)本发明的抗体或其片段与人T细胞结合，以小于或等于大约5nM、4.5nM、4.4nM、4.3nM、4.2nM或4.1nM的EC50(在一些实施方案中，EC50在3或3.5或4nM以上)。在一些实施方案中，所述结合用流式细胞术(例如FACS)测定。

(4)本发明的抗体或其片段具有良好的热稳定性，例如长期热稳定性。在一些实施方案中，例如在加速稳定性测试中，例如在40℃耐受，例如耐受至少30天。在一些实施方案中，在加速稳定性测试中，在例如40℃放置至少10天、20天或30天，抗体保持其单体主峰纯度的至少95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所述抗体或其片段通过差式扫描荧光法测定的Tm大于或等于大约60℃、61℃、62℃或63℃。

(5)本发明的抗体或其片段阻断PD-L1(例如人PD-L1)的相关活性。在一些实施方案中，PD-L1的相关活性是PD-L1与PD-1的结合或PD-L2与PD-1的结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段在MOA(mechanisms ofaction)测定(功能性生物活性检测系统，例如来自Promega)中抑制PD-L1与PD-1的结合。在一些实施方案中，在荧光素酶报告基因检测系统中，本发明的抗体解除PD-1/PD-L1相互作用对NFAT信号通路的抑制，例如以小于或等于大约1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM或0.5nM的EC50(在一些实施方案中，EC50大于或等于大约0.3nM或0.35nM或0.4nM)。

(6)本发明的抗体或其片段不阻断人OX40配体与OX40的结合。在一些实施方案中，所述抗体或其片段的阻断低于现有的抗体，例如pogalizumab。在一些实施方案中，所述抗体或其片段完全不阻断人OX40配体与OX40的结合，例如与IgG相当。

(7)本发明的抗体或其片段有效激活OX40信号通路，例如OX40或OX40配体介导的信号通路和/或其下游信号通路(例如NFkB信号通路)。

(8)本发明的抗体或其片段具有PD-L1(例如人PD-L1)依赖的有效激活OX40信号通路的能力。在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段在表达(例如天然表达或工程化表达)PD-L1的细胞(例如肿瘤细胞)存在下，有效激活OX40信号通路，在一些实施方案中，所述信号通路包括例如OX40或OX40配体介导的信号通路和/或其下游信号通路(例如NFkB信号通路)。

(9)本发明的抗体或其片段有效激活T细胞(例如CD4+T细胞)，例如其激活效果强于抗PD-L1抗体或抗OX40抗体或二者联用。

(10)本发明的抗体具有更好的肿瘤抑制效果。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：

(i)显示与本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ IDNO：7作为式(II)的肽链)对OX40和PD-L1相同或相似的结合亲和力和/或特异性；

(ii)抑制(例如，竞争性抑制)本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)与OX40和PD-L1的结合；

(iii)与本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)结合相同或重叠的表位；

(iv)与本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)竞争结合OX40和PD-L1；

(v)具有本发明抗体(例如包含SEQ ID NO：1作为式(I)的肽链且包含SEQ ID NO：7作为式(II)的肽链)的一个或多个生物学特性。

III.免疫缀合物

在一些实施方案中，本发明还涵盖与其他物质缀合的抗体(“免疫缀合物”)。在一些实施方案中，其它物质例如治疗剂或标记，如细胞毒性剂或免疫抑制剂或化疗剂。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的。

另外，本发明的抗体分子可以与标记序列(如肽)缀合以促进纯化。在优选的实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)等中提供的标签，它们中的许多是可商业获得的。如Gentz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如，六组氨酸提供融合蛋白的便利纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell 37：767)和“flag”标签。

在其他实施方案中，本发明的抗体分子与诊断剂或可检测剂缀合。这类抗体可以作为临床检验方法的部分(如确定特定疗法的效力)，用于监测或预测疾病或病症的发作、形成、进展和/或严重性。可以通过将抗体与可检测物质偶联实现这类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于多种酶；辅基；荧光物质；发光物质；放射性物质；和用于各种正电子发射成像术中的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。

另外，本发明的抗体分子可以与调节给定生物学反应的治疗性部分或药物部分缀合。治疗性部分或药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如，药物部分可以是拥有所需生物学活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可以例如包括毒素；蛋白质或生物学反应调节物。

另外，本发明的抗体分子可以缀合至治疗性部分如放射性金属离子或可用于使放射金属离子缀合至多肽的大环螯合剂。

用于治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如Arnon等人，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，引自MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编著)，第243-256页(Alan R.Liss，Inc.1985)。

抗体也可以连接至固相支持物，所述支持物特别可用于免疫测定法或靶抗原的纯化。此类固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

在一些实施方案中，所述免疫缀合物用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤、T细胞功能障碍性疾病等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌或肺癌。

IV.本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗体或其片段或其任一条链的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞或293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。

本发明还涵盖与下述核酸在严格性条件下杂交的核酸或与下述核酸具有一个或多个置换(例如保守性置换)、缺失或插入的核酸：包含编码选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示氨基酸序列的核酸序列的核酸；或包含编码与选自SEQ ID NO：1-9中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列的核酸。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。例如pXC载体或pTT5载体，例如pXC17.4或pXC18.4。在一个实施方案中，表达载体被构建为双基因表达载体。

一旦已经制备了用于表达的表达载体或DNA序列，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，将细胞在培养基中培育并且筛选适宜的活性。用于培养所产生的转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的并且可以基于本说明书和现有技术已知的方法，根据使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞变动或优化。

另外，可以通过引入允许选择已转染的宿主细胞的一个或多个标记物，选出已经稳定将DNA掺入至其染色体中的细胞。标记物可以例如向营养缺陷型宿主提供原养型、杀生物抗性(例如，抗生素)或重金属(如铜)抗性等。可选择标记基因可以与待表达的DNA序列直接连接或通过共转化引入相同的细胞中。也可能需要额外元件以便最佳合成mRNA。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

在一个实施方案中，提供了包含一种或多种本发明多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含本发明表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

合适的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌。宿主细胞还可以是真核微生物如丝状真菌或酵母，或各种真核细胞，例如昆虫细胞等。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK 293或293F细胞)、293细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝脏细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝脏细胞(Hep G2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHOK1SV细胞、CHOK1SV GS-KO细胞、CHOS细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞系如Y0、NS0、P3X63和Sp2/0等。适于产生蛋白质的哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是CHO细胞，例如CHOS细胞CHOK1SV细胞或CHOK1SV GS-KO，或所述宿主细胞是293细胞，例如HEK293细胞。

V.本发明的抗体分子的生产和纯化

在一个实施方案中，本发明提供制备本发明抗体分子或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包括在适于表达编码本发明抗体分子或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收本发明抗体分子或其片段(优选地抗原结合片段)。

在一个实施方案中，提供了制备本发明抗体分子的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。

为了重组产生本发明抗体分子，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体，例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸，并将其插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括大小排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。

VI.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗体分子鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对所结合抗原的结合，本文中公开了例示性方法，例如生物膜层干涉技术和SPR。

本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗体的测定法。生物学活性可以包括例如结合抗原，对细胞表面抗原的结合、对抗原的抑制或激活作用等。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。

本发明还提供用于鉴定抗体的性质，例如成药性相关性质的方法。所述成药性相关性质包括例如热稳定性，例如长期热稳定性。

供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达抗原或经改造而表达抗原的细胞系。此类细胞还包括表达抗原的细胞系和并非正常情况下表达抗原的编码抗原的DNA转染的细胞系。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物替换或补充本发明的抗体分子来进行任何上述测定法。

可以理解的是，能够使用本发明的抗体分子和别的活性剂来进行任何上述测定法。

在一些实施方案中，所述抗原为PD-L1(例如人PD-L1)和/或OX40(例如人OX40或猴OX40)。

VII.药物组合物和药物制剂

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗体分子或其片段(优选地其抗原结合片段)或其免疫缀合物的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗体分子或其片段或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如抗血管发生剂、化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂)的组合。

在一些实施方案中，所述组合物用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤、T细胞功能障碍性疾病等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌或肺癌。

本发明还包括包含本发明抗体或其免疫缀合物的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和/或包含编码本发明抗体的多核苷酸的组合物(包括药物组合物或药物制剂)。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种本发明抗体或其片段或一种或多种编码一种或多种本发明抗体或其片段的多核苷酸。

这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。

如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。

合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipiems”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，PharmaceuticalPress，London，Chicago。

若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。

本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、分散体剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。常见的优选组合物处于可注射用溶液剂或可输注溶液剂形式。优选的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹腔(i.p.)、肌内)注射。在一个优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体分子。在另一个优选实施方案中，通过肌内、腹腔或皮下注射施用抗体分子。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体与一种或多种任选的药用辅料(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，例如抗血管发生剂、化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

在一些实施方案中，治疗剂选自以下类别(i)-(iii)中的一个、两个或全部类别：(i)增强抗原呈递(例如，肿瘤抗原呈递)的药物；(ii)增强效应细胞反应(例如，B细胞和/或T细胞活化和/或动员)的药物；或(iii)减少免疫抑制的药物。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

本发明的药物组合物适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

治疗性组合物一般应当是无菌的并且在制造和储存条件下稳定。可以将组合物配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或冻干形式。可以通过将活性化合物(即抗体分子)以要求的量加入适宜的溶剂中，随后过滤消毒，制备无菌可注射溶液剂。通常，通过将所述活性化合物并入无菌溶媒中来制备分散体，所述无菌溶媒含有基础分散介质和其他成分。可以使用包衣剂如卵磷脂等。在分散体的情况下，可以通过使用表面活性剂来维持溶液剂的适宜流动性。可以通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶而引起可注射组合物的延长吸收。

包含本文所述抗体分子的试剂盒也处于本发明的范围内。试剂盒可以包含一个或多个其他要素，例如包括：包装插页；其他试剂，例如标记物或用于偶联的试剂；可药用载体；和用于施用至受试者的装置或其他材料。

Viii.组合产品或试剂盒

在一些实施方案中，本发明还提供了组合产品，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，或其免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂(例如抗血管发生剂、化疗剂、其他抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等)。

在一些实施方案中，所述组合产品用于用于预防或治疗疾病，如自身免疫病、炎性疾病、感染、肿瘤、T细胞功能障碍性疾病等。例如，所述疾病是肿瘤(例如癌症)或感染。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。优选地，肿瘤是例如结肠癌或结直肠癌或直肠癌或肺癌。

在一些方案中，所述组合产品中的两种或多种成分可以依次、分开或同时联合施用给受试者。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗体、药物组合物、免疫缀合物或组合产品的试剂盒，以及任选的指导施用的包装插页。

在一些实施方案中，本发明还提供了包含本发明的抗体、药物组合物、免疫缀合物、组合产品的药物制品，任选地，所述药物制品还包括指导施用的包装插页。

IX.本发明的抗体分子的用途

在一个方面，本发明涉及使用本发明的抗体分子体内用来治疗或预防需要在受试者中调节免疫应答的疾病，从而抑制或减少相关疾病如癌性肿瘤、自身免疫病、炎性疾病、感染、T细胞功能障碍性疾病的出现或复发。可以单独使用本发明的抗体分子。备选地，抗体分子可以与其他疗法(例如治疗剂/预防剂/治疗方式)组合施用。当本发明的抗体分子与一种或多种其他药物组合施用时，这种组合可以按任何顺序依次施用、分开或者同时施用。

因此，在一个实施方案中，本发明提供一种调节受试者中免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗体分子。在另一个实施方案中，本发明提供一种防止受试者中疾病出现或者复发的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本文所述的抗体分子。

在一些实施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病，例如癌症。在一些实施方案中，所述疾病是具有T细胞功能障碍的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是具有降低水平的(例如核酸或蛋白质水平)的OX40的疾病，例如OX40表达或活性降低的疾病。

在一些实施方案中，所述疾病是将受益于抑制核酸或蛋白质水平的PD-L1或PD-1或PD-L2的疾病。在一些实施方案中，所述疾病受益于阻断PD-1与PD-L1的结合，或PD-1与PD-L2的结合。在一些实施方案中，所述疾病受益于激活OX40活性，例如激活OX40信号通路，和或激活T细胞。

在一些实施方案中，本发明涉及在个体中抑制抗原作用和/或激活抗原活性或激活抗原介导的信号通路的方法，该方法包括向对象施用有效量的本文公开的抗体分子(例如，抗PD-L1/OX40抗体)或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。在一些实施方案中，所述抗原为OX40(例如人OX40)和/或PD-L1(例如人PD-L1)。在一些实施方案中，抑制抗原作用是指阻断PD-1与PD-L1的结合，或阻断PD-1与PD-L2的结合。在一些实施方案中，激活抗原活性或激活抗原介导的信号通路是指激活OX40信号通路。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体能够活化T细胞(例如CD4+T细胞)，例如增强T效应细胞的免疫刺激/效应功能和/或使这些细胞增殖和/或下调T调节细胞的免疫抑制功能。在一些实施方案中，所述抗体能够引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

在一个具体的实施方案中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体增强CD4+效应T细胞功能，例如通过提高CD4+效应T细胞增殖和/或提高CD4+效应T细胞的细胞因子生成。在一些实施方案中，该细胞因子是γ-干扰素，例如IFNg或白细胞介素，例如IL-2。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体或其片段提高肿瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如CD4+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)。在一些实施方案中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体或其片段提高表达γ-干扰素的肿瘤内(浸润性)CD4+效应T细胞的数目(例如表达γ-干扰素的CD4+效应T细胞的总数，或例如总CD4+细胞中表达γ-干扰素的CD4+细胞的百分比)。

在一些实施方案中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体或其片段增强记忆T细胞功能，例如通过提高记忆T细胞增殖和/或提高记忆细胞的细胞因子生成。在一些实施方案中，该细胞因子是γ-干扰素(例如IFNg)或白细胞介素(例如IL-2)。

在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的肿瘤(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症。

在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。

在另一方面中，本发明涉及预防或治疗受试者的自身免疫性疾病和/或炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的抗体分子或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒。

受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的患者)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，如本文所述的肿瘤或感染或自身免疫性疾病)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。备选地或组合下，受试者因感染而免疫受损或具有因感染而免疫受损的风险。

在一些实施方案中，用抗体分子治疗和/或预防的癌包括但不限于实体瘤、血液学癌及转移性病灶。在一个实施方案中，癌是实体瘤。实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，本文所述的癌症展示人效应细胞(例如受到人效应细胞浸润)。用于检测人效应细胞的是方法本领域公知的，包括例如通过IHC。在一些实施方案中，该癌症展示高水平的人效应细胞。在一些实施方案中，人效应细胞是NK细胞，巨噬细胞，单核细胞中的一项或多项。在本发明的任何方法的一些实施方案中，本文所述的癌症展示表达FcR的细胞(例如受到表达FcR的细胞浸润)。用于检测FcR的方法是本领域公知的，包括例如通过IHC。在一些实施方案中，该癌症展示高水平的表达FcR的细胞。在一些实施方案中，FcR是FcγR。在一些实施方案中，FcR是活化性FcγR。

本文公开的方法和组合物可用于治疗与前述癌症相关的转移性病灶。

在一些实施方案中，所述肿瘤是需要激活T细胞的肿瘤，例如癌症，例如具有T细胞功能障碍的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，所述肿瘤是表达(例如升高水平的)PD-L1的肿瘤，例如癌症。在一些实施方案中，所述肿瘤是OX40的表达或活性被降低的肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是受益于OX40信号通路激活的肿瘤，例如癌症。

在一些实施方案中，用抗体分子治疗和/或预防的感染性疾病包括目前不存在有效疫苗的病原体或常规疫苗对其未及完全有效的病原体。本发明例示的抗体分子对PD-L1阻断作用特别可用来对抗随感染过程推移出现变异抗原的病原体所建立的感染。这些变异抗原在施用本发明抗体时能够被视为外来抗原，由此，本发明例示的抗体分子能够通过PD-L1激发不受负向信号抑制的强烈T细胞反应。

在一些实施方案中，用本发明的抗体分子治疗和/或预防炎性和自身免疫性疾病及移植物抗宿主病(GvHD)，来下调免疫系统。

在其他方面，本发明提供抗体分子或其片段或其免疫缀合物或组合物或组合产品或试剂盒在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗本文提及的相关疾病或病症。

在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段或免疫缀合物或组合物或组合产品或试剂盒会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。

在一些实施方案中，本发明的抗体或药物组合物或免疫缀合物或组合产品或试剂盒还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的预防和/或治疗。

在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。

在一些实施方案中，治疗剂选自抗血管发生剂、化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂或免疫调节剂。

示例性的疫苗包括但不限于癌症疫苗。疫苗可以是基于DNA的疫苗、基于RNA的疫苗或基于病毒转导的疫苗。癌症疫苗可以是预防性的或治疗性的。

示例性的抗感染活性剂包括但不限于，抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗细菌剂。

在进一步的一些实施方案中，本发明的抗体或其片段还能与酪氨酸激酶抑制剂组合使用。

在本发明的任何方法的一些实施方案中，本发明的抗体或其片段的施用与肿瘤抗原的施用组合。抗原可以例如是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌性抗原或来自病原体的抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含蛋白质。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含核酸。在一些实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤细胞。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与抗肿瘤剂联合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与细胞因子联合施用。细胞因子可以作为与本发明的抗体分子的融合分子施用，或作为单独的组合物施用。在一个实施方案中，本发明的抗体与一种、两种、三种或更多种细胞因子(例如，作为融合分子或作为单独组合物)组合施用。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与本领域常规的癌症疗法组合，常规的癌症疗法包括但不限于：(i)放射疗法或用电离辐射杀死癌细胞并缩小肿瘤。放射疗法可经体外放射治疗(EBRT)或经内部近距离放射疗法施用；(ii)化学疗法，或应用细胞毒药物，其一般影响快速分裂的细胞；(iii)靶向疗法，或特异性影响癌细胞蛋白去调节的药剂；(iv)免疫疗法，或增强宿主免疫应答(例如，疫苗)；(v)激素疗法，或阻断激素(例如，当肿瘤是激素敏感的时候)，(vi)血管发生抑制剂，或阻断血管形成和生长，和(vii)姑息护理，或这样的治疗，其涉及改善护理质量以降低疼痛、恶心、呕吐、腹泻和出血。

在一些实施方案中，本发明的抗体或其片段可以与增强宿主免疫功能的常规方法组合。

上文所述的各种组合疗法可以进一步组合以用于治疗。

此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的疗法，例如治疗方式和/或治疗剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体的施用。抗体分子和/或其他疗法，例如治疗剂或治疗方式可以在活动性疾病期间或在缓解或活动度更小的疾病期间施用。抗体分子可以在其他治疗前、与其他治疗同时、治疗后或在疾病缓解期间施用。

在一个实施方案中，本发明的抗体的施用和别的疗法(例如治疗方式或治疗剂)的施用彼此在约一个月内，或约一，两或三周内，或约1，2，3，4，5，或6天内发生。

可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物或组合物或组合产品或试剂盒替换或补充本发明的抗体来进行任何治疗。

本发明的抗体(以及包含其的药物组合物或免疫缀合物，以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。

可以由技术人员确定本发明抗体分子的剂量和治疗方案。在一些实施方案中，调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次团注，可以随时间推移施用几个分开的剂量或可以如治疗情况的危急性所示，按比例减少或增加该剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于剂量的施用和均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗对象的单一剂量的物理分立的单元；每个单元含有预定量的活性化合物，所述的预定量经计算与所要求的药用载体结合时产生所需的治疗效果。用于本发明剂量单位形式的规格直接取决于(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，以及(b)混合这种活性化合物用于个体中敏感性治疗的领域内所特有的限制。

X.用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗体或其抗原结合片段可以用于检测其所结合抗原在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测，示例性的检测方法可以涉及免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术(例如，FACS)、抗体分子复合的磁珠、ELISA测定法、PCR-技术(例如，RT-PCR)。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶。

在一个方面，本发明提供了体外或体内检测生物样品，例如血清、精液或尿或组织活检样品(例如，来自过度增生性或癌性病灶)中存在相关抗原的诊断方法。该诊断方法包括：(i)在允许相互作用发生的条件下使样品(和任选地，对照样品)与如本文所述的抗体分子接触或向受试者施用所述抗体分子和(ii)检测所述抗体分子和样品(和任选地，对照样品)之间复合物的形成。复合物的形成表示存在相关抗原，并且可以显示本文所述治疗和/或预防的适用性或需求。

在一个实施方案中，可以使用本发明抗体诊断疾病，例如评价(例如，监测)对象中本文所述疾病(例如，肿瘤或感染)的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的本发明的抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，以及利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

在本文中提供的任何发明的一些实施方案中，样品是在用本发明的抗体治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在癌症已经转移之后获得的。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定、石蜡包膜(FFPE)的。在一些实施方案中，样品是活检(例如芯活检)，手术标本(例如来自手术切除的标本)，或细针吸出物。

在一些实施方案中，在治疗之前，例如，在起始治疗之前或在治疗间隔后的某次治疗之前检测相关抗原。

在一些实施方案中，体内确定相关抗原的水平和/或分布，例如，以非侵入方式确定(例如，通过使用合适的成像技术(例如，正电子发射断层摄影术(PET)扫描)检测可检测物标记的本发明抗体分子。在一个实施方案中，例如，通过检测用PET试剂(例如，¹⁸F-氟脱氧葡萄糖(FDG))以可检测方式标记的本发明抗体分子，体内测定相关抗原的水平和/或分布。

在一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述抗体分子和使用说明书的诊断试剂盒。

在一些实施方案中，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括：对受试者(例如，样品)(例如，包含癌细胞的受试者样品)检验相关抗原的存在，因而确定其值，将该值与对照值(例如健康个体中的相关抗原的值)比较，并且如果大于对照值，则向受试者施用治疗有效量的任选与一种或多种其他疗法组合的本发明的抗体，因而治疗疾病。

在一些实施方案中，抗原是PD-L1(例如人PD-L1)和/或OX40(例如人OX40)。

能够理解的是，在本发明各部分中描述的各个实施方案，例如疾病、治疗剂、治疗方式和施用等同样适用于本发明的其他部分的实施方案，或可以与其他部分的实施方案组合。在本发明各部分中描述的适用于抗体分子的性质、用途、和方法等实施方案，同样适用于包含抗体的组合物、缀合物、组合产品和试剂盒等。

描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。

实施例1.抗PD-L1/OX40双特异性抗体构建

本实施例利用分子克隆技术，构建了抗PD-L1/OX40双特异性抗体。该双特异性抗体形式含有四条多肽链，并且可以和两种抗原结合，抗原A为OX40，抗原B为PD-L1。用于构建双特异性抗体的亲本抗体为抗OX40单克隆抗体(IgG2形式的ADI-20057，中国发明专利申请号：201710185399.9；抗PD-L1纳米抗体人源化Nb-Fc(中国发明专利申请号：PCT/CN2017/095884)。构建方法如下：抗体的结构如图1A所示，由左右对称的四条多肽链组成，其中左半部分由肽链#1和肽链#2组成，右半部分同样由肽链#1和肽链#2组成。其中肽链#1和肽链#2的结构如图1B所示。下面对这抗PD-L1/OX40双特异性抗体进行描述。抗PD-L1/OX40双特异性抗体左半部分的SEQ ID NO：1所示的抗PD-L1/OX40双特异性抗体肽链#1氨基酸序列从N端至C端包含SEQ ID NO：2所示的抗OX40抗体ADI-20057VH氨基酸序列、SEQ ID NO：3所示的CH1氨基酸序列、SEQ ID NO：4所示的Fc氨基酸序列、SEQ ID NO：5所示的(G4S)₂柔性连接肽链氨基酸序列、以及SEQ ID NO：6所示的抗PD-L1单域抗体氨基酸序列。抗PD-L1/OX40双特异性抗体的左半部分的SEQ ID NO：7所示的抗PD-L1/OX40双特异性抗体肽链#2氨基酸序列从N端至C端包含SEQ ID NO：8所示的抗OX40抗体ADI-20057VL氨基酸序列和SEQ ID NO：9所示的CL氨基酸序列。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6中斜体加粗段序列为本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的CDR区(其中在VHH和VH区的HCDR1利用AbM规则定义；HCDR2&3利用Kabat规则定义；LCDR：利用Kabat规则定义)。具体的序列信息见序列表。

实施例2.抗PD-L1/OX40双特异性抗体蛋白的表达、纯化

在本实施例中，将编码实施例1中构建的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的肽链#1、肽链#2的核苷酸序列分别通过多克隆位点连接入市售的真核表达载体pXC载体，在真核细胞中进行表达和纯化，获得了抗PD-L1/oX40双特异性抗体。具体操作如下。

本实施例中，委托苏州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了抗PD-L1/OX40双特异性抗体、IgG2对照抗体的各肽链的编码核苷酸序列。使用合适的限制性内切酶和连接酶将所合成的编码肽链的核苷酸序列分别连接入载体，其中抗PD-L1/OX40双特异性抗体的两条肽链的编码DNA序列被分别构建入真核表达载体Double-GeneVectors(pXC17.4，pXCl8.4)(购自Lonza公司)并测序验证序列正确性，获得了分别含有所述编码肽链的核苷酸序列的重组载体。肽链#1、#2用电转染的方法转入CHOK1SV GS-KO Cell line(购自Lonza公司)细胞构建蛋白表达细胞株后进行蛋白表达，蛋白表达过程如下：

1)取所需CHOK1SV GS-KO Cell line(Lonza)蛋白表达细胞株，将其传代培养于CDCHO Medium(GIBCO，10743-029)，培养至细胞密度为0.8×106个细胞/ml；

2)过夜培养后隔一天补加培养物体积5/100的200g/L的FEED(Sigma，H6784-100G)，并且补充葡萄糖(D(+)-Glucose anhydrous，Merck，1.37048.5000)至终浓度5g/L；

3)连续培养至第14天或者细胞活力≤60％时，收集培养物，以7500转/分钟离心30分钟，取细胞上清，用以纯化。

细胞培养上清通过亲和层析方法纯化目的双特异性抗体蛋白。具体过程如下：

1)亲和纯化：选用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目录号：17-5438-03)亲和层析柱，并置于AKTApure系统(GE Healthcare)内。用0.1M NaOH将AKTA系统除内毒(过夜)。收样当天将细胞7500rpm/min离心30min，使用SARTOPORE(Sartorius，5441307H4)过滤。纯化前用5倍柱体积的Binding Buffer(Tris 20mM，NaCl 150mM，pH 7.2)清洗系统以及平衡柱子。将需要纯化的上述过滤后的上清通过柱子。用5～10倍柱体积Binding Buffer再平衡，使用AKTApure系统配备的紫外检测装置监测至紫外走平。用Elution Buffer(柠檬酸+柠檬酸钠100mM，pH 3.5)洗脱抗体，根据紫外吸收值来收集样品。每1ml的收集液加80μl的Neutralizing Buffer(Tris-HCl 2M)中和备用；

2)更换缓冲液：按照大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测收集的各级分管中样品的纯度，将纯度大于95％的样品合并。将合并后的溶液使用15ml超滤离心管离心，4500rpm，30min。使用PBS将蛋白稀释后继续离心，4500rpm，30min，重复2次，以更换缓冲液。将更换缓冲液后的抗体合并，测抗体浓度。

纯化后的蛋白利用SEC检测纯度，结果如图2所示。经过两步纯化后，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体纯度较高，其单体主峰纯度分别为100.00％，适合后期开发。

本实施例中，Pogalizumab是在HEK293细胞进行蛋白表达的人IgG1 OX40抗体，其利用来自建议的INN：列表114(参见http：//www.who.int/medicines/publications/ druginformation/innlists/PL114.pdf)的重链和轻链序列。委托苏州金唯智生物科技有限公司(Genewiz)合成了抗体上述各肽链的编码核苷酸序列。使用合适的限制性内切酶和连接酶将所合成的编码肽链的核苷酸序列分别连接入载体pTT5中，获得了分别含有所述编码肽链的核苷酸序列的重组载体。

用Polyethyleneimine(PEI)转染的方法转入HEK293细胞进行蛋白表达，转染过程如下：

1)根据所需转染体积将HEK293细胞(购自Invitrogen公司)传代培养于Expi293细胞培养液(购自Invitrogen公司)中。转染前一天离心细胞培养物，获得细胞沉淀，用新鲜的Expi293细胞培养液悬浮细胞，将细胞密度调整为1×10⁶个细胞/ml。继续培养HEK293细胞，使得转染当天的培养物中细胞密度约为2×10⁶个细胞/ml；

2)取HEK293细胞悬浮液终体积1/10的F17培养基(购自Gibco公司，产品目录号A13835-01)作为转染缓冲液。向每毫升转染缓冲液中加入200μg的1∶1摩尔比率的上述制备的分别包含各条链的核苷酸序列的重组质粒，混匀；

3)加30μg的PEI(Polysciences，23966)到质粒中，混匀后室温孵10min。将混合物轻柔倒入HEK293细胞悬浮液中。轻轻混匀，置于8％CO₂、36.5℃过夜培养；

4)过夜培养后，向培养瓶中补加转染后培养物体积1/50的浓度为200g/L的FEED(Sigma，目录号：H6784-100G)和转染后培养物体积1/50的浓度为200g/L的葡萄糖溶液，轻轻混匀，置于8％CO₂、36.5℃继续培养。20小时后，加入VPA(Gibco，目录号：11140-050)至终浓度为2mM/L；

5)连续培养至第7天或者细胞活力≤60％时，收集培养物，以7500转/分钟离心30分钟，取细胞上清，用以纯化；

细胞培养上清通过亲和层析方法纯化目的双特异抗体蛋白。具体过程如下：1)亲和纯化：选用MabSelect SuRe(GE Healthcare，目录号：17-5438-03)亲

和层析柱，并置于AKTApure系统(GE Healthcare)内。用0.1M NaOH将AKTA系统(GEHealthcare)除内毒(过夜)。收样当天将细胞7500rpm/min离心30min，使用SARTOPORE(Sartorius，5441307H4)过滤。纯化前用5倍柱体积的Binding Buffer(Tris 20mM，NaCl150mM，pH7.2)清洗系统以及平衡柱子。将需要纯化的上述过滤后的上清通过柱子。用5～10倍柱体积Binding Buffer再平衡，使用AKTApure系统配备的紫外检测装置监测至紫外走平。用Elution Buffer(柠檬酸+柠檬酸钠100mM，pH 3.5)洗脱抗体，根据紫外吸收值来收集样品。每1ml的收集液加80μl的Neutralizing Buffer(Tris-HCl 2M)中和备用；

2)更换缓冲液：按照大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测收集的各级分管中样品的纯度，将纯度大于95％的样品合并。将合并后的溶液使用15ml超滤离心管离心，4500rpm，30min。使用PBS将蛋白稀释后继续离心，4500rpm，30min，重复2次，以更换缓冲液。将更换缓冲液后的抗体合并，测抗体浓度。

应用已知的方法制备抗OX40单克隆抗体(IgG2形式的ADI-20057，参见中国发明专利申请号：201710185399.9；抗PD-L1纳米抗体人源化Nb-Fc(参见中国发明专利申请号：PCT/CN2017/095884)，并同样进行上述纯化，获得ADI-20057和抗PD-L1人源化Nb-Fc，用于后续实验。

实施例3.抗PD-L1/OX40双特异性抗体和抗原的结合活性检测

实施例3.1.测定抗PD-L1/OX40双特异性抗体的亲和力的SPR测定

采用表面等离子共振法(SPR)测定本发明抗体结合人PD-L1或人OX40的平衡解离常数(K_D)。基于SPR原理，当一束偏振光以一定的角度入射到棱镜端面，在棱镜与金膜的界面将产生表面等离子波，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。分析时，先在传感芯片表面固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过芯片表面，若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过检测SPR角度变化，获得被分析物的亲和力、动力学常数等信息。

本实施例通过Biacore(GE Healthcare，T200)测定抗PD-L1/OX40双特异性抗体的K_D，具体方法如下：抗体被抗人Fc抗体捕获到芯片之后，通过检测抗原与被捕获的抗体之间的结合与解离获得亲和力及动力学常数。该方法包括芯片制备和亲和力检测。测定过程使用10倍稀释后的10×HBS-EP+(BR-1006-69，GE Healthcare)作为实验缓冲液。芯片制备过程使用氨基偶联试剂盒(BR-1006-33，GE Healthcare)，将其中的抗人Fc抗体偶联在CM5芯片(29-1496-03，GE Healthcare)表面，具体过程为：首先将50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与200mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)新鲜混匀并注入芯片双通道，活化7分钟。然后将抗人Fc抗体稀释于10mM Acetate(pH 5.0)中，注入CM5芯片双通道，使蛋白共价偶联在芯片通道表面，偶联高度约6000RU。最后注入1M乙醇胺，对剩余的活化位点进行封闭7分钟。亲和力检测每个循环包括捕获抗体、结合一种浓度抗原及芯片再生：

捕获抗体：首先将如实施例2制备并纯化的抗体稀释为0.5μg/mL，以10μL/min的流速，捕获在CM5芯片第二通道，捕获时间30s。

结合抗原：根据SPR的最佳浓度范围，使用实验缓冲液，将两倍梯度稀释后的抗原(介于0.15nM-20nM)(人PD-L1(ACRO，PD1-H5229)、人OX40(ACRO，OXO-H5224))，从低浓度到高浓度的顺序，注入CM5芯片双通道，结合时间180s，解离时间600s。

芯片再生：在进行下一个抗体测定前，使用10mM Glycine pH 1.5(BR-1003-54，GEHealthcare)对芯片进行再生。

数据结果使用1∶1结合模型进行动力学的分析。

检测结果如表1及表2所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体可以和人PD-L1及人OX40蛋白结合，且维持了亲本抗体ADI-20057和抗PD-L1人源化Nb-Fc与各相应抗原的亲和力常数。

表1.通过SPR测定法确定的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对人OX40的亲和力

表2.通过SPR测定法确定的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对人PD-L1的亲和力

实施例3.2.测定抗PD-L1/OX40双特异性抗体与猴抗原的亲和力ForteBio测定

本实施例利用Octet Red96系统(ForteBio公司生产)，通过动力学结合测定法确定本发明的上述示例性抗PD-L1/OX40双特异性抗体结合OX40和PD-L1的平衡解离常数(KD)。按照文献中报导的方法(Estep，P等人，High throughput solution Basedmeasurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs，2013，5(2)：p.270-278)进行ForteBio亲和力测定。实验过程如下：

1)准备传感器：实验开始前半个小时，根据样品数量，取合适数量的AHQ传感器(Pall，1506091)浸泡于SD buffer(PBS 1×，BSA0.1％，Tween-200.05％)中中预湿20分钟；

2)实验过程：向96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner)的孔中分别加入100μl的SD缓冲液作为空白对照(用于扣除背景)、100μl 100nM纯化的抗PD-L1/OX40双特异性抗体和作为对照的抗PD-L1人源化Nb-Fc抗体、抗OX40抗体抗体ADI-20057、100μl稀释于SD缓冲液中作为抗原的猴PD-L1(ACRO，PD1-C52H4)、猴OX40(ACRO，OX0-C5220)的溶液。将抗人IgGFc生物传感器AHQ浸没于分别含所述抗体溶液的孔中，在室温浸没600秒上样。随后将传感器在SD缓冲液中洗涤至达到基线，然后浸没于含100ul抗原溶液的孔中，监测抗体与抗原的结合。随后将传感器转移至含有100ulSD缓冲液的孔，监测抗体解离(设置运行步骤及时间：Baseline、Loading～1nm、Baseline、Association和Dissociation时间取决于样品结合、解离速度)。转速为400转/分钟，温度为30℃。通过Octet分析软件(ForteBio)拟合经背景校正的结合曲线和解离曲线，产生结合(K_on)和解离(kdis)速率常数，它们随后用来计算平衡解离常数(K_D)。

检测结果如表3和表4示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体可以和猴PD-L1及猴OX40结合，且维持了亲本抗体ADI-20057和抗PD-L1人源化Nb-Fc与各相应抗原的亲和力常数。

表3.通过ForteBio动力学结合测定法确定的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对猴OX40的结合亲和力

表4.通过ForteBio动力学结合测定法确定的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对猴PD-L1的结合亲和力

实施例3.3.本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体与过量表达人OX40或人PD-L1的CHO细胞的结合分析

为了验证本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体是否可以和细胞表面表达的抗原相结合，本实施例利用流式细胞技术检测了抗PD-L1/OX40双特异性抗体和过表达人OX40或人PD-L1的CHO细胞的结合，实验过程如下：

1)细胞准备：将携带克隆至多克隆位点MCS的人OX40 cDNA(SinoBiological Inc)的pCHO1.0载体(Invitrogen)转染至中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)(Invitrogen)，经压力筛选获得稳定表达人OX40的CHO细胞(CHO-OX40细胞)，将携带克隆至多克隆位点MCS的人PD-L1cDNA(SinoBiological Inc)的pCHO1.0载体(Invitrogen)转染至中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)(Invitrogen)，经压力筛选获得稳定表达人PD-L1的CHO细胞(CHO-PD-L1细胞)，将CHO-PD-L1/CHO-OX40细胞计数，并稀释至2×10⁶个细胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔；

2)检测步骤：400g，5min，离心，去除细胞培养基。将梯度稀释的样品(双特异性抗体、抗PD-L1抗体及抗OX40抗体)加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，冰上静置30min。400g，5min去除上清，PBS洗细胞1遍移除未结合的抗体。400g，5min去除PBS，每孔加入100ul1：200稀释的PE-抗人Fc抗体(SOUTHERN BIOTECH，2040-09)。冰上避光孵育30min。400g，5min去除上清，PBS洗细胞1遍，移除未缀合的抗体。用100μl PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD，ACCURIC6)检测抗体与细胞的结合。

检测结果如图3所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体能够和细胞表面的表达的人OX40结合，结合EC50为8.463nM，和亲本抗OX40抗体ADI-20057的结合能力(EC50为4.710nM)相似。如图4所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体能够和细胞表面的表达的人PD-L1结合，结合EC50为8.732nM，和亲本抗体抗PD-L1人源化Nb-Fc的结合能力(EC50为9.651nM)相似。

实施例3.4.本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体同时结合过量表达人OX40的CHO细胞和过量表达人PD-L1的CHO细胞的分析

为了验证本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体是否可以同时与来自不同细胞上的靶抗原结合，本实施例利用流式细胞技术，检测了双特异性抗体诱导的不同细胞交联情况。具体实验过程如下：

1)将如实施例3.3所述获得的CHO-PD-L1和CHO-OX40细胞经400g，离心5min去除培养基，PBS洗一遍，再用PBS重悬细胞，计数后，调整细胞密度为2×10⁶个/ml；将CHO-PD-L1和CHO-OX40细胞分别按照1∶5000加入CellTracker^TM Deep Red(Thermo，C34565)和CellTrace CFSE(Invitrogen，C34554)染料，于37℃放置30分钟。400g离心5min后，去掉上清，用PBS洗一次细胞；

2)将梯度稀释的样品(双特异性抗体、抗PD-L1抗体及抗OX40抗体和IgG2对照(序列见序列表))分别加入U型底96孔板和染色后的CHO-PD-L1细胞，混合(细胞终密度为1.5×10⁶个/ml)。将U型底96孔板于4℃放置30min后取出，400g，离心5min，PBS洗四次，并用PBS重悬细胞；

3)向2)中的上述细胞中加入上述1)中染色后的CHO-OX40细胞(细胞终密度为1×10⁶个/ml)，于室温放置1小时后进行流式细胞仪(BD，ACCURIC6)检测。通道2及通道4双阳性细胞的比例可反映出由抗PD-L1/OX40双特异性抗体引起的细胞交联情况。

FACS检测结果如图5所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体能够诱导CHO-PD-L1细胞和CHO-OX40细胞的交联，由此表明本发明的双特异性抗体能够同时结合来自不同细胞表面的靶抗原。

实施例4本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的人T细胞结合检测

为了验证本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体是否可以和人T细胞相结合，本实施例利用流式细胞技术检测了抗PD-L1/OX40双特异性抗体和人T细胞的结合能力，实验过程如下：

1)细胞准备：复苏人的PBMC细胞(ALLCELLS，PB005F)，使用Human T cellenrichment kit(STEMCELL，19051)分离出CD4+细胞，按照CD4+∶anti-CD3/CD28 Beads＝1∶1加入Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Gibco，11131D)，刺激3天；

2)检测步骤：将1)中的细胞培养物进行400g，5min，离心，去除细胞培养基，用PBS重悬细胞，计数后，调整细胞密度为2×10⁶个/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。将梯度稀释的样品(抗PD-L1/OX40双特异性抗体、ADI-20057和IgG2对照)加入U型板，并混匀，每孔加100μl，冰上静置30min。400g，5min离心去除上清，PBS洗细胞1遍。400g，5min离心去除PBS，每孔加入100μl 1∶200稀释的PE-抗人Fc抗体(SOUTHERN BIOTECH，2040-09)。冰上避光孵育30min。400g，5min离心去除上清，PBS洗细胞1遍。用100μl PBS重悬细胞，流式细胞仪(BD，ACCURIC6)检测。

检测结果如图6所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体能够和人T细胞结合，结合EC50为4.062nM，和亲本抗OX40抗体ADI-20057的结合能力(EC50为2.571nM)相似。

实施例5本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的加速稳定性检测

为了确认双特异性抗体的稳定性，本实施例通过检测制备的一批抗体在40℃放置0、1、3、7、10、20、30天之后的纯度的变化，从而评价了抗体的长期热稳定性。实验方法如下：

1、浓缩前述获得的抗体样品至10mg/ml(溶于PBS中)，分装于EP管中，200μl/管，避光置于40℃。

2、在第0、1、3、7、10、20、30天各取一管利用大小排阻层析(sizeexclusionchromatography；SEC)检测其单体主峰纯度。

实验结果如表5所示。本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在40℃放置30天，其单体主峰比例降低幅度仅为1.28％。结果表明，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体具有较好的稳定性，适合用于后期开发。

表5.双特异性抗体40℃培养时单体主峰比例变化

放置于40℃(天)	抗PD-L1/OX40双特异性抗体
		0	100.00％
1	100.00％
		3	99.46％
7	99.32％
		10	99.09％
20	98.95％
		30	98.72％

实施例6本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的T_m检测

差示扫描荧光法(DSF)可根据图谱中的荧光变化过程提供有关结构稳定性的信息，检测蛋白的构型变化。荧光曲线绝对值最大时对应的温度为该蛋白的Tm。本实施例利用DSF法，测定了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的T_m值，实验过程如下：

1)用PBS稀释前述制备的抗PD-L1/OX40双特异性抗体样品至1mg/ml。用PBS将SYPRO Orange蛋白凝胶染色(GIBCO，S6650)稀释50倍，即4μl SYPRO Orange蛋白凝胶染色母液加196μl PBS；

2)在96孔PCR板中加样：50μl稀释后抗体样品+10μl SYPRO Orange蛋白凝胶染色稀释液(步骤1)中获得的)+40μl水。置于7500real time PCR system(AppliedBiosystems，AB/7500)进行检测。

实验结果如表6和图7所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的Tm大于60℃，适合用于后期开发。

表6.双特异性抗体Tm值测定结果

抗体的名称	<![CDATA[T<sub>m</sub>1]]>	<![CDATA[T<sub>m</sub>2]]>	<![CDATA[T<sub>m</sub>3]]>
				抗PD-L1/OX40双特异性抗体	63.59	71.20	74.81

实施例7基于荧光素酶报告基因检测抗PD-L1/OX40双特异性抗体的抗PD-L1活性

为了确定抗PD-L1/OX40双特异性抗体是否可以解除对PD-1/PD-L1相互作用对NFAT信号通路的抑制作用，本实施例使用荧光素酶报告基因检测细胞株(Promega，CS187109)，通过检测荧光素酶的表达反应出双特异性抗体对PD-1/PD-L1相互作用的抑制能力，详细实验过程如下：

考虑到对抗体的探索应该建立在对其作用机制(mechanisms of action；MOA)的了解和生物学活性的基础上，本实施例使用PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay，CellPropagation Model(Promega公司)，研究了本发明的双特异性抗体的抗PD-L1生物学活性。

Promega公司的PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay是一种生物学相关的基于MOA的测定法，用于测定能够阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体的效力和稳定性。该测定法由两种基因工程细胞系组成：

·PD-1效应细胞：稳定表达人PD-1和由活化的T细胞的核因子(nuclear factorof activated T cells；NFAT)诱导表达萤光素酶的Jurkat T细胞。

·PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞：稳定表达人PD-L1和以抗原非依赖性方式活化相应TCR的细胞表面蛋白的CHO-K1细胞。

PD-1与PD-L1结合可以阻断NFAT下游信号的转导，从而抑制萤光素酶的表达，当加入PD-1抗体或者PD-L1抗体时，这种阻断效应被反转，萤光素酶表达，从而检测到荧光信号。该检测法灵敏度、特异性、准确度都很好，且稳定性很好。

根据制造商的产品说明书进行检测。

1)活性检测前一天铺PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞：弃培养上清，PBS清洗一次，加入适量胰酶(Gibco，25200072)，37℃，5％CO₂孵育3-5min，用四倍体积的含10％FBS(HyClone，SH30084.03)的RPMI1640(Gibco，22400-071)培养基终止消化，收集细胞，取少量细胞混合液测定细胞浓度，取所需体积细胞，400g，离心10min，弃上清，含10％FBS(HyClone，SH30084.03)的RPMI1640(Gibco，22400-071)培养基作为assay buffer重悬细胞，使得细胞密度为4×10⁵个细胞/ml。将细胞加入96孔白色细胞培养板(Nunclon，136101)100μL/孔，边孔加入PBS，200μl/孔。细胞于二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜；

2)取无菌96孔板(Nunclon，442404)，待测样品(抗PD-L1/OX40双特异性抗体、抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2对照)稀释为400nM为起始浓度，第二个浓度点2至第10浓度点3倍连续稀释，共12个浓度点；

3)取PD-1效应细胞，计数，400g，离心5min，用assay buffer重悬细胞，使得细胞浓度为1.25×10⁶个细胞/ml，取96白色细胞培养板(NUNC，136101)，每班费入100μl细胞；

4)从培养箱中取出步骤1)中的白色细胞培养板，弃95μl/孔，依次加入步骤2)中稀释好的抗体40μl以及步骤3)中的Jurkat/PD-1细胞，每孔40μl；

5)将步骤4)中获得的培养板于二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂培养条件下培养6小时；

6)取出步骤5)中的白色细胞培养板，室温静置5-10min；

7)将Bio-Glo^TM缓冲液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM底物(Promega，G7940)，混匀。将所获得的Bio-Glo^TM试剂以80μl/孔加入上述培养6小时后的检测板(步骤6)中获得的)的孔中。室温放置5至10分钟；

8)用Spectra Max 13酶标仪(Thermo，Maxi3)，收集全波长化学发光，每孔收集时间为1000ms。

实验结果如图8所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体可以有效解除PD1/PD-L1相互作用对NFAT信号通路的阻断效应，且活性与抗PD-L1人源化Nb-Fc相似(抗PD-L1/OX40双特异性抗体的EC50为0.4085，抗PD-L1人源化Nb-Fc的EC50为0.4271)。

实施例8本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对人OX40配体与CHO细胞上的人OX40相互作用的不阻断

为了验证本发明的双特异性抗体是否阻断人OX40配体与人OX40结合，本实施例利用流式细胞技术检测了双特异性抗体不阻断人OX40配体与表达人OX40的CHO细胞结合的能力，实验过程如下：

1)对Human OX40 Ligand Fc Tag(ACRO，OXL-H526X-1MG)的生物素标记按照EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinNoWeighFormat(PIERCE，21327)使用说明书操作，以及脱盐按照2ml Zeba^TM离心式脱盐柱(PIERCE，89890)使用说明书操作；

2)细胞准备：吸取实施例3.3所获得的CHO-OX40细胞到50ml离心管中，血球计数板计数，取2.4×10⁷个细胞/ml于新的50ml离心管中，400g，5min，离心，去除上清，用20ml PBS重悬细胞后，再次离心5分钟，去除上清，用5ml PBS重悬细胞；

3)将2)中处理好的CHO-OX40细胞每孔50μl加入到96孔U底血凝板中备用；

4)梯度浓度样品溶液配制：将3.2ml PBS加入生物素标记的Human OX40 LigandFc Tag(Biotin-Human OX40 Ligand Fc Tag)96μl，混匀，配置成Biotin-Human OX40Ligand Fc Tag PBS混合液。用Biotin-Human OX40 Ligand Fc Tag PBS混合液将抗体样品(抗PD-L1/OX40双特异性抗体、ADI-20057、Pogalizumab和IgG2对照)稀释，以2000nM为起始浓度，后面11个浓度点3倍连续稀释，共12个浓度点；

5)将配置好的梯度浓度样品按每孔50μl加入到3)中获得的96孔U底血凝板中，混匀，4℃，孵育30分钟；

6)将5)中获得的细胞培养物400g，5min，离心，去除上清，每孔加入150μl PBS，之后再400g，5min，离心，去除上清，反复重复三次；

7)将6)中获得的96孔U底血凝板每孔加入1∶200稀释的Streptavidin-R-phycoerythrin(SAPE)(THERMO，S21388)100μl，4℃，30min；

8)向7)中获得的96孔U底血凝板每孔加入150μl PBS，400g，5min，离心，去除上清，反复重复两次；

9)将8)中获得的96孔U底血凝板中的细胞用100μl PBS重悬，细胞流式仪(BD，ACCURIC6)检测。

检测结果如图9所示，在所述实验中，Pogalizumab在大于约1nM或更高的浓度下容易的阻断了人OX40配体与OX40的结合，然而我们发现本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体并未显示出阻断效应，类似于IgG对照。

实施例9基于荧光素酶报告基因的检测抗PD-L1/OX40双特异性抗体的OX40阻断测定法

可以通过测量抗体阻断OX40配体介导的OX40活化的性能来评估本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的非阻断活性。

测量NFkB介导的转录活化来评估本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的抗OX40抗体的激活剂活性。用Anti-Human CD3(BD，555329)，Anti-Human CD28(BD，555725)加上溶液中的抗体活化过表达人OX40(购自Sino)和NFkB-荧光素酶构建体(NFkB启动子-luc，Promega)的Jurkat细胞(美国ATCC)(Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep)，然后加入Bio-Glo^TM试剂显色。具体实验过程如下：

溶液配制：(1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞完全培养基：RPIM-1640(90％)(Gibco，22400-071)，FBS(10％)(HvClone，SH30084.03)，Hygromycin B(200μg/ml)(INVITROGEN，10687010)，Puromycin(2μg/ml)(GBICO，A11138-02)；

(2)分析缓冲液A：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，Anti-Human CD3(4μg/ml)，Anti-Human CD28(16μg/ml)，20μg/ml Human OX40Ligand Fc Tag，现配现用；

(3)分析缓冲液B：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，Anti-Human CD3(4μg/ml)，Anti-Human CD28(16μg/ml)，现配现用。

实验步骤：

1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞处理：取对数生长期的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞计数，400g，离心5min，用完全培养基重悬细胞并调整细胞密度至8×10⁶个/ml备用；

2)梯度浓度样品溶液配制：用处理好的分析缓冲液A将待测抗体样品和对照稀释为200nM为起始浓度，第二个浓度点2至第10浓度点3倍连续稀释，共9个浓度点。用处理好的分析缓冲液B作为对照组；

3)加样：在白色不透明细胞培养板中每孔加入1)中处理好的细胞悬液50μl以及2)中稀释好的抗体样品50μl以及对照样品50μl，将细胞板置于二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂条件下培养12小时；

4)显色：将Bio-Glo^TM缓冲液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM底物(Promega，G7940)，混匀，获得Bio-Glo^TM检测试剂。将所获得的Bio-GloTM检测试剂以80μl/孔加入上述3)中培养12小时后的检测板的孔中。室温放置5至10分钟，读取荧光信号值。

5)读板：用Spectra Max I3酶标仪(Thermo，Max i3)，收集全波长化学发光，每孔收集时间为1000ms。

实验结果如图10所示，Pogalizumab在大于约0.4nM或更高的浓度下容易阻断基于OX40配体介导的OX40信号通路的激活。然而我们惊奇的发现，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体及其亲本抗OX40抗体增加了荧光素酶的水平，表明其具有非OX40配体阻断属性并且对OX40受体聚集具有贡献。

本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体有效增强OX40配体介导的OX40信号通路激活作用，EC50＝1.993nM，且与亲本抗OX40抗体的活化效果相似(EC50＝2.326nM)。

实施例10基于荧光素酶报告基因法检测抗PD-L1/OX40双特异性抗体对OX40介导的信号通路的激活作用

为了检测双特异性抗体的体外生物学活性，本实施例使用信达生物制药(苏州)有限公司的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep稳定细胞株(构建过程见实施例9)，通过加入Raji细胞(ATCC，CCL-86TM)增强OX40特异性抗体的激活作用，同时在细胞反应体系中加入Anti-Human CD3(BD，555329)和Anti-Human CD28(BD，555725)，由此激活下游NFκB荧光素酶报告基因的表达，然后加入荧光素酶的底物裂解细胞并产生荧光，通过荧光的强弱来反映抗OX40抗体的生物学活性。

详细实验过程如下：

溶液配制：(1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞完全培养基：RPIM-1640(90％)(Gibco，22400-071)，FBS(10％)(HyClone，SH30084.03)，Hygromycin B(200μg/ml)(INVITROGEN，10687010)，Puromycin(2μg/ml)(GBICO，A11138-02)；

(2)分析缓冲液：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，Anti-Human CD3(10μg/ml)(BD，555329)，Anti-Human CD28(10μg/ml)(BD，555725)，现配现用；

(3)Raji完全培养基：RPIM-1640(90％)(Gibco，22400-071)，FBS(10％)(HyClone，SH30084.03)。

实验步骤：

1)Raji细胞处理：取Raji细胞计数，400g，离心5min，用分析缓冲液重悬细胞并调整细胞密度至2.0×10⁶个/ml备用；

2)将处理的1)中获得Raji细胞按照实验布局25μl/孔加入到白色不透明细胞培养板中，之后将处理的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞(步骤同实施例9实验步骤1))按照实验布局25μl/孔加入到上述白色不透明细胞培养板中，轻轻水平摇匀，放置于37℃，5％CO₂培养箱中备用；

3)梯度浓度样品溶液配制：用分析缓冲液将抗体样品(抗PD-L1/OX40双特异性抗体、ADI-20057和IgG2对照)稀释，以800nM为起始浓度，第二个浓度点2至第12浓度点3倍连续稀释，共12个浓度点；

4)加样：样品组设置3个复孔，将各个浓度样品(50μ l)分别加入到2)中获得的白色不透明细胞培养板中(每个浓度样品一式三份加入)，将细胞板置于二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂条件下培养16小时；

5)显色：将Bio-Glo^TM缓冲液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM底物(Promega，G7940)，混匀获得Bio-Glo^TM检测试剂。将所获得的Bio-Glo^TM检测试剂以80μl/孔加入上述培养16小时后的4)中获得的检测板的孔中。室温放置5至10分钟，读取荧光信号值。

6)读板：用spectra Max I3酶标仪(Thermo，Max i3)，收集全波长化学发光，每孔收集时间为1000ms。

结果如图11所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体可以激活OX40信号通路，激活EC50＝0.6712nM，且与亲本的激活效果(EC50＝0.1455nM)相似。

实施例11本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体介导PD-L1依赖的激活OX40介导的信号通路的检测

实施例11.1本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在高表达PD-L1 Raii细胞存在的情况下激活OX40介导的信号通路生物活性

为了检测本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在高表达PD-L1 Raji细胞存在的情况下，激活OX40介导的信号通路生物活性。将携带克隆至多克隆位点MCS的人PD-L1 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0载体(Invitrogen)转染入Raji(ATCC，CCL-86TM)宿主细胞，经压力筛选获得稳定表达人PD-L1的Raji细胞(Raii-PD-L1细胞)。本实施例利用该细胞株检测了抗PD-L1/OX40双特异性抗体在Raji-PD-L1存在的情况下对OX40下游的NFkB信号通路的特异性激活作用。

溶液配制：(1)Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞完全培养基：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，Hygromycin B(200μg/ml)，Puromycin(2μg/ml)。

(2)分析缓冲液：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，现配现用。

(3)Raji完全培养基：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)。

实验步骤：

1)取少量细胞悬液，用细胞计数板测定细胞密度，对细胞培养物进行400g，离心10min，去掉上清，加入分析缓冲液温和的重悬细胞，将Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞密度调整至4×10⁵个细胞/ml；将Raii细胞密度调整至1.2×10⁵个细胞/ml；将Raji-PD-L1细胞密度1.2×10⁵个细胞/ml；

2)将1)中获得的细胞悬液移置加样槽中，取96孔白色细胞培养板。第一孔加入66.5μL的1)中处理好的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep(构建过程见实施例9)和Raii细胞悬液(或Raji-PD-L1细胞悬液)，第二孔至第十二孔加入50μL的1)中处理好的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞和Raji细胞悬液(或Raji-PD-L1)；

3)加样：第一孔加入待测抗体，稀释为25nM为起始浓度，第二个浓度点2至第12浓度点4倍连续稀释，共12个浓度点；

4)将细胞板置于二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂条件下培养16小时；

5)将Bio-Glo^TM缓冲液(Promega，G7940)融化，加入Bio-GloTM检测底物(Promega，G7940)，混匀获得。将所获得的Bio-GloTM检测试剂以80μl/孔加入上述培养16小时后的检测板的孔中。室温放置5至10分钟，用Spectra Max I3酶标仪(Thermo，Max i3)，收集全波长化学发光，每孔收集时间为1000ms。

实验结果见图12和13。如图12所示，在没有PD-L1表达的细胞反应体系中，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体与抗OX40抗体(ADI-20057)单独使用、抗PD-L1抗体(抗PD-L1人源化Nb-Fc)单独使用、抗OX40抗体(ADI-20057)和抗PD-L1抗体(抗PD-L1人源化Nb-Fc)联合使用，均无法激活OX40下游的NFkB信号通路。

然而我们惊奇的发现，在有PD-L1表达的细胞体系中(实验结果如图13所示)，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体具有比抗OX40抗体、抗PD-L1抗体单独使用、抗OX40抗体和抗PD-L1抗体联合使用、Pogalizumab相比更加显著的NFkB信号通路的激活作用。本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体显示出了在PD-L1表达的细胞存在的情况下，能够更好的激活OX40下游的NFkB信号通路。

实施例11.2本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在肿瘤细胞存在的情况下对OX40下游的NFkB信号通路的特异性的激活作用

人体内肿瘤细胞表面表达PD-L1蛋白，大多数抗PD-L1单克隆抗体会结合到肿瘤细胞上。本实施例将信达生物制药(苏州)有限公司的Jurkat-OX40-NFkB-Luc-Rep细胞株(构建过程见实施例9)和肿瘤细胞NCI-H292人肺癌细胞(ATCC，CRL-1848)共同孵育，检测了本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在肿瘤细胞存在的情况下是否具有对OX40下游的NFkB信号通路的特异性的激活作用。具体实验过程如下：

溶液配制：(1)Jurkat-OX40-NFκB-luc细胞完全培养基：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，Hygromycin B(200μg/ml)，Puromycin(2μg/ml)。

(2)分析缓冲液：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)，现配现用。

(3)NCI-H292人肺癌细胞完全培养基：RPIM-1640(90％)，FBS(10％)。

实验步骤：

1)NCI-H292人肺癌细胞处理：取NCI-H292细胞计数，1000rpm/min离心5min，用分析缓冲液重悬细胞并调整细胞密度至1.6×10⁶个/ml备用；

2)Jurkat-OX40-NFκB-luc细胞处理：取对数生长期的Jurkat-OX40-NFκB-luc细胞计数，400g，离心5min，用分析缓冲液重悬细胞并调整细胞密度至0.8×10⁶个/ml备用；

3)将处理的NCI-H292人肺癌细胞按照实验布局25μl/孔加入到白色不透明细胞培养板中，之后将处理的Jurkat-OX40-NFκB-luc细胞按照实验布局25μl/孔加入到上述白色不透明细胞培养板中，轻轻水平摇匀，放置于37℃，5％CO₂培养箱中备用；

4)梯度浓度样品溶液配制：用分析缓冲液将抗体样品(如前所述制备的抗PD-L1/OX40双特异性抗体、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc)稀释为20nM为起始浓度，第二个浓度点2至第12浓度点3倍连续稀释，共12个浓度点；

5)加样：样品组设置3个复孔，将各个浓度样品(50μl)分别加入到3)中获得白色不透明细胞培养板中(每个浓度样品孔一式三份)，将细胞板置于二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂条件下培养16小时；

6)显色：将Bio-Glo^TM缓冲液(Promega，G7940)融化，加入Bio-Glo^TM底物(Promega，G7940)，混匀获得Bio-Glo^TM检测试剂。将所获得的Bio-Glo^TM检测试剂以80μl/孔加入上述培养16小时后的检测板的孔中。室温放置5至10分钟，用Spectra Max I3酶标仪(Thermo，Max i3)，收集全波长化学发光，每孔收集时间为1000ms。

实验结果如图14所示，在NCI-H292人肺癌细胞的细胞反应体系中，抗OX40抗体(ADI-20057)单独使用、抗PD-L1抗体(抗PD-L1人源化Nb-Fc)单独使用、抗OX40抗体和抗PD-L1抗体联合(ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc)使用，均无法激活OX40下游的NFkB信号通路。然而我们惊奇的发现，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体具有比抗OX40抗体、抗PD-L1抗体单独使用、抗OX40抗体和抗PD-L1抗体联合使用更加显著的NFkB信号通路的激活作用。双特异性抗体在天然表达PD-L1的肿瘤细胞存在的情况下，能够更好的激活OX40下游的NFkB信号通路能力。

实施例12本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体对人T细胞的激活作用检测

为了检测双特异性抗体的体外生物学活性，本实施例检测了在体外，双特异性抗体对人T细胞的激活作用，详细实验过程如下：

复苏人的PBMC细胞(ALLCELLS，PB005F)，静置3小时贴壁后即为单核细胞，添加10ml AIM

Medium CTS(GIBCO，A3021002)培养基，加入IL4(20ng/ml)(R&D，204-IL)，GM-CSF(10ng/ml)(R&D，215-GM)诱导单核细胞分化为DC细胞，培养至第5天，向细胞培养物中添加诱导DC成熟的细胞因子TNFα(1000U/ml，10ng/ml)(R&D，210-TA)，RhIL-1β(5ng/ml)(R&D，201-LB)，RhIL-6(10ng/ml)(R&D，206-IL)，1μM PGE(Tocris，2296)，二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂培养条件下继续培养2天，作为淋巴细胞混合反应(MLR)的成熟DC细胞(moDC)；

复苏人的PBMC细胞(ALLCELLS，PB005F)，按照Human CD4+T细胞enrichment kit(STEMCELL，19052)的说明书，实施CD4+细胞分离。简而言之，上述将PBMC静置培养2小时后吸取的悬浮细胞液置于20ml离心管中，300g离心10分钟，向细胞沉淀物中加入500μl试剂盒中配备的分离液和100μl试剂盒中配备的纯化抗体，4℃孵育20分钟，用分离液清洗一次，再加入500μl试剂盒中配备的珠缓冲液孵育15分钟，磁场去除珠，用AIM

Medium CTS(GIBCO，A3021002)培养基洗一次，使用8mlAIM

Medium CTS(GIBCO，A3021002)培养基，37℃、5％CO₂培养获得的CD4+细胞。按照CD4+∶anti-CD3/CD28 Beads＝1∶1加入DynabeadsHuman T-Activator CD3/CD28(INVITROGEN，11131D)，二氧化碳培养箱中37℃，5％CO₂培养条件下培养3天，对CD4+细胞实施珠刺激；

将上述分离的成熟DC细胞与经珠刺激的CD4+细胞混合，每孔体积200μl，DC细胞12000个，CD4+细胞120000个，加入Staphylococcal enterotoxin E超抗原(Toxintechnology，ET404)，1 ng/ml，加入抗体样品(如前所述制备的抗PD-L1/OX40双特异性抗体、ADI-20057、抗PD-L1人源化Nb-Fc、ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc和IgG2对照)，100nM为起始浓度，3倍稀释，共十个浓度点。混合培养3天，使用根据cisbio IL2检测试剂盒(CISBIO，62HIL02PEG)检测每个样品中的IL2表达量，不同抗体IL2表达量反应了对T细胞的激活能力。

结果如图15所示，本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体可以在体外激活T细胞，其激活效果比抗OX40抗体(ADI-20057)、抗PD-L1抗体(抗PD-L1人源化Nb-Fc)单独使用、抗OX40抗体和抗PD-L1抗体联合(ADI-20057+抗PD-L1人源化Nb-Fc)使用更强。

实施例13本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的体内抗肿瘤作用

实施例13.1.本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在LoVo细胞荷瘤的NPG小鼠模型体内抗肿瘤作用

在本实施例中，通过使用LoVo(ATCC，CAT#CCL-229TM)细胞与PBMC(All Cells，PB005F)细胞混合接种NPG小鼠来产生荷瘤小鼠，并测定了本发明的抗OX40/PD-L1双特异抗体的抗肿瘤作用。

NPG小鼠：

雌性NPG小鼠(18g/35天龄)购自北京维通达实验动物技术有限公司。等级为SPF级，数量为75只，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.11806300011459。所述小鼠在到达后驯化检疫7天，随后开始研究。

培养细胞和接种小鼠：

细胞：LoVo：ATCC CAT#CCL-229TM Lot#60380843

PRMC：All Cells Lot#3000417

将LoVo细胞进行常规传代培养用于后续体内实验。提前一天复苏PBMC细胞，第二天离心收集PBMC细胞悬液。LoVo细胞进行常规传代培养用于后续体内实验，离心收集细胞，以PBS(1×)分散LoVo细胞。将LoVo细胞与PBMC细胞4∶1混合，以PBS(1×)分散，即LoVo细胞密度为12.5×10⁶个/ml，PBMC细胞密度为3.125×10⁶个/ml。小鼠右侧背部剃毛，在第0天取0.2ml混合细胞悬液皮下接种至NPG小鼠右侧腹部区域中来建立LoVo荷瘤人源化小鼠模型。

给药：肿瘤细胞接种3天后随机分组(每组5-7只小鼠)，给药剂量和方式如表7所示，使用h-IgG(购自Equitech-Bio)作为阴性对照。分别在接种后第3、7、10、14天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。监测至31天后结束。h-IgG对照组给药前肿瘤平均体积为46mm³。接种后第28天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％×(h-IgG对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/( h-IgG对照组肿瘤体积-h-IgG对照组初始肿瘤体积)。

肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝LxW²/2。采用电子天平测定体重。在整个研究期间，当肿瘤达到端点(肿瘤体积＞3000mm³)时或当小鼠具有＞20％体重减轻时，使小鼠安乐死。

表7.实验设计表

*每隔3-4天给药，共4次

实验结果见图16和图17和表8可见本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的肿瘤抑制效果明显优于单抗(抗PD-L1人源化Nb-Fc，ADI-20057)以及抗PD-L1人源化Nb-Fc与ADI-20057的联合用药。

表8.第28天肿瘤抑制率

实施例13.2.本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体在NCI-H292细胞荷瘤的NOG小鼠模型体内抗肿瘤作用

本实施例采用PBMC细胞接种后，再用NCI-H292细胞(ATCC，CRL-1848)接种NOG小鼠，测定本发明的抗PD-L1/OX40双特异性抗体的抗肿瘤作用。

NOG小鼠：雌性NOG小鼠(15-18g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。等级为SPF级，数量110只，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.11400700339672小鼠在到达后驯化7天，随后开始研究。

将NCI-H292细胞进行常规传代培养用于后续体内实验。复苏PBMC细胞(AllCells，PB005F)，离心收集PBMC细胞悬液，以PBS(1×)分散PBMC细胞，制备成细胞浓度为12.5×10⁶个/ml细胞悬液。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOG小鼠眼眶静脉。在第5天离心收集NCI-H292细胞，以PBS(1×)分散NCI-H292细胞，制备成细胞浓度为25×10⁶个/ml细胞悬液。取0.2ml细胞悬液皮下接种至NOG小鼠右侧腹部区域中来建立NCI-H292荷瘤小鼠模型。

给药：

肿瘤细胞接种1天后随机分组(每组5-9只小鼠)分组，给药剂量和方式如表9所示，h-IgG(购自Equitech-Bio)作为阴性对照，分别在接种后第1、4、8、11天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。监测至26天后结束。接种后第25天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％×(h-IgG对照组肿瘤体积-治疗组肿瘤体积)/(h-IgG对照组肿瘤体积-h-IgG对照组初始肿瘤体积)。h-IgG对照组给药前肿瘤平均体积为78mm³。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(w)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W²/2。在整个研究期间，当肿瘤达到端点(肿瘤体积＞3000mm³)时或当小鼠具有＞20％体重减轻时，使小鼠安乐死。

表9.实验设计表

肿瘤抑制率结果如图18-20和表10所示：如图18所示，在接种后第25天，低剂量组与h-IgG对照对比，抗PD-L1人源化Nb-Fc 0.01mg/kg和ADI-20057 0.02mg/kg单药抑制率分别为20％和37％。抗PD-L1人源化Nb-Fc与ADI-20057 0.01+0.02mg/kg联合用药没有明显的肿瘤抑制；抗PD-L1/OX40双特异性抗体0.023mg/kg的肿瘤抑制率62％。抗PD-L1/OX40双特异性抗体0.023mg/kg的抑瘤效果比较好。

如图19和表10所示，中剂量组与h-IgG对照对比，抗PD-L1人源化Nb-Fc 0.1mg/kg和ADI-200570.2mg/kg单药抑制率分别为48％和38％。抗PD-L1人源化Nb-Fc与ADI-200570.1+0.2mg/kg联合用药的肿瘤抑制率为45％；抗PD-L1/OX40双特异性抗体0.23mg/kg的肿瘤抑制率90％。抗PD-L1/OX40双特异性抗体0.23mg/kg的抑瘤效果强于单药和联合用药。

如图20和表10所示，高剂量组与hIgG对比，抗PD-L1人源化Nb-Fc 1mg/kg和ADI-20057 2mg/kg单药抑制率分别为51％和47％。抗PD-L1人源化Nb-Fc与ADI-20057 1+2mg/kg联合用药的肿瘤抑制率为59％；抗PD-L1/OX40双特异性抗体2.3mg/kg的肿瘤抑制率94％。抗PD-L1/OX40双特异性抗体2.3mg/kg的抑瘤效果最好，肿瘤抑制效果强于单药和联合用药。高剂量组较于中剂量和低剂量组抑瘤效果更好，具有剂量依赖效应。

同时我们对小鼠体重进行检测，结果如图21所示，小鼠体重后期有轻微差异。

表10.第25天肿瘤抑制率

表11.示例性抗PD-L1/oX40双特异性抗体和对照的序列信息

表12序列：

Claims (36)

1.一种结合OX40和PD-L1的双特异性抗体分子或其抗原结合片段，其由2条式(I)的多肽链和2条式(II)的多肽链组成：

(i)式(I)的多肽链：

VH-CH1-Fc-X-VHH；和

(ii)式(II)的多肽链：

VL-CL；

其中：

VH表示重链可变区；

CH表示重链恒定区；

Fc包含CH2、CH3，以及任选的CH4；

CH1、CH2、CH3和CH4分别表示重链恒定区的结构域1、2、3和4；

X表示柔性接头；

VHH表示单结构域抗原结合位点，其包含互补决定区域VHH CDR1、VHH CDR2和VHHCDR3，其中VHH CDR1由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；VHH CDR2由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成；VHH CDR3由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成；

VL表示轻链可变区；

CL表示轻链恒定区；

任选地，CH1和Fc之间存在铰链区；

其中，式(I)中的VH-CH1-Fc包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由其组成；且

式(II)的VL-CL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成；其中由VH和VL形成的抗原结合位点对OX40是特异性的，且由VHH形成的抗原结合位点对PD-L1是特异性的。

2.权利要求1的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述接头包含氨基酸序列(Gly₄Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。

3.权利要求2的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述n是1－7中的正整数。

4.权利要求3的抗体或其抗原结合片段，其中所述n是1、2，3，4，5或6。

5.权利要求1-4中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中所述VHH选自骆驼科物种中天然存在的重链抗体的重链可变结构域或人源化的骆驼科抗体重链可变结构域。

6.权利要求1-4中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中OX40为人OX40或猴OX40；和/或其中PD-L1为人PD-L1。

7.权利要求1-4中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VHH包含与SEQID NO:6的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列或由其组成。

8.权利要求7的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)中的VHH包含SEQ ID NO:6所示的序列或由其组成。

9.权利要求1-4中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)的多肽链包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。

10.权利要求9的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(I)的多肽链包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成。

11.权利要求1-4、8或10中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(II)的多肽链包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由其组成。

12.权利要求1-4、8或10中任一项的抗体分子或其抗原结合片段，其中式(II)的多肽链包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成。

13.分离的核酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段。

14.包含权利要求13的核酸的表达载体。

15.权利要求14的表达载体，其中所述表达载体选自pXC载体或pTT5载体。

16.包含权利要求13的核酸或权利要求14或15的载体的宿主细胞。

17.权利要求16的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。

18.权利要求16的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

19.权利要求16的宿主细胞，其中所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。

20.制备权利要求1至12中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适于表达权利要求13的核酸的条件下培养权利要求16-19中任一项的宿主细胞，任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，任选的所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗体或其抗原结合片段。

21.免疫缀合物，其包含权利要求1至12中任一项的抗体分子或其抗原结合片段和其它物质。

22.权利要求21的免疫缀合物，其中所述其他物质选自治疗剂或标记。

23.权利要求21的免疫缀合物，其中所述其他物质选自细胞毒性剂或抗血管发生剂。

24.药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的抗体分子或其抗原结合片段或者权利要求21-23中任一项的免疫缀合物，以及任选的药用辅料。

25.药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的抗体分子或其抗原结合片段或者权利要求21-23中任一项的免疫缀合物，以及其它治疗剂，以及任选的药用辅料。

26.权利要求25的药物组合物，其中所述其它治疗剂选自抗血管发生剂、化疗剂、其它抗体、细胞毒性剂、疫苗、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

27.组合产品，其包含权利要求1至12中任一项的抗体分子或其抗原结合片段或权利要求21-23中任一项的免疫缀合物，以及一种或多种其它治疗剂。

28.权利要求27的组合产品，其中所述其它治疗剂选自抗血管发生剂、化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

29.权利要求1至12中任一项的抗体分子或其抗原结合片段、或权利要求21-23中任一项的免疫缀合物、或权利要求24-26中任一项的药物组合物在制备药物或组合产品中的用途，其中所述药物或组合产品在受试者中预防或治疗肿瘤。

30.权利要求29的用途，其中所述肿瘤是癌症。

31.权利要求30的用途，其中所述癌症是具有升高的表达水平的PD-1或PD-L1和/或具有降低的表达水平或活性的OX40的癌症。

32.权利要求30所述的用途，其中所述癌症为结肠癌或直肠癌或结直肠癌或肺癌。

33.权利要求29所述的用途，其中所述药物或组合产品与一种或多种其它疗法联合施用。

34.权利要求33的用途，其中所述疗法包括手术治疗和/或放射疗法和/或其它治疗剂。

35.权利要求34的用途，其中所述治疗剂选自抗血管发生剂、化疗剂、细胞毒性剂、疫苗、其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂。

36.权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测样品中抗原OX40和/或PD-L1的检测试剂中的用途，所述检测包括

(a)将样品与权利要求1-12任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；和

(b)检测抗体或其抗原结合片段和OX40和/或PD-L1间的复合物的形成，任选地，所述抗体被可检测的标记。

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