JP2023536818A - Ｈｌａ－ｇ抗原結合ドメインを含むタンパク質及びそれらの使用 - Google Patents

Ｈｌａ－ｇ抗原結合ドメインを含むタンパク質及びそれらの使用 Download PDF

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デ ヴェン，ケリー ヴァン
イ，ファン
シン，サンジャヤ
ガネサン，ラジクマール
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Abstract

本発明は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合ドメインを含むＨＬＡ－Ｇタンパク質に結合する抗原結合ドメイン、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それを作製及び使用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年７月２９日に出願された米国仮出願第６３／０５７，９６０号に対する優先権を主張する。前述の出願の各々の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年７月１２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＪＢＩ６３５８ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは７４７ＫＢである。
（発明の分野）
本開示は、ヒト白血球抗原Ｇ（human leukocyte antigen G、ＨＬＡ－Ｇ）タンパク質に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、それらを作製及び使用する方法を提供する。
ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）は、タンパク質の非古典的ＭＨＣクラスＩｂファミリーに属する。４つの膜結合（ＨＬＡ－Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４）タンパク質アイソフォーム及び３つの可溶性（ＨＬＡ－Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７）タンパク質アイソフォームをコードする、７つの代替的ｍＲＮＡが説明されている（Ｃａｒｏｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。高度に多型の古典的ＨＬＡクラスＩ遺伝子とは対照的に、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子多型は、非常に限定されている。１６個の全長タンパク質をコードするＨＬＡ－Ｇについて、５０個の対立遺伝子のみが列挙されている。ＨＬＡ－Ｇ１及びその可溶性対応物ＨＬＡ－Ｇ５は、古典的ＨＬＡクラスＩ様である、ベータ－２－ミクログロブリン（beta-2-microglobulin、β２ｍ）に非共有結合し、ヒストンＨ２Ａペプチドなどの制限ペプチドに結合するのに好適な３つの球状ドメインの重鎖である、同一の細胞外構造を有する１－３。ＨＬＡ－Ｇ１単量体は、そのペプチド結合溝（ＨＬＡ分子の活性化機能に重要な構造的要素）及びそのα３ドメイン（ＨＬＡクラスＩ分子の阻害機能に重要な構造的要素）のレベルで、古典的ＨＬＡクラスＩ分子とは異なる。膜アイソフォームのタンパク質分解性シェディングは、可溶性分子を更に作り出す（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）。単量体、ホモ及び可能なヘテロ多量体、並びにユビキチン化タンパク質は、ＨＬＡ－Ｇについて報告されている構造である。ＨＬＡ－Ｇの阻害機能は、最もよく特徴付けられた受容体としてのヒト阻害受容体Ｉｇ様転写物２及び４（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｌｇ－ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ２ ａｎｄ ４、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４）を遮断する、単量体ではなく二量体に主に起因すると考えられている。ＨＬＡ－Ｇ１ホモ二量体は、α３ドメインのＩＬＴ２結合部位及びＩＬＴ４結合部位を露出させる斜め配向をとり、それによって、ＨＬＡ－Ｇ単量体よりも高い親和性及び遅い解離速度で結合する。
ＨＬＡ－Ｇの既知の受容体としては、末梢免疫細胞上の主要なＨＬＡ－Ｇ受容体である（Ｃｏｌｏｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，１９９８）、阻害性受容体ＩＬＴ２（単球、ＤＣ、Ｂ細胞、並びにナチュラルキラー細胞及びＴ細胞のサブセット上に発現する）及びＩＬＴ４（骨髄単球系統の細胞によって排他的に発現する）、非阻害性受容体ＣＤ８及びＣＤ１６０、並びにＫＩＲ２ＤＬ４受容体（その状態はＨＬＡ－Ｇに関して曖昧なままである）が挙げられる。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４は、ＭＨＣＩのα３ドメイン及びβ２ｍを認識し結合する。
ＨＬＡ－Ｇについて記載された機能のうちのほとんどは免疫機能であるが、血管新生及び骨形成の阻害などの非免疫機能も報告されている。ＨＬＡ－Ｇ－ＩＬＴ２相互作用は、ＮＫ細胞機能を阻害し、したがってＮＫ媒介性細胞溶解からＨＬＡ－Ｇ発現細胞を保護することが繰り返し示された。更に、ＩＬＴ－２発現Ｔ細胞（活性化及び／又はクローンＴ細胞）及びＢ細胞の機能は、ＨＬＡ－Ｇによって直接阻害される。ＨＬＡ－Ｇはまた、骨髄性ＡＰＣにおける代替分化を誘導し、調節性骨髄性細胞及び調節性Ｔ細胞の分化を誘導し、好中球の貪食機能を阻害する。
ＮＫ媒介性細胞溶解、Ｔ細胞増殖、及び調節性／抑制性細胞の誘導に必要とされるシグナル伝達経路を阻害し、それによって免疫系を回避するＨＬＡ－Ｇのこの免疫抑制能力は、腫瘍細胞によって活用されて、免疫監視を逃れ、より高い侵襲能力及び転移能力で細胞の制御されない増殖をもたらし得る。ＨＬＡ－Ｇは、宿主免疫監視を回避することが可能であるだけでなく、悪性腫瘍の進行中に転移を増強する。無数の研究が、疾患ステージ又は患者転帰の悪化と相関し得る、腫瘍によるＨＬＡ－Ｇ発現（正常な周囲領域には存在しない）を実証している。ＨＬＡ－Ｇ発現は、腫瘍の進化及び進行、並びに進行した腫瘍ステージ、より高い侵襲能力及び転移能力、並びに不良な臨床予後を暗示している。その異常発現は、生存時間の減少と関連していた。
様々ながんが、ＨＬＡ－Ｇの発現を示すが、正常組織における発現は、主に絨毛外栄養膜細胞層上の胎児－母体界面、胎盤、羊膜、並びに胸腺、角膜、気管支上皮細胞、膵臓などの特定の健康な成人組織、並びに間葉系幹細胞、活性化単球、赤血球及び内皮前駆体などの特定のタイプの細胞に限定される（Ｃａｒｏｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５に概説されている）。
正常組織におけるその強力かつ広範な免疫抑制機能の役割及び制限された発現パターンを考慮すると、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇを過剰発現する固形腫瘍及びＢ細胞悪性腫瘍における魅力的な治療標的として指定することができる。
生成されている数少ない特異的抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のうち、以下の利用可能な抗体（８７Ｇ、ＭＥＭ－Ｇ９、ＭＥＭ－Ｇ１１、Ｇ２２３）のみが天然細胞発現ＨＬＡ－Ｇに結合する。これらの抗体によるリガンドＩＬＴ－２及び／又はＩＬＴ－４とのＨＬＡ－Ｇ相互作用の阻害の割合は、それぞれ高用量の抗体でさえ完全ではない。更に、特に８７Ｇ抗体がインビトロで腫瘍殺傷を増強することが可能であることが記載されているが、インビボで抗体を投与することによってＨＬＡ－Ｇを遮断する有効性の報告は存在しない。
治療及び診断目的のための次世代ＨＬＡ－Ｇ結合ドメインに対する必要性が存在する。
本発明は、ＨＬＡ－Ｇとその同族受容体ＩＬＴ－２及び／又はＩＬＴ－４との間の結合を強力に遮断する、特異的抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体を提供する。生成された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、古典的ＭＨＣクラスＩ分子との交差反応性の非存在下で、組換え又は内因性ＨＬＡ－Ｇタンパク質のいずれかに結合する。本発明の抗体は、ＨＬＡ－Ｇに対する特異性、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－Ｅとの交差反応性がないこと、並びに／又はＩＬＴ－２／４リガンドとのＨＬＡ－Ｇ相互作用の完全な遮断を実証する、本発明者らの知る限り最初のＨＬＡ－Ｇ特異的抗体である。加えて、本発明の抗体は、インビボ投与後に腫瘍成長阻害を実証した。
本発明はまた、ＨＬＡ－Ｇと免疫抑制リガンドとの相互作用を遮断すること、又はＦｃ若しくは二重特異性タンパク質媒介性の免疫細胞の動員のいずれかによって免疫系に関与することによって、表面上のＨＬＡ－Ｇの発現が上昇した腫瘍細胞を排除するための、そのような抗体、又はこれらの抗体に由来する可変ドメインを含むタンパク質の使用に関する。したがって、抗体は、患者において診断された状態が、患者におけるＨＬＡ－Ｇの誘導された発現を利用する場合、当該状態を治療又は緩和するのに好適である。
本開示は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号５０の重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｂ）配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｃ）配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｄ）配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｅ）配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｆ）配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｇ）配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｈ）配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｉ）配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｊ）配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、単離タンパク質は、
ａ）それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
ｂ）それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
ｄ）それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
ｅ）それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
ｆ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
ｇ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
ｈ）それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
ｉ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、
ａ）約５～５０個のアミノ酸、
ｂ）約５～４０個のアミノ酸、
ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、Ｌ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ、及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、
ａ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
ｂ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
ｃ）配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
ｄ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
ｅ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
ｆ）配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
ｈ）配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
ｉ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｊ）配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、本開示のタンパク質は、半減期延長部分にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（immunoglobulin、Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。
他の実施形態では、単離タンパク質は、単一特異性タンパク質である。
他の実施形態では、単離タンパク質は、多重特異性タンパク質である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性タンパク質である。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、三重特異性タンパク質である。
他の実施形態では、本開示の単離タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域のその断片を更に含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、リンパ球上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。
他の実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。
他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
他の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞である。
他の実施形態において、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合ドメインを含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む。
他の実施形態では、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインは、
ａ）配列番号３６１の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３６９のＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４０のＶＬ、
ｃ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
ｄ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４１のＶＬ、
ｅ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４２のＶＬ、
ｆ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４３のＶＬ、
ｇ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４４のＶＬ、
ｈ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４５のＶＬ、
ｉ）配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、
ｊ）配列番号３４６のＶＨ及び配列番号３４７のＶＬ、又は
ｋ）配列番号３４８のＶＨ及び配列番号３４９のＶＬを含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質のＦｃγ受容体（Fcγreceptor、ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片のＩｇ定常領域は、タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、タンパク質は、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、単離多重特異性タンパク質を提供する。
他の実施形態では、リンパ球抗原は、Ｔ細胞抗原である。
他の実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である。
他の実施形態では、リンパ球抗原は、ＮＫ細胞抗原である。
他の実施形態では、リンパ球抗原は、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである。
他の実施形態では、リンパ球抗原は、ＣＤ３εである。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＶＨＨを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、
ａ）約５～５０個のアミノ酸、
ｂ）約５～４０個のアミノ酸、
ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、Ｌ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号７０、７３、７５、７８、８１、又は８５のＨＣＤＲ１、配列番号７１、７６、７９、８２、又は８６のＨＣＤＲ２、配列番号７２、７４、７７、８０、８３、８４、又は８７のＨＣＤＲ３、配列番号８８、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、又は１０２のＬＣＤＲ１、配列番号８９又は１０３のＬＣＤＲ２、及び配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、又は１０４のＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、
ａ）それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
ｂ）それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
ｄ）それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
ｅ）それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
ｆ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
ｇ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
ｈ）それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
ｉ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、
ａ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
ｂ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
ｃ）配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
ｄ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
ｅ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
ｆ）配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
ｈ）配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
ｉ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｊ）配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ、及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、
ａ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３６９のＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４０のＶＬ、
ｃ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
ｄ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４１のＶＬ、
ｅ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４２のＶＬ、
ｆ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４３のＶＬ、
ｇ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４４のＶＬ、
ｈ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４５のＶＬ、
ｉ）配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、
ｊ）配列番号３４６のＶＨ及び配列番号３４７のＶＬ、又は
ｋ）配列番号３４８のＶＨ及び配列番号３４９のＶＬを含む。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
他の実施形態では、単離多重特異性タンパク質は、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む。
他の実施形態では、Ｌ２は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異、及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
他の実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、以下の変異：
ａ）第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、又は
ｂ）第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた本開示の単離タンパク質を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質をコードするベクターを含む、宿主細胞を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質を産生する方法であって、タンパク質を発現する条件で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質を収集することと、を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた本開示の単離多重特異性タンパク質を含む、免疫コンジュゲートを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｄｏｓｃｌｏｓｕｒｅの単離多重特異性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｄｏｓｃｌｏｓｕｒｅの単離多重特異性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｄｏｓｃｌｏｓｕｒｅの単離多重特異性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離多重特異性タンパク質を産生する方法であって、多重特異性タンパク質を発現する条件で宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された多重特異性タンパク質を収集することと、を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現がんを治療する方法であって、治療有効量の本開示の単離タンパク質、本開示の単離多重特異性タンパク質、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、ＨＬＡ－Ｇ発現がんを治療するのに十分な時間の間、対象に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、本開示の単離タンパク質、本開示の単離多重特異性タンパク質、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間の間、対象に投与することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現がんの確立を予防する方法であって、本開示の単離タンパク質、本開示の単離多重特異性タンパク質、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を対象に投与して、対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現がんの確立を予防することを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ｇ発現がんを発症するリスクがある対象における非がん性状態を治療する方法であって、本開示の単離タンパク質、本開示の単離多重特異性タンパク質、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を対象に投与して、非がん性状態を治療することを含む、方法を提供する。
他の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ発現がんは、肺がん、膵臓がん、腎がん、頭頸部がん、卵巣がん、食道がん、又は乳がんである。
他の実施形態では、単離タンパク質又は単離多重特異性タンパク質は、第２の治療剤と組み合わせて投与される。
他の実施形態では、第２の治療剤は、手術、化学療法、ホルモン受容体遮断療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである。
ある特定の実施形態では、本開示は、対象における存在を検出する方法であって、がんを有することが疑われる対象に本開示の免疫コンジュゲートを投与することと、免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによってがんの存在を検出することと、を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質、本開示の単離多重特異性タンパク質、本開示の免疫コンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を含む、キットを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の単離タンパク質に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＨＬＡ－Ｇ上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、エピトープが、ＨＨＰＶＦＤＹＥ（配列番号４８５）のアミノ酸配列及びＶＰＳを含む、不連続エピトープである、単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４７８又は４７９のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４７８のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４７９のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、単離タンパク質は、配列番号４９０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、単離タンパク質は、配列番号４８９及び４４７のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、単離タンパク質は、配列番号４３９のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４６５及び４６８のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４６６及び４６９のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号４６７及び４７０のアミノ酸配列を含む単離タンパク質を提供する。
前述は、以下の付属の図面に示される例示的実施形態のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
ｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合の熱処理後の組換えＨＬＡ－Ｇに結合するｖ領域の能力を示す。 水素－重水素交換ベースのＬＣ－ＭＳを使用した、ＨＬＡ－Ｇ（配列番号１）上の選択された抗体のエピトープマッピングを示す。示される配列は、成熟ＨＬＡ－Ｇの最初の残基から始まるアミノ酸残基番号付け（残基１８３～２７４が示される、配列番号４９７）を有する、配列番号１の断片である。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６５）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２３）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６６５由来の可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図３Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６５）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２３）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６６５由来の可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図３Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６９）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２６）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６６９由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図４Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６６９）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５２６）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６６９由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図４Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８８）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５９６）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６８８由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図５Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８８）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５９６）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６８８由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図５Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６９４）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ６１６）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６９４由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図６Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６９４）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ６１６）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６９４由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図６Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８７）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５８５）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６８７由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図７Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６８７）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５８５）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６８７由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図７Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６７２）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５０８）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６７２由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図８Ａは、ＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を示す。 ＩｇＧ１（ＭＨＧＢ６７２）又はＩｇＧ４（ＭＨＧＢ５０８）のいずれかに対して操作されたＭＨＧＢ６７２由来可変領域によるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞のＮＫ細胞媒介性細胞傷害の増強を示す。図８Ｂは、ＮＫ－９２細胞媒介性細胞傷害を示す。 選択された抗体ＭＨＧＢ６６５（「Ｂ６６５」）、ＭＨＧＢ６６９（「Ｂ６６９」）、ＭＨＧＢ６７２（「Ｂ６７２」）、ＭＨＧＢ６８２（「Ｂ６８２」）、ＭＨＧＢ６８７（「Ｂ６８７」）、及びＭＨＧＢ６８８（「Ｂ６８８」）によって媒介される、ＪＥＧ－３細胞に対するＡＤＣＣ活性を示す。 選択された抗体のＡＤＣＣ活性を示す。 選択された抗体のＡＤＣＣ活性を示す。 選択された抗体のＣＤＣ活性を示す。 選択された抗体のＣＤＣ活性を示す。 初代ヒトＴ細胞へのハイブリドーマ上清の結合を示す。クローンＵＣＨＴ１を陽性対照として使用し（１１Ｂ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（mouse IgG1 isotype、ｍＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。 初代ヒトＴ細胞へのハイブリドーマ上清の結合を示す。クローンＵＣＨＴ１を陽性対照として使用し（１１Ｂ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ（mouse IgG1 isotype、ｍＩｇＧ１）を陰性対照として使用した。 Ｅ．ｃｏｌｉで発現した抗ＣＤ３ ｓｃＦｖバリアントのＣＤ３への結合を示す。 ＣＤ３Ｂ８１５（配列番号３４０）、ＣＤ３Ｗ２４４（配列番号３４１）、ＣＤ３Ｗ２４５（配列番号３４２）、ＣＤ３Ｗ２４６（配列番号３４３）、ＣＤ３Ｗ２４７（配列番号３４４）、及びＣＤ３Ｗ２４８（配列番号３４５）のＶＬ領域のアラインメントを示す。 ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３ε：ＣＤ３Ｗ２４５）に結合したＣＤ３Ｗ２４５の複合体又はヒトＣＤ３ε（ＣＤ３ε：ＯＫＴ３）に結合したＯＫＴ３の複合体について測定された、水素－重水素交換質量分析（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry、ＨＤＸ－ＭＳ）を使用して決定された水素－重水素交換速度を示す（配列番号３７５の断片である配列番号４８４が示されている）。一重下線は、ＣＤ３ε単独と比較して、抗体の存在下で１０％～３０％の重水素化レベルの減少を有するセグメントを示し、二重下線は、＞３０％の重水素化レベル減少を有するセグメントを示す。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＨＵＰ－Ｔ３に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＨＵＰ－Ｔ３に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す。 ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１に対するＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害、及びＴ細胞活性化％を示す。 ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１細胞に対するＨＣ３Ｂ２５８及びＨＣ３Ｂ１２５の細胞傷害を示し、エフェクター（Ｔ細胞）：標的（ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１）比は、示されるように、１：３、１：１、又は３：１であった。 対照（ＨＬＡ－Ｇ×ヌル）又はＨＣＢ１２５のいずれかで処置したＣＤ３４＋細胞ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおける確立された膵臓ＰＤＸの２７日目の群平均腫瘍体積（１７Ａ）及び個々の腫瘍体積を示す。 対照（ＨＬＡ－Ｇ×ヌル）又はＨＣＢ１２５のいずれかで処置したＣＤ３４＋細胞ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおける確立された膵臓ＰＤＸの２７日目の群平均腫瘍体積（１７Ａ）及び個々の腫瘍体積を示す。 対照（ＣＤ３×ヌル）又はＨＣＢ１２５のいずれかで処置したＴ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおける確立されたＨｕｐ－Ｔ３異種移植片の群平均腫瘍体積を示す。
本開示の方法は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本開示の方法は、本明細書に記載及び／又は示される特定の方法に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、請求項に記載の方法に限定することを意図しないことを理解されたい。
本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。
リストが提示される場合、特に指定されない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストの全ての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」という移行句は、特許用語において概ね受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲を制限する。「備える／含む」という語句（又はその同等語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載される実施形態として提供する。
「約」は、当業者によって求められた特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち、測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において、実施例又は明細書の他の箇所に別途明示的に記載されない限り、「約」は、当該技術分野の実施につき１つの標準偏差、又は５％までの範囲のうちのいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
「活性化」又は「刺激」又は「活性化された」又は「刺激された」は、活性化マーカーの発現、サイトカイン産生、増殖、又は標的細胞の細胞傷害の媒介をもたらす、細胞の生物学的状態の変化の誘導を指す。細胞は、一次刺激シグナルによって活性化され得る。共刺激シグナルは、一次シグナルの大きさを増幅し、初期刺激後の細胞死を抑制することができ、その結果、より耐久性のある活性化状態、ひいてはより高い細胞傷害能をもたらす。「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞及び／若しくはＮＫ細胞の増殖、並びに／又は鍵となる分子の上方制御若しくは下方制御を引き起こすシグナルを指す。
「オルタナティブスカフォールド」は、立体配座許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する、単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、スカフォールドの完全性を損なうことなく導入される多型を許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように遺伝子操作及び選択され得る。
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」、又は「antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ」は、抗体でコーティングされた標的細胞と、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単球、マクロファージ、及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との、エフェクター細胞上で発現するＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介した相互作用に依存する細胞死を誘導する機序を指す。
「抗体依存性細胞貪食作用」又は「Antibody-dependent cellular phagocytosis、ＡＤＣＰ」は、マクロファージ、又は樹状細胞などの貪食細胞による内在化によって、抗体でコーティングされた標的細胞を排除する機序を指す。
「抗原」は、免疫応答を媒介することができる抗原結合ドメイン又はＴ細胞受容体が結合することができる任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの一部分、又はそれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。抗原は、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分を有する流体、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺傷若しくは不活性化された全細胞又は溶解物などの生体サンプルからの遺伝子によって発現し得る、当該サンプルから合成され得る、又は当該サンプルから精製され得る。
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合するタンパク質の一部分を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの一部、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合するオルタナティブスカフォールド、並びに抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別々の一本鎖により発現された場合にＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成することができる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又はオルタナティブスカフォールドにコンジュゲートされてもよい。
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てられ得る。
「二重特異性」は、同じ抗原内の２つの異なる抗原、又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する分子（抗体など）を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca cynomolgus）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
「がん」は、身体における異常細胞の制御されていない成長を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。制御されていない細胞分裂及び成長は、隣接組織を浸潤する悪性腫瘍の形成をもたらし、リンパ系又は血流を介して身体の遠位部分にも転移し得る。「がん」又は「がん組織」は、腫瘍を含み得る。
「補体依存性細胞傷害」又は「Complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ」は、標的に結合したタンパク質のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合し、これを活性化し、次に、補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面に対する補体成分の沈着をもたらし得、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＣＤＣを容易にする
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体の領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）、及びＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－１５，１９９６）などの様々な描写を用いて定義することができる。様々な描写と、可変領域の付番との対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９：６５７－７０、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース、ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照されたい）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、明細書に別途明示的に記載されない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
「減少する」、「低下する」、「低くする」、「低減する」、又は「軽減する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、試験分子が低減された応答（すなわち、下流効果）を媒介する能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍、若しくはそれ以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍、若しくはそれ以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）の減少などの、測定された応答の減少であってもよい。
「分化」は、細胞の能力若しくは増殖を減少させるか、又は細胞をより発達的に制限された状態に移動させる方法を指す。
「コードする」又は「コードすること」は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）か、又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異性配列の固有の特性、並びにそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、細胞又は他の生物系において、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳がタンパク質を産生する場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡは、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖とはいずれも、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするとして言及され得る。
「増強する」、「促進する」、「増加させる」、「拡大する」、又は「改善する」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合に、より大きな応答（すなわち、下流効果）を媒介する試験分子の能力を指す。例示的な応答は、Ｔ細胞拡大、Ｔ細胞活性化、又はＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺傷、又はタンパク質のその抗原若しくは受容体への結合、増強されたＦｃγへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／若しくはＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答の統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、若しくは３０倍、若しくはそれ以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００倍、若しくはそれ以上（１を上回る全ての整数及びその間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８等を含む）の増加などの、測定された応答の増加であってもよい。
「拡大」は、細胞分裂及び細胞死の結果を指す。
「発現する」及び「発現」は、細胞内又はインビトロで起こる周知の転写及び翻訳を指す。したがって、発現産物、例えば、タンパク質は、細胞によって又はインビトロで発現し、細胞内、細胞外、又は膜貫通タンパク質であってもよい。
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成された生物系で利用することができるベクターを指す。
「ｄＡｂ」又は「ｄＡｂ断片」は、ＶＨドメインで構成される抗体断片を指す（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６（１９８９））。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ断片」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２」又は「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋によって接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
「Ｆｄ」又は「Ｆｄ断片」は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成される抗体断片を指す。
「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」は、抗体の単一のアーム由来のＶＨドメイン及びＶＬドメインで構成される抗体断片を指す。
「完全長抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメインで構成され、重鎖定常ドメインは、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。
「遺伝子修飾」は、宿主細胞が、導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを指す。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来」遺伝子又は配列と呼ばれる場合もあり、開始、終止、プロモータ、シグナル、分泌、又は細胞の遺伝機序によって使用される他の配列などのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した調節配列又は制御配列を含んでいてよい。遺伝子又は配列は、既知の機能を有さない非機能的配列を含んでいてよい。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取って発現する宿主細胞は、「遺伝的に操作されている」。宿主細胞に導入されたＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属若しくは種の細胞を含む任意の起源、又は異なる属若しくは種に由来し得る。
「異種」は、自然界では互いに対して同じ関係で見られない、２つ又は３つ以上のポリヌクレオチド又は２つ又は３つ以上のポリペプチドを指す。
「異種ポリヌクレオチド」は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原をコードする、天然には存在しないポリヌクレオチドを指す。
「異種ポリペプチド」は、本明細書に記載される２つ又は３つ以上のネオ抗原ポリペプチドを含む、天然には存在しないポリペプチドを指す。
「宿主細胞」は、異種核酸を含有する任意の細胞を指す。例示的な異種核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター）である。
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限になるように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、その定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はそれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
「～と組み合わせて」は、２つ又は３つ以上の治療剤を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に、又は単剤として任意の順序で順次、対象に投与することを意味する。
「単離された」は、組換え細胞などにおいて分子が産生される系の他の成分から離して実質的に分離及び／又は精製された分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離／単離された」は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
「ヒト白血球抗原Ｇ」又は「ＨＬＡ－Ｇ」は、「ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原、アルファ鎖Ｇ」又は「ＭＨＣクラスＩ抗原Ｇ」とも称される、既知のタンパク質を指す。全てのＨＬＡ－Ｇアイソフォーム及びバリアントは、「ＨＬＡ－Ｇ」に包含される。様々なアイソフォームのアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ１７６９３－１～Ｐ１７６９３－７から検索可能であり、表１に示される。
「調節する」は、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較したときに、より多い又はより少ない応答を媒介する（すなわち、下流効果）試験分子の増強された又は低減された能力のいずれかを指す。
「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からＣ末端リジンを除去する、又はアミノ酸の異性化若しくは脱アミド、メチオニンの酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミドなどの翻訳後修飾といった、可能な周知の変更を除いて同一である、抗体分子の実質的に均質な母集団から得られた抗体、すなわち、集団を構成する個別の抗体を意味する。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってもよい。
「多重特異性」は、２つ又は３つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ又は３つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する、抗体などの分子を指す。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）又はチンパンジー（Pan troglodytes）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有する場合もあり、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合する場合もある。
「ナチュラルキラー細胞」及び「ＮＫ細胞」は、本明細書では互換的かつ同義的に使用される。本明細書で使用するとき、ＮＫ細胞は、ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋及び／又はＣＤ５７＋ＴＣＲ－表現型を有する分化リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、特定の細胞溶解性酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現できない細胞に結合し、殺傷する能力、腫瘍細胞又はＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する他の疾患細胞を殺傷する能力、及び免疫応答を刺激又は阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を特徴とする。
「動作可能に連結された」及び類似の語句は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、それぞれ、互いに機能的な関係で配置された核酸配列又はアミノ酸配列の動作上の連結を指す。例えば、動作可能に連結されたプロモータ、エンハンサエレメント、オープンリーディングフレーム、５’及び３’ＵＴＲ、並びにターミネータ配列は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ）の正確な産生をもたらし、場合によっては、ポリペプチドの産生（すなわち、オープンリーディングフレームの発現）をもたらす。動作可能に連結されたペプチドは、ペプチドの機能ドメインが互いに適切な距離で配置されて、各ドメインの意図された機能を付与するペプチドを指す。
「医薬的組み合わせ」は、一緒に又は別々に投与される２つ又は３つ以上の活性成分の組み合わせを指す。
「医薬組成物」は、活性成分と医薬的に許容される担体とを組み合わせて得られる組成物を指す。
「医薬的に許容される担体」又は「賦形剤」は、対象に対して毒性のない、活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。例示的な医薬的に許容される担体は、バッファ、安定剤、又は防腐剤である。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む、合成分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり得る。
疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、「予防」、又は「予防法」は、対象において障害が発生するのを防ぐことを意味する。
「増殖」は、細胞の対称的又は非対称的な分裂のいずれかである細胞分裂の増加を指す。
「プロモータ」は、転写を開始させるために必要な最小配列を指す。プロモータはまた、それぞれ転写を増強又は抑制するエンハンサ又はリプレッサエレメントを含み得る。
本明細書では互換的に使用される「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基で構成されている１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、モノマーであってもよく、又は同一若しくは異なる２つ若しくは３つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよい。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後改変によって修飾されたタンパク質であり得る。タンパク質は、組換え発現し得る。
「組換え体」は、組換え手段によって調製、発現、創出、又は単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
「調節エレメント」は、核酸配列の発現のある側面を制御する任意のシス又はトランス作用性遺伝要素を指す。
「再発性」は、治療薬による以前の治療の後の改善期間後に疾患又は疾患の徴候及び症状が再開することを指す。
「難治性」は、治療に応答しない疾患を指す。難治性疾患は、治療前若しくは治療開始時に治療に抵抗性であり得るか、又は難治性疾患は、治療中に抵抗性疾患となり得る。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指し、ＶＬ及びＶＨは、ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができる。特に指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれの順序で有していてもよく、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでいてもよく、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでいてもよい。
「特異的に結合する」、「特異的結合」、「特異的に結合している」、又は「結合する」は、タンパク質性分子が、抗原又は抗原内のエピトープに、他の抗原に対する親和性よりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、タンパク質性分子は、約１×１０－７Ｍ以下、例えば約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。本明細書に記載の前立腺ネオ抗原の文脈において、「特異的結合」は、タンパク質性分子が、前立腺ネオ抗原がそのバリアントである野生型タンパク質に検出可能には結合することなく、前立腺ネオ抗原に結合することを指す。
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類及び非哺乳類が挙げられる。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は、互換的であり、本明細書では同義的に使用される。Ｔ細胞には、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、メモリＴ細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（T helper、Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。また、「ＮＫＴ細胞」も含まれ、これは、半不変αβＴ細胞受容体を発現するだけでなく、ＮＫ１．１などの典型的にはＮＫ細胞に関連する様々な分子マーカーも発現する、Ｔ細胞の特殊な集団を指す。ＮＫＴ細胞には、ＮＫ１．１＋及びＮＫ１．１－、並びにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋、及びＣＤ８－細胞が含まれる。ＮＫＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣ Ｉ様分子ＣＤ Ｉｄによって提示される糖脂質抗原を認識するという点で独特である。ＮＫＴ細胞は、炎症又は免疫寛容のいずれかを促進するサイトカインを産生する能力により、保護効果又は有害効果のいずれかを有し得る。また、「ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）」も含まれ、これは、それらの表面に異なるＴＣＲを有するＴ細胞の小さなサブセットの特殊な集団を指し、ＴＣＲがα及びβ－ＴＣＲ鎖と表記される２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴ細胞の大部分とは異なり、γδＴ細胞におけるＴＣＲは、γ鎖及びδ鎖から構成される。γδＴ細胞は、免疫監視及び免疫調節において役割を果たすことができ、ＩＬ－１７の重要な供給源であること、及び強力なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導することが見出された。また、「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」も含まれ、これは、異常又は過剰な免疫応答を抑制し、免疫寛容における役割を果たす、Ｔ細胞を指す。Ｔｒｅｇは、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞であり、かつ、ＩＬ－１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞である転写因子Ｆｏｘｐ３陰性調節性Ｔ細胞も含み得る。
本明細書において互換的に使用される「治療有効量」又は「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。有効な治療剤又は治療剤の組み合わせの例示的な指標としては、例えば、患者の健康状態の改善、腫瘍量の低減、腫瘍の増殖の停止若しくは鈍化、及び／又は体内の他の場所へのがん細胞の転移の非存在が含まれる。
「形質導入」は、ウイルスベクターを使用する、外来核酸の細胞への導入を指す。
がんなどの疾患又は障害を「治療する」、「治療している」、又は「治療」は、以下のうちの１つ又は２つ以上を達成することを指す：障害の重症度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害の特徴的な症状の悪化を阻害する、以前障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害の症状を有していた対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
「腫瘍細胞」又は「がん細胞」は、インビボ、エクスビボ、又は組織培養のいずれかにおいて、自発的な又は誘導された表現型の変化を有するがん性、前がん性、又は形質転換細胞を指す。これらの変化は、必ずしも新たな遺伝物質の取り込みを伴うものではない。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の組み込み、外因性核酸の取り込みにより発生させることもでき、自然発生的に又は発がん物質に曝露した後に発生し、それによって内因性の遺伝子が変異する場合もある。形質転換／がんは、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性病変、腫瘍特異的マーカーレベルの調節、浸潤性、ヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の増殖などによって例示される。
「バリアント」、「変異体」、又は「変化した」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本明細書全体を通して、抗体定常領域におけるアミノ酸残基番号付けは、本明細書に別途明示的に記載されない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
Ｉｇ定常領域の変異は、以下のように称される。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、１つの免疫グロブリン定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を指す。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗは、１つの多量体タンパク質中に存在する、第１のＩｇ定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異並びに第２のＩｇ定常領域におけるＴ３９４Ｗ変異を指す。
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメイン。
本開示は、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメイン、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性又は多重特異性タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれを作製及び使用する方法を提供する。本明細書で同定されるＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、１）改善された熱安定性、２）脱アミド化リスクを低減することによって達成される改善された発展性、３）減少した免疫原性、４）ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－Ｅとの交差反応性の欠如を伴うＨＬＡ－Ｇに対する特異性、並びに５）腫瘍細胞上の免疫チェックポイントリガンド発現を克服し、Ｔ細胞媒介性細胞傷害を介した腫瘍細胞死滅を確実にする能力などの、いくつかの独特の特性を実証した。
本開示は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、単離タンパク質を提供する。
本開示は、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、生殖系列最適化を提供するように操作された変異を含み、変異が、ＶＨドメインにおけるＥ１Ｑ、Ｌ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｓ７１Ｐ、Ｄ４６Ｅ、及びＨ７７Ｎ変異、並びにＶＬドメインにおけるＫ３０Ｅ及びＧ６６Ｖからなる群から選択される、単離タンパク質を提供する。本開示はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、翻訳後修飾のリスクを低減するように操作された変異を含み、変異が、ＶＬドメインにおけるＮ９２Ｈである、単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、単離タンパク質を提供する。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、（ｓｃＦｖ）２である。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２である。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｄである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ抗原結合ドメインは、ｄＡｂである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇ抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
ＨＬＡ－Ｇ結合ｓｃＦｖ
ＨＬＡ－Ｇに結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖフォーマットに操作され得る。また、本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ。ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＬ。ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ。ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ、又はＶＬ－リンカー－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－リンカー－ＶＨなどのｓｃ（ＦＶ）２構造を生成するために使用され得る。
本明細書で同定されたＶＨ及びＶＬドメインは、ｓｃＦｖフォーマットに組み込むことができ、得られたｓｃＦｖのＨＬＡ－Ｇへの結合及び熱安定性は、既知の方法を使用して評価することができる。結合は、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、若しくはＫｉｎＥｘＡ機器、ＥＬＩＳＡ、又は当業者に公知の競合的結合アッセイを使用して評価することができる。結合は、精製されたｓｃＦｖ又はＥ．ｃｏｌｉ上清又は発現したｓｃＦｖを含有する溶解細胞を使用して評価することができる。試験ｓｃＦｖのＨＬＡ－Ｇに対する親和性の測定値は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定した場合に異なり得る。したがって、親和性及びその他の結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、通常、標準的な条件、及び標準化緩衝液を用いて行われる。熱安定性は、試験ｓｃＦｖを５０℃、５５℃、又は６０℃などの高温で、５分（min）、１０分、１５分、２０分、２５分、又は３０分などの期間の間加熱し、ＨＬＡ－Ｇへの試験ｓｃＦｖの結合を測定することによって評価することができる。非加熱ｓｃＦｖサンプルと比較した場合に、ＨＬＡ－Ｇへの同等の結合を保持するｓｃＦｖは、熱安定性であると称される。
組換え発現系にて、リンカーはペプチドリンカーであり、任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ及びＴｈｅである。リンカーは、ＨＬＡ－Ｇへの結合などの所望の活性を保持するように、互いに対して正確な高次構造を形成するような方法でＶＨ及びＶＬを連結させるのに適切な長さを有している必要がある。
リンカーは、約５～５０個のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～４０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１０～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１５～２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、２９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３０個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３１個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３２個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３３個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３４個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３５個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３６個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３７個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３８個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、３９個のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、４０個のアミノ酸長である。使用され得る例示的なリンカーは、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー、並びに他の柔軟なリンカーである。
他のリンカー配列は、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖アイソタイプに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含み得る。代替的に、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマーは、リンカーとしての使用が見出され得る。使用され得る例示的なリンカーを表２に示す。追加のリンカーは、例えば、国際公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、
配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２４８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２４９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む。
ＨＬＡ－Ｇに結合する他の抗原結合ドメイン
ＨＬＡ－Ｇに結合する本明細書で同定されたＶＨドメイン及びＶＬドメインのいずれも、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、又はＦｖフォーマットに操作することができ、それらのＨＬＡ－Ｇへの結合及び熱安定性は、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価することができる。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、
配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、
配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２は、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、
配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｖは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号５０のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号５２のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号５４のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号５６のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号５８のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号６０のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号６２のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号６４のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号６６のＶＨを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｄは、配列番号６８のＶＨを含む。
相同な抗原結合ドメイン及び保存的置換を有する抗原結合ドメイン
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインのバリアントは、本開示の範囲内である。例えば、バリアントは、親抗原結合ドメインと比較したときに改善された機能的性質を保持するか又は有する限り、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９個のアミノ酸置換を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに対して約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であり得る。いくつかの実施形態では、多様性はフレームワーク領域に存在する。いくつかの実施形態では、バリアントは、保存的置換により生成される。
例えば、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、ＶＨにおけるＥ１Ｑ、Ｌ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｓ７１Ｐ、Ｅ１Ｑ、Ｌ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、及びＳ７１Ｐ（配列番号５２のＭＨＧＢ６８８－ＶＨに従う残基番号付け）並びにＶＬにおけるＫ３０Ｅ及びＧ６６Ｖ（配列番号５３のＭＨＧＢ６８８－ＶＬに従う残基番号付け）の残基位置での置換を含み得る。保存的置換は、任意の指定の位置で行うことができ、得られたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインのバリアントを、本明細書に記載のアッセイで所望の特性について試験する。
また、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬと少なくとも８０％同一であるＶＨ及びＶＬを含む、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインも提供される。
いくつかの実施形態では、同一性は、８５％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９０％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９１％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９１％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９２％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９３％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９４％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９４％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９５％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９６％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９７％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９８％である。いくつかの実施形態では、同一性は、９９％である。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ４：１１－１７（１９８８））のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。更に、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ＿／／＿ｗｗｗ＿ｇｃｇ＿ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、ギャップ重み付け１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み付け１、２、３、４、５、又は６を使用して決定することもできる。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインのバリアントは、ＨＬＡ－Ｇに結合する親抗原結合断片の所望の機能的特性を保持しながら、ＣＤＲ領域のいずれかに１つ又は２つの保存的置換を含む。
「保存的改変」は、アミノ酸修飾を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸修飾を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、ポリペプチド中の任意の天然残基はまた、アラニンスキャニング変異誘発（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）について以前に記載されているように、アラニンで置換され得る。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、既知の方法、例えばＰＣＲ突然変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）により行うことができる。代替的に、バリアントのライブラリは、例えば、ランダムコドン（ＮＮＫ）又は非ランダムコドン（例えば１１個のアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）をコードするＤＶＫコドン）を用いて生成することもできる。得られるバリアントは、本明細書に記載のアッセイを用いて、その特徴について試験することができる。
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片を生成する方法
本開示で提供されるＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、様々な技術を使用して生成することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、ＨＬＡ－Ｇに結合するＶＨ／ＶＬ対を同定することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、又はハムスター、ラット、若しくはニワトリなどの他の宿主動物をヒト及び／又はカニクイザルＨＬＡ－Ｇで免疫化し、続いて標準的な方法を使用して免疫化した動物由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する。結合特異性、交差反応性又はその欠如、抗原に対する親和性、及び任意の所望の機能性などの所望の特性を有するＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含有する抗体の生成について、１つの不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーをスクリーニングすることができる。
非ヒト動物を免疫することによって生成されたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインをヒト化してもよい。ヒトアクセプタフレームワークの選択を含む例示的なヒト化技術としては、ＣＤＲ移植（米国特許第５，２２５，５３９号）、ＳＤＲ移植（米国特許第６，８１８，７４９号）、リサーフェシング（Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：４８９－４９９）、特異性決定残基リサーフェシング（米国特許出願公開第２０１０／０２６１６２０号）、ヒトフレームワーク適合（米国特許第８，７４８，３５６号）、又は超ヒト化（米国特許第７，７０９，２２６号）が挙げられる。これらの方法では、ＣＤＲの長さの類似性若しくはカノニカル構造の同一性、又はそれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づき選択され得るヒトフレームワークに、親抗体のＣＤＲ又はＣＤＲ残基のサブセットを移植する。
ヒト化抗原結合ドメインは、国際公開第１０９０／００７８６１号及び同第１９９２／２２６５３号に記載されているものなどの技術により、変化させたフレームワーク支持残基を組み込んで結合親和性を保持することによって（復帰変異）、又はＣＤＲのいずれかに多様性を導入して、例えば抗原結合ドメインの親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化してもよい。
自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するマウス、ラット、又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片を生成することができ、これらは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第１９９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号に記載されている。このような動物の内因的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）、及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、ヒト免疫グロブリン又はその一部、例えばＦａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、又は不対若しくは対合抗体可変領域を発現するようにファージが操作されているファージディスプレイライブラリから選択することができる。ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－９６、及び国際公開第０９／０８５４６２号）に記載されるバクテリオファージｐＩＸ被覆タンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び／又はカニクイザルＨＬＡ－Ｇへのファージ結合についてスクリーニングしてよく、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物からＦａｂを単離し、ｓｃＦｖ又は抗原結合断片の他の構成に変換してよい。
免疫原性抗原の調製並びに本開示の抗原結合ドメインの発現及び生成は、組換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて行うことができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは全細胞又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、あるいは、抗原は、当該抗原又はその一部分をコードする核酸から動物の体内で新規に（de novo）形成されてもよい。
半減期延長部分へのコンジュゲーション
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、半減期延長部分にコンジュゲートさせてもよい。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン並びにその断片及び類似体、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はその断片、例えばＦｃ領域である。前述の半減期延長部分のアミノ酸配列は公知である。Ｉｇ又はその断片は、全てのアイソタイプ、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む。
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインにコンジュゲートされ得る追加の半減期延長部分としては、所望の特性のための、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えば、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖類）が挙げられる。これら部分は、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインと直接融合させてよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成することができる。代替的に、周知の化学的カップリング方法を使用して、組換えで生成された本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインにその部分を結合させてもよい。
例えば、システイン残基を本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインのＣ末端に組み込むか、又は操作してシステインをＨＬＡ－Ｇ結合部位から離れる方向に面する残基位置にし、周知の方法を使用してペギル基をシステインに結合させることによって、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインにペギル部分をコンジュゲートさせることができる。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片は、半減期延長部分にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇの断片である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｉｇ定常領域の断片である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、Ｆｃ領域である。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、アルブミンである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、アルブミン結合ドメインである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、トランスフェリンである。
いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコールである。
半減期延長部分にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、既知のインビボモデルを利用して、それらの薬物動態特性について評価することができる。
免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片へのコンジュゲーション
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートして、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、貪食作用、又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（B cell receptor、ＢＣＲ））のダウンレギュレーションを含む、抗体様特性を付与することができる。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片はまた、本明細書で論じられるように、半減期延長部分としても機能する。本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して操作して従来の完全長抗体にすることができる。ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む完全長抗体は、本明細書に記載のとおり、更に操作されてもよい。
免疫グロブリン重鎖定常領域は、サブドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。ＥＵインデックスに従う残基番号付けで、重鎖においてＣＨ１ドメインは残基Ａ１１８～Ｖ２１５に及び、ＣＨ２ドメイン残基はＡ２３１～Ｋ３４０に及び、ＣＨ３ドメイン残基Ｇ３４１～Ｋ４４７に及ぶ。場合によっては、Ｇ３４１は、ＣＨ２ドメイン残基と称される。ヒンジは、概して、Ｅ２１６を含み、ヒトＩｇＧ１のＰ２３０で終結すると定義される。Ｉｇ Ｆｃ領域は、Ｉｇ定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、したがって、Ｉｇ重鎖定常領域の少なくともおよそＡ２３１からＫ４４７までの領域を含む。
本発明はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを提供する。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、重鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、軽鎖定常領域である。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ヒンジの一部分は、Ｉｇヒンジの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を指す。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートした本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、いくつかの既知のアッセイを使用してそれらの機能性について評価することができる。ＨＬＡ－Ｇへの結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価され得る。Ｉｇ定常ドメイン又はＩｇ定常領域の断片、例えばＦｃ領域によって付与される変化した特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、若しくはＦｃＲｎ受容体などの受容体の可溶性形態を使用するＦｃ受容体結合アッセイにおいて、又は例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ、若しくはＡＤＣＰを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、アッセイすることができる。
ＡＤＣＣは、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞を標的細胞として、またＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するインビトロアッセイを使用して評価することができる。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料、又は天然の細胞内タンパク質）の放出によって検出することができる。例示的なアッセイでは、標的細胞を、１つの標的細胞の、４つのエフェクター細胞に対する比で使用する。標的細胞はＢＡＴＤＡで予め標識し、エフェクター細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを２時間インキュベートし、上清に放出したＢＡＴＤＡを測定することにより、細胞溶解を測定する。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。
ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として、また、ＧＦＰ又は他の標識分子を発現するように操作された任意のＨＬＡ－Ｇ発現細胞を標的細胞として使用することによって評価することができる。例示的なアッセイでは、エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加して、又は添加せずに、標的細胞と共に４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体を用いて特定することができ、貪食作用の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋ＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光％に基づいて求めることができる。
細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％のＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５個の細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）で播種し、５０μＬの試験タンパク質を０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、反応物を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールヒト血清をウェルに添加し、反応物を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定され得る。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、標準的な方法を使用して様々な設計の単一特異性又は多重特異性タンパク質に操作され得る。
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する単離抗原結合ドメインを含む単一特異性タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、単一特異性タンパク質は、抗体である。
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、二重特異性である。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、三重特異性である。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、四重特異性である。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＨＬＡ－Ｇへの結合について一価である。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＨＬＡ－Ｇへの結合について二価である。
本開示はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む単離多重特異性タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、Ｔ細胞抗原である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、ＮＫ細胞抗原である。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原は、ＣＤ３εである。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＶＨＨを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｖを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｄを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約５～５０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約５～４０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約１０～３０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、約１０～２０個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号７０、７３、７５、７８、８１、又は８５のＨＣＤＲ１、配列番号７１、７６、７９、８２、又は８６のＨＣＤＲ２、配列番号７２、７４、７７、８０、８３、８４、又は８７のＨＣＤＲ３、配列番号８８、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、又は１０２のＬＣＤＲ１、配列番号８９又は１０３のＬＣＤＲ２、及び配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、又は１０４のＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、
それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ、及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６９のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２４８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２４９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２５９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６２のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６３のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の結合ドメインは、配列番号２６９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、
配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
配列番号３３９のＶＨ、及び配列番号３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、又は３４５のＶＬ、
配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、又は
配列番号３４６又は３４８のＶＨ及び配列番号３４７又は３４９のＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインは、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域の断片及び／又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む。
いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、本明細書に記載のとおり更に遺伝子操作されてもよい。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲへの多重特異性タンパク質の結合の低減をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片は、以下の変異：
第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、又は
第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む。
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質の生成。
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片は、多重特異性抗体に操作してもよく、これらもまた、本発明の範囲内に包含される。
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片は、Ｆａｂアーム交換を使用して生成される完全長多重特異性抗体に操作してもよく、インビトロでＦａｂアーム交換を促進する、Ｉｇ定常領域ＣＨ３ドメイン内の２つの単一特異性二価抗体に置換が導入される。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をＣＨ３ドメインに有するように、２つの単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下において共にインキュベーションされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電的マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、鎖交換遺伝子操作ドメインボディ（Strand Exchange Engineered Domain body、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きな側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
ＳＥＥＤボディ変異は、米国特許出願公開第２００７／０２８７１７０号に記載のように、選択されたＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号、及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許第９１５０６６３号及び米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５６号に開示されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が含まれる。
ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを組み込むことができる更なる二重又は多重特異性構造としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain Immunoglobulin、ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号；ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意である）、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造、例えば、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメイン（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒にコンジュゲートされた２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂｓ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び遺伝子操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ））、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）並びにＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディベースの抗体、及びドメイン抗体としては、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Dual Affinity Retargeting Technology、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Epigen Biotech）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインはまた、３本のポリペプチド鎖を含む多重特異性タンパク質に操作してもよい。このような設計では、少なくとも１つの抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖの形態である。例示的な設計としては次の設計１～４が挙げられる（「１」が第１の抗原結合ドメインを示し、「２」が第２の抗原結合ドメインを示し、「３」が第３の抗原結合ドメインを示す）。
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
ＣＨ３操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異など、設計１～４に組み込まれ得る。
アイソタイプ、アロタイプ、及びＦｃ遺伝子操作
本開示のタンパク質中に存在するＩｇ定常領域又はＦｃ領域などのＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであってよい。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクター機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質の免疫原性は、輸注反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－０８）。断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによってある程度決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表３は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４／０２７３０９２号に記載のとおり細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ、又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を最高レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量を、既知の方法を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域にコンジュゲートした、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合断片は、約１０％～約９０％のＣ末端リジン含量を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約２０％～約８０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約４０％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約５５％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含量は、約６０％である。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに対してＦｃ領域変異を行って、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／若しくはＡＤＣＰなどのエフェクター機能、並びに／又は薬物動態特性を調節することができる。これは、活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ及び／又はＦｃＲｎへの変異Ｆｃの結合を調節する変異をＦｃに導入することによって達成することができる。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｆｃ領域にある。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｆｃ領域に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、抗体のＦｃＲｎへの結合を調節するＦｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するために変異させることが可能なＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４、及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われることができる例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、タンパク質の活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減する、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減させる少なくとも１つの変異をＦｃ領域に含む。
タンパク質の活性化ＦｃγＲへの結合を低減させ、続いて、エフェクター機能を低減させるために変異させることが可能なＦｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで加えることができる例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓの変異である。また、ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
ＣＤＣが低減したタンパク質をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ｋ３２２、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を増強する、かつ／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、若しくは貪食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を増強する少なくとも１つの変異を、Ｆｃ領域に含む。
タンパク質の活性化ＦｃγＲへの結合を増加させる、かつ／又はＦｃエフェクター機能を増強するために変異させることが可能なＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６，２９０，２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６、又は４３０（ＥＵインデックスに従う残基番号付け）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
ＣＤＣを増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ、及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
本明細書に記載の特異性変異は、配列番号１３０、１３１、及び１３２それぞれのＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
配列番号４８６、野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ
ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴ
ＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ
ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ
ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ
ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４８７、野生型ＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦ
ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ
ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ
ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ
ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４８８、野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ
ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶ
ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹ
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ
ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧ
ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの抗体の結合は、フローサイトメトリーを使用して、各受容体を発現するように操作された細胞で評価することができる。例示的な結合アッセイでは、９６ウェルプレートに２×１０５個／ウェルの細胞を播種し、ＢＳＡ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中にて４℃で３０分間ブロッキングする。細胞を、氷上で、４℃で１．５時間、試験抗体と共にインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、次いで、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、それぞれＢ２及びＢ４チャネルを使用して検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。分析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
糖鎖遺伝子操作
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインのＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のオリゴ糖成分を操作することによって増強することができる。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、公知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを除去すると、抗原結合もＣＤＣ活性も変化させることなく、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介してタンパク質のＡＤＣＣが増強される。このようなタンパク質は、二分岐の複合型のＦｃオリゴ糖を有する比較的高い脱フコシル化免疫グロブリンの発現の成功に導くと報告された異なる方法を使用して達成することができ、以下が含まれる：培養物の浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４（：２４９－６５，２０１２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０，２００２）、宿主細胞株としてのバリアントＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４）：４０５－４１５，２０１０；ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：３４６６－３４７３，２００３）、１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８，２００４）、又はβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ若しくは強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質であるキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６，２００６、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１，２００６、Ｘｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９９：６５２－６５，２００８）。
いくつかの実施形態では、本開示のＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含量を有するグリカン構造を有する。
「フコース含量」は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を意味する。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらの糖構造は、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６ ２号に記載されるような、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理サンプル（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ－並びに高マンノース構造）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦの使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性評価及び定量化され得る。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリクス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization、ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能キャピラリー電気泳動－レーザー誘起蛍光（high performance capillary electrophoresis-laser induced fluorescence、ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び特定することができる。
本明細書で使用される場合、「低フコース」又は「低フコース含量」は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、約１％～１５％のフコース含量を有することを指す。
本明細書で使用される場合、「正常フコース」又は「正常フコース含量」は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、約５０％超、典型的には８０％超又は８５％超のフコース含量を有することを指す。
抗イディオタイプ抗体
抗イディオタイプ抗体は、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗体である。
本発明はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
本発明はまた、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
抗イディオタイプ（idiotypic、Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原決定基（例えば、パラトープ又はＣＤＲ）を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原ブロッキングＩｄは、サンプル中の遊離抗原結合ドメイン（例えば、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメイン）を検出するために使用され得る。ブロッキングしないＩｄを使用して、サンプル中の全抗体（遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの）を検出することができる。Ｉｄ抗体は、抗Ｉｄが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製することができる。
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Ｉｄ抗体を使用して、いわゆる抗－抗Ｉｄ抗体を生成することもできる。抗－抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した元の抗原結合ドメインとエピトープが同一であり得る。したがって、抗原結合ドメインのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗原結合ドメインを発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Ｉｄ抗体は、本明細書の他の箇所に記載のものなどの任意の好適な技術によって変動（それにより、抗Ｉｄ抗体バリアントを産生する）、及び／又は誘導することができる。
免疫コンジュゲート（Immunoconjugates）
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメイン、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、又はＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質（本明細書ではＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質と総称する）は、異種分子にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は細胞傷害性剤である。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する、抗原結合ドメインを提供する。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む、タンパク質を提供する。
本発明はまた、検出可能な標識にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性タンパク質を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する、抗原結合ドメインを提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む、タンパク質を提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む、多重特異性タンパク質を提供する。
本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質は、前立腺がん又は乳がん細胞などのＨＬＡ－Ｇ発現細胞に治療薬を向けるために使用することができる。代替的に、内在化させた後、細胞機能を修飾することを意図する治療薬に結合させた本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質を用いて、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞を標的とすることもできる。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は細胞毒性剤でもある。
検出可能な標識にコンジュゲートした本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質は、様々なサンプルにおけるＨＬＡ－Ｇの発現を評価するために使用することができる。
検出可能な標識は、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質にコンジュゲートさせた場合、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段を介して後者を検出可能にする組成物を含む。
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、α放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユーロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
いくつかの実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、５３（すなわち、ヨウ素）～８３（すなわち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
金属原子は、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋などの＋１、＋２、又は＋３酸化状態の形態の金属イオンであり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質は、造影剤として使用することができる。
検出可能な標識にコンジュゲートしたＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質は、造影剤として使用することができる。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞傷害性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞傷害性又は細胞増殖抑制作用を誘発し得る。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の未結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α－サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボン草（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセン（tricothecenes）などの酵素活性毒素である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
いくつかの実施形態では、細胞傷害性剤は、ドラスタチン又はドロスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０～３５８４）、抗がん及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又は抗体内に遺伝子操作された任意のシステインを介して、本発明の抗体に結合することができる。
本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質は、既知の方法を使用して検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質にコンジュゲートされる。
検出可能な標識又は細胞傷害性部分は、既知の方法を使用して、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質に直接又は間接的に連結させることができる。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（diethylenetriaminepentaacetic avid、ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
いくつかの実施形態では、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質は、腎クリアランスを介して血液から除去される。
キット
本発明はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むキットを提供する。
本発明はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質を含むキットを提供する。
本発明はまた、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を含むキットを提供する。
キットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。
キットは、サンプル中のＨＬＡ－Ｇの存在を検出するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質と、ＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療剤、又はキレート化若しくは別の方法のカップリングに有用な薬剤、標識若しくは治療剤に対する抗体、又は放射線防護組成物；投与するために抗体を調製するためのデバイス又は他の材料；医薬的に許容される担体、及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含む、１つ又は２つ以上の他の要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、容器内のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインと、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、容器内のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質と、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、容器内のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キットにおけるＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、標識される。
いくつかの実施形態では、キットにおけるＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質は、標識される。
いくつかの実施形態では、キットにおけるＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質は、標識される。
いくつかの実施形態では、キットは、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９を含む、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む。
ＨＬＡ－Ｇを検出する方法
本発明はまた、サンプル中のＨＬＡ－Ｇを検出する方法であって、サンプルを入手することと、サンプルを本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインと接触させることと、サンプル中の結合したＨＬＡ－Ｇを検出することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、滑液、循環細胞、組織に会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科的に切除された組織、穿刺吸引を含む生検材料）、組織プレパラートなどに由来し得る。
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、既知の方法を使用して検出することができる。例示的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、又は本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。例示的な標識及び部分は、ルテニウム、１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ－ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ－ヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料である。
本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインは、サンプル中のＨＬＡ－Ｇを検出するための様々なアッセイで使用することができる。例示的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）、又はＥＬＩＳＡアッセイである。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。ＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質は、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメイン、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を含む。
本発明はまた、ＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質又はその断片のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５０のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５１のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５２のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５３のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５４のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５５のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５６のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５７のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５８のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５９のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６０のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６１のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６２のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６３のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６４のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６５のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６６のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６７のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６８のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号６９のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７又は６９のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬをコードする、単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２４８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２４９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５０のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５３のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５７のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２５９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６０のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６２のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６３のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６４のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６５のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６６のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６７のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６８のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号２６９のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本開示のいくつかの実施形態はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む、単離又は精製核酸を提供する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェンシー条件」は、ポリヌクレオチドが、非特異的なハイブリダイゼーションよりも強い検出可能な量で標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又は点在するミスマッチをほんのわずかに含むポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列とマッチしたいくつかの小領域（例えば、３～１２塩基）を有することになったランダム配列と識別する条件を含む。そのような相補的な小領域は、１４～１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、それらが容易に識別可能となる。比較的高ストリンジェンシーな条件は、例えば、約５０～７０℃の温度で約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌ又は等価物によって提供されるものなど、低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間の不一致を、たとえあったとしても、ほとんど許容しない。条件は、漸増量のホルムアミドの添加によって、よりストリンジェントになり得ることが、概ね理解される。
本開示のポリヌクレオチド配列は、意図とする宿主細胞においてヌクレオチド配列を発現させる１つ又は２つ以上の制御エレメント（例えばプロモータ又はエンハンサ）に動作可能に連結し得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。プロモータは、強い、弱い、組織特異的、誘導性、又は発生段階特異的なプロモータであってよい。使用され得る例示的なプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載される実施形態での使用に好適である。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられる。メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、タンパク質キナーゼＲ２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素、Ｍｘ遺伝子、ＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（interferon-stimulated response element、ＩＳＲＥ）を含有するプロモータなどの誘導性プロモータを使用してもよい。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本開示はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってもよい。本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質の発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に動作可能に連結され得る。そのような調節エレメントとしては、転写プロモータ、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製起点、発現する遺伝子に連結された好適なプロモータ及びエンハンサ、他の５’又は３’隣接非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプタ部位、又は転写終結配列を含んでいてもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた、組み込まれ得る。
発現ベクターは、天然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含み得る。天然に存在しない又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間連結は、ベクターの転写又は複製を阻害しない。
ベクターが適切な宿主に組み込まれた後、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされる本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳制御配列は、ウイルス源により提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，３ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）によって記載されるように構築され得る。
本開示のベクターはまた、１つ又は２つ以上の内部リボソーム侵入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列を融合ベクターに含めることは、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含み、その部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターの成分は、近接して連結されてもよいか、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサー」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよいか、又は別の方法で位置付けられてもよい。また、調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフが、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
本開示のベクターは、環状であっても線形であってもよい。これらは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来していてよい。
組換え発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のためのいずれか、又はその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
更に、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製され得る。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞に対し薬剤（例えば、薬物）に対する感受性を付与し、細胞が薬剤と接触したとき又は薬剤に曝露されたときに細胞を死に至らしめる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野において既知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（Herpes Simplex Virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。
ベクターはまた、当技術分野において周知の選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは、陽性及び陰性選択マーカーを含む。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性）、栄養要求性宿主における原栄養を提供するための補完などを含む。例示的なマーカー遺伝子としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ペニシリン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、ヒスチジノール×耐性遺伝子）、グルタミン合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ誘導体、又は６－メチルプリン選択用の細菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子が挙げられる（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８－１７４３（２０００））。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、目的のポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。追加のベクターとしては、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物発現ベクターとしては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってよい。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５０のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５１のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５２のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５３のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５４のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５５のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５６のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５７のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６０のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６１のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６２のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６３のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６４のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６５のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６６のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６７のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６８のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号６９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬをコードする、ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２４８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２４９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２５９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６８のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２６９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
また、本発明は、本発明の１つ又は２つ以上のベクターを含む、宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代においてある特定の改変が生じることがあるため、そのような後代は親細胞と同一ではないことがあるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）などの桿菌（bacilli）、及びサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、及び様々なシュードモナス種（Pseudomonas species）などの他の腸内細菌科である。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレビジアエ（S.cerevisiae））及びピキア（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）、及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）ネズミ細胞株などのハイブリドーマ又は骨髄腫の細胞株などの不死化細胞株が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（Chinese Hamster Ovary、ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
本開示はまた、Ｋ２結合タンパク質を発現する条件で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質を回収することと、を含む、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質を産生する方法を提供する。タンパク質を作製し、それを精製する方法は既知である。（化学的に又は組換えによって）合成された後、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従ってＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質を精製することができる（全般的には、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照）。対象タンパク質は、実質的に純粋、例えば、純度が少なくとも約８０％～８５％、純度が少なくとも約８５％～９０％、純度が少なくとも約９０％～９５％、又は純度が少なくとも約９８％～９９％、若しくはそれ以上であってよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質以外の巨大分子などの夾雑物を含んでいなくてよい。
標準的な分子生物学的方法を使用して、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
修飾ヌクレオチドを使用して、本開示のポリヌクレオチドを生成することができる。例示的な修飾ヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５″－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンである。
医薬組成物／投与
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
本開示はまた、本開示のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメイン及びＨＬＡ－Ｇ以外の腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物を提供する。
本開示のＨＬＡ－Ｇ結合タンパク質は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。これらの溶液は滅菌され、概して粒子状物質を含まない。これらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容可能な補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含むことができる。
医薬組成物に関して本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される」という用語は、動物及び／又はヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
治療及び使用方法
本開示はまた、治療に使用するための、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、細胞増殖性障害の治療に使用するための、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がんの治療に使用するための、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、治療に使用するための医薬品の製造に使用するための、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、細胞増殖性障害の治療に使用するための医薬品の製造に使用するための、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、がんを治療するための医薬品の製造に使用するための、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質を提供する。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を対象に投与してがんを治療することを含み、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、方法を提供する。
本開示はまた、対象におけるがんを治療する方法であって、治療有効量のＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性タンパク質を対象に投与して、がんを治療することを含み、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、方法を提供する。
本開示の更なる態様は、細胞増殖性障害の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重又は多重特異性タンパク質を対象に投与することを含む、方法である。他の実施形態では、本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、二重又は多重特異性タンパク質が対象に投与される。
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、細胞増殖性疾患は、がんである。他の実施形態では、がんは、肺がん、膵臓がん、腎がん、頭頸部がん、卵巣がん、食道がん、乳がん、子宮がん、黒色腫、神経芽種、膠芽腫、大腸がん、胃がん、副甲状腺がん、膀胱がん、肝臓がん、肝細胞がん、胸膜中皮腫、前立腺がん、胆管がん、甲状腺がん、胎児性がん、セミノーマ、ブドウ膜黒色腫、褐色細胞腫、奇形腫、胸腺腫、副腎皮質がん、星状細胞腫、滑膜肉腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄白血病（acute myeloid leukemia、ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ（multiple myeloma、ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、及びＢ細胞慢性リンパ性白血病からなる群から選択される。
他の実施形態では、がんは、肺がんである。他の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（non-small cell lung cancer、ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（small cell lung cancer、ＳＣＬＣ）、又は肺腺がんである。他の実施形態では、がんは、膵臓がんである。他の実施形態では、がんは、腺がん、例えば、転移性腺がん（例えば、肺腺がん、胃腺がん、又は膵臓腺がん）である。
他の実施形態では、腎がんは、淡明細胞型腎細胞がん（Clear Cell Renal Cell Carcinoma、ＣＣＲＣＣ）である。
他の実施形態では、腎がんは、乳頭状タイプである。
他の実施形態では、卵巣がんは、卵巣、腹膜、又は卵管の高悪性度漿液性がんである。
他の実施形態では、卵巣がんは、監視することができる上昇した血液マーカー（例えば、ＣＡ１２５）又はがん関連流体を有する。
他の実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん（triple-negative breast cancer、ＴＮＢＣ）である。
別の態様では、本開示は、（ａ）本開示の、ＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及び第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、前述の二重又は多重特異性タンパク質のうちのいずれか１つを含む組成物と、（ｂ）細胞増殖性障害を治療又は進行を遅延させるために、対象に組成物を投与するための指示書を含む添付文書と、を含む、キットを特色とする。
前述の使用又は方法のいずれかにおいて、対象はヒトであってよい。
実施形態：
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１）ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｂ）配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｃ）配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｄ）配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｅ）配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｆ）配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｇ）配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｈ）配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｉ）配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
ｊ）配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質。
２）
ａ）それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
ｂ）それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
ｄ）それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
ｅ）それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
ｆ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
ｇ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
ｈ）それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
ｉ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載の単離タンパク質。
３）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、実施形態１又は２に記載の単離タンパク質。
４）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、実施形態３に記載の単離タンパク質。
５）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、実施形態３に記載の単離タンパク質。
６）ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態５に記載の単離タンパク質。
７）Ｌ１が、
ａ）約５～５０個のアミノ酸、
ｂ）約５～４０個のアミノ酸、
ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む、実施形態６に記載の単離タンパク質。
８）Ｌ１が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、実施形態６に記載の単離タンパク質。
９）Ｌ１が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の単離タンパク質。
１０）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
１１）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
ｂ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
ｃ）配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
ｄ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
ｅ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
ｆ）配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
ｈ）配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
ｉ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｊ）配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、実施形態１０に記載の単離タンパク質、
１２）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
１３）タンパク質が、半減期延長部分にコンジュゲートされる、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
１４）半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである、実施形態１３に記載の単離タンパク質。
１５）単離タンパク質が、単一特異性タンパク質である、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
１６）単離タンパク質が、多重特異性タンパク質である、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
１７）多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、実施形態１６に記載の単離タンパク質。
１８）多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、実施形態１６に記載の単離タンパク質。
１９）免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域のその断片を更に含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
２０）Ｉｇ定常領域の断片が、Ｆｃ領域を含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２１）Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ２ドメインを含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２２）Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ３ドメインを含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２３）Ｉｇ定常領域の断片が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２４）Ｉｇ定常領域の断片が、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２５）Ｉｇ定常領域の断片が、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、実施形態１９に記載の単離タンパク質。
２６）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端にコンジュゲートされる、実施形態１９～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
２７）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端にコンジュゲートされる、実施形態１９～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
２８）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、第２のリンカー（Ｌ２）を介してＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる、実施形態１９～２７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
２９）Ｌ２が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、実施形態４１に記載の単離タンパク質。
３０）多重特異性タンパク質が、リンパ球上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、実施形態１６～２９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
３１）リンパ球が、Ｔリンパ球である、実施形態３０に記載の単離タンパク質。
３２）Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、実施形態３０に記載の単離タンパク質。
３３）リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態３０に記載の単離タンパク質。
３４）多重特異性タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合ドメインを含む、実施形態１６～３３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
３５）多重特異性タンパク質が、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む、実施形態３４に記載の単離タンパク質。
３６）ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号３６１の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３６９のＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４０のＶＬ、
ｃ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
ｄ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４１のＶＬ、
ｅ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４２のＶＬ、
ｆ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４３のＶＬ、
ｇ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４４のＶＬ、
ｈ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４５のＶＬ、
ｉ）配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、
ｊ）配列番号３４６のＶＨ及び配列番号３４７のＶＬ、又は
ｋ）配列番号３４８のＶＨ及び配列番号３４９のＶＬを含む、実施形態４８に記載の単離タンパク質。
３７）Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１９～３６のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
３８）Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態１９～３７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
３９）タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態３８に記載の単離タンパク質。
４０）Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態１９～３７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
４１）タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態４０に記載の単離タンパク質。
４２）ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態３８～４１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
４３）Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片が、タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、実施形態１９～４２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
４４）タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態４３に記載の単離タンパク質。
４５）タンパク質が、Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、実施形態１９～４４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
４６）Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態４５に記載の単離タンパク質。
４７）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、単離多重特異性タンパク質。
４８）リンパ球抗原が、Ｔ細胞抗原である、実施形態４７に記載の単離多重特異性タンパク質。
４９）Ｔ細胞抗原が、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である、実施形態４７に記載の単離多重特異性タンパク質。
５０）リンパ球抗原が、ＮＫ細胞抗原である、実施形態４７に記載の単離多重特異性タンパク質。
５１）リンパ球抗原が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである、実施形態４７～５０のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
５２）リンパ球抗原が、ＣＤ３εである、実施形態５１に記載の単離多重特異性タンパク質。
５３）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む、実施形態４７～５２のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
５４）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂを含む、実施形態５３に記載の単離多重特異性タンパク質。
５５）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、実施形態５３に記載の単離多重特異性タンパク質。
５６）ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又はＶＬ、Ｌ１、及びＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、実施形態５５に記載の単離多重特異性タンパク質。
５７）Ｌ１が、
ａ）約５～５０個のアミノ酸、
ｂ）約５～４０個のアミノ酸、
ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、又は
ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む、実施形態５６に記載の単離多重特異性タンパク質。
５８）Ｌ１が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、実施形態５７に記載の単離多重特異性タンパク質。
５９）Ｌ１が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、実施形態５８に記載の単離多重特異性タンパク質。
６０）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号７０、７３、７５、７８、８１、又は８５のＨＣＤＲ１、配列番号７１、７６、７９、８２、又は８６のＨＣＤＲ２、配列番号７２、７４、７７、８０、８３、８４、又は８７のＨＣＤＲ３、配列番号８８、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、又は１０２のＬＣＤＲ１、配列番号８９又は１０３のＬＣＤＲ２、及び配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、又は１０４のＬＣＤＲ３を含む、実施形態４７～５９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６１）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、
ａ）それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
ｂ）それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
ｄ）それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
ｅ）それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
ｆ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
ｇ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
ｈ）それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
ｉ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態４７～６０のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６２）ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
ｂ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
ｃ）配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
ｄ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
ｅ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
ｆ）配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
ｈ）配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
ｉ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
ｊ）配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、実施形態４７～６１のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６３）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む、実施形態４７～６１のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６４）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、実施形態４７～６３のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６５）リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインが、
ａ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３６９のＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４０のＶＬ、
ｃ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
ｄ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４１のＶＬ、
ｅ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４２のＶＬ、
ｆ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４３のＶＬ、
ｇ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４４のＶＬ、
ｈ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４５のＶＬ、
ｉ）配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、
ｊ）配列番号３４６のＶＨ及び配列番号３４７のＶＬ、又は
ｋ）配列番号３４８のＶＨ及び配列番号３４９のＶＬを含む、実施形態４７～５６のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６６）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又はリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインが、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる、実施形態４７～６５のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
６７）ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片との間、及びリンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む、実施形態６６に記載の単離多重特異性タンパク質。
６８）Ｌ２が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、実施形態６７に記載の単離多重特異性タンパク質。
６９）第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態６６～６８のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
７０）第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態６６～６９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
７１）多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態７０に記載の単離多重特異性タンパク質。
７２）第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、多重特異性タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、実施形態６６～６９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
７３）多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態７２に記載の単離多重特異性タンパク質。
７４）ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態７０～７３のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
７５）第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、実施形態６６～７４のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
７６）多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態７５に記載の単離多重特異性タンパク質。
７７）第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異、及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、実施形態６６～７６のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
７８）第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第１のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異及び／又は第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは第２のＩｇ定常領域の断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、実施形態７７に記載の単離多重特異性タンパク質。
７９）第１のＩｇ定常領域又は第１のＩｇ定常領域の断片、及び第２のＩｇ定常領域又は第２のＩｇ定常領域の断片が、以下の変異：
ａ）第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、又は
ｂ）第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、及び第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む、実施形態６６～７８のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
８０）治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた、実施形態１～４６のいずれかに一項に記載の単離タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
８１）実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
８２）実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
８３）実施形態８２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
８４）実施形態８３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
８５）実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質を産生する方法であって、タンパク質を発現する条件で実施形態８４に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生されたタンパク質を収集することと、を含む、方法。
８６）治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた、実施形態４７～７９のいずれかに一項に記載の単離多重特異性タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
８７）実施形態４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
８８）実施形態４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
８９）実施形態８８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
９０）実施形態８９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
９１）実施形態４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質を産生する方法であって、多重特異性タンパク質を発現する条件で実施形態９０に記載の宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって産生された多重特異性タンパク質を収集することと、を含む、方法。
９２）対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現がんを治療する方法であって、治療有効量の、実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、実施形態４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、実施形態８０若しくは８６に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態８１若しくは８７に記載の医薬組成物を、ＨＬＡ－Ｇ発現がんを治療するのに十分な時間の間、対象に投与することを含む、方法。
９３）対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、実施形態４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、実施形態８０若しくは８６に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態８１若しくは８７に記載の医薬組成物を、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間の間、対象に投与することを含む、方法。
９４）ＨＬＡ－Ｇ発現がんが、肺がん、膵臓がん、腎がん、頭頸部がん、卵巣がん、食道がん、又は乳がんである、実施形態９２～９３のいずれか一項に記載の方法。
９５）単離タンパク質又は単離多重特異性タンパク質が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、実施形態９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
９６）第２の治療剤が、手術、化学療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態９５に記載の方法。
９７）対象におけるがんの存在を検出する方法であって、がんを有することが疑われる対象に実施形態８０又は８６に記載の免疫コンジュゲートを投与することと、免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによってがんの存在を検出することと、を含む、方法。
９８）実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、実施形態４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、実施形態８０若しくは８６に記載の免疫コンジュゲート、又は実施形態８１若しくは８７に記載の医薬組成物を含む、キット。
９９）実施形態１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
１００）ＨＬＡ－Ｇ上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、エピトープが、ＨＨＰＶＦＤＹＥ（配列番号４８５）のアミノ酸配列及びＶＰＳを含む、不連続エピトープである、単離タンパク質。
１０１）配列番号４７８又は４７９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
１０２）配列番号４７８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
１０３）配列番号４７９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
１０４）配列番号４９０のアミノ酸配列を含む、実施形態１０２に記載の単離タンパク質。
１０５）配列番号４８９及び４４７のアミノ酸配列を更に含む、実施形態１０２又は１０４に記載の単離タンパク質。
１０６）配列番号４３９のアミノ酸配列を更に含む、実施形態１０５に記載の単離タンパク質。
１０７）配列番号４６５及び４６８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
１０８）配列番号４６６及び４６９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
１０９）配列番号４６７及び４７０のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
本明細書において開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。
実施例１．ＨＬＡ－Ｇ細胞株の生成。
ＭＨＣクラスＩタンパク質：ＨＬＡ－Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８９２）、ＨＬＡ－Ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１８４６４）、ＨＬＡ－Ｃ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５０８）、及びＨＬＡ－Ｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１３７４７）を含む全てのＨＬＡの発現を欠く（したがって、ＮＫ細胞ベースの殺傷に好適である）Ｋ５６２慢性骨髄性白血病細胞株（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２４３）を、ｐＣＤＨレンチウイルスベクターを使用して形質導入して、レンチウイルス粒子においてＨＬＡ－Ｇ１－ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）－β－２－ミクログロブリン（β２Ｍ、ＬＰＰ－ＣＳ－Ｚ７４１２－Ｉ００３５－０２－２００、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）又はヒトＨＬＡ－Ｇ（Ｃ４２Ｓ）－ＩＲＥＳ－β２Ｍ（ＬＰＰ－ＣＳ－Ｚ７４１２－Ｉ００３５－０１－２００、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）を発現させ、ＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ中で培養した。第１継代における、安定なＨＬＡ－Ｇ発現を確実にするための、１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１１１３８０３）での選択。密度がおよそ３～４日ごとに約３×１０６個／ｍｌに達したら、細胞を１：１０に分割した。
実施例２：ＨＬＡ－Ｇ抗体の生成。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）トランスジェニックヒト化ラットを使用して生成した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）は、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座（ラットＣＨ遺伝子座に連結された天然立体構造の２２のヒトＶＨ、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含む）を、完全なヒトＩｇＬ遺伝子座（Ｊκ－Ｃκに連結された１２のＶκ及びＪλ－Ｃλに連結された１６のＶλ）と共に含有する。（例えば、Ｏｓｂｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９０（４）：１４８１－１４９０を参照のこと）。したがって、このラットは、ラット免疫グロブリンの発現減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチ及び体細胞変異を受けて、完全にヒトの可変領域を有する高親和性キメラヒト／ラットＩｇＧモノクローナル抗体が生成される。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）の調製及び使用、並びにこのようなラットが有しているゲノム改変は、国際公開第１４／０９３９０８号に記載されている。
ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラットを、組換えヒトＨＬＡ－Ｇ１又は組換えヒトＨＬＡ－Ｇ５のいずれかのαサブユニット、α１、α２、及びα３ドメインを含有するが、膜貫通領域を欠く、β２ｍサブユニット及びヒストンＨ２Ａに融合されたＨＬＡ－Ｇの可溶性アイソフォーム、ＨＬＡ－Ｇ１を発現するＫ５６２細胞、又はＣ４２Ｓ変異を有するＨＬＡ－Ｇ１細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含む構築物を使用して免疫した（表１）。場合によっては、安定性を高めるためにヒストンＨ２Ａペプチドを抗原に融合させた。表４は、抗原の配列を示す。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）ラットの免疫化は、ベルギーで行った。
表４．抗体を生成するために使用される抗原の配列。
Ｈ２Ａペプチドに下線を付す。β２Ｍサブユニットを太字で強調する。Ｈｉｓ、Ａｖｉ－、及びＧｌｙ－Ｓｅｒタグは、イタリック体である。
ＨＹＢ：４２０については、ＯｍｎｉＲａｔを、組換えヒトＨＬＡ－Ｇ１、ヒトＨＬＡ－Ｇ５、及びカニクイザルＭａｆａ－ＡＧ（ＨＬＡ－Ｇ１のホモログ）タンパク質を用いた反復免疫複数部位（Repetitive Immunizations Multiple Site、ＲＩＭＭＳ）プロトコルに従うことによって、週２回、合計１２回の追加免疫のために免疫した。最終細胞追加免疫を、Ｋ５６２細胞由来のｈＨＬＡ－Ｇ１ Ｋ５６２発現細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４３（商標））を使用して行った。血清力価は、免疫原をプレート上にコーティングした固相ＥＬＩＳＡによって決定した。流入領域リンパ節を、ハイブリドーマ生成のためのＦＯ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６４６（商標））とのリンパ球融合のために採取した。
ＨＹＢ：４２３に関しては、ＯｍｎｉＲａｔをヒトＨＬＡ－Ｇ ｐＤＮＡ（ｐＤＲ００００５７４４１（表３）；Ｃ＞Ｓバリアント）で脛骨筋を介して免疫し、その直後にインビボ電気穿孔を複数回行った。ラットは、ヒト及びカニクイザルＨＬＡ－Ｇ過剰発現細胞の両方の組み合わせの最終追加免疫を受けた。流入領域リンパ節を収集し、ハイブリドーマ生成のためにＦＯ骨髄腫細胞と融合させた。
ＨＹＢ：４２１については、ＯｍｎｉＲａｔをヒトＨＬＡ－Ｇ ｐＤＮＡで各脛骨筋に免疫し、続いてインビボ電気穿孔を行った。力価を評価し、２５日目に０～８００の範囲であった。ラットを数ヶ月間休ませ、次いでｐＤＮＡで更に免疫し、続いてヒトＨＬＡ－Ｇを外因的に過剰発現するＫ５６２細胞で最終追加免疫した。より低い流入領域リンパ節を下流のハイブリドーマ生成に使用した。
下流スクリーニングのための抗体クローンを選択するために、ハイブリドーマ上清を、ヒトＨＬＡ－Ｇのみを発現する細胞に結合し、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃを外因的に発現する細胞、又は細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原を発現しない野生型Ｋ５６２細胞には結合しないそれらの能力についてスクリーニングした。Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｇへの＞２０倍高い結合及びＫ５６２－ＨＬＡ－Ａ／Ｂ／Ｃへの１０倍低い結合（アイソタイプ対照と比較して）を示した上清を、ｖ領域配列決定及びクローニングのために選択した。モノクローナル抗体を、エフェクター機能を欠くサイレントフォーマット（ＩｇＧ４ ＰＡＡ又はＩｇＧ１ ＡＡＳ、ここで、「ＰＡＡ」は、ＥＵ番号付けにおけるＰ２２８Ｓ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａを示し、「ＡＡＳ」は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ｓの変異を示す）及び正常なエフェクター機能を有する活性フォーマット（ＩｇＧ１）の両方で生成した。抗体をＣＨＯ細胞からの上清中で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィによって単離した。次いで、組換え抗体を、ＨＬＡーＧ発現細胞に対する選択性について、並びに組換えＨＬＡーＧ（ＭＨＧＷ２）に結合するそれらの能力について（上記のように）再スクリーニングした。これらの分析から、４８個の独特なｖ領域のパネルを同定し、８個の独特なｖ領域を更なる分析のために選択した。ＭＨＧＢ６８８及びＭＨＧＢ６９４に由来する、これらの８つのｖ領域のうちの２つは、それぞれＭＨＧＢ７３８及びＭＨＧＢ７３７をもたらすように生殖系列最適化した。
実施例３．抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の構造的特性評価
選択抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の可変ドメインは、ｆａｂフォーマット、ＶＨ－リンカーＶＬ配向のｓｃＦｖフォーマット、又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のｓｃＦｖフォーマットで発現させた。
可変ドメインＶＨ、ＶＬ、及びＣＤＲ
表５は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表６は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＫａｂａｔ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表７は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＫａｂａｔ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表８は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＣｈｏｔｈｉａ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表９は、抗ＨＬＡ－ＧのＣｈｏｔｈｉａ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１０は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＩＭＧＴ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１１は、抗ＨＬＡ－ＧのＩＭＧＴ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。表１２は、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＡｂＭ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を示す。表１３は、抗ＨＬＡ－ＧのＡｂＭ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を示す。
生殖系列最適化
抗体のｖ領域配列を、潜在的な翻訳後修飾のリスク、生殖系列適合性、及びｓｃＦｖとしてフォーマットするそれらの能力について分析した。２つの抗体、ＭＨＧＢ６９４及びＭＨＧＢ６８８を、生殖系列最適化した。ＭＨＧＢ６９４のｖ領域は、２つの生殖系列変異（Ｅ４６Ｄ及びＮ７７Ｈ）を含有し、したがって、このｖ領域を、これらの部位における生殖系列配列へのこれらの残基の逆変異によって最適化して、ＶＨドメインにおけるＤ４６Ｅ及びＨ７７Ｎの変異によってＭＨＧＢ７３７可変領域を生成した。ＭＨＧＢ６８８のｖ領域は、ＶＨドメインにおけるＥ１Ｑ、Ｌ５Ｑ、Ｅ６Ｑ、及びＳ７１Ｐの変異によって、及びＶＬにおけるＫ３０Ｅ、Ｇ６６Ｖの変異によって同様に最適化した。本発明者らは、ＭＨＧＢ６８８が、脱アミド化のリスクを提示する９２～９３位（Ｋａｂａｔ）での「ＮＳ」モチーフも含有することを見出した。ＭＨＧＢ６７２のＶＬは、９２～９３位に「ＨＳ」を含有することを除いて、同一のＬＣ－ＣＤＲを有していたので、本発明者らは、Ｎ９２Ｈを変異させた。この変化の組み合わせは、ＭＨＧＢ７３８をもたらした。
Ｆａｂ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ
ＨＬＡ－Ｇ特異的ＶＨ／ＶＬドメインを遺伝子操作して、抗体フォーマットで、又はｓｃＦｖとして、又は二重特異性抗体のアームとして（Ｆａｂ－Ｆｃ又はｓｃＦｖ－Ｆｃのいずれかとして）発現させた。抗体フォーマット及びＦａｂ－Ｆｃ二重特異性アームフォーマットは、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３としての重鎖及びＶＬ－ＣＬとしての軽鎖を含み、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４として発現させた。ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ－Ｆｃ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ－Ｆｃ配向のいずれかを含んだ。ｓｃＦｖに使用したリンカーは、上記の配列番号８のリンカーであった。ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＦａｂ－Ｆｃを使用して、実施例１０に記載されるように二重特異性抗体を生成した。
表１４は、選択された抗ＨＬＡーＧ抗体のＨＣアミノ酸配列を示す。表１５は、選択された抗ＨＬＡーＧ抗体のＬＣアミノ酸配列を示す。表１６に、選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＨＣ及びＬＣ ＤＮＡ配列番号を要約する。表１７は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向の選択されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す。表１８は、選択されたｓｃＦｖ－Ｆｃのアミノ酸配列を示す。表１９は、ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの選択された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－Ｆｃ ＤＮＡ配列番号を示す。
配列番号２２６
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＣＴＡＴＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号２２７
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配列番号２２８
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配列番号２４２
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配列番号２４３
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配列番号２４４
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配列番号２４５
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配列番号２４６
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配列番号２４７
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実施例４．抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の生物物理学的特性評価
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の熱安定性。
元のｖ領域及び生殖系列最適化ｖ領域を、ｓｃＦｖフォーマットにおける熱安定性についてスクリーニングした。簡潔に述べると、ｖ領域をｓｃＦｖフォーマットにクローニングし、Ｅｃｏｌｉにおいて発現させた。培養上清を、組換えＨＬＡ－Ｇに結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡによって評価した。また、上清サンプルに５５、６０、又は６５℃のいずれかで熱ショックを与え、熱ショックを与えたサンプルの結合を非加熱サンプルと比較した。この分析は、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合のｖ領域の熱安定性の推定値を提供した。この分析に基づいて、それぞれＭＨＧＢ６９４及びＭＨＧＢ６８８の生殖系列最適化バージョンである、ＭＨＧＢ７３２、ＭＨＧＢ７３７、及びＭＨＧＢ７３８が好ましかった。
図１及び表２０は、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた場合の熱処理後の組換えＨＬＡ－Ｇに結合するｖ領域の能力を示す。Ｖ領域をＥｃｏｌｉからの上清においてｓｃＦｖとして発現させ、組換えＨＬＡ－Ｇに結合するそれらの能力についてＥＬＩＳＡによって分析した。サンプルを室温で、又は５５、６０、若しくは６５℃で１０分間熱処理した後に試験した。Ｂ２３は、アイソタイプ対照であった。
結合特異性及び親和性
ＩｇＧ１ ｍＡｂフォーマットのｖ領域を、ＨＬＡ－Ｇを発現するが他のＭＨＣクラスＩ分子を発現しない細胞に特異的に結合するそれらの能力について試験した（表２１）。簡単に説明すると、１．５×１０７個の細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、７ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、１０分間インキュベートした。インキュベーション後、８ｍＬのウシ胎児血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）を添加し、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離することによって洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中１×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。次いで、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離することによって洗浄し、ヤギ抗ヒトＦｃ Ａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９－６０６－０９８）を補充した染色緩衝液に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１５０μＬの染色緩衝液を添加し、細胞を３００×ｇで５分間の遠心分離によって洗浄した。細胞を２００μＬのランニング緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）プルロニック酸を補充した染色緩衝液）に再懸濁し、３００×ｇで５分間遠心分離することによって洗浄した。細胞を３０ｍＬのランニング緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって抗体結合について分析した。
次に、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）を使用して、ｍＡｂとして組換えＨＬＡ－Ｇに結合するそれらの能力について試験した。ＳＰＲは、複合体の形成及び解離時の質量の変化を測定することによって、２つの結合パートナー間の相互作用の強度を試験するための無標識技術である。簡潔に述べると、抗体をセンサチップ上に固定化し、これをヤギ抗ヒトＦｃと結合させた。可溶性ＨＬＡ－Ｇ１細胞外ドメイン（ＭＨＧＷ８）を、固定化した抗体上に流し、会合／解離応答を監視した。センサグラムを１：１ラングミュアモデルに適合させることによって、速度情報（オンレート及びオフレート定数）を抽出した。結合親和性（ＫＤ）は、速度定数の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として報告した。抗体親和性（Ｋｄ）は、約７７ｐＭ～２．６ｎＭの範囲であり、表２２に示される。
実施例５．リガンド遮断
ＨＬＡ－Ｇは、ある特定の腫瘍型上で過剰発現され、したがって、腫瘍細胞のマーカーとして機能することができる。更に、ＨＬＡ－Ｇは、ＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞上で発現されるリガンドＩＬＴ２及びＩＬＴ４に結合する４，５。ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ２／ＩＬＴ４との間の相互作用は、ＮＫ細胞活性の阻害をもたらす。したがって、本発明者らは、ＩＬＴ２／４と競合的にＨＬＡ－Ｇに結合する抗体が、腫瘍細胞とＮＫ細胞との間の阻害性相互作用を防止し、ＮＫ媒介性腫瘍細胞殺傷の増加をもたらすと仮定した。この仮説に取り組むために、本発明者らはまず、競合アッセイを使用して、抗体がＨＬＡ－ＧとＩＬＴ２／４との間の相互作用を遮断し得るかどうかをアッセイした。ＨＬＡ－Ｇ－デキストラマー複合体とＩＬＴ２又はＩＬＴ４受容体を外因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との間の結合は、蛍光シグナルをもたらす。ＨＬＡ－Ｇ－デキストラマーとＩＬＴ－２／４細胞との間の相互作用と競合するｍＡｂの添加は、蛍光シグナルの減少をもたらす。蛍光シグナル阻害の逆数は、ｍＡｂのリガンド遮断阻害に関連した（表２２）。簡単に説明すると、組換えビオチン化ＨＬＡ－Ｇ１（ＭＨＧＷ８）は、ストレプトアビジンＡＰＣ－デキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘカタログ番号ＤＸ０１－ＡＰＣ）に、１つのデキストラマー分子当たりおよそ４つのＨＬＡ－Ｇ１タンパク質の最終比まで結合した。デキストラマー－ＨＬＡ－Ｇ複合体を、ＩＬＴ－２を外因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＩＬＴ－４を外因的に発現する細胞と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を各濃度で添加し、デキストラマー－ＨＬＡ－Ｇ複合体と共に３０分間、℃でインキュベートした。細胞を添加し（２５，０００細胞）、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞とデキストラマーＨＬＡ－Ｇ複合体との混合物を遠心分離によって洗浄し、３０μＬのランニング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ ＢＤカタログ番号５５４６５７）に再懸濁した。再懸濁した混合物を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｐｌｕｓを使用するフローサイトメトリーによって蛍光シグナルについて分析した。ゲーティングは、最初に一重項細胞に対して、次いでＳｙｔｏｘ（商標）Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して生細胞に対して、次いでＩＬＴ－２／４を発現する細胞についてはＧＦＰに対して、次いで結合したデキストラマー－ＨＬＡ－Ｇ複合体についてはＡＰＣに対して行った。ＭＨＧＢ７３７を除く全ての抗体は、ＩＬＴ４とのＨＬＡ－Ｇ相互作用を阻害することができ、ＭＨＧＢ７３７及びＭＨＧＢ６８７を除く全ての抗体は、ＩＬＴ２との相互作用を阻害することができた（表２３）。これは、このキャンペーンにおいて発見された抗体が、腫瘍を標的とし、腫瘍細胞による免疫阻害を軽減することの両方ができることを示唆した。
実施例６．エピトープのマッピング
次いで、本発明者らは、このリガンド結合の阻害が、ＨＬＡ－Ｇ上の同じ結合部位に対するＩＬＴ２／４との直接競合によるものであるかどうかを問うた。この仮説に取り組むために、本発明者らは、水素－重水素交換ベースのＬＣ－ＭＳ（実施例９に記載される）を使用して、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＭＨＧＢ７３２、又はＭＨＧＢ７３８のいずれかについてのＨＬＡ－Ｇ上のエピトープを同定した（図２）。ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８ Ａｂの両方の結合は、α３ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸残基１９１～１９８、配列ＨＨＰＶＦＤＹＥ（配列番号４８５））における同じペプチドを強力に保護し、＞３０％の重水素化レベルでの平均変化をもたらした。このペプチドはまた、ＩＬＴ２の存在下で保護され、ＩＬＴ４の存在下ではより低い程度で保護された。ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８抗体は両方とも、成熟タンパク質、配列ＶＰＳの残基２４９～２５１からなる第２のエピトープを著しく保護した（１０％～３０％の重水素化レベルでの平均変化）。エピトープをＨＬＡ－Ｇ（ＰＤＢ ＩＤ １ＹＤＰ）６の結晶構造上にマッピングしたところ、ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８ Ａｂ並びにＩＬＴ２／４についてのエピトープがα３ドメインの膜近位領域に存在することが示された。
実施例７．ＮＫ細胞ベースの細胞傷害に対する効果
次いで、本発明者らは、ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ－２／４との相互作用の阻害が、ＮＫ細胞ベースの細胞傷害を介して抗腫瘍活性を媒介し得るかどうかを問うた。これに取り組むために、本発明者らは、各可変領域を、ＩｇＧ１、又はエフェクター機能を欠くサイレントＩｇＧ４－ＰＡＡ定常領域のいずれかにクローニングした。次いで、本発明者らは、Ｆｃ受容体を発現するＮＫ細胞（ＮＫ－９２）又はＦｃ受容体を欠くＮＫ細胞（NK cell which lack Fc receptor、ＮＫＬ）のいずれかによって媒介されるＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞の細胞傷害を媒介する各抗体の能力を試験した。簡潔に述べると、ＨＬＡ－Ｇ細胞を過剰発現するＫ５６２細胞を、細胞増殖色素として機能するカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（Carboxyfluorescein succinimidyl ester、ＣＦＳＥ）で標識した。抗体を、図３Ａ～図８Ｂにおける希釈に従って９６ウェルプレートに希釈した。Ｋ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞を抗体の各ウェルに添加し、４℃で１時間インキュベートした。ＮＫＬ細胞を約１００，０００個の細胞／ウェルで添加し、混合物をＩＬ２及びＮＫｐ４６（ＮＫＬ細胞を活性化するため）の存在下、４℃で一晩（ＮＫＬ細胞）又は４時間（ＮＫ－９２細胞）インキュベートした。細胞を遠心分離によって洗浄し、生／死染色を含む緩衝液中に再懸濁した。混合物を１３０μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによって分析した。ＮＫ受容体の非存在下で細胞傷害を媒介し得る抗体は、ＨＬＡ－ＧとＩＬＴ－２／４との間の免疫チェックポイント相互作用を遮断することを介してこの相互作用を媒介すると考えられた（図３Ａ～図８Ｂ）。本発明者らは、ＩＬＴ２を遮断することができる全ての抗体（ＭＨＧＢ６８７を除く全てのＡｂ）が、２４時間アッセイにおいてＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞に対するＮＫＬ細胞媒介性細胞傷害を増強することができた（図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａ）が、ＩｇＧ１ベースの抗体のみがＦｃ受容体媒介性細胞傷害を増強することができたことを見出した。これは、Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能の非存在下であっても、リガンド遮断が重要な抗腫瘍機構として機能し得ることを示唆した。
実施例８．ｍＡｂのエフェクター機能
本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇを内因的に発現する絨毛がん細胞株ＪＥＧ－３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３６）に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍細胞殺傷を更に媒介する抗体の能力を試験した（図９）。抗体を、細胞内に一方向に浸透することができるＢＡＴＤＡ色素（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号Ｃ１３６－１００）で標識されたＪＥＧ－３細胞に添加した。細胞溶解時に、色素は、ユーロピウムを含有する溶液中に放出され、ユーロピウムは、色素と反応して蛍光キレートを形成し、その蛍光シグナルを測定することができる。一晩培養したＰＢＭＣを、５０：１のＥ：Ｔ比で、５，０００個の細胞／ウェルでＪＥＧ－３細胞に添加し、混合物を３７℃で４時間インキュベートした。細胞混合物をユーロピウム溶液に１：１０で添加し、室温で１５分間インキュベートし、６１０ｎｍでの蛍光を監視して、シグナルを決定した。１００％の殺傷についての蛍光シグナルを、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００界面活性剤と混合したＢＡＤＴＡ標識標的細胞を含有するウェルを使用して決定した。
抗ＨＬＡ－Ｇ Ａｂは、インビトロでＡＤＣＣを示し得るので、本発明者らは、この活性が増強され得るか否かを問うた。いくつかの研究は、１０％未満の末端フコシル化Ｆｃを有する抗体が、Ｆｃ受容体へのより高い親和性結合に起因して、増強されたエフェクター機能を示すことを示した７。したがって、本発明者らは、低フコースＣＨＯ宿主においてＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８を生成して、＜１０％の末端フコースを有する抗体（ＭＨＧＢ７３８．ＣＬＦ）を産生した（表２４、図１０Ａ～Ｄ）。陰性対照として、本発明者らは、Ｆｃ受容体に結合することができないＦｃ領域を有するＭＨＧＢ７３８のバージョンを生成し、このタンパク質をＭＨＧＢ７４５と称した。
正常フコース抗体及び低フコース抗体を、ＪＥＧ－３細胞（図１０Ａ）又はＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１細胞（ヒト肺腺がん細胞株、ＪＣＲＢ１０２０）（図１０Ｂ）いずれかに対するＮＫ細胞ベースのＡＤＣＣを誘導するそれらの能力について試験した。フコシルトランスフェラーゼ酵素を天然に低レベルで発現するＣＨＯ細胞中における重鎖及び軽鎖をコードする構築物を発現させることによって低フコース抗体を生成し、１０％未満のコアフコースを有する抗体の産生をもたらした。エフェクター細胞対標的細胞の比をグラフに示す。アッセイは、上記のＡＤＣＣアッセイと同じ方法で行った。ＭＨＧＢ７４５及びアイソタイプ対照の両方は、アッセイにおいてＡＤＣＣを誘導しなかった。２つのＩｇＧ１ Ａｂ、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３８は、ＡＤＣＣを誘導することができたが、低フコースＦｃ領域を有する同じ抗体は、約１０倍増強されたＡＤＣＣ活性を示した。これは、ＡＤＣＣ増強が低フコース抗体の使用によって得られ得ることを示した。
次に、本発明者らは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する抗体の能力を試験した（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。簡潔に述べると、アッセイは、ＤＭＥＭ（ＪＥＧ－３）又はＲＰＭＩ（ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１）を含有する１０％ＦＢＳ中で実行した。抗体を標的細胞に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１５～２０％（ストック濃度）のウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅカタログ番号ＣＬ３４４１－Ｓ）及び熱不活性化補体をそれぞれ２５μＬ／ウェルの体積でウェルに添加した。混合物を３７℃で４～１２時間インキュベートした。標的細胞溶解を、１００μＬのＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９２４２）試薬を添加し、続いて室温で１０分間インキュベートすることによって検出する。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ ＳＰＡＲＫ（登録商標）を用いて監視した。２つのＩｇＧ１抗体、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３８は、ＣＤＣを媒介しなかった。ＩｇＧ１ Ａｂは、ＣＤＣを媒介することができなかったので、本発明者らは、ＣＤＣ活性を特異的に増強することが示されたＫ２４８Ｅ、Ｔ４３７Ｒ（ＲＥ）変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃにｖ領域をクローニングした８。ＩｇＧ１対応物と同一のｖ領域を有するこれらのＡｂは、ＣＤＣ活性を媒介することができた。本発明者らは、ＲＥ Ｆｃバリアントが低フコースＡｂにおけるＡＤＣＣ活性増強に影響を及ぼすかどうか、及び低フコースＦｃがＲＥ ＦｃバリアントのＣＤＣ活性に影響を及ぼすかどうかを問うた。低フコース宿主（＜１０％のフコシル化Ｆｃを有する）、ＭＨＧＢ７５２、及びＭＨＧＢ７５８において産生されたＲＥ Ａｂは、低フコースＩｇＧ１ Ａｂ ＭＨＧＢ７３２及びＭＨＧＢ７３８と同一のＡＤＣＣ活性を有した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。同様に、低フコース宿主において産生されたＲＥ Ａｂは、正常フコース宿主において産生されたＲＥ Ａｂと同一のＣＤＣ活性を有した（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。
実施例９－ＣＤ３抗体の生成
免疫
抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６及びＣＤ３Ｂ４５０の生成は、米国特許出願公開第２０２０／００４８３４９号に記載されている。ＣＤ３Ｂ２１９が特色であるヒト化抗ＣＤ３ｖ領域は、市販の抗体ＳＰ３４－２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ５５１９１６）に由来した。
以下に記載のＡｂｌｅｘｉｓトランスジェニックマウスプラットフォームを使用して、追加の抗ＣＤ３抗体を生成した。１３匹のカッパマウス及び１２匹のラムダマウスを含むＡｂｌｅｘｉｓマウスを、ＴＲＣＷ５（配列番号３３６）で免疫した。ＴＲＣＷ５は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，ＪＭＢ（２０００）３０２（４）：８９９－９１６によって報告されているように、２６アミノ酸リンカーによってＣＤ３δの細胞外領域に融合されたＣＤ３εの細胞外領域で構成される。このポリペプチドは、そのＣ末端に、部位特異的ビオチン化に使用されるＣ末端Ａｖｉタグを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有していた（Ｆａｉｒｈｅａｄ ＆ Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１５）；１２６６：１７１－１８４）。
ＴＲＣＷ５（配列番号３３６）：
ＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ
マウスを週２回、７週間にわたって免疫した。４２日目に、６箇所の皮下及び２箇所の皮内注射を含む８部位に広げて５０μｇのＴＲＣＷ５及び５０μｇのＣＤ４０ ｍＡｂを投与することによって、マウスをハイブリドーマ融合のためにブーストした。最終的なブーストについては、マウスに、４．７４×１０７細胞／ｍＬで、ＣＤ３εを含むＴ細胞受容体複合体を内因的に発現するＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ細胞を２０μＬ注射した（（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９（５）：６２１－６）。
リンパ節及び脾臓をマウスから摘出し、コホートごとに融合を実施した。リンパ節細胞をカウントし、ＦＯ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１６４６））と１：１の比で合わせ、抗体スクリーニングの前に３７℃で１０日間インキュベートした。次いで、製造指示書に従って、プレート（ＥＬＩＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０２２）上に非特異的に固定化されたＴＲＣＷ５を使用するか、又はビオチン化ＴＲＣＷ５（ＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｇｅｎ）へのストレプトアビジンコンジュゲーションのいずれかによって、ハイブリドーマ融合細胞からの上清を、ＴＲＣＷ５への結合についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＥＬＩＳＡアッセイは、０．５ｕｇ／ｍＬのＴＲＣＷ５及び０．５ｕｇ／ｍＬのＨＶＥＭ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄカタログ番号３６５－ＨＶ）でプレートをコーティングすることによって、４℃で一晩実施した。４℃で一晩、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline、ＰＢＳ）中０．４％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）を添加することによって、プレートをブロッキングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を補充した１×ＰＢＳでプレートを洗浄した。各ウェルに対し、５０ｕＬのハイブリドーマ上清を適用し、室温で１時間インキュベートした。結合した抗体は、ブロッキング緩衝液で１：１０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１１５－０３６－０７１）の添加、続いて室温での３０分間インキュベートによって検出した。３，３，５，５’－テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）基質緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号３４０２２）を２５ｕＬ／ウェルで添加し、暗所で１０分間インキュベートした。２５ｕＬ／ウェルの４Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させた。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｅｐｏｃｈ２マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで発光を読み取った。バックグラウンドよりも少なくとも３倍高いシグナルを有するヒットを選択した。
２つのアッセイフォーマットの結果、４２６ヒット（ＥＬＩＳＡから２６４ヒット、ＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡから１９４、７０ヒットは両方のアッセイで同定された）が得られた。これら４２６個の初期ヒットのうち、４９個のＥＬＩＳＡ、及び３２個のＳＰＡＲＣＬ ＥＬＩＳＡヒットを確認した。陽性バインダーに対応するハイブリドーマ融合物を再度供給し、フローサイトメトリーを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞に結合する能力について試験した。結果は、平均蛍光指数（ＭＦＩ、表２５を参照されたい）に基づいて、クローン００３＿Ｆ１２、クローン０３６＿Ｅ１０、及びクローン０６５＿Ｄ０３を含む３つの抗体が、ＣＤ３を内因的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞に対して著しい結合を示すことを示唆した。クローン００３＿Ｆ１２及び０３６＿Ｅ１０（ヒトカッパマウスから）は、ＥＬＩＳＡによってヒトカッパ軽鎖について陽性であることが確認されたが、クローン０６５＿Ｄ０３（ヒトラムダマウスから）は、ヒトラムダについて陰性であった。次いで、これら３つのクローンの可変遺伝子を配列決定した。
次に、これら３つのクローンを、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞に結合する能力についてスクリーニングした。簡潔に述べると、初代ヒト及びカニクイザル汎Ｔ細胞をフロー染色緩衝液中１×１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁させ、細胞を５０，０００個の細胞／ウェルで播種した。各ウェルに、５０ｕＬのハイブリドーマ上清を添加し、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２００μＬの染色バッファを添加し、３００×Ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。Ａｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした抗マウスＩｇＧを、５０μＬの総体積で染色バッファ中２μｇ／ｍＬで添加し、氷上で３０分間インキュベートした。１５０μＬの染色バッファを添加し、３００×Ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。細胞を、１：１，０００希釈したＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎを含有するランニングバッファ３０μＬに再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで実験した。細胞をＦＣＳ対ＳＣＳでゲーティングして、残屑を除去した。シングレットをＳＣＳ－Ａ対ＳＣＳ－Ｈでゲーティングし、シングレット集団から、Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎによる低－陰性についてＢＬ１チャネルを用いて生細胞を選択した。ＲＬ１（Ａｌｅｘａ－６４７）幾何平均により試験物質を陰性対照と比較することによって、ＣＤ３結合を評価した。このアッセイにおいて、クローン０６５＿Ｄ０３は、最も高い細胞結合シグナルを示した（図１１Ａ～図１１Ｂ）。
次いで、クローン０６５＿Ｄ０３の可変領域をＩｇＧ１骨格にクローニングして、ＣＤ３Ｂ８１５と称される抗体を得た（配列を表２６に示す）。Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合についてＣＤ３Ｂ８１５を再度スクリーニングしたところ、Ｊｕｒｋａｔ細胞への陽性結合を示した。
ＣＤ３結合ドメインのヒト化及びｓｃＦｖフォーマット化
ＣＤ３Ｂ８１５のｖ領域の軽鎖（ＬＣ）を、ｓｃＦｖフォーマットでヒト化した。簡潔に述べると、ＣＤ３Ｂ８１５からのＬＣをヒトＩＧＨＶ３－２１＊０４生殖細胞系にグラフトし、ヒトからマウスへの復帰変異について２つの位置（Ｋａｂａｔに従うＹ４９Ｋ及びＬ７８Ｖ）を同定した。この結果、Ｙ４９Ｋ、Ｌ７８Ｖのいずれか、又はＹ４９Ｋ及びＬ７８Ｖの両方を有するバリアントが得られた。ＣＤ３Ｂ８１５からのＬＣはまた、９２～９３位における脱アミド化のリスクを提示するＮＳモチーフを含んでいた。したがって、生成されたいくつかのバリアントもＮ９２Ｇを含んでいた。これらのバリアント及び関連する変異を表２７に記載し、ＶＨ及びＶＬアミノ酸及び核酸配列を表２８及び２９に示す。ＣＤＲ配列を、表３０～３２に示す。
表２８は、選択された抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を示す。表２９は、選択された抗ＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬ ＤＮＡ配列を示す。表３０は、選択された抗ＣＤ３抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。表３１は、選択された抗ＣＤ３抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。表３２は、抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ及び可変ドメインを示す。図１３は、ＣＤ３Ｂ８１５、ＣＤ３Ｗ２４４、ＣＤ３Ｗ２４５、ＣＤ３Ｗ２４６、及びＣＤ３Ｗ２４７のＶＬ領域のアラインメントを示す。
コンセンサス配列
図１３は、ＣＤ３Ｂ８１５、ＣＤ３Ｗ２４４、ＣＤ３Ｗ２４５、ＣＤ３Ｗ２４６、及びＣＤ３Ｗ２４７のＶＬ領域のアラインメントを示す。配列番号３７４のコンセンサスアミノ酸配列をＶＬ領域について決定し、ＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ残基に下線を付した。
配列番号３７４
ＤＩＱＸ１ＴＱＳＰＸ２Ｘ３ＬＳＸ４ＳＸ５ＧＸ６ＲＶＸ７Ｘ８Ｘ９ＣＲＡＲＱＳＩＧＴＡＩＨＷＹＱＱＫＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＰＸ１４ＬＬＩＸ１５ＹＡＳＥＳＩＳＧＸ１６ＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＸ１７ＳＸ１８ＱＸ１９ＥＤＸ２０ＡＸ２１ＹＹＣＱＱＳＸ２２ＳＷＰＹＴＦＧＸ２３ＧＴＫＬＥＩＫ
式中、Ｘ１は、Ｌ若しくはＭである、Ｘ２は、Ｇ若しくはＳである、Ｘ３は、Ｉ若しくはＳである、Ｘ４は、Ｖ若しくはＡである、Ｘ５は、Ｐ若しくはＶである、Ｘ６は、Ｅ若しくはＤである、Ｘ７は、Ｓ若しくはＴである、Ｘ８は、Ｆ若しくはＩである、Ｘ９は、Ｓ若しくはＴである、Ｘ１０は、Ｔ若しくはＰである、Ｘ１１は、Ｎ若しくはＧである、Ｘ１２は、Ｇ若しくはＫである、Ｘ１３は、Ｓ若しくはＡである、Ｘ１４は、Ｒ若しくはＫである、Ｘ１５は、Ｋ若しくはＹである、Ｘ１６は、Ｉ若しくはＶである、Ｘ１７は、Ｎ若しくはＳである、Ｘ１８は、Ｖ若しくはＬである、Ｘ１９は、Ｓ若しくはＰである、Ｘ２０は、Ｉ若しくはＦである、Ｘ２１は、Ｄ若しくはＴである、Ｘ２２は、Ｎ若しくはＧである、又はＸ２３は、Ｇ若しくはＱである。
エピトープ同定
水素－重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）によって、ＣＤ３上のエピトープを決定した。抗体クローンＯＫＴ３をＨＤＸ実験の対照として使用し、それは、そのＣＤ３ε上のエピトープが結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＳＹ６）から知られていたためである（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１，７６７５－７６８０）。
ＨＤＸ－ＭＳのオンエクスチェンジ実験。血清アルブミンドメインに融合した２６－ａａリンカー領域と融合したＣＤ３εγで構成された１０μＬの１０μＭ ＣＤ３Ｗ２２０（配列番号３７５）を、１．２モル過剰のリガンド及び３０μＬのＨ２Ｏ又は重水素化緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．４、９５％のＤ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、又は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．４、９５％のＤ２Ｏ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と混合して、又は混合せずにオンエクスチェンジ反応を開始させた。反応混合物を１５、５０、１５０、５００、又は１，５００秒間１．２℃でインキュベートした。オンエクスチェンジした溶液を、冷却した４０μＬの８Ｍ尿素、１Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ３．０を添加することによってクエンチし、直ちに分析した。
ＣＤ３Ｗ２２０（ＣＤ３εγ－ＨＳＡ－６ｘＨｉｓ）（配列番号３７５）：
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ＨＤＸ－ＭＳデータ取得のための全般的な手順。自動ＨＤｘシステム（ＬＥＡＰ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）を用いて、ＨＤＸ－ＭＳサンプル調製を行った。カラム及びポンプは、プロテアーゼ、プロテアーゼＸＩＩＩ型（アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）由来のプロテアーゼ、ＸＩＩＩ型）／ペプシンカラム（ｗ／ｗ、１：１、２．１×３０ｍｍ）（ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、トラップ、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ（２．１×５ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、分析用、Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＬＣポンプ、ＶＨ－Ｐ１０－Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。ローディングポンプ（プロテアーゼカラムからトラップカラムに）を、９９％の水、１％のアセトニトリル、０．１％のギ酸で６００μＬ／分に設定した。勾配ポンプ（トラップカラムから分析カラムへ）は、１００μＬ／分において２０分間で０．１％ギ酸水溶液中８％→２８％のアセトニトリルに設定した。
ＭＳデータ取得。２７５℃のキャピラリー温度、分解能１５０，０００、及び質量範囲（ｍ／ｚ）３００～１，８００で、ＬＴＱ（商標）Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して質量分析を実行した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ抽出。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＨＤＸ実験の前に非重水素化サンプルのペプチド同定に使用した。ＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ，Ｍｏｄｅｓｔｏ，ＣＡ）を使用して、ＨＤＸ実験についてのＭＳ生データファイルから質量中心値を抽出した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ分析。抽出されたＨＤＸ－ＭＳデータをＥｘｃｅｌで更に分析した。全ての交換時点（１．２℃でｐＨ６．４又はｐＨ８．４）を、ｐＨ７．４及び２３℃における等価時点に変換した（例えば、１．２℃、ｐＨ６．４で１５秒は、２３℃、ｐＨ７．４で０．１５秒と等価である；表３３）。
結果。抗ＣＤ３アームとしてＣＤ３Ｗ２４５を含有する二重特異性抗体であるＫＬＣＢ９１を組換えＣＤ３εと共にインキュベートすることによって、抗原の特定のセグメントにおいて、異なるパターンの全体的な保護及び保護の程度がもたらされた。ＫＬＣＢ９１及びＯＫＴ３は両方とも、立体配座非同一エピトープを示す非連続セグメント（図１４）を保護した。保護されたセグメントをＣＤ３εの結晶構造（ＰＤＢ １ＳＹ６）にマッピングして、３次元で結合エピトープを可視化した。
ＣＤ３ε（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ０７７６６）に結合したＯＫＴ３の結晶構造と一致して、ＯＫＴ３のエピトープは、ＣＤ３εの残基２９～３７、７９～８４、及び８７～８９に及ぶペプチドからなることが見出された（配列番号３７５及び図１４）。ＣＤ３Ｗ２４５は、ＯＫＴ３のエピトープと部分的に重複するエピトープに結合し、ＣＤ３εのアミノ酸残基２９～３７、５５～６３、及び７９～８４を含んでいた（配列番号３７５及び図１４）。
熱ショック後のヒト化抗ＣＤ３ ｓｃＦｖバリアントのＣＤ３への結合。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、リンカーＧＴＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号３７６）（表３４）を使用して、ＶＨ－ＶＬ配向のｓｃＦｖとして抗ＣＤ３分子の可変領域をフォーマットし、次いで、組換えＣＤ３（ホモ二量体ＣＤ３εγ－Ｆｃ、ＣＤ３Ｗ１４７、配列番号３７７）への結合、Ｔ細胞への結合、及び熱安定性についてスクリーニングした。
ＣＤ３Ｗ１４７（配列番号３７７）：
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簡潔に述べると、ｓｃＦｖをコードしている配列を、分泌のためにＰｅｌＢリーダー配列を有するｐＡＤＬ（商標）－２２ｃベクターにクローニングした。Ｅｃｏｌｉ細胞をプラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充した２×ＹＴ微生物成長培地において３７℃で一晩成長させた。１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導し、培養物を一晩成長させた。発現後、２，２００×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってビオチン化ＣＤ３Ｗ１４７への結合について直接試験した。
ＥＬＩＳＡ分析のために、ビオチン化ＣＤ３Ｗ１４７（配列番号３７７）を２倍希釈で０．０３９ｕｇ／ｍＬ～２．５ｕｇ／ｍＬの範囲の濃度でプレート上に固定化し、続いて、室温で４５分間インキュベートした。結合したｓｃＦｖを、ニワトリ抗ＨＡ－西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して検出し、次いで、化学発光基質で検出した。ＣＤ３Ｂ８１５に由来する全ての試験したｓｃＦｖ分子は、ＣＤ３ｅに結合した（図１２）。
次いで、フローサイトメトリーを使用して、Ｔ細胞に結合する能力についてｓｃＦｖ分子を試験した。簡潔に述べると、ヒトＴ細胞を解凍し、１×１０＾６細胞／ｍＬでフロー染色バッファに再懸濁させ、５０，０００細胞／ウェルで播種した。陽性対照であるＣＤ３Ｗ３６は、ＬＨ－ｓｃＦｖとしてフォーマット化された抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４で構成されており、呼吸器合胞体ウイルスからのＦ－糖タンパク質を標的とするｓｃＦｖである陰性対照Ｂ２３を結合の比較のために使用した。Ｅｃｏｌｉ上清を１５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを染色バッファで洗浄し、染色バッファ中のＡｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートした抗Ｈｉｓ抗体で検出した。インキュベーション後、２００μＬのＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔランニングバッファを混合物に添加し、細胞を１：１，０００ Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎを含有するランニングバッファ３０μＬ中に再懸濁させ、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒで分析した。上記のとおり、ゲーティング及び分析を行った。ＣＤ３Ｂ８１５に由来する全てのｓｃＦｖ分子が、Ｔ細胞結合と一致する平均蛍光指数を示した（表３５）。
実施例１０：二重特異性ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３抗体の生成
実施例１～３で生成した抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＶＨ／ＶＬ領域及び実施例４の抗ＣＤ３抗体のＶＨ／ＶＬ領域を、二重特異性フォーマットに操作し、ＩｇＧ１として発現させた。
ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ ｓｃＦｖの操作
ＣＤ３ ＶＨ／ＶＬ領域を、配列番号８のリンカーを使用して、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして操作した（表３６）。ＣＤ３に結合するＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのｓｃＦｖ分子を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に操作した（表３７）。配列番号３８７又は４９２のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３として使用した。ｓｃＦｖフォーマット及びｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットでの抗ＣＤ３分子のＤＮＡ配列番号を、表３８に示す。
配列番号４１４（ＣＤ３Ｗ２４４＿ＨＬ）
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配列番号４１５（ＣＤ３Ｗ２４４＿ＬＨ）
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配列番号４１６（ＣＤ３Ｗ２４５＿ＨＬ）
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配列番号４１７（ＣＤ３Ｗ２４５＿ＬＨ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＴＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
配列番号４１８（ＣＤ３Ｗ２４６＿ＨＬ）
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配列番号４１９（ＣＤ３Ｗ２４６＿ＬＨ）
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配列番号４３６（ＣＤ３Ｗ４５０＿ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣＧＣＡＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＧＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＣＧＡＡＣＣＴＡＴＴＡＣＣＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＧＣＡＧＴＡＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＡＴＡＣＣＧＣＡＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号４２５（ＣＤ３Ｂ２１９＿ＬＨ－ｓｃＦｖ）
ＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣ
配列番号４３７（ＣＤ３Ｂ２１９＿ＬＨ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）
ＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＡＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３二重特異性生成のためのＣＤ３ Ｆａｂの操作
ＣＤ３特異的ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３（表３９）及びＶＬ－ＣＬ（表４０）フォーマットに操作し、ＩｇＧ１として発現させた。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む配列番号１５８又は４９３のポリペプチドを使用して、ＣＤ３特異的ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した（表３９）。アイソタイプ対照として、Ｂ２３Ｂ６２を使用した。
配列番号１５８（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）＿ＡＡＳ＿ＺＷＡ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４９３
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットの抗ＣＤ３分子のＤＮＡ配列を表４１に示す。
配列番号４５０（ＣＤ３Ｗ２４４、ＣＤＲＷ２４５、ＣＤ３Ｗ２４６、ＣＤ３Ｗ２４７、ＣＤ３Ｗ２４８ ＨＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＧＧＴＴＧＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号４５４（ＣＤ３Ｗ２４４ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号４５５（ＣＤ３Ｗ２４５ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号４５９（ＣＤ３Ｂ３７６ ＬＣ ｃＤＮＡ）
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配列番号４６０（ＣＤ３Ｂ４５０ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
配列番号４５３（ＣＤ３Ｂ２１９ ＨＣ ｃＤＮＡ）
ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴ
配列番号４６１（ＣＤ３Ｂ２１９ ＬＣ ｃＤＮＡ）
ＣＡＧＡＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＣＡ
ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性生成のためのＨＬＡ－Ｇ Ｆａｂ－Ｆｃの遺伝子操作
ＨＬＡ－Ｇ特異性ＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３及びＶＬ－ＣＬフォーマットに遺伝子操作した。Ｆｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む配列番号４６２又は４９４のポリペプチドを使用して、ＨＬＡ－Ｇ特異性ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を生成した。
配列番号４６２（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）＿ＡＡＳ＿ＺＷＢ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号４９４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号４６３又は４６４のポリペプチドを使用して、ＨＬＡ－Ｇ特異性ＶＬ－ＣＬを生成した。
配列番号４６３（ヒトカッパ軽鎖）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号４６４（ヒトラムダ軽鎖）
ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
ＨＬＡ－Ｇ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ及びＬＣのアミノ酸配列をそれぞれ表４２及び４３に示す。ＨＬＡ－Ｇ Ｆａｂ－Ｆｃ ＨＣ及びＬＣのｃＤＮＡ配列番号を表４４に列挙する。
ＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性生成のためのＨＬＡ－Ｇ ｓｃＦｖ－Ｆｃの遺伝子操作
実施例２に記載される配列番号８のリンカー（表１）を使用してＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のいずれかのｓｃＦｖとして操作されたＨＬＡ－Ｇ ＶＨ／ＶＬ領域を、Ｆｃサイレンシング変異（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ）及び選択的ヘテロ二量体化を促進するように設計されたＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ変異を含むｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマットに更に操作し、ＩｇＧ１として発現させた。配列番号４７７又は４９５のポリペプチドを定常ドメインヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３として使用した。
配列番号４７７（ｈｕＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）－ヒンジ－Ｆｃ＿Ｃ２２０Ｓ＿ＡＡＳ＿ＺＷＢ）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ
配列番号４９５
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマット（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の抗ＨＬＡ－Ｇ分子のアミノ酸配列を表４５に示す。ｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３フォーマット（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）の抗ＨＬＡ－Ｇ分子のｃＤＮＡ配列を表４６に列挙する。
ＨＬＡ－Ｇ×ＣＤ３二重特異性
上記のとおりＨＬ及びＬＨ配向の両方の、Ｆａｂ－Ｆｃとして操作された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｂ３７６、ＣＤ３Ｂ４５０、ＣＤ３Ｂ２１９、及びＣＤ３Ｗ２４６のＶＨ／ＶＬ領域、並びにｓｃＦｖ－Ｆｃとして操作された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＭＨＧＢ７３８、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３７のＶＨ／ＶＬ領域を発現させて、二重特異性抗体を生成し、フォーマットｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のＨＬＡ－Ｇ結合アーム並びに重鎖：ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３及び軽鎖：ＶＬ－ＣＬのフォーマットのＣＤ３結合アームを有するＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性抗体を得た（表４７）。Ｂ２３Ｂ６２－Ｆａｂ－Ｆｃアームを、ＣＤ３特異的アームのアイソタイプ対照として使用した。
代替的に、上記のとおり、ＨＬ及び／又はＬＨ配向のｓｃＦｖ－Ｆｃとして操作された抗ＣＤ３抗体ＣＤ３Ｗ２４６、ＣＤ３Ｂ４５０、及びＣＤ３Ｂ２１９のＶＨ／ＶＬ領域（表４７を参照されたい）、並びにＦａｂとして操作された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＭＨＧＢ７３８、ＭＨＧＢ７３２、及びＭＨＧＢ７３７のＶＨ／ＶＬ領域を発現させて、二重特異性抗体を生成し、重鎖ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３の及び軽鎖ＶＬ－ＣＬのフォーマットのＨＬＡ－Ｇ結合アーム並びにフォーマットｓｃＦｖ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３のＣＤ３結合アームを有するＨＬＡ－Ｇ／ＣＤ３二重特異性抗体を得た。抗ｓｃＦｖを生成するために使用されるリンカーは、配列番号８のリンカーである（表４７）。
Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ ＣＨ３変異を１本の重鎖に遺伝子操作し、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ ＣＨ３変異を上記のとおり他の重鎖に遺伝子操作した。加えて、ＨＫ２結合アーム及びＣＤ３結合アームの両方を、上記のとおりＦｃエフェクターサイレンシング変異Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓを含有するように遺伝子操作した。
遺伝子操作された鎖を発現させ、得られた二重特異性構築物を標準的な方法を使用して精製した。二重特異性は、実施例１１～１３に記載されるように、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３へのそれらの結合、それらのインビトロ細胞傷害、免疫チェックポイント応答、並びにインビボ有効性について特性評価した。
実施例１１．ＢｓＡｂフォーマッティング及びインビトロ試験
腫瘍細胞に対するＴ細胞再指向は、臨床において重要な有望性を示しており、本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ及びＴ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットを標的とする二重特異性抗体（bispecific antibody、ＢｓＡｂ）が、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞に対して細胞傷害を示すかどうかを問うた。リードｖ領域を、一連のＣＤ３結合再指向アームを有するＢｓＡｂとしてフォーマットした（表４８）。簡潔に述べると、１ウェル当たり５０，０００個の細胞の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ２００９－ｂ２ｍ）を、１ウェル当たり１０ｎＭから開始して、半対数増分で連続的に増加させた濃度の抗体と共にインキュベートした。精製した初代Ｔ細胞を３：１の比で添加し、混合物を３７℃で７２時間インキュベートした。染色溶液を、１０＾６個の細胞当たり１ｕＬのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ近赤外染色剤（Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ、Ｌ３４９７６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０＾６個の細胞当たり５ｕＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ ｖｉｏｌｅｔ抗ＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０２６３０）をＢＤ ＦＡＣＳ染色緩衝液中に添加して調製した。細胞混合物を、フローサイトメトリーによる加算分析の前にＡｃｃｕｔａｓｅで解離させた。細胞をＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ及びＣＦＳＥ（ＢＬ－１）対ＳＳＣ－Ａでゲーティングし、非生存腫瘍細胞を、ＣＦＳＥ（ＢＬ－１）対近赤外Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（ＲＬ２－Ｈ）ゲーティングについて全腫瘍標的細胞集団によって同定した。ＦｏｒｅＣｙｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）アドバンストメトリクスを使用してデータを分析して、腫瘍の細胞傷害を計算した。全てのＢｓＡｂは、ＨＬＡ－Ｇ結合ｖ領域がＣＤ３結合アームと対になった場合にＴ細胞媒介性細胞傷害を増強する能力を示し、ＥＣ５０値は、ＨＬＡ－Ｇ標的アーム及びＣＤ３標的アームの両方の結合親和性と相関した（表４８）。
ＢｓＡｂを、追加の細胞株Ｈｕｐ－Ｔ３及びＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ－１に対するＴ細胞活性化及びＴ細胞ベースの細胞傷害を媒介するそれらの能力について更に試験した（図１５Ａ～図１５Ｄ）。図１５Ａ～図１５Ｄは、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞に対するＨＣ３Ｂ１２５によって媒介される細胞傷害を示す。
２つのＢｓＡｂ、ＨＣ３Ｂ１２５、及びＨＣ３Ｂ２５８は、重鎖におけるＣ末端リジン、Ｋ４４７を発現するためのコドンの存在（ＨＣ３Ｂ２５８）又は非存在（ＨＣ３Ｂ１２５）のみが異なっていた。抗体の重鎖のＣ末端リジンは、通常タンパク質分解的に処理されるので、２つのＡｂは、同一の質量スペクトルを示した（表４９）。更に、それらは、Ｔ細胞及びＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ細胞の両方に対する熱安定性及び結合親和性などの同一の生物物理学的特性を示した。更に、ＨＣ３Ｂ２５８は、ＨＣ３Ｂ１２５と同様の細胞傷害特性を示した（図１６）。
実施例１２．免疫チェックポイント応答の観察
本発明者らは、細胞傷害の機構がエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を特徴とする抗ＨＬＡ－Ｇ ｍＡｂ、及びＣＤ３×ＨＬＡ－Ｇ ＢｓＡｂが、ＨＬＡ－Ｇを発現する全ての細胞型の殺傷を誘導し得ることを観察した。腫瘍は、多くの場合、ＰＤ－Ｌ１又はＣＴＬＡ－４などの免疫細胞を阻害することができる、ある特定の免疫チェックポイントモジュレータの上方制御を介して免疫監視を逃れる９。したがって、本発明者らは、ＣＤ３×ＨＬＡ－Ｇ ＢｓＡｂを介したＴ細胞媒介性細胞傷害のためにがん細胞を標的化することが、腫瘍細胞上の免疫チェックポイントモジュレータの発現を克服することができるかどうかを問うた。本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞が免疫チェックポイントリガンドを発現したかどうかを測定した（表５０）。簡潔に述べると、細胞を実施例１１のように培養し、次いで、表５０に示される受容体を標的とする市販の抗体で染色した。フローサイトメトリーを用いて蛍光を測定して、各受容体の相対的発現レベルを決定した。興味深いことに、本発明者らは、ＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１細胞が他の標的細胞よりも有意に高いレベルでＰＤ－Ｌ１を発現すること、及びＣＤ３×ＨＬＡ－Ｇ ＢｓＡｂがＲＥＲＦ－ＬＣ－Ａｄ１細胞に対するＴ細胞ベースの細胞傷害を依然として媒介し得ることを観察した（図１５Ａ～図１５Ｄ）。本発明者らは、Ｔ細胞ベースの細胞傷害のための腫瘍細胞上のＨＬＡ－Ｇのα３ドメインを標的とする本発明者らのＡｂが、腫瘍細胞上の免疫チェックポイントリガンド発現を克服することができたことを観察した。
実施例１３．インビボ有効性
患者におけるＨＬＡ－Ｇ発現と予後不良との間の相関は、ほとんどのタイプのがんにおいて確立されているが、インビボでの腫瘍エスケープにおけるＨＬＡ－Ｇの直接的な役割は、これまで実証されていない。ＨＬＡ－Ｇのマウス相同体は存在しないが、ＩＬＴ－２は存在し、したがって、ＨＬＡ－Ｇの役割の研究は、異種移植モデル及びヒト化マウスを必要とする。
Ａｂ及びＢｓＡｂを、一連のマウス研究においてインビボで抗腫瘍有効性を媒介するそれらの能力について試験した。（図１７Ａ～図１７Ｂ、表５１）に示される研究は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのヒト化雌ｈＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＣＭＶ－ＩＬ３、ＣＳＦ２、ＫＩＴＬＧ）に皮下移植された膵臓腫瘍モデルＰＡＸＦ１６５７（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ）を用いた有効性実験からなった。３人の異なるドナー（＃２５９５、＃２５９７、及び＃５８６７）からのヒト臍帯血由来のＣＤ３４＋造血幹細胞（hematopoietic stem cell、ＨＳＣ）を移植されたマウスは、移植の１０～１１週間後に、ＨＳＣの十分な程度の生着（２５％を超えるヒトＣＤ４５＋細胞）について、配給業者によってチェックされた。ＰＡＸＦ１６５７腫瘍を到着の１８日後に移植し、生着の程度を無作為化の２日前に再チェックした。実験は、各々１つのＰＡＸＦ１６５７腫瘍を有する１０匹又は１１匹のマウスの８つの群で構成された。絶対腫瘍体積（absolute tumor volume、ＡＴＶ）を、無作為化の日に、次いで週２回、デジタルキャリパー（Ｓ＿Ｃａｌ ＥＶＯ Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた二次元測定によって決定した。腫瘍体積は、式：腫瘍体積＝（ｌ×ｗ２）×０．５（式中、ｌ＝腫瘍の最大直径及びｗ＝幅（垂直直径）（ｍｍ単位））に従って計算した。４６．７ｍｍ３～１１７．７ｍｍ３の腫瘍体積で、３人のドナーからのＨＳＣを用いてヒト化されたマウスの群の間で可能な限り均一な分布を同時に確保しながら、同等の群平均及び中央値腫瘍体積を目標として、マウスを８つの群に分配した。各抗体を２つ又は３つの用量レベルで評価し、０、３、７、１０、１４、１７、２１、２４日目に投与した（静脈内、２回／週）。ビヒクル対照群を参照として用いて、全ての群の抗腫瘍効果を評価した。腫瘍成長阻害（Tumor growth inhibition、ＴＧＩ）は、対照群における変化に対する試験群の腫瘍体積の変化の比較によって処置期間の終わりに決定され、パーセントでデルタＴＧＩ値（本文ではＴＧＩと示される）として表される。ＴＧＩは、次式：デルタＴＧＩｘ［％］＝（１－平均（Ｔｘ－Ｔ０）／平均（Ｃｘ－Ｃ０））×１００に従って、絶対腫瘍体積を使用して計算し、式中、Ｔ０及びＣ０が、処置の開始時（すなわち無作為化の日）の試験群及び対照群における絶対腫瘍体積であり、Ｔｘ及びＣｘが、処置期間の終わりの対応する絶対腫瘍体積である。これは、この研究において２５日目であった。実験は、２７日目に終了した。ＨＣ３Ｂ１２５は、ｈＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにおける腫瘍モデルＰＡＸＦ１６５７の成長を著しく阻害した。ビヒクル対照群と比較した腫瘍成長阻害は、評価された３つ全ての用量レベルについて統計的に有意であった（Ｄｕｎｎポスト検定と組み合わせたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、表５０）。腫瘍は、０．００２ｍｇのＨＣ３Ｂ１２５群の６／１１匹の動物、０．００６ｍｇの８／１１匹の動物、及び０．０２ｍｇの９／１１匹の動物において完全に退縮した。実験の終わりに、０．００２ｍｇ／０．００６ｍｇ／０．０２ｍｇのＨＣ３Ｂ１２５群において、それぞれ６／７／６匹の腫瘍のない生存者がいた。
腫瘍成長は、試験したいずれの用量レベルにおいてもＨＣ３Ｂ１２８によって阻害されなかった。対照群と比較して高用量のＨＣ３Ｂ１２８で群平均腫瘍体積のわずかな低減が観察されたが、その差は、統計的に有意ではなかった（表５０）。
ｎ／ａ＝該当なしｎ．ｒ．＝到達していない（すなわち、群中央値ＲＴＶは、常に２００％／４００％未満である）。
抗体のビヒクル：ＰＢＳ
２各群におけるデルタＴＧＩ値を、最後の２ＱＷ処置が投与された後の最初の測定日（２５日目）に、セクション誤差！に示される式に従って計算した。参照ソースが見つかりません。；追加のＴＧＩ、Ｔ／Ｃ、及び腫瘍退縮値については、付録１を参照されたい。
３誤差！のセクションに従って、部分的退縮（Partial regression、ＰＲ）及び完全な退縮（complete regression、ＣＲ）を決定した参照ソースが見つかりません。ＴＦＳ：腫瘍のない生存者、Ｔｄ、腫瘍二倍加時間、ｔｑ、腫瘍四倍化時間。
ＨＣ３Ｂ１２５での処置はまた、ＨｕＰ－Ｔ３細胞株由来異種移植片（cell line derived xenograft、ＣＤＸ）モデルにおいて腫瘍増殖阻害をもたらし得た（図１８、表５２）。研究は、Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧ（Jackson Laboratories）マウスに皮下移植された膵臓腫瘍モデルＨｕＰ－Ｔ３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（５０％Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）における１０ｅ６個の細胞／マウス）を用いた有効性実験からなった。実験は、各々１つのＨｕＰ－Ｔ３腫瘍を有する１０匹のマウスの６つの群を含んだ。７日目に、７５ｍｍ３～１５０ｍｍ３の腫瘍体積で、同等の群平均及び中央値腫瘍体積を有することを目的として、マウスを６つの群に無作為化した。マウスに、無作為化と同日の無作為化後に、Ｔ細胞を腹腔内移植した（２０ｅ６個の細胞／マウス、０．２ｍＬ／動物、ＡＬＬＣＥＬＬＳ ６０９３ Ｔ細胞ドナー）。ＨＣ３Ｂ１２５抗体を５つの用量レベルで評価した。全ての群の抗腫瘍効果を、参照としてヌル×ＣＤ３処置群を用いて評価した。処置は、Ｔ細胞生着の１日後に開始し、８、１１、１４、１７、２１、２４、２８、３１、３５、３８、４２、４８日目に行った（腹腔内、２回／週）。腫瘍成長阻害は、処置期間の終わりに、ヌル×ＣＤ３処置対照群の群平均腫瘍体積の変化に対する試験群の群平均腫瘍体積の変化の比較によって決定し、パーセントでデルタＴＧＩ値（本文ではＴＧＩと示される）として表した。腫瘍移植後４２日目を最終日としてＴＧＩ計算に使用した。実験を、４６日目に終了した。ＨＣ３Ｂ１２５は、ｈＮＳＧマウスにおける腫瘍モデルＨｕＰＴ３の成長を著しく阻害した。ヌル×ＣＤ３処置対照群と比較した腫瘍成長阻害は、評価した５つ全ての用量レベルについて統計的に有意であった（表５２）。
実施例１４．Ｔ細胞ヒト化ＮＳＧマウスにおける確立された患者由来異種移植片腫瘍モデルにおけるＨＣ３Ｂ２５８の有効性
ＨＬＡ－Ｇ発現とインビボ抗腫瘍効果との間の相関を調査するために、ヒト汎Ｔ細胞で腹腔内（intraperitoneally、ｉｐ）によってヒト化された雌ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスにおける、１０個のヒト患者由来異種移植片（patient-derived xenograft、ＰＤＸ）固形腫瘍モデル（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｇｅｒｍａｎｙ ＧｍｂＨ）のパネルにおいてＨＣ３Ｂ２５８抗体を評価した表５３。パネル包含のために選択されたＰＤＸモデルは、様々な固形腫瘍適応症にわたる腫瘍モデルを表し、ウェスタンブロット（Western blot、ＷＢ）評価によって決定して、ＨＬＡ－Ｇ標的発現の様々なレベル（発現なしを含む）を実証した。
ＰＤＸモデルは、患者の外科標本に由来した。連続継代で異種移植片から採取した腫瘍を切除し、３～４ｍｍ長の断片に切断し、次いで、ＮＳＧマウスの側腹部に皮下（subcutaneously、ＳＣ）移植した。腫瘍が１００～２００ｍｍ３に達したとき、腫瘍を有するマウスを、全ての群が同様の平均値を有するように、腫瘍体積に基づいて５匹の動物の３つの群に無作為化した。無作為化の日に、マウス当たり０．２ｍＬ中２×１０７細胞のｉｐ注射のために、インビトロで活性化及び増殖させたヒト汎Ｔ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ、ドナー６０９３）を１×１０８細胞／ｍＬの濃度で用いて、動物をヒト化した。Ｔ細胞ヒト化の翌日、マウスに、０．０３若しくは０．３ｍｇ／ｋｇのいずれかのＨＣ３Ｂ２５８、又はビヒクルを合計６用量、週２回静脈内（intravenously、ｉｖ）投与した（Ｔ細胞ヒト化後１、５、８、１２、１５、及び１９日目）。Ｔ－細胞ヒト化マウスに、ＨＣ３Ｂ２５８投与の少なくとも３０分前に、Ｆｃブロック（クローン２．４Ｇ２；ＢｉｏＸＣｅｌｌ，）を０．２ｍｇ／マウスｉｐで、静脈内免疫グロブリン（intravenous immunoglobulin、ＩＶＩＧ）（Ｇａｍｍａｇａｒｄ、ＮＤＣ＃００９４４－２７００－０５）を１０ｍｇ／マウスｉｐで投与して、ＮＳＧマウスにおける低Ｉｇ環境を補正した。
腫瘍体積は、以下の式を使用して計算し、
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（Ｄ×ｄ２／２）
式中、「Ｄ」は、キャリパー測定によって決定して、腫瘍のより大きい直径を表し、「ｄ」は、より小さい直径を表す。少なくとも４匹のマウスが各群に残った場合、処置の終了時（３４～４２日の範囲）に、生物学的及び統計的有意性を含む抗腫瘍効果を、ＨＣ３Ｂ２５８処置群とビヒクル処置対照群との間で比較した。抗腫瘍効果は、腫瘍成長阻害パーセント（％ΔＴＧＩ）で表され、処置群と対照群との間の平均腫瘍量の差として定義し、以下のように計算した。
％ΔＴＧＩ＝（［（ＴＶｃ－ＴＶｃ０）－（ＴＶｔ－ＴＶｔ０）］／（ＴＶｃ－ＴＶｃ０））×１００
式中、「ＴＶｃ」は、所与の対照群の平均腫瘍量であり、「ＴＶｃ０」は、所与の対照群の平均初期腫瘍量であり、「ＴＶｔ」は、処置群の平均腫瘍量であり、「ＴＶｔ０」は、処置群の平均初期腫瘍量である。完全応答（complete response、ＣＲ）は、分析の最終日に触知可能な腫瘍がないこととして定義した。ΔＴＧＩ分析（ＩｎＶｉｖｏＬＤＡ Ｓｈｉｎｙ Ａｐｐ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｓｎｏｎ）を使用して、腫瘍体積測定の統計的有意性を計算した。ｐ≦０．０５のとき、群間の差異は有意であるとみなした。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体４Ｈ８４（Ａｂｃａｍ）を使用して、ＰＤＸ総タンパク質溶解物に対して、ウェスタンブロット（ＷＢ）分析を行った。ＰＤＸ総タンパク質溶解物（各々５ｍｇ／ｍＬ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙから受領した。各サンプル（１０μＬ）をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｍｉｎｉゲルに充填した。ＭａｇｉｃＭａｒｋ（商標）ＸＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ及びＦｕｌｌ Ｒａｎｇｅ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒをタンパク質マーカーとして使用した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動緩衝液を使用した。７０Ｖで１５分間、続いて２００Ｖで５０分間、ゲルを泳動させた。電気泳動後、ＸＣｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（ThermoFisher Scientific）を製造業者のプロトコルに従って使用して、ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene fluoride、ＰＶＤＦ）膜にゲルを移した。３０Ｖで２時間ブロッティングした後、膜を室温のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中に１時間移した。Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中で、一次抗体４Ｈ８４（１：２００）及び希釈した抗ビンキュリン（１：５，０００）と共に、膜を４℃で一晩インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）による３～４回の洗浄工程の後、（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液中１：１，０００に希釈した）適切な二次抗体と共に、膜を室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴによる３～５回の洗浄工程の後、Ｏｄｙｓｓｅｙ ＩＲ造影システム（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、７００ｎｍで膜をスキャンした。以下のようにデータを分析した。Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｓｙｓｔｅｍの２つのＩＲ蛍光検出チャネルは、ＨＬＡ－Ｇ、及び充填対照として使用されるビンキュリンについての同時２色標的分析を可能にする。両方のチャネルにおける各サンプルの蛍光強度（fluorescence intensity、ＦＩ）を決定し（Image Studio）、ＨＬＡ－ＧのＦＩ値をビンキュリンのＦＩで除算することによって正規化した。
いくつかのＰＤＸモデルにおいて、０．０３及び０．３ｍｇ／ｋｇでのＨＣ３Ｂ２５８処置後に、ＨＬＡ－Ｇタンパク質発現がＷＢ＞１（ＰＲＸＦ ＭＲＩ－Ｈ１５７９、ＬＸＦＡ２２０４、及びＲＸＦ４８８）及びＷＢ０．１～１．０（ＲＸＦ２７０６及びＰＡＸＦ２１７５）レベルの、強い抗腫瘍効果及び完全応答（ＣＲ）が観察された。匹敵するレベルのＨＬＡ－Ｇを発現する他のＰＤＸモデル（ＲＸＦ６１６、ＢＸＦ４３９、及びＭＥＸＦ１７９２）におけるＨＣ３Ｂ２５８による処置は、用量依存的な抗腫瘍効果をもたらし、０．０３ｍｇ／ｋｇでの処置に対して中程度に応答し、これらのモデルにおける可能な固有の耐性機序を実証した（表５３）。いずれの用量レベルでのＨＣ３Ｂ２５８による処置も、陰性ＨＬＡ－Ｇタンパク質発現を有するＰＤＸモデルにおいて生物学的に有意な抗腫瘍効果をもたらさなかった。総合すると、これらの結果は、様々なレベルのＨＬＡ－Ｇ標的発現での強力な特異的抗腫瘍効果を示すが、ＨＬＡ－Ｇ発現の非存在下では効果は存在しない。
有意でない（not significant、ｎｓ）と注釈されている場合を除き、対照に対してｐ≦０．０５；ＣＲ＝完全応答。
参考文献
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５ Ｃａｒｏｓｅｌｌａ，Ｅ．Ｄ．，Ｒｏｕａｓ－Ｆｒｅｉｓｓ，Ｎ．，Ｔｒｏｎｉｋ－Ｌｅ Ｒｏｕｘ，Ｄ．，Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．＆ＬｅＭａｏｕｌｔ，Ｊ．ＨＬＡ－Ｇ：Ａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２７，３３－１４４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｂｓ．ａｉ．２０１５．０４．００１（２０１５）．
６ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨＬＡ－Ｇ：ａ ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｆｅｔａｌ－ｍａｔｅｒｎａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２，３３６０－３３６５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４０９６７６１０２（２００５）．
７ Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｃｋ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｈｕｍａｎ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，２６７３３－２６７４０，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ２０２０６９２００（２００２）．
８ Ｚｈａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＯＸ４０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ Ｆｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．ＭＡｂｓ ９，１１２９－１１４２，ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１７．１３５８８３８（２０１７）．
９ Ｗｉｌｋｙ，Ｂ．Ａ．Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｔｈｅ ｌｉｎｃｈｐｉｎｓ ｏｆ ｍｏｄｅｒｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２９０，６－２３，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２７６６（２０１９）．

Claims (107)

  1. ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号５０の重鎖可変領域（ＶＨ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１の軽鎖可変領域（ＶＬ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｂ）配列番号５２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｃ）配列番号５４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｄ）配列番号５６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｅ）配列番号５８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｆ）配列番号６０のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６１のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｇ）配列番号６２のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｈ）配列番号６４のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｉ）配列番号６６のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６７のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、又は
    ｊ）配列番号６８のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、単離タンパク質。
  2. ａ）それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
    ｂ）それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
    ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
    ｄ）それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
    ｅ）それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
    ｆ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
    ｇ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
    ｈ）それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
    ｉ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
  3. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨである、請求項１又は２に記載の単離タンパク質。
  4. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項３に記載の単離タンパク質。
  5. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項３に記載の単離タンパク質。
  6. 前記ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又は前記ＶＬ、前記Ｌ１、及び前記ＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、請求項５に記載の単離タンパク質。
  7. 前記Ｌ１が、
    ａ）約５～５０個のアミノ酸、
    ｂ）約５～４０個のアミノ酸、
    ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、又は
    ｄ）約１０～２０個のアミノ酸、を含む、請求項６に記載の単離タンパク質。
  8. 前記Ｌ１が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離タンパク質。
  9. 前記Ｌ１が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の単離タンパク質。
  10. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  11. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
    ｂ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
    ｃ）配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
    ｄ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
    ｅ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
    ｆ）配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
    ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
    ｈ）配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
    ｉ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
    ｊ）配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、請求項１０に記載の単離タンパク質。
  12. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、配列番号２６５、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  13. 前記タンパク質が、半減期延長部分にコンジュゲートされる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  14. 前記半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、前記Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、前記Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、又はポリエチレングリコールである、請求項１３に記載の単離タンパク質。
  15. 前記単離タンパク質が、単一特異性タンパク質である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  16. 前記単離タンパク質が、多重特異性タンパク質である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  17. 前記多重特異性タンパク質が、二重特異性タンパク質である、請求項１６に記載の単離タンパク質。
  18. 前記多重特異性タンパク質が、三重特異性タンパク質である、請求項１６に記載の単離タンパク質。
  19. 免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又は前記Ｉｇ定常領域のその断片を更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  20. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃ領域を含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  21. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメインを含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  22. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ３ドメインを含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  23. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ＣＨ２ドメイン及び前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  24. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジの少なくとも一部分、前記ＣＨ２ドメイン、及び前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  25. 前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジ、前記ＣＨ２ドメイン、及び前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項１９に記載の単離タンパク質。
  26. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端にコンジュゲートされる、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  27. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＣ末端にコンジュゲートされる、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  28. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、第２のリンカー（Ｌ２）を介して前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片にコンジュゲートされる、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  29. 前記Ｌ２が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の単離タンパク質。
  30. 前記多重特異性タンパク質が、リンパ球上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項１６～２９のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  31. 前記リンパ球が、Ｔリンパ球である、請求項３０に記載の単離タンパク質。
  32. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項３０に記載の単離タンパク質。
  33. 前記リンパ球が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項３０に記載の単離タンパク質。
  34. 前記多重特異性タンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項１６～３３のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  35. 前記多重特異性タンパク質が、ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインを含む、請求項３４に記載の単離タンパク質。
  36. 前記ＣＤ３εに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、
    ｂ）配列番号３４６のＶＨ及び配列番号３４７のＶＬ、
    ｃ）配列番号３４８のＶＨ及び配列番号３４９のＶＬ、
    ｄ）配列番号３６１の重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３６９のＬＣＤＲ３、
    ｅ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４０のＶＬ、
    ｆ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
    ｇ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４１のＶＬ、
    ｈ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４２のＶＬ、
    ｉ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４３のＶＬ、
    ｊ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４４のＶＬ、又は
    ｋ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４５のＶＬを含む、請求項３４に記載の単離タンパク質。
  37. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１９～３６のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  38. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  39. 前記タンパク質の前記ＦｃγＲへの低減された結合をもたらす前記少なくとも１つの変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項３８に記載の単離タンパク質。
  40. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記タンパク質の前記ＦｃγＲへの増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  41. 前記タンパク質の前記ＦｃγＲへの増強された結合をもたらす前記少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項４０に記載の単離タンパク質。
  42. 前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  43. 前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、請求項１９～４２のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  44. 前記タンパク質の前記半減期を調節する前記少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項４３に記載の単離タンパク質。
  45. 前記タンパク質が、前記Ｉｇ定常領域のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、請求項１９～４４のいずれか一項に記載の単離タンパク質。
  46. 前記Ｉｇ定常領域の前記ＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項４５に記載の単離タンパク質。
  47. ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと、リンパ球抗原に結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む、単離多重特異性タンパク質。
  48. 前記リンパ球抗原が、Ｔ細胞抗原である、請求項４７に記載の単離多重特異性タンパク質。
  49. 前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原である、請求項４７に記載の単離多重特異性タンパク質。
  50. 前記リンパ球抗原が、ＮＫ細胞抗原である、請求項４７に記載の単離多重特異性タンパク質。
  51. 前記リンパ球抗原が、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ８、ＫＩ２Ｌ４、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＢＴＮＬ３、ＣＤ１８６、ＢＴＮＬ８、ＰＤ－１、ＣＤ１９５、又はＮＫＧ２Ｃである、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  52. 前記リンパ球抗原が、ＣＤ３εである、請求項５１に記載の単離多重特異性タンパク質。
  53. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は前記リンパ球抗原に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｄＡｂ、又はＶＨＨを含む、請求項４７～５２のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  54. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は前記リンパ球抗原に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、前記Ｆａｂを含む、請求項５３に記載の単離多重特異性タンパク質。
  55. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメイン及び／又は前記リンパ球抗原に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、前記ｓｃＦｖを含む、請求項５３に記載の単離多重特異性タンパク質。
  56. 前記ｓｃＦｖが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、第１のリンカー（Ｌ１）、及びＶＬ（ＶＨ－Ｌ１－ＶＬ）、又は前記ＶＬ、前記Ｌ１、及び前記ＶＨ（ＶＬ－Ｌ１－ＶＨ）を含む、請求項５５に記載の単離多重特異性タンパク質。
  57. 前記Ｌ１が、
    ａ）約５～５０個のアミノ酸、
    ｂ）約５～４０個のアミノ酸、
    ｃ）約１０～３０個のアミノ酸、又は
    ｄ）約１０～２０個のアミノ酸を含む、請求項５６に記載の単離多重特異性タンパク質。
  58. 前記Ｌ１が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の単離多重特異性タンパク質。
  59. 前記Ｌ１が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の単離多重特異性タンパク質。
  60. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号７０、７３、７５、７８、８１、又は８５のＨＣＤＲ１、配列番号７１、７６、７９、８２、又は８６のＨＣＤＲ２、配列番号７２、７４、７７、８０、８３、８４、又は８７のＨＣＤＲ３、配列番号８８、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、又は１０２のＬＣＤＲ１、配列番号８９又は１０３のＬＣＤＲ２、及び配列番号９０、９２、９４、９６、９８、１００、又は１０４のＬＣＤＲ３を含む、請求項４７～５９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  61. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、
    ａ）それぞれ配列番号７０、７１、７２、８８、８９、及び９０、
    ｂ）それぞれ配列番号７３、７１、７４、９１、８９、及び９２、
    ｃ）それぞれ配列番号７５、７６、７７、９３、８９、及び９４、
    ｄ）それぞれ配列番号７８、７９、８０、９５、８９、及び９６、
    ｅ）それぞれ配列番号８１、８２、８３、９７、８９、及び９８、
    ｆ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９９、８９、及び１００、
    ｇ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、１０１、８９、及び１００、
    ｈ）それぞれ配列番号８５、８６、８７、１０２、１０３、及び１０４、又は
    ｉ）それぞれ配列番号７８、７１、８４、９５、８９、及び９６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項４７～６０のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  62. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号５０のＶＨ及び配列番号５１のＶＬ、
    ｂ）配列番号５２のＶＨ及び配列番号５３のＶＬ、
    ｃ）配列番号５４のＶＨ及び配列番号５５のＶＬ、
    ｄ）配列番号５６のＶＨ及び配列番号５７のＶＬ、
    ｅ）配列番号５８のＶＨ及び配列番号５９のＶＬ、
    ｆ）配列番号６０のＶＨ及び配列番号６１のＶＬ、
    ｇ）配列番号６２のＶＨ及び配列番号６３のＶＬ、
    ｈ）配列番号６４のＶＨ及び配列番号６５のＶＬ、
    ｉ）配列番号６６のＶＨ及び配列番号６７のＶＬ、又は
    ｊ）配列番号６８のＶＨ及び配列番号６９のＶＬを含む、請求項４７～６１のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  63. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、又は６８のＶＨ及び配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、又は６９のＶＬを含む、請求項４７～６１のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  64. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、配列番号２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、又は２６９のアミノ酸配列を含む、請求項４７～６３のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  65. 前記リンパ球抗原に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、
    ａ）配列番号３６４のＨＣＤＲ１、配列番号３６５のＨＣＤＲ２、配列番号３６６のＨＣＤＲ３、配列番号３７１のＬＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７３のＬＣＤＲ３、
    ｂ）配列番号３４６のＶＨ及び配列番号３４７のＶＬ、
    ｃ）配列番号３４８のＶＨ及び配列番号３４９のＶＬ、
    ｄ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３６９のＬＣＤＲ３、
    ｅ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４０のＶＬ、
    ｆ）配列番号３６１のＨＣＤＲ１、配列番号３６２のＨＣＤＲ２、配列番号３６３のＨＣＤＲ３、配列番号３６７のＬＣＤＲ１、配列番号３６８のＬＣＤＲ２、及び配列番号３７０のＬＣＤＲ３、
    ｇ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４１のＶＬ、
    ｈ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４２のＶＬ、
    ｉ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４３のＶＬ、
    ｊ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４４のＶＬ、又は
    ｋ）配列番号３３９のＶＨ及び配列番号３４５のＶＬを含む、請求項４７～５６のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  66. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインが、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは前記第１のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされ、かつ／又は前記リンパ球抗原に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、第２の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域若しくは前記第２のＩｇ定常領域の断片にコンジュゲートされる、請求項４７～６５のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  67. 前記ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合ドメインと前記第１のＩｇ定常領域又は前記第１のＩｇ定常領域の前記断片との間、及び前記リンパ球抗原に結合する前記第２の抗原結合ドメインと前記第２のＩｇ定常領域又は前記第２のＩｇ定常領域の前記断片との間に、第２のリンカー（Ｌ２）を更に含む、請求項６６に記載の単離多重特異性タンパク質。
  68. 前記Ｌ２が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載の単離多重特異性タンパク質。
  69. 前記第１のＩｇ定常領域又は前記第１のＩｇ定常領域の前記断片、及び前記第２のＩｇ定常領域又は前記第２のＩｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項６６～６８のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  70. 前記第１のＩｇ定常領域又は前記第１のＩｇ定常領域の前記断片、及び前記第２のＩｇ定常領域又は前記第２のＩｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性タンパク質のＦｃγＲへの低減された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  71. 前記多重特異性タンパク質の前記ＦｃγＲへの低減された結合をもたらす前記少なくとも１つの変異が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７０に記載の単離多重特異性タンパク質。
  72. 前記第１のＩｇ定常領域又は前記第１のＩｇ定常領域の前記断片、及び前記第２のＩｇ定常領域又は前記第２のＩｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性タンパク質のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への増強された結合をもたらす少なくとも１つの変異を含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  73. 前記多重特異性タンパク質の前記ＦｃγＲへの増強された結合をもたらす前記少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７２に記載の単離多重特異性タンパク質。
  74. 前記ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  75. 前記第１のＩｇ定常領域又は前記第１のＩｇ定常領域の前記断片、及び前記第２のＩｇ定常領域又は前記第２のＩｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性タンパク質の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、請求項６６～７４のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  76. 前記多重特異性タンパク質の前記半減期を調節する前記少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ、及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７５に記載の単離多重特異性タンパク質。
  77. 前記第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは前記第１のＩｇ定常領域の前記断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異、及び／又は前記第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは前記第２のＩｇ定常領域の前記断片のＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、請求項６６～７６のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  78. 前記第１のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは前記第１のＩｇ定常領域の前記断片のＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異及び／又は前記第２のＩｇ定常領域のＣＨ３ドメイン若しくは前記第２のＩｇ定常領域の前記断片のＣＨ３ドメインにおける少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７７に記載の単離多重特異性タンパク質。
  79. 前記第１のＩｇ定常領域又は前記第１のＩｇ定常領域の前記断片、及び前記第２のＩｇ定常領域又は前記第２のＩｇ定常領域の前記断片が、以下の変異：
    ａ）前記第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び前記第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、又は
    ｂ）前記第１のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、及び前記第２のＩｇ定常領域におけるＬ２３５Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｄ２６５Ｓ＿Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含む、請求項６６～７８のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質。
  80. 治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた、請求項１～４６のいずれかに一項に記載の単離タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
  81. 請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  82. 請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  83. 請求項８２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  84. 請求項８３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  85. 請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質を発現する条件で請求項８４に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記タンパク質を収集することと、を含む、方法。
  86. 治療剤又は造影剤にコンジュゲートされた、請求項４７～７９のいずれかに一項に記載の単離多重特異性タンパク質を含む、免疫コンジュゲート。
  87. 請求項４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  88. 請求項４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  89. 請求項８８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  90. 請求項８９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  91. 請求項４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質を産生する方法であって、前記多重特異性タンパク質を発現する条件で請求項９０に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記多重特異性タンパク質を収集することと、を含む、方法。
  92. 対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現がんを治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、請求項８０若しくは８６に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項８１若しくは８７に記載の医薬組成物を、前記ＨＬＡ－Ｇ発現がんを治療するのに十分な時間の間、前記対象に投与することを含む、方法。
  93. 対象におけるＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の量を低減する方法であって、請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、請求項８０若しくは８６に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項８１若しくは８７に記載の医薬組成物を、前記ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の量を低減するのに十分な時間の間、前記対象に投与することを含む、方法。
  94. 前記ＨＬＡ－Ｇ発現がんが、肺がん、膵臓がん、腎がん、頭頸部がん、卵巣がん、食道がん、大腸がん、子宮がん、又は乳がんである、請求項９２～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記単離タンパク質又は前記単離多重特異性タンパク質が、第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記第２の治療剤が、手術、化学療法、若しくは放射線、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項９５に記載の方法。
  97. 対象におけるがんの存在を検出する方法であって、がんを有することが疑われる対象に請求項８０又は８６に記載の免疫コンジュゲートを投与することと、前記免疫コンジュゲートが結合している生物学的構造を可視化し、それによって前記がんの存在を検出することと、を含む、方法。
  98. 請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質、請求項４７～７９のいずれか一項に記載の単離多重特異性タンパク質、請求項８０若しくは８６に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項８１若しくは８７に記載の医薬組成物を含む、キット。
  99. 請求項１～４６のいずれか一項に記載の単離タンパク質に結合する、抗イディオタイプ抗体。
  100. ＨＬＡ－Ｇ上のエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む単離タンパク質であって、前記エピトープが、ＨＨＰＶＦＤＹＥ（配列番号４８５）のアミノ酸配列及びＶＰＳを含む、不連続エピトープである、単離タンパク質。
  101. 配列番号４７８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
  102. 配列番号４９０のアミノ酸配列を含む、請求項１０１に記載の単離タンパク質。
  103. 配列番号４８９及び４４７のアミノ酸配列を更に含む、請求項１０１又は１０２に記載の単離タンパク質。
  104. 配列番号４３９のアミノ酸配列を更に含む、請求項１０３に記載の単離タンパク質。
  105. 配列番号４６５及び４６８のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
  106. 配列番号４６６及び４６９のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
  107. 配列番号４６７及び４７０のアミノ酸配列を含む、単離タンパク質。
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