KR101380729B1 - 면역글로불린 융합 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물학적 활성 분자 및 생물학적 활성 분자에 결합 되는 면역글로불린(Ig) Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. Fc 도메인은 (ⅰ) IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 (ⅱ) IgG4 및 IgD의 하이브리드 인간 Fc 도메인이다. 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자의 담체로서 유용하다.

Description

면역글로불린 융합 단백질{IMMUNOGLOBULIN FUSION PROTEINS}
본 발명은 하이브리드 인간 Fc 및 상기 하이브리드 인간 Fc가 생물학적 활성 분자에 결합된 면역글로불린 융합 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 인간 면역글로불린 G (IgG) 서브클래스(subclasses)의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유래되는 하이브리드 인간 Fc 및 상기 Fc가 공유결합을 통하여 생물학적 활성 분자에 결합된 융합 단백질에 관한 것이다.
생물학적 활성 분자는 치료학적으로 매우 중요할 수 있다. 그러나 이들은 생체 내 안정성이 낮기 때문에 치료학적 제제로서 불리할 수 있다. 이들은 생체 내에서 다양한 효소에 의해 분해되기 때문에 이들의 순환 반감기(circulating half-life) 또는 혈청 반감기가 짧다. 그러므로 생물학적 활성 분자의 순환 반감기를 증가시키는 것이 요구된다.
단백질 크기의 증가는 신장에 의한 단백질 제거를 방해하므로 그 반감기가 증가될 수 있다고 알려져 있다(Knauf et al., J. Biol. Chem. 1988. 263:15064-15070). 예를 들면, 인간 알부민에 활성 단백질을 결합시킴으로써 단백질 안정성을 증가시킨다는 것이 보고되어 있다(Kinstler et al., Pharm. Res. 1995. 12:1883-1888). 그러나 인간 알부민에 활성 단백질을 결합시키는 것은, 체류 시간을 약간 증가시킬 뿐이므로, 효과적인 활성 단백질을 포함한 약물학적 제형을 개발하기 위해 인간 알부민을 결합시키는 것은 적합한 방법이 되지 못하였다.
다른 보고된 방법은 단백질의 당화(glycosylation)를 조절하는 것이다. 단백질에 추가적 당화 및 단백질에 시알산(sialic acids)을 도입하는 방법은 간에서의 단백질 분해의 방지를 유도한다. 그러나 단백질 당화의 증가는 또한 단백질의 생물활성의 감소를 동시에 가져온다.
단백질을 안정화하고 신장에서 제거되는 것을 방지하기 위하여, 단백질은 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol, PEG)에 결합되어 왔다. PEG에의 공유적 결합은 증가된 반감기를 갖는 약물을 운반하는데 널리 쓰이고 있다(Delgado et al., 1992. 9:249-304). 그러나 사이토카인(cytokines) 또는 호르몬에 PEG를 결합시키는 것은 결합으로 인한 입체 장애(steric hindrance)로 인하여 수용체 결합 친화력을 감소시키는 결과를 야기한다고 보고되어 있다.
최근, 면역글로불린 (Ig)를 사용하여 제조된 융합 단백질이 연구되고 있으며, 개발되고 있다. Ig 는 혈액의 주요 구성성분이다. 인간 Ig (hIg)는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE와 같은 다양한 부류(classes)를 포함한다(Roitt et al., "Immunology" 1989, Gower Medical Publishing, London, U.K.; New York, N.Y.). 인간 IgG는 인간 IgG1 (hIgG1), 인간 IgG2 (hIgG2), 인간 IgG3 (hIgG3), 및 인간 IgG4 (hIgG4)로 알려진 다양한 아형(subtypes)으로 더 분류될 수 있다.
면역글로불린은 네 개의 폴리펩타이드 사슬이 포함되는데, 두 개의 중쇄 ( heavy chains) 및 두 개의 경쇄 (light chains)인 이들은 사량체(tetramer)를 형성하기 위해 이황화 결합(disulfide bonds)를 통해 연결되어 있다. 각 사슬은 가변 영역 (variable region) 및 불변 영역 (constant region)으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 아이소타입(isotypes)에 따라 셋 또는 네 부위 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)로 더 나뉘어진다. 중쇄 불변 영역의 Fc 영역은, Ig 아이소타입에 따라, 힌지(hinge), CH2, CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함한다.
생체 내 반감기와 관련하여, IgG1, IgG2, 및 IgG4는 21일의 긴 반감기를 가지는 반면, 다른 면역글로불린은 상대적으로 일주일 이하의 짧은 반감기를 가진다. IgG의 Fc 영역에 융합된 키메릭 단백질(chimeric proteins)은 증가된 안정성 및 증가된 혈청 반감기를 보인다(Capon et al., Nature 1989. 337: 525-531). 생물학적 활성 단백질은 CH1 부위의 N-말단, Fc 부위의 N-말단, 또는 Fc CH3 부위의 C-말단에 융합되어 왔다.
처음에, IgG 융합 단백질은 CD4 (Capon et al., Nature 1989. 337: 525-531), TNFR (Mohler et al., J. Immunology 1993. 151:1548-1561), CTLA4 (Linsley et al, J. Exp. Med. 1991. 173: 721-730), CD86 (Morton et al., J. Immunology 1996. 156: 1047-1054)와 같은 세포 표면 수용체의 세포 외 도메인에 부착되어 왔다. 또한, IgG 도메인에 융합 되어온 몇몇의 사이토카인 및 성장 호르몬(growth hormones)이 있다. 그러나, 세포 표면 수용체의 세포 외 도메인에 융합한 경우와는 달리, IgG에 수용성 단백질이 융합한 경우 비-융합 사이토카인 또는 성장 인자들과 비교할때, 생물학적 활성을 감소시키는 결과를 야기한다. 키메릭 단백질은 이량체(dimer)로 존재하는데, 이 이량체는 서로 가깝게 존재하는 두 활성 단백질의 존재로 인하여, 수용체와 같은 그들의 표적 분자와 결합하는데 있어 입체 장애를 야기한다. 따라서 이러한 문제는 효율적인 Fc 융합 단백질을 제조하기 위해서 극복되어야만 한다.
Fc 융합 기술의 다른 한계는 의도되지 않은 면역 반응이다. 면역글로불린의 Fc 도메인 또한 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC, antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 보체-의존적 세포독성(CDC, complement-depent cytotoxicity)과 같은 효과기 기능을 갖는다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Ig의 Fc 부위와 효과기 세포상의 FcRs 사이의 결합을 통하여, 또는 보체 결합을 통하여 달성된다. 그러므로 세포 살해, 사이토카인 분비, 또는 염증과 같은 원치 않는 반응을 감소시키기 위하여 Fc의 효과기 기능은 억제되어야 한다.
요약하면, 생물학적 활성 손실의 최소화 및 원치 않는 면역 반응에 대한 위험성이 감소된, 개선된 Fc 융합 단백질이 요구된다.
본 발명은 하이브리드 Fc를 제공하며, 상기 하이브리드 Fc는 인간 IgG 서브클래스의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유도된다. 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자에 결합하는 경우, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 높이는 효과가 있다.
본 발명은 또한 하이브리드 Fc가 생물학적 활성 분자에 결합된 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 융합 단백질은 때때로 "생물학적 활성-분자-Fc 융합 단백질" 또는 간단하게 "융합 단백질"로 지칭된다. 융합 단백질은 Fc 와 생물학적 활성 분자 사이에 링커(linker)를 가질 수 있다. Fc는 그 N-말단에서 생물학적 활성 분자의 C-말단과 결합될 수 있다.
융합 단백질은 그것을 코딩하고 융합 단백질을 발현할 수 있는 뉴클레오타이드 구조물을 제조하고; 숙주 세포에서 그것을 발현시키며; 융합 단백질을 수득함으로써 생산할 수 있다. 경우에 따라서, 융합 단백질은 Fc를 코딩하는 뉴클레오타이드를 발현시키고 이를 통상적인 방법에 따라 생물학적 활성 분자에 결합시킴으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서 폴리펩타이드는 다음과 같은 화학식으로 나타낼 수 있다:
N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
상기에서 N'은 폴리펩타이드의 N-말단이고 C'는 C-말단이며;
Z1은 적어도 서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 또는 적어도 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열을 가리키며;
Y는 적어도 서열번호 11의 99 내지 113 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 또는 적어도 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열을 가리키며;
Z2는 적어도 서열번호 12의 111 내지 147 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역 또는 적어도 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열을 가리키며;
Z3은 적어도 서열번호 11의 118-223, 서열번호 12의 114-219, 서열번호 24의 165-270 위치, 또는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역을 포함하는 아미노산 서열을 가리키며;
Z4는 적어도 서열번호 11의 224-330, 서열번호 12의 220-326, 서열번호 24의 271-377, 또는 서열번호 13의 221-327 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 아미노산 서열을 가리키며; 및
p는 0 또는 1 인 정수이다.
상기 Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 양쪽 포함, 80 및 140개 사이이다.
Z1은 서열 번호 11의 90-98 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 쪽에서부터 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기 또는 서열번호 14의 90-98 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 쪽에서부터 5-9개의 연속된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, Z1은 IgG1 CH1 도메인 (서열 번호: 11) 또는 IgD CH1 도메인 (서열 번호: 14)의 5, 6, 7, 8 또는 9개의 C-말단 아미노산 잔기일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, Z1은 서열 번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 또는 서열 번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. Z1은 서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 또는 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 5 내지 9개로 구성되는 아미노산 서열일 수 있다. Z1은 또한 서열번호 11의 90 내지 98 아미노산 잔기 또는 서열번호 14의 90 내지 98 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 서열일 수 있다.
Y는 서열번호 11의 99 내지 113 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 쪽에서부터 5 또는 그 이상, 또는 10 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있으며, 또는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 쪽에서부터 5 또는 그 이상, 또는 10 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기일 수 있다.
특정의 구체예로서, Y는 서열 번호 11의 99 내지 113 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 158 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 153 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 143 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 133 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 또는 서얼번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다.
Z2는 서열번호 12 (hIgG2)의 111 내지 147 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 쪽에서부터 4 내지 37, 또는 6-30개의 연속된 아미노산 잔기 또는 서열번호 14 (hIgD)의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 쪽에서부터 4 내지 37, 또는 6-30개의 연속된 아미노산 잔기일 수 있다. 구체적인 양태에서, Z2는 인간 IgG2 CH2 도메인의 6개의 N-말단 아미노산 잔기 또는 인간 IgD CH2 도메인의 8개의 N-말단 아미노산 잔기일 수 있다.
Z2 및 Z3의 총 아미노산의 수는 80에서 140개 사이일 수 있다. 하나의 양태에서, Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 양쪽 포함, 90 과 120개 사이이다. 구체적인 양태로서, Z2 및 Z3의 총 아미노산 잔기의 수는 양쪽 포함, 105 와 115개 사이이다. 다른 구체적인 양태로서, Z2 및 Z3의 총 아미노산 잔기의 수는 108이다. 다른 구체적인 양태로서, Z2 및 Z3의 총 아미노산 잔기의 수는 109개이다.
Z4는 서열번호 11 (hIgG1)의 224-330, 서열번호 12 (hIgG2)의 220-326, 서열번호 24 (hIgG3)의 271-377, 또는 서열번호 13 (hIgG4)의 221 내지 327 위치의 90 또는 그 이상, 또는 100 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. Z4는 서열번호 11의 224-330, 서열번호 12의 220-326, 서열번호 24의 271-377, 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다.
본 발명의 구체예에 따라, Z3-Z4는 (ⅰ) 서열번호 11의 118 내지 223 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 11의 224 내지 330 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 연속된 아미노산 서열, (ⅱ) 서열번호 12의 114 내지 219 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 12의 220 내지 326 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 연속된 아미노산 서열, (ⅲ) 서열번호 24의 165 내지 270 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 24의 271 내지 377 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 연속된 아미노산 서열, 및 (ⅳ) 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역의 연속된 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열이다.
본 발명의 하나의 구체적인 양태에 따른 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 총 수는 154 내지 288개이다.
하나의 구체적인 양태로서 Y는 적어도 서열번호 11의 99-113 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, p는 1 또는 0일 수 있으며, Z2는 적어도 서열번호 12의 111-147 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있으며, Z3는 적어도 서열번호 11의 118-223, 서열번호 12의 114-219, 서열번호 24의 165-270, 또는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 양태에서, p가 1일 때, Z1은 적어도 서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다.
더 구체적인 양태로서, Z3는 서열번호 11의 118-223, 서열번호 12의 114-219, 서열번호 24의 165-270, 또는 서열번호 13의 115-220 위치의 73 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기일 수 있으며, Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 110개일 수 있다. Z2는 서열번호 12의 111-116 위치의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있고, Z3은 서열번호 11의 120-223, 서열번호 12의 116-219, 서열번호 24의 167-270, 또는 서열번호 13의 118 내지 220 위치의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다.
다른 구체적인 양태로서, Y는 적어도 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, p는 1 또는 0 (zero)일 수 있으며, Z2는 적어도 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, Z3는 적어도 서열번호 13의 121 내지 220 위치의 아미노산 잔기 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 양태에서, p가 1일 때, Z1은 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다.
더 구체적인 양태로서, Y는 서열번호 14의 99-162 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 쪽의 20개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 30개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 40개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 50개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 또는 60개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상일 수 있다. Z2는 서열번호 14의 163 내지 170 위치의 아미노산 잔기 일 수 있고, Z3는 서열번호 11의 124-223, 서열번호 12의 120-219, 서열번호 24의 171-270, 또는 서열번호 13의 121-220 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 쪽의 71 내지 100의 연속된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 108개일 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호, 6, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 폴리펩타이드는 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 28 및 서열번호 29로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열이다.
하나의 구체적인 양태로서 폴리펩타이드는 그 N-말단에서 생물학적 활성 분자의 천연형(native form)의 순환 반감기(circulating half-life)에 비해 증가된 순환 반감기를 보인다. 생물학적 활성 분자는 폴리펩타이드, 단백질, 또는 단일 펩타이드일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질 약물(drug)일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 가용성 단백질일 수 있는데, 예를 들면 호르몬, 사이토카인, 성장 인자, 공동-자극 분자 (co-stimulatory molecule), 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 또는 짧은 펩타이드(short peptide)일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 EPO 또는 그의 변이체/단편, p40 또는 그의 변이체/단편 (예를 들어, Asn303Gln 치환체를 포함하는 변이체), G-CSF 또는 그의 변이체/단편, TNF 수용체, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-10 수용체, TGF-β, TGF-β 수용체, IL-17, IL-17 수용체, 인자 Ⅶ, CXCL-11, FSH, 인간 성장 호르몬, BMP-1 (bone morphogenetic protein-1), CTLA4, PD-1, GLP-1, 베타셀룰린(betacellulin), OPG, RNAK, 인터페론-α, 인터페론-β 또는 그들의 변이체/단편일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생물학적 활성 분자는 성숙한 형태 (mature form)의 분비 단백질일 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다: (ⅰ)포유류 숙주 세포에 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자를 도입하는 단계, (ⅱ) 성장 배지에서 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 조건하에서 세포를 배양하는 단계, 및 (ⅲ) 발현된 폴리펩타이드를 수득하는 단계. 포유류 숙주 세포는 CHO, COS 또는 BHK 세포일 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 상기 언급된 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 (ⅰ) 자가면역 질환의 증상을 경감, 예방 또는 치료 (ⅱ) 이식 거부를 억제, 또는 (ⅲ) 내독소-유도된 쇼크를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 여기에서 폴리펩타이드는 생물학적 활성 분자에 융합된 폴리펩타이드를 말한다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 본 발명의 양태에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 폴리펩타이드는 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 28, 및 서열번호 29로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 핵산 분자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 26, 또는 서열번호 27에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 핵산 분자는 신호 서열 또는 리더 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 양태에 따라, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 그 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 발현 벡터의 예로서, pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1, pAD11 p40N303Q-hFc-1, pAD11 EPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-5 및 pAD11 TNFR-hFc-5를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 포유류에게 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에 생물학적 활성 분자를 전달하는 방법을 제공한다.
다른 하나의 구체적인 양태로서, 폴리펩타이드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된 Fc 도메인을 포함하며, 상기 힌지 영역은 적어도 인간 IgD 힌지 영역 또는 인간 IgG1 힌지 영역의 아미노산 잔기 부분을 포함하고; CH2 도메인은 적어도 인간 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 여기에서 인간 IgG4 CH2 도메인의 N-말단에 4-37개의 연속된 아미노산 잔기는 적어도 인간 IgG2 CH2 도메인의 N-말단 영역 또는 인간 IgD CH2 도메인의 N-말단 영역의 아미노산 잔기 부분으로 치환되고, 상기 CH3 도메인은 적어도 인간 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함한다.
힌지(hinge) 영역은 적어도 인간 IgG1 힌지 영역의 아미노산 잔기 부분을 포함할 수 있고, 상기 CH2 도메인은 적어도 인간 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기 부분을 포함하며, 여기에서 인간 IgG4 CH2 도메인의 N-말단의 4-37개의 아미노산 잔기는 적어도 인간 IgG2 CH2 도메인의 N-말단 부위의 아미노산 잔기의 부분으로 치환된다.
힌지 영역은 적어도 인간 IgD 힌지 영역의 아미노산 잔기의 부분을 포함할 수 있고, 상기 CH2 도메인은 적어도 인간 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기 부분을 포함하며, 여기에서 인간 IgG4 CH2 도메인의 N-말단의 4-37개의 아미노산 잔기는 적어도 인간 IgD CH2 도메인의 N-말단 부위의 아미노산 잔기의 부분으로 치환된다.
폴리펩타이드는 CH1 도메인을 더 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 CH1 도메인은 적어도 인간 IgG1 CH1 도메인의 아미노산 잔기 부분을 포함하고, 여기에서 상기 CH1 도메인은 상기 힌지 영역의 N-말단에 결합된다. 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 더 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 CH1 도메인은 인간 IgD CH1 도메인의 아미노산 잔기 부분을 적어도 포함하고, 여기에서 상기 CH1 도메인은 상기 힌지 영역의 N-말단에 결합된다. 폴리펩타이드는 상기 힌지 영역의 N-말단에 결합된 2차 폴리펩타이드를 더 포함할 수 있고, 여기에서 2차 폴리펩타이드는 생물학적 활성 비-면역글로불린 폴리펩타이드(biologically active non-immunoglobulin polypeptide)이다. 폴리펩타이드는 링커를 통해 상기 CH1 도메인의 N-말단 또는 상기 CH4 도메인의 C-말단에 결합된 생물학적 활성 분자를 더 포함할 수 있는데, 여기에서 상기 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 폴리펩타이드가 아니다. 폴리펩타이드 및 생물학적 활성 분자는 링커를 통하여 서로 결합될 수 있다. 링커 분자는 알부민 링커 (albumin linker) 또는 합성 링커 (synthetic linker)이다. 알부민 링커는 서열번호 25의 아미노산 서열 321 내지 323, 318 내지 325, 316 내지 328, 313 내지 330, 311 내지 333 또는 306 내지 338을 포함한다. 합성 링커는 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 아미노산 잔기의 10 내지 20개의 펩타이드일 수 있다. 하나의 구체적인 양태로서, 이러한 Gly-Ser 링커는 GGGGSGGGGSGGGSG (서열번호 32) 이다.
본 발명은 또한 재조합 Fc 부위를 포함하는 항체 분자를 포함한다. 재조합 Fc 부위는 상기에 기술되어 있다.
발명의 최선의 형태
본 발명은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 하이브리드 인간 면역글로불린 Fc 단편을 제공하는데, 여기에서 힌지 영역은 적어도 인간 IgD 힌지 영역 또는 인간 IgG1 힌지 영역의 부분적 아미노산 서열이며; CH2 도메인은 인간 IgG4 CH2 도메인으로서, 그 N-말단 영역이 인간 IgG2 CH2 또는 인간 IgD CH2 도메인의 N-말단 영역의 4-37개의 아미노산 잔기로 치환된 것이다. Fc 융합 단백질을 생산하기 위하여 생물학적 활성 폴리펩타이드와 같은 생물학적 활성 분자에 결합할 때, 상기 하이브리드 Fc 단편은 Fc 융합 단백질의 비-특이적 면역반응을 최소화하고, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 연장시키며, 생물학적 활성 분자의 활성을 최적화한다.
본 발명의 하나의 구체적인 양태에 따른 Fc 융합 단백질에 있어서, IgG4 CH2 도메인의 잔여 부분 (remaining portion)과 IgD CH2 도메인의 N-말단의 조합은, 융합 단백질에서 두 가지의 서로 다른 Ig 서브유닛(subunits)이 재조합되는 영역이 소수성이 되도록 하였다. 융합된 단백질의 소수성 영역은 폴드된 단백질 (folded protein)의 내부에 위치하게 되어, 원치않는 비-특이적 면역 반응을 최소화한다.
본원에서 사용되는 용어 "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 1 (CH1), 중쇄 불변 영역 2 (CH2) 및 중쇄 불변 영역 3 (CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1 (CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 그것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본원에서 "hFc"로 지칭되기도 한다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미하고, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "하이브리드"는 서로 다른 기원의 둘 또는 그 이상의 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 서열이 단일-사슬 면역글로불린 Fc 단편에 존재함을 의미한다.
하나의 구체적인 양태로서, 하이브리드 인간 Fc는 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 여기에서 상기 힌지 영역은 적어도 인간 IgD 힌지 영역 또는 인간 IgG1 힌지 영역의 부분적인 아미노산 서열이고; CH2 도메인은 인간 IgG4 CH2 도메인으로서, 그 N-말단 영역이 인간 IgG2 CH2 또는 인간 IgD CH2 도메인 N-말단 영역의 4-37개의 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 하이브리드 인간 Fc는 공유결합을 통하여 그 N-말단에서 생물학적 활성 분자의 C-말단에 결합될 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서, 생물학적 활성 분자 - 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드는 다음의 화학식에 의해 나타낼 수 있다.
N'-X-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C' 또는
N'-X-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-(linker)q-X-C'
여기에서 N'는 폴리펩타이드의 N-말단이고, C'는 폴리펩타이드의 C-말단이며; Z1은 서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역을 적어도 포함하거나 서열번호 14의 90-98 위치의 아미노산 잔기의 부분을 적어도 포함하는 아미노산 서열을 가리키고; Y는 서열번호 11의 99 내지 113 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역을 적어도 포함하거나, 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기의 부분을 적어도 포함하고; Z2는 서열번호 12의 111 내지 147 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 적어도 포함하거나 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 적어도 포함하며; Z3는 서열번호 11의 118-223, 서열번호 12의 114-219, 서열번호 24의 165-270, 또는 서열번호 13의 115 내지 220의 아미노산 잔기의 C-말단 영역을 적어도 포함하고; Z4는 서열번호 13의 221-327 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 적어도 포함하며, p 및 q는 각각 정수 0 또는 1이고, 여기에서 Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 양 쪽 모두 80에서 140개 사이이며, 링커는 링커 분자이고, X는 목적하는 생물학적 활성 분자이다.
하나의 구체적인 양태로서, Z3-Z4는 (ⅰ) 서열번호 11의 118 내지 223 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 11의 224 내지 330 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 연속된 아미노산 서열, (ⅱ) 서열번호 12의 114 내지 219 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 12의 220 내지 326 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 연속된 아미노산 서열, (ⅲ) 서열번호 24의 165 내지 270 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 24의 271 내지 377 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역을 포함하는 연속된 아미노산 서열, 및 (ⅳ) 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기의 C-말단 영역 및 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기의 N-말단 영역의 연속된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열이다.
본 발명의 하나의 양태에 따른 폴리펩타이드 아미노산 잔기의 총 수는 154에서 288개이다.
화학식 N'-X-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C' 및 N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-(linker)q-X-C'의 폴리펩타이드를 대상에게 투여하는 경우, X를 단독으로 투여한 경우의 순환 반감기보다 생물학적 활성 분자 X의 순환 반감기를 증가시킨다.
링커는 인간 알부민으로부터 유래될 수 있다 (서열번호 25 CAA00606). 링커는 서열번호 25의 아미노산 서열 321 내지 323, 318 내지 325, 316 내지 328, 313 내지 330, 311 내지 333, 또는 306 내지 338을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 링커는 합성 링커일 수 있다. 합성 링커는 Gly 및 Ser의 총 10-20개의 잔기로 구성된 펩타이드일 수 있다. 하나의 양태로서 Gly-Ser 링커는 GGGGSGGGGSGGGSG (서열번호 32)이다.
Z1은 인간 IgG1의 CH1 도메인 (서열번호 11) 또는 IgD (서열번호 14)의 영역을 적어도 포함할 수 있다. Z1은 IgG1 CH1 도메인 (서열번호 11의 90-98위치)의 C-말단 영역 또는 IgD CH1 도메인(서열번호 14의 90-98위치)의 C-말단 영역의 5 내지 9개 또는 7 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또는, Z1은 IgG1 CH1 도메인 또는 IgD CH1 도메인의 5,6,7,8 또는 9개의 C-말단 아미노산 잔기일 수 있다.
하나의 구체적인 양태로서, Z1은 서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 또는 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. Z1은 서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 또는 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 5 내지 9개로 구성된 아미노산 서열일 수 있다. Z1은 또한 서열번호 11의 아미노산 잔기 90 내지 98 또는 서열번호 14의 아미노산 잔기 90 내지 98로 구성된 아미노산 서열 일 수 있다.
Y는 인간 IgG1 또는 IgD의 힌지 영역의 부분을 적어도 포함할 수 있다. Y는 C-말단 IgG1 힌지 영역 (서열번호 11의 아미노산 위치 99 내지 113) 또는 IgD 힌지 영역 (서열번호 14의 아미노산 위치 99 내지 162)의 5 또는 그 이상, 또는 10 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, Y는 서열번호 11의 99 내지 113 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 158 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 153 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 143 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 서열번호 14의 133 내지 162 위치의 아미노산 잔기, 또는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다.
Z2는 인간 IgG CH2 도메인의 N-말단 영역 (서열번호 12의 111 내지 147 위치의 아미노산 잔기) 또는 IgD CH2 도메인의 N-말단 영역 (서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기)의 4 내지 37, 6 내지 30, 6 내지 12, 6 내지 8, 8 또는 6개의 연속된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, Z2는 인간 IgG2 CH2 도메인의 6개의 N-말단 아미노산 잔기 (서열번호 12의 아미노산 잔기 111-116) 또는 인간 IgD CH2 도메인의 8개 N-말단 아미노산 잔기 (서열번호 14의 아미노산 잔기 163-170)일 수 있다.
Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 양쪽 모두, 90에서 120개 사이일 수 있으며, 또는 양쪽 모두, 105에서 115개 사이일 수 있다.
Z4는 IgG4 CH3 도메인의 90 또는 그 이상, 또는 100 또는 그 이상의 연속된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다 (서열번호 11의 224-330, 서열번호 12의 220-326, 서열번호 24의 271-377, 또는 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기). Z4는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 98% 또는 95% 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 하나의 실시예로서, Z4는 인간 IgG CH3 도메인의 전체 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열이다. 예를 들면, Z4는 Kabat 등에 의한 EU 인덱스 넘버링으로 표시되는 인간 IgG4의 아미노산 잔기 341-347에 대응하는 인간 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 서열인데, 이는 서열 번호 13의 221-327 위치의 아미노산 잔기에 대응하는 것이다.
하나의 구체적인 양태로서, Y는 인간 IgG1 힌지 영역 (서열번호 11의 아미노산 잔기 99-113)의 C-말단 아미노산 잔기의 부분을 적어도 포함하는 아미노산 서열일 수 있으며, p는 1 또는 0일 수 있고, Z2는 인간 IgG2 CH2 (서열번호 12의 111-147 위치의 아미노산 잔기)의 N-말단 영역의 부분을 적어도 포함하는 아미노산 서열일 수 있고, Z3는 인간 IgG 서브클래스 중 어느 하나의 (서열번호 11의 118-223, 서열번호 12의 114-219, 서열번호 24의 165-270, 또는 적어도 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기)의 C-말단 영역의 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 이러한 양태에서, p가 1일 때, Z1은 적어도 인간 IgG1 CH1 도메인 (서열번호 11의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기)의 C-말단 영역의 부분을 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 예를 들어, Z1은 서열번호 11의 아미노산 잔기 90 내지 98일 수 있다.
보다 구체적인 양태에서, Z3는 인간 IgG4 CH2 도메인 (서열번호 13의 115-220 위치), 인간 IgG1 CH2 도메인 (서열번호 11의 118-223 위치), 인간 IgG2 CH2 도메인 (서열번호 12의 114-219 위치), 인간 IgG3 CH2 도메인 (서열번호 24의 165-270 위치)의 C-말단 영역의 73 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기일 수 있고, Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 110개일 수 있다. 예를 들면, Z2는 서열번호 12의 111-116 위치의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있고, Z3는 서열번호 13의 117 내지 220 위치의 아미노산 잔기의 아미노산 서열일 수 있다.
또 하나의 양태로서, Y는 적어도 인간 IgD 힌지 영역의 C-말단 영역의 부분을 포함하는 아미노산 서열(서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기)일 수 있고, p는 1 또는 0 (zero)일 수 있으며, Z2는 적어도 IgD CH2 도메인의 N-말단 영역의 부분을 포함하는 아미노산 서열(서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기)일 수 있고, Z3는 적어도 인간 IgG4 CH2 도메인의 C-말단 영역의 부위를 포함하는 아미노산 서열(서열번호 13의 121 내지 220 위치의 아미노산 잔기)일 수 있다. 예를 들면, Y는 서열번호 14의 158 내지 162, 133 내지 162, 또는 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기일 수 있고, Z2는 서열번호 14의 163 내지 170 위치의 아미노산 잔기일 수 있으며, Z3는 서열번호 13의 121-220 위치의 아미노산 잔기일 수 있다.
이러한 양태에서, p가 1 일때, Z1은 인간 IgD CH1 도메인의 C-말단 영역을 포함하는 아미노산 서열(서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기)일 수 있다. 예를 들면, Z1은 서열번호 14의 90 내지 98의 아미노산 잔기일 수 있다.
이러한 양태에서, Y는 인간 IgD 힌지 영역의 C-말단 쪽의 20개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 30개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 40개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 50개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상, 60개의 연속된 아미노산 잔기 또는 그 이상일 수 있다(서열번호 14의 99-162 위치의 아미노산 잔기). Z3는 서열번호 13의 121-220 위치의 아미노산 잔기의 C-말단의 71 내지 100개의 연속된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. Z2 및 Z3의 아미노산 잔기의 총 수는 108일 수 있다.
표 1은 본 발명의 구체적인 양태에 따른 hFc의 구조에 유용한 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgD의 단편의 아미노산 서열을 나타낸다.
hFc 도메인 Ig 단편의 허용가능한 범위 N-말단에서 C-말단 방향으로, 허용가능한 범위내의 가장 긴 단편의 서열 서열번호 서열번호의 위치 EU 색인의 위치 *
CH1 (Z1)
 IgG1 CH1의 5-9 C-말단 아미노산 잔기 SNTKVDKRV** 11 90-98 207-215
IgD CH1의 5-9 C-말단 아미노산 잔기 ASKSKKEIF 14 90-98 Not available
Hinge (Y)
 IgG1 힌지 영역의 5-15 C-말단 아미노산 잔기 EPKSCDKTHTCPPCP 11 99-113 216-230
IgD 힌지 영역의 5-64 C-말단 아미노산 잔기 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECP 14 99-162 Not available
CH2, N-말단 쪽 (Z2)
 IgG2 CH2의 4-37 N-말단 아미노산 잔기 APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTWVVVDVSH 12 111-147 231-267
IgD CH2 도메인의 4-37 N-말단 아미노산 잔기 SHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKD 14 163-199 Not available
CH2, C-말단 쪽 (Z3)
+
CH3(Z4)
 IgG4 CH2의 71-106 C-말단 아미노산 잔기
+
IgG4 CH3의 80-107 N-말단 아미노산 잔기		 LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK
+
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 		13 115-220
+
221-327		 235-340
+
341-447
IgG3 CH2의 71-106 C-말단 아미노산 잔기
+
IgG3 CH3 도메인의 80-107 N-말단 아미노산 잔기		 LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK
+
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCPVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
 24 165-270
+
271-377		 235-340
+
341-447

IgG2 CH2의 71-106 C-말단 아미노산 잔기
+
IgG2 CH3 도메인의 80-107 N-말단 아미노산 잔기		 VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTWVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFCVVSVL TVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK
+
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK		 12 114-219
+
220-326		 234-340
+
341-447
IgG1 CH2의 71-106 C-말단 아미노산 잔기
+
80-107 N-말단 아미노산 잔기		 LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
+
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 		11 118-223
+
224-330		 234-340
+
341+447
* EU 인덱스는 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services"에 기술되어 있다.
** 각 아미노산의 밑줄 친 영역은 허용가능한 아미노산 잔기 범위의 가장 짧은 단편을 가리킨다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 같이 hFc-1, hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5, 또는 hFc-6 중 하나의 하이브리드 Fc를 제공하거나, 도 3 및 도 4에서 나타낸 바와 같이 thFc-1 또는 thFc-2를 제공한다. 도 1 및 도 3은 이중 사슬 (double chain) Fc를 나타내지만, 본 발명은 단일 사슬 하이브리드 Fc 분자도 포함한다. hFc-1 내지 hFc-6의 아미노산 서열은 각각 서열번호 18-23에 제시되어 있으며, thFc-1 및 thFc-2의 아미노산 서열은 각각 서열번호 28 및 서열번호 29에 제시되어 있다. 본 발명은 또한 하이브리드 Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 본 발명은 서열번호 1 (hFc-1), 서열번호 2 (hFc-2), 서열번호 3 (hFc-3), 서열번호 4 (hFc-4), 서열번호 5 (hFc-5), 서열번호 6 (hFc-6), 서열번호 26 (thFc-1) 및 서열번호 27 (thFc-2)에 제시된 것과 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
인간 면역글로불린의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있으며 그들은 공개적으로 접근가능한 수탁기관 (publicly accessible depository)에 수탁되어 있다. 예를 들면, 인간 IgG1 불변 영역, 인간 IgG2 불변 영역, 인간 IgG3 불변 영역, 인간 IgG4 불변 영역, 및 인간 IgD 불변 영역의 아미노산 서열은 각각 CAA75032, CAC20455, CAC20456, AAH25985 및 P01880으로 이용할 수 있다. 이러한 서열들은 각각 서열번호 11, 12, 24, 13 및 14로 표시하였다.
생물학적 활성 분자 X는 가용성 단백질일 수 있다. 구체적으로, 호르몬, 사이토카인, 성장인자, 공동-자극 분자, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 또는 짧은 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, X는 EPO, p40, G-CSF, TNF 수용체 또는 이들의 변이체/단편일 수 있다. X는 GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-10 수용체, TGF-β, TGF-β 수용체, IL-17, IL-17 수용체, 혈액 인자 Ⅶ, CXCL-11, FSH, 인간 성장 호르몬, BMP-1(bone morphogenetic pritein-1), CTLA4, PD-1, GLP-1, 베타셀룰린 (betacellulin), OPG, RNAK, 인터페론-알파, 인터페론-베타 또는 이들의 변이체/단편일 수 있다. 또한 항체의 Fab 영역을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 생물학적 활성 분자는 또한 분비 단백질일 수 있다. 하나의 양태로서, 생물학적 활성 분자는 면역글로불린 군(immunoglobilin family)에 속하지 않는다.
용어 "변이체"란 이들의 핵심적인 특성을 보유하지만, 표준 핵산 또는 폴리펩타이드와는 상이한 폴리펩타이드 또는 핵산을 의미한다. 일반적으로, 변이체들은 전체적으로는 매우 유사하며, 그리고, 많은 영역에서 표준 핵산 또는 폴리펩타이드와 동일하다. 또한, 용어 "변이체"는 본 명세서 또는 당업계의 알려진, 적어도 하나의 기능 및/또는 치료학적 특성을 유지하는 생물학적 활성 분자 약물의 생물학적 활성 부분을 의미한다. 일반적으로, 변이체는 전체적으로 매우 유사하며, 많은 영역에서 목적하는 생물학적 활성 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 동일하다.
또한, 본 발명은 예컨대 서열번호 18-23 및 28-29로 표시되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 가지는 아미노산을 포함하거나, 또는 그러한 아미노산 서열로 구성된 단백질을 제공한다.본 발명은 또한 이러한 폴리펩타이드의 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 당업계에 알려진 (Ausubel, F. M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, at pages 6.3.1, 6.3.6 및 2.10.3) 엄격한 하이브리드화 조건(예, 약 45℃에서 6 x SSC (Sodium chloride/Sodium citrate)에서 필터에 결합된 DNA와 하이브리드화 한 다음 약 50-65℃에서 0.2 x SSC, 0.1% SDS에 한 번 이상 세척), 더욱 엄격한 조건 (약 45℃에서 6 x SSC에서 필터에 결합된 DNA와 하이브리드화 한 다음 약 68℃에서 0.1 x SSC, 0.2% SDS로 한 번 또는 그 이상 세척), 또는 다른 엄격한 하이브리드화 조건에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자의 보체와 하이브리드화한 폴리뉴클레오타이드에 의하여 코딩된 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
쿼리 아미노산 서열과 예컨대 적어도 95%의 "동일성"을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드는, 대상 폴리펩타이드 서열이 쿼리 아미노산 서열에서 100개 아미노산 당 5개까지의 아미노산의 치환을 포함하는 것을 제외하고는, 대상 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 쿼리 서열과 동일하게 된다. 즉, 쿼리 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해서, 대상 서열에 있어서 아미노산 잔기의 최고 5%가 삽입되거나, 결손되거나, 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 표준 서열의 치환은 표준 아미노산 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서 일어날 수 있고 이러한 말단 위치 사이라면 어디에서나 일어날 수 있으며, 표준 서열 내의 잔기들 사이에서 개별적으로, 또는 표준 서열 내의 하나 또는 그 이상의 연속적인 그룹에 산재 되어 일어날 수 있다.
실질적인 예로서, 어떤 특정한 폴리펩타이드가 예컨대 본 발명의 알부민 융합 단백질 또는 그 단편의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지는지 여부는 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 글로벌 서열 정렬 (global sequence alignment)로서 언급되기도 하는, 쿼리 서열 (본 발명의 서열)과 대상 서열 사이의 최상의 전체적 매치(match)를 결정하는 바람직한 방법은, Brutlag et al.의 알고리즘(Comp. App. Biosci. 6:237 245 (1990))을 기초로 한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에 있어서, 쿼리 및 대상 시퀀스는 모두 뉴클레오타이드 서열 또는 모두 아미노산 서열이다. 글로벌 서열 정렬의 결과는 퍼센트 동일성으로서 나타낸다. FASTDB 아미노산 정렬에 사용되는 바람직한 기준은: Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 또는 대상 아미노산 서열의 길이이며, 어느 쪽이든지 더 짧다.
변이체는 통상적으로, 일반적인 HA의 길이 또는 변이체와 동일한 길이인 치료 단백질과 적어도 75% (바람직하게는 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 99%)의 서열 동일성을 가질 수 있다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 수준에서의 상동성 또는 동일성은 서열 유사성 조사 목적으로 짜여진 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 2268 (1990) 및 Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290 300 (1993)) 프로그램이 도입된 알고리즘을 사용한 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 분석으로 결정된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩 부위, 비-코딩 부위, 또는 양쪽 모두에서의 변경을 포함할 수 있다. 특히 바람직하게는 코딩된 폴리펩타이드의 특성 또는 활성을 변경시키지 않는 사일런트 치환, 첨가, 또는 결손을 생산하는 변경을 포함하는 뉴클레오타이드 변이체이다. 바람직하게는 유전적 코드의 퇴화 (degeneracy)에 기인한 사일런트 치환으로 생산된 뉴클레오타이드 변이체이다. 더 나아가, 어떠한 조합에 있어서 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 10개 이하, 또는 5-50, 5-25, 5-10, 1-5, 또는 1-2개의 아미노산이 치환, 결손, 첨가된 폴리펩타이드 변이체 또한 바람직하다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 다양한 이유로 생산될 수 있는데, 예를 들면, 특정 숙주에의 코돈 발현을 최적화하기 위하여 (인간 mRNA 코돈을 효모 (yeast) 또는 E.coli와 같은 박테리아 숙주에 의해 선호되는 코돈으로 변화) 생산된다.
EPO-Fc 융합 구조물, G-CSF-Fc 융합 구조물, 또는 인간 40-Fc 융합 구조물과 같은 다양한 Fc 융합 단백질을 제조하기 위한 목적으로, 인간 EPO의 아미노산 서열, 인간 G-CSF, 인간 p40, 및 인간 TNF 수용체의 아미노산 서열은 NP_000790 (서열번호 15), CAA27291 (서열번호 16), AAG32620 (서열번호 17), 및 NP_001057 (서열번호 31)이 각각 사용될 수 있다. 하나의 구체적인 양태로서, 303 위치의 아미노산 잔기 Asn이 Gln으로 대체된, 변형된 인간 p40이 폴리펩타이드와 연결된다.
본 발명의 다른 양태로서, 제조된 Fc 영역을 포함하는 전체 항체를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 적어도 CH1, 힌지 영역, CH2 또는 CH3 중 적어도 2개 이상을 포함하는 항체 단편을 포함한다. 바람직하게는 전체 단일 클론 항체이다. 항체의 중쇄 가변 영역은 그 결합 특이성에 의해 선택되며 어떤 타입(type)이라도 될 수 있는데, 예를 들면 비-인간의 것, 인간화된 것 또는 전부가 인간의 것일 수 있다. 항체의 중쇄 가변 영역이 비-인간의 것 (예를 들면 쥐)으로서, 본원에 따라 제조된 Fc 영역과 재조합적으로 결합되는 경우, 이와 같이 생성된 재조합 항체를 키메릭 항체 (chimeric)라고 한다. 항체의 중쇄 가변 영역이 인간화된 것으로서, 본원에 따라 제조된 Fc 영역과 재조합적으로 결합되는 경우, 이와같이 생성된 재조합 항체를 인간화 항체라고 한다. 항체의 중쇄 가변 영역이 인간의 것으로서, 본원에 따라 제조된 Fc 영역과 재조합적으로 결합되는 경우, 이와같이 생성된 재조합 항체를 완전한 인간 항체라고 한다. 예를 들면, 중쇄의 가변 영역은 인간화되고, 인간 프레임워크 (framework) 영역 및 비-인간 (이 경우에서는 쥐) CDRs(complementary determining regions)를 포함한다. 프레임워크 영역은 하나의 소스(source) 또는 하나 이상의 소스로부터 유래될 수 있고 CDR은 하나의 소스 또는 하나 이상의 소스로부터 유래될 수 있다. 항체의 인간화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고, 당업계에 잘 알려져 있다.
항체의 경쇄는 인간, 비-인간 또는 인간화된 것일 수 있다. 경쇄는 도 1(b)에 나타난 것처럼, 경쇄는 인간화된 것이고 인간 프레임워크 영역, 비-인간 (이 경우에는 쥐) CDR, 및 인간 불변 영역을 포함한다. 프레임워크 영역은 하나의 소스 또는 하나 이상의 소스로부터 유래될 수 있으며, CDR은 하나의 소스 또는 하나 이상의 소스로부터 유래될 수 있다.
제조된 Fc 부위를 포함하는 항체는 세포 표면 분자 또는 세포 표면 분자에 결합하는 가용성 분자에 결합하는 능력에 기초하여 선택된다. 그러므로, 예를 들면, 항체는 사이토카인 수용체(IL-2R, TNF-αR, IL-15R 등), 부착 분자(adhesion molecules)(예, E-selectin, P-selectin, L-selectin, VCAM, ICAM 등), 세포 분화 또는 활성 항원 (예, CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD40 등) 등과 같은 세포 표면 분자에 결합하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 경우에 따라서, 항체는 세포 표면 분자에 결합하는 가용성 분자에 결합하는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 이러한 가용성 분자는 사이토카인 및 케모카인 (예, 인터루킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-5, IL-6 등), 성장인자 (예, EGF, PGDF, GM-CSF, HGF, IGF, BMP-1 등), 세포 분화를 유도하는 분자 (예, EPO, TPO, SCF, PTN, 등) 및 이 밖의 것들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일반적으로 본원에 제시된 항체 구조물은 유전공학적 기술을 이용하여 알려진 방법을 사용함으로써 수행된다. 예를 들면, DNA를 분리하는 기술, DNA를 발현하는 벡터를 제조하고 선택하는 기술, 핵산을 정제하고 분석하는 기술, 재조합 벡터 DNA를 제조하기 위한 특별한 방법에 대한 기술, 제한 효소로 DNA을 자르고, DNA를 붙이고, 안정적이거나 한시적인 수단으로 숙주 세포에 벡터 DNA를 포함하는 DNA를 도입하는 기술, DNA를 발현하는 세포를 선별 및 유지하기 위하여 선별 배지 또는 비-선별 배지에서 숙주세포를 배양하는 기술은 당업계에 일반적으로 알려져 있는 기술이다.
본원에 기술된 단일클론 항체는 당업계에 공지된 기술인 하이브리도마 기술을 이용하여 얻을 수 있으며, 또는 당업계에 잘 알려진 다른 재조합 DNA 방법을 이용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마 방법은, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물의 림프구에 의하여 항체의 생산될 수 있도록, DNA, 펩타이드 또는 단백질로 면역되는 것이다.
경우에 따라서, 림프구는 시험관 내(in vitro)에서 면역될 수 있다. 항원에 대한 반응으로 생산된 림프구는, 폴리에틸렌 글라이콜 (polyethylene glycol)과 같은 적절한 융합 제제를 사용하여 골수종 세포 (myeloma cells)와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 다음으로, 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모골수종 세포 (parental myeloma cells)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질이 포함된 적절한 배양 배지에 접종되어 성장한다. 바람직한 골수종 세포는 효과적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포의 안정적인 항체 생산을 유지해주며, HAT 배지 (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., Catalog No. H-0262)와 같은 배지에 민감하지 않은 세포이다.
제조된 Fc 영역을 포함하는 항체는 치료학적 제제와 결합되어 별도 투여되는 조성물로서 사용될 수도 있다. 진단 목적으로, 항체는 표지되거나 표지되지 않은 형태 모두 가능하다.
표지 되지 않은 항체는 인간 면역글로불린 불변 영역에 특이적인 항체와 같이, 제조된 항체에 반응하는 다른 표지된 항체 (2차 항체)와 함께 사용될 수 있다. 경우에 따라, 항체는 직접적으로 표지될 수 있다. 방사성핵종 (radionuclides), 플루오즈 (fluors), 효소 (enzymes), 효소 기질, 효소 보조-인자 (enzyme co-factors), 효소 억제제, 리간드 (특히 햅텐 (haptens)) 등 광범위하고 다양한 표지들이 도입될 수 있다. 많은 종류의 면역분석이 가능하며, 이러한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다.
하나의 구체적인 양태에서, 본 발명은 (ⅰ) 포유류 숙주 세포에 융합 단백질을 코딩하는 DNA 분자를 도입하는 단계; (ⅱ) 융합 단백질이 발현되는 조건하에 성장 배지에서 세포를 성장시키는 단계; 및 (ⅲ) 생산된 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
또 다른 실험적 구체예로서, 본 발명은 융합 단백질을 포함하는 약물학적 조성물, 또는 상기 기술한 항체 분자 또는 항체 단편을 제공한다. 또한 약물학적 조성물을 투여함으로써 특정 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, (ⅰ) 자가 면역 질환의 예방/치료에 대한 증상을 경감시키고, (ⅱ) 이식 거부 반응을 억제하며, (ⅲ) 하이브리드 Fc 및 p40 단백질의 융합 단백질 또는 이의 변이체/단편의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 내독소-유도된 쇼크를 치료/예방하는 방법을 제공한다.
조성물은 약물학적 담체를 포함할 수 있다. 약물학적 담체는 환자에게 항체를 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트 (완충제, 분산제) 또한 약물학적 조성물에 포함될 수 있다.
항체 조성물은 다양한 방법으로 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 약물학적 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 그 예는 피하, 근육 내 또는 정맥 내이다. 이러한 조성물은 통상적으로 잘 알려진 멸균 기술에 따라 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절과 같은 생리적 조건을 조절하기 위하여 요구되는 약물학적으로 허용가능한 보조 물질 및 보조제, 독성 조절 제제 및 이의 유사체를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 아세트산 나트륨 (sodium acetate), 염화 나트륨 (sodium chloride), 염화 칼륨 (potassium chloride), 염화 칼슘 (calcium chloride), 젖산 나트륨 (sodium lactate) 등이 있다. 이러한 제형에 있어서 융합 단백질, 항체, 또는 항체 단편의 농도는 매우 다양할 수 있는데, 예를 들면 무게에 따라 약 0.5% 이하일 수 있고, 일반적으로 또는 적어도 약 1% 내지 15% 또는 20%까지 일 수 있고 선택된 특정 투여 방법에 따라 체액 부피, 점성도(viscosities) 등에 우선적으로 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 핵산 분자를 운반하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 핵산은 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 필요로 하는 대상에게 직접적으로 운반될 수 있다. 경우에 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 배지에서 핵산을 발현함으로써 생산되며 그 후 대상에게 투여된다.
여기에서 사용된 용어 "약물"이란 인간 또는 동물에게 투여하였을 때 치료학적 활성을 나타내는 물질을 의미하며, 약물의 예로는 폴리펩타이드, 화합물, 추출물 및 핵산 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 약물은 바람직하게는 폴리펩타이드 약물이다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 활성 폴리펩타이드", "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 단백질", "활성 단백질"은 동일한 의미로 사용되고 있으며, 생체 내에서 다양한 생리학적 기능을 나타내는 생리활성형인 특징을 갖는다.
폴리펩타이드 약물은 쉽게 변성되거나 체내에서 단백질 가수분해 효소 (proteolytic enzyme)에 분해되는 특징으로 인하여 오랜 기간 동안 생리학적 활성을 유지할 수 없는 단점이 있다. 그러나, 폴리펩타이드 약물이 본 발명에 따른 면역글로불린 Fc 단편에 결합 (또는 커플링)하여 융합 단백질을 형성하는 경우, 약물은 구조적 안정성 및 혈청 반감기가 증가된다. 또한, Fc 단편에 결합되는 폴리펩타이드는 다른 알려진 폴리펩타이드 약물 제제 보다 생리학적 활성이 훨씬 적게 감소한다. 그러므로 통상적인 폴리펩타이드 약물의 생체 내 이용률 (bioavailability)과 비교할 때, 본 발명의 폴리펩타이드 약물 및 Fc 단편을 포함하는 융합된 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드 약물 및 Fc 단편의 결합체는 현저하게 증가된 생체 내 이용률을 가짐을 특징으로 한다. 이는 또한 본 발명의 실시예를 통하여 명확하게 기술된다. 즉, 본 발명의 Fc 단편이 결합된 IFN-α, G-CSF, EPO, p40, TNF 수용체 및 다른 단백질 약물들은 그들의 천연 형태 또는 다른 통상적인 융합 형태보다 생체 내 이용률을 증가시킨다.
본 발명은 Fc 융합 단백질, 본 발명에 따라 제조된 Fc 영역을 포함하는 항체, 본 발명의 실시에 유용한 항체 단편을 제조하기 위한 통상적인 재조합 DNA 방법론을 제공한다. Fc 융합 구조물은 바람직하게는 DNA 수준에서 제조되며, 제조된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고 본 발명의 융합 단백질, 항체 또는 항체 단편을 생산하기 위하여 발현된다.
본원에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 통합되고 숙주세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀 (episome)으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드 (phagemids), 코스미드 (cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 및 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역, 및 Fc 융합 단백질 생산물 또는 항체 또는 항체 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다.
유용한 발현 벡터는 RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체이다. 유용한 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV (cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA 의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자 (bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함해야 한다. 본 발명의 하나의 양태로서, 발현 벡터는 RcCMV의 변형 벡터인 pAD11이다. 생물학적 활성 분자 약물을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 운반하는 발현 벡터의 예는, 실시예에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1, pAD11 p40N303Q-hFc-1, pAD11 EPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFC-6, pAD11 p40N303Q-hFc-6, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-5 또는 pAD11 TNFR-hFc-5를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적절한 숙주 세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 현재 바람직한 숙주 세포는 불사의 하이브리도마 세포(immotal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포 (NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, 및 COS 세포를 포함한다.
포유류 세포에서 융합 단백질 또는 항체 또는 항체 단편을 높은 수준으로 발현시키기 위해 사용되는 하나의 발현 시스템은, 5' 에서 3' 방향으로 신호 서열 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 분비카세트, 및 p40, EPO, G-CSF, TNF 수용체와 같은 표적 단백질을 포함하는, 분비 카세트를 코딩하는 DNA 구조물이다. 몇몇의 표적 단백질들은 이러한 시스템에서 성공적으로 발현되고 있는데, 예를 들면 IL-2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, ss; IG-H3, IgE 수용체, PSMA, 및 gp120 등이다. 이러한 발현 구조물은 Lo et al.에 의하여 미국등록특허 제5,541,087호 및 제5,726,044호에 개시되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로써 통합된다.
본 발명의 융합 단백질 또는 항체 분자 또는 항체 단편은 발현될 때 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호 서열"은 생물학적 활성 분자 약물; 융합 단백질의 분비를 지시하는 단편을 의미하며, 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 본 발명의 신호서열은 ER (endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다. 본 발명에서 유용한 신호 서열은 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들면 항체 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열 (Sakano et al., Nature 1980. 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다.
신호 서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 알려져 있고, 그 보다 더 많은 또는 더 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호 서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다. 개시 이후에, 신호 펩타이드는 흔히 신호 펩티다아제 (signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다.신호 펩타이드의 잠재적인 절단 사이트는 일반적으로 "(-3, -1) 법칙"을 따른다. 그러므로 전형적인 신호 펩타이드는 작고, 위치 -1 및 -3에 중성 아미노산 잔기를 가지며, 이 부위 내에 프롤린 잔기가 결여되어 있다.
신호 펩티다아제는 -1 및 +1 아미노산 사이의 상기 신호 펩타이드를 절단하게 된다. 그러므로, 신호 서열은 분비하는 동안 융합 단백질의 아미노- 말단으로부터 절단될 수 있다. 이에 의해 면역글로불린 Fc 영역 및 목적 단백질로 구성되는 Fc 융합 단백질이 분비된다. 신호 펩타이드 서열의 세부적 사항은 von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683에 기술되어 있다.
특정 신호서열이 분비 카세트에 사용되기 적절한지를 알아보기 위해서는 일반적인 실험이 필요하다는 것은 당업자에게 명백하다.
이러한 실험은 융합 Fc 융합 단백질의 분비를 유도하기 위한 신호 서열의 능력을 결정 및 최적의 형태, 게놈 DMA 또는 cDNA의 결정, 융합 단백질의 효과적인 분비를 달성하기 위해 사용되는 서열의 결정을 또한 포함할 것이다. 또한, 당업계자는 von Heijne (1986)에 의해 제시되는 방법에 따라 합성 신호 펩타이드를 제조할 수 있고, 일반적인 실험으로써 상기 합성 신호 서열의 유효성을 테스트 할 수 있다. 신호 서열은 "신호 펩타이드", "리더 서열", 또는 "리더 펩타이드"를 의미할 수 있다.
신호 서열 및 면역글로불린 Fc 영역의 융합은 분비 카세트로 지칭되기도 한다. 본 발명의 실험에서 유용한 대표적인 분비 카세트는 5' 에서 3' 방향으로, 면역글로불린 경쇄 유전자 및 인간 면역 글로불린 y1 유전자의 Fcy1 영역의 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다. 면역글로불린 Fcy1 유전자의 Fcy1 영역은 바람직하게는 적어도 면역글로불린 힌지 도메인의 부분 및 적어도 CH3 도메인을 포함하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 힌지 도메인의 부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 면역글로불린 힌지 영역의 "부분"은 내부사슬 (interchain) 이황화결합을 형성할 수 있는 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 시스테인 잔기를 포함하는 면역 글로불린 힌지의 부분을 의미한다. 분비 카세트를 코딩하는 DNA는 그것의 게놈 형태 또는 그것의 cDNA 형태일 수 있다. 특정한 경우에는, 인간 면역글로불린 Fcy2 중쇄 서열로부터 Fc 영역을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 인간 면역글로불린 y1 및 y2 서열에 기초한 Fc 융합은 마우스에서도 유사하게 행동하지만, y2 서열에 기초한 Fc 융합은 인간에 있어서 우월한 약동학적 특징을 나타낸다.
다른 구체적인 양태로서, DNA 서열은 분비 카세트 및 목적 단백질 사이에 존재하는 단백질 분해 절단 부위를 코딩한다. 절단 부위는 코딩하는 융합 단백질의 단백질 분해 (proteolytic) 절단을 제공하며, 이에 따라 목적 단백질로부터 Fc 도메인을 분리한다. 본원에서 사용되는 용어 "단백질 분해 절단 부위"는 단백질 분해 효소 또는 다른 단백질 분해 제제에 의해 선택적으로 절단되는 아미노산 서열을 의미한다. 유용한 단백질 분해 절단 부위는 트립신 (trypsin), 플라스민 (plasmin) 또는 엔테로키나아제 K (enterokinase K)와 같은 단백질 분해 효소에 의해 인식되는 아미노산 서열을 포함한다. 많은 절단 부위/절단 제제 쌍이 알려져 있다 (예로, 미국등록특허 제5,276,044호를 보라).
또한, 불변 영역 도메인의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되거나 결실된 불변 영역의 구조물의 치환 또는 결실 역시 유용할 수 있다. 하나의 예는 Fc 수용체에 대한 친화력을 감소시킨 Fc 변이체를 제조하기 위해 위쪽 CH2 부위에 아미노산 치환을 도입하는 것이다(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613). 당업자는 잘 알려진 분자 생물학적 기술을 이용하여 상기 구조물을 제조할 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 단편에 결합될 수 있는 단백질 약물의 예는 인간 성장 호르몬, BMP-1 (bone morphogenetic protein-1), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류 및 인터페론 수용체류 (예, 인터페론-α, -β 및 -γ, 수용성 타입 Ⅰ 인터페론 수용체 등), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 글루카곤-유사 펩타이드 (glucagon-like peptides)(예, GLP-1, 등), G-단백질-결합 수용체 (G-ptotein-coupled receptor), 인터루킨류 (예, 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, 28, -29, -30 등) 및 인터루킨 수용체류 (예, IL-1 수용체, IL-4 수용체, 등), 효소 (예, 글루코세레브로시데이즈 (glucocerebrosidase), 이듀로네이트-2-설파테이즈 (iduronate-2-sulfatase), 알파-갈락토시데이즈 A (alpha-galactosidase-A), 아갈시데이즈 알파 및 베타 (agalsidase alpha and beta), 알파-L-이듀로니데이즈 (alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜리네스터레이즈 (butyrylcholinesterase), 키티네이즈 (chitinase), 글루타메이트 디카르복실레이즈 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 라이페이즈 (lipase), 유리케이즈 (uricase), 혈소판-활성화 인자 아세틸하이드롤레이즈 (platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈 (nuetral endopeptidase), 마이엘로페록시데이즈 (myeloperoxidase), 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질 (예, IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 대식세포 (marophage) 활성화 인자, 대식세포 펩타이드, B 세포 인자, T 세포 인자, 단백질 A, 알레르기 억제제, 세포 괴사 글라이코단백질 (cell necrosis glycoproteins), 면역독소 (immunotoxin), 림프독소 (lymphotoxin), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 종양 억제제 (tumor suppressors), 전이 성장 인자 (metastasis growth factor), 알파-1 안티트립신 (alpha-1 antitrypsin), 알부민 (albumin), 알파-락트알부민 (alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E (apolipopritein-E), 적혈구생성인자 (erythropoietin), 고당쇄화 적혈구생성인자 (highly glycosylated erythropoietin), 엔지오포이에틴 (angiopoietins); 헤모글로빈 (hemoglobin), 트롬빈 (thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드 (thrombin receptor activating peptide), 트롬보모듈린 (thrombomodulin), 혈액 인자 Ⅶ, 혈액 인자 Ⅶa, 혈액 인자 Ⅷ, 혈액 인자 Ⅸ, 혈액 인자 ⅩⅢ, 플라스미노겐 활성화 인자 (plasminogen activating factor), 피브린-결합 펩타이드 (fibrin-binding peptide), 유로키나아제 (urokinase), 스트렙토카이네이즈 (streptokinase), 히루딘 (hirudin), 단백질 C (protein C), C-반응성 단백질, (C-reactive protein), 레닌 억제제 (renin inhibitor), 콜라게네이즈 억제제 (collagenase inhibitor), 슈퍼옥사이드 디스뮤테이이즈(superoxide dismutase), 렙틴 (leptin), 혈소판-유래 성장 인자 (platelet-derived growth factor), 상피 성장 인자 (epithelial growth factor), 외피 성장 인자 (epidermal growth factor), 앤지오스타틴 (angiostatin), 앤지오텐신 (angiotensin), 뼈 성장 인자 (bone grwoth factor), 뼈 촉진 단백질 (bone stimulating protein), 칼시토닌 (calcitonin), 인슐린 (insulin), 아트리오펩틴 (atriopeptin), 연골 유도 인자 (cartilage inducing factor), 엘카토닌 (elcatonin), 결합 조직 활성 인자 (connective tissue activating factor), 조직 인자 경로 억제제 (tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone), 황체형성 호르몬 (luteinizing hormone), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (luteinizing hormone releasing hormone), 신경 성장 인자류 (nerve growth factor) (예, 신경 성장 인자, 섬모 신경영양 인자 (ciliary neurotrophic factor), AF-1 (axogenesis factor-1), 뇌-나트륨이뇨 펩타이드 (brain-natriuretic peptide), 신경 아교세포계 유래 향신경 인자 (glial derived neurotrophic factor), 네트린 (netrin), 호중구 억제 인자 (neurophil inhibitor factor), 향신경 인자 (neurotrophic factor), 뉴튜린 (neuturin) 등), 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone), 렐랙신 (relaxin), 세크레틴 (secretin), 소마토메딘 (somatomedin), 인슐린-유사 성장 인자 (insulin-like growth factor), 부신피질 호르몬 (adrenocortical hormone), 글루카곤 (glucagon), 콜레시스토키닌 (choledystokinin), 췌장 폴리펩타이드 (pancreatic polypeptide), 가스트린 방출 펩타이드 (gastrin releasing peptide), 코르티코트로핀 방출 인자 (corticotropin releasing factor), 갑상선 자극 호르몬 (thyroid stimulating hormone), 오토탁신 (autotaxin), 락토페린 (lactoferrin), 미오스타틴 (myostatin), 수용체류(예, TNFR(p75), TNFR(p55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성화 인자 수용체, 등) 수용체 길항제 (IL1-Ra 등), 세포 표면 항원 (예, CD2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 바이러스 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편 (예, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 및 바이러스 유래 백신 항원을 포함한다. 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fd 또는 scFv일 수 있으며, 이러한 항체 단편은 특이적 항원에 결합할 수 있고, 바람직하게는 Fab'이다. Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 가변 도메인 (VH) 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 힌지 영역으로부터 CH1 도메인의 카르복실 말단까지 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과는 상이하다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인만을 포함하며, F(ab')2 단편은 이황화 결합 또는 화학반응을 통하여 Fab' 단편이 쌍을 이룸으로써 제조된다. scFv (single-chain Fv) 단편은 펩타이드 링커로 연결된 VL 및 VH 도메인을 포함하므로 단일 폴리펩타이드 사슬로 존재한다.
구체적으로, 생물학적 활성 분자로서 바람직한 것은 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 체내에 투여될 때 투여빈도가 높은 것으로, 여기에는 인간 성장 호르몬, 인터페론 (인터페론-α, -β, -γ 등), 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), EPO (erythropoietin), TNF 수용체, p40 및 항체 단편이 포함된다.
또한, 특정 유도체들의 기능, 구조, 활성 또는 안정성이 생물학적 활성 분자의 천연형태와 실질적으로 동등한 경우 또는 그보다 개선된 경우, 그러한 유도체들도 본 발명의 생물학적 활성 분자의 범위에 포함되며, 가장 바람직한 폴리펩타이드 약물는 인터페론-알파이다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 예를 들면, IgG-Fc 및 IgG-CH 융합 단백질은 이량체를 형성하기 위하여 단량체로서 생산된다. 전형적으로 이량체는 IgG 힌지 영역에서의 이황화결합에 의하여 형성된다. IgG를 분비하는 세포로부터의 조건배지는, 융합 단백질은 IgG 융합 단백질 단량체 및 이량체의 혼합물을 포함할 수 있다. 인간 치료에 이용하기 위해서는 IgG 융합 단백질 단량체 또는 이량체의 균일 집단을 사용하는 것이 바람직하고, 두 형태를 혼합하여 사용하는 것은 바람직하지 않다.
본 발명은 또한 이량체 활성 폴리펩타이드 - IgG 융합 단백질 본래의 순수한 형태를 수득하는 방법을 제공한다. 그 방법은 일반적으로 IgG 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 숙주세포를 수득하고, 조건 배지를 모으고, 컬럼크로마토그래피에 의해 단량체 융합 단백질, 응집체 및 오염 단백질로부터 이량체 융합 단백질을 정제하는 것이다. IgG 융합 단백질을 발현시키는 적절한 숙주 세포는 효모, 곤충, 포유류 또는 다른 진핵 세포를 포함한다. 하나의 양태로서, 숙주세포는 포유류 세포일 수 있으며, 구체적으로 COS, CHO 또는 BHK 세포이다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드 약물 및 Fc 단편의 신규한 융합 단백질을 제공한다. 하나의 구체적인 양태로서, EPO, p40, G-CSF 또는 TNF 수용체 같은 폴리펩타이드 약물은 펩타이드 링커의 삽입 없이 하이브리드 Fc 단편에 직접적으로 결합된다. 다른 구체적인 양태로서 폴리펩타이드 약물은 1 내지 50 개의 아미노산의 펩타이드 링커를 통해 서로 결합되며, 더욱 바람직하게는 1 내지 7개의 아미노산의 펩타이드 링커를 통해 결합된다. 이러한 목적에 특히 유용한 링커는 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 (Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 서열번호 32) 또는 인간 알부민에서 유래된 서열번호 25의 282-314 위치의 아미노산으로 구성된 면역적으로 비활성인 펩타이드를 포함한다.
링커가 사용되는 경우, 링커 및 폴리펩타이드 약물은 특정한 방법으로 제조될 수 있다. 즉, 링커는 하이브리드 Fc 단편의 N-말단, C-말단 또는 유리 기에 연결될 수 있고, 또한 폴리펩타이드 약물의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 연결 부위에서 일어날 수 있다. 폴리펩타이드 약물 및 하이브리드 Fc가 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 결합(coupling)은 당업계에 알려진 여러 임의의 가교제를 사용하여 이루어질 수 있다. 가교제의 예는 1,1-비스 (다이아조아세틸)-2-페닐에테인 (1,1-bis (diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde),4-아지도살리실릭산 (4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스 (석신이미딜프로피오네이트) (3,3'-dithiobis (succinimidylpropionate))와 같은 다이석신이미딜 에스테르(disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르 (imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드 (bifunctional maleimides)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드 약물-하이브리드 Fc 단편의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드 약물의 투여하여 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 목적 질병과 직접적으로 관련되거나 관련되지 않은 건강 상태를 가진 포유류에게 본 발명의 폴리펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 바람직한 폴리펩타이드 약물-하이브리드 Fc 단편 융합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산이 개체, 바람직하게는 포유류에게 치료학적 제제로서 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 약물-하이브리드 Fc 단편 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포는 개체, 바람직하게는 포유류에게 치료학적 제제로서 투여될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드 약물-하이브리드 Fc 단편 융합 구조물은 개체, 바람직하게는 포유류에게 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 키메릭 폴리펩타이드는 정맥 내, 피하, 경구, 구강, 혀밑, 코, 비경구, 직장, 질 또는 폐 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 EPO (이의 변이체/단편을 포함한다)-Fc 융합 단백질은 포유류에 있어서 헤마토크릿 (hematocrit)을 유지하고 증가시키는데 유용할 수 있다.
p40은 IL-12 및 IL-23의 서브유닛 (subunit)이다. IL-12는 생체 내에서 여러 가지 기능을 갖는 75kDa의 이종이량체 사이토카인이다. 예를 들면, IL-12는 활성화된 T 및 NK 세포의 증식을 촉진시키고 Th1-타입 헬퍼 세포 (Th1-type helper cell) 반응을 촉진시킨다. IL-12는 활성화된 T 및 NK 세포의 혈장막 상의 IL-12 수용체에 결합함으로써 생물학적 효과를 발휘한다. IL-23은 Th17-타입 반응을 촉진시킨다. IL-12와 IL-23이 수용체에 결합하는 능력은 IL-12의 p40 서브유닛 동종이량체에 의해서 저해를 받는다. 그러므로 본 발명의 p40 (이의 변이체/단편을 포함한다)-Fc 융합 단백질은 (ⅰ)자가 면역 질환을 예방/치료의 증상을 완화시키며, (ⅱ) 이식 거부 반응을 억제하고, 또는 (ⅲ) 내독소-유도된 쇼크를 치료/예방하는데 유용할 수 있다. 또한 본 발명의 p40 (이의 변이체/단편을 포함한다)-Fc 융합 단백질은 류마티즘성 관절염(rheumatoid arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 염증성 장 질환(inflammatory bowl disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 또는 건선(psoriasis) 증상을 치료/예방/경감시키는데 유용할 수 있다. 변이체 및 단편은 당업계에 알려져 있으며 본원에 참고로써 통합되는 국제공개특허 제97/20062호를 포함하나 이에 한정되지 않는다. p40 변이체의 한 양태는 Asn303Gln 치환을 포함하는 p40을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
과립구 콜로니 촉진 인자 (G-CSF)는 과립구 특히 호중구 (neutrophil)의 증식 및 분화에 핵심적인 단백질이다. 과립구는 미생물 침입자 및 세포 잔여물을 가라앉히고 제거하므로 감염 반응에 핵심적이다. 화학치료는 과립구를 파괴하고/또는 과립구의 생산을 감소시킨다. 그러므로 본 발명의 G-CSF (이의 변이체/단편을 포함한다)-Fc 융합 단백질은 골수 이식 후에 화학 요법에 의해 유도된 호중구 감소증 골수 억제, 급성 백혈병, 무형성 빈혈(aplastic anemia), 골수이형성증후군 (myelodysplastic syndrome), 중증 만성 호중구 감소증, 또는 이식을 위한 말초혈액 조혈모세포의 가동화(mobilization of peripheral blood progenitor cells) 증상의 치료/예방/경감에 유용하다.
본 발명의 융합 단백질은 치료학적 제제로서 유용할 뿐만 아니라, 진단학적 사용을 위한 항체의 생산에 있어서도 유용함을 당업자가 인식할 수 있다. 그밖에도, 본 발명의 사용 방법은 DNA 또는 RNA의 적절한 투여, 예컨대 그러한 투여 목적의 벡터 또는 다른 전달 시스템을 포함한다.
본 발명의 조성물 (compositions)은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로 (예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로 (예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내 (intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강 내(intrathecal), 조 내(intracistenal), 캡슐 내( intracapsular), 비 내 (intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 수성 (aqueous) 이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 담체 또는 운반체 (vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있고, 이는 환자의 전해질 및/또는 부피 수가 (balace)에 악영향을 끼치지 않는다. 따라서, 제제를 위한 체액 배질로서 일반적으로 생리식염수 (physiologic saline)를 포함할 수 있다.
본 발명의 DNA 구조물 (또는 유전자 구조물)은 폴리펩타이드 약물 또는 이의 융합 단백질 구조물을 코딩하는 핵산을 운반하는 유전자 치료 프로토콜의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명은 원하는 폴리펩타이드 약물의 기능을 재구성하거나 보충하기 위하여 특정 세포 타입에서 목적 폴리펩타이드 약물 또는 이의 융합 단백질 구조물을 생체 내 감염 및 발현기키는 발현 벡터를 특징으로 한다. 원하는 폴리펩타이드 약물의 발현 구조물, 또는 이의 융합 단백질 구조물은 임의의 생물학적 유효 담체와 함께 투여될 수 있는데, 예를 들면 생체 내 세포에 원하는 폴리펩타이드 약물-코딩 유전자 또는 이의 융합 단백질을 효율적으로 운반할 수 있는 임의의 제형 또는 조성물 등이 그것이다.
본 발명은 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 (herpes simplex virus-1)을 포함하는 바이러스 벡터, 또는 재조합 박테리아 플라스미드 또는 재조합 진핵 플라스미드 내에 대상 유전자를 삽입하는 것을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 바람직한 투여량은 인간의 경우 0.1mg 내지 100mg의 범위 사이이며, 더욱 바람직하게는 1mg 내지 10mg, 가장 바람직하게는 2mg 내지 10mg이다. 최적량 및 투여 형태는 당업계의 기술 수준에 속하는 일반적인 실험에 의하여 결정할 수 있다.
융합 단백질의 바람직한 단위 투여량은 인간에 있어서 0.1mg - 1,000mg이며, 더욱 바람직하게는, 1mg - 100mg 및 가장 바람직하게는 5mg - 20mg이다. 이것이 최적량이긴 하나, 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입 (periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir) (예, 정맥주사 보유주머니 (intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
덧붙여, 본 발명의 융합 단백질은 다른 생물학적 활성 분자와 함께 대상 수용체에 투여될 수 있다. 그러나 융합 단백질 및 다른 분자의 최적의 조합,투여 형태, 정량은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 실험을 통하여 결정될 수 있다.
산업상 이용 가능성
본 발명은 생물학적 활성 분자 및 생물학적 활성 분자에 연결된 면역글로불린(Ig) Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. Fc 도메인은 (ⅰ)IgG1, IgG2, 또는 IgG4 또는 (ⅱ)IgG4 및 IgD의 하이브리드 인간 Fc 도메인이다. 하이브리드 Fc 는 생물학적 활성 분자의 담체로서 유용하다.
본 발명은 생물학적 활성 분자 및 생물학적 활성 분자에 연결된 면역글로불린(Ig) Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 본 발명에 따른 하이브리드 Fc 는 생물학적 활성 분자의 담체로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 "X"로 명시된 생물학적 활성 분자의 담체 단백질로서 사용되는 하이브리드 Fc(hFc)의 개략도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 상세한 설명에 따른 hFc를 이루는 IgG1 (서열번호 11), IgG2 (서열번호 12), IgG4 (서열번호 13) 및 IgD (서열번호 14)로부터 유래한 아미노산 위치를 나타내는 개요도이다. 다른 설명이 없는 경우, 같은 방식이 본 출원을 통한 폴리펩타이드의 아미노산 위치의 지시에도 적용된다.
도 3은 "AL"로 명시된 알부민 링커 펩타이드를 통하여 C-말단에 "X"로 명시된 생물학적 활성 분자가 각각 결합된 hFc의 개략 대표도이다.
도 4는 링커와 결합된 hFc의 개략도를 나타낸 것으로, 상기 링커는 본 발명의 상세한 설명에 따라 인간 알부민 (서열번호 25)으로부터 유래된 알부민 링커의 아미노산 위치를 나타낸다.
도 5는 hFc-6의 소수성 구획(hydrophobicity plot)의 결과를 나타낸다.
도 6(a)는 특이적 ELISA 분석을 이용한 MabThera® (Rituximab), hIgG1, Enbrel® (etanercept), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5의 FcγRI 결합 활성 결과를 나타낸다; 도6(b)는 특이적 ELISA 분석을 이용한 MabThera® (Rituximab), hIgG1, Enbrel® (etanercept), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5, p40N303Q-hFc-5의 C1q 결합 활성 결과를 나타낸다.
도 7(a)는 인간 F36E 세포주에서의 EPO의 생물 활성과 비교한 EPO-IgG1 Fc, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5, EPO-hFc-6 및 Aranesp® (darbepoetin alfa)의 생물 활성의 결과를 나타낸다; 도7(b)는 마우스 조혈 (hematopoietic) 세포주(NFS-60)에서의 Neulasta® (pegfilgrastim) 및 G-CSF-hFc-5의 시험관 내 생물 활성의 결과를 나타낸다; 도 7(c)는 인간 PBMCs에서의 p40 및 p40N303Q-hFc-5의 시험관내 생물 활성을 나타낸다; 도 7(d)는 쥐(murine) L929 세포에서의 Enbrel® (enanercept) 및 TNFR-hFc-5의 시험관 내 생물 활성 결과를 나타낸다; 도 7(e)는 인간 WISH 세포에서의 thFc-1-AL(0)-IFN-beta 및 thFc-1-AL(3)-IFN-beta의 시험관 내 생물 활성의 결과를 나타내었다.
도 8(a)은 SC 경로 (좌측 패널) 및 Ⅳ 경로 (우측 패널)를 통해 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에게 투여된 Aranesp® (darbepoetin alfa), EPO-hFc-1, 또는 EPO-hFc-5의 생체 내 반감기에 대한 결과를 나타낸다; 도 8(b)는 SC 경로(왼쪽 패널) 및 Ⅳ 경로 (우측 패널)를 통해 Sprague Dawley 쥐에게 투여된 LEUCOSTIM® (filgrastim) 및 G-CSF-hFc-1의 약동학적 결과를 나타낸다; 도 8(c)는 SC 경로를 통하여 키노몰구스 원숭이에게 투여된 p40N303Q-hFc-5 및 Enbrel® (etanercept)의 약동학적 결과를 나타낸다; 도 8(d)는 SC 경로를 통하여 Sprague Dawley 쥐에게 투여된 TNFR-hFc-5 및 Enbrel® (etanercept)의 약동학적 결과를 나타낸다.
도 9(a)는 SC 경로 (왼쪽 위 패널) 및 Ⅳ 경로 (오른쪽 아래 패널)를 통하여 키노몰구스 원숭이에게 투여된 Aranesp® (darbepoetin alfa) 및 EPO-hFc-5의 생체 내 생물 활성에 대한 결과를 나타낸다; 도 9(b)는 SC 경로 (위쪽 패널) 및 Ⅳ 경로 (아래쪽 패널)을 통하여 Sprague Dawley 쥐에 투여된 LEUCOSTIM® (filgrastim) 및 G-CSF-hFc-1의 생체 내 생물 활성 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 자세히 기술한다. 다만, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
< 실시예 1> hFc -1, hFc -2, hFc -3, hFc -4, hFc -5 및 hFc -6 융합 단백질의 발현 벡터 제조
hFc-1은 C-말단 IgG1 CH1 영역의 9개의 아미노산 (90-98), IgG1의 힌지 영역 (99-113), N-말단 IgG2 CH2 부위의 6개의 아미노산 (111-116), IgG4 CH2 영역의 103개의 아미노산 (118-220), 및 IgG4 CH3 영역의 107개의 아미노산 (221-327)을 포함한다(도 1 및 2). hFc-1의 아미노산 서열은 서열번호 18에 제시되어 있다. hFc-1 (서열번호 1), 인간 EPO (서열번호 7), 인간 G-CSF (서열번호 8) 및 인간 p40N303Q (인간 p40 서브유닛의 303번째 아미노산인 Asn이 Gln으로 치환된 돌연변이) (p40N303Q의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 제시되어 있으며, 인간 p40의 아미노산 서열은 서열번호 17에 제시되어 있다)을 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드를 얻기 위하여, 각각 이러한 뉴클레오타이드 분자들을 TOP Gene Technologies (Quebec, Canada) (www.topgenetech.com)의 커스텀 서비스 (custom service)에 의하여 합성하였다. 단백질 발현 수준을 증가시키기 위하여, 유전자의 코돈 사용을 최적화 시키는 것이 매우 효과적이다. 코돈 사용의 패턴은 유기체 (organisms)간에 상이하다. 어떤 코돈은 어느 하나의 유기체에서 매우 빈번하게 사용되나, 다른 유기체에서는 거의 사용되지 않는다. 코돈 사용에 있어서의 이러한 경향은 번역 효율, 코딩된 단백질을 합성하기 위한 유기체의 능력에 영향을 준다. 발현 벡터 pAD11 (서열번호 10)에 각 융합 유전자를 삽입시키기 위하여, EPO, G-CSF 및 p40N303Q의 ATG 서열의 5' 말단에 EcoR Ⅰ 부위를 생성시키고, hFc-1의 종결 코돈의 3' 말단에 Xba Ⅰ 부위를 생성시켰다. 발현 벡터 pAD11은 RcCMV 골격 (backbone)으로부터 수득하였다 (Invitrogen, Carlsbad로부터 가능). pAD11는, CMV (cytomegalovirus)로부터 유래된 프로모터, 우태 성장 호르몬으로부터 유래된 폴리 (A) 서열 (poly (A) sequences), 토끼 베타 글로빈에서 유래된 gIVS (globin intervening sequence) (Mol Cell Biol, 1988 8:4395) 및 기타 요소를 포함한다. pAD11 벡터를 제조하기 위하여는, RcCMV 벡터 (Invitrogen)를 여러군데 변형시킨다. 우선, 네오마이신 저항성(neomycin resistant) 부위는 Xho Ⅰ 효소에 의해 제거시키고, gIVS를 CMV 프로모터 부위의 3'에 추가시켰다. 또한, 마우스 DHFR (dihydrofolate reductase) 유전자 (Pubmed, NM 010049)는 CMV 프로모터의 5'에 추가시켰다. pA11 벡터는 상기 언급된 것들을 포함한 몇 가지 요소의 조합 상태에서 여러 가지 발현 테스트를 거쳐 개발되었다. 우리의 미발표 결과에서, pAD11 벡터는 RcCMV 벡터 (Invitrogen)과 비교할 때, 발현 수준에 있어서 약 12 배의 증가를 나타내었다. 프레임 내에서 EPO, G-CSF 및 p40N303Q의 3' 말단과 hFc-1의 5' 말단 사이의 연결 부위를 제조하기 위하여, EPO, G-CSF 및 p40N303Q의 코딩 서열의 3' 말단 및 hFc-1의 코딩 서열의 5' 말단에 Nhe Ⅰ부위를 생성시켰다. 각 제한 효소 부위를 이용한 서브클로닝 후, EPO, G-CSF 또는 p40N303Q로 융합된 hFc-1 최종 발현 벡터가 제조되었으며, 이들을 각각, pAD11 EPO-hFc-1, pAD11 G-CSF-hFc-1 및 pAD11 p40N303Q-hFc-1라고 명명하였다. hFc-2, hFc-3, hFc-4, hFc-5 및 hFc-6의 아미노산 서열은 각각 서열번호 19-23에 제시되어 있다. hFc-6은 IgD CH1 도메인 C-말단의 9개의 아미노산 (90-98), IgD의 힌지 영역의 64개의 아미노산(99-162), IgD CH2 도메인 N-말단의 8개의 아미노산 (shtqplgv 163-170), IgG4 CH2 도메인의 100개의 아미노산 (121-220), 및 IgG4 CH3 도메인의 107개의 아미노산 (221-327)을 포함한다 (도 1 및 2). hFc-6 (서열번호 6)을 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 분자를 수득하기 위하여, 유전자는 TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com)의 커스텀 서비스에 의해 합성하였다. 프레임 내에서 EPO, G-CSF, 또는 p40N303Q의 3' 말단 및 hFc-6의 5' 말단을 융합시키기 위하여, hFc-6의 N-말단 코딩 부위 (90 및 91 아미노산)에 포함된 Nhe Ⅰ 부위 (gctagc: Ala-Ser)를 사용하였다. 또한, pAD11 벡터 내로 각 hFc-6 융합 유전자를 삽입하기 위하여, Xba Ⅰ 부위를 hFc-6 유전자의 3' 말단에 생성시켰다. 각 제한 효소 부위를 사용하여 서브클로닝한 후, EPO, G-CSF 및 p40N303Q가 융합된 hFc-6를 제조하기 위한 최종 발현 벡터가 제조되었고, 이들을 각각 pAD11 pEPO-hFc-6, pAD11 G-CSF-hFc-6 및 pAD11 p40N303Q-hFc-6라고 명명하였다. hFc-2, hFc-3, hFc-4, 및 hFc-5는 동일한 CH2 및 CH3 부위를 가지나, 그들은 IgD 힌지의 크기가 상이하다 (도 1 및 2). hFc-2 (서열번호 19), hFc-3 (서열번호 20), hFc-4 (서열번호 21), 및 hFc-5 (서열번호 22)는 각각, C-말단 IgD 힌지의 5개의 아미노산 (158-162), 10개의 아미노산 (153-162), 20개의 아미노산 (143-162), 30개의 아미노산 (133-162)을 포함한다 (도 1 및 2). EPO, G-CSF, p40N303Q 또는 TNFR (tumor necrosis factor receptor Ⅱ) (서열번호 30) 및 이러한 hFc를 코딩하는 핵산 분자 (서열 번호 2-5)사이의 융합 유전자를 제조하기 위하여, 융합된 유전자 전체 크기에서의 최소 유전자 단편을 TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com)의 커스텀 서비스에 의하여 합성하였다. 각 hFc-2, hFc-3, hFc-4, 또는 hFc-5의 힌지 및 N-말단 CH2 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 분자와 융합된 각 EPO, G-CSF, p40N303Q 또는 TNFR의 단편은, 전체 EPO, G-CSF, p40N303Q 또는 TNFR 서열부터 IgG4 내의 CH2 영역 (서열번호 13)의 138-140 번째 아미노산 잔기에 위치하는 동일한 효소 부위인 BstE Ⅱ 부위 (GGTGACC)까지를 포함한다. 여러 유전자 단편을 포함하는 서브클로닝 벡터는 각각 5' 말단 및 3' 말단에 위치하는 EcoR Ⅰ 및 BstE Ⅱ으로 절단되고, 그 후 hFc-6의 CH2-CH3 부위에 연결된다. 최종적으로, 각 융합 유전자는 EcoR Ⅰ 및 Xba Ⅰ 부위를 사용하여 pAD11에 서브클로닝 시켰고, 이들을 각각 pAD11 EPO-hFc-2, pAD11 EPO-hFc-3, pAD11 EPO-hFc-4, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 G-CSF-hFc-2, pAD11 G-CSF-hFc-3, pAD11 EPO-hFc-4, pAD11 EPO-hFc-5, pAD11 p40N303Q-hFc-2, pAD11 p40N303Q-hFc-3, pAD11 p40N303Q-hFc-4, pAD11 p40N303Q-hFc-5, 및 pAD11 TNFR-hFc-5로 명명하였다.
< 실시예2 > IFN -β에 결합된 thFc -1 및 thFc -2를 위한 발현 벡터의 제조
thFc-1은 인간 tPA (tissue plasminogen activator)의 신호 서열의 23개의 아미노산(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS), IgG1 힌지 영역의 15개의 아미노산 (99-113), N-말단 IgG2 CH2 영역의 6개의 아미노산 (111-116), IgG4 CH2 영역의 103개의 아미노산 (118-220), 및 IgG4 CH3 부위의 107개의 아미노산 (221-327)을 포함한다. thFc-1의 아미노산 서열은 서열번호 28에 제시되어 있다. thFc-2는 tPA 신호 서열의 23개의 아미노산 (MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS), IgD 힌지 영역의 15개의 아미노산 (148-162), N-말단 IgD CH2 영역의 8개의 아미노산 (163-170), IgG4 CH2 부위의 100개의 아미노산 (121-220), 및 IgG4 CH3 영역의 107개의 아미노산 (221-327)을 포함한다 (도 3). thFc-2의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시되어 있다. 신호 서열이 제거된 인간 IFN-β의 N-말단에 결합된 thFc-1 (서열번호 26) 또는 thFc-2 (서열번호 27)를 코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드를 수득하기 위하여, 이러한 뉴클레오타이드 분자들을 TOP Gene Technologies (Quebec, Canada) (www.topgenetech.com)의 커스텀 서비스에 의하여 합성하였다. 발현 벡터 pAD11 (서열번호 10)에 각 융합된 유전자를 삽입하기 위하여, thFc-1 또는 thFc-2의 5' 말단에 EcoR Ⅰ부위를 생성시키고, IFN-β의 종결 코돈의 3' 말단에 Not Ⅰ 부위를 생성시켰다. 각 제한효소 부위를 이용하여 서브클로닝한 후, 최종 발현 벡터를 각각 pAD11 thFc-1-AL(0)-IFN-beta 및 pAD11 thFc-2-AL(0)-IFN-beta라고 명명하였다.
서로 다른 크기의 알부민 링커 또는 Gly-Ser 링커를 통하여 IFN-β에 결합된 thFc를 제조하기 위하여, 결합된 thFc-1의 CH3 영역의 Pst Ⅰ 부위부터 서로 다른 크기의 알부민 링커 (3aa, 8aa, 13aa, 18aa, 23aa 및 33aa) 또는 Gly-Ser 링커 (15aa)를 통하여 그 신호 서열이 제거된 IFN-β의 범위를 가지는 유전자 단편을 TOP Gene Technologies (www.topgenetech.com)의 커스텀 서비스에 의하여 합성하였다 (도 4). 발현 벡터 pAD11 thFc-1-AL(0)-IFN-beta 및 pAD11 thFc-2-AL(0)-IFN-beta에 7개의 상이한 유전자 단편을 삽입시키기 위하여, Pst Ⅰ부위를 그들의 5' 말단에 생성시키고, Not Ⅰ부위를 IFN-β의 종결 코돈의 3' 말단에 생성시켰다. 각 제한 효소 부위를 사용하여 서브클로닝한 후, 최종 발현 벡터를 pAD11 thFc-1-AL(1)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-AL(2)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-AL(3)-IFN-beta , pAD11 thFc-1-AL(4)-IFN-beta , pAD11 thFc-1-AL(5)-IFN-beta , pAD11 thFc-1-AL(6)-IFN-beta, pAD11 thFc-1-GS-IFN-beta 및 pAD11 thFc-2-AL(1)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(2)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(3)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(4)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(5)-IFN-beta, pAD11 thFc-2-AL(6)-IFN-beta, 및 pAD11 thFc-2-IFN-beta로 명명하였다.
< 실시예 3> 인간 EPO - hFc , 인간 G- CSF - hFc , 인간 p40N303QhFc , 인간 TNFR -hFc-5 및 thFcs - IFN - beta 단백질의 발현
발현 검증을 위하여 COS-7 세포를 사용하였고, 10% 우태 혈청 (Hyclone, South Logan) 및 항생 물질 (Invitrogen, Carlsbad)이 첨가된 DMEM 배지 (Invitrogen, Carlsbad)에서 배양하였다. EPO-hFcs, G-CSF-hFcs, p40N303Q-hFcs, TNFR-hFc-5, thFcs-IFN-beta를 코딩하는 벡터는 통상적인 전기천공 방법을 사용하여 5 X 106 COS-7 세포에 감염시켰다. 감염 48 시간 후에, 상청액 및 세포를 수득하였다. 각 벡터로부터의 융합 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 모든 샘플은 여러개의 키트를 사용하여 ELISA 분석(R&D system, Minneapolis, #DEP00 for EPO; Biosource, Camarillo, #KHC2032, for G-CSF; R&D system, Minneapolis, #DY1240 for p40N303Q R&D system, Minneapolis, #DRT200 for TNFR, PBL Biomedical Laboratories, #41410-1A for IFN-beta) 및 웨스턴 항-인간 IgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz)를 이용하여 블롯 분석하였다. 그 결과, 모든 벡터는 상청액 및 세포 용해물에서 정확한 발현 양상을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).
< 실시예 4> hFc -융합된 단백질의 정제
CHO/DHFR-/- 세포 (중국 햄스터 난소 세포, DG44, ATCC)는 α-MEM (Invitrogen, Carlsbad), 10% 투석된 우태 혈청 (JRH Biosciences, Kansas), HT 보충제 (Invtrogen, Carlsbad) 및 항생 물질 (Invitrogen, Carlsbad)에서 배양하였다. 통상적인 CaPO4 공침법(coprecipitation method)에 따라 발현 벡터를 CHO 세포에 감염시켰다. 감염 48 시간 후에, CHO 세포를 플레이트로부터 떼어내고 여러 비율(1/2, 1/5, 1/20, 1/50, 1/100, 1/200, 1/500)로 희석시켰다. 희석된 세포는 100mm 디쉬에 접종하고 HT 보충제가 없는 배지에 배양하였다. 스크리닝 과정 동안, 계대(passage) 하지 않은 세포에 HT 보충제가 없는 새로운 배지를 공급하였다. 콜로니는 접종한 2-3주 후에 생성되었고, 각 콜로니들을 48 웰 플레이트에 옮겼다. EPO, G-CSF, p40N303Q 및 TNFR 검출에 대한 ELISA 분석으로 양성 콜로니를 스크리닝 하였다. 가장 높은 발현을 나타낸 각 콜로니들은 무혈청 배지(serum free media)(JRH Biosciences, Kansas)를 사용하여 대규모(5L) 배양하였다. 수득된 무혈청 상청액은 각 융합 단백질을 정제하는 데 사용하였다. 정제를 위하여 20mM 인산 나트륨 (sodium phosphate)(pH 7.0)으로 HiTrap 재조합 단백질 A FF (Amersham biosciences, Piscataway) 컬럼의 균형을 유지시켰다. 여과된 상청액을 컬럼에 첨가하고 0.1M 구연산나트륨 (sodium citrate) (pH 3.0)으로 용출하였다. 용출된 단백질은 막 (MWCO 12 14K, spectrapor, Rancho Dominguez)으로 세 번 이상 투석한 후 최종적으로 수득하였다. 단백질 샘플의 모든 농도는 총 단백질을 측정하기 위한 BCA 키트 (Pierce Biotechnology, Rockford) 및 EPO-hFcs, G-CSF-hFcs, p40N303Q-hFcs, TNFR-hFc-5 및 thFcs-IFN-beta을 측정하기 위한 ELISA 키트에 의하여 결정하였다(Pierce Biotechnology, Rockford).
< 실시예 5> FcgR Ⅰ 및 C1q 결합 분석
hFc-5-융합된 단백질이 FcgRⅠ 및 C1q에 결합하는지 여부를 조사하기 위하여, MabThera (Rituximab, Roche), hIgG1 (Calbiochem, Cat#, 400120), Enbrel® (etanercept, Amagen), EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5 및 p40N303Q-hFc-5를 연속적으로 희석하였고(2㎍/㎖에서 16㎍/㎖까지 2배씩), 4℃에서 8 웰 스트립 상에 밤새 결합시켜 두었다. 표준 곡선을 만들기 위해, FcgRⅠ (R&D, cat#BAF1257) 또는 C1q (AbD serotech, Cat#. 2221-5504) 또한 연속적으로 희석하였고 (2㎍/㎖에서 32ng/㎖까지 2배씩) 4℃에서 오버나잇으로 8 웰 스트립(COSTAR, New York)상에 밤새 결합시켜 두었다. 세척 버퍼 (0.05% tween을 포함하는 PBS)로 각 샘플의 스트립을 세척하고 실온에서 1시간 동안 PBS에서 10% FBS로 억제한 후, 각 웰에 2㎍/㎖의 FcgRⅠ 또는 C1q를 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 모든 스트립은 세척 버퍼로 세척하였다. C1q 결합 검증을 위하여, 각 웰에 2.5㎍/㎖의 항-C1q (AbD serotech, cat#. 2221-5004P) 결합된 HRP를 첨가한 후 암(dark) 조건의 실온에서 30 분간 배양하였다. FcgRⅠ결합 검증을 위하여, 각 웰에 2㎍/㎖의 비오티닐화(biotinylated)된 항-FcgRⅠ(R&D, cat#. 1257-FC)를 첨가한 후 실온에서 1시간동안 배양하였다. 세척 버퍼로 이들을 세척한 후, 3000 배로 희석된 스트렙타비딘-HRP (BD, cat#.554066)를 각 스트립에 첨가한 후 암 조건의 실온에서 30 분간 배양하였다. 스트립을 세척한 후, TMB 용액 (TMB 페록시데이즈 기질 및 페록시데이즈 기질 용액 B, KPL의 1:1 혼합물, KPL, cat#. 50-76-01, cat#, 50-65-00)을 첨가하고, 2N H2SO4를 첨가하였다. 도 6(a) 및 도 6(b)에 나타난 바와 같이, MabThera®, Enbrel® 및 hIgG1은 FcgRⅠ 및 C1q에 잘 결합되었으나, EPO-hFc-5, G-CSF-hFc-5 및 p40N303Q-hFc-5는 그렇지 않은 것으로 나타났다.
< 실시예 6> 정제된 hFc -융합 단백질의 시험관 내( in vitro ) 생물 활성
EPO-hFc 단백질의 시험관 내 생물활성을 조사하기 위하여, 인간 F35E 세포주를 10% FBS, 항생 물질 및 5 IU/㎖ 재조합 인간 EPO (DongA, Republic of Korea)가 첨가된 RPMI1640 배지 (Cambrex, Charles City)에서 배양하였다. 96-웰 세포 배양 플레이트 (Corning , Netherlands)의 테스트 웰에 2 X 104 세포를 접종하여 생물검정 (Bioassay)을 수행하였다. EPO, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5, EPO-hFc-6, EPO-IgG1 Fc 또는 Aranesp (darbepoetin alfa, Amgen)을 연속적으로 희석한 (0, 0.064mIU/㎖ 내지 25IU/㎖) 샘플을 이러한 웰에 첨가하였고, 플레이트는 습한 5% CO2 배양기에 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 세포 성장 비색 분석 키트 (cell groth colorimetric assay kit) (Sigma-Aldrich, Korea)를 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 인간 F35E 세포주는, 세포 수 및 흡광도 값에서의 용량의존방식에 의해 증명된 것과 같이, rEPO에 대해 강한 증식 반응을 보였다. 도 7(a)에 제시된 것과 같이, IgG1 Fc 또는 hFc에 결합된 Aranesp® 및 EPO 단백질은 EPO 단백질에 비해 생물학적 활성이 감소된 것으로 나타났다. 그러나, EPO-hFc-1, EPO-hFc-5 및 EPO-hFc-6는 EPO-IgG1 Fc 보다 현저하게 증가된 생물활성을 나타냈다. 또한, EPO-hFc-5 및 EPO-hFc-6는 Aranesp®보다 약간 높은 생물활성을 보이는데, 이는 hFc-융합 단백질이 EPO 단백질의 생물활성 유지에 있어서 Aranesp®보다 더 우수하게 보이는 것을 의미한다.
시험관 내 G-CSF-hFc 단백질의 생물활성을 조사하기 위하여, 마우스 조혈 세포주 NFS-60을 10% FBS, 항생 물질 및 100 units/㎖ 재조합 마우스 IL-3 (R&D system, Minneapolis)이 첨가된 RPMI1640 배지 (Cambrex, Charles City)에서 배양하였다. 96-웰 세포 배양 플레이트 (Corning , Netherlands)의 웰에 2 X 104 세포를 접종하여 생물검정(Bioassay)을 수행하였다. G-CSF-hFc-5 및 Neulasta를 연속적으로 희석(0에서 10,000 pg/㎖까지의 범위에서 3 배씩)한 샘플 (pergfilgrastim, Amgen)을 이러한 웰에 첨가하였고, 플레이트는 습한 5% CO2 배양기에 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 단백질 샘플은 triplicate well에서 분석하였고, 이러한 실험은 반복하여 다섯 번 수행되었다. 72 시간 배양 후에, 제조사의 프로토콜에 따라 세포 성장 비색 분석 키트 (Sigma-Aldrich, Korea)를 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 도 7(b)에 제시된 것과 같이, G-CSF-hFc-5는 Neulasta®보다 약간 더 높은 시험관 내 생물활성을 보였다.
p40N303Q-hFc 단백질의 시험관 내 생물활성을 조사하기 위하여, 10% FBS, 및 항생 물질을 첨가한 PRMI1640 배지 (Cambrex, Charles City)에서 항-인간 CD3 항체 (R&D system, # MAB100) 2㎍/㎖가 존재하고, 인간 p40 (R&D system) 10ng/㎖ 또는 p40N303Q-hFc-5가 존재하거나 또는 존재하지 않는 환경에서 류마티스성 관절염 환자의 PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)를 배양하였다. 6일 후, CD4 및 IL-17 에 대해 양성인 세포를 FACS 분석으로 측정하였다. 도 7(c)에 제시된 바와 같이 p40N303Q-hFc-5는 p40 단백질보다 CD4+/IL-17+ 세포의 생산에 있어서 더욱 강력한 억제 효과를 나타내었는데, 이는 Th17의 극성화(polarization)에서의 p40N303Q-hFc-5의 억제 기능을 나타내는 것이다.
TNFR-hFc 단백질의 시험관 내 생물활성을 조사하기 위하여, 쥐 L929 세포를 10% FBS 및 항생 물질이 첨가된 RPMI1640(Cambrex, Charles City) 배지에서 배양하였다. 96-웰 세포 배양 플레이트 (Corning, Netherlands)의 웰에 3 X 410 개의 세포를 접종하여 세포 변성 억제 분석 (cytopathic inhibition assay)을 시작하였고, 그 후 TNF-α 1ng/㎖를 처리하였다. TNFR-hFc-5 및 Enbrel® (etanercept, Amgen)가 연속적으로 희석된(15.6에서 1,000 ng/㎖ 범위에서, 2 배씩) 샘플을 이러한 웰에 첨가하였고 플레이트는 습한 5% CO2 배양기에 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 제조사의 프로토콜에 따라 세포 성장 비색 분석 키트 (Sigma-Aldrich, Korea)를 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 도 7(d)에 제시된 것과 같이, TNFR-hFc-5는 시험관 내에서 Enbrel®보다 약간 더 높은 생물활성을 보였다.
thFc-1-AL(0)-IFN-beta 및 thFc-1-AL(3)-IFN-beta 단백질의 시험관 내 생물활성을 조사하기 위하여, WISH 세포 (ATCC, CCL-25)가 10% FBS 및 항생 물질이 첨가된 DMEM/F12 (Cambrex, Charles City) 배지에서 배양되었다. 96-웰 세포 배양 플레이트 (Corning, Netherlands)의 웰에 3 X 410 개의 세포를 접종하여 세포 변성 억제 분석 (cytopathic inhibition assay)을 수행하였고, 그 후 VSV (ATCC, VR-158) 1,500 PFU/well로 처리하였다. 재조합 IFN-beta (WHO 표준, NIBSC 00/572), thFc-1-AL(0)-IFN-beta 및 thFc-1-AL(3)-IFN-beta 단백질이 연속적으로 희석된 샘플(40 IU/㎖부터 2 배씩)을 이러한 웰에 첨가하였고 플레이트를 습한 5% CO2 배양기에 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 제조사의 프로토콜에 따라 세포 성장 비색 분석 키트 (Sigma-Aldrich, Korea)를 사용하여 MTT 분석을 수행하였다. 도 7(e)에 제시된 것과 같이, thFc-1-AL(3)-IFN-beta는 thFc-1-AL(0)-IFN-beta 보다 20배 더 높은 생물활성을 보였는데, 이는 Fc에 융합된 IFN-β의 생물활성을 유지하는데 알부민 링커가 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
< 실시예 7> 정제된 hFc -융합된 단백질의 생체 내( in vivo ) 반감기
EPO-hFc-1, EPO-hFc-5 및 Aranesp®의 반감기를 비교하기 위하여, 15 마리의 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에 단일(single) 피하 (subcutaneous, SC) 주입 또는 단일 정맥(intravenous, IV) 주입을 통해 2,400 IU/kg의 양으로 이들 단백질을 처리하였다. 주입 전 및 주입 후 1, 3, 6, 12, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96, 120, 168, 336, 504, 및 672 시간에 각 원숭이의 혈액 샘플을 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온에서 배양하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플로부터 혈청을 수득하고, 초 저온 냉동고(deep freezer)에 저장하였다. 각 시간에 수득한 모든 샘플을 정량화하기 위하여 EPO ELISA 키트를 이용해 테스트하였다. 도 8(a)에 제시된 것과 같이, SC 또는 IV 경로를 통해 EPO-hFc-1 또는 EPO-hFc-5가 주입된 모든 원숭이들은 SC 또는 IV 경로를 통해 Aranesp®가 주입된 원숭이보다 긴 반감기를 나타내었다.
G-CSF-hFc-1의 약동학(pharmacokinetics)을 조사하기 위하여, 그룹 당 두 마리의 수컷 Sprague Dawley Rats (Charles River Laboratories, Wilmington)에 SC 또는 IV 경로를 통해 대조군으로서 LEUCOSTIM® (filgrastim, DongA, Republic of Korea) 100㎍/kg 및 GCSF-hFc-1을 투여하였다. 주입 전 및 주입 후 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 및 192 시간에 혈액을 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온에서 배양하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플의 혈청을 수득하였고, 초저온 냉동고(deep freezer)에 저장하였다. 샘플은 G-CSF 키트(Biosource, Camarillo, #KHC2032)를 사용하여 1/2, 1/5, 1/50, 1/250, 1/500과 같은 몇 가지의 희석 비율로 정량하였다. 도 8(b)에 제시된 것과 같이, SC 또는 IV 경로를 통해 주입된 G-CSF-hFc-1은 LEUCOSTIM® 보다 긴 반감기를 보였다. G-CSF-hFc-1 및 G-CSF는 SC 투여 후 각각 8.76시간 및 2.36시간의 생체 내 반감기를 가졌고, IV 투여 후에 각각 10.42시간 및 1.78시간의 생체 내 반감기를 가졌다. 따라서 G-CSF-hFc-1는 LEUCOSTIM®과 비교할 때, SC 주입의 경우 3.7 배 및 IV 주입의 경우 5.9배의 반감기 증가를 보였다.
p40N303Q-hFc-5 및 Enbrel®의 약동학을 조사하기 위하여, 그룹 당 세 마리의 키노몰구스 원숭이에 100㎍/kg의 양으로 이들 단백질을 단일 SC 주입 처리하였다. 각 원숭이의 혈액 샘플은 주입 전 및 주입 후 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 336, 504 및 672 시간에 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온에서 배양하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플로부터 혈청을 수득하고, 초저온 냉동고에 저장하였다. 각 시간에 수득한 모든 샘플은 인간 p40 및인간 TNFRⅡ를 정량화하기 위하여 ELISA 키트를 이용해 테스트하였다. 도 8(c)에 제시된 것과 같이, p40N303Q-hFc-5는 Enbrel®보다 낮은 Cmax 값(평균 3ng/㎖ vs 7ng/㎖)을 나타냈지만, p40N303Q-hFc-5는 Enbrel®보다 긴 반감기를 나타내었다(평균 199h vs 127h).
TNFR-hFc-5 및 Enbrel®의 약동학(pharmacokinetics)을 조사하기 위하여, 그룹 당 세 마리의 Sprague Dawley Rats (Charles River Laboratories, Wilmington)에 500㎍/kg의 양으로 이들 단백질을 단일 SC 주입하였다. 각 랫트의 혈액 샘플은 주입 전 및 주입 후 2, 4, 8, 12, 24, 30, 48, 72 및 120 시간에 수득하였다. 혈액 샘플은 응집을 위해 30분 동안 실온에서 배양하였다. 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 각 샘플로부터 혈청을 수득하고, 초저온 냉동고에 저장하였다. 각 시간에 수득한 모든 샘플은 인간 TNFRⅡ를 정량화하기 위하여 ELISA 키트(R&D system, Minneapolis, #DRT200)를 이용하여 테스트하였다. 도 8(d)에 제시된 것과 같이, TNFR-hFc-5는 Enbrel®의 반감기와 유사하게 나타났지만(평균 28.6h vs 29.4h), TNFR-hFc-5는 Enbrel® 보다 높은 AUC 수준을 나타내었다(평균 198.1 vs 172.9㎍*h/㎖).
< 실시예8 > 정제된 hFc -융합 단백질의 생체 내 생물활성
EPO-hFc-5 및 Aranesp®의 생체 내 생물활성을 비교하기 위하여, 그룹당 세 마리의 키노몰구스 원숭이에 2,400 IU/kg의 양으로 이들 단백질을 단일 SC 주입 또는 단일 IV 주입 처리하였다. 주입 전 및 주입 후 1, 3, 6, 12, 24, 30, 48, 54, 72, 78, 96, 120, 168, 336, 504, 및 672 시간에 각 원숭이의 혈액 샘플을 수득하였다. EPO-hFc-5 및 Aranesp®의 생체 내 생물활성을 평가하기 위해 망상적혈구 (reticulocytes)를 포함한 다양한 혈액 세포의 수를 측정하였다. 도 9(a)에 나타난 바와 같이 원숭이에서의 망상적혈구 증가와 관련하여, EPO-hFc-5는 SC 및 IV 경로 모두에서 Aranesp®보다 약간 높은 생체 내 효능(potency)을 보였다.
G-CSF-hFc-1의 생체 내 생물활성을 조사하기 위하여, 대조군으로서 LEUCOSTIM® (filgrastim, DongA, Republic of Korea), 및 G-CSF-hFc-1을 100㎍/kg 양으로 SC 또는 IV 경로를 통해 그룹 당 두 마리의 수컷 Sprague Dawley 랫트 (Charles River Laboratories, Wilmington)에게 투여하였다. 주입 전 및 주입 후 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 및 192 시간에 EDTA를 사용하여 혈액을 수득하였다. 각 혈액 샘플은 RBC 용해 버퍼 (RBC lysis buffer)(BD Bioscience, Korea)로 4분 동안 처리하였고 FACS 버퍼에서 희석된 총 WBCs (white blood cells)는 혈구계선반 (hematocytometer)을 사용하여 3번 반복하여 카운트 하였다. FACS 칼리버 (FACS caliber)를 사용하여 FSC (forward scatter, 정방향 스캐터)로 세포 크기를 결정하고 SSC (side scatter, 측면 스캐터)로 과립의 크기 결정함으로써 과립구의 수를 측정하였다. 도 9(b)에 제시된 것과 같이, SC 및 IV 경로를 통하여 처리된 LEUCOSTIM®은 주입 24시간 후에 WBC 및 과립구의 피크 수를 유도한 반면, G-CFS-hFc-1은 SC 주입 72시간 후, 및 IV 주입 48 시간 후에 WBC 및 과립구의 피크 수를 유도하였다. 주입 후 24시간에서 120 시간에, LEUCOSTIM®과 비교할 때, G-CSF-hFc-1은 생체 내 생물활성을 더욱 높게 지속시켰다.
이상 본 발명을 구체적인 실시예로서 보여주고 기술하였으나, 당업자는 다음의 청구항에 의해 정해지는 본원 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 한 발명의 형태 및 상세의 다양한 변경이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (17)

  1. 하기 식으로 표현되는 폴리펩타이드:
    N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
    상기 N'은 폴리펩타이드의 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 C-말단이고;
    p는 0 또는 1인 정수이고; 및
    Z1은 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Y는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 6 내지 9개, 11 내지 14개, 16 내지 19개, 21 내지 29개, 또는 31 내지 63개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z2는 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z3는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
    Z4는 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이다.
  2. 하기 식으로 표현되는 폴리펩타이드:
    N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
    상기 N'은 폴리펩타이드의 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 C-말단이고;
    p는 0 또는 1인 정수이고; 및
    Z1은 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Y는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5개, 10개, 15개, 20개, 30개 또는 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z2는 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z3는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
    Z4는 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열로서,
    여기에서, Z2가 8개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이면서, 동시에 Z3가 100개의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열인 경우는 제외한다.
  3. 하기 식으로 표현되는 폴리펩타이드:
    N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
    상기 N'은 폴리펩타이드의 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 C-말단이고;
    p는 0 또는 1인 정수이고; 및
    Z1은 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Y는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z2는 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z3는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 100 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
    Z4는 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 327 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이다.
  4. 하기 식으로 표현되는 폴리펩타이드:
    N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
    상기 N'은 폴리펩타이드의 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 C-말단이고;
    p는 0 또는 1인 정수이고; 및
    Z1은 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Y는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z2는 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z3는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 99개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
    Z4는 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 327 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이다.
  5. 하기 식으로 표현되는 폴리펩타이드:
    N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
    상기 N'은 폴리펩타이드의 N-말단이고 C'는 폴리펩타이드의 C-말단이고;
    p는 0 또는 1인 정수이고; 및
    Z1은 서열번호 14의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Y는 서열번호 14의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z2는 서열번호 14의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 36개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z3는 서열번호 13의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 99개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
    Z4는 서열번호 13의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 327 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 및 생물학적 활성 분자를 포함하는 키메릭 폴리펩타이드에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자는 상기 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 것이고, 상기 생물학적 활성 분자는 그 생물학적 활성 분자의 천연형의 순환 반감기에 비해 증가된 순환 반감기를 나타내는 것인, 키메릭 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자는 가용성 단백질인 키메릭 폴리펩타이드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 및 상기 생물학적 활성 분자는 링커를 통해 서로 연결된 것인 키메릭 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커는 알부민 링커 또는 합성 링커인 키메릭 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 합성 링커는 GGGGSGGGGSGGGSG (서열번호 32)인 키메릭 폴리펩타이드.
  11. (i) 포유류 숙주 세포에 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 분자를 도입하는 단계; (ii) 성장 배지에서 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 조건하에서 세포를 키우는 단계; 및 (iii) 발현된 폴리펩타이드를 수득하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 포유류 숙주세포는 CHO, COS 또는 BHK 세포인 방법.
  13. 제6항의 키메릭 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산 분자는 신호 서열 또는 리더 서열을 더 포함하는 것인 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 신호 서열은 tPA 신호서열인 핵산 분자.
  16. 제13항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  17. 제16항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020050626A1 (ko) * 2018-09-05 2020-03-12 주식회사 엘지화학 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드
WO2021006604A1 (ko) 2019-07-08 2021-01-14 주식회사 프로젠 신규 융합단백질 및 그의 용도
WO2021006605A1 (ko) 2019-07-08 2021-01-14 주식회사 프로젠 신규 il-10 변이체 단백질 및 그의 용도
WO2021118256A1 (ko) * 2019-12-11 2021-06-17 주식회사 엘지화학 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역 및 gdf15를 포함하는 융합 폴리펩타이드

Families Citing this family (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110123440A1 (en) * 2005-03-29 2011-05-26 Genevieve Hansen Altered Antibody FC Regions and Uses Thereof
KR101030978B1 (ko) * 2008-07-10 2011-04-28 (주) 에이프로젠 동물세포용 재조합 발현벡터
CN101747440B (zh) * 2008-12-18 2014-05-07 嘉和生物药业有限公司 一种TNFR-Fc融合蛋白及其用途
US20110117092A1 (en) * 2009-10-20 2011-05-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inhibiting g-csfr
AU2011207626B2 (en) 2010-01-19 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Engineered opsonin for pathogen detection and treatment
CN102260343A (zh) * 2010-05-25 2011-11-30 健能隆医药技术（上海）有限公司 重组人g-csf二聚体在治疗神经损伤疾病中的用途
EP2613799A1 (en) * 2010-09-07 2013-07-17 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Readthrough acetylcholinesterase (ache-r) for treating or preventing parkinson's disease
US8883134B2 (en) 2010-10-20 2014-11-11 Handok Pharmaceuticals, Inc. Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein
CA2822775A1 (en) 2011-01-04 2012-07-12 Charite Universitatsmedizin Berlin Modulators of il-12 and/or il-23 for the prevention or treatment of alzheimer's disease
CN102585013B (zh) * 2011-01-07 2014-04-23 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种含有ω干扰素的融合蛋白及制备方法
AU2012222366A1 (en) 2011-03-02 2013-08-01 Novo Nordisk A/S Coagulation factor-targeting to TLT-1 on activated platelets
KR102231139B1 (ko) 2011-06-28 2021-03-24 인히브릭스, 인크. 세르핀 융합 폴리펩타이드 및 이의 이용 방법
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
EP2734843A2 (en) 2011-07-18 2014-05-28 President and Fellows of Harvard College Engineered microbe-targeting molecules and uses thereof
CA2842969C (en) * 2011-07-25 2018-03-27 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Use of g-csf dimer in preparation of medicament for treatment of neurodegenerative diseases
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
JP6322872B2 (ja) 2011-12-19 2018-05-16 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 非シアル化抗炎症ペプチド
KR101183615B1 (ko) * 2011-12-28 2012-09-17 재단법인 경기과학기술진흥원 Ｗｎｔ에 결합하는 신규한 재조합 단백질
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
WO2013138338A2 (en) 2012-03-12 2013-09-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating tissue damage associated with ischemia with apoliporotein d
CA2871468C (en) 2012-04-23 2021-09-21 Nrl Pharma, Inc. Lactoferrin fusion protein and method for preparation thereof
KR101419884B1 (ko) 2012-11-27 2014-07-16 (주)알테오젠 단백질과 Fc 도메인을 융합한 융합 단백질의 안정화용 조성물
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
BR112015019348A2 (pt) 2013-02-13 2017-08-22 Lab Francais Du Fractionnement Métodos para produção de proteína com glicosilação modificada e com sialilação aumentada, para aumentar a atividade de sialil transferase na glândula mamária e para produzir sialil transferase, proteína com glicosilação modificada ou proteína com sialilação aumentada, composição, sialil transferase, mamífero transgênico, e, célula epitelial mamária
EP2956480B1 (en) 2013-02-13 2019-09-04 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof
EP2970506A1 (en) * 2013-03-11 2016-01-20 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormone compounds
BR112015020587A2 (pt) * 2013-03-14 2017-10-10 Regeneron Pharma proteínas de fusão de apelina e suas utilizações
US9587235B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Atyr Pharma, Inc. Histidyl-tRNA synthetase-Fc conjugates
WO2014144325A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for improving detection and/or capture of a target entity
US9815897B2 (en) 2013-05-02 2017-11-14 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against programmed death-1 (PD-1)
CA2913155A1 (en) 2013-05-21 2014-11-27 President And Fellows Of Harvard College Engineered heme-binding compositions and uses thereof
KR101895634B1 (ko) 2013-05-31 2018-09-05 한미약품 주식회사 변이된 힌지 영역을 포함하는 IgG4 Fc 단편
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
CN104231086B (zh) * 2013-08-27 2019-12-13 北京韩美药品有限公司 双功能融合蛋白及其制备方法和用途
AU2014312190A1 (en) 2013-08-28 2016-02-18 Bioasis Technologies Inc. CNS-targeted conjugates of antibodies
CA2931299C (en) 2013-11-20 2024-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aplnr modulators and uses thereof
EP3546474B1 (en) 2013-12-18 2021-07-07 President and Fellows of Harvard College Crp capture/detection of gram positive bacteria
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
CN117065044A (zh) * 2014-03-31 2023-11-17 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白Fc片段连接改善蛋白质和肽的溶解度的方法
KR20150135148A (ko) * 2014-05-23 2015-12-02 주식회사 제넥신 Pd-l1 융합 단백질 및 이의 용도
JP2017520531A (ja) 2014-06-02 2017-07-27 ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジーＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆｃ断片の産生
US10441595B2 (en) * 2014-06-26 2019-10-15 Brigham Young University Methods for treating fungal infections
KR102272213B1 (ko) * 2014-07-08 2021-07-01 삼성전자주식회사 표적화 부위, 절단 부위, 및 세포막 투과 부위를 포함하는 융합 단백질 및 그의 용도
WO2016056812A1 (en) * 2014-10-06 2016-04-14 Genexine, Inc. Human igg4 fc polypeptide variant
CA2967820A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
MY189836A (en) 2014-11-21 2022-03-11 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against cd73 and uses thereof
CA2968382A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
KR102644115B1 (ko) 2014-12-23 2024-03-05 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tigit에 대한 항체
CN105801705B (zh) * 2014-12-31 2019-05-24 天境生物科技(上海)有限公司 含胰高血糖素样肽-1和免疫球蛋白杂合Fc的融合多肽及其用途
KR101825048B1 (ko) * 2014-12-31 2018-02-05 주식회사 제넥신 GLP 및 면역글로불린 하이브리드 Fc 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도
WO2016111575A1 (ko) 2015-01-09 2016-07-14 주식회사 제넥신 지속형 epo 제제를 이용한 빈혈 치료 방법
US10844125B2 (en) 2015-03-04 2020-11-24 The Rockefeller University Anti-inflammatory polypeptides
CA2981312C (en) 2015-03-30 2023-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
PT3288965T (pt) * 2015-04-29 2019-10-15 Mediolanum Farm S P A Um recetor de interleucina-10 quimérico solúvel e sua utilização terapêutica
CN107979973A (zh) 2015-05-04 2018-05-01 法国化学与生物科技实验室 Fc融合蛋白质的转基因生产
WO2016178087A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Biosourcing Sa Transgenic production of chorionic gonadotropin
AR105616A1 (es) * 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
JP6797137B2 (ja) 2015-05-29 2020-12-09 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｏｘ４０に対する抗体およびその使用
US11208452B2 (en) 2015-06-02 2021-12-28 Novo Nordisk A/S Insulins with polar recombinant extensions
WO2016200219A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-15 Genexine, Inc. Modified interleukin-7 protein and uses thereof
BR112017028353A2 (pt) 2015-06-29 2018-09-04 The Rockfeller University anticorpos para cd40 com atividade agonista melhorada
US10435457B2 (en) 2015-08-06 2019-10-08 President And Fellows Of Harvard College Microbe-binding molecules and uses thereof
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
KR102147997B1 (ko) * 2015-10-23 2020-08-25 주식회사 제넥신 피부 주름 개선용 조성물
KR101773858B1 (ko) 2015-10-23 2017-09-01 명지대학교 산학협력단 피부 주름 개선용 조성물
KR20170049319A (ko) * 2015-10-28 2017-05-10 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR102386735B1 (ko) 2015-11-06 2022-04-14 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형
CN108697764A (zh) * 2015-12-04 2018-10-23 格纳西尼有限公司 含有免疫球蛋白fc融合白细胞介素-7融合蛋白的用于预防或治疗流感病毒感染的药物组合物
CN108697765A (zh) * 2015-12-04 2018-10-23 格纳西尼有限公司 用于预防或治疗人乳头瘤病毒引起的疾病的含有免疫球蛋白fc融合il-7融合蛋白的药物组合物
AR107483A1 (es) * 2016-01-29 2018-05-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de enzimas terapéuticas
HUE059593T2 (hu) * 2016-02-17 2022-12-28 Genexine Inc Rekombináns hGH-t tartalmazó gyógyszerkészítmény növekedési hormon hiányának kezelésére
WO2017142331A1 (en) 2016-02-17 2017-08-24 Genexine, Inc. Pharmaceutical composition comprising recombinant hgh for the treatment of growth hormone deficiency
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
CN116063494A (zh) 2016-03-04 2023-05-05 洛克菲勒大学 具有增强的激动剂活性的cd40的抗体
KR20170123849A (ko) * 2016-04-29 2017-11-09 주식회사유한양행 Ccl3 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
CA3024508A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Agenus Inc. Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
CN106191072A (zh) * 2016-08-04 2016-12-07 沈沭彤 重组人源嵌合GcFc基因片段及融合蛋白
JOP20190019A1 (ar) * 2016-08-30 2019-02-12 Genexine Inc تركيبة صيدلانية لعلاج نقص في هرمون نمو يحتوي على بروتين اندماجي لهرمون نمو بشري (hGH)
WO2018079702A1 (ja) 2016-10-28 2018-05-03 株式会社Ｎｒｌファーマ ラクトフェリン／アルブミン融合タンパク質及びその製造方法
US11155624B2 (en) 2016-11-01 2021-10-26 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against programmed death-1 (PD-1)
WO2018089702A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Keros Therapeutics, Inc. Gdnf fusion polypeptides and methods of use thereof
CN108264562B (zh) * 2016-12-30 2021-08-10 惠和生物技术(上海)有限公司 一种结合cd3和t细胞正共刺激分子的双功能分子及其应用
PL3565844T3 (pl) 2017-01-09 2023-06-12 Tesaro Inc. Sposoby leczenia nowotworów złośliwych przeciwciałami anty-pd-1
CN106832002A (zh) * 2017-02-16 2017-06-13 上海科医联创生物科技有限公司 一种靶向pd‑1的融合蛋白及其相关应用
CN110785435B (zh) * 2017-03-06 2024-01-23 艾尔特生物科技公司 与il-12和il-18的基于il-15的融合物
CN108623692B (zh) * 2017-03-20 2020-11-17 徐寒梅 一种融合蛋白及其制备方法和其应用
EP3606560A2 (en) 2017-04-05 2020-02-12 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
AU2018256435A1 (en) 2017-04-20 2019-11-07 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods for treating lung inflammation
EP3612637A4 (en) 2017-04-21 2021-01-27 Yuhan Corporation DOUBLE-FUNCTION PROTEIN PRODUCTION PROCESS AND ITS DERIVATIVES
CN116333129A (zh) 2017-05-25 2023-06-27 百时美施贵宝公司 包含经修饰的重链恒定区的抗体
CN107082815A (zh) * 2017-06-28 2017-08-22 杭州皓阳生物技术有限公司 一种fsh‑hsa融合蛋白及其制备方法
CN111132998B (zh) * 2017-09-25 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 用于癌症治疗的方法和组合物
US11834492B2 (en) 2017-09-27 2023-12-05 Epicentrx, Inc. Human IL-10 receptor alpha fusion proteins
KR102588611B1 (ko) * 2017-12-22 2023-10-16 한미약품 주식회사 신규한 구조를 갖는 치료학적 효소 융합단백질 및 이의 용도
KR20200103761A (ko) 2017-12-27 2020-09-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd40 항체 및 그의 용도
TW201930343A (zh) * 2018-01-08 2019-08-01 南韓商普羅根有限公司 包含IgE受體之重組型胞外區域的藥學組成物
KR102038675B1 (ko) * 2018-01-08 2019-10-30 (주)지아이이노베이션 IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조방법
BR112020013818A2 (pt) * 2018-01-12 2020-12-01 Gi Innovation, Inc. composição compreendendo probióticos e polipeptídeo com afinidade de ligação para ige e uso dos mesmos
CN110054700A (zh) * 2018-01-18 2019-07-26 分子克隆研究室有限公司 长效治疗性融合蛋白
WO2019209078A1 (ko) 2018-04-26 2019-10-31 주식회사 굳티셀 신규한 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20210121529A1 (en) * 2018-05-04 2021-04-29 Ilkogen Ilaç Sanayi Ve Ticaret A.S. Stable hybrid fc fusion g-csf formulation
EP3827837A4 (en) 2018-07-24 2022-05-04 Good T Cells, Inc. COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
KR20200011685A (ko) 2018-07-25 2020-02-04 주식회사유한양행 갑상선 자극 호르몬 수용기(thyrotropin receptor, TSHR) 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
MX2021002190A (es) 2018-08-31 2021-05-14 Regeneron Pharma Estrategia de dosificacion que mitiga el sindrome de liberacion de citoquinas para los anticuerpos biespecificos cd3/cd20.
WO2020053661A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Methods of purifying antibodies from the milk of transgenic non-human mammals comprising the use of chitosan
KR20210093950A (ko) 2018-11-16 2021-07-28 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 Il-7 단백질 및 면역 관문 저해제의 조합으로 종양을 치료하는 방법
WO2020112781A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
BR112021015428A2 (pt) 2019-02-13 2022-02-15 Ilkogen Ilac Sanayi Ve Ticaret A S Uma fc híbrida de fusão g-csf para prevenir neutropenia ou reduzir a duração da neutropenia
WO2020184941A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-17 Genexine, Inc. Glp-1 fusion proteins and uses thereof
KR20220080221A (ko) * 2019-05-14 2022-06-14 주식회사 프로젠 신규 변형 면역글로불린 fc 융합단백질 및 그의 용도
DK3744319T3 (da) 2019-05-28 2023-01-16 Ilkogen Ilac Sanayi Ve Ticaret A S Stabil lyofiliseret formulering til hybrid fc-fusioneret g-csf
CN114080398A (zh) * 2019-07-08 2022-02-22 Gi 医诺微新 包含IgE Fc受体的α亚基的胞外结构域且具有高唾液酸含量的多肽二聚体及包含其的药物组合物
WO2021006603A1 (ko) * 2019-07-08 2021-01-14 주식회사 프로젠 신규 알러지 질환 치료용 약학적 조성물
WO2021006375A1 (ko) * 2019-07-08 2021-01-14 (주)지아이이노베이션 Ige fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 시알산 함량이 높은 폴리펩티드 이량체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CN111057154B (zh) * 2019-12-23 2023-06-06 南京融捷康生物科技有限公司 基于驼源Fc片段的免疫原的制备及应用
CN114945409A (zh) 2020-01-13 2022-08-26 新免疫技术有限公司 用il-7蛋白和双特异性抗体的组合治疗肿瘤的方法
EP4186517A1 (en) * 2020-01-23 2023-05-31 Genexine, Inc. Fusion protein comprising pd-l1 protein and use thereof
EP4100045A1 (en) 2020-02-05 2022-12-14 Washington University Method of treating a solid tumor with a combination of an il-7 protein and car-bearing immune cells
BR112022018134A2 (pt) 2020-03-12 2022-11-22 Sl Metagen Proteína biespecífica nova e seu uso
KR20210141406A (ko) * 2020-05-14 2021-11-23 주식회사 프로젠 신규 재조합 융합단백질 및 그의 용도
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
WO2022000136A1 (en) * 2020-06-28 2022-01-06 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Methods and compositions for cancer treatment
CN111944058B (zh) * 2020-07-28 2021-12-17 中国农业大学 一种兼具抗菌、抗炎、中和内毒素和免疫调节活性的多功能杂合肽及其制备方法和应用
KR102450007B1 (ko) * 2020-10-16 2022-10-04 주식회사 아이엠바이오로직스 IgM 영역을 이용한 융합단백질 플랫폼
KR20230098201A (ko) 2020-10-26 2023-07-03 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 줄기 세포 동원의 유도 방법
KR20230104176A (ko) 2020-11-02 2023-07-07 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 코로나바이러스의 치료를 위한 인터류킨-7의 용도
CN116615236A (zh) 2020-11-05 2023-08-18 新免疫技术有限公司 用il-7蛋白和核苷酸疫苗的组合治疗肿瘤的方法
EP4265269A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 Good T Cells, Inc. Use of taci protein
JP2024509937A (ja) 2021-03-09 2024-03-05 ジーアイ・イノベイション・インコーポレイテッド Ｉｇｅ ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインを含む融合タンパク質の製剤
CN113603791A (zh) * 2021-08-11 2021-11-05 厦门目青股权投资合伙企业(有限合伙) 一种融合蛋白及其应用
WO2023130081A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a tumor with a combination of il-7 protein and vegf antagonist
WO2023173084A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 University Of Rochester Cyclopeptibodies and uses thereof
CN115850517A (zh) * 2022-11-14 2023-03-28 沈阳药科大学 一种提高GLP-1 Fc融合蛋白产量的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
AU1407997A (en) 1995-12-01 1997-06-19 Beth Israel Hospital Il-12 p40 subunit fusion polypeptides and uses thereof
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
DK1252192T3 (da) * 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
RU2319709C2 (ru) * 2001-07-17 2008-03-20 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Терапевтические агенты, содержащие проапоптозные белки
US6797493B2 (en) * 2001-10-01 2004-09-28 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human granulocyte colony-stimulating factor with increased biological activities
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
KR20050047030A (ko) * 2003-11-13 2005-05-19 한미약품 주식회사 약물의 캐리어로서 유용한 ＩｇＧ Ｆｃ 단편 및 그의제조방법
EP2275448A3 (en) * 2003-12-19 2013-02-06 Genentech, Inc. Monovalent antibody fragments useful as therapeutics
US8921528B2 (en) * 2004-06-01 2014-12-30 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
EP2471813B1 (en) * 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemical Society Transactions 30(4): 512-516 (2002. 8.) *
Clinical Immunology 101(1): 21-31 (2001) *
J Immunol 161(8): 3862-3869(1998. 10. 15.) *
Molecular Immunology 29(3): 319-326 (1992. 3.) *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020050626A1 (ko) * 2018-09-05 2020-03-12 주식회사 엘지화학 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드
KR20200027903A (ko) * 2018-09-05 2020-03-13 주식회사 엘지화학 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드
KR102263105B1 (ko) * 2018-09-05 2021-06-09 주식회사 엘지화학 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드
WO2021006604A1 (ko) 2019-07-08 2021-01-14 주식회사 프로젠 신규 융합단백질 및 그의 용도
WO2021006605A1 (ko) 2019-07-08 2021-01-14 주식회사 프로젠 신규 il-10 변이체 단백질 및 그의 용도
WO2021118256A1 (ko) * 2019-12-11 2021-06-17 주식회사 엘지화학 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역 및 gdf15를 포함하는 융합 폴리펩타이드

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Publication number Publication date
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US20080300188A1 (en) 2008-12-04

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