KR101183615B1 - Ｗｎｔ에 결합하는 신규한 재조합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Wnt 결합능이 있는 새로운 재조합 단백질에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 CRD를 포함하는 COL18의 프리즐드 모티프와 인간 IgG의 Fc 도메인을 융합시킨 개량된 재조합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 Wnt에 결합하여 신호전달을 차단하므로, Wnt 신호 이상에 기인한 질환을 치료 또는 예방할 수 있으며, 이의 진단방법에도 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 Wnt 결합능이 있는 새로운 재조합 단백질에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 CRD를 포함하는 콜라젠 타입 18의 프리즐드 모티프와 인간 IgG의 Fc 도메인을 융합시킨 개량된 재조합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질은 Wnt에 결합하여 신호전달을 차단하므로, Wnt 신호 이상에 기인한 질환을 치료 또는 예방할 수 있으며, 이의 진단방법에도 유용하게 사용될 수 있다.
분비성 당단백질인 Wnt는 세포발생 과정 중 세포의 폴라리티(polarity) 결정에 관여하며(Moon, R. T., et al., Science 296: 1644-1646, 2002), 줄기세포 및 암세포 성장에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Reya, T., et al., Nature 434: 843-850, 2005). 따라서, 상기 Wnt의 신호를 차단함으로써 Wnt 신호 이상에 기인한 질환을 치료하기 위한 방법이 연구되고 있다(Moon, R. T., et al., Nat Rev Genet 5: 691-701, 2004). 일례로서, Wnt와 결합하는 것으로 알려진 세포수용체인 프리즐드(frizzled) 단백질 및 분비형 프리즐드 관련 단백질(sFRP)을 이용하는 방법이 개발되고 있다(WO2008/031009, WO98/54325).
콜라젠 타입 18은 혈관신생작용의 내인성 저해제인 엔도스타틴(endostatin)을 카르복시 말단에 포함하고 있으며(Felbor, U., et al., EMBO J 19: 11871194, 2000), 상기 엔도스타틴은 암세포 주변의 혈관신생작용을 억제함으로써 암 치료에 적용될 수 있다는 점이 밝혀졌다(OReilly, M. S., et al., Cell 88: 277285, 1997). 반면, 이러한 혈관신생작용의 억제와는 달리, 콜라젠 타입 18 중 변이체(variant) 3은 Wnt/-카테닌 신호전달을 억제함으로써 암세포의 성장을 저해할 수 있다는 점이 밝혀졌다(Quelard, D., et al., PloS ONE e1878, 2008). 이와 같은 Wnt/-카테닌 신호전달의 억제 효과는 콜라젠 타입 18(하기에서는 "COL18"이라고 지칭함)에만 특이적인 부분인 프리즐드 모티프(frizzled motif)에 기인한 것이다. 상기 논문의 저자는 섬유증, 특히 간세포암종에서 콜라젠 유전자의 발현을 비교함으로써, COL18의 변이체 3을 간세포암종의 진단 및 치료에 사용하기 위한 유효성분으로 개발할 수 있다는 근거를 발견하였다(PCT/EP2008/067779). 또한, 콜라젠 유전자가 도입된 암세포를 이식한 동물실험을 통해, COL18의 프리즐드 모티프가 발현될 때 암세포의 성장이 둔화된다는 점이 밝혀졌다.
그러나, COL18의 변이체 3 및 이의 프리즐드 모티프는 수용성의 성질을 갖지 않고 불용성의 성질을 가지기 때문에, 세포내 발현율 및 세포외 분비율이 저하되는 문제점을 나타낸다. 따라서, 종래에 알려져 있는 COL18의 변이체 3 및 이의 프리즐드 모티프가 그 자체로서는 치료용 단백질에 사용하는데 비효율적이기 때문에, 산업적으로 이용하기 위해서는 개선이 필요하다.
본 발명의 목적은 COL18의 프리즐드 모티프에 기초하여 Wnt에 결합하여 신호전달을 차단하는데 가장 적합한 서열을 결정하고, 이러한 서열을 갖는 재조합 단백질 및 이를 포함하는 Wnt 신호 이상에 따른 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 추가적인 목적은 상기 재조합 단백질의 용해도를 증가시킴으로써 세포내 발현율 및 세포외 분비율을 상승시키고, 분비율의 조절 및 링커와 트롬빈 절단 부위의 삽입 등을 통해 단백질의 안정성을 높이고, 이에 따라 생체내 또는 세포내에서 Wnt/-카테닌 신호전달의 억제효과를 더욱 효과적으로 달성하는 것이다. 또한, 본 발명에서는 상기 재조합 단백질을 보다 신속하고 용이하게 분리정제할 수 있는 제조방법을 제공함으로써, 상기 재조합 단백질은 산업적으로 더욱 효율적으로 이용될 수 있다.
상기 본 발명의 목적들을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 Fc 도메인이 융합된 재조합 단백질의 형태로서 COL18의 여러 변이체들을 제작한 후, Wnt와 결합하여 Wnt/-카테닌 신호전달을 저해할 수 있는 재조합 단백질을 결정하였다. 이와 동시에, 재조합 단백질의 용해도, 세포내 발현율 및 세포외 분비율과 관련된 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 COL18의 프리즐드 모티프에서 이황화 결합에 관여하지 않는 시스테인 잔기를 찾아내어, 이를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 또는 트롬빈 절단 부위를 재조합 단백질에 추가적으로 삽입함으로써, 재조합 단백질의 서열을 변형시켰다.
그 결과, Wnt 결합부위인 시스테인-풍부 도메인(CRD)을 포함하는 COL18의 프리즐드 모티프(하기에서는 "FZC18"라고 지칭함)와 인간 IgG의 Fc 도메인을 융합시켜 새로운 재조합 단백질인 FZC18-Fc T0와 FZC18-Fc V0를 제작하였다.
또한, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 벡터를 제작하였으며, 이러한 벡터에 의해 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) 세포를 형질전환시킨 후, 상기 세포의 배양액으로부터 본 발명의 재조합 단백질을 수득하였다. 이 때, 본 발명의 재조합 단백질에는 Fc 도메인이 특이적으로 결합되어 있기 때문에, 상기 세포의 배양액에 대해 정제 단계로서 유일하게 친화성 크로마토그래피만 사용하더라도 높은 수율로 상기 재조합 단백질을 수득할 수 있었다.
이와 같이 수득된 재조합 단백질은 오랜 시간 동안 보존하더라도 침전되지 않고 그 본래의 형태를 잘 유지할 수 있기 때문에 우수한 안정성을 나타내었다. 특히, 구조적 안정성을 높이기 위해 트롬빈 도메인을 융합한 FZC18-Fc T0에서는 통상적으로 빈번하게 발생하는 Fc의 절단화가 억제됨으로써 단백질의 안정성이 높아지고 발현이 우수하게 나타났다(도 8 참조). 또한, 본 발명의 재조합 단백질은 용해도의 증가로 인해 세포내 및 생체내에서 그 발현양이 우수할 뿐만 아니라, 재조합 단백질을 취급하는데 필요한 용매를 특정 종류의 용매로 한정할 필요가 없다.
또한, 본 발명의 재조합 단백질에는 Fc 도메인이 특이적으로 결합되어 있기 때문에, 항-Fc 항체를 이용하여 재조합 단백질의 발현을 빠르게 확인할 수 있다는 이점이 있다.
본 발명의 재조합 단백질을 포함하는 약학 조성물은 Wnt 과발현이 주원인으로 알려져 있는 대장암 또는 간암과 같은 암 질환, 편평 상피 세포암과 같은 상피세포종 질환, 및 간 질환과 같은 섬유증 질환 등을 치료 또는 예방할 수 있으며, 상기 질환들을 용이하게 진단할 수 있게 해준다.
도 1a는 일과성 발현을 위한 pCEZ 발현 벡터로서, 이는 pUC 복제원점(origin) 및 암피실린 내성 유전자를 포함하며, 포유류 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그널(signal)을 포함한다. 또한, 상기 pCEZ 발현 벡터는 EBNA-1을 발현하며 OriP 시퀀스를 포함하고 있어 일과성 발현이 오래 지속될 수 있으므로, 발현양이 증가될 수 있다. 또한, 상기 pCEZ 발현 벡터는 포유류 선택 마커로서 티미딘 키나아제 프로모터에 의한 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. pCEZ 발현 벡터에서 멀티클로닝 부위에 위치하는 제한효소 부위는 도 1a의 상단부에 표시되어 있다.
도 1b는 안정한 세포주를 제작하기 위한 pIDZ 발현 벡터로서, 이는 pUC 복제원점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하며, 포유류 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 성장호르몬 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 또한, 상기 pIDZ 발현 벡터는 IRES에 의해 DHFR을 발현하며 MTX에 의한 유전자 증폭을 이용하여 생산성이 향상될 수 있다. 또한, 상기 pIDZ 발현 벡터는 포유류 선택 마커로서 SV40 프로모터에 의한 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. pIDZ 발현 벡터에서 멀티클로닝 부위에 위치하는 제한효소 부위는 도 1b의 상단부에 표시되어 있다.
도 1c는 본 발명에 따라 제작된 C18N-Fc, FZC18-Fc T0, FZC18-Fc V0의 간단한 모식도이다.
도 2a는 인간 COL18의 변이체 3의 엑손(Exon) 1의 염기 서열을 나타낸다.
도 2b는 COL18의 위치 1 내지 450의 아미노산 서열을 나타낸다. 여기서, 프리즐드 모티프는 위치 216 내지 450의 빨간색으로 표시된 부분이며, 시스테인-풍부 도메인(CRD)은 위치 329 내지 446의 노란색으로 표시된 부분이며, 시스테인은 녹색으로 표시된 부분이며, N-글리코실화 부위는 파란색으로 표시된 부분이다.
도 3a는 FZC18-Fc T0에 대한 클로닝 개요 및 서열분석 내용을 나타낸 것이다. 여기서, 제한 효소 부위는 HindIII, BamHI, KpnI, XhoI, XbaI이다. Kozak 서열은 녹색으로 표시되어 있으며, 시그널 서열은 청색으로 표시되어 있으며, 트롬빈 절단 부위는 보라색으로 표시되어 있다. COL18의 321 내지 450의 염기서열은 노란색으로 표시되어 있으며, Fc는 회색으로 표시되어 있다.
도 3b는 본 발명에서 이용된 단백질과 재조합 단백질들의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 SignalP-NN에 따라 계산한 분비 시그널의 확률을 나타낸 것이다. 도 4a는 COL18의 시그널 서열에 대한 것이고, 도 4b는 Ig 카파 사슬의 시그널 서열에 대한 것이다.
도 5는 ELISA를 이용하여 Fc 재조합 단백질의 발현양을 측정하는 실험에 관한 것이다. 도 5a는 실험방법에 대한 도식도를 나타낸 것이며, 도 5b는 각 벡터 구조물(construct)을 형질도입시킨 세포를 혈청 함유 배지와 무혈청 배지에서 각각 배양시킨 조건화 배지에서의 Fc 재조합 단백질을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 6a는 세포 용해물 샘플, 배지 샘플, 배지를 단백질 A 비드로 면역침전시킨 샘플에 대해 SDS-PAGE 전기영동한 후 항-Fc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 결과이다.
도 6b는 세포 배양액에 대해 단백질 A 비드를 이용한 면역침강법과 항-Fc 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 실시하여 그 발현을 확인한 결과이다(H = 60kDa 마커, L = 30kDa 마커).
도 7은 ELISA를 이용하여 Fc 재조합 단백질과 Wnt의 결합능을 측정하는 실험에 관한 것이다. 도 7a는 실험방법에 대한 도식도를 나타낸 것이며, 도 7b는 각 샘플에 대해 Wnt 결합능을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 8은 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 단백질을 4~12% gradient SDS-PAGE(MOPS buffer) 전기영동하고, 이를 쿠마시 브릴리안트 블루에 의해 염색한 결과이다. 여기서, FZC18-Fc VO 재조합 단백질과 달리 FZC18-Fc T0 재조합 단백질에서는 Fc 도메인의 절단이 관찰되지 않았다.
도 9는 Wnt와 각 단백질 샘플간의 시험관내 결합능을 측정한 실험 결과이다.
도 10은 Wnt/-카테닌 리포터를 이용하여 각 재조합 단백질에 의해 Wnt에 유도되는 활성이 저해되는지를 측정한 실험 결과이다. 여기서, 그래프의 하단부에 있는 각각의 삼각형은 오른쪽으로 갈수록 1, 3, 10 μg/ml의 순서로 단백질의 농도가 높아진다는 것을 나타낸다.
도 1b는 안정한 세포주를 제작하기 위한 pIDZ 발현 벡터로서, 이는 pUC 복제원점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하며, 포유류 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 성장호르몬 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 또한, 상기 pIDZ 발현 벡터는 IRES에 의해 DHFR을 발현하며 MTX에 의한 유전자 증폭을 이용하여 생산성이 향상될 수 있다. 또한, 상기 pIDZ 발현 벡터는 포유류 선택 마커로서 SV40 프로모터에 의한 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. pIDZ 발현 벡터에서 멀티클로닝 부위에 위치하는 제한효소 부위는 도 1b의 상단부에 표시되어 있다.
도 1c는 본 발명에 따라 제작된 C18N-Fc, FZC18-Fc T0, FZC18-Fc V0의 간단한 모식도이다.
도 2a는 인간 COL18의 변이체 3의 엑손(Exon) 1의 염기 서열을 나타낸다.
도 2b는 COL18의 위치 1 내지 450의 아미노산 서열을 나타낸다. 여기서, 프리즐드 모티프는 위치 216 내지 450의 빨간색으로 표시된 부분이며, 시스테인-풍부 도메인(CRD)은 위치 329 내지 446의 노란색으로 표시된 부분이며, 시스테인은 녹색으로 표시된 부분이며, N-글리코실화 부위는 파란색으로 표시된 부분이다.
도 3a는 FZC18-Fc T0에 대한 클로닝 개요 및 서열분석 내용을 나타낸 것이다. 여기서, 제한 효소 부위는 HindIII, BamHI, KpnI, XhoI, XbaI이다. Kozak 서열은 녹색으로 표시되어 있으며, 시그널 서열은 청색으로 표시되어 있으며, 트롬빈 절단 부위는 보라색으로 표시되어 있다. COL18의 321 내지 450의 염기서열은 노란색으로 표시되어 있으며, Fc는 회색으로 표시되어 있다.
도 3b는 본 발명에서 이용된 단백질과 재조합 단백질들의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 SignalP-NN에 따라 계산한 분비 시그널의 확률을 나타낸 것이다. 도 4a는 COL18의 시그널 서열에 대한 것이고, 도 4b는 Ig 카파 사슬의 시그널 서열에 대한 것이다.
도 5는 ELISA를 이용하여 Fc 재조합 단백질의 발현양을 측정하는 실험에 관한 것이다. 도 5a는 실험방법에 대한 도식도를 나타낸 것이며, 도 5b는 각 벡터 구조물(construct)을 형질도입시킨 세포를 혈청 함유 배지와 무혈청 배지에서 각각 배양시킨 조건화 배지에서의 Fc 재조합 단백질을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 6a는 세포 용해물 샘플, 배지 샘플, 배지를 단백질 A 비드로 면역침전시킨 샘플에 대해 SDS-PAGE 전기영동한 후 항-Fc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한 결과이다.
도 6b는 세포 배양액에 대해 단백질 A 비드를 이용한 면역침강법과 항-Fc 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 실시하여 그 발현을 확인한 결과이다(H = 60kDa 마커, L = 30kDa 마커).
도 7은 ELISA를 이용하여 Fc 재조합 단백질과 Wnt의 결합능을 측정하는 실험에 관한 것이다. 도 7a는 실험방법에 대한 도식도를 나타낸 것이며, 도 7b는 각 샘플에 대해 Wnt 결합능을 측정한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 8은 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 단백질을 4~12% gradient SDS-PAGE(MOPS buffer) 전기영동하고, 이를 쿠마시 브릴리안트 블루에 의해 염색한 결과이다. 여기서, FZC18-Fc VO 재조합 단백질과 달리 FZC18-Fc T0 재조합 단백질에서는 Fc 도메인의 절단이 관찰되지 않았다.
도 9는 Wnt와 각 단백질 샘플간의 시험관내 결합능을 측정한 실험 결과이다.
도 10은 Wnt/-카테닌 리포터를 이용하여 각 재조합 단백질에 의해 Wnt에 유도되는 활성이 저해되는지를 측정한 실험 결과이다. 여기서, 그래프의 하단부에 있는 각각의 삼각형은 오른쪽으로 갈수록 1, 3, 10 μg/ml의 순서로 단백질의 농도가 높아진다는 것을 나타낸다.
본 발명에서는 동물세포의 발현 시스템을 구축하기 위하여 두 개의 방법으로 접근하였다. 먼저 COL18의 재조합 단백질들을 제조하고 이의 발현을 빠르게 확인하기 위하여 일과성 발현(transient expression) 시스템을 이용하였으며, 다음으로 선별된 후보 재조합 단백질들에 대해 안정성 발현(stable expression)을 위해 안정한 세포주를 제작하였다.
상기 일과성 발현 시스템에서는 형질도입의 효율이 높은 HEK293E 세포주에 대해 양이온성 폴리머인 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 형질도입시켰으며, 이로부터 4일 후에 배양액을 회수하고 ELISA를 수행하여 재조합 단백질의 발현 유무와 상대적 발현양을 각각 측정하고 비교하였다.
본 발명자들은 본 발명에서 사용하기 위한 발현 벡터로서 pCEZ(도 1a) 및 pIDZ(도 1b)를 제조하였다. 도 1a에 도시된 pCEZ 벡터는 pUC 복제원점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 10.1 kb 크기의 포유류 발현 벡터로서, 이는 CMV 프로모터에 의해 발현되며, 멀티클로닝 부위에 BspEI-ClaI-BamHI-EcoRI-EcoRV-NotI-XhoI-XbaI-PvuII 제한효소 부위를 삽입하였다. EBNA-1(Epstein-Barr nuclear antigen 1)이 발현되어 OriP를 통해 지연된 일과성 발현이 되도록 설계하였으며, 포유류 선택 마커로서 네오마이신 내성 유전자를 도입하였다. 도 1b에 도시된 pIDZ 벡터는 pUC 복제원점 및 암피실린 내성 유전자를 포함하는 6.4 kb 크기의 포유류 발현 벡터로서, 이는 CMV 프로모터에 의해 조절되며, 멀티클로닝 부위에 BspEI-ClaI-BamHI-EcoRI-EcoRV-NotI-XhoI-XbaI-HpaI 제한효소 부위를 삽입하였다. IRES(Internal ribosome entry site)를 통해 DHFR(dihydrofolate reductase)이 발현되도록 설계하였으며, 포유류 선택 마커로서 네오마이신 내성 유전자를 도입하였다.
이와 같이 제조된 각 공벡터의 XhoI-XbaI 사이에 인간 IgG의 Fc를 삽입하고 ClaI-BamHI 사이에 HindIII-Kozak 시퀀스-분비신호를 삽입하여 Fc 발현 벡터를 제작하였으며, 벡터의 백본에 따라 이를 각각 "pCEZ-S-Fc" 및 "pIDZ-S-Fc"라고 명명하였다.
S-Fc 발현 벡터의 HindIII-XhoI 사이에 Kozak 시퀀스를 포함하여 COL18의 아미노 말단의 위치 1-450의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 삽입하고 이를 "C18N-Fc"라고 명명하였다(도 1c). 또한, S-Fc 발현 벡터의 BamHI-XhoI 사이에 COL18의 위치 321-450의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 삽입하고 이를 "FZC18-Fc V0"라고 명명하였으며, COL18과 Fc 사이에 트롬빈 절단 부위를 추가적으로 삽입한 구조물에 대해 "FZC18-Fc T0"라고 명명하였다(도 1c).
비교 실험을 위하여, 프리즐드 수용체(Frizzled receptor) 8 - Fc 재조합 단백질(Frz8-Fc)의 발현 벡터를 또한 제작하였다. S-Fc 발현 벡터의 HindIII-XhoI 사이에 Kozak 시퀀스를 포함하여 Frz8의 아미노 말단의 위치 1-156의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 삽입하였다.
Wnt의 발현 벡터를 제조하기 위하여, 발현 벡터 HimdIII-XbaI 사이에 Kozak 시퀀스를 포함하여 종결코돈을 제외한 Wnt-3a 전장(1-352) 및 트롬빈 절단 부위의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 삽입하였으며, XbaI-HpaI 사이에 Flag-태깅을 하였다.
C18N 유전자는 HEK293E 세포주의 게놈 DNA를 통해 클로닝하였다. 참조 서열로서 인간 COL18의 변이체 3의 mRNA 서열은 NCBI의 접근번호 NM_130444를 참조하였으며, 이의 아미노산 서열은 UniProtKB P39060 서열을 참조하였다. 게놈 DNA 서열상에서 엑손 1에 아미노 말단의 위치 1-450의 서열이 모두 포함되어 있으므로 인간 게놈 DNA를 주형으로 하여 C18N 유전자를 획득하였으며(도 2a), 그 중 CRD를 포함하는 프리즐드 모티프(위치 329-446)에 대해 각각 FZC18-Fc T0(트롬빈 절단 부위를 포함함) 및 FZC18-Fc V0(트롬빈 절단 부위를 포함하지 않음)를 제조하고 이를 클로닝하였다(도 1c 및 도 2b).
서열분석 과정을 통해 C18N 유전자에서 O-글리코실화 부위는 예상되지 않은 반면 3개의 N-글리코실화 부위(각각 위치 68, 129, 164)가 예상되었으며, 이와 같이 예상된 N-글리코실화 부위는 프리즐드 모티프에 포함되지 않았다(도 2b). COL18의 CRD에는 11개의 시스테인(Cys)이 포함되어 있으며, 여기서 10개의 시스테인이 프리즐드 모티프의 토폴로지를 구성하는 이황화 다리를 형성하는 것으로 여겨졌으며, 오펀(orphan) Cys가 재조합 단백질의 세포외 분비와 불용성에 영향을 주는 것으로 여겨졌다. 이에, 본 발명자들은 이황화 결합에 관여하지 않는 상기 오펀 Cys를 찾기 위한 다양한 구조물들을 설계하였으며, 프로토타입으로부터 돌연변이생성을 통해 위치 408 및 409의 시스테인(Cys)을 글리신(Gly)으로 치환시킨 재조합 단백질과 링커(linker)의 길이가 짧거나 긴 재조합 단백질을 제작하였다.
FZC18-Fc T0(COL18의 아미노산 위치 321-450)(도 3a)에 대해 아미노 말단의 링커를 8개의 아미노산 만큼 짧게 설계한 재조합 단백질(COL18의 아미노산 위치 329-450)을 "FZC18-Fc T1"으로 명명하고, 카르복시 말단의 링커를 4개의 아미노산 만큼 짧게 설계한 재조합 단백질(COL18의 아미노산 위치 321-446)을 "FZC18-Fc T2"로 명명하고, 아미노 말단과 카르복시 말단 모두를 짧게 설계한 구조물(COL18의 아미노산 위치 329-446)을 "FZC18-Fc T3"으로 명명하였다. 또한, 트롬빈 절단 부위가 없는 재조합 단백질 FZC18-Fc V0에 대해 이와 동일한 방식으로 제조하고, 이를 각각 FZC18-Fc V1, FZC18-Fc V2, FZC18-Fc V3으로 명명하였다. 또한, 각 재조합 단백질에 대해 C408G 돌연변이, C409G 돌연변이 및 C408,409G 이중 돌연변이를 제작하였다. 상기 점돌염변이에 대해 명명된 FZC18-Fc M1, FZC18-Fc M3, FZC18-Fc M4, FZC18-Fc M6, FZC18-Fc M7의 구조에 대해서는 도 3b에 표로서 나타내었다. 각 재조합 단백질에 대해 발현양 및 Wnt 결합능을 확인함으로써, 트롬빈 절단 부위의 유무에 따른 차이, 아미노 말단의 링커 및 카르복시 말단의 링커의 길이에 따른 차이, 및 오펀 Cys의 돌연변이에 의한 차이를 비교하였다.
재조합단백질의 세포외 분비를 예상하고 설계하기 위하여 SignalP-NN 프로그램을 작동시켰다. 모든 구조물들이 아미노 말단의 70개의 아미노산에 대한 세포외 분비 및 분비 후 절단이 이루어짐을 확인하였다. FZC18-Fc T0 및 FZC18-Fc V0의 경우, COL18의 시그널 서열 대신 Ig 카파 시그널 서열을 사용하였음에도 불구하고, 확률 스코어가 더 우수하였음 확인되었다(0.998 vs 1.000, 도 4a 및 도 4b).
Frz8, Wnt-3a 및 Fc는 유전자 합성을 통해 클로닝하였다. Frz8의 염기 서열 및 아미노산 서열은 NCBI의 접근번호 NP_114072 및 UniProtKB Q9H461을 참조하였으며, Wnt-3a의 염기 서열 및 아미노산 서열은 NCBI의 접근번호 NM_033131 및 UniProtKB P56704를 참조하였다. Fc 유전자와 관련하여, 인간 IgG1의 중쇄는 UniProtKB Q7Z5W1(위치 244-470)을 참조하였으며 P01857(위치 104-330)의 길이 227 아미노산에 해당하는 유전자는 NCBI의 접근번호 J00228을 참조하였다.
본 발명에서 제조된 재조합 단백질에 Fc가 융합되어 있는 성질을 이용하여 재조합 단백질의 발현을 확인하고 이를 정량하였다. 각 벡터 구조물(construct)을 형질도입시킨 세포를 혈청 함유 배지(5%) 및 무혈청 배지에서 각각 4일 동안 배양하였으며, 그 후 상기 조건화 배지로부터 회수한 샘플에 대해 ELISA를 수행하였다. 인간 IgG Fc에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 샌드위치(Sandwich) ELISA 방법을 적용하였다(도 5a). 즉, 플레이트에 포획(capture) 항체를 고정화시키고 블로킹한 후, 이어서 상기 샘플을 배양하였으며, 페록시다아제가 컨쥬게이션된 항-Fc 항체를 통해 신호를 측정하였다.
이 때, 혈청 함유 배지 및 소 혈청의 IgG에서는 신호가 배경(background) 수준으로 검출된 반면, Fc 재조합 단백질에서는 특이적인 신호가 검출된다는 것을 확인하였다(도 5b). 상기 재조합 단백질은 모두 무혈청 배지에서의 발현에 비해 혈청 함유 배지에서의 발현이 더 우수하였다. S-Fc는 길이가 가장 짧기 때문에 발현양의 수준이 가장 높았다. FZC18-Fc T0, FZC18-Fc T1, FZC18-Fc T2에서 링커의 길이가 짧아질수록 발현양이 감소하는 패턴은 FZC18-Fc V0, FZC18-Fc V1, FZC18-Fc V2에서도 동일하게 나타난 반면, FZC18-Fc T3 및 FZC18-Fc V3에서는 오히려 그 발현양이 증가되었다. 이는 FZC18-Fc T0 프로토타입에서 아미노 말단의 링커와 카르복시 말단의 링커의 길이를 축소시킬 때 발현양이 감소되었지만, 양 말단 모두의 링커의 길이를 축소시킬 때에는 발현양이 오히려 감소되지 않았다는 점을 보여준다. 이는 양 말단의 링커 부분이 구조적으로 연관되어 구조적 골격에 관련된다는 점을 나타낸다.
ELISA 방법을 통해 획득한 재조합 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯팅 결과를 얻었다. 형질도입 이후 무혈청 배지에서 배양한 조건화 배지에 대해 각각 세포 용해물 샘플, 배지 샘플, 배지를 단백질 A 비드(bead)를 이용하여 면역침전시킨 샘플을 준비하고, 항-Fc 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다(도 6a). 단백질 A를 이용한 면역침강법을 적용한 후 항-Fc 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 수행하여 그 결과를 확인하였다(도 6b). 각 발현양을 확인한 결과에 따라 다양하게 변형된 형태의 단백질들을 확인할 수 있었다.
또한, ELISA를 이용하여 Wnt에 대한 결합능을 확인하였다. 플레이트에 Wnt-3a 단백질을 고정화시키고 블로킹한 후, Fc 재조합 단백질 샘플을 배양하였으며, 이어서 페록시다아제가 컨쥬게이션된 항-Fc 항체를 통해 신호를 측정하였다(도 7a). 형질도입 이후 혈청 함유 배지에서 배양시킨 조건화 배지에 대해 ELISA를 수행한 결과(도 5b에서 사용된 것과 동일한 샘플), 배경(background) 시그널이 높은 수준으로 검출되었음에도 불구하고 Frz8, C18N-Fc, FZC18-Fc T0, FZC18-Fc V0, FZC18-Fc V1에서 시그널은 Fc 샘플에 비해 훨씬 더 높은 수준으로 검출되었다(도 7b).
상기 결과에 기초하여, 재조합 단백질 FZC18-Fc T0 및 FZC18-Fc V0는 발현양이 우수하고 Wnt-3a에 대한 결합능이 있다는 것이 확인되었다. 이에 따라, 본 발명자들은 상기 재조합 단백질에 대해 pIDZ 벡터를 이용하여 형질도입된 CHO 세포주를 제작하였다. 비교실험을 위하여 S-Fc 및 Frz8에 대해서도 CHO 세포주를 이용하여 안정한 세포를 제작하였다. 이펙텐(Effectene)을 이용하여 각 구조물을 DHFR 결핍 CHO 세포주에 형질도입시키고, 3주 동안 G418(500ng/ml) 및 메토트렉세이트(MTX, 1nM)로 선택하여 모 클론(parental clone)을 획득하였으며, 부유배양 적응 단계를 거쳐 단백질 생산 세포주를 확립하였다.
각 세포주를 배양하여 이로부터 세포 배양액을 회수하고, 그 후 단백질 A(Protein A)를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 재조합 단백질에 대해 Bradford 염색법으로 정량하고, 4~12% gradient SDS-PAGE(MOPS buffer)로 전기영동하였으며, 쿠마시 염색법으로 확인하였다(도 8). 특히, 트롬빈 절단 부위를 삽입하여 변형시킨 FZC18-Fc T0 재조합 단백질은 FZC18-Fc V0 재조합 단백질에 비해 발현이 더 우수하게 나타났으며, 30kDa 부근에서 Fc 절단화가 관찰되지 않는다는 점을 고려해볼 때 단백질의 안정성이 높다는 것을 알 수 있었다. 또한, 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 재조합 단백질의 순도는 약 95%로 확인되었다. 이러한 결과는 단일 단계로 이루어진 정제법에 의해서도 90% 이상의 높은 순도를 얻을 수 있다는 것을 나타낸다.
정제된 Fc 재조합 단백질을 Flag로 표지된 Wnt-3a와 인큐베이션시키고 항-Flag 비드에 의해 면역침전시킨 후, 항-Fc 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 Wnt에 대한 결합능을 확인하였다. Wnt-3a는 Frz8, FZC18-Fc T0 및 FZC18-Fc V0에 결합한 반면, Fc에는 결합하지 않았다(도 9).
이와 같이 정제된 재조합 단백질 FZC18-Fc T0 및 FZC18-Fc V0가 Wnt 유도 리포터에 어떠한 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 리포터 어세이를 수행하였다. HEK293 세포에 T 세포 인자 리포터(TCF-luc)와 레닐라-루시페라제를 이펙텐에 의해 형질도입시키고, 그로부터 24시간 후 새로운 배지에서 Wnt-3a 단독으로 처리하거나(500ng/ml), 또는 Wnt-3a와 상기 재조합 단백질을 함께 처리하였다(1, 3, 10 μg/ml). 이어서, 24시간을 더 배양한 후 세포 배양액을 회수하였다. 각 샘플에 대해 이중 루시페라제 리포터 분석 시스템을 이용하여 발광도를 측정하고, 레닐라-루시페라제 활성으로 정상화시켜, Wnt-3a를 첨가하지 않은 샘플(음성 대조군: NC)에 대해 폴드 유도(fold induction)를 측정하였다. 상기 음성 대조군과 비교할 때, Wnt를 첨가한 샘플에서는 리포터 활성이 유도되는 것을 확인하였다. Fc는 Wnt에 의한 리포터 활성에 영향을 미치지 않은 반면, Frz8, C18N, FZC18-Fc T0 및 FZC18-Fc V0는 Wnt에 의한 리포터 활성을 저해한다는 점을 확인하였다(도 10).
서열목록 전자파일 첨부
Claims (14)
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 FZC18-Fc T0.
- 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 FZC18-Fc V0.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열에서 콜라젠 18의 카르복시 말단 방향으로 링커의 길이가 4개의 아미노산이 짧은 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열에서 콜라젠 18의 아미노 말단 방향으로 링커의 길이가 8개의 아미노산이 짧은 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열에서 콜라젠 18의 카르복시 말단 방향으로 링커의 길이가 4개의 아미노산이 짧고 콜라젠 18의 아미노 말단 방향으로 링커의 길이가 8개의 아미노산이 짧은 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열에서 408번 위치, 409번 위치, 또는 408번 위치 및 409번 위치의 시스테인이 글리신에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 단백질을 코딩하는 유전자.
- 제7항에 따른 유전자의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제8항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary) 세포.
- 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 단백질을 포함하는, 암, 상피세포종 및 섬유증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암, 상피세포종 및 섬유증 질환의 진단용 키트:
(a) 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 단백질, 및
(b) 인간 IgG Fc에 특이적으로 결합하는 항체. - 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 단백질의 제조방법으로서, 단백질 A(Protein A) 친화성 크로마토그래피를 이용하여 상기 재조합 단백질을 분리정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 재조합 단백질의 Wnt 결합능의 검출방법으로서, Wnt와 상기 재조합 단백질을 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
- 삭제
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