CN116063494A - 具有增强的激动剂活性的cd40的抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了结合人CD40的激动性抗体或其抗原结合部分。这样的抗体任选地包含具有对FcγRIIb增强的特异性的Fc区。本发明还提供了通过向有此需要的受试者施用本发明的抗体治疗癌症和慢性感染的方法。

Description

具有增强的激动剂活性的CD40的抗体
本申请是申请号为2016800853393(申请日：2016年6月28日，发明名称：具有增强的激动剂活性的CD40的抗体)的中国专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月4日提交的美国临时申请号62/304,012的优先权，其公开内容通过提述并入本文。
背景技术
最近的研究表明，人类癌症和慢性感染可以用调节患者对恶性或感染细胞的免疫应答的药剂进行治疗。参见，例如，Reck&Paz-Ares(2015)Semin.Oncol.42:402。基于相信其可以增强这样的免疫应答,已经尝试了激动性抗CD40抗体，诸如CP-870893和达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)，来治疗癌症。参见，例如，Kirkwood et al.(2012)CA CancerJ.Clin.62:309；Vanderheide&Glennie(2013)Clin.Cancer Res.19:1035。最近在小鼠中的实验表明，对抑制性Fc受体FcγRIIb具有增强的特异性的抗CD40抗体具有增加的抗肿瘤功效。参见，例如，WO 2012/087928；Smith,et al.(2012)PNAS 109(16):6181-6；Li&Ravetch(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci(USA)109:10966；Wilson et al.(2011)Cancer Cell 19:101；White et al.(2011)J.Immunol.187:1754。
需要改进的激动性抗人CD40抗体，用于治疗人类受试者的癌症和慢性感染。与活化Fc受体相比，这样的抗体会优选具有对抑制性Fc受体FcγRIIb增强的特异性，并且会表现出增强的抗肿瘤和/或抗感染活性。
发明概述
本文提供了分离的单克隆抗体(例如，鼠单克隆抗体、人源化鼠单克隆抗体和人单克隆抗体)，其特异性结合人CD40(SEQ ID NO：11的成熟序列)，任选地具有增强对结合FcγRIIb受体的特异性的修饰的Fc区。还提供了(i)与本文公开的抗体竞争结合人CD40的抗体，和(ii)与本文公开的抗体结合相同表位的抗体，即与包含突变Fc区的抗体竞争结合人CD40的抗体，所述突变Fc区具有对应于选自下组的IgG重链中的一个或多个突变的一个或多个突变：N297A、S267E(“SE”)、S267E/L382F(“SELF”)、G237D/P238D/P271G/A330R(“V9”)或G237D/P238D/H268D/P271G/A330R(“V11”)(SEQ ID No:3-7)，诸如与mAb 2141IgG1竞争结合人CD40的抗体，也称为CP-870,893。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，其中重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3，以及Fc变体N297A、S267E(“SE”)、S267E/L382F(“SELF”)、G237D/P238D/P271G/A330R(“V9”)、G237D/P238D/H268D/P271G/A330R(“V11”)，如表2所公开的。
在一些实施方案中，FC变体包括N297A(SEQ ID No：2、3)、SE(SEQ ID No：2、4)、SELF(SEQ ID No：2、5)、V9(SEQ ID No：2、6)和/或V11(SEQ ID No：2、7)。在替代实施方案中，本发明的抗人CD40抗体包括包含基本上由这些重链和轻链的序列组成的重链和轻链的抗体，或包含与这些序列共享至少80％、85％、90％和95％序列同一性的重链和轻链的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含与具有天然存在的Fc区的抗体相比对结合FcγRIIb具有更高特异性(这与结合活化性受体相反)的修饰的Fc区。在某些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体的A/I比小于5，并且在优选的实施方案中，小于1。
在某些实施方案中，本发明涉及抗huCD40抗体或其抗原结合片段，其与包含Fc变体N297A(SEQ ID No:2、3)、SE(SEQ ID No:2、4)、SELF(SEQ ID No:2、5)、V9(SEQ ID No:2、6)和/或V11(SEQ ID No:2、7)的一种或多种抗体竞争结合、交叉阻断包含Fc变体N297A(SEQID No:2、3)、SE(SEQ ID No:2、4)、SELF(SEQ ID No:2、5)、V9(SEQ ID No:2、6)和/或V11(SEQ ID No:2、7)的一种或多种抗体，或与包含Fc变体N297A(SEQ ID No:2、3)、SE(SEQ IDNo:2、4)、SELF(SEQ ID No:2、5)、V9(SEQ ID No:2、6)和/或V11(SEQ ID No:2、7)的一种或多种抗体结合相同的表位，包括人抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含一个或多个重链和一个或多个轻链，诸如两个重链和两个轻链。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分，其(i)特异性结合人CD40；并且
(ii)包含突变Fc区，所述突变Fc区具有对应于选自SEQ ID No:3-7的IgG重链中的一个或多个突变的一个或多个突变：。
在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分与CP-870,893或ChiLob、2141竞争结合人CD40。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分具有结合FcγRIIb的增强的特异性。
本发明进一步提供了编码本发明的抗CD40抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的核酸，包含所述核酸分子的表达载体，用所述表达载体转化的细胞，和通过从用所述表达载体转化的细胞中表达所述抗体来产生所述抗体并回收所述抗体的方法。
本发明还提供了包含本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明提供了一种增强受试者中的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而增强受试者中的免疫应答。在某些实施方案中，受试者具有肿瘤并且抗肿瘤的免疫应答被增强。在另一个实施方案中，受试者具有病毒感染，例如，慢性病毒感染，并且抗病毒免疫应答被增强。
本发明还提供了一种抑制受试者中的肿瘤生长的方法，包括向受试者施用本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而抑制肿瘤的生长。
本发明进一步提供了一种例如通过免疫疗法来治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗huCD40抗体，或其抗原结合片段，例如作为药物组合物，由此治疗癌症。在某些实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关癌症。在某些实施方案中，癌症是转移性癌症，难治性癌症或复发性癌症。
在某些实施方案中，本文所述的调节免疫功能的方法和治疗方法包括将本发明的抗huCD40抗体与一种或多种其他治疗剂(例如第二免疫调节抗体)组合或作为双特异性试剂与其一起施用。
附图说明
图1A、1B、1C和1D显示出CD40/FcγR人源化小鼠和2141抗CD40 Fc变体的特征。图1A是来自CD40-/-huCD40+/+和野生型小鼠的所示脾细胞群上的小鼠或人CD40的代表性流式细胞术染色。图1B是来自所示小鼠类型的肠系膜LN的GC B细胞的代表性流式细胞术染色。对活的B220+细胞进行门控。GC B细胞表示为CD38-Fashi。图1C示例说明了用于检测来自用重组流感H1N1免疫的小鼠的流感H1N1特异性IgG的血清水平的ELISA。每个点代表单个小鼠。图1D示例说明了使用重组hCD40通过ELISA评估的抗CD40 Ab克隆2141的所示Fc变体的结合特异性。数据表示为平均值。还参见表1。
图2显示出使用SPR分析进行的hCD40与小鼠和人CD40L的结合，其中使用固定的人CD40和从33至0.5nM滴定的可溶性人/小鼠CD40L。
图3A和3B显示出人CD40 mAb需要FcγR参与用于体内活性。图3A显示出2141抗CD40 Fc变体的FcγR结合谱。还参见表2。图3B显示出在存在或不存在所示的CP-890,873(左)或ChiLob 7/4(右)抗-CD40 Fc变体的情况下，用DEC-OVA免疫的人源化CD40/FcγR小鼠的血液中的OVA特异性CD8+T细胞的流式细胞术分析。每个点代表单个小鼠。
图4A、4B、4C和4D显示通过为了FcγRIIB特异性增强的Fc-工程改造的CP-870,893的增加的活性。图4A显示基于SPR测量，2141抗CD40 Fc变体的hFcγRIIB和hFcγRIIB/hFcγRIIAR131结合亲和力的倍数变化。还参见表2。图4B显示出在存在或不存在所示的CP-870,893抗-CD40 Fc变体的情况下，用DEC-OVA免疫的huCD40/FcγR小鼠的血液中的OVA特异性CD8+ T细胞的流式细胞术分析。每个点代表单个小鼠。图4C显示出在将CP-870,893抗CD40Fc变体施用到人源化CD40/FcγR小鼠中24小时后血液中的血小板计数。每个点代表单个小鼠。图4D显示出在CP-870,893-IgG2存在下，用DEC-OVA免疫hCD40+/hFcγRIIA+/hFcγRIIB+或hCD40+/hFcγRIIA-/hFcγRIIB+，并在第7天分析血液中OVA特异性CD8+ T细胞的百分比。还参见表2。
图5A和5B显示出通过为了FcγRIIB特异性增强的Fc-工程改造的CP-870,893的增加的活性。图5A显示出在将CP-870,893Fc变体单次注射到人源化FcγR/CD40小鼠中后总体重随时间的变化。数据表示为平均值+/-SEM。n＝4。图5B显示出施用CP-870,893抗CD40 Fc变体后7天人源化CD40/FcγR小鼠血液中的血小板计数。每个点代表单个小鼠。
发明详述
本发明提供了分离的抗体，特别是单克隆抗体，例如人源化或人单克隆抗体，其特异性结合人CD40(“huCD40”)并具有激动剂活性。提供了多种人源化鼠抗-huCD40单克隆抗体的序列。在某些实施方案中，本文所述的抗体衍生自特定的鼠重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，诸如包含特定氨基酸序列的CDR区。
本文进一步提供了制成这样的抗体的方法、包含这样的抗体或其抗原结合片段的的免疫缀合物和双特异性分子，以及配制成含有所述抗体或片段的药物组合物。本文还提供了单独使用所述抗体或与其他免疫刺激剂(例如抗体)和/或癌症或抗感染疗法组合使用所述抗体用于免疫应答增强的方法。因此，本文所述的抗huCD40抗体可在多种治疗性应用中用于治疗，包括例如抑制肿瘤生长和治疗慢性病毒感染。
定义
为了更容易理解本说明书，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
CD40指“TNF受体超家族成员5”(TNFRSF5)。除非另有说明或从上下文中清楚，否则本文提到的CD40指人CD40(“huCD40”)，抗CD40抗体指抗人CD40抗体。人CD40在GENE ID NO：958和MIM(Mendelian Inheritance in Man)：109535中进一步描述。包括20个氨基酸的信号序列的人CD40(NP_001241.1)的序列在SEQ ID NO：11提供。
CD40与CD40配体(CD40L)相互作用，CD40配体也称为TNFSF5、gp39和CD154。除非另有说明或从上下文中清楚，否则本文提到的CD40L指人CD40L(“huCD40L”)。人CD40L在GENEID NO：959和MIM：300386中进一步描述。人CD40L的序列(NP_000065.1)在SEQ ID NO：12提供。
除非另有说明或从上下文中清楚，否则本文所用的术语“抗体”可包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。在一个实施方案中，“抗体”指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗体中，每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个框架区(FR)组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和典型补体系统的第一组分(Clq)。
抗体通常以高亲和力特异性结合其同源抗原，所述高亲和力通过10-7至10-11M或更低的解离常数(KD)反映。通常认为任何大于约10-6M的KD表示非特异性结合。如本文所使用的，与抗原“特异性结合”的抗体指以高亲和力结合抗原和基本相同的抗原(意味着具有10- 7M或更小，优选10-8M或更小，甚至更优选5x10-9M或更小，最优选10-8M至10-10M或更小的KD)但不以高亲和力结合不相关的抗原的抗体。如果抗原与给定抗原表现出高度的序列同一性，例如如果抗原与给定抗原的序列表现出至少80％，至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，或甚至更优选至少99％的序列同一性，则该抗原与给定抗原“基本上相同”。举例来说，与人CD40特异性结合的抗体也可能与来自某些非人灵长类物种(例如食蟹猴(cynomolgus monkey))的CD40交叉反应，但可能不与来自其他物种的CD40或不与除CD40外的抗原交叉反应。
除非另有说明，免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA，分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白，例如人IgG1，以几种同种异型存在，它们在至多几个氨基酸中彼此不同。除非另有说明，否则“抗体”可包括，举例来说，单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如人CD40)的能力。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段-由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段-包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，和(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 341:544-546)。分离的互补决定区(CDR)或通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合，如果能够结合抗原，则可以包含抗体的抗原结合结构域。
单链抗体构建体也包括在本发明中。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够被制成单个蛋白质链，其中VL和VH区域配对形成称为单链Fv(scFv)的单价分子；参见例如，Bird et al.(1988)Science 242:423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:5879-5883。这样的单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”内。这些和其他潜在的构建体在Chan&Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10:301中描述。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式对片段进行筛选用于使用。抗原结合部分/片段可以通过重组DNA技术产生，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。
除非另有说明，当提及抗体使用时，诸如在权利要求中，“片段”一词指抗体的抗原结合片段，从而“抗体或片段”具有与“抗体或其抗原结合片段”具有相同的含义。
“双特异性的”或“双功能抗体”是具有两个不同重/轻链对的人工杂合抗体，产生对不同抗原具有特异性的两个抗原结合位点。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见，例如，Songsivilai&Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny et al.(1992)J.Immunol.148,1547-1553。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体，或其中所有抗体对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体组合物。一般地，这样的单克隆抗体会衍生自编码抗体的单个细胞或核酸，并且会在不故意引入任何序列变化的情况下增殖。因此，术语“人单克隆抗体”指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，例如，通过将从转基因或转染色体非人动物(例如，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)获得的B细胞与永生化细胞融合而获得。
如本文所使用的，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从对于人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从被转化以表达抗体的宿主细胞例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体包含利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区，但也包括随后的重排和突变(例如在抗体成熟期间发生的)。如本领域已知的(参见，例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)，可变区含有抗原结合结构域，其由通过重排以形成对外源抗原具有特异性的抗体的多个基因编码。除了重排之外，可以通过多个单个氨基酸改变(称为体细胞突变或超突变)进一步修饰可变区，以增加抗体对外源抗原的亲和力。恒定区会在对抗原的进一步响应中发生变化(即同种型转换)。因此，在对抗原作出响应中编码轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排和体细胞突变的核酸序列可能不与原始种系序列相同，而是会基本上相同或相似(即，具有至少80％同一性)。
“人”抗体(HuMAb)指具有可变区的抗体，在所述可变区中的框架区和CDR区均衍生自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意图包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体指其中非人抗体(例如鼠抗体)的CDR结构域之外的一些、大多数或所有氨基酸用衍生自人免疫球蛋白的相应氨基酸替换的抗体。在人源化形式的抗体的一个实施方案中，CDR结构域外的一些、大多数或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替换，而一个或多个CDR区内的一些、大多数或所有氨基酸未改变。氨基酸的少量添加、缺失、插入、置换或修饰是允许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体类似的抗原特异性。
“嵌合抗体”指其中可变区衍生自一个物种并且恒定区衍生自另一物种的抗体，诸如其中可变区衍生自小鼠抗体并且恒定区衍生自人抗体的抗体。“杂合”抗体指具有不同类型的重链和轻链的抗体，诸如小鼠(亲本)重链和人源化轻链，反之亦然。
如本文所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
“同种异型”指一个特定同种型组内的天然存在的变体，这些变体在一个或几个氨基酸上不同。参见，例如，Jefferis et al.(2009)mAbs 1:1。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
如本文所使用的，“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的一种抗体(例如，特异性结合CD40的分离的抗体基本上不含特异性结合CD40以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CD40表位的分离的抗体可能与来自不同物种的其他CD40蛋白具有交叉反应性。
源自抗体Fc区与某些Fc受体的相互作用的“效应子功能”包括但不必限于C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能(诸如ADCC)和抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)，和细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。这样的效应子功能通常需要Fc区与抗原结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白的Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，其包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种活化性受体(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIb，或等同的FcγRIIB)组成。表1中总结了人FcγR的多个性质。大多数先天型效应细胞类型共表达一种或多种活化性FcγR和抑制性FcγRIIb，而自然杀伤(NK)细胞选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)但不表达小鼠和人中的抑制性FcγRIIb。人IgG1与大多数人Fc受体结合，并且认为在其结合的活化性Fc受体的类型方面与鼠IgG2a等同。
表1.人FcγR的性质
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“Fc区”(片段可结晶区)或“Fc结构域”或“Fc”指抗体重链的C末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)结合。因此，Fc区包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1或CL)之外的抗体的恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含在抗体的两条重链的每一条中的CH2和CH3恒定结构域；IgM和IgE Fc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从C226或P230位的氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)伸长至重链的羧基末端，其中的编号根据Kabat中的EU索引。Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD；还参见美国专利申请公开号2008/0248028的图3c-3f。人IgG Fc区的CH2结构域从约第231位氨基酸延伸至约第340位氨基酸，而CH3结构域位于Fc区中CH2结构域的C末端侧，即，其从IgG的约第341位氨基酸延伸至约第447位氨基酸(包括C-末端赖氨酸)。如本文所使用的，Fc区可以是包括任何同种异型变体在内的天然序列Fc，或变体Fc(例如，非天然存在的Fc)。Fc也可以指单独的该区域或在包含Fc的蛋白质多肽(诸如“包含Fc区的结合蛋白”，也称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素))的环境中的该区域。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区和天然序列的人IgG4 Fc区以及它们的天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的多种同种异型。参见，例如，Jefferis et al.(2009)mAbs 1:1。
术语“表位”或“抗原决定簇”指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原(例如huCD40)上的位点。蛋白质抗原内的表位可以由连续的氨基酸(通常是线性表位)或由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常，但不总是，保持暴露于变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时损失。表位通常包含独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
术语“表位作图”指鉴定参与抗体-抗原识别的抗原上的分子决定簇的过程。用于确定哪些表位与给定抗体结合的方法是本领域公知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试来自(例如，来自CD40)的重叠或连续肽与给定抗体(例如，抗CD40抗体)的反应性；x射线晶体学；二维核磁共振；酵母展示；和HDX-MS(参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
提及两种或更多种抗体的术语“与相同表位结合”意指抗体与相同区段的氨基酸残基结合，如通过给定方法测定的。用于确定抗体是否与本文所述的抗体一样结合“CD40上的相同表位”的技术包括，例如，表位作图法，诸如提供表位的原子级分辨率的抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，和氢/氘交换质谱(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段(例如蛋白水解片段)的结合或抗体与抗原的突变变体的结合，其中由于抗原序列内的氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示，诸如丙氨酸扫描诱变(Cunningham&Wells(1985)Science 244:1081)或突变体靶序列变体的酵母展示。另外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特异性短肽的能力。具有相同或密切相关的VL和VH或相同CDR序列的抗体预期结合相同的表位。
“与另一种抗体竞争结合靶标”的抗体指(部分或完全)抑制另一种抗体与靶标结合的抗体。两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即一种抗体是否以及在何种程度上抑制另一种抗体与靶标的结合，可以使用已知的竞争实验来确定。在某些实施方案中，抗体与另一种抗体竞争并将另一种抗体与靶标的结合抑制了至少10％、20％、30％、40％，50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以根据哪种抗体是“阻断抗体”(即，首先与靶标温育的冷抗体)而不同。竞争测定可以如例如Ed Harlow and David Lane,ColdSpring Harb.Protoc.；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或Harlow and David Lane,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999的“UsingAntibodies”的第11章中所述的那样进行。竞争抗体结合相同的表位，重叠表位或相邻表位(例如，如由位阻现象证明的)。
其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见Stahli et al.(1983)Methods in Enzymology 9:242)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland et al.(1986)J.Immunol.137:3614)；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(参见Harlow and Lane(1988),Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel et al.(1988)Mol.Immunol.25(1):7)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung etal.(1990)Virology 176:546)；和直接标记的RIA(Moldenhauer et al.(1990)Scand.J.Immunol.32:77)。
如本文所使用的，术语“特异性结合”，“选择性结合”，“选择性地结合”和“特异性地结合”指抗体结合预定抗原上的表位但不结合其他抗原。一般地，抗体(i)当通过例如以下方法来确定时以大约小于10-7M的平衡解离常数(KD)结合，诸如大约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低：使用预定抗原(例如重组人CD40)作为分析物和抗体作为配体在
Figure BDA0003772824680000121
2000表面等离子体共振仪器中通过表面等离子共振(SPR)技术，或Scatchard分析抗体与抗原阳性细胞的结合，和(ii)以与其结合除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力相比至少两倍的亲和力与预定抗原结合。因此，“特异性地结合人CD40”的抗体指以10-7M或更低，诸如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD与可溶性或细胞结合的人CD40结合的抗体。“与食蟹猴CD40交叉反应”的抗体指以10-7M或更低，例如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD与食蟹猴CD40结合的抗体。
如本文所使用的，术语“kassoc”或“KA”指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，而本文所用的术语“kdis”或“KD”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如本文所使用的，术语“KD”指平衡解离常数，其由KD与KA的比率(即KD/KA)获得，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域中确立的方法测定抗体的KD值。确定抗体KD的优选方法是生物层干涉测量(BLI)分析(优选使用ForteBio Octet RED装置)、表面等离子体共振(优选使用生物传感器系统诸如
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表面等离子体共振系统)(参见实施例5)或流式细胞术和Scatchard分析。
在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内测定的上下文中的术语“EC50”指诱导为最大应答的50％(即最大应答和基线之间的一半)的应答的抗体或其抗原结合片段的浓度。
术语“与固定的CD40结合”指本文所述的抗体与例如在细胞表面表达的或附接于固体支持物的CD40结合的能力。
如本文所使用的，术语“交叉反应”指本文所述的抗体与来自不同物种的CD40结合的能力。例如，本文所述的结合人CD40的抗体也可结合来自另一物种的CD40(例如食蟹猴CD40)。如本文所使用的，交叉反应性可以通过在结合测定(例如，SPR，ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性来测量，或通过检测与生理上表达CD40的细胞结合或以其他方式与其功能上相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如，使用
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2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)进行
Figure BDA0003772824680000133
表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术技术。
本文所用的应用于物体的术语“天然存在的”指物体可以在自然界中找到的事实。例如，存在于可以从自然界来源分离的生物体(包括病毒)中并且尚未在实验室中被人有意地修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
“多肽”指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，对链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰，例如但不限于糖基化，磷酸化或二硫键。“蛋白质”可包含一个或多个多肽。
如本文所使用的，术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，也可以是cDNA。
还提供了对本文提供的抗体序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码的抗体或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。例如，可以通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)引入修饰。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗-CD40抗体中的预测的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基代替。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的。参见，例如，Brummell et al.(1993)Biochem.32:1180-1187；Kobayashi et al.(1999)Protein Eng.12(10):879-884；和Burks et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)94:412-417。
或者，在另一个实施方案中，可以沿着抗-CD40抗体编码序列的全部或部分随机引入突变，诸如通过饱和诱变，并且可以对所得的修饰的抗-CD40抗体进行筛选以获得改善的结合活性。
对于核酸，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定序列在至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸中是相同的，具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当区段在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在基本同源性。
对于多肽，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，两个多肽或其指定序列在至少约80％的氨基酸，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的氨基酸中是相同的，具有适当的氨基酸插入或缺失。
当序列最佳比对时，两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)，确定最佳比对时考虑两个序列的最佳比对需要引入的空位数和每个空位的长度。序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法完成，如以下的非限制性实施例中所述的。
可以使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性。CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以使用以下方法来确定：已经被并入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分(penalty)为12并且空位罚分为14。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用以下方法来确定：已经被并入GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.(48):444-453)算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)进行这样的搜索。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的具有空位的比对，可以如Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
核酸可以存在于完整细胞中，存在与细胞裂解物中，或以部分纯化的形式或基本纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他方法)从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分)或蛋白质)中纯化出时，核酸被“分离”或“变得基本纯”。参见，F.Ausubel,etal.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York(1987)。
如本文所使用的，术语“载体”意图指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指其中可以接入额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有等同的功能。
如本文所使用的，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意图指包含非天然存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是重组表达载体已被引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅意图指特定的受试者细胞，而且指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，所以事实上这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
“免疫应答”指脊椎动物体内针对外源物质的生物应答，该应答保护生物体免受这些物质以及免于这些物质引起的疾病。免疫应答是由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和由任何这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导的，这导致选择性靶向、结合、损坏、破坏和/或从脊椎动物体内消除入侵病原体\感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞或者在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。免疫应答包括例如活化或抑制T细胞，例如效应T细胞或Th细胞，例如CD4+或CD8+ T细胞，或抑制或消耗Treg细胞。“T效应”(“Teff”)细胞指具有细胞溶解活性的T细胞(例如，CD4+和CD8+ T细胞)以及分泌细胞因子并活化和指导其他免疫细胞的T辅助(Th)细胞，但不包括调节T细胞(Treg细胞)。
如本文所使用的，术语“T细胞介导的应答”指由T细胞介导的应答，包括效应T细胞(例如CD8+细胞)和辅助T细胞(例如CD4+细胞)。T细胞介导的应答包括例如T细胞细胞毒性和增殖。
如本文所使用的，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+ T细胞介导。
“免疫调谐剂(immunomodulator)”或“免疫调节剂(immunoregulator)”指一种剂，例如可参与调谐、调节或修饰免疫应答的信号传导途径的组分。“调谐”、“调节”或“修饰”免疫应答指免疫系统细胞的任何改变或这样的细胞(例如，效应T细胞)的活性的任何改变。这样的调谐包括免疫系统的刺激或抑制，其可以体现在多种细胞类型的数量的增加或减少、这些细胞的活性的增加或减少，或免疫系统内可能发生的任何其他变化。已经鉴定了抑制性和刺激性免疫调节剂，其中一些可在肿瘤微环境中具有增强的功能。在优选的实施方案中，免疫调谐剂位于T细胞的表面上。“免疫调谐靶标”或“免疫调节靶标”是被物质、试剂、部分、化合物或分子靶向结合，并且其活性由于物质、试剂、部分、化合物或分子的结合而改变的免疫调谐剂。免疫调谐靶标包括，例如，细胞表面上的受体(“免疫调谐受体”)和受体配体(“免疫调谐配体”)。
“免疫疗法”指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答在内的方法治疗被疾病折磨或处于染病风险或患病复发的受试者。
“免疫刺激疗法”或“免疫刺激性疗法”指导致增加(诱导或增强)受试者中的免疫应答用于例如治疗癌症的疗法。
“增强内源性免疫应答”意指增加受试者中现有免疫应答的功效或效力。例如，通过克服抑制内源宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源宿主免疫应答的机制，可以实现功效和效力的这样的增加。
如本文所使用的，术语“连接”指两个或更多个分子的结合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(例如，重组融合的)。这样的连接可以使用多种本领域公认的技术(诸如化学缀合和重组蛋白质产生)实现。
如本文所使用的，“施用”指使用本领域技术人员已知的任何多种方法和递送系统将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。或者，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部。还可以进行，例如，一次、多次和/或超过一个或多个延长时段的施用。
如本文所使用的，术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并且涵盖至少约50％，例如，至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的部分和完全抑制/阻断。
如本文所使用的，“癌症”指一大组疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调节的细胞分裂可导致恶性肿瘤或侵入邻近组织的细胞的形成，并可通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。
本文所使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指对受试者进行的任何类型的干预或过程或向受试者施用活性药剂，所述受试者具有逆转、缓解、改善、抑制、或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病况或生化指标的进展、发展、严重程度或复发的目的。预防指向没有患病的受试者施用，以预防疾病发生或如果疾病发生的话将疾病的影响最小化。
术语“有效剂量(effective dose)”或“有效剂量(effective dosage)”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时，促进由疾病症状严重程度降低所证实的疾病消退、无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或预防由疾病折磨引起的损伤或残疾的药物的任何量。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是当单独施用或与另一种治疗剂组合施用于处于发展疾病或患疾病复发的风险的受试者时，抑制疾病的发展或复发的药物的量。治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病的发展或复发的能力可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评价，诸如在临床试验期间的人类受试者中，在预测在人中的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定药剂的活性。
举例来说，抗癌剂是在受试者中减缓癌症进展或促进癌症消退的药物。在优选的实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的点。“促进癌症消退”意指单独施用或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致肿瘤生长减慢或尺寸减小、肿瘤坏死、至少一种疾病症状的严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、预防由于疾病折磨导致的损伤或残疾，或以其他方式改善患者的疾病症状。药理学有效性指药物促进患者癌症消退的能力。生理安全性指由于施用药物导致的在细胞、器官和/或生物体水平上的可接受的低水平毒性或其他有害生理作用(不良反应)。
对肿瘤的治疗实例来说，相对于未治疗的受试者，治疗有效量或治疗有效剂量的药物优选将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并且还更优选至少约80％。在最优选的实施方案中，治疗有效量或治疗有效剂量的药物完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即优选将细胞生长或肿瘤生长抑制100％。可以使用下文描述的测定来评价化合物抑制肿瘤生长的能力。抑制肿瘤生长可能不是治疗后立即的，并且可能仅在一段时间后或在重复施用后发生。或者，可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评价组合物的这样的性质，这样的抑制可以通过本领域技术人员已知的测定在体外测量。在本文所述的其他优选实施方案中，可以观察到肿瘤消退并且肿瘤消退可以持续至少约20天，更优选至少约40天，或甚至更优选至少约60天的时期。
除非从上下文中另外明确，否则本文所使用的“联合”治疗意指涵盖以协调方式施用两种或更多种治疗剂，并且包括但不限于同时施用。具体地，联合治疗涵盖共施用(例如施用共同制剂或同时施用单独的治疗组合物)和连续或顺序施用，条件是一种治疗剂的施用在某种程度上取决于另一种治疗剂的施用。例如，可以仅在施用不同的治疗剂并且允许其作用规定的一段时间后施用一种治疗剂。参见，例如，Kohrt et al.(2011)Blood 117:2423。
术语“患者”和“受试者”指接受预防性或治疗性治疗的任何人。例如，本文所述的方法和组合物可用于治疗患有癌症的受试者。
在以下子章节中更详细地描述了本文所述的多个方面。
I.抗CD40抗体
本申请公开了具有所希望性质的用作治疗疾病诸如癌症的治疗剂的激动性抗huCD40抗体。这些性质包括以高亲和力结合人CD40的能力、人受试者中可接受的低免疫原性，优先结合FcγRIIb的能力，以及不存在可能降低抗体的化学稳定性的序列不利因素中的一种或多种。
本文通过序列公开的抗CD40抗体结合人CD40上的特定表位。与相同或密切相关的表位结合的其他抗体可能也具有这些所希望的性质，并且可以在竞争实验中发现。
与本文公开的抗huCD40抗体竞争的抗huCD40抗体
可以使用与本文所述的那些(实施例1和2)类似的免疫方案产生与本发明的抗体竞争结合huCD40的抗huCD40抗体。与本文通过序列公开的抗huCD40抗体竞争结合的抗体也可以通过用人CD40或包含其细胞外结构域的构建体(SEQ ID NO：11的残基21-193)免疫小鼠或其他非人动物或通过用含有本文公开的抗huCD40抗体结合的表位的人CD40片段免疫来生成。可以通过本领域公知的方法筛选所得抗体的阻断抗体(其包含具有一个或多个突变的突变Fc区，所述一个或多个突变对应于选自下组的IgG重链中的一个或多个突变：N297A、SE、SELF、V9和/或V11(SEQ ID No：3-7))与人CD40结合的能力，例如在ELISA中阻断与CD40胞外域和免疫球蛋白Fc结构域的融合蛋白的结合，或例如通过FACS阻断与表面上表达huCD40的细胞结合的能力。在多种实施方案中，在添加抗体(其包含具有一个或多个突变的突变Fc区，所述一个或多个突变对应于选自下组的IgG重链中的一个或多个突变：N297A、SE、SELF、V9和/或V11(SEQ ID No：3-7))之前、同时或之后，使测试抗体与CD40-Fc融合蛋白(或在其表面上表达huCD40的细胞)接触。例如，可以进行“装箱(binning)”实验以确定测试抗体是否落入与本文通过序列公开的抗体相同的“箱”中，其中本文通过序列公开的抗体作为“参考”抗体，待测试的抗体作为“测试”抗体。减少本文通过序列公开的抗体与人CD40(作为Fc融合体或在细胞上)的结合的抗体，特别是在大致化学计量浓度下，可能在相同、重叠或相邻的表位结合，因此可以也具有抗体(其包含具有一个或多个突变的突变Fc区，所述一个或多个突变对应于选自下组的IgG重链中的一个或多个突变：N297A、SE、SELF、V9和/或V11(SEQ ID No：3-7))的所希望的功能性质。
因此，本文提供了抗huCD40抗体，其将本文所述的抗huCD40抗体与细胞上的huCD40的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，和/或其与细胞上huCD40的结合被本文所述的抗huCD40抗体抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，例如，如通过ELISA或FACS测量的，诸如通过使用以下段落中描述的测定。
用于确定测试抗体是否阻断参考抗体的结合(即“与参考抗体竞争”)的示例性竞争实验可以如下进行：将表达CD40的细胞以每个样品孔105个细胞接种在96孔板中。将平板置于冰上，然后加入浓度范围为0至50μg/mL的未缀合的测试抗体(从最高浓度50μg/mL开始的三倍滴定)。不相关的IgG可以用作第一抗体的同种型对照，并以相同的浓度添加(从最高浓度50μg/mL开始的三倍滴定)。可以包括与50μg/mL未标记的参考抗体预温育的样品作为完全阻断的阳性对照(100％抑制)，并且在初次温育中没有抗体的样品可以用作阴性对照(无竞争；0％抑制)。温育30分钟后，在不洗涤的情况下以每孔2μg/mL的浓度添加标记的例如生物素化的参考抗体。将样品在冰上再温育30分钟。通过用FACS缓冲液洗涤细胞除去未结合的抗体。用检测标记的试剂检测细胞结合的标记的参考抗体，例如用于检测生物素的PE缀合的链霉亲和素(Invitrogen，目录号S21388)。在FACS Calibur流式细胞仪(BD，SanJose)上获得样品，并用Flowjo软件(Tree Star，Inc，Ashland，OR)分析。结果可以表示为％抑制(即，从100％减去每个浓度的标记量除以用无阻断抗体获得的标记量)。
一般地，然后相反地进行相同的实验，即测试抗体是参考抗体，参考抗体是测试抗体。在某些实施方案中，抗体至少部分(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或完全(100％)阻断其他抗体与靶标例如人CD40或其片段的结合，无论当一种或另一种抗体是参考抗体时都发生抑制。当抗体以两种方式(即，在首先添加参考抗体的竞争实验中和在首先添加测试抗体的竞争实验中)彼此竞争时，参考抗体和测试抗体“交叉阻断”彼此与靶标的结合。
结合相同的表位的抗huCD40抗体
可以使用与本文所述的那些类似的免疫方案产生与本文公开的抗体结合相同或相似表位的抗huCD40抗体。可以筛选与人CD40高亲和力结合的所得抗体。然后可以在酵母展示测定中研究选择的抗体，其中huCD40的序列变体呈递在酵母细胞的表面上，或通过氢-氘交换实验，以确定由抗体结合的精确表位。
表位确定可以通过本领域已知的任何方法进行。在多种实施方案中，如果抗huCD40抗体与huCD40的至少一个区域内的一个或多个相同残基接触；如果抗huCD40抗体与huCD40的至少一个区域内的大部分残基接触；如果抗huCD40抗体与huCD40的每个区域内的大部分残基接触；如果抗huCD40抗体在huCD40的整个长度上与大部分残基接触；如果抗huCD40抗体在人CD40的所有相同的独特区域内接触；如果抗huCD40抗体与人CD40上任何一个区域的所有残基接触；或者如果抗huCD40抗体与所有相同区域的所有相同残基接触，则认为该抗huCD40抗体与本文公开的抗huCD40 mAb结合相同的表位。表位“区域”是沿着一级序列的残基簇。
用于确定与本文所述的抗体结合“huCD40上的相同表位”的抗体的技术包括提供表位的原子级分辨率的抗原:抗体复合物的晶体的X射线分析。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。方法还可以依赖于感兴趣的抗体亲和分离来自组合噬菌体展示肽文库或来自靶蛋白的蛋白酶消化物的特定短肽(天然三维形式或变性形式)的能力。然后认为这些肽是用于定义对应于用于筛选肽文库的抗体的表位的指引(lead)。对于表位作图，还开发了已经显示出对构象不连续表位进行作图的计算算法。
表位或包含表位的区域也可以通过筛选与跨越CD40的一系列重叠肽的结合来鉴定。或者，Jespers et al.(1994)Biotechnology 12:899的方法可用于指导选择具有相同表位并因此具有与本文所述的抗CD40抗体相似的性质的抗体。使用噬菌体展示，首先将抗CD40抗体的重链与一组(repertoire)(优选人)轻链配对以选择CD40结合抗体，然后将新的轻链与一组(优选人)重链配对以选择与本文所述的抗huCD40抗体具有相同的表位或表位区域的(优选人)CD40结合抗体。或者，本文所述抗体的变体可通过诱变编码抗体的重链和轻链的cDNA来获得。
如Cunningham&Wells(1989)Science 244:1081所述的丙氨酸扫描诱变，或CD40中氨基酸残基的一些其他形式的点诱变(诸如实施例6中提供的酵母展示方法)也可用于确定对于抗CD40抗体的功能性表位。
由特异性抗体结合的表位或表位区域(“表位区域”是包含表位或与表位重叠的区域)也可以通过评估抗体与包含CD40片段的肽的结合来确定。可以合成涵盖CD40(例如，人CD40)序列的一系列重叠肽，并例如在直接ELISA、竞争ELISA(其中评估肽的防止抗体与结合至微量滴定板孔的CD40结合的能力)中或芯片上筛选结合。这样的肽筛选方法可能不能检测一些不连续的功能性表位，即包含沿着CD40多肽链的一级序列不连续的氨基酸残基的功能性表位。
表位也可以通过基于MS的蛋白质足迹法鉴定，诸如氢/氘交换质谱(HDX-MS)和蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)。HDX-MS可以例如，如Wei et al.(2014)Drug DiscoveryToday 19:95中进一步描述的进行，该方法通过提述具体地并入本文。FPOP可以如，例如Hambley&Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057中所述的进行，该方法通过提述具体地并入本文。
由抗CD40抗体结合的表位也可以通过结构方法确定，诸如X射线晶体结构测定(例如，WO 2005/044853)，分子建模和核磁共振(NMR)光谱，包括核磁共振测定游离时以及与感兴趣的抗体以复合物结合时，CD40中不稳定酰胺氢的H-D交换率(Zinn-Justin et al.(1992)Biochemistry 31:11335；Zinn-Justin et al.(1993)Biochemistry 32:6884)。
关于X射线晶体学，可以使用本领域任何已知方法完成结晶(例如Giege et al.(1994)Acta Crystallogr.D50:339；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1)、包括微批量(例如Chayen(1997)Structure 5:1269)、悬滴蒸汽扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300)、晶胞接种法和透析法。希望使用浓度为至少约1mg/mL，优选约10mg/mL至约20mg/mL的蛋白质制剂。在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量为约1000至约20,000Da)，优选约5000至约7000Da，更优选约6000Da，浓度范围为约10％至约30％(w/v)的聚乙二醇的沉淀剂溶液中可以最好地实现结晶。还可能希望包括浓度范围为约0.5％至约20％的蛋白质稳定剂，例如甘油。合适的盐，诸如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠也可以是在沉淀剂溶液中所希望的，优选浓度范围为约1mM至约1000mM。优选将沉淀剂缓冲至pH为约3.0至约5.0，优选约4.0。可用于沉淀剂溶液的特定缓冲剂可以变化并且是本领域公知的(Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,第三版,(1994)Springer-Verlag,New York)。有用的缓冲液的实例包括但不限于，HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可以在很宽的温度范围内(包括2℃、4℃、8℃和26℃)生长。
抗体:抗原晶体可以使用公知的X射线衍射技术进行研究，并且可以使用计算机软件诸如X-PLOR进行精炼(耶鲁大学，1992，由Molecular Simulations,Inc.发布；参见例如Blundell&Johnson(1985)Meth.Enzymol.114&115,H.W.Wyckoff et al.,Academic Press；美国专利申请公开号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49:37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A:361-423,Carter&Sweet,eds.；Roversi et al.(2000)Acta Cryst.D56:1313-1323)，其公开内容通过提述以其整体并入本文。
除非另有说明，并且参考权利要求，由抗体结合的表位是通过HDX-MS方法测定的表位。
以高亲和力结合的抗CD40抗体
在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体如同本文公开的抗huCD40抗体一样以高亲和力结合huCD40，增加了它们作为有效治疗剂的可能性。在多个实施方案中，本发明的抗huCD40抗体以小于10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM的KD与huCD40结合。在其他实施方案中，本发明的抗huCD40抗体以2nM～100pM的KD与huCD40结合。评价抗体对huCD40的结合能力的标准测定包括ELISA、RIA、蛋白质印迹、生物层干涉测定(BLI)和
Figure BDA0003772824680000241
SPR分析。
抗CD40抗体序列变体
本文公开的抗体序列中的一些可变性可以被容忍并且仍然保持抗体所希望的性质。使用Kabat系统(Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)描绘CDR区。因此，本发明进一步提供了抗huCD40抗体，其包含与本文公开的抗体的CDR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的CDR序列。本发明还提供了抗huCD40抗体，其包含与抗体(其包含具有一个或多个突变的突变Fc区，所述一个或多个突变对应于选自下组的IgG重链中的一个或多个突变：N297A、SE、SELF、V9和/或V11(SEQ ID No：3-7)的重链和/或轻链可变结构域序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％同一性的重链和/或轻链可变结构域序列，及其人源化衍生物。
如本文所使用的，如果抗体的可变区从使用鼠种系免疫球蛋白基因的系统获得，并且抗体序列与种系充分相关(所述种系，与衍生自任何其他种系相比，更可能衍生自给定的种系)，则鼠抗体包含“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用感兴趣的抗原免疫小鼠。通过比较抗体的氨基酸序列与鼠种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择与抗体序列在序列上最接近(即，最大％同一性)的种系免疫球蛋白序列，可以鉴定“衍生”出抗体序列的鼠种系免疫球蛋白序列。“衍生自”特定种系免疫球蛋白序列的鼠抗体可能含有与该种系序列相比的氨基酸差异，这是由于例如天然存在的体细胞突变或故意引入定点突变。然而，选择的鼠抗体的氨基酸序列通常与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列具有至少90％同一性。在某些情况下，鼠抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(例如V区)具有至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％同一性。一般地，衍生自特定鼠种系序列的抗体会展示出与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(例如V区)不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，鼠抗体可以包含与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列(例如V区)不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
II.经工程改造和经修饰的抗体
VH和VL区
还提供了经工程改造和经修饰的抗体，其可以使用具有本文公开的VH和/或VL序列中的一个或多个的抗体作为起始材料以工程改造修饰的抗体，来制备经工程改造的经修饰的抗体，其中经修饰的抗体可以具有与起始抗体相比改变的性质。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内(例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内)的一个或多个残基来工程改造抗体。另外地或替代性地，可以通过修饰恒定区内的残基来工程改造抗体，例如以改变抗体的效应子功能。
可以进行的一种可变区工程改造是CDR移植。这样的移植特别用于人源化非人抗CD40抗体，其与本文公开的抗huCD40抗体竞争结合和/或与本文公开的抗huCD40抗体结合相同的表位。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，与CDR之外的序列相比，CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特异性参考抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包括来自特异性参考抗体并且移植到来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的CDR序列(参见，例如，Riechmann,L.et al.(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.et al.(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.etal.(1989)Proc.Natl.Acad.See.(USA)86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，和Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
这样的框架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库中找到，也可以在Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242；Tomlinson,I.M.,et al.(1992)"The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.et al.(1994)"A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage"Eur.J.Immunol.24:827-836中找到；上述每一文献的内容通过提述明确地并入本文)。
用于本文所述抗体的优选框架序列是结构上类似于本文所述的抗体所用的框架序列的那些。可以将VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列移植到框架区上，所述框架区具有与衍生出该框架序列的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列，或者，可以将CDR序列其移植到与种系序列相比含有多达20个(优选保守的)氨基酸置换的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，突变框架区内的残基以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
本文所述的经工程改造的抗体包括其中对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰(例如以改善抗体的性质)的抗体。通常进行这样的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”到相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生出该抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生出该抗体的种系序列进行比较来鉴定这样的残基。为了使构架区序列回复到其种系构型，可以通过例如定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”至种系序列。这样的“回复突变”的抗体也意图被涵盖在内。
另一种类型的框架修饰涉及突变框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化(deimmunization)”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中进一步详细描述。
另一种类型的可变区修饰是突变CDR区内的氨基酸残基以改善感兴趣的抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变和对抗体结合或其他感兴趣的功能性质的影响。优选引入保守修饰。突变可以是氨基酸添加、缺失，或优选置换。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
可氧化抗体的CDR中的甲硫氨酸残基，导致潜在的化学降解以及随之发生的抗体效力的降低。因此，还提供了抗-CD40抗体，其在重链和/或轻链CDR中具有被不经历氧化降解的氨基酸残基代替的一个或多个甲硫氨酸残基。类似地，可以从抗CD40抗体中，特别是在CDR中去除脱酰胺位点。优选消除抗原结合结构域内的潜在糖基化位点，以防止可能干扰抗原结合的糖基化。参见，例如，美国专利号5,714,350。
Fc和经修饰的Fc
本发明的抗体可以包含基于用于预期用途的抗体的生物学活性(如果有的话)选择的与包含不同Fc区的恒定结构域组合的本发明的可变结构域。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25:1369。例如，人IgG可以分为四个亚类，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且这些中的每一个包含具有对于结合一种或多种Fcγ受体(活化性受体FcγRI(CD64),FcγRIIA、FcγRIIC(CD32a,c)；FcγRIIIA和FcγRIIIB(CD16a,b)和抑制性受体FcγRIIB(CD32b))和对于补体的第一组分(C1q)的独特特征的Fc区。人IgG1和IgG3结合所有Fcγ受体；IgG2结合FcγRIIAH131，并以较低的亲和力结合FcγRIIAR131、FcγRIIIAV158；IgG4结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIAV158；并且抑制性受体FcγRIIB比所有其它Fcγ受体具有更低的对于IgG1、IgG2和IgG3的亲和力。Bruhns et al.(2009)Blood113:3716。研究表明，FcγRI不结合IgG2，并且FcγRIIIB不结合IgG2或IgG4。同上。一般而言，关于ADCC活性，人IgG1≧IgG3＞＞IgG4≧IgG2。作为结果，例如，可以选择IgG1恒定结构域，而不是IgG2或IgG4，用于需要ADCC的药物中；如果活化表达FcγRIIIA的NK细胞、巨噬细胞或单核细胞，则可以选择IgG3；如果抗体用于使过敏患者脱敏，则可以选择IgG4。如果需要抗体缺乏所有效应功能，也可以选择IgG4。
本文所述的抗huCD40可变区可以连接(例如，共价连接或融合)至Fc(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc，其可以是任何同种异型或同种同种异型(asoallotype)，例如，对于IgG1:G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；对于IgG2:G2m、G2m23(n)；对于IgG3:G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v))。参见，例如，Jefferis et al.(2009)mAbs 1:1。同种异型的选择可能受潜在的免疫原性问题的影响，例如，以将抗药物抗体的形成减至最低。
在优选的实施方案中，本发明的抗CD40抗体具有与FcγRIIb结合的Fc或具有增强的与FcγRIIb结合的Fc，其可以提供增强的激动作用。参见，例如，WO 2012/087928；Li&Ravetch(2011)Science 333:1030；Wilson et al.(2011)Cancer Cell 19:101；White etal.(2011)J.Immunol.187:1754。本文所述的可变区可以连接至Fc变体，所述Fc变体增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力，例如，以增强细胞凋亡诱导活性或佐剂活性。Li&Ravetch(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)109:10966；美国专利申请公开号2014/0010812。这样的变体可以提供具有与FcγRIIb+细胞相关的免疫调谐活性的抗体，包括例如B细胞和单核细胞。在一个实施方案中，Fc变体提供了相对于一种或多种活化性受体选择性增强的对FcγRIIb的亲和力。这样的变体还可表现出增强的FcR介导的交联，导致增强的治疗功效。用于改变与FcγRIIb结合的修饰包括一个或多个选自下组的位置处的修饰：根据EU索引的234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332。用于增强FcγRIIb亲和力的示例性置换包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性置换包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcγRIIb结合的其他Fc变体包括235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和267E-328F。具体地，人IgG1的S267E、G236D、S239D、L328F和I332E变体(包括S267E-L328F双变体)在特异性增强对抑制性FcγRIIb受体的亲和力方面特别有用。Chu et al.(2008)Mol.Immunol.45:3926；美国专利申请公开号2006/024298；WO 2012/087928。可通过添加P238D置换和其他突变(Mimoto et al.(2013)Protein.Eng.Des.&Selection 26:589；WO 2012/1152410)，以及V262E和V264E(Yu et al.(2013)J.Am.Chem.Soc.135:9723和WO2014/184545获得对FcγRIIb(与FcγRIIaR131不同)增强的特异性。参见表2。
半衰期延长
在某些实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法都是可能的。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来完成。在一个实施方案中，抗体在CH1或CL区内被改变以含有来自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救(salvage)受体结合表位，如Presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的其他示例性Fc变体包括在位置259、308和434处的置换，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton et al.,(2004),J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hintonet al.(2006)Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields et al.,(2001)Journal of Biological Chemistry,276(9):6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall’Acqua et al.(2002)Journal of Immunology,169:5171-5180,Dall’Acqua et al.,(2006),Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。参见美国专利号8,367,805。
已经提出修饰IgG Fc中的某些保守残基(I253、H310、Q311、H433、N434)，诸如N434A变体(Yeung et al.(2009)J.Immunol.182:7663)，作为增加FcRn亲和力的方法，因此增加抗体在循环中的半衰期。WO 98/023289。已显示出包含M428L和N434S的组合Fc变体增加FcRn结合并使血清半衰期增加高达五倍。Zalevsky et al.(2010)Nat.Biotechnol.28:157。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体也延长了IgG1抗体的半衰期。Petkova etal.(2006)Int.Immunol.18:1759。此外，还显示出包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M和M428L-N434S变体的组合Fc变体延长了半衰期。WO2009/086320。
此外，包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体将半衰期增加接近4倍。Dall’Acquaet al.(2006)J.Biol.Chem.281:23514。已经使用提供增加的FcRn亲和力但降低的pH依赖性的相关IgG1修饰(M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F)来产生IgG1构建体(“MST-HNAbdeg”)用作竞争剂以防止其他抗体与FcRn的结合，导致所述其他抗体(内源性IgG(例如，在自身免疫环境中)或另一种外源性(治疗性)mAb)的清除增加。Vaccaro et al.(2005)Nat.Biotechnol.23:1283；WO 2006/130834。
Yeung et al.(2010)J.Immunol.182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中描述了用于增加FcRn结合的其他修饰。
在某些实施方案中，杂合IgG同种型可用于增加FcRn结合，并可能增加半衰期。例如，可以通过将CH2和/或CH3区域中的IgG1位置用两种同种型有差异的位置处的来自IgG3的氨基酸来置换，以构建IgG1/IgG3杂合变体。因此，可以构建包含一个或多个置换(例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F)的杂合变体IgG抗体。在本文所述的其他实施方案中，可以通过将CH2和/或CH3区域中的IgG2位置用两个同种型有差异的位置处的来自IgG1的氨基酸来置换，以构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可构建包含一个或多个置换(例如，以下氨基酸置换中的一个或多个：233E、234L、235L、-236G(指在236位插入甘氨酸)和327A)的杂合变体IgG抗体。参见美国专利号8,629,113。已经生成IgG1/IgG2/IgG4序列的杂合体，据称其增加血清半衰期并改善表达。美国专利号7,867,491(其中序列号为18)。
通过聚乙二醇化也可以增加本发明的抗体的血清半衰期。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团变成附接于抗体或抗体片段的条件下使抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)试剂(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。优选地，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所使用的，术语“聚乙二醇”意图涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基--聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化(aglycosylated)的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本文所述的抗体。参见例如，Nishimura等的EP 0154316和Ishikawa等的EP 0401384。
或者，在某些情况下，可能需要降低本发明的抗体的半衰期，而不是增加它。人IgG1的Fc中的修饰诸如I253A(Hornick et al.(2000)J.Nucl.Med.41:355)和H435A/R、I253A或H310A(Kim et al.(2000)Eur.J.Immunol.29:2819)可降低FcRn结合，从而减少半衰期(增加清除速度)用于优选快速清除的情况，诸如医学成像。还参见Kenanova et al.(2005)Cancer Res.65:622。增强清除的其他方法包括将本发明的抗原结合结构域格式化为缺乏结合FcRn能力的抗体片段，诸如Fab片段。这样的修饰可以将抗体的循环半衰期从两周减少到几小时。然后，如果需要的话，可以使用抗体片段的选择性PEG化来微调(增加)抗体片段的半衰期。Chapman et al.(1999)Nat.Biotechnol.17:780。抗体片段也可以例如在融合蛋白构建体中与人血清白蛋白融合，以增加半衰期。Yeh et al.(1992)Proc.Nat’lAcad.Sci.(USA)89:1904。或者，可以构建双特异性抗体，其具有本发明的第一抗原结合结构域和结合人血清白蛋白(HSA)的第二抗原结合结构域。参见国际专利申请公开WO2009/127691和其中引用的专利参考文献。或者，可以将专门的多肽序列(例如“XTEN”多肽序列)添加到抗体片段中以增加半衰期。Schellenberger et al.(2009)Nat.Biotechnol.27:1186；国际专利申请公开WO2010/091122。
其他Fc变体
当使用IgG4恒定结构域时，通常优选包括置换S228P，其模拟IgG1中的铰链序列，从而稳定IgG4分子，例如减少正在治疗的患者中的治疗性抗体和内源性IgG4之间的Fab臂交换。Labrijn et al.(2009)Nat.Biotechnol.27:767；Reddy et al.(2000)J.Immunol.164:1925。
可以通过D221G和K222S修饰消除IgG1构建体的铰链中的潜在蛋白酶切割位点，增加抗体的稳定性。WO 2014/043344。
Fc变体对其配体(Fc受体)的亲和力和结合特性可以通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，所述方法包括但不限于平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或放射免疫测定(RIA))，或动力学(例如，
Figure BDA0003772824680000311
SPR分析)，以及其他方法，诸如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如凝胶过滤)。这些和其他方法可以利用正在检查的一种或多种组分上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于生色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul,W.E.,Fundamental Immunology,第四版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)(其主要讲述抗体-免疫原相互作用)中找到。
在其他实施方案中，修饰抗体的糖基化以增加或降低效应子功能。例如，通过突变297位的保守天冬酰胺残基(例如N297A)可以制备缺乏所有效应子功能的糖基化抗体，从而消除补体和FcγRI结合。Bolt et al.(1993)Eur.J.Immunol.23:403。还参见Tao&Morrison(1989)J.Immunol.143:2595(在IgG1中使用N297Q消除297位的糖基化)。
尽管非糖基化抗体通常缺乏效应子功能，但可以引入突变以恢复该功能。非糖基化抗体，例如由N297A/C/D/或H突变产生的或在不糖基化蛋白质的系统(例如大肠杆菌)中产生的那些，可以进一步突变以恢复FcγR结合，例如，S298G和/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)，或E382V和M428I(Jung et al.(2010)Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)107:604)。
可以施用糖基化工程改造，通过改变附接在Fc区的Asn297处的碳水化合物链的α2,6唾液酸含量，来改变IgG构建体的抗炎特性，其中α2,6唾液酸化形式的比例增加导致增强的抗炎症效应。参见Nimmerjahn et al.(2008)Ann.Rev.Immunol.26:513。相反，在不想要抗炎特性的情况下，减少具有α2,6唾液酸化碳水化合物的抗体的比例可能是有用的。在美国专利申请公开号2008/0206246中提供了例如通过选择性纯化α2,6唾液酸化形式或通过酶促修饰来改变抗体的α2,6唾液酸化含量的方法。在其他实施方案中，可以例如通过包含F241A修饰来修饰Fc区的氨基酸序列以模拟α2,6唾液酸化的作用。WO 2013/095966。
III.抗体物理性质
本文所述的抗体可在轻链可变区或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。由于抗原结合的改变，这样的糖基化位点可导致抗体的免疫原性增加或抗体pK的改变(Marshall et al.(1972)Ann.Rev.Biochem.41:673-702；Gala and Morrison(2004)J.Immunol.172:5489-94；Wallick et al.(1988)J.Exp.Med.168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh et al.(1985)Nature 316:452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化发生在含有N-X-S/T序列的基序上。在某些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗huCD40抗体。这可以通过选择在可变区中不含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域内的残基来实现。
在某些实施方案中，本文所述的抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺作用可发生在N-G或D-G序列上，并导致产生异天冬氨酸残基，其在多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)。
每种抗体会具有独特的等电点(pI)，其通常落入6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落入7-9.5的pH范围内，IgG4抗体的pI通常落入6-8的pH范围内。据推测，具有正常范围外pI的抗体可能在体内条件下具有一定程度的解折叠和不稳定性。因此，优选具有pI值落在正常范围内的抗CD40抗体。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。
每种抗体会具有特征性的解链温度(melting temperature)，较高的解链温度表明体内总体稳定性较高(Krishnamurthy R and Manning M C(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3:361-71)。一般地，TM1(初始解折叠温度)优选大于60℃，优选大于65℃，甚至更优选大于70℃。抗体的熔点可以使用差式扫描量热法(Chen et al(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando et al(1999)Immunol Lett.68:47-52)或圆二色谱法(Murray et al.(2002)J.Chromatogr.Sci.40:343-9)测量。
在一个优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander A J和Hughes D E(1995)Anal Chem.67:3626-32)测量抗体的降解。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体，聚集效应可以导致不想要的免疫应答的触发和/或改变的或不利的药代动力学特性。一般而言，具有25％或更低，优选20％或更低，甚至更优选15％或更低，甚至更优选10％或更低，甚至更优选5％或更低的聚集的抗体是可接受的。聚集可以通过若干技术(包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射)测量。
IV.核酸分子
本文所述的另一方面涉及编码本文所述的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或以部分纯化的形式或基本纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、限制性内切酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术)，从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸，例如，其他染色体DNA，例如自然界中与分离的DNA连接的染色体DNA)或蛋白质中纯化出来时，核酸被“分离”或“成为基本纯的”。参见，F.Ausubel,et al.,ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在某些实施方案中，核酸是cDNA分子。
本文所述的核酸可使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，如下进一步描述的从携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因，转化为Fab片段基因或转化为scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一蛋白质的另一DNA片段(诸如抗体恒定区或柔性接头)可操作地连接。在本文的上下文中所使用的术语“可操作地连接”意图指连接两个DNA片段从而由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)，可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子可操作地连接。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)，可以通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，编码VH和VL的DNA片段与编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段可操作地连接，从而VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，VH和VL区通过柔性接头连接(参见例如，Bird et al.(1988)Science 242:423-426；Hustonet al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:5879-5883；McCafferty et al.,(1990)Nature 348:552-554)。
V.抗体生成
本发明的多种抗体，例如，与本文公开的抗huCD40抗体竞争或与本文公开的抗huCD40抗体结合相同表位的那些，可以使用多种已知技术(诸如由Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)描述的标准体细胞杂交技术)产生。虽然优选体细胞杂交方法，但原则上也可以采用其它产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒转化或致癌转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是完善建立的程序。免疫方案和用于分离免疫的脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。
可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列制备本文所述的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤中获得，并使用标准分子生物学技术工程改造成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见例如，Cabilly等的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架中(参见例如，Winter的美国专利号5,225,539，和Queen等的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一个实施方案中，本文所述的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生这样的抗人CD40的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb
Figure BDA0003772824680000361
(Medarex,Inc.)含有人免疫球蛋白基因迷你基因座，其编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶突变(参见例如，Lonberg,et al.(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且在对免疫的应答中，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以生成高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg,N.et al.(1994),同上；Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101中的综述；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93,以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。在Taylor,L.et al.(1992)Nucleic Acids Research20:6287-6295；Chen,J.et al.(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillonet al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:3720-3724；Choi et al.(1993)NatureGenetics 4:117-123；Chen,J.et al.(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.et al.(1994)International Immunology 6:579-591；和Fishwild,D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14:845-851(其全部内容通过提述以其整体由此具体地并入本文)中进一步描述了HuMab小鼠的制备和使用，以及由这样的小鼠携带的基因组修饰。进一步参见，Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等的美国专利号5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92/03918,WO93/12227,WO 94/25585,WO 97/13852,WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等的PCT公开号WO 01/14424。
在某些实施方案中，使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本文所述的抗体。这样的小鼠，在本文中称为“KM小鼠”，在Ishida等的PCT公开WO 02/43478中有详细描述。
此外，替代性的表达人免疫球蛋白基因的转基因动物系统是本领域可获得的，并且可用于产生本文所述的抗huCD40抗体。例如，可以使用称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代性的转基因系统；例如，Kucherlapati等的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述了这样的小鼠。
此外，替代性的表达人免疫球蛋白基因的转染色体动物系统是本领域可获得的，并且可用于产生本文所述的抗CD40抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)97:722-727中描述了这样的小鼠。此外，本领域已经描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛(Kuroiwa et al.(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，并且其可以用于产生本文所述的抗huCD40抗体。
本领域中描述的用于产生人抗体(例如人抗-hCD40抗体)的其他小鼠系统包括(i)
Figure BDA0003772824680000371
小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，其中内源性小鼠重链可变区和轻链可变区已经通过同源重组被人重链可变区和轻链可变区替换，可操作地连接到内源性小鼠恒定区，从而在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，然后随后使用标准重组DNA技术转化为全人抗体；和(ii)
Figure BDA0003772824680000372
小鼠(Merus Biopharmaceuticals,Inc.)，其中小鼠含有未重排的人重链可变区以及单个重排的人共有的(common)轻链可变区。这样的小鼠及其用于产生抗体的用途在例如WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861和US2012/0073004中描述。
本文所述的人单克隆抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。在本领域中已建立用于分离人抗体的这样的噬菌体展示方法。参见例如：Ladner等的美国专利号5,223,409；5,403,484和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
本文所述的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠制备，人免疫细胞已经重新构建到该小鼠中，从而免疫后可以产生人抗体应答。例如，Wilson等的美国专利号5,476,996和5,698,767中描述了这样的小鼠。
免疫
为了产生针对人CD40的全人抗体，可以用纯化或富集的CD40抗原制剂和/或表达CD40的细胞免疫小鼠或含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)，如例如由Lonberg et al.(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild et al.(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和WO 98/24884用于其他抗原中所描述的。或者，可以用编码人CD40的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠在第一次输注时会是6-16周龄。例如，纯化或富集的重组人CD40抗原制剂(5-50μg)可用于腹膜内免疫小鼠。在使用纯化或富集的CD40抗原制剂的免疫不产生抗体的情况下，也可以用表达CD40的细胞(例如，细胞系)免疫小鼠以促进免疫应答。
多种抗原的累积经验显示出，当最初用Ribi佐剂中的抗原腹膜内(IP)或皮下(SC)免疫然后每隔一周用Ribi佐剂中的抗原IP/SC免疫(最高达总共10次)时，HuMAb转基因小鼠应答最好。可以在免疫方案的整个过程中使用通过眶后采血获得的血浆样品来监测免疫应答。可以通过ELISA和FACS(如下所述)筛选血浆，并且具有足够效价的抗CD40人免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。在处死和移出脾脏和淋巴结之前3天，可以用抗原静脉内加强免疫小鼠。预计每次免疫可能需要进行2-3次融合(fusion)。通常针对每种抗原免疫6至24只小鼠。一般地，使用HCo7、HCo12和KM品种。此外，可以将HCo7和HCo12转基因二者一起转入单个小鼠中，该小鼠具有两种不同的人重链转基因(HCo7/HCo12)。
产生CD40单克隆抗体的杂交瘤的生成
为了生成产生本文所述的单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫的小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞，并将其与适当的永生化细胞系融合，例如小鼠骨髓瘤细胞系。可筛选所得杂交瘤以产生抗原特异性抗体。例如，可以使用50％PEG将来自免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与Sp2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将约2x105个细胞接种到平底微量滴定板中，然后在含有10％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50个单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma)的选择性培养基中温育两周。大约两周后，可以在HAT被HT替换的培养基中培养细胞。然后可以通过ELISA筛选各个孔的人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛的杂交瘤生长，通常可在10-14天后观察培养基。可以重新铺板分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，如果人IgG仍然是阳性的，则可以通过有限稀释法将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中生成少量抗体用于进行表征。
为了纯化单克隆抗体，可以在2升旋转瓶中使选择的杂交瘤生长用于单克隆抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱之前，可以过滤和浓缩上清液。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。缓冲溶液可以换成PBS，浓度可以使用1.43消光系数通过OD280来确定。可以将单克隆抗体等分并储存在-80℃。
VI.抗体制造
产生CD40单克隆抗体的转染瘤的生成
本发明的抗体，包括提供序列的特异性抗体和其他相关的抗CD40抗体，可以使用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤进行cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入表达载体中，从而基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在本文的上下文中，术语“可操作地连接”意图指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体中，或者将两个基因插入相同的表达载体中。通过标准方法(例如，连接在抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点，或者如果不存在限制性位点则进行平末端连接)将抗体基因插入表达载体中。本文所述抗体的轻链可变区和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，这通过将它们插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段与载体内的一个或多个CH区段可操作地连接，VL区段与载体内的CL区段可操作地连接。另外地或替代性地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。
除抗体链基因外，重组表达载体还可携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调控序列。术语“调控序列”意图包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列例如在Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中描述。本领域技术人员会理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白质表达的病毒元件，诸如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤。或者，可以使用非病毒调控序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。此外，调控元件由来自不同来源的序列组成，诸如SRα启动子系统，其中含有来自SV40早期启动子和1型人T细胞白血病病毒的长末端重复序列的序列(Takebe,Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除抗体链基因和调控序列外，重组表达载体还可携带额外的序列，诸如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见，例如，Axel等的美国专利号4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，一般地，选择性标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物(诸如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞中，使用氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一个或多个表达载体转染到宿主细胞中。多种形式的术语“转染”意图涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。虽然理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但是在真核细胞最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌恰当折叠的并且有免疫活性的抗体。据报道，抗体基因的原核表达对于产生高产量的活性抗体是无效的(Boss,M.A.and Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。本发明的抗体也可以在酵母巴斯德毕赤酵母的糖基工程改造菌株中生产。Li et al.(2006)Nat.Biotechnol.24:210。
用于表达本文所述的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，其与DHFR选择性标记一起使用，例如，如在R.J.Kaufman andP.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中所述的)，NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一优选的表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许在宿主细胞中表达抗体或者更优选地将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中的一段时间来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
由于通常观察到的翻译后修饰，本发明的抗体多肽链的N-和C-末端可能与预期的序列不同。例如，抗体重链中通常缺少C末端赖氨酸残基。Dick et al.(2008)Biotechnol.Bioeng.100:1132。在治疗性抗体的轻链和重链上的N-末端谷氨酰胺残基和较小程度的谷氨酸残基经常转化为焦谷氨酸残基。Dick et al.(2007)Biotechnol.Bioeng.97:544；Liu et al.(2011)J.Biol.Chem.286:11211。
VII.测定
可以通过例如标准ELISA测试本文所述的抗体与CD40的结合。简言之，将用含1-2μg/ml的纯化的CD40的PBS包被微量滴定板，然后用在PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自CD40免疫的小鼠的血浆稀释液)添加到每个孔中并在37℃下温育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤，然后与缀合辣根过氧化物酶(HRP)的二级试剂(例如，对于人抗体，或具有人重链恒定区的抗体，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃下温育1小时。洗涤后，用ABTS底物(Moss Inc，产品：ABTS-1000)使板显色，并用分光光度计在OD 415-495分析。然后通过流式细胞术进一步筛选来自免疫的小鼠的血清，用于得到结合表达人CD40的细胞系，但不结合不表达CD40的对照细胞系的血清。简言之，通过将表达CD40的CHO细胞与1:20稀释的抗CD40抗体一起温育来评估抗CD40抗体的结合。洗涤细胞并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞术分析。优选地，产生最高效价的小鼠将用于融合。如果要检测小鼠抗huCD40抗体，可以使用抗小鼠检测抗体进行类似的实验。
如上所述的ELISA可用于筛选抗体，并因此筛选产生与CD40免疫原显示出阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可以亚克隆并进一步表征产生与CD40结合(优选以高亲和力与CD40结合)的抗体的杂交瘤。然后可以选择保留亲本细胞的反应性(通过ELISA)的来自每个杂交瘤的一个克隆，用于制成细胞库，以及用于抗体纯化。
为了纯化抗CD40抗体，可以在2升旋转瓶中培养选择的杂交瘤用于单克隆抗体纯化。在用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析之前，可以过滤和浓缩上清液。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。可以将缓冲溶液换成PBS，可以通过OD280使用1.43消光系数来确定浓度。可以将单克隆抗体等分并储存在-80℃。
为了确定所选择的抗CD40单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以用链霉素标记的探针检测生物素化的MAb结合。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的CD40包被的ELISA板进行。
为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，微量滴定板的孔可以在4℃下用1μg/ml的抗人免疫球蛋白包被过夜。用1％BSA封闭后，板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在室温反应1-2小时。然后可以使孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。如上所述显色和分析板。
为了测试单克隆抗体与表达CD40的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简言之，将表达膜结合的CD40的细胞系(在标准生长条件下生长)与在含有0.1％BSA的PBS中的多种浓度的单克隆抗体在4℃混合1小时。洗涤后，在与一抗染色相同的条件下使细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体反应。可以通过FACScan仪器使用光和侧向散射特性分析样品以在单个细胞上进行门控，并确定标记抗体的结合。(除了或代替)流式细胞术测定，可以使用使用荧光显微术的替代测定。可以如上所述精确染色细胞并通过荧光显微镜检查。该方法允许单个细胞的可视化，但是根据抗原的密度可能具有降低的灵敏度。
可以通过蛋白质印迹进一步测试抗huCD40抗体与CD40抗原的反应性。简言之，可以制备来自表达CD40的细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗-IgG碱性磷酸酶检测IgG结合，并用BCIP/NBT底物片剂(SigmaChem.Co.,St.Louis,MO)显色。
用于分析多种抗CD40抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如，生物层干涉测量(BLI)分析和使用
Figure BDA0003772824680000431
2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)的
Figure BDA0003772824680000432
表面等离子体共振(SPR)分析。
在一个实施方案中，抗体特异性结合人CD40的细胞外区域。抗体可以特异性结合CD40的细胞外结构域内的特定结构域(例如，功能结构域)。在某些实施方案中，抗体特异性结合人CD40的细胞外区域和食蟹猴CD40的细胞外区域。优选地，抗体以高亲和力结合人CD40。
VIII.双特异性分子
本文所述的抗体可用于形成双特异性分子。抗CD40抗体或其抗原结合片段可以被衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一肽或蛋白质(例如，另一抗体或受体的配体)以生成结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。事实上，本文所述的抗体可以被衍生化或连接至一种以上的其他功能分子，以生成结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这样的多特异性分子也意图涵盖在本文所用的术语“双特异性分子”中。为了产生本文所述的双特异性分子，本文所述的抗体可以与一种或多种其他结合分子(诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)，从而产生双特异性分子。
因此，本文提供的是双特异性分子，其包含至少一种对CD40的第一结合特异性和对第二种靶表位的第二结合特异性。在本文所述的双特异性分子是多特异性的实施方案中，该分子可以进一步包括第三结合特异性。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，诸如Fv或Ladner等美国专利号4,946,778(其内容通过提述明确地并入本文)中所述的单链构建体。
虽然人单克隆抗体是优选的，但可用于本文所述双特异性分子中的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
本文所述的双特异性分子可通过使用本领域已知的方法缀合组分结合特异性来制备。例如，双特异性分子的每个结合特异性可以单独生成，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，邻苯二甲酰亚胺(o-phenylenedimaleimide，oPDM)，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132；Brennan et al.(1985)Science 229:81-83和Glennie et al.(1987)J.Immunol.139:2367-2375中描述的那些。优选的缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两条重链的C末端铰链区的巯基键合而缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前将铰链区修饰为含有奇数个(优选一个)巯基残基。
或者，两种结合特异性可以编码在同一载体中，并在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，此方法特别有用。本文所述的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单一链分子，或包含两种结合决定簇的单一链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法例如在美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中描述。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以使用本领域公认的方法确认，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或蛋白质印迹测定。这些测定中的每一种通常通过使用对感兴趣的复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。
IX.组合物
进一步提供的是组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体一起配制的一种或多种如本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。这样的组合物可包括本文所述的一种抗体或免疫缀合物或双特异性分子，或(例如，两种或更多种不同的)抗体或免疫缀合物或双特异性分子的组合。例如，本文所述的药物组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性抗体)的组合。
在某些实施方案中，组合物包含浓度为至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml，或1-300mg/ml或100-300mg/ml的抗CD40抗体。
本文所述的药物组合物还可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联合施用。例如，联合治疗可包括本文所述的抗CD40抗体与至少一种其他抗癌和/或T细胞刺激(例如活化)剂联合。可以在联合治疗中使用的治疗剂的实例在下文关于本文所述抗体的用途的部分中更详细地描述。
在一些实施方案中，本文公开的治疗组合物可包括用于治疗癌症的其他化合物、药物和/或药剂。这样的化合物、药物和/或药剂可包括例如化疗药物、小分子药物或刺激对给定癌症的免疫应答的抗体。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣(coating)、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可以将活性化合物(即抗体、免疫缀合物或双特异性分子)包被在材料中，以保护化合物免受酸和其它可能使化合物失活的天然条件的作用。
本文所述的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留亲体化合物的所需生物活性并且不会产生任何不希望的毒理学作用的盐(参见例如，Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的那些盐，诸如盐酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、亚磷酸盐等，以及衍生自无毒有机酸(诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等)的那些盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属(诸如钠、钾、镁、钙等)的那些盐，以及衍生自无毒有机胺(诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)的那些盐。
本文所述的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本文所述的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油诸如橄榄油，和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)，在分散体的情况下通过保持所需的粒度，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可含有助剂(adjuvant)，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)，可以确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和无菌粉末，用于临时制备无菌可注射溶液或分散液。这样的介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容的情况，否则考虑将其用在本文所述的药物组合物中。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。
在制造和储存条件下治疗组合物通常必须是无菌和稳定的。该组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的适当混合物。例如，通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的剂(例如单硬脂酸盐和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物与上面列举的一种成文或成分的组合一起(如果需要的话)掺入适当的溶剂中，然后进行灭菌微滤来制备。一般地，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量会根据所治疗的受试者和具体的施用方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常会是产生治疗效果的组合物的量。通常，基于百分之百，此量的范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的与药学上可接受的载体组合的活性成分。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急状态按比例减少或增加剂量。特别有利的是，以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀。如本文所使用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。本文所述的剂量单位形式的规格由(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果和(b)复合这样的活性化合物用于治疗个体敏感性的本领域中固有的局限性决定并且直接取决于其。
对于抗体的施用，剂量范围为约0.0001至100mg/kg宿主体重，更通常为0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每3至6个月施用一次。
在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在这样的情况下，施用的每种抗体的剂量落在所指示的范围内。通常多次机会施用治疗性抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每三个月或每年。如通过测量患者中针对靶抗原的抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
抗体可以作为缓释制剂施用，在这样的情况下需要较低频率的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。一般而言，人抗体显示出最长的半衰期，然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低的剂量在较长时间内以相对不频繁的间隔施用。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，患者可以任选地被施用预防性方案，尽管在许多免疫肿瘤学适应症中，不需要继续治疗。
可改变本文所述的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现对于特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应并且对患者无毒性的活性成分的量。所选的剂量水平会取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本文所述的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中公知的类似因素。
“治疗有效剂量”的本文所述的抗CD40抗体优选导致疾病症状的严重程度降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或预防由于疾病折磨引起的损伤或残疾。在癌症的情况下，治疗有效剂量优选地防止与癌症相关的身体症状的进一步恶化。癌症的症状在本领域中是公知的，并且包括例如不寻常痣的特征，痣外观的变化，包括不对称性、边界、颜色和/或直径，新着色的皮肤区域，异常的痣，指甲下的变暗区域，乳房肿块，乳头变化，乳房囊肿，乳房疼痛，死亡，体重减轻，虚弱，过度疲劳，进食困难，食欲不振，慢性咳嗽，呼吸困难加重，咳血，血尿，便血，恶心，呕吐，肝转移，肺转移，骨转移，腹满，胃气胀，腹腔积液，阴道出血，便秘，腹胀，结肠穿孔，急性腹膜炎(感染、发烧、疼痛)，疼痛，吐血，大量出汗，发烧，高血压，贫血，腹泻，黄疸，头晕，畏寒，肌肉痉挛，结肠转移，肺转移，膀胱转移，肝转移，骨转移，肾转移和胰腺转移，吞咽困难等。在第一次施用本发明的激动性抗huCD40 mAb后可以立即观察到治疗功效，或者仅在一段时间和/或一系列剂量后可以观察到治疗功效。这样的延迟功效可以仅在治疗数月(长达6、9或12个月)后才能观察到。至关重要的是，不要过早地评论本发明的激动性抗-hCD4040mAb由于一些免疫-肿瘤学药剂所显示的延迟功效而缺乏治疗功效。
治疗有效剂量可以预防或延迟癌症的发作，诸如当存在疾病的早期或初步迹象时可能需要。用于癌症诊断的实验室测试包括化学(包括可溶性CD40或CD40L水平的测量)(Hock et al.(2006)Cancer 106:2148；Chung&Lim(2014)J.Trans.Med.12:102)、血液学、血清学和放射学。因此，监测任何前述的任何临床或生物化学测定可用于确定特定治疗是否是治疗癌症的治疗有效剂量。本领域普通技术人员会能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或施用途径等因素来确定这样的量。
本文所述的组合物可以使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径施用。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或方式会根据所需结果而变化。本文所述抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本文所述的抗体可以经由非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。
活性化合物可以与载体一起制备，所述载体会保护化合物免于快速释放，诸如缓释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐类，聚乙醇酸、胶原、聚正酯类和聚乳酸。用于制备这样的制剂的许多方法是专利的或本领域技术人员通常已知的。参见，例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可以使用本领域已知的医疗装置施用治疗组合物。例如，在一个优选的实施方案中，可以用无针皮下注射装置施用本文所述的治疗组合物，诸如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。与本文所述的抗huCD40抗体一起使用的公知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种透过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物递送的可变流量可植入输注仪器；美国专利号4,439,196，其公开了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。这些专利通过提述并入本文。许多其他这样的植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，可以配制本文所述的抗huCD40抗体以确保体内适当的分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本文所述的治疗性化合物穿过BBB(如果需要的话)，可以将它们配制在例如脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含被选择性转运到特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶标药物的递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向用部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
X.用途和方法
本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如通过激动CD40信号传导来增强免疫应答。在优选的实施方案中，本文所述的抗体是人或人源化抗体。例如，本文所述的抗huCD40抗体可以在培养物中、体外或离体施用于细胞，或者施用于人类受试者，例如体内施用，以增强对多种疾病的免疫力。因此，本文提供了修饰受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段，使得增强、刺激或上调受试者中的免疫应答。
优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法特别适用于治疗患有可通过增加免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)来治疗的病症的人类患者。在一个具体实施方案中，该方法特别适用于体内治疗癌症。为了实现免疫力的抗原特异性增强，本文所述的抗huCD40抗体可与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可以已经存在于待治疗的受试者中(例如，具有肿瘤或具有病毒的受试者)。当CD40抗体与另一种剂一起施用时，两者可以分开或同时施用。
还涵盖的是用于检测样品中人CD40抗原的存在或测量人CD40抗原的量的方法，包括在允许抗体或其片段与人CD40之间形成复合物的条件下，使样品和对照样品与特异性结合人CD40的人单克隆抗体或其抗原结合片段接触。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品相比形成差异复合物表明样品中存在人CD40抗原。此外，本文所述的抗CD40抗体可用于经由免疫亲和纯化来纯化人CD40。
考虑到本文所述的抗huCD40抗体能够增强T细胞应答(例如抗原特异性T细胞应答)的共刺激，本文提供了使用本文所述抗体刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答(例如抗肿瘤T细胞应答)的体外和体内方法。
使用抗CD40抗体可以增强CD4+和CD8+ T细胞应答。T细胞可以是Teff细胞，例如CD4+ Teff细胞、CD8+ Teff细胞、T辅助细胞(Th)和T细胞毒性(Tc)细胞。
进一步涵盖的是在受试者中增强免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)的方法，包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，使得增强受试者中的免疫应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。在一个优选的实施方案中，受试者是具有肿瘤的受试者并且抗肿瘤的免疫应答被增强。肿瘤可以是实体瘤或液体瘤，例如血液恶性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阴性的。受试者也可以是具有病毒的受试者，并且抗病毒的免疫应答被增强。
进一步提供的是用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而抑制受试者中肿瘤的生长。还提供的是治疗受试者中的慢性病毒感染的方法，包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而治疗受试者中的慢性病毒感染。
在某些实施方案中，将抗huCD40抗体作为辅助治疗给予受试者。用抗huCD40抗体治疗患有癌症的受试者可导致相对于当前护理标准的长期持久反应；长期存活至少1、2、3、4、5、10或更多年，无复发存活至少1、2、3、4、5或10或更多年。在某些实施方案中，用抗huCD40抗体治疗患有癌症的受试者预防癌症复发或将癌症复发延迟例如1、2、3、4、5或10或更多年。抗CD40治疗可用作主要或次要治疗线。
本文所述的这些和其他方法在下面进一步详细讨论。
癌症
本文提供了用于治疗患有癌症的受试者的方法，包括向受试者施用本文所述的抗huCD40抗体，从而治疗受试者，例如从而抑制或减少癌性肿瘤的生长，和/或从而肿瘤消退。可以单独使用抗huCD40抗体来抑制癌性肿瘤的生长。或者，抗huCD40抗体可以与另一种剂(例如其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体)联合使用，如下所述。
因此，本文提供了例如通过抑制肿瘤细胞的生长治疗受试者中的癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗huCD40抗体或其抗原结合片段。抗体可以是人源化抗huCD40抗体，人嵌合抗huCD40抗体或人源化非人抗huCD40抗体，例如与本文具体描述的至少一种抗huCD40抗体竞争结合或与结合相同的表位的人、嵌合或人源化抗huCD40抗体。
可以使用本发明的抗体抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾脏癌(例如清除细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(如肾脏细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(胶质母细胞瘤多形性)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、头颈癌(或癌(carcinoma))、胃癌(gastric cancer)、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤、黑色素瘤(例如，转移性恶性肿瘤，诸如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区域的癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤，垂体腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括石棉诱发的癌症)、病毒相关癌症(例如，人乳头瘤病毒(HPV)相关肿瘤)，以及源自两种主要血细胞谱系(即髓样细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞))的血液系统恶性肿瘤，诸如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴细胞和/或髓性白血病，诸如急性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、未分化AML(M0)、成髓细胞白血病(M1)、成髓细胞白血病(M2；细胞成熟)、早幼粒细胞白血病(M3或M3变体[M3V])、髓单核细胞白血病(M4或M4变体与嗜酸性粒细胞增多[M4E])、单核细胞白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核细胞白血病(M7)、孤立性粒细胞肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤，诸如霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(如，Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管性免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、T淋巴母细胞和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、移植后淋巴组织增生性病症、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)、造血细胞淋巴系肿瘤、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样真菌病或Sezary综合征)，和淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)伴瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)；骨髓瘤，诸如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、阴燃骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤、间充质来源的肿瘤(包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)；精原细胞瘤、畸胎癌、中枢和周围神经肿瘤(包括星形细胞瘤、神经鞘瘤)；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤，甲状腺滤泡癌和畸胎癌、淋巴谱系的造血肿瘤、例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症，诸如T-幼淋巴细胞(包括小细胞和脑细胞类型)白血病(T-PLL)；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)，优选为T细胞型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞亚型)；血管中心(鼻)T细胞淋巴瘤；头颈癌、肾脏癌、直肠癌、甲状腺癌；急性髓性淋巴瘤，以及所述癌症的任何组合。本文所述的方法还可用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如，先前免疫疗法(例如用阻断性CTLA-4或PD-1抗体)难以治愈的癌症)和复发性癌症。
抗huCD40抗体可以作为单一疗法或作为唯一的免疫刺激疗法施用，或者可以与癌症疫苗策略中的免疫原性剂(诸如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He et al.(2004)J.Immunol.173:4919-28))组合施用。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。已经设计了许多用于抗肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCOEducational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；还参见Restifo,N.and Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61,pp.3023-3043in DeVitaet al.(eds.),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已经显示，当肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗最有效。已显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效活化剂。Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:3539-43。
对多种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究已经得到所谓的肿瘤特异性抗原的定义。Rosenberg,S A(1999)Immunity 10:281-7。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和产生肿瘤的细胞中表达的差异抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。CD40激动剂可以与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合联合使用，以产生对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原可包括蛋白质端粒酶，其是合成染色体端粒所必需的，并且在超过85％的人类癌症和仅有限数量的体细胞组织中表达(Kim et al.(1994)Science 266:2011-2013)。肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”，因为体细胞突变改变蛋白质序列或在两个不相关的序列(即，费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白，或者来自B细胞肿瘤的独特型。
其他肿瘤疫苗可包括来自涉及人类癌症的病毒(诸如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV))的蛋白质。可以与CD40抑制结合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，这些HSP在递送至抗原呈递细胞时具有高效率，用于引发肿瘤免疫力(Suot&Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura et al.(1997)Science 278:117-120)。
树突细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，可用于引发抗原特异性应答。可以离体产生DC并使其装载多种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle et al.(1998)NatureMedicine 4:328-332)。也可以通过遗传手段转导DC以表达这些肿瘤抗原。为了免疫目的，也已将DC与肿瘤细胞直接融合(Kugler et al.(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为接种疫苗的方法，DC免疫可以与CD40激动作用有效地结合以激活(释放)更有效的抗肿瘤反应。
CD40的激动作用还可以与标准癌症治疗(例如，手术、放射和化疗)组合。CD40的激动作用可以与化学治疗方案有效结合。在这些情况下，可以减少施用的化学治疗剂的剂量(Mokyr et al.(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。这样的组合的一个实例是抗huCD40抗体与氨烯咪胺(decarbazine)组合用于治疗黑素瘤。这样的组合的另一个实例是抗huCD40抗体与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。联合使用CD40激动剂和化疗背后的科学原理是细胞死亡(其是大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果)应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的增加。可通过细胞死亡导致与CD40激动作用协同作用的其他联合治疗是放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与CD40激动剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原供给宿主抗原呈递途径。
本文所述的抗huCD40抗体还可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向至肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见，例如，美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可用于靶向两种单独的抗原。例如，已经使用抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向至肿瘤部位。此靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂(arm)将通过CD40的激动作用而增强。或者，可以通过使用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标志物的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。许多这些机制可以通过肿瘤表达的免疫抑制蛋白的失活来克服。这些其中包括TGF-β(Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)和Fas配体(Hahneet al.(1996)Science 274:1363-1365)。针对这些实体中的每一种的抗体可以与抗huCD40抗体组合使用以抵消免疫抑制剂的作用并且有利于宿主的肿瘤免疫应答。
抗CD40抗体能够有效替代T细胞辅助活性。Ridge et al.(1998)Nature 393:474-478。激活针对T细胞共刺激分子诸如CTLA-4(例如，美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg et al.(2000)Immunol 164:2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero et al.(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff et al.(1999)Nature 397:262-266)的抗体，也可以提供增加的T细胞活化水平。PD1或PD-L1的抑制剂也可以与抗huCD40抗体联合使用。
还有几种实验性治疗方案涉及离体活化和扩增抗原特异性T细胞以及将这些细胞过继转移到受体中以刺激抗肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell(1999)Science285:546-51)。这些方法也可用于激活T细胞对感染剂诸如CMV的应答。在抗CD40抗体存在下的离体活化可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
慢性病毒感染
另一方面，本文所述的发明提供了治疗受试者中的感染性疾病的方法，包括向受试者施用抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而治疗受试者的感染性疾病。
类似于如上所述其对肿瘤的应用，抗体介导的CD40激动作用可以单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以增强对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。该治疗方法特别有用的病原体的实例包括目前没有有效疫苗的病原体，或常规疫苗不完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV，肝炎(A，B和C)，流感，疱疹，贾第虫，疟疾，利什曼原虫，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。CD40激动对于在感染过程中呈现改变的抗原的诸如HIV的剂的已确定的感染特别有用。这些新型表位在抗huCD40抗体施用时被识别为外源，因此引起强烈的T细胞应答。
可通过本文所述的方法治疗的引起感染的致病性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV，Epstein Barr病毒)、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
可通过本文所述的方法治疗的引起感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋病双球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆病细菌。
可通过本文所述的方法治疗的引起感染的病原性真菌的一些实例包括念珠菌(白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等)、新型隐球菌、曲霉菌(烟曲霉、黑曲霉等)，毛霉属(毛霉菌属、犁头霉属、根霉菌属)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)。
可通过本文所述方法治疗的引起感染的致病性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠肠袋虫(Balantidium coli)、福氏耐格里原虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba sp.)、兰伯贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、小鼠焦虫(Babesia microti)、布鲁斯锥虫(Trypanosoma brucei)、克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西钩虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，CD40激动作用可以与其他形式的免疫疗法(诸如细胞因子治疗(例如，干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2))或双特异性抗体疗法组合，其提供肿瘤抗原增强的呈递。参见，例如，Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123。
疫苗佐剂
本文所述的抗huCD40抗体可用于通过共同施用抗huCD40抗体与感兴趣的抗原(例如，疫苗)来增强抗原特异性免疫应答。因此，本文提供了增强受试者对抗原的免疫应答的方法，包括向受试者施用：(i)抗原；(ii)抗huCD40抗体或其抗原结合片段，从而增强受试者对抗原的免疫应答。抗原可以是，例如，肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这样的抗原的非限制性实例包括在以上部分中讨论的那些，诸如上文讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)，或上述的来自病毒、细菌或其他病原体的抗原。
在体内和体外施用本文所述的抗体组合物(例如，人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的合适途径是本领域公知的，并且可由本领域普通技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如，静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量会取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本文所述的抗huCD40抗体可与一种或多种治疗剂(例如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂)共同施用。抗体可以与药剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与药剂分开施用。在后一种情况下(单独施用)，抗体可以在药剂之前、之后施用或与药剂同时施用，或者可以与其他已知疗法(例如抗癌疗法，例如放射)共同施用。这样的治疗剂包括其中是抗肿瘤剂，诸如多柔比星(doxorubicin)(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪(dacarbazine)和环磷酰胺羟基脲，它们本身仅在对患者有毒或亚毒性的水平有效。顺铂以100mg/ml剂量每4周一次静脉内施用，并且阿霉素以60-75mg/ml剂量每21天一次静脉内施用。本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共同施用提供了两种抗癌剂，其经由不同的对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的机制运行。这样的共同施用可以解决由于发生药物抗性或肿瘤细胞的抗原性变化而导致它们与抗体不反应的问题。
还在本文所述范围内的是包含本文所述的抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的试剂盒。试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，或本文所述的一种或多种另外的人抗体(例如，与CD40抗原中不同于第一人抗体的表位结合的具有互补活性的人抗体)。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何书写或记录材料，或者试剂盒随附的任何书写或记录材料。
联合治疗
除了上文提供的联合治疗之外，本文所述的抗CD40抗体还可以用于联合治疗，例如用于治疗癌症，如下所述。
本发明提供联合治疗的方法，其中抗huCD40抗体与一种或多种其他剂(例如，抗体)共同施用，其有效刺激免疫应答，从而进一步增强、刺激或上调受试者的免疫应答。
一般地，本文所述的抗huCD40抗体可以与(i)另一种共刺激受体的激动剂和/或(ii)T细胞上的抑制信号的拮抗剂组合，其中任一种都导致扩大抗原特异性T细胞应答(免疫检查点调节剂)。大多数共刺激分子和共抑制分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员，并且本文所述的抗CD40抗体可以与靶向IgSF家族成员的剂一起施用以增加免疫应答。与共刺激受体或共抑制受体结合的膜结合配体的一个重要家族是B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6。与共刺激受体或共抑制受体结合的膜结合配体的另一个家族是与同源TNF受体家族成员结合的TNF家族分子，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(参见,例如,Tansey(2009)Drug DiscoveryToday 00:1)。
另一方面，抗huCD40抗体可与抑制T细胞活化的细胞因子拮抗剂(例如，IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF)；或其他“免疫抑制细胞因子”，或刺激T细胞活化的细胞因子组合使用，用于刺激免疫应答，例如用于治疗增殖性疾病，诸如癌症。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体和联合抗体疗法还可以与其它公知的疗法联合使用，所述其它公知的疗法因其对抗所治疗的适应症(例如癌症)特别有用被选择。本文所述的激动剂抗huCD40抗体的组合可以与已知的药学上可接受的剂顺序使用。
例如，本文所述的激动剂抗huCD40抗体和联合抗体疗法可以与另外的治疗组合(例如，同时或分开)使用，所述另外的治疗诸如辐射、化疗(例如，使用喜树碱(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、多柔比星、伊立替康、紫杉醇，吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(紫杉酚)、多柔比星、5-fu或喜树碱+apo2l/TRAIL(6X联合体))、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如，BH3I-2'(bcl-xl抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如，INCB24360)、AT-101(R)-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉，obatoclax)或MCL-1(髓样白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如、smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成的smac肽(参见Fulda et al.,Nat Med 2002；8:808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如，贝伐单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如，
Figure BDA0003772824680000601
)、合成的三萜类(参见Hyer et al.,Cancer Research 2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如，天然和合成的PPARγ配体(过氧化物酶体增殖物活化性受体γ)、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如，索拉非尼(Sorafenib))、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、坦西莫司(Temsirolimus)、mTOR抑制剂诸如雷帕霉素和坦西莫司、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂和/或基因毒性药物。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体和联合抗体疗法可进一步与一种或多种抗增殖细胞毒性剂组合使用。可用作抗增殖细胞毒性剂的化合物的种类包括但不限于以下：
烷基化剂(包括但不限于氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐(alkyl sulfonate)、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥、氮芥(Chlorambucil)、环磷酰胺(CYTOXANTM)fosfamide、美法仑(Melphalan)、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷(Pipobroman)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、链佐星(Streptozocin)、达卡巴嗪(Dacarbazine)和替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨磷酸盐(Fludarabine phosphate)、Pentostatine和吉西他滨(Gemcitabine)。
用于与激动剂抗huCD40抗体组合的合适的抗增殖剂，但不限于，紫杉烷类、紫杉醇(紫杉醇作为TAXOLTM市售)、多西他赛(docetaxel)、圆皮海绵内酯(discodermolide，DDM)、dictyostatin(DCT)、Peloruside A、埃坡霉素、埃坡霉素A、埃坡霉素B、埃坡霉素C、埃坡霉素D、埃坡霉素E、埃坡霉素F、呋喃埃坡霉素D、脱氧埃坡霉素B1，[17]-脱氢脱氧埃坡霉素B、[18]脱氢脱氧埃坡霉素B、C12,13-环丙基-埃坡霉素A、C6-C8桥联埃坡霉素A、反式-9,10-脱氢埃坡霉素D、顺式-9,10-脱氢埃坡霉素D、16-去甲基埃坡霉素B、埃坡霉素B10、discoderomolide，帕土匹龙(patupilone，EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(Discodermolide)、TZT-1027(索利多丁，soblidotin)、ILX-651(盐酸他西多丁)、软海绵素B、艾立布林甲磺酸盐(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin，HTI-286)、E-7974、Cyrptophycins、LY-355703、美登素免疫缀合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊匹尼塞，ispinesib)、SB-743921、MK-0731、STA-5312、刺五加苷、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-高-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、cyclostreptin、isolaulimalide、laulimalide、4-表-7-脱羟基-14,16-二脱甲基-(+)-discodermolides和cryptothilone 1，以及本领域已知的其他微管稳定剂。
在需要与本文所述的激动剂抗huCD40抗体一起或在用本文所述的激动剂抗huCD40抗体治疗之前使异常增殖细胞静止的情况下，也可以向患者施用激素和类固醇(包括合成的类似物)，诸如17α-乙炔雌二醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸甲雄烷酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲泼尼龙、甲基睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌氮芥、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、ZOLADEXTM。当使用本文所述的方法或组合物时，也可以根据需要施用在临床环境中用于调谐肿瘤生长或转移的其他剂，例如抗模拟物。
用于安全有效地施用化学治疗剂的方法是本领域技术人员已知的。另外，它们的施用在标准文献中描述。例如，许多化学治疗剂的施用在Physicians'Desk Reference(PDR),例如,1996年版本(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)(其公开内容通过提述在此并入本文)中描述。
可根据本领域公知的治疗方案施用化学治疗剂和/或放射治疗。对于本领域技术人员会显而易见的是，化学治疗剂和/或放射治疗的施用可以根据所治疗的疾病和化学治疗剂和/或放射治疗对那种疾病的已知作用而变化。而且，根据熟练临床医生的知识，鉴于观察的施用的治疗剂对患者的效果，并且鉴于观察到的疾病对于施用的治疗剂的反应，可以改变治疗方案(例如，剂量和施用时间)。
通过以下实施例进一步示例说明本发明，这些实施例不应解释为进一步的限制。本申请中引用的所有附图和所有参考文献，Genbank序列，专利和公开的专利申请的内容通过提述明确地并入本文。
实施例
实施例1
生成CD40/FcγR人源化小鼠
为了产生能够容易地评价人抗CD40 Fc变体的活性并且能够选择最佳的临床候选物的准确且有效的模型，我们生成了针对CD40和FcγR人源化的独特小鼠模型。首先，生成在小鼠CD40缺陷背景基础上的人源化CD40小鼠。评价人CD40 BAC转基因在这些小鼠的不同免疫细胞群体中的表达模式，发现人CD40在血液B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达，但不在T细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞群体上表达，这与在人细胞和它们的小鼠同源体上发现的模式相似(图1A)。
huCD40转基因在这些小鼠中的功能性通过评价生发中心(GC)(该过程需要CD40信号传导)的形成来验证(Basso et al.(2004)Blood 104,4088-4096)。虽然CD40-/-小鼠失去了形成GC的能力，但是这样的表型在引入huCD40转基因后被恢复(图1B)，通过huCD40与小鼠CD40配体的相互作用介导，其具有类似的与人CD40配体结合的动力学和亲和力(图2)。CD40-/-小鼠在免疫后具有缺陷的抗原特异性IgG应答，其在引入huCD40转基因后恢复(图1C)，证实hCD40转基因在功能上补充了小鼠CD40缺陷。总之，这些数据表明，人源化CD40小鼠概括了人基因的表达模式和功能。为了产生其中可评价针对人CD40的完全人激动性IgG的小鼠模型，将这些CD40人源化小鼠与我们先前描述的人源化FcγR小鼠杂交(由(DiLilloand Ravetch(2015)Cell 161,1035-1045；Smith et al.,2012 PNAS(USA)109,6181-6186)详细表征)，导致表达人CD40和FCGR1A、FCGR2AR131、FCGR2BI232、FCRG3AF158和FCGR3B基因的α链的小鼠品种在同源小鼠基因缺失的同基因背景下在其内源性人调控元件的控制下。
FcγRα空-小鼠具有Fcgr2b、Fcgr3和Fcgr4的FcγRα链缺失，并且与FcγRI-/-小鼠杂交(Barnes et al.,2002 Immunity 16,379-389)。其是在C57BL/6背景下产生的，并且其特征如先前所述(Smith,et al.(2012)PHAS USA 109,6181-6186)。如先前所述(Smith,et al.(2012)PNAS(USA)109,6181-6186)，FcγR人源化小鼠(FcγRα空、hFcγRI+、FcγRIIaR131+、FcγRIIb+、FcγRIIIaF158+和FcγRIIIb+)生成并广泛表征。在C57BL/6遗传背景下通过原核注射线性化的RP11-177B15 BAC DNA(Osoegawa,et al.(2001)Genome Research11,483-496)生成人CD40转基因小鼠，并与CD40敲除(“CD40-/-“)小鼠(杰克逊实验室)交配以获得CD40-/-huCD40+/+小鼠。将CD40-/-huCD40+/+小鼠与FcγR人源化的小鼠交配以获得含有CD40-/-hCD40+Fcgra-/-Fcgr1-/-hFCGRI+hFCGRIIA+hFCGRIIB+hFCGRIIIA+hFCGRIIIB+基因型的人源化CD40和FcγR小鼠(称为“hCD40/FcγR”)。图4D中描述的hCD40/hFcRIIB+/hFcRIIA+和hCD40/hFcRIIB+/hFcRIIA-小鼠是所描述的在用于生成hCD40/FcγR小鼠的交配期间获得的。
实施例2
OVA特异性T细胞应答
在存在或不存在10μg的具有多种Fc之一的抗CD40 IgG(以40μg/只小鼠使用的ChiLob IgGs除外)的情况下，通过i.p.注射2μg的DEC-OVA(mIgG1-D265A)来免疫小鼠(DEC-OVA是如前所述通过(Li和Ravetch(2011)Science 333,1030-1034)产生的)。七天后收集外周血并用FITC-缀合的抗-CD4、APC-缀合的抗-CD8α和PE-缀合的OVA肽SIINFEKL H-2b四聚体(tet-OVA,Beckman Coulter)染色，并在BD LSRForttesa上进行分析。
实施例3
流式细胞术
细胞群由以下标记物定义；DC(人：HLA-DR+BDCA1+CD209+CD3-CD14-CD19-CD59-；小鼠:CD11b+CD11c+MHC II+F4/80-),单细胞(人:CD14+HLA-DR+CD15-；小鼠:CD11b+Ly6C+F4/80-CD11c-),巨噬细胞(人:CD14+CD68+；小鼠:CD11b+F4/80+Ly6C-Ly6G-),:B细胞(人:CD19+；小鼠:B220+),T细胞(人:CD3+CD56-；小鼠:CD3),NK细胞(人:CD16+CD56+CD3-；小鼠:NK1.1),嗜中性粒细胞(人:CD15+CD16+CD49d-；小鼠:CD11b+Ly6G+Ly6CintF4/80)。
实施例4
H1N1免疫
在作为佐剂的明矾的存在下，用重组流感H1N1(Sino Biological Inc.)免疫小鼠。11天后，收集血液并使用标准ELISA方案分析抗流感H1N1特异性IgG。
实施例5
SPR
所有实验均使用Biacore T100表面等离子共振(SPR)系统(Biacore，GEHealthcare)进行，如前所述(Bournazos,et al.,2014,Cell 158,1243-1253)。简言之，在25℃在HBS-EP+缓冲液(10mM HEPES,pH 7.4；150mM NaCl；3.4mM EDTA；0.005％(v/v)表面活性剂P20)中进行实验。为了测量IgG亚类变体对FcγR和CD40的亲和力，通过胺偶联将重组IgG固定在Series S CM5芯片上，并将不同浓度的FcγR或CD40样品的可溶性胞外域注射通过流动小室。对于一些FcγR，以反向重复测量，即固定FcγR并注射可溶性IgG。减去结合至空白固定化流动小室的背景，并使用BIAcore T100评价软件(GE Healthcare)使用1:1Langmuir结合模型计算亲和力常数。
实施例6
基于SPR的竞争测定
在Biacore T100仪器上，使用具有10mM磷酸钠、130mM氯化钠、0.05％Tween 20pH7.1的运行缓冲液，在25℃，在由使用标砖胺偶联化学过程固定在CM5传感器芯片上的hCD40-Fc组成的表面上，进行SPR竞争实验。使用T100对照软件中的“双重注射”功能，通过注射分子1(亲本抗体或CD40L)，随后立即注射相同浓度的分子1或分子1加分子2的混合物，来评估与hCD40L-Fc结合的竞争。将结合反应与单独的分子2的对照注射进行比较。所有实验均使用180s的结合和解离时间以30μl/min进行。使用两个15s脉冲的30μl/min的流速的pH 1.5的10mM甘氨酸，在循环之间成功地再生表面。
实施例7
CD40结合ELISA
通过ELISA使用重组CD40(Sino Biological Inc.)测定IgG亚类的结合特异性和亲和力。将ELISA板(Nunc)在4℃用人CD40的重组胞外域(1μg/孔)包被过夜。所有连续步骤均在室温下进行。洗涤后，用PBS/2％脱脂乳将平板封闭1小时，随后与连续稀释的IgG(在PBS/2％脱脂乳中1:3连续稀释)温育1小时。洗涤后，将板与HRP缀合的抗人IgG(JacksonImmunoResearch)温育1小时。使用双组分过氧化物酶底物试剂盒(KPL)进行检测，并通过加入1M磷酸终止反应。使用SpectraMax Plus分光光度计(Molecular Devices)立即记录405nm处的吸光度，并减去来自阴性对照样品的背景吸光度。
实施例8
抗CD40 Fc变体的生成和产生
合成抗人CD40 Ab克隆21.4.1(美国专利号7,338,660)的可变重链区和可变轻链区(Genwize)并将其克隆到具有人IgG1、人IgG2或人κFFF骨架的哺乳动物表达载体中，如前所述(Li和Ravetch(2011)Science 333,1030-1034)。为了产生人IgG1的Fc结构域变体(N297A、S267E、S267E/L328F、G237D/P238D/P271G/A330R、G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)和人IgG2的Fc结构域变体(C127S、C232S)，基于QuikChange定点诱变试剂盒II(Agilent Technologies)，根据制造商的说明，使用特异性引物进行定点诱变。通过直接测序验证突变的质粒序列(Genewiz)。
通过瞬时转染HEK293T细胞(ATCC)生成抗体，使用Protein G Sepharose 4 FastFlow(GE Healthcare)纯化，在PBS中透析，并无菌过滤(0.22mm)，如前所述(Nimmerjahn,etal.(2005)Immunity 23,41-51)。通过SDS-PAGE和考马斯染色评估纯度，评估纯度为>90％。通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法对用于体内实验的Ab内的内毒素(LPS)污染进行定量，并验证其具有<0.1EU/μg的水平。多克隆人IgG购自Bio X Cell。
实施例9
肿瘤攻毒和治疗
皮下植入MC38细胞(2×106)，用电子卡尺每2-3天测量肿瘤体积，并使用公式(L1 2x L2)/2报告体积，其中L1是最短直径，L2是最长直径。在肿瘤接种后7天，将小鼠通过肿瘤尺寸(第0天)随机分配并接受腹膜内(i.p)注射200μg抗CD40或对照IgG。小鼠在第3天接受另外的200μg的IgG处理。对于B16肺转移模型，给小鼠静脉注射1×106个B16-F10细胞，并在肿瘤细胞注射后第1天和第4天用40μg指定的Ab处理。在第14天收获肺并通过使用解剖显微镜分析表面转移灶的存在。
实施例10
生成人抗CD40-Fc变体临床候选物
为了测试靶向人CD40的人IgG的体内活性是否需要与huFcγRIIB相互作用，并确定是否可以进一步工程改造这样的相互作用以优化亲本抗体的活性，将抗-CD40克隆2141(CP-870,893，最初是IgG2同种型)的可变区克隆到具有不同的结合人FcγR的能力的Fc修饰的Ab中。这些包括野生型人IgG1和对huFcγRIIB的结合亲和力增加的一系列突变的IgG1。ELISA(图1D)和SPR(表3)证实引入2141 Ab的不同Fc结构域不改变它们对人CD40的结合特异性或亲和力。表4总结了通过SPR评估的克隆2141的不同Fc变体对重组huFcγRI、hFcγRIIA、huFcγRIIB和huFcγRIIIA的亲和力。
表3. 21.4.1 Fc变体对人CD40的亲和力
Figure BDA0003772824680000671
通过SPR分析使用固定的IgG和可溶性的CD40获得结合常数。
表4. 21.4.1 Fc变体对人FcγR的亲和力
Figure BDA0003772824680000672
通过SPR分析获得结合常数。
倍数＝KD(IgG1)/KD(Fc变体)
n.d.b，没有可检测的结合；NA，不适用。
SE突变体的KD值和与野生型IgG1相比的倍数变化来自参考文献(smith等和Chu等2008)。
实施例11
FcγR-结合是人抗CD40 mAb的体内活性所必需的
虽然IgG1同种型与所有人FcγR具有相对高的亲和力相互作用，但CP-870,893的IgG2同种型对人FcγR具有非常低的结合亲和力，但FcγRIIAH131除外(图3A和表4)。通过测试它们在人源化CD40/FcγR模型中活化和扩增T细胞的能力，比较了抗CD40的IgG1和IgG2同种型在人FcγR的环境中的体内功效。通过与OVA缀合的嵌合抗DEC205 Ab(“DEC-OVA”(Liand Ravetch(2011)Science 333,1030-1034))与CP-870,893抗CD40单克隆抗体的人IgG1-Fc、IgG2-Fc或N297A Fc-空亚类一起将卵清蛋白(OVA)递送至树突细胞，并在7天后监测循环中OVA特异性T细胞的存在(图3B)。虽然IgG1和IgG2同种型都对T细胞活化具有辅助效应，但与相同抗CD40克隆的IgG2同种型相比，IgG1导致显着更高的T细胞应答。通过引入N297A突变完全逆转IgG1的活性，所述N297A突变阻止与FcγR结合，暗示FcγR-结合是抗CD40IgG1的激动活性所必需的。当被检测为与野生型IgG2相比具有降低的对FcγRIIb的结合亲和力的去糖基化形式时，IgG2的显著活性丧失。这也暗示了抗-CD40 IgG2的FcγR依赖性活性，并且表明与IgG1同种型相比IgG2的相对降低的活性可以通过其对人FcγR的低结合亲和力来解释。与该结论相反，已经提出IgG2亚类的抗CD40抗体的激动活性是FcγR非依赖性的并且是由G12铰链和CH1区之间的改组(shuffled)二硫键介导的IgG2铰链的独特构型的结果(White,et al.(2015)Cancer cell 27,138-148)。为了测试该可能性，突变了CP-870,893的特定半胱氨酸，产生分别由C232S和C127S突变获得的锁定构象形式——经典的Y构象“IgG2-A”和更紧凑的构象“IgG2-B”(Allen et al.,2009,Biochemistry 48,3755-3766)。两种形式的IgG2都产生与野生型IgG2类似的活性，这暗示着铰链区构象不决定该Ab克隆的IgG2同种型在人FcγR的环境中的体内激动活性。此外，比较了小鼠或人FcγR背景下人CD40转基因小鼠中IgG2-A和IgG2-B形式的CP-870,893的体内激动剂活性，发现在小鼠FcγR背景中仅有IgG2-B形式是有活性的，而在人FcγR背景中，两种形式都具有显著且相似的活性。获得的CP-870,893Ab的数据进一步得到观察到ChiLob 7/4的IgG1以及IgG2亚类的2A和2B形式的激动活性的等级相似的支持，ChiLob 7/4是另一种激动人CD40 Ab克隆，其识别不同于2141的表位。据报道ChiLob 7/4的IgG2亚类与其IgG1形式相比，在存在或不存在小鼠FcγR的情况下具有卓越的效力，我们还观察到，对于该克隆，在存在人FcγR的情况下，IgG1亚类优于IgG2，并且两种IgG2构象形式具有相似的活性。如在CP-870,893中观察到的，当在huCD40/mFcγR小鼠中测试时，仅IgG2-B形式是有活性的并且与IgG2-A相比，导致显著增强的活性。
这些数据表明，在人FcγR的生理环境中，激动性的人抗CD40 IgG的体内活性依赖于FcγR-结合而不依赖于它们的铰链构象。重要的是，该数据突出了使用人源化FcγR小鼠模型用于适当研究人IgG活性的优势。通过考虑人IgG与人FcγR的相互作用，这些小鼠避免了在携带小鼠FcγR的模型中使用人IgG所产生的混杂结果。
实施例12
增强FcγRIIB-而非FcγRIIA结合的Fc变体实现的抗CD40人IgG的优化活性
我们接下来确定增加人抗CD40抗体和hFcγRIIB之间的结合相互作用是否会导致体内功效增加。通过诱变其Fc结构域，可以增加人IgG对hFcγRIIB的结合亲和力和选择性。携带点突变S267E(SE)和S267E/L328F(SELF)的CP-870,893的Fc变体(Chu et al.(2008)Molecular Immunology 45,3926-3933)分别导致对hFcγRIIB的结合亲和力增加30倍和70倍(图4A和表4)。当施用至人源化FcγR/CD40小鼠时，与CP-870,893的野生型IgG1和IgG2变体相比，这些Fc变体在体内活化T细胞的能力小但显著增加(图4B)。
由于hFcγRIIA和hFcγRIIB之间的序列和结构相似性，SE和SELF突变还导致对活化hFcγRIIA的结合亲和力增加。因此，尽管它们对抑制性hFcγRIIB的结合亲和力增加，但这些突变的IgG的FcγRIIA/FcγRIIB结合亲和力比率与野生型IgG1相似，因此预测导致该亚类的活性增加受限，如所观察到的(图4B)。为了在不存在FcγRIIA的情况下优化FcγRIIB的Fc-结合，我们使用最近描述的突变，G237D/P238D/P271G/A330R(V9)和G237D/P238D/H268D/P271G/A330R(V11)生成CP-870,893的Fc变体，上述两种突变特异性地增强对hFcγRIIB的结合亲和力但不增强对hFcγRIIA的结合亲和力(Mimoto et al.,(2013)PEDS26,589-598)。V9-CP-870,893和V11-CP-870,893Fc变体导致对hFcγRIIB的结合亲和力增加32和97倍，并且对hFcγRIIAR131的结合亲和力降低约3倍(图4A和表4)。与CP-870,893(IgG2)的IgG2亚类相比，V9和V11 Fc变体均具有显著改善的体内活性，并且其SE-和SELF-Fc变体对于hFcγRIIB和hFcγRIIA均增强。与CP-870,893-IgG2相比，2141-V11变体导致T细胞活化增加25倍，并且与SELF变体获得的活性相比增加5倍(图4B)。当在抗体施用后测定体重变化时，观察到CP-870,893Fc变体的类似等级(图5A)。虽然所有测试的Fc变体在单次注射抗CD40后均导致体重的统计学显著降低，但注射V11-CP-870,893的组具有最显著的降低。
我们分析了这些Fc变体的药代动力学(PK)特性，以测试它们的差异FcγR结合是否导致能够解释其差异激动活性的差异PK清除速度。发现CP-870,893的SELF和V11 Fc变体具有比IgG2亚类更快的清除速度(图4B)，可能是其增强的FcRIIB结合活性的结果。然而，尽管事实上SELF和V11具有更快的清除速度，但与IgG2相比，它们显示出卓越的激动活性。类似地，尽管SELF和V11具有相似的PK特性，但与SELF相比，V11是优异的激动剂。因此排除了这些Fc变体的不同PK特性解释其激动活性的可能性。
通过比较其在转基因人CD40和FcγRIIB(而非FcγRIIA)的小鼠中的活性，或转基因人CD40、FcγRIIB和FcγRIIA的小鼠中的活性，来评价hFcγRIIA-结合对CP-870,893活性的影响(图4D)。在不存在FcγRIIA的情况下，CP-870,893-IgG2的T细胞活化效力显著增强，表明FcγRIIA-结合对该抗CD40mAb的激动活性的负面作用。
本发明证明，为了保持低FcγRIIA/FcγRIIB结合比率的同时增强hFcγRIIB-结合而工程改造CP-890,873，导致人抗-CD40IgG的体内激动活性的优化。
对于不阻断hCD40与CD40L的结合的2141(CP-870,893)mAb，证明了通过选择性增强FcγRIIB结合而增强免疫刺激活性，证明可以通过独立于其结合表位和它们交叉阻断CD40L与CD40结合的能力藉由Fc工程改造来选择性增强FcγRIIB结合而优化激动剂人抗CD40 mAb。
在临床中证实了FcγR相互作用对于最有效力的人CD40mAb的重要性，其中证实了通过Fc工程改造选择性操作FcγR相互作用是如何增强这些药物的效力的。通过使用代表性的体内模型使这些结论成为可能，该模型忠实地概括了人FcγR系统的多样性和细胞类型特异性。
本发明还驳斥了激动性CD40 mAb的表位特异性决定其活性的FcγR-要求(分别为FcγR-非依赖性、依赖性)的概念。CP-870,893、ChiLob 7/4不与CD40L结合竞争，但证明其在体内的最佳活性是FcγR依赖性的。
尽管它们共享相同的靶分子，但在不同的mAb克隆之间可以观察到不同的作用模式。例如，最近观察到拮抗性PD-1mAb具有基于其表位特异性递送FcγRIIB依赖性激动的潜力(Dahan et al.(2015)Cancer cell 28,285-295)。尽管小鼠模型对于评价mAb活性可以是非常有益的，但是不能将小鼠中的mAb活性直接转化为人治疗剂，并且对小鼠mAb观察到的治疗机制在开发同源人IgG时可以改变。通过人源化CD40和FcγR二者，生成了小鼠模型，其通过考虑由其Fab和Fc结构域介导的活性而能够在体内评价临床产物。这些小鼠基于其体内激动效力允许在一组人CD40 mAb中进行“先导”选择。应该使用类似的方法在huFcγR背景下生成针对其他治疗靶标人源化的小鼠，以最佳选择另外的免疫调节性mAb。
虽然改善的激动活性是由FcγRIIA和FcγRIIB结合增强的Fc变体(例如，通过S267E或S267E/L328F Fc突变)介导的，但它们的效力受到它们与活化性FcγRIIA的结合增强的限制。因此，本研究已经指出仅选择性增强与抑制性FcγRIIB结合的Fc变体作为最有效力的CD40 mAb衍生物。携带优先结合活化性FcγR的IgG2a亚类的小鼠CD40mAb缺乏活性与CD40表达细胞的耗尽相关(Li and Ravetch(2011)Science 333,1030-1034)。由于人FcγRIIIA而非FcγRIIA通过mAb介导体内耗尽(DiLillo and Ravetch(2015)Cell 161,1035-1045)，并且S267E或S267E/L328F突变体与FcγRIIA的结合增强但与FcγRIIIA的结合不增强，由FcγRIIA-结合介导的CD40 mAb的效力降低不通过CD40表达细胞的耗尽。通过FcγRIIA解释这种抑制作用的机制是我们正在进行的研究的主题。FcγRIIA第131位的组氨酸(H)/精氨酸(R)多态性决定了其对IgG2的结合亲和力，FcγRIIaH131对IgG2的亲和力是FcγRIIaR131的约5倍(van Sorge et al.(2003)Tissue Antigens 61,189-202)。由于FcγRIIA对CP-870,893活性的抑制作用，携带FcγRIIA131H/H基因型的患者对CP-870,893治疗的反应可能降低。人源化小鼠携带FcγRIIA131R/R基因型，但正在生成FcγRIIA131H/H品种，从而可以阐明FcγRIIA等位基因多态性对抗CD40 mAb活性的贡献。
实施例13
抗CD40 Ab的V11 Fc变体具有优异的抗肿瘤活性
评估了对FcγRIIB增强的突变Fc变体观察到的增加的激动活性是否可以转化为抗CD40 mAb的增加的抗肿瘤活性。用同源的MC38结肠腺癌肿瘤接种人源化CD40/FcγR小鼠，并用2141抗CD40激动性mAb的2141-IgG2、-SELF和-V11 Fc变体处理(图6A)。用IgG2(CP-870,893)和SELF Fc变体处理导致类似的抗肿瘤效果(分别与未处理的对照相比肿瘤体积减少约65％，是无肿瘤小鼠的20％至33％)。然而，用V11 Fc变体处理导致显著改善的抗肿瘤反应和该组中所有小鼠的肿瘤完全康复。使用B16转移性黑素瘤模型观察到类似的趋势，其中仅在用V11处理而不是用SELF或IgG2 Fc变体处理的小鼠中观察到肺转移数量的统计学显著降低(图6B)。这些数据表明，CP-870,893的抗肿瘤活性可以通过抗体的Fc工程改造来增强，以提供选择性增强FcγRIIB-结合，并突出该mAb克隆的V11 Fc变体作为最佳临床候选物。
最近报道了人IgG2同种型的独特铰链构象以FcγR非依赖性方式增强CD40 mAb的激动活性。因此表明，对于CP-870,893观察到的优异的激动活性是由于临床评价中的其他激动性CD40 Ab(ChiLob 7/4和SGN40)的IgG2同种型与IgG1同种型相比。当ChiLob 7/4和SGN40作为IgG2生成时，与它们的其原始IgG1同种型相比，导致增强的效力(White et al.(2015)Cancer cell 27,138-148)。该研究的缺点是仅在小鼠FcγR存在(或不存在)的情况下评价mAb，并未评价其在人FcγR的正确环境中的同种型依赖性效力。在这里，我们证明了使用ChiLob 7/4作为IgG2导致在人FcγR环境中与IgG1相比活性降低。我们进一步评价CP-870893和ChiLob 7/4的IgG1相比IgG2亚类(包括2A和2B形式的IgG2)的活性，发现IgG1比IgG2更有效力并且其活性是FcγR依赖性的。因此，我们得出结论，在小鼠中观察到的抗CD40人IgG2的优异激动活性与其在人类中的临床活性不相关。此外，与其他CD40 mAb相比，CP-870,893的相对高效力不是IgG2同种型的结果，并且可能是mAb识别独特的特异性激动表位的结果。最后，选择性增强FcγRIIb结合是迄今为止增强CD40 mAb激动效力的最有效策略。
表2.序列表总结
Figure BDA0003772824680000721
Figure BDA0003772824680000731
1所有2141(CP-870,893)Fc变体的轻链序列都与SEQ ID NO:2的序列相同。
综上所述，本申请包括但不限于以下各项：
1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其
(i)特异性结合人CD40
(ii)包含具有一个或多个突变的突变Fc区，所述一个或多个突变对应于选自下组的IgG重链中的一个或多个突变：SEQ ID No:3-7，其中所述抗体与CP-870,893或ChiLob、2141竞争结合人CD40。
2.根据项1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有结合FcγRIIb的增强的特异性。
3.根据项2的抗体或其抗原结合部分，其表现出小于5的A/I比。
4.根据项3的抗体或其抗原结合部分，其表现出小于1的A/I比。
5.一种核酸，其编码根据项1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分的重链可变区和/或轻链可变区。
6.一种表达载体，其包含根据项5所述的核酸。
7.一种用根据项6所述的表达载体转化的细胞。
8.一种制备抗人CD40抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：
a)在根据项7所述的细胞中表达所述抗体或其抗原结合部分；和
b)从所述细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
9.一种药物组合物，其包含：
a)根据项1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合部分；和
b)载体。
10.一种刺激有此需要的受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用根据项9所述的药物组合物。
11.根据项10的方法，其中所述受试者具有肿瘤，并且抗所述肿瘤的免疫应答被刺激。
12.根据项10的方法，其中所述受试者具有慢性病毒感染，并且抗所述病毒感染的免疫应答被刺激。
13.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据项9所述的药物组合物。
14.根据项13的方法，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫癌/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关癌症。
15.一种治疗慢性病毒感染的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据项9所述的药物组合物。
SEQ ID NO:1-2141-IgG1重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A T T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TY R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S KA K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S RW Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:2-2141-IgG1轻链
D I Q M T Q S P S S V S A S V G D R V T I T C R A S Q G I Y S W L A WY Q Q K P G K A P N L L I Y T A S T L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L TI S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q A N I F P L T F G G G T K V E I KR T V A A PS V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D NA L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K VY A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C
SEQ ID NO:3-2141-IgG1 N297A重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A T T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y A S TY R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S KAK G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S RW Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:4-2141-IgG1 S267E-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A T T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G AL T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V V D V E H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TY R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S KA K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S RW Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:5-2141-IgG1 S267E/L328F-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A T T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V V D V E H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TY R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A F P A P I E K T I S KA K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S RW Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:6-2141-IgG1-G237D/P238D/P271G/A330R(V9)-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A T T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C P P C P A P E L L G D D S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V V D V S H E D G E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TY R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P R P I E K T I S KAK G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S RW Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:7-2141-IgG1-G237D/P238D/H268D/P271G/A330R(V11)-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A T T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C DK T H T C P P C P A P E L L G D D S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V TC V V V D V S D E D G E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S TY R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P R P I E K T I S KA K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S RW Q Q G N V F S C S V M H E AL H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:8-2141-IgG2-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y AQ K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S N F G T Q T Y T C N V D H K P S N T K V D K T V E R K C C VE C P P C P A P P V A G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V VD V S H E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T F R V VS V L T V V H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P AP I E K T I S K T K G QP R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E WE S N G Q P E N N Y K T T P P M L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q GN V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:9-2141-IgG2 C127S-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P S S R S T S E S T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S N F G T Q T Y T C N V D H K P S N T K V D K T V E R K C C VE C P P C P A P P V A G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V VD V S H E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T F R V VS V L T V V H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P A P I E K T I S K T K G QP R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E WE S N G Q P E N N Y K T T P P M L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q GN V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:10-2141-IgG2 C232S-重链
Q V Q L V Q S G A E V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T G Y Y M HW V R Q A P G Q G L E W M G W I N P D S G G T N Y A Q K F Q G R V T M T R D TS I S T A Y M E L N R L R S D D T A V Y Y C A R D Q P L G Y C T N G V C S Y FD Y W G Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P C S R S T S E S T A A L GC L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S LS S V V T V P S S N F G T Q T Y T C N V D H K P S N T K V D K T V E R K S C VE C P P C P A P P V A G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V VD V S H E D P E V Q F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q F N S T F R V VS V L T V V H Q D W L N G K E Y K C K V S N K G L P A P I E K T I S K T K G QP R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E WE S N G Q P E N N Y K T T P P M L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q GN V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
SEQ ID NO:13信号序列
M V R L P L Q C V L W G C L L T A V H P
序列表提供了成熟重链和轻链的序列(即，序列不包括信号肽)。例如在人细胞中用于产生本发明抗体的信号序列在SEQ ID NO：13中提供。
等同物：
本领域技术人员会认识到或使用不超过常规实验就能够确定本文公开的具体实施方案的许多等同物。这些等同物意图由以上各项涵盖。

Claims (10)

1.一种分离的抗体或其抗原结合部分，其
(i)特异性结合人CD40，并且
(ii)包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:4-6中任一项的重链和具有氨基酸序列SEQ IDNO:2的轻链。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有结合FcγRIIb的增强的特异性。
3.一种核酸，其编码权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
4.一种表达载体，其包含权利要求3所述的核酸。
5.一种用权利要求4所述的表达载体转化的细胞。
6.一种药物组合物，其包含：
a)权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合部分；和
b)载体。
7.权利要求6所述的药物组合物在制备用于刺激受试者中的免疫应答的药物中的用途。
8.权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、子宫癌/宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、头颈癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统瘤、淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。
10.权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗慢性病毒感染的药物中的用途。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017004006A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40
WO2017214452A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Xencor, Inc. Treatment of igg4-related diseases with anti-cd19 antibodies crossbinding to cd32b
US20210179727A1 (en) * 2018-04-20 2021-06-17 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
EP3856790A4 (en) * 2018-09-28 2022-09-28 Lyvgen Biopharma Holdings Limited ANTI-CD40 BINDING MOLECULES WITH MODIFIED CF DOMAINS AND THEIR THERAPEUTIC USES
CN111454362B (zh) * 2019-03-04 2021-03-02 北京天广实生物技术股份有限公司 特异结合cd40的抗体及其用途
JP2023505168A (ja) * 2019-12-03 2023-02-08 エヴォテック・インターナショナル・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング インターフェロン会合抗原結合タンパク質及びこれらの使用
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multi-target antibodies for use in the treatment of diseases
IL272389A (en) 2020-01-30 2021-08-31 Yeda Res & Dev Kits containing antibodies to PD-L1 and their uses in therapy
WO2023010081A1 (en) * 2021-07-28 2023-02-02 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Gene signature predicting tertiary lymphoid structures containing b cells
IL286430A (en) 2021-09-14 2023-04-01 Yeda Res & Dev Multispecific antibodies for use in the treatment of diseases
WO2023064878A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 The Rockefeller University Combination of anti-cd40 antibody and il-15 for treating cancer

Family Cites Families (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US7276585B2 (en) 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
WO2006130834A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF
US20080206246A1 (en) 2006-04-05 2008-08-28 Ravetch Jeffrey V Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
KR101380729B1 (ko) 2007-05-30 2014-04-10 포항공과대학교 산학협력단 면역글로불린 융합 단백질
DE102007036200A1 (de) 2007-08-02 2009-02-05 Knorr-Bremse Systeme für Nutzfahrzeuge GmbH Induktiver Weg- oder Drehwinkelsensor mit zwischen zwei Spulen angeordnetem Abschirmblech
EP2808345A3 (en) 2007-12-05 2015-03-11 Massachusetts Institute of Technology Aglycosylated immunoglobulin mutants
EP4098661A1 (en) 2007-12-26 2022-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
AU2009237662A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
NZ628987A (en) 2009-02-03 2015-11-27 Amunix Operating Inc Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CA2782936C (en) 2009-12-10 2019-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make heavy chain antibodies
LT3095871T (lt) 2010-02-08 2019-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bendros lengvosios grandinės pelė
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
HUE030100T2 (en) 2010-02-19 2017-04-28 Xencor Inc New CTLA4-IG immunoadhesins
EP2558498B1 (en) * 2010-04-13 2016-10-12 Celldex Therapeutics, Inc. Antibodies that bind human cd27 and uses thereof
BR112012033248A2 (pt) 2010-06-22 2017-11-28 Regeneron Pharma camundongos expressando uma cadeia leve com variável de lâmbda humana e regiões constantes de camundongo
AU2011349502B2 (en) 2010-12-20 2016-12-22 The Rockefeller University Modulating agonistic TNFR antibodies
EP2520697B1 (en) 2011-05-06 2014-04-09 Vantex Technologies GmbH Device for stopping a rove supply in a spinning apparatus
JP6322872B2 (ja) 2011-12-19 2018-05-16 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 非シアル化抗炎症ペプチド
UY34887A (es) * 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
CA2884730C (en) 2012-09-13 2023-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
US9676861B2 (en) * 2012-10-30 2017-06-13 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use
JP2016510319A (ja) 2012-12-28 2016-04-07 アッヴィ・インコーポレイテッド 多価結合タンパク質組成物
GB201308658D0 (en) 2013-05-14 2013-06-26 Isis Innovation Antibodies
WO2015070972A1 (en) 2013-11-12 2015-05-21 Atlab Pharma Human igg1 derived antibody with pro-apoptotic activity
US20170233485A1 (en) 2014-08-18 2017-08-17 Biogen Ma Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
JP2018526977A (ja) * 2015-06-29 2018-09-20 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ アゴニスト活性が増強されたｃｄ４０に対する抗体
WO2017004006A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40

Also Published As

Publication number Publication date
US11760805B2 (en) 2023-09-19
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