CN103154034B - 结合人cd27的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了与人CD27结合的分离的单克隆抗体以及相关的基于抗体的组合物和分子。还公开了使用所述抗体的治疗和诊断方法。

Description

结合人CD27的抗体及其用途
发明背景
T细胞和抗原呈递细胞之间的相互作用涉及有利于产生免疫应答的多种辅助分子。一种这样的分子为CD27，其结合CD70并属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族(RanheimEA，等，Blood.1995June15；85(12)：3556-65)。CD27一般以糖基化的I型跨膜蛋白存在，形式通常为具有连接两个单体的二硫桥的同源二聚体。二硫桥处于靠近细胞膜的胞外域中(Camerini等，JImmunol.147：3165-69(1991)。CD27也可以可溶形式表达(参见例如，vanOersMH，等，Blood.1993Dec1；82(11)：3430-6和LoenenWA，等，Eur.J.Immunol.22：447，1992)。在T细胞上交联CD27抗原提供协同刺激信号，其与T细胞受体交联一起可诱导T细胞增殖和细胞免疫活化。
CD27在以下细胞上表达：成熟胸腺细胞、大多数CD4+和CD8+外周血T细胞、自然杀伤细胞和B细胞(KobataT，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995Nov21；92(24)：11249-53)。CD27还在B细胞非霍奇金淋巴瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病中高表达(RanheimEA，等，Blood.1995Jun15；85(12)：3556-65)。另外，已在寄生虫感染、巨细胞病毒(CMV)感染、结节病、多发性硬化和B细胞慢性淋巴细胞白血病中的血清或疾病活动性部位鉴定了可溶性CD27蛋白水平升高(LoenenWA，等，Eur.J.Immunol.22：447，1992)。
最近已表明，激动性抗CD27单克隆抗体可促进T细胞应答，并有望作为抗癌治疗剂(参见例如，SakanishiT，等，BiochemBiophys.Res.Commun.2010Feb18和WO2008/051424)。然而，虽然迄今为止获得的结果将CD27确立为免疫疗法的有用靶标，但仍然未知的是，抗CD27单克隆抗体的哪些具体特征对治疗目的尤为有利。因此，本领域仍然需要深入了解使抗CD27抗体在治疗学上有效的具体功能特性，以及对治疗和/或预防疾病更有效的改进型治疗性抗CD27抗体。
发明概述
本发明特别提供分离的抗CD27抗体，其具有可与有利和期望的治疗效果相关联的特定功能特性。具体地讲，通过本发明已生成和表征了能够上调T细胞介导的免疫应答(例如，通过抗原特异性T细胞应答的诱导或增强而表明)的抗CD27单克隆抗体，其尤其适合与疫苗疗法相结合。在一个实施方案中，激动剂抗CD27抗体通过与活疫苗相结合或通过增强内源性免疫应答可增强对癌症或感染性疾病的免疫应答。此类抗体还可以直接或间接诱导细胞因子表达。另外，已经生成并表征了尤其适合治疗免疫疾病(诸如移植排斥、过敏和自身免疫疾病)的下调T细胞介导的免疫应答的抗CD27抗体。此外，已经生成并表征了对治疗多种涉及细胞增殖的疾病(如，癌症)尤其有效的通过直接细胞杀伤机制(如，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDCC))抑制CD27表达细胞生长的抗CD27抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗CD27抗体表现出以下特性中的一种或多种：
(a)在10μg/ml的抗体浓度下阻断sCD70与CD27的结合达至少约70％；
(b)以10-9M或更小的平衡解离常数Kd，或者作为另外一种选择，以10+9M-1或更大的平衡缔合常数Ka与人CD27结合；
(c)在3μg/ml的抗体浓度和约6％的兔血清补体下诱导至少10％的CD27表达细胞的特异性补体介导的细胞毒性(CDC)；
(d)在3μg/ml的抗体浓度以及75∶1的效应子∶靶细胞比率下诱导至少10％的CD27表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)特异性裂解；
(e)与未施用抗体的小鼠相比，当以0.3mg每周至少两次施用(腹腔注射)3周时，在体内肿瘤细胞接种(5×105个Raji细胞或1×106个Daudi细胞)后的重症综合性免疫缺陷(SCID)小鼠中改善中位生存达至少20％；
(f)与疫苗或内源性抗原相结合诱导或增强抗原特异性免疫应答；
(g)与疫苗或内源性抗原相结合诱导或增强抗原特异性TH1免疫应答；
(h)与疫苗或内源性抗原相结合诱导或增强抗原特异性T细胞增殖或活化；
(i)降低或抑制T细胞增殖或活化；
(j)与同时、单独或顺序的TCR活化相结合时诱导或增强T细胞活性；
(k)在10μg/ml的抗体浓度下阻断sCD70与CD27的结合达至少约70％，并且当不能与Fc受体结合或与Fc受体的结合减少时降低或抑制T细胞活性；
(l)当以3mg/kg(静注)施用时在紧接施用后的29天内导致恒河猴CD3+T细胞(而非NK细胞)低于50％的去除；或
(m)当以3mg/kg(静注)施用时在紧接施用后的29天内导致恒河猴记忆B细胞低于50％的去除。
在一个特定的实施方案中，本发明的抗体表现出这些功能特性的组合。
因此，在一个方面，本发明提供诱导和/或增强免疫应答(如，T细胞介导的免疫应答)的抗CD27抗体。在又一个实施方案中，该抗体抑制细胞上CD70与CD27的结合。具有这些特性组合的特定抗体包括含有下述重链和/或轻链可变区序列的mAb1F5，所述序列分别含有SEQIDNO：37和/或43。作为另外一种选择，该抗体不抑制细胞上CD70与CD27的结合。具有这些特性组合的特定抗体包括含有下述重链和/或轻链可变区序列的mAb3H8，所述序列分别含有SEQIDNO：7和/或13；或者7和/或19。此类抗CD27抗体也可具有与所述抗体不同结合特异性的第二分子(例如，作为双特异性分子)连接，诸如T细胞受体(如CD3、CD25、CD137、CD154_)或Fc受体(如，FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR和FcRn)或NK受体(如CD56)或B细胞受体(如CD19、CD20)。
根据本发明的旨在用于诱导或增强免疫应答的抗体可具有允许与Fc受体结合的功能性Fc结构域，并可包括具有增强的与Fc受体结合水平的突变Fc结构域。
在另一方面，本发明提供这样的抗CD27抗体，其通过抑制表达这些蛋白质的细胞上CD27与CD70的结合而下调T细胞介导的免疫应答。在一个特定的实施方案中，该抗体抑制可溶性CD70(sCD70)与CD27表达细胞的结合达至少约70％。属于此类别的特定抗体包括例如包含下述重链和/或轻链可变区序列的mAb，所述序列含有SEQIDNO：37和/或43(mAb1F5)、SEQIDNO：49和/或55(mAb1H8)或SEQIDNO：103和/或109(mAb3H12)。
在又一方面，本发明提供这样的抗CD27抗体，其诱导或增强效应细胞功能(例如，通过ADCC和/或CDC杀伤细胞)。在一个实施方案中，该抗体在10μg/ml的抗体浓度下通过ADCC诱导CD27表达细胞至少约30％的特异性裂解，和/或在10μg/mll的浓度下诱导CD27表达细胞至少约30％的CDC。属于此类别的表现出ADCC效应子功能的特定抗体包括例如包含下述重链和/或轻链可变区序列的mAb，所述序列含有SEQIDNO：61和/或67(mAb1G5)，SEQIDNO：85和/或91、85和/或97(mAb3A10)，SEQIDNO：37和/或43(mAb1F5)，SEQIDNO：7和/或13、7和/或19(mAb3H8)、SEQIDNO：49和/或55(mAb1H8)或SEQIDNO：103和/或109(mAb3H12)。在又一个实施方案中，该抗体还抑制细胞上CD70与CD27的结合。具有这些功能组合的特定抗体包括例如包含下述重链和/或轻链可变区序列的mAb，所述序列含有SEQIDNO：37和/或43(mAb1F5)，SEQIDNO：49和/或55(mAb1H8)，SEQIDNO：103和/或109(mAb3H12)。作为另外一种选择，该抗体如上所述诱导ADCC和/或CDC，但不抑制细胞上CD70与CD27的结合。具有这些特征的特定抗体包括例如含有下述重链和/或轻链可变区序列的mAb，所述序列含有SEQIDNO：61和/或67(mAb1G5)，SEQIDNO：85和/或91、85和/或97(mAb3A10)，SEQIDNO：7和/或13、7和/或19(mAb3H8)。能够诱导或增强效应细胞功能(如，ADCC和/或CDC)的抗CD27抗体也可被构建为包括Fc区，其适当地贡献特异性Fc受体(如，FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB1(CD32)、FcγRIIB2(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)、FcεRI、FcεRII(CD23)、FcαRI(CD89)、Fcα/μR和FcRn)的结合特异性。
在另一个实施方案中，提供一种在有需要的受试者中增强对抗原免疫应答的方法，方式是向该受试者施用：i)抗CD27抗体和ii)抗原，其中抗CD27抗体单独地且在施用抗原前施用。
通常，在这样的方法中，可在施用抗原前至少2小时和96小时之间施用抗CD27抗体。例如，在这样的方法中，可在施用抗原前至少2小时，例如在施用抗原前至少12小时，适当地在施用抗原前至少24小时，在施用抗原前至少48小时或在施用抗原前至少72小时施用抗CD27抗体。其中，TLR激动剂为TLR3激动剂。
在又一个实施方案中，提供一种在有需要的受试者中增强对抗原免疫应答的方法，方式是同时、单独或顺序地向该受试者施用：i)抗CD27抗体；ii)TLR激动剂；以及iii)任选的抗原。
在这样的方法的一个优选实施方案中，TLR激动剂为TLR3激动剂，例如但不限于PolyIC:LC。
CD27表达细胞包括表达CD27的任何和所有细胞，包括但不限于B细胞、NK细胞和T细胞。在一个特定的实施方案中，CD27表达细胞包括癌细胞系，诸如Jurkat细胞、Raji细胞、Ramos细胞和Daudi细胞。在另一个实施方案中，CD27表达细胞为肿瘤细胞或癌细胞。在另一个实施方案中，CD27表达细胞包括B细胞、NK细胞和T细胞，而T细胞包括存在于浸润性肿瘤中的T细胞，也称为肿瘤浸润性淋巴细胞。
本发明的特定抗体包括利用特定人种系的重链和轻链可变区，即，由种系基因编码，但包括抗体成熟期间发生的基因重排和突变，例如体细胞突变。在一个实施方案中，本发明的抗体的重链可变区衍生自人种系3-7或3-33基因。在另一个实施方案中，抗体的轻链可变区衍生自人种系3-20、3-11、24、1D-16或1-13基因。在一个特定的实施方案中，抗体的重链可变区衍生自人种系VH3-7或VH3-33基因，而抗体的轻链可变区衍生自人种系VK3-20、VK3-11、VK1D-16或VK1-13基因。
如下提供了VH3-33种系序列(Genbank登录号AAP44382)：
1vqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfstygmhwvrqapgkglewvaiiwfdgsntyya
61dsvrgrftisrdssrktlylemkslrvedtavyycak(SEQIDNO：3)
如下提供了VH3-7种系序列(Genbank登录号AAP44389)：
1vqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnsymtwvrqapgkglewvanikpdgsdknyi
61nsvrgrftisrdnaekssylqmnslraedtaiyycvt(SEQIDNO：4)
在另一个实施方案中，重链可变区CDR3序列选自由SEQIDNO：10、28、40、52、64、76、88、106及其保守序列修饰(如，保守氨基酸取代)组成的组。该抗体还可包含轻链可变区CDR3序列，其选自由SEQIDNO：16、22、34、46、58、70、82、94、100、112及其保守序列修饰组成的组。在另一个实施方案中，重链CDR2和CDR1序列分别选自SEQIDNO：9、27、39、51、63、75、87、105和SEQIDNO：8、26、38、50、62、74、86、104，以及它们的保守序列修饰。轻链CDR2和CDR1序列分别选自SEQIDNO：15、21、33、45、57、69、81、93、99、111和SEQIDNO：14、20、32、44、56、68、80、92、98、110，以及它们的保守序列修饰。
在又一个实施方案中，本发明提供分离的抗体，其结合CD27并包含选自由下列组成的组的重链和轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列：
(i)包含SEQIDNO：38的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：39的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：40的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：44的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：45的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：46的轻链可变区CDR3；或
它们的保守序列修饰；
(ii)包含SEQIDNO：50的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：51的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：52的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：56的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：57的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：58的轻链可变区CDR3；或
它们的保守序列修饰；
(iii)包含SEQIDNO：104的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：105的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：106的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：110的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：111的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：112的轻链可变区CDR3；或
它们的保守序列修饰；
(iv)包含SEQIDNO：86的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：87的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：88的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：92或98的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：93或99的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：94或100的轻链可变区CDR3；
或它们的保守序列修饰；
(v)包含SEQIDNO：26的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：27的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：28的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：32的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：33的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：34的轻链可变区CDR3；或
它们的保守序列修饰；
(vi)包含SEQIDNO：74的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：75的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：76的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：80的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：81的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：82的轻链可变区CDR3；或
它们的保守序列修饰；
(vii)包含SEQIDNO：8的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：9的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：10的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：14或20的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：15或21的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：16或22的轻链可变区CDR3；或它们的保守序列修饰；以及
(viii)包含SEQIDNO：62的重链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：63的重链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：64的重链可变区CDR3；
包含SEQIDNO：68的轻链可变区CDR1；
包含SEQIDNO：69的轻链可变区CDR2；
包含SEQIDNO：70的轻链可变区CDR3；或
它们的保守序列修饰。
在另一个实施方案中，重链可变区CDR3序列包含选自以下共有序列的氨基酸序列：R(G，E，D)(S，L，G，-)(G，L，T，W，-)(N，A，T，H，-)(V，T，-)(M，P，-)(G，V，-)(R，-)(G，M，-)(D，H，L，T，W)(A，G，N，W)(D，F，V，Y)(F，L)(D，E)(H，I，L，Y)(SEQIDNO：113)，其中“-”表示在该共有位置可以不存在氨基酸残基。该抗体还可包含轻链可变区CDR3序列，其包含选自以下共有序列的氨基酸序列：Q(F，R，Y)(N，S)(N，T，S)(Y，W)P(F，L，P，R)T(SEQIDNO：114)，其中“-”表示在该共有位置可以不存在氨基酸残基。在另一个实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自以下共有序列的氨基酸序列：I(K，W)(Y，N，Q)DGS(E，N)(K，Q)(SEQIDNO：115)，其中“-”表示在该共有位置可以不存在氨基酸残基；以及轻链可变区CDR2序列包含选自以下共有序列的氨基酸序列：(A，D)AS(SEQIDNO：116)。在另一个实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自以下共有序列的氨基酸序列：GF(T，S)(F，L)(S，N)(I，S，H)(Y，H)(SEQIDNO：117)；以及轻链可变区CDR1序列包含选自以下共有序列的氨基酸序列：Q(D，G，S)(I，V)(D，S)(R，S)(A，W，Y)(SEQIDNO：118)。
在另一个实施方案中，本发明的分离抗体与人CD27结合并包含重链可变区，该重链可变区包含选自由SEQIDNO：6、7、24、25、36、37、48、49、60、61、72、73、84、85、102、103及其保守序列修饰组成的组的氨基酸序列。该抗体还可包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自由SEQIDNO：12、13、18、19、30、31、42、43、54、55、66、67、78、79、90、91、96、97、108、109及其保守序列修饰组成的组的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，本发明的分离抗体与人CD27结合并包含重链可变区和轻链可变区，它们分别包含选自由下列组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQIDNO：37和/或43以及它们的保守序列修饰；
(b)SEQIDNO：49和/或55以及它们的保守序列修饰；
(c)SEQIDNO：103和/或109以及它们的保守序列修饰；
(d)SEQIDNO：85和/或91和/或97以及它们的保守序列修饰；
(e)SEQIDNO：25和/或31以及它们的保守序列修饰；
(f)SEQIDNO：73和/或79以及它们的保守序列修饰；
(g)SEQIDNO：7和/或13和/或19以及它们的保守序列修饰；和
(h)SEQIDNO：61和/或67以及它们的保守序列修饰。
包含与任何上述序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或更高序列同一性的重链和轻链可变区的分离抗体也包括在本发明的范围内。上面列举值的中间范围，例如与任何上述序列具有至少80-85％、85-90％、90-95％或95-100％序列同一性的重链和轻链可变区也旨在包括在本发明的范围内。
本发明还包括与本发明的抗体竞争与CD27结合的分离抗体。在一个特定的实施方案中，该抗体与包含下述重链和/或轻链可变区的抗体竞争与CD27的结合，所述重链和/或轻链可变区分别包含如SEQIDNO：37和43、SEQIDNO：49和55、SEQIDNO：103和109、SEQIDNO：85和91、SEQIDNO：85和97、SEQIDNO：25和31、SEQIDNO：73和79、SEQIDNO：7和13、SEQIDNO：7和19、SEQIDNO：61和67所示的氨基酸序列，或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该抗体与包含下述重链和/或轻链可变区的抗体竞争与CD27的结合，所述重链和/或轻链可变区包含如SEQIDNO：37和43(1F5)、SEQIDNO：49和55(1H8)或SEQIDNO：103和109(3H12)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该抗体与包含下述重链和/或轻链可变区的抗体竞争与CD27的结合，所述重链和/或轻链可变区包含如SEQIDNO：25和31(2C2)、SEQIDNO：7和13(3H8)、SEQIDNO：7和19(3H8)、SEQIDNO：61和67(1G5)或SEQIDNO：73和79(2G9)所示的氨基酸序列。在又一个实施方案中，该抗体与包含下述重链和/或轻链可变区的抗体竞争与CD27的结合，所述重链和/或轻链可变区包含如SEQIDNO：85和91(3A10)或SEQIDNO：85和97(3A10)所示的氨基酸序列。
本发明的其他抗体与由本文所述的抗体识别的CD27上的表位结合。在另一个特定的实施方案中，该抗体与由包含下述重链和/或轻链可变区的抗体识别的CD27上的表位结合，所述重链和/或轻链可变区分别包含如SEQIDNO：37和43、SEQIDNO：49和55、SEQIDNO：103和109、SEQIDNO：85和91、SEQIDNO：85和97、SEQIDNO：25和31、SEQIDNO：73和79、SEQIDNO：7和13、SEQIDNO：7和19、SEQIDNO：61和67所示的氨基酸序列，或与之具有至少80％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该抗体与由包含下述重链和/或轻链可变区的抗体识别的CD27上的表位结合，所述重链和/或轻链可变区包含如SEQIDNO：37和43(1F5)、SEQIDNO：49和55(1H8)或SEQIDNO：103和109(3H12)所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该抗体与由包含下述重链和/或轻链可变区的抗体识别的CD27上的表位结合，所述重链和/或轻链可变区包含如SEQIDNO：25和31(2C2)、SEQIDNO：7和13(3H8)、SEQIDNO：7和19(3H8)、SEQIDNO：61和67(1G5)或SEQIDNO：73和79(2G9)所示的氨基酸序列。在又一个实施方案中，该抗体与由包含下述重链和/或轻链可变区的抗体识别的CD27上的表位结合，所述重链和/或轻链可变区包含如SEQIDNO：85和91(3A10)或SEQIDNO：85和97(3A10)所示的氨基酸序列。
本发明的抗体可以为全长的，例如任何以下同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。作为另外一种选择，该抗体可以是片段，诸如抗原结合部分或单链抗体(如Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段、分离的互补决定区(CDR)或两种或更多种分离的CDR的组合)。该抗体可以是任何种类的抗体，包括但不限于人、人源化和嵌合抗体。
本发明所采用的肿瘤抗原(如，在疫苗中与本发明的抗CD27抗体相结合使用)包括：存在于肿瘤细胞上(或与肿瘤细胞相关)而通常不存在于正常细胞上的任何抗原或抗原决定簇、以高于正常(非肿瘤)细胞上的量存在于肿瘤细胞上或与肿瘤细胞相关的抗原或抗原决定簇、或以与正常(非肿瘤)细胞上存在的不同形式存在于肿瘤细胞上的抗原或抗原决定簇。此类抗原包括肿瘤特异性抗原，包括肿瘤特异性膜抗原、肿瘤相关抗原(包括与肿瘤相关的膜抗原)、肿瘤上的胚胎抗原、生长因子受体、生长因子配体和与癌症相关的任何其他类型的抗原。肿瘤抗原可以为例如上皮癌抗原(例如，乳腺癌、胃肠癌、肺癌)、前列腺特异性癌抗原(PSA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)、膀胱癌抗原、肺癌(例如，小细胞肺癌)抗原、结肠癌抗原、卵巢癌抗原、脑癌抗原、胃癌抗原、肾细胞癌抗原、胰腺癌抗原、肝癌抗原、食道癌抗原、头颈癌抗原或结直肠癌抗原。例如，该抗原可以包括肿瘤抗原，诸如βhCG、gp100或Pmel17、CEA、gp100、TRP-2、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2、MUC-1、MAGE-A3和高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)MART1、melan-A、EGFRvIII、NY-ESO-1、MAGE-1、MAGE-3、WT1、Her2或间皮素。本发明所采用的其他抗原(如，在疫苗中与本发明的抗CD27抗体相结合使用)包括来自感染性疾病病原体(诸如病毒、细菌、寄生虫和真菌)的抗原，其实例在本文中有所公开。
本发明还提供双特异性分子，其包含本发明的抗体，而该抗体与具有与所述抗体不同的结合特异性的第二功能性部分连接。例如，在一个实施方案中，该第二分子可与T细胞受体(例如，CD3、CD40)结合。
还提供了组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的抗体或双特异性分子。该组合物还可包含佐剂、免疫刺激剂(如，CD40配体、FLT3配体、细胞因子、集落刺激因子、抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗41BB抗体、抗OX-40抗体、LPS(内毒素)、ssRNA、dsRNA、卡介苗(BCG)、盐酸左旋咪唑、静脉内免疫球蛋白和Toll样受体(TLR)激动剂(如，TLR3激动剂(诸如PolyIC)、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂)、免疫抑制剂、另一种抗体或抗原。示例性的抗原包括但不限于病原体组分、肿瘤抗原(如，βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2抗原、MUC-1抗原和生殖细胞源性肿瘤抗原)、感染性疾病抗原(如病毒抗原、细菌和寄生虫抗原)、过敏原或自身抗原。本文所公开的任何抗原都可包含在本发明的组合物中。
本发明也包括编码本发明抗体的核酸分子，以及包含此类核酸的表达载体和包含此类表达载体的宿主细胞。例如，在一个实施方案中，本发明提供结合人CD27的分离的单克隆抗体，其中该抗体包含通过下述核酸序列编码的重链可变区和轻链可变区，所述核酸序列分别选自由下列组成的组：(a)SEQIDNO：5和11；(b)SEQIDNO：5和17；(c)SEQIDNO：23和29；(d)SEQIDNO：35和41；(e)SEQIDNO：47和53；(f)SEQIDNO：59和65；(g)SEQIDNO：71和77；(h)SEQIDNO：83和89；(i)SEQIDNO：83和95；(j)SEQIDNO：101和107，或者与(a)-(h)的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供在受试者中诱导或增强对抗原的免疫应答(如，T细胞介导的免疫应答和/或NK-介导的应答和/或B细胞介导的免疫应答)的方法，方式是向该受试者施用有效量的本文所述的抗体(如，全长抗体)、组合物或双特异性分子。此类方法尤其适用于疫苗疗法。
本发明的抗体和其他组合物还可用于抑制CD27表达细胞的生长，方式是使该细胞与有效量的抗体或组合物接触从而抑制CD27表达细胞的生长(如，在癌症治疗中)。可用于抑制CD27表达细胞生长的抗体包括全长抗体及其片段，以及包含对Fc受体的第二结合特异性的抗体。在一个实施方案中，使CD27表达细胞在足以诱导靶细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的条件下在存在效应细胞时与抗体接触(例如，该抗体在10μg/ml的浓度下诱导CD27表达细胞的至少约40％的特异性裂解，并包含SEQIDNO：61、67、85、91、97、37和/或43)。在另一个实施方案中，使细胞在足以诱导细胞的补体介导的细胞毒性(CDC)的条件下与抗体接触(例如，该抗体在10μg/ml的浓度下诱导CD27表达细胞至少约40％的补体介导的细胞毒性(CDC)，并包含SEQIDNO：7、13、19、49、55、103和/或109)。
在又一个实施方案中，用来抑制CD27表达细胞的生长的抗体还可具有(或没有)另外的功能特征。例如，该抗体还可抑制表达这些蛋白质的细胞上CD70与CD27的结合(例如，包含下述重链和/或轻链可变区序列的mAb，这些序列包含SEQIDNO：37和/或43(mAb1F5)、SEQIDNO：49和/或55(mAb1H8)或SEQIDNO：103和/或109(mAb3H12))。作为另外一种选择，该抗体可以不抑制此类细胞上CD70与CD27的结合(例如，包含下述重链和/或轻链可变区序列的mAb，这些序列包含SEQIDNO：61和/或67(mAb1G5)，SEQIDNO：85和/或91、85和/或97(mAb3A10)或SEQIDNO：7和/或13、7和/或19(mAb3H8))。
CD27表达细胞包括表达CD27的任何和所有细胞，包括但不限于NK细胞、B细胞和T细胞。在一个特定的实施方案中，CD27表达细胞包括细胞系，诸如Jurkat细胞、Raji细胞、Ramos细胞和Daudi细胞。在另一个实施方案中，CD27表达细胞为肿瘤细胞或癌细胞。在另一个实施方案中，CD27表达细胞包括B细胞、NK细胞、存在于浸润性肿瘤或癌细胞中的T细胞(也称为肿瘤浸润性淋巴细胞)。
本文所述的抑制CD27表达细胞生长的方法可用于治疗和预防多种疾病和病症。例如，在一个实施方案中，该方法可用于治疗或预防癌症(例如，选自由下列组成的组的癌症：白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成髓细胞早幼粒细胞髓单核细胞红白血病(myeloblastspromyelocytemyelomonocyticmonocyticerythroleukemia)、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’slymphoma)、边缘区B细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症淋巴瘤(PolycythemiaveraLymphoma)、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病、实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing’stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食道癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈部癌、胃癌、上皮内瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、黑素瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(如唇、舌、口及咽部)、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌；呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌)。优选的癌症包括表达CD27的肿瘤，其选自由下列组成的组：慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤。在另一个实施方案中，该方法可用于治疗或预防细菌、真菌、病毒或寄生虫感染。
本发明还提供在患病受试者中抑制细胞上CD70与CD27的结合的方法，方式是向该受试者施用如本文所述的抗体或组合物，以及提供在患病个体中下调T细胞应答的方法，方式是向该受试者施用如本文所述的抗体或组合物。这些方法非常适用于治疗免疫疾病，诸如移植排斥、自身免疫疾病和过敏。可用于这些方法的抗体包括Fab片段以及突变Fc区，使得该抗体不结合Fc受体或与之的结合明显降低。在一个特定实施方案中，该抗体包含下述重链和/或轻链可变区序列，所述序列包含SEQIDNO：37和/或43(mAb1F5)、SEQIDNO：49和/或55(mAb1H8)或SEQIDNO：103和/或109(mAb3H12)。
本文所述的抑制细胞上CD70与CD27的结合以及下调T细胞应答的方法可用于治疗多种疾病和紊乱，包括但不限于移植排斥、过敏和自身免疫疾病。在一个特定实施方案中，该疾病为自身免疫疾病(如，多发性硬化、类风湿关节炎、1型糖尿病、牛皮癣、克隆氏病和其他炎性肠病如溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本氏甲状腺炎、肺出血性肾炎综合征(Goodpasture’ssyndrome)、天疱疮、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、带抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多肌炎、恶性贫血、特发性阿狄森病、自身免疫性相关性不育、肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎、大疱性类天疱疮、干燥综合征、银屑病性关节炎、胰岛素抗性、自身免疫性糖尿病、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、格林-巴利综合征、动脉硬化和阿尔茨海默氏病)。
本发明还提供本文所述的抗体、组合物和双特异性分子的特定用途。例如，在一个实施方案中，本发明提供抗体、组合物或双特异性分子在用于诱导或增强受试者中对抗原免疫应答的药剂制造中的用途。在另外的实施方案中，本发明提供抗体或组合物在用于抑制CD27表达细胞的生长的药剂制造中的用途，抗体或组合物在用于抑制患病受试者中细胞上CD70与CD27结合的药剂制造中的用途，以及抗体或组合物在用于下调患病个体中T细胞应答的药剂制造中的用途。本发明还包括用于诱导或增强受试者中对抗原的免疫应答的抗体、组合物或双特异性分子，用于抑制CD27表达细胞的生长的抗体或组合物，用于抑制患病受试者中细胞上CD70与CD27结合的抗体或组合物，以及用于下调患病个体中T细胞应答的抗体或组合物。
本发明还提供用于检测生物样本中CD27存在与否的方法，方式是(1)使生物样本与本文所述的抗体接触(其中将该抗体用可检测的物质标记)，以及(2)检测与CD27的抗体结合。
试剂盒也落在本发明的范围内，其包含本发明的组合物(例如，抗体和/或双特异性分子)和任选的使用说明。该试剂盒还可包含至少一种另外的试剂，诸如细胞因子或补体，或本发明的一种或多种另外的抗体。
本发明的其他特征和优点将通过以下发明详述和权利要求而显而易见。
附图简述
图1显示了mAb1G5、1H8、3H12、3H8、2G9、1F5、3A10、2C2、ms1A4、ms9F4和msM-T271的亲和力和动力学参数，其通过BiacoreTMBiaEvaluation软件(BiacoreAB)用固定在芯片上的重组人CD27测定。
图2为示出使用ELISA确定的人抗CD27抗体(2C2、3H8、1F5、1G5、1H8、2G9、3A10和3H12)与重组纯化人CD27的结合的图。
图3为示出通过ELISA确定的1F5与纯化重组人或猴(恒河猴)CD27的结合的图。
图4为显示通过ELISA确定的人抗CD27抗体(2C2、3H8、1F5、1G5、1H8、2G9、3A10和3H12)和MsIgG(1A4、9F4和M-T271)对可溶性CD70(sCD70)与CD27蛋白结合的影响(示为％阻断)。
图5是对与人淋巴母细胞系结合的1F5以及对sCD70结合的阻断的流式细胞分析。
图6A-D为示出通过流式细胞术评估的Jurkat细胞(图4A)、Raji细胞(图4B)、Ramos细胞(图4C)和Daudi细胞(图4D)上人抗CD27抗体(2C2、3H8和1F5)与CD27的结合的图。
图7为示出通过流式细胞术评估的Daudi细胞上人抗CD27抗体(2C2、3H8、1F5、1G5、1H8、2G9、3A10和3H12)与CD27的结合的图。
3H8、1F5、1G5、1H8、2G9、3A10和3H12)与CD27的结合的图。
图8为示出抗CD27交叉阻断ELISA实验的结果的柱状图，表明抗体1F5、1H8和3H12能够彼此交叉阻断并因而与相同的表位结合。
图9为示出抗CD27交叉阻断ELISA实验的结果柱状图，表明抗体2C2、3H8、1G5和2G9能够彼此交叉阻断并因而与相同的表位结合。
图10为示出抗CD27交叉阻断ELISA实验的结果的柱状图，，表明抗体3A10与CD27的结合未完全被测试的任何其他抗CD27抗体交叉阻断，因而表明3A10结合独特的表位，但3A10结合被抗体1F5、1H8和3H12部分交叉阻断，表明3A10的表位可能接近抗体1F5、1H8和3H12所结合的表位。
图11为示出使用mAb1F5、2C2、3H8、1G5、1H8、2G9、3A10和3H12的补体依赖性细胞毒性(CDCC)测定的结果的图。
图12为示出使用mAb1F5的又一补体依赖性细胞毒性(CDCC)测定的结果的图。
图13为示出使用mAb2C2、1F5、3H8、1G5、1H8、2G9、3A10、3H12、Rituxan和HuIgG的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的结果的图。
图14为示出使用mAb1F5的又一抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定的结果的图。
图15为人抗CD27抗体(1F5(SEQIDNO：36)、1G5(SEQIDNO：60)、1H8(SEQIDNO：48)、2C2(SEQIDNO：24)、2G9(SEQIDNO：72)、3A10(SEQIDNO：84)、3H12(SEQIDNO：102)和3H8(SEQIDNO：6))的VH序列的比对。
图16为人抗CD27抗体(1F5(SEQIDNO：42)、1G5(SEQIDNO：66)、1H8(SEQIDNO：54)、2C2(SEQIDNO：78)、2G9(SEQIDNO：30)、3A10(SEQIDNO：120)、3H12(SEQIDNO：108)和3H8(SEQIDNO：12))的VL序列的比对。
图17和18示出了使用mAb1F5的体内非人灵长类研究的结果。具体地讲，图17示出了单剂量后循环淋巴细胞上的1F5。图18示出了1F5未明显去除循环淋巴细胞。
图19显示了小鼠外周血细胞和脾细胞上的五聚体染色测定的结果。
图20显示了使用抗CD27抗体的ELISPOT测定的结果以及增强的IFNγ产生。
图21示出了通过五聚体染色和IFNELISPOT测定的转基因小鼠模型中通过抗CD27mAb增强了T细胞对疫苗抗原的应答。
图22A-C是实验的方案和结果，示出了抗CD27增强T细胞对APC靶向疫苗(α-DEC205-OVA)的应答。图22A示出了实验的方案。图22B示出了四聚体染色实验测量抗原特异性T细胞的结果。图22C示出了IFN-γELISPOT测定测量抗原特异性T细胞的结果。
图23A-D是实验结果，示出了与TLR3激动剂PolyIC(25μg、50μg或100μg)相结合的抗CD27增强T细胞对APC靶向疫苗(α-DEC205-OVA)的应答。图23A是示出用polyIC和抗CD27mAb1F5处理的野生型小鼠、用polyIC和对照人IgG1抗体处理的huCD27转基因小鼠或用polyIC和抗CD27mAb1F5处理的huCD27转基因小鼠的CD8+T细胞中IFN-γ阳性细胞的％的图。
图24和25显示了在存在或不存在T:LR激动剂的情况下在施用疫苗前施用抗CD27mAb的研究的结果，以及显示了相对于疫苗而施用抗体的时间安排的重要性。
图26和27显示了与得自人CD27转基因小鼠的TCR活化离子T细胞相结合施用抗CD27mAb的结果，如增殖和细胞因子的产生所示。
图28A-D是实验的方案和结果，示出了抗CD27增强MO4(B16-OVA)黑素瘤激发模型中α-DEC205-OVA疫苗的疗效。图24A示出了实验的方案。图24B为绘出在未处理的小鼠中相对于肿瘤接种后的天数的肿瘤大小(以mm2表示)的图。图24C为绘出在仅用疫苗处理的小鼠中相对于肿瘤接种后的天数的肿瘤大小(以mm2表示)的图。图24D为绘出在结合抗CD27抗体用疫苗处理的小鼠中相对于肿瘤接种后的天数的肿瘤大小(以mm2表示)的图。
图29A和B为示出在用同系淋巴瘤(syngeneiclymphoma)激发并施用各种剂量的抗CD27mAb1F5后人CD27转基因小鼠(肿瘤模型)的生存期延长的图。
图30至32显示了在SCID小鼠Raji异种移植模型中测试抗CD27处理效果的实验的结果。
图30A绘出了在未处理的小鼠中、用对照人IgG1抗体处理的小鼠中或用抗CD271F5和3H8抗体处理的小鼠中相对于肿瘤接种后的天数的肿瘤大小(以mm3表示)。箭头指示通过腹腔注射给予抗体治疗的天数。
图30B以Kaplan-Meier曲线图示出了生存期。
图31A绘出了在未处理的小鼠中、用对照人IgG1抗体处理的小鼠中或用抗CD271F5抗体处理的小鼠中相对于肿瘤接种后的天数的肿瘤大小(以mm3表示)。箭头指示通过腹腔注射给予抗体治疗的天数。图31B图以Kaplan-Meier曲线图示出了生存期。
图32以Kaplan-Meier曲线图示出了在SCID小鼠Raji异种移植模型中测试抗CD27处理效果的又一实验的结果。
图33示出了在SCID小鼠Daudi异种移植模型中测试抗CD27处理效果的实验的结果。图33A绘出了在用对照人IgG1抗体处理的小鼠中或用抗CD271F5抗体(0.1mg或0.3mg)处理的小鼠中相对于肿瘤接种后的天数的肿瘤大小(以mm3表示)。箭头指示通过腹腔注射给予抗体治疗的天数。图33B以Kaplan-Meier曲线图示出了生存期。
图34示出了ELISPOT测定的结果，以及当IgG的Fc部分不能接合Fc受体时使用抗CD27抗体不会增强抗原特异性IFNg的产生。
发明详述
本发明提供抗CD27抗体，其表现出与显著的治疗有益效果相关的特定功能特性，包括上调免疫功能(例如，疫苗疗法中T细胞介导的免疫应答、癌症治疗中的NK活化)、抑制细胞生长(例如，在癌症治疗中)以及下调T细胞介导的免疫应答(例如，在自身免疫疗法中)。这些功能特征包括例如：(1)抑制(例如，完全或部分阻断)可溶性CD70与CD27表达细胞的结合达至少约70％，又如至少80％或至少90％；(2)以1×10-9M或更小的KD与人CD27结合；(3)以10μg/ml的浓度诱导CD27表达细胞至少约40％的补体介导的细胞毒性(CDC)；(4)在10μg/ml的浓度下诱导CD27表达细胞的至少约40％的ADCC特异性裂解(又如至少约50％、至少约60％或至少约70％的特异性裂解)；(5)诱导或增强免疫应答，尤其是TH1应答；和/或(6)诱导或增强T细胞活性，尤其是特异性CD8+T细胞数和/或活性。在其他实施方案中，该抗体包含特定的重链和轻链可变区和/或CDR序列。
为了更易理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义在整个发明详述中示出。
术语“CD27”(也称为“CD27分子”、“CD27L受体”、“S1521”、“T细胞活化抗原CD27”、“TNFRSF7”、“MGC20393”、“肿瘤坏死因子受体超家族，成员7”、“T细胞活化抗原S152”、“Tp55”、“肿瘤坏死因子受体超家族成员7”、“CD27抗原”和“T细胞活化抗原CD27”)是指为TNF受体超家族成员的受体，其与配体CD70结合。CD27为产生和长期维持T细胞免疫所必需，并在调节B细胞活化和免疫球蛋白合成中发挥着关键作用。术语“CD27”包括由细胞天然表达的CD27(例如，以登录号AAH12160.1登记于的人CD27)的任何变体或同种型。因此，本发明的抗体可与得自非人物种的CD27交叉反应。作为另外一种选择，该抗体可以是人CD27特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。CD27或其任何变体和同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域熟知的技术和/或本文所述的那些技术通过重组法产生。优选地，使该抗体靶向具有正常糖基化模式的hCD27。
(登录号AAH12160.1)报告了人CD27的氨基酸序列，具体如下(SEQIDNO：1)：
1marphpwwlcvlgtlvglsatpapkscperhywaqgklccqmcepgtflvkdcdqhrkaa
61qcdpcipgvsfspdhhtrphcescrh|cnsgllvrnctitanaecacrngwqcrdkectec
121dplpnpsltarssqalsphpqpthlpyvsemleartaghmqtladfrqlpartlsthwpp
181qrslcssdfirilvifsgmflvftlagalflhqrrkyrsnkgespvepaepcryscpree
241egstipiqedyrkpepacsp
术语“CD70”(也称为“CD70分子”、“CD27L”、“CD27LG”、“TNFSF7”、“肿瘤坏死因子(配体)超家族成员7”、“CD27配体”、“CD70抗原”、“表面抗原CD70”、“肿瘤坏死因子配体超家族，成员7”、“Ki-24抗原”和“CD27-L”)是指CD27的配体(参见，例如BowmanMR等，J.Immunol.1994Feb15；152(4)：1756-61)。CD70是属于肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的II型跨膜蛋白。其为活化的T和B淋巴细胞上的表面抗原，其诱导共刺激T细胞的增殖、增强溶细胞性T细胞的产生并有助于T细胞活化。还已表明，CD70在调节B细胞活化、自然杀伤细胞的细胞毒性功能以及免疫球蛋白合成中发挥着作用(HintzenRQ等，J.Immunol.1994Feb15；152(4)：1762-73)。
(登录号NP_001243)报告了人CD70的氨基酸序列，具体如下(SEQIDNO：2)：
1mpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvael
61qlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicsstta
121srhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrn
181tdetffgvqwvrp
本文所提及的术语“抗体”包括整个抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”在一个优选的实施方案中是指包含通过二硫键互相连在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步划分为与更保守区(称为骨架区(FR))穿插的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(如，效应细胞)和典型补体系统的第一组分(Clq)。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留特异性与抗原(如，人CD27)结合的能力的抗体的一个或多个片段。此类“片段”的长度例如介于约8和约1500个氨基酸之间，适当地介于约8和约745个氨基酸之间，适当地为约8至约300个氨基酸，例如约8至约200个氨基酸，或约10至约50或100个氨基酸。已表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”中所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其为包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地由合成接头接合的两个或更多个分离CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可通过合成接头使用重组方法而接合，所述合成接头使得它们能够制备成单条蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。此类单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原结合部分”的范围内。这些抗体片段可采用本领域技术人员已知的常规技术获得，且可采用与完整抗体一样的方式筛选这些片段的效用。抗原结合部分可通过重组DNA技术、或通过完整免疫球蛋白的酶法或化学裂解而产生。
“双特异性”或“双功能性抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如Songsivilai&Lachmann，Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性并具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和任选的恒定区的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体由包括从转基因非人动物如转基因小鼠获得的B细胞与无限增殖化细胞融合的杂交瘤产生，所述转基因动物具有包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(如，小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，所述可变区和恒定区利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但是包括随后例如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。如本领域所已知(参见，例如Lonberg(2005)NatureBiotech.23(9)：1117-1125)，可变区含有抗原结合域，该抗原结合域由重排的各种基因编码，以形成对外源抗原具有特异性的抗体。除了重排之外，该可变区还可由多个单氨基酸改变而修饰(称为体细胞突变或高变)，以增强抗体与外源性抗原的亲和力。恒定区在对抗原的进一步应答方面发生改变(即，同种型转换)。因此，编码响应于抗原的轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排和体细胞突变的核酸分子可不具有与原核酸分子的序列同一性，而是基本相同或相似(即，具有至少80％的同一性)。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在的话)的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)(参见，Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474)：856-859)；Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113：49-101；Lonberg，N.andHuszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93以及Harding，F.andLonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764：536-546)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即，人源化抗体)。
如本文所用的“异源抗体”的定义关系到产生这种抗体的转基因非人生物体。该术语是指这样的抗体，其具有的氨基酸序列或编码核酸序列与在转基因非人动物以外的生物体中存在的序列相对应，而且通常所述序列来自转基因非人动物物种以外的物种。
如本文所用的“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性与人CD27结合的分离的抗体基本上不含与除人CD27以外的抗原特异性结合的抗体)。然而，特异性与一个表位结合的分离的抗体与来自不同物种的其他CD27蛋白可具有交叉反应性。但是，该抗体优选地总是与人CD27结合。此外，分离的抗体通常基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，将具有不同CD27特异性的“分离的”抗体的组合在良好确定的组合物中加以组合。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法(即，表位作图)在本领域中是熟知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀检测分析，其中对CD27的重叠或邻接肽测试与给定抗CD27抗体的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如，x-射线晶体分析法和二维核磁共振(参见，例如EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology，第66卷，G.E.Morris，编著(1996))。
另外，本发明还包括与CD27上的表位结合的抗体，该表位包括由本文所述的特定抗体识别的表位的全部或一部分(例如，相同的或重叠的区域，或区域之间或跨区域的区域)。
本发明也包括结合相同表位的抗体和/或与本文所述的抗体竞争结合人CD27的抗体。识别相同表位或竞争结合的抗体可以使用常规技术来鉴定。此类技术包括，例如，免疫测定，其显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原结合的能力，即竞争结合测定。在这样的试验中测定竞争结合，其中免疫球蛋白在测试条件下抑制参考抗体与共同抗原如CD27的特异性结合。许多类型的竞争结合检测分析法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(ETA)、夹心竞争测定(参见Stahli等，MethodsinEnzymology9：242(1983))、固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137：3614(1986))、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress(1988))、使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，Mol.Immunol.25(1)：7(1988))、固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology176：546(1990))和直接标记的RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。通常，这样的试验法涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或带有其中任一种的细胞、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白。竞争性抑制通过在测试免疫球蛋白的存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更高。
其他技术包括，例如，表位作图法，诸如抗原：抗体复合物晶体的x-射线分析，其提供对表位的原子解析。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变异的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。此外，也可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和性分离特异性短肽的能力。然后这些肽被视为用于定义对应于用来筛选肽文库的抗体的表位的线索(lead)。对于表位作图，已经开发了表明可对构象不连续表位进行作图的计算算法。
如本文所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人CD27作为分析物并使用抗体作为配体，在BIACORE2000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10-7M，诸如大约低于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如，BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中可以与术语“特异性与抗原结合的抗体”互换使用。
如本文所用的术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，当使用重组人CD27作为分析物并使用抗体作为配体，在BIACORE2000仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，本发明的人抗体以大约10-8M或更低，诸如低于10-9M或10-10M或甚至更小的解离平衡常数(KD)与CD27结合。
如本文所用的术语“kd”意指抗体从抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。
如本文所用的术语“ka”意指抗体与抗原缔合的结合速率常数。
如本文所用的术语“EC50”是指抗体或其抗原结合部分的浓度，该浓度在体外或体内测定中诱导为最大应答50％的应答，即，最大应答与基线之间的中间部分。
如本文所用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如，IgM或IgG1)。在一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体是IgG1同种型的抗体。在另一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体是IgG2同种型的抗体。
术语“与固定的CD27结合”是指本发明的人抗体与例如在细胞表面上表达或连接于固体支持物上的CD27结合的能力。
如本文所用的术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的CD27结合的能力。例如，结合人CD27的本发明的抗体也可以结合另一物种的CD27。如本文所用，交叉反应性是通过在结合测定(例如，SPR、ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达CD27的细胞的结合或与生理表达CD27的功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如，通过使用BiacoreTM2000SPR仪器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
如本文所用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变成另一种其他Ig类别的现象。
如本文所用的“非转换同种型”是指没有发生同种型转换时产生的重链的同种型类别；编码非转换同种型的CH基因通常是紧接在功能性重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换分为典型或非典型同种型转换。典型同种型转换通过重组事件进行，所述重组事件涉及转基因中的至少一个转换序列区。非典型同种型转换可通过例如人σμ和人∑μ(δ相关性缺失)之间的同源重组进行。另外的非典型转换机制，尤其如转基因间和/或染色体间重组，可以发生并实现同种型转换。
如本文所用的术语“转换序列”是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列，通常为μ转换区，将位于转换重组过程中待缺失的构建体区的5′(即，上游)。“转换受体”区将在待缺失的构建体区与置换恒定区(如，γ、ε等)之间。由于没有其中经常发生重组的特异性位点，最终基因序列将通常不能从构建体预测到。
如本文所用的“糖基化模式”定义为共价连接到蛋白质、更具体而言连接到免疫球蛋白的碳水化合物单位的模式。异源抗体的糖基化模式可被表征为与在非人转基因动物物种产生的抗体上天然存在的糖基化模式基本上类似，同时本领域一般技术人员会认识到，异源抗体的糖基化模式与衍生转基因的CH基因的物种的糖基化模式相比，更类似于非人转基因动物物种中的所述糖基化模式。
如本文所用的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如，存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
如本文所用的术语“重排的”是指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V片段以基本上分别编码完整VH或VL结构域的构象直接邻近D-J或J片段。重排的免疫球蛋白基因座可通过与种系DNA比较来鉴定；重排的基因座将具有至少一种重组的七聚体/九聚体同源性成分。
如本文所用的涉及V片段的术语“非重排的”或“种系构型”是指这样的构型，其中V片段没有重组而直接邻近D或J片段。
如本文所用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选地为双链DNA。
如本文所用的涉及编码结合CD27的抗体或抗体部分(如，VH、VL、CDR3的核酸的术语“分离的核酸分子”意指这样的核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含其他核苷酸序列，所述其他核苷酸序列编码结合除CD27外的抗原的抗体或抗体部分，且其他序列可天然位于人基因组DNA中核酸的侧翼。例如，SEQIDNO：35和41、47和53、101和107、83和89、83和95、23和29、71和77分别对应于包含抗CD27抗体单克隆抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸序列。
本发明也包括SEQIDNO：5-112所示序列的“保守序列修饰”，即，不消除由该核苷酸序列编码的或含有该氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。此类保守修饰包括保守的核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向SEQIDNO：5-112中引入修饰。保守氨基酸取代包括将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，预测的人抗CD27抗体中的非必需氨基酸残基优选地被替换为来自相同侧链家族的另一氨基酸残基。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是熟知的(参见，例如Brummell等，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等ProteinEng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：412-417(1997))。
作为另外一种选择，在另一个实施方案中，可以沿抗CD27抗体编码序列的全部或部分随机引入突变，诸如通过饱和诱变引入，并且得到的修饰的抗CD27抗体可以筛选结合活性。
对于核酸，术语“基本同源性”表示两种核酸或其指定序列当以最佳方式进行比对和比较时，虽有适当的核苷酸插入或缺失，但至少有约80％的核苷酸是相同的，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸是相同的。作为另外一种选择，当片段在选择性杂交条件下与该链的互补体杂交时，也存在基本同源性。
两个序列之间的百分比同一性是它们共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/总位置数目×100)，其中考虑了为达到两个序列的最佳比对而需要引入的缺口的数目及各缺口的长度。两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可用数学算法实现，这在以下非限制性实例中有所描述。
两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法来确定，其使用PAM120权重残差表，空位长度罚分为12，且空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，以及1、2、3、4、5或6的长度权重。
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来对公共数据库进行检索，例如用来鉴定相关序列。此类检索可以用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳的标准技术和本领域熟知的其他方法与其他细胞组分或其他掺杂物(例如，其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见F.Ausubel，等，编著CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)。
本发明的核酸组合物，虽然经常为cDNA、基因组或其混合物的天然序列(修饰的限制位点等除外)，但可按照标准技术进行突变，以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可按需影响氨基酸序列。尤其是，设想了基本上同源于或来源于本文所述的天然V、D、J、恒定区、转换区和其他此类序列的DNA序列(其中“来源于”表示某序列与另一序列相同或从后者修饰得到)。
当使一核酸与另一核酸序列处于功能性关系时，所述核酸即是“可操作连接”的。例如，启动子或增强子如果能影响序列的转录，即是与编码序列“可操作连接的”。对于转录调节序列，可操作连接是指被连接的DNA序列是相邻的，当需要连接两个蛋白质编码区时，所述DNA序列是相邻的并位于阅读框中。对于转换序列，可操作连接表示序列能够实现转换重组。
如本文所用的术语“载体”意指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，它是指环状双链DNA环，另外的DNA片段可连接到其中。另一种载体类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可连接到病毒基因组内。某些载体能够在其引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括发挥等同功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
如本文所用的术语“重组宿主细胞”(或简祢为“宿主细胞“)意指其中引入了重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语不但意指特定受试者细胞，也指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响在以后各代中可能发生某些修饰作用，此类后代可能实际上与亲代细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用的术语“抗原”是指任何天然的或合成的致免疫物质，诸如蛋白质、肽或半抗原。用在本发明中(例如，与本发明的抗CD27抗体相结合的疫苗中)的合适抗原包括，例如，希望发生针对它们的保护性或治疗性免疫应答的感染病抗原和肿瘤抗原，例如，肿瘤细胞或病原生物表达的抗原或感染病抗原。例如，合适的抗原包括用于预防或治疗癌症的肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原的实例包括但不限于包含βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2和MUC-1抗原和生殖细胞源性肿瘤抗原的序列的全部或部分的序列。肿瘤相关抗原也包括血型抗原，例如，Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。作为另外一种选择，本发明的抗原-抗体构建体内可以包含一种以上的抗原。例如，MAGE抗原可以与其他抗原如黑色素A、酪氨酸酶和gp100以及佐剂如GM-CSF或IL-12一起组合，并且连接至抗APC抗体上。
其他合适的抗原包括用于预防或治疗病毒性疾病的病毒抗原。病毒抗原的实例包括但不限于HIV-1gag、HIV-1env、HIV-1nef、HBV(表面或核心抗原)、HPV、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2和ORF3抗原。细菌抗原的实例包括但不限于鼠弓形虫(Toxoplasmagondii)或苍白密螺旋体(Treponemapallidum)。本发明的抗体-细菌抗原偶联物可以用于治疗或预防多种细菌性疾病，诸如炭疽、肉毒中毒、破伤风、衣原体、霍乱、白喉、莱姆病、梅毒和结核病。下文公开了来自感染性疾病病原体诸如病毒、细菌、寄生虫和真菌的其他合适的抗原。
上述抗原的序列在本领域中是熟知的。例如，MAGE-3cDNA序列的实例在US6,235,525(LudwigInstituteforCancerResearch)中有所提供；NY-ESO-1核酸和蛋白质序列的实例在US5,804,381和US6,069,233(LudwigInstituteforCancerResearch)中有所提供；Melan-A核酸和蛋白质序列的实例在US5,620,886和US5,854,203(LudwigInstituteforCancerResearch)中有所提供；NY-BR-1核酸和蛋白质序列的实例在US6,774,226和US6,911,529(LudwigInstituteforCancerResearch)中有所提供以及NY-CO-58核酸和蛋白质序列的实例在WO02090986(LudwigInstituteforCancerResearch)中有所提供；HER-2/neu蛋白的氨基酸序列的实例可从登录号AAA58637获得；以及人癌胚抗原样1(CEA-1)的核苷酸序列(mRNA)可从登录号NM_020219获得。
可用于本发明药物组合物和方法中的HPV抗原可包括，例如，HPV-16抗原、HPV-18抗原、HPV-31抗原、HPV-33抗原和/或HPV-35抗原；并且合适地是HPV-16抗原和/或HPV-18抗原。HPV-16的基因组在Virology，145：181-185(1985)中有所描述，并且编码HPV-18的DNA序列在美国专利No.5,840,306中有所描述，其公开内容通过引用全文并入本文中。HPV-16抗原(例如，HPV-16的E1和/或E2蛋白的血清反应区)在美国专利No.6,531,127中有所描述，并且HPV-18扰原(例如，HPV-18的L1和/或L2蛋白的血清反应区)在美国专利No.5,840,306中有所描述，其公开内容通过引用全文并入本文中。类似地，HBV的全基因组可从登录号NC_003977获得，其公开内容通过引用并入本文中。HCV的基因组在欧洲专利申请No.318216中有所描述，其公开内容通过引用并入本文中。通过引用并入本文中的PCT/US90/01348公开了HCV基因组克隆的序列信息、HCV病毒蛋白的氨基酸序列以及制备和使用此类组合物用于包含由其衍生的HCV蛋白和肽的HCV疫苗的方法。
蛋白质的抗原性肽(即，含有T细胞表位的那些)可以用本领域熟知的多种方式鉴定。例如，T细胞表位可以通过利用基于web的预测性算法(BIMAS&SYFPEITHI)分析蛋白质的序列来预测，以产生潜在的MHCI类和II类结合肽，它们匹配10,000个良好表征的以前用CTL定义的MHC结合肽的内部数据库。可以将高得分的肽排序，并且基于对给定MHC分子的高亲和力选择它们作为“感兴趣的”肽。
另外一种鉴定含有T细胞表位的抗原性肽的方法是将蛋白质分为所需长度的非重叠肽或所需长度的重叠肽，它们可以通过重组、合成方法或在某些限制情况下通过化学裂解蛋白质来产生，并检测其免疫原特性，例如，引发T细胞应答(即，增殖或淋巴因子分泌)。
为了通过例如精细作图技术确定蛋白质的精确的T细胞表位，通过T细胞生物学技术测定，具有T细胞刺激活性并因此包含至少一个T细胞表位的肽可以通过在该肽的氨基或羧基末端添加或缺失氨基酸残基来进行修饰，并进行检测以确定对修饰的肽的T细胞活性的变化。如果通过T细胞生物学技术测定，发现在天然蛋白质序列中具有重叠区的两个或更多个肽具有人T细胞刺激活性，则可以产生包含此类肽的全部或一部分的另外的肽，并且可以通过类似的方法检测这些另外的肽。根据这一技术，重组或合成地选择和产生肽。肽的选择基于多种因素，包括对肽的T细胞应答的强度(例如，刺激指数)。然后可以检查这些选择的肽的物理和化学性质(例如，溶解性、稳定性)，以确定这些肽是否适用于治疗组合物，或者这些肽是否需要修饰。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞利用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(如THP-1)、B淋巴母细胞(如c1R.A2、1518B-LCL)和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。一些APC通过吞噬作用或者受体介导的胞吞作用内化抗原。APC受体的实例包括但不限于C型凝集素，诸如人树突和上皮细胞205受体(CD27)和人巨噬细胞甘露糖受体。
术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原和使它们能够被T细胞识别的过程，例如，作为MHC-I和/或MHC-II偶联物的组分。
“MHC分子”包括两类分子：MHCI类和MHCII类。MHCI类分子将抗原呈递给特定的CD8+T细胞，并且MHCII类分子将抗原呈递给特定的CD4+T细胞。外源地递送给APC的抗原主要为了与MHCII类缔合而加工。相反，内源地递送给APC的抗原主要为了与MHCI类缔合而加工。
如本文所用的术语“免疫刺激剂”包括但不限于能够刺激APC诸如DC和巨噬细胞的化合物。例如，用于本发明的合适的免疫刺激剂能够刺激APC，使得APC的成熟过程得到加速，APC的增殖得到加强，和/或共刺激分子(如，CD80、CD86、ICAM-1、MHC分子和CCR7)和促炎细胞因子(如，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-15和IFN-γ)的募集或释放得到上调。合适的免疫刺激剂也能够增强T细胞增殖。此类免疫刺激剂包括但不限于：CD40配体；FLT3配体；细胞因子，诸如IFN-α、IFN-β、IFN-γ和IL-2；集落刺激因子，诸如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗41BB抗体或抗OX-40抗体；LPS(内毒素)；ssRNA；dsRNA；卡介苗(BCG)；盐酸左旋咪唑；和静脉内免疫球蛋白。在一个实施方案中，免疫刺激剂可以是Toll样受体(TLR)激动剂。例如，免疫刺激剂可以是TLR3激动剂，诸如双链肌苷：胞嘧啶多核苷酸(PolyI:C，例如可以作为AmpligenTM得自HemispherxBipharma，PA，US或得自Oncovir的PolyIC:LC)或PolyA:U；TLR4激动剂，诸如单磷酰脂质A(MPL)或RC-529(例如得自GSK，UK)；TLR5激动剂，诸如鞭毛蛋白；TLR7或TLR8激动剂，诸如咪唑喹啉TLR7或TLR8激动剂，例如咪喹莫特(如AldaraTM)或雷西莫特和相关的咪唑喹啉剂(例如，可得自3MCorporation)；或TLR9激动剂，诸如具有非甲基化CpG基序的脱氧核苷酸(所谓的“CpG”，例如可得自ColeyPharmaceutical)。优选的免疫刺激剂为TLR3激动剂，优选地为PolyI:C。此类免疫刺激剂可以与本发明的抗体和构建体同时、单独或顺序施用，也可以物理与该抗体和构建体连接。
如本文所用的术语“连接的”是指两个或更多个分子的缔合，该连接可以是共价的或非共价的。该连接也可以是遗传的(即，重组融合)。此类连接可以使用多种本领域公认的技术来实现，诸如化学偶联和重组蛋白质产生。
如本文所用的术语抗原“交叉呈递”是指外源蛋白质抗原通过APC上的MHCI类和II类分子向T细胞的呈递。
如本文所用的术语“T细胞介导的应答”是指由包括效应T细胞(如，CD8+细胞)和辅助T细胞(如，CD4+细胞)在内的由T细胞介导的任何应答。T细胞介导的应答包括，例如，T细胞细胞毒性和增殖。
如本文所用的术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”是指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
如本文所用的术语“抑制”或“阻断”(如，涉及细胞上CD70与CD27的结合的抑制/阻断)可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。CD70的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生CD70结合时出现的活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括：与抗CD27抗体接触时，与未与抗CD27抗体接触的CD70相比，任何可测量的CD70结合亲和力降低，例如，抑制CD70的结合达至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一个优选的实施方案中，抗CD27抗体抑制CD70的结合达至少约70％。在另一个实施方案中，抗CD27抗体抑制CD70的结合达至少约80％。
如本文所用的术语“抑制生长”(例如，涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低，例如，抑制细胞生长达至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可以互换使用，并指免疫应答对特定抗原的刺激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指刺激特定的直接细胞杀伤机制。例如，在一个实施方案中，抗体在10μg/ml的浓度下诱导至少约20、25、30、35、40、45、50、55或60％的CD27表达细胞的经由CDC的裂解。在一个优选的实施方案中，抗体在10μg/ml的浓度下诱导至少约40％的CD27表达细胞的经由CDC的裂解。在另一个实施方案中，抗体在10μg/ml的浓度下诱导至少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85％的CD27表达细胞的经由ADCC的裂解(即，特异性裂解)。在一个优选的实施方案中，抗体在10μg/ml的浓度下诱导至少约40％的CD27表达细胞的经由ADCC的裂解。
如本文所用的术语“治疗”是指本文所述的治疗性的或预防性的措施。“治疗”的方法是对需要这种治疗的受试者，例如，需要增强对特定抗原的免疫应答的受试者，或最终可能患上这种疾病的受试者，施用本发明的人抗体，以预防、治愈、延迟疾病或复发疾病、减轻其严重程度，或缓解其一种或多种症状，或使受试者的生存期延长超过不使用这种治疗时预期的生存期。
术语“有效剂量”被定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效量”被定义为足以治愈或至少部分停滞已患有疾病的患者的疾病及其并发症的量。对于此用途有效的量取决于所治疗的疾病的严重程度和患者自身免疫系统的总体状况。
术语“患者”包括接受预防或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
如本文所用的术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可以用来治疗患有免疫疾病的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖类、爬行类动物等。
本发明的各个方面在下面的小节中进一步详细说明。
I.针对CD27的抗体的产生
本发明涵盖结合CD27例如人CD27的抗体，例如，完全人抗体。示例性的结合CD27的单克隆抗体包括1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5。本发明的单克隆抗体可以使用多种已知的技术产生，诸如KohlerandMilstein，Nature256：495(1975)所述的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交方法是优选的，但是原则上也可以采用其他生产单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
因此，在一个实施方案中，使用杂交瘤方法产生结合人CD27的抗体。在该方法中，小鼠或其他合适的宿主动物可以用合适的抗原免疫，以便诱导出产生或能够产生将特异性与免疫所用抗原结合的抗体的淋巴细胞。作为另外一种选择，淋巴细胞可以在体外免疫。然后可以使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，第59-103页(AcademicPress，1986))。测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对该抗原的单克隆抗体的产生。鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并且使用标准方法进行培养(Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，第59-103页(AcademicPress，1986))。用于该目的的合适的培养基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。可以通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如，蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中分离由该亚克隆分泌的单克隆抗体。
在另一个实施方案中，结合人CD27的抗体和抗体部分可以从利用如下所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离：例如，McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)；Clackson等，Nature，352：624-628(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)和Hoet等(2005)NatureBiotechnology23，344-348；Ladner等的美国专利NO.5,223,409、5,403,484和5,571,698；Dower等的美国专利NO.5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利NO.5,969,108和6,172,197；以及Griffiths等的美国专利NO.5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。另外，也可以使用通过链改组产生高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及感染和体内重组的组合作为构建极大噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。
在一个特定的实施方案中，使用通过Hoet等(同上)所述的噬菌体展示技术产生结合人CD27的抗体。该技术包括产生具有从人供体分离的免疫球蛋白序列的独特组合并且在重链CDR中具有合成多样性的人Fab文库。然后针对与人CD27结合的Fab筛选该文库。
优选的用于制备产生本发明抗体的杂交瘤的动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是本领域中熟知的，包括免疫方案以及分离和融合被免疫的脾细胞的技术。
在一个实施方案中，使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对CD27的抗体。在一个实施方案中，本发明采用在本文中称为“HuMAb小鼠”的转基因小鼠，该小鼠包含编码未重排的人重链(μ和γ)以及κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和κ链基困座失活的定向突变(Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述在Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷：65-93以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764：536-546)。HuMAb小鼠的制备在下面的第II节和以下文献中有详细描述：Taylor，L.等(1992)NucleicAcidsResearch20：6287-6295；Chen，J.等(1993)InternationalImmunology5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90：3720-3724；Choi等(1993)NatureGenetics4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBOJ.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等，(1994)Nature368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113：49-101；Taylor，L.等(1994)InternationalImmunology6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.第13卷：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci764：536-546；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology14：845-851。进一步参见Lonberg和Kay以及GenPharmInternational的美国专利NO.5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429；Surani等的美国专利No.5,545,807；1998年6月11日公布的国际公布NO.WO98/24884；1994年11月10日公布的WO94/25585；1993年6月24日公布的WO93/1227；1992年12月23日公布的WO92/22645；1992年3月19日公布的WO92/03918。
免疫
为了产生针对CD27的完全人抗体，含有人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)可用纯化的或富集的CD27抗原制品和/或表达CD27的细胞进行免疫，如(例如)Lonberg等(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14：845-851和WO98/24884中所述。如本文所述，用重组CD27蛋白或表达CD27的细胞系作为免疫原免疫HuMAb小鼠。作为另外一种选择，可以用编码人CD27的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠第一次输注时鼠龄在6-16周。例如，可以使用纯化的或富集的重组CD27抗原制品(5-50μg)经腹膜内免疫HuMAb小鼠。如果用纯化的或富集的CD27抗原制品免疫不能导致抗体产生，也可用表达CD27的细胞例如细胞系免疫小鼠，以促进免疫应答。示例性的细胞系包括过表达CD27的稳定的CHO和Raji细胞系。
对各种抗原积累的经验已证明，当最初使用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)或皮下(SC)免疫，接着每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原IP/SC免疫(最多共10次)时，HuMAb转基因小鼠产生最佳应答。在免疫方案过程中可以用眼眶后取血获得的血浆样本监测免疫应答。可通过ELISA(如下所述)筛选血浆，并且具有足够抗CD27人免疫球蛋白效价的小鼠可用于进行融合。用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫，3天后处死并取出脾脏。
产生针对CD27的单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了制备产生针对CD27的单克隆抗体的杂交瘤，可从被免疫的小鼠中分离脾细胞和淋巴结细胞，并与合适的无限增殖化细胞系(诸如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后筛选所得杂交瘤的抗原特异性抗体的产生情况。例如，可使用50％PEG(w/v)，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与SP2/0-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。将细胞以大约1×105的密度接种于平底微量滴定板中，接着在除常用试剂外含有10％胎克隆血清、5-10％origen杂交瘤克隆因子(IGEN)和1XHAT(Sigma)的选择性培养基中孵育两周。大约两周之后，可在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后可通过ELISA筛选各孔的人抗CD27单克隆IgM和IgG抗体，或者通过FLISA(荧光连接的免疫吸附测定)筛选与表达CD27的细胞(例如，表达CD27的CHO细胞系)的表面的结合。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常可在10-14天之后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果对于IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将抗CD27单克隆抗体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生抗体用于表征。
产生针对CD27的单克隆抗体的转染瘤的产生
也可利用(例如)在本领域中熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(Morrison，S.(1985)Science229：1202)在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。
例如，在一个实施方案中，感兴趣的基因，例如，人抗体基因，可以连接到表达载体诸如真核表达质粒中，如WO87/04462、WO89/01036和EP338841公开的GS基因表达系统或本领域熟知的其他表达系统所使用的载体。具有克隆的抗体基因的纯化质粒可以被引入真核宿主细胞诸如CHO细胞或NSO细胞或其他真核细胞如植物源细胞、真菌或酵母细胞中。用来引入这些基因的方法可以是本领域中描述的方法，诸如电穿孔、lipofectine、lipofectamine或其他方法。在将这些抗体基因引入宿主细胞后，可以鉴定和选择表达该抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，它们然后可以进行表达水平的扩增并扩大规模以产生抗体。可以从这些培养上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。
作为另外一种选择，这些克隆的抗体基因可以在其他表达系统诸如大肠杆菌中或在完整生物体中表达，或可以通过合成方式表达。
使用部分抗体序列表达完整的抗体
抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此原因，在各抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR之外的序列更具多样性。因为CDR序列负责大多数抗体抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体来表达模拟天然存在的特异性抗体的性质的重组抗体，该构建体包含来自天然存在的特异性抗体的CDR序列，这些序列已被移植到来自具有不同性质的不同抗体的骨架序列上(参见，例如Riechmann，L.等，1998，Nature332：323-327；Jones，P.等，1986，Nature321：522-525；和Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033)。这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库中获得。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为它们将不包括完全装配的可变基因，后者在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接而形成。种系基因序列在对应的单个可变区中也将不同于高亲和力次级全套抗体(secondaryrepertoireantibody)的序列。例如，骨架区的氨基末端部分的体细胞突变相对少见。例如，体细胞突变在骨架区1的氨基末端部分和骨架区4的羧基末端部分相对少见。此外，许多体细胞突变不会显著改变抗体的结合性质。由于此原因，为了产生具有与原抗体类似的结合性质的完整重组抗体，不一定要获得特定抗体的完整DNA序列(参见1999年3月12日提交的PCT/US99/05535)。对于此目的，跨过CDR区的部分重链和轻链序列一般是足够的。利用该部分序列确定哪些种系可变基因和连接基因片段贡献于重组抗体可变基因。然后利用种系序列补平可变区中丢失的部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被裂解，并且对最终抗体的性质没有贡献。为了添加丢失的序列，通过连接或PCR扩增，克隆的cDNA序列可以与合成的寡核苷酸组合。作为另外一种选择，完整的可变区可以合成为一组短的、重叠的寡核苷酸，并且通过PCR扩增组合，以产生完全合成的可变区克隆。这一方法具有某些优点，诸如消除或包含特定的限制性位点，或者优化特定的密码子。
使用来自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列设计一组重叠的合成寡核苷酸，以产生具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。合成重链和κ链序列可在三个方面不同于天然序列：打断重复核苷酸碱基串，以利于寡核苷酸合成和PCR扩增；根据Kozak规则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870)并入最佳翻译起始位点；以及将HindIII位点工程化在翻译起始位点的上游。
对于重链和轻链可变区，将优化的编码链序列和相应的非编码链序列分解成接近相应非编码寡核苷酸的中点的30-50个核苷酸。因此，对于每条链，寡核苷酸可以装配成重叠的双链组，它们跨过150-400个核苷酸的片段。然后使用该集合作为模板以产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。统筹，单可变区寡核苷酸组将分解为两个集合，它们分别扩增以产生两个重叠的PCR产物。这些重叠的产物然后通过PCR扩增进行组合，以形成完整的可变区。也可能希望在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点，或γ重链的AgeI位点)，以产生看完容易地克隆到表达载体构建体内的片段。
重构的重链和轻链可变区然后与克隆的启动子、前导序列、翻译起点、前导序列、恒定区、3’非翻译区、聚腺苷酸化和转录终止序列组合，以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可以组合到单个载体中，共转染，系列转染，或分别转染进宿主细胞，然后将该宿主细胞融合，形成表达两条链的宿主细胞。
构建用于构建表达载体的质粒，使得可以利用PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列重新构建完整的重链和轻链小基因。这些质粒可以用来表达完全人IgG1κ或IgG4κ抗体。本发明的完全人抗体和嵌合抗体也包括IgG2、IgG3、IgE、IgA、IgM和IgD抗体。为了表达其他重链同种型，或者为了表达包含λ轻链的抗体，可以构建类似的质粒。
因此，在本发明的另一个方面，使用本发明的抗CD27抗体的结构特征产生结构上相关的抗CD27抗体，该抗体保留本发明的抗体的至少一种功能性质，例如，
(1)在10μg/ml的抗体浓度下抑制(如，完全或部分阻断)CD70与CD27表达细胞的结合达至少约70％(如，至少约70％、或至少70％)；
(2)以10-9M或更小的平衡解离常数Kd或作为另外一种选择以10+9M-1或更大的平衡缔合常数Ka与人CD27结合；
(3)在10μg/ml的浓度下诱导至少约30％的CD27表达细胞的补体介导的细胞毒性(CDC)(或在10μg/ml的浓度下诱导至少30％、或至少约40％或至少40％的CD27表达细胞的CDC)；
(4)在10μg/ml的浓度下诱导至少约30％的CD27表达细胞的特异性ADCC介导的裂解(或在10μg/ml的浓度下诱导至少30％、或至少约40％或至少40％的CD27表达细胞的特异性ADCC介导的裂解)；
(5)在异种移植模型中防止或抑制表达CD27的肿瘤细胞的生长(例如，以0.5mg腹腔注射至少6天，在体内肿瘤细胞接种后20天时，减小重症综合性免疫缺陷(SCID)小鼠中的肿瘤大小达至少约50％)；
(6)当与疫苗或其他抗原相结合时诱导或增强抗原特异性免疫应答；
(7)诱导或增强免疫应答，具体地但不限于TH1免疫应答；
(8)诱导或增强T细胞活性，具体地但不限于特异性CD8+T细胞数或功能活性，或T细胞增殖或活化；和/或
(9)降低或抑制T细胞增殖或活化。在一个实施方案中，本发明的抗体的一个或多个CDR区可以与已知的骨架区和CDR重组组合，以产生另外的重组工程化的本发明的抗CD27抗体。其重链和轻链可变骨架区可以来源于相同或不同的抗体序列。抗体序列可以是天然存在的抗体的序列，或者可以是几种抗体的共有序列。参见Kettleborough等，ProteinEngineering4：773(1991)；Kolbinger等，ProteinEngineering6：971(1993)以及Carter等，WO92/22653。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供一种制备抗CD27抗体的方法，包括：制备一种抗体，该抗体包括：(1)重链骨架区和重链CDR，其中至少一条重链CDR包含选自SEQIDNO：8、9、10、26、27、28、38、39、40、50、51、52、62、63、64、74、75、76、86、87、88、104、105、106所示的CDR的氨基酸序列的氨基酸序列；和(2)轻链骨架区和轻链CDR，其中至少一条轻链CDR包含选自SEQIDNO：SEQIDNO：14、15、16、20、21、22、32、33、34、44、45、46、56、57、58、68、69、70、80、81、82、92、93、94、98、99、100、110、111、112所示的CDR的氨基酸序列的氨基酸序列，其中该抗体保留与CD27结合的能力。抗体与CD27结合的能力可以使用标准结合试验来测定，诸如实施例所述的那些(如，ELISA或FLISA)。
本领域熟知的是，抗体的重链和轻链CDR3结构域在抗体对于抗原的结合特异性/亲和力中起着特别重要的作用(参见，Hall等，J.Imunol.，149：1605-1612(1992)；Polymenis等，J.Immunol.，152：5318-5329(1994)；Jahn等，Immunobiol.，193：400-419(1995)；Klimka等，Brit.J.Cancer，83：252-260(2000)；Beiboer等，J.Mol.Biol，296：833-849(2000)；Rader等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：8910-8915(1998)；Barbas等，J.Am.Chem.Soc.，116：2161-2162(1994)；Ditzel等，J.Immunol.，157：739-749(1996))。因此，如上所述制备的本发明的重组抗体优选地包含抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的重链和/或轻链CDR3。该抗体可进一步包含抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的CDR2。该抗体可进一步包含抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的CDR1。该抗体可进一步包含CDR的任何组合。
因此，在另一个实施方案中，本发明进一步提供抗CD27抗体，该抗体包含：(1)重链骨架区、重链CDR1区、重链CDR2区和重链CDR3区，其中重链CDR3区选自1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的CDR3，和(2)轻链骨架区、轻链CDR1区、轻链CDR2区和轻链CDR3区，其中轻链CDR3区选自1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的CDR3，其中抗体结合CD27。该抗体可进一步包含抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的重链CDR2和/或轻链CDR2。该抗体可进一步包含抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的重链CDR1和/或轻链CDR1。
具有修饰序列的抗体的产生
在另一个实施方案中，本发明的抗CD27抗体的可变区序列或其部分被修饰，从而产生结构上相关的抗CD27抗体，该抗体保留了结合(即，与未修饰抗体结合相同的表位)能力，因此在功能上是等同的。鉴定可以被改变而不消除抗原结合的残基的方法是本领域熟知的(参见，例如Marks等(Biotechnology(1992)10(7)：779-83(通过用固定的CDR3序列改变来改组轻链可变区，然后改组重链可变区来使单克隆抗体多样化)；Jespers等(1994)Biotechnology12(9)：899-903(从针对抗原单表位的噬菌体展示谱中选择人抗体)；Sharon等(1986)PNASUSA83(8)：2628-31(抗体的可变多样性片段连接处的不变氨基酸残基的定点诱变)；Casson等(1995)J.Immunol.155(12)：5647-54(抗体重链可变区的随机诱变产生的特异性的丢失和变化的进化))。
因此，在本发明的一个方面中，上述工程化抗体的CDR1、2和/或3区可以包含准确的氨基酸序列，如本文所公开的抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的那些氨基酸序列。然而，在本发明的其他方面，所述抗体包含1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的确切CDR序列的衍生物，而仍然保留有效与CD27结合的能力。此类序列修饰可以包括一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，例如如上所述的保守序列修饰。序列修饰也可以基于抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的特定CDR1、CDR2和CDR3序列的上述共有序列。
因此，在另一个实施方案中，该工程化抗体可以包含一个或多个CDR，所述CDR与抗体1F5、1H8、3H12、3A10、2C2、2G9、3H8和1G5的一个或多个CDR具有例如90％、95％、98％或99.5％同一性。在上述数值中间的范围，例如，与上述序列中的一个或多个具有90-95％、95-98％或98-100％同一性的CDR也旨在包括在本发明中。
在另一个实施方案中，可以改变CDR的一个或多个残基，以改变结合，从而达到更有利的结合速率、更有利的解离速率或这两者，从而达到理想的结合常数。使用这一策略，可以获得具有例如1010M-1或更高的超高结合亲和力的抗体。本领域熟知的和本文所述的亲和力成熟技术可以用来改变CDR区，然后针对希望的结合改变筛选得到的结合分子。因此，当一个或多个CDR改变时，可以监测到结合亲和力以及免疫原性的改变，并且进行评分，从而获得为了结合和低免疫原性的最佳组合而优化的抗体。
除了CDR内的修饰以外或者作为其替代，也可以在抗体重链和/或轻链可变区的一个或多个骨架区、FR1、FR2、FR3和FR4内进行修饰，只要这些修饰不消除抗体的结合亲和力。例如，将本发明抗体的重链和/或轻链可变区的骨架区中的一个或多个非种系氨基酸残基被种系氨基酸残基取代，即，与该抗体具有显著序列同一性的重链或轻链可变区的人种系序列中相应的氨基酸残基。例如，抗体链可以同与之具有显著序列同一性的种系抗体链进行比对，并且在抗体骨架序列和种系链骨架之间不匹配的氨基酸残基可以用来自种系序列的相应的残基取代。当抗体可变骨架区和相当的人种系序列可变骨架区之间的氨基酸不同时，抗体骨架氨基酸通常应当用相当的人种系序列氨基酸代替，如果合理地预期该氨基酸落入以下类别之一中：
(1)直接非共价结合抗原的氨基酸残基，
(2)与CDR区相邻的氨基酸残基，
(3)以其他方式与CDR区相互作用的氨基酸残基(例如，通过计算机建模确定，在CDR区的大约内)，或
(4)参与VL-VH界面的氨基酸残基。
“直接非共价结合抗原”的残基包括非常可能根据确定的化学力如氢键键合、范德华力、疏水相互作用等与抗原上的氨基酸直接相互作用的骨架区内位置处的氨基酸。因此，在一个实施方案中，本发明抗体的骨架区中的氨基酸残基被直接与抗原非共价结合的相应的种系氨基酸残基取代。
“与CDR区相邻的”残基包括与抗体一级序列中的一个或多个CDR直接邻近的位置中的氨基酸残基，例如，在直接邻近根据Kabat定义的CDR，或者根据Chothia定义的CDR的位置中的氨基酸残基(参见例如，Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196：901(1987))。因此，在一个实施方案中，本发明抗体的骨架区内的氨基酸残基被与CDR区相邻的相应的种系氨基酸残基取代。
“以其他方式与CDR区相互作用的”残基包括通过二级结构分析确定的、其空间定向足以影响CDR区的残基。这些氨基酸通常将具有CDR中某些原子的大约3埃单位内的侧链原子，并且必然含有能够根据确定的化学力(如以上所列出的那些)与CDR原子相互作用的原子。因此，在一个实施方案中，本发明抗体的骨架区内的氨基酸残基被以其他方式与CDR区相互作用的相应的种系氨基酸残基取代。
已知在许多抗体中，骨架中的多个位置处的氨基酸对于确定CDR构象是重要的(例如，能够与CDR相互作用)(Chothia和Lesk，同上，Chothia等，同上和Tramontano等，J.Mol.Biol.215：175(1990)，所有这些都通过引用并入本文)。这些作者通过分析多种已知抗体的结构，鉴定了对CDR构象重要的保守骨架残基。基于CDR的构象，所分析的抗体落入有限数量的结构或“规范”类别中。规范类别成员内的保守骨架残基被称为“规范”残基。规范残基包括轻链的残基2、25、29、30、33、48、64、71、90、94和95以及重链的残基24、26、29、34、54、55、71和94。另外的残基(例如，决定CDR结构的残基)可以根据Martin和Thorton(1996)J.Mol.Biol.263：800的方法进行鉴定。值得注意的是，已知轻链位置2、48、64和71和重链位置26-30、71和94处的氨基酸(根据Kabat编号)能够与许多种抗体中的CDR相互作用。轻链中位置35以及重链中位置93和103处的氨基酸也可能与CDR相互作用。可以实现CDR构象的另外的残基可以根据Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487的方法进行鉴定。这些残基被称为“游标”残基，并且是接近地位于CDR下(即，在CDR下形成“平台”)的骨架区中的那些残基。
“参与VL-VH界面”的残基或“堆积残基”包括如例如Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4592-66(1985)或Chothia等(同上)定义的在VL和VH之间界面处的那些残基。
偶然地，关于特定氨基酸是否落于一个或多个上述类别中，有一些不明确。在此类情况下，产生替代的变体抗体，其中之一具有所述特定的取代，另一个没有。这样产生的替代的变异抗体可以在本文所述的任何试验中检测希望的活性，并选择优选的抗体。
骨架区内取代的另外的候选物是在该位置处对于抗体而言不常见的或“罕见的”氨基酸。这些氨基酸可以被来自人种系序列的等同位置或来自更典型抗体的等同位置的氨基酸取代。例如，当抗体骨架区中的氨基酸对于该位置是罕见的，并且种系序列中相应的氨基酸对于免疫球蛋白序列中的该位置是常见的；或者当抗体中的氨基酸对于该位置是罕见的，并且种系序列中相应的氨基酸相对于其他序列也是罕见的时，取代可能是需要的。预期通过将不常见的氨基酸替换为恰好是抗体典型的来自种系序列的氨基酸，可以使抗体的免疫原性较低。
如本文所用的术语“罕见的”表示在代表性的序列样本中，在低于约20％、优选地低于约10％、更优选地低于约5％、甚至更优选地低于约3％、甚至更优选地低于大约2％并且甚至更优选地低于约1％的序列中在该位置处出现该氨基酸，如本文所用的术语“常见的”表示在代表性样本中，在超过约25％但通常超过约50％的序列中出现该氨基酸。例如，所有轻链和重链可变区序列分别分组为序列“亚组”，它们彼此特别同源，并且在某些关键位置处具有相同的氨基酸(Kabat等，同上)。当决定抗体序列中的氨基酸在序列之间是“罕见的”还是“常见的”时，通常优选地只考虑那些与所述抗体序列属于相同亚组的序列。
通常，抗体的骨架区与它们所来源的人种系序列的骨架区基本上相同，并且更通常的是相同。当然，骨架区中的许多氨基酸对抗体的特异性或亲和力没有直接贡献或只有很小的贡献。因此，可以容忍骨架残基的许多单个的保守取代，而不会明显地改变所得免疫球蛋白的特异性或亲和力。因此，在一个实施方案中，抗体的可变骨架区与人种系可变骨架区序列或此类序列的共有序列具有至少85％的序列同一性。在另一个实施方案中，抗体的可变骨架区与人种系可变骨架区序列或此类序列的共有序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
除了简单结合CD27以外，可以选择抗体的保留本发明抗体的其他功能特性，例如：(1)抑制(例如，完全或部分阻断)CD70与CD27表达细胞的结合达至少约70％；
(2)以10-9M或更小的平衡解离常数Kd或作为另外一种选择以10+9M-1或更高的平衡缔合常数Ka与人CD27结合；
(3)在10μg/ml的浓度下诱导至少约40％的CD27表达细胞的补体介导的细胞毒性(CDC)；和/或
(4)在10μg/ml的浓度下诱导至少约40％的CD27表达细胞的ADCC介导的特异性裂解。
针对CD27的单克隆抗体的表征
可以使用多种已知的技术来表征本发明的单克隆抗体与CD27的结合。通常，最初通过ELISA表征抗体。简而言之，微量滴定板可以用PBS中的纯化的CD27包被，并且然后用PBS中稀释的无关蛋白质诸如牛血清白蛋白(BSA)封闭。将来自CD27免疫的小鼠的血浆稀释液加至各孔中，并在37℃下孵育1-2小时。用PBS/Tween20洗板，并且然后与偶联至碱性磷酸酶的山羊抗人IgGFc特异性多克隆试剂于37℃下孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物使板显色，并在OD405处分析。优选地，将形成最高效价的小鼠用于融合。
如上所述的ELISA检测分析可以用来筛选抗体，并因此筛选可产生显示与CD27免疫原具有阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后可以将优选地以高亲和力与CD27结合的杂交瘤进行亚克隆并进一步表征。然后可以从每个杂交瘤选择一个保留亲本细胞反应性(根据ELISA)的克隆，用于制备细胞库，以及用于抗体纯化。
为了纯化抗CD27抗体，选择的杂交瘤可以在摇瓶、2升旋瓶或其他培养系统中生长。可以过滤并浓缩上清液，然后使用蛋白A琼脂糖凝胶(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析，以纯化该蛋白质。将缓冲液更换为PBS后，可以使用1.43的消光系数根据OD280或优选地通过浊度分析来确定浓度。IgG可以通过凝胶电泳以及通过抗原特异性方法来检查。
为了确定选择的抗CD27单克隆抗体是否与独特表位结合，每种抗体可以用商购试剂(Pierce，Rockford，IL)生物素化。生物素化的MAb的结合可以用链霉亲和素标记的探针来检测。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用本领域公认的技术进行同种型ELISA。例如，微量滴定板的孔可以用10μg/ml抗Ig包被，4℃过夜。用5％BSA封闭后，培养板与10μg/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应2小时。孔然后可以与IgG1或其他同种型特异性偶联探针反应。如上所述使板显色并进行分析。
为了检测单克隆抗体与表达CD27的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简而言之，表达膜结合CD27的细胞系和/或人PBMC(在标准生长条件下生长)与在含有0.1％BSA的PBS中的各种浓度的单克隆抗体于4℃混合1小时。洗涤后，细胞与荧光素标记的抗IgG抗体在与一抗染色相同的条件下反应。样本可以通过FACScan仪器进行分析，利用光散射和侧散射性质，以圈选(gate)单细胞，并确定标记的抗体的结合。(除了流式细胞分析以外或者代替它)可以采用使用荧光显微镜的替代试验。可以完全如上所述染色细胞，并通过荧光显微镜检查。该方法允许显示各细胞，但是根据抗原的密度，可能降低灵敏度。
可以通过Western印迹法进一步检测抗CD27IgG对于CD27抗原的反应性。简而言之，可以制备来自表达CD27的细胞的细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探查。IgG结合可以使用抗IgG碱性磷酸酶来检测，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)显色。
分析各种抗CD27抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域中已知的标准检测分析，例如，使用BiacoreTM2000SPR仪器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析，如本文的实施例2中所述。
II.免疫毒素
在另一个实施方案中，本发明的抗体与治疗性部分诸如细胞毒素、药物或放射性同位素连接。当与细胞毒素偶联时，这些抗体偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如，杀伤细胞)的任何试剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋永仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、噻替派苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素类(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))，抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。本发明的抗体可以与放射性同位素例如放射性碘偶联，以产生细胞毒性放射性药物，用于治疗树突细胞相关的疾病，诸如自身免疫病或炎性疾病，或移植物抗宿主病。
本发明的抗体偶联物可以用来改变给定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质包括，例如，具有酶活性的毒素或其活性片段，诸如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物反应调节物，诸如淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是熟知的，参见，例如Arnon等，″MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy″，在MonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy，Reisfeld等(eds.)，第243-56页(AlanR.Liss，Inc.1985)中；Hellstrom等，″AntibodiesForDrugDelivery″，在ControlledDrugDelivery(第2版)，Robinson等(编著)，第623-53页(MarcelDekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy：AReview″，在MonoclonalAntibodies′84：BiologicalAndClinicalApplications，Pinchera等(编著)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy″，在MonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy，Baldwin等(编著)，第303-16页(AcademicPress1985)以及Thorpe等，″ThePreparationAndCytotoxicPropertiesOfAntibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
III.组合物
在另一个实施方案中，本发明提供一种组合物，例如含有与载体(例如，药学上可接受的载体)一起配制的一种或组合的本发明的单克隆抗体的组合物。也提供了含有包含本发明的抗体的双特异性分子的组合物。在一个实施方案中，组合物包括多种(例如，两种或多种)本发明的分离的抗体的组合。优选地，组合物中的每种抗体与CD27的不同的、预先选择的表位结合。
发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的组合物与至少一种或多种另外的治疗剂，诸如抗炎剂、DMARD(疾病改善抗风湿药)、免疫抑制剂和化疗剂。本发明的药物组合物也可以与放射疗法一起施用。与其他抗体的共施用也包括在本发明中。
如本文所用的术语“载体”和“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(如，通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物(即，抗体、双特异性和多特异性分子)可包被以某种材料，以保护所述化合物免受可能使其失去活性的酸和其他自然条件的作用。
可以与本发明的抗体和构建体一起使用的佐剂的实例包括：弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Mich.)；Merck佐剂65(MerckandCompany，Inc.，Rahway，N.J.)；AS-2(SmithKlineBeecham，Philadelphia，Pa.)；铝盐，诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；细胞因子，诸如GM-CSF、白介素-2、-7、-12和其他类似因子；3D-MPL；CpG寡核苷酸；和单磷酰脂质A，例如3-脱-O-酰化单磷酰脂质A。
MPL佐剂可从CorixaCorporation获得(Seattle，Wash；参见，例如美国专利NO.4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)是熟知的，并且在例如WO96/02555、WO99/33488和美国专利NO.6,008,200和5,856,462中有所描述。例如Sato等，Science273：352，1996也描述了免疫刺激性DNA序列。
其他替代佐剂包括，例如，皂草苷，诸如QuilA或其衍生物，包括QS21和QS7(AquilaBiopharmaceuticalsInc.，Framingham，Mass.)；七叶素；洋地黄皂苷；或石头花属(Gypsophila)或奎奴亚藜(Chenopodiumquinoa)皂草苷；MontanideISA720(Seppic，France)；SAF(Chiron，California，UnitedStates)；ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)；SBAS系列佐剂(如，SBAS-2或SBAS-4，可得自SmithKlineBeecham，Rixensart，Belgium)；Detox(EnhanzynTM)(Corixa，Hamilton，Mont.)；RC-529(Corixa，Hamilton，Mont.)和其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)；聚氧乙烯醚佐剂，如WO99/52549A1中所述的那些；合成咪唑喹啉，诸如咪喹莫特[S-26308，R-837](Harrison，等，Vaccine19：1820-1826，2001)和雷西莫德[S-28463，R-848](Vasilakos，等，Cellularimmunology204：64-74，2000)；在抗原呈递细胞和T细胞表面组成型表达的羰基和胺的席夫碱，如妥卡雷琐(Rhodes，J.等，Nature377：71-75，1995)；作为蛋白质或肽的细胞因子、趋化因子和共刺激分子，包括例如促炎细胞因子，诸如干扰素、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、TGF-α和TGF-β；Th1诱导物，诸如干扰素γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21；Th2诱导物，诸如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13；以及其他趋化因子和共刺激基因，诸如MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3、CD80、CD86和CD40L；免疫刺激剂靶向配体，诸如CTLA-4和L-选择素，凋亡刺激蛋白和肽，诸如Fas；基于合成脂质的佐剂，诸如vaxfectin(Reyes等，Vaccine19：3778-3786，2001)、鲨烯、a-生育酚、聚山梨醇酯80、DOPC和胆固醇；内毒素、[LPS](Beutler，B.，CurrentOpinioninMicrobiology3：23-30，2000)；引发Toll受体产生Th1诱导细胞因子的配体，诸如合成分枝杆菌脂蛋白、分枝杆菌脂蛋白p19、肽聚糖、磷壁酸和脂质A；以及CT(霍乱毒素，亚单位A和B)和LT(来自大肠杆菌的不耐热肠毒素，亚单位A和B)，热休克蛋白家族(HSP)和LLO(单核细胞增多性李斯特菌素O；WO01/72329)。这些和各种其他Toll样受体(TLR)激动剂例如在Kanzler等，NatureMedicine，2007年5月，第13卷，No5中有所描述。与本发明的抗CD27抗体结合使用的优选的免疫刺激剂为TLR3激动剂，诸如PolyIC。
“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见例如，Berge，S.M.，等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和脂族二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。
本发明的组合物可以利用本领域熟知的多种方法施用。本领域技术人员应当理解，施用途径和/或方式根据期望的结果而不同。活性化合物可以与保护该化合物不被快速释放的载体一起制备，诸如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所知。参见例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems，J.R.Robinson，编辑，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1978。
为通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能有必要使所述化合物包被以某种材料，或使所述化合物与某种材料一起施用，以防止其失去活性。例如，所述化合物可在适当的载体例如脂质体或稀释剂中施用给患者。可接受的稀释剂包括盐水和含水缓冲溶液。脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则均设想了其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物通常必须是无菌的并在制备和贮存条件下稳定。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂等包被材料，在分散液的情况下通过保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型组合物的延长吸收。
通过将活性化合物以需要的量并入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着进行无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物并入到含有基本分散介质和上面所列所需其他成分的无菌载体中来制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，该方法由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
调节剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单次团注(singlebolus)，可以随时间施用几个分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。例如，本发明的抗体可以通过皮下或肌内注射每周施用一次或两次，或者通过皮下或肌内注射每月施用一次或两次。
特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易施用并且剂量均匀的剂量单位形式。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体联合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独恃特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗性组合物，本发明制剂包括适于经口施用、鼻内施用、局部施用(包括口腔和舌下施用)、直肠施用、阴道施用和/或胃肠外施用的那些剂型。所述制剂可方便地以单位剂型的形式提供，且可通过药物技术领域已知的任何方法制备。能与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据进行治疗的受试者和特定的施用方式而变化。能与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常为产生治疗效果的组合物的量。通常，以总共百分之百计，这个量为约0.001％至约90％活性成分，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％。
适于通过阴道施用的本发明的制剂也包括阴道栓剂、卫生棉、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，它们含有如本领域已知的适当的载体。用于本发明组合物的局部施用或透皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可在无菌条件下与药学上可接受的载体混合，并且需要时也可与任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。
如本文所用的短语“肠胃外施用”是指不同于肠和局部施用的施用模式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可用于本发明的药物组合物中的适当的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油诸如橄榄油，和注射用有机酯诸如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒度，和通过应用表面活性剂，可维持适当的流动性。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述灭菌程序或通过包含各种抗细菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的存在。也可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射用药物剂型的延长的吸收。
当本发明的化合物作为药物施用给人和动物时，可单独给予和作为药物组合物给予，该组合物中包含例如0.001-90％(更优选0.005-70％，诸如0.01-30％)的活性成分及与其组合的药学上可接受的载体。
不管所选择的施用途径如何，本发明的化合物(可以适当的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能变化，以获得可有效实现对特定患者、组合物和施用方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所采用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史以及医学领域中熟知的类似因素。在本领域具有普通技术水平的医师或兽医可容易地确定和开具有效量的所需的药物组合物。例如，医师或兽医开始开出的药物组合物中使用的本发明化合物的剂量水平低于为达到希望的治疗效果所需要的剂量水平，并且然后逐渐增加剂量，直至达到所希望的效果。通常，合适的本发明组合物的日剂量为有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这个有效剂量通常将取决于上述因素。优选施用方式为静脉、肌内、腹膜内或皮下施用，优选在最接近目标部位处施用。如果需要，治疗性组合物的有效日剂量可以两个、三个、四个、五个、六个或更多分剂量的形式在一天中以合适的间隔分开施用，且任选地以单位剂型施用。虽然本发明化合物有可能单独施用，但优选将所述化合物作为药物制剂(组合物)来施用。
治疗性组合物可通过本领域已知的医疗装置施用。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的治疗性组合物可通过无针皮下注射装置施用，如在美国专利NO.5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的熟知的植入物和模块的实例包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分配药物的可植入式微量输注泵；美国专利No.4.,486,194，该专利公开了用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入式输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔室的渗透药物递送系统；和美国专利No.4,475,196，该专利公开了渗透药物递送系统。本领域技术人员已知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。
在某些实施方案中，可以配制本发明的抗体以确保在体内的正确分布。例如，血脑屏障(BBB)会阻止许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿过BBB(如果需要)，可将它们配制在例如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见例如，美国专利4,522,811、5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(参见例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同种类可构成本发明的制剂，以及本发明的分子的组分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；另见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4：273。在本发明的一个实施方案中，将本发明的治疗性化合物配制于脂质体中；在一个更优选的实施方案中，所述脂质体包含靶向部分。在一个最优选的实施方案中，脂质体中的治疗性化合物通过团注递送到最接近肿瘤或感染的部位。组合物的流动性必须达到易于注射的程度。它在生产和贮存条件下必须稳定，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。
化合物抑制癌症的能力可以在预测对于人肿瘤的有效性的动物模型系统中评价。作为另外一种选择，组合物的这种特性可以通过利用熟练技术人员已知的试验检查该化合物抑制如体外抑制的能力进行评价。治疗有效量的治疗性化合物可以减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状。本领域普通技术人员将能够根据以下因素来确定所述化合物的量，诸如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及选择的特定组合物或施用途径。
组合物必须是无菌的，并且其流动性必须达到能使组合物可通过注射器递药的程度。除水之外，载体可为等渗缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用如卵磷脂的包衣，在分散液情况下通过维持需要的粒度，和通过使用表面活性剂，能够维持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂，如糖类、多元醇诸如甘露醇或山梨醇，以及氯化钠。可通过在组合物中加入能延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝或明胶，来实现注射用组合物的长期吸收。
当活性化合物如上所述被适当地保护时，它可口服施用，例如与惰性稀释剂或可同化的食用载体一起施用。
IV.本发明的应用和方法
在一个实施方案中，本发明的抗体、双特异性分子和组合物可以用来治疗和/预防(例如，针对其进行免疫)多种疾病和病症。
可进行治疗的一种主要的疾病适应症是癌症。尤其是，诱导或增强免疫应答的抗CD27抗体可用于治疗癌症。癌症的类型包括但不限于白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成髓细胞早幼粒细胞髓单核细胞红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤、真性红细胞增多淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食道癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统(CNS)癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈部癌、胃癌、上皮内瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌(小细胞、大细胞)、黑素瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(如唇、舌、口及咽部)、卵巢癌、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌；呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌。优选的癌症包括表达CD27的肿瘤，其选自由下列组成的组：慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和边缘区B细胞淋巴瘤。
诱导或增强免疫应答的抗CD27抗体的其他疾病适应症包括细菌、真菌、病毒和寄生虫感染性疾病。抑制或降低免疫应答的抗CD27抗体的其他疾病适应症包括移植排斥、过敏和自身免疫疾病。
示例性自身免疫疾病包括但不限于多发性硬化、类风湿关节炎、1型糖尿病、牛皮癣、克隆氏病和其他炎性肠病如溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力(MG)、桥本氏甲状腺炎、肺出血-肾炎综合征、天疱疮、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、带抗胶原抗体的硬皮病、混合性结缔组织病、多肌炎、恶性贫血、特发性阿狄森病、自身免疫性相关性不育、肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、增生性肾小球肾炎、大疱性类天疱疮、干燥综合征、银屑病性关节炎、胰岛素抗性、自身免疫性糖尿病、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性肝炎、自身免疫性血友病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、格林-巴利综合征、动脉硬化和阿尔茨海默氏病。示例性的过敏性疾病包括但不限于过敏性结膜炎、春季结膜炎、春季角结膜炎和巨乳头性结膜炎；鼻过敏性疾病，包括过敏性鼻炎和鼻窦炎；耳过敏性疾病，包括咽鼓管瘙痒；上和下呼吸道过敏性疾病，包括内因性和外因性哮喘；皮肤过敏性疾病，包括皮炎、湿疹和荨麻疹；以及胃肠道过敏性疾病。
在另一方面，将本发明的抗体与疫苗相结合而施用，以增强对疫苗抗原的免疫应答，例如肿瘤抗原(从而增强对肿瘤的免疫应答)或感染性疾病病原体的抗原(从而增强对感染性疾病病原体的免疫应答)。因此，在该实施方案中，疫苗抗原可包括(例如)能够引起对肿瘤或对感染性疾病病原体(诸如病毒、细菌、寄生虫和真菌)的免疫应答的抗原或抗原组合物。所述一种或多种抗原可以为例如肽/蛋白质、多糖和/或脂质。所述一种或多种抗原可衍生自肿瘤，诸如之前在本文所公开的多种肿瘤抗原。作为另外一种选择，所述一种或多种抗原可衍生自病原体，诸如病毒、细菌、寄生虫和/或真菌，诸如之前在本文所公开的多种病原体抗原。合适的病原体抗原的另外实例包括但不限于以下这些：
病毒抗原或抗原决定簇可衍生自例如：巨细胞病毒(尤其是人，诸如gB或其衍生物)；EB病毒(诸如gp350)；黄病毒(如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)；肝炎病毒，诸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原诸如PreS1、PreS2和S抗原，如EP-A-414374、EP-A-0304578和EP-A-198474中所述)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；HIV-1(诸如tat、nef、gpl20或gpl60)；人疱疹病毒，诸如gD或其衍生物或立即早期蛋白诸如HSV1或HSV2中的ICP27；人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)；流感病毒(生长在蛋或MDCK细胞或Vero细胞中的完整活病毒或灭活病毒、裂解流感病毒或完整流感病毒颗粒(如Gluck，Vaccine，1992，10，915-920中所述)或者其纯化或重组蛋白质，诸如NP、NA、HA或M蛋白质)；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；狂犬病病毒；呼吸道合胞体病毒(诸如F和G蛋白)；轮状病毒(包括减毒活病毒)；天花病毒；水痘-带状疱疹病毒(诸如gpI、II和IE63)；以及导致宫颈癌的HPV病毒(例如得自HPV16的与蛋白D载体融合以形成蛋白D-E6或E7融合体的早期蛋白E6或E7或它们的组合；或E6或E7与L2的组合(参见例如WO96/26277))。
细菌抗原或抗原决定簇可衍生自例如：芽孢杆菌属(Bacillusspp.)，包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(如肉毒菌毒素)；博德特菌属(Bordetellaspp.)，包括百日咳鲍特菌(B.pertussis)(例如百日咳杆菌粘附素、百日咳毒素、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)；疏螺旋体属(Borreliaspp.)，包括伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、埃氏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安德森疏螺旋体(B.andersonii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii)；弯曲杆菌属(Campylobacterspp)，包括空肠弯曲菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵袭素)和结肠弯曲菌(C.coli)；衣原体属(Chlamydiaspp.)，包括沙眼衣原体(C.trachomatis)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumonie)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；梭菌属(Clostridiumspp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(诸如破伤风毒素)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒菌毒素)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B)；棒状杆菌属(Corynebacteriumspp.)，包括白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素)；埃立克体属(Ehrlichiaspp.)，包括马埃立克体(E.equi)和人粒细胞埃立克体病致病物；立克次氏体属(Rickettsiaspp.)，包括立氏立克次体(R.rickettsii)；肠球菌属(Enterococcusspp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；埃希氏菌属(Escherichiaspp)，包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxicE.coli)(例如定植因子、不耐热毒素或其衍生物、或耐热毒素)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorragicE.coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli)(例如类志贺氏毒素)；嗜血杆菌属(Haemophilusspp.)，包括B型流感嗜血杆菌(H.influenzaetypeB)(例如PRP)、不可分型流感嗜血杆菌(non-typableH.influenzae)，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生的肽(参见例如US5,843,464)；螺旋杆菌属(Helicobacterspp.)，包括幽门螺旋杆菌(H.pylori)(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌属(Pseudomonasspp.)，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；军团菌属(Legionellaspp.)，包括嗜肺军团(L.pneumophila)；钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)，包括问号状钩端螺旋体(L.interrogans)；李斯特氏菌属(Listeriaspp.)，包括单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)；莫拉氏菌属(Moraxellaspp.)，包括卡他莫拉菌(Mcatarrhalis)，也称为卡他布兰汉氏菌(Branhamellacatarrhalis)(例如高分子量和低分子量粘附素和侵袭素)；卡他莫拉菌(MorexellaCatarrhalis)(包括其外膜囊泡和OMP106(参见例如W097/41731))；分枝杆菌属(Mycobacteriumspp.)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、禽分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌菌株(M.smegmatis)；奈瑟氏球菌属(Neisseriaspp.)，包括淋病奈瑟菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)(例如荚膜多糖及其偶联物、转铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；B群脑膜炎奈瑟菌(NeisseriamengitidisB)(包括其外膜囊泡和NspA(参见例如WO96/29412))；沙门氏菌属(Salmonellaspp.)，包括伤寒沙门菌(S.typhi)、副伤寒沙门菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门菌(S.enteritidis)；志贺氏菌属(Shigellaspp.)，包括宋内志贺菌(S.sonnei)、痢疾志贺菌(S.dysenteriae)、福氏志贺菌(S.flexnerii)；葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；链球菌属(Streptococcusspp.)，包括肺炎链球菌(S.pneumonie)(例如荚膜多糖及其偶联物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白抗原肺炎球菌溶血素(BiochemBiophysActa，1989，67，1007；Rubins等，MicrobialPathogenesis，25，337-342)及其突变去毒衍生物(参见例如WO90/06951、WO99/03884)；密螺旋体属(Treponemaspp.)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如外膜蛋白)、牙密螺旋体(T.denticola)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；弧菌属(Vibriospp.)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素)；和耶尔森氏菌属(Yersiniaspp.)，包括小肠结肠炎耶尔森氏茵(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)。
寄生虫/真菌抗原或抗原决定簇可衍生自例如：巴贝虫属(Babesiaspp.)，包括微小巴贝虫(B.microti)；假丝酵母属(Candidaspp.)，包括白色念珠菌(C.albicans)；隐球酵母属(Cryptococcusspp.)，包括新型隐球菌(C.neoformans)；内阿米巴属(Entamoebaspp.)，包括溶组织内阿米巴(E.histolytica)；贾第虫属(Giardiaspp.)，包括兰伯氏贾第虫(G.lamblia)；利什曼原虫属(Leshmaniaspp.)，包括硕大利什曼原虫(L.major)；恶性疟原虫(Plasmodiumfaciparum)(MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfsl6、Pfs48/45、Pfs230以及它们在疟原虫属(Plasmodiumspp.)中的类似物)；肺囊虫属(Pneumocystisspp.)，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；血吸虫属(Schisostomaspp.)，包括曼氏血吸虫(S.mansoni)；毛滴虫属(Trichomonasspp.)，包括阴道滴虫(T.vaginalis)；弓形虫属(Toxoplasmaspp.)，包括刚地弓形虫(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；锥虫属(Trypanosomaspp.)，包括克氏锥虫(T.cruzi)。
应当理解，根据本发明的这一方面，抗原和抗原决定簇可以按许多不同的形式使用。例如，抗原或抗原决定簇可以作为分离的蛋白质或肽而存在(例如，在所谓的“亚单位疫苗”中)，或例如作为细胞相关或病毒相关抗原或抗原决定簇而存在(例如在活的或杀死的病原体株中)。活病原体将优选地以已知的方式减毒。作为另外一种选择，可通过使用编码抗原或抗原决定簇的多核苷酸在受试者中原位生成抗原或抗原决定簇(如在所谓的“DNA疫苗”中)，但是应当理解，可与此方法一同使用的多核苷酸不限于DNA，还可以包括如上所讨论的RNA和修饰的多核苷酸。
在一个实施方案中，也可以使疫苗抗原靶向例如特定的细胞类型或靶向特定的组织。例如，可使疫苗抗原靶向抗原呈递细胞(APC)，例如通过使用诸如靶向APC表面受体诸如DEC-205的试剂，例如在WO2009/061996(CelldexTherapeutics，Inc)中所讨论，或Mannose受体(CD206)，例如在WO03040169(Medarex，Inc.)中所讨论。
为了用于治疗，本发明的抗体可以单独或与其他疗法(诸如免疫刺激剂、疫苗、化疗和放疗)一起直接施用于受试者(即，体内)。在所有情况中，抗体、双特异性分子、组合物和免疫刺激剂以及其他疗法以有效量施用，以发挥它们的理想的治疗效果。术语“有效量”是指实现期望的生物学效应所必需的或足以实现该效应的量。例如，有效量可以是消除肿瘤、癌症或细菌、病毒或真菌感染所必需的量。用于任何特定用途的有效量可以根据如下因素而变化，如所治疗的疾病或病症、所施用的特定抗体、受试者的体型、或疾病或病症的严重程度。本领域普通技术人员可以根据经验确定特定分子的有效量，而无需过多的实验。
疫苗的优选施用途径包括，例如，注射(例如，皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内)。注射可以是团注或连续输注。其他施用途径包括口服。
本发明的抗体和双特异性分子也可以与佐剂和其他治疗剂共施用。应当理解，如本文所用的术语“共施用”包括本发明的抗体和偶联物与佐剂和其他药剂同时、单独或顺序施用的任何一种或全部，包括作为给药方案的一部分施用。抗体一般配制在单独的或与此类药剂组合的载体中。此类载体的实例包括溶液、溶剂、分散介质、延迟剂、乳剂等。这些介质用于药物活性物质的应用是本领域熟知的。适用于分子的任何其他常规载体落入本发明的范围内。
与抗体、偶联物、双特异性分子和组合物共施用的适合的药剂包括其他抗体、细胞毒素和/或药物以及佐剂、免疫刺激剂和/或免疫抑制剂。在一个实施方案中，该药剂是化疗剂。抗体、双特异性分子和组合物也可以与放射一起施用。
适于在肿瘤治疗中与本发明的抗体和偶联物共施用的化疗剂包括，例如：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。其他治疗剂包括，例如，抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)，烷化剂(例如，氮芥、噻替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素类(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)和替莫唑胺。
例如通过免疫细胞(例如调节性T细胞、NKT细胞、巨噬细胞、骨髓来源的抑制细胞、未成熟的或抑制性树突细胞)或在肿瘤局部微环境中由肿瘤或宿主细胞产生的抑制性因子(例如，TGFβ、吲哚胺2，3双加氧酶-IDO)消除或抑制免疫抑制活性的药剂，也可以与本发明的抗体和偶联物一起施用。此类药剂包括抗体和小分子药物，诸如IDO抑制剂，诸如1-甲基色氨酸或衍生物。
与本发明的抗体和双特异性分子共施用的用于治疗此类免疫疾病的合适的药剂包括，例如，免疫抑制剂，诸如雷帕霉素、环孢菌素和FK506；抗TNFa剂，诸如依那西普、阿达木单抗和英夫利昔单抗；和类固醇。具体的天然和合成类固醇的实例包括，例如：醛固酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯泼尼醇、可的松、可的伐唑、脱氧皮质酮、地奈德、去羟米松、地塞米松、二氟可龙(difluorocortolone)、氟氯奈德、氟米松、氟尼缩松、肤轻松、醋酸氟轻松、氟考丁酯、氟可的松、氟可龙(fluorocortolone)、氟米龙、氟氢缩松、氟替卡松、氯氟舒松、氢化可的松、icomethasone、甲泼尼松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、替可的松和曲安西龙。
与本发明的抗体和双特异性分子共施用以诱导或增强免疫应答的适合的药剂包括例如佐剂和/或免疫刺激剂，其非限制性实例在前文有所公开。优选的免疫刺激剂为TLR3激动剂，诸如PolyIC。
本发明进一步用以下实施例进行说明，这些实施例不应理解为是对本发明的进一步限制。在本申请中引用的序列表、附图和所有引用文献、专利和公布的专利申请的内容通过引用专门并入本文中。
实施例
实施例1
CD27特异性人单克隆抗体的产生
通过用可溶性人CD27抗原免疫转基因小鼠(“HuMAb”是Medarex，Inc.，Princeton，NewJersey的商标)的HC2/KCo7株产生人抗CD27单克隆抗体。HC2/KCo7HuMAb小鼠如美国专利No.5,770,429和5,545,806中所述产生，其全部公开内容通过引用并入本文。
抗原和免疫：抗原是包含与抗体Fc结构域融合的CD27胞外结构域的可溶性融合蛋白(重组人CD27-Fc嵌合蛋白)(R&DSystems)。将抗原与完全弗氏佐剂(Sigma)混合用于第一次免疫。之后，抗原与不完全弗氏佐剂(Sigma)混合。另外的小鼠用RIBIMPL+TDM佐剂体系(Sigma)中的可溶性CD27蛋白免疫。将溶于PBS的5-25微克可溶性重组CD27抗原或PBS中的为了表面表达人CD27而转染的5×106个CHO细胞与佐剂1∶1混合。每14天向小鼠的腹腔注射100微升制备的抗原。融合前3-4天给产生抗CD27效价的动物静脉注射10微克可溶性重组CD27抗原。取小鼠脾脏，并且将分离的脾细胞用于杂交瘤制备。
杂交瘤制备：将P3x63Ag8.653鼠骨髓瘤细胞系(ATCCCRL1580)用于融合。将含有10％FBS的RPMI1640(Invitrogen)用于培养该骨髓瘤细胞。向杂交瘤生长培养基中添加另外的培养基补充物，包括：3％Origen杂交瘤克隆因子(Igen)、10％FBS(Sigma)、L-谷氨酰胺(Gibco)、0.1％庆大霉素(Gibco)、2-巯基乙醇(Gibco)、HAT(Sigma；1.0×104M次黄嘌呤，4.0×10-7M氨基蝶呤，1.6×10-5M胸苷)或HT(Sigma；1.0×10-4M次黄嘌呤，1.6×10-5M胸苷)培养基。
将脾细胞与P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以6∶1的比例混合，并通过离心沉淀。逐滴添加聚乙二醇，同时小心混合以促进融合。使杂交瘤生长1-2周，直到形成可见的集落。收集上清液，并利用人κ链特异性捕获和人Fc特异性检测通过ELISA用于初始筛选人IgG。然后通过流式细胞术或使用ELISA检测抗CD27而测定IgG阳性上清液的CD27特异性。
亚克隆并扩增产生特异性人单克隆抗体(人mAb；IgG)的杂交瘤。然后按照标准条件通过蛋白A柱层析纯化产生的人mAb，这导致分离出许多特别感兴趣的抗体，命名为4B7-1B3(本文也称为4B7)、3H12-1C8(本文也称为3H12)、1F5-1H5(本文也称为1F5)、2C2-1A10(本文也称为2C2)、2G9-1D11(本文也称为2G9)、1H8-B4(本文也称为1H8)、3H12-1E12(本文也称为3H12)、3G1-1A11(本文也称为3G1)(1B10)、4A2-B11(本文也称为4A2)、3A10-G10(本文也称为3A10)、2G11-B5(本文也称为2G11)、4H11-G11(本文也称为4H11)、2H3-E8(本文也称为2H3)、4A7-B3(本文也称为4A7)、3H8-1B11(本文也称为3H8)和1G5-1B9(本文也称为1G5)。
还筛选了杂交瘤与恒河猴CD27的交叉反应性，并且所有的都为结合阳性。
实施例2
通过表面等离子体共振(SPR)测定人mAb的亲和力和速率常数
使用BiacoreTM2000SPR仪器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)，按照厂商指导，通过BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析检查来自实施例1的各种人抗CD27抗体的结合亲和力和结合动力学。
使用Biacore提供的胺偶联试剂盒按照厂商指导(BIAcore产品号BR-1000-50，包含偶联试剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC))，使用标准胺偶联化学，将纯化的重组人CD27/TNFRSF7/Fc嵌合体(R&DSystems目录号382-CD)蛋白共价连接至BiacoreTMCM5传感器芯片上(共价连接至金表面上的羧甲基化葡聚糖；Biacore产品号BR-1000-14)。将低水平的配体固定，以限制分析物的质量转运对动力学参数的任何影响，使得观测的RMAX为约100-400RU。
通过使抗体以1.56至50nM的浓度和30μl/分钟的低流速流经在HBS-EP缓冲液(HBS-EP缓冲液，Biacore产品号BR-1001-88：4-(2-二羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)0.01M、氯化钠0.15M、乙二胺四乙酸(EDTA)3mM、表面活性剂P200.005％)的传感器芯片180秒来检测结合。监测抗原-抗体缔合和解离动力学480秒，或对于解离速率较慢的抗体为1200秒。
在每种情况下使用未固定蛋白质的空白流通池进行相应的对照，用于“背景”减除。按顺序以50μl/min注射10mMHCl10秒，然后以50μl/min注射10mM甘氨酸(pH2.0)30秒，以之用作整个研究的再生条件。
在每种情况下使用BiacoreBIAevaluation软件3.2版从在HBS-NP运行缓冲液中稀释的分析物浓度系列得出动力学参数。使用BiacoreTMBIAevaluation软件(BiacoreAB)按照厂商指导将缔合和解离曲线与1∶1Langmuir结合模型拟合。
测定的亲和力和动力学参数(背景已减除)在图1中显示。
对于每种抗体，所示的数字是两个单独实验系列的平均值，在每种情况下使用分别制备的流通池(其中ka＝缔合的速率常数，kd＝解离的速率常数，KD＝解离平衡常数(亲和力的量度)，KA＝缔合平衡常数，Rmax＝最大SPR响应信号)。
实施例3
测定人MAb的CD27结合特征的ELISA测定
将微量滴定板用PBS中的可溶性或重组人或恒河猴CD27包被，并且然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。以饱和浓度添加蛋白A纯化的人mAb和同种型对照，并于37℃孵育。用PBS/Tween洗涤板，并且然后于37℃下与偶联有碱性磷酸酶的山羊抗人IgGFc特异性多克隆试剂孵育。洗涤后，将板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并使用微量滴定板读取器在OD405-650处分析。代表性结合曲线在图2中示出。将结果还用于估计50％饱和浓度(4参数拟合曲线中的C值)，如下表1中所示。
为了确立食蟹猴是测试抗CD27mAb的相关模型，捕获各种浓度的纯化猴CD27或人CD27到具有抗Flag抗体的ELISA板，然后用抗人CD27mAb孵育。将山羊抗人IgGFc-HRP抗体和底物SuperBlueTMB用于检测。结果在表1中示出，表明猴和人中与CD27的结合相似。抗体1F5的代表性结合曲线也在图3中示出。
表1
所选抗CD27mAb的表征
**通过与ELISA格式的CD27包被板结合而估计
在进一步的实验中，为了确立与外周血细胞结合的1F5的相似分布，从3个人和3只食蟹猴的全血中分离出了PBMC。将细胞使用与标记物一起的1F5mAb染色，以描绘出表达CD27的主要T细胞和B细胞群。下表(表2)汇总了人和猴细胞关于表达CD27的细胞的百分比和表达强度(MFI)的结果的平均值±标准偏差。这些数据确定与人和猴外周血细胞结合的1F5具有相似的分布。
表2
实施例4
4A：通过ELISA分析sCD70结合的阻断
通过ELISA测量了实施例1中的人mAb对可溶性CD70(sCD70)与CD27蛋白结合的影响。将微量滴定板用1μg/ml得自R&DSystems的可溶性重组人CD27/Fc嵌合体以1μg/mL包被，然后用5％PBA封闭。将抗CD27抗体([最终]＝25μg/mL)与得自USBiologicals的可溶性人重组CD70生物素([最终]＝0.5μg/mL)预混，然后加到板中。用链霉亲和素-HRP和底物SuperBlueTMB检测了CD27捕获的rCD70。结果(显示为％阻断)在图4中示处，并指出了对照。这些结果表明，多种抗体(包括1F5、1H8、3H12和1A4)具有阻断或至少明显抑制sCD70结合的性质。
4B：CD27mAb与人淋巴母细胞系上的CD27结合并阻断配体(CD70)结合
使用BectonDickinsonFACSCantoII流式细胞仪通过流式细胞术分析了抗人CD27mAb1F5与人淋巴母细胞系的结合以及对sCD70结合的阻断。结果在图5中示处，并表明1F5有效地与多种细胞系结合并竞争性抑制sCD70的结合。
实施例5
人mAb与表达人CD27的细胞的结合
抗CD27人mAb与在其表面上表达人CD27的细胞上的CD27结合能力如下所述通过流式细胞术进行研究。
检测了抗体与在其表面上表达人D27的人细胞系的结合。将蛋白A纯化的人mAb2C2、3H8和1F5与表达人CD27的Jurkat、Raji、Ramos和Daudi以及对照细胞在4℃下孵育。所有抗体都以饱和浓度使用。1小时后，用含有0.1％BSA和0.05％NaN3(PBA)的PBS洗涤细胞，并通过细胞与PE标记的山羊抗人IgGFc特异性探针在4℃孵育来检测结合的抗体。用PBA从细胞上洗去过量的探针，并按照厂商说明通过使用LSRTM仪器(BDBiosciences，NJ，USA)的分析来确定细胞相关的荧光。
如图6和7所示，证明人mAb平与表达人CD27的细胞高水结合。这些数据证明与对照细胞相比，这些抗体有效地并特异性地与活细胞上表达的人CD27结合。
实施例6
通过ELISA确定的人mAb的交叉阻断/竞争
将微量滴定板用重组人CD27-Fc嵌合融合蛋白包被，然后用PBS中的5％BSA阻断。将未偶联的人mAb(20μg/mL)与辣根过氧化物酶标记的二抗(0.5μg/mL)混合，然后加到板中并在37℃下孵育。将板用PBS/Tween洗涤，用TMB底物显色，并使用微量滴定板读取器在OD450处进行分析。图8至10中所示的结果表明，第一组人mAb(包括mAb1F5、1H8和3H12)彼此交叉竞争(参见图8)，另一组人mAb(包括mAb2C2、3H8、1G5和2G9)也彼此交叉竞争(参见图9)，以及人mAb3A10结合独特的表位，但可结合与mAb1F5、1H8和3H12的结合位点不同但可能相近的位点，因为这些抗体能够部分地交叉阻断3A10与CD27的结合(参见图10)。
实施例7
补体依赖性细胞毒性(CDCC或CDC)
将靶细胞(淋巴瘤Raji细胞)在以下条件下培养(在AIM-V培养基中)1-2小时：37℃、5％CO2、存在抗CD27抗体和兔补体(最终稀释度1∶15)、最终体积150μl。将具有渗漏信号(仅靶细胞)和最大信号(靶细胞与12％的LysolTM，最终浓度为4％)的合适对照也包括在内。将细胞调到1×106/ml，并且向各孔中加入50μl(达到50,000个细胞/孔)。将孔重悬，并将100μl细胞悬液转移到不透明的白色板中。向这些孔的每一个中，加入100μL的PromegaCellTiterGlo试剂，并且然后将板在室温下混合2分钟。使板孵育10分钟，以稳定荧光信号。在PerkinElmerVictorX4酶标仪上记录了荧光。通过下式确定了细胞毒性：(100-((样本-最大)/(渗漏-最大)))×100。结果(示为％裂解)在图11中示出，从中可以看出，大量的抗CD27抗体显示出明显的CDCC活性。
在进一步的实验中，洗涤靶细胞(Ramos细胞)，并且再用CalceinAM(MolecularProbes)染色。然后将染色的细胞再次洗涤，并重悬在培养基(RPMI+10％FBS)中达到1×106/ml。在以下条件下培养靶细胞2小时：37℃、5％CO2、存在抗CD27抗体和兔补体(最终稀释度1∶15)、最终体积150μl。将具有渗漏信号(仅靶细胞)和最大信号(靶细胞与20％的TritonX-100，最终浓度为2％)的合适对照也包括在内。孵育后，将孔中的75μl上清液转移到不透明的黑色板中。在PerkinElmerVictorX4酶标仪上记录了荧光(激发波长485；发射波长535)。使用下式确定特异性细胞毒性：(实验-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)×100。图12中所示的结果表明，抗CD27mAb(1F5)在3μg/ml的抗体浓度下在Ramos细胞中表现出至少10％的CDC活性。
实施例8
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
洗涤靶细胞(淋巴瘤Raji细胞)，并且然后用BATDA试剂(PerkinElmer)染色。然后将染色的细胞再次洗涤，并重悬在培养基(RPMI+10％FBS)中达到2×105/ml。制备效应细胞，并在培养基中调节到合适的浓度，得到所需的效应细胞∶靶细胞比率(100∶1-50∶1)。在圆底板中，加入靶细胞、效应细胞和抗体，达到150μl的最终体积。使用了合适的对照，包括渗漏信号(仅靶细胞)、自发裂解信号(靶细胞+效应细胞)和最大裂解信号(靶细胞+12％的LysolTM洗涤剂，最终浓度为4％)。将细胞在板中离心沉淀，并在37℃下、5％CO2孵育2小时。孵育后，将孔中的20μl上清液转移到不透明的白色板中。向这些孔的每一个中，加入200μlEuropium溶液，并且然后将板混合15分钟。在PerkinElmerVictorX4酶标仪上记录了时间分辨荧光。使用下式确定了特异性细胞毒性：(实验-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)×100。结果在图13中示出(示为％裂解)，从中可以看出大量抗CD27抗体显示出了明显的ADCC活性。
在进一步的实验中，洗涤靶细胞(淋巴瘤Ramos和Daudi细胞)，并用CalceinAM(MolecularProbes)染色。然后将染色的细胞再次洗涤，并重悬在培养基(RPMI+10％FBS)中达到1×105/ml。制备效应细胞，并在培养基中调节到合适的浓度，得到所需的效应细胞∶靶细胞比率(75∶1)。在圆底板中，加入靶细胞、效应细胞和抗体，达到150μl的最终体积。使用了合适的对照，包括渗漏信号(仅靶细胞)、自发裂解信号(靶细胞+效应细胞)和最大裂解信号(靶细胞+20％的TritonX-100洗涤剂，最终浓度为2％)。将细胞在板中离心沉淀，并在37℃下、5％CO2孵育4小时。孵育后，将孔中的75μl上清液转移到不透明的黑色板中。在PerkinElmerVictorX4酶标仪上记录了荧光(激发波长485；发射波长535)。使用下式确定了特异性细胞毒性：(实验-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)×100。图14中所示的结果表明，抗CD27mAb(1F5)在3μg/ml的抗体浓度以及75∶1的效应细胞∶靶细胞比率下在Daudi和Ramos细胞中表现出至少10％的ADCC活性(以特异性细胞毒性度量)。
实施例9
抗体测序
如以上实施例1所述，将来自产生特异性人mAbIgG的杂交瘤的人mAb通过蛋白A柱层析法进行纯化，导致分离出一组特别感兴趣的抗体(人mAb)。将人mAb4B7、3H12、1F5、2C2、2G9、1H8、3H12、3G1(1B10)4A2、3A10、2G11、4H11、2H3、4A7、3H8和1G5的VH和VL编码区使用来自相应杂交瘤的RNA进行鉴定。将RNA逆转录为cDNA，通过PCR扩增V编码区，并对PCR产物进行测序。以下是人mAb的VH和VL区的核酸和氨基酸序列(就氨基酸序列而言，互补决定区(CDR)以下划线标出)。
3H8VH(VH3-7；D7-27；JH2)
VH核酸序列(SEQIDNO：5)
atggagttggggctgagctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttattggatggcctgggtccgccaggctccagggaaagggctggagtggctgggcaatataaagcaagatggaagtgagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctacaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgtgagggaactggggatggactggtacttcgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：6)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMAWVRQAPGKGLEWLGNIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRELGMDWYFDLWGRGTLVTVSS
VH“成熟”氨基酸序列(SEQIDNO：7)，不包括信号肽：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMAWVRQAPGKGLEWLGNIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRELGMDWYFDLWGRGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：8)：GFTFSSYW
VHCDR2(SEQIDNO：9)：IKQDGSEK
VHCDR3(SEQIDNO：10)：VRELGMDWYFDL
3H8VK#2(VK3-11；JK1)
VL核酸序列(SEQIDNO：11)
Atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttgacagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcaacctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：12)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：13)，不包括信号肽：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：14)：QSVDSY
VLCDR2(SEQIDNO：15)：DAS
VLCDR3(SEQIDNO：16)：QQRSNWPPT
3H8VK#3(VK3-11；JK1)
还发现了另外的轻链也具有活性，具体如下(但是只将上面的轻链(3H8-1B11VK#2)用于上述实施例)：
VL核酸序列(SEQIDNO：17)
Atggaagccccagctcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccaccggagaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagcgtagcaactggcctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：18)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：19)，不包括信号肽：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：20)：QSVSSY
VLCDR2(SEQIDNO：21)：DAS
VLCDR3(SEQIDNO：22)：QQRSNWPPT
2C2VH(VH3-33；D1-7；JH4)
V H 核酸序列(SEQIDNO：23)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgcgactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatgacatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccacgaactcgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattattgtgtgggaggaactgctgaccttgaacactgggaccagggaaccctggtcaccgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：24)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSTNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCVGGTADLEHWDQGTLVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：25)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSTNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCVGGTADLEHWDQGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：26)：GFTFSSYD
VHCDR2(SEQIDNO：27)：IWNDGSNK
VHCDR3(SEQIDNO：28)：VGGTADLEHWDQ
2C2VK(VK1D-16；JK4)
VL核酸序列(SEQIDNO：29)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：30)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：31)，不包括信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：32)：QGISSW
VLCDR2(SEQIDNO：33)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：34)：QQYNSYPLT
1F5VH(VH3-33；D7-27；JH4)
VH核酸序列(SEQIDNO：35)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagttatgacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctccaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggtagtggtaactggggtttctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：36)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWGQGTLVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：37)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWGQGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：38)：GFTFSSYD
VHCDR2(SEQIDNO：39)：IWYDGSNK
VHCDR3(SEQIDNO：40)：ARGSGNWGFFDY
1F5VK#2(VK1D-16；JK1)
VL核酸序列(SEQIDNO：41)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcaggtggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatacttaccctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：42)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPRTFGQGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：43)，不包括信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPRTFGQGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：44)：QGISRW
VLCDR2(SEQIDNO：45)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：46)：QQYNTYPRT
1H8VH(VH3-33；D7-27；JH4)
VH核酸序列(SEQIDNO：47)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcaatatctatgacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaatcaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacattttgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggtactcactgggggtactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：48)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFNIYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNILRAEDTAVYYCARGTHWGYFDYWGQGTLVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：49)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFNIYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNILRAEDTAVYYCARGTHWGYFDYWGQGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：50)：GFTFNIYD
VHCDR2(SEQIDNO：51)：IWYDGSNQ
VHCDR3(SEQIDNO：52)：ARGTHWGYFDY
1H8VK(VK1D-16；JK1)
VL核酸序列(SEQIDNO：53)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccaatttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：54)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPRTFGQGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：55)，不包括信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPRTFGQGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：56)：QGISSW
VLCDR2(SEQIDNO：57)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：58)：QQYNSYPRT
1G5VH(VH3-33；D6-19；JH2)
VH核酸序列(SEQIDNO：59)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcaactggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcagcttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggactggagtgggtggcacttctatggtatgatggtagccataaagactttgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctagatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagagggtttagcagtacctggtcactggtacttcgatctctggggccgtggcaccctggtcactgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：60)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALLWYDGSHKDFADSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRAEDTAVYYCAREGLAVPGHWYFDLWGRGTLVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：61)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVALLWYDGSHKDFADSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRAEDTAVYYCAREGLAVPGHWYFDLWGRGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：62)：GFSFSSYG
VHCDR2(SEQIDNO：63)：LWYDGSHK
VHCDR3(SEQIDNO：64)：AREGLAVPGHWYFDL
1G5VK(VK1-13；JK1)
VL核酸序列(SEQIDNO：65)
Atgagggtccccgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctatgatgcctccagtttggaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagtttaatacttaccctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：66)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNTYPRTFGQGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：67)，不包括信号肽：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNTYPRTFGQGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：68)：QGISSA
VLCDR2(SEQIDNO：69)：DAS
VLCDR3(SEQIDNO：70)：QQFNTYPRT
2G9VH(VH3-33；D1-7；JH4)
VH核酸序列(SEQIDNO：71)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagttggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgcgactctcctgtgcagcgtctggattcaccctcagtagccatgacatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccacgaactcgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattattgtgtgagaggaactgctgaccttgaacactgggaccagggaaccctggtcaccgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：72)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTLSSHDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSTNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCVRGTADLEHWDQGTLVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：73)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTLSSHDIHWVRQAPGKGLEWVAVIWNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSTNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCVRGTADLEHWDQGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：74)：GFTLSSHD
VHCDR2(SEQIDNO：75)：IWNDGSNK
VHCDR3(SEQIDNO：76)：VRGTADLEHWDQ
2G9VK(VK1D-16；JK4)
VL核酸序列(SEQIDNO：77)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：78)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：79)，不包括信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：80)：QGISSW
VLCDR2(SEQIDNO：81)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：82)：QQYNSYPLT
3A10VH(VH3-33；D3-10；JH3)
VH核酸序列(SEQIDNO：83)
Atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtcattatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggccggagtgggtggcaattatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctggatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatggatggactactatggttcggggacttaatgtttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：84)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSHYGMHWVRQAPGKGPEWVAIIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRAEDTAVYYCARDGWTTMVRGLNVFDIWGQGTMVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：85)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSHYGMHWVRQAPGKGPEWVAIIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRAEDTAVYYCARDGWTTMVRGLNVFDIWGQGTMVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：86)：GFTFSHYG
VHCDR2(SEQIDNO：87)：IWYDGSNK
VHCDR3(SEQIDNO：88)：ARDGWTTMVRGLNVFDI
3A10VK#1(VK1D-16；JK5)
VL核酸序列(SEQIDNO：89)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcaggatattagcagctggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctcccaccttcggccaagggacacgactggagattaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：9O)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGQGTRLEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：91)，不包括信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGQGTRLEIK
VLCDR1(SEQIDNO：92)：QDISSW
VLCDR2(SEQIDNO：93)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：94)：QQYNSYPPT
3A10VK#4(VK1-13；JK5)
还发现了另外的轻链也具有活性，具体如下(但是只将上面的轻链(3H8-1B11VK#1)用于上述实施例)：
VL核酸序列(SEQIDNO：95)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggcttctgctgctctggctcccaggtgccagatgtgccatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattagcagtgctttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatagttaccctcccaccttcggccaagggacacgactggagattaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：96)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGQGTRLEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：97)，不包括信号肽：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGQGTRLEIK
VLCDR1(SEQIDNO：98)：QGISSA
VLCDR2(SEQIDNO：99)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：100)：QQYNSYPPT
3H12VH(VH3-33；D7-27；JH4)
VH核酸序列(SEQIDNO：101)
atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcaacgtctggattcaccttcagtagctatgacatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatttggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctccaaatgaacagcctgggagacgaggacacggctgtgtattactgtgcgagaggtagtggtaactggggtttctttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
VH氨基酸序列(SEQIDNO：102)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLGDEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWGQGTLVTVSS
VH氨基酸序列(SEQIDNO：103)，不包括信号肽：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLGDEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWGQGTLVTVSS
VHCDR1(SEQIDNO：104)：GFTFSSYD
VHCDR2(SEQIDNO：105)：IWYDGSNK
VHCDR3(SEQIDNO：106)：ARGSGNWGFFDY
3H12VK#2(VK1D-16；JK1)
VL核酸序列(SEQIDNO：107)
Atgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtgccagatgtgacatccagatgacccagtctccatcctcactgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggtattagcaggtggttagcctggtatcagcagaaaccagagaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtataatacttaccctcggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa
VL氨基酸序列(SEQIDNO：108)(包括信号肽，以带下划线的斜体示出)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPRTFGQGTKVEIK
VL氨基酸序列(SEQIDNO：109)，不包括信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPRTFGQGTKVEIK
VLCDR1(SEQIDNO：110)：QGISRW
VLCDR2(SEQIDNO：111)：AAS
VLCDR3(SEQIDNO：112)：QQYNTYPRT
比对示于图15和16中
实施例10
体内非人灵长类研究
为了评价抗人CD27mAb1F5在非人灵长类中的耐受性，以1、3或10mg/kg1F5的单剂量静注处理3只食蟹猴。观察动物29天。将总淋巴细胞(基于前向散射和侧向散射大小)、记忆B细胞(CD20+和CD95明亮)和单核细胞(基于前向散射和侧向散射大小)用抗人IgG抗体染色(粗线)，并与未染色的对照(阴影柱状图)进行比较。结果在图17中示出。这些结果表明，在整个研究期间，1F5mAb与已知表达CD27的循环淋巴细胞的表面结合。单核细胞是不表达CD27的细胞，其未结合1F5。
此外，为了确定1F5对循环淋巴细胞群的影响，将淋巴细胞用子集标记物(subsetmarker)染色，并在图17中对用不同剂量(方形点＝1mg/kg；圆形点＝3mg/kg；三角形点＝10mg/kg)处理的各动物相对于时间绘制出了％阳性细胞。结果在图18中示出。
综合而言，在图17和18中示出的这些研究的结果表明，在1-10mg/kg的单剂量后，1F5耐受良好，并未明显去除循环淋巴细胞(但在一定程度上短暂去除NK细胞)。此外，无体温升高，以及无可检测水平的TNF-α、IL-6或IL-1β。
实施例11
抗CD27mAb增强了抗原特异性CD8+T细胞增殖和小鼠外周血细胞和脾细胞的活化五聚体染色
将人CD27转基因小鼠(huCD27-Tg)静脉内注射5mg鸡卵清蛋白以及一组在实施例1中生成的识别人CD27的全人抗体(CD27人mAb)。将大鼠抗小鼠CD27克隆AT124和不相关的人IgG1包括在内分别用作阳性和阴性对照。将各抗体(250μg)在第0天与卵清蛋白共同注射，并且在第1天再单独注射250μg抗体。在第7天收获外周血细胞和脾细胞。将脾细胞(1×106)或全血(100μl)用于染色。在Fc受体阻断后，将细胞用10μlH-2Kb/SIINFEKL(SEQIDNO：119)(与卵清蛋白中的肽T细胞表位复合的小鼠MHC的四聚体复合物(BeckmanCoulter))或相似的五聚体复合物(BeckmanCoulter)、抗CD8(eBioscience)以及抗huCD27mAb或抗msCD27mAb(BDBiosciences)在室温下染色30分钟。然后将细胞进行红细胞裂解、洗涤和固定，并且在流式细胞仪LSR(BDBiosciences)中采集了至少100,000个事件。确定了CD8+或CD27+圈选细胞群中四聚体或五聚体阳性细胞的比率。结果在图19和21中示出，从中可以看出抗CD27抗体明显增强了免疫应答。
实施例12
ELISPOT测定
将得自上面实施例8的五聚体染色制品中的脾细胞(2.5×105和0.5×105)在RBC裂解后一式三份地置于抗IFNγ单克隆抗体(mAb)包被的板的孔中。将SIINFEKL(SEQIDNO：119)肽以2μg/ml的最终浓度加入。在不存在肽的情况下，一式三份地设置每个样本的背景对照。在37℃的组织培养箱中将刺激维持过夜。使用ELISPOT试剂盒(BDBiosciences)根据厂商方案进行了ELISPOT检测。对IFNγ斑点数计数。结果在图20和21中示出，从中可以看出抗CD27mAb明显增强了T细胞活性。
实施例13
抗CD27mAb增强T细胞对疫苗抗原的应答
将HuCD27转基因小鼠用与各种剂量(25、50、100、200或400μg)的抗CD27人mAb1F5(腹腔注射)相结合的5μg(皮下注射)靶向APC的疫苗免疫，该疫苗包含与卵清蛋白(OVA)融合的抗小鼠DEC-205IgG抗体(称为α-mDEC-205-OVA)。一周后，分析脾细胞的CD8+T细胞与OVASIINFEKL肽(OVA肽257-264)的反应性，方式是分别通过大致如实施例8和9中所述的程序通过四聚体染色(所有所示CD8+的％四聚体阳性)和IFN-γELISPOT进行。结果在图22A-C中示出，其中图22A示出了所用的方案，图22B示出了四聚体染色实验的结果，并且图22C示出了IFN-γELISPOT实验的结果。这些结果表明，共同施用人mAb1F5明显增强了T细胞对所施用的疫苗组分的应答。
实施例14
抗CD27mAb(1F5)和TLR激动剂(PolyIC)对T细胞对疫苗(抗DEC205-OVA)的应答的协同效应
将huCD27-Tg(转基因)和野生型(WT)同窝小鼠在第-3天经腹膜内注射抗CD27mAb1F5(50μg)，并且然后在第0天通过四只爪子皮下注射抗mDec205-OVA(5μg)+PolyIC0、25、50或100μg。在第7天采集脾脏，并通过四聚体染色、IFNγ-ELISPOT和IFNγ-ICS进行评价。计算了每组3只小鼠中圈选CD8T细胞中阳性IFNγ-ICS的平均值±SD，并且采集了一组代表性的点图。图23A-D中所示的结果表明，抗CD27人mAb与TLR3激动剂PolyIC协同作用以增强T细胞对所施用的疫苗组分的应答。
实施例15
在不存在或存在TLR激动剂的情况下在靶向Dec205的疫苗前施用抗CD27mAb
将huCD27-Tg小鼠和野生型(WT)同窝小鼠在与疫苗相关的各天经腹膜内注射抗CD27mAb(50μg)，如图28所示，并且然后在第0天通过四只爪子皮下注射抗mDec205-OVA(5μg)+或-TLR激动剂PolyIC-LC(20μg)。在第7天采集脾脏，并且通过四聚体染色和IFNγ-ELISPOT进行评价。在图24和25中示出了圈选CD8T细胞中一组代表性的四聚体染色。IFNγ-ELISPOT示出了类似的模式。
这些结果表明，令人惊讶的是，当将抗CD27抗体在存在或不存在TLR激动剂的情况下与疫苗相结合施用时，T细胞活化大于在疫苗前施用抗体的情况，例如在施用疫苗(抗原)前一天或多天的情况。
实施例16
与TCR活化相结合的抗CD27mAb活化人CD27转基因小鼠中的T细胞
为了评价1F5mAb的T细胞活化能力，通过微珠阴性选择从hCD27-Tg小鼠的脾脏中纯化T细胞。将细胞用CFSE标记，并且用0.2μg/ml的抗CD27人mAb1F5或同种型对照孵育3天。将交联的抗人IgG在使用前通过除内毒素柱。在CD8和CD4T细胞中的IFNγ-ICS和CSFE稀释度在图26和27中示出。TNFa-ICS显示出与IFNg相同的模式。如图26和27中所示，当与TCR活化相结合时，1F5mAb在体外有效诱导增殖和T细胞中的细胞因子产生。数据表明，与抗人IgG的交联以及抗CD3mAb对T细胞受体的活化这两者都为1F5诱导的增殖和细胞因子产生所必需。
实施例17
抗CD27mAb增强MO4黑素瘤激发模型中疫苗的疗效
为了评价体内抗肿瘤活性，在第0天将huCD27-Tg和WT对照(每组8只小鼠)皮下接种0.3×105个MO4细胞。在第5和12天，将这些小鼠腹膜内注射抗CD27mAb1F5(50μg)；在第8和15天，注射另外剂量的CD27HuMab(50μg)，并用抗mDec205-OVA(5μg)接种疫苗。每周2次用游标卡尺测量肿瘤生长。结果在图24中示出。
在进一步的研究中，在第0天将huCD27-Tg和WT对照(每组5只小鼠)皮下接种1×105个MO4细胞。在第5和12天，将这些小鼠通过腹膜内接种抗mDec205-OVA(5μg)+TLR激动剂PolyIC-LC(10μg)。在第6和13天，将小鼠注射抗CD27mAb1F5(50μg)。每周2次用游标卡尺测量肿瘤生长，如图285A中所述的方案所示。图28B、C和D中所示的结果显示了，随肿瘤接种后的天数而变化的无处理(图28B)、仅疫苗处理(图28C)或与抗CD27处理相结合的疫苗处理(图28D)对小鼠肿瘤大小的影响。结果表明，与抗CD27mAb(1F5)的组合治疗明显延长了肿瘤激发小鼠的生存期。
实施例18
1F5在BCL1B淋巴瘤的同系转基因小鼠肿瘤激发模型中表现出强大的抗肿瘤活性
为了评价1F5的体内抗肿瘤活性，将分组的9-10只hCD27转基因小鼠(Balb/c背景)在第0天用静脉内施用的107BCL1B淋巴瘤细胞激发。然后将动物如所示用5个剂量的抗人CD27mAb1F5处理。如图29A和29B中所示，以剂量依赖性方式明显延长了肿瘤激发小鼠的生存期。
实施例19
Raji异种移植SCID小鼠模型中的肿瘤杀伤
将CB.17SCID小鼠(购自Taconic)维持在无病原体的小鼠笼中。将淋巴瘤Raji细胞(1×105)皮下注射进SCID小鼠(每组4只小鼠)。在第6天，将这些小鼠用CD27人mAb通过腹膜内施用进行处理，每剂0.5mg，并且每周两次，持续3周。每周3次用游标卡尺测量肿瘤生长。肿瘤生长和Kaplan-Meier分析的结果在图30A和30B中示出，从中可以看出抗CD27mAb明显延长了肿瘤激发小鼠的生存期。
在进一步的实验中，将CB.17SCID小鼠(购自Taconic)维持在无病原体的小鼠笼中。在第0天将人淋巴瘤Raji细胞(5×105)皮下注射进SCID小鼠(每组6只小鼠)。在第5天，将这些小鼠用抗CD27mAb1F5通过腹膜内施用进行处理，每剂0.033、0.1或0.3mg，并且每周两次，持续3周。每周2次用游标卡尺测量肿瘤生长。
图31A中所示的结果表明，抗CD27mAb(1F5)明显抑制了肿瘤生长，并因而明显延长了肿瘤激发小鼠的生存期。还在图31B中提供了数据的Kaplan-Meier生存曲线图，其表明处理组的小鼠与对照组相比中位生存期延长了至少10天。用1G5进行了进一步的异种移植实验，并将结果在图32中示出。
实施例20
Daudi异种移植SCID小鼠模型中的肿瘤杀伤
将CB.17SCID小鼠(购自Taconic)维持在无病原体的小鼠笼中。在第0天将人淋巴瘤Daudi细胞(1×106)皮下注射进SCID小鼠(每组6只小鼠)。在第5天，将这些小鼠用抗CD27人mAb1F5通过腹膜内注射进行处理，每剂0.033、O.1或0.3mg，并且每周两次，持续3周。每周2次用游标卡尺测量肿瘤生长。
图33中所示的结果表明，抗CD27mAb(1F5)明显抑制了肿瘤生长(图33A)，并因而明显延长了肿瘤激发小鼠的生存期(图33B中的Kaplan-Meier曲线图)。
实施例21
经工程化处理不结合Fc受体的抗CD27mAb不会增强T细胞对疫苗抗原的应答
将HuCD27转基因小鼠使用与抗CD27人mAb1F5(腹腔注射)或mAb1F5突变体(Fc部分突变以防止Fc受体结合)或对照IgGmAb相结合的5μg(皮下注射)靶向APC的疫苗免疫，该疫苗包含与卵清蛋白(OVA)融合的抗小鼠DEC-205IgG抗体(称为α-mDEC-205-OVA)。一周后，分析脾细胞的CD8+T细胞与OVASIINFEKL(SEQIDNO：119)肽(OVA肽257-264)的反应性，方式是通过大致如上所述的程序通过IFN-γELISPOT进行。
图34中所示的结果表明，改变的人mAb1F5不会增强T细胞对疫苗的应答，并且因而将是阻断CD70/CD27途径的有效药剂。
等同方案
本领域技术人员只使用常规实验方法就可认识到或能够确定本文所述的本发明特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在由以下权利要求所涵盖。
序列表汇总
SEQ ID NO： 说明
1 人CD27(GenBank登录号：AAH12160.1)
2 人CD70(GenBank登录号：NP_001243)

Claims (13)

1.一种与人CD27结合的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含：
由SEQIDNO:38所示的氨基酸序列组成的重链可变区CDR1；
由SEQIDNO:39所示的氨基酸序列组成的重链可变区CDR2；
由SEQIDNO:40所示的氨基酸序列组成的重链可变区CDR3；
由SEQIDNO:44所示的氨基酸序列组成的轻链可变区CDR1；
由SEQIDNO:45所示的氨基酸序列组成的轻链可变区CDR2；和
由SEQIDNO:46所示的氨基酸序列组成的轻链可变区CDR3。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含如SEQIDNO:37和43所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别由SEQIDNO:35和41所示的核酸序列编码。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体选自:
(i)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体组成的组；和/或
(ii)人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
5.一种表达载体，其包含编码根据权利要求1-4中任一项所述的抗体的轻链和/或重链可变区的核苷酸序列。
6.一种细胞，其用根据权利要求5所述的表达载体转化。
7.一种组合物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的抗体。
8.根据权利要求7所述的组合物，还包含
(i)佐剂和/或免疫刺激剂，任选地其中所述免疫刺激剂选自由下列组成的组：CD40配体、FLT3配体、细胞因子、集落刺激因子、抗CTLA-4抗体、LPS(内毒素)、ssRNA、dsRNA、卡介苗(BCG)、盐酸左旋咪唑、静脉内免疫球蛋白和Toll样受体(TLR)激动剂；或
(ii)免疫抑制剂、另一种抗体和/或抗原，任选地其中所述抗原包含病原体组分、肿瘤抗原、过敏原或自身抗原。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述Toll样受体激动剂选自由下列组成的组：TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述肿瘤抗原选自由下列组成的组：βhCG、gp100或Pmel17、HER2/neu、WT1、间皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、独特型、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪氨酸酶、端粒酶、SSX2抗原、MUC-1抗原和生殖细胞源性肿瘤抗原。
11.权利要求1-4中任一项所述的抗体在制备用于以下应用的药物中的用途：
(i)诱导或增强受试者中对抗原的免疫应答；
(ii)抑制CD27表达细胞的生长；
(iii)抑制患病受试者中细胞上CD70与CD27的结合；或
(iv)下调患病个体中的T细胞应答。
12.根据权利要求1-4任一项所述的抗体在制备用于治疗表达CD27的肿瘤的药物中的用途。
13.一种检测生物样本中CD27存在与否的方法，包括：
(a)使生物样本与根据权利要求1-4中任一项所述的抗体接触，其中将所述抗体用可检测的物质标记；和
(b)检测与CD27结合的所述抗体，从而检测所述生物样本中CD27的存在与否。
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