CN107921106B - Wt1抗原肽和免疫调节剂的组合用途 - Google Patents

Wt1抗原肽和免疫调节剂的组合用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂的组合，以用于治疗或预防癌症。

Description

WT1抗原肽和免疫调节剂的组合用途
技术领域
本发明涉及WT1抗原肽和免疫调节剂的组合用途。
背景技术
细胞免疫，特别是参与其中的细胞毒性T细胞(下文称为CTL)，在活体中发挥重要作用以去除肿瘤细胞或病毒感染的细胞。通过识别肿瘤细胞上的抗原肽(肿瘤抗原肽)和MHC(主要组织相容性复合体)I类分子之间的复合物的前体T细胞的分化和增殖来产生CTL。CTL攻击癌细胞。
人类中的MHC被称为人类白细胞型抗原(HLA)，并且HLA亚型诸如HLA-A、B和Cw是已知的。当细胞内产生的肿瘤抗原蛋白被蛋白酶降解时，肿瘤抗原肽从肿瘤抗原蛋白细胞内产生，所述肿瘤抗原蛋白是在肿瘤中高度表达的蛋白。由此产生的肿瘤抗原肽在内质网中与MHC I类抗原形成复合物，并将复合物递送至细胞表面并呈递在细胞表面上。肿瘤反应性CTL识别细胞表面上呈递的肿瘤抗原肽(杀伤肽)，并通过细胞毒性活性或淋巴因子的产生来显示抗肿瘤作用。
肿瘤抗原蛋白或由其衍生的杀伤肽已经被认为是癌症免疫疗法(诸如癌症疫苗)的有效成分，以通过增强癌症患者体内的癌症特异性CTL来治疗癌症。例如，WT1(Wilm's肿瘤1)靶向的癌症免疫疗法正在开发中。WT1已被鉴定为Wilms肿瘤(儿童中的肾癌)的负责基因，并且编码具有锌指基序的转录因子(非专利文献1)。WT1基因最初被认为是肿瘤抑制基因，但后来通过后续研究，鉴定为造血肿瘤或实体癌中的癌症基因。WT1基因被报道为在各种恶性肿瘤中高度表达(非专利文献2)。WT1被认为是白血病或实体癌中的新型癌症抗原蛋白(非专利文献3)。因此，正在开发使用WT1蛋白或WT1衍生的肽的癌症疫苗疗法或树突细胞疗法，识别WT1衍生的肽和HLA分子之间的复合物的TCR样抗体，或使用表达衍生自TCR样抗体的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程改造的T细胞的CART-细胞疗法。
对于WT1蛋白，报道了MHC I类结合杀伤肽诸如WT1126-134肽、WT1235-243肽、WT110-18肽、WT1187-195肽、WT1302-310肽和WT137-45肽(专利文献1、专利文献2、非专利文献4和5)。
除了CTL以外，辅助T(Th1)细胞在癌症免疫疗法中也发挥重要作用。典型地，抗原蛋白在溶酶体中细胞内降解以提供肽片段，并且具有约13-17个氨基酸的肽片段的部分作为抗原肽(辅助肽)结合MHC II类分子。抗原肽和MHC II类分子之间的复合物被呈递至TCR-CD3复合物以活化Th1细胞。活化的Th1细胞促进CTL的诱导和活化。人类MHC II类分子诸如HLA-DR、DQ和DP是已知的，并且WT1衍生的辅助肽已被鉴定(非专利文献6和7)。
已经报道，免疫调节系统涉及刺激信号，所述刺激信号与彼此相互作用以诱导免疫抑制或耐受。通过抗原呈递细胞的T细胞活化使用免疫调节系统，并且与抗原呈递细胞或T细胞表面上的共刺激分子相互作用的试剂已被报道调节共刺激信号(非专利文献8)。
作为实例，在一些情况下，甚至当CTL存在于肿瘤中时，也没有观察到肿瘤缩小。一种可能的原因是肿瘤浸润性CTL在早期耗尽，并且失去针对肿瘤细胞的细胞毒性活性，多种细胞因子的产生能力和增殖活性，并且导致细胞死亡。耗尽已经被鉴定为由来自在CTL的细胞表面上表达的免疫检查点分子的负信号诱导。
已经报道了免疫检查点分子诸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、KIR、TIM-3、B7-H3、B7-H4、VISTA/PD-1H、HVEM、BTLA、CD160、GAL9、TIGIT、PVR、BTNL2、BTN1A1、BTN2A2、BTN3A2和CD244(非专利文献8和9)。例如，PD-1是在活化的淋巴细胞(T细胞、B细胞、NKT细胞)和骨髓细胞上表达的CD28受体家族的成员，并且与抗原呈递细胞上表达的PD-1配体(PD-L1或PD-L2)结合，以通过向淋巴细胞递送抑制信号来负调节活化的淋巴细胞。除了抗原呈递细胞以外，已经报道了PD-L1在各种肿瘤组织中表达。因此，癌细胞使用PD-L1来逃避CTL的攻击。
在该情况下，最近已经开发了针对免疫检查点分子的抑制性抗体(非专利文献9和10)。这些抗体解除了CTL的耗尽。例如，抗PD-1抗体或抗-PD-L1抗体抑制PD-1和PD-L1之间的结合并恢复CTL的细胞毒性活性。实际上，已经在患者诸如患有非小细胞肺癌或黑色素瘤的患者中进行了抗PD-1或抗PD-L1抗体的临床试验，并且已经观察到显著的效果。然而，PD-1或PD-L1抗体疗法远不能令人满意，因为显示显著反应的患者是总患者的20-30％，并且还观察到严重的免疫相关不良事件。
引文列表
专利文件
专利文献1：WO00/06602
专利文献2：WO00/18795
非专利文件
非专利文献1:Am J Hum Genet.1993；52:192-203
非专利文献2:Blood.1997；89:1405-1412
非专利文献3:Immunogenetics.2000；51:99-107
非专利文献4:Clin Cancer Res.2005；11:8799-807
非专利文献5:Blood.2008Oct 1；112(7):2956-64
非专利文献6:J Immunother.2007；30:282-93
非专利文献7:Cancer Immunol Immunother.2010；59:1467-79
非专利文献8:Nat Rev Cancer.2012；12:252-64
非专利文献9:Nat Rev Drug Discov.2015Aug；14(8):561-8
非专利文献10:Nat Rev Drug Discov.2013Feb；12(2):130-46。
发明内容
本发明的一个目的是提供使用WT1抗原肽和免疫调节剂，用于治疗或预防癌症的方法和药物组合物。
抗PD-1或抗PD-L1抗体没有显示足够效果的一个原因可能是肿瘤中的CTL水平低，或者存在除了PD-1/PD-L1以外的强免疫抑制机制。因此，已经设想与癌症疫苗或PD-1和PD-L1以外的免疫检查点分子的抑制剂的组合。本发明人已经检查了增加肿瘤中的肿瘤反应性CTL的癌症疫苗与免疫检查点抑制剂或其他免疫调节剂之间的组合。通过使用小鼠的深入研究，本发明人已经证明，WT1抗原肽的施用诱导CD8+T细胞，特别是WT1特异性杀伤T细胞和CD4+T细胞中的免疫检查点分子的表达；并且诱导的WT1特异性杀伤T细胞的活化被免疫调节剂诸如免疫检查点抑制剂增强。此外，通过使用人外周血单核细胞的深入研究，本发明人已经证明，当WT1抗原肽与免疫调节剂组合时，从初始T细胞有效诱导WT1特异性杀伤T细胞；并且用WT1抗原肽诱导的WT1特异性杀伤T细胞的活化被免疫调节剂增强。本发明人已经进一步尝试改善组合的效果，并且最终证明使用包含WT1杀伤肽和WT1辅助肽两者组合的癌症疫苗诱导不被癌细胞抑制的CTL，并因此显著改善与免疫调节剂的组合的效果。
因此，本发明提供以下内容。
1.用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含WT1抗原肽或其药学上可接受的盐，其中所述药物组合物与免疫调节剂组合使用。
2.用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含免疫调节剂，其中所述药物组合物与WT1抗原肽或其药学上可接受的盐组合使用。
3.用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包含WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂。
4.根据项目1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述WT1抗原肽是WT1杀伤肽。
5.根据项目4所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL(SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL(SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL(SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV(SEQ ID NO:6)，
RVPGVAPTL(SEQ ID NO:7)，
VLDFAPPGA(SEQ ID NO:8)，
C-CMTWNQMNL(SEQ ID NO:9)(其中C-C内的键是二硫键)，
C-CYTWNQMNL(SEQ ID NO:10)(其中C-C内的键是二硫键)，
RYFPNAPYL(SEQ ID NO:21)，和
YMFPNAPYL(SEQ ID NO:26)；
包含选自SEQ ID NO:2-10、21和26的氨基酸序列的改变的氨基酸序列且具有CTL诱导活性的肽，其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的一至几个氨基酸的缺失、取代和/或添加；或
选自以下的化合物：
式(1)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)，
式(2)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)，和
式(3)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)；
或其药学上可接受的盐。
6.根据项目5所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL(SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL(SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL(SEQ ID NO:5)，
C-CYTWNQMNL(SEQ ID NO:10)，和
YMFPNAPYL(SEQ ID NO:26)；或
式(3)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)；
或其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含WT1辅助肽或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物与WT1辅助肽或其药学上可接受的盐组合使用。
9.根据权利要求7或8所述的药物组合物，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽，或其药学上可接受的盐：
KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:12)，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL(SEQ ID NO:13)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:14)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:15)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:16)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:17)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:19)，
WAPVLDFAPPGASAYGSLC(SEQ ID NO:20)，和
SGQAYMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:37)；或
包含选自SEQ ID NO:11-20的氨基酸序列的改变的氨基酸序列且具有辅助T细胞诱导活性的肽，其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的一至几个氨基酸的缺失、取代或添加。
10.根据项目9所述的药物组合物，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽，或其药学上可接受的盐：
KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:14)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:18)，和
SGQAYMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:37)。
11.根据项目10所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)或其药学上可接受的盐，且所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)或其药学上可接受的盐。
12.根据项目10所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)或其药学上可接受的盐，且所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:14)或其药学上可接受的盐。
13.根据项目10所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是ALLPAVPSL(SEQ ID NO:5)或其药学上可接受的盐，且所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)或其药学上可接受的盐。
14.根据项目10所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是YMFPNAPYL(SEQ ID NO:26)或其药学上可接受的盐，且所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是SGQAYMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:37)或其药学上可接受的盐。
15.根据项目10所述的药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是式(3)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)，或其药学上可接受的盐，且所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:18)或其药学上可接受的盐。
16.根据项目1-15中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物用作癌症疫苗。
17.根据项目1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是至少一种选自以下的药剂：
(1)免疫检查点抑制剂，
(2)共刺激分子激动剂，
(3)免疫活化剂，和
(4)低分子抑制剂。
18.根据项目17所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是抗体、核酸分子、蛋白、肽或低分子化合物。
19.根据项目17或18所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
20.根据项目19所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是至少一种针对选自以下的分子的药剂：
(1)CTLA-4，
(2)PD-1，
(3)LAG-3，
(4)BTLA，
(5)KIR，
(6)TIM-3，
(7)PD-L1，
(8)PD-L2，
(9)B7-H3，
(10)B7-H4，
(11)HVEM，
(12)GAL9，
(13)CD160，
(14)VISTA，
(15)BTNL2，
(16)TIGIT，
(17)PVR，
(18)BTN1A1，
(19)BTN2A2，
(20)BTN3A2，和
(21)CSF-1R。
21.根据项目20所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160。
22.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-1或PD-L1的药剂。
23.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对CTLA-4的药剂。
24.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对LAG-3的药剂。
25.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对TIM-3的药剂。
26.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对BTLA的药剂。
27.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对HVEM的药剂。
28.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对TIGIT的药剂。
29.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PVR的药剂。
30.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对CD160的药剂。
31.根据项目21所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对CSF-1R的药剂。
32.根据项目19-31中任一项所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是抗体。
33.根据项目32所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是针对PD-1或PD-L1的抗体。
33.根据项目33所述的药物组合物，其中针对PD-1的抗体是纳武单抗或派姆单抗。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述针对PD-L1的抗体是德瓦鲁单抗、阿特朱单抗(Atezolizumab，MPDL3280A)或BMS-936559。
35.根据项目17或18所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是共刺激分子激动剂。
36.根据项目35所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是至少一种针对选自以下的分子的药剂：
(1)4-1BB，
(2)4-1BB-L，
(3)OX40，
(4)OX40-L，
(5)GITR，
(6)CD28，
(7)CD40，
(8)CD40-L，
(9)ICOS，
(10)ICOS-L，
(11)LIGHT，和
(12)CD27。
37.根据项目36所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS。
38.根据项目37所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是针对4-1BB的药剂。
39.根据项目37所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是针对OX40的药剂。
40.根据项目37所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是针对GITR的药剂。
41.根据项目37所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是针对CD40的药剂。
42.根据项目37所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是针对ICOS的药剂。
43.根据项目35-42中任一项所述的药物组合物，其中所述共刺激分子激动剂是抗体。
44.根据项目17或18所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是免疫活化剂。
45.根据项目44所述的药物组合物，其中所述免疫活化剂是Toll-样受体(TLR)激动剂。
46.根据项目45所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是至少一种选自以下的药剂：
(1)TLR1/2激动剂，
(2)TLR2激动剂，
(3)TLR3激动剂，
(4)TLR4激动剂，
(5)TLR5激动剂，
(6)TLR6/2激动剂，
(7)TLR7激动剂，
(8)TLR7/8激动剂，
(9)TLR7/9激动剂，
(10)TLR8激动剂，
(11)TLR9激动剂，和
(12)TLR11激动剂。
47.根据项目46所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是至少一种选自以下的药剂：TLR3激动剂、TLR7激动剂、TLR7/8激动剂和TLR9激动剂。
48.根据项目47所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是TLR3激动剂。
49.根据项目47所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是TLR7激动剂。
50.根据项目47所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是TLR7/8激动剂。
51.根据项目47所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是TLR9激动剂。
52.根据项目45-51中任一项所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是核酸分子。
53.根据项目17或18所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是低分子抑制剂。
54.根据项目53所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是至少一种选自以下的药剂：β-联蛋白抑制剂、IDO抑制剂、COX-2抑制剂、CXCR4抑制剂、STAT3抑制剂和多激酶抑制剂。
55.根据项目54所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是β-联蛋白抑制剂。
56.根据项目54所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是IDO抑制剂。
57.根据项目54所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是COX-2抑制剂。
58.根据项目54所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是CXCR4抑制剂。
59.根据项目54所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是STAT3抑制剂。
60.根据项目54所述的药物组合物，其中所述低分子抑制剂是多激酶抑制剂。
62.根据项目1-60中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症选自白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、脑瘤、骨癌、胰腺癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、直肠癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病诸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、多形性成胶质细胞瘤、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和石棉诱导的癌症。
62.根据项目1-61中任一项所述的药物组合物，其中所述WT1抗原肽和所述免疫调节剂同时施用。
63.根据项目1、2和4-61中任一项所述的药物组合物，其中所述WT1抗原肽和所述免疫调节剂分开施用。
64.根据项目1、2和4-61中任一项所述的药物组合物，其中所述WT1抗原肽在施用所述免疫调节剂之前施用。
65.根据项目1、2和4-61中任一项所述的药物组合物，其中所述WT1抗原肽在施用所述免疫调节剂之后施用。
66.根据项目1-66中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗癌症。
67.根据项目1-66中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
68.用于治疗或预防癌症的方法，其包括向哺乳动物施用如项目1至67中任一项中所定义的WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂。
69.根据项目68所述的方法，其中所述WT1抗原肽和所述免疫调节剂同时或分开施用。
70.用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含如项目1至67中任一项中所定义的WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂。
此外，本发明提供以下内容：
用于治疗或预防癌症的方法，包括向哺乳动物施用WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂；
用于治疗或预防癌症的WT1抗原肽或其药学上可接受的盐，其中所述WT1抗原肽或其药学上可接受的盐与免疫调节剂组合使用；
用于治疗或预防癌症的免疫调节剂，其中所述免疫调节剂与WT1抗原肽或其药学上可接受的盐组合使用；
WT1抗原肽或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途，其中WT1抗原肽或其药学上可接受的盐与免疫调节剂组合使用；
免疫调节剂用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途，其中所述免疫调节剂与WT1抗原肽或其药学上可接受的盐组合使用；和
WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途。
此外，本发明提供以下内容：
用于治疗或预防癌症的方法，其包括向哺乳动物施用WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫检查点抑制剂；
用于治疗或预防癌症的WT1抗原肽或其药学上可接受的盐，其中所述WT1抗原肽或其药学上可接受的盐与免疫检查点抑制剂组合使用；
用于治疗或预防癌症的免疫检查点抑制剂，其中所述免疫检查点抑制剂与WT1抗原肽或其药学上可接受的盐组合使用；
WT1抗原肽或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途，其中WT1抗原肽或其药学上可接受的盐与免疫检查点抑制剂组合使用；
免疫检查点抑制剂用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途，其中所述免疫检查点抑制剂与WT1抗原肽或其药学上可接受的盐组合使用；和
WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫检查点抑制剂用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途。
本发明提供用于治疗或预防癌症的方法、药物组合物或试剂盒，其特征在于将WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂组合使用。此外，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法、药物组合物或试剂盒，其特征在于将WT1抗原肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂组合。
附图说明
图1显示用抗PD-1抗体处理的PBMC中杀伤肽B-特异性CTL的检测。横轴显示用抗CD8抗体的染色强度，且纵轴显示用HLA-四聚体的染色强度。虚线框中的点显示WT1抗原肽-特异性CTL。
图2显示用抗PD-L1抗体处理的PBMC中杀伤肽A-特异性CTL的检测。横轴显示用抗CD8抗体的染色强度，且纵轴显示用HLA-四聚体的染色强度。虚线框中的点显示WT1抗原肽-特异性CTL。
图3显示用抗PD-L1抗体处理的PBMC中杀伤肽B-特异性CTL的检测。横轴显示用抗CD8抗体的染色强度，且纵轴显示用HLA-四聚体的染色强度。虚线框中的点显示WT1抗原肽-特异性CTL。
图4显示WT1抗原肽-特异性CTL的检测。纵轴显示在IFN-γELISPOT测定中检测到的斑点的数目。
图5显示CD8+T细胞中PD-1的检测。显示小鼠脾细胞中通过疫苗施用的PD-1表达的变化。横轴显示通过流式细胞术分析的PD-1的染色强度。点划线、短划线和实线分别表示来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体+级分；来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体-级分；和来自未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体-级分的分析结果。虚线表示用同种型对照染色的结果。
图6显示CD4+T细胞中PD-1的检测。显示小鼠脾细胞中通过疫苗施用的PD-1表达的变化。横轴显示通过流式细胞术分析的PD-1的染色强度。短划线和实线分别表示来自接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD4+T细胞的分析结果。虚线表示用同种型对照染色的结果。
图7显示CD4-/CD8-T细胞中PD-1的检测。显示小鼠脾细胞中通过疫苗施用的PD-1表达的变化。横轴显示通过流式细胞术分析的PD-1的染色强度。短划线和实线分别表示来自接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD4-/CD8-T细胞的分析结果。虚线表示用同种型对照染色的结果。
图8显示CD8+T细胞中PD-L1的检测。显示小鼠脾细胞中通过疫苗施用的PD-L1表达的变化。横轴显示通过流式细胞术分析的PD-L1的染色强度。点划线、短划线和实线分别表示来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体+级分；来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体-级分；和来自未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体-级分的分析结果。虚线表示用同种型对照染色的结果。
图9显示CD4+T细胞中PD-L1的检测。显示小鼠脾细胞中通过疫苗施用的PD-L1表达的变化。横轴显示通过流式细胞术分析的PD-L1的染色强度。短划线和实线分别表示来自接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD4+T细胞的分析结果。虚线表示用同种型对照染色的结果。
图10显示CD4-/CD8-T细胞中PD-L1的检测。显示小鼠脾细胞中通过疫苗施用的PD-L1表达的变化。横轴显示通过流式细胞术分析的PD-L1的染色强度。短划线和实线分别表示来自接种疫苗的小鼠和未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD4-/CD8-T细胞的分析结果。虚线表示用同种型对照染色的结果。
图11显示通过用抗PD-1抗体处理的IFN-γ产生。用抗PD-1抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与EL4HHD肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12A显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗CD160或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12C显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗BTLA或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12D显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗TIM-3或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12E显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗LAG-3或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12F显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12G显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗HVEM或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12H显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗VISTA或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图12I显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PVR或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图13A显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图13B显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图13C显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗GITR或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图13D显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗CD40或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图14A显示通过用Toll-样受体(TLR)激动剂处理的IFN-γ产生。用聚I:C处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图14B显示通过用TLR激动剂处理的IFN-γ产生。用咪喹莫特处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图14C显示通过用TLR激动剂处理的IFN-γ产生。用R848处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图14D显示通过用TLR激动剂处理的IFN-γ产生。用CpG-ODN处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图15显示通过用β-联蛋白抑制剂处理的IFN-γ产生。用XAV939处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图16A显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的荷瘤小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞且随后培养，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图16B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗CTLA-4或同种型对照抗体处理在接种疫苗的荷瘤小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞且随后培养，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图16C显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗TIGIT或同种型对照抗体处理在接种疫苗的荷瘤小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞且随后培养，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图17显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗ICOS或同种型对照抗体处理在接种疫苗的荷瘤小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞且随后培养，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图18A显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图18B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗B7-H4或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图18C显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图19A显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图19B显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图20A显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图20B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗B7-H4或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图20C显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图21A显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图21B显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图22A显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图22B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图23A显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图23B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗B7-H4或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图23C显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图24A显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图24B显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图24C显示用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗GITR或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量与WT1杀伤肽和LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图25显示通过抗PD-1抗体和疫苗的组合在体内抑制肿瘤增殖。显示接受媒介物(组a)、抗PD-1抗体(组b)、疫苗(组c)或抗PD-1抗体和疫苗(组b)的EL4-A24/Kb-WT1肿瘤细胞移植的小鼠中的平均肿瘤体积。
图26显示通过抗CTLA-4抗体和疫苗的组合在体内抑制肿瘤增殖。显示接受媒介物(组a)、抗CTLA-4抗体(组b)、疫苗(组c)或抗CTLA-4抗体和疫苗(组b)的EL4-A24/Kb-WT1肿瘤细胞移植的小鼠中的平均肿瘤体积。
图27显示通过HLA四聚体检测WT1抗原肽-特异性CTL。纵轴显示来自接种疫苗的小鼠的脾细胞中包括的WT1抗原肽-特异性CTL的比率。
图28显示通过用WT1抗原肽刺激的IFN-γ产生。在存在WT1杀伤肽的情况下，培养在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图29显示通过用WT1抗原肽刺激的IFN-γ产生。在存在或不存在WT1杀伤肽的情况下，将在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞一起培养，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图30A显示用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-1或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在或不存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图30B显示通过用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗BTLA抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图30C显示用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗LAG-3抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图30D显示用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图30E显示用免疫检查点抑制剂处理的IFN-γ产生。用抗VISTA抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图31A显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB或同种型对照抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在或不存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图31B显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图31C显示通过用共刺激分子激动剂抗体处理的IFN-γ产生。用抗GITR抗体处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图32显示通过用β-联蛋白抑制剂处理的IFN-γ产生。用XAV939处理在接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图33显示通过HLA四聚体检测WT1抗原肽-特异性CTL。纵轴显示来自接种疫苗的小鼠的脾细胞中包括的WT1抗原肽-特异性CTL的比率。
图34A显示通过用WT1抗原肽刺激的IFN-γ产生。在存在WT1杀伤肽的情况下培养在用杀伤疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图34B显示通过用WT1抗原肽刺激的IFN-γ产生。在存在WT1杀伤肽的情况下培养在用鸡尾酒疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量来自细胞的IFN-γ产生。
图35A显示用抗PD-1抗体处理的IFN-γ产生。用抗PD-1抗体处理在用杀伤疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图35B显示用抗PD-1抗体处理的IFN-γ产生。用抗PD-1抗体处理在用鸡尾酒疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图36A显示用抗B7-H4抗体处理的IFN-γ产生。用抗B7-H4抗体处理在用杀伤疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图36B显示用抗B7-H4抗体处理的IFN-γ产生。用抗B7-H4抗体处理在用鸡尾酒疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图37A显示用抗PD-L1抗体处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1抗体处理在用杀伤疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图37B显示用抗PD-L1抗体处理的IFN-γ产生。用抗PD-L1抗体处理在用鸡尾酒疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图38A显示用抗4-1BB抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB抗体处理在用杀伤疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图38B显示用抗4-1BB抗体处理的IFN-γ产生。用抗4-1BB抗体处理在用鸡尾酒疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图39A显示用抗OX40抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40抗体处理在用杀伤疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
图39B显示用抗OX40抗体处理的IFN-γ产生。用抗OX40抗体处理在用鸡尾酒疫苗接种疫苗的小鼠中诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞，并且通过ELISA测量在存在WT1杀伤肽的情况下与LLC-HHD-WT1肿瘤细胞共培养时来自细胞的IFN-γ产生。
实施方案的描述
下文详细解释本发明的实施方案。
本发明涉及WT1抗原肽和免疫调节剂的组合用途。
如本文所用，“WT1抗原肽”是指具有源自WT1蛋白的氨基酸序列，且结合MHC I类或II类分子以有待于作为与MHC分子的复合物而呈递在细胞表面上且诱导杀伤T细胞或辅助T细胞的肽。如本文所用，结合MHC I类分子以诱导杀伤T细胞的WT1抗原肽被称为WT1杀伤肽，并且结合MHC II类分子以诱导辅助T细胞的WT1抗原肽被称为“WT1辅助肽”。WT1蛋白可以是，但不限于，小鼠或人WT1蛋白，并且优选是人WT1蛋白。人WT1蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。如本文所用，术语“WT1抗原肽”包括其药学上可接受的盐，只要其在上下文中是适当的。
WT1抗原肽可以在其氨基酸序列中的部分或全部氨基酸残基处被修饰。此类修饰的肽可以通过本领域中已知的任何方法来制备。例如，修饰的肽可以通过构成该肽的氨基酸残基的侧链的官能团的修饰来制备，所述修饰诸如酯化、烷基化、卤化、磷酸化、磺化或酰胺化。而且，多种物质可以与肽在N-和/或C-末端结合。例如，氨基酸、肽或其类似物可以与肽结合。当此物质与WT1抗原肽结合时，可以通过任何方法，例如通过体内酶促反应或通过细胞内加工，来除去该物质，如此最终产生WT1抗原肽。该物质可以是这样的物质，其调节肽的溶解度；改善肽的稳定性，诸如蛋白酶抗性；将肽递送至特定的组织或器官；或增加抗原呈递细胞对肽的摄取。该物质可以是增加CTL诱导活性的物质，诸如与WT1抗原肽或其药学上可接受的盐不同的杀伤或辅助肽。
WT1抗原肽可以包含除了肽键以外的键，诸如碳-碳键、碳-氮键、碳-硫键。而且，WT1抗原肽可以包含一种或多种D-氨基酸。
如上所述的修饰的肽仅仅是说明性的，并且本领域技术人员可以容易地设想、制备、检查和使用该肽的其他变体。
如本文所用的“氨基酸残基”是指构成肽或蛋白分子的氨基酸中的单一单元。“氨基酸残基”可以是天然或非天然的α-氨基酸残基、β-氨基酸残基、γ-氨基酸残基或δ-氨基酸残基。具体地，“氨基酸残基”可以是天然的α氨基酸残基、鸟氨酸残基、高丝氨酸残基、高半胱氨酸残基、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸或δ-氨基戊酸。
如本文所用的“氨基酸残基”可以由以下缩写表示。
Ala或A:丙氨酸残基
Arg或R:精氨酸残基
Asn或N:天冬酰胺残基
Asp或D:天冬氨酸残基
Cys或C:半胱氨酸残基
Gln或Q:谷氨酰胺残基
Glu或E:谷氨酸残基
Gly或G:甘氨酸残基
His或H:组氨酸残基
Ile或I:异亮氨酸残基
Leu或L:亮氨酸残基
Lys或K:赖氨酸残基
Met或M:甲硫氨酸残基
Phe或F:苯丙氨酸残基
Pro或P:脯氨酸残基
Ser或S:丝氨酸残基
Thr或T:苏氨酸残基
Trp或W:色氨酸残基
Tyr或Y:酪氨酸残基
Val或V:缬氨酸残基
Abu:2-氨基丁酸残基(也被称为α-氨基丁酸残基)
Orn:鸟氨酸残基
Cit:瓜氨酸残基。
本文公开的肽的氨基酸序列根据常规方法描述，其中N-末端氨基酸的氨基酸残基位于左侧，且C-末端氨基酸的氨基酸残基位于右侧。在肽中，除非另有说明，否则N-末端氨基酸残基的氨基结合氢原子，且C-末端氨基酸残基的羰基结合羟基。二价肽基团是指在N-末端氨基酸残基的氨基和C-末端氨基酸残基的羰基处结合的基团。例如，在式(1)至(3)的化合物中包含的肽中，N-末端氨基酸残基的氨基结合氢原子，且C-末端氨基酸残基的羰基结合羟基。
人类中的MHC被称为人白细胞型抗原(HLA)。对应于MHC I类-分子的HLA亚型包括HLA-A、B、Cw、F和G。如本文所用的表述“MHC I类-限制的”是指通过结合MHC I类分子而诱导杀伤T细胞的性质。“MHC I类-限制的”肽的优选实例包括HLA-A限制的肽、HLA-B限制的肽和HLA-Cw限制的肽。
对于每种HLA亚型，等位基因多态性是已知的。HLA-A中的多态性具有27种或更多种类型，诸如HLA-A1、HLA-A2和HLA-A24。HLA-B中的多态性具有59种或更多种类型，诸如HLA-B7、HLA-B40和HLA-B44。HLA-Cw中的多态性具有10种或更多种类型，诸如HLA-Cw0301、HLA-Cw0401和HLA-Cw0602。在此多态性中，HLA-A0201和HLA-A24是优选的。
在一个实施方案中，所述WT1抗原肽是杀伤肽，其结合MHC I类分子并诱导杀伤T细胞(细胞毒性T细胞，CTL)。WT1杀伤肽在以与MHC I类分子的复合物的形式呈递在细胞表面上时诱导WT1-特异性杀伤T细胞。
在一个实施方案中，所述WT1杀伤肽是由SEQ ID NO:1的人WT1蛋白的氨基酸序列中的连续7-30个氨基酸组成的肽或其变体。所述WT1杀伤肽可以是包含选自以下的氨基酸序列的肽：
RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL(SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL(SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL(SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV(SEQ ID NO:6)，
RVPGVAPTL(SEQ ID NO:7)，
VLDFAPPGA(SEQ ID NO:8)，
C-CMTWNQMNL(SEQ ID NO:9)(其中C-C内的键是二硫键)，和
C-CYTWNQMNL(SEQ ID NO:10)(其中C-C内的键是二硫键)，
或包含选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列的改变的氨基酸序列(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)且具有CTL诱导活性的肽。优选地，所述WT1杀伤肽是由选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列组成的肽或由选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列的改变的氨基酸序列(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)组成且具有CTL诱导活性的肽。更优选地，所述WT1杀伤肽是由选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列组成的肽。甚至更优选地，所述WT1杀伤肽是由选自SEQ ID NO:2-6、8和10的氨基酸序列组成的肽。
如本文所用，“包含”给定氨基酸序列的肽是指，如通常所理解，可包含添加至给定氨基酸序列的N-末端和/或C-末端氨基酸的其他氨基酸酸的肽。
如本文所用，“包含…的氨基酸序列的改变的氨基酸序列(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)且具有CTL诱导活性的肽”也被称为改变的杀伤肽。“改变的杀伤肽”是指由其中从原始氨基酸序列缺失、取代和/或添加1至几个、优选1至3个氨基酸的氨基酸序列组成且结合MHC I类以诱导CTL的肽。对于由9个氨基酸残基组成的肽，待取代的氨基酸的位置可以是位置1(N-末端)、位置2、位置3或位置9。待添加(或插入，因为“添加”涵盖“插入”)的氨基酸的数目优选为1或2，更优选为1。优选的添加位置为C-末端。待缺失的氨基酸的数目优选为1。在改变中，待添加或取代的氨基酸可以是除了20种遗传编码的氨基酸以外的非天然氨基酸。
对于HLA亚型中的每种类型的多态性，结合HLA抗原的肽中的氨基酸序列(结合基序)的规则性是已知的。例如，为了制备HLA-A24的结合基序，在由8至11个氨基酸残基组成的肽中，位置2的氨基酸为Tyr、Phe、Met或Trp，且C-末端的氨基酸为Phe、Leu、Ile、Trp或Met(J.Immunol.,152,p3913,1994；J.Immunol.,155,p4307,1994；Immunogenetics,41,p178,1995)。因此，在由9个氨基酸残基组成的肽中，位置2的氨基酸可以用Tyr、Phe、Met或Trp替代和/或位置9的氨基酸可以用Phe、Leu、Ile、Trp或Met替代。含有此氨基酸改变的肽是优选的改变的杀伤肽。类似地，为了制备HLA-A2的结合基序，在由8至11个氨基酸残基组成的肽中，位置2的氨基酸为Leu或Met，且C-末端的氨基酸为Val或Leu。因此，在由9个氨基酸残基组成的肽中，位置2的氨基酸可以用Leu或Met替代且C-末端的氨基酸可以用Val或Leu替代。含有此氨基酸改变的肽是优选的改变的杀伤肽。
改变的杀伤肽的实例包括
RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)的改变的杀伤肽，诸如
RYFPNAPYL(SEQ ID NO:21)(WO03/106682)
FMFPNAPYL(SEQ ID NO:22)，
RLFPNAPYL(SEQ ID NO:23)，
RMMPNAPYL(SEQ ID NO:24)，
RMFPNAPYV(SEQ ID NO:25)和
YMFPNAPYL(SEQ ID NO:26)(WO2009/072610)；
CMTWNQMNL(SEQ ID NO:3)的改变的杀伤肽，诸如
CYTWNQMNL(SEQ ID NO:4)(WO02/79253)，
Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu(SEQ ID NO:27)，
(其中Xaa是Ser或Ala)和
Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu(SEQ ID NO:28)
(其中Xaa是Ser、Ala、Abu、Arg、Lys、Orn、Cit、Leu、Phe或Asn)(WO2004/026897)；
ALLPAVPSL(SEQ ID NO:5)的改变的杀伤肽，诸如
AYLPAVPSL(SEQ ID NO:29)(WO2003/106682)；
SLGEQQYSV(SEQ ID NO:6)的改变的杀伤肽，诸如
FLGEQQYSV(SEQ ID NO:30)，
SMGEQQYSV(SEQ ID NO:31)和
SLMEQQYSV(SEQ ID NO:32)(WO2009/072610)；和
RVPGVAPTL(SEQ ID NO:7)的改变的杀伤肽，诸如
RYPGVAPTL(SEQ ID NO:33)(WO2003/106682)。
在一个实施方案中，所述WT1杀伤肽是
式(1)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)，
式(2)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)，或
式(3)的化合物：
(其中C-C内的键是二硫键)。
除了如上所述的肽和化合物以外，WT1抗原肽(杀伤肽或辅助肽)的实例包括WO2014/157692中公开的化合物。
在一个实施方案中，所述WT1抗原肽是辅助肽，其结合MHC II类分子并诱导辅助T细胞(CD4+T细胞)。WT1辅助肽在以与MHC II类分子的复合物的形式呈递在细胞表面上时诱导WT1-特异性辅助T细胞。WT1-特异性辅助T细胞产生细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素(IFN)并促进B细胞或其他T细胞亚群的增殖、分化或成熟。因此，WT1辅助肽活化辅助T细胞以诱导或维持CTL或活化效应细胞诸如巨噬细胞，其可用于有效治疗或预防癌症。
对应于MHC II类-分子的HLA亚型包括HLA-DR、DQ和DP。如本文所用的表述“MHC II类-限制的”是指通过结合MHC II类分子而诱导辅助细胞的性质。“MHC II类-限制的”肽的优选实例包括HLA-DR-限制的肽、HLA-DQ-限制的肽和HLA-DP-限制的肽。
在一个实施方案中，所述WT1辅助肽是由SEQ ID NO:1的人WT1蛋白的氨基酸序列中的连续7-30个氨基酸、优选14-30个氨基酸组成的肽或其变体。所述WT1辅助肽可以是包含选自以下的氨基酸序列的肽：
KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:12)，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL(SEQ ID NO:13)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:14)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:15)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:16)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:17)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:19)，
WAPVLDFAPPGASAYGSLC(SEQ ID NO:20)，
SGQARMFPNAPYLPSC(SEQ ID NO:34)，
SGQAYMFPNAPYLPSC(SEQ ID NO:35)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:36)，
SGQAYMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:37)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:38)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:39)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:40)，
QARMFPNAPYLPSCL(SEQ ID NO:44)，
LKGVAAGSSSSVKWT(SEQ ID NO:45)和
RYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:46)，或包含选自SEQ ID NO:11-20、34-40和44-46的氨基酸序列的改变的氨基酸序列(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)具有辅助T细胞诱导活性的肽。优选地，所述WT1辅助肽是由选自SEQ ID NO:11-20和34-40的氨基酸序列组成的肽或由选自SEQ ID NO:11-20和34-40的氨基酸序列的改变的氨基酸序列组成(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)的肽，或由选自SEQ ID NO:11-20和34-40的氨基酸序列的改变的氨基酸序列(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)且具有辅助T细胞诱导活性的肽。更优选地，所述WT1辅助肽是由选自SEQ ID NO:11-20和34-40的氨基酸序列组成的肽。甚至更优选地，所述WT1辅助肽是由选自SEQ ID NO:11-20的氨基酸序列组成的肽。
如本文所用，“包含…的氨基酸序列的改变的氨基酸序列(其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的氨基酸改变)且具有辅助T细胞诱导活性的肽”也被称为改变的辅助肽。“改变的辅助肽”是指由其中从原始氨基酸序列缺失、取代和/或添加1至几个、优选1至3个氨基酸的氨基酸序列组成且结合MHC II类以诱导CTL的肽。在改变中，待添加或取代的氨基酸可以是除了20种遗传编码的氨基酸以外的非天然氨基酸。
改变的辅助肽的实例包括
SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:36)的改变的辅助肽，诸如
SGQAYMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:37)(WO2007/120673)，
SGQARMFPNAPYLPSC(SEQ ID NO:34)，和
SGQAYMFPNAPYLPSC(SEQ ID NO:35)；和
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:40)的改变的辅助肽，诸如
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:38)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:39)，
KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:15)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:16)和
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:17)。
WT1抗原肽可以根据肽合成中通常使用的任何方法来制备。此类方法的实例包括在诸如以下的参考文献中描述的那些：Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；The Proteins,Vol 2,Academic Press Inc.,New York,1976；peptide synthesis,Maruzen Co.,LTD.,1975；Basics and Experiment of Peptide Synthesis,Maruzen Co.,LTD.,1985；和Development of Pharmaceutical Product subsequent vol.14,PeptideSynthesis,Hirokawa Shoten,1991。例如，该肽可以通过使用固相合成仪的Fmoc方法或Boc方法，或者通过在液相合成中Boc-氨基酸或Z-氨基酸的相继缩合来制备(其中Fmoc是9-芴基甲氧基羰基基团，Boc是叔丁氧基羰基基团，Z是苄基氧基羰基基团)。
用于制备WT1抗原肽的中间体中的官能团诸如氨基、羧基或巯基可以通过合适的保护基保护，并且必要时使用保护和脱保护技术进行脱保护。优选的保护基、保护方法和脱保护方法详细描述于例如"Protective Groups in Organic Synthesis第2版(JohnWiley&Sons,Inc.；1990)"。巯基-保护基的实例包括乙酰氨基甲基和三苯甲基基团。
当WT1抗原肽具有二硫键时，根据肽化学中通常使用的任何方法，二硫键可以在两个不同的肽(每个肽含有半胱氨酸残基)之间形成，或者在含有半胱氨酸残基的肽和半胱氨酸之间形成。形成二硫键的方法的实例包括在诸如以下的参考文献中描述的那些：PeptideSynthesis,Interscience,New York,1966；The Proteins,Vol.2,Academic Press Inc.,New York,1976；peptide synthesis,Maruzen Co.,LTD.,1975；Basics and Experimentof peptide synthesis,Maruzen Co.,LTD.,1985；和Development ofPharmaceuticalProduct sequential vol.14,Peptide Synthesis,Hirokawa Shoten,1991。
具体地，当肽含有一个半胱氨酸残基时，可以通过除去半胱氨酸侧链上包括巯基-保护基的所有保护基并在惰性溶剂中氧化该肽来制备具有二硫键的化合物(也称为“二硫化物化合物”)。此外，二硫化物化合物可以通过将两种各自具有巯基基团的中间体在适当的溶剂中混合并氧化混合物来制备。用于氧化的方法可以适当时选自通常肽合成中形成二硫键的已知方法。例如，氧化可以是碘氧化；在碱性条件下空气氧化；或在碱性或酸性条件下用氧化剂氧化以形成二硫键。氧化剂的实例包括碘、二甲亚砜(DMSO)和铁氰化钾。溶剂的实例包括水、乙酸、甲醇、氯仿、DMF和DMSO或其混合物。氧化反应经常提供对称和不对称二硫化物化合物的混合物。期望的不对称二硫化物可以通过使用诸如各种类型的色谱或重结晶的技术纯化而获得。或者，可以通过混合具有活化的巯基基团的中间体和具有巯基基团的另一中间体来选择性形成二硫键。具有活化的巯基基团的中间体的实例包括包含与Npys基团(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基基团)键合的巯基基团的中间体。或者，将一种中间体与活化巯基基团的试剂(例如2,2'-二硫代双(5-硝基吡啶))混合，然后向其中添加另一种中间体，由此可以选择性形成二硫键(Tetrahedron Letters.Vol.37.No.9,pp.1347-1350)。
当肽含有两个或更多个半胱氨酸残基时，也可以使用上述方法。在这种情况下，获得具有不同二硫化物键合模式的异构体。使用半胱氨酸侧链的保护基团的特定组合提供了在特定半胱氨酸残基之间具有二硫键的期望的二聚体。保护基团的组合的实例包括MeBzl(甲基苄基)基团和Acm(乙酰氨基甲基)基团，Trt(三苯甲基)基团和Acm基团，Npys(3-硝基-2-吡啶基硫基)基团和Acm基团以及S-Bu-t(S-叔丁基)基团和Acm基团。例如，当使用MeBzl基团和Acm基团的组合时，除去除了半胱氨酸侧链的那些以外的MeBzl基团和保护基团，然后将含有肽单体的溶液进行空气氧化反应以在脱保护的半胱氨酸残基之间形成二硫键。然后，在用碘脱保护和氧化后，形成用Acm基团保护的半胱氨酸残基之间的二硫键。
WT1抗原肽可以是由经二硫键缀合的杀伤肽和辅助肽或两种不同的杀伤或辅助肽构成的化合物。此类肽可以通过包括以下步骤(1)至(3)的方法来合成。
步骤(1)使用Fmoc-C(Mmt)A-SBn和第一抗原肽。步骤(1)合成其中C(Mmt)A的C-末端氨基酸的羰基基团结合第一抗原肽的N-末端氨基的肽。“Fmoc”是9-芴基甲氧基羰基。“Mmt”是单甲氧基三苯甲基。“SBn”是硫代苄基基团。
步骤(2)使用在步骤(1)中获得的肽和具有在N-末端被Npsy基团保护的半胱氨酸残基的第二抗原肽。步骤(2)合成其中步骤(1)中获得的肽中的第一抗原肽的半胱氨酸残基的硫醚基团结合添加至第二抗原肽的N-末端的半胱氨酸残基的硫醚基团的肽。“Nspy”是3-硝基-2-吡啶基硫基基团。
步骤(3)使用在步骤(2)中获得的肽和具有在N-末端被Spy基团保护的半胱氨酸残基的第三抗原肽。步骤(3)合成其中步骤(2)中获得的肽中的第二抗原肽的N-末端半胱氨酸残基的硫醚基团结合第三抗原肽的半胱氨酸残基的硫醚基团的肽。“Spy”是2-吡啶基硫醚基团。
因此获得的WT1抗原肽可以根据本领域普通技术人员已知或通常用于肽化学的任何方法纯化。例如，可以通过诸如各种类型的色谱(例如硅胶柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶过滤或反相色谱)和重结晶的技术来纯化WT1抗原肽。例如，重结晶溶剂可以是醇溶剂诸如甲醇、乙醇或2-丙醇；醚溶剂诸如乙醚；酯溶剂诸如乙酸乙酯；芳烃溶剂诸如苯或甲苯；酮溶剂诸如丙酮；烃溶剂诸如己烷；非质子溶剂诸如二甲基甲酰胺或乙腈；水；或其混合物。也可以使用Jikken Kagaku Kouza(The Chemical Society ofJapan ed.,Maruzen)vol.1或其他参考文献中描述的不同的纯化方法。
二硫化物化合物的纯化方法描述于诸如以下的参考文献中：Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；The Proteins,Vol.2,Academic Press Inc.,New York,1976；peptide synthesis,Maruzen Co.,LTD.,1975；Basics and Experiment of PeptideSynthesis,Maruzen Co.,LTD.,1985；和Development of Pharmaceutical Productsequential vol.14,peptide synthesis,Hirokawa Shoten,1991。在这些方法中，HPLC是优选的。
当WT1抗原肽具有一个或多个不对称点时，可以根据使用具有不对称点的起始物质(氨基酸)的一般方法来制备该肽。为了增加WT1抗原肽的光学纯度，可以在制备的合适阶段进行诸如光学拆分的方法。用于光学拆分的方法的实例包括非对映异构体方法，其在惰性溶剂(例如醇溶剂诸如甲醇、乙醇、2-丙醇，醚溶剂诸如乙醚，酯溶剂诸如乙酸乙酯，烃溶剂诸如甲苯，非质子溶剂诸如乙腈，或其混合物)中形成WT1抗原肽或其中间体与光学活性酸(例如单羧酸诸如扁桃酸、N-苄基氧基丙氨酸或乳酸，二羧酸诸如酒石酸、邻二异亚丙基酒石酸或苹果酸或磺酸诸如樟脑磺酸或溴樟脑磺酸)的盐。当WT1抗原肽或中间体具有酸性官能团诸如羧基基团时，也可以在与光学活性胺(例如，有机胺诸如对苯乙胺、激肽、奎尼丁、辛可尼定、辛可宁或士的宁)形成盐之后进行光学拆分。
用于形成盐的温度选自室温至溶剂沸点的范围。为了改进光学纯度，期望一次升温至溶剂的沸点附近。当通过过滤收集沉淀的盐时，可以根据需要通过冷却来增加得率。光学活性的酸或胺可以以相对于底物的约0.5-约2.0当量、优选约1当量的量使用。必要时，可以将晶体在惰性溶剂(例如醇溶剂诸如甲醇、乙醇或2-丙醇，醚溶剂诸如乙醚，酯溶剂诸如乙酸乙酯，烃溶剂诸如甲苯，非质子溶剂诸如乙腈，或其混合物)中重结晶以便以高纯度提供光学活性盐。必要时，可以用酸或碱通过一般方法处理光学拆分的盐，以得到游离形式。
如本文所用的“药学上可接受的盐”可以是酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐可以是无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐和磷酸盐，或有机酸盐诸如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。碱加成盐可以是与无机碱的盐诸如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或铵盐，与有机碱的盐诸如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐或二异丙基铵盐。而且，所述盐可以是具有碱性或酸性氨基酸诸如精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸盐。
WT1杀伤肽的药学上可接受的盐可以是由选自以下的氨基酸序列组成的肽的酸加成盐或碱加成盐：
RMFPNAPYL(SEQ ID NO:2)，
CMTWNQMNL(SEQ ID NO:3)，
CYTWNQMNL(SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL(SEQ ID NO:5)，
SLGEQQYSV(SEQ ID NO:6)，
RVPGVAPTL(SEQ ID NO:7)，
VLDFAPPGA，(SEQ ID NO:8)，
C-CMTWNQMNL(SEQ ID NO:9)(其中C-C内的键是二硫键)，和
C-CYTWNQMNL(SEQ ID NO:10)(其中C-C内的键是二硫键)，或包含选自SEQ ID NO:2-10的氨基酸序列的改变的氨基酸序列且具有CTL诱导活性的肽，其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的1至几个氨基酸缺失、取代或添加；或由式(1)至(3)中任一个代表的化合物。酸加成盐可以是无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐和磷酸盐，或有机酸盐诸如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。碱加成盐可以是与无机碱的盐诸如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或铵盐，与有机碱的盐诸如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐或二异丙基铵盐。而且，所述盐可以是具有碱性或酸性氨基酸诸如精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸盐。
WT1辅助肽的药学上可接受的盐可以是由选自以下的氨基酸序列组成的肽的酸加成盐或碱加成盐：
KRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:11)，
SGQARMFPNAPYLPSCLES(SEQ ID NO:12)，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL(SEQ ID NO:13)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:14)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK(SEQ ID NO:15)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH(SEQ ID NO:16)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(SEQ ID NO:17)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL(SEQ ID NO:19)和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC(SEQ ID NO:20)；或
包含选自SEQ ID NO:11-20的氨基酸序列的改变的氨基酸序列且且具有辅助T细胞诱导活性的肽，其中改变的氨基酸序列包含在所述氨基酸序列中的1至几个氨基酸缺失、取代或添加。酸加成盐可以是无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐和磷酸盐，或有机酸盐诸如柠檬酸盐、草酸盐、乙酸盐、甲酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。碱加成盐可以是与无机碱的盐诸如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或铵盐，与有机碱的盐诸如三乙基铵盐、三乙醇铵盐、吡啶鎓盐或二异丙基铵盐。而且，所述盐可以是具有碱性或酸性氨基酸诸如精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸盐。
WT1杀伤肽的药学上可接受的盐可以是，但不限于：
RMFPNAPYL乙酸盐，
CMTWNQMNL乙酸盐，
CYTWNQMNL乙酸盐，
ALLPAVPSL乙酸盐，
SLGEQQYSV乙酸盐，
RVPGVAPTL乙酸盐，
VLDFAPPGA乙酸盐，
C-CMTWNQMNL乙酸盐，
C-CYTWNQMNL乙酸盐，
KRYFKLSHLQMHSRKH乙酸盐，
SGQARMFPNAPYLPSCLES乙酸盐，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL乙酸盐，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG乙酸盐，
CNKRYFKLSHLQMHSRK乙酸盐，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH乙酸盐，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG乙酸盐，
WAPVLDFAPPGASAYGSL乙酸盐，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL乙酸盐，
WAPVLDFAPPGASAYGSLC乙酸盐，
RMFPNAPYL三氟乙酸盐，
CMTWNQMNL三氟乙酸盐，
CYTWNQMNL三氟乙酸盐，
ALLPAVPSL三氟乙酸盐，
SLGEQQYSV三氟乙酸盐，
RVPGVAPTL三氟乙酸盐，
VLDFAPPGA三氟乙酸盐，
C-CMTWNQMNL三氟乙酸盐，
C-CYTWNQMNL三氟乙酸盐，
KRYFKLSHLQMHSRKH三氟乙酸盐，
SGQARMFPNAPYLPSCLES三氟乙酸盐，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL三氟乙酸盐，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG三氟乙酸盐，
CNKRYFKLSHLQMHSRK三氟乙酸盐，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH三氟乙酸盐，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG三氟乙酸盐，
WAPVLDFAPPGASAYGSL三氟乙酸盐，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL三氟乙酸盐，或WAPVLDFAPPGASAYGSLC三氟乙酸盐。
本发明还涵盖WT1抗原肽或其药学上可接受的盐的任何水合物和溶剂化物，诸如乙醇溶剂化物。此外，本发明涵盖WT1抗原肽的任何可能的立体异构体，诸如非对映异构体或对映异构体，或任何晶体形式。
CTL诱导活性可以通过经由HLA四聚体方法(Int.J.Cancer:100,565-570(2002))或有限稀释方法(Nat.Med.:4,321-327(1998))测量CTL的数目来证实。为了测定HLA-A24限制的CTL诱导活性，可以使用WO 02/47474和Int.J.Cancer:100,565-570(2002)中描述的HLA-A24模型小鼠。辅助T细胞诱导活性可以通过本领域已知的任何方法、诸如CancerImmunol.Immunother.51:271(2002)中描述的方法来证实。
如本文所用，术语“免疫调节剂”是指通过与参与共刺激信号的传递且存在于抗原-呈递细胞和/或T细胞上的分子相互作用，而控制用抗原-呈递细胞活化T细胞期间的共刺激信号的传递的任何试剂以及直接或间接控制参与建立免疫系统中的免疫耐受(免疫抑制)的分子功能的任何试剂。“免疫调节剂”的实例包括，但不限于，抗体、核酸、蛋白、肽和小分子化合物。如在“免疫调节剂”的上下文中所用，术语“抗体”包括抗体片段。抗体片段的实例包括抗体(VH和VL)、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、Fd、sdFv和scFV的重链和轻链可变区。如在“免疫调节剂”的上下文中所用，术语“蛋白”是指除了抗体以外的任何蛋白。术语“免疫调节剂”的实例包括免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂、免疫活化剂和低分子抑制剂。
“免疫检查点抑制剂”抑制由癌细胞或抗原呈递细胞诱导的免疫抑制作用。免疫检查点抑制剂的实例包括，但不限于，针对选自以下的分子的试剂：(1)CTLA-4(例如，伊匹单抗和曲美木单抗(tremelimumab))；(2)PD-1(例如，纳武单抗、派姆单抗、AMP-224、AMP-514(MEDI0680)和pidilizumab(CT-011))；(3)LAG-3(例如，IMP-321和BMS-986016)；(4)BTLA；(5)KIR(例如，IPH2101)；(6)TIM-3；(7)PD-L1(例如，durvalumab(MEDI4736),MPDL3280A,BMS-936559和avelumab(MSB0010718C))；(8)PD-L2；(9)B7-H3(例如，MGA-271)；(10)B7-H4；(11)HVEM；(12)GAL9；(13)CD160；(14)VISTA；(15)BTNL2；(16)TIGIT；(17)PVR；(18)BTN1A1；(19)BTN2A2；(20)BTN3A2(Nat Rev Drug Discov.2013；12:130-146；Nikkei MedicalCancer Review 2014；9；Nat Rev Immunol.2014；14:559-69)；和(21)CSF1-R。
“共刺激分子激动剂”通过经由T细胞和/或抗原呈递细胞上的共刺激分子传递辅助信号来活化T细胞，以减弱癌细胞或抗原呈递细胞的免疫抑制作用。共刺激分子激动剂的实例包括，但不限于，针对选自以下的分子的试剂：(1)4-1BB；(2)4-1BB-L；(3)OX40(4)OX40-L；(5)GITR；(6)CD28；(7)CD40；(8)CD40-L；(9)ICOS；(10)ICOS-L；(11)LIGHT；和(12)CD27。
“免疫活化剂”通过直接或间接活化免疫细胞诸如T细胞和树突细胞，有效地刺激淋巴结中的杀伤T细胞。免疫活化剂的实例包括，但不限于，Toll-样受体(TLR)激动剂、干扰素基因的刺激剂(STING)激动剂、细胞因子和针对热休克蛋白(HSP)的试剂。
“Toll-样受体(TLR)激动剂”的实例包括，但不限于，TLR1/2激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂(例如聚I：C)、TLR4激动剂(例如S型脂多糖、紫杉醇、脂质A和单磷酰脂质A)、TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)、TLR6/2激动剂(例如MALP-2)、TLR7激动剂、TLR7/8激动剂(例如gardiquimod、咪喹莫特、洛索立宾和瑞喹莫德(R848))、TLR7/9激动剂(例如羟氯喹硫酸盐)、TLR8激动剂(例如，motolimod(VTX-2337))、TLR9激动剂(例如CpG-ODN)和TLR11激动剂(例如前纤维蛋白(profilin))。
“细胞因子”的实例包括，但不限于，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、SCF、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、促红细胞生成素、促血小板生成素、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)和单核细胞趋化蛋白(MCP)。
“热休克蛋白(HSP)”的实例包括，但不限于，HSP70、HSP90、HSP90α、HSP90β、HSP105、HSP72和HSP40。针对热休克蛋白的试剂包括HSP抑制剂。例如，HSP90抑制剂的实例包括，但不限于，塔尼霉素(17-AAG)、luminespib(AUY-922、NVP-AUY922)、阿螺旋霉素(17-DMAG)盐酸盐、ganetespib(STA-9090)、BIIB021、onalespib(AT13387)、格尔德霉素、NVP-BEP800、SNX-2112(PF-04928473)、PF-4929113(SNX-5422)、KW-2478、XL888、VER155008、VER-50589、CH5138303、VER-49009、NMS-E973、PU-H71、HSP990(NVP-HSP990)和KNK437。
“低分子抑制剂”的实例包括，但不限于，组蛋白脱乙酰酶抑制剂、组蛋白脱甲基酶抑制剂、组蛋白乙酰转移酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、蒽环类抗生素、铂制剂、MAPK抑制剂、β-联蛋白抑制剂、STAT3抑制剂、NF-kB抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、IDO抑制剂、COX-2抑制剂、CXCR4抑制剂和精氨酸酶抑制剂。
“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”的实例包括，但不限于，伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替诺特(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古抑菌素A(TSA)、mocetinostat(MGCD0103)、BG45、BRD73954、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228、缩酚酸肽)、4SC-202、HPOB、LMK-235、CAY10603、他喹莫德、TMP269、nexturastat A、罗西司他(ACY-1215)、RGFP966、RG2833(RGFP109)、scriptaid、pacinostat(SB939)、CUDC-101、M344、PCI-34051、达西司特(LAQ824)、tubastatin A盐酸盐、abexinostat(PCI-24781)、CUDC-907、AR-42、苯基丁酸钠、resminostat、tubacin、quisinostat(JNJ-26481585)二盐酸盐、MC1568、givinostat(ITF2357)、droxinostat、西达本胺(C S055、HBI-8000)、CHR-2485、CHR-3996、DAC-060、FRM-0334(EVP-0334)、MGCD-290、CXD-101(AZD-9468)、CG200745、精氨酸丁酸酯、萝卜硫素、SHP-141、CUDC-907、YM753(OBP-801)、丙戊酸钠、apicidin和CI994(tacedinaline)。
“组蛋白脱甲基酶抑制剂”的实例包括，但不限于，GSK J4 HCl、OG-L002、JIB-04、IOX1、SP2509、ORY-1001(RG-6016)、GSK J1、ML324和GSK-LSD12HCl。
“组蛋白乙酰转移酶抑制剂”的实例包括但不限于C646、MG149、remodelin和漆树酸。
“组蛋白甲基转移酶抑制剂”的实例包括，但不限于，pinometostat(EPZ5676)、EPZ005678、GSK343、BIX01294、tazemetostat(EPZ6438)、3-脱氮腺苷类似物A((DZNeP)HCl、UNC1999、MM-102、SGC0946、恩他卡朋、EPZ015666、UNC0379、EI1、MI-2(menin-MLL抑制剂)、MI-3(menin-MLL抑制剂)、PFI-2、GSK126、EPZ04777、BRD4770、GSK-2816126和UNC0631。
“DNA甲基转移酶抑制剂”的实例包括，但不限于，地西他滨、氮杂环丁烷、RG108、硫鸟嘌呤、zebularine、SGI-110、CC-486、SGI-1027、罗米鲁曲和普鲁卡因酰胺盐酸盐。
“蒽环类抗生素”被间插在DNA链之间以抑制DNA松弛。蒽环类抗生素的实例包括，但不限于，多柔比星、多柔比星脂质体、道诺霉素、吡柔比星、表柔比星、伊达比星、阿柔比星、氨柔比星、芦荟素和米托蒽醌。
“铂制剂”的实例包括，但不限于，顺铂、卡铂、miboplatin、奈达铂、赛特铂(JM-126)、奥沙利铂(ELOXATIN)、四硝酸三铂及其DDS制剂。
“MAPK抑制剂”的实例包括，但不限于，SB203580、达马莫德(BIRB796)、SB202190(FHPI)、LY2228820、VX-702、SB239063、培美替尼(ARRY-614)、PH-797804、VX-745和TAK-715。
“β-联蛋白抑制剂”的实例包括，但不限于，XAV-939、ICG-001、IWR-1-endo、Wnt-C59(C59)、LGK-974、KY02111、IWP-2、IWP-L6、WIKI4和FH535。
“STAT3抑制剂”的实例包括，但不限于，S3I-201、Stattic、氯硝柳胺、硝呋齐特、napabucasin(BBI-608)、隐丹参酮、HO-3867、WHI-P154、FLLL32、STA-21、WP1066和SH-4-54。
“NF-κB抑制剂”的实例包括，但不限于，QNZ(EVP4593)、4-氨基水杨酸钠、JSH-23、咖啡酸苯乙酯、水杨酸钠、穿心莲内酯和SC75741。
“JAK抑制剂”的实例包括，但不限于，鲁索替尼(INCB018424)、托法替尼(CP-690550)柠檬酸盐、AZD1480、fedratinib(SAR302503、TG101348)、AT9283、酪氨酸磷酸化抑制剂B42(AG-490)、momelotinib(CYT387)、托法替尼(CP-690550、tasocitinib)、WP1066、TG101209、gandotinib(LY2784544)、NVP-BSK805 2HCl、巴瑞克替尼(LY3009104、INCB02850)、AZ960、CEP-33779、pacritinib(SB1518)、WHI-P154、XL019、S-鲁索替尼(INCB018424)、ZM39923 HCl、decernotinib(VX-509)、cerdulatinib(PRT062070、PRT2070)、filgotinib(GLPG0634)、FLLL32、培非替尼(ASP015K、JNJ-54781532)、GLPG0634类似物、Go6976和姜黄醇。
“mTOR抑制剂”的实例包括，但不限于，西罗莫司(雷帕霉素)、deforolimus(AP23573、MK-8669)、依维莫司(RAD-001)、替西罗莫司(CCI-779、NSC683864)、佐他莫司(ABT-578)、biolimus A9(umirolimus)、AZD8055、KU-0063794、voxtalisib(XL765、SAR245409)、MHY1485、dactolisib(BEZ235、NVP-BEZ235)、PI-103和torkinib(PP242)。
“IDO抑制剂”的实例包括，但不限于，NLG919、INCB024360类似物、indoximod(NLG-8189)和epacadostat(INCB024360)。
“COX-2抑制剂”的实例包括，但不限于，伐地考昔、罗非考昔、卡洛芬、塞来昔布、罗美昔布、托芬那酸、尼美舒利、尼氟酸、阿那达林、氯诺昔康、甲氯芬那酸钠、氨芬酸钠、双氯芬酸钠、酮洛芬、酮咯酸、萘普生钠、吲哚美辛、布洛芬、阿司匹林、甲芬那酸、溴芬酸钠、奥沙普秦、扎托布洛芬和奈帕芬胺。
“CXCR4抑制剂”的实例包括，但不限于，WZ811、普乐沙福(AMD3100)和普乐沙福8HCl(AMD31008HCl)。
本文公开的WT1抗原肽当与免疫调节剂组合时产生抗癌作用。通过将WT1抗原肽与至少一种额外药物组合(多药物疗法)，可以进一步增强效果或可以改善患者的QOL。
本文公开的WT1抗原肽可以与一种或多种选自以下的药物组合：“激素治疗剂”、“免疫治疗剂”、“生物药物”、“细胞生长因子”、“细胞生长因子抑制剂”、“细胞生长因子受体抑制剂”、“放射治疗剂”、“辅助剂”和“化学治疗剂”。优选地，本文公开的WT1抗原肽可以一种至五种选自该组的药物组合使用。更优选地，本文公开的WT1抗原肽可以一种至三种选自该组的药物组合使用。特别优选地，本文公开的WT1抗原肽可以一种选自该组的药物组合使用。可以与本文公开的WT1抗原肽和免疫调节剂组合的药物在下文中称为“伴随药物”。伴随药物的剂量可以基于通常采用的临床剂量适当地确定。
“激素治疗剂”的实例包括肾上腺皮质激素药剂(例如甾体抗炎剂、雌激素制剂、孕酮制剂和雄激素制剂)、抗雌激素药剂、雌激素控制药剂、雌激素合成抑制剂、抗雄激素药剂、雄激素控制药剂、雄激素合成抑制剂、LH-RH激动剂制剂、LH-RH拮抗剂制剂、芳香酶抑制剂、类固醇内酯酶抑制剂、避孕丸、类维生素A和延缓类维生素A的代谢的药剂。
“激素治疗剂”的实例包括磷雌酚、己烯雌酚、fluoxymesterol、氯烯雌醚、甲基睾酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、美帕曲星、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、柠檬酸他莫昔芬、柠檬酸托瑞米芬、碘氧昔芬、丸制剂、美雄烷、睾丸内酯、氨鲁米特、醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、抑那通、亮丙瑞林、屈洛昔芬、表雄甾醇、乙炔雌二醇磺酸盐、雌莫司汀、盐酸法倔唑、阿那曲唑、terorazole、酮康唑、来曲唑、依西美坦、伏罗唑、福美司坦、依西美坦、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、恩杂鲁胺、米非司酮、非那雄胺、地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙、阿比特龙、利罗唑、贝沙罗汀和DN101。
“免疫治疗剂”的实例包括毕西巴尼、云芝孢内多糖、西索非兰、香菇多糖、乌苯美司、干扰素(IFN)-α、干扰素(IFN)-β、干扰素(IFN)-γ、白介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、淋巴毒素、BCG疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、多糖K、丙考达唑、抗-CTLA4抗体、抗PD-1抗体和TLR激动剂(例如TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂)。
“生物药物”的实例包括，但不限于，白介素-2(阿地白介素)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(非格司亭)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(沙格司亭)、IL13-PE38QQR、卡介苗、左旋咪唑、奥曲肽、CPG7909、Provenge、GVAX、Myvax、Favld、来那度胺、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、阿仑单抗、内皮抑素、替坦异贝莫单抗、托西莫单抗、西妥昔单抗、zanolimumab、奥法木单抗、HGS-ETR1、帕妥珠单抗、M200、SGN-30、马妥珠单抗、adecatumumab、地诺单抗、zalutumumab、MDX-060、尼妥珠单抗、MORAb-003、Vitaxin、MDX-101、MDX-010、DPC4抗体、NF-1抗体、NF-2抗体、Rb抗体、p53抗体、WT1抗体、BRCA1抗体、BRCA2抗体、神经节苷脂(GM2)、前列腺特异性抗原(PSA)、α-胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、黑色素瘤相关抗原(MART-1、gap100、MAGE 1,3酪氨酸)、乳头状瘤病毒E6和E7片段及其DDS制剂。
关于“细胞生长因子”、“细胞生长因子抑制剂”和“细胞生长因子受体抑制剂”，细胞生长因子是促进细胞增殖的药剂。例如，细胞生长因子可以是具有不超过20,000的分子量的肽，并且可以通过与受体结合而以低浓度产生效果。
“细胞生长因子”的实例包括，但不限于，表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF(例如胰岛素、IGF-1和IGF-2))、转化生长因子(TGF(例如TGF-α和TGF-β))、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF(例如粒细胞集落刺激(G-CSF))、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、血小板衍生生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF(例如酸性FGF、碱性FGF、角质形成细胞生长因子(KGK)和FGF-10))、肝细胞生长因子(HGF)、调蛋白和血管生成素。术语“细胞生长因子”与术语“生长因子”同义。
“细胞生长因子抑制剂”的实例包括，但不限于，表皮生长因子抑制剂(EGF抑制剂)、胰岛素样生长因子抑制剂(IGF抑制剂)、神经生长因子抑制剂(NGF抑制剂)、脑源性神经营养因子(BDNF抑制剂)、血管内皮细胞生长因子抑制剂(VEGF抑制剂)、集落刺激因子抑制剂(CSF抑制剂)、血小板衍生生长因子抑制剂(PDGF抑制剂)、促红细胞生成素抑制剂(EPO抑制剂)、成纤维细胞生长因子抑制剂(FGF抑制剂)、肝细胞生长因子抑制剂(HGF抑制剂)、调蛋白抑制剂和促血管生成素抑制剂。术语“细胞生长因子抑制剂”与术语“生长因子抑制剂”同义。
“细胞生长因子受体抑制剂”的实例包括，但不限于，表皮生长因子受体抑制剂(EGFR抑制剂)、胰岛素样生长因子受体抑制剂(IGFR抑制剂)、神经生长因子受体抑制剂(NGFR抑制剂)、脑源性神经营养因子受体抑制剂(BDNFR抑制剂)、血管内皮细胞生长因子抑制剂(VEGF抑制剂)、集落刺激因子抑制剂(CSF抑制剂)、血小板衍生生长因子受体抑制剂(PDGFR抑制剂)、促红细胞生成素受体抑制剂(EPOR抑制剂)、成纤维细胞生长因子受体抑制剂(FGFR抑制剂)、肝细胞生长因子受体抑制剂(HGFR抑制剂)、调蛋白受体抑制剂和血管生成素受体抑制剂。术语“细胞生长因子受体抑制剂”与术语“生长因子受体抑制剂”同义。
“放射治疗剂”的实例包括，但不限于，放射性材料和放射增敏剂。
“辅助剂”用于抑制由抗癌剂引起的不利作用诸如副作用或呕吐。辅助剂的实例包括，但不限于，阿瑞匹坦、昂丹司琼、劳拉西泮、地塞米松、苯海拉明、雷尼替丁、西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、西咪替丁、普罗克瑞、依泊汀α、非格司亭、奥普瑞白介素、亚叶酸和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
“化学治疗剂”的实例包括，但不限于，烷化剂、铂制剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、抗有丝分裂剂、抗肿瘤抗生素、植物来源的抗癌剂、表观基因组药物、免疫调节剂、分子靶向治疗剂、血管生成抑制剂和其他化学治疗剂。下面列出一些典型的化学治疗剂的实例。
“烷化剂”的实例包括，但不限于，氮芥、氮芥N-氧化物盐酸盐、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替派、卡波醌、英丙舒凡甲苯磺酸盐、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、美法仑、达卡巴嗪、丙卡巴肼、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、曲他胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、哌泊溴烷、依托格鲁、六甲蜜胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵、福莫司汀、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、司莫司汀、嘌嘧替派、ribomustin、替莫唑胺、曲奥舒凡、曲洛磷胺、净司他丁斯酯、阿多来新、半胱胺亚硝脲、比折来新、二氯甲基二乙胺、尿嘧啶氮芥、链脲霉素、曲贝替定、becaterin、双氯乙基甲胺、甘露舒凡、三亚胺醌、丙卡巴肼、canfosfamide、亚硝基脲类及其DDS制剂。
“铂制剂”的实例包括，但不限于，顺铂、卡铂、miboplatin、奈达铂、赛特铂、奥沙利铂、四硝酸三铂及其DDS制剂。
“抗代谢物”的实例包括，但不限于，抗叶酸剂、嘧啶代谢抑制剂、嘌呤代谢抑制剂、核糖核苷酸还原酶抑制剂和核苷酸类似物。
“抗代谢物”的实例包括，但不限于，巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、培美曲塞、eoshitabin、依诺他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸酯、盐酸安西他滨、5-FU药剂(诸如氟尿嘧啶、Carzonal、Bennan、Lunachol、Lunapon、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美嘧啶-氧嗪酸钾(TS-1)、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、gallocitabine、乙嘧替氟和卡培他滨)、氨喋呤、奈拉滨、亚叶酸钙、Tabloid、丁卡因、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、噻唑呋林、氨莫司汀、苯达莫司汀、氟尿苷、奈拉滨、亚叶酸、羟基脲、硫鸟嘌呤、天冬酰胺酶、硼替佐米、雷替曲塞、氯法拉滨、依诺他滨、sapacitabine、氮杂胞苷、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、甲氧苄氨嘧啶、Liproxstatin-1、D4476、黄腐酚、Epacadostat(INCB024360)、Vidofludimus、P7C3、GMX1778(CHS828)、NCT-501、SW033291、Ro61-8048及其DDS制剂。
“拓扑异构酶抑制剂”的实例包括，但不限于，阿霉素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、蒽二酮、米托蒽醌、丝裂霉素C、博来霉素、更生霉素、plicatomycin、依立替康、喜树碱、鲁比替康、贝洛替康、依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶及其DDS制剂。
“DNA嵌入剂”的实例包括，但不限于，原黄素、阿霉素(亚德里亚霉素)、道诺霉素、放线菌素D、沙利度胺及其DDS制剂。
“抗有丝分裂剂”的实例包括，但不限于，紫杉醇、紫杉醇衍生物(例如DHA紫杉醇、聚谷氨酸紫杉醇、nab-紫杉醇、胶束紫杉醇、7α-葡糖基氧基乙酰基紫杉醇和BMS-275183)、多西他赛、长春瑞滨、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春利定、依托泊苷、替尼泊苷、伊沙匹隆、拉洛他赛、奥塔他赛、替他塞尔、ispinesib、秋水仙碱、长春氟宁及其DDS制剂。
“抗肿瘤抗生素”的实例包括，但不限于，放线菌素D、放线菌素C、丝裂霉素C、色霉素A3、光神霉素A、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸道诺霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、盐酸氨柔比星、新制癌菌素、净司他丁斯酯、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌菌素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星、脂质体多柔比星及其DDS制剂。
“植物来源的抗癌剂”的实例包括，但不限于，依立替康、nogitecan、依托泊苷、磷酸依托泊苷、艾日布林、索布佐生、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、紫杉醇注射液、多西他赛、DJ-927、长春瑞滨、拓扑替康及其DDS制剂。
“表观基因组药物”的实例包括，但不限于，DNA甲基化抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶活化剂、组蛋白脱甲基酶抑制剂和甲基化核苷酸。
“表观基因组药物”的实例包括，但不限于，伏立诺他、贝林司他、mocetinostat(MGCD0103)、恩替司他(SNDX-275)、罗米地辛、氮胞苷、地西他滨、GSK28795522Hl、SGC707、ORY-1001(RG-6016)、PFI-4、SirReal2、GSK2801、CPI-360、GSK503、AMI-1、CPI-169及其DDS制剂。
“免疫调节剂”的实例包括，但不限于，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺及其DDS制剂。
“分子靶向治疗剂”可以是小的化合物或抗体。“分子靶向治疗剂”的实例包括，但不限于，激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、mTOR抑制剂、TNF抑制剂和T-细胞抑制剂。
“激酶抑制剂”的实例包括，但不限于，酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、Raf激酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和促分裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂。
“激酶抑制剂”的具体实例包括，但不限于，伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、阿法替尼、达沙替尼、波舒替尼、凡德他尼、舒尼替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、乐伐替尼、拉帕替尼、尼达尼布、尼罗替尼、克里唑替尼、色瑞替尼、艾乐替尼、鲁索替尼、托法替尼、依鲁替尼、索拉非尼、维罗菲尼、达拉菲尼、帕博西尼、曲美替尼、瑞戈非尼、cedivanib、来他替尼、班德替尼、瓦他拉尼、塞来西布、tivantinib、卡奈替尼、培利替尼、tesevatinib、赛地替尼、莫特塞尼、米哚妥林、福替尼、卡博替尼、司美替尼、来那替尼、volasertib、塞卡替尼、enzastaurin、坦度替尼、semaxanib、alvocidib、ICR-62、AEE788、PD0325901、PD153035、TK787、BBI503、E6201、E7050及其DDS其制剂。
“蛋白酶体抑制剂”的实例包括，但不限于，硼替佐米、卡非佐米及其DDS制剂。
“单克隆抗体”的实例包括，但不限于，抗CD22抗体、抗CD20抗体、抗CD25抗体、抗CD30抗体、抗CD33抗体、抗CD5抗体、抗CD52抗体、抗表皮生长因子受体抗体(EGFR抗体)、抗血管内皮细胞生长因子抗体(VEGF抗体)、抗TNF-α抗体、抗IL-1受体抗体、抗IL-2受体抗体、抗IL-5受体抗体、抗IL-6受体抗体、抗HER2抗体、抗IgE抗体、抗IgG抗体、抗RS病毒抗体、抗CCR4抗体、抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4、CD152)抗体、抗PD-1抗体、抗核因子κB配体(RANKL)的受体激活剂的抗体、抗c-Met抗体和抗CXCR4抗体。
“单克隆抗体”的具体实例包括，但不限于，替坦异贝莫单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、brentuximab vedotin、托珠单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、奥马珠单抗、美泊利单抗、吉妥珠单抗、奥佐米星、帕利珠单抗、兰尼单抗、赛妥珠单抗、ocrelizumab、莫库珠单抗、依库珠单抗、帕妥珠单抗、阿仑单抗、伊珠单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、戈利木单抗、阿达木单抗、雷莫芦单抗、纳武单抗、阿那白滞素、德尼单抗、伊匹单抗、派姆单抗、马妥珠单抗、farletuzumab、MORAb-004、MORA-b009及其DDS制剂。
“mTOR抑制剂”的实例包括，但不限于，依维莫司(RAD001)、雷帕霉素(西罗莫司)、AZD8055、坦西莫司(CCI-779、NSC683864)、KU-0063794、voxtalisib(XL-765、SAR245409)、MHY1485、dactolisib(BEZ235)、PI-103、torkinib(PP242)、地磷莫司(deforolimus、MK-8669)、INK-128(MLN0128)、Torin1、omipalisib(GSK2126458、GSK458)、OSI-027、PF-04691502、apitolisib(GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、gedatolisib(PF-05212384、PKI-587)、WYE-132、PP121、WYE-354、AZD2014、Torin2、WYE-687、CH5132799、WAY-600、ETP-46464、GDC-0349、XL388、佐他莫司(ABT-578)、他克莫司(FK506)、BGT226(NVP-BGT226)、Palomid 529(P529)、大黄酸及其DDS制剂。
“TNF抑制剂”的实例包括，但不限于，依那西普、来那度胺(CC-5013)、泊马度胺、沙利度胺、necrostatin-1和QNZ(EVP4593)。
“T-细胞抑制剂”的实例包括，但不限于，阿巴西普。
“血管生成抑制剂”的实例包括，但不限于，CM101、IFN-α、IL-12、血小板因子-4、苏拉明、塞马尼、血小板反应蛋白、VEGFR拮抗剂、血管生成抑制类固醇和肝素的组合、软骨来源的血管生成抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、巴马司他、马立马司他、血管生成抑制因子、内皮抑制素、2-甲氧基雌二醇、tecogalan、血小板反应蛋白、αVβ3抑制剂、利诺胺、ADH-1、E7820及其DDS其制剂。
“其他化学治疗剂”的实例包括，但不限于，非那雄胺、索布佐生、obatoclax、乙丙昔罗、替吡法尼和洛那法尼。
除了活性成分(WT1抗原肽和/或免疫调节剂)之外，本发明的药物组合物可以包含另外的成分，诸如但不限于药学上可接受的载体。药物组合物中的WT1抗原肽诱导WT1特异性CTL和/或WT1特异性辅助性T细胞，因此所述药物组合物还可以包含合适的佐剂或可以与合适的佐剂一起施用以增加诱导效率。
药学上可接受的载体在施用于细胞或哺乳动物的量和浓度对于接受载体的细胞或哺乳动物是无毒性的。药学上可接受的载体通常可以是pH缓冲水溶液。药学上可接受的载体的实例包括：缓冲剂(诸如磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、三氟乙酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂(诸如抗坏血酸)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸)；单糖、二糖和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(诸如EDTA)；糖醇(诸如甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)；稳定剂(诸如二亚乙基三胺五乙酸)；成盐抗衡离子(诸如钠)；增溶剂(诸如聚山梨酸酯和/或非离子表面活性剂(诸如/>聚乙二醇(PEG)和/>)。药学上可接受的载体可以是大且缓慢代谢的大分子，诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚丙交酯、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物或灭活病毒颗粒。WT1抗原肽可以以脂质体制剂、包含与直径为数微米的珠粒键合的肽的微粒或包含与脂质结合的肽的制剂的形式施用。
药物组合物还可以包含合适的佐剂或可以与合适的佐剂一起施用以有效建立细胞免疫。所述佐剂可以是Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994中描述的试剂。具体地，所述佐剂可以是任何真菌衍生组分，GM-CSF，细胞因子诸如白介素-2、白介素-7和白介素-12，植物衍生成分，海洋生物衍生组分，矿物凝胶诸如氢氧化铝，溶血卵磷脂，表面活性剂诸如普朗尼克多元醇，聚阴离子，肽和油乳剂(乳剂制剂)。真菌衍生组分的实例包括脂质A、作为脂质A的衍生物的单磷酰脂质A、死细菌(分枝杆菌细菌诸如BCG细菌)、细菌衍生蛋白、多核苷酸、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、细胞壁骨架组分(例如BCG-CWS)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)。
而且，所述佐剂可以是沉淀佐剂或油佐剂。沉降性佐剂是吸附肽的无机物质的悬浮液。沉降性佐剂的实例包括氢氧化钠、氢氧化铝(Alum)、磷酸钙、磷酸铝、铝盐、Pepesu和羧基乙烯基聚合物。油佐剂通过与矿物油形成胶束而乳化包含肽的水溶液。油佐剂的实例包括，但不限于，液体石蜡、羊毛脂、弗氏佐剂(弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂)、Montanide和W/O乳剂(参见WO2006/078059)。
本发明的药物组合物可以包含赋形剂，其选自，但不限于，糖醇，诸如甘露醇、海藻糖或乳糖；选自盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、马来酸、磷酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、乙酸钠水合物、无水乙酸钠、柠檬酸钠水合物、柠檬酸二氢钠、酒石酸钠、磷酸二钠、磷酸二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸三钠的pH调节剂以及药物组合物中常规使用的任何其他pH调节剂；填充剂；缓冲剂；悬浮剂；润湿剂；增溶剂；分散剂；防腐剂和/或着色剂。
药物组合物可以作为用于口服施用的固体或液体剂型或用于通过注射、局部应用、吸入或经鼻应用或作为栓剂的肠胃外施用的剂型提供。用于口服施用的固体剂型的实例包括片剂、丸剂、胶囊(包括硬胶囊和软胶囊)、粉剂和颗粒剂。也可以将药物组合物配制成片剂形式，诸如舌下片剂、口腔片剂或快速崩解口服片剂。
固体口服剂型可以根据常规已知的制备方法制备，并且可以包含单独或与以下组合的一种或多种活性剂：填充剂(诸如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素或淀粉)，粘合剂(诸如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸镁铝)，崩解剂(诸如纤维素乙醇酸钙)、润滑剂(诸如硬脂酸镁)、稳定剂、增溶助剂(诸如谷氨酸、天冬氨酸)或任何其他适当的赋形剂。固体口服剂型可以任选地用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或任何其他适当的包衣剂包衣。可以在剂型上施用两层或更多层的包衣。固体口服剂型可以是由可消化物质诸如明胶形成的胶囊。固体口服剂型可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂或任何其他适当的添加剂。
舌下片剂形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，舌下片剂可以通过将一种或多种活性剂与以下合并来制备：填充剂(诸如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、胶体二氧化硅或淀粉)，粘合剂(诸如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或硅酸镁铝)，崩解剂(诸如淀粉、L-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠或纤维素乙醇酸钙)、润滑剂(诸如硬脂酸镁)，溶胀剂(诸如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、黄原胶或瓜尔胶)，溶胀助剂(诸如葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖、海藻糖、磷酸盐、柠檬酸盐、硅酸盐、甘氨酸、谷氨酸或精氨酸)，稳定剂，增溶助剂(诸如聚乙二醇、丙二醇、谷氨酸或天冬氨酸)，调味剂(诸如橙味、草莓味、薄荷味、柠檬味或香草味)或任何其他适当的赋形剂。舌下片剂可以任选地用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或任何其他适当的包衣剂包衣。可以在片剂上施用两层或更多层的包衣。舌下片剂可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂或任何其他适当的添加剂。
口腔片剂形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，口腔片剂可以通过将一种或多种活性剂与以下合并来制备：填充剂(诸如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、胶体二氧化硅或淀粉)，粘合剂(诸如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或硅酸镁铝)，崩解剂(诸如淀粉、L-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠或纤维素乙醇酸钙)、润滑剂(诸如硬脂酸镁)，粘合剂(诸如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、卡波姆、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、黄原胶或瓜尔胶)，粘合助剂(诸如葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖、海藻糖、磷酸盐、柠檬酸盐、硅酸盐、甘氨酸、谷氨酸或精氨酸)，稳定剂，增溶助剂(诸如聚乙二醇、丙二醇、谷氨酸或天冬氨酸)，调味剂(诸如橙味、草莓味、薄荷味、柠檬味或香草味)或任何其他适当的赋形剂。口腔片剂可以任选地用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或任何其他适当的包衣剂包衣。可以在片剂上施用两层或更多层的包衣。口腔片剂可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂或任何其他适当的添加剂。
快速崩解口服片剂形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，为了制备快速崩解口服片剂，可以以粉末或颗粒形式提供一种或多种活性剂，其可以任选地用以下包衣：包衣剂(诸如乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或丙烯酸/甲基丙烯酸共聚物)或增塑剂(诸如聚乙二醇或柠檬酸三乙酯)。然后，可以将活性剂的粉末或颗粒形式与以下合并来制备：填充剂(诸如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、胶体二氧化硅或淀粉)，粘合剂(诸如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或硅酸镁铝)，崩解剂(诸如淀粉、L-羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠或纤维素乙醇酸钙)，润滑剂(诸如硬脂酸镁)，崩解剂(诸如葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖、海藻糖、磷酸盐、柠檬酸盐、硅酸盐、甘氨酸、谷氨酸或精氨酸)，稳定剂，增溶助剂(诸如聚乙二醇、丙二醇、谷氨酸或天冬氨酸)，调味剂(诸如橙味、草莓味、薄荷味、柠檬味或香草味)或任何其他适当的赋形剂，由此形成快速崩解口服片剂。快速崩解口服片剂可以任选地用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或任何其他适当的包衣剂包衣。可以在片剂上施用两层或更多层的包衣。快速崩解口服片剂可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂或任何其他适当的添加剂。
用于口服施用的液体剂型的药物组合物可以是溶液、悬浮液、乳液、糖浆或酏剂的形式，其中一种或多种活性剂被溶解、分散或乳化在常规使用的媒介物(诸如纯净水、乙醇或其混合物)中。液体口服剂型可以任选地包含润湿剂、分散剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂或任何其他适当的添加剂。
用于局部施用的剂型的药物组合物可以是软膏、凝胶、乳膏、膏药、贴剂、擦剂、喷雾剂、吸入剂、气溶胶、滴眼剂或鼻腔滴剂的形式，其可以根据常规已知的制备方法制备，并且可以包含一种或多种活性剂。
软膏可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，软膏可以通过将一种或多种活性剂与软膏基质通过研磨或熔化来合并而制备。为了制备软膏，可使用任何常规使用的软膏基质，其可以包含高级脂肪酸或脂肪酸酯(诸如己二酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸或其酯)，蜡(诸如蜂蜡、鲸蜡或地蜡)，表面活性剂(诸如聚氧乙烯烷基醚磷酸酯)，高级醇(诸如鲸蜡醇、硬脂醇或鲸蜡硬脂醇)，硅油(诸如二甲基聚硅氧烷)，烃类(诸如亲水矿脂、白矿脂、纯化羊毛脂或液体石蜡)，二醇(诸如乙二醇、二甘醇、丙二醇、聚乙二醇或聚乙二醇)，植物油(诸如蓖麻油、橄榄油、芝麻油或松节油)，动物油(诸如貂油、蛋黄油、角鲨烷或角鲨烯)，水，吸收增强剂，皮肤保护剂或其组合。软膏可以额外包含润湿剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、香料或任何其他适当的添加剂。
凝胶形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，凝胶可以通过将一种或多种活性剂与凝胶基质通过熔化来合并而制备。为了制备凝胶，可以使用任何常规使用的药物凝胶基质，其可以包含低级醇(诸如乙醇或异丙醇)，胶凝剂(诸如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或乙基纤维素)，中和剂(诸如三乙醇胺或二异丙醇胺)，表面活性剂(诸如聚氧乙烯甘醇单硬脂酸酯)，树胶，水，吸收增强剂，皮肤保护剂或其组合。凝胶可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、香料或任何其他适当的添加剂。乳膏形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，乳膏可以通过将一种或多种活性剂与药物乳膏基质通过熔化或乳化来合并而制备。为了制备乳膏，可以使用任何常规使用的药物乳膏基质，其可以包含高级脂肪酸酯、低级醇、烃、多元醇(诸如丙二醇或1,3-丁二醇)、高级醇(诸如2-己基癸醇或十六醇)、乳化剂(诸如聚氧乙烯烷基醚或脂肪酸酯)、水、吸收增强剂、皮肤保护剂或其组合。乳膏可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、香料或任何其他适当的添加剂。
膏药形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，膏药可以通过将一种或多种活性剂与膏药基质通过熔化来合并并将混合物施加至支持物上来制备。为了制备膏药，可以使用任何常规使用的药物膏药基质，其可以包含增稠剂(诸如聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、淀粉、明胶或甲基纤维素)，湿润剂(诸如尿素、甘油或丙二醇)，填充剂(诸如高岭土、氧化锌、滑石、钙或镁)，水，增溶助剂，增粘剂，皮肤保护剂或其组合。膏药可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、香料或任何其他适当的添加剂。
贴剂形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，贴剂可以通过将一种或多种活性剂与贴剂基质通过熔化来合并并将混合物施加至支持物上来制备。为了制备贴剂，可以使用任何常规使用的药物贴剂基质，其可以包含聚合物、油或脂肪、高级脂肪酸、增粘剂、皮肤保护剂或其组合。贴剂可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、香料或任何其他适当的添加剂。
擦剂形式的药物组合物可以根据常规已知的制备方法制备。具体而言，擦剂可以通过将一种或多种活性剂溶解、分散或乳化于媒介物中来制备，所述媒介物可以包含水、醇(诸如乙醇或聚乙二醇)、高级脂肪酸、甘油、皂、乳化剂、分散剂或其组合。擦剂可以额外包含防腐剂、抗氧化剂、香料或任何其他适当的添加剂。
喷雾剂或吸入剂形式的药物组合物可以在媒介物中包含活性剂和任选稳定剂诸如亚硫酸氢钠，或张度剂或缓冲剂，诸如氯化钠、柠檬酸钠或柠檬酸。
注射用剂型的药物组合物可以是溶液、悬浮液或乳液的形式，其包含一种或多种溶解、分散或乳化于注射用液体中的活性剂，或者可以作为包含在使用时溶解或分散于注射用液体中的活性剂的固体制剂提供。用于制备可注射制剂的注射用液体可以包含注射用水、生理盐水、植物油、丙二醇、聚乙二醇、醇诸如乙醇或其组合。可注射制剂可以额外包含稳定剂、增溶助剂(诸如谷氨酸、天冬氨酸或聚山梨醇酯)、分散剂、乳化剂、止痛剂、缓冲剂、防腐剂或任何其他适当的添加剂。为了为可注射制剂提供无菌制剂，其可以在其生产的最后步骤中进行灭菌，或者在其整个生产过程中进行无菌生产。注射用固体制剂可以作为无菌固体制剂或特别是冻干制剂提供，其在使用时可以溶解于无菌注射用水或任何其他适当的无菌液体中。
用于吸入的剂型的药物组合物可以是气溶胶、可吸入粉末或可吸入液体的形式，或者可以作为在使用时溶解或分散于水或任何其他适当的媒介物中以形成可吸入制剂的液体浓缩物提供。用于吸入的制剂可以根据常规已知的制备方法制备。可吸入液体可以任选地包含防腐剂(诸如苯扎氯铵或对羟基苯甲酸酯)、着色剂、缓冲剂(诸如磷酸钠或乙酸钠)、张度剂(诸如氯化钠或浓甘油)、增稠剂(诸如羧基乙烯基聚合物)、吸收增强剂或任何其他适当的添加剂。
可吸入粉末可以任选地包含润滑剂(诸如硬脂酸或其盐)、粘合剂(诸如淀粉或糊精)、填充剂(诸如乳糖或纤维素)、着色剂、防腐剂(诸如苯扎氯铵或对羟基苯甲酸酯)、吸收增强剂或任何其他适当的添加剂。
为了施用可吸入液体，可以使用常规使用的喷雾装置(诸如喷雾器或雾化器)。可吸入粉末可以从常规使用的粉末吸入装置分配。
喷雾剂形式的药物组合物可以在媒介物中包含活性剂和任选稳定剂(诸如亚硫酸氢钠)，或张度剂或缓冲剂(诸如氯化钠、柠檬酸钠或柠檬酸)。喷雾剂可以根据例如US 2,868,691或US 3,095,355中所述的制备方法制备。
药物组合物可以通过常规已知的制备方法制备成包含一种或多种活性剂的任何其他肠胃外剂型。其他肠胃外剂型的实例包括直肠栓剂和阴道栓剂。
在一个实施方案中，包含WT1抗原肽的药物组合物包含一种或多种选自以下的药学上可接受的载体：海藻糖、甘露醇、甲硫氨酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸和pH调节剂。
在一个实施方案中，包含免疫调节剂的药物组合物包含一种或多种选自以下的药学上可接受的载体：甘露醇、柠檬酸钠水合物、氯化钠、二亚乙基三胺五乙酸，聚山梨酯和pH调节剂。
WT1抗原肽和免疫调节剂可以以任何途径施用，所述途径取决于诸如待治疗的疾病、对象的状况和靶部位的因素。施用包括通过注射或输注的静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下或脊柱内施用，以及其他肠胃外施用。如本文所用的术语“肠胃外施用”是除了肠内施用和局部施用之外的通过注射或输注的常用施用模式，并且可以是，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外或胸骨下注射或输注。WT1抗原肽可以在淋巴细胞疗法或DC(树突细胞)疗法中施用。免疫调节剂可以通过经皮施用或经粘膜施用诸如鼻内、口腔、阴道、直肠或舌下施用来施用。
除了免疫调节剂以外，WT1抗原肽可以与非药物疗法组合以更有效地治疗或预防癌症。非药物疗法可以是手术、放射疗法、基因疗法、过热、冷冻疗法或激光燃烧疗法，并且可以组合两种或更多种非药物疗法。例如，本发明的药物组合物或药物组合物和伴随药物的组合可以在非药物疗法诸如手术之前或之后，或者在用两种或三种非药物疗法治疗之前或之后使用，以预防抗性的发展，延长无病生存期，预防癌症的转移或复发，或延长生存期。
对于WT1抗原肽或免疫调节剂，可以适当地选择施用的剂量量、剂型和频率，这取决于诸如待治疗的疾病、对象的状况和靶部位的因素。每次施用的WT1抗原肽的剂量量为通常0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-1000mg，更优选0.1mg-10mg。每kg体重的免疫调节剂的剂量量为通常0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-1000mg，更优选0.1mg-10mg。
如本文所用的术语“有效量”是指WT1抗原肽或免疫调节剂或两种或更多种WT1抗原肽或免疫调节剂的组合完全或部分抑制癌症的进展或至少部分缓解癌症的一种或多种症状的量。有效量可以是治疗或预防有效量。有效量根据诸如对象的年龄或性别、待治疗的病况、病况的严重程度和期望的结果的因素来确定。特定对象的有效量可以通过技术人员已知的任何方法来确定。
本发明可以用于治疗或预防(包括预防其复发)表达WT1基因的癌症或伴随WT1基因表达水平升高的癌症。因此，在一个实施方案中，所述癌症可以是血液癌症，诸如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤，以及实体瘤诸如胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、多形性成胶质细胞瘤、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌或脑肿瘤。
此外，由于联合使用免疫调节剂，预期本发明会增加T细胞活化阈值并活化对宿主内的肿瘤的反应。因此，在另一个实施方案中，癌症可以是骨癌、胰腺癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、直肠癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病诸如急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括石棉诱导的癌症，以及如上所述的癌症的组合。预期本发明也可用于治疗转移性癌症，特别是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖人和非类动物。非人动物可以是，但不限于，哺乳动物诸如非人灵长类动物，绵羊，犬科动物，猫科动物，马科动物和牛科动物。在这些哺乳动物中，优选需要增强免疫应答的人类对象，特别是人类对象。因此，本发明特别适合于治疗患有预期通过促进T细胞介导的免疫应答来治疗的疾病的人类对象。
如本文所公开的WT1抗原肽和免疫调节剂可以包含在单独的制剂中或单一制剂中。因此，本发明的药物组合物可以是包含与免疫调节剂组合使用的WT1抗原肽的药物组合物，包含与WT1抗原肽组合使用的免疫调节剂的药物组合物，或包含WT1抗原肽和免疫调节剂的药物组合物(即，组合制剂)。本发明的药物组合物可以以试剂盒的形式提供。例如，试剂盒可以含有包含WT1抗原肽的药物组合物和包含免疫调节剂的药物组合物。本发明的药物组合物和试剂盒可以提供有显示诸如用于组合使用WT1抗原肽和免疫调节剂的剂量量或剂量方案的信息的包装插页、包装或说明书。在一个实施方案中，本发明的药物组合物和试剂盒可以作为用于治疗癌症的医疗产品提供。
WT1抗原肽和免疫调节剂可以同时或分开施用。而且，WT1抗原肽和免疫调节剂可以与另外的伴随药物同时或分开施用。如本文所用的表述“同时施用”是指活性成分以相同的剂量方案施用，并且活性成分可以包含在单一制剂中或分开制剂中。当活性成分包含在分开制剂中时，制剂可以以单剂量或依次施用。表述“分开施用”是指活性成分以不同的剂量方案施用。因此，活性成分的施用之后是一定时间间隔后施用不同的活性成分，并且活性成分的施用顺序和时间间隔的长度没有限制。在活性成分之间施用的频率可以相同或不同。例如，活性成分的施用频率可以是一天一次，而不同活性成分的频率可以是每天两次或更多次。
当活性成分包含在单一制剂中时，活性成分的比率可以基于诸如对象、施用途径、待治疗的疾病、对象的状况或其组合的因素适当地确定。例如，当对象是人时，WT1抗原肽与免疫调节剂或伴随药物的比率可以是1重量份至0.01-100重量份。
本发明的药物组合物可以与另外的药剂诸如止吐剂、睡眠诱导剂或抗惊厥药组合使用，以减少副作用。
WT1抗原肽增加肿瘤中的肿瘤反应性CTL。因此，当WT1抗原肽与免疫调节剂组合时，可以减少免疫调节剂的剂量量，且因此减少不利事件。因此，WT1抗原肽和免疫调节剂的组合将提供更有效的治疗，具有更高的安全性。
实施例
下文通过参照实施例来具体解释本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：免疫检查点抑制剂的组合使用对来自人外周血单核细胞的肿瘤抗原肽-特异性细胞毒性T细胞的诱导的作用
将HLA-A*02:01阳性成人(C.T.L)的冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)重构，悬浮于培养基中，并以1.5×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。用补充5％人血清(Lonza)和1％MEM非必需氨基酸溶液(100×)(Life Technologies)的AIM V培养基(LifeTechnologies)，在37℃、5％CO2下培养细胞。向PBMC中添加抗人PD-1抗体(组A)或抗人PD-L1抗体(组B)或不添加抗人PD-1和PD-L1抗体(组C，对照组)。每组包括24个样品(24个孔)。抗人PD-1抗体为克隆EH12.2H7(BioLegend)，且抗人PD-L1抗体为29E.243(BioLegend)。分别使用小鼠IgG1,κ(BioLegend)和小鼠IgG2b,κ(BioLegend)作为抗人PD-1和PD-L1抗体的同种型对照。
在组A中，分别以10μg/ml的终浓度添加抗人PD-1抗体和同种型对照小鼠IgG2b,κ。在组B中，分别以10μg/ml的终浓度添加抗人PD-L1抗体和同种型对照小鼠IgG1,κ。在组C中，分别以10μg/ml的终浓度添加同种型对照小鼠IgG1,κ和小鼠IgG2b,κ。在培养的第1天(开始培养后一天)，分别将WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)以20μg/ml的终浓度添加至培养的细胞。在培养的第2天，以50U/ml的终浓度添加人IL-2(Shionogi&Co.,Ltd.)。在培养的第5天和第9天，将培养基的一半用含有100U/ml人IL-2的培养基替代。在培养的第13天，收集每组中24个样品的细胞，并用针对杀伤肽A(SEQ ID NO:2)的PE-标记的HLA四聚体(MBL)和FITC-标记的抗CD8抗体(BD)的组合、或针对杀伤肽B(SEQ ID NO:8)的PE-标记的HLA四聚体(MBL)和FITC-标记的抗CD8抗体(BD)的组合进行染色，并用流式细胞仪MACSQuant分析仪(Miltenyi Biotec)分析杀伤肽-特异性CTL。
在其中没有添加抗人PD-1抗体和抗人PD-L1抗体的组C中，在24个样品中的任一者都没有检测到杀伤肽A或B特异性的CTL。在其中添加抗人PD-1抗体的组A中，在24个样品之一中检测到杀伤肽B特异性的CTL(图1)。在其中添加抗人PD-L1抗体的组B中，在24个样品之一中检测到杀伤肽A特异性的CTL(图2)，且在24个样品中的两个检测到杀伤肽B特异性的CTL(图3)。结果显示于图1-3中。这些结果表明免疫检查点抑制剂、抗人PD-1和抗人PD-L1抗体在体外增强了用WT1肽刺激的PBMC的CTL诱导。
实施例2：免疫检查点抑制剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽的免疫应答的作用
将HLA-A*02:01阳性成人(C.T.L)的冷冻保存的外周血单核细胞(PBMC)重构，悬浮于培养基中，并接种在U-底96孔板上。用补充有5％人血清(Lonza)和1％MEM非必需氨基酸溶液(100×)(Life Technologies)且含有20μg/ml杀伤肽B和100U/ml人IL-2(Shionogi&Co.,Ltd.)的AIM V培养基(Life Technologies)培养细胞。在培养的第3天、第7天和第11天，培养基的一半用新鲜培养基替代。在培养的第13天，收集各孔的细胞，并用针对杀伤肽B的PE-标记的HLA四聚体(MBL)和FITC-标记的抗CD8抗体(BD)染色，并用流式细胞仪MACSQuant分析仪(Miltenyi Biotec)分析杀伤肽B-特异性CTL。将从其中检测到杀伤肽B-特异性CTL的孔中收集的细胞混合以提供WT1抗原肽-特异性CTL系。将WT1抗原肽-特异性CTL系用冷冻保存介质CELLBANKER(Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd.)冷冻保存。
将冷冻保存的WT1抗原肽-特异性CTL系用含有100U/ml人IL-2(Shionogi&Co.,Ltd.)的培养基重构并培养过夜。将细胞收集，用培养基洗涤，并在与抗人PD-1抗体(EH12.2H7)(组A)或抗人PD-L1抗体(29E.243)(组B)一起，或无抗人PD-1和抗人PD-L1抗体(C组，对照组)的情况下培养2小时。在组A中，分别以10μg/ml的终浓度添加抗人PD-1抗体和同种型对照小鼠IgG2b,κ。在组B中，分别以10μg/ml的终浓度添加抗人PD-L1抗体和同种型对照小鼠IgG1,κ。在组C中，分别以10μg/ml的终浓度添加同种型对照小鼠IgG1,κ和小鼠IgG2b,κ。抗体是实施例1中使用的抗体。使用IFN-γELISPOT Set(BD)测量肽-特异性细胞应答。将细胞置于ELISPOT板中，并以在存在或不存在40μg/ml的终浓度的杀伤肽B(SEQ IDNO:8)的情况下培养18小时。在各组中，制备两个样品。然后，根据制造商的方案，对所述板进行处理，并用ACE Substrate Set(BD)进行显色。用ELISPOT分析仪(C.T.L)计数斑点。对于组A、B和C中的每一个，通过从添加肽的样品的平均斑点数量中减去不添加肽的样品的平均斑点数量来计算应答。
与对照组C相比，分别用抗人PD-1抗体和抗人PD-L1抗体处理的组A和B分别产生比对照组C多的1.7倍和1.4倍的斑点。结果显示于图4中。这些结果证实免疫检查点抑制剂增强WT1抗原肽-特异性CTL对WT1抗原肽的应答。
实施例3：免疫检查点分子在接受WT1杀伤肽和WT1辅助肽的鸡尾酒疫苗的小鼠脾细胞中的表达变化本实施例中使用的HLA-A*02:01转基因小鼠(C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)缺乏小鼠MHC分子，但表达人MHC HLA-A02:01和小鼠MHC H-2Db的嵌合HLA分子以及HLA-DRB1*01:01(Eur J Immunol.2004；34:3060-9)。在该小鼠中，可以用人HLA-A*02:01-结合肽诱导CTL。而且，在该小鼠中，可以用人HLA-DRB1*01:01-结合肽诱导辅助性T细胞，且因此可以评估用辅助肽对CTL诱导的增强。
将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的组合物与等体积的不完全弗氏佐剂Montanide ISA51VG混合以提供乳剂。将由此获得的鸡尾酒疫苗(下文称为“疫苗”)以1周间隔两次皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠每次免疫施用1mg WT1杀伤肽和0.75mg WT1辅助肽)。最后施用后一周，接种疫苗和未接种疫苗的小鼠用CO2气体安乐死，并且从小鼠取出脾脏以制备脾细胞。脾细胞用FITC-标记的抗CD8抗体(BD Pharmingen)、PE-标记的抗CD4抗体(BD Pharmingen)、针对WT1杀伤肽(SEQ IDNO:8)的PE-标记的HLA四聚体(MBL)、APC-标记的抗PD-1抗体(BD Pharmingen，克隆J43)、APC-标记的同种型对照抗体(BD Pharmingen，仓鼠IgG2,κ)、APC-标记的抗PD-L1抗体(BioLegends，克隆10F.9G2)和APC-标记的同种型对照抗体(eBioscience，大鼠IgG2b,κ)染色，并用流式细胞仪MACSQuant分析仪(Miltenyi Biotec)分析。
结果显示于图5-10中。图5和8显示来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体+级分(点划线)；来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体-级分(短划线)；和来自未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD8+,四聚体-级分(实线)中的PD-1(图5)和PD-L1(图8)的表达。虚线表示用同种型对照染色的结果。图6、7、9和10显示来自接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD4+T细胞(图6和9，短划线)和CD4-,CD8-细胞(图7和10，短划线)；和来自未接种疫苗的小鼠的脾细胞的CD4+T细胞(图6和9，实线)和CD4-,CD8-细胞(图7和10，实线)中的PD-1(图6和7)和PD-L1(图9和10)的表达。虚线表示用同种型对照染色的结果。如图中所示，疫苗施用在CD8+T细胞、特别是CD8+,WT1四聚体+T细胞中诱导高PD-1表达(图5-7)。PD-L1在接种疫苗和未接种疫苗的小鼠中的任何类型的细胞中表达，并且在施用疫苗的情况下在CD4+T细胞中上调(图8-10)。这些结果表明疫苗施用分别诱导WT1-特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞中PD-1和PD-L1的表达。
实施例4：免疫检查点抑制剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对肿瘤细胞的免疫应答的作用
如实施例3中所述，将包含WT1杀伤肽和WT1辅助肽的组合物用等量的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠每次免疫施用1mg WT1杀伤肽和0.75mg WT1辅助肽)。最后施用后1周，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用完全T细胞介质(下文称为“CTM”)制备脾细胞的悬浮液。将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)以40mg/mL用DMSO溶解并用CTM稀释至500μg/mL。将肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃，5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合。向由此获得的脾细胞悬浮液中以10μg/mL添加抗PD-1抗体(Bio X cel，克隆RMP1-14)或同种型对照抗体(Bio Xcell，大鼠IgGa,κ)，并将细胞在37℃、5％CO2下培养5天。培养的脾细胞用10％FBS RPMI1640洗涤并用作应答细胞。然后，将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)以40mg/mL用DMSO溶解，并进一步用10％FBS RPMI1640稀释至100μg/mL。将EL4HHD细胞(J Exp Med.1997；185:2043-51)用含有肽的RPMI1640培养基或不含该肽的RPMI1640培养基悬浮，并在37℃、5％CO2下静置约1小时。EL4HHD是通过在小鼠淋巴瘤细胞系EL4 S3-Rob中稳定表达被称为HHD的嵌合HLA分子(其具有人HLA-A*02:01的α3结构域而不是小鼠MHC I类H-2Db的α3结构域)建立的细胞系(Eur J Immunol.1990；20:171-7)。用10％FBS RPMI1640洗掉过量肽后，将细胞用作刺激细胞。将EL4HHD刺激细胞(1×105个细胞/孔)和培养5天的脾应答细胞(5×105个细胞/孔)在U-底96孔板上混合，并在37℃、5％CO2下培养24小时。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
仅在与用该肽预处理的刺激细胞混合的应答细胞中观察到IFN-γ产生。此外，与抗PD-1抗体培养的应答细胞的IFN-γ产生高于与同种型对照抗体培养的应答细胞。在与未用该肽处理的刺激细胞混合的应答细胞中没有观察到IFN-γ产生。因此，表明WT1抗原肽-特异性T细胞产生IFN-γ。这些结果表明，由疫苗施用诱导的WT1抗原肽-特异性T细胞通过抗PD-1抗体的处理而被活化，且因此增强对肿瘤细胞的免疫应答。
上述实施例表明，当WT1抗原肽与抗PD-1或PD-L1抗体组合时，WT1-特异性T细胞被更有效地诱导；免疫检查点分子的表达在疫苗施用诱导的T细胞中上调；并且抗PD-1或PD-L1抗体的处理增加由WT1抗原肽诱导的肽-特异性T细胞的活性。因此，WT1抗原肽和免疫检查点抑制剂的联合疗法协同地增加各种药剂的治疗效果，且有助于改善对癌症的治疗效果和改善QOL。
实施例5：组合药剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.5mg WT1杀伤肽和0.375mg WT1辅助肽)。施用后1周，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用CTM制备脾细胞的悬浮液。将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)用DMSO以40mg/mL溶解。将WT1杀伤肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，并以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。通过在小鼠Lewis肺癌细胞系LLC中稳定表达HHD和WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)建立的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞用作肿瘤细胞。将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在存在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以5×104个细胞/孔或3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM(介质)、同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂抗体、TLR激动剂或β-联蛋白抑制剂培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为10μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗TIM-3(BioLegend，克隆RMT3-23)、抗CD160(eBioscience，克隆eBioCNX46-3)、抗LAG-3(BioLegend，克隆C9B7W)、抗-BTLA(BioLegend，克隆6A6)、抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)、抗HVEM(BioLegend，克隆HMHV-1B18)、抗VISTA(BioLegend，克隆MH5A)或抗PVR(Hycult Biotech，克隆3F1)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗4-1BB(Bio X Cell，克隆LOB12.3)、抗OX40(Bio X Cell，克隆OX-86)、抗GITR(BioLegend，克隆DTA-1)或抗CD40(BioLegend，克隆1C10)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1、抗TIM-3、抗CD160和抗CD40抗体的大鼠IgG2aκ(BD Pharmingen)；对于抗PD-L1和抗PVR抗体的大鼠IgG2a(Bio X细胞)；对于抗BTLA、抗HVEM和抗VISTA抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；对于抗LAG-3、抗4-1BB和抗OX40抗体的大鼠IgG1κ(eBiosciecne)；和对于抗GITR抗体的大鼠IgG2b(Bio X Cell)。TLR激动剂是TLR3激动剂，聚I:C HMW(GEHealthcare，终浓度为30μg/mL)或聚I:C LMW(GeneDesign，终浓度为30μg/mL)；或TLR7激动剂，咪喹莫特(终浓度为10μg/mL)；TLR7/8激动剂，R848(终浓度为1μmol/L)；或TLR9激动剂，CpG-ODN-D19(终浓度为1μmol/L)，CpG-ODN-1826(终浓度为1μmol/L)或CpG-ODN-C583(终浓度为1μmol/L)。β-联蛋白抑制剂是终浓度为5μmol/L的XAV939。用ELISA试剂盒(R&DSystems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图12-15中。具有免疫检查点抑制剂(图12A-12I)或共刺激分子激动剂抗体(图13A-13D)的培养物中的IFN-γ产生高于具有相应同种型对照抗体的培养物中的IFN-γ产生。而且，具有TLR激动剂(图14A-14D)或β-联蛋白抑制剂(图15)的培养物中的IFN-γ产生高于具有CTM介质的培养物中的IFN-γ产生。这些结果证实免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂、TLR激动剂和β-联蛋白抑制剂增强WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答。
实施例6：组合药剂对来自荷瘤动物的WT1抗原肽-特异性CTLs的免疫反应性的作用已经通过在小鼠淋巴瘤细胞系EL4中稳定表达HLA-A2402/Kb(具有小鼠MHC I类H-2Kb的α3结构域而不是人HLA-A*24:02的α3结构域的嵌合HLA分子)和WT1杀伤肽(SEQ ID NO:4)来建立EL4-A24/Kb-WT1肿瘤细胞。将EL4-A24/Kb-WT1肿瘤细胞悬浮在Hanks平衡盐溶液中并皮内移植至HLA-A*24:02转基因小鼠的腹侧区(每只小鼠3×105个细胞或5×105个细胞)。移植后1天和8天，将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*24:02转基因小鼠的两个部位，前肢和后肢的根部(每只小鼠每次施用施用1mg WT1杀伤肽和0.75mg WT1辅助肽)。移植后15天，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用CTM制备脾细胞的悬浮液。将脾细胞以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM、同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂或共刺激分子激动剂抗体一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗CTLA-4(BioLegend，克隆UC10-4B9)或抗TIGIT(Bio X Cell，克隆1G9)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗ICOS抗体(BioLegend，克隆C398.4A)。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BDPharmingen)；对于抗CTLA-4和抗ICOS抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；和对于抗TIGIT抗体的小鼠IgG1(Bio X Cell)。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图16-17中。具有免疫检查点抑制剂(图16A-16C)或共刺激分子激动剂抗体(图17)的培养物中的IFN-γ产生高于具有相应同种型对照抗体的培养物中的IFN-γ产生。这些结果证实免疫检查点抑制剂和共刺激分子激动剂增强来自荷瘤动物的WT1抗原肽-特异性CTL的免疫反应性。
实施例7：组合药剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:11)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.3mgWT1杀伤肽和0.3mg WT1辅助肽)。施用后1周，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用CTM制备脾细胞的悬浮液。将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)用DMSO以40mg/mL溶解。将WT1杀伤肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，并以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。使用LLC-HHD-WT1肿瘤细胞作为肿瘤细胞。将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在存在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM、同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂或共刺激分子激动剂抗体一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗B7-H4(BioLegend，克隆HMH4-5G1)或抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗4-1BB(BioX Cell，克隆LOB12.3)或抗OX40(Bio XCell，克隆OX-86)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BD Pharmingen)；对于抗PD-L1抗体的大鼠IgG2a(Bio X Cell)；对于抗B7-H4抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；和对于抗4-1BB和抗OX40抗体的大鼠IgG1κ(eBiosciecne)。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图18-19中。具有免疫检查点抑制剂(图18A-18C)或共刺激分子激动剂抗体(图19A-19B)的培养物中的IFN-γ产生高于具有相应同种型对照抗体的培养物中的IFN-γ产生。这些结果证实免疫检查点抑制剂和共刺激分子激动剂增强WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答。
实施例8：组合药剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:14)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.3mgWT1杀伤肽和0.3mg WT1辅助肽)。施用后1周，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用CTM制备脾细胞的悬浮液。将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)用DMSO以40mg/mL溶解。将WT1杀伤肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，并以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。使用LLC-HHD-WT1肿瘤细胞作为肿瘤细胞。将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在存在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM、同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂或共刺激分子激动剂抗体一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗B7-H4(BioLegend，克隆HMH4-5G1)或抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗4-1BB(BioX Cell，克隆LOB12.3)或抗OX40(Bio XCell，克隆OX-86)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BD Pharmingen)；对于抗PD-L1抗体的大鼠IgG2a(Bio X Cell)；对于抗B7-H4抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；和对于抗4-1BB和抗OX40抗体的大鼠IgG1κ(eBiosciecne)。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图20-21中。具有免疫检查点抑制剂(图20A-20C)或共刺激分子激动剂抗体(图21A-21B)的培养物中的IFN-γ产生高于具有相应同种型对照抗体的培养物中的IFN-γ产生。这些结果证实免疫检查点抑制剂和共刺激分子激动剂增强WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答。
实施例9：组合药剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:26)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:37)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.234mg WT1杀伤肽和0.234mg WT1辅助肽)。施用后1周，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用CTM制备脾细胞的悬浮液。将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:26)用DMSO以40mg/mL溶解。将WT1杀伤肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，并以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。使用LLC-HHD-WT1肿瘤细胞作为肿瘤细胞。将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在存在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM、同种型对照抗体或免疫检查点抑制剂一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)或抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BD Pharmingen)和对于抗PD-L1抗体的大鼠IgG2a(Bio X Cell)。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图22中。具有免疫检查点抑制剂的培养物中的IFN-γ产生高于具有相应同种型对照抗体的培养物中的IFN-γ产生。这些结果证实免疫检查点抑制剂增强WT1抗原肽-特异性CTL对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答。
实施例10：组合药剂对WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:5)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:11)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.3mgWT1杀伤肽和0.3mg WT1辅助肽)。施用后1周，将小鼠用CO2气体安乐死，并从小鼠取出脾脏，以使用CTM制备脾细胞的悬浮液。将WT1杀伤肽(SEQ ID NO:5)用DMSO以40mg/mL溶解。将WT1杀伤肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，并以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，并以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上。使用LLC-HHD-WT1肿瘤细胞作为肿瘤细胞。将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在存在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM、同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂或共刺激分子激动剂抗体一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗B7-H4(BioLegend，克隆HMH4-5G1)或抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗4-1BB(Bio X Cell，克隆LOB12.3)、抗OX40(Bio X Cell，克隆OX-86)或抗GITR(BioLegend，克隆DTA-1)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BDPharmingen)；抗PD-L1抗体的大鼠IgG2a(Bio X Cell)；对于抗B7-H4抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；对于抗4-1BB和抗OX40抗体的大鼠IgG1κ(eBiosciecne)；和对于抗GITR抗体的大鼠IgG2b(Bio X Cell)。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图23-24中。具有免疫检查点抑制剂(图23A-23C)或共刺激分子激动剂抗体(图24A-24C)的培养物中的IFN-γ产生高于具有相应同种型对照抗体的培养物中的IFN-γ产生。这些结果证实免疫检查点抑制剂和共刺激分子激动剂增强WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答。
实施例11：用免疫检查点抑制剂增强疫苗对肿瘤增殖的体内抑制本实施例中使用的HLA-A*24:02转基因小鼠(C57BL/6CrHLA-A24/Kb)表达人MHC HLA-A24:01和小鼠MHC H-2Kb的嵌合HLA分子(Int.J.Cancer 2002；100:565-570)。在该小鼠中，可以用人HLA-A*24:02-结合肽诱导CTL。
将EL4-A24/Kb-WT1肿瘤细胞悬浮在Hanks平衡盐溶液中并皮内移植至HLA-A*24:02转基因小鼠的腹侧区(每只小鼠3×105个细胞)。小鼠接受媒介物(Montanide和磷酸盐缓冲盐水)(组a)；Montanide和抗PD-1抗体(组b)；疫苗和同种型对照抗体(组c)；或疫苗和抗PD-1抗体(组d)。每组使用5只小鼠。肿瘤移植后1天和8天，对于组a和b的小鼠，将包含注射用水的组合物用等体积的Montanide乳化并在两个部位(前肢和后肢的根部)皮内施用(每只小鼠每次施用0.1mL)。对于组c和d的小鼠，将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*24:02转基因小鼠的两个部位(前肢和后肢的根部，每只小鼠每次施用施用0.5mg WT1杀伤肽和0.375mg WT1辅助肽)。在肿瘤移植后1、4、8和11天，将磷酸盐缓冲盐水腹膜内施用至组a的小鼠(每只小鼠每次施用0.1mL)。向组b和d的小鼠，腹膜内施用抗PD-1抗体(Bio X Cell，克隆RMP1-14)(每只小鼠每次施用0.2mg)。向组c的小鼠，腹膜内施用同种型对照抗体(Bio XCell，大鼠IgG2a)(每只小鼠每次施用0.2mg)。在肿瘤移植后4、7、10、11、17和21天测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积和显示肿瘤排斥的动物的比率。
结果显示于图25中。与媒介物(组a)相比，抗PD-1抗体(组b)或WT1疫苗(组c)显著抑制肿瘤增殖(参数Dunnett多重检验，*：p<0.05)。当抗PD-1抗体与WT1疫苗联合使用时，肿瘤增殖的抑制是更显著的(组D，**：p<0.01)。如表1中所示，在肿瘤移植后11天，在接受抗PD-1抗体的组中没有动物显示肿瘤排斥，但当抗PD-1抗体与WT1疫苗组合时，显示肿瘤排斥的动物的比率是40％。这些结果证实，将WT1疫苗和免疫检查点抑制剂组合增强肿瘤增殖的抑制并改善治疗响应。
表1：显示肿瘤排斥的动物的比率
实施例12：用免疫检查点抑制剂增强疫苗对肿瘤增殖的体内抑制将EL4-A24/Kb-WT1肿瘤细胞悬浮在Hanks平衡盐溶液中并皮内移植至HLA-A*24:02转基因小鼠的腹侧区(每只小鼠3×105个细胞)。小鼠接受载体(Montanide和磷酸盐缓冲盐水)(组a)；Montanide和抗CTLA-4抗体(组b)；疫苗和同种型对照抗体(组c)；或疫苗和抗CTLA-4抗体(组d)。每组使用6只小鼠。肿瘤移植后3天、4天和10天，对于组a和b的小鼠，将包含注射用水的组合物用等体积的Montanide乳化并在两个部位(前肢和后肢的根部)皮内施用(每只小鼠每次施用0.1mL)。对于组c和d的小鼠，将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*24:02转基因小鼠的两个部位(前肢和后肢的根部，每只小鼠每次施用施用0.5mg WT1杀伤肽和0.375mg WT1辅助肽)。在肿瘤移植后1、4、7和10天，将磷酸盐缓冲盐水腹膜内施用至组a的小鼠(每只小鼠每次施用0.1mL)。向组b和d的小鼠，腹膜内施用抗CTLA-4抗体(Bio X Cell，克隆UC10-4F10-11)(每只小鼠每次施用0.2mg)。向组c的小鼠，腹膜内施用同种型对照抗体(Bio X Cell，亚美尼亚仓鼠IgG)(每只小鼠每次施用0.2mg)。在肿瘤移植21天后测量肿瘤大小并计算肿瘤体积。
结果显示于图26中。与媒介物(组a)相比，抗CTLA-4抗体(组b)或WT1疫苗(组c)没有显著抑制肿瘤增殖(参数Dunnett多重检验，NS：无显著差异)。相反，抗CTLA-4抗体和WT1疫苗的组合显著抑制肿瘤增殖(组d，*：p<0.05)。这些结果证实，将WT1疫苗和免疫检查点抑制剂组合增强肿瘤增殖的抑制。
实施例13：组合药剂对鸡尾酒疫苗诱导的WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.5mg WT1杀伤肽和0.375mg WT1辅助肽)。或者，将包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.5mg WT1杀伤肽)。施用后一周，小鼠用CO2气体安乐死，并且从小鼠取出脾脏以使用CTM制备脾细胞。脾细胞用FITC-标记的抗CD8抗体(BD Pharmingen)和PE-标记的针对WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的HLA四聚体(MBL)进行染色，并用流式细胞仪分析杀伤肽-特异性CTL。
此外，将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下培养约3天。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
此外，如实施例5中所述，将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在存在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与CTM、同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂抗体或β-联蛋白抑制剂一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗LAG-3(BioLegend，克隆C9B7W)、抗BTLA(BioLegend，克隆6A6)、抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)或抗VISTA(BioLegend，克隆MH5A)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗4-1BB(Bio X Cell，克隆LOB12.3)、抗OX40(Bio XCell，克隆OX-86)或抗GITR(BioLegend，克隆DTA-1)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BD Pharmingen)；对于抗PD-L1抗体的大鼠IgG2a(Bio X Cell)；对于抗BTLA和抗VISTA抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；对于抗LAG-3、抗4-1BB和抗OX40抗体的大鼠IgG1κ(eBiosciecne)；和对于抗GITR抗体的大鼠IgG2b(Bio XCell)。β-联蛋白抑制剂是终浓度为5μmol/L的XAV939。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图27-32中。流式细胞术分析显示，来自接受包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:18)的疫苗(被称为“鸡尾酒疫苗a”)的小鼠的脾细胞含有的WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)特异性的CTL是来自接受仅包含WT1杀伤肽(式(3)的化合物)的疫苗(被称为“杀伤疫苗a”)的小鼠的脾细胞中的WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)特异性的CTL的1.9倍(图27)。当这些脾细胞在存在WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的情况下培养时，来自接受鸡尾酒疫苗a的小鼠的脾细胞产生的IFN-γ的量比来自接受杀伤疫苗a的小鼠的脾细胞的高2倍(图28)。相反，当这些脾细胞首先与肿瘤细胞混合且然后在WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)存在或不存在的情况下培养时，与在用WT1杀伤肽进行培养之前未与肿瘤细胞混合的脾细胞相比，来自脾细胞的IFN-γ产生减少。然而，当在WT1存在或不存在的情况下培养时，来自接受鸡尾酒疫苗a的小鼠的脾细胞产生的IFN-γ的量分别比来自接受杀伤疫苗a的小鼠的脾细胞的高12倍和6.9倍(图29)。这些结果证实，来自接受杀伤疫苗a的小鼠的脾细胞中包括的CTL比来自接受鸡尾酒疫苗a的小鼠的脾细胞中包括的CTL更强烈地被肿瘤细胞抑制。此外，当脾细胞除了WT1杀伤肽以外还与免疫检查点抑制剂(图30)、共刺激分子激动剂抗体(图31)或β-联蛋白抑制剂(图32)一起在肿瘤细胞存在的情况下培养时，来自接受鸡尾酒疫苗a的小鼠的脾细胞，以与实施例5相同的方式被组合药剂显著活化。相反，来自接受杀伤疫苗a的小鼠的脾细胞未被活化。这些结果证实，在WT1疫苗中包括杀伤肽和辅助肽两者对于通过免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂抗体或β-联蛋白抑制剂增加WT1抗原肽-特异性CTL对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答是重要的。
实施例14：组合药剂对鸡尾酒疫苗诱导的WT1抗原肽-特异性CTL针对WT1抗原肽或肿瘤细胞的免疫应答的作用将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:11)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.3mg WT1杀伤肽和0.3mg WT1辅助肽)。或者，将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的组合物用等体积的Montanide乳化并且皮内施用至HLA-A*02:01转基因小鼠的尾根部(每只小鼠施用0.3mg WT1杀伤肽)。施用后一周，小鼠用CO2气体安乐死，并且从小鼠取出脾脏以使用CTM制备脾细胞。脾细胞用FITC-标记的抗CD8抗体(BD Pharmingen)和PE-标记的针对WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的HLA四聚体(MBL)进行染色，并用流式细胞仪分析杀伤肽-特异性CTL。
此外，将包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的肽溶液以100μg/mL的终浓度添加至一部分脾细胞中，并将细胞在37℃、5％CO2下静置约1小时。用CTM洗掉过量肽后，将肽脉冲的脾细胞和未脉冲的脾细胞以1:10的比率混合，以3.85×105个细胞/孔接种在U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下培养约3天。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
此外，如实施例7中所述，将X-射线照射(50Gy)的LLC-HHD-WT1肿瘤细胞在小鼠重组IFN-γ(100ng/mL)存在的情况下培养约2天，并用CTM洗涤。将LLC-HHD-WT1肿瘤细胞以3.5×104个细胞/孔接种在含有脾细胞的U-底96孔板上，并在37℃、5％CO2下与同种型对照抗体、免疫检查点抑制剂或共刺激分子激动剂抗体一起培养约3天。免疫检查点抑制剂是终浓度为30μg/mL的抗PD-1(BioLegend，克隆29F.1A12)、抗B7-H4(BioLegend，克隆HMH4-5G1)或抗PD-L1(eBiosciecne，克隆MIH5)抗体。共刺激分子激动剂抗体是终浓度为30μg/mL的抗4-1BB(Bio X Cell，克隆LOB12.3)或抗OX40(Bio XCell，克隆OX-86)抗体。同种型对照抗体是对于抗PD-1抗体的大鼠IgG2aκ(BD Pharmingen)；对于抗PD-L1抗体的大鼠IgG2a(Bio XCell)；对于抗B7-H4抗体的亚美尼亚仓鼠IgG(eBioscience)；和对于抗4-1BB和抗OX40抗体的大鼠IgG1κ(eBiosciecne)。用ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养上清液中小鼠IFN-γ的浓度。
结果显示于图33-39中。流式细胞术分析显示，来自接受包含WT1杀伤肽(SEQ IDNO:2)和WT1辅助肽(SEQ ID NO:11)的疫苗(被称为“鸡尾酒疫苗b”)的小鼠的脾细胞含有的WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)特异性的CTL是来自接受仅包含WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的疫苗(被称为“杀伤疫苗b”)的小鼠的脾细胞中的WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)特异性的CTL的1.3倍(图33)。当这些脾细胞在存在WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)的情况下培养时，来自接受鸡尾酒疫苗b的小鼠的脾细胞产生的IFN-γ的量比来自接受杀伤疫苗b的小鼠的脾细胞的高2.6倍(图34A-34B)。当这些脾细胞首先与肿瘤细胞混合且然后在WT1杀伤肽(SEQ ID NO:2)存在或不存在的情况下培养时，与在用WT1杀伤肽进行培养之前未与肿瘤细胞混合的脾细胞相比，来自脾细胞的IFN-γ产生减少。当脾细胞除了WT1杀伤肽以外还与免疫检查点抑制剂(图35-37)或共刺激分子激动剂抗体(图38-39)一起在肿瘤细胞存在的情况下培养时，来自接受鸡尾酒疫苗b的小鼠的脾细胞，以与实施例7相同的方式被组合药剂显著活化。相反，来自接受杀伤疫苗b的小鼠的脾细胞未被活化。这些结果证实，在WT1疫苗中包括杀伤肽和辅助肽两者对于通过免疫检查点抑制剂或共刺激分子激动剂抗体增加WT1抗原肽-特异性CTL对WT1抗原肽或肿瘤细胞的应答是重要的。
产业实用性
本发明可用于制药领域，例如癌症的治疗和预防组合物的开发或制造中。
序列表自由文本
SEQ ID NO:2肽
SEQ ID NO:3肽
SEQ ID NO:4肽
SEQ ID NO:5肽
SEQ ID NO:6肽
SEQ ID NO:7肽
SEQ ID NO:8肽
SEQ ID NO:9肽
SEQ ID NO:10肽
SEQ ID NO:11肽
SEQ ID NO:12肽
SEQ ID NO:13肽
SEQ ID NO:14肽
SEQ ID NO:15肽
SEQ ID NO:16肽
SEQ ID NO:17肽
SEQ ID NO:18肽
SEQ ID NO:19肽
SEQ ID NO:20肽
SEQ ID NO:21肽
SEQ ID NO:22肽
SEQ ID NO:23肽
SEQ ID NO:24肽
SEQ ID NO:25肽
SEQ ID NO:26肽
SEQ ID NO:27肽
SEQ ID NO:28肽
SEQ ID NO:29肽
SEQ ID NO:30肽
SEQ ID NO:31肽
SEQ ID NO:32肽
SEQ ID NO:33肽
SEQ ID NO:34肽
SEQ ID NO:35肽
SEQ ID NO:36肽
SEQ ID NO:37肽
SEQ ID NO:38肽
SEQ ID NO:39肽
SEQ ID NO:40肽
SEQ ID NO:41肽
SEQ ID NO:42肽
SEQ ID NO:43肽
SEQ ID NO:44肽
SEQ ID NO:45肽
SEQ ID NO:46肽。
序列表
<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.
International Institute of Cancer Immunology, Inc.
<120> WT1抗原肽和免疫调节剂的组合用途
<130> 672801
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 2
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 3
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 4
Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 5
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 6
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 7
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 8
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(2)
<400> 9
Cys Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> 二硫化物
<222> (1)..(2)
<400> 10
Cys Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 11
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His
1 5 10 15
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 12
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 13
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met
1 5 10 15
Thr Lys Leu
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 14
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys His Thr Gly
20
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 15
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5 10 15
Lys
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 16
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5 10 15
Lys His
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 17
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
1 5 10 15
Lys His Thr Gly
20
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 18
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 19
Cys Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Ser Leu
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 20
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Leu Cys
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 21
Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 22
Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 23
Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 24
Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 25
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 26
Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是Ser或Ala
<400> 27
Xaa Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe和Asn
<400> 28
Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 29
Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 30
Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 31
Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 32
Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 33
Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 34
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 35
Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 36
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 37
Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5 10 15
Leu Glu Ser
<210> 38
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 38
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 39
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys His
20
<210> 40
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 40
Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His
1 5 10 15
Ser Arg Lys His Thr Gly
20
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 41
Cys Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 42
Cys Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 43
Cys Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5 10
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 44
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 45
Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽
<400> 46
Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His
1 5 10 15

Claims (37)

1.用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物，其包含WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂，
其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO:10)，其中C-C内的键是二硫键，和
YMFPNAPYL (SEQ ID NO:26)；或
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐，
所述免疫调节剂是至少一种选自以下的药剂：
(1) 免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160，并且所述药剂是抗体；
(2) 共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS，并且所述药剂是抗体；和
(3) 低分子化合物，其为β-联蛋白抑制剂。
2.根据权利要求1所述的可注射药物组合物，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1或2所述的可注射药物组合物，其中所述药物组合物还包含WT1辅助肽或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1或2所述的可注射药物组合物，其中所述药物组合物与WT1辅助肽或其药学上可接受的盐组合使用。
5.根据权利要求3或4所述的可注射药物组合物，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO:13)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:14)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:15)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:16)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:17)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:19)，
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:20)，和
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:37)；或
其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的可注射药物组合物，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:19)，和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:20)，或
其药学上可接受的盐。
7.根据权利要求6所述的可注射药物组合物，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:18)或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的可注射药物组合物，其中所述药物组合物用作癌症疫苗。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的可注射药物组合物，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160。
10.根据权利要求9所述的可注射药物组合物，其中所述免疫调节剂是针对PD-1或PD-L1的抗体。
11.根据权利要求10所述的可注射药物组合物，其中针对PD-1的抗体是纳武单抗或派姆单抗。
12.根据权利要求10所述的可注射药物组合物，其中所述针对PD-L1的抗体是德瓦鲁单抗、MPDL3280A或BMS-936559。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的可注射药物组合物，其中所述免疫调节剂是共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的可注射药物组合物，其中所述免疫调节剂是β-联蛋白抑制剂。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的可注射药物组合物，其中所述癌症选自白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、脑瘤、骨癌、胰腺癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、直肠癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、多形性成胶质细胞瘤、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和石棉诱导的癌症。
16.根据权利要求15所述的可注射药物组合物，其中所述癌症是白血病，并且所述白血病是选自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病的慢性或急性白血病。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的可注射药物组合物，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
18.用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包含用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物，其包含WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐，和用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物，其包含免疫调节剂，
其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO:10)，其中C-C内的键是二硫键，和
YMFPNAPYL (SEQ ID NO:26)；或
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐，并且
所述免疫调节剂是至少一种选自以下的药剂：
(1) 免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160，并且所述药剂是抗体；
(2) 共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS，并且所述药剂是抗体；和
(3) 低分子化合物，其为β-联蛋白抑制剂。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述包含WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐的用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物或所述包含免疫调节剂的用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物，还包含WT1辅助肽或其药学上可接受的盐。
21.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述包含WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐的用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物和/或所述包含免疫调节剂的用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物，与WT1辅助肽或其药学上可接受的盐组合使用。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:12)，
RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO:13)，
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:14)，
CNKRYFKLSHLQMHSRK (SEQ ID NO:15)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (SEQ ID NO:16)，
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO:17)，
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:19)，
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:20)，和
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO:37)；或
其药学上可接受的盐。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:18)，
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:19)，和
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (SEQ ID NO:20)，或
其药学上可接受的盐。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述WT1辅助肽或其药学上可接受的盐是WAPVLDFAPPGASAYGSL (SEQ ID NO:18)或其药学上可接受的盐。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的试剂盒，其中所述药物组合物用作癌症疫苗。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的试剂盒，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述免疫调节剂是针对PD-1或PD-L1的抗体。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中针对PD-1的抗体是纳武单抗或派姆单抗。
29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述针对PD-L1的抗体是德瓦鲁单抗、MPDL3280A或BMS-936559。
30.根据权利要求18-25中任一项所述的试剂盒，其中所述免疫调节剂是共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS。
31.根据权利要求18-25中任一项所述的试剂盒，其中所述免疫调节剂是β-联蛋白抑制剂。
32.根据权利要求18-31中任一项所述的试剂盒，其中所述癌症选自白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、胃癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、脑瘤、骨癌、胰腺癌、头或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、直肠癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T-细胞淋巴瘤、多形性成胶质细胞瘤、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌和石棉诱导的癌症。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述癌症是白血病，并且所述白血病是选自急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病的慢性或急性白血病。
34.根据权利要求18-33中任一项所述的试剂盒，其中所述包含WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐的用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物和/或所述包含免疫调节剂的用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
35.WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂，并且其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO:10)，其中C-C内的键是二硫键，和
YMFPNAPYL (SEQ ID NO:26)；或
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐，
所述免疫调节剂是至少一种选自以下的药剂：
(1) 免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160，并且所述药剂是抗体；
(2) 共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS，并且所述药剂是抗体；和
(3) 低分子化合物，其为β-联蛋白抑制剂。
36.免疫调节剂在制备用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐和所述免疫调节剂，并且其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO:10)，其中C-C内的键是二硫键，和
YMFPNAPYL (SEQ ID NO:26)；或
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐，
所述免疫调节剂是至少一种选自以下的药剂：
(1) 免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160，并且所述药剂是抗体；
(2) 共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS，并且所述药剂是抗体；和
(3) 低分子化合物，其为β-联蛋白抑制剂。
37.WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐和免疫调节剂在制备用于治疗或预防癌症的可注射药物组合物中的用途，其中所述WT1杀伤肽或其药学上可接受的盐是：
由选自以下的氨基酸序列组成的肽：
CYTWNQMNL (SEQ ID NO:4)，
ALLPAVPSL (SEQ ID NO:5)，
C-CYTWNQMNL (SEQ ID NO:10)，其中C-C内的键是二硫键，和
YMFPNAPYL (SEQ ID NO:26)；或
式(3)的化合物：
，其中C-C内的键是二硫键；
或其药学上可接受的盐，
所述免疫调节剂是至少一种选自以下的药剂：
(1) 免疫检查点抑制剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、VISTA、HVEM、TIGIT、PVR、PD-L1和CD160，并且所述药剂是抗体；
(2) 共刺激分子激动剂，其是至少一种针对选自以下的分子的药剂：4-1BB、OX40、GITR、CD40和ICOS，并且所述药剂是抗体；和
(3) 低分子化合物，其为β-联蛋白抑制剂。
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