JP5427027B2 - Ｃｄ４０アゴニスト抗体／ｉ型インターフェロン相乗性アジュバントの結合体、それを含む複合体、および細胞性免疫を強化する治療としてのその使用 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２００６年５月３日に提出された米国仮出願番号６０／７９６，８６７、２００６年６月１日に提出された６０／８０９，８２１、および２００６年９月５日に提出された６０／８４２，００９に関し、それら出願のすべては、その全体が参照により組み込まれる。また本出願は、２００６年３月１日に提出された米国仮出願６０／７７７，５６９に関し、その出願も参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
〔０００１〕本発明は、概して相乗性アジュバント結合体に関し、それを必要とする対象において免疫を強化するために使用されてもよい。特に、本発明は（ｉ）Ｉ型インターフェロンおよび（ｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト、例えばアゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはＣＤ４０ＬポリペプチドまたはＣＤ４０ＬフラグメントまたはＣＤ４０Ｌを含む複合体、および任意に（ｉｉｉ）標的抗原をさらに含む、特定の相乗性アジュバント結合体に関する。

〔０００２〕さらに本発明は、前記相乗性アジュバント結合体を含む、またはコード化する新規のタンパク質またはＤＮＡ複合体、例えば（ｉ）ＣＤ４０アゴニスト抗体または可溶性ＣＤ４０Ｌタンパク質またはＣＤ４０ＬフラグメントまたはＣＤ４０Ｌ複合体、および（ｉｉ）Ｉ型インターフェロン、および任意に（ｉｉｉ）望ましい抗原を含む、またはコード化するタンパク質およびＤＮＡ複合体に関する。

〔０００３〕さらに本発明は、抗原特異的な細胞性免疫、例えばＣＤ８＋免疫を強化するために、そのような相乗性アジュバント結合体またはＤＮＡあるいはタンパク質複合体を投与するステップを含む、新規の免疫療法を提供する。特に、例えばＣＤ４０抗原発現腫瘍等の癌を含む様々な慢性疾患の治療、およびＨＩＶ感染、自己免疫疾患、アレルギー性および炎症性疾患等の感染症の治療、およびワクチンの有効性増強の目的で、これら新規のアジュバント結合体および／またはポリペプチド複合体およびＤＮＡ複合体を含む組成物を使用することについても説明する。

〔０００４〕また本発明は、例えば、ＣＤ４０アゴニストを単独で投与した場合に生じることがある肝毒性等の毒性を低減または予防するために十分な量のＩ型インターフェロンと併用してそのようなＣＤ４０アゴニストを投与することにより、ＣＤ４０Ｌポリペプチドおよび複合体またはアゴニストＣＤ４０抗体等のＣＤ４０アゴニストの毒性を低減する新規の方法を提供する。これは、そうでなければ毒性により妨害される治療用量でのＣＤ４０アゴニストの投与を促進する。

発明の背景
〔０００５〕微生物に対する体の防御系、およびその他の慢性疾患、例えば細胞増殖に影響する慢性疾患に対する体の防御系は、先天性免疫系の初期反応および適応免疫系の後期反応により媒介される。先天性免疫は、例えば微生物病原体に特徴的であり、哺乳類細胞には存在しない構造を認識するメカニズムが関与する。そのような構造の例は、細菌リポサッカリド（ＬＰＳ）、ウイルス二重鎖ＤＮＡ、および非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡヌクレオチドを含む。先天性免疫反応系のエフェクタ細胞は、好中球、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を含む。先天性免疫に加えて、哺乳類を含む脊椎動物は、感染因子への曝露により刺激され、それぞれ特定抗原に対する連続的な曝露により大きさおよび有効性が増大する免疫学的防御系が発達している。特定の感染または抗原の損傷に適合する能力のため、この免疫防御メカニズムは適応免疫と称されている。適応免疫反応には、Ｂリンパ球により生成される抗体が関与する体液性免疫、およびＴリンパ球により媒介される細胞性免疫の２種類がある。

〔０００６〕２種類の主なＴリンパ球は、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４ヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）と称されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞レセプタ（ＴＦＲ）を介して、例えばウイルスまたは細菌に感染した細胞上でクラスＩ ＭＨＣ分子により提示される外来抗原を認識するエフェクタ細胞である。外来抗原を認識する際に、ＣＤ８＋細胞は活性、成熟、および増殖過程を経る。この分化過程の結果、外来抗原を表示する標的細胞を破壊する能力を有するＣＴＬクローンが生じる。一方、Ｔヘルパー細胞は体液性および細胞媒介性の両形態のエフェクタ免疫反応に関与する。体液性または抗体免疫反応に関して、抗体は、Ｔｈ細胞との相互作用を通じてＢリンパ球により生成される。特に、細胞外抗原、例えば循環細菌は、特殊な抗原提示細胞（ＡＰＣ）により摂取、処理され、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞に対するクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に関連して提示される。これらのＴｈ細胞は、順にＢリンパ球を活性化することにより抗体を生成する。反対に、細胞媒介性または細胞性免疫反応は、例えば標的細胞の感染が成功した後、細胞内に局在生息する微生物を中和する働きをする。外来抗原、例えば微生物抗原は感染した細胞内で合成され、クラスＩ ＭＨＣ分子に関連してそのような細胞の表面に提示される。そのようなエピトープの提示は、上述のＣＤ８＋ＣＴＬの刺激、順にＣＤ４＋Ｔｈ細胞によっても刺激される過程に至る。Ｔｈ細胞は、少なくとも２つの個別の亜集団、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞で構成される。Ｔｈ１およびＴｈ２亜型は、抗原に対する曝露後に共通の前駆体から分化するＴｈ細胞の分極集団を表す。

〔０００７〕各Ｔヘルパー細胞の亜型は、互いに反対し、それぞれの増加および機能を相互に制御する独特の免疫効果を促進するサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は、大量のサイトカイン、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）γ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）、およびＩＬ‐１２等、ならびに少量のＩＬ‐４を分泌する。Ｔｈ１関連サイトカインは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を促進し、細胞内病原体に対する細胞媒介性免疫反応と最も頻繁に関連する。反対に、Ｔｈ２細胞は大量のサイトカイン、例えばＩＬ‐４、ＩＬ‐１３、およびＩＬ‐１０、少量のＩＦＮγを分泌し、抗体反応を促進する。Ｔｈ２反応は、特に炭疽菌からの保護等の体液性反応、および寄生虫感染症の排除に関連する。

〔０００８〕結果として生じる免疫反応がＴｈ１またはＴｈ２によるものかどうかは、主に関与する病原体、およびサイトカイン等の細胞環境における要素に依存する。Ｔヘルパー反応、または正しいＴヘルパーサブセットを活性できないことで、特定の病原体に対抗するために十分な反応を実装できないだけでなく、再感染に対して十分な免疫が生成されない可能性がある。多くの感染因子は細胞内病原体であり、予防および／または治療において、Ｔｈ１免疫に例示されるような細胞媒介性反応が重要な役割を果たすことが予測される。さらに、これらの感染因子の多くに関して、不適切なＴｈ２反応の誘導が疾患の結果に負の影響を与えることが示されている。例として、Ｍ結核症、Ｓ．マンソン住血吸虫症、および逆効果を生じるＴｈ２様優位の免疫反応が含まれる。また、らい腫らいも広汎性だが不適切なＴｈ２様反応を特徴とするように思われる。ＨＩＶ感染は別の例を表す。その他のＴｈ細胞集団に対するＴｈ１様細胞の比率の低下、疾患症状への進行に重要な役割を果たす可能性があることが示唆されている。

〔０００９〕感染因子に対する保護手段として、一部微生物からの保護を目的としたワクチン接種プロトコルが開発されている。感染性病原体に対するワクチン接種プロトコルは、多くの場合、不十分なワクチン免疫原性、不適切なタイプの反応（抗体対細胞媒介性免疫）、長期的な免疫記憶を導出する能力の欠如、および／または所定の病原体の異なる抗原型に対して免疫を生成できないことにより妨げられる。現行のワクチン接種法は、所定の抗原型、および多くの一般的な病原体、例えばウイルス抗原型または病原体に特異的な抗体の導出を目的とする。どの抗原が世界中に広まっているかを監視する努力が繰り返し為される必要がある。この例は、主要な感染型となることが予想されるインフルエンザＡ抗原型の発生を毎年監視することである。

〔００１０〕ワクチン接種プロトコルを支援するため、特定の感染症に対する免疫反応の生成をサポートするアジュバントがさらに開発された。例えば、比較的安全かつ有効なワクチンアジュバントとして、アルミニウム塩を使用し、特定の病原体に対する抗体反応を強化している。そのようなアジュバントの欠点の１つは、細胞媒介性免疫反応の刺激に比較的効果がなく、主にＴｈ２偏向された免疫反応を生成することである。

〔００１１〕現在、防御免疫の生成は、抗原に対する曝露だけでなく、その抗原に遭遇する状況にも依存することが広く認識されている。非炎症性の状況において、新規抗原を宿主細胞に導入することにより、長期免疫ではなく免疫寛容を生成するが、炎症性因子（アジュバント）の存在下で抗原に曝露することにより免疫を誘導する例は多くある。（Ｍｏｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９３：２２４５（１９９６）；Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０７５（１９９８）；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４４３（１９９４）；ａｎｄ Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：３２７（１９９４））。

〔００１２〕適応免疫を制御することがよく知られている自然発生分子は、ＣＤ４０である。ＣＤ４０は、ＴＮＦレセプタスーパーファミリに属し、一連の細胞媒介性免疫反応に不可欠であり、Ｔ細胞依存の体液性免疫の開発に必要である（Ａｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２：２９１（１９９３）；Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９１：１０９９（１９９４）；Ｒｅｎｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：１８８９（１９９４））。その自然の役割において、ＣＤ４＋Ｔ細胞上に発現されるＣＤ４０‐リガンド（配位子）は、ＤＣまたはＢ細胞上に発現されるＣＤ４０と相互作用し、ＡＰＣの活性を高めると同時にＴ細胞のさらなる活性を促進する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２３５（１９９４）；Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １４：２９７（２００３））。ＤＣの場合、ＣＤ４０連結反応は、古典的にＴＬＲを通じた刺激と同様の反応、例えば活性化マーカの上方制御および炎症性サイトカイン生成をもたらす（Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２：３０７（２００４）；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ Ｂ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｒ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２：８３（２００３））。ＣＤ８反応におけるその重要性は、ＣＤ４０を通じたＡＰＣの刺激が、ＣＤ４細胞の非存在下で、ＣＤ４依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を救済したことを示す研究により実証された（Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：７２５（２０００）；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７８（１９９８）；Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４（１９９８）。この発見は、一部の疾患環境において、ＣＤ４０アゴニストが単独で思わしくないＣＤ８＋Ｔ細胞反応を救済できる可能性があるという推測を誘発した。

〔００１３〕しかしその他の研究は、ＣＤ４０刺激単独では長期免疫を十分に促進しないことを示している。一部のモデル系において、抗ＣＤ４０治療単独では長期免疫を十分に促進しなかった。特に、抗ＣＤ４０治療単独では炎症性サイトカインが十分に生成されず、抗原特異的Ｔ細胞が削除され（Ｍａｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：６７３（２００１）；Ｋｅｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９８：１０８１１（２００１））、またＢ細胞反応が終了する可能性がある（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０９：６１３（２００２））。また、可溶性三量体化したＣＤ４０リガンドは、臨床においてＣＤ４０経路のアゴニストとして使用されており、報告されている内容は、ＣＤ４０の刺激単独では、長期的なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫に必要なすべてのシグナルを再構成できないという結論と一致する（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １９：３２８０（２００１））。

〔００１４〕様々なアゴニスト抗体は、異なるグループにより報告されている。例えば、ｍＡｂ ＣＤ４０．４（５ｃ３）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの間の活性を約３０〜４０％増加させると報告されている（Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ，１９９５，１：５４７‐５５６）。また米国特許番号６，８４３，９８９において、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓは、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０を使用して抗体ヒトにおいて癌を治療する方法の提供を主張している。その抗体は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用を少なくとも４５％強化し、ＣＤ４０Ｌの媒介による刺激を高める刺激性シグナルを送達し、生体内で新生物の活性を有するとされている。彼らは、強い成長促進シグナルをＢリンパ球に送達することが既に示されているＳ２Ｃ６、アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体からこの抗体を得た（Ｐａｕｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０‐５９５）。

〔００１５〕先天性および適応免疫反応におけるＣＤ４０の役割のため、様々なＣＤ４０アゴニスト抗体を含むＣＤ４０アゴニストをワクチンアジュバントとして、細胞性免疫を強化することが望ましい治療に使用することが調査されている。最近、本発明者らは、一部のＴＬＲアゴニストおよび抗ＣＤ４０治療と併用して抗原を用いた免疫付与（結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与）が、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘導し、いずれかのアゴニストを単独で用いる免疫付与より１０〜２０倍高い反応を導出することを実証した（Ａｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９：７７５（２００４））。これは、ウイルスまたは微生物因子との感染の非存在下で、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成できることを初めて示した。結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与により導出される抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、溶解機能、γインターフェロン生成、および抗原感作に対する強化された２次反応を示す。結果としてＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘導する抗ＣＤ４０を用いた相乗活性は、ＴＬＲ１／６、２／６、３、４、５、７および９のアゴニストで明らかにされている。

〔００１６〕ワクチン接種プロトコルまたは微生物感染において、適応免疫反応の有効性を高めるため、新規の有効なワクチンアジュバントを開発する必要がある。本発明はこの必要性を満たし、その他の利点も提供する。

〔００１７〕また、肝毒性等の副作用を導出しない用量において効果的である有効な免疫アジュバントを開発することが重要である。特に、Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（７）８７６‐８８３３（Ｍａｒｃｈ ２００７）は、典型的なアゴニスト抗体の最大耐量は０．３ｍｇ／ｋｇであり、用量が多いほど、静脈血栓塞栓症、グレード３頭痛、悪寒等の毒作用をもたらすサイトカインの放出、および一時的肝毒性を含む副作用を導出する場合があることを報告している。またＶａｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９（２３）：４３５１‐３（２００１）は、そこに記載されているｈＣＤ４０Ｌポリペプチドの最大耐量が０．１ｍｇ／ｋｇ／日であり、そのポリペプチドが最大用量０．１５ｍｇ／ｋｇ／日で投与された場合、治療対象において、グレード３または４の肝トランスアミナーゼ値上昇を特徴とする肝毒性が観察されたことを報告している。

発明の要約
〔００１８〕本発明は、一実施形態において、特定の部分と併用して樹状細胞上のＣＤ７０を上方制御し、免疫に対する相乗効果を導出するという発見に関する。例えば、それらはＴｈ１細胞性免疫およびＣＤ８Ｔ細胞免疫反応を促進する。特に本発明は、Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニスト、例えばアゴニストＣＤ４０抗体またはＣＤ４０ＬポリペプチドまたはＣＤ４０Ｌ複合体等が同一または個別の組成物において併用投与された場合、またさらに望ましい抗原と任意に併用投与された場合、ＣＤ８＋樹状細胞上のＣＤ７０発現を導出することにより、免疫に対する相乗効果を導出し、さらにＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増加およびＴｈ１免疫の強化をもたらすという発見に関する。

〔００１９〕この発見に基づいて、本発明は、免疫を強化する手段として、それを必要とする対象に投与できる新規のアジュバント結合体を提供する。またその有効性を強化するため、このアジュバント結合体をワクチンに添加するか、またはそれと併用して投与することができる。

〔００２０〕前記発見に関連して、本発明は、（ｉ）Ｉ型インターフェロンおよび（ｉｉ）ＣＤ４０アゴニストをコード化する核酸構造体を提供する。これは、さらに（ｉｉｉ）望ましい抗原をコード化する核酸配列を任意に含んでもよく、ここで核酸構造体は、それを必要とする宿主細胞に対して、任意に抗原と併用して投与されると、免疫に対する相乗効果を導出する。そのようなＣＤ４０アゴニストは、例としてＣＤ４０アゴニスト抗体およびＣＤ４０アゴニスト抗体フラグメント、および可溶性ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０Ｌフラグメントおよび複合体、ならびにオリゴマーＣＤ４０Ｌポリペプチド等のその派生物、例えば三量体ＣＤ４０Ｌポリペプチドおよびそれを含む複合体等を含む。

〔００２１〕また本発明は、（ｉ）少なくとも１つのＩ型インターフェロン、（ｉｉ）少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、例えばＣＤ４０アゴニスト抗体またはＣＤ４０ＬポリペプチドあるいはＣＤ４０ＬフラグメントまたはオリゴマーＣＤ４０Ｌあるいはそれを含む複合体等の複合体乃至はその派生物、および任意に（ｉｉｉ）抗原を含むポリペプチド複合体を提供する。ここで、これらの部分は、任意の順序で直接または間接的に連結されてもよく、それを必要とする対象に投与されると、免疫に対する相乗効果を誘導する。

〔００２２〕特に本発明は、（ｉ）アゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体、またはヒトＣＤ４０Ｌポリペプチドあるいはフラグメント、その複合体あるいは派生物をコード化する１つ以上の遺伝子、（ｉｉ）例えばヒトアルファまたはヒトベータインターフェロン等のヒトＩ型インターフェロンをコード化する遺伝子、および任意に（ｉｉｉ）強化された細胞性免疫反応が望ましく導出される抗原をコード化する遺伝子を含む核酸構造体を提供する。

〔００２３〕また特に本発明は、（ｉ）少なくとも１つのアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体またはヒトＣＤ４０Ｌポリペプチド、あるいはヒトＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ヒトアルファまたはβインターフェロンをアゴナイズするそのフラグメント、および強化された細胞性免疫反応が望ましく導出される少なくとも１つの抗原を任意に含む新規のポリペプチド構造体を提供する。

〔００２４〕さらに、本発明は、相乗的に有効な量の（ｉ）Ｉ型インターフェロン、好ましくはアルファまたはβインターフェロン、（ｉｉ）ＣＤ４０アゴニスト、好ましくはアゴニストＣＤ４０抗体、モノマーあるいはオリゴマー可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチド、またはそのフラグメントあるいは複合体、および任意に（ｉｉｉ）１つ以上の抗原を含むアジュバントポリペプチド組成物を提供する。

〔００２５〕また本発明は、ＣＤ４０アゴニストがＩ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストと併用して投与される場合、ＣＤ４０アゴニストの毒性を有力に低減できるという発見に関する。それにより、ＣＤ４０アゴニストを前述より高い用量で投与できるため、本発明はさらに有効なＣＤ４０アゴニスト治療を提供する。例えば、Ｉ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストと併用投与される場合のＣＤ４０ＬポリペプチドのＭＴＤ（最大耐量）チドは、０．１ｍｇ／ｋｇ／日の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２〜５倍、または１０倍以上であってもよく、それにより、少なくとも約．１５ｍｇ／ｋｇ／日〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日以上の範囲の最大耐量でＣＤ４０Ｌポリペプチドを投与できる。この結果、ＣＤ４０関連の悪性腫瘍の治療、および本明細書に公開されるその他の治療等におけるＣＤ４０Ｌ治療がより効果的となる。さらに、本発明はＣＤ４０アゴニスト抗体治療の毒性を低減し、前述の示唆より高いＣＤ４０アゴニスト抗体用量の投与を促進する。特に、上記のようにＶｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（７）：８７６−８８３（２００７）により報告されたアゴニストＣＤ４０Ｌ抗体のＭＴＤは０．３ｍｇ／ｋｇであり、過剰用量は一時的な肝毒性、静脈血栓塞栓症、グレード３頭痛、サイトカインの放出、および熱、悪寒等の関連毒性ならびに副作用をもたらすことが報告されている。ＣＤ４０アゴニスト抗体をＩ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストと併用投与することは、副作用を生じることなくＭＴＤ抗体量を例えば１．５〜１５倍または５〜１０倍、大幅に増加できる可能性がある。それにより、ＣＤ４０アゴニスト抗体のＭＴＤ量は、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上に増加させてもよい。そのため本発明は、特定のＣＤ４０アゴニスト用量で生じる可能性がある肝毒性等の毒性効果を低減するために十分な量のＩ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストをＣＤ４０アゴニストと併用投与することを含む。

〔００２６〕さらに本発明は、前述のタンパク質またはＤＮＡ複合体、あるいは相乗性アジュバントタンパク質を含む組成物のうちのいずれかを投与するステップを含む新規の治療を提供する。これらの治療は、免疫アゴニスト（アジュバント）としてのその使用を含み、例えばワクチンの有効性を相乗的に強化し、強化された免疫性が望まれる状態、例えば癌、感染症、自己免疫疾患、アレルギー、炎症性疾患、および遺伝子治療等を治療する。

〔００２７〕上記および以下に示すように、驚くことに、前述の新規アジュバント結合体またはタンパク質あるいはそれをコード化するＤＮＡ複合体が、ＣＤ４０アゴニストまたはＩ型インターフェロンの単独投与に関して免疫への相乗効果を導出すること、および／または肝毒性等の副作用を低減または予防する可能性があることが発見されている。そのような毒性の低減は、例えば、免疫刺激結合体が肝トランスアミナーゼ値に与える影響に基づいて特定できる。本発明のアジュバント結合体は、生体内のＣＤ８＋樹状細胞上のＣＤ７０発現を著しく誘導（上方制御）することにより、生体内のＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増加を誘導するため、この相乗効果が明らかに得られる。

〔００２８〕少なくともこのような樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫およびＴｈ１免疫に対する驚くべき相乗効果に基づいて、これらのアジュバント結合体、核酸構造体、またはポリペプチド複合体を含む組成物を、それを必要とする宿主細胞に、以下の手段として投与してもよい。
（ｉ）いずれかのアゴニストを単独で用いる免疫付与と比較して、強化された（指数関数的に優れた）１次および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成する、
（ｉｉ）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の指数関数的な増加を誘導する、および／または
（ｉｉｉ）防御免疫を生成する。

〔００２９〕したがって、タンパク質組成物、またはそれをコード化する核酸構造体あるいはそれを含むポリペプチド複合体を含んでもよいこれらのアジュバント結合体は、上述の強化された細胞性免疫反応が治療上望ましい任意の疾患または状態、特に感染症、癌、アレルギー、自己免疫疾患、炎症性疾患等の増殖性疾患、および強化された細胞性免疫が望ましい治療転帰であるその他の慢性疾患の治療に使用してもよい。本発明の好ましいアプリケーションは、特にＨＩＶ感染および癌等の感染症の治療を含む。

〔００４８〕発明の詳細な説明
〔００４９〕上記のように、本発明は、概して相乗性アジュバント結合体およびその使用に関する。本発明を詳細に説明する前に、以下の定義を提供する。それ以外のすべての用語は、当該技術分野に精通する者であれば理解されるはずである。

〔００５０〕本発明において「アゴニスト」という用語は、レセプタを結合する別のエンティティを用いて複合体を形成する、またはレセプタを直接結合および活性化する別の化合物の修正を行うことにより、レセプタを直接結合および活性化する、またはレセプタを間接的に活性化する任意のエンティティを含む。

〔００５１〕「ＣＤ４０アゴニスト」という用語は、特にＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌをアゴナイズする、および／または１つ以上のＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌに関連する活性を増加させる任意のエンティティを含む。これは例として、ＣＤ４０アゴニスト抗体、そのフラグメント、可溶性ＣＤ４０Ｌ、およびオリゴマー等のそのフラグメントおよび派生物（例えば、二価、三量体ＣＤ４０Ｌ）、およびそれを含む融合タンパク質ならびに組み換えまたはタンパク質合成により生成されるその変型を含む。さらにそのようなＣＤ４０アゴニストは、小分子、および抗体と代替できるＲＮＡまたはＤＮＡ分子から成るＣＤ４０アプタマーを含む。抗原結合部分としてそれを生成および使用する技術は、例えば米国特許番号５，４７５，０４６、５，７２０，１６３、５，５８９，３３２、および５，７４１，６７９において見つけることができる。これらの特許は、それら全体の参照により本明細書に組み込まれる。

〔００５２〕本発明において「ＣＤ４０Ｌ」または「ＣＤ１５４」という用語は、当該技術分野において代替的に知られているように、すべての哺乳類、例えばヒト、ラット、ヒトでない霊長類、マウス等のＣＤ４０Ｌ、および少なくとも対応する哺乳類ＣＤ４０ポリペプチド、例えばヒトＣＤ４０に結合するそのフラグメント、変型、オリゴマー、および複合体を含む。本発明において、投与されるＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌポリペプチドまたは前記ＣＤ４０Ｌポリペプチドをコード化するＤＮＡを含んでもよい。そのようなＣＤ４０ＬポリペプチドおよびＤＮＡは、特に、Ｉｍｍｕｎｅｘ米国特許番号６，４１０，７１１、米国特許番号６，３９１，６３７、米国特許番号５，９８１，７２４、米国特許番号５，９６１，９７４および米国公開出願番号２００４０００６００６に記載されている天然ＣＤ４０Ｌ配列およびそのフラグメント、変型、およびオリゴマーを含む。これらの特許および公開のすべて、およびそこに開示されているＣＤ４０Ｌ配列は、それら全体の参照により本明細書に組み込まれる。

〔００５３〕本発明において４‐１ＢＢアゴニストという用語は、アゴニスト４‐１ＢＢ抗体および４‐１ＭＭポリペプチドおよびその複合体等の４‐１ＢＢレセプタをアゴナイズする任意のエンティティを含む。そのようなアゴニストは、Ｉ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストと併用投与し、免疫への相乗効果を導出できる可能性がある。

〔００５４〕本発明において「Ｉ型インターフェロン」という用語は、ＣＤ４０アゴニストに近接して、またはＣＤ４０アゴニストと併用して投与された場合に、強化されたＣＤ８＋免疫反応を導出する任意のＩ型インターフェロンを包含する。これは、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、およびＩ型インターフェロンとして分類されるその他の種類のインターフェロンを含む。特に、これはエプシロンインターフェロン、ゼータインターフェロン、およびタウインターフェロン、例えば、タウ１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０を含む。またこれは、フラグメント等のその変型、アルファインターフェロン等の異なるＩ型インターフェロン分子の構造を模倣するコンセンサスインターフェロン、そのＰＥＧ化バージョン、組み換え発現または突然変異により変質グリコシル化したＩ型インターフェロン等を含む。当業者は、商業的に入手可能であり、治療として使用されているものを含む異なるＩ型インターフェロンについてよく理解している。好ましくは、Ｉ型インターフェロンはヒトＩ型インターフェロンを含み、最も好ましくはヒトアルファインターフェロンを含む。

〔００５５〕本発明の文脈において「相乗性アジュバント」または「相乗性結合体」という用語は、レセプタアゴニスト、サイトカイン、アジュバントポリペプチド等の２つの免疫モジュレータの組み合わせを含み、その組み合わせは、いずれかの単独投与に比べて免疫に対する相乗効果を導出する。特に本出願は、少なくとも１つのＩ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニストまたはＴＬＲアゴニストおよびＣＤ４０アゴニストまたはＴＬＲアゴニストまたはＩ型インターフェロンおよび４‐１ＢＢアゴニストを含む相乗性結合体を開示する。これらの相乗性結合体は、併用投与または互いに近接して投与されると、例えば、その他の部分の非存在下でＣＤ４０アゴニストまたはＩ型インターフェロンが投与される場合と比較して、免疫に対する大きな影響を導出する。例えば、その大きな影響は、免疫モジュレータまたはアゴニストを単独投与する場合に生じない生体内樹状細胞上のＣＤ７０の上方制御により証明される場合がある。

〔００５６〕本発明において「併用投与」とは、Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニストまたはタンパク質複合体あるいはＤＮＡ複合体、乃至はそれをコード化する複合体を、エンティティ等の異なるエンティティを、例えばＣＤ４０アゴニストおよびＩ型インターフェロンが免疫に対する相乗効果を導出する、例えば樹状細胞上のＣＤ７０の上方制御および／または肝毒性等の副作用を生じるような条件下で投与することを意味する。この部分を同一または異なる組成物において投与されてもよく、個別に投与される場合は、互いに近接して、一般にはそれぞれ２４時間以内、より一般的にはそれぞれ約１〜８時間以内、さらに一般的にはそれぞれ１〜４時間以内、または刺激性投与に近接して行う。相対量は、望ましい相乗効果が得られる用量である。さらに、ＤＮＡ複合体の形態で投与される場合、アゴニストは同一または異なるベクター、プラスミドまたは組み換えウイルスベクター等の同一または異なるベクター、例えばアデノウイルスまたはワクシニアベクター上で構成されてもよい。

〔００５７〕「ワクチン」は、単独投与または本発明のアジュバント結合体との併用投与により、免疫に対して抗原特異的な影響を与える組成物を意味する。これは、予防および治療ワクチンを与える予防ワクチンを含む。

〔００５８〕「抗体」という用語は、正常抗体または特定の結合用正常抗体と競合するその結合フラグメントを意味する。結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術、または正常抗体の酵素的または化学的開裂により生成される。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖおよび一本鎖抗体を含む。これは、特にキメラ、ヒト、ヒト化、二重特異性、および非ヒト抗体を含む。さらに、そのような抗体およびフラグメントは、開裂、グリコシル化、エフェクタ機能等の１つ以上の特性に影響するよう変質されるその変型を含む。

〔００５９〕上記のように、強力な抗体特異的Ｔ細胞免疫を生成でき、肝毒性等の望ましくない副作用を生じない新規ワクチンアジュバントおよび／またはアジュバント製剤を開発および実装する強い必要性がある。

〔００６０〕本発明は、単独投与または既存のワクチンと併用投与し、その有効性を強化できる新規アジュバントを提供することにより、この必要性を満たす。これらのアジュバントは、一般に少なくとも１つのＩ型インターフェロン、好ましくはアルファまたはβヒトインターフェロン、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト（抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメント）あるいは可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチドを含む。

〔００６１〕本発明は、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、好ましくはＣＤ４０アゴニスト抗体または可溶性ＣＤ４０Ｌ、ヒトアルファまたはβインターフェロン等のＩ型インターフェロン、および任意に標的抗原、例えば腫瘍抗原、自己抗原、アレルゲンまたはウイルス抗原の結合体を投与することにより、強化された細胞性免疫反応を、それを必要とする対象において導出する方法を提供する。これらの部分は、ＣＤ８＋樹状細胞上のＣＤ７０発現を誘導することにより細胞性免疫に対する相乗効果を導出する。特にこの結合体は、（ｉ）いずれかのアゴニスト単独の場合と比較される１次および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の生成における指数関数的増加、（ｉｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の指数関数的増加、および（ｉｉｉ）防御免疫の導出を誘導する。上記のとおり、ＣＤ８＋樹状細胞上のＣＤ７０発現の誘導は、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはＩ型インターフェロンを単独投与する場合には起こらない。そのため、驚くことにＣＤ４０アゴニスト／ＩＦＮ結合体は相乗作用し、生体内でＣＤ８＋ＤＣ上のＣＤ７０発現およびＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増加を誘導する。

〔００６２〕この発見に関連し、本発明は、細胞性免疫を促進する新規の相乗性アゴニストポリペプチド複合体をコード化するＤＮＡ構造体をさらに提供する。この構造体は（ｉ）ＣＤ４０アゴニスト、好ましくはＣＤ４０アゴニスト抗体をコード化するＤＮＡまたはそのフラグメント、あるいは可溶性ＣＤ４０Ｌまたはフラグメント乃至は派生物、および（ｉｉ）Ｉ型インターフェロン、例えばアルファまたはβインターフェロンをコード化するＤＮＡを含み、好ましくは（ｉｉｉ）望ましい抗原をコード化するＤＮＡをさらに含む。

〔００６３〕本発明は、細胞性免疫に対する相乗効果を導出する相乗性タンパク質複合体をさらに提供し、ＣＤ４０アゴニスト、好ましくはアゴニストＣＤ４０抗体またはフラグメントあるいはＣＤ４０Ｌ、Ｉ型インターフェロンおよび任意に望ましい標的抗原を含む。

〔００６４〕本発明は、これらのＤＮＡ構造体を含む組成物をさらに提供する。宿主細胞、好ましくはヒトに投与される場合、それらを使用して強化された抗原特異的細胞性免疫反応を生成できる。

〔００６５〕本発明は、前記新規の相乗性アゴニストポリペプチド結合体をコード化するＤＮＡ構造体を含む発現ベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。この結合体は、（ｉ）特定のＣＤ４０アゴニスト、好ましくはアゴニストＣＤ４０抗体をコード化する１つまたは複数のＤＮＡ、あるいは抗体フラグメント乃至はＣＤ４０Ｌのフラグメント、（ｉｉ）Ｉ型インターフェロン、好ましくはアルファまたはβインターフェロンをコード化する１つまたは複数のＤＮＡ、および（ｉｉｉ）好ましくは強化された抗原特異的細胞性免疫反応が望ましく導出される抗原、例えばウイルスまたは腫瘍抗原をコード化するＤＮＡを含む。

〔００６６〕また、本発明は、前記ベクターおよび宿主細胞を使用し、前記新規の相乗性ＩＦＮ／ＣＤ４０アゴニスト／抗原ポリペプチド複合体、好ましくはアゴニストＣＤ４０ａｂ／抗原／Ｉ型インターフェロンポリペプチド複合体含む組成物を生成する方法を提供する。

〔００６７〕さらに、本発明は、前記ＤＮＡ構造体またはそれを含む組成物および担体を、抗原特異的細胞性免疫反応が望ましく導出される宿主細胞、例えば、好ましくは肝毒性等の望ましくない副作用を低減または排除する条件下で、癌または感染性あるいはアレルギー性疾患等の慢性疾患のあるヒトに投与する方法を提供する。

〔００６８〕さらに本発明は、強化された抗原特異的細胞性免疫反応を導出するため宿主細胞への投与に好適な、前記新規の相乗性ＩＦＮ／ＣＤ４０アゴニスト抗原ポリペプチド複合体を含む組成物を提供する。

〔００６９〕また本発明は、治療的使用に好適な組成物を提供し、その組成物は少なくとも１つのインターフェロン、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、および任意にそのような投与を必要とする宿主細胞に投与された場合、細胞性免疫に対する相乗効果を導出する標的抗原の結合体を含む。

〔００７０〕また本発明は、前記新規の相乗性アゴニスト‐抗原ポリペプチド複合体または前記ポリペプチド複合体をコード化するＤＮＡあるいは少なくとも１つのＩ型インターフェロン、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、および任意に少なくとも１つの標的抗原を含む１つまたは複数の組成物を、そのような治療を必要とする宿主細胞に投与し、強化された（抗原特異的）細胞性免疫反応を導出するステップを含む、新規の免疫治療方法を提供する。好ましい実施形態において、これらの組成物および複合体を、癌、感染症、特に、ウイルス、細菌または寄生虫、あるいは自己免疫性、炎症性、またはアレルギー性症状をもたらす慢性疾患のある対象、乃至はそのリスクのある対象に投与する。例えば、本発明を使用し、ＨＩＶに対する抗原特異的細胞性免疫反応を導出してもよい。ＨＩＶは、防御免疫においてウイルスに対して強力かつ生存時間の長い細胞性免疫反応がほぼ確実に必要となる疾患のよく知られた例である。

〔００７１〕また本発明は、ワクチン、特に樹状細胞上のＣＤ７０を上方制御する対象の相乗性アジュバント結合体の組み合わせまたは併用投与により、防御細胞性免疫反応を誘導することを意図したワクチンの有効性を強化する方法を提供する。好ましい実施形態において、そのようなアジュバントは、本明細書に開示する特定のアジュバントを含み、さらにＴＬＲ、例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０またはＴＬＲ１１等の別のアジュバントを任意に含む。理想的には、この追加アジュバントが、樹状細胞によるＣＤ７０発現をさらに誘導し、それを必要とする対象において強化された免疫反応をもたらす。

〔００７２〕本発明は、トール様レセプタ（ＴＬＲ）およびＣＤ４０両方のアゴニストの存在下で、抗原を用いた免疫付与（結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与）が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい増加を導出するという本発明者の以前の説明の延長である。この形態のワクチン接種から導出される反応は、いずれかのアゴニスト単独により導出される反応よりも指数関数的に大きく、従来の方法によるワクチン接種よりもはるかに優れている。結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与は、強力な１次および２次ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成し、免疫付与を２度だけ行った後、循環血液中で５０〜７０％の抗原特異的Ｔ細胞が得られることが観察されている。しかし、本発明者による以前の発明とは異なり、この相乗性結合体は、Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニストまたは４‐１ＢＢアゴニストの結合体を含む。驚くことに、ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト抗体結合体およびＩ型インターフェロン／ＣＤ４０アゴニスト抗体結合体は、どちらもＣＤ８＋ＤＣ上のＣＤ７０発現を誘導し、それによって生体内でＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増加を導出することが認められている。そのため、ＣＤ４０経路は、ＴＬＲおよびＩ型ＩＦＮシグナリング経路の両方と統合され、相乗的に強化されたＤＣ活性の誘導、およびそれによる抗原特異的細胞性免疫の強力な誘導を提供すると考えられる。

〔００７３〕細胞性免疫に対する相乗効果を導出するため、ＣＤ４０アゴニスト、Ｉ型インターフェロンおよび抗原（存在する場合）は、好ましくは免疫に対する望ましい相乗効果を生じる条件下で、互いにほぼ近接してまたは同時に、併用または個別に投与されてもよい個別のポリペプチド部分として投与する。相乗作用が得られるかどうかは、様々な手段、例えば、投与条件下で樹状細胞上のＣＤ７０発現の上方制御に基づいて検出できる。代替として、これらの部分は、単一のポリペプチド融合またはこれら２つ乃至は３つの個別エンティティを含む複合体として投与されてもよく、あるいはＤＮＡ複合体または前記２つ乃至は３つの個別エンティティをコード化する複合体の形態で投与されてもよい。本発明の後半２つの実施形態は、１つのみの活性剤を生成し、治療を必要とする対象、例えばＨＩＶ感染または癌患者に投与する必要があるため、ポリペプチドまたはＤＮＡベースのワクチンにおいて有利である。

〔００７４〕本発明は、単独または既存のワクチンと併用投与してもよい新規アジュバントを提供することにより、その有効性を強化する必要性を満たす。これらのアジュバントは、一般に少なくとも１つのＩ型インターフェロン、好ましくはアルファまたはβヒトインターフェロン、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト（抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントあるいは可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチド）および好ましくは、強化された抗原特異的細胞性免疫が、腫瘍抗原またはウイルス抗原等として望ましく導出される少なくとも１つの抗原を含む。本発明の好ましい実施形態において、これらのポリペプチド部分は、ポリペプチド複合体に含まれるか、または核酸構造体によりコード化される。これは、宿主細胞における生体外発現時、または宿主細胞に対する生体内投与時に、前記アゴニストおよび抗原ポリペプチドの発現、またはこれらのポリペプチドを含む複合体の発現を生じる。

〔００７５〕Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニスト、例えばアゴニストＣＤ４０抗体の投与量は、併用または同時投与において、樹上細胞上のＣＤ７０発現および抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を誘導することにより相乗効果を生じる量を含む。理想的な用量は、例えば、肝トランスアミナーゼ値に基づいて検出可能な肝毒性等の副作用を生じない。Ｉ型インターフェロンに関して、この量は約１Ｘ１０３単位活性（Ｕ）約１Ｘ１０１０Ｕ、より一般的には約１０４Ｕ〜約１０８Ｕの間で変化してもよい。アゴニスト抗体またはＣＤ４０Ｌポリペプチドの量は、約０．００００１ｇ〜約５ｇ、より一般的には約０．００１ｇ〜約１ｇの間で変化してもよい。上記のように、好ましいＭＴＤは０．３ｍｇ／ｋｇを越え、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。治療方法に抗原の投与が含まれる場合は、約０．０００１ｇ〜約５０ｇ、より一般的には約０．１ｇ〜約１０ｇの範囲の量でこれを投与してもよい。上記のとおり、これらの部分は、同一または異なる剤形で投与されてもよい。個別に投与する場合、この部分を任意の順序、一般にそれぞれ数時間以内、より一般的には実質的に近接する時間に投与してもよい。

〔００７６〕上記のように、ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用をアゴナイズする任意の部分を含む。一般にこれらの部分は、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはアゴニストＣＤ４０Ｌポリペプチドとなる。記載のとおり、これらの抗体は例としてヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖｓ、およびＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ結合相互作用を特異的にアゴナイズする抗体フラグメントを含む。最も好ましくは、抗体はキメラ、完全ヒト、またはヒト化ＣＤ４０抗体を含む。

〔００７７〕ヒトＣＤ４０Ｌおよびその他の哺乳類ＣＤ４０Ｌポリペプチドは広く知られており、入手可能である。その可溶性形態、オリゴマーＣＤ４０Ｌポリペプチド、例えばＩｍｍｕｎｅｘ（現在のＡｍｇｅｎ）により最初に報告された三量体ＣＤ４０Ｌ等を含む。またヒトおよびマウスＣＤ４０Ｌの配列も知られており、商業的に入手可能である。上記のように、ＣＤ４０Ｌ用量は、一般的に少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日、より一般的には約０．１５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日である。肝毒性等の副作用および肝トランスアミナーゼ値の上昇が見られないか、またはＩ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストの非存在下でＣＤ４０Ｌポリペプチドが投与される場合と比較して、最小またはごくわずかになるようＭＴＤを選択する。

〔００７８〕上記のように、Ｉ型インターフェロンは、ＣＤ４０アゴニストに近接または併用して投与される場合、細胞性免疫に対する相乗効果を導出する任意のＩ型インターフェロンまたは変型あるいはフラグメントであってよい。そのようなインターフェロンは、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、タウ１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０等のインターフェロンタウ、インターフェロンオメガ、インターフェロンエプシロン、インターフェロンゼータ等、特にその変型およびフラグメントを含んでもよい。これは特に、ＰＥＧ化インターフェロンおよびコンセンサスインターフェロンならびに変質（非天然またはアグリコシル化）グリコシル化したインターフェロンを含む。

〔００７９〕ＴＬＲアゴニストが抗ＣＤ４０アゴニストと相互作用することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を著しく強化することは本発明者らにより既に報告されているが、これらの先行研究は、Ｉ型インターフェロンおよびアゴニスト抗体等のＣＤ４０アゴニストも細胞性免疫に対する相乗効果を生じることを示唆していない。驚くべきことに、本発明者は、ＣＤ４０経路がＴＬＲおよびＩ型ＩＦＮシグナリング経路の両方と統合され、ＤＣ活性の強力な細胞性免疫を誘導することを発見した。さらにこれらの以前の研究は、この過程におけるＣＤ７０の役割を明らかにしていない。

〔００８０〕また以前の研究は、ＴＬＲアゴニスト／ＣＤ４０アゴニストの結合体を伴うため、対象のＤＮＡまたはポリペプチド複合体は、抗原、ＴＬＲアゴニスト、およびＣＤ４０アゴニストの個別投与を必要とすることを示唆していない。反対に、本発明は一部の実施形態において、ＤＮＡ構造体、および２つまたは３つの異なる部分を含む二分裂または三分裂ポリペプチド、または単一のＤＮＡまたはポリペプチド分子においてこれら２つまたは３つの部分をコード化するＤＮＡ、例えばＣＤ４０アゴニスト抗体、アルファインターフェロンおよび抗原を含む複合体を提供する。これは（たった１つの分子エンティティを薬学的に許容しうる形態で生成および投与するだけでよいため）、予防または治療ワクチンの目的でのその使用、および／または強化された細胞性免疫が望まれる癌または自己免疫疾患等の治療において細胞性免疫を強化するためのその使用を簡素化するはずである。これは、有効な予防または治療免疫のために大量のアジュバントが必要となる場合がある慢性疾患または状態の治療において特に有利である。

〔００８１〕分子試薬のみを使用する結合ＩＦＮ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与は、感染因子を用いた感作後に得られる程度のＣＤ８＋Ｔ細胞反応を固有に生成する（Ａｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９：７７５（２００４））。そのため、本発明はＨＩＶおよびウイルス、細菌、真菌または寄生虫が関与するその他慢性感染症、および癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、および炎症性疾患等の増殖性疾患に対する強力なワクチンの開発を提供する。それら疾患において有効な治療は、結合ＩＦＮ（Ｉ型）／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与または樹状細胞上のＣＤ７０発現を上方制御するその他のアジュバント結合体のみが生成できる細胞性免疫の量および性質を必要とする。
発明の適用
〔００８２〕本発明は、ここでタンパク質およびＤＮＡベースのワクチンの両方を例示する。これらは（ｉ）少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、例えば、アゴニスト抗ＣＤ４０ａｂまたはＣＤ４０Ｌポリペプチド、（ｉｉ）任意に少なくとも１つの標的抗原（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇ）および（ｉｉｉ）少なくとも１つのＩ型インターフェロン（例えば、アルファインターフェロン）の結合体を含む。ＨＩＶは強化された細胞性免疫反応が重要な治療可能性を有する慢性感染症であるため、ＨＩＶＧａｇ４０が適切なモデル抗原である。しかし本発明は、強化された細胞性免疫反応が治療上望ましい任意の抗原を含む、上述のような複合体の構造を包含する。好ましい実施形態において、少なくとも１つの標的抗原は、少なくとも１つのＩ型インターフェロン、および少なくとも１つのＣＤ４０アゴニストを含む、投与する組成物に含まれるか、またはこれらの部分を含むポリペプチド複合体に含まれるか、あるいはこれらの部分をコード化するＤＮＡ複合体によりコード化される。しかし一部の実施形態において、Ｉ型インターフェロンおよび抗ＣＤ４０抗体を含む複合体は、抗原とは別に投与してもよく、または宿主細胞は抗原に対して自然に曝露されてもよい。さらに一部の実施形態において、すべての３つの部分、すなわち抗ＣＤ４０抗体、Ｉ型インターフェロンおよび抗原は、個別の分離したエンティティとして併用投与されてもよい。好ましくは、これらの部分すべてを実質的に同時に投与し、肝毒性、静脈血栓塞栓症、サイトカイン毒性、および／または頭痛等の副作用を伴うことなく、細胞性免疫における望ましい相乗性強化を得る。しかしこれらの部分は、細胞性免疫に対する相乗効果を導出することにより、強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の増加およびＣＤ８＋ＤＣ上のＣＤ７０発現の誘導を生じる任意の順序で投与されてもよい。

〔００８３〕典型的な抗原は、細菌、ウイルス、寄生虫、アレルゲン、自己抗原および腫瘍関連抗原を含むが、それらに限定されない。ＤＮＡベースのワクチンが使用される場合、抗原は一般に投与されたＤＮＡ構造体の配列によりコード化される。代替として、抗原が複合体として投与される場合、抗原は一般に投与された複合体に含まれるタンパク質である。さらに、抗原がＣＤ４０アゴニストおよびＩ型インターフェロン部分とは別に投与される場合、抗原は任意の形態を取ることができる。特に抗原は、タンパク質抗原、ペプチド、総不活性有機体等を含むことができる。

〔００８４〕本発明で使用できる抗原の特定例は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型またはＤ型肝炎、インフルエンザウイルス、リステリア、ボツリヌス菌、結核、野兎病、大痘瘡（天然痘）、ウイルス性出血熱、ペスト菌（疫病）、ＨＩＶ、ヘルペス、パピローマウイルスからの抗原、および感染因子に関連するその他の抗原を含む。その他の抗原は、腫瘍細胞に関連する抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび喘息に関する抗原を含む。そのような抗原と対象アゴニスト結合体Ｉ型インターフェロンおよび抗ＣＤ４０抗体との併用投与を、そのような疾患状態に対して免疫付与するための治療または予防ワクチンにおいて使用することができる。

〔００８５〕一部の実施形態において、この方法および組成物を使用して感染性因子からの抗原を含めることにより、感染症を罹患するリスクのある個人、または感染症を罹患している個人を治療できる。感染とは、宿主細胞内で繁殖する外来有機体または因子が宿主細胞に存在することに起因する疾患または状態を意味する。感染症を罹患するリスクのある対象は、感染症を発症しやすい対象である。そのような個人は、例えば感染性有機体または因子に曝露したことが分かっている対象またはその疑いのある対象を含んでもよい。感染症のリスクのある対象は、感染性因子または有機体に対する免疫反応を増加させる能力の不全に関連する状態のある対象、例えば先天性または後天性免疫不全の対象、放射線治療または化学療法を受けている対象、熱傷のある対象、外傷のある対象、手術またはその他の侵襲性医科または歯科治療を受けている対象、または同様に免疫不全の個人を含んでもよい。

〔００８６〕本発明のワクチン組成物を用いて治療または予防される感染症は、細菌性、ウイルス性、真菌性、および寄生虫性を含む。その他のあまり一般的でないタイプの感染症は、リケッチア、マイコプラズマ、およびスクレピー、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、プリオン病（例えば、クル（ｋｕｒｕ）および散発性クロイツフェルトヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ‐Ｊａｃｏｂ）病）を生じる因子を含む。ヒトに感染する細菌、ウイルス、真菌、および寄生虫の例はよく知られている。感染症は、急性、亜急性、慢性、または潜在性であってもよく、局所性または全身性であってもよい。さらに感染症は、宿主細胞における感染有機体または因子のライフサイクルの少なくとも１つの相の間、主に細胞内または細胞外にあってもよい。

〔００８７〕対象ワクチンおよび方法を使用できる細菌性感染症は、グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方を含む。グラム陽性細菌の例は、パスツレラ種、ブドウ球菌種、および連鎖球菌種を含むが、それらに限定されない。グラム陰性細菌の例は、大腸菌、シュードモナス種、およびサルモネラ菌種を含むが、それらに限定されない。感染性細菌の特定例は、ヘリコバクターピロリ、ボレリアブルグドルフェリ、レジオネラニューモフィラ、マイコバクテリア種（例えば、結核菌、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｉｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリアモノサイトゲネス、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、アガラクティエ連鎖球菌（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（ウイルス群）、大便連鎖球菌、ウシ連鎖球菌、連鎖球菌（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原体カンピロバクター種、エンテロコッカス種、ヘモフィルスインフルエンザ、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム種、豚丹毒菌、ウエルシュ菌エンテロトキシン、破傷風菌、エンテロバクターアエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ皮膚壊死毒素、バクテロイデス種、フソバクテリウムヌクレアタム、ストレプトバシラスモニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、苺腫トレポネーマ、レプトスピラ、リケッチア、およびイスラエル放線菌を含むが、それらに限定されない。

〔００８８〕ヒトにおいて感染症をもたらすウイルスの例は、レトロウイルス（例えば、ＨＴＬＶ‐ＩＩＩとも称されるＨＩＶ‐１等のヒト不全ウイルス）、ＨＩＶ‐ＩＩ、ＬＡＣまたはＩＤＬＶ‐ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ‐ＩＩＩおよびＨＩＶ‐ＬＰ等のその他の分離体、ピコマウイルス（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎、腸ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カルシウイルス（例えば、胃腸炎を起こす菌株）、トガウイルス（例えば、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）、コロナウイルス（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス（例えば、小水胞性ストーマウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトロミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ブンガウイルス（例えば、ハターンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）、アリーナウイルス（出血熱ウイルス）、レオウイルス（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス）、ビマウイルス、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス（パルボウイルス）、パポバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス（アデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩおよびＩＩ、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス）およびイリドウイルス（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）および未分類のウイルス（例えば、海綿状脳障害の病原因子、デルタ肝炎の因子、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の因子（クラス１：腸感染；クラス２：Ｃ型肝炎等のように経口感染）、ノーウォークおよび関連ウイルスおよびアストロウイルス）を含むが、それらに限定されない。

〔００８９〕真菌の例は、アスペルギルス種、コクシジオイデスイミティス、クリプトコックスネオフォルマンス、カンジダアルビカンスおよびその他のカンジダ種、ブラストミセス症、ヒストプラスマカプスラーツム、クラミジアトラコマチス、ノカルジア種、およびニューモシスチスカリニを含む。

〔００９０〕寄生虫の例は、血液感染性および／または組織寄生虫、例えばＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉ ｄｉｖｅｒｇａｎｓ、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、熱帯リーシュマニア、リーシュマニア種、ブラジルリーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、熱帯マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマゴンジ、ガンビアトリパノソーマおよびロードシアトリパノソーマ（アフリカ睡眠病）、クルーズトリパノソーマ（チャガ病）およびトキソプラズマゴンジ、扁虫、および回虫を含むが、それらに限定されない。

〔００９１〕上記のように、本発明は、癌等の増殖性疾患の治療における、対象の層状性結合体またはタンパク質あるいはそれを含む、乃至はこの相乗性結合体をコード化するＤＮＡ複合体の使用を包含する。癌は、体内器官およびシステムの正常な機能を妨げる細胞の無制約成長の状態である。癌のある対象は、体内に存在する癌細胞を客観的に計測できる対象である。癌を発症するリスクのある対象は、例えば家系、遺伝性素因、放射線またはその他の癌をもたらす因子に対する曝露等に基づいて、癌を発症しやすい対象である。元の位置から移動し、重要臓器に播種する癌は、影響を受けた臓器の機能悪化により、最終的に対象を死に至らしめる可能性がある。白血病等の造血癌は対象における正常な造血細胞と競合することにより、（貧血、血小板減少、および好中球減少の形態で）造血障害をもたらし、最終的に死に至る可能性がある。

〔００９２〕転移は、原発腫瘍位置とは異なる癌細胞の領域であり、原発腫瘍からその他の体の部分に癌細胞が広まることにより生じる。原発腫瘤の診断時に、転移の有無について対象を監視してもよい。多くの場合、特定症状の監視に加えて、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）、トモグラフィ断層撮影（ＣＴ）、スキャン、血液および血小板数、肝機能検査、胸部Ｘ線および骨スキャンを単独使用または併用することにより、転移が検出される。

〔００９３〕本発明の組成物、タンパク質複合体およびＤＮＡワクチンを使用し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の包含またはＤＮＡコード化によるＣＤ４０発現および非発現癌を含む、様々な癌または癌を発症するリスクのある対象を治療することができる。これは、腫瘍細胞において発現する抗原である。そのような癌の例は、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、メラノーマ、大腸癌、胃癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、咽頭癌、甲状腺癌、膵臓癌、睾丸癌、脳癌、骨肉腫および白血病、慢性リンパ性白血病等の血液の癌を含む。本発明のワクチン接種方法を使用して免疫反応を刺激し、腫瘍の成長を阻害または減速する、あるいは腫瘍のサイズを減少させることにより、腫瘍を治療することができる。腫瘍関連抗原は、必ずしもそうではないが、腫瘍細胞により主に発現される抗原であってもよい。

〔００９４〕追加の癌は、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肉種、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化系の癌、子宮内膜腺癌、食道癌、眼の癌、頭部および頚部癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌、肺がん（小細胞および大細胞）、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；メラノーマ；神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、唇、下、口および咽頭）；子宮頸癌；膵臓癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫；肛門癌；呼吸器系の癌；肉腫；皮膚癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宮癌；泌尿器系の癌、およびその他の癌腫および肉腫を含むが、それらに限定されない。

〔００９５〕本発明の組成物、タンパク質複合体、およびＤＮＡを使用して、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、乾癬またはその他の自己免疫疾患等の自己免疫疾患を治療することもできる。本発明のワクチンおよび免疫アジュバントを用いて治療される可能性があるその他の自己免疫疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎等のその他の炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、自己免疫脳脊髄炎、重症筋無力症（ＭＧ）、橋本甲状腺炎、グッドパスチュア症候群、天疱瘡、グレーブス病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症、混合結合組織疾患、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自己免疫関連不妊症、糸球体腎炎（例えば、半月体形成性糸球体腎炎、増殖性糸球体腎炎）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、乾癬性関節炎、インスリン抵抗性、自己免疫糖尿病（Ｉ型糖尿病；インスリン依存性糖尿病）、自己免疫性肝炎、自己免疫性血友病、自己免疫性リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、およびＧｕｉｌｌａｉｎ‐Ｂａｒｅ症候群を含む。最近は、動脈硬化およびアルツハイマー病が自己免疫疾患として認められた。そのため、本発明のこの実施形態において、抗原は、宿主細胞が組織の崩壊および正常な組織の破壊に寄与する望ましくない免疫反応を導出する自己抗原である。

〔００９６〕本発明の組成物、タンパク質複合体およびＤＮＡワクチンを使用し、喘息およびアレルギー性並びに炎症性疾患を治療することもできる。喘息は、気道の炎症および狭窄、また吸入した因子に対する気道の反応性の増加に特徴付けられる呼吸器系の疾患である。必ずしもそうとは限らないが、多くの場合、喘息はアトピー性またはアレルギー性症状に関連する。アレルギーは、物質（アレルゲン）に対する獲得過敏性である。アレルギー症状は、湿疹、アレルギー性鼻炎、または鼻感冒、花粉症、気管支喘息、蕁麻疹、および食物アレルギーならびにその他のアトピー症状を含む。アレルゲンは、影響を受けやすい対象においてアレルギー反応または喘息反応を誘導できる物質である。花粉、昆虫毒、動物鱗屑、塵、真菌胞子、および薬物を含む多くのアレルゲンがある。

〔００９７〕天然および植物アレルゲンの例は、イヌ、カクマダニ、リビアヤマネコ、アンブロージア、ロチウム、スギ、アルテルナリア、アルダー、ハンノキ、カバノキ、コナラ、オリーブ、アルテミシア、シャゼンソウ、ヒカゲミズ、チャバネゴキブリ、ミツバチ、イトスギ、ジュニパー、ヒノキ科クロベ、ヒノキ、ゴキブリ、シバムギ、ライムギ、コムギ、カモガヤ、ウシノケグサ、イチゴツナギ、カラスムギ、シラゲガヤ、ハルガヤ、リボンガヤ、コヌカグサ、アワガエリ、クサヨシ、スズメノヒエ、モロコシ、およびブロミス属に特異的なタンパク質を含む。

〔００９８〕当然のことながら、本発明の組成物、タンパク質複合体、およびＤＮＡワクチンは、例えば感染疾患、癌または自己免疫疾患等の特定症状を治療するためのその他の治療と併用できる。例えば癌の場合、本発明の方法を化学療法または放射線治療と併用してもよい。

〔００９９〕組成物をワクチンとして生成する方法は、当該技術分野に精通する者によく知られている。有効な量のタンパク質複合体またはＤＮＡは、経験的に特定できるが、動物モデルにおいて免疫的に有効な量に基づいてもよい。考慮すべき要素は、抗原性、剤形、投与経路、投与する免疫用量の数、個人の体調、体重、および年齢等を含む。そのような要素は当該技術分野に精通する者によく知られており、当業者により決定される（例えば、Ｐａｏｌｅｔｔｉ ａｎｄ Ｍｃｌｎｎｅｓ．ｅｄｓ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｆｒｏｍ Ｃｏｎｃｅｐｔ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照）。本明細書に開示されるように、当然のことながら対象のＤＮＡまたはタンパク質複合体は、単独またはその他のアジュバントと併用して投与することができる。さらに、対象のアジュバントを既存のワクチンに添加または併用投与し、その効果を増強することができる。例えば、これらのアジュバントを使用し、子宮頸癌に対して近年承認されたＨＰＶワクチン等のウイルスワクチンの有効性を増強してもよい。またそれらをその他のアジュバントと結合してもよい。

〔００１００〕本発明のＤＮＡおよびタンパク質複合体は、筋肉内、静脈内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経口またはその他の粘膜経路を含む、当該技術分野で知られている任意の方法で、局所的または全身的に投与できる。追加の経路は、頭蓋内（例えば、嚢内または脳室内）、眼窩内、経眼、関節包内、髄腔内、および局所投与を含む。本発明のアジュバントおよびワクチン組成物は、適切な非毒性の薬剤キャリアにおいて投与するか、またはマイクロカプセルあるいは徐放性インプラントに形成することができる。本発明の免疫原性組成物は、望ましい細胞性免疫反応を維持するため、必要に応じて複数回投与することができる。適切な経路、剤形、および免疫付与スケジュールは、当該技術分野に精通する者により決定できる。

〔００１０１〕本発明の方法において、一部の例では、抗原およびＩ型ＩＦＮ／ＣＤ４０アゴニスト複合体を個別に投与するか、または同一剤形に結合して投与してもよい。一部の例において、幾つかの抗原を含むことが有用な場合がある。これらの組成物は、望ましい細胞性免疫の相乗性強化を得る任意の順序で個別に投与するか、または併用投与してもよい。一般に、これらの組成物はそれぞれ短時間内に投与する。すなわち、数日または数時間内、最も一般的には約半日〜１時間以内に投与し、治療計画を促進する。

〔００１０２〕一部の例において、親和性精製を促進する複合体またはＤＮＡに部分を含むことが有益となる場合がある。そのような部分は、複合体におけるポリペプチドの機能を妨げない比較的小さい分子を含む。代替として、タグは開裂により除去可能であってもよい。そのようなタグの例は、ポリヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、マルターゼ結合タンパク質、レクチン、グルタチオン‐Ｓトランスファーゼ、アビジン等を含む。その他の適切な親和性タグは、ＦＬＡＧ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ等を含む。

〔００１０３〕対象のアジュバント結合体およびタンパク質またはＤＮＡ複合体は、生理食塩水等の生理的に許容しうるキャリアを用いて投与する。また組成物は、別のキャリアまたはバッファ等の賦形剤、例えばクエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、および重炭酸塩、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質、血清アルブミン、エチレンジアミン４酢酸、塩化ナトリウム、またはその他の塩、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、グリセロール等を含んでもよい。本発明の因子は、対応する投与経路に従って様々な方法で形成できる。例えば、液体製剤を摂取または注射ゲル用に形成するか、またはプロシージャを摂取、吸入、または局所アプリケーション用に形成できる。そのような製剤を形成する方法は、よく知られており、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”１８ｔｈ Eｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａにおいて見つけることができる。

〔００１０４〕上記のように、本発明はＤＮＡベースのワクチンを包含する。これらのＤＮＡは、裸のＤＮＡとして投与してもよく、または発現ベクターに含まれてもよい。さらに、グラフトの移植に先立って、対象の核酸配列をグラフトの細胞に導入してもよい。好ましくは、このＤＮＡをヒト化し、ヒト対象における発現を促進する。

〔００１０５〕対象のポリペプチド複合体は、さらに「マーカ」または「レポータ」を含んでもよい。マーカまたはレポータ分子の例は、ベータラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、ヒグロマイシンＢ‐ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ｌａｃＺ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼらを含む。

〔００１０６〕対象の核酸構造体は、その発現を誘導できる任意のベクター、例えばベクターにより変換された細胞を含むことができる。発明者は、バキュロウイルスベクターを使用した経験が豊富であるため、ここではこのベクターを例示する。使用してもよいその他のベクターは、細菌において使用するＴ７ベースベクター、イースト発現ベクター、哺乳類発現ベクター、ウイルス発現ベクター等を含む。ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ベクター、ヘルペスウイルス、シミアンウイルス４０、およびウシパピローマウイルスベクターを含む。

〔００１０７〕対象ポリペプチド複合体の発現の促進に使用できる原核細胞および真核細胞は、例として、微生物、植物および動物細胞、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核生物、Ｓｆ２１細胞等の昆虫細胞、サッカロミセス、カンジダ、クリヴェロミセス、スキゾサッカロミセス、およびピチア等のイースト、およびＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ等の哺乳類細胞を含む。当該技術分野に精通する者であれば、望ましい細胞または有機体に適切な発現ベクター、プロモータ、選択可能なマーカ等を含む、特定の発現系に適切な構成要素を容易に選択できる。様々な発現系の選択および使用は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Pｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；およびＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”：，１９８５ Ｓｕｐｐｌ．１９８７）において見つけることができる。また対象のＤＮＡ構造体を含むおよび発現する真核細胞も提供する。

〔００１０８〕細胞移植の場合、移植手順または血管壁を通じたカテーテル介在の注射手順のいずれかを用いて、細胞を投与することができる。一部の場合において、脈管構造に放出することにより細胞を投与してもよい。次に、細胞はこの脈管構造から血流に分配され、および／または周辺組織に移動する。

〔００１０９〕対象ポリペプチド複合体またはＤＮＡ構造体は、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、好ましくはマウスまたはヒトＣＤ４０の結合を特異的に結合する、またはアゴナイズするアゴニスト抗ＣＤ４０抗体、またはＣＤ４０Ｌあるいはそのフラグメントを含む、またはコード化する。本明細書で使用されるように、「抗体」という用語は、その最も広範な意味で使用され、多クローンおよびモノクローン抗体、およびその抗原結合フラグメントを含む。これは、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメントを含む。

〔００１１０〕さらに、「抗体」という用語は、自然発生する抗体および自然発生しない抗体、例えば一本鎖抗体、キメラ抗体、二官能性およびヒト化抗体を含む。キメラ、ヒト化、および完全なヒト抗体が本発明における使用に好適である。キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト、一本鎖および二官能性抗体を合成する方法は、当業者によく知られている。さらに、ＣＤ４０に特異的なアゴニスト抗体は広く知られて入手可能であり、ＣＤ４０抗原、好ましくはヒトＣＤ４０を用いた好適な宿主細胞の免疫付与により形成される。

〔００１１１〕抗マウスＣＤ４０抗体（ＦＧＫ４５）の使用は、例において実証される。抗ヒトＣＤ４０抗体がマウスＣＤ４０を特異的に結合せず、生体内研究がげっ歯類であったため、この抗体を選択した。ヒト治療の場合は、選択したアゴニストＣＤ４０抗体をヒトＣＤ４０に特異的に結合する。ヒトＣＤ４０に特異的なアゴニストＣＤ４０抗体も当該技術分野において知られており、周知の方法で生成されてもよい。代替として、ＣＤ４０アゴニストは、ヒトＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの相互作用をアゴナイズするＣＤ４０Ｌのフラグメントまたはそれを含む融合タンパク質を含んでもよい。

〔００１１２〕上記のように、本発明の相乗性結合体は、ＣＤ４０アゴニストと相互作用する少なくとも１つのＩ型インターフェロンまたはそのフラグメントあるいは変型を含み、ＣＤ８＋ＤＣ上にＣＤ７０発現を誘導し、生体内のＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増加を導出する。これは、例としてアルファインターフェロン、ベータインターフェロン、オメガインターフェロン、タオインターフェロン、ゼータインターフェロン、およびエプシロンインターフェロンらとともに、その機能的変型およびフラグメントを含む。

〔００１１３〕当然のことながら、本発明の様々な実施形態の活性に著しく影響しない修正も、本明細書において提供される発明の定義の範囲内で提供される。
発明者の理論
〔００１１４〕上述のように、これまでに試験されたすべてのＴＬＲアゴニストは、抗ＣＤ４０と相互作用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘導する。しかし、一部のＴＬＲアゴニスト／抗ＣＤ４０結合体（ＴＬＲ３、７、９の場合）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を強化するためにＩ型インターフェロン（ＩＦＮαβ）に深く依存するが、その他のＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体（ＴＬＲ２および５の場合）はそうでないことが観測された。驚くことに、ＣＤ４細胞の欠失により、ＴＬＲ３または７／ＣＤ４０アゴニスト結合体はＣＤ８＋Ｔ細胞反応の生成に対するＩＦＮαβ要件を排除する。これらのデータは集合的に、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞反応の制御におけるＩＦＮαβおよびＣＤ４細胞の役割を発明者に示唆する。

〔００１１５〕これらの観察に基づいて、本発明者は、ＤＣ上のＴＮＦリガンド誘導がＩＦＮαβに依存性または非依存性であること、およびこれがＩＦＮαβに対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応の後次依存性を決定すると仮定した。ＩＦＮαβ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、ＣＤ４の欠失により回復できるため、ＤＣ上のＣＤ７０発現またはＣＤ８＋Ｔ細胞反応のいずれかは、制御Ｔ細胞により負の影響を受けると仮定した。それにより、ＩＦＮαβが結合ＴＬＲ（３、７、または９）／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続いて、ｉ）ＣＤ７０担持ＡＰＣ（ＣＤ８Ｔ細胞中心）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を直接増加させる、ｉｉ）ＴＮＦリガンド発現のためＤＣを直接活性化する（ＤＣ中心）、ｉｉｉ）ＡＰＣ ＴＮＦリガンド発現またはＣＤ８＋Ｔ細胞増加に対する制御ＣＤ４＋Ｔ細胞活性を阻害する（Ｔｒｅｇ中心）という機能のうちの１つ以上を行うことにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応に影響するメカニズムを提案した。ＣＤ８＋Ｔ細胞増加の誘導における抗ＣＤ４０との相互活性は、ＴＬＲ１／２、２／６、３、４、５、７、および９のアゴニストを含む、試験したすべてのＴＬＲアゴニストの特性である。これらのデータは集合的に、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与が、強力な１次ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の導出に必要なすべてのシグナルを再構成できることを示す。

〔００１１６〕ＴＬＲとＣＤ４０との相互作用に関する細胞および分子要件を特定するため、抗体を用いたブロッキングまたは欠失により、様々な細胞型または因子が欠失したノックアウトおよび／またはマウスにおいて多くの実験を行った。これらの研究は、正常なＣＤ４０およびＴＲＬシグナリング経路（ＣＤ４０ ＫＯおよびＭｙＤ８８ ＫＯマウスを使用）の必要性を確認した。この相互作用はＣＤ４細胞に依存しないが、観察されたＩＦＮγ、ＩＬ‐１２、またはＩＬ‐２３は、使用されるＴＬＲアゴニストにより、ＩＦＮαβに対する相互作用に変数依存した。Ａｈｏｎｅｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｃ．Ｌ．Ｄｏｘｓｅｅ，Ｓ．Ｍ．ＭｃＧｕｒｒａｎ，Ｔ．Ｒ．Ｒｉｔｅｒ，Ｗ．Ｆ．Ｗａｄｅ，Ｒ．Ｊ．Ｂａｒｔｈ，Ｊ．Ｐ．Ｖａｓｉｌａｋｏｓ，Ｒ．Ｊ．Ｎｏｅｌｌｅ，ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｋｅｄｌ．２００４．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＴＬＲ ａｎｄ ＣＤ４０ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ｔｙｐｅ Ｉ ＩＦＮ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９：７７５．ＩＦＮαβに対する依存の程度は、一般に所定のＴＬＲが誘導したＩＦＮαβの量に関連するようであることが観察された。そのため、ＴＬＲ３、７、または９のアゴニストと併用して抗ＣＤ４０で免疫付与したＩＦＮαβレセプタノックアウト（ＩＦＮαβＲＫＯ）マウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成できなかった。逆に、ＴＬＲ２または５のアゴニストと併用して抗ＣＤ４０で免疫付与したＩＦＮαβＲＫＯマウスは、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成した。これらのデータは、ＩＦＮαβが適応免疫の生成において、以下の例に示されるように、既に理解されているよりもはるかに重要な役割を果たす可能性があることを発明者に示唆した。

〔００１１７〕最初に、Ｔ細胞反応の生成におけるＩＦＮαβの正確な役割を予測および明確にすることは困難であることを強調する必要がある。その理由の一部は、Ｔ細胞機能に対するＩＦＮαβの影響の多くが間接的であるように思われることである。ＩＦＮαβは、主要な細胞型に関するＭＨＣ分子の上昇を含む、ＡＰＣ活性の多くの側面を強化する。Ｔｏｕｇｈ，Ｄ．Ｆ．２００４．Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｓ ａ ｌｉｎｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ４５：２５７；Ｌｅ Ｂｏｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｔｏｕｇｈ．２００２．Ｌｉｎｋｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：４３２．最近では、ＩＦＮαβが外因性抗原のＡＰＣ過程をクラスＩ経路、クロスプライミングとして知られる過程に進展させることが示された。Ｌｅ Ｂｏｎ，Ａ．，Ｎ．Ｅｔｃｈａｒｔ，Ｃ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ａｓｈｔｏｎ，Ｓ．Ｈｏｕ，Ｄ．Ｇｅｗｅｒｔ，Ｐ．Ｂｏｒｒｏｗ，ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｔｏｕｇｈ．２００３．Ｃｒｏｓｓ‐ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｖｉｒｕｓ‐ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：１００９．これにより、外因性タンパク質抗原を投与した後のＣＤ８＋Ｔ細胞反応の生成が可能になる。またＩＦＮαβは、Ｔ細胞活性化および増殖に対するその他の影響も持つ。高レベルのＩＦＮαβもナイーブ型の一部活性化および記憶ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘導する。Ｔｏｕｇｈ，Ｄ．Ｆ．，Ｓ．Ｓｕｎ，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ Ｊ．Ｓｐｒｅｎｔ．１９９９．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １７０：３９’Ｓｐｒｅｎｔ，Ｊ．，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｓｕｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｔｏｕｇｈ．２０００．Ｔ‐ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ３５５：３１７；Ｓｐｒｅｎｔ，Ｊ．２００３．Ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ‐ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ５：２２７；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓ．Ｓｕｎ，Ｉ．Ｈｗａｎｇ，Ｄ．Ｆ．Ｔｏｕｇｈ，ａｎｄ Ｊ．Ｓｐｒｅｎｔ．１９９８．Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ‐ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ＩＬ‐１５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：５９１；Ｔｏｕｇｈ，Ｄ．Ｆ．，ａｎｄ Ｊ．Ｓｐｒｅｎｔ．１９９８．Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ６３：１２３．
〔００１１８〕ＩＦＮαβはナイーブ型Ｔ細胞を直接刺激して生存させるが、ナイーブ型Ｔ細胞に対するＩＦＮαβの影響はＡＰＣにより一部媒介されてもよい。Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，Ｊ．Ｋａｐｐｌｅｒ，ａｎｄ Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ．１９９９．Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｋｅｅｐ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｌｉｖｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：５２１；Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｂｅｎｄｅｒ，Ｄ．Ｈｉｌｄｅｍａｎ，Ｒ．Ｋｅｄｌ，Ｋ．Ｔｅａｇｕｅ，ａｎｄ Ｊ．Ｋａｐｐｌｅｒ．．１９９８．Ｔ‐ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １６５：２７９．この生存活性は、Ｔ細胞内のＳＴＡＴ１に依存し、Ｔ細胞における直接ＩＦＮαβシグナリングを伴う必要があることを示す。Ｍａｒｒａｃｋ，Ｐ．，Ｊ．Ｋａｐｐｌｅｒ，ａｎｄ Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ．１９９９．Ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｋｅｅｐ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｌｉｖｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：５２１．最近では、ＩＦＮαが、抗原およびＢ７媒介性同時刺激に呼応して、ナイーブ型ＣＤ８＋Ｔ細胞に直接作用し、増殖、エフェクタ機能および記憶の進行を促進することが明らかになっている。Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｏ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｐ．Ａｇａｒｗａｌ，Ｄ．Ｌｉｎｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｆ．Ｍｅｓｃｈｅｒ．２００５．
〔００１１９〕Ｉ型ＩＦＮは、３つ目のシグナルをＣＤ８Ｔ細胞に提供し、クローン増殖および分化を刺激する。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：４４６５．反対に、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の増殖に対するＩＦＮαβの影響は間接的であるという説もある。この増殖は、その他の細胞型からＩＬ‐１５の生成を介して生じ、ＣＤ４Ｔ細胞ではなく記憶ＣＤ８の増殖を選択的に誘導する。Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｓ．Ｓｕｎ，Ｉ．Ｈｗａｎｇ，Ｄ．Ｆ．Ｔｏｕｇｈ，ａｎｄ Ｊ．Ｓｐｒｅｎｔ．１９９８．Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ‐ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ＩＬ‐１５．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：５９１；Ｓｐｒｅｎｔ，Ｊ．，Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｓｕｎ，ａｎｄ Ｄ．Ｔｏｕｇｈ．１９９９．Ｔ‐ｃｅｌｌ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６５：２１．そのため、Ｔ細胞の活性および増殖の開始において、Ｔ細胞に対するＩＦＮαβの間接的および直接的影響がどちらも観察されている。

〔００１２０〕反対に、Ｔ細胞の成長または機能の制御に対するＩ型ＩＦＮの影響に関するデータはほとんどない。ＩＦＮαとＩＬ‐１０の結合体を使用し、ヒト制御性細胞を生体外で生成可能であることを示す報告がある。Ｌｅｖｉｎｇｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｒ．Ｓａｎｇｒｅｇｏｒｉｏ，Ｆ．Ｇａｌｂｉａｔｉ，Ｓ．Ｓｑｕａｄｒｏｎｅ，Ｒ．ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ，ａｎｄ Ｍ．Ｇ．Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ．２００１．ＩＦＮα ａｎｄ ＩＬ‐１０ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ １ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：５５３０．
〔００１２１〕上述のように、また発明の発見に続く例におけるデータが支持するように、Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニストの結合体は、免疫性細胞に対する相乗効果を導出し、樹状細胞上のＣＤ７０を上方制御して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の指数関数的な増加を提供することにより、治療において対象の新規アジュバント結合体が導出する細胞性免疫の量および性質が必要であると考えられる種類の疾患に対してさらに強力なワクチンの開発を可能にする。

〔００１２２〕以下の例は、例示の目的で提供する。しかし、当然のことながら本発明の範囲は請求項により画定される。
以下の例の一部で使用される材料および方法。

〔００１２３〕C５７ＢＬ／６、ＩＦＮαβＲＫＯ、またはＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯマウスにモデル抗原で免疫付与する。つまり、０．１〜０．５ｍｇの総タンパク質（オブアルブミンまたはＨＳＶ糖たんぱく質Ｂ［ＨＳＶｇＢ］）または５０μｇのペプチド（オブアルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＨＳＶｇＢのＳＳＩＦＦＡＲＬ、ワクシニアウイルスＢ８ＲのＴＳＹＫＳＥＦＶ）をＴＬＲアゴニスト（５０μｇ Ｐａｍ３Ｃｙｓ、２５μｇ ＭＡＬＰ‐２、１００μｇ ＰｏｌｙＩＣ、１５０μｇ ２７６０９、５０μｇ ＣｐＧ １８２６、または２５μｇ フラジェリン）、抗ＣＤ４０抗体ＦＧＫ４５（５０μｇ）、または両方と併用して腹腔内注射する。オブアルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、前述のようにＴｒｉｔｏｎＸ‐１１４ ＬＰＳ無毒化方法を使用して汚染ＬＰＳを除去する。Ａｄａｍ，Ｏ．，Ａ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｎｅ，Ｆ．Ｐａｕｌ，Ｐ．Ｆ．Ｍｏｎｓａｎ，ａｎｄ Ｇ．Ｐｕｚｏ．１９９５．Ａ ｎｏｎｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２２５：３２１．総ＨＳＶｇＢタンパク質は、前述のようにバキュロウイルスにおける発現およびニッケルカラム上の精製により形成され、ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｒｏｓｅｌｙｎ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇから厚意で提供される。Ｂｅｎｄｅｒ，Ｆ．Ｃ，Ｊ．Ｃ．Ｗｈｉｔｂｅｃｋ，Ｍ．Ｐｏｎｃｅ ｄｅ Ｌｅｏｎ，Ｈ．Ｌｏｕ，Ｒ．Ｊ．Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｇ．Ｈ．Ｃｏｈｅｎ．２００３．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：９５４２．使用されるＴＬＲアゴニストは、購入する（Ｐａｍ３Ｃｙｓ‐ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、ＭＡＬＰ‐２‐Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＰｏｌｙＩＣ‐Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＣｐＧ １８２６‐Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、材料譲渡契約を通じて提供される（２７６０９‐３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、あるいは自社で合成する（フラジェリン）。各ＴＬＲアゴニストについて、ＬｉｍｕｌｕｓアッセイによりＬＰＳ汚染を試験し、生体内に注射した量の５ＩＵ未満のＬＰＳ活性（約５０〜３００ｎｇ）を有することが分かった。この量のＬＰＳの注射は、生体内の脾臓樹状細胞に対して観測可能な影響をもたらさない（データ表示せず）。自社で分離したフラジェリンの場合、オブアルブミン非毒性化に関して上述される同様のプロトコルを使用し、汚染ＬＰＳを除去した。

〔００１２４〕これらのＴＬＲアゴニストは、２つの主な理由から本実験に使用するため選択した。第１に、２次リンパ系組織における主なＤＣサブセットは、ＣＤ８＋およびＣＤ１１ｂ＋ＤＣであり、どちらも共通および固有のＴＬＲを発現する。選択したＴＬＲアゴニストは、ＣＤ８＋ＤＣ（ポリＩＣ‐ＴＬＲ３）、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣ（２７６０９‐ＴＬＲ７およびフラジェリン‐ＴＬＲ５）、または両ＤＣサブセット（Ｐａｍ３Ｃｙｓ／ＭＡＬＰ‐２、ＴＬＲ２刺激）を直接刺激する。第２に、選択した分子は、抗ＣＤ４０と併用してＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導するためのＩＦＮαβ依存性（ポリＩＣ、２７６０９、ＣｐＧ １８２６）または非依存性（Ｍａｌｐ‐２、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラジェリン）であるＴＬＲアゴニストを表す。

〔００１２５〕記載の免疫付与は、ＣＤ７０（ＦＲ７０）、ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ１３４（ＲＭ１３４Ｌ）、または４１ＢＢＬ／ＣＤ１３７Ｌ（ＴＫＳ‐１）をブロッキングする抗体を併用投与する場合と、しない場合とで行う。２５０μｇの抗体を２日毎に腹腔投与することで、これらのリガンド／レセプタ相互作用それぞれの相互作用を十分にブロックする（図５を参照）。ブロッキング実験はこの投与計画を用いて行い、後次の同様の実験を使用してＣＤ８＋Ｔ細胞反応に対する影響があるとすれば、それをもたらすために必要な遮断抗体の最小量を特定した。

〔００１２６〕抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を監視するため、免疫付与の５〜７日後、前述のように末梢血および／または脾臓細胞を分離し、Ｈ‐２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＨ‐２Ｋｂ／ＳＳＩＦＦＡＲＬ ＭＨＣ四量体で染色した。Ｋｅｄｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｍ．Ｊｏｒｄａｎ，Ｔ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｋａｐｐｌｅｒ，Ｐ．Ｍａｒｒａｃｋ，ａｎｄ Ｓ．Ｄｏｗ．２００１．ＣＤ４０ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ‐ａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９８：１０８１１；Ｋｅｄｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｗ．Ａ．Ｒｅｅｓ，Ｄ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｍａｎ，Ｂ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｋａｐｐｌｅｒ，ａｎｄ Ｐ．Ｍａｒｒａｃｋ．２０００．Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｃｏｍｐｅｔｅ ｆｏｒ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ‐ｂｅａｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ‐ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１１０５；Ｋｅｄｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｂ．Ｃ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｋａｐｐｌｅｒ，ａｎｄ Ｐ．Ｍａｒｒａｃｋ．２００２．Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｏｗｎ‐ｍｏｄｕｌａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ‐ＭＨＣ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｎ ＡＰＣｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．３：２７．細胞のエフェクタサイトカイン生成能力の指標として、細胞内インターフェロンγ（ＩＣ ＩＦＮγ）染色により、ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析する。ＩＣ ＩＦＮγ染色は文献において広く利用されており、上述のように実施する。さらに、抗原刺激後のＣＤ１０７ａ発現を抗原特異的細胞溶解機能の指標として分析する。ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ‐１）は、細胞溶解顆粒の膜タンパク質構成要素であり、抗原刺激後のＴ細胞プラズマ膜上のその識別は、細胞溶解性顆粒のエクソサイトーシスの表示である。結合した四量体およびＣＤ１０７ａ染色を前述のように行う。つまり、ＭＨＣ四量体を用いて細胞を３０分間３７℃で培養する。次に抗原ペプチド（１μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ１０７ａ‐ＦＩＴＣ抗体をさらに１時間添加し、その後１μｇ／ｍｌモネンシンを細胞に添加して、抗体結合ＣＤ１０７ａがリソソームに吸収されるにつれて、統合ＦＩＴＣ蛍光の破壊を抑制する。細胞をさらに３〜４時間３７℃で培養し、ＣＤ８に対する抗体で染色し、洗浄、固定してＦＡＣＳにより分析する。上述のように、結合ＴＬＲ２‐または‐５／ＣＤ４０アゴニストの免疫付与中に、ＣＤ７０、４１ＢＢＬ、ＯＸ‐４０Ｌ、およびＣＤ３０Ｌに対する遮断抗体をＩＦＮαβＲＫＯマウスにも同様に注射する。ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の大きさおよび機能は、上述のように、四量体、ＩＣ ＩＦＮγ染色、およびＰＢＬおよび／または脾臓細胞のＦＡＣＳ分析により特定する。

〔００１２７〕記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加に対する１次免疫付与中のＴＮＦリガンドブロッキングの影響を判断するため、免疫付与したマウスを少なくとも６０日間静養させ、同一の免疫付与により再度感作し、２次反応を上述のように分析する。実験は、ＩＦＮαβＲＫＯマウス、ＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯマウス、および対照として正常かつＣＤ４欠失のＢ６マウスにおいて実施する。健康なＩＦＮαβＲＫＯマウスにおいて、ＩＦＮαβ非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成するＴＬＲ／ＣＤ４０結合体を分析する。ＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯマウスにおいて、ＩＦＮαβ依存性および非依存性ＴＬＲ／ＣＤ結合体の両方を試験する。代表的なＣＤ４欠失および免疫付与したマウスを、１次免疫付与後少なくとも６０日間静養させた後、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与により再度感作する。これらの実験を使用し、ＩＦＮαβ欠乏宿主細胞、ＣＤ４欠失宿主細胞または欠失でない宿主細胞の免疫付与に続く１次および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞反応が、ＣＤ７０および／またはその他のＴＮＦリガンドに依存するかどうかを判断する。

例１：
結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の増加はＩＦＮαβへの可変依存を示す。

〔００１２８〕すべてのＴＬＲアゴニストは抗ＣＤ４０と相互作用してＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を促進したが、本発明者は、特定のＴＬＲアゴニスト／抗ＣＤ４０結合体から導出されたＣＤ８＋Ｔ細胞反応が、完全にＩＦＮαβに依存することに気づいた。それに基づいて、本発明者は、上述のように図１および２に含まれる実験において、異なる結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニストに関連し、インターフェロンαβレセプタノックアウト（ＩＦＮαβＲＫＯ）マウスにペプチド抗原で免疫付与した。

〔００１２９〕図１に含まれる実験において、オブアルブミンペプチド、抗ＣＤ４０、および表示ＴＬＲアゴニストで免疫付与したアゴンマウス（ａｇｏｎｍｉｃｅ）（最下列）における結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニストの投与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を測定した。７日後、四量体染色およびＦＡＣＳ分析により、脾臓におけるオブアルブミン特異的Ｔ細胞反応を測定した。右上四分儀の数字は、総ＣＤ８＋細胞に占める四量体染色細胞のパーセンテージを示す。

〔００１３０〕図２含まれる実験において、ＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞のＣＤ４欠失が、アゴニスト抗ＣＤ４０と併用してＩＦＮαβ依存性ＴＬＲアゴニストを用いた免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を回復することが明らかになった。ＷＴおよびＩＦＮαβＲＫＯマウス、図２に示されるようなＣＤ４欠失または非欠失マウスに、ＨＳＶ‐１ペプチド、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体、およびポリＩＣを用いて免疫付与した。７日後、ＨＳＶ‐１特異的反応を四量体（Ａ）およびＩＣ ＩＦＮγ（Ｂ）染色ＰＢＬ細胞により特定した。

〔００１３１〕図２に含まれる結果から分かるように、これらのマウスにおいて、ＴＬＲ３、７、または９アゴニストと抗ＣＤ４０とを併用した免疫付与に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を完全に破棄した（図２）。反対に、残りのＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、ＩＦＮαβに一部のみ依存するか（ＴＬＲ４／ＣＤ４０）または比較的独立していた（ＴＬＲ２／６／ＣＤ４０アゴニスト）（図１）。その他の実験において、ＴＬＲ１／２アゴニストＰａｍ３Ｃｙｓ、およびＴＬＲ５アゴニストフラジェリンも、ＩＦＮαβＲＫＯにおいて抗ＣＤ４０と併用された場合、ｗｔマウスに相当するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成した（データ表示せず）。これらの結果は、抗ＣＤ４０が、ＴＬＲ２または５アゴニストと併用した場合はＩＦＮαβ非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を導出するが、ＴＬＲ３、７、または９アゴニストと併用した場合は、ＩＦＮαβ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を導出することを示す。このため、ＴＬＲ２または５アゴニストとＣＤ４０経路との相互作用は、ＩＦＮαβに非依存であると考えられる。逆に、ＴＬＲ３、７、または９アゴニストとＣＤ４０経路との相互作用は、ＩＦＮαβに依存すると考えられる。このデータは、直接Ｔ細胞、抗原含有ＡＰＣ、またはその両方を通じてシグナリングすることにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の生成におけるＩＦＮαβの役割を本発明者に示唆した。

〔００１３２〕例２
結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は、ＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞において回復する。

〔００１３３〕ＩＦＮαβＲＫＯマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応不全は、上述の特定ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体により導出される反応においてＩＦＮαβに対する義務的役割を本発明者に示唆すると思われた。図２の実験で示されるように、ＷｔおよびＩＦＮαβＲＫＯマウスは、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニストを併用するペプチド免疫付与の１日前に抗ＣＤ４抗体ＧＫ１．５を注射したことにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠失した（図２）。結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与から７日後、マウスを犠牲死させ、ＰＢＬおよび脾臓細胞を分離し、四量体および細胞内ＩＦＮγ染色により分析した。ペプチドおよびポリＩＣ／抗ＣＤ４０を用いた免疫付与は、ＩＦＮαβＲＫＯマウスにおいてＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成できなかった。しかしＣＤ４の欠失は、ＩＦＮαβＲＫＯマウスにおける抗原特異的Ｔ細胞の数（総ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセント、図２Ａ）および機能（図２Ｂ）の両方に関して、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を回復した。これは、試験したすべてのＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体（ＴＬＲ２、５、および７）に対しても該当し、ＩＦＮαβ非依存性ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体（すなわち、ＴＬＲ２）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応でさえも、非ＣＤ４欠失対照と比較して強化された（データ表示せず）。そのため、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＩＦＮαβＲＫＯマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、一般にＣＤ４欠失後に強化される。

〔００１３４〕これらの発見に関する本発明者の懸念の１つは、それらが生理学的に関連するか否か、または単にＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞に固有であるか否かということであった。そのため、多クローン性ラビット抗ＩＦＮ抗体使用し、ＩＦＮαβをブロックして、ＣＤ４欠失および欠失でないｗｔ宿主細胞において実験を行った。

〔００１３５〕図３に示されるように、抗ＩＦＮは、ＣＤ４欠失により回復されるポリＩＣ／ＣＤ４０媒介性ＣＤ８反応をブロックする。この実験において、抗ＩＦＮおよび／またはＣＤ４欠失および欠失でないマウスに、抗ＩＦＮおよび／またはＣＤ欠失オブアルブミン（結合ポリＩＣ／抗ＣＤ４０）に対する免疫を付与した。７日目に、抗原特異的Ｔ細胞パーセントに関する材料および方法の段で上述したように、ＰＢＬを四量体染色により分析した。

〔００１３６〕図３に示されるように、結合ポリＩＣ／αＣＤ４０を用いて免疫付与したｗｔマウスの場合、抗ＩＦＮαβ抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の程度を著しく減少させた（図３）。
ＩＦＮαβＲＫＯマウスで見られる結果と一致して、抗ＩＦＮ処理したマウスのＣＤ４欠失は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を完全に回復した。そのため、ＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞およびＩＦＮαβ欠失抗体を注射したｗｔ宿主細胞の両方において、ＣＤ４の欠失は、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＩＦＮαβに対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応の依存性を低減するように思われた。これらの結果は、１）ＣＤ４＋Ｔ細胞の小集団が、特定のＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体を用いた免疫付与に続くＩＦＮαβＲＫＯマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞反応を制御する、２）ＩＦＮαβは、これらのＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体を用いた免疫付与後に、このＣＤ４＋Ｔ細胞集団の制御能力を阻害する働きをする場合がある、および３）その他のＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体（例えば、ＴＬＲ２または５）は、ＩＦＮαβ非依存様式で制御ＣＤ４＋Ｔ細胞による阻害を回避できることを発明者に示唆した。

〔００１３７〕これらの結果は、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与が、使用されるＴＬＲアゴニストに応じてＩＦＮαβに対する関心の可変依存を示す強力な１次および２次ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を導出できることを示す。これらの発見は、既に解明されているよりも直接的なＣＤ８＋Ｔ細胞反応におけるＩＦＮαβの役割を発明者に示唆した。また、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与は、ＤＣ上のＣＤ７０の上方制御を固有に誘導し、ＷＴマウスにおける確実なＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、これに大きく依存するようであることも明らかになった。この予備データは、活性化したＡＰＣ上のＣＤ７０発現の増強、およびＣＤ２７を介した抗原特異的Ｔ細胞の後次刺激が、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に応答したＣＤ８＋Ｔ細胞反応の形成および生存に関する主要チェックポイントであることを示唆した。しかし、さらに驚くべきことは、ＩＦＮαβＲＫＯ（図２）およびＷＴマウス（図３）の両方におけるＩＦＮαβ依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を、ＣＤ４＋Ｔ細胞の宿主細胞を欠失させることにより救済できるという本発明者の観測である。これらの結果は、ＩＦＮαβが以下の理由からＣＤ８＋Ｔ細胞反応に影響する可能性があることを示唆する。１）ＴＮＦＬ発現ＡＰＣに対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を制御する、２）ＡＰＣ活性およびＴＮＦリガンドの発現を制御する、３）ＴＮＦリガンドのＡＰＣ発現またはＴＮＦＬ担持ＡＰＣに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を抑制するＣＤ４＋Ｔ細胞の制御機能を阻害する、４）上述のいずれかの組み合わせ。以下の例は、すべて結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続く、ｉ）ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の媒介におけるＩＦＮαβの役割、ｉｉ）ＤＣ活性化におけるＩＦＮαβの役割、およびｉｉｉ）ＣＤ４＋制御細胞機能におけるＩＦＮαβの役割を組織的に検討することにより、これらの仮説の正確性を最終的に決定する。

〔００１３８〕例３
ＩＦＮαβＲＫＯにおけるＣＤ８＋反応に対するＴＮＦリガンドの役割
〔００１３９〕図４の実験に示されるように、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与により生成されたＷＴマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、ＣＤ７０に依存する（図４を参照）。この実験において、ＣＤ４欠失ＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞において、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞反応を評価した。結果から、ＣＤ７０に大きく依存することが分かった。ＩＦＮαβＲＫＯマウスはＣＤ４細胞を欠失し、上述のようにＨＳＶ‐１ペプチド、ポリＩＣ、および抗ＣＤ４０抗体を用いて免疫付与した。次に、図１のように抗ＴＮＦリガンド抗体をマウスに注射した。７日目に、ＰＢＬを四量体染色により再度分析した。

〔００１４０〕前述の実験から明らかなように、ＩＦＮαβＲＫＯマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に先立って、ＩＦＮαβを刺激しないＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体、またはＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞によってのみ導出可能である点で固有である。図４の結果は、ＣＤ７０がＩＦＮαβＲＫＯマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞反応において必要な役割を果たすことをさらに示す。この実験において、抗ＣＤ７０は反応を約１０倍ブロックしたが、その他のＴＮＦＬ抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を最大２倍まで阻害したことに留意する。これは、ｗｔマウス（図１）とは反対に、複数のＴＮＦリガンドが、ＩＦＮαβＲＫＯマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞反応の程度に対して、少なくともいくらかの影響をもたらす可能性があることを示唆する。図４に示されるデータは、最小遮断抗体の注射により得られた。

〔００１４１〕例４
材料および方法。
〔００１４２〕可溶性ＣＤ７０／ｌｇ融合タンパク質（ｓＣＤ７０ｌｇ）の注射は、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ Ｇｅｎｅｒａｌ ＨｏｓｐｉｔａｌのＤｒ．Ａｙｍｅｎ Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉによって最初に記載されたように（Ｒｏｗｌｅｙ，Ｔ．Ｆ．，ａｎｄ Ａ．Ａｌ‐Ｓｈａｍｋｈａｎｉ．２００４．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｏｌｕｂｌｅ ＣＤ７０ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｔｒｏｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ＣＤ８＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：６０３９）、生体内でＣＤ２７を介してT細胞にアゴニスト刺激を良好に提供する。Ｄｒ．Ａｌ‐Ｓｈａｍｋｈａｎｉから厚意で提供されたこの試薬を、ＴＬＲおよびＣＤ４０刺激と併用してＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞に注射する。最初に、ｓＣＤ７０ｌｇ試薬を追加注射することにより、ＩＦＮαβ依存性ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニストの結合体に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応の救済を試みる。初期抗原感作後７日目に、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を再度分析する。Ｄｒ．Ａｌ‐Ｓｈａｍｋｈａｎｉの研究室から得たデータは、抗原感作後２〜４日目に２５０μｇのｓＣＤ７０ｌｇを毎日注射することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加に最適なＣＤ７０媒介性シグナルを提供することを示している（私信）。本発明者は、このＣＤ７０ｌｇ注射の時間的経過が、ＷＴウスにおいてＴＬＲアゴニスト単独に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を増加させることを確認した（データ表示せず）。抗原およびＴＬＲアゴニスト、抗ＣＤ４０、または両方を用いて、ゼロ日目にマウスを腹腔内感作する。抗原注射後２、３、および４日目に、２５０μｇのｓＣＤ７０ｌｇを腹腔内注射した後、元の抗原感作後７日目に血液および／または脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応を分析した。

〔００１４３〕図４に示すデータから、ＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞は、任意の組み合わせのＴＬＲ／ＣＤ４０刺激に対して反応するようになることは明らかである。図４に示されるように、ＣＤ７０の封鎖は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応を誘導するためのＴＬＲアゴニストとＣＤ４０アゴニストとの相互作用を排除する。この実験において、抗ＣＤ４０＋／ＴＬＲ‐アゴニストの表示結合体を用いてマウスを感作した。代表的なマウスのサブセットに、抗ＣＤ７０遮断抗体ＦＲ７０を注射した（下位ドットプロット）。図４Ａは代表的な四量体染色を示し、図４Ｂは１群あたりマウス３匹の平均および標準偏差を示し、図４Ｃは、５Ａと同様にマウスに免疫付与したが抗ＣＤ７０を与えなかった場合、１回注射した場合、または２回注射した場合を示す。２４時間後にＤＣを分離し、各サブセットにおけるＤＣの数（上パネル）およびＣＤ７０染色（下パネル）を分析した。

〔００１４４〕ＷＴマウスにおいて、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の反応は、ＣＤ７０に依存することが分かる（図４）。上述および図４に示されるデータは、少なくともＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞にも該当することを示唆する。また図４における結果は、複数のＴＮＦリガンドが、ＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞反応において、ある程度関与する場合があることを示唆する。

〔００１４５〕例５
〔００１４６〕ｗｔマウスにおける組み換えＩＦＮα＋／−抗ＣＤ４０に続く免疫細胞反応。

〔００１４７〕以下の材料および方法を使用して実験を行い、ＩＦＮαβ依存性ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体を用いて免疫付与した後、ＩＦＮαβの作用が単独で十分にＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を導出するかどうかを判断する。
材料および方法
〔００１４８〕簡潔に言うと、ポリＩＣ刺激性のＢ細胞ｃＤＮＡから新規ＩＦＮα配列をクローン化した。誘導された亜型のうち、このＩＦＮα亜型を選択したのは、グリコシル化配列がないため昆虫細胞において発現可能であり、異常なグリコシル化の心配がないためである。親和性精製の目的でＴＣＲ ＣαエピトープタグをＣ末端に付加し、配列をｐＢａｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｐ１０プロモータ部位にクローン化した。組み換えバキュロウイルスを生成し、Ｈｉ５細胞の感染後、親和性およびサイズクロマトグラフィにより組み換えＩＦＮαを上澄みから精製した。ＩＦＮαの活性は、ＡＰＣ上のクラスＩ ＭＨＣの上方制御に基づいて生体外および生体内で確認した（データ表示せず）。

〔００１４９〕ワクチン環境における組み換えＩＦＮαの使用は、既に公開されており（Ｌｅ Ｂｏｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｔｏｕｇｈ．２００２．Ｌｉｎｋｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｖｉａ ｔｙｐｅ Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：４３２）、またここで提案される研究において同様のプロトコルが最初に使用される。上述のように、抗原および抗ＣＤ４０を１０４‐１０６単位のＩＦＮαと併用し、野生型マウスを調整する。次に、結果として生じるＣＤ８＋Ｔ細胞反応を、結合ＴＬＲ（３、７、または９）／ＣＤ４０アゴニストで免疫付与したマウスと比較し、ＩＦＮαと抗ＣＤ４０が、ＴＬＲ刺激と同程度に相互作用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を導出するかどうかを判断する。その他の対照マウスにＩＦＮαまたは抗ＣＤ４０のみを注射する。ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を上述のように分析する。

〔００１５０〕図５の実験から分かるように、得られたデータは、組み換えＩＦＮαおよび抗ＣＤ４０を用いた免疫付与に対する相乗効果があることを示した。１ｘ１０５単位ＩＦＮを３回、１ｘ１０６単位ＩＦＮを１回、抗ＣＤ４０単独、または抗ＣＤ４０をＩＦＮのいずれかの投与計画と併用して注射する状況において、マウスに抗原で免疫付与した。ＩＦＮまたはＣＤ４０単独では検出可能なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を刺激したが、結合ＩＦＮ／ＣＤ４０は相互作用し、ポリＩＣ／ＣＤ４０免疫付与への応答で見られる反応に類似するＣＤ８＋Ｔ細胞反応を生成した（図５）。

〔００１５１〕特にこの実験は、Ｉ型インターフェロンおよびアゴニストＣＤ４０抗体の併用投与が、いずれかを単独投与した場合と比較して、抗原特異的ＣＤ８＋およびＴ細胞の指数関数的な増加を誘導することを明らかにする。オブアルブミンおよび抗ＣＤ４０、ポリＩＣ、または組み換えＩＦＮの表示結合体をマウスに腹腔内注射した。ＩＦＮ注射の場合、マウスに、抗原注射の日から開始して１ｘ１０５単位のＩＦＮを３日連続で注射するか、または抗原注射と同時に１ｘ１０６単位のＩＦＮを１回注射した。７日後にマウスを犠牲死させ、末梢血または脾臓のいずれかから得た細胞を四量体で染色して、オブアルブミン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加の程度を識別した。細胞をＦＡＣＳにより分析し、示されたデータをＣＤ８＋Ｂ２２０イベント上にゲートした。図において、５‐（Ａ）は四量体染色のドットプレート、５（Ｂ）は２％四量体および総ＣＤ８＋Ｔ細胞に占める血液中のＣＤ８＋細胞の平均および標準偏差（個別のマウス２匹）である。

〔００１５２〕図５に示されるデータは、組み換えＩ型インターフェロンが、ＴＬＲ／ＣＤ４０刺激と同程度にＣＤ４０と相互作用することを示し、これらの結果は、バキュロウイルスにおいて生成された組み換えＩＦＮが生体内でも同様に作用することをさらに示す。さらにこれらの結果は、結合ＩＦＮα／ＣＤ４０刺激が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加促進において、ＴＬＲ／ＣＤ４０刺激と同程度に相互作用できることを示す。

〔００１５３〕例６
Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０抗体の併用投与はＤＣ上のＣＤ７０＋発現を誘導する
〔００１５４〕前述の実験に含まれるデータは、ＩＦＮαβに対するＤＣおよび／またはＣＤ４＋Ｔｒｅｇｓの反応によりＩＦＮαβ依存性が特定されることを示唆する。本発明者は、結合ＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与の場合に、ＩＦＮαβがそのような強力なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を導出するメカニズムにＣＤ７０が関与すると仮定した。前述の例の結果から、特にＣＤ４０アゴニストおよびＩ型インターフェロンは、ＣＤ８＋免疫に対する相乗効果を導出することが分かる（図５を参照）。このデータは、ＡＰＣではなく、応答するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する結合ＩＦＮα／ＣＤ４０刺激の最終的な影響を示す。以下の実験を行い、結合ＩＦＮα／ＣＤ４０刺激が抗原含有ＤＣサブセット上のＣＤ７０および／またはその他のＴＮＦリガンドの発現を誘導するかどうかを調べる。

〔００１５５〕上述の組み換えＩＦＮαを使用し、１０４‐１０６単位のＩＦＮαと併用して、上述のように抗原および抗ＣＤ４０を用いてｉＷＴＢ６マウスを調整した。対照として、抗ＣＤ４０単独、ＩＦＮα単独、または結合ポリＩＣ／抗ＣＤ４０陽性対照を用いてマウスに免疫付与し、ＤＣ ＣＤ７０発現を増加させる。調整後６〜４８時間に代表的なマウスを犠牲死させ、脾臓コラゲナーゼを消化し、ＤＣを染色してＦＡＣＳにより分析した。ＴＮＦリガンドＣＤ７０、４１ ＢＢＬ、ＯＸ‐４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、およびＧＩＴＲＬの発現についてＤＣを評価する。結果として生じるＤＣ発現型を、結合ＴＬＲ３、７、または９／ＣＤ４０アゴニストで免疫付与したマウスと比較し、ＩＦＮαと抗ＣＤ４０が、ＴＬＲ刺激と同程度に相互作用し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を導出できるかどうかを判断する。その他の対照マウスには、ＩＦＮαまたは抗ＣＤ４０のみを注射する。抗原処理および様々なサブセットの提示に対するＩＦＮαの影響を判断するため、上述のように、マウスを組み換えＩＦＮα Ｖ‐＋／‐抗ＣＤ４０と併用して蛍光抗原で感作する。抗原摂取、抗原提示、およびＤＣ活性とＴＮＦＬ発現は、上述のように判断する。これらの実験は、ＩＦＮαがどれだけ独立して、また抗ＣＤ４０と併用して、抗原提示、ＤＣ ＴＮＦＬの発現、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増加に影響するかを特定する。

〔００１５６〕図６の実験から分かるように、Ｉ型インターフェロンおよびアゴニストＣＤ４０抗体の併用投与は、生体内でＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ７０発現を誘導するが、いずれかを単独投与する場合は誘導しない。この実験において、抗ＣＤ４０抗体単独、ポリＩＣ（陽性対照）、組み換えαインターフェロンまたは抗ＣＤ４０抗体およびＩ型インターフェロンをマウスに注射した。１８時間後、脾臓ＤＣを分離し、そのＣＤ７０発現を分析した。図７の右上四分儀の数字は、ＣＤ７０染色の標準蛍光強度を示す。このデータは、ポリＩＣ／ＣＤ４０アゴニストの投与と同様に、ＣＤ／ＩＦＮもＣＤ８＋ＤＣ上のＣＤ７０の発現を増加することも明らかにする。

〔００１５７〕そのため、データ（図６）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の導出においてＩＦＮα／ＣＤ４０免疫付与の成功を示し、ＩＦＮα／抗ＣＤ４０を注射したマウスのＤＣは、抗原摂取、抗原提示、および／またはＴＮＦＬ上方制御に関して結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニストで免疫付与した対照から得たＤＣと類似することを示す。特にＣＤ７０は、結合ＩＦＮα／αＣＤ４０免疫付与に続いて１つ以上のＤＣサブセット上で増加するが、いずれかの刺激単独の感作では増加しない。

〔００１５８〕例７
〔００１５９〕ＣＤ４０アゴニスト抗体を含む、または含まない増加量のαＩＦＮの併用投与
〔００１６０〕図７の実験において、アゴニストＣＤ４０抗体の有無にかかわらず、多量のＩ型インターフェロンを用いること以外は前述の例と同様にマウスに注射した。図のデータは、２匹の個別マウス間の平均ＣＤ７０ＭＦＩとして表され、エラーバーは、標準偏差を表す。これらの結果からも同様に、Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニストの併用投与は、生体内でＤＣ上のＣＤ７０発現を増加したが、Ｉ型インターフェロンおよびＣＤ４０アゴニストをそれぞれ単独で投与した場合は増加しないことが分かった。

〔００１６１〕例８
〔００１６２〕減少用量のＩＦＮαおよびＣＤ４０アゴニストまたは抗ＣＤ７０で免疫付与したマウスにおける抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージ
〔００１６３〕図８の実験において、抗ＣＤ４０抗体、ＩＦＮαおよび抗ＣＤ４０抗体、ポリＩＣおよびＣＤ４０抗体をそこに記載されるように異なる減少用量で、またαインターフェロンおよび抗ＣＤ４０抗体を用いてマウスに免疫付与した。図に示されるデータから、低用量のＩＦＮαで抗原（オブアルブミン）特異的Ｔ細胞の数が指数関数的に減少すること、およびＩＦＮ／ポリＩＣおよびＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニストを持つ高原特異的細胞の数がほぼ同じであったこと分かる（図８を参照）。そのため、図６、７および８のデータは、体外から添加したＩＦＮαが抗ＣＤ４０と相互作用し、ＤＣ上のＣＤ７０発現を上方制御することにより、抗原特異的Ｔ細胞の増加をもたらすことを示す。

〔００１６４〕例９
〔００１６５〕ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト結合体を持つＩＦＮαβＲＫＯマウスから得たＤＣ上のＣＤ７０発現
〔００１６６〕図６および７に見られる結果を実証するため、内因性ＩＦＮに関連するＩＦＮαを体外から添加し、図９に示されるようなＩＦＮαβマウスにおいて実験を行った。図に示されるように実験を行う。ここで、マウスは転移骨髄（この場合は、ＢＭ発現ＧＦＰ＋／‐Ｂｃｌ‐２）（図９）を用いて正常に再構成され、再構成から８週間後に免疫付与した後、免疫反応を生成した（図示せず）。

〔００１６７〕図９の実験で示されるように、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト投与感作は、ＩＦＮαβＲＫＯマウスにおいて標的ＴＬＲを発現するＤＣ上でのみＣＤ７０発現を誘導する。この実験において、抗ＣＤ４０抗体単独、またはポリＩＣあるいはＰａｍ３Ｃｙｓと併用してＩＦＮαβＲマウスに注射した。Ｐａｍ３ＣｙｓはＴＬＲ２アゴニストであり、ポリＩＣはＴＬＲ３アゴニストである。２４時間後、脾臓ＤＣを分離し、前述のようにＣＤ７０発現を染色した。ＣＤ８＋ＤＣはＴＬＲ２およびＴＬＲ３を発現するが、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣはＴＬＲ３ではなくＴＬＲ２を発現する。これらのデータは、ＩＦＮαβシグナリングの非存在下で、ＴＬＲおよびＣＤ４０の両方を介して直接刺激されたＤＣのみがＣＤ７０発現を増加できることを示唆する。

〔００１６８〕以前のデータと併せて、このデータは、ＣＤ７０発現の増大がＣＤ８＋Ｔ細胞の同時増加に関与することをさらに示唆する。
〔００１６９〕例１０
〔００１７０〕抗原特異的Ｔ細胞の数に対するＩ型ＩＦＮ／ＣＤ４０結合体の影響およびＩＬ‐２／ＣＤ４０アゴニスト結合体の影響
〔００１７１〕図１０の実験は、ＣＤ４０アゴニストと結合された場合のＩＬ‐２の別のサイトカインおよびＩ型インターフェロンの影響を比較するよう設計された。上記のように、ＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト結合体を用いて得られる相互作用は全く予期せぬことであり、その他のサイトカイン／ＣＤ４０アゴニスト結合体では見られないと考えられる。

〔００１７２〕この実験において、Ｉ型ＩＦＮ／ＣＤ４０抗体、ＩＬ‐２／ＣＤ４０抗体、ＩＬ‐２単独、ＩＦＮα単独、およびＣＤ４０アゴニスト単独の影響を比較した。図１０に示されるこの結果から、ＩＬ‐２およびＩＦＮ／ＣＤ４０結合体は、抗原特異的Ｔ細胞免疫細胞のパーセンテージに対して同様の影響をもたらさないことが分かる。ここでは、オブアルブミン（３００ｍｇ）を抗ＣＤ４０（５０ｍｇ）、組み換えＩＦＮα（１Ｘ１０６Ｕ）、ＩＬ‐２（１Ｘ１０６Ｕ）、ＩＬ‐２およびＣＤ４０と併用して、または同用量のＩＦＮおよびＣＤ４０アゴニストを単独でマウスに注射した。７日後に末梢血を採取し、Ｋｂ／ｏｖａ四量体で染色して抗原特異的Ｔ細胞のパーセンテージを識別した。ドットプロットにおける数字は、表示された楕円ゲート（四量体＋）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントである。棒グラフは、１回の注射あたりマウス２匹の平均および標準偏差である。その結果は、抗原特異的Ｔ細胞の数は、ＩＬ‐２／ＣＤ４０結合体を同量のＣＤ４０アゴニストと併用して投与した場合、および両サイトカインを同一の活性レベルで投与した場合に比べ、ＩＦＮ／ＣＤ４０結合体を投与した動物においてはるかに高かったことを示す。これは、ＩＦＮ／ＣＤ４０アゴニスト結合体を用いて得られる相乗効果が予期されないことをさらに実証する。

〔００１７３〕例１１
〔００１７４〕転移性メラノーマにおける生存時間に対するＩＦＮαおよびＣＤ４０アゴニストの影響
〔００１７５〕この実験において、ゼロ日目に、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに１００，０００のＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞を経静脈的に投与した。４日後、１００μｇ腫瘍ペプチド（デルタＶ）、１００μｇの抗ＣＤ４０および１X１０６単位のアルファインターフェロンをマウスに投与した。図に示されるように、抗ＣＤ４０／ＩＦＮ結合体を投与したマウスは、著しく長い生存時間を有した。このデータは、腫瘍ワクチンおよび癌治療における対象アジュバント結合体の可能なアプリケーションをさらに支持する。

〔００１７６〕例１２
〔００１７７〕転移性肺癌ｔに対するＣＤ４０アゴニスト／ＩＦＮアルファ結合体の影響
〔００１７８〕図１２の実験は、対象ＣＤ４０アゴニスト／ＩＦＮアルファ結合体がマウスを転移性肺癌から保護することを示す。この実験において、ゼロ日目に、Ｃ５７ＢＩ／６マウスに１００，０００のＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞を経静脈的に投与した。４日後、１００μｇの腫瘍ペプチド、デルタＶ、１００μｇ抗ＣＤ４０抗体、１００μｇのＳ‐２７６０９（ＴＬＲ７アゴニスト）および１X１０６単位のアルファインターフェロンをマウスに投与した。腫瘍感作後２１日目にマウスを犠牲死させ、肺を取り出し、解剖顕微鏡により転移性小節を数えた。図のパネルＡは、肺を摘出した日における代表的な肺のデジタル写真を示す。パネルＢは、肺転移の計数を示す。ここでＮ＝７〜８マウス／群である。これらの結果は、その他の治療と比較したＣＤ４０アゴニスト／ＩＦＮアルファ結合体の保護効果を示す。

〔００１７９〕例１３
〔００１８０〕腫瘍のある肺からの肺侵入分析
〔００１８１〕図１３に示される実験は、腫瘍のある肺からのＴＩＬ（腫瘍侵入リンパ球）分析を行った。ゼロ日目に、１００，０００のＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＩ／６マウスに静脈投与した。５日後、図に示されるように、１００μｇの腫瘍ペプチド（デルタＶ）、１００μｇの抗ＣＤ４０、および１Ｘ１０６単位のインターフェロンアルファをマウスに投与した。腫瘍感作後２０日目にマウスを犠牲死させた。肺を取り出し、パーコール勾配遠心法によりＴＩＬを分離した。次に、細胞をフローサイトメトリ分析し、侵入するＣＤ４（１３Ａおよび１３Ｄ）、ＣＤ８（１３Ｂおよび１３Ｅ）、およびＦｏｘＰ３＋細胞（１３Ｃおよび１３Ｆ）の相対数および絶対数を調べた。この実験では、Ｎ＝４マウス／群である。

〔００１８２〕例１４
〔００１８３〕腫瘍のあるマウスにおいて肺に侵入するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する併用免疫療法の影響
〔００１８４〕図１４に含まれるこの実験において、腫瘍のあるマウスの肺に侵入する抗原特異的エフェクタＣＤ８＋Ｔ細胞の生成に対する対象併用免疫療法の影響を分析した。この実験において、ゼロ日目に、１００，０００のＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞をＣ５７ＢＩ／６マウスに静脈投与した。５日後、図に示されるように、１００μｇの腫瘍ペプチド（デルタＶ）、１００μｇの抗ＣＤ４０、および１Ｘ１０６単位のアルファインターフェロンを３匹のマウスに投与した。腫瘍感作後２０日目にマウスを犠牲死させ、肺を取り出し、パーコール勾配遠心法によりＴＩＬを再度分離した。次に、１μｇ／ｍｌ ｒｈｌＬ‐２およびブレフェルジンＡを用いて１２〜１８時間、細胞を刺激した後、細胞内サイトカイン染色を行った。ＩＦＮｇで染色する前に、まず細胞を抗体でＣＤ８およびＣＤ４４と標識し、次に固定して浸透可能にした。無関係の（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチド対照で観察されるバックグラウンドを控除することにより陽性細胞を計算し、次にＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＩＦＮｇ＋Ｔ細胞の正のパーセント（１４Ａ）または絶対数（１４Ｂ）として表示した。この実験では、Ｎ＝４マウス／群である。

〔００１８５〕図の結果から、対象ＩＦＮ／ＣＤ４０アゴニスト結合体を投与した結果、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が増加することが明らかである。これらの結果は、さらに癌ワクチンおよびそのような免疫増強が望まれるその他の治療における対象アジュバント結合体の有効性を実証する。

〔００１８６〕最後に、本発明についてさらに説明するため、本出願は、例で使用した典型的アゴニスト抗体の配列を示す図１５、および本発明に従って、例えばバキュロウイルス発現系を使用してＤＮＡ構造体およびポリペプチド複合体を生成するために好適な方法および材料を概略的に示す図１６および１７を含む。

〔００１８７〕当然のことながら、本発明は上文にリストされる実施形態に限定されず、その権利は例示の実施形態および以下の請求項の範囲に含まれるすべての修正に対して確保される。
〔請求項１〕
（ｉ）ＣＤ４０のアゴニストをコード化する少なくとも１つの核酸配列と、
（ｉｉ）任意に望ましい抗原をコード化する核酸配列と、
（ｉｉｉ）Ｉ型インターフェロンをコード化する核酸配列と、
を含む核酸構造体であって、
前記配列（ｉ）、（ｉｉ）（存在する場合）および（ｉｉｉ）は、同一または異なる転写調節配列に操作可能に結合され、さらに前記配列（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、リンカー配列および／またはＩＲＥＳにより任意に分離されることを特徴とする核酸構造体。
〔請求項２〕
ポリペプチドＩ型インターフェロンは、インターフェロンα、β、タオ、エプシロン、ゼータ、およびオメガから選択されることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項３〕
前記Ｉ型インターフェロンは、アルファインターフェロンであることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項４〕
前記Ｉ型インターフェロンは、ベータインターフェロンであることを特徴とする請求項３に記載の核酸構造体。
〔請求項５〕
前記ＣＤ４０アゴニストは、抗ＣＤ４０抗体またはアゴニストＣＤ４０抗体フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項６〕
前記ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０Ｌであることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項７〕
前記ＣＤ４０Ｌは、ヒト、マウス、ラット、または霊長類ＣＤ４０Ｌであることを特徴とする請求項６に記載の核酸構造体。
〔請求項８〕
前記ＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌまたは可溶性ヒトＣＤ４０Ｌフラグメント、可溶性ＣＤ４０Ｌオリゴマー、またはヒトＣＤ４０を結合させるＣＤ４０Ｌの変異体あるいは複合体であることを特徴とする請求項７に記載の核酸構造体。
〔請求項９〕
前記抗体は、キメラ抗体であることを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１０〕
前記抗体は、ヒト化抗体であることを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１１〕
前記抗体は、ヒト抗体であることを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１２〕
前記抗体は、一本鎖免疫グロブリンであることを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１３〕
前記抗体は、ヒト重鎖および軽鎖定常領域を含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１４〕
前記抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から成る群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１５〕前記抗体は、核酸配列をコード化する免疫グロブリン軽鎖、および同一のプロモータに操作可能に結合される核酸配列をコード化する免疫グロブリン重鎖によりコード化されることを特徴とする請求項５に記載の核酸構造体。
〔請求項１６〕
前記免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖の配列は、ＩＲＥＳが介在することを特徴とする請求項１５に記載の核酸構造体。
〔請求項１７〕
前記抗原配列（ｉｉ）は、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原をコード化することを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項１８〕
前記抗原配列（ｉｉ）は、ヒト抗原をコード化することを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項１９〕
前記ヒト抗原は、癌抗原、自己抗原、またはその発現が関連する、または慢性ヒト疾患に関与するその他のヒト抗原であることを特徴とする請求項１８に記載の核酸構造体。
〔請求項２０〕
前記ウイルス抗原は、ＨＩＶ、ヘルペス、パピローマウイルス、エボラ、ピコルナ、エンテロウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ＶＳＶ、デングウイルス、肝炎ウイルス、ライノウイルス、黄熱病ウイルス、ブンガウイルス、ポリオーマウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、エコーウイルス、ポックスウイルス、水痘帯状ヘルペス、アフリカ豚コレラウイルス、インフルエンザウイルス、およびパラインフルエンザウイルスから成る群から選択されるウイルスに特異的であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸構造体。
〔請求項２１〕
前記αインターフェロンは、任意でＰＥＧ化されてもよいヒトアルファインターフェロンであることを特徴とする請求項３に記載の核酸構造体。
〔請求項２２〕
前記細菌性抗原は、サルモネラ、大腸菌、シュードモナス、バチルス、ビブリオ、カンピロバクター、ヘリコバクター、エルビニア、ボレリア、ペロバクター、クロストリジウム、セラシア、キサントモナス、エルシニア、バークホルデリア、リステリア、赤痢菌、パスツレラ、腸内細菌、コリネバクテリアおよび連鎖球菌から成る群から選択される細菌に由来することを特徴とする請求項１７に記載の核酸構造体。
〔請求項２３〕
前記寄生虫抗原は、バベシア、エントアメーバ、リーシュマニア、マラリア原虫、トリパノソーマ、トキソプラズマ、ジアルジア、扁虫および回虫から選択される寄生虫に由来することを特徴とする請求項１７に記載の核酸構造体。
〔請求項２４〕
前記真菌抗原は、アスペルギルス、コクシジオイデス、クリプトコッカ、カンジダノカルジア、ニューモシスチス、およびクラミジアから成る群から選択される真菌に由来することを特徴とする請求項１７に記載の核酸構造体。
〔請求項２５〕
前記抗原は、腫瘍抗原であることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項２６〕
前記腫瘍抗原は、肺腫瘍抗原であることを特徴とする請求項２５に記載の核酸構造体。
〔請求項２７〕
前記抗原は、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌（小細胞または大細胞）、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、睾丸癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、大腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、頭部および頚部癌、肉腫、グリア癌、および胆嚢癌から成る群から選択されるヒト癌により発現した癌抗原であることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項２８〕
前記抗原は、その発現が自己免疫疾患に関連する自己抗原であることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
〔請求項２９〕
請求項１による核酸構造体を含むことを特徴とする発現ベクター。
〔請求項３０〕
プラスミド、組み換えウイルス、およびエピソームベクターから選択されることを特徴とする請求項２９に記載の発現ベクター。
〔請求項３１〕
請求項１に記載の核酸構造体を発現することを特徴とする組み換え宿主細胞細胞またはヒトではない動物。
〔請求項３２〕
細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、鳥細胞、および両生類細胞から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の組み換え宿主細胞細胞。
〔請求項３３〕
ヒト細胞であることを特徴とする請求項３１に記載の組み換え宿主細胞細胞。
〔請求項３４〕
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸構造体またはベクターの発現時に生じることを特徴とするタンパク質複合体。
〔請求項３５〕
抗ＣＤ４０抗体、ヒトアルファインターフェロン、およびその発現が疾患状態に関連する抗原を含むことを特徴とする請求項３４に記載のタンパク質複合体。
〔請求項３６〕
前記疾患は、癌、アレルギー、自己免疫疾患、感染症、および炎症状態から選択されることを特徴とする請求項３５に記載のタンパク質複合体。
〔請求項３７〕
ＨＩＶ抗原を含むことを特徴とする請求項３６に記載のタンパク質複合体。
〔請求項３８〕
前記ＨＩＶ抗原は、Ｇａｇであることを特徴とする請求項３７に記載のタンパク質複合体。
〔請求項３９〕
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の核酸構造体、または前記核酸構造体を含むベクターあるいは宿主細胞細胞を投与することにより、強化された細胞性免疫反応を導出することを特徴とする方法。
〔請求項４０〕
前記投与により、以下の
（ｉ）ＣＤ４０アゴニストまたはＩ型インターフェロンのみをコード化するＤＮＡの投与に対する１次および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の強化、
（ｉｉ）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の指数関数的な増加の誘導、
（ｉｉｉ）正常（ＣＤ４０欠失でない）宿主細胞に相当するＣＤ４欠失宿主細胞における防御免疫反応の生成、および
（ｉｖ）樹状細胞上のＣＤ７０発現の誘導、
のうちの少なくとも１つを生じることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
〔請求項４１〕
前記強化された細胞性免疫反応は、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌抗原、自己抗原、アレルゲン、および癌抗原から選択される抗原に特異的であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
〔請求項４２〕
前記抗原は、ＨＩＶ抗原であることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
〔請求項４３〕
前記ＨＩＶ抗原は、ｇａｇまたはｅｎｖであることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
〔請求項４４〕
前記抗原は、ヒト腫瘍により発現した抗原であることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
〔請求項４５〕
強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫反応を、それを必要とする対象において導出する方法であって、相乗的に有効な量の（ｉ）少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、（ｉｉ）少なくとも１つのＩ型インターフェロン、および任意に（ｉｉｉ）その発現が特定疾患に関連する少なくとも１つの抗原、あるいは同一または個別の薬学的に許容しうる組成物に含まれるこれらの部分を含むポリペプチド複合体を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
〔請求項４６〕
前記ＣＤ４０アゴニスト、前記Ｉ型インターフェロン、および前記抗原は、存在する場合、同一の組成物に含まれることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項４７〕
前記ＣＤ４０アゴニストおよび前記Ｉ型インターフェロンは、個別の組成物に含まれることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項４８〕
前記ＣＤ４０アゴニストは、抗ＣＤ４０抗体であることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項４９〕
前記ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０Ｌポリペプチドであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項５０〕
前記ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチド、そのフラグメントまたはオリゴマーＣＤ４０Ｌポリペプチド、あるいは前述のいずれかを含む複合体を含むことを特徴とする請求項４９に記載の方法。
〔請求項５１〕
前記ＣＤ４０Ｌは、ヒトＣＤ４０Ｌまたは可溶性フラグメント、オリゴマー、あるいはヒトＣＤ４０を結合する複合体を含むことを特徴とする請求項５０に記載の方法。
〔請求項５２〕
前記Ｉ型インターフェロンは、アルファ、ベータ、アルファ／ベータ、エプシロン、タウ、オメガ、またはゼータインターフェロン、またはその変異体、フラグメント、あるいはＰＥＧ化形態から選択されることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項５３〕
前記疾患は、癌、アレルギー、炎症性疾患、感染症、および自己免疫疾患から選択されることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項５４〕
前記感染症は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫により引き起こされることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
〔請求項５５〕
前記ウイルスは、ＨＩＶであることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
〔請求項５６〕
前記投与により、以下の
（ｉ）前記ＣＤ４０アゴニストまたは前記Ｉ型インターフェロン単独の前記投与に対して、強化された１次および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の実質的な誘発、
（ｉｉ）抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の指数関数的な増加の誘導、および
（ｉｉｉ）正常（ＣＤ４欠失でない）宿主細胞に相当するＣＤ４欠失宿主細胞における防御免疫反応の生成、ならびに
（ｉｖ）樹状細胞上のＣＤ７０発現の誘導、
のうちの少なくとも１つを生じることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
〔請求項５７〕
ウイルス感染または癌の治療に使用されることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
〔請求項５８〕
前記核酸構造体は、粘膜的、局所的、経口的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、経膣的、経肛門的、腫瘍内、くも膜下、または眼球内に投与されることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
〔請求項５９〕
前記ポリペプチド複合体は、粘膜的、局所的、経口的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、経膣的、経肛門的、腫瘍内、くも膜下、または眼球内に投与されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
〔請求項６０〕
相乗的に有効な量の（ｉ）少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、（ｉｉ）少なくとも１つのＩ型インターフェロン、および（ｉｉｉ）任意に少なくとも１つの抗原を含む、強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫反応を導出するヒトの治療における使用に好適なことを特徴とする組成物。
〔請求項６１〕
前記ＣＤ４０アゴニストは、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはアゴニスト抗ＣＤ４０抗体フラグメントであることを特徴とする請求項６０に記載の組成物。
〔請求項６２〕
前記アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ヒト、キメラ、ヒト化、または一本鎖抗体であることを特徴とする請求項６１に記載の組成物。
〔請求項６３〕
前記アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であることを特徴とする請求項６１に記載の組成物。
〔請求項６４〕
前記ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０Ｌポリペプチドであることを特徴とする請求項６０に記載の組成物。
〔請求項６５〕
前記ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、可溶性ヒトＣＤ４０Ｌフラグメント、そのオリゴマー、またはそれを含む複合体であることを特徴とする請求項６４に記載の組成物。
〔請求項６６〕
ヒト腫瘍抗原または自己抗原を含むことを特徴とする請求項６０に記載の組成物。
〔請求項６７〕
細菌性抗原、ウイルス抗原または真菌抗原を含むことを特徴とする請求項６０に記載の組成物。
〔請求項６８〕
前記Ｉ型インターフェロンは、ヒトアルファまたはβインターフェロンであることを特徴とする請求項６０に記載の組成物。
〔請求項６９〕
前記インターフェロンは、コンセンサスアルファインターフェロンまたはＰＥＧ化アルファあるいはベータインターフェロンであることを特徴とする請求項６８に記載の組成物。
〔請求項７０〕
アレルゲンを含むことを特徴とする請求項６０に記載の組成物。
〔請求項７１〕
少なくとも１つのＣＤ４０アゴニストおよび少なくとも１つのＩ型インターフェロンと併用して、前記ワクチンを添加または投与するステップを含む、ワクチン組成物の有効性を強化することを特徴とする方法。
〔請求項７２〕
前記ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
〔請求項７３〕
前記Ｉ型インターフェロンは、ヒトアルファインターフェロンまたはヒトベータインターフェロンであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
〔請求項７４〕
前記添加または併用投与は、前記ワクチンに含まれる抗原に特異的である強化されたＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を誘導することを特徴とする請求項７１に記載の方法。
〔請求項７５〕
樹状細胞上でＣＤ７０発現を誘導することを特徴とする請求項７４に記載の方法。
〔請求項７６〕
前記Ｉ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストの非存在下で前記ＣＤ４０アゴニストが投与される場合に対し、肝毒性を低減または除去するために十分な量のＩ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストと併用して前記アゴニストを投与することにより、ＣＤ４０アゴニストの毒性を低減することを特徴とする方法。
〔請求項７７〕
前記ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはフラグメント、あるいはＣＤ４０Ｌポリペプチドであることを特徴とする請求項７６に記載の方法。
〔請求項７８〕
肝毒性の低減は、肝トランスアミナーゼ値に基づいて判断されることを特徴とする請求項７６に記載の方法。
〔請求項７９〕
Ｉ型インターフェロンまたはＴＬＲアゴニストの非存在下で、肝トランスアミナーゼレベルにおいて同様の増加をもたらすＭＴＤよりも、約１．５〜１０倍多い前記ＣＤ４０アゴニストの最大耐量（ＭＴＤ）を提供することを特徴とする請求項７６に記載の方法。

〔００１８８〕本明細書で引用される学会誌、特許、およびその他の出版物に対する様々な言及は最新のものを含み、参照により完全な説明として組み込まれる。

〔００３１〕図１は、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト免疫付与に続くＣＤ８＋Ｔ細胞の増加がＩＦＮα／βに可変的に依存することを示す図である。ＷＴ（最上列）およびＩＦＮαβＲＫＯ（最下列）をオブアルブミンペプチド、抗ＣＤ４０および表示ＴＬＲアゴニストで免疫付与した。７日後、四量体染色およびＦＡＣＳ分析により、脾臓におけるオブアルブミン特異的Ｔ細胞反応を測定した。右上四分儀の数字は、総ＣＤ８＋Ｔ細胞に占める四量体染色細胞のパーセンテージを示す。 〔００３２〕図２は、ＩＦＮαβ依存性ＴＬＲアゴニストを抗ＣＤ４０と併用して免疫付与した後、ＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を回復することを示す図である。図のようにＣＤ４０欠失、または欠失でないＷＴおよびＩＦＮαβＲＫＯマウスを上述のようにＨＳＶ‐１ペプチド、抗ＣＤ４０、およびポリＩＣを用いて免疫付与した。７日後、四量体（Ａ）およびポリＩＣ ＩＦＮγ（Ｂ）染色ＰＢＬにより、ＨＳＶ‐１特異的反応を特定した。 〔００３３〕図３は、ＣＤ４欠失により回復される抗ＩＦＮブロックポリＩＣ／ＣＤ４０の媒介によるＣＤ８反応を示すグラフである。抗ＩＦＮおよび／またはＣＤ４欠失の有無にかかわらず、オブアルブミン（結合ポリＩＣ／アルファＣＤ４０）に対してマウスに免疫付与した。上述の四量体染色により、抗原特異的Ｔ細胞の７日目ＰＢＬを分析した。 〔００３４〕図４は、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０免疫付与に続くＣＤ４欠失のＩＦＮαβＲＫＯ宿主細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、主にＣＤ７０に依存することを示す図である。ＩＦＮαβＲＫＯマウスはＣＤ４細胞を欠失し、上述のようにＨＳＶ‐１ペプチド、ポリＩＣ、および抗ＣＤ４０を用いて免疫付与した。図６に示すように、抗ＴＮＦリガンド抗体をマウスに注射した。７日目ＰＢＬを四量体染色により分析した。 〔００３５〕図５は、指数関数的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を導出するＩＦＮとＣＤ４０の相互作用を示す図である。上述のようにマウスを感作した。最初の抗原感作から７日後、四量体染色によりＰＢＬを分析した。 〔００３６〕図６は、Ｉ型インターフェロンおよびアゴニスト抗体の結合投与に関する実験結果を含み、この結合体は生体内でＣＤ８＋樹状細胞上のＣＤ７０発現を誘導するが、いずれかの単独投与では誘導しないことを示す。抗ＣＤ４０抗体単独、陽性対照としてポリＩＣ、組み換えＩ型インターフェロン（１Ｘ１０７Ｕ）または抗ＣＤ４０＋ＩＦＮをマウスに注射した。１８時間後、膵臓ＤＣを分離し、ＣＤ７０の発現を分析した。右上四分儀の数字は、ＣＤ７０染色の平均蛍光強度を示す。データは、ＣＤ４０／ポリＩＣ注射と同様に、ＣＤ４０／ＩＦＮもＣＤ８＋ＤＣ上のＣＤ７０発現を増加することを示す図である。 〔００３７〕図７は、結合Ｉ型インターフェロンおよびアゴニストＣＤ４０抗体の投与が生体内でＣＤ８＋ＤＣ上のＣＤ７０発現に与える影響を示す実験を含む。結果は、ＣＤ４０アゴニストまたはＩＦＮ単独ではなく、免疫刺激結合体のみがＤＣ上のＣＤ７０発現を誘導することを示すグラフである。 〔００３８〕図８は、抗ＣＤ４０、ＩＦＮα、ポリＩＣ／ＣＤ４０、ＩＦＮαおよび抗ＣＤ７０またはＩＦＮα／ＣＤ４０を様々な減少ＩＦＮ用量で投与されたマウスにおける抗原特異性（オブアルブミンＴ細胞）のパーセンテージを分析した実験を含むグラフである。 〔００３９〕図９は、図７における実験と同様に、結合ＴＬＲ／ＣＤ４０アゴニスト感作が、ＩＦＮαβＲＫＯマウスにおいて標的ＴＬＲを発現するＤＣ上でのみＣＤ７０を誘導することを示すグラフである。ＩＦＮαβＲＫＯマウスに抗ＣＤ４０単独（ａＣＤ４０）またはポリＩＣ（＋ポリＩＣ）あるいはＰａｍ３Ｃｙｓ（＋Ｐａｍ３Ｃｙｓ）と併用して注射した。Ｐａｍ３ＣｙｓはＴＬＲ２アゴニストであり、ＰｏｌｙＩＣはＴＬＲ３アゴニストである。２４時間後、膵臓ＤＣを分離し、上述のようにＣＤ７０発現を染色した。ＣＤ８＋ＤＣはＴＬＲ２および３を発現したが、ＣＤ１１ｂ＋ＤＣはＴＬＲ３ではなくＴＬＲ２を発現した。このデータは、ＩＦＮαβシグナリングの非存在下で、ＴＬＲおよびＣＤ４０の両方を介して直接刺激されたＤＣのみがＣＤ７０発現を増加できることを示唆する。 〔００４０〕図１０は、ＩＬ‐２／ＣＤ４０アゴニスト結合体およびＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト結合体がＰＢＬから得た抗原特異的（オブアルブミン）Ｔ細胞のパーセンテージに与える影響を比較する実験を含む。そこに含まれる結果は、ＩＬ‐２／ＣＤ４０アゴニスト結合体が、ＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト結合体としてＣＤ８＋Ｔ細胞免疫に対して同程度の相乗効果を導出しないことを示す図である。 〔００４０〕図１０は、ＩＬ‐２／ＣＤ４０アゴニスト結合体およびＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト結合体がＰＢＬから得た抗原特異的（オブアルブミン）Ｔ細胞のパーセンテージに与える影響を比較する実験を含む。そこに含まれる結果は、ＩＬ‐２／ＣＤ４０アゴニスト結合体が、ＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト結合体としてＣＤ８＋Ｔ細胞免疫に対して同程度の相乗効果を導出しないことを示す図である。 〔００４１〕図１１は、Ｃ５７ＢＩ／６マウスにメラノーマ細胞を注射する実験を含み、ＩＦＮα／ＣＤ４０アゴニスト結合体は、この転移メラノーマ動物モデルにおける生存時間を増加させたグラフである。 〔００４２〕図１２の実験は、Ｃ５７ＢＩ／６動物モデルにおいてＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮαを用いた転移肺癌の対象結合アジュバント治療が、アジュバント結合体を用いて治療した動物において転移性小節の数が減少したことから分かるように、マウスを転移性肺癌から保護することを示す図である。 〔００４２〕図１２の実験は、Ｃ５７ＢＩ／６動物モデルにおいてＣＤ４０アゴニストおよびＩＦＮαを用いた転移肺癌の対象結合アジュバント治療が、アジュバント結合体を用いて治療した動物において転移性小節の数が減少したことから分かるように、マウスを転移性肺癌から保護することを示す図である。 〔００４３〕図１３の実験では、対象アジュバント結合体および適切な対照を用いて治療したＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞を接種したＣ５７ＢＩ／６マウスにおいてＴＩＬ分析を行った図。対象アジュバント結合体を投与したマウスでは、図のデータに示されるように、ＴＩＬの数が増加することが明らかになった。 〔００４４〕図１４は、対象ＣＤ４０アゴニスト／ＩＦＮ結合体治療が、腫瘍のあるマウス（Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞を接種したＣ５７ＢＩ／６マウス）の肺に侵入する抗原特異的エフェクタＴ細胞を生成することを示す実験を含む図である。 〔００４５〕図１５Ａおよび１５Ｂは、例で使用される典型的なＣＤ４０アゴニスト抗体（ＦＧＫ．４５）の軽鎖および重鎖配列を含む図である。 〔００４５〕図１５Ａおよび１５Ｂは、例で使用される典型的なＣＤ４０アゴニスト抗体（ＦＧＫ．４５）の軽鎖および重鎖配列を含む図である。 〔００４６〕図１６は、本発明に従うバキュロウイルス発現系におけるＣＤ４０アゴニスト抗体‐抗原‐Ｉ型ＩＦＮ複合体の発現用ＤＮＡ構造体の概略構造を示す図である。この構造体は、選択の抗原（例えば、ＨＩＶｇａｇ）およびＩ型インターフェロン（アルファインターフェロン）に連結した抗ＣＤ４０抗体の発現を生じる。 〔００４７〕図１７は、バキュロウイルス発現系において、本発明に従ってＣＤ４０ａｂ抗体Ｉ型ＩＦＮ複合体を生成するための構造体、およびＤＮＡ免疫付与に使用するベクターを生成するための構造体を示す図である。

Claims (18)

1. 相乗的に有効な量の（ｉ）アゴニストＣＤ４０抗体またはアゴニストＣＤ４０抗体フラグメントから選択される、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、（ｉｉ）アルファインターフェロンおよびベータインターフェロンから選択される少なくとも１つのＩ型インターフェロン、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの腫瘍抗原の、抗腫瘍性免疫への相乗的効果を、それを必要とするヒト対象において導出するための方法に使用される１またはそれ以上の医薬の製造における使用であって、この方法により、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数の相乗的増加および／または強化された１次および記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞反応が結果としてもたらされる、および／または樹状細胞上のＣＤ７０発現が誘導される、前記使用。
2. 前記抗腫瘍性免疫が以下の事項の一つ以上をそれを必要とする対象においてもたらす、請求項１に記載の使用：腫瘍の成長を阻害または減速すること、腫瘍のサイズを減少させること、腫瘍侵入リンパ球の数を増加させること、生存期間の延長、転移の低減、および転移の阻害。
3. ＣＤ４０アゴニストがアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体または抗ヒトＣＤ４０抗体フラグメントである、請求項１または２の使用。
4. 前記Ｉ型インターフェロンは、アルファインターフェロンであることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
5. 前記ＣＤ４０アゴニストがアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体または抗ヒトＣＤ４０抗体フラグメントであり、Ｉ型インターフェロンがアルファインターフェロンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
6. 前記腫瘍抗原が、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌（小細胞または大細胞）、骨癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、睾丸癌、皮膚癌、白血病、大腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、頭部および頚部癌、肉腫、グリア癌、胆嚢癌、メラノーマ、食道癌、咽頭癌、慢性リンパ性白血病、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、子宮内膜癌、眼の癌、上皮内新生物、腎臓癌、喉頭癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、口腔癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肛門癌、および子宮癌から成る群から選択される癌に特異的である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
7. 医薬が、前立腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌（小細胞または大細胞）、骨癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、卵巣癌、睾丸癌、皮膚癌、白血病、大腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、頭部および頚部癌、肉腫、グリア癌、胆嚢癌、メラノーマ、食道癌、咽頭癌、慢性リンパ性白血病、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、子宮内膜癌、眼の癌、上皮内新生物、腎臓癌、喉頭癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、口腔癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肛門癌、および子宮癌から成る群から選択される癌の治療薬である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
8. 医薬が転移を治療または予防することを意図するものである、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
9. 腫瘍抗原、ＣＤ４０アゴニストおよびインターフェロンが異なる複数の医薬組成物中にあることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
10. 腫瘍抗原、ＣＤ４０アゴニストおよびインターフェロンが同一の医薬組成物中にあることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
11. インターフェロンがＰＥＧ化されていることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用。
12. 腫瘍抗原がメラノーマ抗原であり、ＣＤ４０アゴニストが抗ヒトＣＤ４０抗体または抗ヒトＣＤ４０抗体フラグメントであることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 相乗的に有効な量の（ｉ）アゴニストＣＤ４０抗体またはアゴニストＣＤ４０抗体フラグメントから選択される、少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、（ｉｉ）アルファインターフェロンおよびベータインターフェロンから選択される少なくとも１つのＩ型インターフェロン、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの腫瘍抗原を含有する、抗腫瘍性免疫への相乗的効果をそれを必要とするヒト対象において導出する方法に使用される、単一または複数の組成物。
14. ＣＤ４０アゴニストが抗ヒトＣＤ４０抗体または抗ヒトＣＤ４０抗体フラグメントである、請求項１３の組成物。
15. Ｉ型インターフェロンがアルファインターフェロンである、請求項１３の組成物。
16. ＣＤ４０アゴニストがアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体または抗ヒトＣＤ４０抗体フラグメントであり、Ｉ型インターフェロンがアルファインターフェロンである、請求項１３の組成物。
17. 腫瘍抗原、ＣＤ４０アゴニストおよびインターフェロンが異なる複数の医薬組成物中にあることを特徴とする、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 腫瘍抗原、ＣＤ４０アゴニストおよびインターフェロンが同一の医薬組成物中にあることを特徴とする、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の組成物。

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