KR20150041149A

KR20150041149A - 고순도 암 줄기 세포 및 고순도 암 줄기 세포 개체군의 신속한 생성 방법

Info

Publication number: KR20150041149A
Application number: KR1020157006546A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 콘포스; 미쉘 맥개리
Original assignee: 네오스템 온콜로지, 엘엘씨
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2013-08-06
Publication date: 2015-04-15
Also published as: HK1210498A1; US20150238586A1; EP2885403A4; SG11201501195RA; CA2882095A1; WO2014028274A1; EP2885403A1; JP2015526087A; AU2013303012A1; IL237205A0; GB201503604D0; CN105051187A; AU2013303012B2; GB2519717A

Abstract

본 발명은 신생물성 장애를 갖는 대상체에 투여하기에 유용한, 세포를 포함하는 시약 및 관련 방법을 제공한다. 시약 및 방법은 향상된 순도의 암 줄기 세포를 포함한다. 신생물성 장애는 흑색종, 난소암, 결장직장암, 유방암 및 폐암을 포함한다.

Description

고순도 암 줄기 세포 및 고순도 암 줄기 세포 개체군의 신속한 생성 방법 {RAPID METHOD PRODUCTION HIGH PURITY CANCER STEM CELLS AND POPULATION OF HIGH PURITY CANCER STEM CELLS}

본 출원은 그 전체가 본원에 통합된 "고순도 암 줄기 세포 및 고순도 암 줄기 세포 개체군의 신속한 생성 방법"이라는 명칭으로 2012년 10월 25일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/718,643, 및 그 전체가 또한, 본원에 통합된 "고순도 암 줄기 세포 및 고순도 암 줄기 세포 개체군의 신속한 생성 방법"이라는 명칭으로 2012년 8월 15일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/683,477의 우선권 이익을 청구한다.

발명의 분야

본 발명은 암 줄기 세포, 세포 정제 방법 및 시약, 면역 반응을 자극하기 위한 방법, 및 대상체에 투여하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 조성물 및 관련 방법은 신생물성 장애에 특유한 항원, 또는 그러한 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 본 발명의 신생물성 장애는 흑색종, 간암, 위암, 및 난소암을 포함한다.

고형 종양에서, 적은 백분율의 세포는 모 종양 (parental tumor)과 동일한 조직학적 이질성의 종양을 개시하는 능력을 갖는다. 이들 세포는 "암 줄기 세포"로 불린다. 이들은 또한, 종양-개시 세포 또는 암-개시 세포로서 공지되어 있다. 암 줄기 세포는 한 군의 특성들에 의해 규정될 수 있다. 먼저, 이들은 이들 자체를 신생시킬 수 있는 능력을 갖는다. 두 번째로, 이들은 이식되는 경우 새로운 종양을 확립할 수 있다. 세 번째로, 이들은 잠복의 또는 느리게 순환하는 (세포 주기) 종양 세포로서 특징화될 수 있다. 네 번째로, 이들은 화학요법 또는 방사선 요법에 대한 종양 내성의 원인일 수 있다. 다섯 번째로, 이들은 신생하고 더 많은 분화된 전구 세포를 발생시킬 수 있는 이들의 능력을 유지하는 특정한 미세환경에 의존적이며, 여기서 미세환경은 미분화된 상태의 암 줄기 세포를 유지한다. 이러한 미세환경은 중간엽 줄기 세포, 조직-관련 섬유모세포, 및 내피 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결장 암 줄기 세포의 경우에, 이러한 미세환경은 종양-관련 근섬유모세포의 존재를 포함한다. (Schmidt et al (2011) Oncotarget. 2:313-320; Borovski et al (2011) Cancer Res. 71 :634-639; Korkaya et al (2011) J. Clin. Inv. 121 :3804-3809). 시험관내 배양으로 구를 형성할 수 있는 능력은 또한, 암 줄기 세포로서 특정 세포의 검정에 기여할 수 있는 또 다른 특징이다 (Perego et al (2011) J. Inv. Dermatol. 11:546-547). 암 줄기 세포의 한 비제한적 정의는 완전 이질성의 모 종양을 재생하고 다중 계대 후에도 지속적으로 성장할 수 있는 세포이다 (Civenni et al (2011) Cancer Res. 71 :3098-3109).

암 줄기 세포는 면역 반응을 억제하는 것으로 입증되었으며, 여기서 억제 메카니즘은 T 조절 세포 (Tregs)의 유도, T 세포 활성화 및 증식의 손상을 포함한다 (Wei et al (2010) Clin. Cancer Res. 16:461-473).

암 줄기 세포는 지속적으로 자가-신생하는 이들의 능력에 의해 종양 덩어리를 확립하고 유지한다. 게다가, 종양 줄기 세포는 또한, 상피-중간엽 이행 상태로 불리는 것에서 이동한다. 자가-신생 및 이동 또는 침습 특징의 이러한 특색은 암 병독성의 주요 원인인 것으로 간주된다 (Greaves et al (2012) Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381): p. 306-13). 또한, 암 줄기 세포는 면역억제 특성을 갖는다 (Wu et al (2010) Glioma cancer stem cells induce immunosuppressive macrophages/microglia. Neuro. Oncol. 12:1 1 13-1 125). 이와 같이, 암 줄기 세포는 예를 들어, 암 줄기 세포를 파괴하는 시약 및 방법에 의해 항-암 요법에 대한 표적으로서 연구되었다.

추정 종양 줄기 세포는 마우스에서 수행된 일련의 이식 제노그라피 (xenograph) 검정 및 마커를 기반으로 하여 다양한 고형 종양에서 검정되었다. 수개의 표면 마커가 흑색종의 종양 줄기 세포에서 검정될 수 있으나, 이들 마커의 발현은 외과적 절개 후 검정할 경우 종양마다 가변적이다. 바이오마커 CD271은 신경 능선 기원의 세포와 관련된 성장 인자 수용체이다. CD271은 추정 흑색종 줄기 세포를 검정하는데 사용될 수 있으며, 여기서 이러한 흑색종 줄기 세포는 계단 희석하의 마우스 모델에서 번식될 수 있다 (Civenni et al (2011) Human CD271 -positive melanoma stem cells associated with metastasis establish tumor heterogeneity and long-term growth. Cancer Res. 71 :3098-3109).

배 발생 동안의 신경 능선 세포의 특징은 중간엽 세포의 특징인 이들의 이동 능력이다. 중간엽 세포 특징을 보유하는 흑색종 세포는 공격적인 종의 흑색종 세포이다. 흑색종 세포 부착 분자 (MCAM) 및 MUC18로서 또한 공지된 CD146은 흑색종 진행의 마커이다 (Schlagbauer-Wadl et al (1999) Influence of MUC18/MCAM/CD146 expression on human melanoma growth and metastasis in SCID mice. Int J Cancer. 81:951 -955). CD146 (MCAM)은 또한 정상적인 중간엽 줄기 세포에 의해 발현된다 (Rusell et al (2010) stem cells. 28:788-798). 동일 세포에서 이러한 2개 마커의 공동-발현은 매우 공격적인 형태의 암 줄기 세포를 나타낸다.

비-암 줄기 세포 특이적 매개체를 이용한 전통적인 방법은 노동 집약적이며, 평균 3.8 개월 (0.6 내지 22.3 개월 범위, 평균 3.1)의 긴 생산 시간이 소요된다. 이는 지연된 치료 시간을 초래하며, 단지 환자의 29%만이 샘플 수용 요법을 받았다. 빈번하게는, 정상 섬유모세포의 과다성장은 숙련된 기술자에 의한 광대한 조작이 요망되며, 이는 공정에 비용이 많이 소모되게 한다. 대량 제조물에는 가장 공격적인 표현형, 소위 종양 개시 또는 암 줄기 세포로부터의 많은 양의 항원이 결핍되어 있다.

환자 종양 샘플로부터 추정 암 줄기 세포를 분리하고 증식시켜 수지상 세포 로딩에 필요한 양을 정량함으로써, 본 발명은 전통적인 방법을 넘어서는 이점을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 신생물성 장애를 갖는 대상체에 투여하기에 유용한 세포를 포함하는 시약 및 관련된 방법을 제공한다. 시약 및 방법은 향상된 순도의 암 줄기 세포를 포함한다. 신생물성 장애는 흑색종, 난소암, 결장직장암, 유방암, 및 폐암을 포함한다.

본 발명은 인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, (i) 개체군 중 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하고, 개체군 중 적어도 30%의 세포가 CD271을 발현하거나, (ii) 적어도 30%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 퍼센트 값 (%)은 개체군에 대한 평균 값으로서 정의되는, 분리된 세포 개체군을 제공한다. 또한, 발현이 적어도 35%이며, 공동-발현이 적어도 35%인 상기 분리된 세포 개체군이 제공된다. 또한, 발현이 적어도 40%이며, 공동-발현이 적어도 40%인 상기 분리된 세포 개체군이 제공된다. 또한, 발현이 적어도 45%이며, 공동-발현이 적어도 45%인 상기 분리된 세포 개체군이 제공된다. 또 다른 양태에서, 발현이 적어도 50%이며, 공동-발현이 적어도 50%인 상기 분리된 세포 개체군이 제공된다.

상기 분리된 세포 개체군에 있어서, 5% 미만의 세포가 오염 세포이거나, 2% 미만의 세포가 오염 세포인, 분리된 세포 개체군이 또한 고려된다.

백신 구체예에서, 자가 수지상 세포를 포함하는 백신에 있어서, 상기 분리된 세포 개체군이 수지상 세포에 로딩되고, 수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는, 백신이 제공된다.

상기 백신에 있어서, 수지상 세포에 로딩되기 전에 세포 개체군은 세포 분열을 방지하는 방사선 손상을 포함하거나, 세포 분열을 방지하는 핵산 가교제를 포함하는, 백신이 제공된다.

또 다른 백신 구체예에서, 자가 수지상 세포를 포함하는 백신으로서, 수지상 세포에 인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군 중 적어도 하나가 로딩되며, (i) 개체군 중 적어도 50%의 세포가 CD146을 발현하며, 개체군 중 적어도 50%의 세포가 CD271을 발현하거나, (ii) 적어도 50%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 퍼센트 값 (%)은 개체군에 대한 평균 값으로 정의되며, 수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는, 백신이 제공된다.

상기 백신에 있어서, 수지상 세포에 로딩되기 전에 세포 개체군은 세포 분열을 방지하는 방사선 손상을 포함하거나, 세포 분열을 방지하는 핵산 가교제를 포함하는 백신이 제공된다.

인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, 개체군 중 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하며, 적어도 30%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 30%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 세포가 단계 i. 흑색종 종양 샘플중의 세포를 분산시키는 단계, 단계 ii. 저부착성 표면 또는 초-저부착성 표면상에서 배양하는 단계, 단계 iii. 침전하여 미세구를 수집하는 단계, 및 단계 iv. 미세구로부터 세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 분리된 세포 개체군이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 세포를 증량시키기 위해 부착성 표면상의 배양 배지에서 배양하여 증량된 세포 개체군을 생성하는 단계 (단계 v)를 추가로 포함하는 방법이 추가로 제공된다.

상기 방법에 있어서, 단계 (ii)가 저부착성 표면상의 배양을 포함하거나, 단계 (ii)가 저부착성 표면상의 배양을 포함하지 않거나, 단계 (ii)가 초-저부착성 표면상의 배양을 포함하거나, 단계 (ii)가 초-저부착성 표면상의 배양을 포함하며, 저잡착성 표면상의 배양은 포함하지 않는, 방법이 제공된다.

상기 세포 개체군에 있어서, 분리된 세포 개체군이 단계 i의 세포에서 검출가능한 발현과 비교하여 (i) 하향-조절된 면역억제 분자; (ii) 상향-조절된 MHC-II; 또는 (iii) 하향-조절된 면역억제 분자 및 상향 조절된 MHC-II중 적어도 하나를 갖는, 세포 개체군이 제공된다.

상기 세포에 있어서, 면역억제 분자가 인돌아민-피롤-2,3-디옥시게나제, 종양 성장 인자-베타, 및 인터루킨-10 (IL-10) 중 적어도 하나이며, 하향-조절은 단계 i에서 검출가능한 발현 (100%로서 규정됨) 대비 80% 또는 그 미만인 수준으로 조절되는, 세포가 제공된다.

상기 세포에 있어서, 흑색종 종양 샘플 및 미세구 중 하나 또는 둘 모두로부터의 세포 분산이 첨가된 프로테아제로의 처리를 포함하는, 세포가 제공된다.

상기 세포에 있어서, 저부착성 표면상에서의 배양이 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재하에 수행되는, 세포가 제공된다.

상기 세포에 있어서, 저부착성 표면 또는 초-저부착성 표면상에서의 배양이 형성된 임의의 종양 줄기 세포 구를 수집하는 것을 포함하며, 수집은 저부착성 표면상에서의 새로운 배지에 수집된 구를 새로 배양하면서 2-3일 마다 수행하는, 세포가 제공된다.

백신 구체예에서, 상기 기술된 바와 같은 분리된 세포 개체군이 로딩된 자가 수지상 세포를 포함하는 백신으로서, 수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 백신이 제공된다.

또 다른 백신 구체예에서, 상기 백신에 있어서, 수지상 세포에 로딩되기 전에 종양 세포 분열이 종양 세포의 방사선 조사에 의해 또는 종양 세포로의 핵산 가교제의 첨가에 의해 방지되는, 백신이 제공된다.

인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, 개체군 중 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하며, 적어도 30%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 30%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 세포가 단계 i. 흑색종 종양 샘플중에 세포를 분산시키는 단계, 단계 ii. 저부착성 표면 또는 초-저부착성 표면상에서 배양하는 단계, 단계 iii. 침전하여 미세구를 수집하는 단계, 및 단계 iv. 미세구로부터 세포를 분리하는 단계, 및 단계 v. 세포를 증량시키기 위해 부착성 표면상의 배양 배지에서 배양하여 증량된 세포 개체군을 생성시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 분리된 세포 개체군이 제공된다.

상기 세포에 있어서, 분리된 세포 개체군이 단계 i의 세포에서 검출가능한 발현과 비교하여, (i) 하향-조절된 면역억제 분자; (ii) 상향-조절된 MHC-II; 또는 (iii) 하향-조절된 면역억제 분자 및 상향 조절된 MHC-II중 적어도 하나를 갖는, 분리된 세포 개체군이 제공된다.

상기 세포에 있어서, 세포를 증량하기 위해 부착성 표면상에서의 배양이 bFGF를 함유하는 배양 배지에서 수행되는, 세포가 제공된다.

상기 세포에 있어서, 저부착성 표면상에서의 배양이 형성된 임의의 종양 줄기 세포 구를 수집하는 것을 포함하며, 수집은 저부착성 표면상에서의 새로운 배지에 수집된 구를 새로 배양하면서 2-3일 마다 수행되는, 세포가 제공된다.

상기 세포에 있어서, 부착성 표면상에서 총 배양 시간이 12-30일, 14-28일 또는 18-24일의 기간으로부터 선택되는, 세포가 제공된다.

방법 구체예에서, 하나 이상의 흑색종-특이적 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 상기 분리된 세포 개체군이 로딩된 자가 수지상 세포를 포함하는 백신을 생 흑색종 세포를 포함하는 인간 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 방법이 제공된다. 상기 방법에 있어서, 흑색종-특이적 항원이 MAGE 항원인 방법이 또한 제공된다.

또 다른 방법 구체예에서, 정제된 암 줄기 세포를 생성시키는 방법으로서, (a) 종양 샘플로부터 세포를 분리함으로써 미리 획득된 세포 현탁액을 뉴런 줄기 세포 배지에 침지시키고 초-저부착성 컨테이너 또는 저부착성 컨테이너에서 배양하는 단계; (b) 암 줄기 세포 구의 형성을 허용하는 단계; (c) 침전에 의해 암 줄기 세포 구를 회수하여 회수된 구를 생성시키는 단계; (d) 회수된 구를 재-배양하는 단계; (e) 상기 재-배양 동안 회수된 구가 서로 결합되는 것을 허용하는 단계; (f) 결합된 구를 분리하여 단일 세포 현탁액을 수득하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 단계 (a)가 저부착성 컨테이너상의 배양을 포함하거나, 단계 (a)가 저부착성 컨테이너상의 배양을 포함하지 않거나, 단계 (a)가 초-저부착성 컨테이너상의 배양을 포함하거나, 단계 (a)가 초-저부착성 컨테이너상의 배양을 포함하며 저잡착성 컨테이너상의 배양은 포함하지 않는, 방법이 제공된다.

또한, 상기 방법에 있어서, 세포 현탁액을 생성하기 위해 종양 샘플을 분리하는 단계 전에 종양 샘플을 획득하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에 있어서, 증식성 부착 세포 배양을 확립하고 세포를 증량시키는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다.

본 발명은 인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, 개체군중 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하며, 개체군 중 적어도 30%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 30%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 퍼센트 값 (%)은 개체군에 대한 평균 값인 세포 개체군을 제공한다.

또한, 상기 세포 개체군에 있어서, 개체군중 적어도 40%의 세포가 CD146을 발현하며, 개체군 중 적어도 40%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 40%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 퍼센트 값 (%)은 개체군에 대한 평균 값으로 정의되는, 세포 개체군이 제공된다.

또한, 상기 세포 개체군에 있어서, 개체군중 적어도 50%의 세포가 CD146을 발현하며, 개체군 중 적어도 50%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 50%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며, 퍼센트 값 (%)은 개체군에 대한 평균 값인, 세포 개체군이 제공된다.

또한, 상기 세포에 있어서, 부착성 표면상에서의 배양이 상기 증량된 세포 개체군에서 면역억제 분자의 하향-조절을 유도하는, 세포가 제공된다. 또한, 상기 세포에 있어서, 부착성 표면상에서의 배양이 면역억제 분자의 하향-조절을 유도하며, (i) 면역억제 분자가 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제, 종양 성장 인자-베타, 및 인터루킨-10 (IL-10)중 적어도 하나이며, (ii) 부착성 표면상에서의 배양 전에 적어도 하나의 면역억제 분자의 발현은 100%이며, 부착성 표면상에서의 배양 후 하향 조절은 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 및 기타 등등의 수준으로 발현을 유도하는, 세포가 제공된다.

bFGF, 또는 또 다른 성장 인자, 또는 하나 이상의 성장 인자와 조합된 bFGF는 각각 약 0.5 ng/mL, 약 1.0 ng/mL, 약 2.0 ng/mL, 약 5.0 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 12 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 또는 0.5-1.0 ng/mL, 1-2 ng/mL, 2-4 ng/mL, 1-5 ng/mL, 5-10 ng/mL, 10-12 ng/mL, 10-15 ng/mL, 15-20 ng/mL, 20-25 ng/mL, 25-30 ng/mL, 20-30 ng/mL, 30-40 ng/mL의 범위, 및 기타 등등의 농도로 사용될 수 있다. 또한, 배제적 구체예에 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 bFGF가 0.5 ng/mL, 1.0 ng/mL, 2.0 ng/mL, 5.0 ng/mL, 10 ng/mL, 12 ng/mL, 15 ng/mL, 20 ng/mL, 25 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 또는 0.5-1.0 ng/mL, 1-2 ng/mL, 2-4 ng/mL, 1-5 ng/mL, 5-10 ng/mL, 10-12 ng/mL, 10-15 ng/mL, 15-20 ng/mL, 20-25 ng/mL, 25-30 ng/mL, 20-30 ng/mL, 30-40 ng/mL 범위, 및 기타 등등으로 발생하는 방법 및 배지를 배제시킬 수 있다. 상기 대안적 구체예 및 상기 배제적 구체예는 비-부착성 표면 (또는 매우 저-부착성 표면, 또는 초-저부착성 표면)과 사용되는 배지에 적용될 수 있다. 또한, 상기 대안적 구체예 및 상기 배제적 구체예는 부착성 표면과 사용되는 배지에 적용될 수 있다.

게다가, 상기 세포에 있어서, 세포 배양에 사용되는 배지가 동물 생성물을 포함하지 않는, 세포가 제공된다. 또한, 상기 세포에 있어서, 흑색종 종양 샘플 및 미세구 중 하나 또는 둘 모두로부터의 세포 분산이 첨가된 프로테아제로의 처리를 포함하는, 세포가 제공된다. 또한, 상기 세포에 있어서, 흑색종 종양 샘플로부터의 세포 분산이 첨가된 콜라게나제를 포함하는, 세포가 제공된다. 또한, 상기 세포에 있어서, 미세구로부터의 세포 분산이 첨가된 트립신으로의 처리를 포함하는, 세포가 제공된다.

본 발명은 분리된 세포 개체군으로서, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 CD146을 발현하거나, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 CD271을 공동-발현하거나, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포 개체군이 CD146 및 CD271 각각을 적어도 동일한 백분율로 발현하거나, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 CD146 및 CD271 둘 모두를 공동-발현하는 분리된 세포 개체군을 제공한다.

본 발명은 상기 분리된 세포 개체군으로서, 세포가 세포 구에 의해 포함되거나, 세포가 세포 구 형태로 발생하거나, 세포가 세포 구에 의해 포함되지 않거나, 세포가 세포 구의 일부가 아니거나, 세포가 현탁액중에 존재하거나, 세포가 단일층에 존재하는 세포 개체군이 제공된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 분리된 세포 개체군으로서, 상기 분리된 세포 개체군의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%가 암 줄기 세포인, 세포 개체군을 포함한다. 게다가, 본 발명은 적어도 1개의 암 줄기 세포, 적어도 10개의 암 줄기 세포, 적어도 100개의 암 줄기 세포, 적어도 1,000개의 암 줄기 세포, 적어도 2,000개의 암 줄기 세포, 적어도 5,000개의 암 줄기 세포, 적어도 10,000개의 암 줄기 세포, 적어도 20,000개의 암 줄기 세포, 적어도 50,000개의 암 줄기 세포, 적어도 100,000개의 암 줄기 세포, 적어도 1 x 10⁶ 개의 암 줄기 세포, 적어도 10 x 10⁶ 개의 암 줄기 세포, 적어도 100 x 10⁶ 개의 암 줄기 세포, 적어도 1 x 10⁹ 개의 암 줄기 세포, 적어도 10 x 10⁹ 개의 암 줄기 세포, 적어도 100 x 10⁹ 개의 암 줄기 세포, 또는 적어도 1 x 10¹² 개의 암 줄기 세포를 함유하는 분리된 개체군을 제공한다.

MAGE 항원을 발현하는 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있는 상기 세포 개체군이 본 발명에 의해 고려되며, 상기 분리된 개체군은 적어도 하나의 수지상 세포와 접촉되며, 상기 분리된 개체군은 적어도 하나의 수지상 세포에 의해 생체내에서 처리되며, 효과적인 면역 반응이 대상체로의 적어도 하나의 수지상 세포의 투여에 대하여 대상체에서 발생한다.

흑색종 암 세포, 폐암 세포, 유방암 세포, 결장직장암 세포, 또는 간세포성 암 세포인 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 자극할 수 있는 상기 분리된 세포 개체군이 본 발명에 의해 추가로 포괄되며, 상기 분리된 개체군은 적어도 하나의 수지상 세포와 접촉되며, 상기 분리된 개체군은 적어도 하나의 수지상 세포에 의해 생체내에서 처리되며, 효과적인 면역 반응이 적어도 하나의 수지상 세포의 투여 결과로서 대상체에서 발생하며, 수지상 세포는 각각 흑색종, 폐암, 유방암, 결장직장암, 또는 간세포성 암을 갖는 대상체에 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 분리된 세포 개체군으로서, 효과적인 면역 반응이 (a) 각 종양 세포에 대한 세포독성 T 세포 반응, (b) 세포내 사이토킨 염색 검정, ELISPOT 검정 또는 테트라머 검정에 의해 측정시 증가된 반응, (c) 항원-특이적 CD8⁺ T 세포의 증가된 개체군 수, (d) 항원-특이적 CD4⁺ T 세포의 증가된 개체군 수, (e) RECIST 기준에 따른 종량 존재량 감소, 및 (f) 대상체의 증가된 생존중 하나 이상을 포함하는, 개체군을 제공한다.

추가로, 본 발명은 상기 분리된 세포 개체군으로서, 실질적으로 개체군 전부가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 95%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 90%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 80%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 70%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 60%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 50%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 45%가 MAGE 항원을 발현하며; 개체군 중 약 25%가 MAGE 항원을 발현하는, 개체군을 제공한다.

구현예의 또 다른 구성에서, 본 발명은 분리된 세포 개체군으로서, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 MAGE를 발현하거나; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 CD146을 발현하거나; 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 CD271을 공동-발현하거나; 개체군의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 각각 CD146 및 CD271을 적어도 동일한 백분율로 발현하거나, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 세포가 CD146 및 CD271 둘 모두를 공동-발현하는, 개체군을 포함한다.

정의

인간, 포유동물, 포유동물 대상체, 동물, 가축 대상체, 플라세보 대상체, 연구 대상체, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때의 "투여"는 비제한적으로, 외생 리간드, 시약, 플라세보, 소분자, 약제, 치료제, 진단제 또는 조성물의 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체 등으로의 접촉을 나타낸다. "투여"는 예를 들어, 치료학적, 약동학적, 진단학적, 연구, 플라세보 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. 세포의 처리는 시제의 세포로의 접촉 및 시약의 유체로의 접촉을 포함하며, 여기서 유체는 세포와 접촉된 상태이다. 또한, "투여"는 예를 들어, 시약, 진단제, 결합 조성물 또는 또 다른 세포로의 세포의 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다.

"효능제"는 리간드 및 수용체에 대한 것으로서, 수용체를 자극하는 분자, 분자의 조합물, 복합물 또는 시약의 조합물을 포함한다. 예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 효능제는 GM-CSF, GM-CSF의 뮤테인 또는 유도체, GM-CSF의 펩티드 모사체, GM-CSF의 생물학적 작용을 모사하는 소분자, 또는 GM-CSF 수용체를 자극하는 항체를 포함할 수 있다. 길항제는 리간드 및 수용체에 관한 것으로서, 수용체를 억제하고/거나 대응하고/거나 하향 조절하고/거나 탈감작화시키는 분자, 분자의 조합물 또는 복합물을 포함한다. "길항제"는 수용체의 구성적 활성을 억제하는 임의의 시약을 포함한다. 구성적 활성은 리간드/수용체의 상호작용의 부재하에 분명해지는 것이다. 또한, "길항제"는 수용체의 자극된 (또는 조절된) 활성을 억제하거나 방지하는 임의의 시약을 포함한다. 예를 들어, GM-CSF 수용체의 길항제는 비제한적으로, 리간드 (GM-CSF)에 결합하여 리간드가 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체, 또는 수용체에 결합하여 리간드가 수용체에 결합하는 것을 방지하는 항체를 포함하거나, 여기서 항체는 수용체를 불활성 형태로 락킹 (locking)시킨다.

다르게 분명히 언급되지 않거나 문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 용어 "발현"은 하기를 포함한다. "발현"은 mRNA의 생합성, 폴리펩티드 생합성, 예를 들어, 번역-후 수식에 의한 폴리펩티드 활성화, 또는 아세포 위치 (subcellular location) 변화에 의한 또는 크로마틴으로의 모집에 의한 발현 활성화를 포함한다. 즉, "증가된 발현"은 증가된 생합성, 또는 인산화에 의해 초래되는 증가된 활성, 또는 세포질로부터 핵으로의 이동에 의해 초래되는 증가된 활성을 포함한다.

항원 제시 세포 (APC)는 항원을 T 세포에 제시하는데 사용된 면역계의 세포이다. APC는 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 번연부 Kupffer 세포, 마이크로글리아, 랑게르한스 세포, T 세포 및 B 세포를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Rodriguez-Pinto and Moreno (2005) Eur. J. Immunol. 35:1097-1105] 참조). 수지상 세포는 2개 이상의 리니지 (lineage)에서 발생한다. 제 1 리니지는 pre-DC1, 골수성 DC1 및 성숙한 DC1을 포함한다. 제 2 리니지는 CD34⁺⁺CD45RA-초기 선조 다능성 세포, CD34⁺⁺CD45RA⁺ 세포, CD34⁺⁺CD45RA⁺⁺ CD4⁺ IL-3R알파⁺⁺ pro-DC2 세포, CD4⁺CD11c^- 플라스마사이토이드 pre-DC2 세포, 림프구성 인간 DC2 플라스마사이토이드-유래된 DC2, 및 성숙한 DC2을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gilliet and Liu (2002) J. Exp. Med. 195:695-704; Bauer, et al. (2001) J. Immunol. 166:5000-5007; Arpinati, et al. (2000) Blood 95:2484-2490; Kadowaki, et al. (2001) J. Exp. Med. 194:863-869; Liu (2002) Human Immunology 63:1067-1071; McKenna, et al. (2005) J. Virol. 79:17-27; O'Neill, et al. (2004) Blood 104:2235-2246; Rossi and Young (2005) J. Immunol. 175:1373-1381; Banchereau and Palucka (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:296-306] 참조).

"유효량"은 비제한적으로, 의학적 상태 또는 장애의 증상 또는 징후를 개선시키거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 예방하거나 진단할 수 있는 양을 포함한다. 명시적으로 또는 문맥상 달리 언급되지 않는 한, "유효량"은 상태를 개선시키는데 충분한 최소량으로 제한되지 않는다. 질환 또는 장애의 중증도 및 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하거나 완화시키는 치료제의 효능이 비제한적으로, 바이오마커 또는 임상 변수에 의해 측정될 수 있다. 바이오마커는 혈구계수, 혈청, 소변 또는 뇌척수액중의 대사물 수준, 종양 세포 계수, 암 줄기 세포 계수, 종양 수준을 포함한다. 종양 크기 및 수는 RECIST 기준에 의해 결정될 수 있다 (Eisenhauer, et al. (2009) Eur. J. Cancer. 45:228-247). 발현 마커는 mRNA의 유전자 발현 또는 유전자 증폭, 항원의 발현 및 폴리펩티드의 발현을 포함한다. 임상 변수는 비제한적으로, 질병무진행생존율 (PFS), 6-개월 PFS, 무질환 생존율 (DFS), 진행 시간 (TTP), 원위 전이 시간 (TDM), 및 전체 생존율을 포함한다.

"라벨링된" 조성물은 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 아이소토픽 또는 화학 방법에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들어, 유용한 라벨은 ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹⁴C, ³H, ¹²⁵I, 안정한 아이소토프, 에피토프 태그 형광 염료, 전자-조밀 시약, 기질 또는 효소 (예를 들어, 효소-결합된 면역 검정에 사용됨), 또는 플루오레테 (fluorette)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Rozinov and Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728] 참조).

"인간 흑색종 종양으로부터 기원하는" 세포 개체군에서와 같은 용어 "기원하는"은 비제한적으로, 종양으로부터의 단일 세포로부터 기원하는 세포 개체군을 포함하며, 여기서 세포 개체군은 단일 세포를 배양함으로써 세포 분열에 의해 세포 개체군을 생성시킴으로써 생성된다. 또한, 하나의 종양으로부터의 많은 (1 초과의 수) 세포로부터 기원하는 세포 개체군을 포함하며, 여기서 그러한 수의 세포를 배양하여 세포 분열에 의해 더 많은 수의 세포를 생성시킨다. 또한, 환자의 한 특정 종양으로부터 획득된 하나 이상의 세포, 및 또한, 동일한 환자로부터의 상이한 종양으로부터 획득한 하나 이상의 세포로부터 기원하는 세포 개체군을 포함하며, 여기에서, 궁극적으로 생성된 세포 개체군은 모든 수확된 종양으로부터의 조합된 종양 세포를 나타낸다. 수확된 종양의 수는 1, 2, 3, 4 또는 그 초과일 수 있다. 용어 "인간 흑색종 종양으로부터 기원하는" 세포 개체군은 출발 세포로서, 종양에 거주하지 않는 흑색종 종양 세포를 사용하는 것을 포함하며, 즉, 고립 세포 예를 들어, 림프계 또는 순환계에 거주하는 세포로서 흑색종 종양 세포로의 출발이 발생한다. 비제한적으로, 용어 "기원하는"은 오염 세포를 제거함으로써 정제 처리되고, 배지에서 배양 처리되고, 냉장고에서 저장 처리되고, 배지에서 증량 처리되고, 하나 이상의 구의 시험관내 형성 처리되고 기타 등등 처리되는 수확된 종양 세포를 포함한다.

암의 면역학

암은 암에 대한 효과적인 면역 반응의 결핍에 의해 구별된다. 면역 반응의 결핍은 예를 들어, 많은 종양 항원이 "자가-항원"이라는 점, 종양 세포에 의한 MHC의 발현 결핍 및 그 결과 종양 세포에 의한 종양 항원 제시의 결핍, 면역 반응을 저하시키는 사이토카인을 발현하는 대식세포와 종양의 회합 (association), 및 T 조절 세포 (Treg)의 면역억제 활성으로부터 초래될 수 있다. 또한, 종양에 대한 면역 반응의 결핍은, 종양 세포가 선천적인 면역 반응을 자극하는 분자 즉, 톨-유사 수용체 (TLR) 또는 뉴클레오티드-결합 올리고머화 도메인 (NOD)-유사 수용체를 자극하는 분자를 발현하지 않는 경향이 있다는 점으로부터 초래된다. 암은 고형 암 (solid tumors) 및 혈액 암 (hematological cancers) 예컨대, 백혈병 (leukemias) 및 골수형성이상 증후군 (myelodysplastic syndromes)을 포함한다.

암은 면역계의 장애로서 분류될 수 있다. 이러한 분류는 고통받는 인간 개체군의 적어도 특정 부분에서 면역계가 암에 대해 최적으로 반응하지 못한다는 점을 기반으로 한다. 암 세포는 하기 이유로 인해 면역계에 의한 공격을 회피한다. 첫 번째로, 암 세포는 감염성 유기체를 갖는 상황과는 두드러지게 대조적으로 자가-항원으로 주로 구성된다. 암 항원으로서 분류되는 일부 항원은 실제로 과다발현되는 정상 항원 또는 폴리펩티드 사슬에서 단지 하나 또는 두 개의 아미노산에서의 돌연변이를 갖는 정상 항원이다. 두 번째로, 암 세포는 주조직적합복합체 (MHC)를 하향-조절하며, 따라서 MHC에 의한 종양 세포-유래된 펩티드를 많이 제시하지 않는다. 세 번째로, 암 세포 및 회합된 종양-회합된 대식세포는 면역반응을 약화시키는 사이토킨을 발현한다 (예를 들어, 문헌 [Yu et al (2007) Nature Rev. Immunol. 7:41-51] 참조). 이러한 약화는 예를 들어, 회합된 대식세포 또는 암 세포에 의한 인터루킨-10 (IL-10)의 분비에 의해 초래된다. 네 번째로, 감염 상황과는 달리, 암 세포는 임의의 면역 애주번트를 제공하지 않는다. 병원체는 다양한 자연-발생 면역 애주번트를 발현하며, 이는 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제 및 NOD 효능제 형태를 취한다 (예를 들어, 문헌 [Kleinnijenhuis et al (2011) Clin. Dev. Immunol. 405310 (12 pages)] 참조). 일반적으로, 최적의 수지상 세포 활성화에는 면역 애주번트와 하나 이상의 톨-유사 수용체 (TLR)의 접촉이 요구된다. 이는 수지상 세포에 의해 발현되는 TLR를 나타낸다. 따라서, 임의의 암 세포 또는 암 세포 항원은 더욱 활성화시키지 않고, 최적으로 임의의 수지상 세포를 활성화시킬 수 있는 경우일 것 같지 않다. 수지상 세포의 활성화 없이, 수지상 세포와 T 세포 (면역 스냅스)의 접촉은 T 세포의 최적의 활성화를 유도하지 못한다.

구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 면역 애주번트 예컨대, 톨-유사 수용체 (TLR) 효능제 예를 들어, CpG-올리고누클레오티드 (TLR9), 이미퀴모드 (TLR7), 폴리(l:C) (TLR3), 글루코피라노실 지질 A (TLR4), 뮤레인 (TLR2), 플라젤린 (TLR5)은 물론, 애주번트 예컨대, CD40 효능제, 예를 들어, CD40-리간드, 또는 사이토킨, 인터페론-감마, 프로스타글란딘 E2, 및 기타 등등으로 수지상 세포 (DC)를 활성화시키기 위한 시약 및 방법을 포함한다. 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로서 통합된 노엘 (Noelle) 등에 인가된 미국 특허 번호 7,993,659; 케들 (Kedl) 등에 인가된 US 7,993,648; 두벤스카이 (Dubensky) 등에 인가된 US 7,935,804 참조. 본 발명은 상기 애주번트 시약중 하나 이상으로의 DC의 시험관내 처리, 또는 추가적으로 또는 대안적으로, 인간 대상체, 동물 대상체 또는 가축 대상체로의 애주번트 투여를 포함한다.

면역계는 세포성 면역, 체액성 면역 및 보체 반응을 포함한다. 세포성 면역은 세포 네트워크 및 수지상 세포, CD8⁺ T 세포 (세포독성 T 세포; 세포독성 림프구) 및 CD4⁺ T 세포 (헬퍼 T 세포)를 포함하는 사건을 포함한다. 수지상 세포 (DC)는 폴리펩티드 항원을 획득하며, 여기서 이들 항원은 DC 외부로부터 획득될 수 있거나 감염 유기체에 의해 DC의 내부에서 생합성될 수 있다. DC는 폴리펩티드를 처리하여 약 10개 아미노산 길이의 펩티드를 유도하고, 이러한 펩티드를 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II에 전달하여 복합체를 형성하고, 복합체를 DC 표면으로 실어 나른다. MHC 클래스 I/펩티드 복합체를 갖는 DC가 CD8⁺ T 세포와 접촉하는 경우, 그 결과 CD8⁺ T 세포는 활성화되고 증식된다. MHC 클래스 II의 역할에 있어서, MHC 클래스 II/펩티드 복합체를 함유하는 DC가 CD4⁺ T 세포와 접촉하는 경우, 그 결과 CD4⁺ T 세포가 활성화되고 증식된다 (Munz, et al. (2010) Curr. Opin. Immunol. 22:89-93; Monaco (1995) J. Leukocyte Biol. 57:543-547; Robinson, et al (2002) Immunology 105:252-262). 항원을 T 세포에 제시하는 수지상 세포가 그러한 T 세포를 "활성화"시킬 수 있지만, 그렇게 활성화된 T 세포는 효과적인 면역 반응을 일으키지 못할 수 있다. CD8⁺ T 세포에 의한 효과적인 면역 반응은 다수의 상호작용중 하나 이상에 의한 DC 자극 전에 종종 필요하다. 이러한 상호작용으로는 CD4⁺ T 세포의 DC로의 직접 접촉 (DC의 CD40 수용체로의 CD4⁺ T 세포의 CD40 리간드의 접촉에 의해) 또는 수지상 세포의 톨-유사 수용체 (TLR)중 하나로의 TLR 효능제의 직접 접촉을 포함한다.

체액성 면역은 B 세포 및 항체에 관한 것이다. B 세포는 형질 세포로 변형되며, 혈질 세포는 항체를 발현하고 분비한다. 미경험 B 세포는 이들이 마커 CD27를 발현하지 않는 반면, 항원-특이적 B 세포는 CD27을 발현하다는 점에서 구별된다 (Perez-Andres, et al. (2010) Cytometry Part B 78B (Suppl. 1) S47-S60). 분비된 항체는 후속하여 종양 세포의 표면상에 거주하는 종양 항원에 결합할 수 있다. 그 결과, 감염된 세포 또는 종양 세포는 항체로 태깅된다. 감염된 세포 또는 종양 세포에 항체가 결합함으로써, 결합된 항체는 감염된 세포 또는 종양 세포의 치사를 매개하며, 여기서 치사는 NK 세포에 의해 이루어진다. NK 세포는 T 세포가 표적 항원을 인식하도록 구성된 방식으로 특이적 표적 항원을 인식하도록 구성되어 있지 않지만, 항체의 불변 영역으로 결합할 수 있는 NK 세포의 능력은 NK 세포가 항체로 태깅된 세포를 특이적으로 치사시킬 수 있게 한다. NK 세포의 항체 인식은 항체의 Fc 부분에 결합하는 (NK 세포의) Fc 수용체에 의해 매개된다. 이러한 유형의 치사를 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)이라 부른다. NK 세포는 또한, ADCC의 메카니즘에 독립적인 세포를 치사시킬 수 있으며, 여기서 이러한 치사에는 표적 세포에서 MHC 클래스 I의 발현이 없거나 결여되어야 한다 (예를 들어, 문헌 [Caligiuri (2008) Blood 112:461-469] 참조).

일부 구현예에서, 본 발명은 암 줄기 세포의 NK 세포-매개된 치사를 향상시키는 시약 및 방법을 제공한다. NK 세포는 암 줄기 세포에 대한 세포독성을 매개할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jewett and Tseng (2011) J. Cancer. 2:443-457] 참조). 임의의 특정 메카니즘으로 결부되지 않기를 바라면서, 본 발명은 암 줄기 세포 항원의 투여 또는 암 줄기 세포 항원이 로딩된 수지상 세포의 투여를 포함하며, 여기서 항원은 암 줄기 세포 항원 중 하나 이상을 특이적으로 인식하는 항체의 생성을 자극하며, 항체는 ADCC를 매개한다. 문구 "항원이 로딩된"은 수지상 세포의 생 세포 포획, 괴사 세포 포획, 죽은 세포 포획, 폴리펩티드 포획 또는 펩티드 및 기타 등등의 포획 능력을 지칭한다. 교차-제시에 의한 포획이 본 발명에 포함된다. 또한, 수지상 세포가 아닌 항원-제시 세포 예컨대, 대식 세포 또는 B 세포의 용도가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [O'Neill et al (2004) Blood. 104:2235-2246; Sabado and Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56] 참조).

"지연형 과민 반응"의 기법은 주로 세포성 면역과 관련된 면역 반응 또는 주로 체액성 면역과 관련된 면역 반응 사이를 구분하는데 이용될 수 있다. 지연형 과민 반응으로부터의 파지티브 시그널은 세포성 반응을 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Roychowdhury, et al. (2005) AAPS J. E834-E846] 참조).

본 발명은 감별 트립신 처리 예를 들어, 10분 동안의 0.25% 트립신을 사용한 처리를 포함한다. 또한, 완전한 트립신 처리 예를 들어, 0.25% 트립신과의 또는 120분의 인큐베이션이 포함된다 (Liu et al (2012) PLoS ONE. 7:e35720 (14 pages). 또 다른 양태에서, 본 발명은 추가된 트립신을 이용하거나, 감별 트립신 처리를 이용하거나, 완전 트립신 처리를 이용하는 시약 또는 방법을 배제한다. 본 발명은 시약 또는 방법을 포함하며, 또한, 그 전체가 각각 본원에 참조로서 통합된 에딘거 (Edinger) 등의 US2012/0122215; 하리라 (Harira) 등의 2012/0020936; 아보트 (Abbot) 등의 2011/0250182에 기술된 바와 같은 시약 또는 방법 중 하나 이상을 배제시킨다. 문헌 [Selvan et al (2010) Melanoma Res. 20:280-292]에는 부착성 세포를 떼어내기 위한 시약 및 방법이 기술되어 있다.

본 발명은 약제, 시약, 진단 키트를 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 약제, 시약 및 키트는 수지상 세포, 항체 또는 항원을 포함한다. 또한, 적어도 하나의 수지상 세포 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 방법, 항체 형성을 자극하는 방법, ADCC를 자극하는 방법, 보체-의존성 세포독성을 자극하는 방법, 및 환자 적합성을 결정하고, 임상 시험 또는 통상적인 의학 처치 맥락에서 환자 포함/제외 기준을 결정하고, 약제 또는 시약에 대한 반응을 예측하기 위한 방법 및 키트가 제공된다. 보체-의존성 세포독성은 기술되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Goodman, et al. (1990) J. Clin. Oncol. 8:1083-1092; Cheson (2010) J. Clin. Oncol. 28:3525-3530] 참조). 본 발명의 약제 조성물, 시약 및 관련 방법은 CD83 파지티브 수지상 세포를 포함하며, 여기서 CD83은 IFN-감마-처리된 암 세포로 로딩함으로써 유도된다. 본 발명의 CD83 양태에서, CD83은 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 6%, 7%, 8%, 9%, 및 10% 등등까지 유도된다. 또 다른 양태에서, DC 시약 또는 DC-관련 방법으로서, 수지상 세포의 CD83이 IFN-감마-처리된 암 세포의 로딩에 의해 검출가능하게 유도되지 않는 DC 시약 또는 DC-관련 방법이 배제된다. 배지, 라벨링된 항체, 세포 배양 공급물 및 그 밖의 시약은 예를 들어, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Life Technologies (Carlsbad, CA) 및 GIBCO (Grand Island, NY)로부터 입수가능하다. KO DMEM 배지는 "넉아웃 둘베코의 개질된 이글 배지 (Knockout Dulbecco's modified Eagle's medium)"이다. B27 배지는 예를 들어, 문헌 [Stevens et al (2009) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 106:16568-16573, and Brewer et al (1993) J. Neurosci. Res. 35:567-576]에 기술되어 있다. Glutamax®는 L-알라닐-L-글루타민이다.

수지상 세포 로딩

수지상 세포 (DCs)에 흑색종 종양 세포 항원이 로딩될 수 있으며, DC 백신이 제조될 수 있으며, DC 백신은 하나 이상의 투여 경로에 의해 인간 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Selvan et al (2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383; Sabado and Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56; Hirschowitz et al (2004) J. Clin. Oncol. 22:2808-2815; O'Neill et al (2004) Blood. 104:2235-2246; Schwaab et al (2009) Clin. Cancer Res. 15:4986-4992; Zhong et al (2007) Clin. Cancer Res. 13:5455-5462] 참조.

본 발명은 종양 세포가 예를 들어, 방사선, 핵산 가교제, 폴리펩티드 링커 또는 이들의 조합에 의해 불활성화된, 조성물 및 방법을 제공한다. 특정한 한 핵산 알킬화제는 베타-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르이다. 자외선 (UVA) 조사와 조합된 예시적인 가교제 예컨대, 소랄렌은 DNA를 가교시키나 단백질은 비변형된 채로 남겨두는 능력을 갖는다. 핵산 타겟팅 화합물은 4'-(4-아미노-2-옥사)부틸-4,5',8-트리메틸소랄렌 ("S-59")일 수 있다. 세포는 150 마이크로몰의 소랄렌 S-59 및 3J/cm² UVA 광으로 불활성화될 수 있다 (FX 1019 조사 장치, Baxter Fenwal, Round Lake, IL). 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 통합된 두벤스카이의 미국 특허 번호 7,833,775 및 7,691,393 참조.

종양 항원

본 발명은 종양 항원에 대한 면역 반응을 자극하고, 종양 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 자극하고, 인간 또는 가축 대상체에 투여하고, 인간 또는 가축 대상체를 진단하는데 사용하고, 기타 등등에 사용하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 본 발명은 예를 들어, p53, MUC1, NY-ESO-1, c-myc, 서바이빙 (surviving), p62, 사이클린 B1, 및 Her2/neu중 하나 이상을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 시약 및 관련 방법을 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Reuschenbach et al (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58:1535-1554] 참조). 일부 구현예에서, 면역 반응은 상기 항원 또는 항원들을 발현하는 세포에 대한 것이나, 그 세포에 반드시 특이적일 필요는 없다 (면역 반응은 또한 다른 세포에 대한 것이다). 그 밖의 구현예에서, 면역 반응은 상기 항원 또는 항원들을 발현하는 세포에 대한 것이며, 여기에서 면역 반응은 상기 항원의 인식을 필요로 한다. 또 다른 구현예에서, 면역 반응은 상기 항원 또는 항원들을 발현하는 세포에 대한 것이며, 여기에서 면역 반응은 상기 항원의 인식을 필요로 하지 않는다.

본 발명은 열 충격 단백질 (HSP)을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. HSP에 대한 면역요법은 결장직장암, 흑색종 및 콩팥 세포 암종에 대해 효과적이다 (예를 들어, 문헌 [Buonaguro et al (2011) Clinical Vaccine Immunol. 18:23-34] 참조). 암-고환 항원, 또는 분화 항원, 또는 과다발현된 항원, 또는 종양-관련된 탄수화물 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 방법이 포함된다. 그 밖의 구현예에서, 유방암, 결장직장암, 위암, 췌장암 및 난소암과 관련된 항원인 MUC1을 발현하는 신생물성 장애에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 방법이 제공된다 (Reuschenbach et al (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58:1535-1554). 또한, 폐암, 결장직장암, 식도암, 및 난소암과 관련된 항원인 p53을 발현하는 신생물성 장애에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 방법이 제공된다 (상기 류첸바흐 (Reuschenbach) 등의 문헌 참조). 게다가, 유방암, 결장직장암 및 난소암과 관련된 항원인 Her2/neu를 발현하는 신생물성 장애에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 방법이 제공된다. 구현예에서, 본 발명은 하기 항원에 대한 또는 상기 항원을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 방법을 제공하며, 여기에서 항원은 MAGE 패밀리 항원이다. MAGE는 "흑색종 관련 항원"이다. MAGE 패밀리 항원은 흑색종 (Selvan et al (2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383)은 물론, 간세포성 암종 (예를 들어, 문헌 [Mou et al (2002) Brit.J.Cancer. 86:110-116] 참조), 난소암 (Zhang et al (2010) BMC Cancer. 10:163 (6-pages), 비-소세포 폐암 (NSCLC) (Gridelli et al (2009) The Oncologist. 14:909-920; Sienel et al (2007) Clin. Cancer Res. 13:3840-3847), 및 결장직장암 (Toh et al (2009) Clin. Cancer Res. 15:7726-7736)과 관련이 있다.

CD133은 흑색종, 결장직장암, 유잉 육종, 간세포성 암 (HCC), 비-소세포 폐암 (NSCLC), 및 난소암을 포함하는 다양한 암에 의해 발현되는 항원이다 (Perego et al (2011) J. Inv. Dermatol. 11:546-547; Cao, et al. (2011) BMC Gastroenterol. 11:71 (11 pages); Lorico and Rappa (2011) 135039 (6 pages); Ferrandina et al (2009) BMC Cancer. 9:221 (9 pages)). 본 발명은 CD133을 발현하는 암 줄기 세포의 개체군; CD133을 발현하는 암 줄기 세포가 로딩된 적어도 하나의 수지상 세포; CD133을 발현하는 암 줄기 세포가 로딩된 수지상 세포를 제조하는 방법; 및 CD133 바이오마커를 발현하는 암을 갖는 대상체에 CD133을 발현하는 암 줄기 세포가 로딩된 적어도 하나의 수지상 세포를 투여하는 방법을 제공한다.

ABCB5 항원에 있어서, 본 발명은 ABCB5를 발현하는 암 줄기 세포가 수지상 세포와 접촉되거나 수지상 세포에 로딩되고, 로딩된 수지상 세포가 ABCB5-발현 암을 갖는 인간 대상체 또는 동물에 투여되는, 시약 및 방법을 제공한다. ABCB5 발현은 예를 들어, 흑색종 암 줄기 세포 (Schatton et al (2010) Cancer Res. 70:697-708)는 물론, 결장직장암 (Wilson et al (2011) Cancer Res. 71:5307-5316)과 관련이 있다. 관련 방법은 ABCB5를 발현하는 세포 바람직하게는, ABCB5를 발현하는 암 줄기 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 하기 항원에 대한 시약 및 방법을 포함한다: 알데하이드 데하이드로게나제 (ALDH), 예를 들어, ALDH1A3; ABCB1 (P-당단백질/MDR1); BCL2A1; SNAI2 (slug); ATM, CHEK1, 및 CHEK2. 또한, CD44, CD133, CD24, CD49f, ESA; CD166; 및 리니지 패널 (lineage panels)에 대한 시약 및 방법이 포함된다. 리니지 패널은 CD45, CD31 , CD3, CD64, CD10, CD16, CD18, 및 GPA; CD45, CD31, CD140a, 및 Ter119; CD45, CD31 및 CD140a을 포함한다. 전형적으로, 리니지 패널은 CD45, CD31, CD3, CD64, CD10, CD16, CD18, GPA, CD140a 및 Ter119 중 하나 이상을 포함한다 (그 전체가 본원에 참조로서 통합된 디흔 (Diehn) 등의 US 201 1/0124032).

하기 항원 중 하나 이상 또는 하기 항원 중 하나 이상을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 자극하는데 특이적인 시약 및 관련 방법이 또한 포함된다: MAGE-A 서브타입, 예컨대, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3/6, MAGE-A4, 및 MAGE-A12 (예를 들어, 상기 시에넬 (Sienel) 등의 문헌 참조). 대안적인 구현예에서, 본 발명은 세포간 부착 분자-1 (ICAM-1)중 하나 이상을 갖는 것으로 확인된 대상체에서 ICAM-1, 또는 ICAM-1을 발현하는 세포, 또는 신생물성 세포, 또는 암에 대하여 자극하는 시약 및 관련 방법을 제공한다. ICAM-1 관련 암은 흑색종, 결장암, 방광암, 폐암, 췌장암, 및 간세포성 암종을 포함한다 (Shih et al (2004) Korean J. Intern. Med. 19:48-52). 게다가, 본 발명은 sHLA-E를 갖는 것으로 확인된 대상체에서 하기 항원, 또는 하기 항원을 발현하는 세포, 또는 신생물성 세포, 또는 암에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 방법을 제공한다. sHLA-E는 비-전형적 MHC 클래스 I 분자이며, 이는 흑색종, 결장직장암, 및 신장암과 관련된다 (Allard et al (2011) PLoS One. 6:e21118 (9-pages). 또한, 하기 항원을 발현하는 대상체에서 하기 항원, 또는 하기 항원을 발현하는 세포, 또는 하기 항원을 발현하는 신생물성 세포, 또는 암에 대한 반응을 자극하는 시약 및 방법이 제공된다. 항원은 HERV-K gag-관련 NGO-Pr-54이다. 이러한 항원은 난소암, 전립선암, 및 백혈병과 관련된다 (Ishida et al (2008) Cancer Immunol. 8:15 (10-pages)).

본 발명은 하기와 같은 대상체에서 하기와 같은 신생물성 세포, 또는 암에 대한 면역 반응을 자극하는 시약 및 관련 방법을 제공한다. 구현예는 (1) 흑색종 및 결장직장; (2) 흑색종 및 난소; (3) 흑색종 및 폐; (4) 흑색종 및 간; (5) 흑색종, 결장직장, 및 난소; (6) 흑색종, 결장직장, 및 폐; (7) 흑색종, 결장직장, 및 간; (8) 흑색종, 폐, 및 간; (9) 흑색종, 난소, 및 폐; (10) 흑색종, 난소, 및 간; (11) 흑색종, 난소, 폐, 및 간; (12) 흑색종, 결장직장, 폐, 및 간; (13) 흑색종, 결장직장, 난소, 및 간; (14) 흑색종, 결장직장, 난소, 및 폐; 및 (15) 흑색종, 결장직장, 난소, 폐, 및 간을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

배제되는 구현예는 소정 수준의 면역 반응을 유도하지 않는 또는 유도하는데 실패한 것으로 보이는 시약 및 방법이다. 소정 수준의 면역 반응은 예를 들어, 흑색종 세포, 결장직장암 세포, 난소암 세포, 폐암 세포, 또는 간암 세포인 암 세포 중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다. 비제한적 규정에 의해서, 소정 수준 자극은 예를 들어, 최대 수준의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만인 자극일 수 있다. 최대 수준은 RECIST 기준에 따른 최대 반응을 나타내는 인간 대상체의 퍼센트, 인간 대상체 또는 실험 동물에서 암 줄기 세포의 치사, 전체 생존율, 질병무진행생존율 (PFS); 진행 시간 (TTP), 최대 세포독성 림프구 (CTL) 반응 시그널, 최대 ELISPOT 검정 시그널, 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)으로부터의 최대 결과, T 세포 활성화, T 세포 증량, 세포내 사이토킨 염색 (ICS) 검정, 테트라머 검정 및 기타 등등에 관한 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nomura et al (2008) Cytometry A. 73:984-991] 참조). 예를 들어, 한 구현예에서, 소정의 최대 수준의 20% 미만으로 자극하는 시약 및 방법이 배제된다. 임상적 종점 예컨대, PFS, TTP, 혈액전이 시간, 전체 생존율, 및 이들 종점을 해석하기 위한 기법은 상세히 기술되어 있으며 (Brody (2012) Clinical Trials:Study Design, Endpoints and Biomarkers. Elsevier, San Diego, CA), 본 발명의 일부이다.

본 발명에 의해 포함되는 시약, 방법 및 기법은 암 줄기 세포에 대한 수가야 (Sugaya) 등의 US 2011/0313229, 흑색종 암 줄기 세포의 분리에 대한 와이즈만 (Weismann) 및 보이코 (Boiko)의 WO 2011/041453, 및 CD146에 대한 블롯-샤바우드 (Blot-Chabaud) 등의 US 2011/0286963을 포함한다. 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.

비-부착 조건, 비-부착성 플레이트, 비-부착성 코팅 등이 소수성 물질 및 비-생오염 물질 예컨대, 폴리스티렌, 얇은 한천 코팅, 실록산, 플루오로폴리머, 폴리에틸렌 및 기타 등등에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 그 전체가 각각 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Tsai et al (2009) J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 20:1611-1628; US 7,790,217 issued to Toreki et al, US 6,342,591 issued to Zamora et al, US 201 1/0282005 of Jiang et al.] 참조. 비-부착을 위한 폴리에틸렌글리콜 (PEG)은 문헌 [Kim et al (2006) Lab Chip. 6:1432-1437. Ultra-Low Attachment surfaces include Corning Ultra-Low Attachment Surface (Corning, Inc.) and Thermo Scientific's Nunc Hydrocell Surface]에 기재되어 있다.

구현예에서, 본 발명은 비-부착 조건을 증진할 수 있는 첨가제 예컨대, 막 확장제, 장력활성제 (tensioactive agent), 플루로닉 F-68, 트윈-80, 또는 폴리비닐알콜 (PVA) (Sigma Aldrich catalogue, St. Louis, MO)를 제공한다.

구현예에서, 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제의 하향-조절은 소듐 부티레이트, COX-2 억제제, 안티-센스 핵산, si-RNA, 또는 마이크로-RNA에 의해 영향 받을 수 있다. IL-10 또는 TGF-베타의 하향-조절은 안티-센스 핵산, si-RNA, 또는 마이크로-RNA에 의해 영향 받을 수 있다. 문헌 [Liu et al (2011) FEBS Lett. 585:1963-1968]에는 하향-조절된 IL-10 발현에 대한 마이크로-RNA의 용도가 기재되어 있다. 문헌 [Yu et al (2012) Carcinogenesis. 33:68-76]에는 전환성장인자-베타 (TGF-베타)를 하향-조절함으로써 TGF-베타의 효능을 감소시키는데 있어서 마이크로-RNA의 용도가 기재되어 있다. 문헌 [Lang et al (2011) Biochim. Biophys. Res. Commun. 409:448-453]은 TGF-베타 발현을 억제하는데 있어서 작은 간섭 RNA (siRNA)의 용도를 보고한다.

구현예에서, 증량 절차는 단일 세포로 출발하여 수행된다. 기타 구현예에서, 증량 절차는 약 10개 세포, 약 20개 세포, 약 50개 세포, 약 100개 세포, 약 200개 세포, 약 500개 세포, 약 1000개 세포, 약 2000개 세포, 약 5000개 세포, 약 10000개 세포, 약 20000개 세포, 약 50000개 세포 및 기타 등등으로 개시된다.

배제되는 구현예가 제공된다. 비제한적으로, 본 발명의 시약 및 방법은 CD146의 발현이 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 세포, 조직, 기관 또는 대상체 및 기타 등등의 개체군을 배제시킬 수 있다. 또한, CD271의 발현이 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 세포, 조직, 기관 또는 대상체 및 기타 등등의 개체군이 배제될 수 있다. 또 다른 배제되는 구현예에서, CD146 및 CD271 둘 모두의 공동-발현 (측정된 각 세포에 있어서, 동일한 세포에서 정확하게 공동-발현)이 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 세포, 조직, 기관 또는 대상체 및 기타 등등의 개체군이 배제될 수 있다. 또한, CD146 및 CD271 둘 모두의 발현 (동일한 세포에서 정확하게 공동-발현되거나, 단지 전체 세포 개체군에서 둘 모두 발현됨)이 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 2% 미만인 세포, 조직, 기관 또는 대상체 및 기타 등등의 개체군이 배제될 수 있다.

용어 "공동-발현"은 지시된 마커 예를 들어, 유전자, 폴리펩티드, 항원 및 기타 등등이 동일한 세포에서 정확하게 발현되며, 또한 동시에 발현되는 상황을 나타낸다. 동시 공동-발현에 있어서, 공동-발현 기간은 약 5 분, 약 30 분, 약 1 시간, 약 6 시간, 약 12 시간, 약 1 일, 약 2 일, 약 4 일, 약 8 일, 및 기타 등등일 수 있다. 공동-발현 기간은 적어도 1 min, 적어도 5 min, 적어도 10 min, 적어도 20 min, 적어도 60 min, 적어도 2 시간, 적어도 4 시간, 적어도 6 시간, 적어도 12 시간, 적어도 24 시간, 적어도 2 일, 적어도 3 일, 적어도 4 일, 적어도 8 일, 적어도 1 주, 적어도 2 주, 및 기타 등등일 수 있다.

본 발명은 인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, 개체군중 적어도 20%의 세포가 CD146을 발현하고 적어도 20%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 20%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하는 세포 개체군을 제공한다. 또한, 인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, 개체군중 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하고 적어도 30%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 40%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하는 세포 개체군이 제공된다. 또한, 인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서, 개체군중 적어도 40%의 세포가 CD146을 발현하고 적어도 30%의 세포가 CD271을 발현하거나, 적어도 40%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하는 세포 개체군이 제공된다. 본 발명은 비제한적으로, 단일층 또는 기타 층으로서 발생하는 세포 개체군, 현탁액으로서 발생하는 세포 개체군, 하나 이상의 구 및 기타 등등으로서 발생하는 세포 개체군을 포함한다.

CD146 또는 CD271 중 단지 하나만 검출가능하게 발현하는 세포 개체군

본 발명은 CD271은 발현하지 않고 CD146을 발현하는 세포 개체군을 포함한다. 또한, 본 발명은 CD146은 발현하지 않고 CD271을 발현하는 세포 개체군을 포함한다. 구체예에서, 적어도 20%의 세포가 CD146을 발현하고, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 세포가 CD146을 발현하고 CD271은 발현하지 않는 세포 개체군이 포함된다. 또한, 적어도 20%의 세포가 CD146을 발현하고, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 세포는 CD271을 발현하고, CD146을 발현하지 않는 세포 개체군이 포함된다. 상기 세포를 배양하는 방법, 세포를 분리하는 방법, 수지상 세포에 상기 세포를 ㄹ로딩하는 방법, 상기 세포를 포함하는 백신, 상기 세포가 로딩된 수지상 세포를 포함하는 백신, 백신을 대상체에 투여하는 방법 및 기타 등등이 포함된다.

CD146+/CD271-인 흑색종 세포는 중간엽 암 세포를 동정하며, CD146+/CD271+인 흑색종 세포는 중간엽 특징을 갖는 암 줄기 세포인 세포를 동정한다. 본 발명은 개체군중 적어도 20%의 세포가 CD146+/CD271-이며, 적어도 22%, 적어도 24%, 적어도 26%, 적어도 28%, 적어도 30%, 적어도 34%, 적어도 38%, 적어도 42%, 적어도 46%, 적어도 50%, 적어도 54%, 적어도 58%, 적어도 62%, 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 74%, 적어도 78%, 또는 적어도 82%의 세포가 CD146+/CD271-인 세포 개체군 및 관련 방법을 제공한다. 본 발명은 개체군중 적어도 20%의 세포가 CD146-/CD271+이며, 적어도 22%, 적어도 24%, 적어도 26%, 적어도 28%, 적어도 30%, 적어도 34%, 적어도 38%, 적어도 42%, 적어도 46%, 적어도 50%, 적어도 54%, 적어도 58%, 적어도 62%, 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 74%, 적어도 78%, 또는 적어도 82%의 세포가 CD146-/CD271+인 세포 개체군 및 관련 방법을 제공한다. 배제적 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 백분율중 하나를 충족시키지 못하는 임의의 세포 개체군을 배제시킬 수 있다.

배제적 구체예

CD146의 발현이 10% 미만의 세포에서 발생하고, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만의 세포에서 발생하는, 단일 세포, 세포 개체군, 단일층 또는 기타 층으로서 발생하는 세포 개체군, 현탁액으로서 발생하는 세포 개체군, 하나 이상의 구로서 발생하는 세포 개체군 및 기타 등등이 배제될 수 있다. CD271의 발현이 10% 미만의 세포에서 발생하고, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만의 세포에서 발생하는, 단일 세포, 세포 개체군, 단일층 또는 기타 층으로서 발생하는 세포 개체군, 현탁액으로서 발생하는 세포 개체군, 하나 이상의 구로서 발생하는 세포 개체군 및 기타 등등이 배제될 수 있다. CD146 및 CD271 각각의 발현이 10% 미만의 세포에서 발생하고, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만의 세포에서 발생하는, 단일 세포, 세포 개체군, 단일층 또는 기타 층으로서 발생하는 세포 개체군, 현탁액으로서 발생하는 세포 개체군, 하나 이상의 구로서 발생하는 세포 개체군 및 기타 등등이 배제될 수 있다. CD146 및 CD271의 공동-발현이 10% 미만의 세포에서 발생하고, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만의 세포에서 발생하는, 단일 세포, 세포 개체군, 단일층 또는 기타 층으로서 발생하는 세포 개체군, 현탁액으로서 발생하는 세포 개체군, 하나 이상의 구로서 발생하는 세포 개체군 및 기타 등등이 배제될 수 있다. 본 문맥에 있어서, 공동-발현은 주어진 특정 세포의 분석에 있어서, CD146 및 CD271 둘 모두가 그러한 특정 세포에 의해 검출가능하게 발현됨을 의미한다. 1% 초과, 2% 초과, 4% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과의 흑색종 세포가 흑색종 암 줄기 세포가 아닌, 임의의 흑색종 세포 개체군이 배제될 수 있다.

도 1. 정제 공정의 다양한 단계에서 흑색종 줄기 세포의 유동 세포분석 특징화.
도 2. 자가 흑색종 세포주에서 CD146 및 CD271의 발현 백분율을 보여주는 표.
도 3. 다양한 흑색종 세포주의 표현형 (CD146; CD271).
도 4. 효소 분해에서 흑색종 줄기 세포, 표준 방법으로 제조된 흑색종 줄기 세포, 및 구-발생 방법에 의해 제조된 흑색종 세포의 유동 세포분석 결과 (CD146; CD271).
도 5. 다양한 처리법으로 처리된 흑색종 세포의 유동 세포분석 결과 (CD146; CD271) (MHC 클래스 II; MHC 클래스 I).
도 6. 방법 1을 사용한 정제 절차 도면.
도 7. 방법 2를 사용한 정제 절차 도면.
도 8. 정제 공정 동안 암 줄기 세포의 풍부화. 도 8A는 막대 그래프를 보여준다. 도 8B는 유동 세포분석 결과를 보여준다.
도 9는 (1) 대량 종양 세포에서 CD146 및 CD271, (2) 본 발명의 "암 줄기 세포", 및 (3) 표준 방법에 의해 생성된 "정제된 세포주"의 발현을 비교한 막대 그래프.

첨부된 청구범위를 포함하는 본원에 사용된 바와 같이, 낱말의 단수형은 달리 명확히 명시하지 않는 한 이들의 상응하는 복수형의 언급 대상을 포함한다. 본원에 언급된 모든 참고문헌은 각 개별적인 공개문헌, 특허, 공개 특허 출원 및 서열 목록과 상기 공개 문헌 및 특허 문헌의 도 및 도면이 본원에 통합되는 것으로 구체적으로 그리고, 개별적으로 언급되는 바와 같이 동일한 정도로 참조로서 통합된다.

추가 설명

피부 흑색종의 병기결정(Staging)

본 발명의 약제 또는 시제는 흑색종 환자에 투여될 수 있으며, 여기서 흑색종은 I 기, II 기, III 기, 또는 IV 기로 진단된다(Mohr, et al (2009) Ann. Oncology (Suppl. 6) vi14-vi21). I 기는, 예를 들어, 국소 또는 원위 전이의 증거 없이 원발성 흑색종을 갖는 환자를 나타낸다. II 기는 림프성 질환 또는 원위 전이의 증거가 없는 환자를 포함하며, 상기 환자는, 예를 들어, 피개 상피의 궤양을 갖는 1 mm 초과 내지 2mm 이하의 두께의 병소, 또는 상피 궤양을 갖는 2mm 초과 내지 4mm 이하의 두께의 병소를 추가 특징으로 한다. III 기 흑색종은 국소적 림프절 또는 통과 전이(in-transit metastasis) 또는 위성 전이(satellite metastasis)의 병리학적으로 기록된 관련성을 갖는 병소를 포함하며, 여기서 환자는, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 또는 그 초과의 침범된 림프절을 가질 수 있다. IV 기 흑색종은 원위 전이의 존재에 의해 규정되며, 상기 전이는 원위의 피부, 피하 조직, 또는 림프절에만 위치되거나, 상기 전이는 폐 전이를 수반하거나, 상기 전이는 모든 다른 내장 부위를 수반한다.

본 발명의 예방적인, 즉, 흑색종으로 진단되지 않았거나 진단된 적이 없는 대상체에 사용하기 위한 투여 방법을 포함한다. 대상체가 이전에 흑색종으로 진단된 적이 있고, 흑색종을 근절시키기 위해 이전에 성공적으로 치료된 적이 있고(또는 자연적인 완전한 관해를 경험한 적이 있고), 근절 후에 투여가 예방적으로 이용되는 투여 방법이 포함된다.

본 발명은 1.0 미만의 위험비(HR), 0.9 미만의 HR, 0.8 미만의 HR, 0.7 미만의 HR, 0.6 미만의 HR, 0.5 미만의 HR, 0.4 미만의 HR, 0.3 미만의 HR 등을 갖는 생존 데이터를 유도하는 약학적 조성물 또는 약학적 시약, 관련 투여 방법, 및 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 전체 생존 데이터, 무진행 생존 데이터, 진행까지의 시간 데이터 등을 발생시킨다. 또한 제공되는 것은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 등의 6-개월 PFS이다. 또한, 제공되는 것은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 등의 6-개월 전체 생존이다. 또한, 제공되는 것은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 등의 1-년(또는 2-년) PFS이다. 또한, 제공되는 것은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 등의 1-년(또는 2-년) 전체 생존율이다 (예를 들어, U.S. Dept. of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies (April 2005) 참조).

바이오마커 및 유동 세포분석

흑색종 암 줄기 세포의 연구는 마커 예컨대, CD271 (Civenni et al (2011) Cancer Res. 71 :3098-3109), CD146, CD146 (Perego et al (2010) J. Inv. Dermatol. 130:1877-1886); 및 ABCB5 (Schatton et al (2011) Cancer Res. 70:697-708)를 검출하는 시약 및 방법을 밝혀낸다. 흥미로운 기타 바이오마커는 CD20, CD133, CD44, CD90, CD24, EpCAM, ALDH1, 및 ABCB5을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Wang and Jacob (2011) Genome Medicine. 3:1 1 (6 pages); Schlaak et al (2012) Oncotarget. 3:22-30] 참조).

세포 개체군의 표현형 특징분석은 표면 마커 (BD Pharmingen San Diego, CA: BD) Pharmingen에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 수행된다. 각각의 주행 전에 CaliBRITE 유동 세포분석 교정 (BD Pharmingen)을 사용하고, 동일한 장치 세팅을 유동 세포분석 데이타 수집 전반에 걸쳐 사용한다. 유동 세포분석은 Beckton-Dickenson FACS Calibur® 유동 세포분석기로 수행된다. 세포에 의해 발현된 폴리펩티드의 수가 예를 들어, 유동 세포분석에 의해 정량적으로 형광 항체를 사용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Macey (2010) Flow CytometryPrinciples and Applications, Humana Press; Hawley (2010) Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, Wiley-Liss] 참조).

유동 세포분석에 의한 본 발명의 세포주의 특징분석은 흑색종 줄기 세포 마커로서 기술되었던 중간엽 및 신경 능선 기원의 세포 (각각 CD146 및 CD271)가 풍부함을 입증하였다. 이들 세포주 대 원래의 대량의 효소 분해 샘플의 비교는 이들이 정제 및 증량 후 CD146 및/또는 CD271 (78.5 ± 8.3% 대 26.9 ± 5.8%)이 풍부해졌음을 입증하였다. 무작위의 II 단계 임상 시험에 사용된 35/42 세포주의 조사는 정제된 종양 세포주에서 이들 마커의 일관된 발현을 드러냈다 (35.2 ± 3.9% CD146+/CD271-, 41.5 ± 4.3 CD146+/CD271+, 16.9 ± 4.0 CD146-/CD271-, 6.4 ± 1.9 CD146-/CD271+). 자가 수지상 세포 요법에서 항원 공급원으로서 이들 세포의 사용은 IV기 흑색종을 갖는 환자 (n = 54)에서 50%의 5년 생존율을 유도하였다. 다른 방법으로 과다 냉동 보존된 샘플을 사용하여, 본 발명자들은 생산 시간을 2달까지 감소시키고, 성공률을 80%까지 증가시킬 수 있었다. 이러한 공정은 또한, 이러한 공지된 암 줄기 세포 마커를 기준으로 하여 ~70%로부터 >90%로의 암 줄기 세포 순도의 증가를 유도하였다. 또한, 섬유모세포 오염이 최소 숙련된 조작으로 제거되었다. 이러한 방법은 자동화 및 확장성을 지지하는 폐쇄 및 균일 시스템이 구성될 수 있는 자동화 및/또는 최적화에 적합하다. 확장성 및 최적화는 종종 수송 및 제조 비용 감소와 관련되며, 자동화는 또한, 인건비 감소를 유도할 수 있다.

구

세포의 구 형성 능력은 부분적으로, 인테그린으로 불리된 세포-표면 단백질로부터 기인한다. 세포 표면상에 발현된 동종친화성 인테그린은 세포가 "함께 유지"되게 한다. 구는 배양의 아주 초기에 단일 세포 현탁액인 효소 분해 (ED)로부터 직접 형성되거나, 임의의 시간에서 냉동 샘플 또는 존재하는 부착된 배양물로부터 형성될 수 있다. 효소 분해 시딩은 세포에 특이적 표면 특성을 통합시키는 이러한 구 형성을 유도한다. 예를 들어, 섬유모세포는 통합될 수 없으며, 결국 중력 공급 동안 배양물로부터 흐려진다. 사용된 배지는 동종친화성 특성을 갖지 않는 세포의 비-특이적 응집을 방지하고, 배양 용기 표면으로의 부착을 방지하기 위해 부착을 증진하는 분자가 결여되어 있다. 이러한 부착 분자 (CAM)는 보통 동물 또는 인간 혈청에서 발견되며, 따라서 혈청 비함유 배지 조성물이 적합하다.

혈청 비함유 배양 배지에서, 보충에 의해 배지로 공급되는 것은 성장 및 유지, 또는 세포 생리 및 작용의 기타 요망되는 양태를 지지하는데 요구되는 임의의 호르몬, 영양분, 미네랄 및 비타민을 포함한다. 일부 예에서, 분열촉진 활성을 갖는 성장 인자 예를 들어, 예컨대, FGF 패밀리 및 EGF의 첨가 또는 양 조절로 줄기 세포 증식을 자극하고 지속시킬 수 있다.

암 줄기 세포의 구를 포함하는 세포의 구는 바이오마커 발현에 있어서 라벨링된 항체로의 고정 및 염색 이어서, 공초점 현미경 관찰로의 관찰에 의해 특성결정될 수 있다 (Weiswald et al (2010) Cancer. 10:106 (11 pages)). 구는 흑색종 세포의 경우에 있어서 기록된 바와 같이, 예를 들어, 부착성 세포로서 성장하기에 적합한 세포 또는 새로운 종양으로부터 수득된 현탁액으로부터 제조될 수 있다 (Perego et al (2011) J. Inv. Dermatol. 11:546-547). 구는 구의 형광 미세현미경 이미지에 의해 도시된 바와 같은 단일 세포로부터 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cao et al (2011) BMC Gastroenterol. 11:71 (11 pages)] 참조). 예를 들어, 크고 불규칙한 형태의 구 대 작고 조밀한 형태의 구는 배지 선택에 의해 영향을 받을 수 있다 (Mancini et al (2011) PLoS ONE. 6:e21320 (12 pages). 비제한적으로, 본 발명은 상기 참조에 기술된 방법 및 기법을 포함한다.

배양 시간

본 발명은 흑색종 암 줄기 세포 제조를 위한 방법을 제공하며, 여기서 배지 교환, 리플레이팅, 원심분리 및 침전과 같은 조작에 필요한 시간을 포함하는 전체 배양 시간은 5 개월 미만, 4 개월 미만, 3 개월 미만, 2 개월 미만, 1 개월 미만, 150 일 미만, 120 일 미만, 90 일 미만, 60 일 미만, 30 일 미만, 또는 150 일 미만 (+/-20 일), 120 일 미만 (+/-20 일), 90 일 미만 (+/-20 일), 60 일 미만 (+/-20 일), 30 일 미만 (+/-20 일)이다. 배제 구체예에서, 본 발명은 조작에 요구되는 시간이 상기 기술된 기간 중 하나 보다 긴, 암 줄기 세포를 제조하는 임의의 방법, 및 이러한 방법에 의해 제조된 임의의 암 줄기 세포 개체군을 배제시킬 수 있다. 상기 기간중 하나에 의해 나타내는 부착 배양 시간이 제공된다. 또한, 상기 기간중 하나인, 비-부착 배양 시간이 제공된다. 게다가, 또한, 상기 기간 중 하나에 의해 확인된 부착 배양 및 비-부착 배양의 조합된 시간이 제공된다.

본 발명의 배지

한 포뮬레이션 변화는 B27 보충물과 HSA (인간 혈청 알부민)을 사용할 수 있으며, 한편 또 다른 변화는 B27 보충물과 BSA (소 혈청 알부민)을 사용한다. 표 1은 인간 알부민을 갖는 혈청 비함유 보충 조성물이 예시됨을 보여준다 (표 1에서 최종 성분 참조). 일부 구현예에서, BSA가 인간 혈청 알부민 (HSA) 대신에 사용될 수 있다. 표 11에는 배지 RPMI 1640의 성분들이 기재되어 있다. "PSF"는 "Pen Strep and Fungizone"을 나타낸다. PSF는 항생제 및 항-진균제로서 사용된다. "뉴로블라스트 (Neuroblast) 줄기 세포 배지"는 표 8 (배지중 소 성분) 및 표 9 (인간 혈청 알부민으로 제조됨; HSA)에 기술되어 있다. "뉴로블라스트 배지" 및 "뉴로블라스트 스템 셀 (NeuroBlast Stem Cell) 배지"는 하나이며 동일하다.

본 발명은 뉴런 줄기 세포 배지, 뉴런 줄기 세포 배지를 사용하는 방법, 뉴런 줄기 세포 배지를 사용하여 제조된 세포, 상기 세포를 대상체에 투여하는 방법, 및 뉴런 줄기 세포 배지를 포함하는 키트를 포함한다. 뉴런 줄기 세포 배지의 각 개별 성분에 있어서, 본 발명은 +/-5% 또는 그 미만, +/-10% 또는 그 미만, +/-15% 또는 그 미만, +/-20% 또는 그 미만, +/-25% 또는 그 미만, +/-30% 또는 그 미만, 및 기타 등등인 농도 범위를 포함하며, 전체 부피는 일정하게 유지된다. 본 발명은 성분들중 하나 이상이 누락된 뉴런 줄기 세포 배지를 포함한다. 본 발명은 또한, 하나 이상이 치환된 뉴런 줄기 세포 배지를 포함한다. 세포 배지에 대한 치환의 일반적 예는 예를 들어, 포타슘 포스페이트를 소듐 포스페이트로, 글리세롤을 수크로스로, 시스테인을 시스틴으로의 치환 및 기타 등등을 포함한다.

염기성 섬유모세포 성장 인자의 대체물

비-부착성 기재상에서의 배양에 있어서, 배지는 선택적으로, 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), bFGF 유사체, 하나 이상의 그 밖의 성장 인자와 조합된 bFGF, 또는 bFGF가 미첨가된 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 성장 인자는 EHNA 화합물 (Burton et al (2010) Biochem. Soc. Trans. 38:1058-1061), 뼈 형태형성 단백질-2 (BMP-2), 혈관내피 성장 인자 (VEGF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 인슐린 성장 인자-1 또는 -2 (IGF-1; IGF-2), 전환성장인자-베타 (TGF-베타), 및 기타 등등을 포함한다.

본 발명은 bFGF에 대한 대체물로서, MAPK (미토겐-활성화된 단백질 키나제)를 통해 작용하는 임의의 성장 인자 또는 리간드를 제공한다. MAPK는 원래 ERK (세포외 신호-조절 키나제)로 불렸다.

이러한 메카니즘을 통해 작용하는 성장 인자의 분류 목록은 FGF, EGF, PDGF, NT3/4, BDNF, NGF, VEGF을 포함한다. 또한, 이들은 동일한 방식으로 작용한다: TNF, IL-1, TGFb, FASL. 이러한 성장 인자는 미토겐으로서 주로 작용한다.

활용될 수 있는 신속한 증식의 또 다른 메카니즘은 수용체 티로신 키나제 (예컨대, EGF, IGF 등등) 및 GPCR (G 단백질-결합된 수용체)을 통한 PI3K-AKT 경로를 자극하는 것이다.

상기 경로를 자극하는 천연 리간드 이외에, 억제제를 길항하는 제제가 시험관내 제작 용도로 고려된다. 이러한 억제제의 예는 PI3K-AKT 시스템에 작용하는 PTEN 억제제이다.

그 밖의 암 치료는 이러한 경로의 단일 표적에 대한 제제를 사용한다. 생체내 요법에 이미 사용된 단일 표적의 예는 예를 들어, Raf 키나제 억제제 소라페닙 (sorafenib), SB590885, PLX4720, XL281, RAF265, LGX818, 베무라페닙 (vemurafenib); MEK 억제제: XL518, CI-1040, PD035901 , MEK162, 셀루메티닙 (selumetinib), 트라메티닙 (Trametinib) (GSK1 120212)을 포함한다.

이러한 치료에 반해, 본 발명은 시험관내 제작을 위한 암 증량을 촉진하는 (효능제) 리간드를 사용한다.

본 발명에 사용된 리간드 (예컨대, FGF, EGF)의 형태형성 효과는 열거된 경로들을 통해 Nanog, cKit, Sox2, Oct3/4과 같은 전사 인자를 자극함으로써 암 줄기 세포 개체군의 우선적인 증량에 기여한다.

상기 천연 및 합성 리간드 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합물이 예를 들어, 저부착성 플라스크, 매우 저부착성 플라스크 또는 초-저부착성 플라스크에서 비-부착 배양 동안 배양 배지에 첨가될 수 있거나, 부착 배양 동안 배양 배지에 첨가될 수 있다. 하기는 부착 배양에서의 성장을 다룬다. bFGF는 부착 배양 동안 절대적으로 필요하지는 않으나, Nanog, cKit, Sox2, Oct3/4와 같은 전사 인자를 자극함으로써 암 세포의 "줄기 세포" 상태를 유지하는 것을 도울 수 있다. 반대로, bFGF의 무분별한 사용 또는 과다-사용은 종양 세포가 아닌 예컨대, 정상 섬유모세포 또는 상피 세포인 개체군의 성장을 향상시킬 수 있다. 따라서, 부착 단계에서의 사용은 암 세포 개체군의 순도를 평가함으로써 시간 제한이 있어야 한다. 제작시 구형형성 단계 (spherogenic step)는 정상 세포 개체군의 증량을 방지할 것이며, 이는 성장 인자가 과도하게 사용되는 시점이며, 불순화가 의심되는 경우, 이러한 단계 (구형형성)가 반복될 수 있다.

비제한적으로, 본 발명의 주요 특징은 (1) 바람직하게는, 단일 성장 인자, 또는 성장 인자의 조합물, 또는 억제제의 길항제와 비-부착 조건하에서의 성장; (2) 구형체를 분리함으로써 암 단계 세포 선택을 포함한다 (암 줄기 세포를 분리하는 임의의 그 밖의 방법을 사용하지 않음). 구형체는 중력법, 원심분리, 여과 및 기타 등등에 의해 분리될 수 있으며; (3) 바람직하게는, 하나 이상의 성장 인자와 부착 조건하에서 성장하고, (4) 비-부착 공정이 선택적으로 반복된다.

도면의 상세한 설명

도 1

신경내분비 및 중간엽 표현형을 갖는 흑색종 줄기 세포를 감별 부착 및 혈청 고갈 방법을 이용하여 정제 공정 동안 풍부화시켰다. 배양 기간 시작시 (효소 분해), 부분적 순수 지점 (중간), 및 정제 완료 후 (정제) CD146 및 CD271에 대한 대표적인 유동 세포분석 플롯이 도시되어 있다. 정상 인간 진피 섬유모세포 (NHDF)를 대조군으로서 포함시켰다. 8개의 분리되어 처리된 샘플에 대한 요약된 데이타가 도시되어 있다. 나타낸 값은 평균 ± SD이다.

도 2

막대 그래프는 3개의 상이한 제조 단계의 세포에 있어서, CD146 및 CD271을 발현하는 세포의 퍼센트를 나타낸다. 단계는 효소 분해, 중간 및 정제이다. 표 12는 활성 특이적 면역요법을 위해 수지상 세포에 로딩하는데 사용된 자가 흑색종 세포주에서 CD146 및 CD271의 발현 백분율을 나타낸다. 막대 그래프를 포함하는 개별 환자에 있어서, N = 63.

도 3

활성 특이적 면역요법에서 수지상 세포에 로딩하는데 사용된 자가 흑색종 세포주는 신경 능선 및 중간엽 기원과 관련된 항원을 발현하는 세포를 함유하였다. 방사선 조사되고 냉동보존된 정제된 자가 흑색종 세포를 CD146 및 CD271의 발현을 위한 유동 세포분석에 의해 평가하였으며, N = 36, 기재된 값은 ± SD이다.

도 4

표준 또는 구 발생 방법론으로부터 유도된 흑색종 줄기 세포주는 동일 표현형의 세포를 발생시킨다. 도면에 도시된 각 조건으로부터의 세포를 이중 양성을 측정하는 CD146 및 CD271에 대한 유동 세포분석에 의해 검정하였다. 도 3의 발견 대비 도 4의 발견은 일부 경우에, 인큐베이션 동안 구를 형성하지 않는 세포 손실 및 CD271 발현 증가중 적어도 하나가 있을 수 있음을 시사한다.

도 5

정제된 흑색종 세포주를 7일의 기간 동안 뉴런 줄기 세포 배지 또는 표준 혈청 함유 증량 배지 (15%FBS/RPMI)에 위치시켰다. 그 후, 세포를 부착성 세포의 경우 트립신화 및 암 줄기 세포 구의 단순한 수집에 의해 수확하였다. 도면에 도시된 각 조건으로부터의 세포를 CD146, CD271, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II에 대한 유동 세포분석에 의해 동시에 분석하였다. 더 높은 MHC II 발현은 활성화 사이토킨의 분비에 의해 면역 반응을 지지하고 지속시킬 수 있는 CD4 기억 세포를 자극한다.

도 6

분별 부착 및 혈청 고갈을 이용한 흑색종 암 줄기 세포의 정제 공정의 개략적 대표도 (방법 I). 효소적으로 분해된 외과 종양 샘플을 나타내는 대량 종양을 세포 배양 배지를 함유하는 혈청에서 1-3일 동안 인큐베이션시키고, 이어서 2회 세척하여 림프구를 제거한다. 이어서, 섬유모세포, 비-암 줄기 세포 및 암 줄기 세포의 부착된 혼합물을 저 혈청 세포 배양 조건 (1-5% 범위 소태 혈청) 및 평균 120일 기간에 걸친 일련의 분별 부착 과정으로 처리된다. 분별 부착 과정은 기재로부터 세포 혼합물을 효소적으로 분리시키고, 25-30%의 세포가 부착될 때 까지 5-20분 기간 동안 새로운 기층 (표준 혈장 처리된 세포 배양 플라스크)상으로 플레이팅시키는 것으로 구성된다. 이어서, 비-부착된 세포를 새로운 플라스크에 옮기고, 부착 과정을 4-6회 연속으로 반복한다. 이러한 공정은 암 세포의 부착율 대비 더 높은 섬유모세포의 부착율을 특징으로 하는 이점을 갖는다. 추가적으로, 저 혈청 조건은 암 줄기 세포 대비 이들 세포의 더 높은 영양분 요건으로 인해 오염 섬유모세포 및 비-암 줄기 세포 성장률을 억제할 것이다.

도 7

암 줄기 세포를 분리하기 위한 초-저부착성 줄기 세포 조건 이어서, 부착성 증량 조건을 이용한 정제 공정의 개략적 대표도 (방법 2). 일부 구현에서, Corning® 상표 물질로 피복된 폴리스티렌이 초-저부착을 지지하는데 사용된다. 폴리-프로필렌은 또한, 초-저부착성을 지지할 구조-유전된 소수성 특성을 갖는다. Corning® 상표물 코팅 이외에, 얇은 한천 코팅 (폴리사카라이드), 폴리아미드 또는 실록산이 사용될 수 있다. 효소적으로 분해된 외과적 종양 샘플을 나타내는 대량 종양을 14일 후 생성된 암 줄기 세포 구에 대한 초-저부착성 또는 부착성 조건하에 줄기 세포 배지에서 인큐베이션시킨다. 부착성 (adherency)은 세포가 성장하는 표면에 부착된 채로 유지되는 세포를 나타내며; 비-부착된 세포는 세척 및 수확 동안 제거될 것이다. 비 부착 조건은 세포가 유사한 생 세포 이외의 기재에는 부착되지 않는 경우의 배양 조건을 나타낸다. 소수성 물질 또는 비-생물오염 처리는 비-부착 조건을 달성하는데 사용될 수 있다: 아가로스, 폴리-에틸렌, 플루오로-폴리머, 실록산. 비-부착 조건을 증진시킬 수 있는 조건은 배지 또는 기재로부터 인테그린에 대해 특이적인 말단부를 갖는 펩티드 (RGD, IKVAV, YIGSR, RETTAWA 등등)의 결여 또는 혈청 성분 결여를 포함한다. 또한, 막 확장제 또는 장력활성제의 첨가: 플루로닉 F-68, 트윈80, 폴리-비닐 알콜 (PVA), 폴리-에틸렌 글리콜 (PEG)이 비-부착 조건을 증진시킬 수 있다. 더 높은 농도에서 이동성 효소로서 작용할 수 있는 히알루로니다제가 세포 분리를 초래할 수 있다. 또한, CD44 의존성 앵커리지 결여를 초래할 수 있다. 포유동물 세포 배양 분야에서의 숙련자는 초-저 부착성 또는 저 부착성인 배양 플라스크, 배양 접시 및 기타 배양 컨테이너를 용이하게 구별할 수 있다.

이는 림프구 및 섬유모세포 및 비-암 줄기 세포 종양 세포와 같은 오염 세포 개체군의 제거를 유도한다. 이들 구에는 CD146/CD271 양성 암 줄기 세포 개체군이 풍부해진다. 이어서, 구는 기계적으로 또는 효소적으로 분리되고, 부착성 표면상으로 플레이팅되고, 추가 30-45일 동안 복제 허용된다. 이어서, 세포는 전세포 또는 세포 용해물로서 면역요법에 사용하기 위해 수확된다.

도 8

도 8은 정제 공정 동안 암 줄기 세포의 풍부화를 나타낸다. 도 8A는 유동 세포분석 결과를 보여주며, 도 8B는 유동 세포분석 결과를 요약한 막대 그래프를 보여준다. 결과는, 이러한 특정 세포 제조에 있어서, 효소 분해 (대량 종양, 백색 막대)에서, 가장 우세한 세포 유형은 CD146 마이너스/CD271 마이너스이며, 본 발명의 정제 단계에서, 가장 우세한 세포 유형은 CD146 플러스/CD271 마이너스임을 입증한다. 중간 단계에서, CD146 플러스/CD271 세포 및 CD146 마이너스/CD271 플러스 세포가 대략 동일한 백분율로 발생하였다.

도 9

도 9는 본 발명의 "암 줄기 세포" 및 표준 방법에 의해 생성된 "정제된 세포주"에서 대량 종양 세포중 CD146 및 CD271의 발현을 기재한다.

도 9에 있어서, 대량 종양 세포에서, CD146 마이너스/ CD271 마이너스 세포 (백색 막대 부분)가 세포에서 가장 높은 비율을 차지하며, CD146 마이너스/ CD271 플러스 세포 (하향 사선 무늬 막대 부분)가 그 다음으로 우세한 세포를 차지한다. "암 줄기 세포"에서 CD146 플러스/ CD271 플러스 세포 (십자형 무늬 막대 부분)가 가장 우세한 유형의 세포이다. "정제된 세포 주"에서, CD146 플러스/ CD271 플러스 세포 (십자형 무늬 막대 부분) 및 CD146 플러스/ CD271 마이너스 세포 (상향 사선 무늬 막대 부분)이 대략 동일한 비율이나, CD146 플러스/ CD271 플러스 세포가 CD146 플러스/ CD271 마이너스 세포보다 다소 더 높은 백분율로 발생한다. 도 9는 표 13으로부터의 데이타를 나타낸다.

실시예

본 발명은 세포-기반 면역요법에 사용하기 위한 흑색종 샘플의 생검체로부터 중간엽 및 신경 능선 기원의 암 줄기 세포를 분리하고 증량시키는 방법 및 시약을 제공한다. 방법론은 신경 능선 및/또는 중간엽 표현형을 갖는 종양 줄기 세포의 구별되는 개체군을 분리하고 증식시키기 위한 배지 포뮬레이션의 사용을 포함한다. CD146은 중간엽 세포에서 빈번하게 발견된 마커이며, 고도의 침습성 표현형과 관련된다. CD271인 뉴런 성장 인자 수용체 p75는 뉴런 전구체 세포에 의해 발현되며, 흑색종 개시 세포 상에서 발현된다. 전이성 흑색종 제조물에서 발견될 수 있는 유형의 세포를 분리하고 증량시키는 단계가 제공되며, 여기서 이러한 세포는 CD146+/CD271-, CD146+/CD271+, 또는 CD146-/CD271+이다. 추가로, 이들 세포는 또한, 전체적으로 또는 부분적으로 CD44, Twist, Zeb1/2, Snail, Slug, SIP, CD133, CD166, CXCR4, Notch-1 및 CD90에 대해 양성일 수 있다. 세포를 줄기 세포 배지에서 10-14일 동안 비-부착 조건하에 재배하고, 이어서 비-줄기 세포 증량 배지하에 부착 조건으로 전환시킨다. 최종 부착 단계는 주조직적합복합체의 상향-조절 및 면역억제 분자 예컨대, 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제, 종양 성장 인자 베타 및 인터루킨-10의 하향-조절을 증진하는 것이다. 본 발명은 환자를 면역화시키기 위해 대량 종양 생검 또는 정제된 비-부착성 암 줄기 세포보다는 이러한 세포를 사용한다. 따라서, 본 발명은 여전히 비-부착 "구형체 (spheroid)" 상태인 면역억제 암 줄기 세포 또는 대량 종양 생검에서 우세한 세포인 분화된 비-증식 세포 개체군과는 대조적으로 종양 형성으로서 검정되는 세포를 사용한다. 문헌 [Selvan et al (2010) Melanoma Res. 20:280-292]은 흑색종 조직 샘플을 처리하기 위한 시약 및 방법을 기재한다.

세포-기반 면역요법은 종양-관련된 신생항원의 존재로 인해 자가 조직 환경 (autologous setting)에 유효한 것으로 예상된다. 그러나, 대량 자가 종양 제조물의 사용은 아마도 대량 종양에 존재하는 세포 개체군이 주로, 낮은 백분율의 세포가 암 줄기 세포를 나타내는 분화된 세포라는 점 때문에 예상된 임상 결과를 수득하지 못하였다. 본 발명의 기법은, 종양 검체가 암 줄기 세포의 풍부화 가장 효과적인 방식으로 처리되어야 함을 입증한다. 특히, 본 공정은 구 형성 기법을 사용하여, CD146+/CD271- (중간엽 암 세포), 또는 CD271/CD146 (중간엽 특징을 갖는 암 줄기 세포)인 세포의 풍부화를 유도한다.

그러나, 이어서 세포는 암 줄기 세포의 면역억제 효과에 대해 감시하기 위해 면역요법에 사용되기 전에 최종 증식 단계를 위한 기재 예컨대, 세포 배양 플라스크에 부착되어야 한다 (Wei et al (2010) Glioma-associated cancer-initiating cell induce immunosuppression. Clin Cancer Res. 16:461 -473; Schatton et al (2010) Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating cell. Cancer Res. 70:697-708).

표준 세포 배양 플라스크 또는 유사 표면과 같은 부착성 기재상에서 세포 증량 효과는 주조직적합복합체 (MHC 클래스 I 및 클래스 II)로 불리된 중요한 면역 관련 단백질을 상향 조절한다. 이들 단백질 복합체는 면역계가 바이러스로 감염되거나 이종인 세포를 인식하고 이에 반응하는 주요 메카니즘이다. 암 줄기 세포는 분리되는 구형체 성장 단계 동안 이들 분자를 하향 조절하고, 부착되는 증량 성장 단계 동안 이들을 상향 조절한다. 증량 동안 비-부착 상태로부터 부착 상태로 암 줄기 세포를 이행시키는 작용은 면역 반응을 억제하는 암 줄기 세포의 능력을 감소시키거나 제거하는 것으로 예측된다. MHC 클래스 I 및 클래스 II 단백질 이외에, 암 줄기 세포는 또한, 그 밖의 면역억제 분자 예컨대, 전환성장인자-베타 (TGF-b), 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제 (IDO) 및 인터루킨-10 (IL-10)을 상향-조절한다 (Jewett, A. and H.C. Tseng, Tumor induced inactivation of natural killer cell cytotoxic function; implication in growth, expansion and differentiation of 암 줄기 세포. J. Cancer, 201 1 . 2:443-457). 후속하여, 이들 인자는 기재로의 부착에 대한 반응에서 하향-조절되어야 한다.

하향-조절률 및 상향-조절률

본 발명은 부착성 표면상에서의 배양이 면역억제 분자의 하향-조절을 유도하며, (i) 면역억제 분자가 인돌아민-피롤-2,3-디옥시게나제, 종양 성장 인자-베타, 및 인터루킨-10 (IL-10)중 적어도 하나이며, (ii) 부착성 표면상에서의 배양 전 적어도 하나의 면역억제 분자의 발현은 100%이며, 부착성 표면상에서의 배양 후 하향 조절은 초기 100%와 비교하여, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 수준의 발현을 유도하는, 세포 및 관련 방법 및 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 부착성 표면상에서의 배양이 면역억제 분자의 하향-조절을 유도하며, (i) 면역억제 분자가 인돌아민 -피롤-2,3- 디옥시게나제이며, (ii) 부착성 표면상으로의 배양 전에 면역억제 분자의 발현은 100%이며, 부착성 표면상에서의 배양 후 하향 조절은 초기 100%와 비교하여, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 수준의 발현을 유도하는, 세포 및 관련 방법 및 조성물을 제공한다.

부착성 표면상에서의 배양이 면역억제 분자의 하향-조절을 유도하며, (i) 면역억제 분자가 종양 성장 인자-베타이며, (ii) 부착성 표면상으로의 배양 전에 면역억제 분자의 발현이 100%이며, 부착성 표면상에서의 배양 후 하향 조절은 초기 100%와 비교하여, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 수준의 발현을 유도하는, 세포 및 관련 방법 및 조성물이 제공된다.

또 다른 양태에서, 부착성 표면상에서의 배양이 면역억제 분자의 하향-조절을 유도하며, (i) 면역억제 분자가 인터루킨-10 (IL-10)이며, (ii) 부착성 표면상에서의 배양 전에 면역억제 분자의 발현이 100%이며, 부착성 표면상에서의 배양 후 하향 조절은 초기 100%와 비교하여, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 수준의 발현을 유도하는, 세포 및 관련 방법 및 조성물이 제공된다.

구체예에서, 특정 핵산 또는 폴리펩티드의 상향-조절은 세포 개체군 중 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%에서 검출가능하다. 하향-조절에 있어서, 특정 핵산 또는 폴리펩티드의 하향-조절은 세포 개체군 중 적어도 20%의 세포, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%에서 검출가능하다.

구체예에서, 특정 핵산 또는 폴리펩티드의 상향-조절은 암 줄기 세포 개체군중 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%에서 검출가능하다. 하향-조절에 있어서, 특정 핵산 또는 폴리펩티드의 하향-조절은 암 줄기 세포 개체군 중 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%에서 검출가능하다.

상기 언급된 관련 방법 및 조성물은 세포 배양 방법, 수지상 세포 (DC)로의 암 줄기 세포 로딩 방법, 백신 제조 방법, 흑색종 암 줄기 세포가 로딩된 DC를 포함하는 백신인 조성물, 대상체, 흑색종 발병 위험이 있는 대상체 또는 흑색종을 포함하는 대상체로의 백신 투여 방법, 및 적어도 하나의 흑색종-특이적 항원에 대한 특이적 면역 반응을 자극하는 방법, RECIST 기준에 의해 측정가능한 객관적 종점을 개선시키는 방법, 및 임상 종점, 예컨대, 질병무진행생존율 (PFS), 원위 전이 시간 (TDM), 또는 전체 생존율 (OS)을 개선시키는 방법을 포함한다.

본 발명은 부착성 표면상에서의 배양이 MHC-I, MHC-II, 또는 MHC-I과 MHC-II 둘 모두의 상향-조절을 유도하고, (ii) 부착성 표면상에서의 배양 전의 MHC-I, MHC-II, 또는 MHC-I과 MHC-II 둘 모두의 발현이 100%이며, 부착성 표면상에서의 배양 후 상향-조절은 초기 100%와 비교하여, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 200% (2-배 증가), 적어도 250%, 적어도 300%, 적어도 400% (4-배 증가), 적어도 500% 수준의 발현을 유도하는, 세포 및 관련 방법 및 조성물을 제공한다. MHC는 주조직적합복합체이다. MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 발현을 측정하고, 상향-조절 또는 하향-조절로서 발현을 정량화시키는 방법이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Pantel et al (1991) Cancer Res. 51 :4712-4715; Vertuani et al (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58:653-664; Yadav et al (2009) J. Immunol. 182:39-43; Lollini et al (1998) Int. J. Cancer. 77:937-941] 참조).

인돌아민-피롤-2,3-디옥시게나제 (Orabona et al (2006) Blood. 107:2846-2854), 인터루킨-10 (IL-10) (Hedrich and Bream (2010) Immunol. Res. 47:185-206), 및 종양 성장 인자-베타 (Kloen et al (1997) Cancer. 80:2230-2239)의 발현 검출 또는 상향-조절 검출을 위한 다양한 비제한적 방법이 인용된다.

본 발명은 제조된 흑색종 세포를 제공하며, 제조된 흑색종 세포가 로딩된 수지상 세포를 제공하며, 제조된 흑색종 세포가 로딩된 수지상 세포를 포함하는 백신을 제공하며, 여기에서 면역억제는 최대 면역억제의 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 등등으로 감소된다. 이러한 문맥에서, "면역억제"는 하나 이상의 흑색종 항원의, 또는 정제된 흑색종 항원이 로딩된 수지상 세포를 포함하는 백신, 또는 처리된 흑색종 세포가 로딩된 수지상 세포를 포함하는 백신에 대한 임의의 면역억제 (내성) 능력을 지칭하며, 즉 내성은 하나 이상의 흑색종-특이적 종양 항원에 대해 증가된다. 비제한적으로, 본 발명의 백신은 구로 로딩된 수지상 세포 (DC), 구를 포함하는 세포 개체군으로 로딩된 수지상 세포, 구로부터 유도되고 DC로 로딩되기 전에 부착성 표면상에서 증량된 세포 개체군으로 로딩된 수지상 세포, DC로 로딩되기 전에 균질환 또는 초음파 처리된 구로 로딩된 수지상 세포, DC로 로딩되기 전에 균질화 또는 초음파 처리된 증량된 세포 개체군으로 로딩된 수지상 세포 및 기타 등등을 포함할 수 있다.

시험관내 세포 배양 기법에 의한 중간엽 특징을 갖는 종양 줄기 세포의 풍부화는 세포-기반 면역요법 프로토콜에서 이들 세포의 사용을 가능하게 할 것이다. 이들 방법은 유방암, 교모세포종, 중피종, 난소암, 폐암, 전립선암, 간암 및 결장암 생검으로부터의 샘플에 이용될 수 있다.

표 14는 분별 부착 및 혈청 고갈의 표준 방법론으로부터 유도된 세포 주에 대한 통상의 흑색종 관련 항원의 발현을 기재하고 있다. 또한, 예를 들어, 문헌 [Selvan et al (2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383; Selvan et al (2010) Melanoma Res. 20:280-292] 참조.

구현예에서, 본 발명은 분리된 암 줄기 세포 개체군으로서, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 세포가 CD146+/CD271-이며, 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 90 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 상기 동일한 세포가 CD44, Twist, Zeb1/2, Snail, Slug, SIP, CD133, CD166, CXCR4, Notch-1, 및 CD90 중 하나 이상을 발현하는 암 줄기 세포 개체군을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 분리된 암 줄기 세포 개체군으로서, 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 세포가 CD146-/CD271+이며, 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 90 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 상기 동일한 세포가 CD44, Twist, Zeb1/2, Snail, Slug, SIP, CD133, CD166, CXCR4, Notch-1, 및 CD90 중 하나 이상을 발현하는 암 줄기 세포 개체군을 제공한다.

구현예에서, 본 발명은 분리된 암 줄기 세포 개체군으로서, 세포 개체군의 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 세포가 CD146+/CD271+이며, 약 0%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 90 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 동일한 세포가 CD44, Twist, Zeb1/2, Snail, Slug, SIP, CD133, CD166, CXCR4, Notch-1, 및 CD90 중 하나 이상을 발현하는 암 줄기 세포 개체군을 제공한다.

구현예에서, 분리된 암 줄기 세포 개체군은 약 100개 세포, 약 1,000개 세포, 약 2,000개 세포, 약 5,000개 세포, 약 10,000개 세포, 약 20,000개 세포, 약 50,000개 세포, 약 100,000개 세포, 약 200,000개 세포, 약 500,000개 세포, 약 1 X 10⁶개 세포, 약 2 X 10⁶개 세포, 약 5 X 10⁶개 세포, 약 10 X 10⁶개 세포, 약 20 X 10⁶개 세포, 약 50 X 10⁶개 세포, 약 100 X 10⁶개 세포, 약 200 X 10⁶개 세포, 약 500 X 10⁶개 세포, 약 1 X 10⁹개 세포, 약 2 X 10⁹개 세포, 약 5 X 10⁹개 세포, 약 10 X 10⁹개 세포, 약 20 X 10⁹개 세포, 약 50 X 10⁹개 세포, 약 100 X 10⁹개 세포, 및 기타 등등이다.

방법

방법 1. 흑색종 암 세포 주를 생성시키기 위한 표준 방법론

언급된 임상 시험에 사용되는 정제된 종양 세포 주를 생성시키는데 이용되는 방법은 분별 부착 및 혈청 고갈 방법이며, 이에 의해 섬유모세포 및 정상 간질 세포가 제거된다 (Dillman et al (1993) Establishing in vitro cultures of autologous tumor cells for use in active specific immunotherapy. J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14:65-69).

적어도 약 수백개 세포의 외과적 검체를 병리학적 검사 후 수득하고, 외과용 메스 및 콜라게나제 분해 (효소 분해)로 잘게함으로써 단일-세포 부유물로 처리하였다. 생성된 정제된 세포 배양물을 약 20억 개 세포로 증량시키고, 냉동보존 및 액체 질소에서의 저장 전에 방사선 조사시켰다. 적합한 환자에 대해 성분채집하여 정화 정제를 위한 단핵구를 수득하였다. 이어서, 정제된 단핵구를 AIMV (Invitrogen)중의 178ng/ml GM-CSF 및 80 ng/mL IL-4 (Cell Genetics)를 사용하여 수지상 세포로 분화시켰다. 이어서, 생성된 수지상 세포는 방사선 조사된 정제된 종양 세포 (DC+TC)가 로딩된 항원이다. 환자에 500 마이크로그램의 GM-CSF에 재현탁된 DC+TC의 8회 피하 주입으로 투여하였다. 당업자는 이는 본 발명의 범위내에 속하며, 일부 경우에, GM-CSF를 TLR 효능제 및 CD40 리간드 중 적어도 하나로 대체 (전체적 또는 부분적) 또는 증가시키는 것이 가능할 수 있음을 이해할 것이다.

흑색종 주에서 발현된 항원 패널의 발현은 면역세포화학 절차를 이용하여 측정하였다. 간단하게는, 세포를 1000IU/mL IFN-c의 존재 또는 부재하에 8-챔버 배양 슬라이드 (Thermo Fisher)에서 배양하였다. 72 시간 후, 세포를 인산염 완충된 염수 (PBS)로 3회 세척하고, 냉 아세톤에서 고정시켰다. 내생성 퍼옥시다제를 차단한 후, 세포를 기록된 항원에 대한 적절한 일차 항체와 인큐베이션하였다. 바이오티닐화된 항-마우스 또는 토끼 면역글로불린, 슈퍼 센서티브 효소 (Super Sensitive enzyme)-컨주게이팅된 스트렙타비딘 라벨링 및 호스 래디쉬 퍼옥시다제 색소원, 및 기재 키트 (Biogenex, Fremont, CA)를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다. 하기 항-인간 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 반응성을 아이소타입-ㅁ매칭된 대조군 항체와 함께 조사하였다: S-100 및 HMB-45 (Biogenex), Mel-2, Mel- 5, Mart-1 (Signet), 티로시나제, Mage-1 (Thermo Scientific, Waltham, MA), Melan-A, HLA 클래스 I, 및 HLA 클래스 II (Dako, Carpinteria, CA).

방법 2. 암 세포 주의 암 줄기 세포 구형제 정제 방법

외과적 종양 샘플을 외과용 매스 및 콜라게나제 분해로 잘게함으로써 처리하였다. 생성 세포 현탁액을 초-저부착성 세포 배양 플라스크 (Corning)에서 21일 동안 0.05-0.2 백만 세포/mL로 뉴런 줄기 세포 배지 (Neuroblast stem cell media, California stem cell, Irvine, CA)에 위치시켰다. 초-저부착성 기재상에서의 배양 동안, bFGF는 절대적으로 필요하지는 않으나, bFGF는 더욱 신속한 증식을 촉진한다. 본 발명은 bFGF가 초-저부착성 기재상에서의 배양 동안 사용되지 않으며, 또한, bFGF가 실제로 초-저부착성 기재상에서의 배양 동안 포함되는, 세포 개체군, 구 개체군 및 관련 방법을 제공한다. 종양 줄기 세포 구를 매 2-3일 마다 침전을 이용하여 회수하고 새로운 배지에서 재-배양하였다. 21일의 구형체 배양 기간 후, 구를 효소 트립신화에 의해 분리시켜 단일 세포 부유물을 수득하였다. 이어서, 세포를 15% 소태 혈청을 함유하는 RPMI 배지 또는 동물 산물-비함유 증량 배지 (Omega Scientific, Tarzana, CA)중에서 표준 세포 배양 플라스크 (Corning, Corning, NY)에 위치시키고, 증량시켜 증식성 부착 세포 배양을 확립하였다. 적합한 영양분을 제공하는 그 밖의 증량 배지 포뮬레이션을 사용할 수 있어 부착 암 세포 개체군의 신속한 증량을 보장한다.

정제된 종양 세포 배양물, 암 줄기 세포 구 및 효소 분해 샘플을 냉동보존으로부터의 해동 후 또는 세포 배양 동안 유동 세포분석에 의해 하기 중 하나 이상의 발현에 대해 검정하였다: MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 및 CD146 및 CD271 (BD Biosciences, San Jose, CA). 또한, 정상 인간 진피 섬유모세포의 대조군 샘플을 또한 검정하였다. 세포를 15분 동안 4% 파라포름알데하이드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에서 고정시키고, 인산염 완충된 염수 (PBS) (Omega Scientific)로 2회 세척하고, 밀리리터당 1백만 세포로 재-현탁시켰다. 세포를 30분 동안 10 uL의 CD146 및 CD271 또는 아이소타입 대조군 (BD Biosciences)으로 염색하고, PBS로 세척하고, 비드-교정 FACS Calibur (bead-calibrating FACS Calibur) (BD Biosciences)에 대한 제조 설명서에 따라 유동 세포분석을 수행하였다.

세포 증량 구현예에서, 절차로 처리된 세포는 약 1개 세포, 정확히 1개 세포, 약 10개 세포, 약 20개 세포, 약 50개 세포, 100개 세포, 약 1,000개 세포, 약 2,000개 세포, 약 5,000개 세포, 약 10,000개 세포, 약 20,000개 세포, 약 50,000개 세포, 약 100,000개 세포, 약 200,000개 세포, 약 500,000개 세포, 약 1 X 10⁶개 세포, 약 2 X 10⁶개 세포, 약 5 X 10⁶개 세포, 약 10 X 10⁶개 세포, 약 20 X 10⁶개 세포, 약 50 X 10⁶개 세포, 약 100 X 10⁶개 세포, 약 200 X 10⁶개 세포, 약 500 X 10⁶개 세포, 약 1 X 10⁹개 세포, 약 2 X 10⁹개 세포, 약 5 X 10⁹개 세포, 약 10 X 10⁹개 세포, 약 20 X 10⁹개 세포, 약 50 X 10⁹개 세포, 약 100 X 10⁹개 세포, 및 기타 등등이다.

일부 예에서, 방법 2에 하기 단계 중 하나 이상을 부가하는 것이 유용할 수 있다. 종양의 효소 분해의 사실상 직후 혈장 처리된 조직 배양 플라스크 상으로의 부착 단계, 이어서 플라스크에 부착되지 않은 림프구 및 파편 제거를 위한 세척 단계. 인큐베이션 단계로서, 세척 단계에 이어서 뉴런 줄기 세포 배지에서 암 세포 및 정상 세포의 부착 혼합물을 인큐베이션하고, 이는 플라스크의 표면으로부터 암 줄기 세포 구의 발아를 생성시킬 것이다. 발아 암 줄기 세포가 수집될 수 있으며, 추가 증식을 위한 초-저부착 조건에 위치시키는 수집 단계.

변형된 방법 2. 암 세포 주의 암 줄기 세포 구형체 정제 방법

하기 비제한적 프로토콜은 미세구 기법에 의해 발생되는 종양 세포 주를 처리하고 특성분석하기 위한 것이다. 미세구 기법은 하기 기술되어 있다.

단계 1. 효소 분해된 흑색종 종양 샘플 8개를 무작위로 선택한다.

단계 2. 37도 C로 설정된 수조에서 저온 유리병을 해동시켜, 세포 현탁액을 생성시킨다. 5% RPMI 배지를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브에 현탁액을 적가한다.

단계 3. 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한다.

단계 4. 10 mL의 뉴로블라스트 배지에서 재현탁시킨다.

단계 5. 혈구계산기를 사용하여 세포 계수 및 생존력 평가를 수행한다.

단계 6. 80,000개 생존 세포/뉴로블라스트 mL와 10ng/mL bFGF에 재현탁시키고, 제곱 센티미터당 0.52ml로 초-저부착성 플라스크에 위치시킨다.

단계 7. 매 2-3일 마다, 900 rpm에서 5 분 동안 세포를 원심분리하고, 새로운 배지로 교체한다. 처음 3번의 배지가 교환되도록 이를 반복하고, 이어서 전체 21일의 나머지 배양 기간 동안 수동적인 침전으로 전환시킨다. 수동적 침전은 50 mL 원뿔형 튜브로 세포 현탁액을 전달하고, 3-5 분 동안 플랫 표면상의 홀더에 원뿔형 튜브를 위치시키는 것으로 구성된다. 원불형 튜브 바닥의 미세구 수집물을 관찰한다. 상청액을 제거하고, 10 ng/mL bFGF가 보충된 5% FBS와 뉴로블라스트에 세포 펠렛을 재현탁시킨다. 21일 말에, 수동 침전을 수행한다.

단계 8. 상청액을 제거하고, 부드럽게 피펫팅하면서 10분 동안 TrypLE로 세포 펠렛을 분리시킨다. 혈구계산기를 사용하여 생존율을 평가하고, 세포 계수를 수행한다.

단계 9. 표준 부착 세포 배양 플라스크에서 10 ng/ml bFGF가 보충된 5% FBS와 뉴로블라스트에서 제곱 센티미터당 20,000 내지 30,000개 생존 세포로 세포를 재현탁시킨다. 3-4주 동안 세포 배양물을 유지시키면서, 사용 배지에 따라 주당 2-3회 배지를 교체한다. 주기적으로 위상차 사진 (phase contrast photograph)을 찍는다.

단계 10. 증량 기간 말기에, 세포에 TrypLE를 통과시키고 세포 계수를 수행한다.

단계 11. 제조된 세포로부터의 샘플은 하기와 같이 특성분석될 수 있다. CD146 및 CD271에 대한 항체를 사용한 유동 세포분석 특징분석을 위해, 파라포름알데하이드 고정에서 인큐베이션시킴으로써 3-5백만 세포를 고정시킨다. 세포를 또한, PBS중 실온에서 어둠하에 30분 동안 아이소타입 lgG1-PE 및 IgGI-FITC, CD146-PE 및 CD271-FITC 라벨링된 항체로 염색하였다. 염색된 세포를 5분 동안 400 x g에서 원심분리하고, PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 0.4ml의 PBS에 재현탁시키고, BD FACSCalibur® 장치에서 유동 세포분석에 사용하였다.

대상체로의 투여

수지상 세포 백신을 피하 (SC) 투여하였다. 각 용량은 5 백만-2 천만 로딩된 DC 범위이며, 일련의 8회 용량으로 반복된다. 주입 (4)은 첫 달에는 매주 제공되며, 다음 4회 주입후 매달 제공된다. 대안적인 구현예에서, 투여는 3주 동안 주 1회이며, 이어서 5개월 동안 매달 1회로 총 8주이다. 일부 구현예에서, 부스트 애주번트 (GM-CSF)는 모든 투여물과 동시에 제공된다. 대안적인 구현예에서, GM-CSF 부스트 애주번트가 제공되나, 매 단일 용량으로 제공되지 않는다. 또 다른 구현예에서, GM-CSF 부스트 애주번트가 전혀 제공되지 않는다.

비제한적으로, 수지상 세포 (예를 들어, 자가 또는 동종이형 수지상 세포)는 세포 용해물, 산 용리물, 세포 추출물, 부분적으로 정제된 항원, 정제된 항원, 분리된 항원, 부분적으로 정제된 펩티드, 정제된 펩티드, 분리된 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합물로서 암 줄기 세포 항원과 접촉된다. 이어서, 수지상 세포는 대상체 예를 들어, 암을 포함하는 대상체, 또는 암을 포함하지 않는 대조군 대상체에 투여된다. 구현예에서, 수지상 세포는 피하, 결절내, 근내, 정맥내, 비내, 흡입, 경구, 장 내강으로의 도포 및 기타 등등인 경로 중 하나 이상에 의해 접촉되거나, 투여되거나, 이들에 주입된다 (예를 들어, 문헌 [O'Neill et al (2004) Blood. 104:2235-2246; Sabado and Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56] 참조).

이와 같이, 구현예에 적용되는 바와 같은 본 발명의 근본적인 신규한 특성 및/또는 이의 양태가 도시되고 기술되고 강조되었으나, 구현예, 이의 내용 및 양태의 형태 및 상세한 사항에 있어서 다양한 생략, 재구성 및 치환, 및 교환이 본 발명 및/또는 청구범위의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 동일한 결과를 달성하기 위한 실질적으로 동일한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 이러한 요소 및/또는 방법 단계의 모든 조합이 본 발명의 범위 내에 있음이 명확히 의도하고자 한다. 게다가, 임의의 기재된 형태 또는 구현과 관련하여 도시되고/거나 기술된 구조 및/또는 요소 및/또는 방법이 일반적인 설계 선택 문제로서 임의의 기타 기재되거나 기술되거나 제안된 형태 또는 구현에 통합될 수 있음이 인식되어야 한다. 따라서, 이는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌, 특허, 특허 출원 및 참조는 본원에 그 전체가 기술되어 있는 것처럼 본원에 이러한 참조로서 통합된다.

방법 및 장치가, 가장 실제적이고 바람직한 구현, 예 및/또는 구체예인 것으로 현재 고려되는 것에 있어서 기술되었지만, 본 발명은 기재된 구현, 예 및/또는 구체예에 제한될 필요가 없음이 이해되어야 한다. 청구범위의 사상 및 범위 내에 포함된 다양한 변형 및 유사한 배열을 내포하는 것으로 의도되며, 이의 범위는 모든 이러한 변형 및 유사한 구조를 포함하는 것과 같은 가장 넓은 해석에 따라야 한다.

또한, 본 발명의 본질로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 변화는 또한, 본 기술을 암시적으로 포함한다. 이들은 여전히 본 발명의 범위내에 있다. 본 발명이 방법 및 장치 모드 둘 모두에서 및 전체적인 시스템으로서 및 독립적으로 많은 양태를 내포하는 특허를 수득하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.

게다가, 본 발명, 이의 예, 양태 및 청구범위의 각각의 다양한 요소는 또한, 다양한 방식으로 획득될 수 있다. 이러한 내용은 각 이러한 변형, 임의의 장치의 이의 변형, 방법 또는 공정, 또는 심지어 이들의 임의의 요소의 변형을 내포하는 것으로 이해되어야 한다.

특히, 본 발명은 청구된 요소에 관한 것이며, 각 요소에 대한 단어는 동일한 장치 용어 또는 방법 용어로 표현될 수 있음이 - 심지어 기능 또는 결과가 동일한 경우에만- 이해되어야 한다.

이러한 등가물, 더 넓은 범위 또는 심지어 더욱 일반적인 용어는 각 요소 또는 작용 설명에 내포되는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 용어들은 필요에 따라 치환될 수 있어, 본 발명에 부가되는 함축적으로 광범위한 범위를 명백히 할 수 있다.

모든 작용은 그러한 작용을 초래하는 요소로서 또는 그러한 작용을 취하는 수단으로서 표현될 수 있음이 이해되어야 한다.

유사하게는, 기재된 각 물리적 요소는 그러한 물리적 요소가 가능하게 하는 작용의 내용을 내포하는 것으로 이해되어야 한다.

본 특허 출원에 언급된 임의의 특허, 공개문헌 또는 그 밖의 참조는 본원에 참조로서 통합된다.

최종적으로, 본 출원과 함께 또는 이후에 제출된 Information Disclosure Statement 또는 기타 정보 공개에 기록된 모든 참조가 첨부되고 본원에 참조로서 통합된다; 그러나, 상기 각각에 있어서, 참조로서 통합된 이러한 정보 또는 진술이 청구된 발명(들)의 특허와 불일치한 것으로 간주될 수 있는 경우이면, 이러한 진술은 본 출원인(들)에 의해 작성된 것으로 명백히 간주되지 않는다.

이와 관련하여, 실질적인 이유에 있어서 그리고, 잠재적으로 수백개의 청구범위 신설을 회피하기 위해, 본 출원인이 단지 초기 종속항을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.

신규 물질 법규 -- 비제한적으로, 35 USC §132 또는 기타 그러한 법규 포함 --하에 요구되는 정도로 뒷받침되어, 하나의 독립항 또는 개념하에 제시된 임의의 다양한 종속항 또는 기타 요소를 임의의 다른 독립항 또는 개념하의 종속항 또는 요소로서 부가하는 것을 허용하는 것으로 이해되어야 한다.

비실질적인 치환이 이루어지는 경우, 본 출원인이 임의의 특정 구체예를 문자적으로 내포하도록 실제로 임의의 청구항을 설계할 수 없는 경우, 및 다르게 적용되는 경우, 본 출원인에게 어떠한 방식으로도 본 출원인이 단순히 모든 만일의 경우를 예상할 수 없는 그러한 범위를 실제로 포기하거나 그렇게 의도되는 것으로 이해되지 않으며; 당업자에게 이러한 대안적 구체예를 문자적으로 내포할 청구범위를 작성하도록 합리적으로 예측되지 않는다.

추가로, 이행 문구 "포함하는"의 사용은 전통적인 청구범위 해석에 따라 본원에서 "개방형" 청구항을 유지하는데 이용된다. 따라서, 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는" 또는 "포함하여"와 같은 변형은 언급된 요소, 또는 단계, 또는 요소 또는 단계의 군을 내포하며, 임의의 그 밖의 요소 또는 단계 또는 요소 또는 단계의 군을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이러한 용어는 본 출원인에 법적으로 허용가능한 가장 넓은 범위를 제공하는 이들의 가장 넓은 형태로 해석되어야 한다.

요약은 기술 개시내용의 특성 및 요지를 독자가 신속히 확인하는 것을 가능케 하기 위해 37 CFR §1.72(b)에 따라 제공된다. 요약은 청구항의 범위 또는 의미를 해석하거나 제한하기 위해 사용되지 않는다는 이해와 함께 제공된다.

Claims

인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서,
(i) 개체군에서 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하며, 개체군에서 적어도 30%의 세포는 CD271을 발현하거나,
(ii) 적어도 30%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며,
퍼센트 값 (%)은 개체군에 대한 평균 값으로서 규정되는, 분리된 세포 개체군.
제 1항에 있어서, 발현이 적어도 35%이며, 공동-발현이 적어도 35%인, 분리된 세포 개체군.
제 1항에 있어서, 발현이 적어도 40%이며, 공동-발현이 적어도 40%인, 분리된 세포 개체군.
제 1항에 있어서, 발현이 적어도 45%이며, 공동-발현이 적어도 45%인, 분리된 세포 개체군.
제 1항에 있어서, 발현이 적어도 50%이며, 공동-발현이 적어도 50%인, 분리된 세포 개체군.
제 1항에 있어서, 5% 미만의 세포가 오염 세포인 분리된 세포 개체군.
제 1항에 있어서, 2% 미만의 세포가 오염 세포인 분리된 세포 개체군.
자가 수지상 세포를 포함하는 백식으로서, 수지상 세포가 제 1항의 분리된 세포 개체군으로 로딩되고, 수지상 세포 및 인간 종양은 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 백신.
자가 수지상 세포를 포함하는 백식으로서, 수지상 세포가 제 5항의 분리된 세포 개체군중 적어도 하나로 로딩되고, 수지상 세포 및 인간 종양은 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 백신.
제 8하에 있어서, 세포 개체군이 수지상 세포에 로딩되기 전에 세포 분열을 방지하는 방사선 손상을 포함하거나, 세포 분열을 방지하는 핵산 가교제를 포함하는 백신.
인간 흑색종 종양으로부터 기원하는 분리된 세포 개체군으로서,
개체군에서 적어도 30%의 세포가 CD146을 발현하며, 적어도 30%의 세포는 CD271을 발현하거나,
적어도 30%의 세포가 CD146 및 CD271을 공동-발현하며,
세포는 단계 i. 흑색종 종양 샘플중의 세포를 분산시키는 단계,
단계 ii. 저부착성 표면 또는 초-저부착성 표면상에서 배양하는 단계,
단계 iii. 침전시켜 미세구를 수집하는 단계; 및
단계 iv. 미세구로부터 세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 분리된 세포 개체군.
제 11항에 있어서, 방법이 세포를 증량하기 위해 부착성 표면상의 배양 배지에서 배양하여 증량된 세포 개체군을 생성시키는 단계 (단계 v)를 추가로 포함하는 세포.
제 11항에 있어서, 분리된 세포 개체군이, 단계 i의 세포에서 검출가능한 발현과 비교하여,
(i) 하향-조절된 면역억제 분자;
(ii) 상향-조절된 MHC-II; 또는
(iii) 하향-조절된 면역억제 분자와 상향-조절된 MHC-II중 적어도 하나를 갖는 세포.
제 12항에 있어서, 분리된 세포 개체군이, 단계 i의 세포에서 검출가능한 발현과 비교하여,
(i) 하향-조절된 면역억제 분자;
(ii) 상향-조절된 MHC-II; 또는
(iii) 하향-조절된 면역억제 분자와 상향-조절된 MHC-II중 적어도 하나를 갖는 세포.
제 12항에 있어서, 면역억제 분자가 인돌아민-피롤-2,3-디옥시게나제, 종양 성장 인자-베타 및 인터루킨-10 (IL-10) 중 적어도 하나이며, 하향-조절은 단계 i에서 검출가능한 발현 (100%로서 규정)과 비교하여 80% 또는 그 미만의 수준인 세포.
제 11항에 있어서, 흑색종 종양 샘플 및 미세구 중 하나 또는 이 둘 모두로부터의 세포 분산이 첨가된 프로테아제로의 처리를 포함하는 세포.
제 11항에 있어서, 저부착성 표면 또는 초-저부착성 표면상의 배양이 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF)의 존재하에 수행되는 세포.
제 12항에 있어서, 세포를 증량하기 위한 부착성 표면상의 배양이 bFGF를 함유하는 배양 배지에서 수행되는 세포.
제 11항에 있어서, 저부착성 표면 또는 초-저부착성 표면상에서의 배양이 형성된 임의의 종양 줄기 세포 구를 수집하는 것을 포함하며, 수집은 저부착성 표면상에서의 새로운 배지에 수집된 구를 새로 배양하면서 2-3일 마다 수행되는 세포.
제 12항에 있어서, 부착성 표면상에서의 전체 배양 시간이 12-30일, 14-28일 또는 18-24일의 기간으로부터 선택되는 세포.
제 11항의 분리된 세포 개체군으로 로딩된 자가 수지상 세포를 포함하는 백신으로서, 수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 백신.
제 12항의 분리된 세포 개체군으로 로딩된 자가 수지상 세포를 포함하는 백신으로서, 수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 백신.
제 21항에 있어서, 수지상 세포에 로딩되기 전에 종양 세포를 방사선 조사하거나 종양 세포에 핵산 가교제를 첨가함으로써 세포 분열이 방지된 백신.
하나 이상의 흑색종-특이적 항원에 대한 항원-특이적 면역 반응을 자극하는 방법으로서,
생 흑색종 세포를 포함하는 인간 대상체에 제 11항의 분리된 세포 개체군이 로딩된 자가 수지상 세포를 포함하는 백신을 투여하는 것을 포함하며,
수지상 세포 및 인간 종양이 동일한 인간 대상체로부터 유래되는 방법.
제 24항에 있어서, 흑색종-특이적 항원인 MAGE 항원인 방법.
정제된 암 줄기 세포를 생성하는 방법으로서,
(a) 종양 샘플의 세포를 분리함으로써 미리 획득된 세포 부유물을 뉴런 줄기 세포 배지에 침지시키고 초-저부착성 또는 저부착성 컨테이너에서 배양하는 단계;
(b) 암 줄기 세포 구가 형성되게 하는 단계;
(c) 침전에 의해 암 줄기 세포 구를 회수하여 회수된 구를 생성시키는 단계;
(d) 회수된 구를 재-배양하는 단계;
(e) 상기 재-배양 동안 회수된 구가 서로 회합되는 것을 허용하는 단계;
(f) 회합된 구를 분리하여 단일 세포 부유물을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
제 26항에 있어서, 세포 부유물을 생성하기 위해 종양 샘플을 분리하는 단계 전에 종양 샘플을 획득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 26항에 있어서, 증식성 부착 세포 배양을 확립하고 세포를 증량시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 11항에 있어서, 단계 (ii) 배양이 저부착성 표면상에서 수행되지 않는 방법.
제 11항에 있어서, 단계 (ii) 배양이 초-저부착성 표면상에서 수행되는 방법.