CN105051187A - 快速方法生产高纯度癌干细胞和高纯度癌干细胞群 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供可用于给予患有肿瘤性病症的受试者的试剂(包括细胞)和相关方法。所述试剂和方法包括纯度提高的癌干细胞。肿瘤性病症包括黑素瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌和肺癌。

Description

快速方法生产高纯度癌干细胞和高纯度癌干细胞群

优先权

本申请要求2012年10月25日提交的标题为“Rapid Production of High Purity Cancer Stem Cells and Population of High Purity Cancer Stem Cells (高纯度癌干细胞和高纯度癌干细胞群的快速生产)”的美国临时顺序号61/718,643 (其由此以其整体结合到本文中)和2012年8月15日提交的标题为“Rapid Method to Produce High Purity Cancer Stem Cells and Population of High Purity Cancer Stem Cells (生产高纯度癌干细胞和高纯度癌干细胞群的快速方法)”的美国临时顺序号61/683,477 (其也由此以其整体结合到本文中)的优先权。

本公开内容的领域

本公开内容涉及癌干细胞、用于细胞纯化的方法和试剂、用于刺激免疫应答的方法和用于给予受试者的方法。组合物和相关方法可刺激针对肿瘤性病症特有的抗原或针对表达所述抗原的细胞的免疫应答。本公开内容的肿瘤性病症包括黑素瘤、肝癌、胃癌和卵巢癌。

背景

在实体瘤中，少部分细胞具有引发与亲代肿瘤相同的组织学异质性的肿瘤的能力。这些细胞被称为“癌干细胞”。这些亦称为肿瘤引发细胞或癌引发细胞。癌干细胞可通过一组性质定义。第一，它们具有使自身更新的能力。第二，在移植时它们能够建立新的肿瘤。第三，它们可被描述为休眠的或慢循环的(细胞周期)肿瘤细胞。第四，它们可能是造成肿瘤对化学疗法或放射疗法的抗性的原因。第五，它们依赖保持其更新和产生更分化的祖细胞的能力的特殊微环境，其中所述环境保持癌干细胞的未分化状态。这种微环境可包括间充质干细胞、组织相关成纤维细胞和内皮细胞。例如，在结肠癌干细胞的情况下，该微环境包括肿瘤相关成肌纤维细胞的存在。(Schmidt等(2011) Oncotarget. 2:313-320；Borovski等(2011) Cancer Res. 71 :634-639；Korkaya等(2011) J. Clin. Inv. 121: 3804-3809)。体外培养时形成球体(sphere)的能力是又一个特征，其可有助于鉴定特定细胞为癌干细胞(Perego等(2011) J. Inv. Dermatol. 11: 546-547)。癌干细胞的一个非限制性定义是能够复制亲代肿瘤的完全异质性，并且甚至在多次传代后仍继续生长的细胞(Civenni等(2011) Cancer Res. 71: 3098-3109)。

已表明癌干细胞抑制免疫应答，其中抑制机制包括T调节细胞(Treg)的诱导、T细胞活化和增殖的损害(Wei等(2010) Clin. Cancer Res. 16:461-473)。

癌干细胞通过其不断自我更新的能力建立和保持肿瘤块。另外，肿瘤干细胞还在称为上皮-至-间充质变换状态中迁移。自我更新和迁移或侵袭特性的这些特征被认为是癌症毒力的主要原因(Greaves等(2012) Clonal evolution in cancer (癌症的克隆进化). Nature. 481 (7381): 第306-13页)。另外，癌干细胞具有免疫抑制性质(Wu等(2010) Glioma cancer stem cells induce immunosuppressive macrophages/microglia (神经胶质瘤癌干细胞诱导免疫抑制巨噬细胞/小胶质细胞). Neuro. Oncol. 12:1113-1125)。因此，已研究通过例如消灭癌干细胞的试剂和方法，使癌干细胞作为抗癌疗法的靶标。

根据标志物和在小鼠中进行的连续移植异种移植物测定法，在多种实体瘤中鉴定出推定的肿瘤干细胞。在黑素瘤中，几种表面标志物可鉴定肿瘤干细胞，但当在手术切开术后测定时，这些标志物的表达在肿瘤之间是可变的。生物标志物CD271是与神经嵴源的细胞有关的生长因子受体。CD271可用于鉴定推定的黑素瘤干细胞，其中这些黑素瘤干细胞可在系列稀释下在小鼠模型中增殖(Civenni等(2011) Human CD271-positive melanoma stem cells associated with metastasis establish tumor heterogeneity and long-term growth (与转移有关的人CD271-阳性黑素瘤干细胞建立肿瘤异质性和长期生长). Cancer Res. 71: 3098-3109)。

在胚胎发育期间神经嵴细胞的特性是其迁移的能力，一种间充质细胞的特性。保持间充质特性的黑素瘤细胞是攻击性黑素瘤细胞类。CD146 (亦称为黑素瘤细胞粘附分子(MCAM)和MUC18)是黑素瘤进展的标志物(Schlagbauer-Wadl等(1999) Influence of MUC18/MCAM/CD146 expression on human melanoma growth and metastasis in SCID mice (SCID小鼠中MUC18/MCAM/CD146表达对人黑素瘤生长和转移的影响). Int J Cancer. 81: 951-955)。CD146 (MCAM)也由正常的间充质干细胞表达(Rusell等(2010) Stem Cells. 28:788-798)。相同细胞上这两种标志物的共表达表明癌干细胞极具攻击性的形式。

使用非癌干细胞特异性培养基的传统方法一直是劳动密集型的和漫长的，其平均生产时间为3.8个月(范围为0.6-22.3个月，中位值3.1)。这导致治疗时间延长，提交样品的患者中仅29%接受治疗。通常，正常成纤维细胞的过度增殖需要熟练技术人员的大量操作，这使得该方法昂贵。批量制备缺乏大量来自最有攻击性表型(即肿瘤引发细胞或癌干细胞)的抗原。

通过分离并使患者肿瘤样品中的推定的癌干细胞增殖到用于加载树突细胞所需要的量，本公开内容提供超出传统方法的益处。

本公开内容的概述

本公开内容提供可用于给予患有肿瘤性病症的受试者的试剂(包括细胞)和相关方法。所述试剂和方法包括纯度提高的癌干细胞。肿瘤性病症包括黑素瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、乳腺癌和肺癌。

本公开内容提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中：(i)所述群中至少30%的细胞表达CD146，且所述群中至少30%的细胞表达CD271，或(ii)其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，其中百分比值(%)定义为相对于所述群的平均值。此外，提供上述分离的细胞群，其中：表达为至少35%；且共表达为至少35%。此外，提供上述细胞群，其中：表达为至少40%；且共表达为至少40%。此外，提供上述细胞群，其中：表达为至少45%；且共表达为至少45%。另一方面，提供上述细胞群，其中：表达为至少50%；且共表达为至少50%。

还考虑上述分离的细胞群，其中低于5%的细胞是污染的细胞，或其中低于2%的细胞是污染的细胞。

在疫苗实施方案中，提供包含自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞加载了上述分离的细胞群，且其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，所述细胞群包含防止细胞分裂的辐射损伤，或包含防止细胞分裂的核酸交联剂。

在另一个疫苗实施方案中，提供包含自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞加载了来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群的至少一种，其中：(i)该群中至少50%的细胞表达CD146，且该群中至少50%的细胞表达CD271，或(ii)其中至少50%的细胞共表达CD146和CD271，其中百分比值(%)定义为相对于所述群的平均值，且其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，所述细胞群包含防止细胞分裂的辐射损伤，或包含防止细胞分裂的核酸交联剂。

提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，且至少30%的细胞表达CD271，或其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，其中所述细胞通过包括以下步骤的方法制备：步骤i. 将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，步骤iii. 沉降以收集微球体；和步骤iv. 将细胞从微球体中分离。

进一步提供上述方法，所述方法还包括为扩增细胞，在培养基中在粘附表面上培养以产生扩增细胞群的步骤(步骤v.)。

提供上述方法，其中步骤(ii)包括在低粘附表面上培养，或其中步骤(ii)不包括在低粘附表面上培养，或其中步骤(ii)包括在超低粘附表面上培养，或其中步骤(ii)包括在超低粘附表面上和不在低粘附表面上培养。

提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，且至少30%的细胞表达CD271，或其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，其中所述细胞通过包括以下步骤的方法制备：步骤i. 将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，步骤iii. 沉降以收集微球体；和步骤iv. 将细胞从微球体中分离。

提供上述细胞群，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，分离的细胞群具有以下的至少一种：(i)减量调节的免疫抑制分子；(ii)增量调节的MHC-II；或(iii)减量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。

提供上述细胞，其中免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶、肿瘤生长因子-β和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且其中与在步骤i中是可检出的表达(定义为100%)相比，减量调节是至80%或更低的水平。

提供上述细胞，其中将细胞从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散包括用添加的蛋白酶处理。

提供上述细胞，其中在低粘附表面上的培养是在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在下。

提供上述细胞，其中在低粘附表面或超低粘附表面上的培养包括收集已经形成的任何肿瘤干细胞球体，其中所述收集每隔2-3天进行，将所收集的球体在新鲜培养基中在低粘附表面上恢复培养。

在疫苗实施方案中，提供包含加载了上文公开的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

在其它疫苗实施方案中，提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞中之前，通过照射肿瘤细胞或通过将核酸交联剂加入肿瘤细胞中，来防止肿瘤细胞分裂。

提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，且至少30%的细胞表达CD271，或其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，其中所述细胞通过包括以下步骤的方法制备：步骤i. 将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，步骤iii. 沉降以收集微球体，步骤iv. 将细胞从微球体中分离，和步骤v为了扩增细胞在培养基中在粘附表面上培养以产生扩增细胞群。

提供上述方法，其中步骤(ii)包括在低粘附表面上培养，或其中步骤(ii)不包括在低粘附表面上培养，或其中步骤(ii)包括在超低粘附表面上培养，或其中步骤(ii)包括在超低粘附表面上和不在低粘附表面上培养。

提供上述细胞，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，分离的细胞群具有以下的至少一种：(i)减量调节的免疫抑制分子；(ii)增量调节的MHC-II；或(iii)减量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。

提供上述细胞，其中免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶、肿瘤生长因子-β和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且其中与在步骤i中是可检出的表达(定义为100%)相比，减量调节是至80%或更低的水平。

提供上述细胞，其中将细胞从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散包括用添加的蛋白酶处理。

提供上述细胞，其中在低粘附表面上的培养是在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在下。

提供上述细胞，其中为了扩增细胞在粘附表面上的培养是在含有bFGF的培养基中。

提供上述细胞，其中在低粘附表面上的培养包括收集已经形成的任何肿瘤干细胞球体，其中所述收集每隔2-3天进行，将所收集的球体在新鲜培养基中在低粘附表面上恢复培养。

提供上述细胞，其中在粘附表面上培养的总时间选自是12-30天、14-28天或18-24天的期限。

在疫苗实施方案中，提供包含加载了上文公开的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

在其它疫苗实施方案中，提供上述疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，通过照射肿瘤细胞或通过将核酸交联剂加入肿瘤细胞中，来防止肿瘤细胞分裂。

在方法实施方案中，提供用于刺激针对一种或多种黑素瘤特异性抗原的抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括给予包含活的黑素瘤细胞的人类受试者包含加载了上述分离的细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。还提供上述方法，其中黑素瘤特异性抗原是MAGE抗原。

在另一个方法实施方案中，提供用于产生纯化的癌干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将之前通过分离肿瘤样品的细胞而获得的细胞悬液浸入神经元干细胞培养基中，并且在超低粘附容器或低粘附容器中培养；(b)允许癌干细胞球体形成；(c)通过沉降回收癌干细胞球体以产生回收的球体；(d)将回收的球体重新培养；(e)在所述重新培养期间允许回收的球体彼此缔合；(f)使缔合的球体分离以产生单细胞悬液。

提供上述方法，其中步骤(a)包括在低粘附容器中培养，或其中步骤(a)不包括在低粘附容器中培养，或其中步骤(a)包括在超低粘附容器中培养，或其中步骤(a)包括在超低粘附容器中和不在低粘附容器中培养。

此外，提供上述方法，所述方法还包括在分离肿瘤样品以产生细胞悬液的步骤之前获得肿瘤样品的步骤。此外，提供上述方法，所述方法还包括建立增殖性贴壁细胞培养物并扩增细胞的步骤。

本发明提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，且其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，或其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，其中百分比值是相对于该群的平均值。

还提供上述细胞群，其中该群中至少40%的细胞表达CD146，且至少40%的细胞表达CD271，或其中至少40%的细胞共表达CD146和CD271，其中百分比值定义为相对于该群的平均值。

还提供上述细胞群，其中该群中至少50%的细胞表达CD146，且至少50%的细胞表达CD271，或其中至少50%的细胞共表达CD146和CD271，其中百分比值是相对于该群的平均值。

还提供上述细胞，其中在粘附表面上培养导致所述扩增细胞群中免疫抑制分子减量调节。还提供上述细胞，其中在粘附表面上培养导致免疫抑制分子减量调节，且(i)其中免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶、肿瘤生长因子-β和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且(ii)其中在粘附表面上培养之前至少一种免疫抑制分子的表达为100%，且其中在粘附表面上培养之后的减量调节导致处于是以下水平的表达：低于80%、低于70%、低于60%、低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于10%、或低于约80%、低于约70%、低于约60%、低于约50%、低于约40%、低于约30%、低于约20%、低于约10%等。

bFGF，或另一种生长因子，或与一种或多种生长因子组合的bFGF，可各自以下列浓度使用：约0.5 ng/mL、约1.0 ng/mL、约2.0 ng/mL、约5.0 ng/mL、约10 ng/mL、约12 ng/mL、约15 ng/mL、约20 ng/mL、约25 ng/mL、约30 ng/mL、约40 ng/mL、约50 ng/mL，或以下列范围使用：0.5-1.0 ng/mL、1-2 ng/mL、2-4 ng/mL、1-5 ng/mL、5-10 ng/mL、10-12 ng/mL、10-15 ng/mL、15-20 ng/mL、20-25 ng/mL、25-30 ng/mL、20-30 ng/mL、30-40 ng/mL等。还提供排斥性实施方案。例如，本公开内容可不包括这样的方法，且可不包括这样的培养基，其中bFGF以0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、12 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL存在，或以0.5-1.0 ng/mL、1-2 ng/mL、2-4 ng/mL、1-5 ng/mL、5-10 ng/mL、10-12 ng/mL、10-15 ng/mL、15-20 ng/mL、20-25 ng/mL、25-30 ng/mL、20-30 ng/mL、30-40 ng/mL等范围存在。上述备选实施方案，以及上述排斥性实施方案可适用于与非粘附表面(或极低粘附表面，或超低粘附表面)一起使用的培养基。此外，上述备选实施方案，以及上述排斥性实施方案可适用于与粘附表面一起使用的培养基。

此外，提供上述细胞，其中用于培养细胞的培养基无一包含动物产品。还提供上述细胞，其中从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散细胞包括用添加的蛋白酶处理。还提供上述细胞，其中从黑素瘤肿瘤样品中分散细胞包括添加的胶原酶。还提供上述细胞，其中从微球体中分散细胞包括用添加的胰蛋白酶处理。

本公开内容提供分离的细胞群，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞表达CD146，或其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞共表达CD271，或其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞群以至少相同的百分比表达CD146和CD271的每一种，或其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞共表达CD146和CD271两种。

本公开内容包括上述分离的细胞群，其中细胞被细胞球体所包含，其中细胞以细胞球体的形式存在，其中细胞不被细胞球体所包含，其中细胞不是细胞球体的一部分，其中细胞在悬液中，或其中细胞在单层中。

另一方面，本公开内容包括上述分离的细胞群，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的分离的细胞群是癌干细胞。此外，本公开内容提供含有至少1个癌干细胞、至少10个癌干细胞、至少100个癌干细胞、至少1,000个癌干细胞、至少2,000个癌干细胞、至少5,000个癌干细胞、至少10,000个癌干细胞、至少20,000个癌干细胞、至少50,000个癌干细胞、至少100,000个癌干细胞、至少1 x 10⁶个癌干细胞、至少10 x 10⁶个癌干细胞、至少100 x 10⁶个癌干细胞、至少1 x 10⁹个癌干细胞、至少10 x 10⁹个癌干细胞、至少100 x 10⁹个癌干细胞或至少1 x 10¹²个癌干细胞的分离群。

本公开内容考虑了能够刺激针对表达MAGE抗原的细胞的有效免疫应答的上述细胞群，其中使所述分离群与至少一种树突细胞接触，其中所述分离群在体内被至少一种树突细胞处理，且其中有效的免疫应答发生在对将至少一种树突细胞给予受试者起反应的受试者中。

本公开内容进一步包括上述分离的细胞群，其能够刺激针对是黑素瘤癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞或肝细胞癌细胞的细胞的有效的免疫应答，其中使所述分离群与至少一种树突细胞接触，其中所述分离群在体内被至少一种树突细胞处理，且其中有效的免疫应答由于给予至少一种树突细胞而发生在受试者中，其中将树突细胞分别给予患有黑素瘤、肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌或肝细胞癌的受试者。

另一方面，本公开内容提供上述分离的细胞群，其中有效的免疫应答包括以下的一种或多种：(a)针对各个肿瘤的细胞的细胞毒性T细胞应答，(b)通过胞内细胞因子染色测定法、ELISPOT测定法或四聚体测定法测量的应答提高；(c)抗原特异性CD8⁺ T细胞的群体数提高，(d)抗原特异性CD4⁺ T细胞的群体数提高，(e)通过RECIST标准的肿瘤负荷降低，和(f)受试者的生存期延长。

此外，本公开内容提供上述分离的细胞群，其中基本上该群的全部都表达MAGE抗原；其中该群约95%表达MAGE抗原；其中该群约90%表达MAGE抗原；其中该群约80%表达MAGE抗原；其中该群约70%表达MAGE抗原；其中该群约60%表达MAGE抗原；其中该群约50%表达MAGE抗原；其中该群约45%表达MAGE抗原；且其中该群超过约25%表达MAGE抗原。

在另一种主题组合物的示例性实施中，本公开内容包括分离的细胞群，其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞表达MAGE；其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞表达CD146；或其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞共表达CD271；或其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞群以至少相同的百分比表达CD146和CD271的每一种，或其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞共表达CD146和CD271两种。

定义

“给予”当应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽医受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，无限制地是指外源的配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触。“给予”可指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰治疗和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞接触，以及试剂与流体接触，而该流体与细胞接触。“给予”还包括例如细胞用试剂、诊断剂、结合组合物或用另一种细胞进行体外和离体处理。

“激动剂”当涉及配体和受体时，包含刺激受体的分子、分子的组合、复合物或试剂的组合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的激动剂可包括GM-CSF、GM-CSF的突变型蛋白或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF的生物功能的小分子或刺激GM-CSF受体的抗体。拮抗剂，当涉及配体和受体时，包括抑制、抵消、减量调节受体和/或使受体脱敏的分子、分子的组合或复合物。“拮抗剂”包括抑制受体的组成型活性的任何试剂。组成型活性是在配体/受体相互作用不存在时是明显的活性。“拮抗剂”还包括抑制或防止受刺激的(或调节的)受体活性的任何试剂。举例来说，在没有暗示任何限制的情况下，GM-CSF受体的拮抗剂包括与配体(GM-CSF)结合并防止其与受体结合的抗体，或与受体结合并防止配体与受体结合的抗体，或其中抗体将受体锁定在无活性的构象上。

除非另有明确说明或上下文另有说明，否则术语“表达”包括下列方面。表达包括mRNA的生物合成、多肽生物合成、例如通过翻译后修饰的多肽活化或通过改变亚细胞位置或通过募集到染色质的表达的活化。换句话说，“表达提高”包括生物合成提高，或由磷酸化引起的活性提高，或由自细胞溶胶迁移到核引起的活性提高。

抗原呈递细胞(APC)是用于将抗原呈递给T细胞的免疫系统细胞。APC包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区Kupffer细胞、小胶质细胞、朗格汉斯细胞、T细胞和B细胞(参见例如Rodriguez-Pinto和Moreno (2005) Eur. J. Immunol. 35:1097-1105)。树突细胞发生在至少两个谱系中。第一谱系包括pre-DC1、髓样DC1和成熟DC1。第二谱系包括CD34⁺⁺CD45RA-早期祖多能细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺⁺CD4⁺ IL-3Ralpha⁺⁺ pro-DC2细胞、CD4+CD11c^-浆细胞样pre-DC2细胞、淋巴样人DC2浆细胞样衍生DC2和成熟DC2 (参见例如Gilliet和Liu (2002) J. Exp. Med. 195:695-704；Bauer等(2001) J. Immunol. 166:5000-5007；Arpinati等(2000) Blood 95:2484-2490；Kadowaki等(2001) J. Exp. Med. 194:863-869；Liu (2002) Human Immunology 63:1067-1071；McKenna等(2005) J. Virol. 79:17-27；Rossi和Young (2005) J. Immunol. 175:1373-1381；Banchereau和Palucka (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:296-306)。

“有效量”包括而不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学病况或病症的症状或病征的量。除非另有明确说明或通过上下文说明，否则“有效量”不限于足以改善病况的最小量。在没有暗示任何限制的情况下，可通过生物标志物或通过临床参数，测量疾病或病症的严重程度，以及预防、治疗或减轻疾病或病症的治疗的能力。生物标志物包括血细胞计数、血清、尿液或脑脊液中的代谢物水平、肿瘤细胞计数、癌干细胞计数、肿瘤水平。肿瘤大小和数目可通过RECIST标准测定(Eisenhauer等(2009) Eur. J. Cancer. 45:228-247)。表达标志物包括mRNA的基因表达或基因扩增、抗原的表达和多肽的表达。在没有暗示任何限制的情况下，临床参数包括无进展生存期(PFS)、6月PFS、无病生存期(DFS)、至疾病进展时间(TTP)、至远端转移时间(TDM)和总体生存。

被“标记的”组合物是通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学方法直接或间接可检测的。例如，有用的标记包括例如用于酶联免疫测定法或fluorettes的³²P、³³P、³⁵S、¹⁴C、³H、¹²⁵I、稳定同位素、表位标签荧光染料、电子致密试剂、底物或酶(参见例如Rozinov和Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728)。

在没有暗示任何限制的情况下，术语如在即“来源于人黑素瘤肿瘤”的细胞群中的“来源于”包括来源于来自肿瘤的单细胞的细胞群，且其中细胞群如下产生：通过培养单细胞经细胞分裂以产生细胞群。还包括来源于来自一个肿瘤的多个(数目大于1)细胞的细胞群，且其中细胞数经培养通过细胞分裂以产生更多数目的细胞。还包括这样的细胞群，其来源于自患者的一个特定肿瘤获得的一个或多个细胞，还来源于自同一患者的不同肿瘤获得的一个或多个细胞，其中最终产生的细胞群代表来自所有收获肿瘤的混合肿瘤细胞。所收获的肿瘤数目可为1、2、3、4个或更多个。术语“来源于人黑素瘤肿瘤”的细胞群包括用作起始细胞的恰好不存在于某一肿瘤中的黑素瘤肿瘤细胞，即以黑素瘤肿瘤细胞开始，作为独立细胞存在，例如存在于淋巴系统或循环系统中的细胞。术语“来源于”包括而不限于这样收获的肿瘤细胞：其通过除去污染细胞经过细胞纯化、经过在培养基中培养、经过在冰箱中保存、经过在培养基中扩增、经过一个或多个球体的体外形成等。

癌症免疫学

癌症因缺乏针对癌的有效免疫应答而著称。免疫应答缺乏可产生于例如许多肿瘤抗原是“自身抗原”的事实，产生于缺乏肿瘤细胞表达MHC而必然缺乏肿瘤细胞呈递肿瘤抗原，产生于巨噬细胞与其中巨噬细胞表达降低免疫应答的细胞因子的肿瘤的缔合，并产生于T调节细胞(Treg)的免疫抑制活性。缺乏针对肿瘤的免疫应答还产生于肿瘤细胞趋于不表达刺激先天性免疫应答的分子的事实，所述分子即刺激toll样受体(TLR)或核苷酸-结合寡聚结构域(NOD)样受体的分子。癌症包括实体瘤以及血液学癌症，例如白血病和骨髓增生异常综合症。

癌症可归类为免疫系统病症。这种分类基于这样的事实，即至少在某些受累人群中，免疫系统无法对癌症起最适反应。癌细胞因为以下原因避开免疫系统的攻击。第一，与感染性生物的情况形成鲜明对比，癌细胞主要由自身抗原组成。被归类为癌抗原的一些抗原实际上是过量表达的正常抗原，或仅在多肽链的一个或两个氨基酸上具有突变的正常抗原。第二，癌细胞减量调节主要组织相容性复合体(MHC)，因此通过MHC几乎不呈递肿瘤细胞衍生的肽。第三，癌细胞和缔合的肿瘤相关巨噬细胞，表达抑制免疫应答的细胞因子(参见例如Yu等(2007) Nature Rev. Immunol. 7:41-51)。这种抑制由例如通过癌细胞或缔合的巨噬细胞分泌白介素-10 (IL-10)引起。第四，与感染的情况不一样，癌细胞不提供任何免疫佐剂。病原体表达多种天然存在的免疫佐剂，其呈toll样受体(TLR)激动剂和NOD激动剂的形式(参见例如Kleinnijenhuis等(2011) Clin. Dev. Immunol. 405310 (12页))。一般而言，树突细胞的最佳活化需要免疫佐剂与一种或多种toll样受体(TLR)接触。这是指由树突细胞表达的TLR。因此，不可能的情况是任何癌细胞或癌细胞抗原(在没有更多的情况下)可最优地激活任何树突细胞。并且在不激活树突细胞的情况下，树突细胞和T细胞(免疫突触)之间的接触无法引起T细胞的最佳活化。

在示例性的实施中，本公开内容包括用一种或多种免疫佐剂激活树突细胞(DC)的试剂和方法，所述免疫佐剂例如toll样受体(TLR)激动剂，例如CpG-寡核苷酸(TLR9)、咪喹莫德(TLR7)、聚(I:C) (TLR3)、吡喃葡糖基脂质A (TLR4)、胞壁质(TLR2)、鞭毛蛋白(TLR5)以及佐剂例如CD40激动剂，例如CD40-配体；或细胞因子、干扰素-γ、前列腺素E2等。参见例如授予Noelle等人专利权的美国专利号7,993,659；授予Kedl等人专利权的US 7,993,648；授予Dubensky等人专利权的US 7,935,804，其每一个均通过引用以其整体结合到本文中。本公开内容包括体外用一种或多种上述佐剂试剂处理DC，或另外或备选，将佐剂给予人类受试者、动物受试者或兽医受试者。

免疫系统包括细胞免疫、体液免疫和补体反应。细胞免疫包括涉及树突细胞、CD8⁺ T细胞(细胞毒性T细胞；细胞毒性淋巴细胞)和CD4⁺ T细胞(辅助性T细胞)的细胞和事件网。树突细胞(DC)获取多肽抗原，其中这些抗原可从DC外部获取，或通过感染性生物从DC内部生物合成。DC加工所述多肽，产生长为约10个氨基酸的肽，将该肽传送至MHC I类或MHC II类以形成复合体，并将复合体在DC表面穿梭。当携带MHC I类/肽复合体的DC接触CD8⁺ T细胞时，结果便是CD8⁺ T细胞激活并增殖。至于MHC II类的作用，当携带MHC II类/肽复合体的DC接触CD4⁺ T细胞时，结果便是CD4⁺ T细胞的激活并增殖(Munz等(2010) Curr. Opin. Immunol. 22:89-93；Monaco (1995) J. Leukocyte Biol. 57:543-547；Robinson等(2002) Immunology 105:252-262)。虽然将抗原呈递给T细胞的树突细胞可“激活”该T细胞，但激活的T细胞也许不能够发动有效的免疫应答。因CD8⁺ T细胞引起的有效免疫应答常常需要多种相互作用的一种或多种对DC的较早刺激。这些相互作用包括CD4⁺ T细胞与DC直接接触(通过CD4⁺ T细胞的CD40配体与DC的CD40受体接触)，或TLR激动剂与树突细胞的toll样受体(TLR)之一直接接触。

体液免疫是指B细胞和抗体。B细胞转化成浆细胞，而浆细胞表达并分泌抗体。幼稚B细胞以其不表达标志物CD27而著称，而抗原特异性B细胞的确表达CD27 (Perez-Andres等(2010) Cytometry Part B 78B (Suppl. 1) S47-S60)。分泌的抗体随后可与驻留在肿瘤细胞表面的肿瘤抗原结合。结果便是受感染的细胞或肿瘤细胞变得被抗体加标签。在抗体与受感染的细胞或肿瘤细胞结合的同时，结合的抗体介导杀死受感染的细胞或肿瘤细胞，其中杀死由NK细胞引起。虽然NK细胞未以T细胞被配置成识别靶抗原的方式而被配置成识别特异性靶抗原，但是NK细胞结合抗体恒定区的能力，使得NK细胞能够特异性地杀死被抗体加标签的细胞。NK细胞的抗体识别受与抗体Fc部分结合的Fc受体(NK细胞的Fc受体)介导。这种类型的杀死被称为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。NK细胞还可杀死不依赖于ADCC机制的细胞，其中这种杀死需要靶细胞中的MHC I类表达丧失或缺乏(参见例如Caligiuri (2008) Blood 112:461-469)。

在一些示例性的实施中，本公开内容提供提高NK细胞介导的杀死癌干细胞的试剂和方法。NK细胞可介导针对癌干细胞的细胞毒性(参见例如Jewett和Tseng (2011) J. Cancer. 2:443-457)。不希望受任何特定机制的束缚，本公开内容包括给予癌干细胞抗原，或给予加载癌干细胞抗原的树突细胞，其中抗原刺激特异性识别一种或多种癌干细胞抗原的抗体的产生，且其中抗体介导ADCC。短语加载抗原，是指树突细胞俘获活细胞、俘获坏死细胞、俘获死细胞、俘获多肽或俘获肽等的能力。本公开内容包括通过交叉呈递的俘获。还包括使用不是树突细胞的抗原呈递细胞(例如巨噬细胞或B细胞) (参见例如O'Neill等(2004) Blood. 104:2235-2246；Sabado和Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56)。

可采用“迟发型超敏反应”技术来区分主要涉及细胞免疫或主要涉及体液免疫的免疫应答。迟发型超敏反应的阳性信号表明细胞反应(参见例如Roychowdhury等(2005) AAPS J. E834-E846)。

本公开内容包括差异胰蛋白酶消化，例如使用0.25%胰蛋白酶处理10分钟。还包括完全胰蛋白酶消化，例如用0.25%胰蛋白酶孵育120分钟(Liu等(2012) PLoS ONE. 7:e35720 (14页)。另一方面，本公开内容不包括使用添加的胰蛋白酶、使用差异胰蛋白酶消化或使用完全胰蛋白酶消化的试剂或方法。本公开内容包括试剂或方法，还不包括描述于以下文献的试剂或方法的一种或多种：Edinger等人的US2012/0122215、Harira的2012/0020936、Abbot等人的2011/0250182，所述各文献通过引用以其整体结合到本文中。Selvan等(2010) Melanoma Res. 20:280-292，公开了用于使贴壁细胞剥离的试剂和方法。

本公开内容提供药物、试剂、包括诊断试剂盒在内的试剂盒，其中药物、试剂和试剂盒包含树突细胞、抗体或抗原。还提供用于给予包含至少一种树突细胞和至少一种抗原的组合物的方法、用于刺激抗体形成的方法、用于刺激ADCC的方法、用于刺激补体依赖性细胞毒性的方法及用于测定患者适宜性、用于在临床试验或普通医学治疗的情况下确定患者纳入/排除的标准和用于预测对药物或试剂的反应的方法和试剂盒。描述了补体依赖性细胞毒性(参见例如Goodman等(1990) J. Clin. Oncol. 8:1083-1092；Cheson (2010) J. Clin. Oncol. 28:3525-3530)。本公开内容的药物组合物、试剂和相关方法包括CD83阳性树突细胞，其中CD83通过加载IFN-γ处理的癌细胞而被诱导。在本公开内容的CD83方面，CD83被诱导达至少2%、至少3%、至少4%、6%、7%、8%、9%、10%等。另一方面，不包括这样的DC试剂或DC相关方法，其中通过加载IFN-γ处理的癌细胞无法可检测地诱导树突细胞的CD83。培养基、标记抗体、细胞培养补充物和其它试剂可获自例如Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Life Technologies, Carlsbad, CA和GIBCO, Grand Island, NY。KO DMEM培养基是“Knockout Dulbecco改良的Eagle培养基”。B27培养基描述于例如Stevens等(2009) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 106:16568-16573和Brewer等(1993) J. Neurosci. Res. 35:567-576。Glutamax®是L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。

加载树突细胞

树突细胞(DC)可用黑素瘤肿瘤细胞抗原加载，可制备DC疫苗，并可通过一种或多种给药途径将DC疫苗给予人类受试者。参见例如Selvan等(2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383；Sabado和Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56；Hirschowitz等(2004) J. Clin. Oncol. 22:2808-2815；O'Neill等(2004) Blood. 104:2235-2246；Schwaab等(2009) Clin. Cancer Res. 15:4986-4992；Zhong等(2007) Clin. Cancer Res. 13:5455-5462。

本公开内容提供其中肿瘤细胞被灭活(例如通过放射、核酸交联剂、多肽接头或这些的组合)的组合物和方法。一种具体的核酸烷基化剂(alkylator)是β-丙氨酸,N-(吖啶-9-基),2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。示例性的交联剂，例如与紫外线(UVA)照射组合的补骨脂素具有交联DNA但保留蛋白质未被修饰的能力。核酸靶向的化合物可为4'-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4,5',8-三甲基补骨脂素(“S-59”)。可用150微摩尔的补骨脂素S-59和3 J/cm² UVA光(FX 1019照射装置，Baxter Fenwal，Round Lake，IL)使细胞灭活。参见Dubensky的美国专利号7,833,775和Dubensky的7,691,393，其通过引用以其整体结合到本文中。

肿瘤抗原

本公开内容提供用于刺激针对肿瘤抗原的免疫应答、用于刺激针对表达肿瘤抗原的细胞的免疫应答、用于给予人或兽医受试者和用于诊断人或兽医受试者等的试剂和方法。本公开内容提供用于刺激针对表达以下一种或多种的细胞的免疫应答的试剂和相关方法：例如p53、MUC1、NY-ESO-1、c-myc、存活蛋白(surviving)、p62、细胞周期蛋白B1和Her2/neu (参见例如Reuschenbach等(2009) Cancer Immunol. Immunother. 58:1535-1554)。在一些示例性的实施中，免疫应答针对表达所述一种或多种抗原的细胞，但不必对该细胞有特异性(免疫应答也针对其它细胞)。在其它示例性的实施中，免疫应答针对表达所述一种或多种抗原的细胞，且其中免疫应答需要识别所述抗原。在另外其它示例性的实施中，免疫应答针对表达所述一种或多种抗原的细胞，且其中免疫应答不需要识别所述抗原。

本公开内容提供用于刺激针对表达热激蛋白(HSP)的细胞的免疫应答的试剂和方法。针对HSP的免疫疗法针对结肠直肠癌、黑素瘤和肾细胞癌是有效的(参见例如Buonaguro等(2011) Clinical Vaccine Immunol. 18:23-34)。包括用于刺激针对癌-睾丸抗原、或针对分化抗原、或针对过量表达的抗原、或针对肿瘤相关糖抗原的免疫应答的试剂和方法。在其它示例性的实施中，提供刺激针对表达MUC1的肿瘤性病症的免疫应答的试剂和方法，所述MUC1为一种与乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌相关的抗原(Reuschenbach等(2009) Cancer Immunol. Immunother. 58:1535-1554)。还提供刺激针对表达p53的肿瘤性病症的免疫应答的试剂和方法，所述p53为一种与肺癌、结肠直肠癌、食管癌和卵巢癌有关的抗原(Reuschenbach等，同上)。此外，提供刺激针对表达Her2/neu的肿瘤性病症的免疫应答的试剂和方法，所述Her2/neu为一种与乳腺癌、结肠直肠癌和卵巢癌有关的抗原。在示例性的实施中，本公开内容提供用于刺激针对下列抗原或针对表达所述抗原的细胞的免疫应答的试剂和方法，其中所述抗原为MAGE家族抗原。MAGE意指“黑素瘤相关抗原”。MAGE家族抗原与黑素瘤(Selvan等(2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383)以及与肝细胞癌(参见例如Mou等(2002) Brit. J. Cancer. 86:110-116)、卵巢癌(Zhang等(2010) BMC Cancer. 10:163 (6页)、非小细胞肺癌(NSCLC) (Gridelli等(2009) The Oncologist. 14:909-920；Sienel等(2007) Clin. Cancer Res. 13:3840-3847)和结肠直肠癌(Toh等(2009) Clin. Cancer Res. 15:7726-7736)有关。

CD133是一种由多种癌症表达的抗原，包括黑素瘤、结肠直肠癌、尤因肉瘤、肝细胞癌(HCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌(Perego等(2011) J. Inv. Dermatol. 11: 546-547；Cao,等(2011) BMC Gastroenterol. 11: 71 (11页)；Lorico和Rappa (2011) 135039 (6页)；Ferrandina等(2009) BMC Cancer. 9:221 (9页))。本公开内容提供表达CD133的癌干细胞群；至少一种加载表达CD133的癌干细胞的树突细胞；用于制备加载表达CD133的癌干细胞的树突细胞的方法；和将至少一种加载表达CD133的癌干细胞的树突细胞给予患有表达CD133生物标志物的癌症的受试者的方法。

至于ABCB5抗原，本公开内容提供这样试剂和方法，其中表达ABCB5的癌干细胞与树突细胞接触或加载到树突细胞中，且其中将加载的树突细胞给予患有表达ABCB5的癌症的人类受试者或动物。ABCB5表达与例如黑素瘤癌干细胞(Schatton等(2010) Cancer Res. 70:697-708)以及与结肠直肠癌(Wilson等(2011) Cancer Res. 71: 5307-5316)有关。相关方法包括诱导针对表达ABCB5的细胞、优选表达ABCB5的癌干细胞的免疫应答。

本公开内容还包括与下列抗原有关的试剂和方法：醛脱氢酶(ALDH)，例如ALDH1A3；ABCB1 (P-糖蛋白/MDR1)；BCL2A1；SNAI2 (slug)；ATM、CHEK1和CHEK2。还包括与CD44、CD133、CD24、CD49f、ESA、CD166和谱系组(lineage panel)有关的试剂和方法。谱系组包括CD45、CD31、CD3、CD64、CD10、CD16、CD18和GPA；CD45、CD31、CD140a和Ter119；CD45、CD31和CD140a。通常谱系组包括CD45、CD31、CD3、CD64、CD10、CD16、CD18、GPA、CD140a和Ter119的一种或多种(Diehn等人的US 2011/0124032，其通过引用以其整体结合到本文中)。

还包括对刺激针对下列抗原的一种或多种或针对表达下列抗原的一种或多种的细胞的免疫应答是特异性的试剂和相关方法：MAGE-A亚型，例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3/6、MAGE-A4和MAGE-A12 (参见例如Sienel等，同上)。在备选的示例性实施中，本公开内容提供刺激针对胞间粘附分子-1 (ICAM-1)、或针对表达ICAM-1的细胞、或针对肿瘤细胞、或针对被鉴定具有一种或多种ICAM-1的受试者的癌症的试剂和相关方法。ICAM-1相关癌症包括黑素瘤、结肠癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌和肝细胞癌(Shih等(2004) Korean J. Intern. Med. 19:48-52)。此外，本公开内容提供用于刺激针对下列抗原、或针对表达下列抗原的细胞、或针对肿瘤细胞、或针对鉴定具有sHLA-E的受试者的癌症的免疫应答的试剂和方法。sHLA-E是一种与黑素瘤、结肠直肠癌和肾癌有关的非经典的MHC I类分子(Allard等(2011) PLoS One. 6:e21118 (9页))。还提供用于刺激针对下列抗原、或针对表达下列抗原的细胞、或针对表达下列抗原的肿瘤细胞、或针对表达下列抗原的受试者的癌症的应答的试剂和方法。所述抗原是HERV-K gag相关NGO-Pr-54。该抗原与卵巢癌、前列腺癌和白血病有关(Ishida等(2008) Cancer Immunol. 8:15 (10页))。

本公开内容提供用于刺激针对是如下的癌细胞、或针对是如下的受试者的癌症的免疫应答的试剂和相关方法。示例性的实施包括而不限于：(1)黑素瘤和结肠直肠癌；(2)黑素瘤和卵巢癌；(3)黑素瘤和肺癌；(4)黑素瘤和肝癌；(5)黑素瘤、结肠直肠癌和卵巢癌；(6)黑素瘤、结肠直肠癌和肺癌；(7)黑素瘤、结肠直肠癌和肝癌；(8)黑素瘤、肺癌和肝癌；(9)黑素瘤、卵巢癌和肺癌；(10)黑素瘤、卵巢癌和肝癌；(11)黑素瘤、卵巢癌、肺癌和肝癌；(12)黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌和肝癌；(13)黑素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌和肝癌；(14)黑素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌和肺癌；以及(15)黑素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌、肺癌和肝癌。

排斥性的示例性实施是不诱导或表明无法诱导预定水平的免疫应答的试剂和方法。例如，可针对是黑素瘤细胞、结肠直肠癌细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞的癌细胞的一种或多种，来评价免疫应答的预定水平。作为非限制性定义，预定水平刺激可为例如是低于20%、低于15%、低于10%、低于5%、低于2%、低于1%最高水平的刺激。最高水平可用通过RECIST标准显示最大反应的人类受试者的比例表示、用人类受试者或实验动物中癌干细胞的杀死表示、用总体生存表示、用无进展生存期(PFS)表示、用至疾病进展时间(TTP)表示、用最大细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应信号表示、用最大ELISPOT测定信号表示、用来自抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的最大结果表示、用T细胞活化表示、用T细胞扩增表示、用胞内细胞因子染色(ICS)测定法表示、用四聚体测定法表示等(参见例如Nomura等(2008) Cytometry A. 73:984-991)。例如，在一个示例性的实施中，不包括刺激低于预定最高水平20%的试剂和方法。详细描述了临床终点(例如PFS、TTP、至远端转移时间、总体生存)和用于解释这些终点的技术(Brody (2012) Clinical Trials: Study Design, Endpoints and Biomarkers. Elsevier, San Diego, CA)，且这些是本公开内容的一部分。

本公开内容所包括的试剂、方法和技术包括Sugaya等人的US 2011/0313229，其涉及癌干细胞；Weismann和Boiko的WO 2011/041453，其涉及黑素瘤癌干细胞的分离；以及Blot-Chabaud等人的US 2011/0286963，其涉及CD146。这些的每一个通过引用以其整体结合到本文中。

可通过疏水材料和非生物淤积材料，例如聚苯乙烯、薄的琼脂涂料、硅氧烷、含氟聚合物、聚乙烯等，提供非贴壁条件、非贴壁板、非贴壁涂料等。参见例如Tsai等(2009) J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 20:1611-1628；授予Toreki等人专利权的US 7,790,217、授予Zamora等人专利权的US 6,342,591、Jiang等人的US 2011/0282005，其每一份均通过引用以其整体结合到本文中。Kim等(2006) Lab Chip. 6:1432-1437公开了用于非贴壁的聚乙二醇(PEG)。超低附着表面包括Corning Ultra-Low Attachment Surface (Corning, Inc.)和Thermo Scientific's Nunc HydroCell Surface。

在示例性的实施中，本公开内容提供可促进非贴壁条件的添加剂，例如是膜扩展剂(membrane expander)的添加剂、表面活性剂、Pluronic F-68、Tween-80或聚乙烯醇(PVA) (Sigma Aldrich目录, St. Louis, MO)。

在示例性的实施中，可通过丁酸钠、COX-2抑制剂、反义核酸、si-RNA或微小RNA，实现吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶的减量调节。可通过反义核酸、si-RNA或微小RNA影响IL-10或TGF-β的减量调节。Liu等(2011) FEBS Lett. 585:1963-1968公开了微小RNA减量调节IL-10表达的用途。Yu等(2012) Carcinogenesis. 33:68-76公开了微小RNA通过减量调节TGF-β受体以降低转化生长因子-β (TGF-β)的功效的用途。Lang等(2011) Biochim. Biophys. Res. Commun. 409:448-453报告了小干扰RNA (siRNA)抑制TGF-β表达的用途。

在示例性的实施中，以单细胞开始进行扩增过程。在其它示例性的实施中，以约10个细胞、约20个细胞、约50个细胞、约100个细胞、约200个细胞、约500个细胞、约1000个细胞、约2000个细胞、约5000个细胞、约10000个细胞、约20000个细胞、约50000个细胞等开始扩增过程。

提供排斥性的示例性实施。在没有暗示任何限制的情况下，本公开内容的试剂和方法可排除其中CD146的表达低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的细胞群、组织、器官或受试者等。此外，可排除其中CD271的表达低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的细胞群、组织、器官或受试者等。在又一个排斥性的示例性实施中，可排除其中CD146和CD271两者的共表达(对于所测量的每个细胞，在确切相同的细胞中共表达)低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的细胞群、组织、器官或受试者等。此外，可排除其中CD146和CD271两者的表达(在确切相同的细胞中共表达，或两者只在整个细胞群中表达)低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的细胞群、组织、器官或受试者等。

术语“共表达”是指其中指定的标志物，例如基因、多肽、抗原等等在确切相同的细胞中表达，并且还同时表达的情况。至于同时共表达，共表达的时间范围可为约5分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约4天、约8天等。共表达的时间范围可为至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少60分钟、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少8天、至少1周、至少2周等。

本公开内容提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少20%的细胞表达CD146，且至少20%的细胞表达CD271，或其中至少20%的细胞共表达CD146和CD271。还提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，且至少30%的细胞表达CD271，或其中至少40%的细胞共表达CD146和CD271。还提供来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少40%的细胞表达CD146，且至少30%的细胞表达CD271，或其中至少40%的细胞共表达CD146和CD271。本公开内容包括而不限于作为单层或其它层存在的细胞群、作为悬液存在的细胞群、作为一个或多个球体存在的细胞群等。

可检测地表达 CD146 或 CD271 中的唯一一个的细胞群

本公开内容包括表达CD146但不表达CD271的细胞群。此外，本公开内容包括表达CD271但不表达CD146的细胞群。在实施方案中，包括这样的细胞群，其中至少20%的细胞表达CD146，其中至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%的细胞表达CD146但不表达CD271。此外，包括这样的细胞群，其中至少20%的细胞表达CD146、其中至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%的细胞表达CD1271但不表达CD146。包括培养上述细胞的方法、分离该细胞的方法、将该细胞加载到树突细胞上的方法、包含上述细胞的疫苗、包含加载了上述细胞的树突细胞的疫苗、用于将疫苗给予受试者的方法等。

作为CD146+/CD271-的黑素瘤细胞鉴定间充质癌细胞，作为CD146+/CD271+的黑素瘤细胞鉴定是具有间充质特性的癌干细胞的细胞。本公开内容提供细胞群和相关方法，其中所述群中至少20%的细胞为CD146+/CD271-，至少22%、至少24%、至少26%、至少28%、至少30%、至少34%、至少38%、至少42%、至少46%、至少50%、至少54%、至少58%、至少62%、至少66%、至少70%、至少74%、至少78%或至少82%的细胞为CD146+/CD271-。本公开内容提供细胞群和相关方法，其中所述群中至少20%的细胞为CD146-/CD271+，至少22%、至少24%、至少26%、至少28%、至少30%、至少34%、至少38%、至少42%、至少46%、至少50%、至少54%、至少58%、至少62%、至少66%、至少70%、至少74%、至少78%或至少82%的细胞为CD146-/CD271+。在排斥性实施方案中，本公开内容可排除未能满足上文公开的百分比之一的任何细胞群。

排斥性实施方案

可排除单细胞、细胞群、作为单层或其它层存在的细胞群、作为悬液存在的细胞群、作为一个或多个球体存在的细胞群等，其中CD146的表达在低于10%的细胞中发生，在低于20%、低于30%、低于40%、低于50%、低于60%、低于70%、低于80%细胞中发生。可排除单细胞、细胞群、作为单层或其它层存在的细胞群、作为悬液存在的细胞群、作为一个或多个球体存在的细胞群等，其中CD271的表达在低于10%的细胞中发生，在低于20%、低于30%、低于40%、低于50%、低于60%、低于70%、低于80%的细胞中发生。可排除单细胞、细胞群、作为单层或其它层存在的细胞群、作为悬液存在的细胞群、作为一个或多个球体存在的细胞群等，其中CD146和CD271各自的表达在低于10%的细胞中发生，在低于20%、低于30%、低于40%、低于50%、低于60%、低于70%、低于80%的细胞中发生。可排除单细胞、细胞群、作为单层或其它层存在的细胞群、作为悬液存在的细胞群、作为一个或多个球体存在的细胞群等，其中CD146和CD271各自的共表达在低于10%的细胞中发生，在低于20%、低于30%、低于40%、低于50%、低于60%、低于70%、低于80%的细胞中发生。在这种情况下，共表达意味着，在分析指定的具体细胞的情况下，所述具体细胞同时可检出地表达CD146和CD271。可排除任何黑素瘤细胞群，其中高于1%、高于2%、高于4%、高于5%、高于10%、高于15%、高于20%、高于30%、高于40%、高于50%、高于60%、高于70%、高于80%、高于90%的黑素瘤细胞不是黑素瘤癌干细胞。

附图简述

图1. 纯化过程不同阶段的黑素瘤干细胞的流式细胞术表征。

图2. 显示自体黑素瘤细胞系中CD146和CD271的表达百分比的图表。

图3. 不同黑素瘤细胞系的表型(CD146；CD271)。

图4. 酶消化中的黑素瘤干细胞、通过标准方法制备的黑素瘤干细胞和通过球体形成方法制备的黑素瘤细胞的流式细胞术结果(CD146；CD271)。

图5. 进行不同处理的黑素瘤细胞的流式细胞术结果(CD146；CD271) (MHC II类；MHC I类)。

图6. 采用方法1的纯化程序的示图。

图7. 采用方法2的纯化程序的示图

图8. 纯化过程中癌干细胞的富集。图8A显示直方图。图8B显示流式细胞术结果。

图9. 比较以下表达的直方图：(1)团块肿瘤细胞中的CD146和CD271，(2)本公开内容的“癌干细胞”，和(3)通过标准方法产生的“纯化的细胞系”。

如本文(包括随附权利要求书)所用，措词的单数形式，例如“a”、“an”和“the”包括其相应的复数所指物，除非上下文中另有明确说明。本文引用的所有参考文献通过引用予以结合，其程度就像各个出版物、专利、已公开的专利申请和序列表以及所述出版物和专利文献中的附图和制图具体而单独指明通过引用予以结合一样。

进一步描述

皮肤黑素瘤的分期

可将本公开内容的药物或试剂给予黑素瘤患者，其中诊断出I期、II期、III期或IV期的黑素瘤(Mohr等(2009) Ann. Oncology (Suppl. 6) vi14-vi21)。例如，I期是指患有原发性黑素瘤而无区域或远端转移证据的患者。II期包括没有淋巴性疾病或远端转移证据的患者，其中患者的特征还在于例如在上皮上的溃疡厚度大于1 mm且小于或等于2mm病变，或上皮溃疡厚度大于2mm且小于或等于4mm的病变。III期黑素瘤包括伴病理学上记录的局部淋巴结受累或运送中(in-transit)的转移或卫星转移(satellite metastases)的病变，其中患者可有例如1、2、3或4个或更多个受累淋巴结。IV期黑素瘤通过存在远端转移来限定，其中转移仅位于远端皮肤、皮下组织或淋巴结；其中转移包括肺转移；或其中转移包括所有其它的内脏部位。

本公开内容包括预防性的给药方法，即用于尚未诊断或从未诊断患有黑素瘤的受试者。包括其中受试者早期诊断患有黑素瘤和早期成功治疗以根除黑素瘤(或已经历自发性完全缓解)的给药方法，和在根除后预防性地使用给药的给药方法。

本公开内容提供产生危险比(HR)低于1.0、HR低于0.9、HR低于0.8、HR低于0.7、HR低于0.6、HR低于0.5、HR低于0.4、HR低于0.3等生存数据的药物组合物或药物试剂、给药的相关方法和治疗方法。本公开内容产生总体生存数据、无进展生存期数据、至疾病进展时间数据等。还提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月PFS。此外，提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6月总体生存。

另外，提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的1年(或2年) PFS。此外，提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的1年(或2年)总体生存(参见例如U.S. Dept. of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologies (2005年4月))。

生物标志物和流式细胞术

黑素瘤癌干细胞的研究公开了用于检测标志物例如CD271 (Civenni等(2011) Cancer Res. 71: 3098-3109)、CD146、CD146 (Perego等(2010) J. Inv. Dermatol. 130:1877-1886)和ABCB5 (Schatton等(2011) Cancer Res. 70:697-708)的试剂和方法。其它目标生物标志物包括CD20、CD133、CD44、CD90、CD24、EpCAM、ALDH1和ABCB5 (参见例如Wang和Jacob (2011) Genome Medicine. 3:11 (6页)；Schlaak等(2012) Oncotarget. 3:22-30)。

使用针对表面标志物的单克隆抗体(BD Pharmingen San Diego，CA：BD) Pharmingen，进行细胞群表型表征。在每次运行前，使用CaliBRITE流式细胞术校准(BD Pharmingen)，在整个流式细胞术数据采集期间，使用相同的仪器设置。流式细胞术用Beckton-Dickenson FACS Calibur®流式细胞仪进行。可使用例如通过流式细胞术定量的荧光抗体，来测量细胞表达的多种多肽(参见例如Macey (2010) Flow Cytometry Principles and Applications, Humana Press；Hawley (2010) Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press；Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, Wiley-Liss)。

通过流式细胞术对本公开内容的细胞系的表征证实了被描述为黑素瘤干细胞标志物的间充质和神经嵴源(分别为CD146和CD271)的细胞的富集。这些细胞系相对于起始大部分酶消化样品的比较证实，它们在纯化和扩增后富含CD146和/或CD271 (78.5 ± 8.3%与26.9 ± 5.8%)。用于随机II期临床试验的35/42个细胞系的检查结果显示在纯化的肿瘤细胞系中始终表达这些标志物(35.2 ± 3.9% CD146+/CD271-、41.5 ± 4.3 CD146+/CD271+、16.9 ± 4.0 CD146-/CD271-、6.4 ± 1.9 CD146-/CD271+)。在自体树突细胞疗法中，使用这些细胞作为抗原来源导致IV期黑素瘤患者的50% 5年生存期(n = 54)。以我们的方法，使用极深低温冷藏的样品，我们能够缩短生产时间至2个月，并提高成功率至80%。基于这些已知的癌干细胞标志物，该方法还导致癌干细胞的纯度从约70%提高到>90%。另外，污染的成纤维细胞用最少的技术操作清除。该方法适于自动化和/或优化，其中可构建支持自动化和可量测性的封闭统一系统。可量测性和优化常常与递送和制备成本降低有关，自动化还可导致人工成本降低。

球体

细胞形成球体的能力部分产生于称为整联蛋白的细胞表面蛋白质。细胞表面表达的嗜同种整联蛋白确保细胞“待在一起”。球体由酶消化物(ED) (其在培养刚开始时是单细胞悬液)直接形成，或可在任何时间自冷冻样品或存在的贴壁培养物形成。酶消化物接种导致这种球体形成，将具有特定表面性质的细胞合并。例如，成纤维细胞不被合并，在重力供应(gravitational feeding)期间最终从培养物中消失。为了防止不具有嗜同种性质的细胞非特异性附聚并防止粘附在培养容器表面上，所用培养基缺乏促进粘附的分子。所述粘附分子(CAM)通常存在于动物或人血清中，因此不含血清的培养基组成是合适的。

在不含血清的培养基培养物中，向培养基供应的补充剂包括支持生长和维持所必须的任何激素、营养物、矿物质和维生素或细胞生理学和功能的其它所需方面。在某些情况下，可添加或调整具有促有丝分裂活性的生长因子(例如FGF家族和EGF)的量，来刺激和维持干细胞增殖。

可根据经过固定并用标记抗体染色、接着用共焦显微术观察生物标志物表达，来表征细胞的球体，包括癌干细胞的球体(Weiswald等(2010) Cancer. 10:106 (11页))。例如，球体可从获自新鲜肿瘤的悬液或从适于作为贴壁细胞生长的细胞制备，如黑素瘤细胞的情况所证实的一样(Perego等(2011) J. Inv. Dermatol. 11: 546-547)。球体可自单细胞产生，如球体的荧光显微术成像所示(参见例如Cao等(2011) BMC Gastroenterol. 11: 71 (11页))。球体的形态学，例如大而不规则与极小而致密，可能受培养基选择的影响(Mancini等(2011) PLoS ONE. 6:e21320 (12页)。在没有暗示任何限制的情况下，本公开内容包括上述参考文献中公开的方法和技术。

培养时间

本公开内容提供用于制备黑素瘤癌干细胞的方法，其中总的培养时间，包括例如更换培养基、再铺板、离心和沉淀等操作所需要的时间，为少于5个月、少于4个月、少于3个月、少于2个月、少于1个月、少于150天、少于120天、少于90天、少于60天、少于30天或少于150天(+/-20天)、少于120天(+/-20天)、少于90天(+/-20天)、少于60天(+/-20天)、少于30天(+/-20天)。在排斥性实施方案中，本公开内容可排除这样的用于制备癌干细胞的任何方法和通过该方法制备的任何癌干细胞群，其中操作所需要的时间为大于上文公开的时限之一。提供上述时限之一表示的贴壁培养时间。此外，提供是上述时限之一的非贴壁培养时间。此外，还提供是上述时限之一表示的贴壁培养和非贴壁培养的混合时间。

本公开内容的培养基

一种配方变化可使用补充HSA (人血清白蛋白)的B27，而另一种变通法使用补充BSA (牛血清白蛋白)的B27。表1公开了以人白蛋白为例说明的不含血清的补充剂组成(参见表1中的最终组分)。在一些示例性的实施中，可使用BSA替代人血清白蛋白(HSA)。表11公开了培养基RPMI 1640的组分。“PSF”是指青霉素、链霉素和两性霉素”。PSF用作抗生素和抗真菌剂。“成神经细胞干细胞培养基”描述于表8 (培养基中的牛组分)和表9 (用人血清白蛋白HSA制备)中。“NeuroBlast培养基”和“NeuroBlast干细胞培养基”是同一个。

本公开内容包括神经元干细胞培养基、使用神经元干细胞培养基的方法、使用神经元干细胞培养基制备的细胞、将所述细胞给予受试者的方法和包含神经元干细胞培养基的试剂盒。对于神经元干细胞培养基的每个个别组分，本公开内容包括是+/-5%或更少、+/-10%或更少、+/-15%或更少、+/-20%或更少、+/-25%或更少、+/-30%或更少等的浓度范围，其总体积保持不变。本公开内容包括省略了一种或多种组分的神经元干细胞培养基。本公开内容还包括具有一种或多种替代物的神经元干细胞培养基。细胞培养基的替代物的一般实例包括例如用磷酸钠代替磷酸钾、用蔗糖代替甘油、胱氨酸代替半胱氨酸等。

碱性成纤维细胞生长因子的备选物

在非贴壁基质上培养时，培养基可任选包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、bFGF类似物、与一种或多种其它生长因子组合的bFGF、或未添加bFGF的一种或多种生长因子。生长因子包括EHNA化合物(Burton等(2010) Biochem. Soc. Trans. 38:1058-1061)、骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素生长因子-1或-2 (IGF-1；IGF-2)、转化生长因子-β (TGF-β)等。

本公开内容提供通过MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)起作用的任何生长因子或配体作为bFGF的备选物。MAPK最初称为ERK (胞外信号调节激酶)。

通过该机制起作用的生长因子的经典列表包括FGF、EGF、PDGF、NT3/4、BDNF、NGF、VEGF。另外，这些也以相同方式起作用：TNF、IL-1、TGFb、FASL。这些生长因子主要作为促分裂原起作用。

可利用的快速增殖的另一个机制是通过受体酪氨酸激酶(例如EGF、IGF等)和GPCR (G蛋白偶联受体)刺激PI3K-AKT途径。

除刺激上述途径的天然配体以外，拮抗抑制剂的作用剂被考虑体外制备使用。所述抑制剂的实例是在PI3K-AKT系统中起作用的PTEN抑制剂。

其它癌症治疗使用针对该途径中的单一靶标的试剂。已用于体内疗法的单一靶标的实例包括例如Raf激酶抑制剂索拉非尼、SB590885、PLX4720、XL281、RAF265、LGX818、vemurafenib；MEK抑制剂：XL518、CI-1040、PD035901、MEK162、selumetinib、Trametinib (GSK1120212)。

与这些治疗形成对比，本公开内容使用促进癌扩增的(激动剂)配体用于体外制备。

用于本公开内容的配体(例如FGF、EGF)的形态发生作用通过经由所列举的途径刺激转录因子(例如Nanog、cKit、Sox2、Oct3/4)促进癌干细胞群优先扩增。

可在非贴壁培养期间，将上述天然和合成配体的一种或多种或其任何组合加入培养基中，例如在低粘附培养瓶、极低粘附培养瓶或超低粘附培养瓶中，或可在贴壁培养期间加入培养基中。以下涉及在贴壁培养中的生长。在贴壁培养期间bFGF不是绝对需要的，但它可通过刺激转录因子例如Nanog、cKit、Sox2、Oct3/4，有助于保持癌细胞的“干细胞”状态。不利的是，bFGF不加区别的使用或过度使用可提高不是肿瘤的细胞群(例如正常成纤维细胞或上皮细胞)生长。因此应通过评价癌细胞群的纯度，及时限制在贴壁期的使用。制备时球体形成步骤可防止正常细胞群的扩增，且正是这个点可广泛使用生长因子，而且如果怀疑有杂质，便可重复该步骤(球体形成步骤)。

在没有暗示任何限制的情况下，本公开内容的主要特征包括：(1)在优选具有单一生长因子或生长因子组合或抑制剂的拮抗剂的非贴壁条件下生长；(2)通过分离球状体(且不使用分离癌干细胞的任何其它方法)选择癌步骤细胞。球状体可通过重力方法、离心、过滤等分离；(3)在优选具有一种或多种生长因子的贴壁条件下生长；和(4)任选重复非贴壁过程。

附图详述

图 1

采用差别贴壁和血清饥饿方法，在纯化过程中富集具有神经内分泌和间充质表型的黑素瘤干细胞。显示了在培养期开始时(酶消化)、将近部分纯度(中间产物)和在完成纯化之后(纯化的) CD146和CD271的代表性流式细胞术示图。包括作为对照的正常人真皮成纤维细胞(NHDF)。显示了8个单独处理样品的汇总数据。所示值为平均数± SD。

图 2

直方图公开了对于在制备的3个不同阶段的细胞来说表达CD146和CD271的细胞的百分比。所述阶段为酶消化、中间产物和纯化的。表12显示对于特异性主动免疫疗法用于加载树突细胞的自体黑素瘤细胞系中CD146和CD271表达的百分比。N = 63，对于各患者包含直方图。

图 3

在特异性主动免疫疗法中用于加载树突细胞的自体黑素瘤细胞系含有表达与神经嵴和间充质源有关的抗原的细胞。针对CD146和CD271的表达，通过流式细胞术评价经照射和深低温冷藏的纯化的自体黑素瘤细胞，N = 36，所示值为± SD。

图 4

来源于标准或球体产生方法的黑素瘤干细胞系产生相同表型的细胞。通过针对CD146和CD271测量双阳性的流式细胞术评价图中所示来自各种条件的细胞。与图3研究结果相比，图4研究结果表明在某些情况下可存在在孵育期间不形成球体的细胞丧失和CD271表达增加的至少一种。

图 5

将纯化的黑素瘤细胞系置于神经元干细胞培养基或含标准血清的扩增培养基(15%FBS/RPMI)中为期7天。之后，在贴壁细胞的情况下通过胰蛋白酶消化和通过癌干细胞球体的简单收集，收获细胞。通过针对CD146、CD271、MHC I类和MHC II类的流式细胞术同时测定来自图中所示各个条件的细胞。较高的MHC II表达刺激CD4记忆细胞，其可通过分泌活化细胞因子来支持和维持免疫应答。

图 6

使用差别贴壁和血清饥饿的黑素瘤癌干细胞处理的纯化图示(方法I)。将表示酶促消化的手术肿瘤样品的团块肿瘤在含血清的细胞培养基中孵育1-3天，然后洗涤两次以除去淋巴细胞。然后将成纤维细胞、非癌干细胞和癌干细胞的粘附混合物在平均120天的进程内置于低血清细胞培养条件(1-5%胎牛血清的范围)和一系列差别贴壁程序中。差别贴壁程序包括从基质中酶促剥离细胞的混合物，并置于新的底质(标准血浆处理的细胞培养瓶)中达5-20分钟的时间，直到25-30%的细胞贴壁。然后将非贴壁细胞转移到新的培养瓶中，重复剥离程序4-6次。该方法利用以下特性：与癌细胞相比，成纤维细胞较高的贴壁率。另外，低血清条件将抑制污染的成纤维细胞的生长和非癌干细胞生长速率，这是因为与癌干细胞相比，这些细胞较高的养分需要所致。

图 7

使用超低贴壁干细胞条件分离癌干细胞接着贴壁扩增条件的纯化过程的图示(方法2)。在一些实施中，使用涂覆Corning®专利材料的聚苯乙烯支持超低贴壁。聚丙烯具有结构继承性疏水性质，这也可支持超低贴壁。除Corning®专利涂料之外，可以使用薄的琼脂涂料(多糖)、聚酰胺或硅氧烷。将表示酶促消化的手术肿瘤样品的团块肿瘤在超低贴壁或贴壁条件下在干细胞培养基中孵育以在14天后产生癌干细胞球体。贴壁是指保持粘附在它们在上面生长的表面上的细胞；在洗涤和收获期间可除去非贴壁细胞。非贴壁条件是指当细胞不粘附在非类似的活细胞的基质上的培养环境。可使用以下疏水材料或非生物淤积处理以实现非贴壁条件：琼脂糖、聚乙烯、含氟聚合物、硅氧烷。可促进非贴壁条件的条件包括缺乏血清组分或缺乏对来自培养基或基质的整联蛋白(RGD、IKVAV、YIGSR、RETTAWA等)有特异性的末端的肽。此外，添加膜扩展剂或表面活性剂：Pluronic F-68、Tween80、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)可促进非贴壁条件。在较高浓度下可用作移动性酶(mobility enzyme)的透明质酸酶可引起细胞脱落。它还可引起缺乏CD44依赖性贴壁。哺乳动物细胞培养领域的技术人员可容易地区分是超低粘附的培养瓶、培养皿和其它培养容器与是低粘附的那些。

这导致将污染细胞群(例如淋巴细胞和成纤维细胞和非癌干细胞肿瘤细胞)去除。这些球体富集CD146/CD271阳性癌干细胞群。然后球体被机械或酶促地分离，铺在粘附表面上，并使其复制另外30-45天。然后收获细胞作为完整细胞或裂解物用于免疫疗法。

图 8

图8公开了在纯化过程中癌干细胞的富集。图8A显示流式细胞术结果，图8B显示概述流式细胞术结果的直方图。结果证实，对于这种具体的细胞制备，在酶消化(团块肿瘤，空心条形柱)中，最普遍的细胞类型是CD146-/CD271-，且在本公开内容的纯化步骤中，最普遍细胞类型为CD146+/CD271-。在中间物阶段，CD146+/CD271细胞和CD146-/CD271+细胞以大致相等的百分比存在。

图 9

图9公开了在本公开内容的“癌干细胞”中和在通过标准方法产生的“纯化的细胞系”中团块肿瘤细胞中CD146和CD271的表达。

有关图9，在团块肿瘤细胞中，CD146-/CD271-细胞(条形柱的空心段)占细胞的最大比例，其中CD146-/CD271+细胞(条形柱段的下斜影线)构成次最普遍细胞。在“癌干细胞”中，CD146+/CD271+细胞(条形柱段的方格影线)是最普遍的细胞类型。在“纯化的细胞系中，CD146+/CD271+细胞(条形柱段中的方格影线)，CD146+/CD271-细胞(条形柱段中的上斜影线)的比例大致相等，其中CD146+/CD271+细胞以略大于D146+/CD271-细胞的百分比存在。图9表示表13的数据。

实施例

本公开内容提供用于分离和扩增来自黑素瘤样品活检的间充质和神经嵴源的癌干细胞以用于基于细胞的免疫疗法的方法和试剂。方法包括使用培养基配方分离然后增殖具有神经嵴和/或间充质表型的不同的肿瘤干细胞群。CD146是常存在于间充质细胞中的标志物，并与高侵袭性表型有关。CD271，神经元生长因子受体p75，由神经元祖细胞表达，并在黑素瘤引发细胞中表达。提供用于分离和扩增可存在于转移性黑素瘤制备物中的细胞类型的步骤，其中就这些细胞而言是CD146+/CD271-、CD146+/CD271+或CD146-/CD271+。另外，这些细胞还对CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1和CD90全部或部分呈阳性。将细胞在非贴壁条件下在干细胞培养基中培养10-14天，然后转换到在非干细胞扩增培养基中的贴壁条件。最后的贴壁步骤是促进主要组织相容性复合体的增量调节和免疫抑制分子(像吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶、肿瘤生长因子β和白介素-10)的减量调节。本公开内容使用这些细胞而不是团块肿瘤活检样品或纯化的非贴壁癌干细胞使患者免疫。因此，本公开内容使用被鉴定为肿瘤形成性的细胞，其与是在团块肿瘤活检样品中是主导细胞的分化的非增殖性细胞群或仍处于非贴壁“球形体”状态的免疫抑制癌干细胞不同。Selvan等(2010) Melanoma Res. 20:280-292公开了用于加工黑素瘤组织样品的试剂和方法。

由于肿瘤相关新抗原的存在，预期基于细胞的免疫疗法在自体背景下是有效的。然而，团块自体肿瘤制备物的使用未产生预期的临床结果，可能是因为团块肿瘤中存在的细胞群主要是分化细胞，其中代表癌干细胞的细胞百分比低。本公开内容的技术证实肿瘤样本必须以富集是最有效的癌干细胞的方式处理。具体地说，采用球体形成技术，所述处理导致是CD146+/CD271- (间充质癌细胞)或CD271/CD146 (具有间充质特性的癌干细胞)的细胞富集。

然而，细胞然后在用于免疫疗法前必须粘附到基质(例如细胞培养瓶)上用于最后的增殖步骤以避免癌干细胞的免疫抑制作用(Wei等(2010) Glioma-associated cancer-initiating cells induce immunosuppression (神经胶质瘤相关癌引发细胞诱导免疫抑制). Clin Cancer Res. 16:461-473；Schatton等(2010) Modulation of T-cell activation by malignant melanoma initiating cells (通过恶性黑素瘤引发细胞调节T-细胞活化). Cancer Res. 70:697-708)。

扩增在粘附基质(例如标准细胞培养瓶或类似表面)上的细胞的作用是增量调节重要的免疫相关蛋白质，其被称为主要组织相容性复合体(MHC I类和II类)。这些蛋白质复合体是免疫系统籍以识别外来的或被病毒感染的细胞并对之起反应的主要机制。癌干细胞当处于生长的剥离的球形体阶段时减量调节那些分子，而当处于生长的贴壁的扩增阶段时增量调节所述分子。预期在扩增期间，癌干细胞从非贴壁转移到贴壁状态的行为降低或消除癌干细胞抑制免疫应答的能力。除MHC I类和II类蛋白质以外，癌干细胞还增量调节其它免疫抑制分子，例如转化生长因子-β (TGF-b)、吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶(IDO)和白介素-10 (IL-10) (Jewett, A.和H.C. Tseng, Tumor induced inactivation of natural killer cell cytotoxic function；implication in growth, expansion and differentiation of cancer stem cells (肿瘤诱导的天然杀伤细胞细胞毒性功能的灭活；参与癌干细胞的生长、扩增和分化). J. Cancer, 2011. 2:443-457)。随后，这些因子在响应与基质粘附时应减量调节。

百分比减量调节和百分比增量调节

本公开内容提供细胞及相关方法和组合物，其中在粘附表面上培养导致免疫抑制分子减量调节，和(i)其中免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶、肿瘤生长因子-β和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且(ii)其中在粘附表面上培养之前至少一种免疫抑制分子的表达为100%，且其中在粘附表面上培养之后的减量调节导致与最初的100%相比处于是以下水平的表达：低于80%、低于70%、低于60%、低于50%、低于40%、低于30%。

此外，本公开内容提供细胞及相关方法和组合物，其中在粘附表面上培养导致免疫抑制分子减量调节，和(i)其中免疫抑制分子是吲哚胺 - 吡咯 -2,3- 双加氧酶，且(ii)其中在粘附表面上培养之前免疫抑制分子的表达为100%，且其中在粘附表面上培养之后的减量调节导致与最初的100%相比处于是以下水平的表达：低于80%、低于70%、低于60%、低于50%、低于40%、低于30%。

还提供细胞及相关方法和组合物，其中在粘附表面上培养导致免疫抑制分子减量调节，和(i)其中免疫抑制分子是肿瘤生长因子 -β，且(ii)其中在粘附表面上培养之前免疫抑制分子的表达为100%，且其中在粘附表面上培养之后的减量调节导致与最初的100%相比处于是以下水平的表达：低于80%、低于70%、低于60%、低于50%、低于40%、低于30%。

另一方面，提供细胞及相关方法和组合物，其中在粘附表面上培养导致免疫抑制分子减量调节，和(i)其中免疫抑制分子是白介素 -10 (IL-10)，且(ii)其中在粘附表面上培养之前免疫抑制分子的表达为100%，且其中在粘附表面上培养之后的减量调节导致与最初的100%相比处于是以下水平的表达：低于80%、低于70%、低于60%、低于50%、低于40%、低于30%。

在实施方案中，具体核酸或多肽的增量调节在至少20%的细胞群中、在至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的细胞群中可检出。至于减量调节，具体核酸或多肽的减量调节在至少20%细胞群中、在至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%细胞群中可检出。

在实施方案中，具体核酸或多肽的增量调节在至少20%的癌干细胞群中、在至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的癌干细胞群中可检出。至于减量调节，具体核酸或多肽的减量调节在至少20%的细胞群、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的癌干细胞群中可检出。

上述相关方法和组合物，包括细胞培养的方法、将癌干细胞加载到树突细胞(DC)中的方法、用于制备疫苗的方法、是包含加载黑素瘤癌干细胞的DC的疫苗的组合物；将疫苗给予受试者、给予有黑素瘤风险的受试者或给予带有黑素瘤的受试者的方法；和用于刺激针对至少一种黑素瘤特异性抗原的特异性免疫应答的方法、用于改进通过RECIST标准可测量的目标终点的方法和用于改进临床终点(例如无进展生存期(PFS)、至远端转移时间(TDM)或总体生存(OS))的方法。

本公开内容提供细胞及相关方法和组合物，其中在粘附表面上培养导致MHC-I、MHC-II或MHC-I和MHC-II两者增量调节，且(ii)其中在粘附表面上培养之前MHC-I、MHC-II或MHC-I和MHC-II两者的表达为100%，且其中在粘附表面上培养之后的增量调节导致与最初的100%相比处于是以下水平的表达：至少125%、至少150%、至少200% (2倍增加)、至少250%、至少300%、至少400% (4倍增加)、至少500%。MHC是主要组织相容性复合体。可获得用于测量MHC I类或MHC II类的表达和用于将表达定量为增量调节或减量调节的方法(参见例如Pantel等(1991) Cancer Res. 51: 4712-4715；Vertuani等(2009) Cancer Immunol. Immunother. 58:653-664；Yadav等(2009) J. Immunol. 182:39-43；Lollini等(1998) Int. J. Cancer. 77:937-941)。

引述了用于检测表达或用于检测吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶(Orabona等(2006) Blood. 107:2846-2854)、白介素-10 (IL-10) (Hedrich和Bream (2010) Immunol. Res. 47:185-206)和肿瘤生长因子-β (Kloen等(1997) Cancer. 80:2230-2239)的增量调节的多种非限制性方法。

本公开内容提供制备的黑素瘤细胞，提供加载制备的黑素瘤细胞的树突细胞，并提供包含加载制备的黑素瘤细胞的树突细胞的疫苗，其中免疫抑制降低至低于90%最大免疫抑制、至低于85%、至低于80%、至低于75%、至低于70%、至低于60%、至低于50%、至低于40%、至低于30%最大免疫抑制等。在这种情况下，“免疫抑制”是指一种或多种黑素瘤抗原的任何免疫抑制(耐受)能力，或是指包含加载纯化的黑素瘤抗原的树突细胞的疫苗，或是指包含加载处理的黑素瘤细胞的树突细胞的疫苗，即，其中针对一种或多种黑素瘤特异性肿瘤抗原的耐受性提高。在没有暗示任何限制的情况下，本公开内容的疫苗可包含以下的树突细胞(DC)：加载球体、加载包含球体的细胞群、加载来源于球体和在加载到DC中之前在粘附表面上扩增的细胞群、加载在加载到DC中之前进行匀浆或超声处理的球体、加载在加载到DC中之前进行匀浆或超声处理的扩增细胞群等。

通过体外细胞培养技术富集具有间充质特性的肿瘤干细胞使得可能将这些细胞用于基于细胞的免疫疗法方案中。可在来自乳腺癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和结肠癌活检样品的样品中采用这些方法。

表14公开了来源于差别贴壁和血清饥饿标准方法的细胞系中常见黑素瘤相关抗原的表达。另参见例如Selvan等(2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383；Selvan等(2010) Melanoma Res. 20:280-292。

在示例性的实施中，本公开内容提供分离的癌干细胞群，其中至少20%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%的细胞为CD146+/CD271-，其中约0%、约5%、约10%、约20%、约40%、约60%、约80%、约90%或至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的相同细胞表达CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1和CD90的一种或多种。

在示例性的实施中，本公开内容提供分离的癌干细胞群，其中至少20%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%的细胞为CD146-/CD271+，其中约0%、约5%、约10%、约20%、约40%、约60%、约80%、约90%或至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的相同细胞表达CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1和CD90的一种或多种。

在示例性的实施中，本公开内容提供分离的癌干细胞群，其中至少20%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%的细胞为CD146+/CD271+，其中约0%、约5%、约10%、约20%、约40%、约60%、约80%、约90%或至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的相同细胞表达CD44、Twist、Zeb1/2、Snail、Slug、SIP、CD133、CD166、CXCR4、Notch-1和CD90的一种或多种。

在示例性的实施中，分离的癌干细胞群为约100个细胞、约1,000个细胞、约2,000个细胞、约5,000个细胞、约10,000个细胞、约20,000个细胞、约50,000个细胞、约100,000个细胞、约200,000个细胞、约500,000个细胞、约1 X 10⁶个细胞、约2 X 10⁶个细胞、约5 X 10⁶个细胞、约10 X 10⁶个细胞、约20 X 10⁶个细胞、约50 X 10⁶个细胞、约100 X 10⁶个细胞、约200 X 10⁶个细胞、约500 X 10⁶个细胞、约1 x 10⁹个细胞、约2 X 10⁹个细胞、约5 X 10⁹个细胞、约10 x 10⁹个细胞、约20 x 10⁹个细胞、约50 x 10⁹个细胞、约100 x 10⁹细胞等。

方法

方法 1. 用于产生黑素瘤癌细胞系的标准方法

用于产生用于引用的临床试验的纯化的肿瘤细胞系的方法是差别贴壁和血清饥饿，籍以消除成纤维细胞和正常基质细胞(Dillman等(1993) Establishing in vitro cultures of autologous tumor cells for use in active specific immunotherapy (建立自体肿瘤细胞的体外培养用于特异性主动免疫疗法). J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14:65-69)。

在病理学检查后获得大约至少几百个细胞的手术样本，通过用解剖刀切碎和胶原酶消化(酶消化)，加工成单细胞悬液。使所得的纯化的细胞培养物扩增至约20亿个细胞，并在深低温保藏和在液氮中保存之前照射。合格的患者进行单采血液成分术以获得单核细胞用于经淘析纯化。然后使用含178 ng/mL GM-CSF和80 ng/mL IL-4 (Cell Genetics)的AIMV (Invitrogen)，使纯化的单核细胞分化成树突细胞。所得的树突细胞然后抗原加载经照射的纯化的肿瘤细胞(DC+TC)。患者接受8次皮下注射重新悬浮于500微克GM-CSF中的DC+TC。本领域普通技术人员应了解，在本公开内容的范围内的是在某些情况下，增加GM-CSF或将(全部或部分) GM-CSF用TLR激动剂和CD40配体的至少一种替换是可行的。

采用免疫细胞化学方法，测定在黑素瘤系中表达的一组抗原的表达。简单地说，在1000IU/mL IFN-c存在或不存在时，将细胞在8室培养载玻片(Thermo Fisher)中培养。72小时后，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，并在冷的丙酮中固定。在封闭内源过氧化物酶后，将细胞与针对所列抗原的合适的第一抗体一起孵育。使用生物素化抗小鼠或兔免疫球蛋白，超敏感酶(Super Sensitive enzyme)缀合的链霉抗生物素标记和辣根过氧化物酶色原和底物试剂盒(Biogenex，Fremont，CA)，进行免疫组织化学。用同种型匹配的对照抗体研究了下列抗人多克隆或单克隆抗体的反应性：S-100和HMB-45 (Biogenex)、Mel-2、Mel-5、Mart-1 (Signet)、酪氨酸酶、Mage-1 (Thermo Scientific, Waltham, MA)、Melan-A、HLA I类和HLA II类(Dako，Carpinteria，CA)。

方法 2. 癌细胞系纯化的癌干细胞球状体方法

通过解剖刀切碎和胶原酶消化，对手术肿瘤样品进行处理。将所得细胞悬液以5-20万个细胞/mL置于超低贴壁细胞培养瓶(Corning)中的神经元干细胞培养基(成神经干细胞培养基，California Stem Cell, Irvine, CA)中21天。在超低粘附基质中培养期间，bFGF不是绝对需要的，然而，bFGF促进更快速的增殖。本公开内容提供细胞群、球体群和相关方法，其中在超低粘附基质中培养期间不使用bFGF，和其中在超低粘附基质中培养期间实际上还包括bFGF。每隔2-3天，使用沉降回收肿瘤干细胞球体，在新鲜培养基中重新培养。在21天球形体培养期后，球体用酶促的胰蛋白酶消化分离，得到单细胞的悬液。然后将细胞置于标准细胞培养瓶(Corning，Corning，NY)中含有15%胎牛血清的RPMI培养基或不含动物产品的扩增培养基(Omega Scientific，Tarzana，CA)中，扩增以建立增殖的贴壁细胞培养物。可以使用提供足够营养物的其它扩增培养基配方以确保贴壁癌细胞群的快速扩增。

在从深低温保藏中融化后或在细胞培养期间，通过流式细胞术，针对以下一种或多种的表达，对纯化的肿瘤细胞培养物、癌干细胞球状体和酶消化样品进行测定：MHC I类、MHC II类和CD146和CD271 (BD Biosciences，San Jose，CA)。另外，还测定了正常人真皮成纤维细胞的对照样品。将细胞在4%低聚甲醛(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中固定15分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Omega Scientific)洗涤两次，以100万个细胞/毫升重新悬浮。细胞用10 uL CD146和CD271或同种型对照(BD Biosciences)染色30分钟，用PBS洗涤，并按照制备说明书，在珠粒标准化的FACS Calibur (BD Biosciences)上进行流式细胞术。

在细胞扩增示例性实施中，进行程序的细胞为约1个细胞、正好1个细胞、约10个细胞、约20个细胞、约50个细胞、100个细胞、约1,000个细胞、约2,000个细胞、约5,000个细胞、约10,000个细胞、约20,000个细胞、约50,000个细胞、约100,000个细胞、约200,000个细胞、约500,000个细胞、约1 X 10⁶个细胞、约2 X 10⁶个细胞、约5 X 10⁶个细胞、约10 X 10⁶个细胞、约20 X 10⁶个细胞、约50 X 10⁶个细胞、约100 X 10⁶个细胞、约200 X 10⁶个细胞、约500 X 10⁶个细胞、约1 x 10⁹个细胞、约2 X 10⁹个细胞、约5 X 10⁹个细胞、约10 x 10⁹个细胞、约20 x 10⁹个细胞、约50 x 10⁹个细胞、约100 x 10⁹细胞等。

在某些情况下，可能有用的是将下列步骤的一个或多个添加到方法2。血浆处理的组织培养瓶上的贴壁步骤，基本上紧接肿瘤的酶消化，接着洗涤步骤以除去未粘附在培养瓶上的淋巴细胞和碎片。孵育步骤，其中洗涤步骤之后可为在神经元干细胞培养基中孵育癌细胞和正常细胞的贴壁混合物，这可从培养瓶表面产生癌干细胞球体的芽。收集步骤，其中可收集出芽的癌干细胞，并置于超低贴壁条件下用于进一步增殖。

改进的方法 2. 癌细胞系纯化的癌干细胞球状体方法

下列非限制性方案是用于处理和表征通过微球体技术产生的肿瘤细胞系。下面公开了微球体技术。

步骤1. 随机选择8个酶促消化的黑素瘤肿瘤样品。

步骤2. 将冷冻小瓶在设置为37℃的水浴中融化，得到细胞悬液。将悬液滴加到含有5% RPMI培养基的15 mL圆锥管中。

步骤3. 以1200 rpm离心5分钟。

步骤4. 重新悬浮于10 mL的成神经细胞培养基中。

步骤5. 使用血细胞计数器进行细胞计数和存活力测试。

步骤6. 以80,000个活细胞/mL重新悬浮于Neuroplast加10 ng/mL bFGF中，并以0.52ml/平方厘米置于超低粘附培养瓶中。

步骤7. 每2-3天，细胞以900 rpm离心5分钟，并用新鲜培养基更换。对于前3次培养基更换重复该步骤，然后对于共21天的剩余培养期，改为被动沉降。被动沉降包括将细胞悬液转移到50 mL圆锥管中，将夹具中的圆锥管置于平坦表面3-5分钟。观察圆锥管底部以收集微球体。除去上清液，将细胞沉淀重新悬浮在补充10 ng/mL bFGF的Neuroblast加5% FBS中。在21天结束时，进行被动沉降。

步骤8. 除去上清液，轻轻吸放的同时，用TrypLE分离细胞沉淀10分钟。使用血细胞计数器进行细胞计数，并评价存活力。

步骤9. 以20,000-30,000个活细胞/平方厘米将细胞悬浮于标准贴壁细胞培养瓶中的补充10 ng/mL bFGF的Neuroblast加5% FBS中。保持细胞培养3-4周，同时每周更换培养基2-3次，这取决于培养基的使用。定期拍摄相衬照片。

步骤10. 在扩增期结束时，将细胞用TrypLE传代，并进行细胞计数。

步骤11. 可如下表征来自所制备的细胞的样品。通过在低聚甲醛固定液中孵育将300-500万个细胞固定，对于流式细胞术表征，使用针对CD146和CD271的抗体。细胞还用同种型lgG1-PE和IgGI-FITC、CD146-PE和CD271-FITC标记的抗体在室温下在PBS中避光染色30分钟。染色的细胞以400 x g离心5分钟，用PBS洗涤一次。然后将细胞重新悬浮于0.4 mL PBS中，并用于BD FACSCalibur®仪器中的流式细胞术。

给予受试者

皮下(SC)给予树突细胞疫苗。各剂量的范围为500-2000万加载的DC，以一系列8剂重复。第一个月每周给予注射(4次)，在接下来4次注射后每月给予。在备选的示例性实施中，给药一周一次达3周，然后一月一次为期5个月，共8周。在一些示例性的实施中，与每剂一起同时给予加强佐剂(GM-CSF)。在备选的示例性实施中，给予GM-CSF加强佐剂，但不与每个单剂量一起给予。在其它示例性的实施中，完全没有GM-CSF加强佐剂。

无限制地，将树突细胞(例如自体或同种异体树突细胞)与作为细胞裂解物、酸洗脱液、细胞提取物、部分纯化的抗原、纯化的抗原、分离的抗原、部分纯化的肽、纯化的肽、分离的肽、合成肽或其任何组合的癌干细胞抗原接触。然后将树突细胞给予受试者，例如，带有癌的受试者或未带有癌的对照受试者。在示例性的实施中，通过皮下、结节内、肌内、静脉内、鼻内、吸入、口服的一种或多种途径、通过施用于肠腔等，与树突细胞接触、注射或给予树突细胞(参见例如O'Neill等(2004) Blood. 104:2235-2246；Sabado和Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56)。

因此，虽然如应用于示例性实施和/或其方面一样，显示、描述和指出本公开内容的基本的新特征，但应了解在不偏离本公开内容和/或权利要求书的精神的情况下，本领域技术人员可在示例性实施、公开内容和其方面的形式和详细资料中进行各种省略、重新配置和取代及变化。例如，明确预期，以基本相同的方式执行基本相同的功能以实现相同结果的所述要素和/或方法步骤的所有组合都在本公开内容的范围内。此外，应认识到，结合任何公开的形式或实施所显示和/或描述的结构和/或要素和/或方法步骤可并入任何其它公开或描述或提议的形式或实施作为设计选择的普通题材。因此意图是不限制本公开内容的范围。预期所有这样的修饰在此都在随附权利要求书的范围内。

本说明书中引用的所有出版物、专利、专利申请和参考文献通过引用结合到本文中，就像在本文完全给出一样。

虽然通过目前被认为是最实用和优选的实施、范例和/或实施方案描述了方法和仪器，但要了解，本公开内容不必限于所公开的实施、范例和/或实施方案。预期涵盖包括在权利要求书的精神和范围内的各种修改和类似安排，权利要求书的范围应符合最宽泛的诠释以包括所有这样的修改和类似结构。

还应理解，可在不偏离本发明的本质的情况下进行多种改变。所述变化也明确包括在本说明书中。它们仍落入本公开内容的范围内。应理解，本公开内容意欲产生独立地和作为整体系统以及在方法和仪器方式两者中涵盖多个方面的专利。

此外，本公开内容、范例、其方面和权利要求书的不同要素的每一个也可以多种方式实现。本公开内容应理解为包括各个所述变化是任何仪器、方法或过程的变化，或甚至只是这些的任何要素的变化。

尤其应理解，因为本公开内容涉及要求保护的要素，各要素的措词可通过等同的仪器术语或方法术语表示—甚至只要功能或结果相同。

所述等同、较宽泛或甚至更通用的术语应视为包括在各要素或操作的描述中。在需要使本发明对其享有权利的绝对宽大的覆盖范围明确时，所述术语可被替换。

应理解，所有操作都可表示为采取该操作的手段或表示为引起该操作的要素。

同样，所公开的各个物理要素应理解为包括该物理要素促进的操作的公开。

本专利申请提及的任何专利、出版物或其它参考文献均通过引用结合到本文中。

最后，信息披露声明或其它信息声明所列举的所有参考文献随本申请提交或之后予以附加和通过引用予以结合；然而，至于上面的每一个，就通过引用结合的所述信息或声明可能被视为与对所要求保护的发明申请专利不一致的方面来说，所述声明明确不视为由本申请人所作。

在这一方面，应理解出于实践理由且为了避免增加可能的数百个权项，本申请人只提供具有初始从属性(initial dependencies)的权项。

应理解，支持存在至在新的主题法规——包括但不限于35 USC §132或其它所述法规——下所要求的程度，以允许加入在一个独立权项或构思下呈现的不同附属性或其它要素的任一个作为任何其它独立权项或构思下的附属性或要素。

就所进行的非实质替换而言，就本申请人实际上没有草拟任何权项使得字面上包括任何具体的实施方案而言，且就以别的方式可适用而言，不应认为本申请人以任何方式预期或实际上放弃所述覆盖范围，因为本申请人仅可能不能够预测所有的不测事件；不应理当预期本领域的技术人员草拟字面上将包括所述备选实施方案的权利要求。

此外，按照传统权项诠释，过渡性词语“包含”的使用在本文被用来保持“开放式”权利要求。因此，除非文中另有要求，否则应理解术语“包含”或变化形式例如“包括”或“具有”仅欲指包括规定的要素或步骤或要素类或步骤类，但不排除任何其它要素或步骤或要素类或步骤类。

所述术语应以其最扩展的方式解释，以便提供本申请人法律上允许的最广泛的覆盖范围。

提供遵从37 CFR §1 .72(b)的发明摘要，以供读者快速查明技术公开内容的性质和主旨。要理解，发明摘要以不用于解释或限制权利权利要求书的范围或含义的方式提供。

Claims (30)

1. 一种来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中：

(i) 所述群中至少30%的细胞表达CD146，且所述群中至少30%的细胞表达CD271，或

(ii) 其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，其中百分比值(%)定义为相对于所述群的平均值。

2. 权利要求1的分离的细胞群，其中：

表达为至少35%；和

共表达为至少35%。

3. 权利要求1的分离的细胞群，其中：

表达为至少40%；和

共表达为至少40%。

4. 权利要求1的分离的细胞群，其中：

表达为至少45%；和

共表达为至少45%。

5. 权利要求1的分离的细胞群，其中：

表达为至少50%；和

共表达为至少50%。

6. 权利要求1的分离的细胞群，其中低于5%的细胞是污染细胞。

7. 权利要求1的分离的细胞群，其中低于2%的细胞是污染细胞。

8. 一种包含自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细胞加载了权利要求1的分离的细胞群，且其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

9. 一种包含自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细胞加载了权利要求5的分离的细胞群的至少一种，且其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

10. 权利要求8的疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，所述细胞群包含防止细胞分裂的辐射损伤，或包含防止细胞分裂的核酸交联剂。

11. 一种来源于人黑素瘤肿瘤的分离的细胞群，其中所述群中至少30%的细胞表达CD146，至少30%的细胞表达CD271，或

其中至少30%的细胞共表达CD146和CD271，

其中所述细胞通过包括以下步骤的方法制备：

步骤i. 将黑素瘤肿瘤样品中的细胞分散，

步骤ii. 在低粘附表面或超低粘附表面上培养，

步骤iii. 沉降以收集微球体；和

步骤iv. 将细胞从微球体中分离。

12. 权利要求11的细胞，所述方法还包括为了扩增细胞在培养基中在粘附表面上培养以产生扩增细胞群的步骤(步骤v)。

13. 权利要求11的细胞，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，所述分离的细胞群具有以下的至少一种：

(i) 减量调节的免疫抑制分子；

(ii) 增量调节的MHC-II；或

(iii) 减量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。

14. 权利要求12的细胞，其中与在步骤i的细胞中是可检出的表达相比，所述分离的细胞群具有以下的至少一种：

(i) 减量调节的免疫抑制分子；

(ii) 增量调节的MHC-II；或

(iii) 减量调节的免疫抑制分子和增量调节的MHC-II。

15. 权利要求12的细胞，其中所述免疫抑制分子是吲哚胺-吡咯-2,3-双加氧酶、肿瘤生长因子-β和白介素-10 (IL-10)的至少一种，且其中与在步骤i中是可检出的表达(定义为100%)相比，减量调节是至80%或更低的水平。

16. 权利要求11的细胞，其中将细胞从黑素瘤肿瘤样品和微球体的一种或两种中分散包括用添加的蛋白酶处理。

17. 权利要求11的细胞，其中在低粘附表面或超低粘附表面上的培养是在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在下。

18. 权利要求12的细胞，其中为了扩增细胞在粘附表面上的培养是在含有bFGF的培养基中。

19. 权利要求11的细胞，其中在低粘附表面或超低粘附表面上的培养包括收集已经形成的任何肿瘤干细胞球体，其中所述收集每隔2-3天进行，将所收集的球体在新鲜培养基中在低粘附表面上恢复培养。

20. 权利要求12的细胞，其中在粘附表面上培养的总时间选自为12-30天、14-28天或18-24天的期限。

21. 一种包含加载权利要求11的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

22. 一种包含加载权利要求12的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

23. 权利要求21的疫苗，其中在加载到树突细胞上之前，通过照射肿瘤细胞或通过将核酸交联剂加入肿瘤细胞中，来防止肿瘤细胞分裂。

24. 一种用于刺激针对一种或多种黑素瘤特异性抗原的抗原特异性免疫应答的方法，所述方法包括给予包含活的黑素瘤细胞的人类受试者

包含加载了权利要求11的分离细胞群的自体树突细胞的疫苗，

其中所述树突细胞和人肿瘤来自同一人类受试者。

25. 权利要求24的方法，其中所述黑素瘤特异性抗原是MAGE抗原。

26. 一种用于产生纯化的癌干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 将之前通过分离肿瘤样品的细胞而获得的细胞悬液浸入神经元干细胞培养基中和在低粘附或超低粘附容器中培养；

(b) 允许癌干细胞球体形成；

(c) 通过沉降回收癌干细胞球体以产生回收的球体；

(d) 将回收的球体重新培养；

(e) 在所述重新培养期间允许回收的球体彼此缔合；

(f) 使缔合的球体分离以产生单细胞悬液。

27. 权利要求26的方法，所述方法还包括在分离肿瘤样品以产生细胞悬液的步骤之前获得肿瘤样品的步骤。

28. 权利要求26的方法，所述方法还包括建立增殖性贴壁细胞培养物并扩增细胞的步骤。

29. 权利要求11的方法，其中步骤(ii)培养不在低粘附表面上。

30. 权利要求11的方法，其中步骤(ii)培养在超低粘附表面上。