CN104540937A - 多能胚层起源抗原呈递癌症疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供用于治疗或预防起源于各胚层(内胚层、中胚层、外胚层、神经嵴)的癌症的试剂、方法和药盒。所述试剂包括干扰素-γ (IFN-γ)反应性癌细胞，其中所述细胞是自噬的和非凋亡的癌细胞，且其中所述细胞表达MHC II类。

Description

多能胚层起源抗原呈递癌症疫苗

相关申请

本申请要求2012年2月2日提交的美国临时申请号61/594,304的完全巴黎公约优先权和权益，所述临时申请的内容通过该引用予以结合，就像以其整体在本文中完整提供。

领域

本公开内容涉及治疗来源于各胚胎胚层的癌症、筛选适于治疗的受试者、组合物、方法和药盒。

背景

癌症的特征在于缺乏针对癌症的有效免疫应答。免疫应答的缺乏可产生于例如这样的事实：出于缺乏肿瘤细胞表达的MHC而必然缺乏肿瘤细胞对肿瘤抗原的呈递、出于巨噬细胞与肿瘤结合(在肿瘤处巨噬细胞表达降低免疫应答的细胞因子)以及出于T调节性细胞(Treg)的免疫抑制活性，因此许多肿瘤抗原是“自身抗原”。缺乏针对肿瘤的免疫应答还由以下事实引起：肿瘤细胞趋于不表达刺激先天免疫应答的分子，即刺激toll样受体(TLR)或核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体的分子。癌症包括实体瘤以及血液癌症，例如白血病和骨髓增生异常综合征。

胚胎胚层为内胚层、中胚层、外胚层和神经嵴。神经嵴来源于外胚层，但有时被视为第四胚层。肿瘤细胞(neoplastic cell)可鉴定为来源于这些胚层之一。例如，乳腺癌、肉瘤和结肠癌分别产生于来源于胚胎外胚层、中胚层和内胚层的组织(Singer等(1997) J. Clin. Endocrinol. Metabol. 82:1917-1922)。本公开内容提供刺激免疫应答的试剂，所述免疫应答针对来源于产生自各胚胎胚层的组织的癌症以及针对混合型胚胎起源的肿瘤。

免疫系统包括细胞免疫、体液免疫和补体应答。细胞免疫包括涉及树突细胞、CD8⁺ T细胞(细胞毒性T细胞；细胞毒性淋巴细胞)和CD4⁺ T细胞(辅助T细胞)的细胞和事件的网络。树突细胞(DC)捕获多肽抗原，其中这些抗原可获自DC以外，或由感染性生物在DC内生物合成。DC加工该多肽，产生长度约10个氨基酸的肽，将该肽转移至MHC I类或MHC II类形成复合体，并使复合体穿梭到DC的表面。当携带MHC I类/肽复合体的DC接触CD8⁺ T细胞时，结果是CD8⁺ T细胞的活化和增殖。至于MHC II类的作用，当携带MHC II类/肽复合体的DC接触CD4⁺ T细胞时，结果是CD4⁺ T细胞的活化和增殖(Munz等(2010) Curr. Opin. Immunol. 22:89-93；Monaco (1995) J. Leukocyte Biol. 57:543-547；Robinson等(2002) Immunology 105:252-262)。虽然树突细胞将抗原呈递给T细胞可“激活”该T细胞，但是激活的T细胞可能不能够发起有效的免疫应答。由CD8⁺ T细胞所致的有效免疫应答常常需要DC被许多相互作用中的一个或多个在先刺激。这些相互作用包括CD4⁺ T细胞与DC直接接触(通过CD4⁺ T细胞的CD40配体与DC的CD40受体接触)，或TLR激动剂与树突细胞的toll样受体(TLR)之一直接接触。

体液免疫是指B细胞和抗体。B细胞转化成浆细胞，而浆细胞表达和分泌抗体。幼稚B细胞的特征在于它们不表达标志物CD27，而抗原特异性B细胞却表达CD27 (Perez-Andres等(2010) Cytometry Part B 78B (Suppl. 1) S47-S60)。所分泌的抗体随后可与驻留在肿瘤细胞表面的肿瘤抗原结合。结果是被感染的细胞或肿瘤细胞被抗体加标签。随着抗体与受感染的细胞或肿瘤细胞结合，结合的抗体介导杀死受感染的细胞或肿瘤细胞，其中杀死通过NK细胞进行。虽然NK细胞未以T细胞配置成识别特异性靶抗原的方式配置成识别特异性靶抗原，但NK细胞与抗体恒定区结合的能力，使得NK细胞能够特异性地杀死被抗体加标签的细胞。NK细胞的抗体识别受与抗体的Fc部分结合的Fc受体(NK细胞的Fc受体)介导。这种杀死类型被称为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。NK细胞也可杀死不依赖于ADCC机制的细胞，而这种杀死需要靶细胞中MHC I类的表达丧失或缺乏(参见例如Caligiuri (2008) Blood 112:461-469)。

“迟发型超敏反应应答”技术可用来分辨主要涉及细胞免疫或主要涉及体液免疫的免疫应答。迟发型超敏反应应答的阳性信号表明细胞应答(参见例如Roychowdhury等(2005) AAPS J. E834-E846)。

自噬是一个稳态过程，籍此将胞质组分和细胞器递送到溶酶体用于降解。自噬还与对胞内病原体的先天性和适应性免疫应答有关，胞质抗原籍此被加载到主要组织相容性复合体(MHC) II类分子上用于CD4⁺ T细胞识别。

描述

如本文包括随附权利要求书中所用，单词例如“a”、“an”和“the”的单数形式包括其相应的复数对象，除非文中另有明确说明。本文引用的所有参考文献通过引用结合到本文中，其程度就像每个单独的出版物、专利、公开的专利申请和序列表以及所述出版物和专利文献中的图表和附图，具体而单独说明通过引用予以结合一样。

公开内容

本公开内容提供包含取自患有癌症的受试者的癌细胞的癌特异性肽的哺乳动物树突细胞群；其中癌特异性肽自所述癌细胞由树突细胞在体外获得；其中癌细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中大多数的癌细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中小于约40%的癌细胞用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中小于约30%的癌细胞用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中小于约20%的癌细胞用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中小于约10%的癌细胞用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中小于约5%的癌细胞用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中小于约1%的癌细胞用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中大于60百分比(%)的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和癌细胞来自同一受试者；其中大于70百分比(%)的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和癌细胞来自同一受试者；其中大于80百分比(%)的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和癌细胞来自同一受试者；其中大于90百分比(%)的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和癌细胞来自同一受试者。

在其中要求不加入IFN-γ的一些实例中，本公开内容涉及显著的或相当大的量。换种方式说，要求是至少60%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少70%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少80%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少90%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少95%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少98%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少99%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在一些实例中，至少100%的癌细胞不用IFN-γ处理(或暴露于IFN-γ)。在上述情况下，“处理”和“暴露”是指外源加入的IFN-γ或IFN-γ模拟物。因此，如果使用说明或方案要求至少60%的癌细胞是未处理的，则接受该方案并在IFN-γ中只处理30%的细胞的使用者，将成功遵从方案的要求。然而，如果接受方案的使用者犯错且用IFN-γ处理62%细胞，则使用者将不能符合该方案的要求。本公开内容未设置所添加的IFN-γ或IFN-γ模拟物的任何具体浓度或经处理或未处理的癌细胞的量。在所添加的IFN-γ或IFN-γ模拟物接触癌细胞时，本公开内容未设置暴露的任何具体时限。本公开内容未设置对所添加的IFN-γ或IFN-γ模拟物的功效的任何要求。

本公开内容提供包含取自患有癌症的受试者的癌细胞的癌特异性肽的哺乳动物树突细胞群；其中癌特异性肽自所述癌细胞由树突细胞在体外获得；其中癌细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；其中大于60%、或大于70%、或大于80%、或大于90%、或大于95%、或大于98%、或大于99%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和癌细胞来自同一受试者。

在要求加入IFN-γ的那些实例中，例如来自受试者的树突细胞群包含取自患有癌症的受试者的癌细胞的癌特异性肽，其中所述癌特异性肽自用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞由树突细胞在体外获得，其中大于60百分比(%)的用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和癌细胞来自同一受试者。在其它实施方案中，所要求的是大于65%、大于70%、大于75%、大于80%、大于90%、大于95%、大于98%、大于99%或100%的癌细胞是自噬的和非凋亡的。但是上述示例性方案(其中要求加入IFN-γ)没有对用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的总癌细胞的百分比明确提出要求，没有对IFN-γ或IFN-γ模拟物的浓度提出任何要求，没有对所添加的IFN-γ或IFN-γ模拟物对癌细胞具有任何特定水平的功效提出任何要求。然而，在备选的示例性实施方案(其中要求加入IFN-γ)中，所要求的是至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%的癌细胞暴露于外源加入的IFN-γ或IFN-γ模拟物(或与之接触)。“群”可根据以下方面定义：停留在培养瓶、烧杯、生物反应器、滴定板孔、给定滴定板的所有孔、瓶、批号、癌细胞来源于其中的特定肿瘤活检样品、特定批次的癌细胞首次进行维持培养或生长培养的日期和时间等。在排斥性实施方案中，本公开内容可排除非来自于所需培养瓶、烧杯、生物反应器、特定肿瘤活检样品、维持培养批次、生长培养批次等的细胞、癌细胞、树突细胞或用肿瘤抗原处理树突细胞。

还提供上述树突细胞群，其中癌症来自于内胚层起源、中胚层起源或外胚层起源的一种或多种的组织。还提供上述树突细胞群，其中癌症来自于神经嵴起源的组织，且其中神经嵴是外胚层起源的。还提供上述树突细胞群，其中癌症来自于内胚层起源、中胚层起源或外胚层起源的一种或多种的组织，且其中癌症是神经嵴起源的黑素瘤、内胚层起源的结肠癌、中胚层起源的肾癌、外胚层起源的成胶质细胞瘤或混合型中胚层加胚外起源的卵巢癌。

还提供上述树突细胞群，其中大于80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的。还提供用于上述受试者的包含上述树突细胞群的疫苗。还提供上述树突细胞群，其中基本所有的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞不能细胞分裂。还提供上述树突细胞群，其中基本所有的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞被照射并且不能够细胞分裂。还提供上述树突细胞群，其中至少80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞被照射并且不能够细胞分裂。还提供上述树突细胞群，其中至少80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞用核酸交联剂处理并且不能够细胞分裂。

还提供权利要求1的上述树突细胞群，其包含一种或多种来源于黑素瘤特异性抗原的肽，所述黑素瘤特异性抗原为S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶，且其中癌症为黑素瘤。还提供上述树突细胞群，其中指定受试者为人受试者。还提供上述树突细胞群，其中指定受试者为非人哺乳动物。在疫苗实施方案中，提供包含以下的癌症疫苗：来自患有癌症的受试者的至少一种成熟树突细胞；其中至少一种成熟树突细胞已与来自同一受试者的至少一种癌症肿瘤细胞接触，其中与至少一种成熟树突细胞接触的至少一种癌症肿瘤细胞是不分裂的、自噬的和非凋亡的。还提供用于刺激针对癌特异性抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫刺激量的上述树突细胞群给予受试者。

还提供上述方法，其中被刺激的免疫应答包括CD4+ T细胞应答、CD8+ T细胞应答和B细胞应答的一种或多种。还提供上述方法，其中CD4+ T细胞应答、CD8+ T细胞应答或B细胞应答可通过ELISPOT测定法、通过胞内细胞因子染色测定法、通过四聚体测定法或通过检测抗原特异性抗体产生来测量。还提供上述方法，其中免疫应答包括含2年总体生存率(OS)的生存时间，且其中2年总体生存率为至少60%。还提供上述方法，其中给药包括皮下注射疫苗。还提供上述方法，其中给药包括每周一次给予疫苗注射达3个月，然后每月一次达5个月。还提供用于制备包括来自同一受试者的癌细胞和树突细胞的树突细胞疫苗的方法，所述方法包括：一种或多种癌细胞用阻止细胞分裂的作用剂处理；所述一种或多种癌细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；选择是自噬的和非凋亡的癌细胞；排除是非自噬的和凋亡的癌细胞；且其中将是自噬的和非凋亡的癌细胞提供给一种或多种自体树突细胞，或者，其中将来源于是自噬的和非凋亡的癌细胞的肽提供给一种或多种自体树突细胞。

下面提供组合物实施方案。提供包括以下的组合物：来自第一受试者的不用干扰素-γ (IFN-γ)处理的至少一种癌细胞，和来自同一第一受试者的至少一种抗原呈递细胞(APC)，其中癌细胞是：自噬的；和非凋亡的。还提供上述组合物，其中癌细胞是表达MHC II类的。还提供上述组合物，其中APC是树突细胞、巨噬细胞或B细胞。还提供上述组合物，其中至少一种癌细胞包含癌特异性肽，且其中癌特异性肽基本上不包含在所述APC内，并且基本上不被所述APC加工。还提供上述组合物，其中癌细胞包含癌特异性肽，且其中癌特异性肽基本上包含在所述APC内，且在所述APC中被部分加工或被充分加工。

还提供上述组合物，其中将癌细胞加载至APC中。还提供上述组合物，其中不将癌细胞加载至APC中。还提供上述组合物，其中自噬通过测定微管相关蛋白轻链3 (LC3)的试验证实。还提供上述组合物，其中使用试剂7-氨基放线菌素D (7-ADD)或试剂膜联蛋白的至少一种证实细胞是非凋亡的。在方法实施方案中，提供在患有癌症和包含癌细胞的受试者中刺激免疫应答的方法，其中受试者与第一受试者是同一受试者，所述方法包括给予免疫有效量的上述组合物。还提供上述组合物，其中至少90%的癌细胞不用IFN-γ体外处理，且小于10%的癌细胞用IFN-γ体外处理。

下面提供制备方法的实施方案。提供用于制备上述疫苗或上述组合物的方法，所述方法包括使至少一种癌症肿瘤细胞与至少一种抗原呈递细胞(APC)接触，其中至少一种癌症肿瘤细胞来自于第一人受试者，且其中至少一种APC来自于同一第一人受试者。还提供用于制备树突细胞疫苗的方法，其包括：将获自第一受试者的癌细胞用阻止细胞分裂的作用剂处理；其中癌细胞不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理；选择是自噬的和非凋亡的癌细胞；且使所选择的癌细胞与来自同一第一受试者的自体树突细胞接触。还提供包含通过上述方法制备的树突细胞疫苗的组合物。此外，提供用于刺激针对癌特异性抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将上述组合物给予患有癌症的受试者。

公开了包含来自患有黑素瘤和包含黑素瘤细胞的指定受试者的黑素瘤特异性肽的哺乳动物树突细胞群；其中所述黑素瘤特异性肽自不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述黑素瘤细胞由树突细胞在体外获得，其中大于60百分比(%)的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述黑素瘤细胞是自噬的和非凋亡的，且其中树突细胞和黑素瘤细胞来自于同一受试者。

还公开了上述哺乳动物树突细胞群，其中：大于80%的所述黑素瘤细胞是自噬的和非凋亡的。

公开了上述树突细胞，其中基本上所有的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的黑素瘤细胞不能够细胞分裂；以及上述树突细胞，其中基本上所有的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的黑素瘤细胞被照射并且不能够细胞分裂；以及上述树突细胞，其中至少80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的黑素瘤细胞被照射并且不能够细胞分裂；以及上述树突细胞，其中至少80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的黑素瘤细胞用核酸交联剂处理并且不能够细胞分裂。

还公开了包含上述哺乳动物树突细胞的上述群体的疫苗。

还公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑素瘤特异性肽来自于不能够细胞分裂的黑素瘤细胞。

此外，公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑素瘤特异性肽来自于因为黑素瘤细胞被照射过而不能够细胞分裂的黑素瘤细胞。

公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑素瘤特异性肽来自于因为黑素瘤细胞的染色体被核酸交联剂交联而不能够细胞分裂的黑素瘤细胞。

还公开了上述树突细胞，其包含来自于用放射处理的黑素瘤细胞的黑素瘤特异性肽。

公开了上述树突细胞，其包含黑素瘤特异性肽，其中全部所述肽来自于用放射处理的黑素瘤细胞。

还公开了上述树突细胞，其包含来源于以下黑素瘤特异性抗原的一种或多种肽：S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶。

公开了上述树突细胞，其中基本上所有的黑素瘤特异性肽来自于经体外处理不能够细胞分裂的黑素瘤细胞。

还公开了上述树突细胞，其中指定受试者为人受试者。

公开了上述树突细胞，其中指定受试者为非人哺乳动物。

公开了黑素瘤疫苗，其包含来自患有黑素瘤的受试者的至少一种成熟树突细胞，其中使至少一种成熟树突细胞与来自同一受试者的至少一种黑素瘤肿瘤细胞接触，其中与至少一种成熟树突细胞接触的至少一种黑素瘤肿瘤细胞是不分裂的、自噬的和非凋亡的。

还公开了用于刺激针对黑素瘤特异性抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫刺激量的权利要求1的树突细胞给予受试者。

公开了其中受试者患有黑素瘤且确实包含黑素瘤细胞。

公开了上述方法，其中被刺激的免疫应答包括CD4+ T细胞应答、CD8+ T细胞应答和B细胞应答的一种或多种。

公开了上述方法，其中CD4+ T细胞应答、CD8+ T细胞应答或B细胞应答可通过ELISPOT测定法、通过胞内细胞因子染色测定法、通过四聚体测定法或通过检测抗原特异性抗体产生来测定。

还公开了上述方法，其中免疫应答包括含2年总体生存率(OS)的生存时间，且其中2年总体生存率为至少60%。

公开了上述方法，其中给药包括皮下注射疫苗。

公开了上述方法，其中给药包括每周一次给予疫苗注射达3个月，然后每月一次达5个月。

还公开了用于制备包括来自同一受试者的黑素瘤细胞和树突细胞的树突细胞疫苗的上述方法，所述方法包括：将一种或多种黑素瘤细胞用阻止细胞分裂的作用剂处理；所述一种或多种黑素瘤细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；选择是自噬的和非凋亡的黑素瘤细胞；排除是非自噬的和凋亡的黑素瘤细胞；且其中将是自噬的和非凋亡的黑素瘤细胞提供给一种或多种自体树突细胞，或者，其中将来源于是自噬的和非凋亡的黑素瘤细胞的肽提供给一种或多种自体树突细胞。

公开了包含以下的组合物：来自第一受试者的不用干扰素-γ (IFN-γ)处理的至少一种黑素瘤细胞，和来自同一第一受试者的至少一种抗原呈递细胞(APC)，其中黑素瘤细胞是：自噬的和非凋亡的。

此外，公开了上述组合物，其中黑素瘤细胞是表达MHC II类的。

还公开了上述组合物，其中APC是树突细胞、巨噬细胞或B细胞。

公开了上述组合物，其中至少一种黑素瘤细胞包含黑素瘤特异性肽，且其中黑素瘤特异性肽基本上不包含在所述APC内，并且基本上不被所述APC加工。

还公开了上述组合物，其中黑素瘤细胞包含黑素瘤特异性肽，且其中黑素瘤特异性肽基本上包含在所述APC内，且在所述APC中被部分加工或被充分加工。还公开了上述组合物，其中将黑素瘤细胞加载到APC中。公开了上述组合物，其中黑素瘤细胞不加载到APC中。

公开了上述组合物，其中自噬通过测定微管相关蛋白轻链3 (LC3)的试验证实。

公开了上述组合物，其中使用试剂7-氨基放线菌素D (7-ADD)或试剂膜联蛋白的至少一种证实细胞是非凋亡的。

公开了在患有黑素瘤和包含黑素瘤细胞的受试者中刺激免疫应答的方法，其中受试者与第一受试者是同一受试者，所述方法包括给予免疫有效量的上述组合物。

公开了上述组合物，其中至少90%的黑素瘤细胞不用IFN-γ体外处理，且小于10%的黑素瘤细胞用IFN-γ体外处理。

公开了用于制备上述疫苗或上述组合物的方法，所述方法包括使至少一种黑素瘤肿瘤细胞与至少一种抗原呈递细胞(APC)接触，其中至少一种黑素瘤肿瘤细胞来自于第一人受试者，且其中至少一种APC来自于同一第一人受试者。

公开了用于制备树突细胞疫苗的方法，其包括：将获自第一受试者的黑素瘤细胞用阻止细胞分裂的作用剂处理；其中黑素瘤细胞不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理；选择是自噬的和非凋亡的黑素瘤细胞；并使所选择的黑素瘤细胞与来自同一第一受试者的自体树突细胞接触。

公开了包含通过上述方法制备的树突细胞疫苗的组合物。

公开了用于刺激针对黑素瘤特异性抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将上述组合物给予患有黑素瘤的受试者。

公开了包含来自第一受试者的至少一种黑素瘤细胞和来自同一第一受试者的至少一种抗原呈递细胞(APC)的组合物，其中黑素瘤细胞是：自噬的、非凋亡的和表达MHC II类的。在本公开内容中，IFN-γ处理的黑素瘤细胞不加载到APC中，且其中IFN-γ处理的黑素瘤细胞不加载到APC中。另一方面，包括了上述组合物，其中黑素瘤细胞来自于I期、II期、III期或IV期黑素瘤受试者。另外，预期上述组合物、相关药盒和相关方法，其中APC包含至少一种树突细胞。

一方面，本公开内容的药物组合物、试剂和相关方法使用是7-AAD阴性和膜联蛋白V阴性的癌细胞的制备物。该群体可以是例如约99% 7-AAD阴性和约99%膜联蛋白V阴性，或至少95% 7-AAD阴性和至少95%膜联蛋白V阴性，或至少90% 7-AAD阴性和至少90%膜联蛋白V阴性，以提供非限制性实例。

此外，包括了上述组合物，其中自噬通过测定微管相关蛋白轻链3 (LC3)的试验证实；和上述组合物，其中使用试剂7-氨基放线菌素D (7-AAD)或试剂膜联蛋白的至少一种证实细胞是非凋亡的。

在方法方面，提供制备上文公开的组合物的方法，所述方法包括从第一受试者中取出至少一种黑素瘤细胞，从第一受试者中取出至少一种APC，使黑素瘤细胞与APC接触；以及用于刺激针对受试者或患者的黑素瘤的免疫应答的方法，所述方法包括将上述组合物给予受试者。

在药盒方面，本公开内容提供用于测试针对受试者的肿瘤抗原的免疫应答的药盒，其中受试者用上述方法的一种或多种治疗，且其中药盒包含检测体液免疫应答、细胞免疫应答或先天免疫应答的试剂。

附图

图1. 显示从贴壁细胞分离漂浮细胞的方法的图示。

图2. 直方图与标志物表达。

图3. 显示MHC II类与标志物表达的流式细胞术。

图4. 流式细胞术与标志物表达。

图5. 细胞相衬显微照片。

图6. 流式细胞术。

图7. 直方图。

图8. 显示MHC II类与膜联蛋白-V的流式细胞术。

图9. 直方图。

图10. MHC II类表达与膜联蛋白-V阳性百分比的示图。

图11. 生存曲线。

图12. 生存曲线。

图13. 生存曲线。

图14. 显示MHC表达的流式细胞术。

图15. MHC I类和MHC II类的表达。

图16. 显示7-AAD与膜联蛋白V的流式细胞术。

图17. 显示MHC表达与膜联蛋白V的流式细胞术。

图18. MHC II类的表达。

图19. 显示MHC表达与膜联蛋白V的流式细胞术。

定义

在没有限制的情况下，免疫刺激量可以是这样的量：提高ELISPOT测定结果可测量的量、提高ICS测定结果可测量的量、提高四聚体测定结果可测量的量、提高血液抗原特异性CD4+ T细胞群可测量的量、提高血液抗原特异性CD8+ T细胞群可测量的量，或其中当与合适的对照相比时，提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、1.5倍、2.0倍、3.0倍等。合适的对照可为对照疫苗，其中树突细胞不加载黑素瘤细胞，或不加载来源于黑素瘤细胞的肽。

在具体的语句重复提及“癌症/癌”时，除非另有说明，否则它将假设癌症是相同类型的癌症。例如，在引述“获自患有癌症的受试者的癌细胞的癌特异性肽”时，它意指下述含义。如果患癌症的受试者患有黑素瘤，则肽是黑素瘤特异性肽，且癌细胞是黑素瘤细胞。

为了提供黑素瘤的非限制性实例，术语“黑素瘤特异性抗原”包括通常与黑素瘤有关的抗原，其中与同其它癌症有关的不同，该抗原被认为是黑素瘤独特的，另外，术语“黑素瘤特异性抗原”包括常与黑素瘤有关的抗原，且其中该抗原还与其它类型的癌症(例如乳腺癌、结肠直肠癌等)有关。

在照射本公开内容的黑素瘤细胞的情况下，“照射”优选通过γ-照射，但也包括通过X射线、电子、中子、质子、电磁照射、可见光、紫外光等照射。一方面，照射起阻止黑素瘤细胞细胞分裂的作用。另一方面，照射阻止细胞分裂，但还使细胞蛋白质变性。作为照射的备选方式，本公开内容通过物理破坏(例如超声处理、空化(cavitation)、脱水、离子耗尽)，或通过暴露于一种或多种盐产生的毒性，来阻止黑素瘤细胞细胞分裂。

如“大于60%的黑素瘤特异性肽”中的术语“百分比”是指肽分子的数目，而不是指不同的抗原确定的肽(different antigenically distinct peptide)的数目。如“大于80%的黑素瘤特异性肽”中的术语“百分比”是指肽分子的数目，而不是指不同的抗原确定的肽的数目。如“小于40%的黑素瘤特异性肽”中的术语“百分比”是指肽分子的数目，而不是指抗原确定的肽的数目。如“小于20%的黑素瘤特异性肽”中的术语“百分比”是指肽分子的数目，而不是指抗原确定的肽的数目，等等。

如“大于60%的黑素瘤特异性肽”中的术语“肽”是指肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和。如“大于80%的黑素瘤特异性肽”中的术语“肽”是指肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和。如“小于40%的黑素瘤特异性肽”中的术语“肽”是指肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和。如“小于20%的黑素瘤特异性肽”中的术语“肽”是指肽分子、寡肽分子和多肽分子的数目的总和，等等。

在来源于一种或多种癌细胞的肽的情况下，“来源于”包括以下方面。例如，可通过匀浆器或通过渗透爆裂，使癌细胞破裂，产生粗提物。可将粗提物的肽、寡肽和多肽暴露于树突细胞中，接着肽被树突细胞加工。来源于还包括用完整癌细胞提供给树突细胞，其中癌细胞是活的，或其中癌细胞已用照射处理但仍有代谢活性，或其中癌细胞已用核酸交联剂处理但仍有代谢活性。“来源于”包括癌细胞碎片、游离癌细胞蛋白和照射过的癌细胞的混合物，其被树突细胞摄取，因此来源于癌细胞。

“给予”当应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、兽药受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，无限制地是指使外源配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物流体等接触。“给予”可涉及例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。细胞的处理包括使试剂与细胞接触，以及使试剂与流体接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”还包括例如细胞用试剂、诊断、结合组合物或用另一种细胞体外和离体处理。

“激动剂”在涉及配体和受体时，包括刺激受体的分子、分子的组合、复合物或试剂的组合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的激动剂可包括GM-CSF、GM-CSF的突变蛋白或衍生物、GM-CSF的肽模拟物、模拟GM-CSF的生物功能的小分子或刺激GM-CSF受体的抗体。拮抗剂，在涉及配体和受体时，包括抑制、对抗、减量调节受体和/或使受体脱敏的分子、分子的组合或复合物。“拮抗剂”包括抑制受体的组成型活性的任何试剂。组成型活性是在缺乏配体/受体相互作用时显现的活性。“拮抗剂”还包括抑制或阻止受体受刺激的(或受调节的)活性的任何试剂。举例来说，GM-CSF受体的拮抗剂包括而绝不限于与配体(GM-CSF)结合并阻止配体与受体结合的抗体，或与受体结合并阻止配体与受体结合的抗体，或其中抗体锁定受体呈无活性构象。

除非另有明确说明，或上下文另有规定，否则术语“表达”包括下列方面。表达包括mRNA生物合成、多肽生物合成、例如通过翻译后修饰的多肽活化或通过改变亚细胞位置或通过募集至染色质所致表达的活化。换句话说，“增加的表达”包括增加的生物合成，或通过磷酸化引起的增加的活性，或通过从细胞溶胶迁至核引起的增加的活性。

抗原呈递细胞(APC)是用于向T细胞呈递抗原的免疫系统的细胞。APC包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、边缘区Kupffer细胞、小胶质细胞、朗格汉斯细胞、T细胞和B细胞(参见例如Rodriguez-Pinto和Moreno (2005) Eur. J. Immunol. 35:1097- 1105)。树突细胞出现于至少两种谱系。第一谱系包括pre-DC1、骨髓样DC1和成熟DC1。第二谱系包括CD34⁺⁺CD45RA-早期祖代多能细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺细胞、CD34⁺⁺CD45RA⁺⁺ CD4⁺ IL-3Ralpha⁺⁺ pro-DC2细胞、CD4⁺CD11c^-浆细胞样pre-DC2细胞、淋巴样人DC2浆细胞样衍生的DC2和成熟DC2 (参见例如Gilliet和Liu (2002) J. Exp. Med. 195:695-704；Bauer等(2001) J. Immunol. 166:5000-5007；Arpinati等(2000) Blood 95:2484-2490；Kadowaki等(2001) J. Exp. Med. 194:863-869；Liu (2002) Human Immunology 63:1067-1071；McKenna等(2005) J. Virol. 79:17-27；O'Neill等(2004) Blood 104:2235-2246；Rossi和Young (2005) J. Immunol. 175:1373-1381；Banchereau和Palucka (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:296-306)。

“有效量”无限制地包括可以改善、逆转、减轻、预防或诊断医学病况或病症的症状或体征的量。除非另有明确说明或通过上下文说明，否则“有效量”不限于足以改善病况的最低量。可毫无任何限制地通过生物标志物或通过临床参数测量疾病或病症的严重程度以及预防、治疗或减轻疾病或病症的治疗的能力。生物标志物包括血细胞计数、血清、尿液或脑脊液中的代谢物水平、肿瘤细胞计数、癌症干细胞计数、肿瘤水平。肿瘤水平可通过RECIST标准(Eisenhauer等(2009) Eur. J. Cancer. 45:228-247)测定。表达标志物包括mRNA的遗传表达或基因扩增、抗原的表达和多肽的表达。临床参数毫无任何限制地包括无进展生存率(PFS)、6个月PFS、无病生存率(DFS)、至进展的时间(TTP)、至远端转移的时间(TDM)和总体生存率。

被“标记的”的组合物是可通过以下方法直接或间接检测的：分光镜方法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法、同位素方法或化学方法。例如，有用的标记包括³²P、³³P、³⁵S、¹⁴C、³H、¹²⁵I、稳定同位素、表位标签荧光染料、电子致密试剂、底物或酶，例如用于酶联免疫测定法或fluorettes (参见例如Rozinov和Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728)。

免疫系统调节剂

下面总体上涉及toll样受体(TLR)激动剂、消耗T调节性细胞(Treg)的作用剂、可提高CD8⁺ T细胞或CD4⁺ T细胞活性的作用剂和可调节免疫系统的其它作用剂。本公开内容提供试剂、给药方法、诊断方法和使用下列试剂的一种或两种及其组合刺激针对肿瘤抗原的免疫应答的方法。

本公开内容提供与树突细胞疫苗一起使用的免疫佐剂和其它免疫系统调节剂。提供toll样受体(TLR)激动剂，例如以下激动剂。咪唑并喹啉类(例如咪喹莫德和瑞喹莫德)是TLR7或TLR8激动剂。刺激浆细胞样树突细胞的TLR7引起IFN-α表达。刺激骨髓样树突细胞的TLR7引起白介素-12表达和随后的Th1型免疫应答。CpG寡核苷酸(CpG ODN)是TLR9激动剂。CpG ODN以3个类别CpG-A、CpG-B和CpG-C存在。因为其对浆细胞样DC的IFN-α产生作用，因此CpG-A刺激NK细胞。CpG-B诱导IFN-α，并增量调节pDC和B细胞上的共刺激标志物。TLR3激动剂包括多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(poly I:C)，其是病毒双链RNA (dsRNA)的类似物。TLR4激动剂包括单磷酰脂质A (MPL)，其是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)脂多糖的衍生物，并且用作针对人乳头瘤病毒的疫苗的一部分。减毒细菌用于抗癌疗法。牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)刺激TLR2和TLR4和TLR9。单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)刺激各种TLR (Dubensky等人的US 2007/0207171，其通过引用以其整体结合到本文中)。另参见Galluzzi等(2012) Oncolmmunology. 1:699-716；Adams (2009) Immunotherapy. 1:949-964。

还提供α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer) (Schwaab和Ernstoff (2011) Therapy. 4:369-377)。α-GalCer激发表达某些T细胞受体的NKT细胞活化(Lopez-Sagaseta等(2012) PLoS Biol. 10:e1001412 (11页))。还提供NOD受体的激动剂。NOD受体包括NOD1和NOD2。NOD激动剂包括N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(胞壁酰二肽(MDP))，其与NOD 2结合。NOD激动剂包括γ-D-谷氨酰基-内消旋-二氨基庚二酸(iE-DAP)，其与NOD1结合。NOD激动剂包括脱胞壁酰肽(DMP)，其与NOD1结合。参见例如Uehara等(2006) J. Immunol. 177:1796-1804)。NOD激动剂来源于肽聚糖的片段。

还提供抑制T调节性细胞(Treg)的作用剂。这些作用剂包括环磷酰胺、吉西他滨和消耗Treg的抗体(参见例如Le和Jaffee (2012) Cancer Res. 72:3439-3444；Klages等(2010) Cancer Res. 70:7788-7799)。吉西他滨降低骨髓衍生的抑制性细胞(MDSC)的免疫抑制活性(Le等(2009) Int. Immunopharmacol. 9:900-909)。抗CD25抗体可消耗Treg，并且已用于癌症治疗(Klages等(2010) Cancer Res. 70:7788-7799)。达克珠单抗是一种抗CD25抗体，其阻断白介素-2 (IL-2)与CD25结合，因此阻断Treg维持所需要的信号。某些Treg表达高水平的CTLA4 (CD45RA⁺ Treg)。抗CTLA4抗体(例如伊匹木单抗)靶向CTLA4。伊匹木单抗用于治疗黑素瘤(Rech等(2012) Immunotherapy. 4:1103-1105)。

淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)阻滞剂(例如抗LAG-3抗体或可溶性LAG-3 (例如LAG-3 Ig))，可提高对癌症或感染的免疫应答。抗LAG-3抗体降低Treg的活性(参见例如Huang等(2004) Immunity 21:503-513；Triebel (2003) Trends Immunol. 24:619-622)。

可获得直接靶向CD8⁺ T细胞或CD4⁺ T细胞的抗体。这些抗体包括靶向共刺激受体(4-1 BB、OX40和GITR)或阻断共抑制受体(CTLA-4、PD-1和PD-L1)的那些抗体。GITR是糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白。参见例如Schaer等(2010) Curr. Opin. Investig. Drugs. 11:1378-1386)。抗GITR可终止Treg的抑制功能，因此解释了抗GITR在抗癌疗法中的功效(Coe等(2010) Cancer Immunol. Immunother. 59:1367-1377)。DTA-1是一种抗GITR抗体。

评价免疫应答的方法

本公开内容还提供ELISPOT测定法、胞内细胞因子染色(ICS)和四聚体测定法，用于表征免疫应答(参见例如Pardoll的US 2007/0190029；Chattopadhyay (2008) Cytometry A. 2008 73:1001-1009；Vollers (2008) Immunology. 123:305-313；Lalvani等(1997) J. Exp. Med. 186:859-865；Waldrop (1997) J. Clin. Invest. 99:1739-1750；Hudgens (2004) J. Immunol. Methods 288:19-34；Goulder (2001) J. Virol. 75:1339-1347；Goulder (2000) J. Exp. Med. 192:1819-1831；Anthony (2003) Methods 29:260-269；Badovinac和Harty (2000) J. Immunol. Methods 238:107-117)。可通过用于肿瘤学临床试验的终点，包括客观反应(RECIST标准)、总体生存率、无进展生存率(PFS)、无病生存率、至远端转移的时间、6个月PFS、12个月PFS等，来评价患者的免疫应答。

抗原

成胶质细胞瘤特异性抗原包括PTPRZ1、EGFR、SEC61G、TNC、HER2、TRP-2、gp100、MAGE-1、IL13Ralpha2、AIM-2 (Phuphanich等(2013) Cancer Immunol. Immunother. 62:125-135；Neidert等(2012) J. Neurooncol.)。结肠直肠癌特异性抗原包括SPARC、CEA、Cep55/c10orf3 (Inoue等(2010) Int. J. Cancer. 127:1393-1403；Parkhurst等(2011) Mol. Ther. 19:620-626；Inoda等(2011) Exp. Mol. Pathol. 90:55-60)。肾癌特异性抗原包括碳酸酐酶IX (CA-IX)、MUC-1和NYESO-1和5T4 (Tykodi等(2012) J. Immunother. 35:523-533)。卵巢癌特异性抗原包括WT1、间皮素、NY-ESO-1、p53、携带特异性突变的p53、HER-2/neu、叶酸受体-α、IGFBP、MUC1、MUC4、MUC16、EpCAM、CTA (Dohi等(2011) Anticancer Res. 31:2441-2445；Vermeij等(2012) Curr. Pharm. Des. 18:3804- 3811；Preston等(2011) Immunother. 3:539-556)。特异性可产生自抗原的氨基酸序列、肿瘤细胞表达该抗原的程度、抗原的翻译后修饰等。某些类型的癌细胞的特异性也可产生自多种肿瘤抗原的特定指纹。特异性还可产生自这样的事实，即具体的抗原虽然由各种各样的肿瘤细胞表达，但只在针对较少数的肿瘤类型的免疫疗法中具有特定用途。特异性还可产生自这样的事实，即特定集合的MHC I类可呈递和MHC II类可呈递表位存在于特定的多肽或多肽片段上。此外，可通过删除可激发免疫耐受性的一种或多种肽，在所给予的抗原中产生特异性。技术人员可容易地查到相关的核酸和多肽序列，例如美国政府网址ncbi.nlm.nih。

疫苗

本公开内容的疫苗可以是纯预防性的，其可用于治疗现有的癌症或肿瘤前病症，或可用于预防之前治疗的癌症的复发。本公开内容的树突细胞疫苗可通过真皮内、结内、粘膜或皮下途径、或上述的任何组合给予。每个剂量可包含约10 x 10³个树突细胞、20 x 10³个细胞、50 x 10³个细胞、100 x 10³个细胞、200 x 10³个细胞、500 x 10³个细胞、1 x 10⁶个细胞、2 x 10⁶个细胞、20 x 10⁶个细胞、50 x 10⁶个细胞、100 x 10⁶个细胞、200 x 10⁶、500 x 10⁶、1 x 10⁹个细胞、2 x 10⁹个细胞、5 x 10⁹个细胞、10 x 10⁹个细胞等。给药频率可为例如每周一次、每周两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每两月一次、每三月一次、每四月一次、每五月一次、每六月一次等。其中发生给药的总天数可为1天、2天或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天等。要了解，任何规定的给药可包括在同一日注射两次或更多次。一方面，本公开内容包括树突细胞用完整肿瘤细胞加载，其中至少10%、其中至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的加载到树突细胞的黑素瘤细胞来源的蛋白质停留在完整肿瘤细胞中。在非限制性实施方案中，将树突细胞疫苗装在培养瓶、小瓶、瓶、注射器、导管、套管等中。对于给药，至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%的给予的树突细胞为成熟树突细胞。

疫苗均质性

在实施方案中，本公开内容提供包含树突细胞的疫苗，所述树突细胞含有来源于体外加载的黑素瘤肽，其中疫苗包含树突细胞/黑素瘤细胞的比率为至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1等的树突细胞(含有黑素瘤肽的DC和不含黑素瘤肽的DC的总和)。还提供包含树突细胞的疫苗，所述树突细胞含有来源于体外加载的黑素瘤肽，其中疫苗包含[树突细胞]/[既非DC也非黑素瘤的细胞]的比率为至少5/95、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10、95/5、98/2、99/1等的树突细胞(含有黑素瘤肽的DC和不含黑素瘤肽的DC的总和)。本公开内容提供分区容器，其中第一区室含有黑素瘤细胞，第二区室含有树突细胞。两个区室可被防止黑素瘤细胞与树突细胞接触的膜、滤器、阀、管道、联接器分开，但是在手工转移时，或在除去膜或打开阀时允许黑素瘤细胞与树突细胞接触，使黑素瘤细胞、黑素瘤细胞片段和/或黑素瘤肽加载到树突细胞中。

干扰素 - γ模拟物

本公开内容包括模拟物，例如干扰素-γ模拟物，例如模拟肽95-132 (Ahmed (2007) J. Immunol. 178:4576-4583；Fulcher (2008) FEBS Lett. 582:1569-1574)。IFN模拟物包括例如具有相同的干扰素-γ激动剂活性的抗体。

使黑素瘤细胞灭活

本公开内容提供组合物和方法，其中例如通过辐射或通过核酸交联剂使癌细胞灭活。示例性的交联剂具有交联DNA但留下未被修饰的蛋白质的能力。核酸烷基化剂(alkylator)可以是β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一些实施方案中，靶向核酸的化合物是被UVA照射激活的补骨脂素化合物。例如，核酸靶向化合物可以是4'-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4,5',8-三甲基补骨脂素(本文亦称为“S-59”)。细胞可用150微摩尔补骨脂素S-59和3 J/cm² UVA光(FX 1019照射装置，Baxter Fenwal，Round Lake，IL)灭活。用S-59灭活称为光化学处理，并导致细胞彻底失活。可测试不同浓度的核酸交联剂在使细胞灭活中的功效，例如阻止细胞分裂的功效。S-59的特征是其交联核酸、但留下未被修饰的完整蛋白质的能力。可将细胞悬浮于5 mL含有0、1、10、100和1000 nM的补骨脂素S-59的盐水中。如下照射每个样品。可加入100 nM浓度的S-59。可按约2 J/cm² (FX1019照射装置，Baxter Fenwal，Round Lake，III.)的剂量对样品进行UVA照射。然后将各样品转移到15 mL管中，离心，除去上清液，然后用5 mL盐水洗涤，离心，除去上清液，并将最后的沉淀悬浮于0.5 mL盐水中(Dubensky的美国专利号7,833,775和Dubensky的7,691,393)。

非凋亡癌细胞的富集

可通过例如采用从是非自噬的和凋亡的细胞中分离是非凋亡的和自噬的细胞的技术，在是非凋亡的黑素瘤细胞中富集黑素瘤细胞群，其中分离通过使自噬的和非凋亡的细胞粘附在表面上进行，其中其它细胞是漂浮的。还可通过借助于对磷脂酰丝氨酸有特异性的抗体除去凋亡的细胞，来获得在非凋亡的黑素瘤细胞中富集的群体。可获得通过固定化抗体除去细胞的技术(Onodera (1998) Ther. Apher. 2:37-42)。可获得对磷脂酰丝氨酸有特异性的抗体(例如，EMD Millipore，Billerca，MA)。此外，大部分黑素瘤细胞群可用荧光抗磷脂酰丝氨酸抗体标记，其中加标签的凋亡的黑素瘤细胞通过流式细胞术、亲和色谱法、免疫磁性分离除去(参见例如Hoeppener (2012) Recent Results Cancer Res. 195:43-58；Dainiak (2007) Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 106:1-18)。该技术一般适用于在是黑素瘤细胞的癌细胞中富集，也适用于不是黑素瘤细胞的癌细胞。

凋亡抑制剂

凋亡抑制剂Z-VAD (Z-VAD-fmk)可获自例如Enzo Life Sciences (Exeter，UK)、R & D Systems (Minneapolis，MN)、Tocris Biosciences (Bristol，UK)、BioMol (Plymouth Meeting，PA)和EMD Chemicals (Gibbstown，NJ)。Z-VAD-fmk是一种合成肽Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH₂F。胱天蛋白酶是蛋白酶家族的半胱氨酸-天冬氨酸特异性成员。通过死亡受体连接例如TRAIL、FAS；通过DNA损伤、应激、血清饥饿和在一些细胞类型中通过干扰素，来激活胱天蛋白酶。胱天蛋白酶在高度调节的细胞凋亡的过程(包括核断裂、染色质浓缩和胞质完整性丢失)中起关键作用。全胱天蛋白酶(pan-capase)抑制剂z-VAD-fmk (苄氧羰基-缬氨酰基-丙氨酰基-天冬氨酰基[O-甲基]-氟甲基酮)不可逆地结合胱天蛋白酶的催化部位并抑制其在诱导细胞凋亡中的功能。抑制细胞在响应IFN-γ时进行细胞凋亡的能力可以是籍此产生是非凋亡但是自噬的细胞而无需通过洗涤除去漂浮的凋亡细胞的选择步骤的手段。

本公开内容提供药物、试剂、药盒(包括诊断药盒)，其中药物、试剂和药盒包含树突细胞、抗体或抗原。还提供用于给予包含至少一种树状细胞和至少一种抗原的组合物的方法、用于刺激抗体形成的方法、用于刺激ADCC的方法、用于刺激补体依赖性细胞毒性的方法及用于测定患者适合性、用于在临床试验或普通医学治疗的情况下测定患者纳入/排斥标准和用于预测对药物或试剂的反应的方法和药盒。描述了补体依赖性细胞毒性(参见例如Goodman等(1990) J. Clin. Oncol. 8:1083-1092；Cheson (2010) J. Clin. Oncol. 28:3525-3530)。本公开内容的药物组合物、试剂和相关方法包括CD83阳性树突细胞，其中CD83通过加载IFN-γ处理的癌细胞来诱导。在本公开内容的CD83方面，CD83被诱导至少2%、至少3%、至少4%、6%、7%、8%、9%、10%等。

图 1显示在用IFN-γ处理前(左)和在用IFN-γ处理72小时后(右)培养的肿瘤细胞的示图。在处理后，培养的肿瘤细胞是漂浮的、非自噬的和凋亡的，或是贴壁的、自噬的和非凋亡的。漂浮细胞显示表达凋亡标志物磷脂酰丝氨酸。漂浮细胞显示相对少地表达MHC II类，而贴壁细胞显示过量表达MHC II类。

图 2A-D显示用于加载树突细胞的IFN-γ处理的自体肿瘤细胞的特征。在含15% FBS/ECS的RPMI中，将自体黑素瘤肿瘤细胞用或不用1000 IU/mL IFN-γ处理72小时，收获，用100Gy照射，并冷藏保存。然后将细胞在AIMV中融化，取样品用于流式细胞术和用于制备进行免疫印迹法的细胞裂解物，然后进行DC的抗原加载。显示了4个不同的自体黑素瘤细胞系的实例(图2A、图2B和图2C)。通过IFN-γ处理自体肿瘤细胞诱导主要组织相容性复合体(图2D)。在用或不用1000 IU/mL IFN-γ处理72小时后收获肿瘤细胞，然后测定MHC I类和II类。使用对照同种型抗体鉴定阳性群体。深色数据点表示中值平均荧光+/-95%置信区间。N = 65。在照射后，通过测定检查黑素瘤细胞，确保没有任何有丝分裂。

一方面，本公开内容不包括用于加载树突细胞的非自体肿瘤细胞，并且不包括使用用于加载树突细胞的非自体肿瘤细胞的方法。

图 3A 和 3B描述了用或不用干扰素-γ处理的自体黑素瘤细胞系加载的树突细胞的表型。将一组4个自体黑素瘤细胞系用或不用1000 IU/mL的IFN-γ处理72小时，照射并冷藏保存。然后将细胞在AIMV中融化，与自体树突细胞混合约24小时，随后收获并通过流式细胞术测定CD80、CD83、CD86和MHC II类的表达(图3A)。数据概括于图3B。显示了平均值± SD，n = 4。

图 4A 和 4B显示用于剂量制剂的树突细胞的表型。通过流式细胞术，针对CD80、CD83、CD86和MHC II类的表达，对在用IFN-γ处理的、经照射的自体肿瘤细胞加载之前(ATC加载前DC，N = 53)和加载之后(ATC加载后DC，N = 65)的DC样品进行了评价。使用FACS Caliber®珠粒设定初始流式细胞仪仪器设置，其随后在数据采集期间保持恒定(图4A)。图4B中，比较了ATC加载前和ATC加载后的百分比表达和平均荧光强度(MFI)的值±SD。*p = 0.019和**p = 0.0009。

图 5A-5C显示干扰素-γ处理的黑素瘤细胞进行自噬。在5%FBS/RMPI中，将选择的市售得到的黑素瘤细胞系与1000 IU/mL IFN-γ一起温育72小时。在温育期结束时拍摄SK-5-Mel细胞培养物的相衬显微照片(图5A)，显示具有表明自噬体的空泡的放大细胞。通过在用IFN-γ处理前用GFP-LC3B构建体转染证实了自噬体形成(图5B)。通过使用LC3B抗体的蛋白质印迹法证实了在IFN-γ处理后的自噬诱导(图5C)，其鉴定出已表明与自噬管(autophagic vessel)形成有关的LC3的快速迁移形式。

图 6A 和 6B揭示响应干扰素-γ时所诱导的细胞凋亡和自噬。使SK-5-Mel细胞与1000 IU/mL的IFN-γ一起温育72小时，之后收集非贴壁群和贴壁群，使用7-AAD和膜联蛋白-V，通过流式细胞术测定细胞凋亡和自噬(图6A)。通过流式细胞术，经测量生产商提供的染料的平均峰移强度(图6B)，使用Enzo Cyto-ID自噬检测染料测量自噬。与5% FBS/RPMI相比的峰移倍数变化见图6C，其中无血清用作自噬诱导的阳性对照。

图 7揭示了在黑素瘤细胞中在阻断胱天蛋白酶活性后的自噬诱导不影响响应IFN-γ的自噬诱导。在20uM全胱天蛋白酶抑制剂z-VAD或其对照化合物z-FA存在下，将SK-5-Mel细胞用1000 IU/mL的IFN-γ处理72小时。收获细胞，并通过流式细胞术测定自噬，如图6C所示。

图 8显示在10 uM自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)存在下，与1000 IU/mL的IFN-γ一起温育72小时的SK-5-Mel细胞。然后收获细胞，并通过流式细胞术，测定细胞凋亡和MHC II类(HLA-DR)表达。

图 9显示针对MHC II类或细胞凋亡的变化，对自患者肿瘤样本(N = 36)产生的肿瘤细胞系的IFN-γ处理的细胞进行测定。所示数据是平均荧光强度(MFI)的平均数± SE。

图 10显示通过流式细胞术，自用于加载树突细胞以用于患者特异性疫苗免疫疗法的样品，测定IFN-γ处理的细胞(N = 54)的MHC II类或细胞凋亡。显示了MHC II类平均荧光强度(MFI)的倍数变化和百分比凋亡细胞(膜联蛋白-V阳性)。

图 11和图 12显示在接受了加载自噬的、非凋亡的干扰素-γ处理的肿瘤细胞的树突细胞的患者中，MHC II类诱导和细胞凋亡缺乏(干扰素-γ抵抗)间的关系与更好的无进展生存率(图11)和总体生存率(图12)有关。

图 13显示3个试验的生存曲线。示图(Kaplan-Meier图)是一种阶梯曲线，显示在临床试验期间研究受试者生存的百分比。各组命名为DC-54 (实心圆)；TC-74 (实心正方形)；TC-24 (实心三角形)；和DC-18 (直线)。用TC-24出现最差生存率。次最差生存率是用TC-74。TC-24是指在包括24名受试者的研究中肿瘤细胞的疫苗。

图 14显示3个试验的生存曲线。试验是与图13所公开的那些相同的临床试验，但有较后时间点获得的其它数据。

其它公开内容

自体树突细胞产生

在补充IL-4 (CellGenix，Freisberg，Germany)和GM-CSF (Berlex，Seattle，WA)各1,000 IU/mL的无抗生素AIM-V培养基(Invitrogen，Grand Island，NY) (DC培养基)中，通过ficoled单采血液成分术产品的塑料粘附方法(Choi等(1998) Clin. Cancer Res. 4:2709-2716；Luft等(1998) Exp. Hematol. 26:489-500；Cornforth等(2011) Cancer Immunol. Immunother. 60:123-131)产生树突细胞。然后培养瓶经培养6天后，加载IFN-γ处理的、经照射的自体肿瘤细胞。

IFN-γ自体肿瘤细胞系产生和药物的制备

按照Cornforth等人(Cornforth等(2011) Cancer Immunol. Immunother. 60:123-131；Dillman等(1993) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14:65-69；Dillman等(2000) Cancer Biother. Radiopharm. 15:161-168)，产生纯的肿瘤细胞。然后使肿瘤细胞与1,000U/mL的干扰素-γ (InterMune，Brisbane，CA)一起温育72小时，用来自铯源的100Gy照射，并冷藏保存(Selvan等(2007) Int. J. Cancer 122:1374-1383；Selvan等(2010) Melanoma Res. 20:280-292)。从冷藏保存中回收IFN-γ处理和照射的肿瘤细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后加入到培养的树突细胞(DC)中，然后温育约24小时。通过用橡胶刮棒轻轻刮擦，收获加载抗原的DC，并冷藏保存。获得等分的IFN-γ处理或未处理的肿瘤细胞和加载的DC用于流式细胞术评价和锥虫蓝排斥测定。

皮肤黑素瘤的分期

可将本公开内容的药物或试剂给予黑素瘤患者，其中黑素瘤诊断为I期、II期、III期或IV期(Mohr等(2009) Ann. Oncology (Suppl. 6) vi14-vi21)。例如，I期是指患有原发性黑素瘤、没有局部或远端转移证据的患者。II期包括没有淋巴病或远端转移证据的患者，其中患者通过以下进一步表征：例如病变大于1mm，且覆盖在上皮上面的溃疡厚小于或等于2mm；或病变大于2mm，且上皮溃疡厚小于或等于4mm。III期黑素瘤包括具有病理学记载的涉及局部淋巴结或移动中(in-transit)或随体(satellite)转移的病变，其中患者可具有例如1、2、3或4个或更多个受累淋巴结。IV期黑素瘤定义为存在远端转移，其中转移仅位于远端皮肤、皮下组织或淋巴结；其中转移包括肺转移；或其中转移包括所有其它的内脏部位。

本公开内容包括用于是预防性给药(即用于尚未或从未诊断为黑素瘤的受试者)的方法。包括这样的给药方法，其中受试者早期被诊断为黑素瘤、早期已成功接受治疗以根治黑素瘤(或经历过自发性完全缓解)和其中在根治后预防性地使用给药。

肿瘤抗原

不意指任何限制，本公开内容的黑素瘤细胞表达Mage、Mart-1、Mel-5、HMB45、S100或酪氨酸酶的一种或多种(Dillman等(2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 26:407-415)。一方面，肿瘤抗原的检测使用未暴露于IFN-γ的细胞，而另一方面，肿瘤抗原的检测在用IFN-γ处理的细胞中进行(参见例如Cornforth等(2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 26:345-351)。包括了表达一种或多种黑素瘤抗原的黑素瘤细胞，或包含一种或多种分离的黑素瘤抗原的组合物，如Dubensky等人的US2007/0207171所公开，其通过引用以其整体结合到本文中。

测量细胞凋亡

可用许多试剂(例如荧光染料标记的膜联蛋白)、通过用染料(例如碘化丙锭和7-氨基放线菌素D (7-AAD))染色、通过测定线粒体内膜电位的丧失、通过测量胱天蛋白酶的活化或切割，来检测或测量细胞凋亡。参见例如George等(2004) Cytometry Part A. 59A:237-245。细胞凋亡的早期事件是磷脂酰丝氨酸暴露于质膜的外表面，这可通过荧光染料标记的膜联蛋白检测。可用得方法可区分活细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。本公开内容使用在IFN-γ处理后，通过7-ADD测定不是凋亡的、通过膜联蛋白V测定不是凋亡的、通过细胞凋亡测定不是凋亡的(Dillman等(2011) Cancer Biotherapy Radiopharmaceuticals 26:407-415)或通过生物标志物Bcl-2、胱天蛋白酶-3、P53或存活蛋白的一种或多种而不是凋亡的(Karam等(2007) Lancet Oncol. 8:128-136)黑素瘤细胞。本公开内容的药物组合物、试剂和相关方法不包括IFN-γ处理的是凋亡的黑素瘤细胞，其中细胞凋亡按照例如被授予专利权的Herlyn等人的美国专利号7,544,465、被授予专利权的Thorpe等人的美国专利号7,714,109测定，所述专利通过引用结合到本文中。

测量自噬

自噬是用于许多蛋白质和一些细胞器降解的一个天然存在的过程。自噬介导蛋白质和细胞器更新、饥饿反应、细胞分化、细胞死亡等。微管相关蛋白轻链3 (LC3)将用于监测自噬。在一种方法中，自噬可通过测量LC3转化(其包括LC3-I转化成LC3-II)来检测。LC3-II的量与自噬体的数目相关。详细地讲，LC3是胞质的和可溶的，而LC3-II存在于膜上。LC3-II有较大的分子量，因为它与脂质缀合。LC3加工可通过例如蛋白质印迹测量，而自噬、自噬泡和自噬体可通过显微镜测量。可例如通过检测已加工的LC3-II、通过早期与晚期自噬区室间的比例或通过自噬的容积对自噬进行定量测定。参见(Mizushima和Yoshimori (2007) Autophagy 3:542-546:634-641；Tanida等(2008) Methods Mol. Biol. 445:77-88；Eng等(2010) Autophagy 6:634-641)。一方面，本公开内容利用自噬作为筛选工具，用于选择合适的自噬癌细胞，其中可根据一个或多个特定阶段中自噬的出现来选择细胞。这些自噬阶段包括：(1)通过自噬体分隔出胞质区室，(2)自噬体与溶酶体融合形成自体溶酶体，和(3)自体溶酶体内容物被溶酶体内的蛋白酶降解。另一方面，本公开内容包括大部分显示第一阶段的细胞、大部分为第二阶段、大部分为第三阶段、大部分为第一和第二阶段、大部分为第二和第三阶段或大部分显示所有三个阶段的细胞。又一方面，本公开内容包含显示第一阶段、第二阶段、第三阶段、第一和第二、第二和第三阶段的细胞或显示所有三个阶段的细胞。

干扰素 - γ (IFN- γ ) 信号转导

IFN-γ (II型干扰素)信号转导取决于许多基因的表达，例如IFN-γ受体、STAT1、STAT2、STAT1同二聚体、STAT1/STAT2异二聚体、IRF-1、GAS和IRF-E。研究表明，IFN-γ信号转导取决于IFN-γ受体(IFNGR1链；IFNGR2链)。细胞表面上IFNGR的低表达可阻断IFN-γ信号转导的某些方面(Schroder等(2004) J. Leukocyte boil. 75:163-189)。一方面，本公开内容不包括使用显示低的IFNGR表面表达的癌细胞。另一方面，本公开内容针对表达STAT1同二聚体的细胞筛选癌细胞，使用这些细胞，且基本上不包括不表达STAT1同二聚体的细胞。又一方面，本公开内容预期针对具有STAT1磷酸化(丝氨酸-727)的细胞筛选细胞。还预期不包括来自具有STAT1基因中功能突变丧失的患者的癌细胞(参见例如Dupuis等(2001) Science 293:300-303；Schroder等(2004) J. Leukoc. Biol. 75:163-189)。下面涉及IRF基因家族。IRF-1、IRF-2和IRF-9都参与IFN-γ信号转导。本公开内容包括使用表达这些IRF基因家族基因的一种或多种的癌细胞，或不包括不表达这些基因的一种或多种的癌细胞。

IFN-γ响应基因

本公开内容包括需要使用响应IFN-γ的黑素瘤细胞或肿瘤发生前黑素瘤细胞的生物材料、组合物、试剂和方法。可通过测定一种或多种IFN-γ响应基因的表达，来鉴定、区分和选择黑素瘤细胞。已鉴定出许多IFN-γ响应基因(参见例如Halonen等(2006) J. Neuroimmunol. 175:19-30；MacMicking (2004) 11:601-609；Boehm等(1997) 15:749-795)。所述测定可包括从患者中取出一个或多个黑素瘤细胞，在添加的IFN-γ存在和不存在下培养该细胞，并测定对IFN-γ的响应性。在该测定中，可通过测定对转录因子与IFN-γ诱导的基因的启动子结合、对自IFN-γ诱导的基因的mRNA的表达、对表达的多肽等的敏感性，来检测IFN-γ诱导的基因表达。IFN-γ响应基因可包括例如用于免疫应答的基因、编码转录因子、转运蛋白的基因、细胞凋亡基因、用于细胞生长或维持的基因、用于脂质代谢的基因、介导胞吞或胞吐的基因、胞内信号转导基因、葡萄糖代谢基因、细胞粘附基因以及没有确定功能的基因。

一方面，本公开内容不包括这样的黑素瘤细胞，即在IFN-γ处理的情况下显示MHC II类表达降低、显示MHC II类表达无可检出的变化、显示MHC II类表达增加10%或更少、显示MHC II类表达增加15%或更少、显示MHC II类表达增加20%或更少、25%或更少、30%或更少、40%或更少、50%或更少等。一方面，百分比值是指存在于得自指定受试者或患者的活检样品或部分活检样品中黑素瘤细胞群的平均表达值。

用于 IFN- γ响应癌细胞筛选的 IFN- γ可诱导基因的非限制性清单

ab000677，JAB/SOCS1；m63961，IFN-γ可诱导蛋白(mag-1)；m35590，巨噬细胞炎性蛋白1-β；m19681，MCP-1 (JE)；y07711，斑联蛋白；M34815，IFN-γ诱导的单核因子(MIG)；m33266，干扰素可诱导蛋白10 (IP-10)；U44731，嘌呤核苷酸结合蛋白；U88328，细胞因子信号转导-3超家族(SOCS-3)；M21065，干扰素调节因子1；M63630，GTP结合蛋白(IRG-47)；U19119，G-蛋白样LRG-47；L27990，Ro蛋白；M31419，204干扰素可激活蛋白；af022371，干扰素可诱导蛋白203；U28404，MIP-1 α受体；U43085，糖皮质激素减毒反应39；x56123，踝蛋白；m31419，204干扰素可激活蛋白；U53219，GTPase IGTP；l38444，T细胞特异性蛋白质；M31418，202干扰素可激活蛋白；d38417，芳基烃受体；m26071，组织因子(mtf)；D13759，Cot原癌基因；M18194，纤连蛋白；u59463，ICH-3；M13945，pim-1原癌基因；L20450，DNA结合蛋白(参见Gil等(2001) Proc. Natl. Acad. Sci 98:6680-6685)。本公开内容包括使用IFN-γ诱导的基因CIITA (参见例如Chan等(2010) J. Leukocyte Biol. 88:303-311；Kwon等(2007) Mol. Immunol. 44:2841-2849)。

本公开内容包括测量下列IFN-γ可诱导基因的一种或多种的表达，作为用于限定或选择给予药物的患者的筛选程序。所述基因包括(基因1) FCGR1A、(基因2) IL6R、(基因3) CXCL9、(基因4) CLCSF14、(基因5) UBD、(基因6) C/EBPα和(基因7) MHC2TA (CIITA) (参见Waddell等(2010) PLoS ONE 5:e9753)。在限定程序中还包括使用这些基因的特定群，例如基因1和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、2和4、2和5、2和6、2和7、3和5、3和6、3和7、4和6、4和7、5和7，以及3种基因的组合，例如1、2、3；或3、4、5；或4、5、6；或5、6、7；或1、3、4；或1、3、5；或1、3、6；或1、3、7；或1、2、4；或1、2、5；或1、2、6；或1、2、7等。(这些基因编号是任意的)。

不包括小于90%是自噬的、小于80%是自噬的、小于70%是自噬的、小于60%是自噬的、小于50%是自噬的、小于40%是自噬的等黑素瘤细胞群。

不包括小于90%是非凋亡的、小于80%是非凋亡的、小于70%是非凋亡的、小于60%是非凋亡的、小于50%是非凋亡的、小于40%是非凋亡的等黑素瘤细胞群。

不包括小于90%是非贴壁的、小于80%是非贴壁的、小于70%是非贴壁的、小于60%是非贴壁的、小于50%是非贴壁的、小于40%是非贴壁的等黑素瘤细胞群。

测量 MHC II 类的表达

例如，可使用对MHC II类基因产物有特异性的抗体或核酸探针，测量MHC II类的表达。这些MHC II类基因产物包括HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB1以及HLA-DM和HLA-DO (参见例如Apostolopoulos等(2008) Human Vaccines 4:400-409)。

例如，本公开内容包括需要表达STAT1和STAT2、具有活性STAT1信号转导途径、具有活性STAT2信号转导途径或具有活性STAT1和STAT2信号转导途径的黑素瘤细胞的试剂、治疗方法和诊断方法。

本公开内容提供产生具有危险比(hazard ratio，HR)小于1.0、HR小于0.9、HR小于0.8、HR小于0.7、HR小于0.6、HR小于0.5、HR小于0.4、HR小于0.3等的生存率数据的药物组合物或药用试剂、相关给药方法和治疗方法。本公开内容产生总体生存数据、无进展生存数据、至进展的时间数据等。还提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6个月PFS。此外，提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的6个月总体生存率。另外提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的1年(或2年) PFS。此外，提供至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%等的1年(或2年)总体生存率(参见例如U.S. Dept. of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Guidance for Industry. Clinical trial endpoints for the approval of cancer drugs and biologics (2005年4月))。

IFN-γ和自噬的诱导

在IFN-γ处理后自噬的诱导，如通过主要组织相容性II类复合体表达的增加所测量，可用来测定对系统IFN-γ处理的响应。如果活检黑素瘤肿瘤细胞在培养时暴露于IFN-γ中，进行自噬但无细胞凋亡，则这就表明这些患者可有利地响应系统IFN-γ处理。另外，如果从活检样品建立成功的细胞系，则患者还可获利于细胞疗法产品，所述产品由IFN-γ处理的纯化的肿瘤细胞系制备，所述细胞系来自于自噬但非凋亡的贴壁细胞群。

本公开内容包括分离和表征主要组织相容性复合体，其分离自从用干扰素-γ处理的肿瘤细胞系中收集的自噬非凋亡细胞。主要组织相容性复合体含有对CD4⁺ T细胞有特异性的抗原，并且与抗体介导的免疫应答有关。该复合体可表示大的抗原库，所述抗原因在自噬细胞中诱导的溶酶体介导的抗原加工的作用所致可能不存在于非自噬细胞中。

因自噬肿瘤细胞表面的高水平的主要组织相容性复合体所致，自IFN-γ处理的细胞系产生的非凋亡自噬肿瘤细胞可与树突细胞融合以提高抗原呈递。该过程将产生因两种细胞类型融合产生的新的细胞产物。

自噬响应IFN-γ的诱导过程可以不引起细胞凋亡的方式诱导。通过肿瘤细胞用胱天蛋白酶抑制剂和干扰素γ处理的组合，可阻断细胞死亡过程(和最终tolergeneic凋亡细胞的形成)而不抑制自噬的诱导或主要组织相容性II类复合体的增加。

清除凋亡细胞同时保留有活力的自噬细胞的方法

在临床试验中，黑素瘤研究表明存在凋亡细胞与生存率差之间的相关性(Cornforth等(2011) Cancer Immunol. Immunother. 60:123-131；Dillman等(2011) Cancer Biother. Radiopharmaceuticals 26:407-415)。下面的研究调查了在体外IFN-γ处理黑素瘤肿瘤细胞后自噬、细胞凋亡和MHC II类分子的诱导。

研究方法如下。将自体和模式黑素瘤肿瘤细胞系与1000 IU/mL的IFN-γ一起温育72小时后，测定自噬、细胞凋亡和MHC II类表达。通过用抗LC3 II的抗体的免疫印迹和通过带有Enzo's CytoID®自噬检测试剂盒的流式细胞术检测自噬。分别使用7-AAD和膜联蛋白-V染色和抗MHC II类的抗体，通过流式细胞术测定细胞凋亡和MHC II类诱导。7-AAD嵌入dsDNA中。7-AAD被有活力的细胞排斥，因此可用来检测死细胞。

研究结果表明，IFN-γ在黑素瘤细胞系中诱导自噬和凋亡细胞群两者。凋亡群主要存在于非贴壁群中，而自噬细胞保持附着在培养瓶上。用抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬抑制响应IFN-γ时MHC II类阳性细胞的诱导(39.4% IFN-γ相对于10.0% IFN-γ + 3-MA)。用全胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD抑制胱天蛋白酶活性阻止细胞凋亡但不干扰IFN-γ处理的细胞的自噬(2.75 ± 0.15 IFN-γ相对于3.04 ± 0.27 IFN-γ + Z-VAD，倍数变化)。最后，细胞凋亡的诱导与自噬和MHC II类诱导的水平降低有关。本公开内容提供清除凋亡细胞的方法或程序，同时在IFN-γ处理后保留有活力的自噬细胞可提高这种基于细胞的免疫疗法类型的有效性。

IFN-γ与抑制针对肿瘤的免疫应答有关(参见例如Hallermalm (2008) J. Immunol. 180:3766-3774；Romieu-Mourez (2010) Cancer Res. 70:7742-7747；Lee (2005) Clinical Cancer Res. 11:107-112)。

肿瘤可以是不同程度的分化细胞的异质群。肿瘤的黑素瘤细胞的IFN-γ处理可作用于某些更易于细胞凋亡的更加分化的细胞。通过从抗原来源清除这些细胞，结果可以是在接种后损失对肿瘤块的某些作用，这通过肿瘤大小消退慢或无明显消退来解释。研究表明，凋亡细胞不激活树突细胞(Sauter (2000) J. Exp. Med. 191:423-434)。

IFN-γ可起使单核细胞分化从DC偏向巨噬细胞的作用。制备物中IFN-γ的量可通过使表型偏向较少特异化的巨噬细胞，影响DC的不完全分化。

IFN-γ可用来增加MHC II类分子，并具有向T细胞的直接呈递。然而，Ii蛋白(钙防卫蛋白)与MHC II类分子的共诱导阻止内源肿瘤抗原自MHC II类分子的呈递。

第一项研究的材料与方法

自体树突细胞产生

树突细胞通过之前描述的塑料粘附方法产生(Choi (1998) Clin. Cancer Res. 4:2709-2716；Luft (1998) Exp. Hematol. 26:489-500)。简单地说，对自体单采血液成分术产物进行聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque) (GE Healthcare，Buckinghamshire，United Kingdom)密度梯度分离。在细胞培养瓶(Corning-Costar，Corning，NY)中，将所得外周血单核细胞按15 x 10⁶个细胞/mL接种于补充了IL-4 (CellGenix，Freisberg，Germany)和GM-CSF (Berlex，Seattle，WA)各1,000 IU/mL的无抗生素AIM-V培养基(Invitrogen，Grand Island，NY) (DC培养基)中。在1小时温育后，弃去非贴壁群，将新的DC培养基加入培养瓶中。次日上午，弃去非贴壁细胞，培养瓶用环境温度PBS洗涤一次，加入新的DC培养基。然后将培养瓶培养6天，届时进行流式细胞术评价，以测定通过该方法产生的DC的百分比和表型(加载前DC)。

自体肿瘤细胞系产生

将按之前报告产生和表征的纯的肿瘤细胞增殖到2亿个细胞，然后如前所述与1000 IU/mL的IFN-γ (InterMune，Brisbane，CA)一起在含15%FBS/ECS的RPMI (完全培养基)中温育72小时，用来自铯源的100 Gy照射，并冷藏保存(Choi (1998) Clin. Cancer Res. 4:2709-2716；Luft (1998) Exp. Hematol. 26:489-500；Dillman (1993) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14:65-69)。从冷藏保存回收IFN-γ处理和照射的肿瘤细胞，用PBS洗涤3x，然后加至体外培养的DC中，并温育约24小时。通过用橡胶刮棒轻刮，收获加载抗原的DC，并以9-11等分样品的等分量冷藏保存。获取等分细胞用于流式细胞术评价，其表示加载后的DC细胞。

流式细胞术

树突细胞群的表型表征使用获自BD Pharmingen San Diego，CA的以下抗表面标志物单克隆抗体进行：与PerCp缀合的抗MHC II类、与APC缀合的抗CD11c、与PE缀合的抗CD86、抗CD80、抗CD83。使用同种型对照测定百分比阳性细胞。使用来自BD Pharmingen的与FITC缀合的针对MHC I类和II的抗体、膜联蛋白-V-PE和7-氨基-放线菌素D (7-AAD)，进行肿瘤细胞的流式细胞术。在每次运行前使用CaliBRITE流式细胞术校准(BD Pharmingen)，流式细胞术数据采集期间使用相同的仪器设置。

免疫印迹测定法

用哺乳动物蛋白质提取试剂(Mammalian Protein Extraction Reagent) (Thermo Scientific，Rockford，IL)加蛋白酶抑制剂混合物(Roche，Indianapolis，IN)在冰上按10,000个细胞/uL制备胞质细胞裂解物。将约25 uL/泳道的细胞裂解物在12.5% tris-甘氨酸凝胶上分离，转移到PVDF膜上，用针对以下的抗体探查：钙网蛋白(MBL，Woburn，MA)、Hsp-60、Hsp-70、Hsp-90 (R&D Systems，Minneapolis，MN)、HMBG-1 (Cell Signaling，Danvers，MA)、ICAM-1 (Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)、Mel-4、Mart-1 (Signet，Emeryville，CA)、酪氨酸酶(Upstate，Lake Placid，NY)和GADPH (Calbiochem，Darmstadt，Germany)。

免疫组织化学

采用免疫细胞化学程序，测定由黑素瘤系表达的一组抗原。在1000 IU/mL IFN-γ存在或不存在下，将细胞培养在8室培养载玻片(Thermo Fisher，Rochester，NY)上。72小时后，细胞用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，并在冷丙酮中固定。在阻断内源过氧化物酶后，将细胞与针对所列出的抗原的合适的第一抗体一起温育。使用生物素化抗小鼠或兔免疫球蛋白、超灵敏酶(Super Sensitive enzyme)缀合的链霉抗生物素标记和辣根过氧化物酶色原、和底物试剂盒(Biogenex，San Ramon，CA)，进行免疫组织化学。用同种型匹配对照抗体，对下列抗人多克隆或单克隆抗体的反应性进行了研究：S-100和HMB-45 (Biogenex，San Ramon，CA)、Mel-2、Mel-5、Mart-1 (Signet，Dedham，MA)、酪氨酸酶和Mage-1 (Thermo Scientific，Fremont，CA)、Melan-A、HLA-I类和HLA-II类(Dako，Denmark)。

统计分析

等方差的双尾、两样品的Student t检验。通过p值≤ 0.05，确定显著差异。

第一项研究的结果

在自体黑素瘤肿瘤细胞系中，在响应在完全培养基中与IFN-γ温育72小时时差异性地诱导细胞死亡。在用与不用IFN-γ处理的细胞中进行的锥虫蓝染料排斥测定，揭示了在IFN-γ处理的细胞中趋于较低存活力的明显趋势(89.1 ± 6.8%相对于84.9 ± 9.3%，p = 0.014，N = 47)。通过流式细胞术，针对细胞凋亡诱导对4个自体黑素瘤细胞系样品的分析(图1A)揭示了黑素瘤细胞差异性地对IFN-γ诱导的细胞凋亡的作用敏感，其中一些细胞显示更多晚期细胞凋亡或“死亡”群(7-AAD+/膜联蛋白-V+)，而其它细胞显示早期细胞凋亡或“濒死”群(7-AAD-/膜联蛋白-V+)的迹象。在IFN-γ处理后得到的凋亡细胞的存在与无进展生存率和总体生存率显著下降有关(Cornforth (2010) Cancer Immunol. Immunother。对干扰素-γ对用于患者特异性树突细胞免疫疗法的黑素瘤细胞的促凋亡作用的抵抗与改进的总体生存率有关)。对数秩(log-rank)检验显示与在黑素瘤肿瘤细胞的IFN-γ处理时较低的存活力和研究中的患者的总体生存率显著相关。

针对可能是重要的免疫介质的各种分子，对来自在IFN-γ存在或不存在时温育的细胞的裂解物进行了免疫印迹法(图1B)。在用IFN-γ处理的黑素瘤细胞的背景下，热激蛋白显得被差异性调节，但依然很大程度存在于细胞制备物中，尤其在hsp-70的情况下。内质网蛋白质钙网蛋白和高迁移率族box-1蛋白(HMGB-1)，在用IFN-γ处理时在某些情况下显得增量调节(图1B)。相比之下，普通黑素瘤抗原(mel-4、Mart-1和酪氨酸酶)一般显得被IFN-γ减量调节，而ICAM-1，一种与对淋巴细胞介导的细胞毒性的敏感性有关的淋巴细胞粘附分子(Hamai (2008) Cancer Res. 68:9854-9864)，被显著地增量调节(图1C)。实际上，发现IFN-γ处理的黑素瘤肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性更敏感。另外，一组黑素瘤相关抗原的免疫组织化学揭示在所检查的许多抗原中，IFN-γ导致抗原表达减量调节(表1)。

使用IFN-γ导致主要组织相容性复合体I类和II类增量调节(Bohn (1998) J. Immunol. 161:897-908)。如图1D所示，用IFN-γ处理自体黑素瘤细胞导致MHC I类几乎普遍和显著地上调(p = 2.8 x 10^-8)，其倍数诱导中值为2.91 ± 1.13 (95% C.I.)。另外，MHC II类的平均荧光强度(MFI)也显著较高，但只是少些如此(p = 0.039)，其诱导中值为4.23 ± 2.66 (95% C.I.)。自体黑素瘤细胞表面上MHC II类分子的水平一般低于MHC I类分子的水平，但在70%的情况下，MHC II类分子由于MHC II类表达初始水平低，因此在响应IFN-γ处理时诱导超过两倍。在将抗原加载到树突细胞期间肿瘤细胞中这些分子的存在可为将MHC复合体“交叉装饰(cross dressing)”到抗原呈递细胞上提供机会(Dolan (2006) J. Immunol. 277:6018-6024，Dolan (2006) J. Immunol. 176:1447-1455)。

将一组4个代表性自体黑素瘤细胞系与IFN-γ一起温育，并按等量加载到树突细胞中，然后通过流式细胞术，测定树突细胞的CD80、CD83、CD86和MHC-II类表达。结果表明，在加载IFN-γ处理的黑素瘤细胞时观察到表达CD83的树突细胞的百分比阳性群小但可观的增加(图2)。另外，在CD86点图(左上象限)中注意到更多未加工的肿瘤细胞，这导致百分比CD86阳性群中可识别的降低，表明IFN-γ未处理肿瘤细胞仍存在。这种作用更可能是因为IFN-γ诱导细胞凋亡所致，因为如之前的报告，凋亡细胞更可能被树突细胞吞噬。

如图3所示，DC加载前的样品显示，它们表达CD80 (39.0 ± 16.2%)、CD83 (7.1 ± 6.9%)、CD86 (73.6 ± 19.5%)，并且是MHC II类阳性的，其存活力为96.2 ± 5.0%。加载的DC具有显著较高的CD83百分比(9.4 ± 7.1%，p = 0.019)，其显著较高的平均荧光强度(MFI) (172.9 ± 79.0，p = 0.0009)表明用经照射的IFN-γ处理的肿瘤细胞加载DC诱导某些树突细胞成熟(图3B)。

第一项研究的讨论

技术人员实施了在抗肿瘤免疫情况下用于抗原加载、成熟和给药的方案以及对基于树突细胞(DC)的免疫疗法的指导。这种治疗类型包括使用纯化的自体肿瘤细胞作为抗原来源，并含有患者特异性肿瘤相关抗原库(Selvan (2010) Melanoma Res. 20:280-292；Dillman (2007) Cancer Biother. Radiopharm. 22:309-321)。一些临床试验正使用未纯化的自体团块肿瘤。这种抗原来源可能具有污染性成纤维细胞和坏死组织(O'Rourke (2007) Melanoma Res. 17:316-322)。肿瘤干细胞相关抗原可存在于纯化的细胞系中(Dillman (2006) New Engl. J. Med. 355:1179-1181)。IFN-γ处理增加MHC II类分子的表达。MHC II类分子对响应基于树状细胞的疗法是重要的。存在于被吞噬的材料中的分子，例如钙网蛋白、HMGB-1和热激蛋白，可对成熟信号作出贡献，其中这种贡献可附加到细胞因子混合物的贡献中。本发明的DC制备物显示趋于成熟的趋势，这可能与晚期凋亡细胞的吞噬相关(Ip (2004) J. Immunol. 173:189-196)。使用凋亡细胞与树突细胞的产生相互关联，所述树突细胞相对于加载肿瘤细胞裂解物或坏死细胞的树突细胞，对刺激淋巴细胞IFN-γ分泌更有效，表明了加载凋亡细胞的树突细胞可能在体内更有效。对IFN-γ的促凋亡作用的抵抗可能与更好的临床结果有关(Cornforth (2010) Cancer Immunol. Immunother. 60:123-131)。通过成熟DC的白介素-12 (IL-12)分泌可导致强大的细胞毒性淋巴细胞(CTL；CD8⁺ T细胞)活性。解决了离体成熟是否导致持久肿瘤免疫的问题。另已表明，因未成熟DC所致调节性T细胞的诱导风险(其可抑制抗原特异性CTL)，随细胞因子成熟的DC而发生。正在对导致成熟的信号转导事件顺序的重新评价进行研究，以改进DC成熟方案。因此，在该研究中，使用经照射的完整肿瘤细胞作为抗原来源，无需离体细胞因子成熟，可能是DC免疫疗法的一种更优选的方法，因为本文呈现的证据表明，DC已开始成熟过程。在注射时，这些“成熟中的” DC可通过分泌趋化因子(其将吸引经许可的抗原特异性CD40L表达CD4⁺ T细胞)，来完成成熟过程。血清趋化因子，比如在响应佐剂GM-CSF时由树突细胞产生的CCL17/TARC，与更好的无进展生存率相关。在某些情况下，通过树突细胞激活淋巴细胞可能需要共刺激分子(比如CD80和CD86)的表达。作为成熟的标志物，CD83在成熟树突细胞上表达，可能与会诱导更有效的免疫应答的树突细胞相对应(Prazma (2008) Immunol. Lett. 115:1-8)。这代表了在药物制备中所有细胞的一部分。在任一个药物方案中，仅成熟DC的数目，可能与或可能不与更好的患者反应关联。

第一项研究的表格

表1：在基于患者特异性细胞的树突细胞疗法所使用的黑素瘤细胞系中常见肿瘤相关抗原在响应干扰素-γ时表达水平的改变。

N = 27个样品。

第二项研究的材料与方法

黑素瘤细胞系

市售获得的黑素瘤细胞系A375、SK-Mel-5和SK-Mel-28购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) (目录号：CRL-1619、HTB-70和HTB-72)。将A375、SK-Mel-5和SK-Mel-28保持在含5%胎牛血清的RPMI-1640 (Invitrogen，目录号11875-085)中。全胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk及其对照化合物z-FA-fmk购自BD Pharmingen (目录号：550377和550411)。按照生产商说明书进行GFP-LC3的转染(InvivoGen，目录号psetz-gfplc3和lyec-12)，并使用DP72数码相机，在Olympus BX-51显微镜上拍摄显微照片。测定前，将肿瘤细胞系与1000 U/mL的IFN-γ (InterMune，Cat#)一起温育72小时。患者特异性细胞系如所述如下产生(Hamai (2008) Cancer Res. 68:9854-9864；Tyring (1984) J. Natl. Cancer Inst. 73:1067-1073)：对手术肿瘤样品进行酶消化，在补充胎牛血清和富含牛血清(Omega Scientific，San Diego，CA)加1 mM丙酮酸钠、1 mM谷氨酰胺和HEPES缓冲液的RPMI-1640组织培养基中培养。使用Nikon DS-L1数码显微镜相机，在Olympus CK-2显微镜上拍摄相衬显微照片。

自体树突细胞产生

在补充IL-4 (CellGenix，Cat#)和GM-CSF (Berlex, Seattle，WA)各1,000 IU/mL的无抗生素AIM-V培养基(Invitrogen，Cat#) (DC培养基)中，通过ficoled单采血液成分术产品的塑料粘附方法产生树突细胞(Selvan (2007) Int. J. Cancer. 122:1374-1383；Cornforth (2010) Cancer Immunol. 60:123-131)。然后在用IFN-γ处理的、经照射的自体肿瘤细胞加载前，将培养瓶培养6天。

流式细胞术

使用针对MHC II类的抗体、膜联蛋白-V和7-氨基-放线菌素D (7-AAD)，对在响应IFN-γ时的肿瘤细胞死亡和主要组织相容性II类表达的变化进行了分析，并在Beckton-Dickenson FACS Calibur®流式细胞仪中获取。

蛋白质印迹法

黑素瘤肿瘤细胞裂解物经10-12.5% SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维上，用第一抗体探测过夜，然后第二抗体缀合并通过Novex AP显色底物(Invitrogen，Carlsbad，CA)显影以显现条带。分别按生产商推荐的1:100和1:10,000稀释度，使用针对LC3-B抗体(Cell Signaling Technologies，Boston，MA)和GADPH (EMD biosciences，Germany)的抗体。

第二项研究的描述

研究在IFN-γ处理后，体外黑素瘤肿瘤细胞的自噬、细胞凋亡和MHC II类分子的诱导。将自体和模式黑素瘤肿瘤细胞系与1000 IU/mL的IFN-γ一起温育72小时后，测定自噬、细胞凋亡和MHC II类表达。通过用抗LC3 II的抗体的免疫印迹和通过带有Enzo's CytoID自噬检测试剂盒的流式细胞术，对自噬进行检测。分别使用7-AAD和膜联蛋白-V染色和抗MHC II类的抗体，通过流式细胞术测定了细胞凋亡和MHC II类诱导。

第二项研究的结果

结果表明，IFN-γ诱导黑素瘤细胞系的自噬和凋亡细胞群两者。凋亡群主要存在于非贴壁群中，而自噬细胞保持附着在培养瓶上。用抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬抑制在响应IFN-γ时MHC II类阳性细胞的诱导(39.4% IFN-γ相对于10.0% IFN-γ + 3-MA)。用全胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD抑制胱天蛋白酶活性阻止细胞凋亡但不干扰IFN-γ处理的细胞的自噬(2.75 ± 0.15 IFN-γ相对于3.04 ± 0.27 IFN-γ + Z-VAD，倍数变化)。细胞凋亡的诱导与自噬和MHC II类表达水平降低相关。接受是加载自体肿瘤细胞的树突细胞(其是来源于干扰素-γ处理的纯化肿瘤细胞系的非凋亡自噬细胞)的患者，具有改善的无进展和总体生存率(分别为p 0.003和p 0.002)。在IFN-γ处理后清除凋亡细胞同时保留有活力的自噬细胞的方法，可提高这种类型的基于细胞的免疫疗法的有效性。

研究的汇总分析

自体、增殖性、自我更新肿的瘤细胞(公认的肿瘤干细胞和/或早期祖细胞)，对于建立转移癌的新贮库(depot)是重要的，并且可能是用于疫苗的优异抗原来源。这些研究解决了用来自所述细胞的抗原进行免疫对存活率的影响。

方法

从3个连续的II期试验中汇总数据，全部数据包括患有被证实为转移性黑素瘤的患者，在使用来自自体肿瘤细胞的细胞培养物的抗原的方案中对患者进行治疗。给予S.C.注射每周一次达3周，然后每月一次达5个月：74名患者注射经照射的肿瘤细胞(TC)：54名患者注射与经照射的自体肿瘤细胞(NCI-V01-1646)共培养的自体树突细胞(DC)：在随机II期试验中，24名患者注射TC，18名注射DC。

结果

表2概括了各试验的总体生存率(OS)。在汇总分析中，有98名TC和72名DC患者。就年龄(51，52)、男性(62%，62%)、治疗时无疾病证据(46%，47%)和在治疗时存在M1c内脏疾病(13%，14%)而言，特征相似。用DC治疗的患者中OS较长(中位值63.1月相对于20.2月，5年OS 51%相对于26%，p⁼0.0002 Mantle-Cox 对数秩检验)。随机试验中OS的差异亦是显著的(p=0.007)。

用来自自体增殖、自我更新的肿瘤细胞的抗原引发的患者特异性DC疫苗与令人鼓舞的长期生存率有关，并且在被诊断为转移性黑素瘤的患者群中优于患者特异性TC疫苗。

来自患者特异性疫苗的3个试验的生存曲线见图 13。连续的I期和II期临床试验使用自体肿瘤细胞，与自体树突细胞或不与树突细胞组合进行。给予皮下注射一周一次达三(3)个周，然后一月一次达五(5)个月，给74名患者注射未用IFN-γ预处理的经照射的肿瘤细胞(TC)：给54名患者注射与用IFN-γ预处理的经照射的自体肿瘤细胞共培养的自体树突细胞(DC)：在随机II期试验中，给24名患者注射未用IFN-γ预处理的TC，给18人注射DC加未用IFN-γ预处理的TC。

图 14显示3个试验的生存曲线，其中试验与图13公开的试验是同一临床试验，但是具有从较后时间点获取的其它数据，从对两个图中的步阶图的比较来看是明显的。临床试验中的黑素瘤细胞TC-24和TC-74不接受IFN-γ。临床试验中的黑素瘤细胞DC-TC-18不接受IFN-γ。临床试验中的黑素瘤细胞DC-TC-54的确得到IFN-γ。

用于制备树突细胞疫苗的非限制性标准操作程序包括以下方面(表3)。在扩增后收获肿瘤细胞时，对各患者的肿瘤细胞批次，进行以下操作。需要约2.2亿个细胞制备肿瘤细胞疫苗批次。将任何额外的细胞冷藏保存作为备份细胞。按22 ml培养基中220 x 10⁶个细胞制备原液细胞悬液，按下列方法进行分配(表3)。

试验#2：DC 2000-2006 (NCI-V01-1646)。加载来自经照射的自体肿瘤细胞的抗原的自体树突细胞作为患者特异性疫苗的II期试验(BB-IND 8554)：树突细胞(DC)疫苗。在用于该试验的疫苗的生产中，将自体增殖性肿瘤细胞与IFN-γ一起共温育，冷藏保存，然后接着与自体树突细胞一起共温育。将各等分的细胞悬浮于500微克的GM-CSF用于注射。

试验#3：DC vs. TC 2007-2011 (NCT00436930)：转移性黑素瘤患者中由佐剂GM-CSF加增殖性肿瘤细胞组成的自体疫苗vs. GM-CSF加加载增殖性肿瘤细胞的树突细胞组成自体疫苗的随机II期试验(BB-IND 8554和BB-IND 5838)：'MAC VAC'。第3个试验是测定在上述两种方法中是否有差异的随机试验。在肿瘤细胞生产中不使用IFN-γ。正如上述DC试验，所有患者随机接受与500微克GM-CSF一起s.c.注射的TC或DC一周一次达3个周，然后每月一次达5个月。DC组中患者的预计72%的2年生存率与之前54名患者DC试验中观察的71%的2年生存率(其中中位生存率为5年)相当。

有关结肠癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤和肾癌细胞的信息

下面提供得自结肠癌细胞(内胚层)、卵巢癌细胞(混合型中胚层加胚外层)、成胶质细胞瘤细胞(外胚层)和肾癌细胞(中胚层)研究的流式细胞术数据。这些细胞类型各自的胚胎学起源点用圆括号标注。黑素瘤细胞具有神经嵴起源。表3概括了肿瘤细胞类型，而表4概括了这些细胞实验的结果，其中细胞用干扰素-γ (IFN-γ)处理。

肿瘤细胞与成体干细胞具有多处相似性，例如在更成熟的细胞类型中自我增殖和分化的潜力。下列数据表明自噬是可被诱导成来源于所有胚胎层的肿瘤细胞的现象。除起源于来自神经嵴的细胞的黑素瘤以外，本研究涉及在来源于内胚层(结肠)、中胚层(肾)、外胚层(成胶质细胞瘤)和混合型中胚层加胚外层(卵巢)的组织中产生的肿瘤。

表4公开了以下结果。在干扰素-γ处理后的贴壁细胞群中，在不存在细胞凋亡(磷脂酰丝氨酸暴露)时，在基于MHC II类复合体诱导所检查的肿瘤类型中显示自噬被诱导。

材料与方法

按照Dillman和Comforth等人的文献，从结肠、卵巢、成胶质细胞瘤和肾细胞癌中生产纯的肿瘤细胞(Cornforth等(2011) Cancer Immunol. Immunother. 60:123-131；Dillman等(1993) J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 14:65-69；Dillman等(2000) Cancer Biother. Radiopharm. 15:161-168；Dillman等(1999) 14:443-449；Dillman等(2000) 15:161-168)。

简单地说，将来自手术样品的肿瘤活检样品酶促加工成单细胞悬液，并通过差异附着和血清饥饿产生纯化的细胞系。将所产生的细胞系在液氮中冷藏保存，融化，并用或不用含干扰素-γ的5%胎牛血清/RPMI培养基处理72小时。在暴露于干扰素-γ后，通过流式细胞术，对自贴壁细胞分离的非贴壁细胞进行分析。所研究的标志物为MHC I类、MHC II类、膜联蛋白V (细胞凋亡)和7-ADD (存活力)。

图14公开了以下方面。数据来自于没有任何分离成贴壁细胞和非贴壁细胞的原液细胞。干扰素-γ处理增加主要组织相容性复合体的表达：结肠(A)、卵巢(B)、成胶质细胞瘤(C)和肾细胞癌(D)。在用或不用1000 IU/mL IFN-γ处理72小时后，收获肿瘤细胞系，然后通过流式细胞术测定MHC I类和II类(图1A)。图15显示以下方面。使用对照同种型抗体鉴定阳性群体。主要组织相容性复合体I类和II类的平均荧光强度(MFI)的倍数变化概括于图15中。

图16披露了以下方面。通过IFN-γ处理来自各种不同来源的肿瘤细胞诱导细胞凋亡。结肠(A)、卵巢(B)、成胶质细胞瘤(C)和肾细胞癌(D)。在用或不用1000 IU/mL IFN-γ处理72小时后，收获肿瘤细胞系，然后通过膜联蛋白-V测定磷脂酰丝氨酸暴露，通过7-AAD测定细胞存活力。

图17公开了以下方面。在贴壁细胞群中(但不在非贴壁群中)，通过IFN-γ处理来自各种不同来源的肿瘤细胞诱导非凋亡的自噬MHC II类表达细胞。结肠癌(A)、成胶质细胞瘤(C)和肾细胞癌(D)。通过用HBSS洗涤除去非贴壁肿瘤细胞群，在用或不用1000 IU/mL IFN-γ处理72小时后收获贴壁细胞，然后通过膜联蛋白-V测定磷脂酰丝氨酸暴露，并在7-AAD阴性流分中测定主要组织相容性复合体II类(图17)。

图18公开了以下方面。使用对照同种型抗体鉴定阳性群体。在非贴壁细胞群中，主要组织相容性复合体II的平均荧光强度(MFI)的倍数变化概括于图18。因为MHC II类表达是自噬的代表，因此该图的平均荧光强度(MFI)数据表示倍数变化，在图中表示为结肠癌细胞(A)、成胶质细胞瘤(C)和肾细胞癌细胞(D)的自噬的增加的变化。所用细胞来自非凋亡群。MFI的变化是响应IFN-γ处理的。

图19公开了以下方面。该图公开了来自所检查的4种肿瘤类型的贴壁非凋亡细胞(膜联蛋白-V)中自噬的诱导。在用或不用1000 IU/mL IFN-γ处理72小时后，通过用HBSS洗涤除去非贴壁群，收获贴壁细胞，通过膜联蛋白-V测定磷脂酰丝氨酸暴露，并测定7-AAD阴性流分中的主要组织相容性复合体II类。结肠(A)、卵巢(B)、成胶质细胞瘤(C)和肾细胞癌(D)。

结果

MHC II类分子通常专门在特化细胞例如树突细胞、单核吞噬细胞、B淋巴细胞、一些内皮细胞和胸腺中表达。如表4所示，发现由于上述体外操作，通过所研究的所有样品明确表示出MHC II类的表达。一些样品对IFN-γ更敏感，并导致细胞凋亡的诱导，这可能是与凋亡途径蛋白质(例如胱天蛋白酶和bcl家族蛋白)表达有关的一个特征。

在所述体外操作后肿瘤细胞上的MHC II类分子表达是溶酶体加工的结果，因此该结果表明自噬的诱导发生在来源于本文以结肠、卵巢、成胶质细胞瘤和肾细胞癌为例的所有胚胎胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的肿瘤细胞系的贴壁非凋亡群中。这种对干扰素-γ的响应与用黑素瘤细胞观察到的响应相同，表明这个特征可用作生产非凋亡自噬细胞群的方式，我们表明该细胞群是用于癌症的基于细胞的免疫疗法的关键组分。由于自噬所致的MHC II类呈递性肿瘤细胞可与辅助T淋巴细胞(CD4⁺ T细胞)直接相互作用，并诱导免疫应答。与只基于树突细胞、未经操作的肿瘤细胞群或来自肿瘤的细胞裂解物的其它免疫疗法相比，树突细胞与自噬肿瘤细胞的复合体在患者中诱导更快和更强的应答，正如我们的临床数据所表明的一样。

使用MHC II类表达作为响应干扰素-γ处理的自噬的替代标志物得到本文和所引用的著作(表明自噬被描述为参与内源蛋白质迁移到MHC II类加载区室)提供的证据的充分支持。通过自噬细胞表面MHC II类复合体表达的增加，揭示了这种作用(参见例如Crotzer和Blum (2009) J. Immunol. 182:3335-3341)。本公开内容或引用的优先权文献，表明尽管用干扰素-γ处理，但使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤导致MHC II类表达丧失。因此，MHC II类诱导的测量可用作自噬的替代标志物。

因此，虽然显示、描述和指出本公开内容适于其示例性实施和/或方面的新的基本特征，但应了解本领域技术人员可在其示例性实施、公开内容和方面的形式和细节上进行各种省略、再组合和替换和变化，而不偏离本公开内容和/或权利要求书的精神。例如，明确指出以基本相同的方式执行基本相同的功能以达到相同结果的要素和/或方法步骤的所有组合都在本公开内容的范围内。而且，应认识到，连同任何公开的形式或实施所显示和/或描述的结构和/或要素和/或方法步骤可并入任何其它公开或描述或建议的形式或实施中作为设计选择的普通内容。因此，无意限制本公开内容的范围。所有这类修改都预期在其所随附的权利要求书的范围内。

本说明书所引用的所有出版物、专利、专利申请、参考文献和序列表均通过引用结合到本文中就像全部阐述于本文中一样。

提供符合37 CFR §1.72(b)的摘要以允许读者快速查明该技术内容的性质和要点。按摘要并非用来解释或限制权利要求书的范围或含义的认识，来提交摘要。

Claims (36)

1.一种哺乳动物树突细胞群，其包含：

取自患有癌症的受试者的癌细胞的癌特异性肽；

其中所述癌特异性肽自所述癌细胞由树突细胞在体外获得；

其中所述癌细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；

其中大于约60百分比(%)的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的，和，

其中所述树突细胞和癌细胞来自于同一受试者。

2.权利要求1的树突细胞群，其中所述癌症来自于内胚层起源、中胚层起源或外胚层起源中的一种或多种的组织。

3.权利要求1的树突细胞群，其中所述癌症来自于神经嵴起源的组织，且其中所述神经嵴是外胚层起源的。

4.权利要求1的树突细胞群，其中所述癌症来自于内胚层起源、中胚层起源或外胚层起源中的一种或多种的组织，且其中所述癌症是神经嵴起源的黑素瘤、内胚层起源的结肠癌、中胚层起源的肾癌、外胚层起源的成胶质细胞瘤或混合型中胚层加胚外起源的卵巢癌。

5.权利要求1的树突细胞群，其中大于80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理的所述癌细胞是自噬的和非凋亡的。

6.一种用于权利要求1的受试者的疫苗，其包含权利要求1的树突细胞群。

7.权利要求1的树突细胞群，其中基本所有的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞不能够细胞分裂。

8.权利要求1的树突细胞群，其中基本所有的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞被照射并且不能够细胞分裂。

9.权利要求1的树突细胞群，其中至少80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞被照射并且不能够细胞分裂。

10.权利要求1的树突细胞群，其中至少80%的不用IFN-γ或IFN-γ模拟物处理的癌细胞用核酸交联剂处理并且不能够细胞分裂。

11.权利要求1的树突细胞群，其包含一种或多种来源于黑素瘤特异性抗原的肽，所述抗原是S-100、HMB-45、Mel-2、Melan-A、Mel-5、MAGE-1、MART-1或酪氨酸酶，且其中所述癌症为黑素瘤。

12.权利要求1的树突细胞群，其中所述特定的受试者为人受试者。

13.权利要求1的树突细胞群，其中所述特定的受试者为非人哺乳动物。

14.一种黑素瘤疫苗，其包含：

来自患有黑素瘤的受试者的至少一种成熟树突细胞；

其中所述至少一种成熟树突细胞与来自同一受试者的至少一种癌症肿瘤细胞接触，

其中与至少一种成熟树突细胞接触的至少一种癌症肿瘤细胞是不分裂的、自噬的和非凋亡的。

15.一种用于刺激针对癌特异性抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将免疫刺激量的权利要求1的树突细胞给予受试者。

16.权利要求15的方法，其中所述被刺激的免疫应答包括CD4⁺ T细胞应答、CD8⁺ T细胞应答和B细胞应答中的一种或多种。

17.权利要求16的方法，其中CD4⁺ T细胞应答、CD8⁺ T细胞应答或B细胞应答可通过ELISPOT测定法、通过胞内细胞因子染色测定法、通过四聚体测定法或通过检测抗原特异性抗体产生来测定。

18.权利要求15的方法，其中所述免疫应答包括含2年总体生存率(OS)的生存时间，且其中2年总体生存率为至少约60%。

19.权利要求15的方法，其中所述给药包括皮下注射疫苗。

20.权利要求15的方法，其中所述给药包括每周一次给予疫苗注射达3个月，然后每月一次达5个月。

21.一种用于制备包含来自同一受试者的癌细胞和树突细胞的树突细胞疫苗的方法，所述方法包括：

一种或多种癌细胞用阻止细胞分裂的作用剂处理；

所述一种或多种癌细胞不用干扰素-γ (IFN-γ)或IFN-γ模拟物体外处理；

选择是自噬的和非凋亡的癌细胞；

排除是非自噬的和凋亡的癌细胞；且其中将是自噬的和非凋亡的癌细胞提供给一种或多种自体树突细胞，或者，其中将来源于是自噬的和非凋亡的癌细胞的肽提供给一种或多种自体树突细胞。

22.一种组合物，其包含：

来自第一受试者的不用干扰素-γ (IFN-γ)处理的至少一种癌细胞和来自同一第一受试者的至少一种抗原呈递细胞(APC)，其中所述癌细胞是：

自噬的；和，

非凋亡的。

23.权利要求22的组合物，其中所述癌细胞是表达MHC II类的。

24.权利要求22的组合物，其中所述APC是树突细胞、巨噬细胞或B细胞。

25.权利要求22的组合物，其中所述至少一种癌细胞包含癌特异性肽，且其中所述癌特异性肽基本上不包含在所述APC内，并且基本上不被所述APC加工。

26.权利要求22的组合物，其中所述癌细胞包含黑素瘤特异性肽，且其中所述癌特异性肽基本上包含在所述APC内，且在所述APC中被部分加工或被充分加工。

27.权利要求22的组合物，其中将所述癌细胞加载至APC中。

28.权利要求22的组合物，其中不将所述癌细胞加载至APC中。

29.权利要求19的组合物，其中自噬通过测定微管相关蛋白轻链3 (LC3)的试验证实。

30.权利要求22的组合物，其中使用试剂7-氨基放线菌素D (7-ADD)或试剂膜联蛋白的至少一种证实细胞是非凋亡的。

31.一种在患有癌症和包含癌细胞的受试者中刺激免疫应答的方法，其中所述受试者与第一受试者是同一受试者，所述方法包括给予免疫有效量的权利要求22的组合物。

32.权利要求22的组合物，其中至少90%的癌细胞不用IFN-γ体外处理，且小于10%的癌细胞用IFN-γ体外处理。

33.一种用于制备权利要求1的疫苗或权利要求19的组合物的方法，所述方法包括使至少一种癌症肿瘤细胞与至少一种抗原呈递细胞(APC)接触，其中所述至少一种癌症肿瘤细胞来自于第一人受试者，且其中所述至少一种APC来自于同一第一人受试者。

34.一种用于制备树突细胞疫苗的方法，所述方法包括：将获自第一受试者的癌细胞用阻止细胞分裂的作用剂处理；其中所述癌细胞不用IFN-γ或IFN-γ模拟物体外处理；选择是自噬的和非凋亡的癌细胞；且使所选择的癌细胞与来自同一第一受试者的自体树突细胞接触。

35.一种组合物，其包含按权利要求34的方法制备的树突细胞疫苗。

36.一种用于刺激针对癌特异性抗原的免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求34的组合物给予患有癌症的受试者。