KR101743340B1 - 위암 환자 종양 유래 이종이식 모델 및 이의 용도. - Google Patents
위암 환자 종양 유래 이종이식 모델 및 이의 용도. Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 목적은 환자 유래의 암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 계대한 환자 유래 종양조직 이종이식 동물 및 이의 제조방법을 제공하고, 이를 이용하여 표적 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 환자 유래 종양조직 이종이식 동물 모델은 암 환자에서의 암과 유전적, 생리적 및 환경적 특성이 동일한 조건을 제공할 수 있으므로, 암 환자의 표적 항암제 후보물질 스크리닝 및 암 치료에 큰 활용이 기대된다.
Description
본 발명은 위암 환자 종양 유래 이종이식 모델 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 환자맞춤형 항암치료를 통해 암을 극복하고자 하는 연구가 경쟁적으로 수행되고 있다. 특히, 표적치료제는 말기암 환자의 항암제에 대한 반응률을 획기적으로 높이면서 항암제 부작용을 최소화할 수 있을 뿐만 아니라 치료제에 대한 암의 반응을 분자신호로 예측할 수 있다는 측면에서 환자 맞춤형 항암치료 연구의 핵심이라 할 수 있다. 그러나, 표적치료제의 개발을 위해서는 치료제의 효능을 예측할 수 있는 전임상 자료가 필요하지만 암 치료제에 대한 일반 검사(routine test)로 이용할 수 있는 효과적인 전-임상 평가 시스템이 존재하지 않는다.
한편, 현재 항암제에 대한 체외(in vitro) 평가 시스템으로 불멸화된 종양조직 주 및 조직으로부터 초기 종양조직을 이용한다. 불멸화된 종양조직을 이용하여 항암제 효과를 보는 것은 어려운 일은 아니지만, 환경 인자에 따라 종양조직의 분자적 특징 및 표현형이 쉽게 바뀌기 때문에 이를 이용하여 실제적으로 항암제에 적용하는데 문제점이 존재한다. 세포는 생존을 위하여 세포의 특성을 변화시키고 강한 생존력을 갖는 세포는 계대 배양시 계속 선택되기 때문에 본래의 종양의 특징과 많이 달라질 수 있다. 또한, 다양한 환자에게 일어나는 여러 암 인자를 타겟으로 하는 새로운 항암제의 개발에 적합하지 않다. 또한, 다른 시스템으로 HRDA(histoculture drug response assay)를 임상전 단계에서 환자의 암치료제의 민감도를 미리 검사하는 적으로 사용된다. 그러나, 이것은 적은 양의 조직을 사용하기 때문에, 다양한 항암제의 검사가 불가능하며, 한번 쓴 샘플은 버려지므로, 주요한 암 조직의 손실이 크다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 제약회사와 국가 연구소에서 환자 암 조직을 이용한 PDX 모델 (patient-derived xenograft)이 개발되고 있으며, 상기 모델은 화학적 민감도를 체내(in vivo) 상에서 평가하기에 적절하고, 여러 항암제 중에서 환자 개개인에 맞는 가장 적합한 치료제를 선택할 수 있는 좋은 전임상 모델이다. 또한, 암의 진행 및 전이의 과정을 이해하기 위하여, 동종 장기 내에 이식한 동물모델 또한 개발하고 있다. 그러나, 상기 시스템은 많은 암 표본이 필요하며, 체내(in vivo) 검사 전에 암세포를 이용한 체외(in vitro) 평가에 사용할 수 없다는 단점이 존재한다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들은 암환자로부터 암 조직을 직접 쥐에 이식하여 암 전이 동물 모델을 제작하였다.
본 발명의 목적은 환자 유래의 암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 계대한 환자 유래 종양조직 이종이식 동물 및 이의 제조방법을 제공하고, 이를 이용하여 표적 항암제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 “암” 이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 학문적으로는 신생물이라고도 명명되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환으로, 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 상당수의 암이 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 용인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.
본 발명의 일 구체예에서 “암 조직 절편” 이란, 암 환자에 있어서 인체에 유익하고자 하는 목적으로 암 절개술이 필요한 경우에, 절개술 시행 후 폐기되는 암 조직으로부터 수득되는 절편을 의미한다. 상기 암 조직 절편을 이용하여 암 환자의 인체에 유익하고자 하는 목적 하에 특정 암 조직에 대한 맞춤형 치료제 개발을 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “전이”란, 암세포가 원발장기를 떠나 다른 장기로 가는 것이다. 암이 신체의 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암 조직이 성장하여 직접적으로 주위장기를 침윤하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격전이를 하는 것으로 나눈다. 전이는 암 발생과 관련된 유전자의 발현 억제 또는 상기 유전자의 단백질 활성 억제를 통해 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “신생 혈관”이란, 혈관 내피세포가 증식하고 재구성되어 기존에 존재하는 혈관 네트워크로부터 새로운 혈관을 형성하는 세포 현상을 의미한다. 암세포가 증식 및 성장하기 위해서는 산소와 영양을 공급하는 새로운 혈관이 필요하므로, 신생혈관의 억제를 통해서 암의 전이 억제를 유도할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “이종이식”이란, 종이 다른 동물의 간, 심장, 신장 등 기관, 장기, 조직, 세포 등을 이식하는 방법을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 이종이식은 환자로부터 분리된 암세포를 면역결핍 동물에 이식하는 방법으로 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 “면역 결핍 마우스”란, 암이 발병될 수 있도록 면역시스템을 구성하는 일부 구성요소를 유전자 수준에서 인위적으로 손상시켜서 정상적인 면역시스템이 구현되지 않도록 조작하여 제조된 동물모델을 의미한다. 상기 면역 결핍 마우스를 포함하는 면역 결핍 동물로는 신경계가 형성된 동물을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 면역 결핍 포유동물을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 면역 결핍되도록 조작된 마우스, 랫트, 햄스터, 기니어피그 등의 면역 결핍 설치류가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 누드 마우스, NOD(non-obese diabetic) 마우스, SCID(Severe combined immunodeficiency) 마우스, NOD-SCID 마우스, NOG(NOD/shi-SCID/IL2Rnull) 마우스 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구체예에서 “환자 유래 이종이식 동물(patient-derived xenograft, PDX)”이란, 환자 유래 암세포 또는 암 조직을 면역결핍 동물에 이종이식하여 제작된 암 환자 맞춤형 동물모델로서, 암 환자에서 암과 형태학적 환경이 동일 또는 유사하고, 유전학적 환경이 동일 또는 유사하며, 암의 마커 단백질의 발현특성이 동일하여, 암 환자의 유전적, 생리적 및 환경적 특성을 그대로 반영한 조건을 제공할 수 있다. 따라서, 환자 유래 이종이식 동물모델에서 항암 효과가 있다고 판단된 항암제 후보물질을 암세포 또는 암 조직을 제공한 암 환자에게 처리하면, 이들 항암제 후보물질을 환자에게 직접 처리하여 스크리닝 한 것과 동일한 효과를 확인할 수 있으므로, 상기 환자 유래 이종이식 동물 모델을 이용하면 항암제가 실제로 환자에게 적절한 효과를 나타낼 수 있는지에 대하여 확인할 수 있다는 장점을 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 “계대”또는 “계대 배양”이란, 세포 또는 조직을 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포 또는 조직의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포 또는 조직의 대 (代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포 또는 조직 내 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지 (배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage, F1)라고 한다. 본 발명의 목적상 배양용기는 면역 결핍 마우스의 생체시스템이며, 이는 이식된 환자 유래 암 조직을 배양하기 위한 영양체이다. 배양된 암 조직의 계대(passage, 예; F1 → F2) 이식시 새로운 개체의 면역 결핍 마우스가 사용되는 것이 바람직하며, 이를 마우스의 순계 생산을 위한 근교계(형매교배 또는 근친교배 등)와 혼동하는 것은 바람직하지 않다. 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 기계적 분리 또는 효소적 분리로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “기계적 방법”또는 “기계적 분해 방법”이란, 물리적 또는 기계적으로 세포 덩어리로서의 조직을 분리하는 것을 의미하며, 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 블레이드 (blade), 조직 분쇄기 (tissue chopper), 바늘 (needle), 피펫팅 (pipetting), EBD (embryoid body divider) 또는 스크래퍼 (scrapper)를 이용하여 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 암의 발병 유무 및 전이 여부를 확인하는 것이다. 암 발병 또는 전이 의심 환자로부터의 조직의 육안적 또는 세포학적 확인으로 암을 진단할 수 있으며, 암 발병 또는 전이 의심 조직의 검체(임상적으로는 세포, 혈액, 수액, 흉수, 복수, 관절액, 농(膿), 분비액, 담,인두점액, 요(尿), 담즙, 대변등) 내에 포함되어 있는 암 대응 항체를 이용하는 방법, 상기 검체 내 암 관련 단백질을 직접 검출하는 방법 또는 암 관련 단백질을 코딩하는 핵산을 직접 검출하는 방법으로 암을 진단할 수 있다. 항원-항체 결합 또는 암 관련 단백질을 직접 검출하는 방법을 이용한 진단적 수단으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 암 관련 단백질을 코딩하는 핵산을 직접 검출하는 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서 “스크리닝”이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 스크리닝은, 암 발병 및 암 전이 의심 개체에 위암 치료용 후보 물질의 투여 후 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 핵산이 코팅하는 단백질의 활성이 저해되는 경우에, 후보 물질을 암 치료제로 결정하는 암 치료제의 스크리닝 방법이다. 분자생물학적 어쎄이(assay), 디지털 이미징, 세포학적 및 조직학적 검사와 같은 수단적 방법들이 위암 발병 병소 또는 위암 세포 전이 의심 조직에 대한 본 발명의 유전자와 단백질의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “항암제 후보물질”이란, 종양조직의 성장 또는 전이에 대하여 억제 활성을 가지는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 펩타이드, 단백질, 항체 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 후보물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)이다. 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA),Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 후보물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, 1-비드 1-화합물 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J.Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 치료용 약학조성물을 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질환들을 치료하기 위하여 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다. 바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 환자로부터 분리된 암 조직을 절편으로 나누는 단계; (b) (a)의 암 조직 절편을 면역 결핍 마우스의 피하에 이식하는 단계; (c) (b)의 이식 후 배양된 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계; (d) (c)의 암 조직 절편을 새로운 면역 결핍 마우스의 피하에 재이식하는 단계; 및 (e) 상기 재이식하는 계대를 반복하는 단계를 포함하는, 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하고, 상기 환자로부터 분리된 암 조직은 위암 조직인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 위암은 보우만 3형, 관선암, 로렌(Lauren) 분류상 장형 또는 HER2 결과 2+인 위암 조직인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 면역 결핍 마우스는 T세포, B세포 및 자연살해세포(NK세포) 결핍인 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 면역 결핍 마우스는 NOG 마우스인 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (b) 내지 (e) 단계에서 암 조직 절편을 면역 결핍 마우스에게 이식하는 위치는 등쪽 피하인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 단계에서 페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신으로 이루어진 군에서 1종 이상의 항생제로 항균 처리하는 단계를 추가로 포함하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 단계에서 엠포테리신 B로 항진균 처리하는 단계를 추가로 포함하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 단계에서 암 조직으로부터 적혈구를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 내지 (c) 단계에서 암 조직의 절편은 1 mm3 내지 10 mm3 크기의 암 조직 절편인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (a) 내지 (c) 단계에서 암 조직을 절편하는 방법은 기계적 분해 방법인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (b) 내지 (e) 단계에서 암 절편의 이식은 3 내지 20개의 절편을 모아 이식하는 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공하며, 상기 (e) 단계에서 배양된 조직을 새로운 면역 결핍 마우스에게 재이식하는 계대 단계는 1 내지 10회 반복하는 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 환자로부터 분리된 암 조직 절편을 면역 결핍 마우스의 피하에 이식하고, 배양된 조직을 획득하여 계대하는 단계를 반복하는 방법에 의하여 제조된 이종이식 암 전이 동물 모델을 제공하고, 상기 환자로부터 분리된 암 조직인 위암 조직인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델을 제공하며, 상기 위암은 보우만 3형, 관선암, 로렌(Lauren) 분류상 장형 또는 HER2 결과 2+인 위암 조직인 것을 특징으로 하는 이종이식 암 전이 동물 모델을 제공하며, 상기 면역 결핍 마우스는 T세포, B세포 및 자연살해세포(NK세포) 결핍인 이종이식 암 전이 동물 모델을 제공하며, 상기 면역 결핍 마우스는 NOG 마우스인 이종이식 암 전이 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 환자로부터 분리된 암 조직을 절편으로 나누는 단계; (b) (a)의 암 조직 절편을 면역 결핍 마우스의 피하에 이식하는 단계; (c) (b)의 이식 후 배양된 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계; (d) (c)의 암 조직 절편을 새로운 면역 결핍 마우스의 피하에 재이식하는 계대 단계를 반복하여 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델을 제조하는 단계; (e) 상기 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델에 항암 후보물질을 처리하는 단계; 및 (f) 항암 후보물질에 의하여 암 조직의 크기가 감소했을 경우에 후보물질을 암 치료제로 결정하는 단계를 포함하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료 후보 물질이 처리된 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델의 암 전이 억제를 확인하여 치료 효과를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 후보 물질이 처리된 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델의 예후를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 목적하는 환자로부터 분리된 암 조직을 절편으로 나누는 단계; (b) (a)의 암 조직 절편을 면역 결핍 마우스의 피하에 이식하는 단계; (c) (b)의 이식 후 배양된 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계; (d) (c)의 암 조직 절편을 새로운 면역 결핍 마우스의 피하에 재이식하는 계대 단계를 반복하여 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델을 제조하는 단계; (e) 상기 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델에 항암 후보물질을 처리하는 단계; 및 (f) 항암 후보물질에 의하여 암 조직의 크기가 감소했을 경우에 후보물질을 상기 목적하는 환자의 암 치료제로 선택하는 환자 맞춤형 암 치료방법의 선택을 위한 정보제공 방법을 제공하고, 상기 (f) 단계는 환자유래 종양조직 이종이식 동물 모델의 예후를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 환자 맞춤형 암 치료방법의 선택을 위한 정보제공 방법을 제공하며, 상기 암 치료방법의 선택은 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 환자 맞춤형 암 치료방법의 선택을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
환자 유래 종양조직 이종이식 동물 모델은 암 환자에서의 암과 유전적, 생리적 및 환경적 특성이 동일한 조건을 제공할 수 있다. 따라서, 환자 유래 이종이식 동물모델에서 항암 효과가 있다고 판단된 항암제 후보물질을 암세포 또는 암 조직 제공 암 환자에게 처리하면, 이들 항암제 후보물질을 환자에게 처리한 것과 동일한 효과를 확인할 수 있으므로, 암 환자의 표적 항암제 후보물질 스크리닝 및 암 치료에 큰 활용이 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 위암 환자 종양 유래 이종이식 모델의 제조에 사용된 위암 조직을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 위암 환자 종양 유래 이종이식 모델의 제조방법에 대한 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 1세대 마우스에 대한 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 제 1세대 마우스의 조직분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제 2세대 마우스에 대한 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 2세대 마우스에 대한 또 다른 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 3세대 마우스에 대한 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 위암 환자 종양 유래 이종이식 모델의 제조방법에 대한 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 1세대 마우스에 대한 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 제 1세대 마우스의 조직분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 제 2세대 마우스에 대한 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 2세대 마우스에 대한 또 다른 전이 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 제 3세대 마우스에 대한 전이 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 환자 유래 이종이식 동물(patient-derived xenograft, PDX) 모델 제조
실시예 1-1. 환자 정보
환자는 54세 남자로 수술 결과 1기 (Ib)에 해당하는, 임파선 전이가 없이 위 근육층까지 침범한 (proper muscle invasion) 진행성 위암이었다. 종양은 위 전정부 (antrum)에 위치한 보우만 3형 (Borrmann type III)이었다. 조직학적 분류상 중등도 분화도를 보이는 위 관선암 (moderately differentiated tubular adenocarcinoma)이고, Lauren 분류상 장형 (intestinal type)이었다. HER2 면역조직화학염색법 결과 2+ 였다.
상기 환자의 위암 제거 수술 후, 절제된 위에서 위암 조직을 분리 채취하였다.
실시예 1-2. 환자 유래 이종이식 동물(PDX) 제작
수술 후 얻은 위암조직은 3 종류의 항생제(페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신)와 항진균제(엠포테리신 B)가 들어 있는 배지에 넣는다. 종양조직을 PBS에 세척 후 3 mm3 정도의 작은 절편으로 자른다. 작게 자른 절편을 5~10 개를 모아 NOG (NOD/shi-SCID, IL2Rnull) 생쥐 (F1 세대)의 등쪽 피하에 이식한다. 이 후 종양의 크기는 베니어 칼리퍼(vernier calipers)를 사용하여 일주일에 두 차례 측정한다. 피하에 이식한 종양의 크기가 약 1000 mm3에 도달하면, 생쥐를 희생하여 종양을 획득하고 5~10 mm3 크기의 절편으로 자른 후 새로운 NOG 생쥐 (F2 세대)에 재이식한다. 나머지 절편들은 추후 조직학적 분석 및 유전체 분석을 위해 저장한다. 같은 방식으로 F3, F4, F5 세대까지 계대를 진행하여 종양조직이 이식된 생쥐 개체 수를 증가시킨다.
실시예 2: 환자 유래 이종이식 동물(PDX)의 특징 확인
실시예 2-1. 제 1세대(F1) 결과
NOG 마우스의 피하에 이식된 환자의 종양은 이식 50일 이후부터 자라기 시작하여 60일 이후부터 급격히 자랐다. 이식 94일 째 종양의 크기는 991.93 mm3 이었고, F2 세대로 계대되었다. 이 때 간에서 20 여개의 결절(nodule)이 발견되었으며, 양쪽 신장으로 전이 소견이 관찰되었다. 조직학적 분석 결과, 환자 종양과 F1 세대 생쥐에서 자란 종양의 조직학적 구조가 일치함을 확인하였으며 간과 신장으로 전이되었음을 확인하였다.
실시예 2-2. 제 2세대(F2) 결과
F2 세대의 NOG 마우스 중 한 마리에서는 이식 후 34일 째 종양의 크기가 1131.59 mm3 이었으며, F3 세대로 계대되었다. 이 때 간에서 1개의 결절을 발견하였으며, 비장과 부신으로 전이 소견이 관찰되었다. 또 다른 한 마리에서는 이식 후 49일째 종양의 크기가 923.7 mm3 이었고, F3 세대로 계대되었다. 이 때 간에서 1 개의 결절을 발견하였으며, 비장과 림프절로 전이 소견이 관찰되었다.
실시예 2-3. 제 3세대(F3) 결과
F3 세대의 NOG 마우스에서는 이식 후 27일째 종양의 크기가 1782.96 mm3 이었고, F4 세대로 계대되었다. 이 때 간에서 3개의 결절이 발견되었고, 비장과 림프절로의 전이 소견이 관찰되었다.
따라서 위암 환자 종양을 NOG 생쥐에 이식하여 세대를 거듭하여 종양의 자발적 전이가 가능한 동물모델이 수립되었다고 보여진다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (24)
- (a) 환자로부터 분리된 암 조직을 절편으로 나누는 단계;
(b) (a) 단계의 암 조직 절편을 F1 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 이식하는 단계;
(c) (b) 단계의 마우스로부터 이식된 암 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계; 및
(d) (c) 단계의 암 조직 절편을 F2 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 재이식하는 단계를 포함하고,
상기 F2 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도는 F1 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도보다 증가되는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 환자로부터 분리된 암 조직은 위암 조직인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 2항에 있어서,
상기 위암은 보우만 3형, 관선암, 로렌(Lauren) 분류상 장형 또는 HER2 결과 2+인 위암 조직인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (d) 단계 이후에,
(e) (d) 단계의 마우스로부터 암 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계; 및
(f) (e) 단계의 암 조직 절편을 F3 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 재이식하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 F3 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도는 F2 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도보다 증가되는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 4항에 있어서,
상기 (f) 단계 이후에,
이전 세대(older generation) NOG 마우스로부터 획득한 암 조직을 다음 세대(next generation) NOG 마우스로 재이식하는 단계를 추가로 포함하고,
다음 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도는 이전 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도보다 증가되는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (b) 또는 (d) 단계에서 암 조직 절편을 NOG 마우스에게 이식하는 위치는 등쪽 피하인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항생제로 항균 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 엠포테리신 B로 항진균 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 암 조직으로부터 적혈구를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (c) 단계에서 암 조직의 절편은 1 mm3 내지 10 mm3 크기의 암 조직 절편인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (a) 또는 (c) 단계에서 암 조직을 절편하는 방법은 기계적 분해 방법인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (b) 또는 (d) 단계에서 암 절편의 이식은 3 내지 20개의 절편을 모아 이식하는 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델의 제조방법.
- 삭제
- 환자로부터 분리된 암 조직 절편을 F1 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 이식하고, 이식된 조직을 획득하여 F2 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스에 재이식하는 방법에 의하여 제조되며,
상기 F2 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도는 F1 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도보다 증가되는 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델.
- 제 14항에 있어서,
상기 환자로부터 분리된 암 조직은 위암 조직인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델.
- 제 15항에 있어서,
상기 위암은 보우만 3형, 관선암, 로렌(Lauren) 분류상 장형 또는 HER2 결과 2+인 위암 조직인 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델.
- 제 14항에 있어서,
상기 F2 세대 NOG 마우스에 재이식된 암 조직을 획득하여 F3 세대 NOG 마우스에 재이식하는 방법에 의하여 제조되고,
상기 F3 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도는 F2 세대 NOG 마우스의 암 성장 및 전이 속도보다 증가되는 것을 특징으로 하는, 암 환자 유래 이종이식 동물모델.
- 삭제
- (a) 환자로부터 분리된 암 조직을 절편으로 나누는 단계;
(b) (a) 단계의 암 조직 절편을 F1 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 이식하는 단계;
(c) (b) 단계의 마우스로부터 이식된 암 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계;
(d) (c) 단계의 암 조직 절편을 F2 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 재이식하여 암 환자 유래 이종이식 동물 모델을 제조하는 단계;
(e) 상기 암 환자 유래 이종이식 동물 모델에 항암 후보물질을 처리하는 단계; 및
(f) 상기 항암 후보물질에 의하여 암 조직의 크기가 감소한 경우에 후보물질을 효과적인 암 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
- 제 19항에 있어서,
상기 방법은 항암 후보물질이 처리된 암 환자 유래 이종이식 동물 모델의 암 전이 억제를 확인하여 항전이 효과를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
- 제 19항에 있어서,
상기 방법은 항암 후보물질이 처리된 암 환자 유래 이종이식 동물 모델의 예후를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
- (a) 목적하는 환자로부터 분리된 암 조직을 절편으로 나누는 단계;
(b) (a) 단계의 암 조직 절편을 F1 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 이식하는 단계;
(c) (b) 단계의 마우스로부터 이식된 암 조직을 획득하여 절편으로 나누는 단계;
(d) (c) 단계의 암 조직 절편을 F2 세대 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull) 마우스의 피하에 재이식하여 암 환자 유래 이종이식 동물 모델을 제조하는 단계;
(e) 상기 F1 세대 또는 F2 세대 암 환자 유래 이종이식 동물 모델에 항암 후보물질을 처리하는 단계; 및
(f) 항암 후보물질에 의하여 암 조직의 크기가 감소하거나 암 전이가 억제되었을 경우에 후보물질을 상기 목적하는 환자의 암 치료제로 선택하는, 환자 맞춤형 암 치료제 선택을 위한 정보제공 방법.
- 제 22항에 있어서,
상기 (f) 단계는 암 환자 유래 이종이식 동물 모델의 예후를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 환자 맞춤형 암 치료제 선택을 위한 정보제공 방법.
- 제 22항에 있어서,
상기 암 치료제는 화학적 요법, 방사선 요법, 외과적 요법, 면역세포치료법 또는 이들의 조합을 병용하여 처리 가능한 것을 특징으로 하는, 환자 맞춤형 암 치료제 선택을 위한 정보제공 방법.
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